JP2002524026A

JP2002524026A - Ｍｅｋｋ１（セリントレオニンキナーゼ）相互作用性ｆｈａ（フォークヘッド結合ドメイン）タンパク質１（ｍｉｆ１）

Info

Publication number: JP2002524026A
Application number: JP2000561308A
Authority: JP
Inventors: マルシロー，クリストフ; ミユルトン，マリ−クリステイーヌ; ポラール−ウセ，バレリー
Original assignee: アバンテイス・フアルマ・エス・アー
Priority date: 1998-07-21
Filing date: 1999-07-21
Publication date: 2002-08-06
Anticipated expiration: 2019-07-21
Also published as: AU5505799A; PT1100913E; JP4548938B2; DK1100913T3; CY1109289T1; ATE430196T1; EP1100913B1; ES2326442T3; WO2000005362A1; EP1100913A1; DE69940812D1; AU764094B2

Abstract

(57)【要約】本発明は、MEKKシグナル伝達経路の新規タンパク質およびそれをコードする遺伝子に関する。さらに、本発明は、該タンパク質または該遺伝子の診断および治療用途、ならびに該タンパク質のアゴニストまたはアンタゴニスト（特にMEKK活性に関するもの）のスクリーニング方法に関する。特に、本発明は、MIF1をコードする遺伝子、MIF1タンパク質、およびMIF1に特異的に結合する抗体を提供する。MIF1およびMIF1遺伝子は、スクリーニングアッセイにおいて（特に、MIF1とMEKKとの相互作用のアゴニストおよびアンタゴニスト、したがってMEKKシグナル経路のモジュレーターを同定するために）使用することができる。また、MIF1遺伝子（またはcDNA）は、例えば、インビトロスクリーニングまたは試験のために又は遺伝子治療用にインビボもしくはex vivoで、細胞に運搬されうる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】（発明の分野）本発明は、MEKKシグナル伝達経路の新規タンパク質およびそれをコードする遺
伝子に関する。さらに、本発明は、該タンパク質または該遺伝子の診断および治
療用途、ならびに該タンパク質のアゴニストまたはアンタゴニスト（特にMEKK活
性に関するもの）のスクリーニング方法に関する。

【０００２】（発明の背景）最近、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（MAP）が精力的な研究の主要
対象となっている。相同キナーゼのこのファミリーは細胞外刺激に対する種々の
細胞応答に関与し、それらのそれぞれの活性化状態が細胞の運命を決定するらし
い。すべての真核生物間で良く保存された少なくとも3つのキナーゼモジュール
よりなる種々のMAPKカスケードの同定が、各キナーゼシグナリング経路に関与す
る応答のそれぞれの枠組みを部分的に明らかにした。ERKモジュールは、マイト
ジェンまたは分化シグナルにより活性化されて、その基質（p90リボソームS6キ
ナーゼ、cPLA2、PHAS-1、c-myc、MAPKAPK2およびElk1を含む）を活性化する。一
方、ストレス、いくつかの増殖因子、プロ炎症性サイトカイン、UVまたはγ線照
射、セラミド、バソアクティブペプチド、タンパク質合成阻害剤または熱ショッ
クに対する細胞応答は、Jun N末端キナーゼ（JNK）およびp38/HOGの活性化を伴
う。このストレスキナーゼカスケードの終着点は、c-Jun、Elk lまたはATF-2（C
RE-BP1）転写因子のリン酸化である。JNKの持続的活性化は、増殖停止、アポト
ーシスの発生または造血幹細胞の活性化に関連している。

【０００３】 JNKは、JNKキナーゼ（MKK4/SEK1）による二重のリン酸化により活性化される
。それらのJNKキナーゼは、MEKキナーゼ（MEKK）と称される上流のセリントレオ
ニンキナーゼにより活性化される。MEKKは、キナーゼの拡張ファミリーを代表す
るものである。哺乳類MEKK1 cDNAは78kDaのタンパク質をコードしているが、種
々の細胞系においてMEKK1のいくつかの形態（50、78または98kDa）が報告された
。その後、195kDaのタンパク質をコードするラットMEKK1完全長cDNAがクローニ
ングされた。これはカスパーゼにより切断されて、より短く且つより活性なキナ
ーゼの発現をアノイキス（anoikis）（細胞剥離によるアポトーシス）中に引き
起こすと報告されている。その98kDaの切断産物は完全長MEKK1のC末端部分の625
アミノ酸に対応する。最近のデータは、MEKK1がiκB-αキナーゼのリン酸化によ
りnFκB転写因子をも調節することを示している。

【０００４】 MAPKの活性化を招く広範な細胞外または細胞内刺激においては、それらの活性
化メカニズムの特異性が問題となる。マイトジェンキナーゼカスケード（ERK）
の活性化段階は既に記載されている。これに対して、ストレスキナーゼカスケー
ドを調節する第1活性化段階は現時点では不明である。このMAPK/JNKカスケード
の共通の調節体（例えば、ホスファターゼ）が同定されており、それは、細胞増
殖とアポトーシスとの間の平衡（すなわち、すべての組織の恒常性を調節する平
衡）の決定因子として作用する。

【０００５】 Raf（マイトジェンRas依存性シグナルにより活性化されるMAPKKK）およびMEKK
1は共に、GTP結合Rasとそのエフェクタードメインを介して相互作用するが、Ras
-GTPがMEKK1タンパク質を直接活性化するという証拠はない。それでも、腫瘍原
性Rasはまた、JNKカスケードを活性化し、この活性化はRasトランスフォーメー
ションに必要であるらしい。

【０００６】これらの例は、MEKK1が、細胞分裂、細胞活性化または細胞死のいずれかにつ
ながる広範な細胞事象の調節に関与することを示している。したがって、その活
性の顕著な制御が細胞内で生じているはずである。MEKK1活性の増加は、過剰の
アポトーシスまたはT細胞活性化を招く可能性があり、炎症および喘息、免疫抑
制、心臓虚血または肥大、骨髄形成異常症候群、神経変性などの広範な病理の原
因となりうる。一方、MEKK1活性のダウンレギュレーションは、過剰な細胞増殖
および／または生存を誘導して、腫瘍増殖、過剰な血管新生、慢性関節リウマチ
、乾癬および持続的ウイルス感染症を招きうる。

【０００７】本明細書に開示するMIF1 cDNAと100％相同なcDNAは、Ren Yら, Eur. J. Bioch
em., 253, pp734-742, 1988に公開されており（受託番号Genbank AF015308）、
ホモ・サピエンス（Homo sapiens）微小球（microspherule）タンパク質（MSP58
）と称される。しかし、このタンパク質には何れの機能も帰属されていない。

【０００８】しかしながら、MEKKに媒介される細胞過程の分子メカニズムを更に理解するこ
とが、当技術分野において必要とされている。特に、MEKK調節タンパク質を同定
することが、当技術分野において必要とされている。

【０００９】以下に説明するとおり、本発明はこの要求について対処するものである。

【００１０】本明細書におけるいずれの参照文献の引用も、そのような参照文献が本出願の
「先行技術」として利用可能であることを認めるものと解釈されるべきではない
。

【００１１】（発明の概要）前記のとおり、本発明は、MEKK調節因子の同定に関する。この因子は、本発明
ではMEKK相互作用性FAHタンパク質（MIF1）と称され、MEKK活性のモジュレーシ
ョン、したがって多数の生理的過程（例えば、アポトーシス、ならびに炎症およ
び他の刺激に対する細胞応答）のモジュレーションのための手段を提供する。

【００１２】したがって、第1の態様において、本発明は、MEKK相互作用性FHAタンパク質（
MIF1）をコードする単離された核酸であって、それが、配列番号1または配列番
号7に由来するオリゴヌクレオチドプライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応
（PCR）により増幅されうること；それが、ストリンジェントな条件下、配列番
号1に示すヌクレオチド配列を有する核酸にハイブリダイズすること；それが、
配列番号2、配列番号8、それらのスプライシング変異体およびそれらの対立遺伝
子変異体よりなる群から選ばれるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードす
ること；およびそれが、配列番号8に示すMIF1のアミノ酸16〜28に対応するペプ
チドに対して産生した抗体に特異的に結合するポリペプチドをコードすること；
から選ばれる特性を有することを特徴とする単離された核酸を提供する。以下に
例示する特定の実施形態においては、MIF1は、配列番号2に示すアミノ酸配列を
有する。例えば、その単離された核酸は、配列番号1に示すヌクレオチド配列を
含む。以下に例示するもう1つの実施形態において、MIF1は、配列番号8に示すア
ミノ酸配列を有する。例えば、その単離された核酸は、配列番号7に示すヌクレ
オチド配列を含む。もう1つの実施形態においては、MIF1は約483アミノ酸を有す
る。特定の実施形態においては、「約」または「およそ」なる語は、与えられた
値または範囲の20％以内、好ましくは10％以内、より好ましくは5％以内を意味
する。

【００１３】当業者には容易に理解されるとおり、本発明の核酸（特に、cDNA）を製造する
ための1つの有効な方法は、MIF1のコード配列を含むcDNAライブラリーから該核
酸をPCRにより増幅することである。配列番号1または配列番号7からの任意の所
望のセグメントに対応する種々のPCRプライマーを、本発明に従い使用すること
ができる。以下の特定の実施形態においては、配列番号10、11および14に示す配
列を有するPCRプライマーを使用して、本発明の核酸を増幅し単離した。あるい
は、本発明の核酸は、配列番号7に示す配列または相補的配列を有するヌクレオ
チドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプロ
ーブ（例えば、少なくとも10塩基のもの）で単離し同定することができる。特定
の態様においては、該オリゴヌクレオチドは、ゲノムDNA（サザン分析）の検出
、または細胞内でのMIF1コード化mRNA（ノーザン分析）の発現のための方法にお
いて使用することができる。いずれの場合も、該方法は、該細胞由来のサンプル
と、検出可能（例えば、放射性同位体または発色団もしくは発蛍光団での標識に
よるもの）なオリゴヌクレオチドとを接触させ、該サンプル中のゲノムDNAまた
はmRNAに対する該オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを検出すること
を含み、この場合、ゲノムDNAに対する該オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼ
ーションの検出は、ゲノム内のMIF1コード化遺伝子の存在を示し、mRNAに対する
ハイブリダイゼーションの検出は、MIF1をコードするmRNAの発現を示す。また、
定量的方法、例えばゲノム内のMIF1遺伝子の数を検出するための方法またはmRNA
の発現レベルの増加もしくは減少を検出するための方法を用いることも可能であ
る。

【００１４】また、本発明のオリゴヌクレオチドは、アンチセンスオリゴヌクレオチド、す
なわち、MIF1をコードするmRNAに結合し細胞内でのその翻訳を妨げるオリゴヌク
レオチドであってもよい。そのようなアンチセンス分子は、細胞内で発現される
ベクターによりコードされうる。あるいは、そのようなアンチセンス分子は、合
成オリゴヌクレオチド、好ましくは、非ホスホエステル結合を含み細胞内ヌクレ
アーゼに抵抗性のものであってもよい。

【００１５】もう1つの実施形態においては、前記の単離された核酸は、ポリペプチドタグ
をコードする配列を更に含んでいてキメラタグ付きMIF1タンパク質をコードする
ものであってもよい。適当なタグには、Mycタンパク質の一部、ポリヒスチジン
配列またはグルタチオントランスフェラーゼタンパク質が含まれるが、決してこ
れらに限定されるものではない。

【００１６】もちろん、本発明の核酸、特にcDNA分子は、クローニングベクター中または発
現ベクター中で提供されうる。発現ベクターにおいては、MIF1をコードする配列
は、発現コンピテント宿主細胞内でのMIF1ポリペプチドの発現を可能にする発現
制御配列に作動的に結合している。本発明のベクターには、RNA分子、プラスミ
ドDNA分子およびウイルスベクターが含まれる。該ベクターがプラスミドDNA分子
である場合、該プラスミドDNAは、DNA凝縮（condensing）タンパク質、正電荷脂
質、リポソーム、重合体およびDNA沈殿剤よりなる群から選ばれる組成物を更に
含んでいてもよい。該ベクターがウイルスベクターである場合、該ウイルスベク
ターとしては、少数ながら挙げると、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ
随伴ウイルス、ヘルペスウイルスおよびワクシニアウイルスなどのベクターを挙
げることができる。好ましいレトロウイルスベクターには、HIVなどのレンチウ
イルス科のベクターが含まれる。また、本発明は、クローニングベクター（その
場合の宿主は、通常、後記に例示する原核細胞となろう）または発現ベクターの
いずれかでトランスフェクトされた宿主細胞を提供する。該発現ベクターを含有
する宿主細胞には、細菌細胞、酵母細胞および哺乳類細胞が含まれる。特定の実
施形態においては、酵母細胞および宿主細胞の両方を用いる。

【００１７】本発明の宿主細胞は、MIF1を組換え的に製造するために使用することができる
。この方法は、該宿主細胞を、MIF1の発現を可能にする条件下、培地内で培養し
、該培養からMIF1を単離することを含む。

【００１８】もう1つの態様において、本発明は、単離されたMEKK相互作用性FHAタンパク質
（MIF1）を提供する。該タンパク質は、本発明の核酸にコードされうる。あるい
は、MIF1タンパク質は、配列番号2、配列番号8、それらのスプライシング変異体
およびそれらの対立遺伝子変異体よりなる群から選ばれるアミノ酸配列を有する
。さらにもう1つの実施形態においては、該タンパク質は、配列番号8に示すMIF1
のアミノ酸16〜28に対応するペプチドに対して産生した抗体に特異的に結合する
ことにより特徴づけられる。本発明は、マウスおよびヒトの両方のMIF1を提供す
る。さらにもう1つの実施形態においては、該タンパク質は、例えば前記のとお
りのポリペプチドタグを含むキメラMIF1である。

【００１９】また、単離されたMEKK相互作用性FHAタンパク質（MIF1）の断片である抗原性
ペプチドを提供する。特定の実施形態においては、該抗原性ペプチドは、配列番
号8のアミノ酸16〜28に対応するアミノ酸配列を有する。

【００２０】もちろん、本発明は更に、MIF1タンパク質に特異的に結合する抗体を提供する
。そのような抗体は、細胞内のMIF1の存在および所望によりその量を検出するた
めに診断的に使用することができる。また、本発明の抗体、特に、一本鎖Fv抗体
（scFv）は、MIF1活性を抑制するために治療的に使用することができる。後記に
例示する特定の実施形態においては、該抗体は、配列番号8のMIF1アミノ酸16〜2
8を特異的に認識する。後記に例示するもう1つの特定に実施形態においては、該
抗体はポリクローナルである。モノクローナル抗体および（scFv抗体のほかの）
抗体フラグメントも本発明に含まれる。本発明の抗体を使用して、MIF1タンパク
質への該抗体の結合を可能にする条件下で該細胞由来のサンプルと該抗体とを接
触させ、該サンプル中のタンパク質への該抗体の結合を検出することにより、細
胞内でのMIF1タンパク質の発現を検出することができ、この場合、該タンパク質
への該抗体の結合の検出は、該細胞内でのMIF1の発現を示す。定量的イムノアッ
セイまたはウエスタンブロット法を用いて、MIF1を定量し、特に、より早期の細
胞または正常細胞と比較した場合のMIF1の量の増加または減少を検出することが
可能である。

【００２１】前記のとおり、MIF1はMEKKの活性を調節する。MEKKは、多数の系における重要
なシグナル伝達分子である。本発明は、有利にも、MIF1の活性、したがってMEKK
の活性をモジュレーションする分子に関するスクリーニング方法を提供する。当
技術分野における任意のスクリーニング方法（特に、ハイスループットスクリー
ニング）を用いることができる。特定の実施形態においては、該方法は、MIF1タ
ンパク質と候補分子とを接触させ、該MIF1タンパク質への該分子の結合を検出す
ることを含む。特定の実施形態においては、MIF1への該分子の結合の検出は、MI
F1とMEKKとの相互作用のモジュレーションを検出することを含む。特定の実施形
態においては、MEKKのMIF1結合ドメインと転写アクチベーターのDNA結合ドメイ
ンとよりなるキメラタンパク質の制御下で発現されたレポーター遺伝子の発現レ
ベルの変化を、MIF1および該MEKKキメラタンパク質でトランスフェクトされた細
胞系内で検出することを、MIF1とMEKKとの相互作用のモジュレーションが含む。
より詳しくは、発現の検出は、一過性にトランスフェクトされた哺乳類細胞にお
けるものである。MEKK活性の一過性モジュレーションを、後記実施例において例
示する。本発明のスクリーニング方法は、MIF1のアゴニストまたはアンタゴニス
トの同定を可能にする。

【００２２】さらにもう1つの実施形態において、本発明は、細胞内のMIF1タンパク質のレ
ベルを増加させることを含んでなる、該細胞内のMEKK活性を減少させる方法を提
供する。該MIF1タンパク質はマウスMIF1であってもよい。より好ましくは、それ
はヒトMIF1である。好ましい実施形態においては、該細胞は、該MIF1タンパク質
の発現を可能にする条件下、MIF1をコードするベクターでトランスフェクトされ
ている。

【００２３】あるいは、所望により、本発明は、細胞内のMIF1タンパク質のレベルを減少さ
せることを含んでなる、該細胞内のMEKK活性を増加させる方法を提供する。細胞
内条件下でMIF1 mRNAにハイブリダイズするMIF1アンチセンス核酸を細胞内に導
入することにより、MIF1タンパク質のレベルを減少させることができる。あるい
は、MIF1に特異的に結合する一本鎖Fv抗体（scFv）を、MIF1に結合しそれを不活
性化するのに十分なレベルで細胞内に導入することにより、MIF1タンパク質のレ
ベルを減少させることができる。

【００２４】したがって、本発明の第1の目的は、MEKK（特にMEKK1）の活性を調節する因子
を提供することにある。

【００２５】それに関連した目的は、そのようなポリペプチドをコードする核酸を提供する
ことにある。

【００２６】さらにもう1つの目的は、MEKK調節因子をコードする核酸を増幅するためのPCR
プライマーとしての又はそのような核酸を検出もしくは単離するためのハイブリ
ダイゼーションプローブとしてのオリゴヌクレオチドを提供することにある。

【００２７】本発明の更にもう1つの目的は、精製タンパク質の回収のためのトランスフェ
クト化またはトランスデュース化細胞の発酵による、あるいは細胞内のインビボ
での、MEKK調節タンパク質の高レベルの発現（インビトロでの更なる試験または
インビボでのMEKK活性の調節、例えば遺伝子治療を目的としたもの）を提供する
ことにある。

【００２８】特に、本発明の目的は、MIF1活性（特に、MEKKに対するMIF1の相互作用）の小
分子モジュレーター（例えば、アゴニストおよびアンタゴニスト）のスクリーニ
ングを提供することにある。

【００２９】これらの及び他の目的について本発明で検討する。本発明は、添付図面および
以下の「発明の詳細な記載」および「実施例」で更に詳しく説明する。

【００３０】（発明の詳細な記載） MEKK1の上流調節に関してはほとんど知られていないため、その活性の推定調
節体を見出すためにMEKK1のパートナーを同定するように努めた。本発明は、1つ
には、そのような調節タンパク質（本発明ではMIF1と称される）の同定に基づく
。MEKK1の活性化および調節経路の更なる知見はMIF1タンパク質によりもたらさ
れうるであろう。ツーハイブリッド法および餌（bait）としてのMEKK1を使用し
て、MIF1（MEKK1相互作用性FHAタンパク質1、483アミノ酸）をクローニングした
。

【００３１】 MIF1タンパク質は、Prositeデータバンク中で同定されたタンパク質モチーフ
を含有する。このドメイン（フォークヘッド関連（Forkhead Associated）（FHA
）ドメイン）は、タンパク質-タンパク質相互作用に関与すると記載されており
、リン酸化セリンおよびトレオニンに対する結合モチーフでありうる。既に記載
されており恐らく細胞質内に位置する唯一のフォークヘッド相同タンパク質はKA
PP（リン酸化依存的にセリン／トレオニンキナーゼと相互作用するホスファター
ゼ）である。

【００３２】 MIF1とMEKK1との間の相互作用ドメインのマッピングは、MIF1とMEKK1との相互
作用がMEKK1のリン酸化に依存することを示した。MEKK1が非修飾キナーゼ活性を
有し相互作用部位を自己リン酸化する場合にのみ、酵母におけるMIF1とMEKK1と
の相互作用が認められうる。MEKK1 cDNA（ツーハイブリッド）の種々の断片を使
用することにより、MIF1と相互作用するMEKK1ドメインが該キナーゼの調節ドメ
イン（アミノ酸284〜369）内にマッピングされた（図1を参照されたい）。

【００３３】したがって、本発明は、小分子または天然物に関するスクリーニングにおける
使用のための（例えば、MEKK/MIF1相互作用の阻害のための）、MIF1タンパク質
、ホモログ、スプライシング変異体、単点または欠失突然変異体をコードするヒ
トcDNAおよびこれらの配列にコードされるタンパク質の使用に関する。実施例に
記載のツーハイブリッド株、リン酸化によるMEKKの活性化、記載されているMIF1
活性の修飾を、本方法において用いることができる。

【００３４】また、細胞内でのJNKの活性化を修飾するために、遺伝子治療用途においてMIF
1を使用することができる（コードおよびアンチセンスの両方の分子を使用する
ことができる）。MIF1の過剰発現またはダウンレギュレーションに基づくこれら
の遺伝子治療に関連した病理学については、前記の「発明の背景」で検討されて
いる。

【００３５】また、診断および精製用途において抗MIF抗体を使用することができる。

【００３６】 MAP3K活性の調節体としての新規MAP4Kをクローニングするために、MIF1 cDNA
および誘導体を酵母スリーハイブリッドスクリーニングにおいて有効に使用する
ことができる。また、MAP4Kの阻害剤に関してスクリーニングするために、MIF1
cDNAおよび誘導体を使用することができる。

【００３７】本発明のこれらの及び他の態様、特に、MIF1遺伝子の単離、MIF1タンパク質の
発現、抗MIF1抗体の産生、MIF1のモジュレーションに関するスクリーニングアッ
セイ、MIF1/MEKK相互作用のアンタゴニストまたはアゴニストを同定するための
スクリーニングアッセイ、および特に遺伝子治療用のMIF1コード化ベクターの運
搬について、以下の節で詳しく説明する。節の見出しは、読者の便宜のために与
えられているにすぎず、いかなる点においても限定的なものとみなされるべきで
はない。

【００３８】 MIF1タンパク質をコードする遺伝子本発明は、任意の動物（特に哺乳類または鳥類、さらに詳しくはヒト）由来の
MIF1の完全長または天然に存在する形態およびそれらの任意の抗原性断片を含む
本発明のMIF1をコードする遺伝子の単離に関する。本発明で用いる「遺伝子」な
る語は、ポリペプチドをコードするヌクレオチドの集合体を意味し、cDNAおよび
ゲノムDNA核酸を含む。本発明で用いる「MIF1」はMIF1ポリペプチドを意味し、
「MIF1」は、MIF1ポリペプチドをコードする遺伝子を意味する。

【００３９】本発明では、当技術分野の通常の知識に含まれる通常の分子生物学、微生物学
および組換えDNA技術を用いることができる。そのような技術は文献中に十分に
説明されている。例えば、Sambrook, Fritsch ＆ Maniatis, Molecular Cloning
: A Laboratory Manual, 第2版 (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press,
Cold Spring Harbor, New York（本明細書中では「Sambrookら, 1989」と称さ
れる）; DNA Cloning: A Practical Approach, Vol.IおよびII（D.N. Glover編,
1985）; Oligonucleotide Synthesis（M.J. Gait編, 1984）; Nucleic Acid Hy
bridization [B.D. Hames ＆ S.J. Higgins編, (1985)]; Transcription And Tr
anslation [B.D. Hames ＆ S.J. Higgins編, (1984)]; Animal Cell Culture [R
.I. Freshney編, (1986)]; Immobilized Cell And Enzymes [IRL Press, (1986)
]; B.Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); F.M. Ausubel
ら (編), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley ＆ Sons, Inc
. (1994)を参照されたい。

【００４０】したがって、本明細書で用いる以下の用語は以下に記載の意義を有するものと
する。

【００４１】「クローニングベクター」は、別のDNAセグメントが結合していて該結合セグ
メントの複製を引き起こしうるレプリコン（例えば、プラスミド、ファージまた
はコスミド）である。「レプリコン」は、インビボにおいてDNA複製の自律的単
位として機能する（すなわち、それ自身の制御下で複製されうる）任意の遺伝的
要素（例えば、プラスミド、染色体、ウイルス）である。クローニングベクター
は、1つの細胞型における複製と別の細胞型における発現とをもたらしうる（「
シャトルベクター」）。

【００４２】「カセット」は、ベクターの特定の制限部位に挿入されうるDNAセグメントを
意味する。該DNAセグメントは、関心のあるポリペプチドをコードする。該カセ
ットおよび制限部位は、転写および翻訳に適したリーディングフレームでの該カ
セットの挿入が保証されるように設計される。

【００４３】外因性または異種DNAにより細胞が「トランスフェクト」されているのは、そ
のようなDNAが該細胞の内部に導入されている場合である。外因性または異種DNA
により細胞が「形質転換」されているのは、該トランスフェクト化DNAが表現型
の変化をもたらす場合である。その形質転換するDNAは、該細胞のゲノムを構成
する染色体DNA内に組込まれ（共有結合し）うる。

【００４４】「核酸分子」は、リボヌクレオシド（アデノシン、グアノシン、ウリジンまた
はシチジン；「RNA分子」）またはデオキシリボヌクレオシド（デオキシアデノ
シン、デオキシグアノシン、デオキシチミジンまたはデオキシシチジン；「DNA
分子」）のリン酸エステル重合体、あるいはそれらの任意のホスホエステル類似
体、例えばホスホロチオエートおよびチオエステルの一本鎖形態または二本鎖ヘ
リックスを意味する。二本鎖DNA-DNA、DNA-RNAおよびRNA-RNAヘリックスが可能
である。核酸分子、特に、DNAまたはRNA分子なる語は該分子の一次および二次構
造を指すにすぎず、それをいずれかの特定の三次形態に限定するものではない。
したがって、この語は、とりわけ、直鎖状または環状DNA分子（例えば、制限断
片）、プラスミドおよび染色体において見出される二本鎖DNAを含む。特定の二
本鎖DNA分子の構造を論ずる場合、配列は、DNAの非転写鎖に沿った5'から3'への
方向の配列（すなわち、mRNAと相同な配列を有する鎖）のみを示す標準的な慣例
に従い表されうる。「組換えDNA分子」は、分子生物学的操作を受けたDNA分子で
ある。

【００４５】核酸分子が別の核酸分子（例えば、cDNA、ゲノムDNAまたはRNA）に「ハイブリ
ダイズ」するのは、温度および溶液イオン強度の適当な条件下で該核酸分子の一
本鎖形態が、その別の核酸分子にアニーリングする場合である（Sambrookら, 前
掲を参照されたい）。温度およびイオン強度の条件は、ハイブリダイゼーション
の「ストリンジェンシー」を決定する。相同核酸に関する予備的スクリーニング
のためには、55℃のTmに対応する低いストリンジェンシーのハイブリダイゼーシ
ョン条件（例えば、ホルムアミドの不存在下の5 x SSC、0.1％ SDS、0.25％ミル
ク；または30％ホルムアミド、5 x SDS、0.5％ SDS）を用いることができる。中
等度のストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件は、より高いT_mに対応
し、例えば、40％ホルムアミドの存在下の5xまたは6x SCCである。高いストリン
ジェンシーのハイブリダイゼーション条件は、より高いTmに対応し、例えば、50
％ホルムアミド、5xまたは6x SSCである。ハイブリダイゼーションのストリンジ
ェンシーに応じた塩基間のミスマッチが可能であるが、ハイブリダイゼーション
のためには、2つの核酸が相補的配列を含有することを要する。核酸のハイブリ
ダイゼーションのための適当なストリンジェンシーは、核酸の長さおよび相補性
の度合などの当技術分野においてよく知られた変数に左右される。2つのヌクレ
オチド配列間の類似性または相同性の度合が大きくなればなるほど、それらの配
列を有する核酸ハイブリッドのTmの値は大きくなる。核酸のハイブリダイゼーシ
ョンの相対的安定性（より高いTmに対応する）は以下の順序で減少する：RNA:RN
A、DNA:RNA、DNA:DNA。100ヌクレオチド長を超えるハイブリッドに関するTmの計
算のための式が誘導されている（Sambrookら, 前掲, 9.50-0.51を参照されたい
）。より短い核酸（すなわち、オリゴヌクレオチド）とのハイブリダイゼーショ
ンでは、ミスマッチの位置がより重要となり、オリゴヌクレオチドの長さがその
特異性を決定する（Sambrookら, 前掲, 11.7-11.8を参照されたい）。好ましく
は、ハイブリダイズ可能な核酸の最低限の長さは少なくとも約10ヌクレオチド、
好ましくは少なくとも約15ヌクレオチドであり、より好ましくは、その長さは少
なくとも約20ヌクレオチドである。

【００４６】特定の実施形態においては、「標準的なハイブリダイゼーション条件」なる語
は55℃のTmを意味し、前記の条件を用いるものである。好ましい実施形態におい
ては、Tmは60℃である。より好ましい実施形態においては、Tmは65℃である。

【００４７】本発明で用いる「オリゴヌクレオチド」なる語は、MIF1をコードするゲノムDN
A分子、cDNA分子またはmRNA分子にハイブリダイズしうる、一般には少なくとも1
8ヌクレオチドの核酸を意味する。オリゴヌクレオチドは、ビオチンなどの標識
に共有的に共役している例えば³²P-ヌクレオチドで標識することができる（MIF1
ポリペプチドの標識に関しては前記考察を参照されたい）。1つの実施形態にお
いては、MIF1をコードする核酸の存在を検出するためのプローブとして、標識オ
リゴヌクレオチドを使用することができる。もう1つの実施形態においては、完
全長または断片形態のMIF1をクローニングするために、あるいはMIF1をコードす
る核酸の存在を検出するために、PCRプライマーとしてオリゴヌクレオチド（そ
れらの一方または両方が標識されていてもよい）を使用することができる。もう
1つの実施形態においては、本発明のオリゴヌクレオチドはMIF1 DNA分子と三重
鎖を形成していてもよい。一般には、オリゴヌクレオチドは、好ましくは核酸シ
ンセサイザー上で合成的に調製する。したがって、オリゴヌクレオチドは、天然
には存在しないホスホエステル類似体結合（例えば、チオエステル結合など）で
調製することができる。

【００４８】 DNA「をコードする配列（コード配列）」は、適当な調節配列の制御下に配置
された場合にインビトロまたはインビボで細胞内で転写されポリペプチドに翻訳
される二本鎖DNA配列である。コード配列の境界は、5'（アミノ）末端の開始コ
ドンと、3'（カルボキシル）末端の翻訳終結コドンとにより定められる。コード
配列には、原核性配列、真核性mRNA由来のcDNA、真核性（例えば、哺乳類）DNA
由来のゲノムDNA配列、さらには合成DNA配列が含まれうるが、これらに限定され
るものではない。コード配列を真核細胞内で発現させようとする場合には、通常
、該コード配列に対して3'側にポリアデニル化シグナルおよび転写終結配列が位
置するであろう。

【００４９】転写および翻訳制御配列は、宿主細胞内でのコード配列の発現をもたらすDNA
調節配列（例えば、プロモーター、エンハンサー、ターミネーターなど）である
。ポリアデニル化シグナルは真核細胞における制御配列である。

【００５０】「プロモーター配列」は、細胞内でRNAポリメラーゼに結合し下流（3'方向）
のコード配列の転写を開始させうるDNA調節領域である。本発明を定義する目的
においては、プロモーター配列は、その3'末端で転写開始部位と境界をなし、バ
ックグラウンドを超えて検出可能なレベルでの転写の開始に必要な最小数の塩基
または要素を含むように上流（5'方向）に伸長する。プロモーター配列内には、
転写開始部位（例えば、ヌクレアーゼS1でのマッピングにより簡便に定められる
）と、RNAポリメラーゼの結合をもたらすタンパク質結合ドメイン（コンセンサ
ス配列）とが見出されるであろう。

【００５１】 RNAポリメラーゼがコード配列をmRNAに転写し、ついでそれがトランスRNAスプ
ライシングされ（該コード配列がイントロンを含有する場合）、該コード配列に
コードされるタンパク質に翻訳される場合、該コード配列は、細胞内での転写お
よび翻訳制御配列の「制御下」にある。

【００５２】本発明で用いる「相同」なる語は、そのすべての文法形態および文字変形にお
いて、「共通の進化起源」を有するタンパク質 [スーパーファミリー（例えば、
免疫グロブリンスーパーファミリー）に由来するタンパク質を含む]間、および
異なる種に由来する相同タンパク質（例えば、ミオシン軽鎖など）間の関係を意
味する（Reeckら, 1987, Cell 50:667）。そのようなタンパク質（およびそれら
のコード遺伝子）は、それらの高い配列類似性により表されるとおりの配列相同
性を有する。

【００５３】したがって、「配列類似性」なる語は、そのすべての文法形態において、共通
の進化起源を有していても有していなくてもよい核酸またはタンパク質アミノ酸
配列間の同一性または対応の度合を意味する（Reeckら, 前掲を参照されたい）
。しかしながら、一般的な用法および本出願においては、「高度（に）」などの
副詞で修飾された場合の「相同」なる語は配列類似性を指すことがあり、一般的
な進化起源を指すものではない。

【００５４】特定の実施形態においては、2つのDNA配列は、それらのDNA配列の一定の長さ
にわたり該ヌクレオチドの少なくとも約50％（好ましくは少なくとも約75％、最
も好ましくは少なくとも約90％または95％）がマッチする場合、「実質的に相同
」または「実質的に類似」である。配列データバンクにおいて利用可能な標準的
なソフトウェアを使用して、または例えばその特定の系に関して定められたスト
リンジェントな条件下でのサザンハイブリダイゼーション実験において配列を比
較することにより、実質的に相同な配列を同定することができる。適当なハイブ
リダイゼーション条件を定めることは、当業者の技量の範囲内に含まれる。例え
ば、Maniatisら, 前掲; DNA Cloning, Vol.I＆II, 前掲; Nucleic Acid Hybridi
zation, 前掲を参照されたい。

【００５５】同様に、特定の実施形態においては、2つのアミノ酸配列は、該アミノ酸の30
％以上が同一である又は約60％以上が類似（機能的に同一）である場合、「実質
的に相同」または「実質的に類似」である。好ましくは、例えばGCG（Genetics
Computer Group, Program Manual for the GCG Package, Version 7, Madison,
Wisconsin）パイルアッププログラムを使用するアライメントにより、類似また
は相同な配列を同定する。

【００５６】本発明では、「対応」なる語は、類似性または相同性の比較対象分子と厳密な
位置が同一であるか異なるかには無関係に、類似または相同配列を表すために用
いられる。核酸またはアミノ酸配列のアライメントはスペースを含みうる。した
がって、「対応」なる語は配列類似性を指すものであり、アミノ酸残基またはヌ
クレオチド塩基の数を指すものではない。

【００５７】 MIF1をコードする遺伝子は、ゲノムDNAであるかcDNAであるかにかかわらず、
任意の起源（特に、ヒトcDNAまたはゲノムライブラリー）から単離することがで
きる。MIF1遺伝子を得るための方法は、前記のとおり、当技術分野でよく知られ
ている（例えば、Sambrookら, 1989, 前掲を参照されたい）。

【００５８】したがって、任意の動物細胞が、MIF1遺伝子の分子クローニングのための核酸
源として潜在的に有用である。該DNAは、当技術分野で公知の標準的な方法によ
りクローン化DNA（例えば、DNA「ライブラリー」）から得ることができる。好ま
しくは、該タンパク質を高レベルで発現する組織（例えば、心臓、膵臓および胎
盤cDNAが挙げられる。ならなら、これらは、MIF1の最高レベルの発現を示す細胞
だからである）から調製したcDNAライブラリーから、化学合成により、cDNAクロ
ーニングにより、または所望の細胞から精製したゲノムDNAもしくはその断片の
クローニングにより、該DNAを得る（例えば、Sambrookら, 1989, 前掲; Glover,
D.M. (編), 1985, DNA Cloning: A Practical Approach, MRL Press, Ltd., Ox
ford, U.K Vol. I, IIを参照されたい）。ゲノムDNA由来のクローンは、コード
領域に加えて調節性およびイントロンDNA領域を含有しうる。cDNA由来のクロー
ンはイントロン配列を含有しないであろう。特定の実施形態においては、Hela細
胞ライブラリーからMIF1を単離した。該遺伝子は、その起源には無関係に、該遺
伝子の増殖に適したベクター内に分子的にクローニングされるべきである。

【００５９】該DNA断片が得られたら、所望のMIF1遺伝子を含有する特定のDNA断片の同定を
多数の方法で行うことができる。例えば、標識プローブに対する核酸ハイブリダ
イゼーションにより、DNA断片をスクリーニングすることができる（Bentonおよ
びDavis, 1977, Science 196:180; GrunsteinおよびHogness, 1975, Proc. Natl
. Acad. Sci. U.S.A. 72:3961）。該プローブに対する相当な相同性を有するDNA
断片がハイブリダイズするであろう。前記のとおり、相同性が大きいほど、より
ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件を用いることができる。特定の
実施形態においては、MIF1遺伝子のmRNAスプライシング変異体を同定するために
ノーザンハイブリダイゼーション条件を用いる。

【００６０】該遺伝子の特性に基づき、さらなる選択を行うことができる（例えば、該遺伝
子が、本明細書に開示するMIFタンパク質の等電点電気泳動性アミノ酸組成また
は部分アミノ酸配列を有するタンパク質産物をコードする場合）。したがって、
該遺伝子の発現産物の物理的、化学的または免疫学的特性に基づくアッセイによ
り、該遺伝子の存在を検出することができる。例えば、cDNAクローン、または適
当なmRNAをハイブリッド選択するDNAクローン（例えば、MIF1について知られて
いるものと類似または同一の電気泳動度、等電点電気泳動または非平衡pHゲル電
気泳動挙動、タンパク質分解消化地図または抗原特性を有するタンパク質を産生
するもの）を選択することができる。特定の実施形態においては、発現されたタ
ンパク質は、MIF1のアミノ酸16〜28に対して産生したポリクローナル抗体により
認識される。

【００６１】本発明はまた、MIF1および他の種に由来するそのホモログと同じまたは相同な
機能的活性を有する、本発明のMIF1の対立遺伝子変異体、スプライシング変異体
、類似性および誘導体をコードする遺伝子（例えば、cDNA）に関する。MIF1に関
連した誘導体および類似体の製造および使用は、本発明の範囲内である。特定の
実施形態においては、該誘導体または類似体は機能的に活性である（すなわち、
本発明の完全長の野生型MIF1に関連した1以上の機能的活性を示しうる）。特に
、そのような類似体または誘導体はMEKK活性を調節しうる。あるいは、対立遺伝
子変異体は、MEKK活性をMIF1が調節するのを不能にする突然変異を含みうる。

【００６２】機能的に等価な分子を与える置換、付加または欠失により、コードする核酸配
列を変化させることにより、MIF1誘導体を製造することができる。好ましくは、
天然MIF1と比較して増強または増加した機能活性を有する誘導体を製造する。

【００６３】ヌクレオチドコード配列の縮重によりMIF1遺伝子と実質的に同じアミノ酸配列
（単一のアミノ酸変異体を含有するアミノ酸配列を含む）をコードする他のDNA
配列を、本発明の実施において使用することができる。これらには、対立遺伝子
、他の種に由来する相同遺伝子、およびMIF1遺伝子の全部または一部を含むヌク
レオチド配列（サイレントな変化をもたらすように該配列内の同一アミノ酸残基
をコードする異なるコドンの置換により改変されたもの）が含まれるが、これら
に限定されるものではない。同様に、本発明のMIF1誘導体には、同類アミノ酸置
換を与えるように機能的に等価なアミノ酸残基により該配列内の残基が置換され
ている改変した配列を含むMIF1タンパク質のアミノ酸配列の全部または一部を一
次アミノ酸配列として含有するものが含まれるが、これらに限定されるものでは
ない。例えば、該配列内の1以上のアミノ酸残基を、サイレントな変化をもたら
す機能的等価体として作用する同様の極性の別のアミノ酸により置換することが
できる。該配列内のアミノ酸に代わるアミノ酸は、該アミノ酸が属するクラスの
他のメンバーから選ばれうる。例えば、非極性（疎水性）アミノ酸には、アラニ
ン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプト
ファンおよびメチオニンが含まれる。芳香環構造を含有するアミノ酸としては、
フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンが挙げられる。極性中性アミ
ノ酸には、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギ
ンおよびグルタミンが含まれる。正に荷電した（塩基性）アミノ酸には、アルギ
ニン、リシンおよびヒスチジンが含まれる。負に荷電した（酸性）アミノ酸には
、アスパラギン酸およびグルタミン酸が含まれる。そのような改変は、ポリアク
リルアミドゲル電気泳動により測定される見掛け分子量にも等電点にも影響を及
ぼさないと予想される。

【００６４】特に好ましい置換には以下のものが挙げられる：・ArgからLys、およびその逆（これらの場合には、正電荷が維持されうる）、・AspからGlu、およびその逆（これらの場合には、負電荷が維持されうる）、・ThrからSer（この場合には、遊離-OHが維持されうる）、および・AsnからGln（この場合には、遊離CONH₂が維持されうる）。

【００６５】また、特に好ましい特性を有するアミノ酸で置換するために、アミノ酸の置換
を導入することができる。例えば、別のCysとのジスルフィド架橋の潜在的部位
に、Cysを導入することができる。Hisを、特に「触媒性」である部位として導入
することができる（すなわち、Hisは酸または塩基として作用することが可能で
あり、生化学的触媒作用における最も一般的なアミノ酸である）。Proは、タン
パク質構造内でβターンを誘導する特に平面的な構造を有するため、Proを導入
することができる。

【００６６】本発明のMIF1誘導体および類似体をコードする遺伝子は、当技術分野において
公知の種々の方法により製造することができる。それらの製造をもたらす操作は
遺伝子またはタンパク質レベルで行うことができる。例えば、当技術分野におい
て公知の多数の方法（Sambrookら, 1989, 前掲）のいずれかにより、該クローン
化MIF1遺伝子配列を修飾することができる。該配列を、インビトロで、適当な部
位において制限エンドヌクレアーゼで切断し、ついで、必要に応じて更に酵素に
よる修飾に付し、単離し、連結することができる。MIF1の誘導体または類似体を
コードする遺伝子の製造においては、修飾された遺伝子が、所望の活性をコード
する遺伝子領域内において、翻訳終結シグナルにより遮断されることなくMIF1遺
伝子と同じ翻訳リーディングフレーム内に依然として存在することが保証される
ように注意すべきである。

【００６７】また、MIF1をコードする核酸配列をインビトロまたはインビボで突然変異させ
て、翻訳、開始および／または終結配列を生成させ及び／又は破壊し、またはコ
ード領域内に変異を生成させ、および／または新たな制限エンドヌクレアーゼ部
位を形成させ、または既存の該部位を破壊して、さらなるインビトロ修飾を促進
させることができる。好ましくは、そのような突然変異が、突然変異したMIF1遺
伝子産物の機能的活性を増強する。インビトロ部位特異的突然変異誘発（Hutchi
nson, C.ら, 1978, J. Biol. Chem. 253:6551; ZollerおよびSmith, 1984, DNA
3:479-488; Oliphantら, 1986, Gene 44:177; Hutchinsonら, Proc. Natl. Acad
. Sci. U.S.A. 83:710）、TAB（登録商標）リンカー（Pharmacia）の使用などを
含む（これらに限定されるものではない）当技術分野において公知の任意の突然
変異誘発技術を用いることができる。部位特異的突然変異誘発には、PCR技術が
好ましい（Higuchi, 1989, “Using PCR to Engineer DNA”, PCR Technology:
Principles and Applications for DNA Amplification, H. Erlich編, Stockton
Press, 第6章, pp.61-70を参照されたい）。

【００６８】ついで、同定され単離された遺伝子を適当なクローニングベクター内に挿入す
ることができる。当技術分野で公知の多数のベクター-宿主系を使用することが
できる。考えられうるベクターには、プラスミドまたは修飾ウイルスが含まれる
が、これらに限定されるものではない。ただし、該ベクター系は、用いる宿主細
胞に対して和合性でなければならない。ベクターの具体例には、大腸菌（E. col
i）、バクテリオファージ、例えばラムダ誘導体、またはプラスミド、例えばpBR
322誘導体もしくはpUCプラスミド誘導体、例えばpGEXベクター、pmal-c、pFLAG
などが含まれるが、これらに限定されるものではない。クローニングベクター内
への挿入は、例えば、相補的な付着末端を有するクローニングベクター内に該DN
A断片を連結させることにより達成されうる。しかしながら、該DNAを断片化する
ために使用した相補的制限部位が該クローニングベクター内に存在しない場合に
は、該DNA分子の末端を酵素的に修飾することができる。あるいは、該DNA末端上
にヌクレオチド配列（リンカー）を連結させることにより、所望の任意の部位を
得ることができる。これらの連結リンカーは、制限エンドヌクレアーゼ認識配列
をコードする特定の化学合成オリゴヌクレオチドを含んでいてもよい。該遺伝子
配列の多数のコピーが産生されるよう、形質転換、トランスフェクション、感染
、エレクトロポレーションなどにより、組換え分子を宿主細胞内に導入すること
ができる。好ましくは、クローニング細胞（例えば、大腸菌（E. coli））の増
殖と、所望により適当な発現細胞系内への後続の挿入のための簡便な精製とをも
たらすシャトルベクタープラスミド上に、該クローン化遺伝子を含有させる。例
えば、大腸菌（E. coli）プラスミド由来の配列を酵母2mプラスミド由来の配列
と連結させることによりシャトルベクター（これは、2以上の生物型内で複製さ
れうるベクターである）を調製して、大腸菌（E. coli）およびサッカロミセス
・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）の両方における複製をもたらすこと
が可能である。

【００６９】 MIF1ポリペプチドの発現 MIF1またはその抗原断片、誘導体もしくは類似体、または機能的に活性なその
誘導体（キメラタンパク質を含む）をコードするヌクレオチド配列を、適当な発
現ベクター（すなわち、挿入されたタンパク質コード配列の転写および翻訳に必
要な要素を含有するベクター）内に挿入することができる。本発明においては、
そのような要素を「プロモーター」と称することにする。したがって、本発明の
MIF1をコードする核酸は、本発明の発現ベクター内でプロモーターに作動的に結
合している。cDNA配列およびゲノム配列は共に、そのような調節配列の制御下で
クローニングされ発現されうる。また、発現ベクターは、好ましくは、複製起点
を含む。

【００７０】必要な転写および翻訳シグナルを、組換え発現ベクター上に設けることができ
る。あるいは、それらは、MIF1をコードする天然遺伝子および／またはそのフラ
ンキング領域により供給されうる。

【００７１】潜在的な宿主-ベクター系には、ウイルス（例えば、ワクシニアウイルス、ア
デノウイルスなど）に感染した哺乳類細胞系、ウイルス（例えば、バキュロウイ
ルス）に感染した昆虫細胞系、酵母ベクターを含有する酵母などの微生物、また
はバクテリオファージDNA、プラスミドDNAもしくはコスミドDNAで形質転換され
た細菌が含まれるが、これらに限定されるものではない。ベクターの発現要素は
、それらの強度および特異性の点で様々である。使用する宿主-ベクター系に応
じて、多数の適当な転写および翻訳要素のいずれかを使用することができる。

【００７２】本発明の組換えMIF1タンパク質またはその機能的断片、誘導体、キメラ構築物
もしくは類似体は、組換えによる該コード配列の組込みの後、染色体上で発現さ
れうる。この場合、高レベルの安定な遺伝子発現を達成するために、多数の増幅
系のいずれかを用いることができる（Sambrookら, 1989, 前掲を参照されたい）
。

【００７３】 MIF1をコードする核酸を含む組換えベクターが導入された細胞を、該細胞によ
るMIF1の発現がもたらされる条件下、適当な細胞培養培地内で培養する。

【００７４】クローニングベクター内へのDNA断片の挿入のための既に記載されている方法
のいずれかを用いて、該タンパク質コード配列および適当な転写／翻訳制御シグ
ナルよりなる遺伝子を含有する発現ベクターを構築することができる。これらの
方法には、インビトロ組換えDNAおよび合成技術ならびにインビボ組換え（遺伝
的組換え）が含まれうる。

【００７５】 MIF1タンパク質の発現は、当技術分野で公知の任意のプロモーター／エンハン
サー要素により制御されうるが、これらの調節要素は、発現用に選択した宿主内
で機能的でなければならない。MIF1遺伝子発現を制御するために使用しうるプロ
モーターには、SV40初期プロモーター領域（BenoistおよびChambon, 1981, Natu
re 290:304-410）、ラウス肉腫ウイルスの3'長末端反復配列内に含まれるプロモ
ーター（Yamamotoら, 1980, Cell 22:787-797）、ヘルペスチミジンキナーゼプ
ロモーター（Wagnerら, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:1441-1445）
、メタロチオネイン遺伝子の調節配列（Brinsterら, 1982, Nature 296:39-42）
；βラクタマーゼプロモーター（Villa-Kamaroffら, 1978, Proc. Natl. Acad.
Sci. U.S.A. 75:3727-3731）またはtacプロモーター（DeBoerら, 1983, Proc. N
atl. Acad. Sci. U.S.A. 80:21-25）などの原核性発現ベクター（“Useful prot
eins from recombinant bacteria”, Scientific American, 1980, 242:74-94も
参照されたい）；酵母または他の真菌由来のプロモーター要素、例えばGal4プロ
モーター、ADC（アルコールデヒドロゲナーゼ）プロモーター、PGK（ホスホグリ
セロールキナーゼ）プロモーター、アルカリホスファターゼプロモーター；およ
び組織特異性を示しトランスジェニック動物において用いられている動物転写制
御領域；膵臓腺房細胞内で活性なエラスターゼI遺伝子制御領域（Swiftら, 1984
, Cell 38:639-646; Ornitzら, 1986, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol.
50:399-409; MacDonald, 1987, Hepatology 7:425-515）；膵臓β細胞内で活性
なインスリン遺伝子制御領域（Hanahan, 1985, Nature 315:115-122）、リンパ
球様細胞内で活性な免疫グロブリン遺伝子制御領域（Grosschedlら, 1984, Cell
38:647-658; Adamesら, 1985, Nature 318:533-538; Alexanderら, 1987, Mol.
Cell. Biol. 7:1436-1444）、精巣、乳、リンパ様およびマスト細胞内で活性な
マウス乳癌ウイルス制御領域（Lederら, 1986, Cell 45:485-495）、肝臓内で活
性なアルブミン遺伝子制御領域（Pinkertら, 1987, Genes and Devel. 1:268-27
6）、肝臓内で活性なαフェトプロテイン遺伝子制御領域（Krumlaufら, 1985, M
ol. Cell. Biol. 5:1639-1648; Hammerら, 1987, Science 235:53-58）、肝臓内
で活性なα1-アンチトリプシン遺伝子制御領域（Kelseyら, 1987, Genes and De
vel. 1:161-171）、骨髄性細胞内で活性なβグロビン遺伝子制御領域（Mogramら
, 1985, Nature 315:338-340; Kolliasら, 1986, Cell 46:89-94）、脳内の希突
起神経膠細胞内で活性なミエリン塩基性タンパク質遺伝子制御領域（Readheadら
, 1987, Cell 48:703-712）、骨格筋内で活性なミオシン軽鎖-2遺伝子制御領域
（Sani, 1985, Nature 314:283-286）および視床下部内で活性な性腺刺激ホルモ
ン遺伝子制御領域（Masonら, 1986, Science 234:1372-1378）が含まれるが、こ
れらに限定されるものではない。

【００７６】本発明のMIF1をコードする核酸を含有する発現ベクターは、以下の5つの一般
的アプローチにより同定することができる：（a）所望のプラスミドDNAまたは特
異的mRNAのPCR増幅、（b）核酸ハイブリダイゼーション、（c）選択マーカー遺
伝子機能の存在または不存在、（d）適当な制限エンドヌクレアーゼでの分析、
および（e）挿入された配列の発現。第1のアプローチにおいては、増幅産物の検
出がもたらされるよう、PCRにより該核酸を増幅することができる。第2のアプロ
ーチにおいては、発現ベクター内に挿入された外来遺伝子の存在を、挿入された
マーカー遺伝子と相同な配列を含むプローブを使用する核酸ハイブリダイゼーシ
ョンにより検出することができる。第3のアプローチにおいては、ベクター内へ
の外来遺伝子の挿入により生じる或る「選択マーカー」遺伝子機能（例えば、β
ガラクトシダーゼ活性、チミジンキナーゼ活性、抗生物質耐性、形質転換表現型
、バキュロウイルス内の封入体形成など）の存在または不存在に基づき、組換え
ベクター／宿主系を同定し選択することができる。もう1つの例では、MIF1をコ
ードする核酸を該ベクターの「選択マーカー」遺伝子配列内に挿入する場合には
、該MIF1インサートを含有する組換え体を、MIF1遺伝子機能の不存在により同定
することができる。第4のアプローチにおいては、適当な制限酵素での消化によ
り、組換え発現ベクターを同定する。第5のアプローチにおいては、発現された
タンパク質が、機能的に活性なコンホメーションを取る場合には、該組換え体に
より発現された遺伝子産物の活性、生化学的または免疫学的特性に関してアッセ
イすることにより、組換え発現ベクターを同定することができる。

【００７７】本発明のDNA配列を発現させる場合には、多種多様な宿主／発現ベクターの組
合せを使用することができる。例えば、有用な発現ベクターは、染色体、非染色
体および合成DNA配列のセグメントよりなるものでありうる。適当なベクターに
は、SV40の誘導体および公知細菌プラスミド、例えば大腸菌（E. coli）プラス
ミドcol E1、pCR1、pBR322、pMal-C2、pET、pGEX（Smithら, 1988, Gene 67:31-
40）、pMB9およびそれらの誘導体、RP4などのプラスミド；ファージDNAS、例え
ばファージ1の多数の誘導体、例えばNM989および他のファージDNA、例えばM13お
よび繊維状一本鎖ファージDNA；酵母プラスミド、例えば2mプラスミドまたはそ
の誘導体；真核細胞において有用なベクター、例えば昆虫または哺乳類細胞にお
いて有用なベクター；プラスミドおよびファージDNAの組合せに由来するベクタ
ー、例えばファージDNAまたは他の発現制御配列を利用するように修飾されたプ
ラスミドなどが含まれる。

【００７８】例えば、バキュロウイルス発現系においては、非融合トランスファーベクター [例えば、pVL941（BamH1クローニング部位; Summers）、pVL1393（BamH1、SmaI
、XbaI、EcoR1、NotI、XmaIII、BglIIおよびPsIクローニング部位; Invitrogen
）、pVL1392（BglII、PstI、NotI、XmaIII、EcoRI、XbaI、SmaIおよびBamH1クロ
ーニング部位; SummersおよびInvitrogen）およびpBlueBacIII（BamH1、BglII、
PstI、NcoIおよびHindIIIクローニング部位; ブルー／ホワイト組換え体スクリ
ーニングが可能; Invitrogen）などが挙げられるが、これらに限定されるもので
はない] および融合トランスファーベクター [例えば、pAc700（BamH1およびKpn
Iクローニング部位; 該BamH1認識部位は開始コドンで始まる; Summers）、pAc70
1およびpAc702（異なるリーディングフレームを有する以外はpAc700と同じ）、p
Ac360（ポリヘドリン開始コドンの36塩基対下流にBamH1クローニング部位; Invi
trogen (195)）およびpBlueBacHisA、B、C（異なる3つのリーディングフレーム;
BamH1、BglII、PstI、NcoIおよびHindIIIクローニング部位、ProBond精製用のN
末端ペプチドを有し、プラークのブルー／ホワイト組換え体スクリーニングが可
能; Invitrogen(220)] の両方を使用することができる。

【００７９】本発明での使用が意図される哺乳類発現ベクターには、ジヒドロ葉酸レダクタ
ーゼ（DHFR）プロモーターなどの誘導プロモーターを有するベクター、例えば、
DHFR発現ベクターまたはDHFR/メトトレキセート共発現ベクター、例えばpED（Ps
tU、SalI、SbaI、SmaIおよびEcoRIクローニング部位; 該ベクターは、クローン
化遺伝子とDHFRとの両方を発現する）を有する任意の発現ベクターが含まれる（
Kaufman, Current Protocols in Molecular Biology, 16.12 (1991)を参照され
たい）。あるいは、グルタミンシンテターゼ／メチオニンスルホキシミン共発現
ベクター、例えば、pEE14（HindIII、XbaI、SmaI、SbaI、EcoRIおよびBclIクロ
ーニング部位; 該ベクターは、グルタミンシンターゼおよびクローン化遺伝子を
発現する; Celltech）を使用することができる。もう1つの実施形態においては
、エプスタイン・バーウイルス（EBV）の制御下でエピソーム発現を指令するベ
クター、例えばpREP4 [BamH1、SfiI、XhoI、NotI、NheI、HindIII、NheI、PvuII
およびKpnIクローニング部位、構成的ラウス肉腫ウイルス長末端反復配列（RSV-
LTR）プロモーター、ハイグロマイシン選択マーカー; Invitrogen]、pCEP4 [Bam
H1、SfiI、XhoI、NotI、NheI、HindIII、NheI、PvuIIおよびKpnIクローニング部
位、構成的ヒトサイトメガロウイルス（hCMV）前初期遺伝子、ハイグロマイシン
選択マーカー; Invitrogen]、pMEP4（KpnI、PvuI、NheI、HindIII、NotI、XhoI
、SfiI、BamH1クローニング部位、誘導性メタロチオネインIIa遺伝子プロモータ
ー、ハイグロマイシン選択マーカー; Invitrogen）、pREP8（BamH1、XhoI、NotI
、HindIII、NheIおよびKpnIクローニング部位、RSV-LTRプロモーター、ヒスチジ
ノール選択マーカー; Invitrogen）、pREP9（KpnI、NheI、HindII、NotI、XhoI
、SfiIおよびBamHIクローニング部位、RSV-LTRプロモーター、G418選択マーカー
; Invitrogen）およびpEBVHis（RSV-LTRプロモーター、ハイグロマイシン選択マ
ーカー、ProBond樹脂により精製可能でありエンテロキナーゼにより切断されるN
末端ペプチド; Invitrogen）を使用することができる。本発明で使用する選択可
能な哺乳類発現ベクターには、pRc/CMV（HindIII、BstXI、NotI、SbaIおよびApa
Iクローニング部位; G418選択; Invitrogen）、pRc/RSV（HindIII、SpeI、BstXI
、NotI、XbaIクローニング部位、G418選択; Invitrogen）などが含まれる。本発
明で使用するワクシニアウイルス哺乳類発現ベクター（Kaufman, 1991, 前掲を
参照されたい）には、pSC11（SmaIクローニング部位、TK-およびb-gal選択）、p
MJ601（SalI、SmaI、AflI、NarI、BspMII、BamHI、ApaI、NheI、SacII、KpnIお
よびHindIIIクローニング部位; TK-およびb-gal選択）およびpTKgptF1S（EcoRI
、PstI、SalI、AccI、HindII、SbaI、BamHIおよびHpaクローニング部位、TKまた
はXPRT選択）が含まれるが、これらに限定されるものではない。

【００８０】また、本発明においては、MIF1を発現させるために酵母発現系を使用すること
ができる。例えば、2例だけを挙げると、非融合pYES2ベクター（XbaI、SphI、Sh
oI、NotI、GstXI、EcoRI、BstXI、BamH1、SacI、Kpn1およびHindIIIクローニン
グ部位; Invitrogen）または融合pYESHisA、B、C（XbaI、SphI、ShoI、NotI、Bs
tXI、EcoRI、BamHI、SacI、KpnIおよびHindIIIクローニング部位、ProBond樹脂
で精製されエンテロキナーゼで切断されるN末端ペプチド; Invitrogen）を、本
発明に従い使用することができる。

【００８１】特定の組換えDNA分子を同定し単離したら、当技術分野で公知のいくつかの方
法を用いてそれを増殖させることができる。適当な宿主系および増殖条件を確立
したら、組換え発現ベクターを増殖させ、大量生産することができる。既に説明
したとおり、使用しうる発現ベクターには、少数ながら挙げると以下のベクター
またはそれらの誘導体が含まれるが、これらに限定されるものではない：ヒトま
たは動物ウイルス、例えばワクシニアウイルスまたはアデノウイルス；昆虫ウイ
ルス、例えばバキュロウイルス；酵母ベクター；バクテリオファージベクター（
例えば、ラムダ）ならびにプラスミドおよびコスミドDNAベクター。

【００８２】また、挿入された配列の発現を、所望の特異的様態でモジュレーションし又は
該遺伝子産物を修飾しプロセシングする宿主細胞系を選択することができる。異
なる宿主細胞は、それらに特徴的かつ特異的な、タンパク質の翻訳および翻訳後
プロセシングならびに修飾のメカニズムを有する。発現された外来タンパク質の
所望の修飾およびプロセシングが保証されるよう、適当な細胞系または宿主系を
選択することができる。酵母内での発現は、生物学的に活性な産物を産生しうる
。真核細胞内での発現は、「天然」のフォールディングの可能性を増大させうる
。また、哺乳類細胞内での発現は、MIF1活性を再生または構成するための手段を
提供しうる。さらに、異なるベクター／宿主発現系は、異なる程度で、タンパク
質分解切断などのプロセシング反応に影響を及ぼしうる。

【００８３】ベクターは、当技術分野で公知の方法 [例えば、トランスフェクション、エレ
クトロポレーション、マイクロインジェクション、トランスダクション、細胞融
合、DEAEデキストラン、リン酸カルシウム沈殿、リポフェクション（リソソーム
融合）、遺伝子銃の使用またはDNAベクター輸送体（例えば、Wuら, 1992, J Bio
l. Chem. 267:963-967; WuおよびWu, 1988, J. Biol. Chem. 263:14621-14624;
1990年3月15日付け出願のHartmutら, カナダ国特許出願第2,012,311号を参照さ
れたい）] により、所望の宿主細胞内に導入される。

【００８４】培養流体を集め、例えば界面活性剤での処理、および所望により超音波処理ま
たは他の機械的処理（前記のとおり）により封入体を可溶化することにより、該
タンパク質の可溶性形態を得ることができる。可溶化された又は可溶性のタンパ
ク質は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE）、等電点電気泳動、2次元ゲ
ル電気泳動、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、アフィニティー、イム
ノアフィニティーおよびサイジングカラムクロマトグラフィー）、遠心分離、溶
解度の差、免疫沈降などの種々の技術を用いて、あるいはタンパク質の精製のた
めの他の任意の標準的技術により、単離することができる。

【００８５】 MIF1に対する抗体本発明では、組換え的に又は化学合成により製造したMIF1ポリペプチドおよび
その断片または他の誘導体または類似体（融合タンパク質を含む）を抗原または
免疫原として使用して、該MIF1ポリペプチドを認識する抗体を産生させることが
できる。ある分子が、免疫グロブリン（抗体）またはT細胞抗原受容体などの免
疫系の抗原認識分子と特異的に相互作用しうる場合、該分子は「抗原性」である
。抗原性ポリペプチドは、少なくとも約5個、好ましくは、少なくとも約10個の
アミノ酸を含有する。分子の抗原性部分は、抗体またはT細胞受容体の認識に関
して免疫優性な部分でありうる。あるいは、それは、抗原性部分を免疫化用担体
分子と共役させることにより該分子に対する抗体の産生に使用された部分であり
うる。抗原性分子は、それ自体が免疫原性である（すなわち、担体無しで免疫応
答を惹起しうる）必要はない。

【００８６】そのような抗体には、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、一本鎖、Fa
bフラグメントおよびFab発現ライブラリーが含まれるが、これらに限定されるも
のではない。本発明の抗MIF1抗体は交差反応性でありうる。例えば、それらは、
異なる種に由来するMIF1を認識しうる。ポリクローナル抗体では、交差反応性と
なる可能性が、より高い。あるいは、本発明の抗体は、単一のMIF1形態（例えば
、マウスMIF1）に特異的でありうる。好ましくは、そのような抗体はヒトMIF1に
特異的である。

【００８７】当技術分野で公知の種々の方法を、MIF1ポリペプチドまたはその誘導体もしく
は類似体に対するポリクローナル抗体の製造に用いることができる。抗体の製造
のためには、MIF1ポリペプチドまたはその誘導体（例えば、断片または融合タン
パク質）の注射により、種々の宿主動物（ウサギ、マウス、ラット、ヒツジ、ヤ
ギなどが含まれるが、これらに限定されるものではない）を免疫することができ
る。1つの実施形態においては、MIF1ポリペプチドまたはその断片を免疫原性担
体（例えば、ウシ血清アルブミン（BSA）またはキーホールリンペットヘモシア
ニン（KLH））にコンジュゲートさせることができる。免疫応答を増強するため
に、宿主種に応じて種々のアジュバント[フロイント（完全および不完全）、無
機質ゲル、例えば水酸化アルミニウム、界面活性物質、例えばリゾレシチン、プ
ルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油性乳剤、キーホールリンペ
ットヘモシアニン、ジニトロフェノールおよび潜在的に有用なヒトアジュバント
、例えばBCG（bacille Calmette-Guerin）およびコリネバクテリウム・パルブム
（Corynebacterium parvum）が含まれるが、これらに限定されるものではない]
を使用することができる。

【００８８】 MIF1ポリペプチドまたはその断片、類似体もしくは誘導体に対するモノクロー
ナル抗体の製造のためには、培養内の連続的継代細胞系による抗体分子の産生を
もたらす任意の技術を用いることができる。これらには、KohlerおよびMilstein
[Nature 256:495-497 (1975)]により最初に開発されたハイブリドーマ技術、ト
リオーマ技術、ヒトB細胞ハイブリドーマ技術 [Kozborら, Immunology Today 4:
72 (1983); Coteら, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80:2026-2030 (1983)]、
およびヒトモノクローナル抗体を産生させるためのEBV-ハイブリドーマ技術 [Co
leら, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp.7
7-96 (1985)]が含まれるが、これらに限定されるものではない。本発明の追加的
な実施形態においては、モノクローナル抗体を無菌動物において製造することが
できる [1989年12月28日付け公開の国際特許公開WO 89/12690]。実際、本発明で
は、MIF1ポリペプチドに特異的なマウス抗体分子に由来する遺伝子と適当な生物
活性のヒト抗体分子に由来する遺伝子とをスプライシングさせることによる「キ
メラ抗体」の製造用に開発された技術 [Morrisonら, J. Bacteriol. 159:870 (1
984); Neubergerら, Nature 312:604-608 (1984); Takedaら, Nature 314:452-4
54 (1985)]を用いることができる。そのような抗体は本発明の範囲内である。そ
のようなヒトまたはヒト化キメラ抗体は、ヒトの疾患または障害（後記）の治療
での使用に好ましい。なぜなら、該ヒトまたはヒト化抗体は、異種抗体に比べて
、免疫応答（特に、アレルギー応答）自体を誘導する可能性がはるかに低いから
である。

【００８９】本発明では、一本鎖Fv（scFv）抗体の製造に関して記載されている技術 [Hust
onの米国特許第5,476,786号および第5,132,405号; 米国特許第4,946,778号]を、
MIF1ポリペプチド特異的一本鎖抗体の製造に応用することができる。本発明の追
加的な実施形態は、MIF1ポリペプチドまたはその誘導体または類似体に対する所
望の特異性を有するモノクローナルFabフラグメント（断片）の迅速かつ簡便な
同定を可能にするFab発現ライブラリーの構築に関して記載されている技術 [Hus
eら, Science 246:1275-1281 (1989)]を用いる。

【００９０】該抗体分子のイディオタイプを含有する抗体フラグメントを、公知技術により
産生させることができる。例えば、そのようなフラグメントには、該抗体分子の
ペプシン消化により産生されうるF(ab')₂フラグメント；F(ab')₂フラグメントの
ジスルフィド架橋を還元することにより産生されうるFab'フラグメント；および
該抗体分子をパパインおよび還元剤で処理することにより産生されうるFabフラ
グメントが含まれるが、これらに限定されるものではない。

【００９１】抗体の製造においては、当技術分野で公知の技術、例えばラジオイムノアッセ
イ、ELISA（酵素結合免疫吸着アッセイ）、「サンドウィッチ」イムノアッセイ
、免疫放射測定アッセイ、ゲル内拡散沈降素反応、免疫拡散アッセイ、in situ
イムノアッセイ（例えば金コロイド、酵素または放射性同位体標識を使用するも
の）、ウエスタンブロット、沈降反応、凝集アッセイ（例えば、ゲル凝集アッセ
イ、血球凝集アッセイ）、補体結合アッセイ、免疫蛍光アッセイ、プロテインA
アッセイおよび免疫電気泳動アッセイなどにより、所望の抗体に関するスクリー
ニングを行うことができる。1つの実施形態においては、一次抗体上の標識を検
出することにより、抗体結合を検出する。もう1つの実施形態においては、一次
抗体への二次抗体または試薬の結合を検出することにより、一次抗体を検出する
。さらにもう1つの実施形態においては、二次抗体を標識する。イムノアッセイ
における結合を検出するための多数の手段が当技術分野で公知であり、本発明の
範囲内に含まれる。例えば、MIF1ポリペプチドの特異的エピトープを認識する抗
体を選択するために、そのようなエピトープを含有するMIF1ポリペプチド断片に
結合する産物に関して、産生したハイブリドーマをアッセイすることができる。
特定の動物種由来のMIF1ポリペプチドに特異的な抗体を選択する場合には、その
動物種の細胞により発現された又は該細胞から単離されたMIF1ポリペプチドとの
陽性結合に基づいて、選択を行うことができる。

【００９２】前記の抗体は、MIF1ポリペプチドの局在位置決定および活性に関する当技術分
野で公知の方法（例えば、前記の又は当技術分野で公知の検出技術のいずれかを
用いるウエスタンブロット法、MIF1ポリペプチドのin situでのイメージング、
適当な生理的サンプル中のそのレベルの測定などのための方法）において使用す
ることができる。

【００９３】特定の実施形態においては、MIF1ポリペプチドの活性を作動または拮抗する抗
体を産生させることができる。そのような抗体は、リガンドを同定するための後
記アッセイを用いて試験することができる。特に、そのような抗体は、細胞内で
発現されるscFv抗体であってもよい。

【００９４】スクリーニングアッセイ本発明のMIF1をコードする遺伝子の同定および単離は、天然源から単離可能な
ものより大量のMIF1の発現をもたらし、あるいは、細胞のトランスフェクション
または形質転換後に発現されるMIF1の活性を示すように特別に操作された指示細
胞内でのMIF1の発現をもたらす。したがって、MIF1ポリペプチドの構造に基づく
アゴニストおよびアンタゴニストの論理的設計に加えて、本発明は、当技術分野
において公知の種々のスクリーニングアッセイを用いてMIF1の特異的リガンドを
同定するためのもう1つの方法を意図する。

【００９５】 MIF1のアゴニストまたはアンタゴニストに関してスクリーニングするために、
あるいはMIF1/MEKK1結合のアンタゴニストに関してスクリーニングするために、
当技術分野で公知の任意のスクリーニング技術を用いることができる。

【００９６】本発明は、小分子リガンドまたはリガンド類似体および模擬体に関するスクリ
ーニング、ならびにインビボにおいてMIF1に結合しMIF1の活性を作動または拮抗
する天然リガンドに関するスクリーニングを意図する。例えば、本発明のアッセ
イを用いて、MIF1活性を作動または拮抗する分子に関して天然物ライブラリーを
スクリーニングすることができる。

【００９７】 MIF1活性を作動または拮抗する及び／又はMIF1/MEKK相互作用をモジュレーシ
ョンする分子または化合物は、細胞アポトーシスの調節解除を伴う病理または他
の病理（例えば、炎症および喘息、免疫抑制、心臓虚血または肥大、骨髄形成異
常症候群、神経変性、肝臓変性障害、自己免疫疾患、ウイルス感染症、エイズ、
血管新生障害に関連した病理、慢性関節リウマチ、創傷治癒不全、アテローム動
脈硬化症、糖尿病性網膜症、カポジ肉腫、乾癬など）の予防および／または治療
のための新たな立脚点となりうる。

【００９８】この点に関して、本発明はまた、MIF1活性を作動または拮抗する及び／又はMI
F1/MEKK相互作用をモジュレーションする分子または化合物の治療的に有効な量
を投与することを含んでなる、MIF1活性を抑制または活性化することを要する又
はMEKK活性を調節することを要する個体の治療方法を提供する。本発明は、医薬
の製造のための、そのような分子または化合物の使用を提供する。

【００９９】 MIF1の一次配列、および公知機能を有するタンパク質とその配列との類似性の
知見は、該タンパク質のインヒビターまたはアンタゴニストとしての最初の手が
かりを与えうる。該タンパク質の構造的特徴を、例えばX線結晶学、中性子回折
、核磁気共鳴分光法、および構造決定のための他の技術を用いて決定することに
より、アンタゴニストの同定およびスクリーニングが更に促進される。これらの
技術は、アゴニストおよびアンタゴニストの論理的設計または同定をもたらす。

【０１００】もう1つのアプローチは、大きなライブラリーを得るために組換えバクテリオ
ファージを用いるものである。「ファージ法」[ScottおよびSmith, 1990, Scien
ce 249:386-390 (1990); Cwirlaら, Proc. Natl. Acad. Sci., 87:6378-6382 (1
990); Devlinら, Science, 249:404-406 (1990)]を用いて、非常に大きなライブ
ラリー（10⁶〜10⁸個の化合物）を構築することができる。第2のアプローチは、
主として化学的方法を用いるものである。そのような化学的方法としては、例え
ば、Geysen法 [Geysenら, Molecular Immunology 23:709-715 (1986); Geysenら
, J. Immunologic Method 102:259-274 (1987)]およびFodorらの方法 [Science
251:767-773 (1991)]が挙げられる。Furkaら[14th International Congress of
Biochemistry, Volume 5, Abstract FR:013 (1988); Furka, Int. J. Peptide P
rotein Res. 37:487-493 (1991)]、Houghton [1986年12月発行の米国特許第4,63
1,211号]およびRutterら [1991年4月23日付け発行の米国特許第5,010,175号]は
、アゴニストまたはアンタゴニストとして試験されうるペプチドの混合物の製造
方法を記載している。

【０１０１】もう1つの態様においては、本発明に従いMIF1リガンドに関してスクリーニン
グするために、合成ライブラリー [Needelsら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90
:10700-4 (1993); Ohlmeyerら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:10922-10926 (
1993); Lamら, 国際特許公開WO92/00252; Kocisら, 国際特許公開WO9428028; そ
れらの各々の全体を参照により本明細書に組み入れることとする]などを使用す
ることができる。

【０１０２】 MIF1を発現する組換え細胞を用いて、あるいは前記の精製されたタンパク質（
例えば、組換え的に産生されたもの）を使用して、該スクリーニングを行うこと
ができる。例えば、前記の参照文献に記載のとおり、ライブラリーをスクリーニ
ングするために、該分子のMEKK結合性部分を含む標識された可溶性MIF1の能力を
利用することができる。

【０１０３】 1つの実施形態においては、MIF1を直接的に標識することができる。もう1つの
実施形態においては、関心のある分子（例えば、固相支持体に結合した分子）に
対するMIF1の結合を検出するために、標識された二次試薬を使用することができ
る。酵素標識による発色団のin situでの形成により、結合を検出することがで
きる。適当な酵素には、アルカリホスファターゼおよびホースラディッシュペル
オキシダーゼが含まれるが、これらに限定されるものではない。もう1つの実施
形態においては、関心のある異なる受容分子上に2つの酵素標識を有する2つの発
色性基質を使用する2つの発色アッセイを用いることができる。交差反応性およ
び単一反応性リガンドを、二色アッセイで同定することができる。

【０１０４】本発明で使用する他の標識には、着色ラテックスビーズ、磁気ビーズ、蛍光標
識 [例えば、発蛍光団を少数ながら挙げると、フルオレセインイソチオシアネー
ト（FITC）、フィコエリトリン（PE）、テキサスレッド（TR）、ローダミン、遊
離またはキレート化ランタニド系列塩、特にEu³⁺などである]、化学発光分子、
放射性同位体または磁気共鳴イメージング標識が含まれる。二色アッセイは、2
以上の着色ラテックスビーズ、または異なる波長で発蛍光する発蛍光団を用いて
行うことができる。標識は、視覚的に又は機械的／光学的手段により検出するこ
とができる。機械的／光学的手段には、蛍光活性化ソーティング（すなわち、FA
CSと類似した方法）、およびマイクロマニピュレーター除去（removal）手段が
含まれる。

【０１０５】本明細書に例示されているとおり、MIF1タンパク質のレベルは、該タンパク質
の代謝標識により評価することができる。[³⁵S]-メチオニンで補足された培地の
存在下での生検組織のインビトロでのインキュベーション中に代謝標識が生じる
ため、検出される各マーカーのレベルは該インビトロ条件により影響されうる。
[³⁵S]-メチオニンでの代謝（または生合成）標識に加えて更に、[¹⁴C]-アミノ酸
および[³H]-アミノ酸（該トリチウムは、反応活性でない位置で置換される）で
の標識が、本発明において意図される。したがって、化合物のサンプルまたはラ
イブラリーを、その中のタンパク質の標識後に、直接的に分析することができる
。これは、例えば、銀、金、クーマシーブルーまたはアミド-シュワルツ（amido
-schwartz）（少数の例が挙げられているにすぎない）を使用する比色染色；例
えば[³²P]-オルトホスフェート、[¹²⁵I]、[¹³¹I]での同位体標識；蛍光または化
学発光タグ；および標識抗体による又はマーカーの特異的結合パートナーによる
免疫学的検出により行うことができる。

【０１０６】また、MIF1に対するリガンド、MIF1/MEKK1結合のアゴニストまたはアンタゴニ
ストを同定するために、およびMEKK1をリン酸化しうるMAP4Kを同定するために、
酵母におけるツーハイブリッド系でのスクリーニングにおいて、MIF1 cDNAおよ
び誘導体を使用することができる。

【０１０７】遺伝子治療およびトランスジェニックベクター前記のとおり、「ベクター」は、本発明の核酸を宿主細胞内に導入するための
任意の手段である。好ましいベクターとしては、ウイルスベクター、例えばレト
ロウイルス、ヘルペスウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルスが挙
げられる。例えば、抗血管新生性タンパク質またはそのポリペプチドドメイン断
片をコードする遺伝子を、ウイルスベクターを使用して又はDNAの直接導入によ
りインビボ、エクス・ビボ（ex vivo）またはインビトロで導入する。標的組織
内での発現は、トランスジェニックベクターを特定の細胞に標的化することによ
り行うことができる。そのような標的化は、例えば、ウイルスベクターまたは受
容体リガンドを使用して又は組織特異的プロモーターを使用して又はその両方を
使用することにより行うことができる。

【０１０８】前記のとおり、本発明の発現ベクターを使用して、細胞をトランスフェクトし
てMIF1活性のモジュレーターのスクリーニングまたは生物学的試験を行ったり、
あるいは遺伝子治療用にインビボまたはエクスビボ（ex vivo）でMIF1遺伝子ま
たはMIF1アンチセンス遺伝子を運搬して例えばMIF1活性のレベルを増加または減
少させることができる。また、抗MIF scFvを発現するベクターを、後記の技術を
用いて導入することができる。

【０１０９】インビボまたはエクスビボ（ex vivo）ターゲッティングおよび治療操作にお
いて一般に使用されるウイルスベクターとしては、DNA系ベクターおよびレトロ
ウイルスベクターが挙げられる。ウイルスベクターを構築し使用するための方法
は、当技術分野において公知である [例えば、MillerおよびRosman, BioTechniq
ues 7:980-990 (1992)を参照されたい]。好ましくは、ウイルスベクターは複製
欠損型である。すなわち、それらは標的細胞内で自律的には複製されない。一般
に、本発明の範囲内で使用される複製欠損ウイルスベクターのゲノムは、感染細
胞内での該ウイルスの複製に必要な少なくとも1つの領域を欠く。これらの領域
は、当業者に公知の任意の技術により除去（全部または一部）または非機能化さ
れうる。これらの技術には、全摘出、置換（他の配列、特に、挿入された核酸に
よる置換）、（複製に）必須な領域に対する1以上の塩基の付加または部分的欠
失が含まれる。そのような技術は、遺伝子操作の技術を用いて又は突然変異誘発
剤での処理によりインビトロ（単離されたDNA上）またはin situで行うことがで
きる。好ましくは、複製欠損ウイルスは、ウイルス粒子を被包するのに必要なそ
のゲノムの配列を保有する。

【０１１０】 DNAウイルスベクターには、弱毒化または欠損DNAウイルス、例えば、単純ヘル
ペスウイルス（HSV）、乳頭腫ウイルス、エプスタイン・バー・ウイルス（EBV）
、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（AAV）、ワクシニアウイルスなどが含
まれるが、これらに限定されるものではない。ウイルス遺伝子を完全に又はほぼ
完全に欠く欠損ウイルスが好ましい。欠損ウイルスは、細胞内に導入された後、
複製可能ではなく、したがって生産的ウイルス感染を引き起こさない。欠損ウイ
ルスベクターの使用により、特定の限局領域内の細胞への投与が可能となり、こ
の場合、該ベクターが他の細胞に感染するのではないかと心配する必要がない。
このようにして、特定の組織が特異的に標的化されうる。個々のベクターの具体
例には、欠損ヘルペスウイルス1（HSV1）ベクター [Kaplittら, Molec. Cell. N
eurosci. 2:320-330 (1991)]、糖タンパク質L遺伝子を欠く欠損ヘルペスウイル
スベクター [特許公開RD 371005 A]または他の欠損ヘルペスウイルスベクター [
1994年9月24日付け公開の国際特許公開WO94/21807; 1994年4月2日付け公開の国
際特許公開WO92/05263]；弱毒化アデノウイルスベクター、例えば、Stratford-P
erricaudetら [J. Clin. Invest. 90:626-630 (1992); また、La Salleら, Scie
nce 259:988-990 (1993)も参照されたい]；および欠損アデノ随伴ウイルスベク
ター [Samulskiら, J. Virol. 61:3096-3101 (1987); Samulskiら, J. Virol. 6
3:3822-3828 (1989); Lebkowskiら, Mol. Cell. Biol. 8:3988-3996 (1988)]が
含まれるが、これらに限定されるものではない。

【０１１１】インビボ投与の場合には、好ましくは、ウイルスベクターおよびトランスフェ
クト化細胞の免疫不活性化を回避するために、ウイルスベクター（例えば、アデ
ノウイルスベクター）での処理と共に適当な免疫抑制処理を行う。例えば、ウイ
ルスベクターに対する体液性または細胞性免疫応答を阻止するために、免疫抑制
性サイトカイン、例えばインターロイキン12（IL-12）、インターフェロンγ（I
FN-γ）または抗CD4抗体を投与することができる [例えば、Wilson, Nature Med
icine (1995)を参照されたい]。また、最小数の抗原を発現するように操作され
たウイルスベクターを使用するのが好都合である。

【０１１２】もちろん、本発明は、遺伝子治療用途のための、治療的に有効な量のMIF1を発
現するベクターの運搬を意図する。本発明で用いる「治療的に有効な量」なる表
現は、宿主の活性、機能および応答における臨床的に有意な欠損を少なくとも約
15％、好ましくは少なくとも50％、より好ましくは少なくとも90％減少させ、最
も好ましくはそれを予防するのに十分な量を意味する。あるいは、治療的に有効
な量は、宿主における臨床的に有意な状態の改善をもたらすのに十分な量である
。

【０１１３】本発明の任意のウイルス性または非ウイルス性ベクターが、医薬上許容される
ビヒクルまたは担体中でインビボにおいて好ましく導入されるであろう。「医薬
上許容される」なる表現は、ヒトに投与された場合にアレルギー性または同様の
不都合な反応（例えば、胃の不調、眩暈など）を典型的には引き起こさない生理
的に許容されうる分子または組成物に関して用いられる。好ましくは、本発明で
用いる「医薬上許容される」なる語は、連邦政府または州政府の統制機関により
承認されていること、または米国薬局方もしくは一般に認められた他の薬局方（
動物、特にヒトでの使用に関するもの）に掲載されていることを意味する。「担
体」なる語は、該化合物と共に投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤または
ビヒクルを意味する。そのような医薬担体は、無菌液、例えば水および油（石油
、動物、植物または合成技術に由来するものを含み、例えば、ラッカセイ油、ダ
イズ油、鉱油、ゴマ油などが挙げられる）であってもよい。水または水溶液、例
えば、食塩水、水性デキストロースおよびグリセロール溶液が、担体、特に注射
液用担体として好ましく使用される。適当な医薬担体は、E.W. Martin（Remingt
on's Pharmaceutical Sciences）により記載されている。

【０１１４】アデノウイルスベクター好ましい実施形態においては、該ベクターはアデノウイルスベクターである。
アデノウイルスは、本発明の核酸を種々の細胞型に効率的に運搬するよう修飾さ
れうる真核性DNAウイルスである。種々の血清型のアデノウイルスが存在する。
本発明の範囲内においては、これらの血清型のうち、2型または5型ヒトアデノウ
イルス（Ad2またはAd5）または動物由来のアデノウイルス（WO94/26914を参照さ
れたい）の使用が好ましい。本発明の範囲内で使用されうる動物由来のアデノウ
イルスには、イヌ、ウシ、マウス（例えば、Mav 1, Beardら, Virology 75 (199
0） 81）、ヒツジ、ブタ、トリおよびサル（例えば、SAV）由来のアデノウイル
スが含まれる。好ましくは、動物由来のアデノウイルスは、イヌアデノウイルス
、より好ましくは、CAV2アデノウイルス（例えば、ManhattanまたはA26/61株 (A
TCC VR-800)）である。

【０１１５】好ましくは、本発明の複製欠損アデノウイルスベクターは、ITR、カプシド化
配列、および関心のある核酸を含む。より好ましくは、該アデノウイルスベクタ
ーの少なくともE1領域が非機能的である。E1領域における欠失は、好ましくは、
Ad5アデノウイルスの配列のヌクレオチド455〜3329（PvuII-BglII断片）または
ヌクレオチド382〜3446（HinfII-Sau3A断片）に伸長する。また、他の領域、特
にE3領域（WO95/02697）、E2領域（WO94/28938）、E4領域（WO94/28152、WO94/1
2649およびWO95/02697）または後期遺伝子L1-L5のいずれかが修飾されていても
よい。

【０１１６】好ましい実施形態においては、該アデノウイルスベクターは、E1領域に欠失を
有する（Ad 1.0）。E1欠失アデノウイルスの具体例はEP 185,573（その内容を参
照により本明細書に組み入れることとする）に開示されている。もう1つの好ま
しい実施形態においては、該アデノウイルスベクターは、E1およびE4領域におけ
る欠失を有する（Ad 3.0）。E1/E4欠失アデノウイルスの具体例はWO95/02697お
よびWO96/22378（それらの内容を参照により本明細書に組み入れることとする）
に開示されている。さらにもう1つの好ましい実施形態においては、該アデノウ
イルスベクターは、E4領域および該核酸配列が挿入されたE1領域における欠失を
有する [FR94 13355（その内容を参照により本明細書に組み入れることとする）
を参照されたい]。

【０１１７】本発明の複製欠損組換えアデノウイルスは、当業者に公知の任意の技術（Levr
eroら, Gene 101 (1991) 195, EP 185 573; Graham, EMBO J. 3 (1984) 2917）
により製造することができる。特に、とりわけ対象DNA配列を保持するプラスミ
ドとアデノウイルスとの間の相同組換えにより、それらを製造することができる
。該アデノウイルスおよびプラスミドを適当な細胞系内にコトランスフェクトし
た後、相同組換えが生じる。使用する細胞系は、好ましくは、（i）前記要素に
より形質転換されうるべきである；そして（ii）好ましくは組換えの危険性をな
くすために組込み形態として、該複製欠損アデノウイルスのゲノム部分を相補し
うる配列を含有すべきである。使用されうる細胞系の具体例としては、ヒト胎児
腎細胞系293（これは、そのゲノム内に組込まれたAd5アデノウイルスのゲノムの
左側部分（12％）を含有する）（Grahamら, J. Gen. Virol. 36 (1977) 59）、
およびE1およびE4の機能を相補しうる細胞系（出願WO94/26914およびWO95/02697
に記載されている）が挙げられる。当業者によく知られた標準的な分子生物学的
技術を用いて、組換えアデノウイルスを回収し精製する。

【０１１８】アデノ随伴ウイルスベクターアデノ随伴ウイルス（AAV）は、感染細胞のゲノム内に安定かつ部位特異的に
組込まれうる比較的小さなサイズのDNAウイルスである。それは、細胞の増殖、
形態学または分化に何ら影響を及ぼすことなく広域スペクトルの細胞に感染する
ことが可能であり、ヒトの病理には関与しないらしい。AAVゲノムは既にクロー
ニングされ配列決定され特徴づけられている。それは、約4700塩基を含み、両端
に約145塩基の逆方向末端反復配列（ITR）領域を含有し、これは該ウイルスの複
製起点として働く。該ゲノムの残りの部分は、被包化機能を保持する2つの必須
領域；ウイルスの複製および該ウイルス遺伝子の発現に関与するrep遺伝子を含
有する該ゲノムの左側部分；および該ウイルスのカプシドタンパク質をコードす
るcap遺伝子を含有する該ゲノムの右側部分に分けられる。

【０１１９】インビトロおよびインビボで遺伝子を導入するためのAAV由来のベクターの使
用は既に記載されている（WO91/18088; WO93/09239; 米国特許第4,797,368号,
米国特許第5,139,941号, EP 488 528を参照されたい）。これらの刊行物は、rep
および／またはcap遺伝子が欠失し対象遺伝子で置換された種々のAAV由来構築物
を記載しており、該対象遺伝子をインビトロで（培養細胞内）またはインビボで
（生物内に直接的に）導入するための、これらの構築物の使用を記載している。
2つのAAV逆方向末端反復配列（ITR）領域に隣接した対象核酸配列を含有するプ
ラスミドと、AAV被包化遺伝子（repおよびcap遺伝子）を保持するプラスミドと
を、ヒトヘルパーウイルス（例えば、アデノウイルス）に感染した細胞系内にコ
トランスフェクトすることにより、本発明の複製欠損組換えAAVを増殖させるこ
とができる。ついで、産生されたAAV組換え体を標準的技術により精製する。

【０１２０】したがって、本発明はまた、AAV ITRに隣接した抗血管新生性因子をコードす
る核酸をコードする配列を含むゲノムを有するAAV由来組換えウイルスに関する
。本発明はまた、AAV由来の2つのITRに隣接した抗血管新生性因子をコードする
核酸をコードする配列を含むプラスミドに関する。そのようなプラスミドを、そ
のまま該核酸配列の導入に使用することが可能であり、適宜、該プラスミドをリ
ポソームベクター（偽ウイルス）内に取込ませることができる。

【０１２１】レトロウイルスベクターもう1つの実施形態においては、該遺伝子をレトロウイルスベクター内に導入
する（例えば、Andersonら, 米国特許第5,399,346号; Mannら, 1983, Cell 33:1
53; Teminら, 米国特許第4,650,764号; Teminら, 米国特許第4,980,289号; Mark
owitzら, 1988, J. Virol. 62:1120; Teminら, 米国特許第5,124,263号; EP 453
242, EP 178220; Bernsteinら, Genet. Eng. 7 (1985) 235; McCormick, BioTec
hnology 3 (1985) 689; 1995年3月16日付け公開のDoughertyら, 国際特許公開WO
95/07358; およびKuoら, 1993, Blood 82:845に記載されている）。レトロウイ
ルスは、分裂中の細胞に感染する組込み性ウイルスである。レトロウイルスゲノ
ムは、2つのLTR、被包化配列および3つのコード領域（gag、polおよびenv）を含
む。組換えレトロウイルスベクターにおいては、一般には、gag、polおよびenv
遺伝子を完全に又は部分的に欠失させ、関心のある異種核酸配列で置換する。こ
れらのベクターは、HIV、MoMuLV（「マウスモロニー白血病ウイルス」）、MSV（
「マウスモロニー肉腫ウイルス」）、HaSV（「ハーベイ肉腫ウイルス」）、SNV
（「脾臓壊死ウイルス」）、RSV（「ラウス肉腫ウイルス」、フレンドウイルス
などの種々の型のレトロウイルスから構築することができる。欠損レトロウイル
スベクターはWO95/02697に開示されている。

【０１２２】一般には、核酸配列を含有する組換えレトロウイルスを構築するために、LTR
、被包化配列およびコード配列を含有するプラスミドを構築する。この構築物を
、パッケージング細胞系（この細胞系は、該プラスミドに欠損しているレトロウ
イルス機能をトランスで供給しうる）にトランスフェクトするために使用する。
したがって、一般には、該パッケージング細胞系はgag、polおよびenv遺伝子を
発現しうる。そのようなパッケージング細胞系は先行技術において既に記載され
ており、特に、細胞系PA317（米国特許第4,861,719号）、PsiCRIP細胞系（WO90/
02806）およびGP+envAm-12細胞系（WO89/07150）が挙げられる。また、該組換え
レトロウイルスベクターは、転写活性を抑制するためのLTR内の修飾、と、gag遺
伝子の一部を含みうる長い被包化配列とを含有していてもよい（Benderら, J. V
irol. 61 (1987) 1639）。組換えレトロウイルスベクターは、当業者に公知の標
準的技術により精製する。

【０１２３】レトロウイルスベクターは、感染粒子として機能するように又は一連のトラン
スフェクションに付されるように構築されうる。前者の場合には、腫瘍原性トラ
ンスフォーメーション特性を与える遺伝子以外のその遺伝子の全部を保有するよ
うに及び異種遺伝子を発現するように、該ウイルスを修飾する。非感染性ウイル
スベクターの調製は、該ウイルスパッケージングシグナルが破壊されるように、
かつ該異種遺伝子と該パッケージングシグナルとを含有するよう操作された共導
入ウイルスのパッケージングに必要な構造遺伝子が保有されるように行う。した
がって、産生されるウイルス粒子は、さらなるウイルスを産生する能力を有さな
い。

【０１２４】標的化遺伝子運搬は、1995年10月に公開された国際特許公開WO95/28494に記載
されている。

【０１２５】非ウイルスベクター別法として、リポフェクションにより該ベクターをインビボで導入することが
できる。過去10年の間に、インビトロで核酸をカプセル化しトランスフェクトす
るためのリポソームの使用が益々増加してきている。リポソーム媒介トランスフ
ェクションの際に遭遇する問題点や危険性を制限するように設計された合成正電
荷脂質を使用して、マーカーをコードする遺伝子のインビボトランスフェクショ
ン用のリポソームを調製することができる [Felgnerら, Proc. Natl. Acad. Sci
. U.S.A. 84:7413-7417 (1987); Mackeyら, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85
:8027-8031 (1988)を参照されたい; Ulmerら, Science 259:1745-1748 (1993)]
。正電荷脂質の使用は、負に荷電した核酸のカプセル化を促進することが可能で
あり、また、負に荷電した細胞膜との融合を促進することが可能である [Felgne
rおよびRingold, Science 337:387-388 (1989)]。核酸の導入に特に有用な脂質
化合物および組成物は、国際特許公開WO95/18863およびWO96/17823ならびに米国
特許第5,459,127号に記載されている。外因性遺伝子を特定の器官内にインビボ
で導入するためのリポフェクションの使用は、ある種の実用的利点を有する。特
定の細胞に対するリポソームの分子ターゲッティングは、有益な1つの領域を代
表するものである。特定の細胞型にトランスフェクションを導くことが、細胞不
均質性を有する組織（例えば、膵臓、肝臓、腎臓および脳）においては特に有利
であることが明らかである。ターゲッティングの目的のために、脂質を他の分子
と化学的にカップリングさせることができる [Mackeyら, 前掲を参照されたい]
。ターゲッティングされるペプチド、例えばホルモンまたは神経伝達物質、およ
びタンパク質（例えば、抗体）、または非ペプチド性分子を、リポソームに化学
的にカップリングさせることができる。

【０１２６】また、インビボでの核酸のトランスフェクションを促進するためには、他の分
子、例えば正電荷オリゴペプチド（例えば、国際特許公開WO95/21931）、DNA結
合タンパク質由来のペプチド（例えば、国際特許公開WO96/25508）または正電荷
重合体（例えば、国際特許公開WO95/21931）も有用である。

【０１２７】また、該ベクターを裸のDNAプラスミドとしてインビボで導入することも可能
である。当技術分野で公知の方法（例えば、トランスフェクション、エレクトロ
ポレーション、マイクロインジェクション、トランスダクション、細胞融合、DE
AEデキストラン、リン酸カルシウム沈殿、遺伝子銃の使用、またはDNAベクター
輸送体の使用）[例えば、Wuら, J. Biol. Chem. 267:963-967 (1992); Wuおよび
Wu, J. Biol. Chem. 263:14621-14624 (1988); 1990年3月15日付け出願のHartmu
tら, カナダ国特許出願第2,012,311号; Williamsら, Proc. Natl. Acad. USA 88
:2726-2730 (1991)を参照されたい]により、遺伝子治療用の裸のDNAベクターを
所望の宿主細胞内に導入することができる。受容体介在DNA運搬アプローチを用
いることも可能である [Curielら, Hum. Gene Ther: 3:147-154 (1992); Wuおよ
びWu, J. Biol. Chem. 262:4429-4432 (1987)]。

【０１２８】本発明は、以下の非限定的な実施例を参照することにより、より深く理解され
るであろう。これらの実施例は本発明の典型例として記載されている。

【０１２９】（実施例）材料および方法酵母株 Hela細胞融合バンクをツーハイブリッド系によりスクリーニングするための手
段として、サッカロミセス・セレビシエ（S. cerevisiae）属（MATa、ura3-52、
his3-200、ade2-101、lys2-801、trp1-901、leu2-3、112、can1、gal4-542、gal
80-538、met16::URA3-pGAL1/10-LacZ）のYCM17株を使用した。それを以下の培地
上で培養した。

【０１３０】 YPD完全培地：・酵母エキス（10g/L）（Difco）・バクト-ペプトン（20g/L）（Difco）・グルコース（20g/L）（Merck）寒天（Difco）20g/Lを加えることにより、この培地を固まらせた。

【０１３１】 YNB最少培地：・酵母窒素塩基（アミノ酸を含まない）（6.7g/L）（Difco）・グルコース（20g/L）（Merck）寒天（Difco）20g/Lを加えることにより、この培地を固まらせた。この培地上で
の栄養要求性酵母の増殖を可能にするためには、該酵母が依存するアミノ酸また
は窒素塩基50mg/Lをそれに加えることが必要である。

【０１３２】細菌株使用する組換えプラスミドを増幅し単離するための手段として、遺伝子型supE
、hsdD5、thi、D(lac-proAB)、F'[tra D36 pro A⁺B⁺ lacI^qlacZDM15]の大腸菌（
Escherichia coli）のTG1株を使用することができる。それを以下の培地上で培
養した：LB培地：・NaCl（5g/L）（Difco）・バクト-トリプトン（10g/L）（Difco）・酵母エキス（5g/L）（Difco）寒天（Difco）20g/Lを加えることにより、この培地を固まらせた。アンピシリン
（100μg/ml）は、この抗生物質に対する耐性を付与する遺伝子をマーカーとし
て保持するプラスミドを受容した細菌の選択を可能にする。

【０１３３】プラスミド一連のpGBT（Clontech、または以下に記載されている：Roder KH, Wolf SSお
よびSchweizer M (1996) Anal. Biochem 241:260-2）のベクターを使用した。こ
れらは、細菌および酵母の2つの微生物内で高コピー数で複製されるのを可能に
する細菌および酵母の複製起点を有するシャトルプラスミドである。これらのプ
ラスミドは、GAL4のDNA結合ドメインのコード配列の下流かつ終結コドンの上流
に位置するマルチクローニング部位を含有していて、融合タンパク質の形成をも
たらす。それらはまた、エス・セレビシエ（S. cerevisiae）の遺伝子TRP1を含
有し、これは、遺伝子型trp1の酵母が相補されてトリプトファン非含有最少培地
上でそれらが選択されるのを可能にする。このベクターは、アンピシリン耐性を
付与する遺伝子を保持し、該遺伝子は、それを有する細菌のアンピシリン含有培
地上での選択を可能にする。

【０１３４】一連のpGAD（Clontech）のベクターも使用した。これらは、GAL4のトランスア
クチベータードメインと、関心のあるタンパク質またはHela細胞バンク由来のcD
NA（EcoRI XhoI部位のレベルで挿入されているもの）にコードされるタンパク質
との融合タンパク質が酵母内で発現されるのを可能にするベクターである。

【０１３５】タンパク質p53とT抗原との間のタンパク質-タンパク質相互作用を示すための
陽性対照として、ベクターpAV3およびpTD1（Clontech）を使用した。

【０１３６】一連のBluescriptベクター（Stratagene）を使用した。これらのベクターは、
一連のpMTL（Chambersら, Gene 1988, 68, pp 139-149）と同様にクローニング
を行うことを可能にする。

【０１３７】また、ベクターpCDNA3（Invitrogen）および誘導体ベクター（pSG42およびpCN
W8）を使用した。これらは、哺乳類細胞内でのCMVプロモーターの制御下のタン
パク質発現を可能にする。

【０１３８】また、PCR断片のクローニングを可能にするベクターpCRII（Invitrogen）を使
用した。

【０１３９】これらのプラスミド内にcDNAをクローニングし挿入するために用いた遺伝子工
学技術は、通常のプロトコールによるものであった（Maniatis Tら, “Molecula
r Cloning, a Laboratory Manual”, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Sp
rinng Harbor, N.Y., 1982; Ausbel F.M.ら (編), “Current Protocols in Mol
ecular Biology”, John Wiley＆Sons, New York, 1987）。

【０１４０】プラスミドDNAの調製 Promegaの高速DNA調製キットを該製造業者の説明書に従い使用して、大量のDN
Aを調製した。以下の方法により少量のDNAを調製した。該プラスミドを含有する
細菌を、シェーカー内のLB培地2ml中、攪拌しながら少なくとも4時間培養した。
ついでそれらを、エッペンドルフチューブ中、14,000rpmで2分間遠心分離し、つ
いで該濃縮物を、100μlの溶液I（50mMグルコース, 25mM Tris-HCl pH8バッファ
ー, 10mM EDTA pH8）中の懸濁液に戻し、200μlの溶液II（0.2M NaOH, 1％ SDS
）で溶菌した。ついで該溶菌溶液を150μlの溶液III（3M酢酸カリウム, 11.5％(
v/v)氷酢酸）で中和した。綿状沈殿物が得られるまで該チューブを攪拌した後、
フェノール/クロロホルム（水中に飽和した50％フェノールおよび50％クロロホ
ルム）の混合物150μlを加え、全混合物を30秒間攪拌した。14,000rpmで2分間の
遠心分離の後、該DNAを含有する水相を回収した。ついで該DNAを、0.5容積のイ
ソプロパノールの添加により沈殿させ、ついで14,000rpmで5分間遠心分離し、最
終的に20μlのTE-RNアーゼ（50μg/ml RNアーゼと共に10mM Tris-HClおよび1mM
EDTAを含む溶液）に溶解するために風乾した。

【０１４１】ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）によるDNAの酵素増幅二本鎖DNA、dNTP(0.2mM)、PCRバッファー（10mM Tris-HCl pH8.5、1mM MgCl₂
、5mM KCl、ゼラチン0.01％）、該オリゴヌクレオチドのそれぞれの0.5μgおよ
び2.5 IUのAmpli Taq DNAポリメラーゼ（Perkin Elmer）の存在下でホルムアミ
ド（5％）の存在下または不存在下、100μlの最終容積中でPCR反応を行った。該
サンプルの蒸発を抑えるために、該混合物を2滴のパラフィン油で覆った。使用
した装置はAppligeneの「Crocodile II」であった。ヘリックスを変性させるた
めに、90℃の温度で変性を行った。該変性（一本鎖）DNAに対する該オリゴヌク
レオチドのハイブリダイゼーションのための温度は、該オリゴヌクレオチドの分
離のための温度より5〜10℃低かった。該酵素による伸長には、72℃の温度を用
いた。PCRにより得た断片をクローニングに使用し、それらがクローニングされ
たら、該断片を系統的に再配列決定して、増幅中に生じたかもしれない突然変異
が存在しないことを確認した。

【０１４２】 β-シアノエチル保護基を使用するホスホロアミダイト法（Sinha, 1984）によ
り、該オリゴデオキシヌクレオチドを化学合成した。合成後、アンモニアでの処
理により該保護基を除去し、ブタノールでの2回の沈殿により、該オリゴデオキ
シヌクレオチドの精製および濃縮が達成された（Sawadogo, 1991）。光学濃度を
260nmで測定することにより、該DNA濃度を測定した。

【０１４３】連結反応すべての連結反応は、100〜200ngのベクター、0.5〜2μgのインサート、40 IU
の酵素T4 DNAリガーゼ（Biolabs）および連結バッファー（50mM Tris-HCl pH7.8
; 10mM MgCl₂; 10mM DTT、1mM ATP）の存在下、10μlの最終容積中、+14℃で一
晩行った。該インサートの不存在下での該ベクターの連結により、陰性対照を得
た。

【０１４４】供給業者の説明書に従い、大腸菌（E. coli）のDNAポリメラーゼIのクレノウ
フラグメント（Biolabs）により連結する前に、必要に応じて、突出5'末端を埋
めた。突出3'末端の破壊を、製造業者の推奨に従い使用したT4ファージのDNAポ
リメラーゼ（Biolabs）の存在下で行った。

【０１４５】細菌の形質転換 Chungら（1988, Proc. Natl. Acad. Sci. 86:2172-2175）の方法によりコンピ
テント化されたTG1細菌を形質転換するために、全連結容積（10μl）を使用した
。600nmで0.6のODが得られるまで、該TG1細菌を、インキュベーター中、液体LB
培地内の培養内に37℃で攪拌しながら数時間配置した。ついで該培地を6,000rpm
で10分間遠心分離した。最初の培養の培地容積の1/10に相当する容積のTSB（LB
培地 + 100g/LのPEG 4000、5％ DMSO、10mM MgCl₂、10mM MgSO₄）に該細菌濃縮
物を溶解することにより、該細菌をコンピテント化した。4℃で30〜60分間イン
キュベートした後、200μlの細菌を、氷上で15分間該連結産物と接触させて配置
した。200μlのLB（培地）を加えた後、該細菌を37℃で30分間インキュベートし
、ついでLB+アンピシリン培地上に広げた。

【０１４６】 DNAの分離および抽出 DNAの分離を、そのサイズに相関する電気泳動により行った。これを行うため
には、分離する断片のサイズに応じて種々のゲルを使用した：・大きなDNA断片（500bpを超えるもの）を分離するためには、TBEバッファー（9
0mM Tris塩基、90mMホウ酸塩; 2mM EDTA）中の1％アガロースゲル（Gibco BRL）
；・小さな断片（500bp未満のもの）を分離するためには、TBEバッファー中の2％
NuSieveアガロースゲル（FMC Bioproducts）。

【０１４７】アガロースゲルまたはポリアクリルアミドゲル上での泳動を、TBEバッファー
中および分子量マーカー（1Kbラダー, Gibco BRL）の存在下で行った。該DNAを
、該ゲル上で析出させる前に、青色の析出物容積（200g/LのFicoll、0.5g/Lのブ
ロモフェノールブルー、50mM EDTA）の1/10と混合した。100ボルトで泳動させ臭
化エチジウム（0.5μg/mlゲル）で染色した後、該バンドをUVランプ下で可視化
した。

【０１４８】アガロースゲルのバンドからの該DNAの抽出は、電気溶出により以下のとおり
に行った。該DNA断片を含有するゲル片を小刀で切り出し、2個のクランプで密封
され100〜500μlのTBEを含有する透析チューブ内に配置した。該全混合物を電気
泳動タンク内に配置し、該タンク内でそれを100ボルトの電場にさらした。つい
で、該DNAを該ゲルから取り出した後、該DNAをフェノール/クロロホルムでの2回
の抽出およびそれに続くクロロホルムでの2回の抽出により精製し、ついで0.3M
酢酸ナトリウムおよび2.5容積の無水アルコールの存在下で沈殿させた。遠心分
離（14,000rpmで5分間）の後、該DNA濃縮物を乾燥させ、ついで20μlの水に溶解
した。

【０１４９】プラスミドDNAの蛍光配列決定異なる蛍光マーカーを有する4種のジデオキシリボヌクレオチドを使用しSange
rの方法に従い、配列決定を行った。これらのジデオキシリボヌクレオチドのう
ちの1種の取込みは、配列決定するDNAのTaqポリメラーゼによる複製の停止を引
き起こした。この反応は種々のサイズのDNA断片を与え、それらはすべて、それ
らの4種のジデオキシリボヌクレオチドのうちの1種により3'で終結するものであ
った。1μgのプラスミドおよび4ピコモルのプライマーを、Applied Biosystems
から商標PRISM（著作権）で供給されている9.5μlの「プレミックス（premix）
」に加えた。96℃で30秒間の変性工程、50℃で15秒間のハイブリダイゼーション
工程および60℃で4分間の伸長工程に分けられる25サイクルのPCRを行うためには
、最終容積を20μlにしなければならなかった。増幅後に得られたDNA断片を排除
カラム（ClontechからのChromaspin-30）上で精製し、ついでSpeed Vac中で乾燥
した。該乾燥物質のすべてを、24μlのEDTA（50mM）と120μlの脱イオン化ホル
ミアミドとからなる5μlの混合物に溶解した。96℃で3分間の変性後、3〜5μlを
電気泳動ゲル上で析出させた。種々のDNA断片を、それらのサイズに応じて分離
し、ついで、種々の発蛍光団が検出されるABI 370 DNAシークエンサー（Applied
Biosystems）のレーザーリーダーの前方に連続的に通過させた。

【０１５０】 Hela細胞バンク（Clontech（登録商標））からのプラスミドの調製 Hela細胞cDNAバンクを細菌の形態で入手した。該バンクの力価を確認した後、
8mlのLB（培地）内に予め配置されているHela細胞融合バンクからの2μlの細菌
を固体培地上にまばらに広げて、このバンクの典型的性質を維持するようにした
。したがって、本発明者らは、LB+アンピシリン培地を含有する16 770cm²のディ
ッシュ上に該細菌を広げた。該ディッシュのそれぞれについて、出現したコロニ
ーを30mlの液体LB+アンピシリン培地中に溶解した。ついで、得られた懸濁液を
エルレンマイヤーフラスコ中に配置し、シェーカー中、37℃で3時間でインキュ
ベートした。ついで、Maxiprep技術により、これらの株から該DNAを抽出した。D
NA濃度を260nmで測定した。

【０１５１】プラスミドによる酵母の形質転換 100mlの液体培地内で培養した酵母細胞を、3,000rpmで3分間の遠心分離後に集
め、1mlの無菌水中の懸濁液中に配置した。3,000rpmで3分間の遠心分離後、該細
胞濃縮物を再び、1mlの無菌水中の懸濁液中に配置し、ついで再び遠心分離した
。該培地の痕跡を除去するために、この操作をもう1度繰返した。ついで該酵母
細胞を1mlの形質転換溶液I（0.1M LiAc、10mM Tris-HCl pH7.5、1mM EDTA）中に
溶解し、3,000rpmで3分間遠心分離した。該細胞濃縮物を再び、1mlの形質転換溶
液Iに溶解した。50μlのこの懸濁液を50μgのサケ精子DNAおよび1〜5μgのプラ
スミドDNAと混合した。つぎに300μlの形質転換溶液II（0.1M LiAc、10mM Tris-
HCl pH7.5、1mM EDTA; 40％ PEG₄₀₀₀中）を加え、ついで該全混合物を28℃で30
分間インキュベートした。ついで該形質転換混合物に、水浴中、40℃で15分間の
熱ショックを与え、ついで該全混合物を15,000rpmで1分間遠心分離して該細胞濃
縮物を集めた。この濃縮物を200μlの水に溶解し、ついで、該形質転換プラスミ
ドにより提供されたマーカーに対応するアミノ酸を含有していない寒天最少培地
上に広げた。ついで該酵母を28℃で72時間培養した。

【０１５２】 Hela細胞cDNAバンクによる酵母の形質転換は、異なる方法で行った。使用した
酵母は、GAL4のDNA結合ドメインに融合したMEKKの発現を許容するプラスミドpCM
433を含有していた。それを、10⁷細胞/mlの濃度になるまで、250mlのYPG最少培
地中、攪拌しながら28℃で培養した。該細胞を3,000rpmで10分間の遠心分離によ
り集め、250mlの水に溶解した。もう1度遠心分離した後、該細胞濃縮物を100ml
の水に溶解し、再び遠心分離した。ついで該濃縮物を10mlの形質転換溶液Iに溶
解し、攪拌しながら28℃で1時間インキュベートした。遠心分離後、該細胞をも
う1度、2.5mlの形質転換溶液I、100μlのHela細胞cDNAバンクおよび20mlの形質
転換溶液IIに溶解し、ついで攪拌しながら28℃で1時間インキュベートした。こ
の形質転換混合物に42℃で20分間、熱ショックを与えた。遠心分離（3,000rpmで
5分間）を連続的に3回繰返した。各遠心分離において、該濃縮物を10mlの無菌水
に溶解した。3回目の遠心分離では、該濃縮物を2.5mlの無菌水に溶解した。この
ようにして、細胞に毒性のPEGが除去された。2.4mlのこの懸濁液を使用して、ア
ミノ酸His、LysおよびMetならびに塩基UraおよびAdeを含有する250mlの最少培地
に播き、シェーカー中、28℃で一晩培養した。該一晩培養物を遠心分離（3,000r
pmで5分間）し、連続して2回、無菌水で洗浄した。ついで該濃縮物を2.5mlの水
に溶解した。2.4ml（この容積を無菌水中で10mlまで増加させた）を使用して、Y
NB+Lys+Met+His+Ade培地を含有する10 435cm²ディッシュに播き、それを3日間イ
ンキュベートした。

【０１５３】酵母ゲノムおよびプラスミドDNAの調製平均的な酵母クローンアリコートを、直径450μmの3gのガラスビーズおよび20
0μlのフェノール/クロロホルムの存在下、200μlのTELT溶液（2％ Triton X100
、1％ SDS、100mM NaCl、10mM Tris pH8、1mM EDTA）中に配置した。この混合物
を15分間ボルテックスし、ついで14,000rpmで2分間遠心分離した。該タンパク質
ケークを取込むことなく、該上清を集め、この相中に含まれるDNAを2.5容積の無
水アルコールで沈殿させた。14,000rpmで2分間の遠心分離後、該DNA濃縮物を乾
燥させ、20μlのTE-RNアーゼに溶解した。ゲノムとプラスミドDNAとの混合物に
相当するこのDNA溶液を、細菌の形質転換に直接使用した。該プラスミドDNAだけ
が該細菌中で複製可能であり、ミニプレップ技術により分析可能であった。

【０１５４】 β-ガラクトシダーゼ活性試験ニトロセルロースのシートを、個々の酵母クローンを含有するペトリディッシ
ュ上に予め配置した。吸着現象のため、該クローンの配置と一致した像が得られ
た。ついで、このシートを液体窒素中に30秒間浸して酵母を破裂させ、それによ
りβガラクトシダーゼ活性を放出させた。融解後、1.5mlのPBS溶液（60mM Na₂HP
O4、40mM NaH₂PO4、10mM KCl、1mM MgSO₄、pH7）および10〜30μlのX-Gal（5-ブ
ロモ-4-クロロ-3-インドイル-β-D-ガラクトシダーゼ）と50mg/mlのN,N-ジメチ
ルホルムアミドとで予め飽和されたワットマン紙を含有する別のペトリディッシ
ュ中に、ニトロセルロースのシートを、コロニーが上向きになるように配置した
。ついで該ディッシュを、乾燥を防ぐためにカバーで密閉して、オーブン中に37
℃で配置した。青染色が出現するまでの時間は、数分から数時間までの大きなば
らつきを示した。この試験は、既知相互作用を有し迅速に青変する陽性対照の存
在下で行った。

【０１５５】 CHO-K1細胞のトランスフェクション CHO-K1細胞を完全培地（HAM's F12、10％熱不活性化ウシ胎仔血清、1％ペニシ
リン、1％グルタミン）中で増殖させた。細胞（1.10⁵細胞/ウェル）を6ウェルプ
レート中に播き、完全培地中で24時間増殖させた。ついで、GIBCO-BRLからのリ
ポソーム製剤（Lipofectamine試薬）を使用し該製造業者の推奨に従い、細胞を1
μg/ウェルの合計量のプラスミド（pCDNA3またはpCM562）でトランスフェクトし
た。トランスフェクションの4日後、細胞を10cmペトリディッシュ中に播き、500
μg/mlのG418と共に2週間インキュベートした。ついで耐性細胞をプールし、分
析および／または凍結するまで、G418の存在下で増殖させた。

【０１５６】細胞抽出物およびPAGE-SDSによるタンパク質発現分析細胞をPBS（1,06mM KH2PO4、154mM NaCl、5,6mM Na2HPO4）で洗浄し、HNTG溶
解バッファー [Hepes pH7.4 50mM、NaCl 150mM、TritonX100 1％、グリセロール
10％]中で集めた。30分間の細胞溶解の後、細胞抽出物を遠心（2000rpmで10分間
、室温）し、比色アッセイ（Pierce）により上清中のタンパク質を定量した。熱
変性後、10μgの細胞抽出物を10％ Tris-グリシンPAGE-SDS上で分離し、PVDFメ
ンブレン上にエレクトロブロットした。ブロットをTBS [Tris pH7.5mM 20mM、Na
Cl 150mM]-Tween 0.1％中の2％乾燥乳で4℃で16時間飽和させた。二次抗体とし
てのHRP酵素と共役した抗マウス抗体を使用するECL表現系（Amersham）およびマ
ウス抗myc抗体を使用して、Mycタグ付きMIF1/MSP58タンパク質を検出した。

【０１５７】 Mycタグ付きMIF1/MSP58タンパク質を発現する安定クローンの生成 MIF1/MSP58タンパク質を発現する安定クローンを、個々の細胞のクローニング
により得た。200μl当たり約0.1個の細胞を含有する細胞懸濁液を96ウェルプレ
ートに分注（200μl/ウェル）し、37℃で数日間インキュベートした（3個のプレ
ートを調製した）。4週間増殖させた後、36個のクローンを得、細胞抽出物を、
抗myc抗体を使用する免疫ブロット法により分析して、MIF1/MSP58タンパク質を
検出した。

【０１５８】外部刺激で処理した細胞におけるJNKキナーゼ活性の分析細胞（2.10⁵個/ウェル）を6ウェルプレートに播き、完全培地中で24時間イン
キュベートした。ついで200μMのソルビトール（PBS中に新たに希釈したもの）
を加え、細胞を5、15または30分間インキュベートした。対照細胞を200μlのPBS
で処理した。インキュベーション後、細胞をPBSで素早く洗浄し、プロテアーゼP
ICのインヒビター（0.1mMペファブロック、10μg/mlアプロチニン、10μg/mlロ
イペプチン、1μg/mlアンチパイン、10μg/mlベンズアミジン、1μg/mlダイズト
リプシンインヒビター、1μg/mlキモスタチン、1μg/mlペプスタチンA）で補足
された200μlのb-グリセロリン酸バッファー（80mM b-グリセロリン酸 pH7.4、2
0mM EGTA pH8、15mM MgCl₂）中で集めた。ついで細胞を超音波処理（6×30秒）
し、細胞抽出物を100,000rpm、4℃で30分間の超遠心分離により清澄化した。上
清（細胞質ゾル抽出物）を-80℃で保存した。タンパク質濃度をPierce試薬で測
定した。500ngの細胞抽出物を、20mM HEPES pH7.4、5mM MgCL₂、2mM DTT、2mM E
GTA中、基質（2.5μg）としてのGST-cJun(1/223)組換えタンパク質のインビトロ
リン酸化に使用した。反応混合物をPKI（20μg/ml）、Na₃VO₄（1mM）、ATP（25
μM）および³³PgATP 3μCiで補足した。サンプルを30℃で10分間インキュベート
し、Laemmliローディングバッファー（5X）の添加により反応を停止させた。タ
ンパク質を、10％ Tris-グリシンPAGE-SDS上で分離する前に熱不活性化（95℃で
10分間）した。ホスホルイメージャー（phosphorimager）（Packard）を使用し
て、リン酸化GST-Jun (1-223)タンパク質を定量した。

【０１５９】アポトーシスアッセイ細胞（2.10⁵個/ウェル）を6ウェルプレートに播き、完全培地中で24時間イン
キュベートした。200mMのソルビトールを加え、細胞を24時間インキュベートし
た。ついで上清を遠心（3500rpm、室温で10分間）して、アポトーシス性細胞を
ペレット化した。プレートからの細胞をトリプシン処理により集め、PBSで洗浄
し、遠心した。ついでペレットを冷エタノールに穏やかに再懸濁させ、RNアーゼ
（1mg/ml）の存在下でのヨウ化プロピジウム染色（10μg/ml）後のFACS分析によ
り10000個の細胞上でアポトーシスを調べた。

【０１６０】 GST-MEKK1プラスミドの構築全MEKK1（Russelら, 1995, J. Biol. Chem. vol 270 p11757）コード配列を含
有するpCM556由来のHindIII[平滑]-XhoI断片を、HpaIおよびXhoI酵素で切断した
pBCGSTプラスミド（Biotechniques, 1995, vol 18, p142）中にクローニングし
た。MEKK1配列（C-Term）に融合したGST（N-Term）のオープンリーディングフレ
ームを、DNA配列決定により確認した。このプラスミドをpBCGST-MEKK1と命名し
た。

【０１６１】 GSTプルダウンによるMIF1/MSP58-MEKK1相互作用の分析 CHOMIF1/MSP58#34（6.10⁵細胞）を10cmペトリディッシュに播き、完全培地中
で3日間増殖させた。ついでリポフェクタミン試薬（Gibco）を使用して、GST-ME
KK1タンパク質をコードするプラスミド（pBCGST-MEKK1）または対照としてのpBC
GSTの10μgで細胞をトランスフェクトした。ついで細胞を完全培地で24時間増殖
させた。ついで、細胞溶解の前に、細胞を200mMソルビトールの存在下または不
存在下で30分間インキュベートした。細胞をPBSで洗浄し、1mM Na₃O₄、4mM NaF
、10μM AlC1₃と共にプロテアーゼインヒビターPICを含有する500μlのHNTGバッ
ファー中、4℃で細胞溶解した。ついで細胞を超音波処理（6×30秒）し、細胞抽
出物を遠心分離（4℃、3000rpmで10分間）により清澄化した。上清（500μl）を
、HNTGで平衡化されたGSHセファロース4B（Pharmacia）100μlと共に4℃で1時間
、回転させながらインキュベートした。遠心分離後、GSH-セファロースを200μl
のHNTGで3回洗浄した。GST/GSH複合体を、100μlのTris.HCl（pH7.7）50mM、GSH
10mM中、4℃で16時間溶出した。ついでGSH-セファロースを4000rpm（4℃）で30
分間遠心し、溶出液のアリコート30μlを10％ Tris-グリシン PAGE-SDS上にロー
ディングし、抗GST抗体（Tebu）および抗myc抗体（MIF1/MSP58の検出用）を使用
するウエスタンブロットにより分析した。

【０１６２】実施例1：MEKK1とGAL4のDNA結合ドメインとの融合タンパク質の発現を可能に
するベクターの構築二重（double）ハイブリッド系を用いるバンクのスクリーニングは、タンパク
質MEKK1がトランスアクチベータータンパク質GAL4のDNA結合ドメインと融合して
いることを要する。GAL4のDNA結合ドメイン（GAL4DB）に対応する配列と同じリ
ーディングフレームにてpCM411（MEKK1をコードする遺伝子を保持するベクターp
MTL21）由来の断片EcoR1-Xho1が導入されているベクターpGBT9（前記「材料およ
び方法」）を用いて、この融合タンパク質の発現を行った。MEKK1遺伝子をプラ
スミドpGBT9のEcoR1-Sal1部位のレベルで挿入して、プラスミドpCM433を得た。

【０１６３】該構築物を配列決定した。これは、該MEKK1遺伝子が実際に、GAL4DBに対応す
る断片と同じオープンリーディングフレームにて存在することを証明した。

【０１６４】実施例2：Hela細胞融合バンクのスクリーニング本発明者らにとって関心のあるタンパク質と相互作用しうるGAL4のトランスア
クチベータードメインに融合したタンパク質を産生するクローンの同定が、融合
バンクのスクリーニングにより達成されうる。この相互作用は、YCM17株におけ
るレポーター遺伝子URA3およびLacZの発現を誘導しうるトランスアクチベーター
の再構成を可能にする。

【０１６５】このスクリーニングを行うために、ヒトHela細胞cDNAを使用して作製した融合
バンクを選択した。このバンクは細菌の形態で供給されたため、該バンクのプラ
スミドDNAをまず精製した。

【０１６６】融合バンクからのプラスミドDNAの調製 Hela細胞cDNAバンクからのプラスミドDNAを、Clontech（登録商標）のプロト
コール（「材料および方法」）に従い抽出した。この調製中に、該バンクの典型
的性質を維持すること、すなわち、それを含む独立したプラスミドの数（合計6
×10⁶個のプラスミド）を維持することが重要であった。この調製中にバンクか
らプラスミドが喪失するのを防ぐために、該プラスミドDNAロットを、該バンク
の典型的性質の3倍を少し超える数（すなわち、1.8×10⁷個のコロニー）に対応
する単離された細菌コロニーから得た。

【０１６７】 Hela細胞バンクによる形質転換およびβガラクトシダーゼ活性試験による選択該融合バンクからの各独立プラスミドが、少なくとも1つの酵母中に、プラス
ミドGAL4DB-MEKK1と同時に存在する高い可能性が、該スクリーニング中に確保さ
れる必要があった。これは、該酵母の形質転換に関する優れた効率を必要とした
。この目的のために、形質転換細胞10⁵個/1μg DNAの効率を与える酵母形質転換
プロトコールを選択した。また、2つの異なるプラスミドによる該酵母の同時形
質転換はこの効率を減少させるため、プラスミドpCM433により予め形質転換され
た酵母を使用した。この酵母株を該融合バンク由来の100μgのプラスミドDNAに
より形質転換した。DNAのこの量は、本発明者らが1.5×10⁶個の形質転換細胞を
得ることを可能にした。機能的GAL4トランスアクチベーターを再構成しうる形質
転換細胞の選択を、YNB+Lys+Met+His+Ade培地上で行った。得られたクローンのl
acZ活性を確認した。

【０１６８】この第2選択の終了までに、表現型Ura+およびbGal+を有する46個のクローンを
得た。

【０１６９】実施例3：選択されたプラスミドインサートの同定該酵母から抽出したプラスミドを該細菌内に導入し、ついで「材料および方法
」に記載のとおりに調製した。該EcoRI部位から52bpの位置に存在するHela細胞c
DNAバンクの挿入部位付近のGAL4TA領域の相補的オリゴヌクレオチドCTATTCGATGA
TGAAGATACCCC（配列番号9）を使用して、配列決定を行った。オープンリーディ
ングフレーム（配列番号1）を表すがGenBank寄託配列に対する有意な相同性を示
さない同一cDNAが、該陽性クローンにおいて数回見出された。この遺伝子をMIF1
と命名し、該cDNAバンク由来の対応プラスミドをpCM480と命名した。このスクリ
ーニング中、他の4つの配列がオープンリーディングフレームを示した。2つはGe
nBank寄託配列と同一であった（すなわち、プラスミドpCM479およびpCM481に対
応するそれぞれセントリン（またはカルトラクチン）およびUBC9）。プラスミド
pCM524由来の、オープンリーディングフレームを示す1つの配列は、サッカロミ
セス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）遺伝子に対する若干の相同性を
タンパク質レベルで示した。オープンリーディングフレームを示す最後の配列は
、GenBank寄託配列に対する相同性を全く示さなかった。

【０１７０】実施例4：MEKK1の種々の欠失断片とGAL4のDNA結合ドメインとの融合タンパク
質の酵母内発現を可能にするベクターの構築プラスミドpCM433のNco1-Nco1断片の欠失は、プラスミドpCM484の入手を可能
にした。このベクターは、Gal4pのDNA結合ドメインに融合したMEKK1pのアミノ酸
353〜672の発現を可能にした。

【０１７１】プラスミドpCM433のPst1-Pst1断片の欠失は、プラスミドpCM485の入手を可能
にした。このベクターは、Gal4pのDNA結合ドメインに融合したMEKK1pのアミノ酸
1〜369の発現を可能にした。

【０１７２】プラスミドpCM433のSac1-Sac1断片の欠失は、プラスミドpCM486の入手を可能
にした。このベクターは、Gal4pのDNA結合ドメインに融合したMEKK1pのアミノ酸
287〜672の発現を可能にした。

【０１７３】実施例5：タンパク質MEKK1とMIF1との相互作用領域の位置決定酵母yCM17株を、実施例1および4に記載の種々のプラスミドおよびpCM480で同
時形質転換した。「材料および方法」に記載のとおりに、β-gal活性を測定した
。これは、MIF1との相互作用に必須のMEKK1の領域の検出を可能にした。実際、2
87〜353の領域がMIF1との相互作用に重要であるらしい（図1を参照されたい）。

【０１７４】実施例6：MEKK1のキナーゼDEAD突然変異体とGAL4のDNA結合ドメインとの融合
タンパク質の酵母内発現を可能にするベクターの構築プラスミドpCM411上で、オリゴヌクレオチド9471および7841でPCR断片を増幅
した。この断片をStu1およびPshA1で消化し、ついで、制限酵素Stu1およびPshA1
で切断されたプラスミドpCM433中に連結した。得られたプラスミドをpCM518と命
名した。

【０１７５】プラスミドpCM518のSac1-Sac1断片の欠失は、プラスミドpCM519の入手を可能
にした。このベクターは、Gal4pのDNA結合ドメインに融合したキナーゼ-dead ME
EK1pのアミノ酸287〜672の発現を可能にした。

【０１７６】プラスミドpCM518のNco1-Nco1断片の欠失は、プラスミドpCM520の入手を可能
にした。このベクターは、Gal4pのDNA結合ドメインに融合したキナーゼ-dead ME
EK1pのアミノ酸353〜672の発現を可能にした。

【０１７７】実施例7：タンパク質MEKK1とGal4のトランス活性化ドメインとの融合タンパク
質およびタンパク質MIF1とGal4のDNA結合ドメインとの融合タンパク質の酵母内
発現を可能にするベクターの構築 Gal4のトランス活性化ドメイン（GAL4TA）に対応する配列と同じリーディング
フレームにてpCM411由来の断片EcoR1-Xho1が導入されたベクターpGAD424（「材
料および方法」）により、タンパク質MEKK1とGal4のトランス活性化ドメインと
の融合タンパク質の発現が達成された。このプラスミドの配列を確認した。この
プラスミドをpCM490と命名した。

【０１７８】 GAL4のDNA結合ドメイン（GAL4DB）に対応する配列と同じリーディングフレー
ムにてpCM480由来の断片EcoR1-Xho1が導入されたベクターpGBT9+2（「材料およ
び方法」）により、タンパク質Mif1とGal4のDNA結合ドメインとの融合タンパク
質の発現が達成された。このプラスミドの配列を確認した。このプラスミドをpC
M491と命名した。

【０１７９】実施例8：タンパク質Mekk1pとMifp1との相互作用領域の位置決定酵母yCM17株を、プラスミドpCM479、pCM480、pCM481、pCM482およびpCM524と
同時に実施例1、4、5、6および7に記載の種々のプラスミドで形質転換した。「
材料および方法」に記載のとおりに、β-gal活性を検出した。タンパク質MEKK1p
のキナーゼ活性が、タンパク質MIF1p（pCM480）、セントリン（pCM479）、およ
びプラスミドpCM482およびpCM524のタンパク質との相互作用に重要であるらしい
。これに対して、タンパク質UBC9p（pCM481）とのその相互作用はキナーゼ活性
の不存在に影響されないらしい（図1を参照されたい）。

【０１８０】実施例9：タンパク質MIF1pをコードする遺伝子の5'部分の同定プラスミドpCM480のインサートの配列に対して又は相互間で高い割合の相同性
を示すGenBankの種々のESTのコレクション（すなわち、EST番号W26888, 受託番
号g1306116; EST番号AA134651, 受託番号g1695513; EST番号F12127, 受託番号g7
06460; EST番号W00383, 受託番号g1271822; EST番号T66207, 受託番号g675252;
EST番号R28239, 受託番号g784374）から、コンセンサス配列を確立することがで
きた。タンパク質MIF1をコードする配列の5'末端を増幅するためのオリゴヌクレ
オチド：5' CGC GGA GAA ATT GTT GGA 3'（配列番号10）/5' CCG ATA TCG CAC T
TG GTC CCC TTT GG 3'（配列番号11）を、このコンセンサス配列から選択した。
Hela細胞cDNAバンク上でPCRを行った後、得られた断片を、該供給業者が提供し
ている説明書に従いプラスミドpCR2中にクローニングして、プラスミドpCM577を
得た。プラスミドpCM577のインサートの配列を確認した。該断片の980個中603個
のヌクレオチドが、プラスミドpCM480のインサートの5'末端と同一であることを
確認した。残りの377ヌクレオチドは、タンパク質MIF1をコードするcDNAの5'末
端部分に対応した。これらの2つの配列を結合させることにより、タンパク質MIF
1の全コード配列（配列番号7）を再構成させることができた。

【０１８１】実施例10：mycタグを有するタンパク質MIF1の哺乳類細胞内発現を可能にする
ベクターの構築オリゴヌクレオチド：5' agcttccaccatggagcagaagctgatctccgaggaggac ctggaa
ttctctcgag3'（配列番号12）および5' gatcctcgagagaattccaggtcctcctcgg agatc
agcttctgctccatggtgga 3'（配列番号3）をペアにし、ついでBamH1およびHind3で
消化されたベクターpCDNA3内に連結してプラスミドpSG47を得た。ベクターpCM48
0由来のSma1-Apa1断片をpSG47のEcoR1およびApa1部位のレベルで挿入して、pCM5
00を得た。ついで該Apa1-Apa1断片を適切な配向でpCM500のApa1部位のレベルで
連結して、プラスミドpCM501を得た。オリゴヌクレオチド：5' CGG GAT CCA TGG
ACA AAG ATT CTC AG 3'（配列番号4）および5' CCG ATA TCG CAC TTG GTC CCC
TTT GG 3'（配列番号11）を使用するPCRにより、タンパク質Miflpをコードする
配列の5'末端をプラスミドpCM577から増幅し、それをBamH1およびEcoRVで消化し
、同様にBamH1およびEcoRVで消化されたベクターｐBluescriptII内に連結した。
得られたプラスミドをpCM525と命名した。このプラスミドの配列を確認した。プ
ラスミドpCM525のBamH1-PshA1断片をプラスミドpCM501のBamH1-PshA1部位のレベ
ルで挿入した。得られたプラスミドpCM562は、CMVプロモーターの制御下、mycタ
グを有するタンパク質Miflpの哺乳類細胞内発現を可能にした。

【０１８２】実施例11：HAタグを有するタンパク質MEKK1pの哺乳類細胞内発現を可能にする
ベクターの構築オリゴヌクレオチド：5' agcttccaccatgtatccgtatgatgtgcctgactacgcagaattct
c tcgag 3'（配列番号5）および5' gatcctcgagagaattctgcgtagtcaggcacatcatacg
gata cagggtgga 3'（配列番号6）をペアにし、ついでBamH1およびHind3で切断さ
れたベクターpCDNA3内に連結してプラスミドpSG52を得た。プラスミドpCM411のE
coR1-Xho1断片をpSG52のEcoR1-Xho1部位のレベルで挿入した。得られたpCM556は
、CMVプロモーターの制御下、HAタグを有するMEKK1pの哺乳類細胞内発現を可能
にした。

【０１８３】実施例12：インビボおよびインビトロでのMIF1の真核性発現 ESTライブラリーのスクリーニングによる試験では、MIF1は多種多様な組織に
おいて発現される。ヒト腫瘍サンプルのノーザンブロット分析は、すべての被検
腫瘍において発現される2.4kbの唯一のメッセンジャーRNAを検出する（図2）。
正常化（normalized）ヒト多組織ブロットのノーザンブロット分析により示され
るとおり、MIF1は、正常組織においても発現される。より強い発現が心臓、膵臓
および胎盤において見出された。この最後の組織においては、異なるメッセンジ
ャーを検出することができた。これらの異なるサイズのメッセンジャーの観察は
、天然スプライシング変異体が存在することを示している。

【０１８４】 NIH3T3細胞における一過性トランスフェクション実験においては、MIF1タンパ
ク質は、Gal4Junレポーターに融合したMEKK1タンパク質でのコトランスフェクシ
ョンにより得られるJNK活性化のレベルを減少させた（図4）。安定なトランスフ
ェクト体をCHOおよびPC12細胞において得た。MIF1タンパク質の過剰発現による
毒性は何ら認められなかった。これは、細胞内で過剰発現された場合に細胞アポ
トーシスを誘導すると報告されているMEKK1の触媒ドメインとは対照的である。

【０１８５】 MIF1のアミノ酸16〜28（S14Y）に対応するペプチドに対するポリクローナル抗
体を産生させた。この抗体は、ヒトおよびマウスの両方のMIF1タンパク質を認識
し、ウエスタンブロットにおけるMIF1タンパク質の検出を可能にした（図5）。

【０１８６】実施例13：MIF1タンパク質を発現する安定クローンの作製 CMVプロモーターの制御下でMIF1 cDNAをコードするプラスミド（pCM562）また
は対照としての空ベクター（pCDNA3）で、細胞をトランスフェクトした。G418耐
性細胞のプールの細胞抽出物をウエスタンブロットにより分析した。結果は、pC
M562で安定にトランフェクトされた細胞が、タグ付きMIF1/MSP58タンパク質を発
現することを示した（図6）。抗myc抗体を使用する免疫蛍光による分析は、G418
耐性細胞のプールにおける種々のレベルのMIF1タンパク質発現から生じた核の不
均一標識を示した。ついで、高レベルのMIF1タンパク質を発現する細胞の個々の
クローニングを行い、36個のクローンをMIF1タンパク質発現に関して試験した。
高レベルの組換えタンパク質の産生に関して、2つのクローンを選択した（#14お
よび#34）（図7）。これらのクローンは、pCDNA3ベクターでトランスフェクトさ
れた対照細胞と比較して増殖速度における有意な相違を示さなかった（図8）。

【０１８７】実施例14：MIF1はソルビトール誘導性JNK活性を阻害する本発明者らは、MEKK1刺激を介したJNK活性化に対するMIF1発現の効果を分析す
るためにCHOMIF1 #34を使用した。

【０１８８】 Yurijiら（Science (1988), vol 282, p1911）は、MEKK1が、200mMソルビトー
ルに応答してJNKを活性化することを示した。ソルビトールによるMEKK1の活性化
に対するMIF1発現の効果を分析するために、本発明者らは、200mMソルビトール
の存在下でCHOMIF1細胞および対照細胞（CHOpCDNA3）を種々の時間（5、15およ
び30分間）インキュベートした。ついで細胞抽出物を調製し、MEKK1活性化（お
よびそれに続くJNK活性化）を、インビトロGST-Jun（1-223）リン酸化試験（「
材料および方法」を参照されたい）を用いて分析した。MIF1発現細胞は、ソルビ
トールのインキュベーションに応答したJNK活性化の阻害（弱いGST-JUNリン酸化
により示される）を示した（図9）。これらの結果は、ソルビトール（200mM）で
の刺激の後に、MIF1が、見掛け上はMEKK1活性の阻害により、JNK活性化を阻害す
ることを示した。

【０１８９】実施例15：ストレス条件においてMIF1はMEKK1と相互作用する細胞内でのMEKK1タンパク質とMIF1タンパク質との相互作用を分析するために
、本発明者らは、GST-MEKK1タンパク質（約120Kda）をコードする組換えプラス
ミドを構築した（「材料および方法」を参照されたい）。CHOMIF1 #34細胞内へ
のトランスフェクションの後、ソルビトール（200mM）を30分間加えるか又は加
えず、ついで細胞を細胞溶解し、GST-タンパク質をGSH-セファロース上に固定し
た。過剰のGSH溶液で溶出した後、タンパク質複合体をTris-グリシン PAGE-SDS
上に分離し、抗GST抗体（図11）または抗myc抗体（図12）を使用するウエスタン
ブロットにより分析した。図11に示されている結果は、細胞抽出物のインキュベ
ーション後にGSTおよびGST-MEKK1がGSHセファロースと相互作用したことを示し
ている。図12は、MIF1-mycタグ付き細胞タンパク質がMEKK1タンパク質と相互作
用したことを示している。この相互作用は、ストレス条件（+ソルビトール）に
おいて、より重要であり（レーン4をレーン3と比較されたい）、このことは、酵
母ツーハイブリッド実験において既に示されているとおり、MIF1-MEKK1相互作用
がMEKK1リン酸化により促進されることを示している。これらの結果は、ツーハ
イブリッド酵母系において得られたデータを証明するものであり、MIF1タンパク
質が細胞内でリン酸化MEKK1タンパク質と相互作用することを示している。

【０１９０】総合すると、これらの結果は、MEKK1タンパク質によるストレスキナーゼカス
ケードの活性をMIF1が阻害しうること、およびそれがMEKK1タンパク質との直接
的相互作用により生じることを証明している。

【０１９１】実施例16：MIF1はMEKK1活性の阻害によりアポトーシスに対する細胞の感受性
を増強する MEKK1の活性化はソルビトールに対する長期暴露による細胞アポトーシスを防
ぎうることが示されている（Yurijinら, (1988), Science vol 282, p1911; Yur
ijinら, (1999), J. Biol. Chem., vol 274, p12605）。

【０１９２】 CHOpCDNA3およびCHOMIF1 #34のアポトーシスに対する感受性を、細胞を200mM
ソルビトール中で24時間インキュベトした後に分析した。結果は、MIF1を発現す
る細胞が、ソルビトール誘導性アポトーシスに対して、対照細胞より感受性であ
ることを示した（図10）。

【０１９３】実施例17：MEKK1-MIF1タンパク質相互作用を破壊する化合物を同定するための
試験本明細書に記載の方法は、MEKK1-MIF1相互作用およびMEKK1のキナーゼ活性を
阻害する薬物の同定を可能にする。この方法は、ツーハイブリッド技術に基づく
（Fields S, Sternglanz R Trends Genet 1994 Aug;10(8):286-92 The two-hybr
id system: an assay for protein-protein interactions/Mendelsohn AR, Bren
t R Curr Opin Biotechnol 1994 Oct;5(5):482-6 Applications of interaction
traps/two-hybrid system to biotechnology research/Bemis LT, Geske FJ, S
trange R. Methods Cell Biol 1995;46:139-51 Use of the yeast two-hybrid s
ystem for identifying the cascade of protein interactions resulting in a
poptotic cell death/White MA. Proc Natl Acad Sci U S A 1996 Sep 17;93(19
):10001-3 The yeast two-hybrid system: forward and reverse/Luban J, Goff
SP Curr Opin Biotechnol 1995 Feb;6(1):59-64 The yeast two-hybrid system
for studying protein-protein interactions./Bai C, Elledge SJ Methods En
zymol 1996;273:331-47 Gene identifications using the yeast two-hybrid sy
stem/Frederickson RM Curr Opin Biotechnol 1998 Feb;9(1):90-6 Macromolecu
lar matchmaking: advances in two-hybrid and related technologies./T Cola
s P, Brent R rends Biotechnol 1998 Aug;16(8):355-63 The impact of one-hy
brid and related methods on biotechnology./Vidal M, Legrain P Nucleic Ac
ids Res 1999 Feb 15;27(4):919-29 Yeast forward and reverse‘n'-hybrid sy
stemに概説されている)。

【０１９４】 DNA結合ドメインに融合した欠失MEKK1または完全長MEKK1を使用する（対応す
るコード配列を、例えば酵母プラスミドpCM433およびpCM486内にクローニングす
る（実施例1および4に記載されてる））。トランスアクチベータードメインに融
合した欠失MIF1または完全長MIF1を使用する（例えば、対応するコード配列をプ
ラスミドpCM480内にクローニングする（実施例3に記載されている））。使用す
る酵母ツーハイブリッド株は、少なくとも1つのレポーター遺伝子（URA3、HIS3
、LEU2、CYH2、CAN1、lacZ、GFPまたは他のレポーター遺伝子が挙げられる）と
、レポーター遺伝子の発現の検出を可能にする関連突然変異（すなわち、レポー
ター遺伝子としてURA3遺伝子を使用する場合にはura3突然変異）とを、各試験化
合物の内部濃度を増加させる追加的な遺伝子突然変異または不活性化の存在下ま
たは不存在下に有する（WO96/10082を参照されたい）。一例として、「材料およ
び方法」に記載の酵母yCM17株を用いる。MEKK1/MIF1相互作用の減少を引き起こ
す薬物は、レポーター遺伝子の発現の減少を誘導する。レポーター遺伝子の発現
をモニターするためには、種々の方法（例えば、レポーター遺伝子にコードされ
る酵素タンパク質の比色／蛍光／発光酵素アッセイ）を用いることができる。酵
母染色体突然変異を相補するレポーター遺伝子に選択的な培地上で、増殖阻害性
ハロ体（halo）を測定することができ、一方、非選択培地上で増殖性ハロ体を測
定することができる（対抗選択が利用可能な場合）（例えば、レポーター遺伝子
がURA3の場合にはフルオロ体含有培地；レポーター遺伝子がCAN1で酵母がcan1突
然変異または不活性化を有する場合にはカナバニン含有培地などである）。酵母
生物学において用いられるこれらのすべての方法は、文献に詳細に記載されてい
る（Methods Enzymol 1991;194:1-863 Guide to yeast genetics and molecular
biology, Methods Enzymol 1983,101:167-346 Recombinant DNA, Biotechnolog
y 1989;13:1-354 Yeast genetic engineering; Methods in molecular biology
1996,53,1-433 Yeast protocols; Molecular Genetics of Yeast: A Practical
Approach, John R. Johnston編集 1994 1-300; The Yeast Two-Htbrid System 1
997 1-356 Paul L. BartelおよびStanley Fields; Methods in Yeast Genetics:
A Laboratory Course Manual 1997; Methods in Yeast Genetics: A Laborator
y Course Manual, 1990）。

【０１９５】 MIF1/MSP58-MEKK1結合のアンタゴニストまたはアゴニストを同定するための二
次スクリーニングの原理を、図13に記載する。MIF1/MSP58を過剰発現する細胞安
定クローン（例えば、クローンCHOMIF #34）を、MEKK1/JNK経路の活性化を表現
するレポーター系でトランスフェクトする（Yujiriら, 1999, J. Biol. Chem. V
ol 274, p12605; Yujiriら, 1998, Science, vol 282, p1911）。プラスミド1は
、MIF1/MSP58をコードし（例えば、pCM562）、ネオマイシン耐性遺伝子を保持す
る。プラスミド2および3は、レポーター遺伝子系Gal4-Jun/Gal 4 Lucを与え（La
ssignal Johnsonら, 1996 J. Biol. Chem. Vol 271, p3229; Guptaら, 1993, Pr
oc. Natl. Acad. Sci. Vol 90, p3216; Hibiら1993, Genes and Dev., Vol 7, p
2135）、異なる他の2つの選択マーカーを保持する（例えば、プラスミド2はハイ
グロマイシン耐性遺伝子を保持し、プラスミド3はゼオシン耐性遺伝子を保持す
る）。プラスミド2は融合タンパク質Gal4_(1-147)-Jun_(1-233)をコードしている
（Hibiら, 1993, Genes and Dev., vol 7, p2135, Sadowskiら, 1989, Nucleic
Acids Res, Vol 17, p7539）。このタンパク質は、レポーター遺伝子ルシフェラ
ーゼの上流のプロモーター内に位置するGal4-DBD配列に結合することが可能であ
り（Guptaら, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. Vol 90, p3216）、Jun部分がリン
酸化されるとルシフェラーゼ遺伝子の転写を活性化する。MEKK1/JNK経路を活性
化する外部刺激は、低濃度（200mM）のソルビトールまたは低温ショックまたは
ノコダゾール（0.5μg/ml）などでありうる（Yujiriら, 1999, J. Biol. Chem.
Vol 274, p12605; Yujiriら, 1998, Science, vol 282, p1911）。被検分子を、
外部刺激の存在下（または前もしくは後）、完全培地内に加える。ルシフェラー
ゼ活性を、製造業者の説明書（Promega）に従う細胞溶解の後に分析し、ルミノ
メーターで測定する。

【０１９６】本発明の範囲は、本明細書に記載の特定の実施形態により限定されるものでは
ない。実際のところ、本明細書に記載のものに加えて本発明の種々の修飾が、前
記の記載および添付図面から当業者に理解されるであろう。そのような修飾は、
添付の請求の範囲の範囲内に含まれると意図される。

【０１９７】さらに、核酸またはポリペプチドに関して与えられた全ての塩基サイズまたは
アミノ酸サイズおよび全ての分子量または分子質量値は概数であり、説明用に記
載されていると理解されるべきである。

【０１９８】本明細書中に引用した種々の刊行物の全体を、参照により本明細書に組み入れ
ることとする。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】トランケート化MEKK1および部分的または完全長MIF1をコードする種々のプラ
スミドの組で形質転換された酵母yCM17株におけるβ-ガラクトシダーゼの活性の
検出。

【図２】ヒト腫瘍サンプルのノーザン分析。該プローブは、完全長MIF1をコードするpC
M562プラスミドから得た1069bpのKpnI-BamHI断片よりなる。該プローブを標準的
方法REDIPRIME（Amersham）で標識し、製造業者の説明書に従いハイブリダイズ
させた。

【図３】ヒト組織のノーザン分析。該プローブは、図2に記載のものと同じであった。

【図４】 MIFの存在下および不存在下にMEKKでトランスフェクトされたNIH3T3細胞上の
ルシフェラーゼ活性。

【図５】 CHO K1細胞抽出物のウエスタンブロット。pcDNA3 MIF1/MSP58プラスミドで細
胞をトランスフェクトするか又はトランスフェクトしなかった。ペプチドS14Y（
アミノ酸残基16〜28）へのポリクローナル抗体の結合により、MIF1の発現を判定
した。

【図６】 CHOトランスフェクト化細胞（プールNeoR）内でのMIF1の発現。CHOK1をpCDNA3
（レーン1）およびpCM562（Mycタグ付きMIF1/MSP58タンパク質をコードする）（
レーン2）でトランスフェクトし、G418で選択した。耐性細胞を集め、細胞溶解
した。細胞抽出物を10％ Tris-グリシンPAGE-SDS上で分離し、エレクトロブロッ
トし、MIF1/MPS58の発現を、抗myc抗体を使用して検出した。ペルオキシダーゼ
と共役した2次抗体を使用するECL系（Amersham）を用いて表現させた。

【図７】安定なクローンにおけるMIF1の発現。96ウェルプレートの細胞懸濁液の限界希
釈により、pCM562でトランスフェクションした後、個々の安定なクローンをNeoR
耐性細胞のプールから誘導した。増幅後、抗myc抗体を使用して各クローン（示
されているクローンは#13、#14および#34である）をMIF/MSP58タンパク質の発現
に関して試験した。クローニング前のトランスフェクト化細胞の細胞抽出物をレ
ーンT+pCM562にローディングした。

【図８】 24ウェルプレート中、完全培地（HAM's F12、10％熱不活性化ウシ胎仔血清、1
％ペニシリン、1％グルタミン、500μG/mkl G418）内に密度1（5.10³細胞/ウェ
ル）で細胞を播いた。各時点で、ウェルを計数し、結果を4個の独立した計数値
の平均で表した。

【図９】 MIF1/MSP58は、ソルビトールで誘導されたJNK活性を阻害する。CHOpcDNA3（空
ベクターを使用して得られたCHO安定クローン）およびCHO-MIF34（MIF1/MSP58を
過剰発現するCHO安定クローン#34）安定細胞を、示されている時間にわたりソル
ビトール（200mM）によるストレスに付し、JNKの活性化に対するMIF1/MSP58の過
剰発現の効果を、サイトゾル抽出物によるGST-Jun（1〜223）基質のリン酸化（
インビトロリン酸化）により直接調べた。

【図１０】 MIF1/MSP58の発現は、緩和な浸透圧ショック（200mMソルビトール）に応答し
たアポトーシスを増強する。細胞を6ウェルプレート内に播き、200mMソルビトー
ルの存在下または不存在下で24時間インキュベートした。ついで、ヨウ化プロピ
ジウム染色後、FACSによりアポトーシスを検出した。

【図１１】 GSH-セファロース上のGST-MEKK1の保持。CHOMIF1/MSP58#34細胞をpBCGST（対
照ベクター、レーン1および2）またはpBCGST-MEKK1（レーン3および4）でトラン
スフェクトし、200mMソルビトールで処理するか（レーン1および3）または処理
しなかった（レーン2および4）。細胞抽出物をGSHセファロース上で固定し、タ
ンパク質複合体を過剰のGSHで溶出した。PAGE-SDS上へのローディング後、結合
タンパク質を抗GST抗体で分析し、ECL系で表現した。結果は、両方のタンパク質
がGSH-セファロースに結合することを示した。

【図１２】 GSTプルダウンは、MIF1/MSP58がMEKK1タンパク質と相互作用することを示して
いる。CHOMIF1/MSP58#34細胞をpBCGST（対照ベクター、レーン1および2）または
pBCGST-MEKK1（レーン3および4）でトランスフェクトし、200mMソルビトールで
処理するか（レーン1および3）または処理しなかった（レーン2および4）。細胞
抽出物をGSHセファロース上で固定し、結合タンパク質をGSHで溶出した。PAGE-S
DS上へのローディング後、MIF-MSP58の存在を、抗myc抗体を使用して検出し、EC
L系で表現した。結果は、MIF1/MSP58がGST-MEKK1に結合すること、および該結合
がストレスにより調節されることを示している。

【図１３】 MIF1/MSP58-MEKK1結合のアンタゴニストまたはアゴニストの同定のための2次
スクリーニングの原理。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｋ 48/00 Ａ６１Ｐ 9/10 ４Ｃ０８４Ａ６１Ｐ 1/16 １０１４Ｃ０８５ 9/10 11/06 ４Ｃ０８６１０１ 17/00 １０１４Ｈ０４５ 11/06 17/02 17/00 １０１ 17/06 17/02 19/02 17/06 19/08 19/02 25/00 19/08 25/28 25/00 27/02 25/28 29/00 27/02 １０１ 29/00 31/12 １０１ 31/18 31/12 35/00 31/18 37/00 35/00 37/06 37/00 43/00 １０５ 37/06 １１１ 43/00 １０５Ｃ０７Ｋ 14/47 １１１ 16/18 Ｃ０７Ｋ 14/47 19/00 16/18 Ｃ１２Ｎ 1/19 19/00 1/21 Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 1/21 Ｃ１２Ｑ 1/02 5/10 1/48 ＺＣ１２Ｐ 21/02 1/68 ＡＣ１２Ｑ 1/02 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ 1/48 33/50 Ｚ 1/68 33/53 ＤＧ０１Ｎ 33/15 Ｍ 33/50 33/566 33/53 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 5/00 Ｂ 33/566 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＵ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＧＤ，ＧＥ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡＦターム(参考） 2G045 AA25 AA40 CB01 DA12 DA13 DA14 DA36 DA77 FB02 FB03 FB07 4B024 AA01 AA11 BA31 BA80 CA04 CA07 CA09 CA12 CA20 DA02 DA05 DA12 EA04 FA02 GA11 GA27 HA13 HA14 HA17 4B063 QA01 QA05 QQ21 QQ41 QQ53 QQ61 QQ79 QQ89 QR32 QR35 QR40 QR56 QR77 QR80 QS33 QS34 QX02 QX10 4B064 AG01 AG31 CA02 CA06 CA10 CA19 CC01 CC24 DA01 DA13 4B065 AA01X AA72X AA90X AA91X AA91Y AA93Y AB01 AC14 BA02 BA25 CA24 CA44 CA46 4C084 AA02 AA13 AA17 BA01 BA03 BA08 BA22 BA23 BA44 DC50 NA05 NA14 ZA011 ZA331 ZA361 ZA451 ZA591 ZA751 ZA891 ZA961 ZB071 ZB081 ZB111 ZB151 ZB211 ZB212 ZB261 ZB331 ZC022 ZC192 ZC202 ZC551 4C085 AA13 BB11 CC03 CC05 4C086 AA01 AA02 AA03 EA16 NA14 ZA33 ZA36 ZA45 ZA59 ZA75 ZA89 ZA96 ZB07 ZB08 ZB11 ZB15 ZB21 ZB26 ZB33 ZC02 ZC19 ZC20 ZC55 4H045 AA10 AA11 AA20 AA30 BA10 BA41 CA40 DA75 DA86 EA20 EA50 FA71 FA74

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】 MEKK相互作用性FHAタンパク質（MIF1）をコードする単離さ
れた核酸であって、 a）それが、配列番号1または配列番号7に由来するオリゴヌクレオチドプライマ
ーを使用するポリメラーゼ連鎖反応（PCR）により増幅されうること； b）それが、ストリンジェントな条件下、配列番号1に示すヌクレオチド配列を有
する核酸にハイブリダイズすること； c）それが、配列番号2、配列番号8、それらのスプライシング変異体およびそれ
らの対立遺伝子変異体よりなる群から選ばれるアミノ酸配列を有するポリペプチ
ドをコードすること； d）それが、配列番号8に示すMIF1のアミノ酸16〜28に対応するペプチドに対して
産生した抗体に特異的に結合するポリペプチドをコードすること；から選ばれる特性を有することを特徴とする単離された核酸。
【請求項２】該MIF1が、配列番号2に示すアミノ酸配列を有する、請求項
１に記載の単離された核酸。
【請求項３】配列番号1に示すヌクレオチド配列を含む、請求項２に記載
の単離された核酸。
【請求項４】該MIF1が、配列番号8に示すアミノ酸配列を有する、請求項
１に記載の単離された核酸。
【請求項５】配列番号7に示すヌクレオチド配列を含む、請求項４に記載
の単離された核酸。
【請求項６】該オリゴヌクレオチドプライマーが、配列番号10、11および
4よりなる群から選ばれる、請求項１に記載の単離された核酸。
【請求項７】ポリペプチドタグをコードする配列を更に含んでいて、キメ
ラタグ付きMIF1タンパク質をコードする、請求項１に記載の単離された核酸。
【請求項８】請求項１に記載の核酸を含んでなるベクター。
【請求項９】 MIF1をコードする配列が、発現コンピテント宿主細胞内での
MIF1ポリペプチドの発現を可能にする発現制御配列に作動的に結合している、請
求項８に記載のベクター。
【請求項１０】 RNA分子、プラスミドDNA分子およびウイルスベクターより
なる群から選ばれる、請求項９に記載のベクター。
【請求項１１】 DNA凝縮タンパク質、正電荷脂質、リポソーム、重合体お
よびDNA沈殿剤よりなる群から選ばれる組成物を更に含むプラスミドDNA分子であ
る、請求項１０に記載のベクター。
【請求項１２】レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、
ヘルペスウイルスおよびワクシニアウイルスよりなる群から選ばれるウイルスベ
クターである、請求項１０に記載のベクター。
【請求項１３】請求項８に記載のベクターでトランスフェクトされた宿主
細胞。
【請求項１４】請求項９に記載のベクターでトランスフェクトされた宿主
細胞。
【請求項１５】細菌細胞、酵母細胞および哺乳類細胞よりなる群から選ば
れる、請求項１４に記載の宿主細胞。
【請求項１６】 a）請求項１４に記載の宿主細胞を、MIF1の発現を可能に
する条件下、培地内で培養し、 b）該培養からMIF1を単離することを含んでなる、MIF1の製造方法。
【請求項１７】ストリンジェントな条件下、配列番号7に示す配列または
相補的配列を有するヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも10塩基のオリ
ゴヌクレオチド。
【請求項１８】完全長MIF1をコードするpCM562プラスミドから得られた10
69bpのKpnI-BamHI断片である、請求項１７に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１９】配列番号10、配列番号11および配列番号4よりなる群から
選ばれるヌクレオチド配列を有する、請求項１７に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２０】単離されたMEKK相互作用性FHAタンパク質（MIF1）であっ
て、 a）それが、請求項１に記載の核酸にコードされること； b）それが、配列番号2、配列番号8、それらのスプライシング変異体およびそれ
らの対立遺伝子変異体よりなる群から選ばれるアミノ酸配列を有すること；およ
び c）それが、配列番号8に示すMIF1のアミノ酸16〜28に対応するペプチドに対して
産生した抗体に特異的に結合すること；よりなる群から選ばれる特性を有することを特徴とする単離されたタンパク質。
【請求項２１】マウスタンパク質である、請求項２０に記載の単離された
タンパク質。
【請求項２２】ヒトタンパク質である、請求項２０に記載の単離されたタ
ンパク質。
【請求項２３】配列番号2に示すアミノ酸配列を含む、請求項２０に記載
の単離されたタンパク質。
【請求項２４】配列番号8に示すアミノ酸配列を含む、請求項２０に記載
の単離されたタンパク質。
【請求項２５】ポリペプチドタグを含むキメラタグ付きMIF1タンパク質で
ある、請求項２０に記載の単離されたタンパク質。
【請求項２６】単離されたMEKK相互作用性FHAタンパク質（MIF1）の断片
である抗原性ペプチドであって、 a）該MIF1が、請求項１に記載の核酸にコードされること； b）該MIF1が、配列番号2、配列番号8、それらのスプライシング変異体およびそ
れらの対立遺伝子変異体よりなる群から選ばれるアミノ酸配列を有すること；お
よび c）該MIF1が、配列番号8に示すMIF1のアミノ酸16〜28に対応するペプチドに対し
て産生した抗体に特異的に結合すること；よりなる群から選ばれる特性を該MIF1が有することを特徴とする抗原性ペプチド
。
【請求項２７】配列番号8のアミノ酸16〜28に対応するアミノ酸配列を有
する、請求項２６に記載の抗原性ペプチド。
【請求項２８】請求項２０に記載のMIF1タンパク質に特異的に結合する抗
体。
【請求項２９】配列番号8のMIF1アミノ酸16〜28を特異的に認識する、請
求項２８に記載の抗体。
【請求項３０】ポリクローナルである、請求項２８に記載の抗体。
【請求項３１】 MIF1をコードするmRNAの細胞内での発現を検出するための
方法であって、 a）該細胞由来のサンプルと、検出可能な請求項１７に記載のオリゴヌクレオチ
ドとを接触させ、 b）該サンプル中のmRNAに対する該オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーショ
ンを検出することを含んでなり、 mRNAに対する該オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションの検出が、MIF1を
コードするmRNAの発現を示すことを特徴とする方法。
【請求項３２】細胞内でのMIF1タンパク質の発現を検出するための方法で
あって、 a）該細胞由来のサンプルと請求項２８に記載の抗体とを、該サンプル中のMIF1
タンパク質への該抗体の結合を可能にする条件下で接触させ、 b）該サンプル中のタンパク質への該抗体の結合を検出することを含んでなり、
該タンパク質への該抗体の結合の検出が、該細胞内でのMIF1の発現を示すことを
特徴とする方法。
【請求項３３】 MIF1の活性をモジュレーションする分子に関するスクリー
ニング方法であって、 a）配列番号8に示すアミノ酸配列を有するタンパク質、配列番号8に示すアミノ
酸配列を有するタンパク質の対立遺伝子変異体、配列番号8に示すアミノ酸配列
を有するタンパク質のスプライシング変異体、および配列番号8に示すアミノ酸
配列を有するタンパク質の異種由来相同タンパク質よりなる群から選ばれるMIF1
タンパク質と候補分子とを接触させ、 b）該MIF1タンパク質への該分子の結合を検出することを含んでなる方法。
【請求項３４】 MIF1への該分子の結合の検出が、MIF1とMEKKとの相互作用
のモジュレーションの検出を含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】 MEKKのMIF1結合ドメインと転写アクチベーターのDNA結合
ドメインとよりなるキメラタンパク質の制御下で発現されるレポーター遺伝子の
発現レベルの変化を、MIF1および該MEKKキメラタンパク質でトランスフェクトさ
れた細胞系内で検出することを、MIF1とMEKKとの相互作用のモジュレーションが
含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】発現の検出が、一過性にトランスフェクトされた哺乳類細
胞におけるものである、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】該分子がMIF1のアゴニストである、請求項３３に記載の方
法。
【請求項３８】該分子がMIF1のアンタゴニストである、請求項３３に記載
の方法。
【請求項３９】細胞内のMIF1タンパク質のレベルを増加させることを含ん
でなる、該細胞内のMEKK活性を減少させる方法であって、該MIF1タンパク質が、配列番号8に示すアミノ酸配列を有するタンパク質、配列
番号8に示すアミノ酸配列を有するタンパク質の対立遺伝子変異体、配列番号8に
示すアミノ酸配列を有するタンパク質のスプライシング変異体、および配列番号
8に示すアミノ酸配列を有するタンパク質の異種由来相同タンパク質よりなる群
から選ばれることを特徴とする方法。
【請求項４０】該異種由来相同タンパク質がマウスMIF1タンパク質である
、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】該細胞が、該MIF1タンパク質の発現を可能にする条件下、
MIF1をコードするベクターでトランスフェクトされている、請求項３９に記載の
方法。
【請求項４２】細胞内のMIF1タンパク質のレベルを減少させることを含ん
でなる、該細胞内のMEKK活性を増加させる方法であって、該MIF1タンパク質が、配列番号8に示すアミノ酸配列を有するタンパク質、配列
番号8に示すアミノ酸配列を有するタンパク質の対立遺伝子変異体、配列番号8に
示すアミノ酸配列を有するタンパク質のスプライシング変異体、および配列番号
8に示すアミノ酸配列を有するタンパク質の異種由来相同タンパク質よりなる群
から選ばれることを特徴とする方法。
【請求項４３】細胞内条件下でMIF1 mRNAにハイブリダイズするMIF1アン
チセンス核酸を該細胞内に導入することにより、MIF1タンパク質のレベルを減少
させる、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】 MIF1に特異的に結合する一本鎖Fv抗体（scFv）を、MIF1に
結合しそれを不活性化するのに十分なレベルで該細胞内に導入することにより、
MIF1タンパク質のレベルを減少させる、請求項４２に記載の方法。