ES2218163T5 - Anticuerpos monoclonales y sus derivados sintéticos y biotecnológicos que actúan como moléculas antagonistas de NGF - Google Patents
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Abstract
Un anticuerpo monoclonal, y sus derivados sintéticos y biotecnológicos, capaz de reconocer y unirse al receptor de alta afinidad del NGF (factor de crecimiento nervioso), con actividad de tirosina-quinasa, denominado TrkA, y de actuar como antagonista de la unión del NGF a TrkA.
Description
Anticuerpos monoclonales y sus derivados sintéticos y biotecnológicos que actúan como moléculas antagonistas del
NGF.
El presente invento se refiere a anticuerpos monoclonales, y a sus derivados sintéticos y biotecnológicos, que actúan
como moléculas antagonistas del NGF.
El invento también concierne a los usos diagnósticos y terapéuticos de esas moléculas y de composiciones
relacionadas.
Las neurotrofinas son una familia de factores de crecimiento peptídicos (Barde, 1994), estructuralmente relacionados
con el primer miembro de la familia, el NGF (factor de crecimiento nervioso, Levi-Montalicini, 1987). Las
neurotrofinas modulan la diferenciación y supervivencia neuronales, así como la transmisión sináptica, tanto de las
neuronas periféricas como de las del sistema nervioso central. Además, el NGF actúa sobre varios tejidos y células
no neuronales, como las células del sistema inmunitario.
El NGF actúa a través de dos receptores de membrana presentes en las células diana, el receptor p75 de baja
afinidad, y la glicoproteína transmembranal TrkA, de alta afinidad y de 140 kDa (Kaplan y col., 1991, Klein y col.,
1991) que tiene actividad de tirosina-quinasa. La TrkA se expresa en las neuronas de las crestas neurales, en las
neuronas del sistema simpático así como en neuronas colinérgicas del prosencéfalo basal y del cuerpo estriado, en
las que representa el mediador crucial de las actividades del NGF (Holtzman y col., 1992, Verge y col., 1992). La
TrkA también se expresa en algunos tejidos y células no neuronales, que incluyen los linfocitos B (Torcia y col.,
1996).
La técnica anterior sugiere el uso potencial del NGF en el tratamiento de diferentes patologías neurodegenerativas,
que incluyen la enfermedad de Alzehimer (Lindsay y col., 1994; Ebendal y col., 1991), y otras patologías, como
diabetes mellitus y lepra (Anand y col., 1996). Sin embargo, los ensayos clínicos iniciales fueron desalentadores,
complicados por las dificultades de suministro, por la farmacocinética en el sistema nervioso central, y por las
propiedades agonistas negativas del NGF contra otras dianas periféricas, fuera del sistema nervioso central, que
conducen a estímulos excesivos y no deseados.
Por lo tanto, hace falta desarrollar moléculas antagonistas selectivas de la interacción NGF-receptor TrkA y
derivados farmacológicamente activos de las mismas, que sean suministradas con facilidad.
Además, la sobreproducción de NGF en diferentes trastornos inflamatorios se había relacionado con el aumento de
la sensibilidad al dolor de los nociceptores primarios aferentes, contribuyendo así a la presencia de un estado de
dolor crónico. La población de neuronas sensitivas que son sensibles a daños tisulares (nociceptores) es
particularmente dependiente de NGF. Además, considerando los inconvenientes y limitaciones de las dos clases de
fármacos analgésicos existentes (fármacos anti-inflamatorios no esteroideos y opioides), la provisión de una nueva
diana diferente, como es el NGF, representa un progreso en la técnica (Snider y McMahon, 1998). Y además, según
lo sugerido por Levine (Levine, 1988), el NGF proporciona una diana potencial para el diseño de nuevos tratamientos
para el dolor, especialmente para aquellos dolores resultantes de trastornos inflamatorios o neuropáticos, para los
que los fármacos convencionales son menos efectivos. Por último, estudios recientes han mostrado una relación
directa entre el dolor y el sistema TrkA, demostrando, en cuatro casos no relacionados de insensibilidad crónica al
dolor de tipo 4, con anhidrosis, la presencia de mutaciones del gen TrkA y, en consecuencia, la ausencia de
receptores funcionales para NGF (Indo y col., 1996; Wood, 1996).
Por consiguiente, el sistema NGF-TrkA proporciona una diana potencial para diseñar tratamientos para el dolor, es
decir, tratamientos capaces de antagonizar el síndrome del dolor neuropático por medio de antagonistas efectivos
frente a TrkA (Levine, 1998; Sneider y Mcmahon, 1998).
La expresión aberrante del mRNA de receptores TrkA se había relacionado también con patologías neoplásicas. El
pronóstico de tumores que expresan TrkA, su diagnóstico mediante "formación de imágenes" así como su
tratamiento, representan un área de aplicación de anticuerpos que tienen una elevada afinidad por TrkA. De hecho,
en estos tumores, los agentes que se unen a TrkA representan herramientas útiles para el diagnóstico clínico, el
pronóstico y los tratamientos terapéuticos (Kramer y col., 1997).
Los anticuerpos recombinantes (Vaughan y col., 1998) representan reactivos de partida de elección para el
desarrollo de moléculas pequeñas que mimeticen su actividad (Le Sauteur y col., 1995).
Un anticuerpo monoclonal agonista de TrkA fue descrito por Le Sauteur y col., 1996, en la solicitud de PCT n.º
WO97/21732. La actividad agonista del único anticuerpo descrito (5C3) le hace no adecuado para los objetivos del
presente invento y para todas las situaciones en las que debe evitarse la hiperactivación del receptor TrkA. La
solicitud de PCT n.º WO97/21732 describe el uso en pruebas diagnósticas de "formación de imágenes" del anticuerpo agonista 5C3. Sin embargo este anticuerpo, debido a su actividad agonista, no puede ser utilizado para la aplicación anteriormente mencionada, a menos que la activación del receptor no esté impedida.
Urfer et al. (JBC 1998, 273(10): 5829-5840) divulgan los anticuerpos A1488, A1502 y A1503 pero no describen la caracterización química de tales anticuerpos. Además, el documento en sí no se ocupa de la función TrkA.
El Abstract of the Society for Neurosciency, vol. 22, 1996, página 1010, resumen 402.11 (Hongo et al.,) divulga un anticuerpo Mab1503 del que se dice que es un potente inhibidor de la unión de trk-NGF tal como se determina mediante un bioensayo de activación de receptor inducida por quinasa (KIRA). Sin embargo, el ensayo KIRA no proporciona en realidad pruebas de unión ligando-receptor. A partir de este resumen, no se puede decir que Mab 1503 es un antagonista funcional de TrkA.
El documento EP-A-0 471 205 divulga una serie de anticuerpos monoclonaes que se unen a una proteína protooncogénica trk y/o a una proteína oncogénica relacionada con trk, su secuencia no se describe y su uso es para el tratamiento del cáncer.
El documento 95/15180 se refiere a anticuerpos completos agonistas. El documento contiene una descripción aislada concerniente a las propiedades bloqueantes del supuesto receptor de fragmentos de anticuerpos monovalentes. Sin embargos, tal conclusión no está soportada por las evidencias mostradas en dicha solicitud. Hongo et al. (Hybridoma 1995, 14(3):253-259) describen el desarrollo y caracterización de nuevos anticuerpos monoclonales murinos contra el péptido asociado a la latencia (LAP) de TGF-11.
Clary et al., (Molecular Biol.. of the Cell 1994, 5:549-563) divulga un estudio de los efectos de un antisuero policlonal, de anticuerpos completos o fragmentos Fab, contra el receptor TrkA. En lo que concierne a la aplicación terapéutica, el documento se refiere sólo al efecto de la unión NGF/trkA sobre el desarrollo neuronal.
Por lo tanto, resulta evidente que es necesario desarrollar nuevas moléculas adecuadas para interferir con la unión del NGF a TrkA, para proporcionar nuevas actividades terapéuticas y, en particular, para proporcionar un anticuerpo TrkA que actúe como antagonista y sea por ello ideal para bloquear la activación del receptor producida por un ligando endógeno (NGF), y que no presente actividad de activación del receptor. Además ese anticuerpo podría utilizarse ventajosamente en el desarrollo de reactivos, es decir, de fragmentos sintéticos y recombinantes que bloqueen la interacción NGF-TrkA.
El autor del presente invento ha aislado varios anticuerpos monoclonales capaces de interaccionar con la unión NGF-receptor, denominados TrkA. Entre estos anticuerpos monoclonales, un anticuerpo, el denominado MNAC13, actúa como un potente antagonista de TrkA, inhibiendo la unión del NGF a TrkA. Este anticuerpo representa una herramienta muy efectiva para impedir la activación funcional de TrkA por NGF en diversos sistemas biológicos.
El anticuerpo se obtuvo mediante inmunización congénica de ratones Balb/C, con un receptor TrkA natural humano, expresado en células Balb/C 3T3. El cribado se basó en la capacidad de los anticuerpos para inhibir la unión del NGF a las células que expresan TrkA. Esto condujo al aislamiento de anticuerpos capaces de unirse a TrkA en su dominio de unión a NGF, impidiendo así la unión de NGF. El anticuerpo MNAC13 es muy efectivo para prevenir la activación funcional de TrkA producida por NGF en diferentes sistemas biológicos. El autor del presente invento ha clonado también los genes que codifican las regiones variables del anticuerpo MNAC13 y, mediante técnicas de DNA recombinante, ha ensamblado esas regiones en un polipéptido funcional de tamaño reducido (fragmento Fv de cadena sencilla, scFvMNAC13), confirmando que conserva las propiedades del anticuerpo de origen.
Anticuerpo agonista significa un anticuerpo capaz de activar el antígeno receptor en ausencia del ligando natural del propio receptor.
Anticuerpo antagonista significa un anticuerpo dirigido contra el sitio activo del receptor antigénico, y que es capaz de inhibir la actividad del ligando natural que está en competición con el anticuerpo mencionado por la unión al mismo receptor.
Derivados sintéticos y biotecnológicos de un anticuerpo significan cualquier fragmento construido por ingeniería genética, sintetizado por técnicas químicas o recombinantes, que conserva las propiedades funcionales del anticuerpo.
Un objetivo del presente invento son anticuerpos tal como los definidos en las reivindicaciones 1-3 y 20, fragmentos y derivados de los anticuerpos tal como los definidos en las reivindicaciones 4-5 y 21-24, ácidos nucleicos y sus usos tal como los definidos en las reivindicaciones 6-9 y 25-26, un animal transgénico no humano tal como los definidos en las reivindicaciones 10 y 27, un vector recombinante como los definidos en las reivindicaciones 11-12 y 28-29, una composición farmacológica tal como las definidas en las reivindicaciones 13-16, 18, 30-33 y 35, células manipuladas por ingeniería genética según las revindicaciones 17 y 34, una composición para uso en el diagnóstico in vivo mediante técnicas de "formación" de imágenes según las reivindicaciones 19 y 36 y uso de un anticuerpo monoclonal que se une a TrkA para la fabricación de una composición farmacológica para el tratamiento del dolor crónico o el dolor agudo tal como se define en la reivindicación 37.
Los ácidos nucleicos del invento pueden utilizarse ventajosamente como transgenes para obtener animales transgénicos no humanos, preferiblemente ratones, en los que el anticuerpo se expresa de un modo inducible, o bajo el control de promotores que determinan la expresión en el animal adulto. Estos animales pueden utilizarse ventajosamente para estudiar y probar fármacos para patologías humanas en las que la interacción NGF/TrkA está inhibida, y en particular, en patologías neurodegenerativas. Animales transgénicos no humanos pueden obtenerse con técnicas estándar, es decir, como las descritas en Allen y col., 1987.
Los modelos transgénicos (Smeyne y col., 1994) basados en la represión del gen TrkA, muestran un fenotipo letal en el plazo de 1-2 semanas desde el nacimiento, y por lo tanto no son adecuados para estudiar TrkA en el sistema nervioso adulto o maduro. Animales transgénicos que expresan anticuerpos se encuentran descritos por Piccioli y col., 1991, 1995.
El presente invento será descrito en relación con ejemplificar, pero no limitar, sus realizaciones. Se hará referencia a las siguientes Figuras.
Figura 1. Inhibición de la unión del 125I-NGF a células Balb/C 3T3 TrkA+. Los sobrenadantes de los hibridomas se preincubaron con células Balb/C 3T3 TrkA+, antes de la adición de 125I-NGF. El histograma presenta la inhibición de la unión específica NGF-célula producida por diferentes anticuerpos. La unión específica se evaluó restando de la unión total la obtenida en presencia de un exceso de NGF no marcado. Los valores presentados son la media de valores triplicados.
Figura 2. MNAC13 reconoce el dominio extracelular del receptor TrkA. Los receptores solubles TrkA y TrkB, construidos por ingeniería genética como inmunoadhesinas, se utilizaron como antígenos en fase sólida para un ensayo de ELISA y se incubaron con 2 ó 20 ng/ml del anticuerpo MNAC13 purificado.
Figura 3. MNAC13 reconoce el receptor TrkA sobre células vivas. Células Balb/C 3T3 o células Balb/C 3T3 TrkA+, se incubaron con el anticuerpo MNAC13 y se sometieron a un análisis de FAGS.
Figura 4. MNAC13 marca los receptores asociados a TrkA sobre neuronas del prosencéfalo basal de ratas. Secciones de la corona del prosencéfalo basal de ratas P10 se incubaron en presencia (A) o en ausencia (B) del anticuerpo MNAC13. Línea de escala: 98 !m.
Figura 5. MNAC13 inhibe la diferenciación de células PC12 de rata, inducida por NGF. Las células PC12 se transfirieron a un medio libre de suero y se incubaron en ausencia (A) o en presencia (B, C y D) de NGF en concentración de 20 ng/ml, durante aproximadamente 4 días. El anticuerpo MNAC13 (4 !g/ml) inhibe totalmente la supervivencia y diferenciación inducida por NGF, mientras que el anticuerpo de control 9E10 no las inhibe (D).
Figura 6. El implante de células secretoras de MNAC13 en cerebro de rata reduce significativamente el número de neuronas colinérgicas del prosencéfalo basal. El fenotipo colinérgico de neuronas del prosencéfalo basal de ratas P9 se determinó mediante inmunorreactividad con la colina-acetiltransferasa (ChAT), después del implante intraventricular de hibridomas secretores de MNAC13 (B), de células de mieloma de control (A), en el día P2. Nótese la notable reducción del número de neuronas positivas a ChAT en las ratas en las que se ha implantado el hibridoma secretor de MNAC13 (B). Línea de escala: 65 !m.
Figura 7. Formas recombinantes del mAB MNAC13 se unen a TrkA. Se utilizaron fagos con scFvMNAC13 (A), con scFvMNAC13 soluble (B) y con el anticuerpo monoclonal MNAC13 de origen (C) en un ensayo de ELISA, utilizando la inmunoadhesina TrkA como antígeno en fase sólida, en presencia de concentraciones crecientes de una inmunoadhesina TrkA soluble competidora. • : dilucion de diez veces del anticuerpo con respecto a ..
Figura 8. Inhibición del crecimiento de las neuritas de células PC12, inducido por NGF, producida por el anticuerpo recombinante ScFvMNAC13. La fracción periplásmica que contiene el ScFvMNAC13 (B) o el fragmento de control ScFv (antifox ScFv) se añadieron, junto con una concentración de 10 ng/ml de NGF, a células PC12 inducidas durante 7 días con una concentración de 50 ng/ml de NGF, y sembradas en placa de nuevo al comienzo del ensayo. El anticuerpo recombinante ScFvMNAC13 en B inhibe el nuevo crecimiento de neuritas en las células PC12 resembradas e inducidas con NGF, mediado por la activación de TrkA producida por NGF.
Protocolo de la inmunización
Células Balb/C 3T3 transfectadas, que expresan 106 moléculas de TrkA humana por célula, se utilizaron en un protocolo de inmunización congénica. Tres grupos de ratones Balb/C hembras se inmunizaron con 105, 5x105 y 106 células vivas por ratón, respectivamente. Después de cinco inyecciones a intervalos de dos semanas, los sueros prefusión se ensayaron con respecto a su capacidad para inhibir la unión del NGF al receptor TrkA sobre células Balb/C 3T3 TrkA+. La mayor inhibición de la unión del NGF se encontró en los sueros de ratones a los que se habían inyectado 5x105 células (inhibición de la unión con una dilución 1/100).
Producción de hibridomas
Tres días después de una inyección de refuerzo de células Balb/C 3T3 TrkA+, los ratones se sacrificaron, se extrajeron los bazos y los esplenocitos se fusionaron con un mieloma NSO (proporción 10:1) con polietilenglicol (PEG 1500), según la manera descrita (Novak y col., 1991). El crecimiento de los hibridomas y su selección se llevaron a cabo conforme a métodos estándar (Galfre y Milstein, 1981).
Inhibición de la unión de 125I a células Balb/C 3T3 TrkA+
Se purificó NGF 2,5 S a partir de glándulas submandibulares de ratones y se yodó hasta alcanzar una actividad específica del 105 cpm/ng según la manera descrita (Cattaneo y col., 1983). Una cantidad de 5x104 células Balb/C 3T3 TrkA+ se sembraron en cada uno de los pocillos de microplacas de 96 pocillos, en un volumen de 50 !l de medio de cultivo (DMEM con FCS al 10%). Partes alícuotas de 50 !l de sobrenadante de los hibridomas se incubaron durante 1 hora con las células, seguido de la adición de una disolución de 125I-NGF (5x104 cpm/pocillo). Las placas se procesaron según la manera descrita (Cattaneo y col., 1988). La unión inespecífica se determinó en pocillos paralelos, en presencia de un exceso (5 !g/ml) de NGF no marcado. En los pocillos paralelos, la unión se llevó a cabo en presencia de un sobrenadante de un hibridoma no relevante (Rab50) o de un anticuerpo neutralizador anti-NGF (mAB aD11, Cattaneo y col., 1988).
ELISA
Los receptores solubles TrkA y TrkB se construyeron por ingeniería genética como inmunoadhesinas (Charnow y Ashkenazi, 1996) uniendo el dominio extracelular del receptor TrkA humano con la porción Fc de IgG2, constituida por una secuencia de 35 aminoácidos, seguida de los dominios CH2 y CH3. Las secuencias de DNA que codifican las inmunoadhesinas TrkA y TrkB (TrkA-IgG y TrkB-IgG) se clonaron en baculovirus (virus de la polihedrosis nuclear de Autographa californica, AcNPV) para su expresión en células de insectos (kit de transfección Baculogold, Pharmigen Ing.) y las proteínas se purificaron por cromatografía en Sepharose-Proteína A a partir de medio de cultivo libre de suero, de células de insectos High Five. Para el ensayo de ELISA, TrkA-IgG y TrkB-IgG se incubaron en una concentración de 2 !g/ml y luego con 2 ó 20 ng/ml de MNAC13 e IgG anti-ratón, previamente preabsorbidos sobre inmunoglobulinas de camélidos).
Análisis de inmunofluorescencia
El anticuerpo monoclonal MNAC13 se purificó a partir de sobrenadantes de hibridomas libres de suero mediante cromatogarfía en Sepharose-Proteína A. Una cantidad de 5x104 células Balb/C 3T3 TrkA+ se incubaron con anticuerpo MNAC13 purificado y se analizaron en un clasificador de células activadas (FACS). Para determinar la inmunofluorescencia, las células adherentes se fijaron con paraformaldehído al 3,7% en PBS, se incubaron con MNAC13 purificado, y después con IgG anti-ratón marcada con FITC, y se analizaron por microscopía confocal (Olympus).
Ensayo biológico de NGF con células PC12
Células PC12 de rata (Greene y Tischler, 1976) se incubaron en RPMI con suero de caballo inactivado por calor al 10% y FCS al 5%. Para el ensayo biológico las células se transfirieron a medio libre de suero y se incubaron con una concentración de 20 ng/ml de NGF durante de 4 a 6 días, en presencia o ausencia de anticuerpos MNAC13 o de su versión Fv recombinante de cadena sencilla (scFvMNAC13). Como alternativa, las células se incubaron con una concentración de 50 ng/ml de NGF durante una semana y después se separaron mecánicamente las neuritas para resembrarlas en placa en presencia de una concentración de 10 ng/ml de NGF y la adición del anticuerpo apropiado. El crecimiento de neuritas se valoró 24-48 horas después.
Inyecciones intraventriculares del hibridoma e inmunoquímica
La inyección intraventricular del hibridoma y el análisis del fenotipo colinérgico de las neuronas del prosencéfalo basal se realizaron esencialmente según la manera descrita (Molnar y col., 1997 y 1998). Brevemente expuesto, células de hibridoma MNAC13 y células de mieloma de control (células P3X63Ag8) se resuspendieron en disolución de Hank (HBBS) a una densidad de 2x105 células/!l, y se inyectaron en el ventrículo lateral derecho de ratas Wistar según la manera descrita (Molnar y col., 1998). La inyección se llevó a cabo en el día 2 post-natal (P2) y los animales se sacrificaron para los análisis en el día P8. Después de una perfusión bajo anestesia los cerebros se procesaron para un estudio inmunohistoquímico con ChAT según la manera descrita (Molnar y col., 1997 y 1998). El nivel de anticuerpos MNAC13 en el fluido cerebroespinal se determinó mediante un ensayo de ELISA, utilizando receptores solubles TrkA como antígenos en fase sólida. Para el estudio inmunoquímico con MNAC13, los animales se anestesiaron con éter, y se perfundieron con PB (0,1 M, pH 7,4) y luego con paraformaldehído al 4% en PB, a 4ºC durante 2 horas. Después de la disección, los cerebros se fijaron en paraformaldehído al 4% en PB, a 4ºC durante 2 horas, se transfirieron a sacarosa al 25% en PBS, luego se congelaron en isopentano a -20ºC y se seccionaron con un criostato. Las secciones de la corona que contienen el prosencéfalo basal se recogieron sobre portaobjetos gelatinizados y se almacenaron a -20ºC hasta el momento de ser procesados. Después de bloquear la unión inespecífica en una disolución de FCS al 10%/BSA al 5% en Tris-HCl 0,1 M, pH 7,4, Tritón X-100 al 0,05%, las secciones se incubaron durante la noche a 4ºC con anticuerpo anti-TrkA (6 !g/ml) en FCS al 10%/BSA al 2% en Tris-HCl 0,1M, pH 7,4, Tritón X-100 al 0,05%. En los días siguientes, las secciones se incubaron con IgG anti-ratón biotinilada, durante 2 horas a temperatura ambiente y durante 1 hora en el kit ABC (Vector). La reacción se reveló en 3,3'-diaminobenzidina-HCl. Después de la deshidratación, las secciones se montaron en DPX.
Clonación de las regiones variables del mAb MNAC13
La clonación de las regiones variables del mAb MNAC13 se llevó a cabo a partir de mRNA del hibridoma mediante una PCR de las regiones variables. La PCR de las regiones variables se llevó a cabo con una colección de cebadores oligonucleotídicos correspondientes a inmunoglobulinas de ratón (Krebber y col., 1997). Las regiones variables VH y VK amplificadas se ensamblaron en un formato de scFv mediante PCR y se clonaron en un vector pDNA (Bradbury y col., 1996). Después de un análisis de determinación de la huella genética con la endonucleasa de restricción BstNI, que confirmó una diversidad limitada de los fragmentos scFv resultantes, las partículas fágicas que presentaban fragmentos scFv se sometieron a un ensayo de ELISA utilizando TrkA-IgG como antígeno en fase sólida. El ensayo se desarrolló con anticuerpos secundarios anti-M13 acoplados a HRP. Los fagos identificados positivamente se analizaron de nuevo y por último se utilizaron para producir fragmentos scFv solubles en E. coli. Los sobrenadantes bacterianos se ensayaron por ELISA frente a TrkA-IgG, utilizando un anticuerpo monoclonal dirigido contra una secuencia marcadora SV5 (Hanke y col., 1992) presente en el fragmento scFv, seguido de IgG anti-ratón conjugada con HRP.
RESULTADOS
Producción y caracterización de un anticuerpo monoclonal que inhibe la unión de NGF a TrkA
Con el fin de producir anticuerpos capaces de interferir con la actividad de unión a neurotrofinas del receptor TrkA, se utilizó un protocolo de inmunización congénica. Células Balb/C-3T3 que expresan el receptor TrkA humano, producidas mediante la transfección del proto-oncogén trk humano, se utilizaron para la inmunización de un ratón Balb/C. Se encontró que el número de células era crítico para la inducción de los anticuerpos séricos que neutralizan la unión del NGF a las células diana.
Los sobrenadantes de los hibridomas se sometieron a un análisis de su capacidad para inhibir la unión del 125I a células 3T3-TrkA+. Del total de 1.266 pocillos en los que el crecimiento de los hibridomas estaba teniendo lugar, solamente 4 mostraron una actividad de neutralización de NGF. Las células correspondientes se subclonaron obteniéndose los clones MNAC13, C30, C191 y C232. La capacidad de los anticuerpos producidos por estos clones para inhibir la unión del NGF a células 3T3-TrkA+ se muestra en la Figura 1. Estos anticuerpos anti-TrkA inhiben la unión del NGF tan eficientemente como el anticuerpo neutralizador aD11 anti-NGF (Figura 1). Mientras que este último anticuerpo se une al sitio activo de NGF, los primeros anticuerpos mencionados se unen al receptor TrkA, muy probablemente en el sitio de reconocimiento para NGF o cerca de él. El anticuerpo IgG MNAC13 se seleccionó para estudios posteriores.
La inhibición de la unión del NGF se obtiene mediante interacción directa de los anticuerpos con la porción extracelular del receptor TrkA, según se demuestra por medio de diversos estudios de unión realizados con una forma soluble del receptor TrkA humano, construido por ingeniería genética en forma de una inmunoadhesina (Chamow y Ashkenazi, 1996) en el que la porción extracelular del receptor está fusionada a los dominios FC de las inmunoglobulinas de camélidos (véase Métodos). La Figura 2 muestra que el anticuerpo MNAC13 se une a la inmunoadhesina TrkA en un ensayo de ELISA, mientras que no reacciona con la inmunoadhesina TrkB. Esto confirma que el anticuerpo MNAC13 se une específicamente a la porción extracelular de TrkA.
La Figura 3 muestra el resultado de un análisis de FACS realizado con células 3T3 TrkA+, que demuestra que el anticuerpo MNAC13 interacciona con el receptor humano expresado sobre la membrana de células vivas. Un análisis de inmunofluorescencia confirma este resultado.
La especificidad de especie de los anticuerpos MNAC13 se ensayó con respecto a su capacidad para reconocer receptores TrkA sobre neuronas de rata. Se tomaron secciones de cerebro de rata de la región del prosencéfalo basal (Figura 4) que es rica en neuronas positivas a TrkA. La intensa tinción obtenida en el prosencéfalo basal con el anticuerpo MNAC13 (Figura 4A) muestra que este anticuerpo, obtenido contra el receptor TrkA humano, reconoce también su análogo en rata. El anticuerpo no tiñe regiones cerebrales, tales como los núcleos habenulares mediales, que se sabe que carecen de neuronas positivas a TrkA (Holtzmann y col., 1995).
Bloqueo funcional de acciones biológicas mediadas por TrkA, producido por el anticuerpo MNAC13
La capacidad del anticuerpo MNAC13 para inhibir in vivo la activación biológica del receptor TrkA por acción del ligando NGF, se estudió por lo tanto en células PC12, tanto in vitro (Figura 5) como in vivo (Figura 6). La diferenciación de las células PC12 inducida por NGF (Figura 5B) se inhibe totalmente mediante la incubación de los cultivos con anticuerpo MNAC13 (Figura 5C) en comparación con la incubación con un anticuerpo no relevante (Figura 5D).
Las neuronas colinérgicas del prosencéfalo basal son dianas muy conocidas para la acción del NGF en el sistema nervioso central (Korsching, 1986; Holzmann y col., 1992). Las células de hibridoma que secretan el anticuerpo MNAC13 se implantaron en el ventrículo lateral de ratas recién nacidas dos días después de su nacimiento y el fenotipo colinérgico de las neuronas se estudió una semana más tarde mediante estudios inmunohistoquímicos con anticuerpos dirigidos contra colina-acetiltransferasa (ChAT). Esta estrategia experimental se ha utilizado recientemente para estudiar los efectos de células implantadas que secretan el anticuerpo monoclonal aD11 anti-NGF (Berardi y col., 1994; Molnar y col., 1997 y 1998). Una semana después del implante, el nivel de anticuerpos anti-TrkA encontrado en el fluido cerebroespinal, determinado por ELISA, fue de 1,4 ng/!l. Los resultados de la Figura 8 muestran que el número de células positivas a ChAT se reduce enormemente en los cerebros en los que se implantó el anticuerpo anti-TrkA con respecto a los controles (en los que se inyectó un mieloma no relevante). Una evaluación cuantitativa del número de las neuronas positivas a ChAT mostró que este número se reduce en el 70% en el tabique medial y en el 77% en la banda diagonal de las ratas en las que se implantó el anticuerpo MNAC13, con respecto a los controles. Una extensión de este estudio a diferentes edades postnatales, comparando los efectos obtenidos en un estudio previo, con un implante de células que secretan un anticuerpo neutralizador anti-NGF (Molnar y col., 1997, 1998), mostró que los efectos de privación del sistema colinérgico del prosencéfalo basal, obtenidos con el anticuerpo MNAC13 anti-TrkA, son mucho más importantes.
Aislamiento de una forma funcional recombinante del mAB MNAC13 con un tamaño significativamente reducido
Con el fin de expandir la variedad de la aplicación, las regiones variables de este anticuerpo se clonaron y se manipularon por ingeniería genética dando lugar a un anticuerpo recombinante de menor tamaño. La clonación de las regiones variables de anticuerpos monoclonales a partir del correspondiente hibridoma puede ser complicada, conduciendo a la clonación de regiones variables de artefacto. Por ello, el autor del invento utilizó la técnica según Winter y col., (1994). Las regiones variables de la cadena pesada (VH) y de la cadena ligera (VL) del anticuerpo MNAC13 se amplificaron por PCR a partir de un cDNA derivado del mRNA del hibridoma, utilizando cebadores oligonucleotídicos específicos de IgG de ratón. Las regiones variables se ensamblaron formando un fragmento Fv de cadena sencilla (scFv) mediante PCR y se clonaron en el vector pDAN para permitir la expresión de fragmentos de anticuerpo clonados, sobre la superficie del fago filamentoso. Los fragmentos scFv representan un derivado biotecnológico del anticuerpo de origen (Bird y col., 1988) y están constituidos por las regiones variables de la cadena ligera y de la cadena pesada unidas a un péptido enlazador que enlaza el extremo C-terminal de la región VL con el extremo N-terminal de la región VH. La secuencia de nucleótidos del fragmento específico ScMNAC13 se muestra en SEQ ID No. 1. La secuencia de aminoácidos se muestra en SEQ ID No. 2, en la que la región VL va desde el aa 23 hasta el aa 134, y la región VH va desde el aa 152 hasta el aa 276.
Las CDR (regiones determinantes de la complementaridad del anticuerpo) son tres para cada una de las cadenas, y en concreto son:
VL CDR1 aa 46-55 de SEQ ID. No. 2;
VL CDR2 aa 71-77 de SEQ ID. No. 2;
VL CDR3 aa 110-1.119 de SEQ ID. No. 2;
VH CDR1 aa 176-185 de SEQ ID. No. 2;
VH CDR2 aa 200-216 de SEQ ID. No. 2;
5 VH CDR3 aa 249-262 de SEQ ID. No. 2;
Las secuencias de las regiones variables de las cadenas ligera y pasada del anticuerpo MNAC13 se comparó con la del anticuerpo descrito en la solicitud de Patente, PCT n.º WO97/21732, según se muestra en las Tablas 1 y 2.
10 Tabla 1 Alineamiento de la cadena ligera de 5C3 y MNAC13
Tabla 2 Alineamiento de la cadena pesada de 5C3 y MNAC13
15 Los fragmentos ScFv ensamblados por PCR se expresaron en el fago filamentoso, en forma de una fusión con la proteína del fago p3. La minibiblioteca de partículas del fago se sometió a cribado con un ensayo de ELISA realizado con los fagos, utilizando la inmunoadhesina TrkA como antígeno en fase sólida. Esto condujo al aislamiento de los fagos positivos que expresan sobre su superficie la versión ScFv del anticuerpo MNAC13 de origen (scFvMNAC13). Las propiedades de unión de este fago, así como las del fragmento scFv soluble derivado de este fago, se
20 caracterizaron mediante un ensayo de competición de ELISA (Figura 7). La inmunoadhesina TrkA se acopló en la fase sólida y se incubó con las partículas del fago que expresan MNAC13 (Figura 7A), con el anticuerpo soluble ScFvMNAC13 (Figura 7B) o con el anticuerpo MNAC13 de origen (Figura 7C), en presencia de cantidades solubles de inmunoadhesina TrkA soluble competidora. Los resultados confirman que la versión ScFv del anticuerpo monoclonal de origen, ya sea la del fago o ya sea la secretada por E. coli, se une a TrkA igual de eficientemente que el anticuerpo monoclonal de origen.
La actividad biológica de ScFVMNAC13 se ensayó en células PC12. Las células se incubaron durante una semana con 50 ng/ml de NGF, pasada la cual se volvieron a sembrar en placa en presencia de NGF y del fragmento ScFVMNAC13 del anticuerpo. Como se muestra en la Figura 8, el fragmento ScFVMNAC13 inhibe radicalmente la extensión de las neuritas de las células PC12, confirmando que el fragmento Fv recombinante, de cadena sencilla, del anticuerpo MNAC13 conserva las propiedades de neutralización del anticuerpo de origen. El pequeño tamaño de este anticuerpo polipeptídico sencillo expande la variedad de aplicaciones del anticuerpo del invento, facilitando su suministro y expresión en el sistema nervioso.
Prueba de nocicepción
El anticuerpo MNAC13 se utilizó en una prueba de nocicepción para determinar la sensibilidad al dolor por medio de la "prueba de la placa caliente". Este experimento se llevó a cabo según McMahon y col., (1995), utilizando el anticuerpo MNAC13 como inmunoadhesina. El anticuerpo se infundió por vía subcutánea en una pata trasera de una rata adulta durante un período de tres semanas o por medio de una minibomba osmótica. La sensibilidad a la nocicepción se evaluó a intervalos utilizando la prueba de la placa caliente (Eddy y Leimbach, 1953), que simula situaciones de hiperalgesia después de una inflamación o un daño parcial en el nervio. El estímulo nociceptivo induce en este caso una respuesta (lamer la pata y/o saltar) que supone una coordinación integrada mayor que la de un simple reflejo. Según el ensayo, el animal se coloca en una jaula que contiene una placa calentada a la temperatura deseada como inicial, usualmente 56ºC. La latencia de cualquiera de las dos respuestas (lamer la pata y/o saltar) se mide en animales de control (tratados con un anticuerpo no relevante) y en los animales tratados con anticuerpo anti-TrkA. El resultado del experimento demostró la manifestación de una hipoalgesia notable, como lo indica un aumento significativo de la latencia en el grupo tratado con MNAC13.
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<212>PRT <213>anticuerpo ScFv humano <400>2
Claims (37)
- REIVINDICACIONES
- 1.
- Un anticuerpo monoclonal, y sus derivados sintéticos y biotecnológicos, capaz de reconocer y unirse al receptor de alta afinidad del NGF (factor de crecimiento nervioso), con actividad de tirosina-quinasa, denominado TrkA, y de actuar como antagonista de la unión del NGF a TrkA, en el que la región variable de la cadena ligera tiene esencialmente la secuencia que va desde el aa 23 hasta el aa 134 de SEQ ID No. 2.
-
- 2.
- Un anticuerpo monoclonal, y sus derivados sintéticos y biotecnológicos, capaz de reconocer y unirse al receptor de alta afinidad del NGF (factor de crecimiento nervioso), con actividad de tirosina-quinasa, denominado TrkA, y de actuar como antagonista de la unión del NGF a TrkA, en el que la región variable de la cadena pesada tiene esencialmente la secuencia que va desde el aa 152 hasta el aa 276 de SEQ ID No. 2.
-
- 3.
- Un anticuerpo monoclonal, y sus derivados sintéticos y biotecnológicos según cualquiera de las reivindicaciones previas, en el que la región variable de la cadena ligera tiene esencialmente la secuencia que va desde el aa 23 hasta el aa 134 de SEQ ID No. 2 y la región variable de la cadena pesada tiene esencialmente la secuencia que va desde el aa 152 hasta el aa 276 de SEQ ID No. 2.
-
- 4.
- Un fragmento ScFv de un anticuerpo monoclonal capaz de reconocer y unirse al receptor de alta afinidad del NGF (factor de crecimiento nervioso), con actividad de tirosina-quinasa, denominado TrkA, y de actuar como antagonista de la unión del NGF a TrkA, en el que dicho fragmento ScFv tiene esencialmente la secuencia de SEQ ID No. 2.
-
- 5.
- Un derivado sintético o biotecnológico de un anticuerpo monoclonal capaz de reconocer y unirse al receptor de alta afinidad del NGF (factor de crecimiento nervioso), con actividad de tirosina-quinasa, denominado TrkA, y de actuar como antagonista de la unión del NGF a TrkA, que comprende al menos una región determinante de la complementariedad (CDR) del anticuerpo y que es capaz de actuar como antagonista de la unión del NGF a TrkA, en el que dicha región determinante de la complementaridad (CDR) del anticuerpo y que es capaz de actuar como antagonista de la unión del NGF a TrkA, está dentro de la región variable de la cadena pesada que va desde el aa 152 hasta el aa 276 de SEQ ID No. 2.
-
- 6.
- Un ácido nucleico que codifica el anticuerpo o sus derivados según cualquiera de las reivindicaciones precedentes.
-
- 7.
- Un ácido nucleico según la reivindicación 6, que codifica el fragmento ScFv de SEQ ID No. 2.
-
- 8.
- Un ácido nucleico según la reivindicación 7, que tiene esencialmente la secuencia de SEQ ID No. 1.
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- 9.
- El uso de un ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 6-8, para la producción de animales transgénicos no humanos, preferiblemente ratones, en el que el anticuerpo o su derivado según las reivindicaciones 1-5, se expresa de un modo inducible o bajo el control de promotores que determinan la expresión en el animal adulto.
-
- 10.
- Un animal transgénico no humano que se transforma con un ácido nucleico según las reivindicaciones 6-8, expresándose dicho ácido nucleico de un modo inducible o bajo el control de promotores que determinan la expresión en el animal adulto.
-
- 11.
- Un fago o un vector procariótico recombinante que comprende y es capaz de expresar de manera correcta y efectiva el ácido nucleico según una cualquiera de las reivindicaciones 6-8.
-
- 12.
- Un vector eucariótico recombinante que comprende y es capaz de expresar de manera correcta y efectiva el ácido nucleico según una cualquiera de las reivindicaciones 6-8.
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- 13.
- Una composición farmacológica que comprende una cantidad efectiva del vector según la reivindicación 12 y un excipiente farmacéuticamente aceptable, para la terapia génica de patologías neurológicas comprendidas dentro del siguiente grupo: dolor crónico, dolor agudo, neuromas, tumores neoplásicos que expresan TrkA.
-
- 14.
- Una composición farmacológica que comprende una cantidad efectiva del anticuerpo monoclonal o de sus derivados sintéticos o biotecnológicos según cualquiera de las reivindicaciones 1-5, capaz de reconocer y unirse al receptor de alta afinidad del NGF (factor de crecimiento nervioso), con actividad de tirosina-quinasa, denominado TrkA, y de actuar como antagonista de la unión del NGF a TrkA, y un excipiente farmacéuticamente aceptable.
-
- 15.
- Una composición farmacológica según la reivindicación 14, para el tratamiento de patologías neurológicas comprendidas dentro del siguiente grupo: dolor crónico, dolor agudo, neuromas, tumores neoplásicos que expresan TrkA.
-
- 16.
- Una composición farmacéutica que comprende cantidades farmacéuticamente activas de NGF y del anticuerpo o de sus derivados según cualquiera de las reivindicaciones 1-5.
-
- 17.
- Células eucarióticas manipuladas por ingeniería genética, capaces de expresar el anticuerpo o sus derivados según una cualquiera de las reivindicaciones 1-5.
-
- 18.
- Una composición farmacológica que comprende células según la reivindicación 17, y un excipiente farmacéuticamente aceptable, para la terapia génica de patologías neurológicas comprendidas dentro del siguiente grupo: dolor crónico, dolor agudo, neuromas, tumores neoplásicos que expresan TrkA.
-
- 19.
- Una composición que comprende una cantidad efectiva del anticuerpo monoclonal o de sus derivados sintéticos
o biotecnológicos según cualquiera de las reivindicaciones 1-5, capaz de reconocer y unirse al receptor de alta afinidad del NGF (factor de crecimiento nervioso), con actividad de tirosina-quinasa, denominado TrkA, y de actuar como antagonista de la unión del NGF a TrkA, y un excipiente diagnósticamente aceptable para usar en pruebas diagnósticas in vivo de "formación de imágenes". -
- 20.
- Un anticuerpo monoclonal, y sus derivados sintéticos y biotecnológicos, capaz de reconocer y unirse al receptor de alta afinidad del NGF (factor de crecimiento nervioso), con actividad de tirosina-quinasa, denominado TrkA, y de actuar como antagonista de la unión del NGF a TrkA, y que impide la activación funcional de TrkA por NGF, y caracterizado por al menos una CDR seleccionada de entre: CDRs de cadena ligera definidas por los aa 46-55 de SEQ ID No 2, aa 71-77 de SEQ ID No 2 y aa 110-119 de SEQ ID No 2 y CDRs de cadena pesada definidas por los aa 176-185 de SEQ ID No 2, aa 200-216 de SEQ ID No 2 y aa 249-262 de SEQ ID No 2.
-
- 21.
- Un fragmento ScFv del anticuerpo monoclonal según la reivindicación 20, que comprende al menos una región de la cadena ligera o de la cadena pesda del anticuerpo descrito en la reivindicación 20.
-
- 22.
- El fragmento ScFv según la reivindicación 21, que comprende la región variable de la cadena ligera y de la cadena pesada del anticuerpo descrito en la reivindicación 20.
-
- 23.
- El fragmento ScFv según la reivindicación 22, que comprende una secuencia de conexión entre la región variable de la cadena ligera y la región variable de la cadena pesada.
-
- 24.
- Un derivado sintético o biotecnológico según la reivindicación 20, que comprende al menos una región determinante de la complementariedad (CDR) del anticuerpo y que es capaz de actuar como antagonista de la unión del NGF a TrkA.
-
- 25.
- Un ácido nucleico que codifica el anticuerpo o sus derivados según cualquiera de las reivindicaciones 20-24.
-
- 26.
- El uso de un ácido nucleico según la reivindicación 25, para la producción de animales transgénicos no humanos, preferiblemente ratones, en el que el anticuerpo o su derivado según las reivindicaciones 20-24 se expresa de un modo inducible o bajo el control de promotores que determinan la expresión en el animal adulto.
-
- 27.
- Un animal transgénico no humano que se transforma con un ácido nucleico según la reivindicación 25, expresándose dicho ácido nucleico de un modo inducible o bajo el control de promotores que determinan la expresión en el animal adulto.
-
- 28.
- Un fago o un vector procariótico recombinante que comprende y es capaz de expresar de manera correcta y efectiva el ácido nucleico según la reivindicación 25.
-
- 29.
- Un vector eucariótico recombinante que comprende y es capaz de expresar de manera correcta y efectiva el ácido nucleico según la reivindicación 25.
-
- 30.
- Una composición farmacológica que comprende una cantidad efectiva del vector según la reivindicación 29 y un excipiente farmacéuticamente aceptable, para la terapia génica de patologías neurológicas comprendidas dentro del siguiente grupo: dolor crónico, dolor agudo, neuromas, tumores neoplásicos que expresan TrkA.
-
- 31.
- Una composición farmacológica que comprende una cantidad efectiva del anticuerpo monoclonal o de sus derivados sintéticos o biotecnológicos según cualquiera de las reivindicaciones 20-24, capaz de reconocer y unirse al receptor de alta afinidad del NGF (factor de crecimiento nervioso), con actividad de tirosina-quinasa, denominado TrkA, y de actuar como antagonista de la unión del NGF a TrkA, y un excipiente farmacéuticamente aceptable.
-
- 32.
- Una composición farmacológica según la reivindicación 31, para el tratamiento de patologías neurológicas comprendidas dentro del siguiente grupo: dolor crónico, dolor agudo, neuromas, tumores neoplásicos que expresan TrkA.
-
- 33.
- Una composición farmacéutica que comprende cantidades farmacéuticamente activas de NGF y del anticuerpo o de sus derivados según cualquiera de las reivindicaciones 20-24.
-
- 34.
- Células eucarióticas manipuladas por ingeniería genética, capaces de expresar el anticuerpo o sus derivados según una cualquiera de las reivindicaciones 20-24.
-
- 35.
- Una composición farmacológica que comprende células según la reivindicación 34, y un excipiente
farmacéuticamente aceptable, para la terapia génica de patologías neurológicas comprendidas dentro del siguiente 5 grupo: dolor crónico, dolor agudo, neuromas, tumores neoplásicos que expresan TrkA. - 36. Una composición que comprende una cantidad efectiva del anticuerpo monoclonal o de sus derivados sintéticoso biotecnológicos según cualquiera de las reivindicaciones 20-24, capaz de reconocer y unirse al receptor de alta afinidad del NGF (factor de crecimiento nervioso), con actividad de tirosina-quinasa, denominado TrkA, y de actuar como antagonista de la unión del NGF a TrkA, y un excipiente diagnósticamente aceptable para usar en pruebas10 diagnósticas in vivo de "formación de imágenes".
- 37. Uso de un anticuerpo monoclonal, y de sus derivados sintéticos y biotecnológicos, capaz de reconocer y unirse al receptor de alta afinidad del NGF (factor de crecimiento nervioso), con actividad de tirosina-quinasa, denominado TrkA, y de actuar como antagonista de la unión del NGF a TrkA, y que impide la activación funcional de TrkA por NGF, para la fabricación de una composición farmacológica para el tratamiento de patologías neurológicas15 comprendidas dentro del siguiente grupo: dolor crónico y dolor agudo.
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