DE69930378T2

DE69930378T2 - Therapeutischer wirkstoff gegen ngf

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Publication number: DE69930378T2
Application number: DE69930378T
Authority: DE
Inventors: Alan George S. Robertson; Jane Shelley ALLEN; David Dawbarn
Original assignee: University of Bristol
Current assignee: University of Bristol
Priority date: 1998-04-09
Filing date: 1999-04-09
Publication date: 2007-01-11
Anticipated expiration: 2019-04-10
Also published as: US20030097667A1; EP1661994A1; ID29596A; JP2002511262A; WO1999053055A3; EP1068315B1; CA2325332A1; EP1068315A2; ZA200005821B; DE69930378D1; AU3433699A; GB9807781D0; KR20010042565A; ATE320490T1; KR100624881B1; US20070067856A1; AU769317B2; WO1999053055A2

Description

Die Erfindung betrifft therapeutische Mittel und Screening-Verfahren. Insbesondere betrifft die Erfindung die Verwendung der Ig2-Domäne der Tyrosinkinase TrkA und Fragmenten davon bei der Behandlung von Störungen, bei denen die Spiegel von Neurotrophinen wie NGF erhöht sind, wie beispielsweise bei Schmerzerkrankungen. Sie betrifft auch die Verwendung der TrkAIg2-Domäne als ein Target zum Screenen von Verbindungen, die der Wirkung von Neurotrophinen wie NGF entgegenwirken oder diese imitieren. TrkAIg ist hier so definiert, dass es die TrkAIg-ähnliche Subdomäne 2 zusammen mit der prolinreichen Region (1A) mit umfasst.
Der Nervenwachstumsfaktor (Nerve Growth Factor, NGF) ist ein potenter neurotropher Faktor für cholinerge Vorhirnneuronen und fördert das Überleben und die Differenzierung von sympathischen und sensorischen Neuronen während der Entwicklung. Im Tiermodell ist gezeigt worden, dass mit der Verabreichung von NGF die Wirkungen von cholinerger Atrophie in alten oder verletzten Tieren korrigiert werden kann. Gereinigter Maus NGF ist zur Behandlung der Alzheimer Erkrankung verwendet worden. Bei dieser Behandlung ist jedoch eine invasive Chirurgie erforderlich und eine langfristige Lösung wäre die Bildung von kleinen Molekülagonisten, die in der Lage sind, die trophischen Aktionen von NGF zu imitieren. NGF liegt üblicherweise als ein Dimer vor, für diese Zwecke umfasst der Begriff NGF jedoch monomere, dimere, trimere und heterodimere Formen.
Es gibt Anzeichen dafür, dass NGF auch als ein Mediator für einige anhaltende Schmerzzustände wirken kann (McMahon S. B. Series B-Biological Sciences, (1996), Bd. 351, Nr. 1338, 431–440), und zwar durch Wechselwirkung mit Rezeptoren auf noziceptiven primären Afferenzen. In einer Vielzahl von experimentellen entzündlichen Zuständen steigen die NGF-Konzentrationen in dem entzündeten Gewebe rasch an. Die systematisch bzw. systemische oder lokale Anwendung von exogenem NGF erzeugt gleichfalls ein rasches und anhaltendes hyperalgetisches Verhalten sowohl bei Tieren als auch bei Menschen. In einer Reihe von Tiermodellen wird ein großer Teil der Hyperalgesie, die mit experimenteller Entzündung verbunden ist, durch Moleküle blockiert, die in der Lage sind, NGF zu sequestrieren, einschließlich Antikörpern. Daher können peripher wirkende NGF-sequestrierende Mittel oder NGF-Antagonisten potentiell zur Behandlung von einigen chronischen Schmerzzuständen verwendet werden.
Eine periphere Entzündung wird üblicherweise charakterisiert durch eine erhöhte Schmerzempfindlichkeit oder Hyperalgesie, welche die Folge der Freisetzung von Ent zündungsmediatoren, Zytokinen und Wachstumsfaktoren ist. NGF scheint eine zentrale Rolle bei der Schmerzmediation zu spielen durch seine Wirkung auf die TrkA-Rezeptoren einer Untergruppe der noziceptiven sensorischen Neuronen des Spinalganglions (dorsal root ganglion, DRG). Beim Erwachsenen umfasst dies einige 40% der DRG-Zellen. Diese Neuronen exprimieren auch die Peptide Substanz P und das Calcitonin-Gene-Related Peptid (CGRP). Durch die Wirkung von NGF auf TrkA-Rezeptoren resultiert ein Anstieg der Neuropeptidkonzentrationen in diese sensorischen Neuronen; zusätzlich werden Natrium- und Calciumkanäle beeinflusst, so dass diese Neuronen eine erhöhte Erregbarkeit aufweisen. Diese Wirkungen können zu einem Anstieg des Schmerzniveaus führen. NGF-sequestrierende Mittel wie die extrazellulären TrkA-Domänen können somit potentiell zum Absenken dieses Schmerzniveaus verwendet werden.
Unter Bedingungen einer ständigen NGF-Hochregulierung kann eine chronische Entzündung zu einem anhaltenden Schmerzzustand führen. Es gibt verschiedene Modelle der chronischen Entzündung, die eine exogene Verabreichung von NGF oder seine Hochregulierung mit umfassen. Ein derartiges Modell (Woolf, C. J. et al. British Journal Of Pharmacology, (1997), Bd. 121, Nr. 3, 417–424) ist das durch intraplantare Injektion von komplettem Freund's Adjuvans in erwachsenen Ratten induzierte. Dieses erzeugt eine örtliche Entzündung der Hinterpfote mit Anstieg der TNF-β-, IL-1-β- und NGF-Spiegel. Es ist berichtet worden, dass TNF-α-Injektionen einen Anstieg der Wärmeempfindlichkeit und der mechanischen Empfindlichkeit erzeugen, der durch vorherige Verabreichung von Anti-NGF-Antiserum abgemildert wird. Es ist auch bekannt, dass die Verabreichung von Carrageenan einen spezifischen Anstieg der NGF-mRNA-Spiegel (von bis zu 500%) verursacht, die für andere Neurotrophine wie NT-3 und BDNF nicht festgestellt wird.
In chronischen entzündlichen Zuständen können die Wirkungen von ständig erhöhten NGF-Spiegeln zu einem langfristigen behindernden Schmerzzustand führen. Beispiele hierfür können einige Formen Blasenzystitis sein, bei der erhöhte Spiegel von NGF in Biopsin gefunden worden sind (Lowe, E. M. et al., British Journal Of Urology, (1997), Bd. 79, Nr. 4, 572–577). Ein Rattenmodell für humane chronische Zystitis, die durch Verabreichung eines reizenden chemischen Stoffes induziert wurde, kann, wiederum durch NGF-Sequestrierung, durch Verabreichung von TrkA-Immunoadhäsin behandelt werden (Dmitrieva, N. et al., Neuroscience, (1997), Bd. 78, Nr. 2, 449–459). Durch systemische Behandlung mit dem NGF-sequestrierenden Molekül konnten etablierte entzündliche Veränderungen um etwa 30–60% teilweise und signifikant rückgängig gemacht werden. Es ist ebenfalls gezeigt worden, dass die Verabreichung von exogenem NGF in das Lumen der Harnblasen normaler Ratten eine rasche und markante Blasenhyperflexie ähnlich derjenigen hervorruft, die bei experimenteller Entzündung festgestellt wird. Es ist auch wahrscheinlich, dass chronisch erhöhte NGF-Spiegel sowohl zu peripherer Sensibilisierung von Noziceptoren und zentraler Sensibilierung von Dorsalhornneuronen und möglicherweise sogar langfristigen sensorischen neuronalen Anomalitäten führen (Mc-Mahon, S. B. Series B-Biological Sciences, (1996), Bd. 351, Nr. 1338, 431–440).
Bei Arthrose sind in der Synovialflüssigkeit hohe Konzentrationen von NGF beobachtet worden. Es ist auch gezeigt worden, dass transgene arthritische Mäuse erhöhte NGF-Konzentrationen und einen Anstieg in der Anzahl der Mastzellen aufweisen (Aloe, L. et al., International Journal Of Tissue Reactions-Experimental And Clinical Aspects, (1993), Bd. 15, Nr. 4, 139–143). Gereinigte NGF-Antikörper, die in arthritische transgene Mäuse injiziert werden, verursachen eine Reduktion der Anzahl der Mastzellen sowie eine Abnahme der Histamin- und Substanz P-Spiegel im Synovium (Aloe, L. et al., Rheumatology International, (1995), Bd. 14, Nr. 6, 249–252).
Es scheint auch wahrscheinlich, dass die Postherpes-Neuralgie (PHN), die mit der Erkrankung Gürtelrose verbunden ist, die Hochregulierung von NGF-Protein involvieren kann. Das Varicella-Zoster-Virus (VZV) ist ein α-Herpesvirus, das für zwei menschliche Erkrankungen verantwortlich ist: Hühnerpocken in der Kindheit (Varicella) und Gürtelrose. Das Virus bleibt latent in Spinalganglien und kann im späteren Leben wieder auftauchen, wobei es sich die Verschlechterung der Immunfunktion zu Nutze macht, die mit dem Älterwerden einhergeht. Eine Reaktivierung verursacht Herpes Zoster, im Allgemeinen bekannt als Gürtelrose. Das Auftreten von Herpes Zoster nimmt mit fortschreitendem Alter zu. Schmerzen, Allodynie und Empfindungsverlust in dem betroffenen Dermatom sind die zentralen Manifestationen der Störung. Starker Schmerz ist die Hauptursache für akute und chronische Krankhaftigkeit bei Patienten mit Herpes Zoster. Der chronische und oftmals schwächende Schmerz, PHN, ist die häufigste Komplikation bei Herpes Zoster. Bis zu 50% der älteren Patienten, die Gürtelrose haben, können PHN entwickeln. In geeigneter Weise systemisch verabreichte Antivirenmittel können den Schmerz bei akuter Gürtelrose stark erleichtern, auch Antidepressiva können hilfreich sein; herkömmliche Analgetika sind jedoch im Allgemeinen wenig hilfreich, obwohl bei einigen Patienten mit Opioiden, insbesondere Methadon, eine gewisse Erleichterung erreicht worden ist. Die Schwierigkeit beim Testen der Wirkungen einer Anti-NGF-Behandlung liegt darin, dass das Modell für Gürtelrose bei der Ratte nicht möglich ist, es gibt lediglich ein Katzenmodell. Es kann jedoch möglich sein, solche Behandlungen bei menschlichen Patienten zu untersuchen, und zwar mit der Möglichkeit, die NGF-Spiegel zu reduzieren und die damit verbundenen Schmerzen zu mildern.
Chronische entzündliche Zustände sind weit verbreitet und die derzeitigen Therapien sind stark eingeschränkt. Es wird beispielsweise geschätzt, dass in den Vereinigten Staaten 37,9 Millionen Menschen von Arthritis und 450.00 Menschen von interstitieller Zystitis betroffen sind. In einer Studie über rheumatoide Arthritis hatten über 80% der Patienten starke Schmerzen trotz der Tatsache, dass die Mehrheit Analgetika einnahmen. Für interstitielle Arthritis, die durch schmerzhafte Blasensymptome charakterisiert ist, gibt es ebenfalls keine wirksame Therapie.
NGF ist ein Mitglied aus einer Familie von Neurotrophinen, die an der Entwicklung und Aufrechterhaltung des peripheren und zentralen Nervensystems beteiligt sind. NGF kann aus verschiedenen Quellen isoliert werden, hauptsächlich aus den Speicheldrüsen männlicher Mäuse. Er kann zunächst als 75 NGF isoliert werden, benannt nach seinem Sedimentationskoeffizienten, der ein Komplex aus β-NGF und γ-NGF ist. 2.5S NGF kann hieraus erhalten werden. Es ist bekannt, dass 2.5S NGF für die neurotrophe biologische Aktivität des Komplexes verantwortlich ist. 2.5S NGF ist β-NGF, jedoch häufig am Amino- und Carboxyterminus teilweise proteolysiert. Die anderen Mitglieder umfassen beispielsweise BDNF, NT-3 und NT-4. Sämtliche Neurotrophine binden an einen gemeinsamen Rezeptor p75NGFR. Jeder bindet auch an ein Mitglied einer homologen Familie von Tyrosinkinaserezeptoren: NGF bindet an TrkA, BDNF und NT-4 binden an TrkB, und NT-3 bindet an TrkC. NT-3 kann mit reduzierter Affinität auch an TrkA und TrkB binden.
Obwohl die dreidimensionale Struktur der extrazellulären TrkA-Domäne unbekannt ist, sind einzelne Strukturmotive in der Sequenz charakterisiert worden (1A). Die extrazelluläre Domäne von Trk umfasst drei leucinreiche Tandemmotive (LRM, leucine rich motifs), die von zwei Cysteinclusterregionen flankiert sind, an die sich zwei immunoglobulinähnliche (Ig-ähnliche) Domänen anschließen. Basierend auf der Sequenzhomologie mit dem neuralen Zelladhäsionsmolekül und dem Platelet Derived Growth Faktor (PDGF)-Rezeptor, sind die Ig-ähnlichen Domänen bislang so klassifiziert worden, dass sie zu der C2-Klasse der Immunoglobulin-Superfamilie (IgSF) gehören (Williams, AF, und Barclay AN (1988) Ann Rev Immunol 6, 381–405). Zahlreiche Untersuchungen haben Neurotrophinreste definiert, die mit p75NGFR und Trk-Rezeptoren interagieren, es ist jedoch wenig über die Trk-Reste bekannt, die bei der Bindung der Neurotrophine beteiligt sind.
Kürzlich haben zwei Gruppen gezeigt, dass die Ig-ähnlichen Domänen der Trk-Rezeptoren eine wichtige Rolle bei der Bindung von Neurotrophinliganden und der Rezeptoraktivierung spielen. Perez P. et al. (Molecular and Cellular Neuroscience 6: 97–105 (1995)) schloss, dass beide Ig-ähnlichen Domänen für die Bindung von NGF an TrkA von Bedeutung sind. Urfer, R. et al. (EMBO J. 14 S. 2795–2805 (1995)) schloss, dass die zweite Ig-ähnliche Subdomäne und prolinreiche Region, Ig2 (1A) die Hauptkontakte für die NGF-Bindung bereitstellen. Diese Gruppe berechnete auch ein Modell für diese Domäne voraus, basierend auf der Struktur der 1VCA-Domäne 1 (Urfer, R. et al. (1998) J. Biol. Chem 273 5829–5840).
Die extrazelluläre Domäne von TrkA weist eine Länge von 375 Aminosäuren auf. Die Erfinder haben kürzlich gezeigt, dass ein Protein, das die zwei Immunoglobulinähnlichen Domänen und die prolinreiche Region (Aminosäuren 160–375) umfasst, alleine in der Lage sind, mit einer Affinität an NGF zu binden, die derjenigen der kompletten extrazellulären Domäne ähnlich ist (Holden P. H et al. (1997) Nature Biotechnology 15: 668–672). Diese Region ist hier als TrkAIg1,2 definiert worden. Überraschenderweise haben die Erfinder gefunden, dass selbst eine kleinere Domäne von TrkA, die als TrkAIg2 (Aminosäuren 253–375) bezeichnet wird, in der Lage ist, NGF mit einer ähnlichen Affinität wie die komplette extrazelluläre Domäne oder die TrkAIg1,2-Region zu binden und somit in erster Linie für seine Bindungseigenschaften verantwortlich ist.
Die Erfinder haben gezeigt, dass die rekombinanten Ig-ähnlichen Domänen in der Lage sind, Neurotrophine wie NGF mit hoher Affinität zu binden und die biologische Aktivität von NGF in vitro und in vivo zu inhibieren. Insbesondere trägt TrkAIg2, definiert durch die Aminosäuren 253–375 (1A), hauptsächlich zur NGF-Bindung bei. Die Erfinder haben Molekularmodelltechniken verwendet, um ein Modell der TrkAIg1- und TrkAIg2-Domänen zu erstellen. Überraschenderweise haben sie gefunden, dass die Trklg2-ähnliche Subdomäne 2 nicht zur Klasse C2 gehört sondern zum V-Set der Ig-ähnlichen Domänen (1B).
Dies gibt Anlass zu mehreren Einsatzmöglichkeiten für TrkAIg2 und davon abgeleiteten Polypeptiden. Strukturdaten aus Kokristallen von TrkAIg2-NGF kennzeichnen die Reste in TrkA, die an der Bindung von NGF beteiligt sind. Dies ermöglicht das rationale Design von Neurotrophinmimetika, insbesondere NGF-Mimetika. Immobilisierte TrkAIg2 kann als ein Target für Phagendisplaybibliotheken sowie als kombinatorische chemische Bibliotheken und Pilzextrakte verwendet werden. Dies ermöglicht eine Auswahl von Molekülen, die in der Lage sind, TrkA zu binden und somit am Rezeptor entweder als Agonisten oder Antagonisten zu agieren. Eine dritte Verwendung von TrkAIg2 ist eine als therapeutisches Mittel für eine Reihe chronischer Schmerzzustände. NGF ist insbesondere von Bedeutung für periphere sensorische Neuronen. Es liegt nahe, dass NGF für einige anhaltende Schmerzzustände durch Interaktion mit Rezeptoren auf noziceptiven primären Afferenzen als ein Mediator agieren kann und dass peripher agierende NGF-Antagonisten hilfreich sein können bei der Behandlung einiger chronischer Schmerzzustände wie beispielsweise rheumatoider Arthritis, interstitieller Zystitis und Gürtelrose.
In einem ersten Aspekt der Erfindung wird ein Polypeptid bereit gestellt, das aus der Aminosäuresequenz der Reste 22 bis 119 von 4(B) oder aus der Aminosäuresequenz der Reste 22 bis 144 von 4(B) besteht und die ein Neurotrophin bindet. Das Polypeptid kann TrkAIg1,2 oder ein Teil davon sein. Ein solches Peptid kann durch chemische oder biologische Mittel hergestellt werden.
Die gesamte Codierungssequenz von natürlichem TrkA wird ausgeschlossen.
Das Polypeptid kann von Tierzellen stammen. Bevorzugt wird das Polypeptid aus Säugerzellen ausgewählt und insbesondere kann es aus menschlichen Zellen ausgewählt werden. Alternativ kann das Polypeptid aus Vogelzellen einschließlich Hühnerzellen oder Reptilien oder Amphibien oder Fischen oder Insekten ausgewählt werden.
Vorzugsweise ist das Neurotrophin NGF, NT-3 oder ein Neurotrophin, das p75 NGFR bindet. Ein solches Neurotrophin kann in monomerer, dimerer, trimerer oder heterodimerer Form vorliegen und es kann von einem Säugetier wie beispielsweise einem Menschen stammen.
In einem zweiten Aspekt der Erfindung wird eine DNA-Sequenz bereit gestellt, die ein Polypeptid gemäß dem ersten Aspekt der Erfindung codiert; oder Varianten einer solchen DNA-Sequenz aufgrund der Degeneration des genetischen Codes oder Insertions- oder Deletionsmutanten davon, die ein Polypeptid gemäß dem ersten Aspekt der Erfindung codieren. Diese DNA-Sequenz kann in ein Plasmid oder einen anderen Vektor wie beispielsweise pET15b (2A) insertiert werden.
In einem weiteren Aspekt der Erfindung wird ein Komplex bereit gestellt, der ein Polypeptid gemäß einem ersten Aspekt der Erfindung in Kombination mit mindestens einem Neurotrophin oder einer Neurotrophinuntereinheit, wie beispielsweise NGF oder NT-3, umfasst.
In einem weiteren Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren bereit gestellt zur Herstellung eines Polypeptids gemäß einem ersten Aspekt der Erfindung, das das Einführen einer DNA-Sequenz gemäß einem zweiten Aspekt der Erfindung in einen geeigneten Wirt und Kultivieren dieses Wirts umfasst, wodurch TrkAIg2 exprimiert wird. Ein geeigneter Wirt kann ausgewählt werden aus Tierzellen wie beispielsweise Bakterienzellen, Insektenzellen und Säugerzellen, insbesondere menschlichen Zellen.
Darüber hinaus kann TrkAIg2 in geeigneter Weise als ein Target für einen Hochdurchsatzscreen für Moleküle verwendet werden, die an den TrkA-Rezeptor binden, wobei ein Polypeptid gemäß einem ersten Aspekt der Erfindung verwendet wird. Ein solches Verfahren kann die Verwendung von Phagen- oder Peptiddisplaybibliotheken, kombinatorischen chemischen Bibliotheken und Pilzextrakten, und ELISA-Techniken, mit umfassen.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung umfasst die vergleichende Bindung eines mutmaßlichen Liganden an zumindest einen Teil von TrkAIg1 mit seiner Bindung an zumindest einen Teil von TrkAIg2. Derartige Verfahren können das Auswählen von Molekülen mit umfassen, die an mindestens eine solvensexponierte Schleife von TrkAIg2 binden, beispielsweise die E- oder F-Schleife oder C''- bis D-Schleife, wie in 1(B) gezeigt ist. Die ausgewählten Moleküle können die Bindung eines Polypeptids gemäß einem ersten Aspekt der Erfindung, oder zumindest eines Teils von TrkA in seinem natürlichen Zustand, an ein Neurotrophin verbessern.
In einem weiteren Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren der kombinatorischen Chemie bereit gestellt, das die Bildung von Verbindungen und das Sreenen der Verbindungen unter Verwendung ihrer Bindungsaffinitäten an ein Polypeptid gemäß einem ersten Aspekt der Erfindung umfasst.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung umfasst eine Wirtszelle, die ein Polypeptid gemäß einem ersten Aspekt der Erfindung umfasst, das auf einem Plasmid getragen wird. Eine solche Wirtszelle kann eine Säugetierzelle (einschließlich Menschenzelle), Bakterien-, Insekten-, Hefe-, Vogel-, Amphibien-, Fisch- oder Reptilienzelle sein.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung umfasst eine Diagnosesonde, die einen Teil eines Polypeptids gemäß einem ersten Aspekt der Erfindung umfasst. Die Sonde kann mit einem Fluoreszenz- oder Radiomarker markiert sein.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung umfasst einen Organismus, der konstruiert wurde, um ein Polypeptid gemäß einem ersten Aspekt der Erfindung zu exprimieren, wobei der Organismus nicht-menschlich ist.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung umfasst eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Verwendung in einem Verfahren zur Behandlung eines Patienten mit Schmerzen, die mit erhöhten Neurotrophin-Polypeptidspiegeln verbunden sind, wobei die pharmazeutische Zusammensetzung ein Polypeptid gemäß einem ersten Aspekt der Erfindung umfasst.
Der Schmerz kann ein Symptom von ISU, interstitieller Zystitis, Arthritis, Gürtelrose, peripherer Entzündung, chronischer Entzündung oder Postherpes-Neuralgie sein.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung umfasst eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Verwendung in einem Verfahren zur Behandlung eines Patienten mit Alzheimer-Erkrankung, wobei die pharmazeutische Zusammensetzung ein Polypeptid gemäß einem ersten Aspekt der Erfindung umfasst.
Eine Zusammensetzung, die ein Polypeptid gemäß einem ersten Aspekt der Erfindung umfasst, kann verwendet werden, um in einem Patienten die freien NGF-Spiegel zu senken.
Sämtliche vorherigen Bezugnahmen auf Neurotrophin schließen NGF und NT-3 mit ein.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung umfasst einen Kristall, der ein Polypeptid gemäß einem ersten Aspekt der Erfindung umfasst, insbesondere ein TrkAIg2-Polypeptid.
Die Erfindung wird nun lediglich anhand von Beispielen unter Bezugnahme auf die beigefügten Zeichnungen 1 bis 20 beschrieben, in denen
1(A) eine schematische Darstellung der TrkA-Struktur ist (die gefüllten Kreise stellen übereinstimmende Glycosylierungsstellen dar);
1(B) ein Strukturmodell für TrkAIg1 und TrkAIg2 zeigt; die wichtigsten Bindungsdeterminanten treten vermutlich in der Schleife auf, die die Stränge E und F (die EF-Schleife) verbindet.
2(A) eine Restriktionskarte des Plasmids pET15b ist;
2(B) die Sequenz von Oligonukleotiden zeigt, die die zum Amplifizieren von TrkAIg1,2 verwendet wird.
3 die Nukleotidsequenz des Inserts von pET15b-TrkAIg1,2 und die davon abgeleitete Aminosäuresequenz zeigt;
4(A) die Nukleotidsequenz und abgeleitete Aminosäuresequenz von his TrkAIg1 zeigt;
4(B) die Nukleotidsequenz und abgeleitete Aminosäuresequenz von his TrkAIg2 zeigt;
4(C) die TrkAIg2-Domäne einer Splice-Variante von TrkA einschließlich des Sechs-Aminosäureinserts in der prolinreichen Region zeigt, das an NT-3 binden kann;
5 ein Gel ist, das die Expression von TrkAIg1,2, TrkAIg1 und TrkAIg2 veranschaulicht;
6(A) ein Gel ist, das die Reinigung von TrkAIg2 veranschaulicht;
6(B) ein Gel ist, das die Reinigung von TrkAIg1 veranschaulicht;
7(A) ein Elutionsprofil von TrkAIg1 aus Poros 20HQ nach der Rückfaltung zeigt;
7(B) ein Elutionsprofil von TrkAIg 2 aus Poros 20HQ nach der Rückfaltung zeigt;
8 ein Spektrum des zirkularen Dichroismus von TrkAIg2 zeigt. Die molekulare Elliptizität (q) ist als eine Funktion der Wellenlänge angegeben.
9 einen kompetitiven Bindungsassay für TrkAIg1,2 und TrkAIg2 zeigt; die Achse ist in der logarithmischen Skala als 1 × 10^–11 bis 1 × 10^–5 M angegeben.
10 Oberflächenplasmonen-Resonanz (surface plasmon resonance, SPR) von NGF zeigt, das an immobilisiertes TrkAIg2 bindet;
11 die Ergebnisse der Bindungsexperimente veranschaulicht, bei denen TrkAIg2 (2mM) und TrkAIg1 (2mM) separat mit einer Standardkurve von bNGF (0–1000pM) inkubiert wurden;
12 die Ergebnisse von Bindungsexperimenten veranschaulicht, wobei zunehmende Konzentrationen von bNGF (1–200mM) separat mit 2mM TrkAIg1 oder 2mM TrkAIg2 inkubiert wurden;
13 die Wirkung von TrkAIg2 auf NGF-abhängiges Neuritenwachstum von PC12-Zellen zeigt.
14A bis F die Wirkung von co-injiziertem TrkAIg1,2 auf NGF-induzierte Plasmaextravasation veranschaulicht;
15 den Effekt einer 5-minütigen Vorbehandlung mit TrkAIg1,2 auf NGF-induzierte Plasmaextravasation veranschaulicht;
16 den Effekt einer 40-minütigen Vorbehandlung mit TrkAIg1,2 auf NGF-induzierte Plasmaextravasation veranschaulicht;
17 den Effekt von co-injiziertem TrkAIg1 auf NGF-induzierte Plasmaextravasation veranschaulicht;
18 den Effekt einer Koinjektion von TrkAIg2 auf NGF-induzierte Plasmaextravasation veranschaulicht;
19 den Effekt einer 5-minütigen Vorbehandlung mit TrkAIg2 auf NGF-induzierte Plasmaextravasation veranschaulicht;
20 den Effekt einer 40-minütigen Vorbehandlung mit TrkAIg2 auf NGF-induzierte Plasmaextravasation veranschaulicht.
21 die Koordinationsdaten für das Modell von 1(B) angibt.
Vorhersage der Struktur der extrazellulären Domäne von TrkA und Modellieren der Ig-ähnlichen Domänen:
Eine Sekundärstrukturanalyse der Ig-ähnlichen Regionen mittels PredictProtein (Rost B. und Sander C. (1993) PNAS 90: 7553–7562; Rost B. und Sander C. (1993) J. Mol. Biol. 232: 584–599; Rost B. und Sander C. (1994) Proteins 19: 55–72) zeigte definierte Strecken von b-Strängen. Die erste Ig-ähnliche Subdomäne, TrkAIg1, besteht aus Resten 160–252 (1A) in der reifen extrazellulären Domäne von TrkA, während die zweite Ig-ähnliche Subdomäne aus den Resten 253–349 (1A) besteht. Es liegt auch eine prolinreiche Region bei den Resten 349–375 (1A) vor.
Für TrkAIg1 wurden zwei bekannte Proteine (Eltern) identifiziert als Homologe, aus denen ein Modell gebildet werden konnte. Es sind dies 2NCM (Domäne 1 von Maus NCAM) und 1VCA (Domäne 1 des menschlichen vaskulären Zelladhäsionsmoleküls). Beide Domänen sind I-Set Ig-Domänen und weisen eine Sequenzidentität von 32% bzw. 29% mit der Zielsequenz auf. 2NCM wurde als der Elternteil identifiziert, der am meisten geeignet ist, um das Modell darauf aufzubauen, abgesehen von den Resten 38–50, die den b-Strang C mit D verbinden, wo die kleinere Schleife verwendet wurde, die in 1VCA gefunden wurde (1B).
Für TrkAIg2 wurden zwei Eltern als Homologe identifiziert, aus denen ein Modell erstellt werden konnte. Es sind dies 1TNM (Titin Modul M5) und 1HNG (CD2 Domäne 1). Die Homologen sind bei einer Sequenzidentität von 21 bzw. 14% recht entfernt verwandt und gehören zu der I-Set Ig-Familie bzw. der V-Set Familie. Es können jedoch bestimmte Schlüsselmerkmale der Ig-Faltung identifiziert werden einschließlich einer Disulfidbrücke und eines Trp in dem C-Strang. Dies ist überraschend, da beiden Homologen eine Disulfidbindung fehlt. Diese Homologen weisen in verschiedenen Regionen eine höhere Sequenzidentität auf, daher wurde ein chimeres Modell unter Verwendung von 1TNM als dem Haupttemplat gebildet und 1HNG für die Modellreste 39–59 (1B), und die Koordinatendaten sind in 21 gezeigt.
Auf geringfügige manuelle Interventionen im Sequenzalignment folgend haben die Erfinder ein Modell erläutert, das 8 b-Stränge mit den Strängen (ABDE) in einem Blatt und (A'CFG) auf dem anderen Blatt enthält. Zusammen bilden sie das b-Sandwich für TrkAIg1. Bei TrkAIg2 liegt kein A'-Strang vor und es werden zwei extra Stränge C' und C" vorausgesagt, wobei das b-Sandwich durch b-Stränge (ABDE) und (GFC'C'') gebildet wird. Für Domäne 1 kartierte das Alignment das Disulfid zwischen die Stränge B und F über das b-Sandwich zu derselben Position wie sie in 2NCM gefunden wird. Dieses Disulfid überlagert auch auf das 1VCA Disulfid zwischen die Reste 23–71. Umgekehrt wird für Domäne 2 ein Disulfid auf der Oberfläche des Moleküls vorausgesagt, das zwei gegenüberliegende b-Stränge, B und E, überbrückt, das zweite Cys schließt sich in 1TNM mit einem Ser zusammen. Diese Disulfid-Bindungsanordnung ist ähnlich dem von Urfer et al (Urfer, R., Tsoulfas, P., O'Connell, L., Hongo, J. A., Zhao, W. und Presta, L. G. (1998). J. Biol. Chem. Urfer et al. (s.o.) 273: 5829–5840) vorhergesagten Modell, das auf einer 1VCA Domäne 1 modelliert ist, obwohl unser TrkAIg2-Modell neun b-Blätter des V-Sets voraussagt, im Gegensatz zu dem Modell mit sieben b- Blättern in einer I-Set Anordnung. Die Strukturmodelle sind in 1B und die Koordinationsdaten sind in DATA.1 angegeben.
Bezüglich des hier für TrkAIg2 gebildeten Strukturmodells sind die in der Modellkonstruktion verwendeten Eltern, Titin Modul M5 (1tnm) und CD2 Domäne 1 (1hng) deutlich entfernte Homologe, die durch sinnvolle Sequenzsuchmethoden identifiziert werden können (Barton, G. J. (1993) Comput. Appl. Biosci. 9: 729–734; Henikoff, S. und Henikoff, J. G. 1991. Nucleic Acids Research 19: 6565–6572). Die VCAM-Domäne 1, die zum Bau des Modells von TrkAIg2 von Urfer et al. verwendet wurde (Urfer, R., Tsoulfas, P., O'Connell, L., Hongo, J. A., Zhao, W. und Presta, L. G. (1998) JBC 273: 5829–5840) zeigt keine signifikante Sequenzverwandtschaft, ist jedoch homolog, da sie ein Ig-Fold ist. Bezüglich Titin und VCAM (beides I-Set-Domänen) weist die TrkAIg2-Sequenz eine signifikante Insertion (~10 Reste) zwischen den Strängen C und D auf. Die Region entsprechend den Positionen 39–59, die dieses Insert enthält, weist eine signifikantere Homologie zur CD2-Domäne 1 auf als andere Ig-Domänen. Darüber hinaus entspricht die vorausgesagte Sekundärstruktur (Rost B. und Sander C. (1993) PNAS 90: 7553–7562) von TrkAIg2 in dieser Region der Co-Existenz von zwei Extrasträngen (C' und C'') gemäß der CD2-Struktur. Dies führt zu einer vorausgesagten V-Set-Domäne im Gegensatz zur von Urfer et al. (Urfer, R., Tsoulfas, P., O'Connell, L., Hongo, J. A., Zhao, W. und Presta, L. G. (1998). JBC 273: 5829–5840) vorgeschlagenen I-Set-Domäne.
Die Bedeutung von Schlüsselresten bei der Bindung von NGF wird verständlich durch Bezugnahme auf unser Modell und die umfangreiche Mutationsanalyse von TrkAIg2 durch Urfer et al. (Urfer, R., Tsoulfas, P., O'Connell, L., Hongo, J. A., Zhao, W. und Presta, L. G. 1998. J. Biol. Chem. 273: 5829–5840). Die wichtigsten Bindungsdeterminanten in TrkAIg2 treten in der Schleife auf, die die Stränge E und F (die EF-Schleife) verbinden, und zwar mit den Einzelmutationen T319A, H320A und N323A, die eine mehr als 100-fache Reduktion in der Bindung zeigen. Der Hinweis auf unser Strukturmodell zeigt, dass alle drei Reste sich in solvensexponierten Stellen nahe dem Scheitel der EF-Schleife befinden. Ein geringerer Beitrag zum Verlust an Bindungsaffinität tritt auch in der räumlich benachbarten AB-Schleife mit den Mutationen H258A, V261E, M263A und H264A ein. Die Lage der ersten drei Reste befindet sich in solvensexponierten Stellen auf der Oberfläche dieser Schleife. Lediglich zwei andere Mutationen zeigen eine mehr als 50-fache Reduktion der Bindungsaffinität, es sind dies P269E und H310A. Diese beiden Reste liegen in unserem Modell räumlich benachbart zueinander und in großer Nähe zur Disulfidbrücke (C267–C312), welche die Stränge B und E verbindet. Es ist möglich, dass diese Reste eine direkte Rolle bei der Bindung von NGF spielen, wie von Urfer et al. (Urfer, R., Tsoulfas, P., O'Connell, L., Hongo, J. A., Zhao, W. und Presta, L. G. 1998. J. Biol. Chem. 273: 5829–5840) vorgeschlagen wurde. Eine alternative Erklärung wäre jedoch ihre Bedeutung beim Aufrechterhalten der strukturellen Integrität der Disulfidbrücke. Anders als die konservierte Kerndisulfidbindung von kanonischen Ig-Domänen ist die solvensexponierte Disulfidbrücke möglicherweise bei der Stabilisierung der Struktur der Domäne nicht so bedeutend, die kovalente Verknüpfung zwischen den Strängen B und E kann jedoch bei der Aufrechterhaltung der Konformation der AB- und EF-Schleife bei der Bindung von Bedeutung sein. Tatsächlich führt der Verlust des Disulfids miti den Mutationen C267A oder C312A zu einer 10- bis 30-fachen Reduktion der Bindung, was die Bedeutung der Disulfidbrücke beim Bindungsmechanismus unterstreicht.
Eine alternativ gespleißte Form von TrkA, die in der prolinreichen Domäne ein sechs Aminosäureninsert enthält (bei der Aminosäureposition 224–225 (3)), VSFSPV, zeigt eine höhere Affinität für NT3 und kann daher für das Binden von Liganden von Bedeutung sein (Clan, D. O & Reichardt L. F. (1994) PAISA 91: 11133–11137). Diese Sequenz wird auch in der TrkA-Sequenz von Ratten gefunden und eine ähnliche Sequenz wird in der TrkA von Hühnern gefunden. Es liegt auch ein ähnlicher von polaren Resten in sämtlichen TrkB-Sequenzen vor (Allen S. J. et al. (1994) Neuroscience 60: 825–834). Es ist daher möglich, dass diese Region zur Bindung der Neurotrophine oder zur Spezifität des Rezeptors beiträgt.
Es wird allgemein davon ausgegangen, dass die TrkAIg1,2-Region die Aminosäuren 160–375 der reifen extrazellulären Domäne von TrkA (1A), TrkAIg1 oder der TrkAIg-ähnlichen Subdomäne 1 umfasst, die Aminosäuren 160–252 umfasst und die TrkAIg-ähnliche Subdomäne 2 als Aminosäuren 253–349 mit einschließt. TrkAIg2 umfasst hier Aminosäuren 253–375 der prolinreichen Region. In sämtlichen Fällen gehört die Verwendung von Varianten von TrkA und dessen Subdomänen wie die zuvor beschriebenen zur vorliegenden Erfindung.
Konstruktion von TrkAIg2 mit dem Insert aus der alternativ gespleißten Variante:
TrkAIg2 mit dem Insert aus der alternativ gespleißten Variante wurde mittels PCR-Mutagenese gebildet. Die Mutagenese wurde in zwei Stufen durchgeführt. Zunächst wurden die 5'- und 3'-Fragmente so amplifiziert, dass eine Überlappung vorliegt welche die Sequenz der alternativ gespleißten Form von TrkA kodiert. In der zweiten Stufe wurden die PCR-Produkte der 5'- und 3'-Fragmente mittels der Überlappungssequenz und den beiden flankierenden Primern bzw. Startern miteinander gespleißt. Der erste Durchgang der PCR umfasste oligo66816 (ATCATATGCC GGCCAGTGTG CAGCT) und oli go49234 (CCACTGGCGA GAAGGAGACA GGGATGGGGT CCTCGGGG), um das 5'-Fragment zu bilden und oligo49233 (GTCTCCTTCT CGCCAGTGGA CACTAACAGC ACATCTGG) und den T7-Terminator-Primer (GCTAGTTATTGCTCAGCGG), um das 3'-Fragment zu erzeugen. Die Produkte wurden dann gereinigt und als ein Target für einen zweiten Durchgang der PCR verwendet, wobei ein oligo66816 und T7-Terminator-Primer eingesetzt wurden. Das PCR-Produkt aus dem zweiten Durchgang der PCR wurde dann in pET15b geklont und auf dieselbe Weise wie TrkAIg2 exprimiert.
Subklonierung von TrkAIg1,2:
Aus den vorausgesagten Daten zur Sekundärstruktur wurde beschlossen, die DNA kodierenden Aminosäuren 160 bis 375 (1A) der extrazellulären Domäne von TrkA zu subklonieren. Es wurden Oligonukleotid-Primer (10692 und 10693) entwickelt, die geeignete Restriktionsstellen bereitstellen würden, so dass das TrkAIg1,2 Insert mit der Polyhistidin-Markierung des Expressionsvektors pET15b (Novagen) und zwei Stop-Kodons zum Terminieren der Translation in-frame wäre. Eine Karte von pET15b und die Sequenz der Oligonukleotid-Primer ist in 2 angegeben.
Die Amplifikation mittels PCR wurde dann unter Verwendung der Primer oligo10692 und oligo10693 (Cruachem Ltd) und dem humanen full-length TrkA cDNA Klon (ein Geschenk von David Kaplan, Montreal Neurological Institute, Kanada) als Target verwendet wurden. Das PCR-Produkt wurde dann in das Plasmid pCRII (Invitrogen) ligiert, wobei pCRII-TrkAIg1,2 erhalten wurde. pCRII-TrkAIg1,2 wurde dann mit XhoI verdaut und das Insert aus einem niedrig schmelzenden Agarose-Gel mittels Phenolextraktion gereinigt und in pET15b (Novagen) ligiert, welches zuvor durch Verdauen mit XhoI und Dephosphorylierung mittels Calf-Intestinal Alkaline Phosphatase (CIAP) hergestellt wurde. Nach Transformation in Escherichia coli XL1Blue (Stratagene) wurden die Transformanden mittels PCR gescreent, wobei der T7-Promoter-Primer verwendet wurde, der mit pET15b und oligo10693 hybridisiert. Auf diese Weise wurden Klone identifiziert, welche das TrkAIg1,2 Insert in der korrekten Orientierung zur Expression mit dem T7-Promotor aufwiesen. Der erhaltene Klon, pET15b-TrkAIg1,2 wurde vom T7-Promotor-Primer und dem T7-Terminator-Primer sequenziert, um zu gewährleisten, dass das Insert an das pET15b an der XhoI-Stelle ligiert hatte. Die DNA-Sequenz des Inserts von pET15b-TrkAIg1,2 und die abgeleitete Aminosäuresequenz sind in 3 fett angegeben (Amino säuren 24–239, Nukleotide 71–718). Enzyme und Enzympuffer wurden von Boerhinger erhalten.
Subklonieren von TrkAIg1:
Es wurde ein Oligonukleotid-Primer entwickelt, der eine Amplifikation der TrkAIg1-Domäne ermöglichen würde unter Verwendung des linken Primers für TrkAIg1,2, so dass das PCR-Produkt in-frame mit der Polyhistidin-Markierung in die XhoI-Stelle von pET15b ligiert werden kann.
oligo36770 Rechter Primer für TrkAIg1;
Die Amplifikation mittels PCR wurde dann unter Verwendung von oligo10692 und oligo36770 mit pET15b-TrkAIg1,2 als Target durchgeführt. Das PCR-Produkt wurde dann in pCRII (Invitrogen) ligiert, wobei pCRII-TrkAIg1 erhalten wurde, das dann mit XhoI verdaut wurde und einer Elektrophorese mit einem Agarose-Gel mit niedrigem Schmelzpunkt unterzogen. Das Insert wurde dann gereinigt und in pET15b ligiert, das zuvor mit XhoI verdaut und mit CIAP behandelt wurde. Nach Transformation in E. coli XL1Blue wurden die Transformanden mittels PCR gescreent, wobei oligo10692 und der T7-Terminator-Primer verwendet wurden. Der erhaltene Klon pET15b-TrkAIg1 wurde dann sequenziert, um zu gewährleisten, dass der Leserahmen von TrkAIg1 mit der Polyhistidin-Markierung von pET15b in-frame war. 4a zeigt die Nukleotidsequenz (Reste 71–349) und abgeleitete Aminosäuresequenz (Reste 24–116) von TrkAIg1 in Fettbuchstaben.
Subklonierung von TrkAIg2:
Es wurde ein Oligonukleotid-Primer entwickelt, der die Amplifikation der TrkAIg2-Domäne unter Verwendung des T7-Terminator-Primers von pET15b-TrkAIg1,2 ermöglichen würde;
oligo66816 Linker Primer für TrkAIg2;
Es wurde eine Amplifikation mittels PCR durchgeführt, wobei oligo66816 und der T7-Terminator-Primer mit pET15b-TrkAIg1,2 als Templat DNA verwendet wurde. Das PCR-Produkt wurde dann mit NdeI und BamHI verdaut und in pET15b ligiert, das zuvor durch Verdauung mit denselben Enzymen und Behandeln mit CIAP hergestellt wurde. Die Transformanden wurden mittels PCR gescreent, wobei der T7-Promotor-Primer und oligo10693 verwendet wurde und die positiven Klone wurden sequenziert. 4b zeigt, in Fettbuchstaben, die Nukleotidsequenz (Reste 65–433) und die abgeleitete Aminosäuresequenz (Reste 22–144) von TrkAIg2.
Hybridisierung mit TrkA-DNA-Sequenz
DNA, die TrkAIg1,2 oder TrkAIg2 (Sequenzen gemäß 3 und 4B) kodiert, kann für einen Hybridisierungsassay verwendet werden. Eine DNA-Sequenz, die TrkAIg1,2 oder TrkAIg2 oder Teile einer solchen Sequenz kodiert, kann durch reverse Transkriptase PCR von genomischer DNA oder direkt durch PCR oder Restriktionsverdauung aus der cDNA für TrkA erhalten werden. DNA oder RNA, die zu der DNA komplementär ist, die TrkAIg1,2 oder TrkAIg2 oder Teile einer solchen Sequenz kodiert, oder einer Sequenz, die eine ähnliche Zusammensetzung aufweist, jedoch eine Degeneration der Sequenz aufweist, kann mit der zuvor hergestellten DNA hybridisiert werden. Eine solche Sequenz wird hier als eine Sonde bezeichnet. Üblicherweise sind die komplementäre DNA oder RNA durch radioaktive oder nicht-radioaktive Substanzen markiert.
Ein Beispiel hierfür ist die Northern Analyse von TrkAIg2 unter Verwendung einer radioaktiv markierten cDNA-Sonde. Eine cDNA-Sonde wird mit ³²P-dATP (6000Ci/mmol; Dupont NEN) mittels Random Priming markiert (Stratagene, CA). Die Sonde wird dann mittels einer Nuctrap-Säule (Stratagene) auf eine spezifische Aktivität im Bereich von 2 × 10⁶ cpm/ng gereinigt. Ovarzellen des chinesischen Hamsters (CHO), die TrkA exprimieren, werden dann in Ultraspec^TM (Biotecx, Houston, Texas) homogenisiert und die gesamte RNA extrahiert. Die RNA wird auf ein 1% denaturierendes Agarose-Gel aufgebracht und mittels Elektrophorese separiert, bevor es auf Hybond N (Amersham, Cardiff, UK) über Nacht geblottet und 2 Stunden lang bei 80°C gebacken wird. Diese Hybond N Filter werden 4 Stunden lang bei 65°C vorhybridisiert, indem sie in einem Hybridisierungspuffer (6SSC, 5 × Denhardts, 0,5% SDS und 0,002% sauer gespaltene Lachsspermien DNA) in einem Hybridisierungsofen umgewälzt werden. Die Sonde wird dann 5 Minuten lang bei 100°C denaturiert, bevor sie zu frischer Hybridisierungslösung zugegeben wird. Die Filter werden dann über Nacht bei 65°C unter diesen hohen Stringenzbedingungen hybridisiert. Die Stringenz kann gemäß der Degeneration der Sonde oder der Homologie des Targets variiert werden. Niedrigere Temperaturen wie 50°C oder höhere Salzkonzentrationen wie 20 × 55 C ermöglichen eine niedrigere Stringenz. Das Vorliegen von Formamid senkt die Affinität der Nukleinsäurebindung und ermöglicht Abweichungen in der Stringenz. Derartige Strategien sind gut beschrieben (z. B. Nucleic acid hybridisation, a practical approach hrsg. von Hames und Higgins, IRL Press 1988). Am nächsten Tag werden die Filter in 2 × SSC/0,5% SDS und bei 65°C zweimal 30 Minuten lang in Hybaid mit 2 × SSC/0,5% SDS gewaschen. Die Filter werden dann getrocknet und über Nacht bei –70°C Hyperfilm ausgesetzt (Hyperfilm MP, Amersham) und am folgenden Tag entwickelt. DNA-Sonden, die an RNA gebunden haben, welche die TrkAIg2-Sequenz kodiert, werden als exponierte, schwarze Flächen auf dem Autoradiographiefilm sichtbar gemacht.
Ein weiteres Beispiel hierfür ist der Nachweis der Expression von TrkAIg1,2 oder TrkAIg2 oder ähnlicher Sequenzen in einer Expressionsbibliothek. Eine λGT10 cDNA Bibliothek von humanem Gehirn (M. Goedert, Cambridge) wird verwendet, um E. coli c600 Zellen zu infizieren. Diese werden auf Agarplatten einer Größe von 24 cm × 24 cm aufgetragen, wobei 10.000 pfu pro Platte erhalten werden. Dann wird ein Plaquelift durchgeführt, indem Nylonmembran Hybond N (Amersham, Cardiff, UK) 1 Minute lang auf die Agarplatte gelegt wird. Der Filter wird dann mit der DNA Seite nach oben für 30 Sekunden auf Denaturierungslösung (1,5 N NaCl, 0,5 N NaOH) gelegt, bevor er für 2 Minuten eingetaucht wird. Der Filter wird dann für 5 Minuten in neutralisierende Lösung (1,5 N NaCl, 0,5 N Tris-HCl pH 8,0) eingetaucht. Das Eintauchen wird in frischer neutralisierender Lösung wiederholt. Der Filter wird dann kurz in 2 × SSC (0,3 N NaCl, 0,03 N Na₃Citrat, pH 7,0) gespült und auf Filterpapier gelegt, das 2 Stunden lang bei 80°C gebacken wird. Die Hybridisierung wird wie zuvor beschrieben durchgeführt. Die Position der DNA-Sonden, die an die Plaques gebunden haben, die die TrkA-Sequenz kodieren, werden als exponierte, schwarze Flächen des Autoradiographiefilms sichtbar gemacht. Diese exponierten, schwarzen Flächen können den Platten wieder zugeordnet werden, um positive Klone zu identifizieren, die Sequenzen exprimieren, welche TrkAIg1,2 oder TrkAIg2 oder einem Teil einer solchen DNA-Sequenz ähnlich sind.
Hybridisierung kann auch unter Verwendung homologer PCR-Techniken stattfinden. Es können spezifische oder degenerierte Oligonukleotide, die einer Region in der Sequenz für TrkAIg 1,2 entsprechen, verwendet werden, um einen Teil der Sequenz zu amplifizieren, wie beispielsweise in dem Abschnitt mit dem Titel „Subklonierung von TrkAIg2" beschrieben ist. Derartige Hybridisierungsassays können als Werkzeuge verwendet werden, um die Gegenwart von TrkAIg1,2 oder TrkAIg2-Sequenzen oder Teilen davon in Diagnosekits nachzuweisen.
Expression von TrkAIg1,2, TrkAIg1 und TrkAIg2:
Kompetente BL21 (DE3) Zellen wurden mit dem oben genannten Vektor transformiert und die Expression wurde unter Verwendung einer Variation des im pET Handbuch (Novagen) für schwierige Targetproteine beschriebenen Verfahren durchgeführt. Kurz gesagt wurden 2 ml 2 YT Nährlösung (die 200 mg/ml Carbenecillin enthält) mit einer Kolonie inokuliert und bei 37°C bis zur mid-log-Phase angezüchtet. Die Zellen wurden nicht zentrifugiert und in 2 YT resuspendiert (wie im Handbuch), sondern direkt dazu verwendet, 50 ml 2 YT Nährlösung (die 500 mg/ml Carbenecillin enthält) zu inokulieren und bei 37°C bis zur mid-log-Phase angezüchtet. Die Zellen wurden nicht mittels Zentrifugieren abgeerntet und resuspendiert, sondern direkt verwendet, um 5 Liter 2 YT (das 500 μg/ml Ampicillin enthält) zu infizieren. Nachdem ein OD₆₀₀ von 1 erreicht wurde, wurde die Zellkultur durch Zugabe von IPTG zu einer Endkonzentration von 1 mM induziert und die Zellen weitere 2 Stunden lang bei 37°C gezüchtet. 5 zeigt ein 15% SDS PAGE Gel von Extrakten von Kulturen von BL21 (DE3), die die verschiedenen pET15b-TrkAIg-Konstrukte enthalten. Eine weitere Analyse der Zellextrakte zeigte, dass für sämtliche Konstrukte das exprimierte TrkAIg-Protein unlöslich war. Es wurden verschiedene Versuche unternommen, um das TrkAIg-Protein in der löslichen Fraktion zu exprimieren, sie waren jedoch nicht erfolgreich. Die Tatsache, dass die TrkAIg-Proteine unlöslich waren, erleichterte jedoch ihre Reinigung.
Reinigung und Rückfaltung von TrkAIg1,2:
Die geernteten Zellen wurden in 10% Glyzerin resuspendiert, bei –70°C eingefroren und das Pellet wurde dreimal durch ein Xpress (BioX, 12 ton psi) durchgeleitet. Die lysierten Zellen wurden mit 20 mM Tris-HCl (pH 8,0) gewaschen und 30 Minuten lang bei 10.000 upm bei 4°C zentrifugiert, bis sämtliches lösliches Material entfernt war, wobei Einschlusskörper zurückblieben, die unlösliches Protein enthielten. Die gereinigten Einschlusskörper wurden in 6M Harnstoffpuffer (20 mM Tris-HCl, pH 8,5, 1 mM β-Mercaptoethanol) bei etwa 0,1 mg/ml Protein solubilisiert und auf Eis unter leichtem Schütteln 1 Stunde lang inkubiert. Die Rückfaltung wurde mittels Dialyse gegen 400 × Puffer (20 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, pH 8,5) bei 4°C 24 Stunden lang durchgeführt, mit einmaligem Pufferaustausch. Das rückgefaltete TrkAIg1,2-Protein wurde auf eine 1 ml Resource Q (Pharmacia) aufgebracht und mit einem linearen Gradienten von 0–1 M NaCl in 20 mM Tris-HCl über 40 ml bei 2 ml pro Minute eluiert. Der Hauptpeak, der bei 280 nm (unter Verwendung eines UV-Detektors) nachgewiesen wurde, wurde gesammelt und einer Affinitätsreinigung unterzogen gemäß dem Novagen His Säulenreinigungsprotokoll, wobei eine 2,5 ml Einwegsäule aus His-Bind-Resin (Novagen) verwendet wurde. Schließlich wurde das eluierte Protein wieder auf die Resource Q Säule aufgebracht, um Imidazol zu entfernen. Dieses wurde mit einem 10 ml Salzgradienten von 0–1 m NaCl in 20 mM Tris-Puffer, pH 8,0 eluiert.
Reinigung von TrkAIg1 und TrkAIg2:
Die geernteten Zellen wurden in 10% Glyzerin resuspendiert, bei –70°C eingefroren und das Pellet wurde dreimal durch eine Xpress (BioX) durchgeleitet. Der Extrakt wurde dann bei 4°C 30 Minuten lang bei 10.000 upm zentrifugiert, um die unlöslichen Einschlusskörper zu pelletisieren. Die Einschlusskörper wurden dann in 50 ml 1% (vol/vol) Triton X-100, 10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA und anschließend 50 ml 1 M NaCl 10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA und schließlich 10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA, gewaschen. Die Einschlusskörper wurden dann in 20 mM Na-Phosphat, 30 mM Imidazol, 8 M Harnstoff, pH 7,4, solubilisiert. Die solubilisierten Einschlusskörper wurden dann mittels Zentrifugieren geklärt, bevor sie auf eine 5 ml His-Trap-Säule (Pharmacia) aufgebracht wurden. Die Säule wurde mit 50 ml 20 mM Na-Phosphat, 30 mM Imidazol, 8 M Harnstoff, pH 7,4 gewaschen und das gereinigte TrkAIg1 und TrkAIg2 mit 25 ml 20 mM Na-Phosphat, 300 mM Imidazol, 8 M Harnstoff, pH 7,4 bei 2 ml/Minute eluiert (6(A) und 6(B)).
Rückfaltung von TrkAIg1 und TrkAIg2:
Die gereinigten TrkAIg-Proteine wurden auf eine Konzentration von 0,1 mg/ml in 20 mM Na-Phosphat, 30 mM Imidazol, 8 M Harnstoff, pH 7,4 eingestellt, wobei 1 mM β-Mercaptoethanol zugegeben wurde und gegen 20 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, pH 8,5 für TrkAIg2 und 20 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, pH 9,0 für TrkAIg1 (2 × 100 Volumen) dialysiert. Die dialysierten Proteine wurden auf eine 1,6 ml Poros 20HQ Säule geladen und mit einem linearen Gradienten von 0,05–1 M NaCl über 20 Säulenvolumen eluiert (7).
Die Elution der Poros 20HQ Säule für TrkAIg2 ergab drei Peaks, die sämtliche eine Bande entsprechend TrkAIg2 (Daten nicht gezeigt) ergaben. Der Rückfaltungsprozess muss daher zu drei Spezies von TrkAIg2 führen, die sämtliche eine unterschiedliche Konformation aufweisen. Verdrängungsbindungsstudien zeigen, dass der erste eluierende Peak NGF bindet, die anderen dagegen nicht. Der erste Peak wurde daher gesammelt, Glyzerin zu einer Endkonzentration von 20% (Vol./Vol.) zugegeben und in flüssigem Stickstoff schockgefroren, bevor er bei –70°C gelagert wurde.
Für TrkAIg1 eluieren lediglich zwei Peaks aus der Poros 20HQ Säule mit mehr Protein im Durchfluss. Wieder zeigen SDS Page eines jeden Peaks und der Durchfluss, dass TrkAIg1 das einzig vorliegende Protein ist. Verdrängungsbindungsassays der beiden Peaks zeigen, dass keine der Spezies von TrkAIg1 an NGF bindet (Daten nicht gezeigt).
Untersuchungen zum zirkularen Dichroismus an TrkAIg2
Um den Sekundärstrukturgehalt des gefalteten Proteins zu bestimmen, wurden Messungen des zirkularen Dichroismus (CD) im fernen UV durchgeführt. Der CD von Proteinen ist in erster Linie der CD des Amidchromophors, das spät im UV-Bereich anfängt zu absorbieren, wobei die erste Bande bei etwa 220 nm liegt. Antiparallele β-Blatt-Strukturen zeigen normalerweise einen negativen Cotton-Effekt bei einem Minimum nahe 218 nm und einen positiven Effekt bei einem Maximum um 195 nm. Die Amplitude des fernen UV-Spektrums von verschiedenen Immunoglobulinen wie variablen (VL) und konstanten (CL) Domänen der leichten Kette zeigen ebenfalls ein Minimum um 215–218 nm. Für die TrkAIg-Proteine wurden daher ähnliche Ergebnisse erwartet.
CD-Spektren wurden bei Raumtemperatur auf einem Jobin Yvon CD6 Gerät aufgezeichnet, wobei eine Küvette mit 0,5 mm Weglänge bei einer Proteinkonzentration von 40 μm verwendet wurde. Es wurden zehn Scans mit einer Abtastgeschwindigkeit von 0,5 nm/s akkumuliert. Die Spektren wurden gemittelt und das kleine Signal, das von dem Puffer entstand, wurde abgezogen. Der CD des aktiven TrkAIg2 zeigt ein Minimum bei 218 nm und Maximum nahe 200 nm (8). Dies ist typisch für ein antiparalleles b-Blatt, das einen negativen Cotton-Effekt zeigt mit einem Minimum nahe 218 nm und einen positiven Cotton-Effekt mit einem Maximum bei etwa 195 nm (Yang, J. T., Wu, C. S. C. und Martinez, H. M. (1986). Methods Enzymol. 130: 208–269). Ähnliche Ergebnisse sind auch für andere Immunoglobulindomänen berichtet worden (Ikeda, K., Hamaguchi, K. und Migita, S. (1968) J. Biochem. 63: 654–660) und für TrkAIg1,2 (Holden, P. H., Asopa, V., Robertson, A. G. S., Clarke, A. R., Tyler, S., Bennett, G. S., Brain, S. D., Wilcock, G. K., Allen, S. J., Smith, S. und Dawbarn, D. (1997) Nat. Biotechnol. 15: 668–672). Andere Ergebnisse stimmen mit dem Modell für TrkAIg2 überein, das in 1B gezeigt ist.
Die CD-Daten zeigen somit, dass TrkAIg2, das als erstes von der Poros 20HQ Säule eluiert, zu einer kompakten Struktur gefaltet ist und dass es wahrscheinlich eine ähnliche Struktur wie die anderen Immunoglobulindomänen aufweist.
Die Bindung von NGF an Immunoglobulin-ähnliche Domänen von TrkA 1 Kompetitive Bindung
Die Bindungsaffinität von ¹²⁵I-NGF an die Ig-ähnlichen Domänen von TrkA wurden bestimmt mittels eines kompetitiven Bindungsassays, wobei die Melanoma-Zelllinie A875, American Tissue Culture Collection (ATCC), verwendet wurde, welche den NGF-Rezeptor p75^NGFR exprimiert.
Gereinigter rekombinanter humaner NGF wurde mit I¹²⁵ radiojodiert, wobei ein Lactopeoxidase-Verfahren und eine Gleichgewichtsbindung mit [¹²⁵I]-NGF durchgeführt wurde (Treanor et al., 1991; Neuroscience Letters 121 S. 73–76). Kurz gesagt, es wurden A875 Zellen (10⁶ pro ml) mit [¹²⁵I]-NGF (0,14 nM) und seriellen Verdünnungen von nicht markiertem humanen NGF (Konzentrationsbereich: 10^–6 M bis 1 × 10^–11 M), TrkAIg1,2 (Konzentrationsbereich: 4 × 10^–6 M bis 1 × 10^–11 M) oder TrkAIg2 (Konzentrationsbereich 5 × 10^–6 M bis 1 × 10^–11 M) inkubiert. Die Röhrchen wurden bei Raumtemperatur 1 Stunde lang stark geschüttelt. Dann wurden 100 μl Aliquote über 200 μl Sucrose (0,15 M in Bindungspuffer) in Beckman-Röhrchen geschichtet. Nach Zentrifugation (15 Sekunden bei 20.000 g) wurden gebundener und freier [¹²⁵I]-NGF abgetrennt, indem die Röhrchen in flüssigem Stickstoff eingefroren wurden und der gebundene [¹²⁵I]-NGF des Zellpellets bestimmt. Bindungsreaktionen wurden dreifach durchgeführt. Die Zähler wurden hintergrundkorrigiert und die spezifische Bindung betrug zwischen 85–87% der gesamten Bindung. Der kompetitive Bindungsassay (9) ermöglicht eine Bewertung der Bindungsaffinität von [¹²⁵I]-NGF an das rekombinante TrkAIg2-Protein. Ein Bereich von Konzentrationen von Ig-ähnlichen Domänen wird mit ¹²⁵I-NGF und A875 Zellen inkubiert (Vale R. D. & Shooter E. M (1985) Methods in Enzymology 109: 21–39). Dies führt zu einer Konkurrenz zwischen der TrkAIg-Domäne und dem p75^NGFR für verfügbares ¹²⁵I-NGF. Zwei konkurrierende Gleichgewichte sind:
wobei N für NGF; R für den p75^NGFR Zellrezeptor und T für die TrkAIg2-Domäne steht.
Die Daten geben den NGF, der bei variierenden TrkAIg2-Konzentrationen an die Zelle gebunden ist, als eine Fraktion des in Abwesenheit von TrkAIg2 gebundenen an. Aufgrund der hohen Affinität von NGF für den p75^NGFR Zellrezeptor ist die analytische Lösung der Kurve komplex. Die Daten wurden daher unter Verwendung numerischer Simulation angepasst (FACSIMILE, U. K. A. E. A).
Der angepasste Wert für die Dissoziationskonstante für die Interaktion von TrkAIg1,2/NGF (K_d2) betrug 3,3 nM (Holden et al., 1997; Nature Biotechnology 15 S. 668–672). Dies stimmt gut überein mit einem K_d von zwischen 0,1 und 1,0 nM für die NGF-Bindung an ektopisch exprimierter TrkA in Säugetierzellen. Die IC₅₀ (Konzentration von kaltem NGF, die erforderlich ist, um ¹²⁵I-NGF um 50% zu inhibieren) für unmarkier ten (kalten) NGF betrug 0,2 nM (Holden, P. H et al. (1997) Nature Biotechnology 15: 668–672) (4B).
Die Ergebnisse zeigen, dass TrkAIg2 NGF mit einer ähnlichen Affinität wie TrkAIg1,2 bindet (9). Die IC₅₀ für TrkAIg2 ist lediglich dreifach höher als diejenige von TrkAIg1,2, was eine recht ähnliche Affinität für NGF anzeigt. Dieses überraschende Ergebnis zeigt, dass der Hauptbeitrag zur Bindung in TrkAIg1,2 in der zweiten Ig-Domäne, TrkAIg2 zu finden ist.
2 Oberflächenplasmonenresonanzuntersuchungen:
Kinetische Daten der Bindung von NGF an TrkAIg2 wurden unter Verwendung eines BiaCore-X erhalten. Die BiaCore Technologie erlaubt Echtzeitmessungen von Geschwindigkeitskonstanten unter Verwendung sehr geringer Proteinmengen. Kurz gesagt, es fließen variierende Konzentrationen von Proben (Analyten) über einen Sensorchip, an den das interessierende Protein (der Ligand) gebunden worden ist. Wenn der Analyt den Liganden bindet, tritt eine Änderung der Elektronendichte auf der Oberfläche des Sensorchips auf, welche die Intensität und Wellenlänge von durch die Oberfläche absorbiertem Licht beeinflusst.
Da die Daten aus kompetitiven Bindungsassays darauf hinweisen, dass TrkAIg2 den Hauptbeitrag zur NGF-Bindung lieferte, wurde diese Domäne weiter untersucht.
TrkAIg2 wurde an die Oberfläche des Sensorchips kovalent gebunden, indem es mit Amingruppen auf TrkAIg2 an Carboxylgruppen auf der Oberfläche gekoppelt wurde, wobei ein BiaCore Amin-Kopplungskit verwendet wurde und variierende Konzentrationen von NGF bei einer konstanten Fließgeschwindigkeit von 20 μl/min zwei Minuten lang darüber geleitet wurden. Die Daten wurden für einen Bereich von NGF-Konzentrationen von 1 μM bis 1 nM gesammelt. Es wurde gefunden, dass bei den hohen Konzentrationen und bei den sehr niedrigen Konzentrationen die Daten schwierig zu interpretieren waren, möglicherweise aufgrund von Aggregation des NGF bei den hohen Konzentrationen und nicht-spezifischen Interaktionen mit der Oberfläche bei sehr niedrigen Konzentrationen. Die für den Bereich 40 nM bis 500 nM gesammelten Daten konnten jedoch erfolgreich ausgewertet werden. Unter Einsatz der geeigneten Software, BiaEval 3.0, wurde ein Kd von 11,8 nM erhalten. Der erhaltene Kd-Wert von 11,8 nM ist konsistent mit der Tatsache, dass die IC₅₀ für TrkAIg2 dreifach höher ist als die von TrkAIg1,2, vorausgesetzt, dass der K_d für TrkAIg1,2, der an NGF bindet, 3,3 nM beträgt wie durch kompetitiven Bindungsassay bestimmt wurde.
Darüber hinaus wurde 20 μM BDNF ebenfalls über den TrkAIg2 geleitet, wobei eine vernachlässigbare Bindung beobachtet wurde. Es ist eindeutig, dass TrkAIg2 sowohl den Hauptbeitrag für die NGF-Bindungsfähigkeit von TrkA liefert als auch spezifisch für NGF ist.
3 Bindung von TrkAIg-ähnlichen Domänen unter Verwendung der ELISA-Technik
Verfahren 1
Anti-βNGF (polyklonaler Kaninchen-anti-Maus-NGF von Sigma, 1:1000), verdünnt in Coat I Puffer (50 mM Natriumcarbonat pH 9,6, NaN₃ 0,1%) wird auf 96er Platten (50 μl pro Vertiefung) aufgetragen und über Nacht bei 4°C stehen gelassen. Die Vertiefungen wurden geleert und pro Vertiefung wurde 100 μl Coat II Puffer (Coat I plus 1% BSA) zugegeben. Nach 2 Stunden bei 4°C wurde die Platte dreimal gewaschen, wobei Waschpuffer (50 mM Tris-HCl pH 7,2, 200 mM NaCl, 0,1% Triton X-100, 0,1% NaN₃, 0,25% Gelatine) verwendet wurde und Proben und Standardkurven von NGF (0–1000 pg/ml) verdünnt in Samplepuffer (Waschpuffer plus 1% BSA) wurden zugegeben (50 μl pro Vertiefung). Die Proben waren vorinkubiert worden mit variierenden Konzentrationen von TrkAIg-ähnlichen Domänen für zehn Minuten unter Schütteln bei Raumtemperatur, bevor sie zu der Platte zugegeben wurden. Die Platte wurde eine Stunde lang bei Raumtemperatur stehen gelassen, bevor dreimal mit Waschpuffer, anti-βNGF-Galactosidasekonjugat (Boerhinger: 2.5–20 mU und 5–10 ng Antikörper pro Assay) verdünnt (1:40) in Waschpuffer (50 μl pro Vertiefung wurde zugegeben) gewaschen. Die Platte wurde 2 Stunden lang bei Raumtemperatur inkubiert und dann dreimal mit Waschpuffer gewaschen, bevor 50 μl Substrat (200 mM 4-Methylumbelliferylgalactosid (4-MUG)) in Substratpuffer (100 mM Natriumphosphat pH 7,3, 1 mM MgCl₂) zugegeben wurden. Die Herstellung eines fluoreszierenden Produkts (4-Methylubelliferon) aus 4-MUG wurde dann gemessen, wobei ein Fluorimeter bei einer Anregungswellenlänge von 364 nm, Emission bei 448 nm, verwendet wurde.
Verfahren 2
Der Assay ist ähnlich demjenigen von Verfahren 1, mit der Ausnahme, dass die TrkAIg1,2-Domäne direkt auf die 96er Platte in Coat I Puffer aufgebracht wurde und über Nacht bei 4°C stehen gelassen wurde. Die Vertiefungen wurden dann geleert und für 2 Stunden bei 4°C Coat II Puffer zugegeben. Eine Standardkurve von βNGF (0–200 nM) wurde 10 Minuten lang bei Raumtemperatur mit 2 μM TrkAIg1 oder 2 μM TrkAIg2 präinkubiert und zu der Platte zugegeben. Diese wurde bei Raumtemperatur eine Stunde lang inkubiert, bevor sie gewaschen und anti-ßNGF-Galactosidasekonjugat zugegeben wurde. Die Platte wurde dann 2 Stunden lang bei Raumtemperatur inkubiert und mit Waschpuffer gewaschen, bevor Substrat (200 mM 4-MUG) zugegeben wurde. Die Herstellung eines fluoreszierenden Produkts wurde dann gemessen, wobei ein Fluorimeter bei einer Anregungswellenlänge von 364 nm, Emission bei 448 nm, verwendet wurde.
Der TrkAIg1 wies keinen Effekt auf die NGF-Bindung an die anti-βNGF Antikörper auf der Platte auf, was anzeigt, dass sie in der Präinkubation NGF nicht sequestrierten. Im Gegensatz hierzu band TrkAIg2 an 22% des NGF bei 0,5 nM und 38% bei 1 nM NGF (11).
TrkAIg2 war in der Lage, NGF zu sequestrieren und daher war für die Bindung an den TrkAIg1,2 weniger NGF verfügbar. Die Bindung wurde bei 200 nM NGF um 40% gesenkt. TrkAIg1 war nicht in der Lage, NGF zu sequestrieren und daher blieb die Bindung an TrkAIg1,2 unbeeinflusst (12).
Diese Ergebnisse zeigen, dass TrkAIg2 an NGF bindet, was zu einem Absenken der NGF-Konzentration führt, die zur Bindung an eine 96er Platte verfügbar ist. TrkAIg1 ist hierzu nicht in der Lage. Die vorangehenden Protokolle beschreiben eine Wahl von Verfahren, wobei ein Hochdurchsatzscreening von nicht-Peptid- oder Peptiddatenbasen auf dem Format einer 96er Platte durchgeführt werden kann. Konkurrenz unbekannter Liganden mit NGF um die Bindung an TrkAIg-ähnliche Domänen auf Platten kann durch Minderung der Fluoreszenz gemessen werden.
In vitro Effekte von TrkAIg-ähnlichen Domänen auf NGF-induziertes Neuritenwachstum durch PC12 Zellen
PC12 (stammend von einem transplantierbaren adrenalen Phaeochromocytoma der Ratte, ECACC Nr. 88022401) Zellen, die in Gegenwart von 4 ng NGF (13A) wuchsen, differenzieren und erzeugen nach 72 Stunden Neurite. In Abwesenheit von NGF tritt dies nicht ein (13B). TrkAIg2, der in Gegenwart von 4 ng NGF bei 2,5 μM (13C), 1,25 μM (13D) und 0,625 μM (13E) zu PC12 Zellen zugegeben wurde, inhibiert Neuritenwachstum. Lediglich wenn die TrkAIg2-Konzentration auf 0,312 μM (13F) reduziert wird, fängt Neuritenwachstum an aufzutreten.
Die Ergebnisse zeigen, dass die TrkAIg2-Domäne in der Lage ist, das Neuritenwachstum von PC12 Zellen durch Sequestrierung von NGF zu inhibieren (13), wogegen TrkAIg1 hierzu nicht in der Lage ist.
In vivo Effekte von TrkAIg-ähnlichen Domänen: Inhibierung der Plasmaextravasation
Inhibierung der NGF-Aktivität in vivo
Sämtliche in vivo Experimente wurden gemäß dem Animals (Scientific Procedures) Act 1986 unter terminaler Anästhesie durchgeführt. Die in Rattenhaut durch intradermalen (i. d.) NGF induzierte Plasmaproteinextravasation wurde durch die extravaskuläre Akkumulation von intravenösem (i. v.) ¹²⁵I-Humanserumalbumin gemessen (Brain, S. A. und Williams T. J. (1985) British Journal of Pharmacology 86: 855–860). Männliche Wistarratten (200–350 g) wurden mit 60 mg/kg intraperitoneal (i. p.) narkotisiert, mit Aufrechterhaltungsdosen (15 mg/ml) nach Bedarf. Die Rückenhaut wurde rasiert und für die Injektion von Testsubstanzen gemäß einem ausbalanciertem, randomisiertem Plan mit zwei Stellen pro Testagens markiert. Die Ratten erhielten ¹²⁵I-Humanserumalbumin (100 kBq) und Evans Blue Farbstoff (0,2–0,5 ml von 0,5% Gew./Vol in Kochsalzlösung) i. v. über die Schwanzvene zu Beginn der Akkumulationsperiode. NGF und andere Testagenzien (in Tyrodes Puffersalzlösung) wurden dann i. d. injiziert und über einen Zeitraum von 30 Minuten akkumulieren gelassen. Mittels Herzpunktur (für Plasma) wurde eine Probe entnommen und die Ratten durch Genickbruch getötet. Die Rückenhaut wurde dann entfernt und Injektionsstellen ausgestochen (16 mm Durchmesser). Plasma und Hautstellen wurden in einem Gammazähler gezählt. Die Plasmaproteinextravasation an jeder Stelle wurde angegeben als Volumen von extravasiertem Plasma.
Für Koinjektionsexperimente erhielten sämtliche Hautstellen 100 μl (i. d.) von entweder NGF (8 pmol) oder Tyrode (mit oder ohne TrkAIg1,2, TrkAIg1 oder TrkAIg2). Für vorbehandelnde Experimente erhielten die Hautstellen 100 μl (i. d.) entweder von TrkAIg1,2, TrkAIg1 oder TrkAIg2 (24 oder 80 pmol) oder Vehikel (Tyrodelösung) bei –5 oder –40 Minuten. Diese Stellen erhielten dann 50 μl (i. d.) NGF (8 pmol) oder Tyrode zu Beginn der Akkumulationsperiode (0 Minuten).
Die Wirkung von TrkAIg1,2 auf NGF-induzierte Plasmaextravasation
Die Wirkung der Koinjektion von TrkAIg1,2 auf NGF-induzierte Plasmaextravasation ist in 14 gezeigt. Die Ergebnisse sind angegeben als extravasiertes Plasma (μl/Stelle) in Antwort auf ein intradermales Testagens, mittel ± Standardfehlermittel, n = 6. Die durch 7S NGF-induzierte Antwort (7S NGF ist ein Komplex aus 2,55 (β-NGF) und γNGF) sowohl alleine als auch mit Koinjektion von TrkAIg1,2 ist angegeben (8 pmol, gefüllte Quadrate). Zum Vergleich ist die durch Tyrodelösung (Vehikel, offene Kreise) alleine und mit Koinjektion von TrkAIg1,2 ebenfalls angegeben. Die Plasmaextravasation an Stellen, die Agens plus koinjizierten TrkAIg1,2 erhielten, die sich signifikant von den Stellen unterscheiden, die Agens alleine erhielten, sind als ** p < 0,01 angegeben, wie mittels ANOVA mit Bonferroni-Post-Test berechnet wurde.
Der TrkAIg1,2 kann den Wirkungen von NGF entgegenwirken, wenn er bei einer Dosis von 24 pmol verwendet wird, d. h. dreifach höher als die Dosis des verwendeten NGF. Im Gegensatz dazu rief eine Injektion von TrkAIg1,2 in einem Vehikel keine signifikante Plasmaextravasation hervor. TrkAIg1,2 kann somit der Wirkung von NGF entgegenwirken, insbesondere dann, wenn vorgemischt und koinjiziert wird. Dies zeigt, dass TrkAIg1,2 in der Lage ist, NGF zu binden und somit zu sequestrieren, und somit seine Extravasationswirkung zu inhibieren. Um das Vermögen von TrkAIg1,2 zu untersuchen, NGF in vivo entgegenzuwirken, wurden Hautstellen mittels intradermaler Injektion von TrkAIg1,2 vorbehandelt und NGF wurde (i. d.) 5 Minuten später gegeben. Die Ergebnisse, die in 15 gezeigt sind, zeigen, dass 24 pmol TrkAIg1,2 die durch 8 pmol 7S NGF inhibierte Plasmaextravasation signifikant inhibieren können. Die Ergebnisse sind ange geben als extravasiertes Plasma (μl/Stelle) in Antwort auf ein intradermales Testagens, Mittel ± Standardfehlermittel, n = 4. Die durch 7S NGF (8 pmol) induzierte Antwort ist in den gefüllten Quadraten gezeigt, sowohl alleine als auch in Stellen, die mit zunehmenden Dosen von TrkAIg1,2 vorbehandelt wurden. Zum Vergleich ist die Antwort, die durch 7S NGF (8 pmol) koinjiziert mit TrkAIg1,2 (24 pmol) induziert wird, in dem gefüllten Balken angegeben. Durch intradermale Injektion von GR 73632 (30 pmol) induzierte Plasmaextravasation ist den gefüllten Dreiecken, und Tyrodelösung (Vehikel) in den offenen Kreisen angegeben mit der Vorbehandlungsdosis von TrkAIg1,2. Die Plasmaextravasation an Stellen, die Agens plus koinjizierten TrkAIg1,2 erhielten, die sich signifikant von den Stellen unterscheiden, die Agens alleine erhielten, sind gezeigt als ** p < 0,01, wie mittels ANOVA mit Bonferroni-Post-Test berechnet wurde.
Die Plasmaextravasation, die mit NGF an mit 24 pmol TrkAIg1,2 vorbehandelten Stellen zu sehen ist, war ähnlich der Plasmaextravasation, die durch NGF koinjiziert mit 24 pmol TrkAIg1,2 erzeugt wurde. Wie bei den Koinjektionsversuchen erzeugte eine Vorbehandlung mit TrkAIg1,2 keine signifikante Plasamextravasation, wenn sie alleine injiziert wurde. In einem Versuch zum Bestimmen, ob die Wirkung von TrkAIg1,2 für NGF-induzierte Antworten spezifisch war oder ein allgemeiner entzündungshemmender Effekt, wurde der NK1-Agonist GR73632 (30 pmol) in mit TrkAIg1,2 vorbehandelten Stellen injiziert. Durch die 5-minütige Vorbehandlung wurde die Plasmaextravasation, die durch GR73632 induziert wurde, nicht inhibiert, wie ebenfalls in 15 angegeben ist.
Um die Stabilität der NGF Sequestrierung zu bewerten, wurden Hautstellen für einen längeren Zeitraum (40 Minuten) mit TrkAIg1,2 vorbehandelt und NGF zu Beginn der Akkumulationsperiode gegeben, wie in 16 gezeigt ist. Die Ergebnisse sind angegeben als extravasiertes Plasma (μl/Stelle) in Antwort auf intradermales Testagens, Mittel ± Standardfehlermittel, n = 4. Die durch 7S NGF (8 pmol) induzierte Antwort ist in den gefüllten Quadraten gezeigt, sowohl alleine als auch in Stellen, die mit zunehmenden Dosen von TrkAIg1,2 vorbehandelt wurden. Zum Vergleich ist die Antwort, die durch 7S NGF (8 pmol) koinjiziert mit TrkAIg1,2 (24 pmol) induziert wird, in dem gefüllten Balken gezeigt. Plasmaextravasation, die durch intradermale Injektion von GR73632 (30 pmol) induziert wird, ist in den gefüllten Dreiecken angegeben und Tyrodelösung (Vehikel) in den offenen Kreisen, wobei die Vorbehandlungsdosis von TrkAIg1,2 auf der y-Achse angegeben ist. Plasmaextravasation an Stellen, die Agens plus koinjizierten TrkAIg1,2 erhielten, die sich signifikant von den Stellen unterschieden, die Agens alleine erhielten, sind gezeigt als * p < 0,05, wie mittels ANOVA mit Bonferroni-Post-Test berechnet wurde.
In diesen Versuchen wurde NGF-induzierte Plasmaextravasation durch 80 pmol, jedoch nicht durch 24 pmol TrkAIg1,2 signifikant inhibiert. Die Plasmaextravasation, die durch Koinjektion von 8 pmol NGF mit 80 pmol TrkAIg1,2 induziert wurde, ist zum Vergleich angegeben. In Übereinstimmung mit den Ergebnissen der vorhergehenden Versuche wurde durch die Dosen des verwendeten TrkAIg1,2 keine signifikante Plasmaextravasation hervorgerufen, wenn es alleine injiziert wurde und die Plasamextravasation, die durch GR73632 induziert wurde, konnte ebenfalls nicht inhibiert werden (wie zuvor).
Die Wirkung von TrkAIg1 auf NGF-induzierte Plasmaextravasation
Anschließend an die vorherigen Versuchsreihen, bei denen beide Immunoglobulinähnlichen Domänen (TrkAIg1,2) verwendet wurden, versuchten wir, die Bindung von NGF an die Immunoglobulin-ähnlichen Domänen von TrkA weiter zu charakterisieren. Dafür verwendeten wir eine Probe von rekombinatem TrkAIg1, die erste Immunoglobulin-ähnliche Domäne. Wie in 17 zu sehen ist, zeigten Koinjektionsexperimente mit TrkAIg1 keine signifikante Inhibierung der NGF-induzierten Plasmaextravasation bei Dosen bis zu 80 pmol/Stelle.
Die Ergebnisse sind angegeben als extravasiertes Plasma (μl/Stelle) in Antwort auf intradermales Testagens, Mittel ± Standardfehlermittel, n = 6. Die durch 7S NGF (8 pmol) induzierte Antwort ist in gefüllten Quadraten angegeben, sowohl alleine als mit Koinjektion von TrkAIg1 angegeben. Zum Vergleich ist die durch Tyrodelösung (Vehikel) induzierte Antwort in den offenen Kreisen angegeben, wobei die Dosis des koinjizierten TrkAIg1 angegeben ist. Die Plasmaextravasation an Stellen, die Agens plus koinjizierten TrkAIg1 erhielten, die sich signifikant von den Stellen unterscheiden, die Agens alleine erhielten, sind als ns, nicht signifikant, angegeben, wie mittels ANOVA mit Bonferroni-Post-Test berechnet wurde.
Die Wirkung von TrkAIg2 auf NGF-induzierte Plasmaextravasation
Es wurde die Fähigkeit von TrkAIg2, NGF zu binden und zu sequestrieren, berechnet.
Wie aus 18 zu sehen ist, konnte mittels Koinjektion von TrkAIg2 mit NGF eine signifikante Inhibierung der NGF-induzierten Plasmaextravasation erzeugt werden, wenn ein zehnfacher Überschuss verabreicht wurde. Bei sämtlichen verwendeten Dosen rief TrkAIg2 keine Inhibierung der Plasmaextravasation hervor, welche durch GR73632 induziert wurde, und rief auch keine signifikante Plasmaextravasation hervor, wenn es alleine injiziert wurde. Die Ergebnisse sind angegeben als extravasiertes Plasma (μl/Stelle) in Antwort auf intradermales Testagens, Mittel ± Standardfehlermittel, n = 4–8. Die durch 7S NGF (8 pmol) induzierte Antwort ist in den gefüllten Quadraten angegeben, sowohl alleine als mit Koinjektion von TrkAIg2 angegeben. Zum Vergleich ist die durch GR73632 (30 pmol) induzierte Antwort in den gefüllten Dreiecken angegeben und die durch Tyrodelösung (Vehikel) induzierte in den offenen Kreisen angegeben, wobei die Dosis des koinjizierten TrkAIg2 angegeben ist. Plasmaextravasation an Stellen, die Agens plus koinjizierten TrkAIg2 erhielten, die sich von den Stellen signifikant unterschieden, die Agens alleine erhielten, sind gezeigt als *** p < 0,001, wie durch ANOVA mit Bonferroni-Post-Test berechnet wurde.
Durch Vorbehandlung von Hautstellen mit 80 pmol TrkAIg2 mit NGF war es auch möglich, die Plasmaextravasation zu inhibieren, welche durch 5 Minuten später gegebene 8 pmol NGF induziert wurde, 19. Die Ergebnisse sind angegeben als extravasiertes Plasma (μl/Stelle) in Antwort auf intradermales Testagens, Mittel ± Standardfehlermittel, n = 4. Die durch 7S NGF (8 pmol) induzierte Antwort ist in den gefüllten Quadraten angegeben, sowohl alleine als in Stellen, die mit zunehmenden Dosen von TrkAIg2 vorbehandelt wurden. Die Plasmaextravasation, die durch intradermale Injektion von GR73632 (30 pmol) induziert wurde, ist in den gefüllten Dreiecken angegeben und Tyrodelösung (Vehikel) in den offenen Kreisen, wobei die Vorbehandlungsdosis von TrkAIg2 angegeben ist. Plasmaextravasation an Stellen, die Agens plus koinjizierten TrkAIg2 erhielten, die sich signifikant unterscheiden von den Stellen, die Agens alleine erhielten, sind angegeben als [***]p < 0,001, wie durch ANOVA mit Bonferroni-Post-Test berechnet wurde. Auch hier wies diese Vorbehandlung auf die GR73632-induzierte Plasmaextravasation keine Wirkung auf und es wurde keine signifikante Plasmaextravasation hervorgerufen, wenn es alleine injiziert wurde (19).
Ähnliche Ergebnisse wurden erhalten, wenn TrkAIg2 als eine 40-minütige Vorbehandlung verwendet wurde, wie in 20 gezeigt ist. Die Ergebnisse sind angegeben als extravasiertes Plasma (μl/Stelle) in Antwort auf intradermales Testagens, Mittel ± Standardfehlermittel, n = 3. Die durch 7S NGF (8 pmol) induzierte Antwort ist in den gefüllten Quadraten gezeigt, sowohl alleine als in Stellen, die mit zunehmenden Dosen von TrkAIg2 vorbehandelt wurden. Die Plasmaextravasation, die durch intradermale Injektion von GR73632 (30 pmol) induziert wird, ist in den gefüllten Dreiecken angegeben und Tyrodelösung (Vehikel) in den offenen Kreisen, wobei die Vorbehandlungsdosis von TrkAIg2 angegeben ist. Die Plasmaextravasation an Stellen, welche Agens plus koinjizierten TrkAIg2 erhielten, die sich signifikant unterscheiden von den Stellen, die Agens alleine erhielten, sind gezeigt als *** p < 0,001, wie mittels ANOVA mit Student-Newman-Keuls-Post-Test berechnet wurde. Die durch NGF-induzierte Plasmaextravasation wurde durch TrkAIg2 bei 80 pmol signifikant inhibiert.
Zum Vergleich ist die Plasmaextravasation, die durch 8 pmol 7S NGF koinjiziert mit 80 pmol TrkAIg2 induziert wird, in der gefüllten Säule angegeben. Vorbehandlung mit TrkAIg2 induzierte alleine keine Plasmaextravasation und beeinflusste die durch GR73632 induzierte Plasmaextravasation nicht.
Die Ergebnisse zeigen eindeutig, dass die TrkAIg2-Domäne in der Lage ist, in vivo an NGF zu binden und seine biologische Aktivität zu blockieren.
Kristallisation von TrkAIg2
Kristalle von rekombinantem TrkA-Ig2 wurden unter einer Reihe von Bedingungen, zwischen 14–20% MPD, pH 5,0 (100 mM Na-Citrat), 300 bis 500 mM NaCl, pH 5,0 (100 mM Na-Citrat) am vorteilhaftesten bei 500 mM NaCl, pH 5,0 erhalten. Die Kristalle wuchsen reproduzierbar zu Dimensionen von annähernd 0,2 × 0,2 × 0,2 mm. Die Kristalle wurden dann kryo-konserviert. Unter Verwendung der Heimquelle (Rotationsanode, Spiegel, Imaging Plate) und der Synchrotron-Quelle in Hamburg, beugen diese Kristalle bei etwa 2,8 Å. Wird 50% Solvens angenommen, wird geschätzt, dass in der asymmetrischen Einheit 4 (oder möglicherweise 3) Moleküle vorliegen. Kristalle einer selenoMet-Form des Proteins sind hergestellt worden, wobei ein selenoMet Auxotroph (in dem Konstrukt liegen 4 Methionine vor) hergestellt worden, der für MAD-Phasing und als ein Schweratomderivat verwendet worden war. Es wurden rekombinante Formen von sowohl dem nativem als auch dem selenoMet TrkA-Ig2 hergestellt, gereinigt und rückgefaltet, wobei die anerkannten Vorgehensweisen verwendet wurden, wie sie an anderer Stelle in der Beschreibung definiert sind.
Therapeutische Aspekte von TrkAIg2
Da bestimmte Schmerzzustände durch eine Überexpression von NGF verursacht werden, wird angenommen und die Ergebnisse zeigen es, dass die Anwendung von NGF-Antagonisten wie Antikörpern oder der rekombinanten TrkAIg2-Bindungsdomäne entstehende Schmerzzustände mildern kann (McMahon, S. B. Series B-Biological Sciences, (1996), 351, Nr. 1338, 431–440; Woolf, C. J. et al. British Journal of Pharmacology, (1997), 121, Nr. 3, 417–424; Lowe, E. M. et al. British Journal of Urology, (1997), 79, Nr. 4, 572–577; Dmitrieva, N. et al. Neuroscience, (1997), 78, Nr. 2, 449–459; Aloe, L. et al. International Journal of Tissue Reactions-Experimental and Clinical Aspects, (1993), 15, Nr. 4, 139–143; Aloe, L. et al. Rheumatology International, (1995), 14, Nr. 6, 249–252).
Zusammenfassend haben die Erfinder daher das Unvermögen der Region, die als TrkAIg1 bezeichnet wird, an NGF zu binden, gezeigt. Die geringe Größe des TrkAIg2-Moleküls und die Fülle, mit der dieses Protein beispielsweise in E. coli erzeugt werden kann, gereinigt und in seine korrekte Formation rückgefaltet werden kann, verleiht ihm gegenüber der gesamten extrazellulären Domäne bestimmte Vorteile, die notwendigerweise in Säugetier- oder Insektenzellen gemacht werden müssen.
Es sind verschiedene Schmerzzustände bekannt, häufig chronische entzündliche Zustände, die mit einem Anstieg der NGF-Proteinkonzentrationen verbunden sind. Diese umfassen idiopathischen sensorischen Drang und interstitielle Zystitis, Arthritis und Gürtelrose. Es wird auch vorgeschlagen, dass solche chronischen Zustände zu einer Sensibilisierung peripherer Neuronen führen können und möglicherweise sogar zu langfristigen sensorischen neuronalen Anormalitäten. Durch Sequestrieren dieses erhöhten NGF durch die Verwendung von TrkAIg2, ist es möglich, Schmerz bei derartigen Zuständen und in anderen Zuständen, bei denen NGF erhöht ist, zu mildern.
In der gesamten Beschreibung wurden die folgenden Abkürzungen verwendet:
Abkürzungen für Aminosäuren
Abkürzungen für Nukleotide:

A

Adenin

G

Guanin

C

Cytosin

T

Thymin

U

Uracil

Abkürzungen für Mutationen:

X₁NNNX₂

X₁ und X₂

= ein Ein-Buchstabensymbol für eine Aminosäure wie zuvor definiert.

NNN

= numerische Ziffern, die die Position der Mutation in der Aminosäuresequenz anzeigen.

Claims

Isoliertes Polypeptid, bestehend aus der Aminosäuresequenz der Reste 22 bis 119 von 4B, wobei das Polypeptid in der Lage ist, ein Neurotrophin zu binden.
Isoliertes Polypeptid, bestehend aus der Aminosäuresequenz der Reste 22 bis 144 von 4B, wobei das Polypeptid in der Lage ist, ein Neurotrophin zu binden.
Polypeptid nach Anspruch 1 oder 2, das mit hoher Affinität an ein Neurotrophin bindet.
Polypeptid nach Anspruch 3, das mit einer Dissoziationskonstante von weniger als 10nM an ein Neurotrophin bindet.
Polypeptid nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Polypeptid aus Tierzellen isoliert wird.
Polypeptid nach Anspruch 5, wobei die Tierzellen Säugetierzellen sind.
Polypeptid nach Anspruch 6, wobei die Säugetierzellen menschliche Zellen sind.
Polypeptid nach Anspruch 5, wobei die Tierzellen Insektenzellen, Reptilienzellen, Fischzellen, Vogelzellen oder Amphibienzellen sind.
Polypeptid nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Neurotrophin NGF, NT-3 oder ein Neurotrophin, das p75NGFR bindet, ist.
Polypeptid nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Neurotrophin als ein Monomer, Dimer, Trimer, oder ein Neurotrophin-Heterodimer vorliegt.
Polypeptid nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Neurotrophin von einem Säuger, Insekt, Reptil, Fisch, Vogel oder einer Amphibie stammt.
Polypeptid nach Anspruch 11, wobei das Säugerneurotrophin ein menschliches Neurotrophin ist.
Isolierte DNA-Sequenz, die ein Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 12 kodiert oder Varianten einer derartigen DNA-Sequenz aufgrund der Degeneration des genetischen Codes oder Insertions- oder Deletionsmutanten davon, die ein Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 12 kodieren.
Plasmid oder anderer Vektor, der eine DNA-Sequenz nach Anspruch 13 umfasst.
Plasmid nach Anspruch 14, wobei das Plasmid ein Expressionsvektor ist.
Plasmid nach Anspruch 14 oder 15, wobei das Plasmid pET-15b (2A) ist.
Komplex, umfassend mindestens ein Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 12 und mindestens ein Neurotrophin oder eine Neurotrophinuntereinheit, ein Monomer oder einen biologisch aktiven Teil davon.
Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids nach einem der Ansprüche 1 bis 12, das das Einführen einer DNA-Sequenz nach Anspruch 13 oder eines Plasmids nach einem der Ansprüche 14 bis 16 in einen geeigneten Wirt umfasst, wodurch die DNA-Sequenz exprimiert wird.
Verfahren nach Anspruch 18, wobei der Wirt eine Tierzelle ist.
Verfahren nach Anspruch 19, wobei der Wirt eine Bakterienzelle ist.
Verfahren nach Anspruch 20, wobei der Wirt eine Säugerzelle ist.
Verfahren nach Anspruch 21, wobei der Wirt eine menschliche Zelle ist.
Verfahren zum Screenen von Molekülen, die an den TrkA-Rezeptor binden, wobei ein Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 12 verwendet wird.
Verfahren nach Anspruch 23, umfassend den Vergleich des Bindens eines putativen Liganden an TrkAIg1 oder eines Teils davon mit dem Binden des selben putativen Liganden an TrkAIg2 oder eines Teils davon.
Verfahren nach Anspruch 23 oder 24, umfassend die Auswahl von Molekülen, die an mindestens eine Solvens-exponierte Schleife von TrkAIg2 binden.
Verfahren nach Anspruch 25, wobei die Solvens-exponierte Schleife die Schleife E bis F, wie in 1(B) angegeben, ist.
Verfahren nach Anspruch 25 oder 26, wobei die Solvens-exponierte Schleife die Schleife C'' bis D, wie in 1(B) angegeben, ist.
Verfahren nach Anspruch 26 oder 27, wobei Moleküle mit einer Affinität von mindestens 10nM ausgewählt sind.
Verfahren nach einem der Ansprüche 23 bis 28, umfassend die Auswahl von Molekülen, die das Binden eines Polypeptids nach einem der Ansprüche 1 bis 12 oder TrKA oder eines Teils davon in seinem natürlichen Zustand an ein Neurotrophin erhöhen.
Verfahren der kombinatorischen Chemie umfassend: 1. einen eine Verbindung erzeugenden Schritt 2. einen eine Verbindung screenenden Schritt, der das Binden der während Schritt 1 erzeugten Verbindung mit einem Polypeptid oder einem Teil eines Polypeptids nach einem der Ansprüche 1 bis 12 umfasst.
Wirtszelle, die eine DNA-Sequenz nach Anspruch 14 oder ein Plasmid oder einen anderen Vektor nach einem der Ansprüche 14 bis 16 enthält.
Wirtszelle nach Anspruch 31, wobei die Wirtszelle eine Säuger-, Bakterien-, Insekten-, oder Hefezelle ist.
Wirtszelle nach Anspruch 32, wobei die Säugerzelle eine menschliche Zelle ist.
Diagnostische Sonde, wobei die Sonde ein Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 12 umfasst.
Diagnostische Sonde nach Anspruch 34, wobei die Sonde markiert ist.
Diagnostische Sonde nach Anspruch 35, wobei die Markierung eine fluoreszierende Markierung oder eine Radiomarkierung ist.
Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids nach einem der Ansprüche 1 bis 12 durch chemische oder biologische Mittel.
Organismus, der erzeugt wurde, um ein Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 12 oder eine DNA-Sequenz nach Anspruch 13 zu enthalten, zu exprimieren, oder zu überexprimieren, wobei der Organismus nicht menschlich ist.
Organismus nach Anspruch 38, wobei der Organismus ein Tier, Bakterien, Hefe oder ein Insekt ist.
Organismus nach Anspruch 39, wobei der Organismus ein Säuger, Bakterien, Hefe oder ein Insekt ist.
Zusammensetzung zur Kontrolle von Schmerzen, die mit einer Erhöhung der Neurotrophinspiegel einhergehen, umfassend ein Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 12.
Pharmazeutische Zusammensetzung zur Verwendung in einem Verfahren zur Behandlung eines Probanden mit Schmerzen, die mit einer Erhöhung der Neurotrophinspiegel einhergehen, wobei die Zusammensetzung ein Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 12 umfasst.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 42 zur Verwendung in einem Verfahren zur Behandlung eines Probanden mit Schmerzen, die mit einer Erhöhung der Neurotrophinspiegel einhergehen, wobei die Schmerzen ein Symptom für Leiden sind, die ausgewählt sind aus idiopathischem sensorischem Drang (idiopathic sensory urgency (ISU)), interstitieller Cystitis, Arthritis, Gürtelrose, peripherer Entzündung, chronischer Entzündung oder Postherpes-Neuralgie.
Pharmazeutische Zusammensetzung zur Verwendung in einem Verfahren zur Behandlung eines Probanden mit Alzheimer-Erkrankung, wobei die Zusammensetzung ein Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 12 umfasst.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 42 bis 44, wobei das Neurotrophin NGF ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend ein Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 12 zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger oder Verdünnungsmittel.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 46, die mindestens ein Neurotrophin enthält.
Kristall, umfassend ein Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 10.
Kristall nach Anspruch 48, wobei das Polypeptid TrkAIg2 ist.