DE60009484T2 - Als ngf-antagonisten wirkende monoklonale antiköper und deren synthetische und biotechnologische derivate - Google Patents

Als ngf-antagonisten wirkende monoklonale antiköper und deren synthetische und biotechnologische derivate Download PDF

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Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft monoklonale Antikörper, deren synthetische und biotechnologische Derivate, die als NGF-Antagonisten bzw. NGF-antagonistische Moleküle wirken.
  • Insbesondere betrifft die Erfindung einen monoklonalen Antikörper, synthetische und rekombinante Derivate davon, der/die dazu befähigt sind, den Tyrosinkinase-Rezeptor von NGF (Nervenwachstumsfaktor) mit hoher Affinität, TrkA genannt, zu erkennen und zu binden und als Antagonist der Bindung von NGF an TrkA zu wirken. Die Erfindung betrifft ebenfalls diagnostische und therapeutische Verwendungen derartiger Moleküle und damit verbundene Zusammensetzungen.
  • Neutrophine sind eine Familie von Peptid-Wachstumsfaktoren (Barde, 1994), die mit dem ersten Mitglied der Familie, NGF (Nervenwachstumsfaktor, Levi-Montalicini, 1987), strukturell verwandt sind. Neutrophine modulieren die neuronale Differenzierung und das neuronale Überleben sowie die synaptische Übertragung sowohl von peripheren Neuronen als auch im Zentralnervensystem. Des Weiteren wirkt NGF auf verschiedene nicht-neuronale Gewebe und Zellen, wie beispielsweise Zellen des Immunsystems.
  • NGF wirkt über zwei Membranrezeptoren, die in den Zielzellen vorliegen, nämlich den p75-Rezeptor mit niedriger Affinität und das 140-kDa-Transmembranglycoprotein mit hoher Affinität, TrkA (Kaplan et al., 1991, Klein et al., 1991), das eine Tyrosinkinase-Aktivität aufweist. TrkA wird in Neuronen der Neuralleiste, in sympathischen Neuronen sowie in cholinergen Neuronen des basalen Vorderhirns und des Corpus striatum expremiert, wo es den entscheidenden Mediator der NGF-Wirkungen darstellt (Holtzman et al., 1992; Verge et al., 1992), TrkA wird ebenfalls in einigen nicht-neuronalen Geweben und Zellen, einschließich B-Lymphocyten (Torcia et al., 1996), expremiert.
  • Im Stand der Technik wird die potentielle Verwendung von NGF in der Behandlung von verschiedenen neurodegenerativen Erkrankungen, einschließlich der Alzheimerschen Erkrankung (Lindsay et al., 1994; Ebendal et al., 1991) und anderer Erkrankungen wie Diabetes mellitus und Lepra (Anand et al., 1996), vorgeschlagen. Erste klinische Tests verliefen jedoch enttäuschend, wobei sie durch Schwierigkeiten mit der Abgabe, durch die Pharmakokinetiken im Zentralnervensystem und durch negative agonistische Eigenschaften von NGF gegenüber anderen peripheren Zielen außerhalb des Zentralnervensystems kompliziert wurden, die zu massiven und unerwünschten Stimuli führten.
  • Daher besteht der Bedarf an der Entwicklung gegenüber der Wechselwirkung NGF-TrkA-Rezeptor selektiven antagonistischen Molekülen und pharmakologisch wirksamen Derivaten davon, die leicht abgegeben werden.
  • Des Weiteren war die NGF-Überproduktion in verschiedenen entzündlichen Zuständen mit dem Anstieg der Schmerzempfindlichkeit der primären afferenten Nocizeptoren verbunden, was somit zum Auftreten eines chronischen Schmerzzustandes beitrug. Die Population sensorischer Neuronen, die auf Gewebeschäden ansprechen (Nocizeptoren), ist besonders NGF-abhängig. Zieht man außerdem die Nachteile und Beschränkungen der zwei existierenden Klassen von Schmerzmitteln (nicht-steroide entzündungshemmende Arzneimittel und Opiate) in Betracht, stellt die Bereitstellung eines neuen davon verschiedenen Ziels wie NGF einen Fortschritt im Fachgebiet dar (Snider und McMahon, 1998). Des Weiteren stellt NGF, wie von Levine (Levine, 1998) vorgeschlagen, ein potentielles Ziel für die Gestaltung bzw. das Design neuer Therapien von Schmerzen, insbesondere diejenigen, die sich aus entzündlichen oder neuropathischen Zuständen ergeben, bei denen übliche Arzneimittel weniger wirksam sind, bereit. Schließlich zeigten neuere Untersuchungen eine direkte Beziehung zwischen dem Schmerz und dem TrkA-System, wobei in vier unabhängigen Fällen des Schmerzes vom Typ 4 mit chronischer Unempfindlichkeit und begleitender Anhidrose, das Vorliegen von Mutationen im TrkA-Gen und somit das Fehlen funktionaler NGF-Rezeptoren nachgewiesen wurde (Indo et al., 1996; Wood, 1996).
  • Demgemäß stellt das NGF-TrkA-System ein potentielles Ziel für das Design von Schmerztherapien, d. h. Behandlungen, die mit Hilfe effizienter TrkA-Antagonisten dazu befähigt ist, das neuropathische Schmerzsyndrom zu bekämpfen, bereit (Levine, 1998; Snider und McMahon, 1998).
  • Die anormale Expression der TrkA-Rezeptor-mRNA war auch mit neoplastischen Erkrankungen verbunden. Die Prognose von TrkA-expremierenden Tumoren, die „bildgebende" Diagnostik sowie die Therapie stellen Anwendungsgebiete für Antikörper mit hoher Affinität für TrkA dar. Tatsächlich stellen in diesen Tumoren TrkA-bindende Agentien wertvolle Werkzeuge der klinischen Diagnose, Prognose und therapeutischer Behandlungen dar (Kramer et al., 1997).
  • Rekombinante Antikörper (Vaughan et al., 1998) sind Ausgangsreagenzien der Wahl bei der Entwicklung kleiner Moleküle, die deren Wirksamkeit nachahmen (Le Sauteur et al., 1995).
  • Debeir et al., PNAS, März 1999, Bd. 96, Seiten 4067–4072, offenbaren ein kleines Peptid, das die Wechselwirkung zwischen NGF und TrkA inhibiert.
  • Von Le Sauteur et al., 1996, und in der PCT-Anmeldung Nr. WO97/21732 wurde ein TrkA-agonistischer monoklonaler Antikörper beschrieben. Aufgrund der agonistischen Wirksamkeit des einzigen offenbarten Antikörpers (5C3) ist er für die Ziele der vorliegenden Erfindung und in allen Situationen ungeeignet, in denen die Hyperaktivierung des TrkA-Rezeptors vermieden werden muss. Die PCT-Anmeldung Nr. WO97/21732 offenbart die Verwendung des agonistischen Antikörpers 5C3 als „Bildgebungs"-Diagnostikum. Dieser Antikörper kann jedoch aufgrund seiner agonistischen Wirkung nicht in der obigen Anwendung verwendet werden, so lange die Rezeptoraktivierung nicht behindert wird.
  • Daher besteht ein klarer Bedarf an der Entwicklung neuer Moleküle, die geeignet sind, mit der Bindung von NGF an TrkA zu interferieren, neue therapeutische Wirkungen bereitstellen und insbesondere einen TrkA-Antikörper bereitstellen, der als Antagonist wirkt, und dann idealerweise die Blockierung der Rezeptoraktivierung durch endogene Liganden (NGF) gewährleisten und keine Aktivierungsaktivität gegenüber dem Rezeptor aufweisen. Des Weiteren könnte der Antikörper vorteilhafterweise bei der Entwicklung von Reagenzien, d. h. synthetischen und rekombinanten Fragmenten, welche die NGF-TrkA-Wechselwirkung blockieren, verwendet werden.
  • Der Autor der vorliegenden Erfindung hat verschiedene monoklonale Antikörper isoliert, die zur Wechselwirkung mit dem NGF-Rezeptor, TrkA genannt, befähigt sind. Von diesen wirkt ein Antikörper, MNAC13 genannt, durch Inhibition der Bindung von NGF an TrkA als starker Antagonist von TrkA. Dieser Antikörper stellt ein sehr wirksames Mittel zur Verhinderung der funktionellen Aktivierung von TrkA durch NGF in einer Vielzahl von biologischen Systemen dar.
  • Der Antikörper wurde durch kongene Immunisierung von Balb/C-Mäusen mit einem humanen nativen TrkA-Rezeptor, der auf Balb/C-3T3-Zellen expremiert wird, erzeugt. Die Selektion basierte auf der Befähigung der Antikörper zur Inhibierung der Bindung von NGF an TrkA-expremierende Zellen. Dies führte zur Isolierung von zur Bindung an TrkA an dessen NGF-bindender Domäne befähigter Antikörper, die dadurch die Bindung von NGF verhindern. Der Antikörper MNAC13 verhindert in sehr wirksamer Weise die funktionelle Aktivierung von TrkA durch NGF in verschiedenen biologischen Systemen. Der Autor der vorliegenden Erfindung hat ebenfalls die Gene, welche die variablen Regionen des MNAC13-Antikörpers kodieren, kloniert, und mit Hilfe von rekombinanten DNA-Techniken derartige Regionen zu funktionellen Polypeptiden verminderter Größe (Einzelketten-Fv-Fragment, scFvMNAC13) zusammengesetzt, wobei bestätigt wurde, dass diese die Eigenschaften des parentalen Antikörpers beibehalten.
  • Ein agonistischer Antikörper bedeutet einen Antikörper, der zur Aktivierung des Rezeptorantigens in Abwesenheit des nativen Liganden des Rezeptors selbst befähigt ist.
  • Ein antagonistischer Antikörper bedeutet einen Antikörper, der gegen das aktive Zentrum des Antigenrezeptors gerichtet ist und dazu befähigt ist, die Aktivität des natürlichen Liganden, der bezüglich der Bindung zum Rezeptor selbst mit Letzterem konkurriert, zu inhibieren.
  • Synthetische und biotechnologische Derivate eines Antikörpers bedeuten jegliche veränderte bzw. (gen)technisch erzeugte, durch chemische oder rekombinante Techniken synthetisierte Fragmente, welche die funktionellen Eigenschaften des Antikörpers beibehalten.
  • Ein Ziel der vorliegenden Erfindung ist ein monoklonaler Antikörper, synthetische und biotechnologische Derivate davon, das/die dazu befähigt ist/sind, den Tyrosinkinase-Rezeptor von NGF (Nervenwachstumsfaktor) mit hoher Affinität, TrkA genannt, zu erkennen und zu binden und als Antagonist der Bindung von NGF an TrkA zu wirken.
  • Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform weist der Antikörper der vorliegenden Erfindung die variable Region der leichten Kette auf, die im Wesentlichen aus der Sequenz von AA. 23 bis AA. 134 der SEQ ID Nr. 2 besteht.
  • Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform weist der Antikörper der vorliegenden Erfindung die variable Region der schweren Kette auf, die im Wesentlichen aus der Sequenz von AA. 152 bis AA. 276 der SEQ ID Nr. 2 besteht.
  • Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist das biotechnologische Derivat der Erfindung ein ScFv-Fragment, das
    • a) die variable Region der leichten Kette des erfindungsgemäßen Antikörpers oder funktionelle Derivate davon und
    • b) die variable Region der schweren Kette des Antikörpers der vorliegenden Erfindung oder funktionelle Derivate davon umfasst.
  • Vorzugsweise umfasst das ScFv-Fragment eine Verknüpfungs-Sequenz bzw. eine Linker-Sequenz zwischen den variablen Regionen der leichten Kette und der schweren Kette auf. Mehr bevorzugt weist das ScFv-Fragment im Wesentlichen die Sequenz der SEQ ID Nr. 2 auf.
  • Ein weiteres Ziel der Erfindung ist ein synthetisches oder biotechnologisches Derivat des monoklonalen Antikörpers, das mindestens eine die Komplementarität des Antikörpers bestimmende Region (CDR) umfasst und das zur Wirkung als Antagonist der Bindung von NGF an TrkA befähigt ist. Vorzugsweise liegt die Region innerhalb der variablen Region der schweren Kette, mehr bevorzugt ist die Region in der Sequenz von AA. 152 bis AA. 276 der SEQ ID Nr. 2 enthalten.
  • Die vorliegende Erfindung schließt eine Nukleinsäure ein, die für den erfindungsgemäßen Antikörper oder Derivate davon kodiert. Vorzugsweise kodiert die Nukleinsäure das ScFv-Fragment der SEQ ID Nr. 2, mehr bevorzugt weist die Nukleinsäure die Sequenz der SEQ ID Nr. 1 auf.
  • Die Nukleinsäuren der vorliegenden Erfindung können vorteilhafterweise als Transgene verwendet werden, um nicht-humane transgene Tiere, vorzugsweise Mäuse, zu erhalten, in welchen der Antikörper induzierbar oder unter Kontrolle von Promotoren, welche die Expression im adulten Tier bestimmen bzw. steuern, expremiert wird. Diese Tiere können vorteilhafterweise dazu verwendet werden, Arzneimittel für humane Erkrankungen, bei denen die NGF/TrkA-Wechselwirkung inhibiert ist, und insbesondere neurodegenerative Erkrankungen, zu untersuchen und zu testen. Transgene nicht-humane Tiere können mit Hilfe von Standardtechniken, d.h. wie in Allen et al., 1987, beschrieben, erhalten werden.
  • Transgene Modelle (Smeyne et al., 1994), die auf der Repression des TrkA-Gens basieren, zeigen einen letalen Phänotyp innerhalb von 1–2 Wochen nach der Geburt und sind dann zur Untersuchung von TrkA im adulten und gealterten Nervensystem ungeeignet. Antikörper-expremierende transgene Tiere sind von Piccioli et al., 1991, 1995, offenbart.
  • Die vorliegende Erfindung schließt einen Phage oder einen prokaryotischen Vektor ein, der die erfindungsgemäße Nukleinsäure umfasst und dazu befähigt ist, diese korrekt und wirksam zu expremieren.
  • Die vorliegende Erfindung schließt einen rekombinanten eukaryotischen Vektor, der die erfindungsgemäße Nukleinsäure umfasst und dazu befähigt ist, diese korrekt und wirksam zu expremieren, sowie eine pharmakologische Zusammensetzung, umfassend den rekombinanten Vektor, zur Gentherapie neurologischer Erkrankungen, ein. Erkrankungen umfassen die folgende Gruppe, sind aber nicht auf diese beschränkt: chronischer Schmerz, akuter Schmerz, Neurome, TrkA-expremierende neoplastische Tumoren.
  • Die vorliegende Erfindung schließt eine pharmakologische Zusammensetzung ein, die eine wirksame Menge des monoklonalen Antikörpers der Erfindung oder synthetischer und biotechnologischer Derivate davon, der/die dazu befähigt ist/sind, den Tyrosinkinase-Rezeptor von NGF (Nervenwachstumsfaktor) mit hoher Affinität, TrkA genannt, zu erkennen und zu binden und als Antagonist der Bindung von NGF an TrkA zu wirken, und einen pharmazeutisch verträglichen Träger umfasst. Die Zusammensetzung der Erfindung kann vorteilhafterweise zur Behandlung neurologischer Erkrankungen verwendet werden, die in der folgenden Gruppe eingeschlossen, jedoch nicht darauf beschränkt sind: chronischer Schmerz, akuter Schmerz, Neurome, TrkA-expremierende neoplastische Tumoren.
  • In Anbetracht der Tatsache, dass NGF bei der Behandlung einige unerwünschte Nebenwirkungen zeigt, betrifft die Erfindung ebenfalls eine pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend eine pharmazeutisch wirksame Menge von NGF und des erfindungsgemäßen Antikörpers oder der Derivate davon. Eine derartige Zusammensetzung sollte zur Inhibierung unerwünschter Wirkungen von NGF bei peripheren Spiegeln befähigt sein.
  • Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung bilden veränderte bzw. (gen)technisch erzeugte Zellen, die zur Expression des Antikörpers der Erfindung oder biotechnologisch und synthetischer Derivate davon befähigt sind, sowie eine pharmakologische Zusammensetzung, welche die Zellen umfasst, zur Gentherapie neurologischer Erkrankungen, die in der folgenden Gruppe eingeschlossen, jedoch nicht darauf beschränkt sind: chronischer Schmerz, akuter Schmerz, Neurome, TrkA-expremierende neoplastische Tumoren.
  • Angesichts der Spezifität des Antikörpers der vorliegenden Erfindung und in Abwesenheit unerwünschter induzierender Wirkungen, kann er vorteilhafterweise in einer Zusammensetzung für „bildgebende" In-Vivo-Diagnostiken verwendet werden.
  • Die vorliegende Erfindung wird nachstehend in Bezug auf beispielhafte, jedoch nicht einschränkende Ausführungsformen beschrieben. Es wird auf die folgenden Figuren Bezug genommen.
  • 1 Inhibition der Bindung von 125I-NGF an TrkA+-Balb/C-3T3-Zellen. Hybridom-Überstände wurden vor der Zugabe von 125I-NGF mit TrkA+-Balb/C-3T3-Zellen vorinkubiert. Das Histogramm stellt die Inhibition der spezifischen NGF-Zell-Bindung durch verschiedene Antikörper dar. Die spezifische Bindung wurde durch Subtraktion von der Gesamtbindung, die in Gegenwart eines Überschusses von unmarkiertem NGF erhalten wurde, bestimmt. Die gezeigten Werte sind der Durchschnitt von Dreifachbestimmungen.
  • 2 MNAC13 erkennt die extrazelluläre Domäne des TrkA-Rezeptors. Lösliche TrkA- und TrkB-Rezeptoren, die in Form von Immunoadhesinen erzeugt wurden, wurden als Festphasenantigene für einen ELISA-Test verwendet und mit 2 oder 20 ng/ml gereinigtem MNAC13-Antikörper inkubiert.
  • 3 MNAC13 erkennt den TrkA-Rezeptor auf lebenden Zellen. Balb/C-3T3- oder TrkA+-Balb/C-3T3-Zellen wurden mit dem MNAC13-Antikörper inkubiert und einer FACS-Analyse unterworfen.
  • 4 MNAC13 markiert die TrkA-Rezeptoren auf Neuronen des basalen Vorderhirns der Ratte.
  • Koronale Schnitte des basalen Vorderhirns von P10-Ratten wurden in Gegenwart (A) oder in Abwesenheit (B) des MNAC13-Antikörpers inkubiert. Vergleichsbalken: 98 μm.
  • 5 MNAC13 inhibiert die von NGF induzierte Differenzierung von PC12-Rattenzellen.
  • PC12-Zellen wurden in Serum-freies Medium überführt und in Gegenwart (A) oder in Abwesenheit (B, C und D) von 20 ng/mg NGF für etwa 4 Tage inkubiert. Der MNAC13-Antikörper (4 μg/ml) inhibiert vollständig das NGF-induzierte Überleben und die NGF-induzierte Differenzierung, während der Kontroll-Antikörper 9E10 dies nicht bewirkt (D).
  • 6 Die Implantation von MNAC13-sekretierenden Zellen in das Rattenhirn vermindert deutlich die Anzahl cholinerger Neuronen im basalen Vorderhirn.
  • Der cholinerge Phänotyp von Neuronen im basalen Vorderhirn von P9-Ratten wurde durch die Immunreaktivität mit der Cholinacetyltransferase (ChAT) nach der intraventrikulären Implantation von MNAC13-Hibridom-(B)- von Kontroll-Myelom-(A)-Zellen am Tag P2 bestimmt. Es ist eine deutliche Verminderung der Anzahl ChAT-positiver Neuronen in den MNAC13-implantierten Ratten (B) festzustellen. Vergleichsbalken: 65 μm.
  • 7 Rekombinante Formen von MNAC13-mAk binden TrkA.
  • Phagen mit scFvMNAC13 (A), löslichem scFvMNAC13 (B) und dem parentalen monoklonalen Antikörper MNAC13 (C) wurden in einem ELISA-Test unter Verwendung von TrkA-Immunadhesin als Festphasenantigen in Gegenwart ansteigender Konzentrationen des konkurrienden löslichen TrkA-Immunadhesins verwendet.
    Figure 00090001
    : 10-fache Verdünnung des Antikörpers in Bezug auf
  • 8 Inhibition des NGF-induzierten Neuriten-Wachstums von PC12-Zellen durch den rekombinanten Antikörper ScFvMNAC13.
  • Periplasmatische Fraktionen, enthaltend den rekombinanten ScFvMNAC13 (B) oder ein ScFv-Kontrollfragment (Antifox-ScFv) wurden zusammen mit 10 ng/ml NGF zu PC12-Zellen, die für 7 Tage mit 50 ng/ml NGF induziert wurden und zum Beginn des Tests erneut ausplattiert wurden, gegeben. Der rekombinante ScFvMNAC13-Antikörper in B inhibiert das durch die Aktivierung von TrkA durch NGF gesteuerte wiederkehrende Wachstum von Neuriten in erneut ausplattiertem NGF-induzierten PC12-Zellen.
  • METHODEN Immunisierungsprotokoll
  • Es wurden Balb/C-3T3-transfizierte Zellen, die 106 humane TrkA-Moleküle pro Zelle expremieren, in einem kongenen Immunisierungsprotokoll verwendet. Es wurden drei Gruppen weiblicher Balb/C-Mäuse mit 105, 5 × 105 bzw. 106 lebenden Zellen pro Maus immunisiert. Nach 5 Injektionen in einem Abstand von zweiwöchigen Intervallen wurden Präfusionsseren hinsichtlich ihrer Befähigung zur Inhibition der Bindung von NGF an den TrkA-Rezeptor auf TrkA+-Balb/C-3T3-Zellen getestet. Die größte Inhibition der NGF-Bindung wurde bei Seren von Mäusen festgestellt, die mit 5 × 105-Zellen injiziert wurden (Bindungsinhibition bei einer Verdünnung von 1:100).
  • Hybridom-Herstellung
  • Drei Tage nach einer Verstärkungsinjektion von TrkA+-Balb/C-3T3-Zellen wurden die Mäuse getötet, die Milzen entfernt und Splenocyten mit einem NSO-Myelom (10:1-Verhältnis) mit Polyethylenglycol (PEG 1500), wie beschrieben (Novak et al., 1991), fusioniert. Das Hybridom-Wachstum und die Selektion wurden gemäß Standardmethoden durchgeführt (Galfre und Milstein, 1981).
  • Inhibition der 125I-Bindung an TrkA+-Balb/C-3T3-Zellen
  • 2,5 S NGF wurden aus submandibulären Drüsen von Mäusen gereinigt und auf eine spezifische Aktivität von 105 cpm/ng, wie beschrieben (Cattaneo et al., 1983), iodiert. 5 × 104 TrkA+-Balb/C-3T3-Zellen wurden in jede Vertiefung von Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen in einem Volumen von 50 μl Kulturmedium (DMEM mit 10 % FCS) ausplattiert. Es wurden Aliquote von 50 μl Hybridom-Überstand für 1 Stunde mit Zellen inkubiert, gefolgt von der Zugabe der 125I-NGF-Lösung (5 × 104 cpm/Vertiefung). Die Platten wurden wie beschrieben (Cattaneo et al., 1988) weiter verarbeitet. Die nicht-spezifische Bindung wurde parallel in Vertiefungen in Gegenwart eines Überschusses (5 μg/ml) von nicht-markiertem NGF bestimmt. In parallel verarbeiteten Vertiefungen wurde die Bindung in Gegenwart eines nichtrelevanten Hybridom-Überstands (Rab50) oder neutralisierendem Anti-NGF (mAk αD11, Cattaneo et al., 1988) durchgeführt.
  • ELISA
  • Lösliche TrkA- und TrkB-Rezeptoren wurden als Immunadhesine (Chamow und Ashkenazi, 1996) durch Verknüpfen der extrazellulären Domäne des humanen TrkA-Rezeptors mit dem FC-Anteil von IgG2, der aus einer Sequenz von 35 Aminosäuren besteht, gefolgt von CH2- und CH3-Domänen, erzeugt. Die für die TrkA- und TrkB-Immunadhesine (TrkA-IgG und TrkB-IgG) kodierenden Sequenzen wurden in Baculoviren (Autographa califonica Nukleärer Polyhedrosis Virus, AcNPV) für die Expression in Insektenzellen (Baculogold Transfektions-Kit, Pharmingen Ing.) kloniert, und die Proteine wurden durch Protein-A-Sepharose-Chromatographie aus Serum-freien Kulturmedium von High-Five-Insektenzellen gereinigt. Für den ELISA-Test wurden TrkA-IgG und TrkB-IgG bei 2 μg/ml inkubiert und dann mit 2 oder 20 ng/ml MNAC13 und Anti-Maus-IgG, die zuvor an Kamel-Immunoglobinen vorabsorbiert wurden, inkubiert.
  • Immunfluoreszenz-Analvse
  • Der monoklonale MNAC13-Antikörper wurde aus Serum-freien Hybrodom-Überständen durch Protein-A-Sepharose-Chromatographie gereinigt. Es wurden 5 × 104 TrkA+-3T3-Balb/C-Zellen mit gereinigtem MNAC13-Antikörper inkubiert und mit einem Sortiergerät für aktivierte Zellen (FACS) analysiert. Für die Immunfluoreszenz wurden adhärente Zellen mit 3,7 % Paraformaldehyd in PBS fixiert, mit gereinigtem MNAC13 inkubiert, gefolgt von einem FITC-markierten Anti-Maus-IgG und mittels konfokaler Mikroskopie (Olympus) analysiert.
  • NGF-Biotest mit PC12-Zellen
  • PC12-Rattenzellen (Greene und Tischler, 1976) wurden in RPMI mit 10 % Hitze-inaktiviertem Pferde-Serum und 5 % FCS kultiviert. Für den Biotest wurden die Zellen in Serum-freies Medium überführt und mit 20 ng/ml NGF für 4 bis 6 Tage in Gegenwart oder Abwesenheit von MNAC13-Antikörpern oder dessen einzelkettiger rekombinanter Fv-Version (scFvMNAC13) inkubiert. In einer anderen Ausführungsform wurden die Zellen mit 50 ng/ml NGF für 1 Woche inkubiert, und dann wurden sie mechanisch von den Neuriten entfernt, um sie in Gegenwart von 10 ng/ml NGF und unter Zugabe des geeigneten Antikörpers wieder auszuplattieren. Das Neuriten-Wachstum wurde 24–48 Stunden danach bewertet.
  • Intraventrikuläre Hybridom-Injektionen und Immunchemie
  • Intraventrikuläre Hybridom-Injektionen und die Analyse des cholinergen Phänotyps von Neuronen des basalen Vorderhirns wurden im Wesentlichen wie beschrieben (Molnar et al., 1997 und 1998) durchgeführt. Kurz erläutert wurden MNAC13-Hybridom-Zellen und Myelom-Kontrollzellen (P3X63Ag8) in Hank-Lösung (HBBS) bei 2 × 105 Zellen/μl suspendiert und in den rechten lateralen Ventrikel von Wistar-Ratten, wie beschrieben (Molnar et al., 1998), injiziert. Die Injektion wurde am postnatalen Tag 2 (P2) durchgeführt, und die Tiere wurden zur Analyse am Tag P8 getötet. Nach Perfusion unter Anästhesie wurden die Hirne zur aChAT-Immunhistochemie, wie beschrieben (Molnar et al., 1997 und 1998), verarbeitet. Der Gehalt an MNAC13-Antikörpern im cerebrospinalen Fluid (CSF) wurde durch einen ELISA-Test unter Verwendung löslicher TrkA-Rezeptoren als Festphasen-Antigene bestimmt.
  • Für die Immunchemie mit MNAC13 wurden die Tiere mit Ether unter Perfusion mit PB (0,1 M, pH 7,4), gefolgt von 4 % Paraformaldehyd/PB bei 4 °C für 2 Stunden betäubt. Nach der Präparierung wurden die Hirne in 4 % Paraformaldehyd/PB bei 4 °C für 2 Stunden fixiert, in 25 % Sucrose/PBS überführt, dann in Isopentan bei –20 °C gefroren und mit einem Cryostaten geschnitten. Die koronalen Schnitte, enthaltend das basale Vorderhirn, wurden auf gelatinisierten Objektträgern gesammelt und bei –20 °C bis zur Verarbeitung gelagert. Nach der Blockierung nichtspezifischer Bindungsstellen in einer Lösung von 10 % FCS/5 % BSA in Tris HCl 0,1 M pH 7,4, 0,05 % Triton-100, wurden die Schnitte über Nacht bei 4 °C mit Anti-TrkA (6 μg/ml) in 10 % FCS/2 % BSA in Tris HCl 0,1 M, pH 7,4, 0,05 % Triton X-100 inkubiert. Während der nächsten Tage wurden die Schnitte mit biotinylierten Anti-Maus-IgG für 2 Stunden bei Raumtemperatur und für 1 Stunde im ABC-Kit (Vector) inkubiert. De Reaktion wurde in 3,3'-Diaminobenzidin-HCl entwickelt. Nach der Dehydratation wurden die Schnitte in DPX gegossen.
  • Klonierung der variablen Regionen des mAk MNAC13
  • Die Klonierung der variablen Regionen des mAk MNAC13 wurde ausgehend von Hybridom-mRNA mittels PCR der variablen Region durchgeführt. Die PCR der variablen Regionen wurde mit einem Satz für Maus-Immunoglobuline spezifischer Oligonukleotid-Primer (Krebber et al., 1997) durchgeführt. Die amplifizierten variablen VH- und VK-Regionen wurden mittels PCT zu einem scFv-Format zusammengefügt und in einen pDNA-Vektor (Bradbury et al., 1996) kloniert. Nach einer Fingerabdruck-Analyse mit der Restriktions-Endonuklease BstNI, welche eine eingeschränkte Diversität der resultierenden scFVs bestätigte, wurden Phagen-Partikel, welche die scFV-Fragmente zeigten, einem ELISA unter Verwendung von TrkA-IgG als Festphasen-Antigen unterworfen. Der Test wurde mit sekundären HRP-gekoppelten Anti-M13-Antikörpern entwickelt. Als positiv identifizierte Phagen wurden weiter getestet und schließlich zur Herstellung löslicher scFV-Fragmente in E. coli verwendet. Bakterielle Überstände wurden mittels ELISA gegen TrkA-IgG unter Verwendung eines monoklonalen Antikörpers gegen den SV5-Marker (Hanke et al., 1992), der im scFV-Fragment vorliegt, gefolgt von HRP-konjugierten Anti-Maus-IgGs getestet.
  • ERGEBNISSE
  • Herstellung und Charakterisierung eines monoklonalen Antikörpers, der die Bindung von NGF an TrkA inhibiert
  • Um Antikörper herzustellen, die dazu befähigt sind, die Neutrophin-Bindungsaktivität des TrkA-Rezeptors zu stören, wurde ein kongenes Immunisierungsprotokoll verwendet. Es wurden durch Transfektion mit dem humanen Proto-Onkogen trk hergestellte Balb/C-3T3-Zellen, welche den humanen TrkA-Rezeptor expremieren, für die Immunisierung von Balb/C-Mäusen verwendet. Es wurde festgestellt, dass die Anzahl der Zellen für die Induktion von Serum-Antikörpern, welche die Bindung von NGF an Zielzellen neutralisieren, kritisch war.
  • Die Hybridom-Überstände wurden hinsichtlich ihrer Befähigung zur Inhibition der Bindung von 125I an 3T3-TrkA+-Zellen getestet. Von 1266 Vertiefungen, in welchen ein Hybridom-Wachstum auftrat, zeigten nur 4 eine NGF-neutralisierende Aktivität. Die entsprechenden Zellen wurden subkloniert, wodurch die Klone MNAC13, C30, C191 und C232 erhalten wurden. Die Befähigung der von diesen Klonen hergestellten Antikörper zur Inhibierung der Bindung von NGF an 3T3-TrkA+-Zellen ist in 1 gezeigt. Diese Anti-TrkA-Antikörper inhibieren die Bindung von NGF ebenso effizient bzw. wirksam wie der neutralisierende Anti-NGF-αD11-Antikörper (1). Während der Letztere im aktiven Zentrum von NGF bindet, bindet der Erstere den TrkA-Rezeptor sehr wahrscheinlich an der oder nahe der NGF-erkennenden Stelle. Der IgG-MNAC13-Antikörper wurde für weitere Untersuchungen ausgewählt.
  • Die Inhibition der NGF-Bindung erfolgt durch eine direkte Wechselwirkung der Antikörper mit dem extrazellulären Anteil des TrkA-Rezeptors, was durch verschiedene Bindungsstudien mit einer löslichen Form des humanen TrkA-Rezeptors, der als Immunadhesin erzeugt wurde (Charmow und Ashkenazi, 1996), in welchem der extrazelluläre Anteil des Rezeptors mit den FC-Domänen der Karnel-Immunoglobuline (siehe Methoden) fusioniert ist, gezeigt wurde. Die 2 zeigt, dass der MNAC13-Antikörper das TrkA-Immunadhesin in einem ELISA-Test bindet, während er nicht mit dem TrkB-Immunadhesin reagiert. Dies bestätigt, dass der MNAC13-Antikörper spezifisch an den extrazellulären Teil von TrkA bindet.
  • Die 3 zeigt das Ergebnis einer FACS-Analyse mit 3T3-TrkA+-Zellen, welche zeigt, dass der MNAC13-Antikörper mit dem auf der Membran von lebenden Zellen expremierten humanen Rezeptor wechselwirkt. Eine Immunfluoreszenzanalyse bestätigt dieses Ergebnis.
  • Die Spezies-Spezifität von MNAC13-Antikörpern wurde anhand seiner Befähigung zur Erkennung von TrkA-Rezeptoren auf Rattenneuronen getestet. Schnitte von Rattenhirnen wurden der basalen Vorderhirnregion entnommen (4), welche reich an TrkA-positiven Neuronen ist. Die mit dem MNAC13-Antikörper erhaltene intensive Färbung im basalen Vorderhirn (4A) zeigt, dass dieser Antikörper, der gegen den humanen TrkA-Rezeptor erhalten wurde, auch dessen Entsprechung aus der Ratte erkennt. Der Antikörper färbt Hirnregionen, wie die medialen habenulären Nuclei nicht, von denen bekannt ist, dass sie keine TrkA-positiven Neuronen enthalten (Holtzman et al., 1995).
  • Funktionelle Blockierung der TrkA-gesteuerten biologischen Wirkungen durch den MNAC13-Antikörper Die Befähigung des MNAC13-Antikörpers zur Inhibierung der biologischen Aktivierung des TrkA-Rezeptors durch den NGF-Liganden in vivo wurde daher in PC12-Zellen sowohl in vitro (5) als auch in vivo (6) untersucht.
  • Die von NGF induzierte Differenzierung von PC12-Zellen (5B) wird vollständig durch Inkubation der Kulturen mit dem MNAC13-Antikörper (5C), verglichen mit der Inkubation mit einem nicht-relevanten Antikörper (5D), inhibiert.
  • Die cholinergen Neuronen des basalen Vorderhirns sind ein wohl bekanntes Ziel der Wirkung von NGF im Zentralnervensystem (Korsching, 1986; Holtzman et al., 1992). Die den MNAC13 sekretierenden Hybridom-Zellen wurden in den lateralen Ventrikeln von neonatalen Ratten zwei Tage nach der Geburt implantiert, und der cholinerge Phänotyp der Neuronen wurde eine Woche später (P9) durch Immunhistochemie mit Antikörpern gegen die Cholinacetyltransferase (ChAT) untersucht. Diese experimentelle Vorgehensweise wurde kürzlich verwendet, um die Wirkungen von implantierten Zellen, die den anti-NGF-monoklonalen Antikörper αD11 sekretieren, zu untersuchen (Berardi et al., 1994; Molnar et al., 1997 und 1998). Eine Woche nach der Implantation wurde ein Spiegel der Anti-TrkA-Antikörper im cerebrospinalen Fluid, bestimmt durch ELISA, von 1,4 ng/μl festgestellt. Die Ergebnisse in 6 zeigen, dass die Anzahl ChAT-positiver Zellen in den Hirnen, in denen der Anti-TrkA-Antikörper implantiert wurde, im Vergleich zu den Kontrollen (bei denen ein nicht-relevantes Myelom injiziert wurde) drastisch vermindert ist. Eine quantitative Bestimmung der Anzahl positiver ChAT-Neuronen zeigte, dass diese Anzahl um 70 im medialen Septum und um 77 % im diagnonalen Band von Ratten, in denen der MNAC13-Antikörper implantiert wurde, im Vergleich zu den Kontrollen vermindert war. Eine Ausweitung dieser Untersuchung auf verschiedene postnatale Alter, um sie mit den Wirkungen zu vergleichen, die in der vorhergehenden Untersuchung erhalten wurden, bei denen Zellen implantiert wurden, die einen anti-NGF-neutralisierenden Antikörper sekretieren (Molnar et al., 1997, 1998), zeigte, dass die Entzugwirkungen des cholinergen Systems des basalen Vorderhirns, die mit dem Anti-TrkA-MNAC13-Antikörper erhalten wurden, sehr viel stärker waren.
  • Isolierung einer rekombinanten funktionellen Form des mAk MNAC13 mit einer deutlich verminderten Größe
  • Um den Bereich der Anwendungen auszudehnen, wurden die variablen Regionen dieses Antikörpers kloniert und in einen rekombinanten Antikörper geringerer Größe eingebaut.
  • Die Klonierung der variablen Regionen monoklonaler Antikörper aus dem korrespondierenden Hybridom kann kompliziert sein, was zur Klonierung artifizieller variabler Regionen führen kann. Daher verwendete der Autor die Technik nach Winter et al. (1994). Die variablen schweren (VH) und leichten (VL) Regionen des MNAC13-Antikörpers wurden durch PCR, ausgehend von einer von Hybridom-mRNA abgeleiteten cDNA, unter Verwendung von Maus-IgG-spezifischen Oligonukleotid-Primern bzw. -Startern amplifiziert. Die variablen Regionen wurden durch PCR zu Einzelketten-Fv (scFv) zusammengesetzt und in den pDNA-Vektor kloniert, um die Expression von auf der Oberfläche von filamentösen Phagen klonierten Antikörper-Fragmenten zu erlauben. ScFv-Fragmente stellen ein biotechnologisches Derivat des originären Antikörpers dar (Bird et al., 1988) und bestehen aus den variablen Regionen der leichten und schweren Kette, verbunden mit einem Verknüpfungs-Peptid, welches den C-Terminus der VL-Region mit dem N-Terminus der VH-Region verbindet. Die Nukleotid-Sequenz des ScMNAC13-spezifischen Fragments ist in der SEQ ID Nr. 1 gezeigt. Die Aminosäuresequenz ist in der SEQ ID Nr. 2 gezeigt, in welcher die VL-Region von AA. 23 bis AA. 134, die VH-Region von AA. 152 bis AA. 276 reicht.
  • Es sind in jeder Kette drei CDRs (die Komplementarität des Antikörpers bestimmende Regionen) vorhanden und insbesondere:
    VL CDR1 AA. 46–55 von SEQ ID Nr. 2;
    VL CDR2 AA. 71–77 von SEQ ID Nr. 2;
    VL CDR3 AA. 110–1119 von SEQ ID Nr. 2;
    VH CDR1 AA. 176–185 von SEQ ID Nr. 2;
    VH CDR2 AA. 200–216 von SEQ ID Nr. 2;
    VH CDR3 AA. 249–262 von SEQ ID Nr. 2.
  • Die Sequenz der leichten und schweren variablen Regionen des Antikörpers MNAC13 wurde mit denjenigen des Antikörpers, der in der Patentanmeldung PCT Nr. WO97121732 beschrieben ist, wie in den Tabellen 1 und 2 gezeigt, verglichen.
  • Tabelle 1 Gegenüberstellung der schweren Ketten von 5C3 und MNAC13
    Figure 00170001
  • Tabelle 2 Gegenüberstellung der schweren Ketten von 5C3 und MNAC13
    Figure 00170002
  • Die mittels PCR zusammengesetzten ScFV-Fragmente wurden auf den filamentösen Phagen als Fusion mit dem Phagenprotein p3 expremiert. Eine Minibibliothek von Phagenpartikeln wurde mit Hilfe eines ELISA-Tests auf Phagen unter Verwendung des TrkA-Immunadhesins als Festphasen-Antigen durchmustert. Dies führte zur Isolierung von positiven Phagen, welche auf ihrer Oberfläche die ScFv-Version des parentalen MNAC13-Antikörpers expremieren (scFvMNAC13). Die Bindungseigenschaften dieses Phagen sowie diejenigen des von diesem Phagen abgeleiteten löslichen scFv-Fragments wurden mit Hilfe eines Kompetitions-ELISA-Tests (7) charakterisiert. Das TrkA-Immunadhesin wurde an die feste Phase gekoppelt und mit MNAC13-expremierenden Phagenpartikeln (7A), mit löslichem ScFvMNAC13-Antikörper (7B) oder mit dem parentalen MNAC13-Antikörper (7C) in Gegenwart ansteigender Mengen des konkurrierenden löslichen TrkA-Immunadhesins inkubiert. Die Ergebnisse bestätigen, dass die ScFv-Version des monoklonalen Antikörpers sowohl auf dem Phagen als auch von E. coli sekretiert TrkA genauso wirksam wie der parentale monoklonale Antikörper bindet.
  • Die biologische Aktivität von cFVMNAC13 wurde auf PC12-Zellen getestet. Die Zellen wurden für eine Woche mit 50 ng/ml NGF inkubiert, wonach sie in Gegenwart von NGF und dem ScFVMNAC13-Antikörper-Fragment wieder ausplattiert wurden. Wie in der 8 gezeigt, inhibiert das ScFVMNAC13-Fragment drastisch die Extension von Neuriten aus PC12-Zellen, was bestätigt, dass im rekombinanten Einzelketten-Fv des MNAC13-Antikörpers die neutralisierenden Eigenschaften des parentalen Antikörpers erhalten bleiben. Die kleine Größe dieses Einzelpolypeptid-Antikörpers erweitert den Bereich der Anwendungen des Antikörpers der Erfindung, erleichtert seine Abgabe und die Expression innerhalb des Nervengewebes.
  • Nocizeptionstest
  • Der Antikörper MNAC13 wurde in einem Nocizeptionstest mittels des „Tests mit heißer Platte" zur Bestimmung der Schmerzempfindlichkeit verwendet. Das Experiment wurde gemäß McMahon et al. (1995) unter Verwendung des Antikörpers MNAC13 als Immunadhesin durchgeführt. Der Antikörper wurde subkutan in die hintere Pfote einer adulten Ratte über eine Zeitspanne von drei Wochen oder über eine osmotische Minipumpe infundiert. Die Nocizeptions-Sensititivät wurde über Intervalle unter Verwendung des Test mit heißer Platte (Eddy und Leimbach, 1953) bestimmt, welcher die Hyperalgesie-Situationen nach Entzündung oder teilweiser Beschädigung des Nervs simuliert. Der nociceptive Stimulus induziert in solchem Fall eine Antwort bzw. Reaktion (Lecken der Pfote und/oder Hüpfen), was eine integrierte Koordination erfordert, die höherwertiger ist als ein simpler Reflex. Gemäß dem Test wird das Tier auf einen Stift mit einer auf die gewünschte Temperatur (gewöhnlicherweise auf 56°) erhitzten Platte als Basis gesetzt. Die Latenzzeit zwischen zwei Reaktionen (Lecken der Pfote und Hüpfen) wird in Kontrolltieren (mit nicht-relevantem Antikörper behandelt) und in denjenigen gemessen, die mit dem Anti-TrkA-Antikörper behandelt wurden. Das Ergebnis des Experiments demonstrierte das Auftreten einer bemerkenswerten Hypoalgesie, wie es durch einen deutlichen Anstieg der Latenzzeit in der mit MNAC13-behandelten Gruppe gezeigt wird.
  • LITERATUR
    • – Allen, N.D., et al. (1987). In Mammalian development : A practical approach, M. Monk, Hrsg. (Washington DC: IRL Press) Seiten 217–234.
    • – Anand et al. (1996) Nature Medicine 2, 703–707.
    • – Barde YA (1994) J. Neurobiol. 25, 1329–1333.
    • – Berardi N. et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 684–688.
    • – Bird RE, et al. (1988) Science 242: 423–425.
    • – Bradbury A, Cattaneo A, Hoogenboom H (1996) In: Manual of the EMBO theoretical and practical Course, Seiten 1–122, Triest 18.–26. November.
    • – Cattaneo A, et al. (1983) Eur. J. Biochem. 135: 285–290
    • – Cattaneo A, Rapposelli B, Calissano P (1988), J. Neurochem. 50: 1003–-1010.
    • – Chamow SW, Ashkenazi A (1996), Trends in Biotechnol. 14: 52–60.
    • – Ebendal T, et al. (1991) In: Plasticity and regeneration of the nervous system (Timiras P., Privat A, Hrsg.), New York: Plenum Press.
    • – Eddy NB and Leimbach DJ (1953) J. Phar. Exp. Ther. 107: 385–393.
    • – Galfre G., Milstein C. (1981) Methods Enzymol. 73: 3–45.
    • – Greene LA, Tischler AS (1976) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 73: 2424–2428.
    • – Hanke T, Szawlowski P, Randall RE (1992) J. Gen. Virol. 73: 653–60.
    • – Holtzman DM, et al. (1992) Neurin. 9: 465–478.
    • – Holtzman DM, et al. (1995) J. Neuroscience 15: 1567–1576.
    • – Jones PT, et al. (1986) Nature 321: 522–525.
    • – Kaplan DR et al. (1991) Science 252: 554–558.
    • – Klein R, et al. (1991) Cell 65: 189–197.
    • – Korsching S (1986) Trends in Neurosci 9: 570–573.
    • – Krebber A, et al. (1997) J. Immunol. Methods 15: 35–55.
    • – Kramer K, et al. (1997) Eur. J. Cancer 33: 2090–2091.
    • – Indo et al. (1996) Nature Genetics 13, 485–488.
    • – LeSauteur L. et al. (1995) J. Biol. Chem. 270:6564–6569.
    • – LeSauteur L., et al. (1996) J. Neurosci. 16, 1308–1316.
    • – Levi-Montalcini R (1987) EMBO J. 6, 1145–1316.
    • – Levi-Montalcini R, Angeletti PU (1996) Pharmacol. Rev. 18: 619–628.
    • – Levine ID (1998) Neuron 20: 649–654.
    • – Lindsay RM et al. (1994) Trends in Neuroscience, 17, 182.
    • – McMahon et al. (1995) Nature Medicine 1, 774–780.
    • – Molnar M. et al. (1997) NeuroReport 8:575–579.
    • – Molnan M. et al. (1998) Eur. J. Neurosci. 10: 3127–3140.
    • – Novak M. et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 5837–5841.
    • – Piccioli P. et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 5611–5615.
    • – Piccioli P. et al. (1995) Neuron 15: 373–384
    • – Smeyne RJ, et al. (1994) Nature 368: 246–249.
    • – Sinder WD, McMahon SB (1998) Neuron 20: 629–632.
    • – Torcia M, et al. (1996) Cell 85: 345–356.
    • – Vaughan TJ, Osbourne JK, Tempest PR (1998) Nature Biotech 16, 535–-539.
    • – Verge VMK, et al. (1992) J. Neurosci. 12: 4011–4022.
    • – Winter G., et al. (1994) Annu. Rev. Immunol. 12: 433–455.
    • – Wood (1996) Nature Genetics 13, 382–383.
  • Sequenzprotokoll
    Figure 00210001
  • Figure 00220001
  • Figure 00230001

Claims (24)

  1. Monoklonaler Antikörper, synthetische und biotechnologische Derivate davon, der/die zum Erkennen und Binden des Tyrosinkinase-Rezeptors von NGF (Nervenwachstumsfaktor) mit hoher Affinität, TrkA genannt, befähigt ist/sind und als Antagonist der Bindung von NGF an TrkA wirkt/wirken.
  2. Monoklonaler Antikörper, synthetische und biotechnologische Derivate davon, nach Anspruch 1, wobei die variable Region der leichten Kette im Wesentlichen die Sequenz von AA. 23 bis AA. 134 der SEQ ID Nr. 2 aufweist.
  3. Monoklonaler Antikörper, synthetische und biotechnologische Derivate davon, nach Anspruch 1, wobei die variable Region der schweren Kette im Wesentlichen die Sequenz von AA. 152 bis AA. 276 der SEQ ID Nr. 2 aufweist.
  4. Monoklonaler Antikörper, synthetische und biotechnologische Derivate davon, nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die variable Region der leichten Kette im Wesentlichen die Sequenz von AA. 23 bis AA. 134 der SEQ ID Nr. 2 aufweist und die variable Region der schweren Kette im Wesentlichen die Sequenz von AA. 152 bis AA. 276 der SEQ ID Nr. 2 aufweist.
  5. ScFv-Fragment des monoklonalen Antikörpers nach einem der vorhergehenden Ansprüche, umfassend mindestens eine variable Region der leichten Kette oder der schweren Kette des in Anspruch 1 beschriebenen Antikörpers.
  6. ScFv-Fragment nach Anspruch 5, umfassend variable Regionen der leichten Kette und der schweren Kette des in Anspruch 1 beschriebenen Antikörpers.
  7. ScFv-Fragment nach Anspruch 6, umfassend eine Verknüpfungssequenz zwischen der variablen Region der leichten Kette und der variablen Region der schweren Kette.
  8. ScFv-Fragment nach Anspruch 7, wobei das ScFv-Fragment im Wesentlichen die Sequenz der SEQ ID Nr. 2 aufweist.
  9. Synthetisches oder biotechnologisches Derivat nach Anspruch 1, das mindestens eine die Komplementarität des Antikörpers bestimmende Region (CDR) umfasst und zum Wirken als Antagonist gegenüber der Bindung von NGF an TrkA befähigt ist.
  10. Synthetisches oder biotechnologisches Derivat nach Anspruch 9, wobei die Region, welche die Komplementarität des Antikörpers bestimmt (CDR), und die zum Wirken als Antagonist der Bindung von NGF an TrkA befähigt ist, innerhalb der variablen Region der schweren Kette von AA. 152 bis AA. 276 der SEQ ID Nr. 2 liegt.
  11. Nukleinsäure, die für den Antikörper oder die Derivate davon nach einem der vorhergehenden Ansprüche kodiert.
  12. Nukleinsäure nach Anspruch 11, die das ScFv-Fragment der SEQ ID Nr. 2 kodiert.
  13. Nukleinsäure nach Anspruch 12, die im Wesentlichen die Sequenz der SEQ ID Nr. 1 aufweist.
  14. Verwendung der Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 11–13 zur Herstellung nicht-humaner transgener Tiere, vorzugsweise Mäuse, wobei der Antikörper oder das Derivat davon gemäß den Ansprüchen 1–10 induzierbar oder unter der Kontrolle von Promotoren, welche die Expression im adulten Tier steuern, expremiert wird.
  15. Nicht-humanes transgenes Tier, das mit einer Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 11–13 transformiert ist, wobei die Nukleinsäure induzierbar oder unter der Kontrolle von Promotoren, welche die Expression im adulten Tier steuern, expremiert wird.
  16. Phage oder prokaryotischer rekombinanter Vektor, der die Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 11–13 umfasst und dazu befähigt ist, diese korrekt und wirksam zu expremieren.
  17. Rekombinanter eukaryotischer Vektor, der die Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 11–13 umfasst und dazu befähigt ist, diese korrekt und wirksam zu expremieren.
  18. Pharmakologische Zusammensetzung, umfassend eine wirksame Menge des Vektors nach Anspruch 17 und einen pharmazeutisch verträglichen Träger, zur Gentherapie neurologischer Erkrankungen aus der folgenden Gruppe: chronischer Schmerz, akuter Schmerz, Neurome, TrkA-expremierende neoplastische Tumoren.
  19. Pharmakologische Zusammensetzung, umfassend eine wirksame Menge des monoklonalen Antikörpers oder synthetischen oder biotechnologischen Derivats davon nach einem der Ansprüche 1–10, der/das zum Erkennen und Binden des Tyrosinkinase-Rezeptors von NGF (Nervenwachstumsfaktor) mit hoher Affinität, TrkA genannt, und zum Wirken als Antagonist der Bindung von NDF an TrkA befähigt ist, und einen pharmazeutisch verträglichen Träger.
  20. Pharmakologische Zusammensetzung nach Anspruch 19 zur Behandlung neurologischer Erkrankungen aus der folgenden Gruppe: chronischer Schmerz, akuter Schmerz, Neurome, TrkA-expremierende neoplastische Tumoren.
  21. Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend pharmazeutisch wirksame Mengen von NGF und des Antikörpers oder der Derivate davon nach einem der Ansprüche 1–10.
  22. Eukaryotische, gentechnisch erzeugte Zelle, die zur Expression des Antikörpers oder der Derivate davon nach einem der Ansprüche 1–10 befähigt sind.
  23. Pharmakologische Zusammensetzung, umfassend Zellen nach Anspruch 22 und einen pharmazeutisch verträglichen Träger, zur Gentherapie neurologischer Erkrankungen aus der folgenden Gruppe: chronischer Schmerz, akuter Schmerz, Neurome, TrkA-expremierende neoplastische Tumoren.
  24. Zusammensetzung, umfassend eine wirksame Menge des monoklonalen Antikörpers oder synthetischer oder biotechnologischer Derivate davon nach einem der Ansprüche 1–10, der/die zum Erkennen und Binden des Tyrosinkinase-Rezeptors von NGF (Nervenwachstumsfaktor) mit hoher Affinität, TrkA genannt, und zum Wirken als Antagonist der Bindung von NGF an TrkA befähigt ist/sind, und einen diagnostisch verträglichen Träger zur Verwendung in der „bildgebenden" In-Vivo-Diagnostik.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IT1306704B1 (it) * 1999-05-26 2001-10-02 Sirs Societa Italiana Per La R Anticorpi monoclonali e suoi derivati sintetici o biotecnologici ingrado di agire come molecole antagoniste per il ngf.
FR2807660A1 (fr) * 2000-04-13 2001-10-19 Warner Lambert Co Utilisation d'antagonistes du ngf pour la prevention ou le traitement de douleurs viscerales chroniques
AU2002308722B2 (en) * 2001-05-30 2007-05-17 Genentech, Inc. Anti-NGF antibodies for the treatment of various disorders
WO2003057841A2 (en) * 2001-12-31 2003-07-17 Sugen, Inc. Remote homologues and kinases and methods of detection
DE60335957D1 (de) 2002-10-08 2011-03-17 Rinat Neuroscience Corp Verfahren zur behandlung von postoperativen schmerzen durch verabreichung eines antikörpers gegen nervenwachstumsfaktor und diesen enthaltende zusammensetzungen
UA80447C2 (en) 2002-10-08 2007-09-25 Methods for treating pain by administering nerve growth factor antagonist and opioid analgesic
US7569364B2 (en) 2002-12-24 2009-08-04 Pfizer Inc. Anti-NGF antibodies and methods using same
CA2921578C (en) 2002-12-24 2017-02-14 Rinat Neuroscience Corp. Anti-ngf antibodies and methods using same
US9498530B2 (en) 2002-12-24 2016-11-22 Rinat Neuroscience Corp. Methods for treating osteoarthritis pain by administering a nerve growth factor antagonist and compositions containing the same
BRPI0407375A (pt) 2003-02-19 2006-02-07 Rinat Neuroscience Corp Métodos para tratar dor por meio da administração de um antagonista do fator de crescimento neural e u nsaid e composições contendo os mesmos
ITRM20030601A1 (it) 2003-12-24 2005-06-25 Lay Line Genomics Spa Metodo per l'umanizzazione di anticorpi e anticorpi umanizzati con esso ottenuti.
HUE037549T2 (hu) 2004-04-07 2018-09-28 Rinat Neuroscience Corp Eljárások csontrákfájdalom kezelésére idegi növekedési faktor antagonista antitest beadásával
KR101298383B1 (ko) * 2005-01-24 2013-08-20 엘란 파마 인터내셔널 리미티드 Ｎｇｆ에 대한 특이적 결합 멤버
SI1853588T1 (sl) 2005-02-16 2008-10-31 Astrazeneca Ab Kemične spojine
EP1899323A2 (de) 2005-05-16 2008-03-19 AstraZeneca AB Als tyrosinkinaseinhibitoren geeignete pyrazolylaminopyrimidinderivate
ITRM20050290A1 (it) * 2005-06-07 2006-12-08 Lay Line Genomics Spa Uso di molecole in grado di inibire il legame tra ngf e il suo recettore trka come analgesici ad effetto prolungato.
ITRM20050332A1 (it) * 2005-06-24 2006-12-25 Lay Line Genomics Spa Uso di molecole in grado di bloccare l'attivita' di trka per potenziare gli effetti di analgesici oppiacei sul dolore.
BRPI0618011A2 (pt) 2005-10-28 2011-08-16 Astrazeneca Ab composto ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, processo para a preparação do mesmo, composição farmacêutica, uso de um composto ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, e, métodos para produzir um efeito anti-proliferativo e um efeito pró-apoptósico em um animal de sangue quente, para tratar doença e para produzir um efeito inibidor de jak em um animal de sangue quente
TW200826937A (en) * 2006-11-01 2008-07-01 Astrazeneca Ab New use
UA99459C2 (en) 2007-05-04 2012-08-27 Астразенека Аб 9-(pyrazol-3-yl)- 9h-purine-2-amine and 3-(pyraz0l-3-yl)-3h-imidazo[4,5-b]pyridin-5-amine derivatives and their use for the treatment of cancer
CA2695997C (en) 2007-08-10 2016-11-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. High affinity human antibodies to human nerve growth factor
US8309088B2 (en) 2007-08-10 2012-11-13 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Method of treating osteoarthritis with an antibody to NGF
AU2009211340B2 (en) * 2008-02-04 2013-09-12 Lay Line Genomics S.P.A. Anti-TrkA antibodies and derivatives thereof
JP5752601B2 (ja) 2008-12-08 2015-07-22 ブイエム ファーマ エルエルシー タンパク質受容体チロシンキナーゼ阻害薬の組成物
ES2514319T3 (es) 2009-05-04 2014-10-28 Abbvie Research B.V. Anticuerpos contra el factor de crecimiento nervioso (NGF) con estabilidad in vivo mejorada
PT3333188T (pt) 2010-08-19 2022-03-28 Zoetis Belgium S A Anticorpos de anti-ngf e a sua utilização
US9078878B2 (en) 2010-12-01 2015-07-14 Alderbio Holdings Llc Anti-NGF antibodies that selectively inhibit the association of NGF with TrkA, without affecting the association of NGF with p75
WO2012075340A2 (en) 2010-12-01 2012-06-07 Alderbio Holdings Llc Anti-ngf compositions and use thereof
US9884909B2 (en) 2010-12-01 2018-02-06 Alderbio Holdings Llc Anti-NGF compositions and use thereof
US9067988B2 (en) 2010-12-01 2015-06-30 Alderbio Holdings Llc Methods of preventing or treating pain using anti-NGF antibodies
US11214610B2 (en) 2010-12-01 2022-01-04 H. Lundbeck A/S High-purity production of multi-subunit proteins such as antibodies in transformed microbes such as Pichia pastoris
US9539324B2 (en) 2010-12-01 2017-01-10 Alderbio Holdings, Llc Methods of preventing inflammation and treating pain using anti-NGF compositions
EP2731439A4 (de) 2011-07-12 2014-12-03 Merck Sharp & Dohme Trka-kinase-hemmer, zusammensetzungen daraus und verfahren dafür
US9181261B2 (en) 2012-05-22 2015-11-10 Merck Sharp & Dohme Corp. TrkA kinase inhibitors, compositions and methods thereof
US9617334B2 (en) 2012-06-06 2017-04-11 Zoetis Services Llc Caninized anti-NGF antibodies and methods thereof
ES2666126T3 (es) 2012-06-08 2018-05-03 Glenmark Pharmaceuticals S.A. Anticuerpos anti-TrkA humanizados con sustituciones de aminoácidos
EP2674439B1 (de) * 2012-06-13 2017-02-01 Rottapharm Biotech S.r.l. Ant-TrkA-Antikörper, Derivate und Verwendungen damit
WO2015039333A1 (en) 2013-09-22 2015-03-26 Merck Sharp & Dohme Corp. TrkA KINASE INHIBITORS, COMPOSITIONS AND METHODS THEREOF
WO2015039334A1 (en) 2013-09-22 2015-03-26 Merck Sharp & Dohme Corp. TrkA KINASE INHIBITORS, COMPOSITIONS AND METHODS THEREOF
PL3102555T3 (pl) 2014-02-05 2021-12-20 VM Oncology LLC Kompozycje związków i ich zastosowania
WO2015143652A1 (en) 2014-03-26 2015-10-01 Merck Sharp & Dohme Corp. TrkA KINASE INHIBITORS,COMPOSITIONS AND METHODS THEREOF
WO2015143653A1 (en) 2014-03-26 2015-10-01 Merck Sharp & Dohme Corp. TrkA KINASE INHIBITORS,COMPOSITIONS AND METHODS THEREOF
WO2015143654A1 (en) 2014-03-26 2015-10-01 Merck Sharp & Dohme Corp. TrkA KINASE INHIBITORS,COMPOSITIONS AND METHODS THEREOF
MA41097A (fr) * 2014-12-05 2017-10-10 Glenmark Pharmaceuticals Sa Anticorps anti-trka à propriétés inhibitrices améliorées et dérivés desdits anticorps destinés à être utilisés pour traiter les douleurs osseuses
WO2016161572A1 (en) 2015-04-08 2016-10-13 Merck Sharp & Dohme Corp. TrkA KINASE INHIBITORS, COMPOSITIONS AND METHODS THEREOF
AR114110A1 (es) * 2018-02-28 2020-07-22 Lilly Co Eli Anticuerpo anti-trka
MX2020009526A (es) 2018-03-12 2020-10-28 Zoetis Services Llc Anticuerpos anti-ngf y metodos de estos.
TW202210467A (zh) 2020-05-28 2022-03-16 美商美國禮來大藥廠 TrkA抑制劑
WO2023125477A1 (en) * 2021-12-28 2023-07-06 4B Technologies (Beijing) Co., Limited TrkA ANTIBODY AND APPLICATION THEREOF
WO2023212596A1 (en) 2022-04-27 2023-11-02 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Treatment of arthropathy based upon stratification of osteoarthritis polygenic risk score

Family Cites Families (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU3418389A (en) * 1988-03-28 1989-10-16 Regents Of The University Of California, The Nerve growth factor peptides
IL162181A (en) * 1988-12-28 2006-04-10 Pdl Biopharma Inc A method of producing humanized immunoglubulin, and polynucleotides encoding the same
EP0471205A1 (de) 1990-08-15 1992-02-19 E.R. SQUIBB & SONS, INC. Monoklonale Antikörper, die an TRK Proto-Onkogenproteinen binden
ES2202310T3 (es) * 1991-12-13 2004-04-01 Xoma Corporation Metodos y materiales para la preparacion de dominios variables de anticuerpos modificados y sus usos terapeuticos.
EP0598998B1 (de) * 1992-09-07 2004-05-19 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd Humanisierte Antikörper, die mit dem GM2-Gangliosid reagieren
BR9207175A (pt) * 1992-10-28 1995-12-12 Genentech Inc Composição contendo antagonista de fator de crescimento de célula endotelial vascular sequência aminoácida de anticorpo monoclonal polipeptídeo e método de tratamento de tumor em mamífero
US5753225A (en) 1993-12-03 1998-05-19 The Regents Of The University Of California Antibodies that mimic actions of neurotrophins
US6811779B2 (en) * 1994-02-10 2004-11-02 Imclone Systems Incorporated Methods for reducing tumor growth with VEGF receptor antibody combined with radiation and chemotherapy
CN1241944C (zh) * 1995-09-11 2006-02-15 协和发酵工业株式会社 抗人白介素－5受体α链的抗体
GB9525180D0 (en) 1995-12-08 1996-02-07 Univ Mcgill Design of hormone-like antibodies with agonistic and antagonistic fuctions
US20020064528A1 (en) * 2000-01-28 2002-05-30 Zhenping Zhu Antibodies specific to KDR and uses thereof
IT1306704B1 (it) * 1999-05-26 2001-10-02 Sirs Societa Italiana Per La R Anticorpi monoclonali e suoi derivati sintetici o biotecnologici ingrado di agire come molecole antagoniste per il ngf.
AT411997B (de) * 1999-09-14 2004-08-26 Baxter Ag Faktor ix/faktor ixa aktivierende antikörper und antikörper-derivate
FR2807660A1 (fr) 2000-04-13 2001-10-19 Warner Lambert Co Utilisation d'antagonistes du ngf pour la prevention ou le traitement de douleurs viscerales chroniques
AU2009211340B2 (en) 2008-02-04 2013-09-12 Lay Line Genomics S.P.A. Anti-TrkA antibodies and derivatives thereof

Also Published As

Publication number Publication date
JP4917226B2 (ja) 2012-04-18
ES2218163T3 (es) 2004-11-16
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EP1181318A2 (de) 2002-02-27
PT1181318E (pt) 2004-08-31

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