JP2012040007A - Ngf−アンタゴニスト分子として作用するモノクローナル抗体、その合成及び生命工学的誘導体 - Google Patents
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Abstract
【課題】神経成長因子(NGF)−アンタゴニスト分子として作用するモノクローナル抗体、その合成及び生命工学的誘導体(ScFv又はその他)を提供する。
【解決手段】NGF高親和性チロシンキナーゼレセプターであるTrkAを認識及び結合することができ、かつNGFのTrkAへの結合に対するアンタゴニストとして作用する、特定配列を有する軽鎖可変領域を含むモノクローナル抗体、その合成、そのフラグメント、それらをコードする核酸、神経学的疾病の治療、遺伝子治療、診断のための医薬組成物、並びにこのような疾病を研究するためのトランスジェニック動物モデル。
【選択図】なし
【解決手段】NGF高親和性チロシンキナーゼレセプターであるTrkAを認識及び結合することができ、かつNGFのTrkAへの結合に対するアンタゴニストとして作用する、特定配列を有する軽鎖可変領域を含むモノクローナル抗体、その合成、そのフラグメント、それらをコードする核酸、神経学的疾病の治療、遺伝子治療、診断のための医薬組成物、並びにこのような疾病を研究するためのトランスジェニック動物モデル。
【選択図】なし
Description
(発明の詳細な説明)
本発明は、NGF−アンタゴニスト分子として作用するモノクローナル抗体、その合成及び生命工学的誘導体に関する。
さらに詳しくは、本発明は、TrkAと称されるNGF[神経成長因子(Nerve Growth Factor) ]の高親和性チロシンキナーゼレセプターを認識することができ、及び結合することができ、またNGFのTrkAへの結合に対するアンタゴニストとして作用するモノクローナル抗体、その合成及び組換え誘導体に関する。本発明はまた、このような分子の診断及び治療における使用及び関連組成物に関する。
本発明は、NGF−アンタゴニスト分子として作用するモノクローナル抗体、その合成及び生命工学的誘導体に関する。
さらに詳しくは、本発明は、TrkAと称されるNGF[神経成長因子(Nerve Growth Factor) ]の高親和性チロシンキナーゼレセプターを認識することができ、及び結合することができ、またNGFのTrkAへの結合に対するアンタゴニストとして作用するモノクローナル抗体、その合成及び組換え誘導体に関する。本発明はまた、このような分子の診断及び治療における使用及び関連組成物に関する。
神経栄養物質(neurotrophins) は、ファミリーの第一員であるNGF[神経成長因子(Nerve Growth Factor)、Levi-Montalicini,1987 ]に構造的に関連するペプチド成長因子のファミリーである(Barde,1994)。神経栄養物質は、末梢神経及び中枢神経系の両方の神経の分化及び生存、ならびにシナプス伝達を調整する。さらにまた、NGFは種々の非ニューロン組織及び免疫形細胞などの細胞に対して作用する。
NGFは標的細胞に存在する2種の膜レセプター、すなわち低親和性p75レセプター及び140kDa高親和性膜貫通糖タンパク質であるチロシンキナーゼ活性を有するTrkA(Kaplan 等、1991,Klein等、1991) を介して作用する。TrkAは、神経堤ニューロン、交感神経、ならびに基底前脳(basal forebrain) 及び線条体(corpus striatum) のコリン作用性ニューロンで発現され、NGF活性に決定的なメディエーターである(Holtzman 等、1992;Verge等、1992) 。TrkAはまた、Bリンパ細胞を包含する数種の非ニューロン組織及び細胞で発現される(Torcia 等、1996) 。
NGFは標的細胞に存在する2種の膜レセプター、すなわち低親和性p75レセプター及び140kDa高親和性膜貫通糖タンパク質であるチロシンキナーゼ活性を有するTrkA(Kaplan 等、1991,Klein等、1991) を介して作用する。TrkAは、神経堤ニューロン、交感神経、ならびに基底前脳(basal forebrain) 及び線条体(corpus striatum) のコリン作用性ニューロンで発現され、NGF活性に決定的なメディエーターである(Holtzman 等、1992;Verge等、1992) 。TrkAはまた、Bリンパ細胞を包含する数種の非ニューロン組織及び細胞で発現される(Torcia 等、1996) 。
従来技術は、アルツハイマー病(Lindsay等、1994;Ebendal等、1991) 、及び真性糖尿病及びらい病(Anand等、1996) などのその他の疾病を包含する種々の神経変質性病気の処置のためのNGFの使用の可能性を示唆している。しかしながら、初期の臨床試験は送達上の問題により、中枢神経系における薬物動力学により、及び過度の望ましくない刺激を導く中枢神経外のその他の末梢標的に対するNGFのマイナスのアゴニスト物性により複雑化され、思わしくなかった。
従って、容易に送達されるNGF−TrkAレセプター相互反応について選択性であるアンタゴニスト分子及びその薬理学的活性誘導体の開発に対するニーズがある。
従って、容易に送達されるNGF−TrkAレセプター相互反応について選択性であるアンタゴニスト分子及びその薬理学的活性誘導体の開発に対するニーズがある。
さらにまた、種々の炎症状態におけるNGF過剰産生は、主要な求心性侵害受容器(primary afferent nociceptors)の痛覚感受性の増大に関連し、従って慢性の痛み症状の発生に関与する。組織損傷に対して敏感である一団の感覚ニューロン(侵害受容器)の数は、特にNGF依存性である。さらに、2種の現存する鎮痛薬(非ステロイド系抗炎症薬及びアヘン製剤)の欠点及び制限を考慮すると、NGFのような新しい相違する標的の提供は、当該技術に進歩をもたらす(Snider 及びMcMahon,1998) 。さらにまた、Levineにより示唆されているように(Levine,1998) 、NGFは慣用の医薬が効果的ではない痛み、特に炎症又は神経障害状態から生じる痛みの新しい治療法の設計に対して強力な標的を提供する。さらに、新しい研究は、無発汗症を伴うタイプ4痛み慢性無感覚の4種の非関連ケースにおいて、TrkA遺伝子の変異の存在及びその結果としての機能性NGFレセプターの不存在を立証して、痛みとTrkA系との間の直接的関係を示した(Indo 等、1996; Wood,1996)。
従って、NGF−TrkA系は痛み治療に対する強力な標的を提供する、すなわちTrkA−有効アンタゴニストによる痛み神経障害症候群に拮抗することができる処置を提供する(Levine,1998;Snider 及びMcmahon,1998) 。
TrkAレセプターmRNAの異常発現はまた、新生物疾病に関連していた。TrkA発現性腫瘍の予後、すなわち「造影」診断及び治療は、TrkAに対して高親和性を有する抗体の適用領域もまた表わしている。事実として、これらの腫瘍において、TrkA結合剤は臨床診断、予後及び治療的処置の有用な道具である(Kramer 等、1997) 。
組換え抗体(Vaughan等、1998) は、それらの活性を擬装する小型分子の開発のために選択される出発剤を代表する(Le Sauteur 等、1995) 。
TrkAレセプターmRNAの異常発現はまた、新生物疾病に関連していた。TrkA発現性腫瘍の予後、すなわち「造影」診断及び治療は、TrkAに対して高親和性を有する抗体の適用領域もまた表わしている。事実として、これらの腫瘍において、TrkA結合剤は臨床診断、予後及び治療的処置の有用な道具である(Kramer 等、1997) 。
組換え抗体(Vaughan等、1998) は、それらの活性を擬装する小型分子の開発のために選択される出発剤を代表する(Le Sauteur 等、1995) 。
TrkA−アゴニストモノクローナル抗体は、Le Sauteur等、1996及びPCT出願No.WO97/21732 に開示された。開示されている唯一つの抗体(5C3)のアゴニスト活性は、これを本発明の目的に適するものにせず、またTrkAレセプターの過剰活性化を回避しなければならない状態の全部に対して適するものにしない。PCT 出願No.WO97/21732 は、アゴニスト抗体5C3の「造影」(“imaging ”)診断法としての使用を開示している。しかしながら、この抗体は、そのアゴニスト活性によって、レセプター活性化を防止しないかぎり、上記用途に使用することはできない。
従って、新規な治療活性を得るためには、特にアンタゴニストとして作用し、従って外因リガンド(NGF)によるレセプター活性化を防止するのに理想的であり、また当該レセプターの活性化活性を有していないTrkA抗体を提供するためには、NGFのTrkAへの結合を妨害するのに適する新規分子の開発が求められていることは明白である。さらにまた、このような抗体は、薬剤、すなわちNGF−TrkA相互反応を防止する合成及び組換えフラグメントの開発に有利に使用することができる。
本発明の発明者は、TrkAと呼ばれるNGF−レセプターと相互反応することができる種々のモノクローナル抗体を単離した。これらの中で、MNAC13と命名された抗体は、NGFのTrkAへの結合を阻害することによって、TrkAの強力なアンタゴニストとして作用する。この抗体は、種々の生物学系において、NGFによるTrkAの機能的活性化の防止における非常に効果的な道具である。
本発明の発明者は、TrkAと呼ばれるNGF−レセプターと相互反応することができる種々のモノクローナル抗体を単離した。これらの中で、MNAC13と命名された抗体は、NGFのTrkAへの結合を阻害することによって、TrkAの強力なアンタゴニストとして作用する。この抗体は、種々の生物学系において、NGFによるTrkAの機能的活性化の防止における非常に効果的な道具である。
この抗体は、Balb/C3T3細胞上に発現されるヒト天然TrkAレセプターによるBalb/Cマウスの類遺伝子性免疫化(congenic immunization) により誘導された。このスクリーニングは、抗体のNGFのTrkA発現性細胞への結合の阻害能力に基づいている。このスクリーニングは、そのNGF結合性ドメインでTrkAに結合することができる抗体の単離を導き、これによりNGFの結合が防止される。抗体MNAC13は、種々の生物学系におけるNGFによるTrkAの機能的活性化の防止に非常に有効である。本発明の発明者はまた、MNAC13抗体の可変領域をコードする遺伝子をクローン化し、組換えDNA技術を用いることによって、減少されたサイズを有する機能的ポリペプチドへこのような領域を組立て(一本鎖Fvフラグメント、scFvMNAC13)、これが親の抗体の性質を保有することを確認した。
アゴニスト抗体(agonist antibody)の用語は、レセプターそれ自体の固有リガンドの不存在下にレセプター抗原を活性化することができる抗体を意味する。
アンタゴニスト抗体(antagonist antibody) の用語は、抗原レセプターの活性部位を指向し、レセプターそれ自体に対する結合にかかわり固有リガンドと競合して、固有リガンドの活性を阻害することができる抗体を意味する。
抗体の合成及び生命工学的誘導体の用語は、当該抗体の機能上の性質を保有する化学的技術又は組換え技術により合成されるいずれの操作されたフラグメント(engineered fragment) をも意味する。
アンタゴニスト抗体(antagonist antibody) の用語は、抗原レセプターの活性部位を指向し、レセプターそれ自体に対する結合にかかわり固有リガンドと競合して、固有リガンドの活性を阻害することができる抗体を意味する。
抗体の合成及び生命工学的誘導体の用語は、当該抗体の機能上の性質を保有する化学的技術又は組換え技術により合成されるいずれの操作されたフラグメント(engineered fragment) をも意味する。
本発明の目的は、TrkAと称されるNGF(神経成長因子)の高親和性チロシンキナーゼレセプターを認識することができ、及び結合することができ、またNGFのTrkAへの結合に対するアンタゴニストとして作用するモノクローナル抗体、その合成及び生命工学的誘導体にある。
好適態様に従う場合、本発明の抗体は、配列番号:2のaa.23からaa.134までの配列から本質的になる軽鎖可変領域を有する。
もう一つの好適態様に従う場合、本発明の抗体は、配列番号:2のaa.152からaa.276までの配列から本質的になる重鎖可変領域を有する。
もう一つの好適態様に従う場合、本発明の生命工学的誘導体は、
a)本発明の抗体又はその機能的誘導体の軽鎖可変領域、及び
b)本発明の抗体又はその機能的誘導体の重鎖可変領域、
を含むScFvフラグメントである。
好適態様に従う場合、本発明の抗体は、配列番号:2のaa.23からaa.134までの配列から本質的になる軽鎖可変領域を有する。
もう一つの好適態様に従う場合、本発明の抗体は、配列番号:2のaa.152からaa.276までの配列から本質的になる重鎖可変領域を有する。
もう一つの好適態様に従う場合、本発明の生命工学的誘導体は、
a)本発明の抗体又はその機能的誘導体の軽鎖可変領域、及び
b)本発明の抗体又はその機能的誘導体の重鎖可変領域、
を含むScFvフラグメントである。
好ましくは、このScFvフラグメントは、軽鎖の可変領域と重鎖の可変領域との間にリンカー配列を含有する。さらに好ましくは、このScFvフラグメントは、配列番号:2の配列を本質的に有する。
本発明のもう一つの目的は、NGFのTrkAへの結合に対するアンタゴニストとして作用することができ、抗体の相補性を決定する領域(CDR)を少なくとも一つ含む、モノクローナル抗体の合成及び生命工学的誘導体にある。好ましくは、この領域は重鎖の可変領域内にあり、さらに好ましくは、この領域は配列番号:2のaa.152からaa.276までの配列を包含する。
本発明の抗体又はその誘導体をコードする核酸は本発明の範囲内にある。好ましくは、この核酸は配列番号:2のScFvフラグメントをコードし、さらに好ましくは、この核酸は配列番号:1の配列を有する。
本発明のもう一つの目的は、NGFのTrkAへの結合に対するアンタゴニストとして作用することができ、抗体の相補性を決定する領域(CDR)を少なくとも一つ含む、モノクローナル抗体の合成及び生命工学的誘導体にある。好ましくは、この領域は重鎖の可変領域内にあり、さらに好ましくは、この領域は配列番号:2のaa.152からaa.276までの配列を包含する。
本発明の抗体又はその誘導体をコードする核酸は本発明の範囲内にある。好ましくは、この核酸は配列番号:2のScFvフラグメントをコードし、さらに好ましくは、この核酸は配列番号:1の配列を有する。
本発明の核酸は、非ヒトトランスジェニック動物、好ましくはマウスを得るための導入遺伝子(transgenes)として有利に使用することができ、この場合、抗体は誘導可能な方法で、又は成熟動物における発現を決定するプロモーターの制御下に発現される。これらの動物は、NGF/TrkA相互作用を阻害するヒト疾病、特に神経変質性疾病用の研究及び試験試薬として有利に使用することができる。トランスジェニック非ヒト動物は、標準的技術により、すなわちAllen 等、1987に記載された技術を用いて得ることができる。
TrkA遺伝子の抑制に基づくトランスジェニックモデル(Smeyne 等、1994)は、生後1〜2週間以内に致死的表現型(lethal phenotype)を示し、従って成熟し、老化した神経系におけるTrkAの研究には不適である。抗体発現性トランスジェニック動物は、Piccioli等、1991; 1995 により開示されている。
TrkA遺伝子の抑制に基づくトランスジェニックモデル(Smeyne 等、1994)は、生後1〜2週間以内に致死的表現型(lethal phenotype)を示し、従って成熟し、老化した神経系におけるTrkAの研究には不適である。抗体発現性トランスジェニック動物は、Piccioli等、1991; 1995 により開示されている。
本発明の核酸を包含し、この核酸を正確に、また効果的に発現することができるファージ又は原核生物ベクター(prokaryotic vector)は、本発明の範囲内にある。
本発明の核酸を包含し、この核酸を正確に、また効果的に発現することができる組換え真核生物ベクター(eukaryotic vector) 及びこの神経学的疾病の遺伝子治療用組換えベクターを含有する医薬組成物はまた、本発明の範囲内にある。このような疾病には、これらに制限されないものとして、次の群:慢性の痛み、急性の痛み、神経腫、TrKA発現性新生物腫瘍が包含される。
本発明の核酸を包含し、この核酸を正確に、また効果的に発現することができる組換え真核生物ベクター(eukaryotic vector) 及びこの神経学的疾病の遺伝子治療用組換えベクターを含有する医薬組成物はまた、本発明の範囲内にある。このような疾病には、これらに制限されないものとして、次の群:慢性の痛み、急性の痛み、神経腫、TrKA発現性新生物腫瘍が包含される。
TrkAと称されるNGF(神経成長因子)の高親和性チロシンキナーゼレセプターを認識することができ、及びこれと結合することができ、またNGFのTrkAへの結合に対するアンタゴニストとして作用するモノクローナル抗体、その合成又は生命工学的誘導体の有効量及び調剤上で許容される担体を含有する医薬組成物は、本発明の範囲内にある。本発明の組成物は、これらに制限されないものとして、次の群:慢性の痛み、急性の痛み、神経腫、TrKA発現性新生物腫瘍を包含する神経学的疾病の処置に有利に使用することができる。
NGFが治療において望ましくない或る種の付随作用を有することがあることを考慮して、本発明はまた、医薬活性量のNGF及び医薬活性量の本発明による抗体又はその誘導体を含有する医薬組成物に関する。このような組成物は、NGFの望ましくない作用を末梢レベルで阻害することができるはずである。
NGFが治療において望ましくない或る種の付随作用を有することがあることを考慮して、本発明はまた、医薬活性量のNGF及び医薬活性量の本発明による抗体又はその誘導体を含有する医薬組成物に関する。このような組成物は、NGFの望ましくない作用を末梢レベルで阻害することができるはずである。
本発明のもう一つの目的は、本発明の抗体又はその生命工学的及び合成誘導体を発現することができる操作細胞(engineered cells)、ならびにこのような細胞を含有する医薬組成物であって、これらに制限されないものとして、次の群:慢性の痛み、急性の痛み、神経腫、TrKA発現性新生物腫瘍を包含する神経学的疾病の遺伝子治療用医薬組成物にある。
本発明による抗体の特異性及び望ましくない誘導作用の不存在の観点から、本発明による抗体は、インビボ「造影」診断用組成物に有利に使用することができる。
本発明を、例示的であるが制限的でないその態様に言及して説明する。添付の図面を参照することができる。
本発明による抗体の特異性及び望ましくない誘導作用の不存在の観点から、本発明による抗体は、インビボ「造影」診断用組成物に有利に使用することができる。
本発明を、例示的であるが制限的でないその態様に言及して説明する。添付の図面を参照することができる。
方法
免疫化方法
105 ヒトTrkA分子/細胞を発現するBalb/C 3T3トランスフェクションした細胞を、類遺伝子性コンジェニック免疫化法に使用した。3群の雌のBalb/Cマウスを、それぞれ105 、5×105 及び106 の生存細胞/マウスで免疫化した。2週間の間隔で5回の注射後、融合前血清を、TrkA+Balb/C 3T3細胞におけるNGFのTrkAレセプターに対する結合を阻害するそれらの能力について試験した。NGF結合の最大阻害は、5×105 細胞を注射したマウスからの血清で見出された(1/100稀釈における結合阻害)。
ハイブリドーマ製造
開示されているように(Novak等、1991) 、TrkA+Balb/C 3T3細胞のブースト注射後の3日目に、マウスを犠牲にし、脾臓を取り出し、次いで脾臓細胞を、ポリエチレングリコール(PEG1500)によりNSO骨髄腫に融合させた(10:1比)。ハイブリドーマ成長及び選択は、標準方法に従って行った(Galfre 及びMilstein、1981) 。
免疫化方法
105 ヒトTrkA分子/細胞を発現するBalb/C 3T3トランスフェクションした細胞を、類遺伝子性コンジェニック免疫化法に使用した。3群の雌のBalb/Cマウスを、それぞれ105 、5×105 及び106 の生存細胞/マウスで免疫化した。2週間の間隔で5回の注射後、融合前血清を、TrkA+Balb/C 3T3細胞におけるNGFのTrkAレセプターに対する結合を阻害するそれらの能力について試験した。NGF結合の最大阻害は、5×105 細胞を注射したマウスからの血清で見出された(1/100稀釈における結合阻害)。
ハイブリドーマ製造
開示されているように(Novak等、1991) 、TrkA+Balb/C 3T3細胞のブースト注射後の3日目に、マウスを犠牲にし、脾臓を取り出し、次いで脾臓細胞を、ポリエチレングリコール(PEG1500)によりNSO骨髄腫に融合させた(10:1比)。ハイブリドーマ成長及び選択は、標準方法に従って行った(Galfre 及びMilstein、1981) 。
TrkA+Balb/C 3T3細胞に対する 125 I結合の阻害
開示されているように(Cattaneo 等、1983) 、2,5S NGFを、マウス顎下腺から精製し、105 cpm/ngの特異活性にヨウ素化した。5×104 TrkA+Balb/C 3T3細胞を、培養培地(FCS10%含有DMEM)50μlの容積で96ウエルミクロプレートの各ウエル中にプレート形成した。ハイブリドーマ上清の50μlアリコートを、細胞とともに1時間にわたりインキュベートし、次いで125 I−NGF溶液(5×104 cpm/ウエル)を添加した。これらのプレートを開示されているように処理した(Cattaneo 等、1988) 。非特異的結合は、過剰(5μg/ml)の無標識NGFの存在下に、平行ウエルで測定した。平行ウエルにおいて、結合は無関係ハイブリドーマ上清(Rab50)又は中和性抗−NGF(mABαD11、Cattaneo等、1988)の存在下に行った。
開示されているように(Cattaneo 等、1983) 、2,5S NGFを、マウス顎下腺から精製し、105 cpm/ngの特異活性にヨウ素化した。5×104 TrkA+Balb/C 3T3細胞を、培養培地(FCS10%含有DMEM)50μlの容積で96ウエルミクロプレートの各ウエル中にプレート形成した。ハイブリドーマ上清の50μlアリコートを、細胞とともに1時間にわたりインキュベートし、次いで125 I−NGF溶液(5×104 cpm/ウエル)を添加した。これらのプレートを開示されているように処理した(Cattaneo 等、1988) 。非特異的結合は、過剰(5μg/ml)の無標識NGFの存在下に、平行ウエルで測定した。平行ウエルにおいて、結合は無関係ハイブリドーマ上清(Rab50)又は中和性抗−NGF(mABαD11、Cattaneo等、1988)の存在下に行った。
ELISA
可溶性TrkA及びTrkBレセプターを、ヒトTrkAレセプターの細胞外ドメインを35アミノ酸配列から構成されているIgG2のFc部分に結合させ、次いでCH2及びCH3ドメインに結合させることによって、イムノアドヘシンとして操作した(Chamow 及びAshkenazi 、1996) 。TrkA及びTrkAイムノアドヘシン(TrkA−IgG及びTrkB−IgG)をコードするDNA配列を、昆虫細胞における発現にかかわりバキュロウイルス[オートグラファ カリホルニア ニュークレア ポリヘドロシス ウイルス(Autographa Califonica nuclear polyhedrosis virus)、AcNPV]中にクローン化し[バキュロゴールド トランスフェクション キット(Baculogold transfection kit) 、Pharmingen Ing. ]、このタンパク質をハイ ファイブ(High Five) 昆虫細胞の血清を含まない培養培地からプロテインA−セファロースクロマトグラフイにより精製した。ELISAアッセイするために、TrkA−IgG及びTrkB−IgGを2μg/mlでインキュベートし、次いでラクダ免疫グロブリン上に予め予備吸着させた2又は20ng/mlのMNAC13及び抗マウスIgGとともにインキュベートした。
可溶性TrkA及びTrkBレセプターを、ヒトTrkAレセプターの細胞外ドメインを35アミノ酸配列から構成されているIgG2のFc部分に結合させ、次いでCH2及びCH3ドメインに結合させることによって、イムノアドヘシンとして操作した(Chamow 及びAshkenazi 、1996) 。TrkA及びTrkAイムノアドヘシン(TrkA−IgG及びTrkB−IgG)をコードするDNA配列を、昆虫細胞における発現にかかわりバキュロウイルス[オートグラファ カリホルニア ニュークレア ポリヘドロシス ウイルス(Autographa Califonica nuclear polyhedrosis virus)、AcNPV]中にクローン化し[バキュロゴールド トランスフェクション キット(Baculogold transfection kit) 、Pharmingen Ing. ]、このタンパク質をハイ ファイブ(High Five) 昆虫細胞の血清を含まない培養培地からプロテインA−セファロースクロマトグラフイにより精製した。ELISAアッセイするために、TrkA−IgG及びTrkB−IgGを2μg/mlでインキュベートし、次いでラクダ免疫グロブリン上に予め予備吸着させた2又は20ng/mlのMNAC13及び抗マウスIgGとともにインキュベートした。
免疫蛍光分析
MNAC13モノクローナル抗体を、血清を含まないハイブリドーマ上清からプロテインA−セファロースクロマトグラフイにより精製した。5×104 TrkA+3T3 Balb/C細胞を、MNAC13精製抗体とともにインキュベートし、次いで活性化された細胞選別装置(sorter)(FACS)で分析した。免疫蛍光分析するために、付着性細胞をPBS中の3.7%パラホルムアルデヒドで固定し、精製MNAC13とともに、次いでFITC標識した抗マウスIgGとともにインキュベートし、次いで共焦点顕微鏡(Olympus) により分析した。
MNAC13モノクローナル抗体を、血清を含まないハイブリドーマ上清からプロテインA−セファロースクロマトグラフイにより精製した。5×104 TrkA+3T3 Balb/C細胞を、MNAC13精製抗体とともにインキュベートし、次いで活性化された細胞選別装置(sorter)(FACS)で分析した。免疫蛍光分析するために、付着性細胞をPBS中の3.7%パラホルムアルデヒドで固定し、精製MNAC13とともに、次いでFITC標識した抗マウスIgGとともにインキュベートし、次いで共焦点顕微鏡(Olympus) により分析した。
PC12細胞によるNGFバイオアッセイ
ラットPC12細胞(Greene 及びTischler、1976) を、10%加熱不活性化ウマ血清及び5%FCSとともにRPMIで培養した。バイオアッセイのために、これらの細胞を血清を含まない培地に移し、MNAC13抗体又はその一本鎖組換えFvバージョン(scFvMNAC13)の存在又は不存在下に4〜6日間、NGF20ng/mlとともにインキュベートした。別法として、これらの細胞を、NGF50ng/mlとともに1週間にわたりインキュベートし、次いで神経突起から機械的に分離し、相当する抗体の添加及びNGF10ng/mlの存在下に再プレート形成した。神経突起成長は、24〜48時間後に評価した。
ラットPC12細胞(Greene 及びTischler、1976) を、10%加熱不活性化ウマ血清及び5%FCSとともにRPMIで培養した。バイオアッセイのために、これらの細胞を血清を含まない培地に移し、MNAC13抗体又はその一本鎖組換えFvバージョン(scFvMNAC13)の存在又は不存在下に4〜6日間、NGF20ng/mlとともにインキュベートした。別法として、これらの細胞を、NGF50ng/mlとともに1週間にわたりインキュベートし、次いで神経突起から機械的に分離し、相当する抗体の添加及びNGF10ng/mlの存在下に再プレート形成した。神経突起成長は、24〜48時間後に評価した。
脳室内ハイブリドーマ注入及び免疫化学
脳室内ハイブリドーマ注入及び基底前脳ニューロンのコリン作用性表現型の分析を本質的に、開示されている方法で行った(Molnar 等、1997及び1998) 。簡単に説明すると、開示されているように(Molnar 等、1998) 、MNAC13ハイブリドーマ細胞及び対照骨髄腫細胞(P3X63Ag8)細胞を、2×105 細胞/μlでハンク(Hank)(HBBS)溶液に再懸濁し、次いでウイスター(Wistar)ラットの右側脳室中に注入した。この注入は、生後2日目(P2)に行い、P8日目に分析用に犠牲にした。麻酔下に潅流させた後、開示されているように(Molnar 等、1997及び1998) 、脳をaChAT免疫組織化学用に処理した。脳脊髄液(CSF)中のMNAC13抗体のレベルを、固相抗原としてTrkAレセプターを用いるELISA分析により測定した。
脳室内ハイブリドーマ注入及び基底前脳ニューロンのコリン作用性表現型の分析を本質的に、開示されている方法で行った(Molnar 等、1997及び1998) 。簡単に説明すると、開示されているように(Molnar 等、1998) 、MNAC13ハイブリドーマ細胞及び対照骨髄腫細胞(P3X63Ag8)細胞を、2×105 細胞/μlでハンク(Hank)(HBBS)溶液に再懸濁し、次いでウイスター(Wistar)ラットの右側脳室中に注入した。この注入は、生後2日目(P2)に行い、P8日目に分析用に犠牲にした。麻酔下に潅流させた後、開示されているように(Molnar 等、1997及び1998) 、脳をaChAT免疫組織化学用に処理した。脳脊髄液(CSF)中のMNAC13抗体のレベルを、固相抗原としてTrkAレセプターを用いるELISA分析により測定した。
MNAC13による免疫組織化学試験の場合、動物をエーテルで麻酔し、PB(0.1M、pH7.4)を潅流させ、次いで4℃で2時間、4%パラホルムアルデヒド/PBを潅流させた。解剖後、脳を4℃で2時間、4%パラホルムアルデヒド/PB中で固定し、25%スクロース/PBS中に移し、次いで−20℃においてイソペンタン中で凍結させ、次いで低温保持装置を用いて切開した。基底前脳を含む脳室区分をゼラチン処理したスライド上に採取し、操作するまで、−20℃で保存した。トリス(Tris)HCl(0.1M、pH7.4)、0.05%トリトン(Triton)−100中の10%FCS/5%BSA溶液中で非特異的結合をブロックした後、これらの区分を4℃で一夜にわたり、トリス(Tris)HCl(0.1M、pH7.4)、0.05%トリトン(Triton)−100中の10%FCS/2%BSA中で抗−TrkA(6μg/ml)と共にインキュベートした。翌日、これらの区分を室温で2時間、次いでABCキット(Vector)で1時間、ビオチニル化(biotynilated)抗マウスIgGとともにインキュベートした。この反応は3,3´−ジアミノベンジジンHCl中で進展させた。脱水後、これらの区分をDPXに配置した。
mAbMNAC13の可変領域のクローニング
mAbMNAC13の可変領域のクローニングは、可変領域PCRによりハイブリドーマmRNAから行った。可変領域PCRはマウス免疫グロブリン用の一組のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて行った(Krebber等、1997) 。増幅されたVH及びVK可変領域を、PCRによりscFvホーマットで組立て、次いでpDNAベクター中にクローン化した(Bradbury 等、1996) 。BstNI制限エンドヌクレアーゼを用いるフィンガープリント分析後(これにより生成するscFVsの制限された多様性が確認される)、scFVフラグメントを表わすファージ粒子を、固相抗原としてTrkA−IgGを用いるELISAに付した。このアッセイは二次HRP結合した抗M13抗体により展開させた。陽性と同定されたファージをさらにアッセイし、最終的に、イー・コリ(E.coli)における可溶性scFvフラグメントの生成に使用した。細菌上清を、scFvフラグメント中に存在するSV5タグに対するモノクローナル抗体を用いてTrkA−IgGに対してELISAによりアッセイし(Hanke等、1992) 、次いでHRP結合した抗マウスIgGによりアッセイした。
mAbMNAC13の可変領域のクローニングは、可変領域PCRによりハイブリドーマmRNAから行った。可変領域PCRはマウス免疫グロブリン用の一組のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて行った(Krebber等、1997) 。増幅されたVH及びVK可変領域を、PCRによりscFvホーマットで組立て、次いでpDNAベクター中にクローン化した(Bradbury 等、1996) 。BstNI制限エンドヌクレアーゼを用いるフィンガープリント分析後(これにより生成するscFVsの制限された多様性が確認される)、scFVフラグメントを表わすファージ粒子を、固相抗原としてTrkA−IgGを用いるELISAに付した。このアッセイは二次HRP結合した抗M13抗体により展開させた。陽性と同定されたファージをさらにアッセイし、最終的に、イー・コリ(E.coli)における可溶性scFvフラグメントの生成に使用した。細菌上清を、scFvフラグメント中に存在するSV5タグに対するモノクローナル抗体を用いてTrkA−IgGに対してELISAによりアッセイし(Hanke等、1992) 、次いでHRP結合した抗マウスIgGによりアッセイした。
結果
NGFのTrkAに対する結合を阻害するモノクローナル抗体の製造及び特徴確認
TrkAレセプターの神経栄養物質結合活性を妨害することができる抗体を製造するために、類遺伝子性免疫化方法を使用した。ヒトtrkプロト癌遺伝子のトランスフェクションによって生成されたヒトTrkAレセプターを発現するBalb/C−3T3細胞を、Balb/Cマウスの免疫化に使用した。細胞数は標的細胞に結合するNGFを中和する血清抗体の誘導に決定的であることが見出された。
NGFのTrkAに対する結合を阻害するモノクローナル抗体の製造及び特徴確認
TrkAレセプターの神経栄養物質結合活性を妨害することができる抗体を製造するために、類遺伝子性免疫化方法を使用した。ヒトtrkプロト癌遺伝子のトランスフェクションによって生成されたヒトTrkAレセプターを発現するBalb/C−3T3細胞を、Balb/Cマウスの免疫化に使用した。細胞数は標的細胞に結合するNGFを中和する血清抗体の誘導に決定的であることが見出された。
ハイブリドーマ上清を3T3−TrkA+細胞に対する125 Iの結合の阻害にかかわるそれらの能力について評価した。ハイブリドーマ成長が生じた1266個のウエルの中で、4個のみがNGF中和活性を示した。相当する細胞をサブクローニングし、MNAC13、C30、C191及びC232クローンを得た。これらのクローンにより産生される抗体の3T3−TrkA+細胞に対するNGFの結合を阻害する能力は、図1に示されている。これらの抗−TrkA抗体は、中和性抗−NGFαD11抗体と同様に効果的に、NGFの結合を阻害する(図1)。後者はNGFの活性部位に結合するのに対して、前者は、おそらくNGF認識部位又はその付近でTrkAレセプターに結合する。IgGMNAC13抗体を引き続く研究用に選択した。
NGF結合の阻害は、可溶性形態のヒトTrkAレセプターに対する種々の結合性試験によって証明されるように、イムノアドヘシンとして操作された(Chamow及びAshkenazi、1996)TrkAレセプターであって、レセプターの細胞外部分をラクダ免疫グロブリンのFCドメインに融合させるもの(方法の項参照)、の細胞外部分と抗体との直接的相互反応によって得られる。図2は、MNAC13抗体が、ELISAアッセイにおいてTrkAイムノアドヘシンに結合するが、TrkBイムノアドヘシンとは反応しないことを示している。このことは、MNAC13抗体がTrkAの細胞外部分に特異的に結合することを確認する。
図3は、3T3TrkA+細胞に対するFACS分析の結果を示しており、MNAC13抗体が生存している細胞の膜で発現されたヒトレセプターと相互作用することを証明している。免疫蛍光分析は、この結果を確認する。
MNAC13抗体の種特異性を、ラットのニューロンにおけるそのTrkAレセプターを認識する能力に基づいて試験した。ラット脳の切片を、TrkA陽性ニューロンに富んでいる基底前脳領域から採取した(図4)。この基底前脳でMNAC13抗体により得られた強い染色は、このヒトTrkAレセプターに対して得られた抗体がまた、そのラット同等物を認識することを示す。この抗体は、陽性TrkAニューロンに欠けていることが知られている中央小帯核(medial habenular nuclei)のような脳領域は染色しない(Holtzmann等、1995)。
MNAC13抗体の種特異性を、ラットのニューロンにおけるそのTrkAレセプターを認識する能力に基づいて試験した。ラット脳の切片を、TrkA陽性ニューロンに富んでいる基底前脳領域から採取した(図4)。この基底前脳でMNAC13抗体により得られた強い染色は、このヒトTrkAレセプターに対して得られた抗体がまた、そのラット同等物を認識することを示す。この抗体は、陽性TrkAニューロンに欠けていることが知られている中央小帯核(medial habenular nuclei)のような脳領域は染色しない(Holtzmann等、1995)。
MNAC13抗体によるTrkA媒介生物学的作用の機能的ブロック
従って、NGFリガンドによるTrkAレセプターの生物学的活性化のインビボ阻害にかかわるMNAC13抗体の能力をPC12細胞においてインビトロ(図5)及びインビボ(図6)で試験した。
PC12細胞のNGF誘発分化(図5B)は、無関係抗体とのインキュベーション(図5D)に比較して、培養物をMNAC13抗体とともにインキュベートすることによって完全に阻害される(図5C)。
従って、NGFリガンドによるTrkAレセプターの生物学的活性化のインビボ阻害にかかわるMNAC13抗体の能力をPC12細胞においてインビトロ(図5)及びインビボ(図6)で試験した。
PC12細胞のNGF誘発分化(図5B)は、無関係抗体とのインキュベーション(図5D)に比較して、培養物をMNAC13抗体とともにインキュベートすることによって完全に阻害される(図5C)。
基底前脳のコリン作用性ニューロンは、中枢神経系におけるNGFの作用にかかわる周知の標的である(Korsching、1986;Holtzman等、1992)。MNAC13抗体を分泌するハイブリドーマ細胞を、生後2日目の新生児ラットの側脳室に移植し、次いでニューロンのコリン作用性表現型を、1週間後(P9)にコリンアセチルトランスフェラーゼ(ChAT)に対する抗体による免疫組織化学的方法により試験した。この実験手段は、最近に、抗−NGFモノクローナル抗体αD11を分泌する移植細胞の効果の試験に使用されている(Berardi等、1994;Molnar等、1997及び1998)。移植後の1週間、ELISAにより測定して、脳脊髄液中の抗−TrkA抗体レベルは、1.4ng/μlであることが見出された。図6に示されている結果は、ChAT陽性細胞の数が、対照(無関係骨髄腫を注入)と比較して、抗−TrkA抗体を移植した脳で劇的に減少したことを示している。陽性ChATニューロンの数の定量的評価は、この数が対照に比較して、MNAC13抗体移植ラットの中央隔壁(medial septum)で70%まで減少し、またダイアゴナルバンド(diagonal band)で77%まで減少することを示した。この試験を種々の生後日数について拡大試験により、抗−NGF中和性抗体を分泌する細胞を移植した(Molnar等、1997;1998)、従来の試験で得られた効果と比較すると、抗−TrkA MNAC13抗体により得られた基底前脳のコリン作用系の欠乏効果がよりいっそう厳しいものであることを示した。
格別に減少されたサイズを有する組換え機能性形態のmAB MNAC13の単離
用途範囲を拡大させるために、この抗体の可変領域をクローン化し、より小さいサイズの組換え抗体に加工した。
相当するハイブリドーマからのモノクローナル抗体の可変領域のクローニングは、複雑であることがあり、人工的可変領域のクローニングに帰着する。従って、発明者は、Winter等による技術(1994)を使用した。MNAC13抗体の可変重鎖(VH)及び可変軽鎖(VL)領域を、マウスIgG特異性オリゴヌクレオチドプライマーを用いて、ハイブリドーマmRNAから誘導されたcDNAからPCRによって増幅させた。これらの可変領域を、PCRによって一本鎖Fv(scFv)中に組入れ、次いでpDNAベクター中にクローン化し、繊維状ファージの表面におけるクローン化した抗体フラグメントの発現を可能にした。ScFvフラグメントは、元の抗体(Bird等、1988)の生命工学的誘導体の代表例であり、VL領域のC末端がVH領域のN末端に結合するリンカーペプチドに結合した可変軽鎖領域及び可変重鎖領域からなる。ScMNAC13特異性フラグメントのヌクレオチド配列を配列番号:1に示す。アミノ酸配列は、配列番号:2に示されており、この配列において、VL領域はaa.23からaa.134までであり、VH領域はaa.152からaa.276までである。
用途範囲を拡大させるために、この抗体の可変領域をクローン化し、より小さいサイズの組換え抗体に加工した。
相当するハイブリドーマからのモノクローナル抗体の可変領域のクローニングは、複雑であることがあり、人工的可変領域のクローニングに帰着する。従って、発明者は、Winter等による技術(1994)を使用した。MNAC13抗体の可変重鎖(VH)及び可変軽鎖(VL)領域を、マウスIgG特異性オリゴヌクレオチドプライマーを用いて、ハイブリドーマmRNAから誘導されたcDNAからPCRによって増幅させた。これらの可変領域を、PCRによって一本鎖Fv(scFv)中に組入れ、次いでpDNAベクター中にクローン化し、繊維状ファージの表面におけるクローン化した抗体フラグメントの発現を可能にした。ScFvフラグメントは、元の抗体(Bird等、1988)の生命工学的誘導体の代表例であり、VL領域のC末端がVH領域のN末端に結合するリンカーペプチドに結合した可変軽鎖領域及び可変重鎖領域からなる。ScMNAC13特異性フラグメントのヌクレオチド配列を配列番号:1に示す。アミノ酸配列は、配列番号:2に示されており、この配列において、VL領域はaa.23からaa.134までであり、VH領域はaa.152からaa.276までである。
これらのCDR(抗体相補性を決定する領域)は、各鎖について3個であり、特に下記のとおりである:
VL CDR1 配列番号:2のaa.46〜55
VL CDR2 配列番号:2のaa.71〜77
VL CDR3 配列番号:2のaa.110〜1119
VH CDR1 配列番号:2のaa.176〜185
VH CDR2 配列番号:2のaa.200〜216
VH CDR3 配列番号:2のaa.249〜262。
表1及び2に示されているように、MNAC13抗体の軽鎖可変領域及び重鎖可変領域の配列を、特許出願PCT No.WO97/21732に記載されている抗体の配列と比較した。
VL CDR1 配列番号:2のaa.46〜55
VL CDR2 配列番号:2のaa.71〜77
VL CDR3 配列番号:2のaa.110〜1119
VH CDR1 配列番号:2のaa.176〜185
VH CDR2 配列番号:2のaa.200〜216
VH CDR3 配列番号:2のaa.249〜262。
表1及び2に示されているように、MNAC13抗体の軽鎖可変領域及び重鎖可変領域の配列を、特許出願PCT No.WO97/21732に記載されている抗体の配列と比較した。
PCR組込みScFVフラグメントを、p3ファージタンパク質への融合として、繊維状ファージ上で発現させた。このファージ粒子のミニライブラリイを、固相抗原としてTrkAイムノアドヘシンを用いて、ファージ上でELISAアッセイによりスクリーニングした。このスクリーニングは、MNAC13の親の抗体のscFvバージョン(scFvMNAC13)を、それらの表面上で発現する陽性ファージの単離を導いた。このファージの結合物性及びこのファージから誘導されたscFv可溶性フラグメントの結合物性を、競合ELISAアッセイにより特性決定した(図7)。TrkAイムノアドヘシンを固相に結合し、次いで増加する量の競合する可溶性TrkAイムノアドヘシンの存在下に、MNAC13発現性ファージ粒子とともに(図7A)、ScFvMNAC13可溶性抗体とともに(図7B)又は親のMNAC13抗体とともに(図7C)、インキュベートした。この結果は、ファージ上の、又はE.coliにより分泌される親のモノクローナル抗体のScFvバージョンが、親のモノクローナル抗体と同様なほど効果的にTrkAに結合することを確証した。
ScFvMNAC13の生物学的活性をPC12細胞で試験した。この細胞を、50ng/mlのNGFとともに1週間にわたりインキュベートし、次いでこれらをNGF及び抗体ScFvMNAC13フラグメントの存在下に再プレート形成した。図8に示されているように、ScFvMNAC13フラグメントはPC12細胞からの神経突起の伸張を劇的に阻害した。このことは、MNAC13抗体の組換え一本鎖Fvが親の抗体の中和物性を保有することを確証する。この一本鎖ポリペプチド抗体の小さいサイズは、本発明の抗体の用途範囲を拡大し、神経組織内におけるその放出及び発現を助長する。
侵害受容試験(nociception test)
MNAC13抗体を侵害受容試験に使用し、「ホットプレート試験」により痛み感受性を測定した。この試験は、イムノアドヘシンとして抗体MNAC13を使用して、McMahon等(1995)に従い行った。この抗体を成熟ラットの後肢に、3週間にわたり皮下注入するか又は浸透圧利用ミニポンプにより注入した。侵害受容感受性は、炎症又は神経の部分的損傷後の痛覚過敏状態を擬装するホットプレート試験(Eddy及びLeimbach、1953)を用いて或る間隔で評価した。侵害受容性刺激は、単純な反射よりも大きい集積した共同作用と見做される応答(足をなめる行為及び/又は跳躍)のような場合を誘発する。この試験に従い、動物を基礎温度として所望の温度(通常56゜)に加熱したプレートを有するオリに入れる。2種の応答(足をなめる行為及び/又は跳躍)のいずれかの潜伏期間を、対照動物(無関係抗体で処置)及び抗−TrkA抗体で処置した動物で測定した。この試験結果は、MNAC13処置群における潜伏期間の格別の増加によって指摘されるように、顕著な侵害受容の発現を証明した。
MNAC13抗体を侵害受容試験に使用し、「ホットプレート試験」により痛み感受性を測定した。この試験は、イムノアドヘシンとして抗体MNAC13を使用して、McMahon等(1995)に従い行った。この抗体を成熟ラットの後肢に、3週間にわたり皮下注入するか又は浸透圧利用ミニポンプにより注入した。侵害受容感受性は、炎症又は神経の部分的損傷後の痛覚過敏状態を擬装するホットプレート試験(Eddy及びLeimbach、1953)を用いて或る間隔で評価した。侵害受容性刺激は、単純な反射よりも大きい集積した共同作用と見做される応答(足をなめる行為及び/又は跳躍)のような場合を誘発する。この試験に従い、動物を基礎温度として所望の温度(通常56゜)に加熱したプレートを有するオリに入れる。2種の応答(足をなめる行為及び/又は跳躍)のいずれかの潜伏期間を、対照動物(無関係抗体で処置)及び抗−TrkA抗体で処置した動物で測定した。この試験結果は、MNAC13処置群における潜伏期間の格別の増加によって指摘されるように、顕著な侵害受容の発現を証明した。
Claims (37)
- TrkAと称されるNGF(神経成長因子)の高親和性チロシンキナーゼレセプターを認識することができ、及び結合することができ、かつNGFのTrkAへの結合に対するアンタゴニストとして作用する、軽鎖の可変領域が、配列番号:2のaa.23からaa.134までの配列を本質的に含む、モノクローナル抗体、その合成及び生命工学的誘導体。
- TrkAと称されるNGF(神経成長因子)の高親和性チロシンキナーゼレセプターを認識することができ、及び結合することができ、かつNGFのTrkAへの結合に対するアンタゴニストとして作用する、重鎖の可変領域が配列番号:2のaa.152からaa.276までの配列を本質的に含む、モノクローナル抗体、その合成及び生命工学的誘導体。
- 軽鎖の可変領域が配列番号:2のaa.23からaa.134までの配列を本質的に含み、及び重鎖の可変領域が配列番号:2のaa.152からaa.276までの配列を本質的に含む、請求項1又は2に記載のモノクローナル抗体、その合成及び生命工学的誘導体。
- TrkAと称されるNGF(神経成長因子)の高親和性チロシンキナーゼレセプターを認識することができ、及び結合することができ、かつNGFのTrkAへの結合に対するアンタゴニストとして作用する、配列番号:2の配列を本質的に含む、モノクローナル抗体のScFvフラグメント。
- TrkAと称されるNGF(神経成長因子)の高親和性チロシンキナーゼレセプターを認識することができ、及び結合することができ、かつNGFのTrkAへの結合に対するアンタゴニストとして作用し、少なくとも1つの抗体の相補性を決定する領域(CDR)で、かつNGFのTrkAへの結合に対するアンタゴニストとして作用することができる領域を含み、前記抗体の相補性を決定する領域(CDR)で、かつNGFのTrkAへの結合に対するアンタゴニストとして作用することができる領域が配列番号:2のaa.152からaa.276までの重鎖可変領域内にある、モノクローナル抗体の合成又は生命工学的誘導体。
- 請求項1〜5のいずれかに記載の抗体又はその誘導体をコードする核酸。
- 配列番号:2のScFvフラグメントをコードする、請求項6に記載の核酸。
- 配列番号:1を本質的に含む、請求項7に記載の核酸。
- 非ヒトトランスジェニック動物、好ましくはマウスの製造における請求項6〜8のいずれかに記載の核酸の使用であって、請求項1〜5に記載の抗体又はその誘導体を、誘導可能な方法で又は成熟動物における発現を決定するプロモーターの制御下に発現させる、上記使用。
- 請求項6〜8に記載の核酸により形質転換される非ヒトトランスジェニック動物であって、上記核酸が誘導可能な方法で又は成熟動物における発現を決定するプロモーターの制御下に発現される、上記非ヒトトランスジェニック動物。
- 請求項6〜8のいずれかに記載の核酸を含み、及び当該核酸を正確に、また効果的に発現することができるファージ又は原核生物組換えベクター。
- 請求項6〜8のいずれかに記載の核酸を含み、及びこの核酸を正確に、また効果的に発現することができる組換え真核生物ベクター。
- 有効量の請求項12に記載のベクター及び医薬上で許容される担体を含有する医薬組成物であって、次の群:慢性の痛み、急性の痛み、神経腫、TrkA発現性新生物腫瘍を包含する神経学的病気の遺伝子治療用医薬組成物。
- 有効量の請求項1〜5のいずれかに記載されており、TrkAと称されるNGF(神経成長因子)の高親和性チロシンキナーゼレセプターを認識することができ、及び結合することができ、かつNGFのTrkAへの結合に対するアンタゴニストとして作用するモノクローナル抗体、又はその合成又は生命工学的誘導体並びに医薬上で許容される担体を含有する医薬組成物。
- 次の群:慢性の痛み、急性の痛み、神経腫、TrkA発現性新生物腫瘍を包含する神経学的病気を処置するための請求項14に記載の医薬組成物。
- 医薬活性量のNGF及び医薬活性量の請求項1〜5のいずれかに記載の抗体又はその誘導体を含有する医薬組成物。
- 請求項1〜5のいずれかに記載の抗体又はその誘導体を発現することができる真核生物操作細胞。
- 請求項17に記載の細胞及び医薬上で許容される担体を含有する医薬組成物であって、次の群:慢性の痛み、急性の痛み、神経腫、TrkA発現性新生物腫瘍を包含する神経学的病気の遺伝子治療用医薬組成物。
- 有効量の請求項1〜5のいずれかに記載されており、TrkAと称されるNGF(神経成長因子)の高親和性チロシンキナーゼレセプターを認識することができ、及び結合することができ、かつNGFのTrkAへの結合に対するアンタゴニストとして作用するモノクローナル抗体又はその合成又は生命工学的誘導体並びに診断上で許容される担体を含有する組成物であって、インビボ「造影」診断に使用するための組成物。
- TrkAと称されるNGF(神経成長因子)の高親和性チロシンキナーゼレセプターを認識することができ、及び結合することができ、かつNGFのTrkAへの結合に対するアンタゴニストとして作用し、かつNGFによるTrkAの機能的活性を阻害し、かつ配列番号:2のaa.46から55、配列番号:2のaa.71から77及び配列番号:2のaa.110から119で定義される軽鎖CDR、並びに配列番号:2のaa.176から185、配列番号:2のaa.200から216及び配列番号:2のaa.246から262で定義される重鎖CDRから選択される少なくとも1つのCDRによって特徴付けられる、モノクローナル抗体、その合成及び生命工学的誘導体。
- 請求項20に記載の抗体の軽鎖又は重鎖の少なくとも1つの可変領域を含む、請求項20に記載のモノクローナル抗体のScFvフラグメント。
- 請求項20に記載の抗体の軽鎖及び重鎖の可変領域を含む、請求項21に記載のScFvフラグメント。
- 軽鎖の可変領域と重鎖の可変領域の間のリンカー配列を含む、請求項22に記載のScFvフラグメント。
- 少なくとも1つの抗体の相補性を決定する領域(CDR)で、かつNGFのTrkAへの結合に対するアンタゴニストとして作用することができる領域を含む、請求項20に記載の合成及び生命工学的誘導体。
- 請求項20〜24のいずれかに記載の抗体又はその誘導体をコードする核酸。
- 非ヒトトランスジェニック動物、好ましくはマウスの製造における請求項25に記載の核酸の使用であって、請求項20〜24に記載の抗体又はその誘導体を、誘導可能な方法で又は成熟動物における発現を決定するプロモーターの制御下に発現させる、上記使用。
- 請求項25に記載の核酸により形質転換される非ヒトトランスジェニック動物であって、上記核酸が誘導可能な方法で又は成熟動物における発現を決定するプロモーターの制御下に発現される、上記非ヒトトランスジェニック動物。
- 請求項25に記載の核酸を含み、及び当該核酸を正確に、また効果的に発現することができるファージ又は原核生物組換えベクター。
- 請求項25のいずれかに記載の核酸を含み、及びこの核酸を正確に、また効果的に発現することができる組換え真核生物ベクター。
- 有効量の請求項29に記載のベクター及び医薬上で許容される担体を含有する医薬組成物であって、次の群:慢性の痛み、急性の痛み、神経腫、TrkA発現性新生物腫瘍を包含する神経学的病気の遺伝子治療用医薬組成物。
- 有効量の請求項20〜24のいずれかに記載されており、TrkAと称されるNGF(神経成長因子)の高親和性チロシンキナーゼレセプターを認識することができ、及び結合することができ、かつNGFのTrkAへの結合に対するアンタゴニストとして作用するモノクローナル抗体又はその合成又は生命工学的誘導体並びに医薬上で許容される担体を含有する医薬組成物。
- 次の群:慢性の痛み、急性の痛み、神経腫、TrkA発現性新生物腫瘍を包含する神経学的病気を処置するための請求項31に記載の医薬組成物。
- 医薬活性量のNGF及び医薬活性量の請求項20〜24のいずれかに記載の抗体又はその誘導体を含有する医薬組成物。
- 請求項20〜24のいずれかに記載の抗体又はその誘導体を発現することができる真核生物操作細胞。
- 請求項34に記載の細胞及び医薬上で許容される担体を含有する医薬組成物であって、次の群:慢性の痛み、急性の痛み、神経腫、TrkA発現性新生物腫瘍を包含する神経学的病気の遺伝子治療用医薬組成物。
- 有効量の請求項20〜24のいずれかに記載されており、TrkAと称されるNGF(神経成長因子)の高親和性チロシンキナーゼレセプターを認識することができ、及び結合することができ、かつNGFのTrkAへの結合に対するアンタゴニストとして作用するモノクローナル抗体又はその合成又は生命工学的誘導体並びに診断上で許容される担体を含有する組成物であって、インビボ「造影」診断に使用するための組成物。
- 次の群:慢性の痛み、及び急性の痛みを包含する神経学的病気の治療のための医薬組成物の製造のための、TrkAと称されるNGF(神経成長因子)の高親和性チロシンキナーゼレセプターを認識することができ、及び結合することができ、かつNGFのTrkAへの結合に対するアンタゴニストとして作用し、かつNGFによるTrkAへの機能的活性を阻害する、モノクローナル抗体又はその合成又は生命工学的誘導体の使用。
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