ES2481165T3 - Anticuerpos inhibidores de GDF-8 y usos de los mismos - Google Patents

Abstract

Un anticuerpo monoclonal aislado que se une específicamente a los aminoácidos 1 a 50 de SEC ID Nº: 15, en el que el anticuerpo reduce la actividad de GDF-8 asociada con la regulación negativa de la masa muscular esquelética.

Description

Anticuerpos inhibidores de GDF-8 y usos de los mismos

La presente solicitud reivindica prioridad respecto a la solicitud provisional de Patente de los Estados Unidos con Nº de Serie 60/324.528, presentada el 26 de septiembre de 2001.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a inhibidores del Factor de Diferenciación del Crecimiento 8 (GDF-8) proteínas y procedimientos de uso para dichos inhibidores. Más particularmente, la invención proporciona anticuerpos novedosos y fragmentos de anticuerpo que son específicamente reactivos con proteínas GDF-8 in vivo e in vitro. La invención es particularmente útil para diagnosticar, prevenir, o tratar trastornos de seres humanos o animales en los que sería terapéuticamente beneficioso un aumento en el tejido muscular. Los trastornos ejemplares incluyen trastornos neuromusculares (por ejemplo, distrofia muscular y atrofia muscular), enfermedad pulmonar obstructiva congestiva, síndrome de pérdida de masa muscular, sarcopenia, y caquexia; trastornos del tejido adiposo (por ejemplo, obesidad); diabetes tipo 2; y enfermedad degenerativa del hueso (por ejemplo, osteoporosis).

Antecedentes de la invención

El Factor de Crecimiento y Diferenciación 8 (GDF-8), también conocido como miostatina, es un miembro de la superfamilia del Factor de Crecimiento Transformante-beta (TGF-) de factores de crecimiento relacionados estructuralmente, todos los cuales poseen propiedades morfogenéticas y reguladoras del crecimiento fisiológicamente importantes (Kingsley y col. (1994) Genes Dev., 8: 133-46; Hoodless y col. (1998) Curr. Topics Microbiol. Immunol., 228: 235-72). GDF-8 es un regulador negativo de la masa muscular esquelética, y hay un interés considerable en identificar factores que regulan su actividad biológica. Por ejemplo, GDF-8 se encuentra altamente expresado en el músculo esquelético adulto y en desarrollo. La mutación nula en GDF-8 en ratones transgénicos se caracteriza por una hipertrofia e hiperplasia marcada en el músculo esquelético (McPherron y col. (1997) Nature, 387: 83-90). Son evidentes aumentos similares en la masa muscular esquelética en mutaciones naturales de GDF-8 en ganado bovino (Ashmore y col. (1974) Growth, 38: 501-507; Swatland y Kieffer (1994) J. Anim. Sci., 38: 752-757; McPherron y Lee (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94: 124557-12461; y Kambadur y col. (1997) Genome Res., 7: 910-915).Ya que el GDF-8 se expresa tanto en músculos adultos y en desarrollo, no está claro si regula la masa muscular durante el desarrollo o en adultos. Por lo tanto, la cuestión de si regula o no la masa muscular en adultos es importante desde una perspectiva terapéutica y científica. Los estudios recientes también han mostrado que la pérdida de masa muscular asociada con infección por VIH en seres humanos se acompaña de aumentos en la expresión de la proteína GDF-8 (González-Cadavid y col. (1998) PNAS, 95: 14938-43). Además, GDF-8 puede modular la producción de enzimas específicas del músculo (por ejemplo, creatinin quinasa) y modula la proliferación celular de mioblastos (documento WO 00/43781).

El documento WO98/33887 divulga un ratón transgénico knockout en GDF-8 y muestra que el ratón transgénico tiene tejido muscular aumentado. El documento WO98/33887 también divulga anticuerpos policlonales dirigidos a GDF-8 murina.

Un número de trastornos en seres humanos y animales se asocian con una pérdida o un impedimento funcional del tejido muscular, que incluye distrofia muscular, atrofia muscular, enfermedad pulmonar obstructiva congestiva, síndrome de pérdida de masa muscular, sarcopenia, y caquexia. Hasta la fecha, existen muy pocas terapias efectivas o fiables para estos trastornos. Sin embargo, los terribles síntomas asociados con estos trastornos pueden reducirse sustancialmente empleando terapias que aumenten la cantidad de tejido muscular en pacientes que padecen los trastornos. Aunque no curan las afecciones, dichas terapias podrían mejorar significativamente la calidad de vida para estos pacientes y podrían aliviar algunos de los efectos de estas enfermedades. Por tanto, existe una necesidad en la técnica para identificar nuevas terapias que puedan contribuir a un aumento general del tejido muscular en pacientes que padecen estos trastornos.

Además de sus propiedades morfogenéticas y reguladoras del crecimiento en el músculo esquelético, GDF-8 puede también estar involucrado en un número de otros procesos fisiológicos, incluyendo homeostasis de la glucosa en el desarrollo de la diabetes de tipo 2 y trastornos del tejido adiposo, como la obesidad. Por ejemplo, GDF-8 modula la diferenciación de preadipocitos a adipocitos (Kim y col. (2001) BBRC, 281: 902-906).

También hay un número de afecciones asociadas con una pérdida de hueso, incluyendo osteoporosis, especialmente en las mujeres ancianas y/o postmenopáusicas. Las terapias actualmente disponibles para estas afecciones funcionan inhibiendo la resorción ósea. Sería deseable como alternativa a o además de estas terapias una terapia que promueva la formación de nuevo hueso.

Al igual que TGF--1, -2, y -3, la proteína GDF-8 se sintetiza como una proteína precursora que consiste en un propéptido amino terminal y un dominio maduro carboxilo terminal (McPherron y Lee, (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94: 12457-12461). Antes de la escisión, la proteína GDF-8 precursora forma un homodímero. A continuación el propéptido amino terminal se escinde del dominio maduro. El propéptido escindido puede permanecer unido no covalentemente al dímero de dominio maduro, inactivando su actividad biológica (Miyazono y col. (1988) J. Biol.

Chem., 263: 6407-6415; Wakefield y col. (1988) J. Biol. Chem., 263: 7646-7654; y Brown y col. (1990) Growth Factors, 3: 35-43). Se cree que dos propéptidos de GDF-8 se unen al dímero maduro de GDF-8 (Thies y col. (2001) Growth Factors, 18: 251-259). Debido a su propiedad inactivante, el propéptido se conoce como el “péptido asociado a la latencia” (LAP), y el complejo de dominio maduro y propéptido se cita comúnmente como el “complejo latente pequeño” (Gentry y Nash (1990) Biochemistry, 29: 6851-6857; Derynck y col. (1995) Nature, 316: 701-705; y Massague (1990) Ann. Rev. Cell Biol., 12: 597-641). También se sabe que otras proteínas se unen a GDF-8 o proteínas relacionadas estructuralmente e inhiben su actividad biológica. Dichas proteínas inhibidoras incluyen folistatina, y potencialmente, proteínas relacionadas con folistatina (Gamer y col. (1999) Dev. Biol., 208: 222-232). Se cree que el dominio maduro es activo como homodímero cuando se elimina el propéptido.

GDF-8 se encuentra elevadamente conservada en secuencia y función entre las distintas especies. La secuencia de aminoácidos de GDF-8 murina y humana es idéntica, al igual que el patrón de expresión de ARNm (McPherron y col. (1997) Nature 387: 83-90; González-Cadavid y col. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 14938-14943). Esta conservación de secuencia y función sugiere que la inhibición de GDF-8 en seres humanos es probable que tenga un efecto similar que la inhibición de GDF-8 en ratones.

GDF-8 se encuentra involucrada en la regulación de varios procesos biológicos críticos. Debido a su función clave en estos procesos, GDF-8 puede ser una diana deseable para intervención terapéutica. En particular, pueden emplearse agentes terapéuticos que inhiben la actividad de GDF-8 para tratar trastornos en seres humanos o animales en los que un aumento en el tejido muscular sería terapéuticamente beneficioso, en particular trastornos del tejido muscular y adiposo, enfermedades degenerativas del hueso, trastornos neuromusculares y diabetes como se discutió anteriormente.

Sumario de la invención

La presente invención proporciona inhibidores de proteínas novedosos que comprenden anticuerpos y fragmentos de anticuerpo que son reactivos específicamente con una proteína GDF-8 madura, tanto si se encuentra en forma monomérica, forma dimérica activa, o en complejo dentro del complejo latente de GDF-8. En una realización de la invención, los anticuerpos se unen a un epítopo sobre la proteína GDF-8 madura, que da como resultado una reducción de una o más de las actividades biológicas asociadas con GDF-8, en relación a una proteína GDF-8 madura que no está unida al mismo anticuerpo. En una realización de la invención, los anticuerpos divulgados en el presente documento reducen la actividad de GDF-8 asociada a la regulación negativa de la masa del músculo esquelético y/o densidad ósea.

Los anticuerpos divulgados en el presente documento poseen propiedades biológicas únicas e inesperadas. Por ejemplo, un experto en la técnica podría típicamente esperarse que buenos anticuerpos neutralizantes se uniesen fuertemente a la proteína GDF-8 activa in vitro, formando un complejo inhibidor estable con la proteína. Se esperará normalmente que un anticuerpo neutralizante también llamado un anticuerpo inhibidor, que tiene una elevada afinidad por una proteína particular, proporcione niveles mayores de neutralización en relación a un anticuerpo de menor afinidad a la misma proteína. Sin embargo, de forma inesperada, los presentes inventores han descubierto anticuerpos que únicamente se unen débilmente a y neutralizan la proteína GDF-8 activa in vitro, aunque son efectivos in vivo. El descubrimiento de dichos anticuerpos condujo, por su parte, a la identificación de un sitio específico en GDF-8 al que se unen los anticuerpos. Por lo tanto puede esperarse que cualquier anticuerpo que se una específicamente al sitio identificado posea de manera similar propiedades neutralizantes in vivo.

Además, los anticuerpos divulgados en el presente documento poseen propiedades únicas e inesperadas. Por ejemplo, los anticuerpos no solo reconocen a la proteína GDF-8 madura en sus formas monomérica y dimérica, sino que también reconocen el complejo latente de GDF-8 intacto.

Los anticuerpos divulgados en el presente documento pueden administrarse en una dosis terapéuticamente efectiva para tratar o prevenir afecciones médicas en las que un aumento en la masa de tejido muscular o densidad ósea puede ser terapéuticamente beneficioso. Las enfermedades y trastornos que pueden tratarse mediante estos anticuerpos de GDF-8 incluyen trastornos musculares o neuromusculares como distrofia muscular, atrofia muscular, enfermedad pulmonar obstructiva congestiva, síndrome de pérdida de masa muscular, sarcopenia y caquexia; trastornos del tejido adiposo como obesidad; trastornos metabólicos como diabetes tipo 2, tolerancia a la glucosa impedida, síndromes metabólicos (por ejemplo, síndrome X), resistencia a la insulina inducida por traumatismo (por ejemplo, quemaduras); y enfermedades degenerativas del hueso como osteoporosis, especialmente en las mujeres ancianas y/o postmenopáusicas. Los trastornos y enfermedades metabólicas del hueso adicionales susceptibles de tratamiento con estos anticuerpos de GDF-8 incluyen baja masa ósea debido a terapia crónica con glucocorticoides, fallo gonadal prematuro, supresión andrógena, deficiencia de vitamina D, hiperparatiroidismo secundario, deficiencias nutricionales, y anorexia nerviosa.

Además, los anticuerpos divulgados en el presente documento pueden emplearse como herramienta diagnóstica para detectar cuantitativamente o cualitativamente la proteína GDF-8 madura o fragmentos de la misma, independientemente de si se encuentra en su forma monomérica, forma dimérica activa, o en complejo en el complejo latente de GDF-8. Por ejemplo, los anticuerpos pueden emplearse para detectar cuantitativamente o cualitativamente la proteína GDF-8 madura en una célula, fluido corporal, tejido, o un órgano. La presencia o

cantidad de proteína GDF-8 madura detectada está por tanto correlacionada con una o más de las afecciones médicas listadas anteriormente.

Los anticuerpos divulgados en el presente documento pueden proporcionarse en un kit diagnóstico. El kit puede contener otros componentes que ayuden a la detección de la proteína GDF-8 madura, y ayuden a correlacionar los resultados con una o más de las afecciones médicas descritas anteriormente.

Breve descripción de las secuencias

SEC ID Nº

Figuras (si es aplicable) Descripción

1

Figura 16 Secuencia de AA de la región variable de la cadena pesada de JA-16

2, 3, 5, 8

Sitios de unión del anticuerpo en la proteína

4

Secuencia de ADN para GDF-8 (nº de acceso xm 030768)

6

Secuencia de ácido nucleico que codifica SEC ID Nº: 1

7

Secuencia de ADN para BMP-11 (nº de acceso xm_049170)

9

Péptido B1, derivado de BMP-11

10

Péptido G1, derivado de GDF-8

11-13, 65, 105, 114,129

Figura 1 Péptidos sintéticos derivado de SEC ID Nº: 14

14

Una secuencia mutada de cisteína a serina de GDF-8 madura.

15

Figura 3 Secuencia de AA de GDF-8 madura

16

Figura 3 Secuencia de AA de BMP-11

18

Región del epítopo de JA-16 de GDF-8

17-64

Figura 6A Péptidos 13-mer superpuestos correspondientes a porciones de la secuencia de GDF-8

65

Péptido N-terminal biotinilado derivado de GDF-8

66-104, 106113,115-128

Versiones mutadas de SEC ID Nº: 18

130

Secuencia de AA del propéptido de GDF-8 (nº de acceso xp 030768)

131

Secuencia de AA del propéptido de BMP-11 (nº de acceso xp 049170)

Breve descripción de las Figuras

La Figura 1 muestra los péptidos sintéticos de GDF-8 (SEC ID Nº: 11-13, 65, 105, 114, y 129, todas derivadas de 10 SEC ID Nº: 14) empleados para caracterizar la especificidad de unión de JA-16. Los aminoácidos subrayados indican las posiciones donde las cisteínas nativas se han reemplazado con serinas.

La Figura 2 muestra la unión de JA-16 a los péptidos sintéticos de GDF-8.

15 La Figura 3 indica las diferencias en las secuencias de aminoácidos de GDF-8 madura (SEC ID Nº: 15) y BMP11 (SEC ID Nº: 16).

La Figura 4 muestra una comparación de las características de unión de JA-16 al péptido G1 (SEC ID Nº: 10, un péptido derivado de GDF-8) conjugado a albúmina de suero bovino (BSA) y péptido B1 (SEC ID Nº: 9, un péptido 20 derivado de BMP-11) conjugado a BSA.

La Figura 5 muestra una comparación de las características de unión de JA-16 a G1-BSA (SEC ID Nº: 10) después de que JA-16 se preincube con G1, B1, GDF-8, o BMP-11.

25 Las Figuras 6A y B muestran los estudios de mapeo de unión de JA-16 empleando secuencias de péptido sintético 13-mer superpuesto de GDF-8.

Las Figuras 7A y B muestran los resultados de un análisis de sustitución y deleción de la región del epítopo de JA-16 de GDF-8, Gly-Leu-Asp-Ser-Asp-Glu-His-Ser-Thr-Glu-Ser-Arg-Ser (SEC ID N: 18), empleando síntesis in 30 situ.

La Figura 8 muestra la unión de GDF-8 biotinilada al receptor ActRIIB.

Las Figuras 9A y 9B muestran la inhibición de la unión de GDF-8 biotinilada al receptor ActRIIB en presencia y ausencia de JA-16.

La Figura 10 muestra un ensayo de gen indicador que evalúa el efecto neutralizante de JA-16 sobre la actividad de GDF-8 in vitro.

La Figura 11 muestra el efecto in vivo de JA-16 en ratones durante un estudio de 4 semanas. Se trataron ratones hembra BALB/c de siete semanas durante cuatro semanas con JA-16 mediante inyección intraperitoneal a 50 mg/kg dos veces a la semana. La gráfica a la izquierda muestra el cambio en la masa magra y grasa durante el periodo de tratamiento medido con análisis de dexascan (rayos x de energía dual). El gráfico a la derecha muestra la masa de tejidos diseccionados. Se indica mediante un asterisco una diferencia estadísticamente significativa, p<0,01 para un test de Student.

La Figura 12 muestra el efecto in vivo de JA-16 en la masa corporal total de ratones durante un estudio de 14 semanas. Los ratones macho C57BL usados en este estudio eran o bien de tipo silvestre en el locus de agutí (a)

o portaban la mutación amarilla letal (Ay) en ese locus. La mutación Ay causa un desarrollo de obesidad y diabetes en adultos. Los ratones jóvenes adultos se trataron con inyecciones intraperitoneales semanales de 60 mg/kg de JA-16 o anticuerpo control. Además, al comienzo del período de tratamiento, los ratones se cargaron con 60 mg/kg intraperitonealmente y 10 mg/kg por vía intravenosa del mismo anticuerpo. Estos gráficos muestran el peso corporal semanal para cada grupo de ratones. Las barras de error muestran el error estándar de la media para cada punto de datos.

La Figura 13 muestra el efecto in vivo de JA-16 en la masa muscular total en ratones durante un estudio de 14 semanas. Al final del estudio, se diseccionaron y pesaron los músculos. Estos gráficos muestran la masa muscular media para cada grupo de ratones. Se indica mediante un asterisco una diferencia estadística significativa, p<0,01 para un test de Student.

La Figura 14 muestra el efecto in vivo de JA-16 en la masa grasa total en ratones durante un estudio de 14 semanas. Al final del estudio se diseccionaron y pesaron los panículos adiposos. Estos gráficos muestran la masa media de panículos adiposos para cada grupo de ratones.

La Figura 15 muestra el efecto in vivo de JA-16 en los niveles de glucosa en sangre en ratones durante un estudio de 14 semanas. Después de 12 semanas de tratamiento, los ratones de C57BL-Ay/a se sometieron a ayuno durante una noche y se midió su glucosa en sangre.

La Figura 16 muestra la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada de JA-16 (SEC ID Nº: 1). Las regiones determinantes de complementariedad (CDR) están subrayadas. La secuencia de ácido nucleico correspondiente se proporciona en SEC ID Nº: 6.

La Figura 17 muestra una comparación in vivo de Myo-19 y JA-16. Se trataron ratones hembra C57B6/scid de siete semanas durante cinco semanas con JA-16, Myo-19, o vehículo mediante inyección intraperitoneal. Al final del estudio, se diseccionaron y pesaron los músculos. Los gráficos muestran la masa muscular media para cada grupo de ratones. Se indica mediante un asterisco una diferencia estadística significativa, p<0,01 para un estudio de t de Student.

La Figura 18 muestra los resultados de la inmunoprecipitación de GDF-8 con JA-16 y Myo-19.

Las Figuras 19A y 19B muestran los resultados del tratamiento de JA-16 en ratones hembra BALB/c durante ocho semanas. Los ratones tenían 21 meses o 4 meses de edad al final del estudio. (19A) Masa del cuádriceps diseccionado para ratones tratados con JA-16 y ratones tratados con el vehículo al final del estudio. (19B) Fuerza de miembro anterior determinada mediante un ensayo de agarre para ratones tratados con JA-16 y ratones tratados con vehículo después de siete semanas de tratamiento. Cada barra o punto de datos indica el valor medio para el grupo indicado  el error estándar; (**) indica que p < 0,01 para el estudio de t de Student comparando el grupo de JA-16 con el grupo de vehículo; n = 8 para cada grupo.

Las Figuras 20A-20D muestran los resultados del tratamiento con JA-16 en ratones mdx. (20A) Los ratones tratados con JA-16 tenían un peso de EDL significativamente aumentado, en comparación con los controles de mdx (19,72  50 vs. 14,63  0,69 mg; n=12; p<0,0001). (20B) Los ratones tratados con JA-16 tenían una relación de masa muscular a peso corporal significativamente aumentada (peso de EDL / peso corporal) comparado con los controles (0,6  0,02 vs. 0,5  0,02; n=12; p<0,014). (20C) Los ratones tratados con JA-16 generaron una fuerza significativamente mayor durante la contracción muscular isométrica en comparación con los controles (177,32  8,37 vs. 132,38  12,45 mN; n=12; p<0,03). (20D) Los ratones tratados con JA-16 generaron una fuerza significativamente mayor durante la contracción tetánica isométrica en comparación con los controles

(491,23  16,34 vs. 370,74  19,21 mN; n=12; p<0,003).

Definiciones

El término “anticuerpo” se refiere a uno o más anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales, composiciones de anticuerpos, anticuerpos que tienen mono o poli-especificidad, anticuerpos humanizados, anticuerpos de cadena sencilla, anticuerpos quiméricos, anticuerpos injertados a CDR, fragmentos de anticuerpo como Fab, F(ab’)2, Fv, y otros fragmentos de anticuerpo que mantienen la función de unión al antígeno del anticuerpo parental.

La expresión “anticuerpos quiméricos” se refiere a moléculas en las que una porción de la cadena pesada y/o ligera es idéntica u homóloga a las secuencias correspondientes para una especie en particular (o que pertenecen a una clase o subclase particular de anticuerpo), mientras que la parte restante de la cadena o cadenas es idéntica u homóloga a las secuencias correspondientes derivadas de especies diferentes (o que pertenecen a una clase o subclase diferente de anticuerpo). Dichos anticuerpos quiméricos se describen por Morrison, y col. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 6851-6855.

El término “epítopo” se refiere a una molécula o porción de una molécula que es capaz de reaccionar específicamente con un anticuerpo monoclonal anti-GDF-8. Los epítopos pueden comprender proteínas, fragmentos de proteínas, péptidos, carbohidratos, lípidos, u otras moléculas, pero son más frecuentemente proteínas, oligopéptidos cortos, o combinaciones de los mismos.

Las expresiones “polipéptido de GDF” y “proteína de GDF” se refieren generalmente a cualesquiera factores de crecimiento y de diferenciación que están relacionados estructural o funcionalmente con GDF-8.

La expresión “inhibidor de GDF” incluye cualquier agente capaz de inhibir la actividad, expresión, procesamiento o secreción de una proteína GDF. Dichos inhibidores incluyen proteínas, anticuerpos, péptidos, peptidomiméticos, ribozimas, oligonucleótidos antisentido, ARN bicatenario y otras moléculas pequeñas que inhiben específicamente las proteínas GDF.

Los términos “GDF-8” o “proteína GDF-8” se refieren a un factor específico de crecimiento y diferenciación. Los términos incluyen la forma de precursor sin procesar de longitud completa de la proteína, así como las formas madura y de propéptido que son el resultado de la escisión postraduccional. Los términos también se refieren a cualquier fragmento de GDF-8 que mantienen las actividades biológicas conocidas asociadas con la proteína, como se discute en el presente documento, incluyendo secuencias que se han modificado con cambios conservativos o no conservativos a la secuencia de aminoácidos.

Estas moléculas del GDF-8 pueden derivarse de cualquier fuente, natural o sintética. La forma humana de la proteína GDF-8 madura se proporciona en SEC ID Nº: 15. Sin embargo, la presente invención también engloba moléculas de GDF-8 de todas las otras fuentes, incluyendo GDF-8 de bovino, pollo, murino, de rata, porcino, ovino, pavo, babuino y pez. Estas diversas moléculas de GDF-8 se han descrito en McPherron y col. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94: 12457-12461.

La expresión “GDF-8 madura” se refiere a la proteína que se escinde del dominio carboxilo terminal de la proteína precursora de GDF-8. GDF-8 maduro puede estar presente como un monómero, homodímero, o como un complejo latente de GDF-8. Dependiendo de las condiciones in vivo o in vitro, puede existir un equilibrio entre cualquiera o todas estas diferentes formas. Se cree que GDF-8 es biológicamente activo como homodímero. En su forma biológicamente activa, GDF-8 maduro también se cita como “GDF-8 activo”.

La expresión “propéptido de GDF-8” se refiere al polipéptido que se escinde del dominio amino terminal de la proteína precursora de GDF-8. El propéptido de GDF-8 es capaz de unirse al dominio de unión al propéptido en GDF-8 maduro.

La expresión “complejo latente de GDF-8” se refiere al complejo de proteínas formado entre el homodímero de GDF-8 maduro y el propéptido de GDF-8. Se cree que dos propéptidos de GDF-8 se asocian con un homodímero de GDF-8 para formar un complejo tetramérico inactivo. El complejo latente puede incluir otros inhibidores de GDF-8 en lugar de o además de uno o más propéptidos de GDF-8.

La expresión “inhibidor de GDF-8” incluye cualquier agente capaz de inhibir la actividad, expresión, procesamiento, o secreción de proteína GDF-8. Dichos inhibidores incluyen proteínas, anticuerpos, péptidos, peptidomiméticos, ribozimas, oligonucleótidos anti sentido, ARN bicatenario, y otras moléculas pequeñas que inhiben específicamente la actividad de la proteína GDF-8. Se dice que dichos inhibidores “neutralizan” o “reducen” la actividad biológica de la proteína GDF-8.

La expresión “actividad de GDF-8” se refiere a una o más actividades morfogenéticas o reguladoras del crecimiento asociadas con la proteína GDF-8 activa. Por ejemplo, GDF-8 activo es un regulador negativo del músculo esquelético. GDF-8 activo también puede modular la producción de enzimas específicas de músculo (por ejemplo, creatinin quinasa), estimular la proliferación de células mioblásticas, y modular la diferenciación de preadipocitos a adipocitos.

Los términos “aislado” o “purificado” se refieren a una molécula que está sustancialmente libre de su entorno natural. Por ejemplo, una proteína aislada está sustancialmente libre de material celular u otras proteínas contaminantes de la célula o fuente de tejido de la que se deriva. La expresión “sustancialmente libre de material celular” se refiere a preparaciones donde la proteína aislada es al menos un 70 % a un 80 % (p/p) pura, opcionalmente al menos un 80 % -89 % (p/p) pura, opcionalmente un 90-95 % pura; y opcionalmente al menos un 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % (p/p) pura.

El término “mamífero” para los propósitos de tratamiento se refiere a cualquier animal clasificado como un mamífero, incluyendo seres humanos, animales domésticos y de granja, y animales de zoológico, deporte o mascotas, tales como perros, caballos, gatos, ovejas, cerdos, vacas, etc. En una realización de la invención el mamífero es un ser humano.

La expresión “anticuerpo monoclonal” se refiere a uno o más anticuerpos de una población de anticuerpos sustancialmente homogénea que se dirige contra un solo epítopo antigénico. El término engloba anticuerpos humanizados, anticuerpos de cadena simple, anticuerpos quiméricos, anticuerpos injertados a CDR, fragmentos de anticuerpo como Fab, F(ab’)2, Fv, y otros fragmentos de anticuerpo que retienen la función de unión a antígeno del anticuerpo parental.

Además, la expresión “anticuerpo monoclonal” no está limitada a cualquier especie particular o fuente del anticuerpo,

o la manera en la que se fabrica. Los anticuerpos monoclonales pueden fabricarse mediante técnicas de hibridoma tradicionales (Kohler y Milstein (1975) Nature, 256: 495-499), procedimientos de ADN recombinante (Patente de Estados Unidos Nº 4.816.567), o bibliotecas de anticuerpos de fagos (Clackson y col. (1991) Nature, 352: 624-628; Marks y col. (1991) J. Mol. Biol., 222: 581-597). Los anticuerpos monoclonales de cualquier mamífero o especie de no mamífero pueden emplearse en esta invención. Por ejemplo, los anticuerpos pueden derivarse de primates (por ejemplo, ser humano, orangután, etc.), aviar (por ejemplo, pollo, pavo, etc.), bovino, murino, rata, porcino, ovino o pez. En una realización de la invención, los anticuerpos son de rata, murino, u origen humano.

Los términos “neutralizar” y “neutralizante” se refieren a una reducción en la actividad de GDF-8 mediante un inhibidor de GDF-8, en relación a la actividad de una molécula de GDF-8 que no está unida mediante el mismo inhibidor. Por tanto, un anticuerpo “neutralizante” reduce la actividad de GDF-8 en relación a la actividad de una molécula de GDF-8 no unida al mismo anticuerpo. La actividad de la proteína GDF-8, cuando está unida a uno o más de los inhibidores de GDF-8 divulgados en el presente documento (por ejemplo, los anticuerpos divulgados en el presente documento), se reduce en al menos aproximadamente un 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, o 55 %, opcionalmente en al menos aproximadamente un 60 %, 62 %, 64 %, 66 %, 68 %, 70 %, 72 %, 72 %, 76 %, 78 %, 80 %, 82 %, 84 %, 86 %, u 88 %, opcionalmente en al menos aproximadamente un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, o 94 %, y opcionalmente en al menos del 95 % al 100 % en relación a una proteína GDF-8 que no está unida a uno o más de los inhibidores GDF-8 divulgados en el presente documento.

Las expresiones “interacción específica” o “se une específicamente” o similares, significan que dos moléculas forman un complejo que es relativamente estable en condiciones fisiológicas. El término también es de aplicación donde, por ejemplo, un dominio de unión a antígeno es específico para un epítopo concreto, que es portado por un número de antígenos, en cuyo caso el miembro específico de unión que porta el dominio de unión a antígeno será capaz de unirse a los diversos antígenos que portan el epítopo. La unión específica se caracteriza por una elevada afinidad y una capacidad de baja a moderada. La unión no específica normalmente tiene una baja afinidad con una capacidad de moderada a alta. Típicamente, la unión se considera específica cuando la constante de afinidad Ka es mayor de 106 M-1, o puede ser mayor de 108 M-1. En caso de que sea necesario, la unión no específica puede reducirse sin afectar sustancialmente a la unión específica variando las condiciones de unión. Dichas condiciones son conocidas en la técnica, y un experto en la técnica puede seleccionar las condiciones adecuadas empleando técnicas rutinarias. Las condiciones se definen normalmente en términos de concentración de anticuerpos, fuerza iónica de la solución, temperatura, tiempo dejado para la unión, concentración de moléculas no relacionadas (por ejemplo, seroalbúmina, caseína de leche), etc. Las condiciones ejemplares se indican en el Ejemplo 4.

La expresión “superfamilia de TGF-” se refiere a una familia de factores de crecimiento relacionados estructuralmente, todos los cuales están dotados de propiedades reguladoras del crecimiento y morfogenéticas fisiológicamente importantes. Esta familia de factores de crecimiento relacionados es bien conocida en la técnica (Kingsley y col. (1994) Genes Dev., 8: 133-146; Hoodless y col. (1998) Curr. Topics Microbiol. Immunol., 228: 235272). La superfamilia de TGF- incluye Proteínas Morfogenéticas Óseas (BMP), Activinas, Inhibinas, Sustancia Inhibidora Mulleriana, Factor Neurotrófico derivado de Glía, y un número aún creciente de Factores de Diferenciación y Crecimiento (GDF), como GDF-8 (miostatina). Varias de estas proteínas se relacionan en estructura con GDF-8, como BMP-11; y/o en actividad, como activina.

El término “tratamiento” se refiere tanto a tratamiento terapéutico como a medidas profilácticas o preventivas. Aquellos en necesidad de tratamiento pueden incluir individuos que ya tienen un trastorno médico concreto así como a aquellos que puedan en última instancia adquirir el trastorno (es decir, aquellos que necesiten medidas preventivas).

Descripción detallada de la invención

Anticuerpos

Los anticuerpos intactos son normalmente glicoproteínas heterotetraméricas de aproximadamente 150.000 daltons, compuestas de dos cadenas ligeras (L) idénticas y dos cadenas pesadas (H) idénticas. Cada cadena ligera está unida a una cadena pesada por medio de un enlace covalente disulfuro, mientras que el número de uniones disulfuro varía entre las cadenas pesadas de diferentes isotipos de inmunoglobulinas. Cada cadena pesada y ligera también tiene puentes disulfuro intracadena espaciados de manera regular. Cada cadena pesada tiene en un extremo un dominio variable (VH) seguido de un número de dominios constantes. Cada cadena ligera tiene un dominio variable en un extremo (VL) y un dominio constante en su otro extremo; el dominio constante de la cadena ligera se alinea con el primer dominio constante de la cadena pesada, y el dominio variable de la cadena ligera se alinea con el dominio variable de la cadena pesada. Se cree que restos de aminoácido concretos forman una interfaz entre los dominios variables de la cadena ligera y la cadena pesada (Clothia y col. (1985) J. Mol. Biol., 186: 651-663; Novotny y Haber (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 4592-4596).

Dependiendo de la secuencia de aminoácidos del dominio constante de las cadenas pesadas, las inmunoglobulinas pueden asignarse a diferentes clases. Hay cinco clases principales de inmunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG, e IgM, y varias de éstas pueden además dividirse en subclases (isotipos), por ejemplo, IgA1 e IgA2 para IgA; IgGI, IgG2, IgG3, IgG4 para IgG en humanos, e IgG1, IgG2a, IgG2b, e IgG3 para IgG en ratón. Los dominios constantes de cadena pesada que corresponden a las clases principales de inmunoglobulinas se llaman , , ,  y , respectivamente. Las estructuras de las subunidades y las configuraciones tridimensionales de las diferentes clases de inmunoglobulinas son bien conocidas en la técnica.

Para una revisión de la estructura del anticuerpo, véase Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, eds. Harlow y col., 1988. En resumen, cada cadena ligera se compone de un dominio variable (V) N terminal (VL) y un dominio constante (C) (CL). Cada cadena pesada se compone de un dominio V N-terminal, tres o cuatro dominios C, y una región bisagra. El dominio CH más proximal a VH se denomina CH1. Los dominios VH y VL consisten en cuatro regiones de secuencias relativamente conservadas llamadas regiones de marco conservado (FR1, FR2, FR3 y FR4), que forman un andamio para tres regiones de secuencia hípervariable (regiones determinantes de complementariedad, CDR). Las CDR contienen la mayor parte de los restos responsables de interacciones específicas con el antígeno. Las CDR se citan como CDR1, CDR2, y CDR3. Por consiguiente, los constituyentes CDR de la cadena pesada se citan como H1, H2 y H3, mientras que los constituyentes CDR de la cadena ligera se citan como L1, L2, y L3. CDR3 es la mayor fuente de diversidad molecular entre el sitio de unión de anticuerpos. H3, por ejemplo, puede ser tan corta como dos restos de aminoácidos o mayor de 26. Las localizaciones de los dominios variables de inmunoglobulina en un anticuerpo dado pueden determinarse como se describe por ejemplo en Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Department of Health and Human Services, eds. Kabat y col., 1991.

La diversidad de los anticuerpos se crea por el uso de múltiples genes de la línea germinal que codifican regiones variables y una variedad de eventos somáticos. Los eventos somáticos incluyen recombinación de segmentos variables de genes con segmentos génicos de diversidad (D) y de unión (J) para producir una región completa VH y la recombinación de segmentos génicos variables y de unión para producir una región VL completa. El proceso de recombinación es impreciso en sí mismo, lo que da como resultado la pérdida o adición de aminoácidos en las uniones V(D)J. Estos mecanismos de diversidad suceden en los linfocitos B en desarrollo antes de la exposición al antígeno. Después de la estimulación antigénica, los genes de anticuerpo expresados en los linfocitos B sufren mutación somática. Basándose en el número estimado de segmentos génicos de la línea germinal, la recombinación al azar de estos segmentos, y el emparejamiento VH-VL al azar, podrían producirse hasta 1,6 x 107 anticuerpos distintos (Fundamental immunology, 3ª ed., ed. Paul, Raven Press, Nueva York, NY, 1993). Cuando se tienen en cuenta otros procesos que contribuyen a la diversidad de anticuerpos (como mutación somática), se cree que pueden generarse más de 1 x 1010 anticuerpos distintos (Immunoglobulin Genes, 2ª ed., eds. Jonio y col., Academic Press, San Diego, CA, 1995). Debido a los diversos procesos involucrados en la generación de la diversidad de anticuerpos, es poco probable que los anticuerpos monoclonales derivados independientemente con la misma especificidad de antígeno tengan secuencias de aminoácidos idénticas.

Los anticuerpos pueden suscitarse contra cualquier porción de una proteína que proporciona un epítopo antigénico.

Los anticuerpos divulgados en el presente documento se unen a la proteína GDF-8 madura como se expone en SEC ID Nº: 15; entre el aminoácido 1 y el aminoácido 50; opcionalmente entre el aminoácido 1 y el aminoácido 25; y opcionalmente entre el aminoácido 1 y el 15 de SEC ID Nº: 15.

En otra realización, los anticuerpos divulgados en el presente documento se unen específicamente a la secuencia Asp-Glu-His-Xaa-Thr (SEC ID Nº: 2) en una cualquiera de las proteínas que pertenecen a la superfamilia TGF-, donde Xaa es Ala, Gly, His, Met, Asn, Arg, Ser, Thr o Trp. Opcionalmente, los anticuerpos se unen específicamente a la secuencia peptídica Asp-Glu-His-Xaa-Thr (SEC ID Nº: 2) en GDF-8, donde Xaa es Ala, Gly, His, Met, Asn, Arg, Ser, Thr, o Trp. Opcionalmente, los anticuerpos se unen específicamente a Asp-Glu-His-Ser-Thr (SEC ID Nº: 3) en la proteína GDF-8 madura (SEC ID Nº: 15).

Opcionalmente, los anticuerpos divulgados en el presente documento se unen específicamente a la secuencia peptídica Asp-Phe-Gly-Leu-Asp-Cys-Asp-Glu-His-Xaa-Thr-Gfu-Ser-Arg-Cys (SEC ID Nº: 5) en una cualquiera de las proteínas que pertenecen a la superfamilia TGF-, donde Xaa es Ala, Gly, His, Met, Asn, Arg, Ser, Thr, o Trp. Opcionalmente, los anticuerpos se unen específicamente a la secuencia peptídica Asp-Phe-Gly-Leu-Asp-Cys-Asp-Glu-His-Xaa-Thr-Glu-Ser-Arg-Cys (SEC ID Nº: 5) en GDF-8, donde Xaa es Ala, Gly, His, Met, Asn, Arg, Ser, Thr, o Trp. Opcionalmente, los anticuerpos se unen específicamente a la secuencia peptídica Asp-Phe-Gly-Leu-Asp-Cys-Asp-Glu-His-Ser-Thr-Glu-Ser-Arg-Cys (SEC ID Nº: 8) en la proteína GDF-8 madura (SEC ID Nº: 15).

La proteína GDF-8 a la cual los anticuerpos divulgados en el presente documento pueden unirse específicamente es opcionalmente al menos aproximadamente un 75 %-80 % idéntica a SEC ID Nº: 15, opcionalmente al menos de aproximadamente un 81 % a aproximadamente un 85 % idéntica a SEC ID Nº: 15, opcionalmente al menos aproximadamente un 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, o 94 % idéntica a SEC ID Nº: 15, y opcionalmente al menos aproximadamente 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a SEC ID Nº: 15. La proteína GDF-8 opcionalmente comprende SEC ID Nº: 15.

En una realización alternativa, los anticuerpos divulgados en el presente documento pueden unirse específicamente a la proteína BMP-11. La proteína BMP-1 es opcionalmente al menos aproximadamente un 75 %-80 % idéntica a SEC ID Nº: 16, opcionalmente al menos aproximadamente un 81 % a aproximadamente un 85 % idéntica a SEC ID Nº: 16, opcionalmente al menos aproximadamente un 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, o 94 % idéntica a SEC ID Nº: 16, y opcionalmente al menos aproximadamente un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a SEC ID Nº: 16. La proteína BMP-11 opcionalmente comprende SEC ID Nº: 16.

En una realización particular, llamada JA-16, el anticuerpo comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 1 como parte de la región variable de la cadena pesada. En otras realizaciones, el anticuerpo comprende al menos una cadena sencilla CDR seleccionada de los aminoácidos 30-35 de SEC ID Nº: 1, aminoácidos 50-66 de SEC ID Nº: 1, y los aminoácidos 99-102 de SEC ID Nº: 1.

Un experto en la técnica reconocerá que los anticuerpos de la invención pueden contener cualquier número de cambios conservativos o no conservativos con sus secuencias de aminoácidos respectivas sin alterar sus propiedades biológicas. Se pueden hacer cambios tanto en sus regiones de marco conservado (FR) o en las regiones CDR. Mientras que los cambios en las regiones de marco conservado normalmente están diseñados para mejorar la estabilidad e inmunogeneidad del anticuerpo, los cambios en las regiones CDR normalmente están diseñados para aumentar la afinidad del anticuerpo por su diana. Dichos cambios para aumentar la afinidad se determinan típicamente de manera empírica alterando la región CDR y evaluando el anticuerpo. Dichas alteraciones pueden efectuarse de acuerdo con los procedimientos descritos en Antibody Engineering, 2ª. ed., Oxford University Press, ed. Borrebaeck, 1995. Las modificaciones conservativas de aminoácidos se basan en la similitud relativa de los sustituyentes de la cadena lateral de los aminoácidos, por ejemplo, su hidrofobicidad, hidrofilidad, carga, tamaño y similares. Las sustituciones conservativas ejemplares que toman en consideración varias de las características anteriormente indicadas, son bien conocidas para los expertos en la técnica e incluyen: arginina y lisina; glutamato y aspartato; serina y treonina; glutamina y asparagina; y valina, leucina, e isoleucina. En las secciones a continuación se describen dichos cambios. A diferencia de las CDR, pueden hacerse cambios sustanciales no conservativos en las regiones de marco conservado (FR) sin afectar negativamente a las propiedades de unión de un anticuerpo. Los cambios en las FR incluyen, pero sin limitación, humanizar una región de marco conservado derivada de no humano

o diseñar por ingeniería genética ciertos restos de región de marco conservado que son importantes para el contacto con el antígeno o para estabilizar el sitio de unión, por ejemplo, cambiar la clase o subclase de la región constante, cambiar los restos aminoacídicos específicos que pueden después tener una función efectora como la unión al receptor de Fc (Lund y col. (1991) J. Immun. 147: 2657-2662 y Morgan y col. (1995) Immunology 86: 319-324), o cambiar la especie de la que se deriva la región constante como se describe a continuación.

En una realización, los anticuerpos divulgados en el presente documento se unen específicamente a la proteína GDF-8 madura, independientemente de si está en su forma monomérica, forma de dímero activo, o formando un complejo en un complejo latente de GDF-8, con una afinidad de entre aproximadamente 106 y aproximadamente 1011 M-1, opcionalmente entre aproximadamente 108 y aproximadamente 1011 M-1 .

Los anticuerpos de la presente divulgación pueden comprender anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales, composiciones de anticuerpos, anticuerpos que tienen mono o poli-especificidad, anticuerpos humanizados, anticuerpos de cadena simple, anticuerpos injertados con CDR, fragmentos de anticuerpo como Fab, F(ab’)2, Fv y otros fragmentos de anticuerpo que mantienen la función de unión a antígeno del anticuerpo parental. Los anticuerpos divulgados en el presente documento también pueden modificarse a anticuerpos quiméricos. Por ejemplo, una región Fc humana puede fusionarse a una región de unión a GDF-8 de un anticuerpo murino para generar un anticuerpo quimérico. Mediante el reemplazo de otras porciones del anticuerpo murino (fuera de la región de unión al antígeno) con fragmentos de anticuerpo humanos correspondientes, puede producirse un anticuerpo humanizado. Dichos anticuerpos humanizados o quiméricos pueden mostrar especificidad biológica mejorada o estabilidad in vivo. Son particularmente útiles en el diseño de anticuerpos para terapias humanas. Se entiende que los profesionales están familiarizados con los recursos materiales estándar que describen condiciones y procedimientos específicos para la construcción, manipulación, producción, y aislamiento de anticuerpos (véase, por ejemplo, Harlow y Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor,

Nueva York).

La presente divulgación también proporciona células, como hibridomas, que producen cualquiera de los anticuerpos divulgados en el presente documento. Un experto en la técnica está familiarizado con las diversas células que son adecuadas para producir anticuerpos. Puede usarse cualquier célula compatible con la presente invención para producir los anticuerpos divulgados en el presente documento. En una realización, los anticuerpos divulgados en el presente documento se producen mediante una célula de hibridoma. Una línea celular de hibridoma, que produce el anticuerpo murino JA-16 anti-GDF-8 se ha depositado en American Tissue Culture Collection (Número de Designación de Depósito PTA-4236) el 18 de abril de 2002. La dirección del depositario es 10801 University Blvd, Manassas, VA 20110.

Procedimientos para tratar enfermedad

Los anticuerpos de la presente divulgación también son útiles para prevenir, diagnosticar o tratar varios trastornos médicos en seres humanos o animales. Los anticuerpos se usan para inhibir o reducir una o más actividades asociadas con la proteína GDF, en relación a la proteína GDF pero no unidos mediante el mismo anticuerpo. Los anticuerpos inhiben o reducen una o más de las actividades de GDF-8 madura (independientemente de si está en forma monomérica, forma dimérica activa, o formando un complejo en un complejo latente de GDF-8) en relación a la proteína GDF-8 madura que no está unida a los mismos anticuerpos. En una realización, la actividad de la proteína GDF-8 madura cuando se une mediante uno o más de los anticuerpos divulgados en el presente documento, se inhibe al menos un 50 %, opcionalmente al menos un 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 72, 76, 78, 80, 82, 84, 86, u 88 %, opcionalmente al menos un 90, 91, 92, 93, o 94 %, y opcionalmente al menos un 95 % a 100 % en relación a la proteína GDF-8 madura que no se une a uno o más de los anticuerpos divulgados en el presente documento.

El trastorno médico que se diagnostica, trata, o previene mediante los anticuerpos divulgados en el presente documento es opcionalmente un trastorno muscular y neuromuscular; un trastorno del tejido adiposo como la obesidad; diabetes de tipo 2, tolerancia impedida a la glucosa, síndromes metabólicos (por ejemplo, síndrome X), resistencia a la insulina inducida por trauma como quemaduras; o enfermedad degenerativa del hueso como osteoporosis. La afección médica es opcionalmente un trastorno muscular y neuromuscular, como una distrofia muscular, atrofia muscular, enfermedad pulmonar obstructiva congestiva, síndrome de pérdida de masa muscular, sarcopenia, o caquexia y trastornos asociados con una pérdida de hueso, que incluyen osteoporosis, especialmente en las mujeres ancianas y/o postmenopáusicas, osteoporosis inducida por glucocorticoides, osteopenia, y fracturas relacionadas con la osteoporosis. Otros trastornos y enfermedades metabólicas diana del hueso susceptibles de tratamiento con anticuerpos de GDF-8 de la invención incluyen baja masa muscular debido a terapia con glucocorticoides crónica, fallo gonadal prematuro, supresión androgénica, deficiencia de vitamina D, hiperparatiroidismo secundario, deficiencias nutricionales y anorexia nerviosa. Los anticuerpos se usan opcionalmente para prevenir, diagnosticar, o tratar dichos trastornos médicos en mamíferos, opcionalmente en seres humanos.

Los anticuerpos o composiciones de anticuerpo de la presente invención se administran en cantidades terapéuticamente efectivas. Como se usa en el presente documento, una “cantidad efectiva” del anticuerpo es una dosificación que es suficiente para reducir la actividad de proteína GDF para lograr un resultado biológico deseado (por ejemplo, aumentar la masa muscular o fuerza). Generalmente, una cantidad terapéuticamente efectiva puede variar con la edad del sujeto, estado, y sexo, así como la severidad de la afección médica en el sujeto. La dosificación puede determinarse por un médico y ajustarse, según sea necesario, para ajustarse a los efectos observados del tratamiento. Generalmente, las composiciones se administran de tal forma que los anticuerpos se proporcionan a una dosificación de entre 1 g/kg y 20 mg/kg. Opcionalmente, los anticuerpos se proporcionan como una dosis en bolo, para maximizar los niveles circulantes de anticuerpos durante el máximo de tiempo después de la dosis. También puede usarse la infusión continua después de la dosificación del bolo.

Los procedimientos de tratamiento, diagnóstico o prevención de las afecciones médicas anteriores con los anticuerpos divulgados en el presente documento también pueden usarse sobre otras proteínas de la superfamilia TGF-. Muchas de estas proteínas, por ejemplo, BMP-11, están relacionadas estructuralmente con GDF-8. Por consiguiente, en otra realización, la invención proporciona procedimientos para tratar los trastornos anteriormente mencionados administrando a un sujeto un anticuerpo capaz de inhibir BMP-11 o activina, ya sea por sí solo o en combinación con otras inhibidores de TGF-, como un anticuerpo neutralizante contra GDF-8.

Los anticuerpos de la presente invención pueden emplearse para detectar la presencia de proteínas que pertenecen a la superfamilia de TGF-, tal como BMP-11 y GDF-8. Correlacionando la presencia o nivel de estas proteínas con una afección médica, un experto en la técnica puede diagnosticar la afección médica asociada. Las afecciones médicas que pueden diagnosticarse mediante los anticuerpos divulgados en el presente documento se expusieron anteriormente.

Dichos procedimientos de detección son bien conocidos en la técnica e incluyen ELISA, radioinmunoensayo, imunotransferencia, transferencia de Western, inmunofluorescencia, inmunoprecipitación, y otras técnicas comparables. Los anticuerpos pueden además proporcionarse en un kit diagnóstico que incorpora una o más de

estas técnicas para detectar una proteína (por ejemplo, GDF-8). Dicho kit puede contener otros componentes, empaquetamiento, instrucciones, u otro material para ayudar en la detección de la proteína y uso del kit.

En los casos en los que los anticuerpos estén concebidos con fines de diagnóstico, puede ser deseable modificarlos, por ejemplo mediante un grupo ligando (como biotina) o un grupo marcador detectable (como un grupo fluorescente, un radioisótopo o una enzima). Si se desea, los anticuerpos (ya sean policlonales o monoclonales) pueden marcarse empleando técnicas convencionales. Los marcadores adecuados incluyen fluoróforos, cromóforos, átomos radioactivos, reactivos densos a electrones, enzimas, y ligandos que tienen compañeros específicos de unión. Las enzimas se detectan típicamente por su actividad. Por ejemplo, la peroxidasa de rábano picante se detecta normalmente por su capacidad para convertir 3,3’,5,5’-tetrametilbenzidina (TMB) en un pigmento azul, cuantificable con un espectrofotómetro. Otros marcadores adecuados incluyen, por ejemplo, uno de los compañeros de unión, como biotina y avidina o estreptavidina, IgG y proteína A, y varias parejas receptor-ligando conocidas en la técnica. Otras permutaciones y posibilidades serán fácilmente evidentes para los expertos en la técnica, y se consideran equivalentes dentro del ámbito de la presente invención.

Composiciones de anticuerpos

La presente invención proporciona composiciones que comprenden los anticuerpos divulgados en el presente documento. Dichas composiciones pueden ser adecuadas para uso farmacéutico y administración a pacientes. Las composiciones típicamente comprenden uno o más anticuerpos de la presente invención y un excipiente farmacéuticamente aceptable. Como se usa en el presente documento, la expresión “excipiente farmacéuticamente aceptable” incluye cualquiera y todos los disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y retardantes de la absorción, y similares, que son compatibles con la administración farmacéutica. El uso de dichos medios y agentes para sustancias farmacéuticamente activas es bien conocido en la técnica. Las composiciones también pueden contener otros principios activos que proporcionan funciones terapéuticas suplementarias, adicionales, o mejoradas. Las composiciones farmacéuticas también pueden incluirse en un contenedor, paquete, o dispensador junto con instrucciones para su administración.

Una composición farmacéutica de la invención se formula para que sea compatible con su ruta de administración prevista. Los procedimientos para llevar a cabo la administración son conocidos para los expertos en la técnica. También puede ser posible obtener composiciones que sean administradas por vía tópica u oral, o que sean capaces de transmitirse a través de las membranas mucosas. La administración puede, por ejemplo, ser intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, intracavidad, subcutánea o transdérmica.

Las soluciones o suspensiones utilizadas para aplicación subcutánea o intradérmica típicamente incluyen uno o más de los siguientes componentes: un diluyente estéril como agua para inyección, solución salina, aceites fijos, polietilenglicoles, glicerina, propilenglicol u otros disolventes sintéticos; agentes antibacterianos como alcohol bencílico o parabenos de metilo; antioxidantes como ácido ascórbico o bisulfato de sodio; agentes quelantes como ácido etilendiaminotetraacético; tampones como acetatos, citratos o fosfatos; y agentes para ajustar la tonicidad como son cloruro de sodio o dextrosa. El pH puede ajustarse con ácidos o bases, como ácido clorhídrico o hidróxido de sodio. Dichas preparaciones pueden encerrarse en ampollas, jeringuillas desechables o viales multidosis fabricados en vidrio o plástico.

Las composiciones farmacéuticas adecuadas para inyección incluyen soluciones o dispersiones acuosas estériles y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles. Para la administración intravenosa, los transportadores adecuados incluyen suero salino fisiológico, agua bacteriostática, Cremophor EL™ (BASF, Parsippany, NJ) o suero salino tamponado con fosfato (PBS). En todos los casos, la composición tiene que ser estéril y debe ser fluida hasta el punto de que sea fácilmente inyectable. Tiene que ser estable en las condiciones de fabricación y almacenamiento y debe conservarse contra la acción contaminante de microorganismos como bacterias y hongos. El transportador puede ser un medio de disolución o dispersión que contiene, por ejemplo, agua, etanol, polioles (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido, y similares), y mezclas adecuadas de los mismos. Puede mantenerse la fluidez adecuada, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento como lecitina, manteniendo el tamaño de partícula necesario en el caso de dispersiones y mediante el uso de tensioactivos. Evitar la acción de microorganismos puede lograrse mediante varios agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorbutanol, fenol, ácido ascórbico, timerosal, y similares. En muchos casos, se añadirán a la composición agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes como manitol, sorbitol o cloruro de sodio. La absorción prolongada de las composiciones inyectables puede lograrse incluyendo en la composición un agente que retrase la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.

Las composiciones orales generalmente incluyen un diluyente inerte o un transportador comestible. Pueden encerrarse en cápsulas de gelatina o comprimirse en comprimidos. Para el propósito de la administración terapéutica oral, los anticuerpos pueden incorporarse con excipientes y emplearse en forma de comprimidos, pastillas o cápsulas. Se pueden incluir agentes aglutinantes farmacéuticamente compatibles, y/o materiales adyuvantes como parte de la composición. Los comprimidos, píldoras, cápsulas, pastillas y similares pueden contener cualquiera de los siguientes ingredientes, o compuestos de una naturaleza similar: un aglutinante como celulosa microcristalina, goma o gelatina de tragacanto; un excipiente como almidón o lactosa, un agente desintegrante como ácido algínico, Primogel, o almidón de maíz; un lubricante como estearato de magnesio o

Sterotes; un emoliente como dióxido de silicio coloidal; un agente edulcorante como sacarosa o sacarina; o un agente aromatizante como aromas de menta, salicilato de metílico, o de naranja.

Para la administración por inhalación, los anticuerpos se proporcionan en forma de un espray en aerosol en un contenedor presurizado o dispensador que contiene un propulsor adecuado, por ejemplo, un gas como dióxido de carbono, o un nebulizador.

La administración sistémica también puede ser por medios transmucosales o transdérmicos. Para la administración transmucosal o transdérmica, se usan en la formulación penetrantes adecuados para permear la barrera. Dichos penetrantes se conocen generalmente en la técnica, e incluyen, por ejemplo, para la administración transmucosal, detergentes, sales de bilis, y derivados del ácido fusídico. La administración transmucosal puede lograrse mediante el uso de espráis nasales o supositorios. Para la administración transdérmica, los compuestos activos se formulan en ungüentos, pomadas, geles, o cremas como se conoce de forma general en la técnica.

Los anticuerpos también pueden prepararse en forma de supositorios (por ejemplo, con bases de supositorio convencional como manteca de cacao y otros glicéridos) o enemas de retención para dispensación rectal.

En una realización, los anticuerpos divulgados en el presente documento se preparan con transportadores que protejan el compuesto contra la eliminación rápida del cuerpo, como una formulación de liberación controlada, que incluye implantes y sistemas de dispensación microencapsulados. Pueden emplearse polímeros biodegradables biocompatibles, como etileno acetato de vinilo, polianhídridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres y ácido poliláctico. Los procedimientos para la preparación de dichas formulaciones serán evidentes para los expertos en la técnica. Los materiales también pueden obtenerse comercialmente a través de Alza Corporation y Nova Pharmaceuticals, Inc. También pueden emplearse suspensiones liposómicas que contienen los anticuerpos divulgados en el presente documento como transportadores farmacéuticamente aceptables. Éstas pueden prepararse de acuerdo con los procedimientos conocidos para los expertos en la técnica, por ejemplo, los descritos en la Patente de los Estados Unidos 4.522.811.

Es especialmente ventajoso formular las composiciones parenterales u orales en formas de dosificación unitarias para facilitar la administración y uniformidad de dosificación. La forma de dosificación unitaria como se usa en el presente documento se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosificaciones unitarias para el sujeto a tratar; conteniendo cada unidad una cantidad predeterminada de principio activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el vehículo farmacéutico requerido. Las especificaciones para las formas de dosificación unitarias de la invención están dictadas por y dependen directamente de las características únicas del compuesto activo y el efecto terapéutico particular a lograr, y las limitaciones inherentes en la técnica de componer un tal compuesto activo para el tratamiento de individuos.

La toxicidad y eficacia terapéutica de tales compuestos puede determinarse mediante procedimientos farmacéuticos convencionales en cultivos celulares o animales experimentales, por ejemplo, para determinar el DL50 (la dosis letal para el 50 % de la población) y el DE50 (la dosis terapéuticamente efectiva en el 50 % de la población). La proporción de dosificación entre efectos tóxicos y terapéuticos es el índice terapéutico y puede expresarse como la proporción DL50/DE50. Los anticuerpos que muestran elevados índices terapéuticos son una realización de la invención.

Los datos obtenidos a partir de los ensayos en cultivo celular y estudios animales pueden emplearse para formular una variedad de dosificaciones para su uso en seres humanos. La dosificación de dichos compuestos se encuentra opcionalmente dentro de un intervalo de concentraciones circulantes que incluyen el DE50 con poca o nula toxicidad. La dosificación puede variar dentro de este intervalo dependiendo de la forma de dosificación empleada y la vía de administración utilizada. Para cualquier anticuerpo usado en la presente invención, la dosis terapéuticamente efectiva puede estimarse inicialmente mediante ensayos en cultivos celulares. Puede formularse una dosis en modelos animales para lograr un intervalo de concentración en plasma circulante que incluya la CI50 (es decir, la concentración del anticuerpo de ensayo que logra la mitad de la inhibición máxima de los síntomas) determinado en cultivo celular. Los niveles en plasma pueden medirse, por ejemplo, mediante cromatografía líquida de alto rendimiento. Los efectos de cualquier dosificación particular pueden controlarse mediante un bioensayo adecuado. Los ejemplos de bioensayos adecuados incluyen ensayos de replicación de ADN, ensayos basados en la transcripción, ensayos de unión de proteína GDF/receptor, ensayos de creatinín quinasa, ensayos basados en la diferenciación de pre-adipocitos, ensayos basados en la captación de glucosa en adipocitos, y ensayos inmunológicos.

Anticuerpos modificados

Un experto en la técnica entenderá que pueden sustituirse determinados aminoácidos por otros aminoácidos en la estructura de una proteína sin afectar negativamente a la actividad de la proteína, por ejemplo, las características de unión de un anticuerpo. Por tanto, los inventores contemplan que pueden efectuarse diversos cambios en la secuencia de aminoácidos de los anticuerpos divulgados en el presente documento, o secuencias de ADN que codifican los anticuerpos, sin una pérdida apreciable de su actividad o utilidad biológica. Dichos cambios pueden incluir deleciones, inserciones, truncamientos, sustituciones, fusiones, mezcla aleatoria de motivos de secuencia, y similares.

Al efectuar dichos cambios, puede considerarse el índice hidropático de los aminoácidos. Se entiende generalmente en la técnica la importancia del índice hidropático de aminoácidos para conferir una función biológica interactiva a una proteína (Kyte y Doolittle (1982) J. Mol. Biol., 157: 105-132). Se acepta que el carácter hidropático relativo del aminoácido contribuye a la estructura secundaria de la proteína resultante, que a su vez define la interacción de la proteína con otras moléculas, por ejemplo, enzimas, sustratos, receptores, ADN, anticuerpos, antígenos, y similares.

Se ha asignado un índice hidropático a cada aminoácido en base a su hidrofobicidad y características de carga (Kyte y Doolittle, 1982); éstos son isoleucina (+4,5), valina (+4,2), leucina (+3,8), fenilalanina (+2,8), cisteína/cistina (+2,5), metionina (+1,9), alanina (+1,8), glicina (-0,4), treonina (-0,7), serina (-0,8), triptófano (-0,9), tirosina (-1,3), prolina (1,6), histidina (-3,2), glutamato (-3,5), glutamina (-3,5), aspartato (-3,5), asparagina (-3,5), lisina (-3,9), y arginina (-4,5).

Al efectuar dichos cambios, la sustitución de aminoácidos cuyos índices hidropáticos se encuentren entre  2 es una realización de la invención, aquellos que estén entre 1 son opcionales, y aquellos entre 0,5 también son opcionales.

También se entiende en la técnica que la sustitución de aminoácidos similares puede efectuarse de una manera efectiva en base a la hidrofilidad. La Patente de los Estados Unidos 4.554.101 afirma que la mayor hidrofilidad media local de una proteína, al estar gobernada por la hidrofilidad de sus aminoácidos adyacentes, se correlaciona con una propiedad biológica de la proteína.

Como se detalla en la Patente de los Estados Unidos 4.554.101, se asignaron los siguientes valores de hidrofilidad a los restos de aminoácidos: arginina (+3,0), lisina (+3,0), aspartato (+3,0  1), glutamato (+3,0  1), serina (+0,3), asparagina (+0,2), glutamina (+0,2), glicina (0), treonina (-0,4), prolina (-0,5  1), alanina (-0,5), histidina (-0,5), cisteína (-1,0), metionina (-1,3), valina (-1,5), leucina (-1,8), isoleucina (-1,8), tirosina (-2,3), fenilalanina (-2,5), y triptófano (-3,4).

Al hacer dichos cambios, la sustitución de aminoácidos cuyos valores de hidrofilidad se encuentren entre  2 es una realización de la invención, aquellos entre 1 son opcionales, y aquellos entre 0,5 son opcionales.

Las modificaciones pueden ser conservativas, de tal forma que la estructura o función biológica de la proteína no se vea afectada por el cambio. Dichas modificaciones de aminoácidos conservativas se basan en la similitud relativa de los sustituyentes de la cadena lateral de los aminoácidos, por ejemplo, su hidrofobicidad, hidrofilidad, carga, tamaño, y similares. Las sustituciones conservativas ejemplares que tienen en consideración varias de las características precedentes son bien conocidas para los expertos en la técnica e incluyen: arginina y lisina; glutamato y aspartato; serina y treonina; glutamina y asparagina; y valina, leucina, e isoleucina. La secuencia de aminoácidos de lo anticuerpos divulgados en el presente documento puede modificarse para tener cualquier número de cambios conservativos, siempre que la unión del anticuerpo a su antígeno diana no se vea afectada negativamente. Dichos cambios pueden introducirse dentro o fuera de la porción de unión al antígeno del anticuerpo. Por ejemplo, los cambios introducidos dentro de la porción de unión a antígeno del anticuerpo pueden diseñarse para aumentar la afinidad del anticuerpo por su diana.

Además de los cambios a la secuencias de aminoácidos indicados anteriormente, los anticuerpos pueden glicosilarse, pegilarse o unirse a albúmina o un polímero no proteico. Por ejemplo, los anticuerpos divulgados en el presente documento pueden unirse a uno de una variedad de polímeros no proteicos, por ejemplo, polietilenglicol, polipropilenglicol, o polioxialquilenos, del modo expuesto en las Patentes de los Estados Unidos con número 4.640.835, 4.496.689, 4.301.144, 4.670.417, 4.791.192, o 4.179.337. Los anticuerpos se modifican químicamente por conjugación covalente a un polímero para aumentar su vida media circulante, por ejemplo. También se muestran en las Patentes de los Estados Unidos 4.766.106, 4.179.337, 4.495.285, y 4.609.546 ciertos polímeros, y procedimientos para unirlos a péptidos.

En otra realización, el anticuerpo puede modificarse para tener un patrón de glicosilación alterado (es decir, alterado respecto del patrón de glicosilación original o nativo). Como se usa en el presente documento, “alterado” significa que tienen uno o más restos de carbohidrato eliminados, y/o tiene uno o más sitios de glicosilación añadidos al anticuerpo original.

La glicosilación de anticuerpos es típicamente tanto unido a N o unido a O. Unido a N se refiere a la unión del resto de carbohidrato a la cadena lateral de un resto de asparagina. Las secuencias de tripéptido asparagina-X-serina y asparagina-X-treonina, donde X es un aminoácido excepto prolina, son las secuencias de reconocimiento para la unión enzimática del resto de carbohidrato a la cadena lateral de asparagina. Por tanto, la presencia de cualquiera de estas secuencias de tripéptido en un polipéptido crea un sitio de glicosilación potencial. La glicosilación unida a O se refiere a la unión de uno de los azúcares N-acetilgalactosamina, galactosa, o xilosa a un hidroxiaminoácido, más comúnmente serina o treonina, aunque también puede usarse 5-hidroxiprolina o 5-hidroxilisina.

La adición de sitios de glicosilación a los anticuerpos divulgados en el presente documento se consigue convenientemente alterando la secuencia de aminoácidos de tal forma que contenga una o más de las secuencias de tripéptidos descritas anteriormente (para los sitios de glicosilación unidos a N). La alteración también puede

hacerse mediante la adición, o sustitución por, uno o más restos de serina o treonina a la secuencia de anticuerpos originales (para los sitios de glicosilación unidos a O). Por facilidad, la secuencia de aminoácidos del anticuerpo se altera, de manera opcional, mediante cambios a nivel de ADN.

Otro medio de aumentar el número de restos de carbohidrato en los anticuerpos es mediante acoplamiento enzimático o químico de glucósidos a los restos de aminoácidos del anticuerpo. Estos procedimientos son ventajosos en tanto que no requieren la producción del inhibidor del péptido GDF en una célula hospedadora que tiene capacidad de glicosilación para glicosilaciones unidas a N o a O. Dependiendo del modo de acoplamiento empleado, los azúcares pueden unirse a (a) arginina e histidina, (b) grupos carboxilo libres, (c) grupos sulfhidrilo libres como aquellos de la cisteína, (d) grupos hidroxilo libres como aquellos de la serina, treonina, o hidroxiprolina,

(e) restos aromáticos como aquellos de la fenilalanina, tirosina o triptófano, o (f) el grupo amida de glutamina. Estos procedimientos se describen en el documento WO 87/05330, y en Aplin y Wriston (1981) CRC Crit. Rev. Biochem.,

22: 259-306.

La eliminación de cualquier resto de carbohidrato presente en los anticuerpos puede llevarse a cabo química o enzimáticamente. La deglicosilación química necesita la exposición del anticuerpo a ácido trifluorometanosulfónico, o un compuesto equivalente. Este tratamiento da como resultado la escisión de la mayor parte de los azúcares excepto el azúcar de unión (N-acetilglucosamina o N-acetilgalactosamina), mientras que dejan intacta la secuencia de aminoácidos.

La deglicosilación química se describe por Hakimuddin y col. (1987) Arch. Biochem. Biophys., 259: 52; y Edge y col. (1981) Anal. Biochem., 118: 131. La escisión enzimática de restos de carbohidrato en inhibidores del péptido GDF puede lograrse mediante el uso de una variedad de endo-y exo-glicosilasas como se describe por Thotakura y col. (1987) Meth. Enzymol., 138: 350.

Análisis de secuencias

Aunque no es siempre necesario, si se desea, un experto en la técnica puede determinar las secuencias de aminoácidos o ácidos nucleicos de los anticuerpos divulgados en el presente documento. La presente invención incluye estas secuencias de aminoácidos y ácidos nucleicos. La presente invención también incluye variantes, homólogos, y fragmentos de estas secuencias de ácido nucleico y aminoácidos. Por ejemplo, el anticuerpo puede comprender una secuencia de región variable de cadena pesada que comprende a SEC ID Nº: 1, o una secuencia de ácidos nucleicos que codifica SEC ID Nº: 1 (por ejemplo, SEC ID Nº: 6). La secuencia de ácidos nucleicos o aminoácidos comprende opcionalmente una secuencia al menos de un 70 % a un 79 % idéntica con la secuencia de ácidos nucleicos o aminoácidos de la región variable de cadena pesada divulgada en el presente documento, opcionalmente al menos de un 80 % a un 89 % idéntica, opcionalmente al menos de un 90 % a un 95 % idéntica, y opcionalmente al menos de un 96 % a un 100 % idéntica. Un experto en la técnica reconocerá que la región CDR, que determina las propiedades de unión antigénicas del anticuerpo, puede tolerar menos variación de secuencias que las otras porciones del anticuerpo no involucradas en la unión a antígeno. Por tanto, estas regiones no de unión del anticuerpo pueden contener variaciones sustanciales sin alterar significativamente las propiedades de unión del anticuerpo. Sin embargo, un experto en la técnica también reconocerá que pueden efectuarse muchos cambios a la región CDR que están especialmente diseñados para aumentar la afinidad del anticuerpo por su diana. Dichos cambios que aumentan la afinidad se determinan típicamente empíricamente alterando la región CDR y evaluando el anticuerpo. Todas dichas alteraciones, ya estén dentro de la CDR o fuera de la CDR, se incluyen en el ámbito de la presente invención.

La similitud o identidad de secuencias relativa puede determinarse usando los programas “Best Fit” o “Gap” del Sequence Analysis Software Package™ (Versión 10; Genetics Computer Group, Inc., University of Wisconsin Biotechnology Center, Madison, WI). “Gap” utiliza el algoritmo de Needleman y Wunsch (Needleman y Wunsch, 1970) para encontrar el alineamiento de dos secuencias que maximiza el número de coincidencias y minimiza el número de huecos. “BestFit” efectúa un alineamiento óptimo del mejor segmento de similitud entre dos secuencias. Los alineamientos óptimos se encuentran insertando huecos para maximizar el número de coincidencias empleando el algoritmo de homología local de Smith y Waterman (Smith y Waterman, 1981; Smith y col., 1983).

El Sequence Analysis Software Package descrito anteriormente contiene un número de otras herramientas de análisis de secuencia útiles para identificar homólogos de las secuencias de aminoácidos y nucleótidos divulgadas en el presente documento. Por ejemplo, el programa “BLAST” (Altschul y col., 1990) busca secuencias similares a la secuencia introducida (ya sea péptido o ácido nucleico) en una base de datos especificada (por ejemplo, bases de datos de secuencias mantenidas en el National Center for Biotechnology Information (NCBI) en Bethesda, MD); “FastA” (Lipman y Pearson, 1985; véase también Pearson y Lipman, 1988; Pearson y col., 1990) efectúa una búsqueda de Pearson y Lipman para similitud entre una secuencia introducida y un grupo de secuencias del mismo tipo (ácido nucleico o proteína); “TfastA” efectúa una búsqueda Pearson y Lipman de similitud entre una secuencia de proteína introducida y un grupo de secuencias de nucleótidos (traduce la secuencia de nucleótido en seis marcos de lectura antes de efectuar la comparación); “FastX” efectúa una búsqueda de Pearson y Lipman para similitud entre una secuencia de nucleótidos introducida y un grupo de secuencias de proteínas, teniendo en cuenta el marco de lectura. “TfastX” efectúa una búsqueda de Pearson y Lipman para similitud entre una secuencia de proteína introducida y cualquier grupo de secuencia de nucleótidos, teniendo en cuenta los marcos de lectura (traduce ambas

cadenas de la secuencia de nucleótidos antes de efectuar la comparación).

Los siguientes ejemplos proporcionan realizaciones de la invención. Los ejemplos no limitan en modo alguno la invención.

Ejemplos

Ejemplo 1: Purificación de GDF-8

Se acidificaron medios condicionados a partir de una línea celular seleccionada que expresa proteína GDF-8 humana de longitud completa (GDF-8 madura + propéptido de GDF-8) a pH 6,5 y se aplicaron a una columna de intercambio aniónico POROS HQ de 80 x 50 mm en tándem con una columna de intercambio catiónico POROS SP de 80 x 50 mm (PerSeptive Biosystems, Foster City, CA). El flujo a través se ajustó a pH 5,0 y se aplicó a una columna de intercambio catiónico POROS SP de 75 x 20 mm (PerSeptive Biosystems) y se eluyó con un gradiente de NaCl. Las fracciones que contienen GDF-8, como se indica por una electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecil sulfato sódico (SDS-PAGE), se agruparon, acidificaron con ácido trifluoroacético (TFA) hasta pH 2-3, a continuación se enrasaron a 200 ml con TFA al 0,1 % para disminuir la viscosidad. La agrupación se aplicó a una columna C5 de 250 x 21,2 mm (Phenomenex, Torrance, CA) precedida por una columna de guarda de 60 x 21,2 mm (Phenomenex) y se eluyó con un gradiente de TFA/CH3CN, para separar GDF-8 madura del propéptido de GDF-8. Las fracciones agrupadas que contenían GDF-8 madura se concentraron mediante liofilización para eliminar el acetonitrilo y se añadieron 20 ml de TFA al 0,1 %. La muestra a continuación se aplicó a una columna C5 de 250 x 10 mm (Phenomenex) calentada a 60 ºC para ayudar en la separación. Esto se repitió hasta que no se pudo lograr una separación adicional. Las fracciones que contenían GDF-8 madura se agruparon y enrasaron a acetonitrilo al 40 % y se aplicaron a una columna de exclusión por tamaño BioSep S-3000 de 600 x 21,2 mm (Phenomenex) precedida por una columna de guarda de 60 x 21,2 mm. Las fracciones que contenían GDF-8 madura purificada se agruparon y concentraron para su uso en los experimentos siguientes.

Las fracciones de columna C5 que contenían propéptido de GDF-8 se agruparon, el acetonitrilo se eliminó mediante evaporación, se añadieron 20 ml de TFA al 0,1 %, y la muestra se inyectó a continuación en la columna C5 de 250 x 10 mm a 60 ºC. Esto se repitió hasta que no pudo lograrse una separación adicional. Las fracciones que contenían el propéptido de GDF-8 se agruparon y enrasaron a acetonitrilo al 40 % y se aplicaron a una columna de exclusión por tamaño BioSep S-3000 de 600 x 21,2 mm (Phenomenex) precedida de una columna de guarda de 60 x 21,2 mm. Las fracciones que contienen GDF-8 purificada se agruparon y concentraron para su uso en los experimentos siguientes.

En la SDS-PAGE, GDF-8 madura purificada migró como una banda ancha a 25 kDa en condiciones no reductoras y a 13 kDa en condiciones reductoras. Se ha notificado un perfil SDS-PAGE similar para GDF-8 murina (McPherron y col., 1997, anteriormente citado), y refleja la naturaleza dimérica de la proteína madura.

El peso molecular aparente del propéptido de GDF-8 purificado fue de 38 kDa tanto en condiciones reductoras y no reductoras. Esto indica que el propéptido de GDF-8 es en sí mismo monomérico. La diferencia entre el peso molecular aparente y el peso molecular predicho del propéptido de GDF-8, -26 kDa, puede reflejar la adición de carbohidrato, ya que su secuencia de aminoácidos contiene un sitio potencial de glicosilación unido a N (McPherron y col., 1997, anteriormente citado).

Ejemplo 2: Características de GDF-8 humana recombinante purificada

Se mezclaron y dializaron 50 g de cada una de GDF-8 madura purificada y propéptido GDF-8 purificado en 50 mM de fosfato de sodio, pH 7,0, y se efectuó una cromatografía en una columna de exclusión por tamaño BioSep S-3000 de 300 x 7,8 mm (Phenomenex). El peso molecular del complejo de GDF-8 madura: propéptido se determinó a partir del tiempo de elución, usando estándares de peso molecular (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) cromatografiados en la misma columna.

Cuando se incubó el propéptido de GDF-8 con GDF-8 madura purificada a pH neutro, las dos proteínas parecía que formaban complejo, como se indica por el perfil de exclusión por tamaño. El pico de proteína primaria eluido a 12,7 minutos tenía un peso molecular estimado de 78 kDa a partir de los estándares de peso molecular (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) cromatografiados en la misma columna. El tamaño del complejo es más coherente con un dímero de GDF-8 madura asociándose con dos monómeros de propéptido.

Para confirmar esta observación, se incubó una preparación que contenía tanto GDF-8 madura como propéptido de GDF-8 con o sin 100 mM de hidrocloruro de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC, Pierce) durante 1 hora a temperatura ambiente (TA), acidificado con HCl a pH 2-3, y concentrado con un concentrador Micron-10 Amicon (Millipore, Bedford, MA) para la SDS-PAGE, usando un gel de acrilamida tamponado con tricina al 10 %. Las proteínas se visualizaron mediante la tinción del gel con azul de Coomassie. En presencia de EDC, se observó un complejo reticulado con un peso molecular aparente de 75 kDa.

La secuencia de aminoácidos y de ADN del propéptido de GDF-8 se indican en McPherron y Lee (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94: 12457-12461.

Ejemplo 3: Producción de anticuerpo anti-GDF-8

Para desarrollar un anticuerpo capaz de inhibir la actividad de GDF-8, se inmunizó cada dos semanas a un grupo de ratones “knockout” en GDF-8 con proteína GDF-8 madura (purificada como se describe en el Ejemplo 1) mezclada en adyuvante completo de Freund para las dos primeras inmunizaciones, y adyuvante incompleto de Freund en las sucesivas. Durante el periodo de inmunización, se tomaron muestras de sangre y se evaluó la presencia de anticuerpos circulantes. A la semana 9, se seleccionó un animal con anticuerpos circulantes, se inmunizó durante tres días consecutivos, y se sacrificó. Se retiró el bazo y se homogeneizó en células. Las células esplénicas se fusionaron con un compañero de fusión de mieloma (línea P3-x63-Ag8.653) usando PEG 1500 al 50 % mediante un procedimiento establecido (Oi y Herzenberg (1980) Selected Methods in Cellular Immunology, W. J. Freeman Co., San Francisco, CA, pág. 351). Las células fusionadas se emplacaron en placas de microtitulación de 96 pocillos a una densidad de 2 x 105 células/pocillo. Después de 24 horas, las células se sometieron a selección de HAT (Littlefield (1964) Science, 145: 709) eliminando de manera efectiva cualquier célula sin fusionar y de mieloma unida de manera improductiva.

Las células de hibridoma fusionadas de manera satisfactoria que secretaban anticuerpos anti-GDF-8 se identificaron por ELISA en fase sólida y en solución. La proteína GDF-8 madura se preparó a partir de células CHO como se describe anteriormente y se recubrieron sobre poliestireno (para los ensayos en fase sólida) o se biotinilaron (para ensayo basado en solución). También se emplearon ensayos neutralizantes en los casos donde el receptor ActRIIB se recubrió sobre una placa de poliestireno y la unión de biotina a GDF-8 se inhibió mediante la adición de sobrenadante de hibridoma. Los resultados identificaron hibridomas que expresaban anticuerpos de GDF-8. Estos clones positivos se cultivaron y expandieron para estudio posterior. Estos cultivos permanecieron estables cuando las líneas celulares y expandidas se clonaron mediante dilución limitante y criopreservaron.

Se desarrolló un panel de anticuerpos a partir de estos cultivos celulares que reconocen específicamente a GDF-8 madura. El isotipo de los anticuerpos se determinó empleando un kit de isotipado de inmunoglobulina de ratón (Zymed Laboratories, San Francisco, CA). Uno de los clones de anticuerpo, designado JA-16, se estudió posteriormente.

Ejemplo 4: Caracterización de la especificidad de unión de JA-16

Para determinar la especificidad de unión de JA-16, se produjo un panel de péptidos sintéticos que correspondían a porciones de la secuencia de proteína de GDF-8. La Fig. 1 muestra los péptidos sintéticos de GDF-8 usados en este estudio. Los péptidos de número par (N2-N14) se biotinilaron en la amina primaria. Los péptidos biotinilados N2, N4, N6, N8, N10, N12, N14 y un péptido irrelevante DAE-10, se recubrieron a 1 g/ml durante 2 h a temperatura ambiente sobre placas de 96 pocillos de poliestireno recubierto con Estreptavidina Reacti-Bind™ (Pierce, Rockford, IL, Nº Cat. 15124) siguiendo el protocolo del fabricante.

Después de bloquear, se añadieron JA-16 o un anticuerpo monoclonal de control a la placa de ELISA a 100, 10 y 1 nM (solo JA-16), y se incubaron durante 30 min. Después de enjuagar la placa, se añadió un anticuerpo secundario (IgG de cabra anti-murino (H+L)-HRP, Calbiochem, San Diego, CA, Nº Cat. 401215) a una dilución 1:1000 y se incubó durante 30 minutos a temperatura ambiente. La placa se lavó cuatro veces, y se añadió sustrato TMB (KPL, Gaithersburg, MD, Nº Cat. 50-76-04). Las mediciones colorimétricas se efectuaron a 450 nm en un lector de microplacas de Molecular Devices. Los resultados se muestran en la Fig. 2. JA-16 se unió fuerte y específicamente al péptido N terminal biotinilado N8 (SEC ID Nº: 65).

GDF-8 madura y BMP-11 son homólogas en un 90 % a nivel de aminoácidos (Fig. 3). Tres de estos cambios están presentes en el péptido N8. Para comparar la especificidad de JA-16 hacia GDF-8 y BMP-11, se diseñaron péptidos más cortos, G1 y B1, específicos para GDF-8 y BMP-11, respectivamente. Las diferencias entre G1 y B1 se indican mediante subrayado.

G1: Asp-Phe-Gly-Leu-Asp-Ser-Asp-Glu-His-Ser-Thr-Glu-Ser-Arg-Cys (SEC ID Nº: 10).

B1: Asn-Leu-Gly-Leu-Asp-Ser-Asp-Glu-His-Ser-Ser-Glu-Ser-Arg-Cys (SEC ID Nº: 9).

Los péptidos G1 y B1 se conjugaron con BSA empleando un kit de conjugación PIERCE (Nº Cat. 77116ZZ) siguiendo el protocolo del fabricante. Se recubrieron G1-BSA y B1-BSA sobre placas de ensayo de fondo plano de 96 pocillos (Costar, NY, Nº Cat. 3590) a 1 g/ml en tampón de carbonato de sodio 0,2 M durante la noche a 4 ºC. Las placas se lavaron y bloquearon con PBS, BSA 1 mg/ml, Tween 0,05 % durante 1 hora a temperatura ambiente. JA-16 (5 nM) se diluyó en serie (1:2). Las diluciones se añadieron a la placa de ELISA y se incubaron durante 30 min a TA. Después de 4 lavados, se añadió un anticuerpo secundario (IgG de cabra anti-murino (H+L)-HRP, Calbiochem, Nº Cat. 401215) a una dilución 1:1000 y se incubaron durante 30 minutos a TA. Las placas se lavaron cuatro veces, y se añadió el sustrato TMB (KPL, Nº Cat. 50-76-04). Las medidas colorimétricas se efectuaron a 450 nm en un lector de microplacas de Molecular Devices. La Fig. 4 muestra que JA-16 se une a G1-BSA de manera dependiente de la concentración, pero no a B1-BSA, incluso a la concentración más alta.

Para evaluar adicionalmente la especificidad de JA-16, se recubrió G1-BSA como se describe anteriormente, pero esta vez, se preincubó JA-16 a 5 nM con o bien péptido G1 o péptido B1, GDF-8 o BMP-11 a varias

concentraciones. El resultado se muestra en la Fig. 5. El péptido específico de BMP-11 B1 no inhibe la unión de JA-16 a G1-BSA, pero G1 sí. La CI50 para GDF-8 es 0,8 g/ml, mientras que la CI50 de BMP-11 es 3,8 g/ml lo que demuestra que JA-16 reconoce a GDF-8 con una afinidad 5 veces mayor que BMP-11.

Ejemplo 5: Mapeo del epítopo de JA-16

Para mapear el epítopo exacto de JA-16, se sintetizaron péptidos 13-mer superpuestos (SEC ID Nº: 17-64, véase Fig. 6A) que corresponden a porciones de la secuencia de GDF-8 sobre papel de celulosa usando la técnica de síntesis in situ (Molina y col. (1996) Peptide Research, 9: 151-155; Frank y col. (1992) Tetrahedron, 48: 9217-9232). En esta matriz, los restos de cisteína se reemplazaron con serina a fin de reducir las complicaciones químicas que causa la presencia de cisteína. Las membranas de celulosa modificadas con polietilenglicol y aminoácidos protegidos con Fmoc se compraron a Abimed (Lagenfeld, Alemania). La matriz se definió sobre la membrana acoplando un espaciador de -alanina y los péptidos se sintetizaron empleando química de acoplamiento estándar DIC (diisopropilcarbodiimida)/HOBt (hidroxibenzotriazol) como se describió anteriormente (Molina y col. (1996) Peptide Research, 9: 151-155; Frank y col. (1992) Tetrahedron, 48: 9217-9232).

Los aminoácidos activados se localizaron empleando un robot Abimed ASP 222. Las etapas de lavado y desprotección se efectuaron manualmente y los péptidos se acetilaron en N terminal después del ciclo final de síntesis. Después de la síntesis de péptidos, la membrana se lavó en metanol durante 10 minutos y en bloqueante (TBST (salino Tris tamponado con 0,1 % (v/v) de Tween 20) + 1 % (p/v) de caseína) durante 10 minutos. La membrana se incubó a continuación con 2,5 g/ml de JA-16 en bloqueante durante 1 hora con agitación suave. Después de lavar 3 veces con bloqueante durante 10 minutos, la membrana se incubó con anticuerpo secundario marcado con HRP (0,25 g/ml en bloqueador) durante 30 minutos. La membrana se lavó a continuación 3 veces durante 10 minutos cada una con bloqueante y 2 veces durante 10 minutos cada una con TBST. El anticuerpo unido se visualizó usando reactivo SuperSignal West (Pierce) y una cámara digital (Alphalnnotech FluorImager). Los resultados se muestran en la Fig. 6B. JA-16 se unió a los primeros 4 péptidos de la matriz (SEC ID Nº: 17-20), que corresponden a 18 restos del N terminal de GDF-8.

Para caracterizar adicionalmente el epítopo de JA-16, se efectuaron análisis de sustitución y deleción del péptido Gly-Leu-Asp-Ser-Asp-Glu-His-Ser-Thr-Glu-Ser-Arg-Ser (SEC ID Nº: 18) empleando síntesis in situ. En los análisis de sustitución, cada resto de este péptido se reemplazó individualmente con cada uno de los 20 aminoácidos naturales excepto cisteína, generando las SEC ID Nº: 3, 18, 66-104, 106-113, y 115-128. Los ensayos de síntesis y unión se efectuaron como se describe anteriormente. Los resultados se muestran en la Fig. 7. Las sustituciones en los 4 aminoácidos N terminal y los 4 aminoácidos C terminal se toleraron bien, lo que sugiere que estos aminoácidos no eran necesarios para la unión de JA-16 a GDF-8 madura. Sin embargo, no se toleraron otros cambios en el segmento medio de este péptido, Asp-Glu-His-Ser-Thr (SEC ID Nº: 3), excepto por unas pocas sustituciones en el resto de serina, lo que sugiere que esta secuencia peptídica era necesaria para la unión de JA-16. Además, la secuencia Asp-Glu-His-Ser-Thr (SEC ID Nº: 3) era el péptido más pequeño al que se podía detectar unión en el análisis de deleción. Por tanto, los resultados sugieren que JA-16 reconoce el epítopo Asp-Glu-His-Ser-Thr (SEC ID Nº: 3) en GDF-8, siendo importantes los restos Asp, Glu, His y Thr (Asp-Glu-His-Xaa-Thr (SEC ID Nº: 2)) para la unión.

Ejemplo 6: Caracterización de JA-16 in vitro

Se llevaron a cabo dos ensayos para determinar la capacidad de JA-16 para neutralizar la actividad de GDF-8 in vitro. Primeramente, se evaluó la capacidad de JA-16 para inhibir la proteína GDF-8 madura uniéndose al receptor ActRIIB. La quimera recombinante ActRIIB.Fc (R&D Systems, Minneapolis, MN, Nº Cat. 339-RB/CF) se recubrió sobre placas de ensayo de fondo plano de 96 pocillos (Costar, Nº Cat. 3590) a 1 g/ml en tampón de carbonato de sodio 0,2 M durante la noche a 4 ºC. Las placas se bloquearon a continuación con 1 mg/ml de albúmina de suero bovino y se lavaron siguiendo las técnicas estándar de ELISA.

Se añadieron 100 l de proteína GDF-8 madura biotinilada a las placas de ELISA bloqueadas, se incubaron durante 1 hora, y se lavaron. La cantidad de proteína GDF-8 madura unida se detectó mediante estreptavidina-peroxidasa de rábano picante (SA-HRP, BD PharMingen, San Diego, CA, Nº Cat. 13047E) seguido de la adición de TMB (KPL, Nº Cat. 50-76-04). Las mediciones colorimétricas se efectuaron a 450 nm en un lector de microplacas Molecular Devices. Los resultados se muestran en la Fig. 8. GDF-8 madura mostró un DE50 de 12 ng/ml.

También se llevó a cabo el mismo protocolo después de preincubar el anticuerpo JA-16 con proteína GDF-8 madura biotinilada a 5 ng/ml durante 30 min. Se incluyó un anticuerpo monoclonal irrelevante como control negativo. La Fig. 9 muestra que JA-16 tiene una actividad neutralizante in vitro muy débil de aproximadamente 1 M. Estos datos in vitro sugieren que JA-16 es poco probable que sea un buen neutralizante de GDF-8 activa, especialmente en condiciones in vivo menos controladas.

En un segundo conjunto de ensayos, se llevó a cabo un ensayo de gen indicador para evaluar la actividad biológica de la proteína GDF-8 activa in vitro. El ensayo usa un vector indicador, pGL3(CAGA)12, unido a luciferasa. Se ha comunicado anteriormente que la secuencia CAGA es una secuencia de respuesta a TGF- en el promotor del gen inducido de TGF-, PAI-1.

El vector indicador que contiene 12 cajas CAGA se produjo empleando el plásmido indicador básico, pGL3 (Promega Corporation, Madison, WI, Nº Cat. E1751). Se insertaron la caja TATA y el sitio de iniciación de la transcripción del promotor tardío principal del adenovirus (-35/+10) entre los sitios BgIII e HindIII. Los oligonucleótidos que contienen doce repeticiones de las cajas CAGA AGCCAGACA se anillaron y clonaron en el sitio Xhol. La línea celular de rabdomiosarcoma humano A204 (ATCC HTB-82), se transfectó transitoriamente con pGL3(CAGA)12 usando reactivo de transfección FuGENE 6 (Roche Diagnostics, Indianapolis, MN Nº Cat. 1 814 443). Después de la transfección, las células se cultivaron en placas de 48 pocillos en medio McCoys 5A (Life Technologies, Rockville, M, Nº Cat. 21500-079) suplementado con glutamina 2 mM, estreptomicina 100 U/ml, penicilina 100 g/ml y suero fetal bovino al 10 % durante 16 horas. Las células a continuación se trataron con GDF-8 madura, BMP-11, o activina en medio McCoy 5A con glutamina, estreptomicina, penicilina, y 1 mg/ml de albúmina de suero bovino durante 6 h a 37 ºC. Se cuantificó la luciferasa en las células tratadas empleando Luciferase Assay System (Promega Corporation, Madison, WI, Nº Cat. E1483). GDF-8 activó máximamente la construcción indicadora 10 veces, con un DE50 de 10 mg/ml de GDF-8. BMP-11, que es un 90 % idéntica a GDF-8 a nivel de aminoácidos (Gamer y col. (1999) Dev. Biol., 208(1): 222-32; Nakashima y col. (1999) Mech. Dev., 80(2): 185-9), y activina suscitaron una respuesta biológica similar.

La actividad neutralizante de JA-16 se determinó preincubando JA-16 con proteína GDF-8 madura durante 30 min antes de la adición de las células A204. También se ensayaron un anticuerpo irrelevante (control monoclonal) así como un anticuerpo de GDF-8 humana derivado de la librería phagemid scFv empleando tecnología de visualización de fagos (Myo-19).

La Fig. 10 muestra que, también en este ensayo, JA-16 es débilmente neutralizante con un CI50 de aproximadamente 1 M, mientras que la CI50 de Myo-19 es aproximadamente 100 nM. Basándose a los datos in vitro, se podría haber esperado que el anticuerpo Myo-19 fuese un mejor neutralizante de la proteína GDF-8 activa que JA-16 in vivo, lo que no es el caso, como se muestra en el presente documento.

Ejemplo 7: Inmunoprecipitación de GDF-8 con JA-16

Para evaluar la unión de JA-16 a GDF-8 madura y complejos de GDF-8, se efectuaron una serie de estudios de inmunoprecipitación.

En primer lugar, para determinar si JA-16 puede inmunoprecipitar el complejo latente de GDF-8, se radiomarcaron células CHO que expresan GDF-8 con 35S-metionina y 35S-cisteína. Se incubaron 100 l de medio condicionado para estas células que contiene complejo latente de GDF-8 con 1 mg/ml de JA-16 durante 1 hora a 4 ºC. Se añadió proteína A sefarosa a la mezcla, que se incubó a continuación durante la noche a 4 ºC. Se recogió el inmunoprecipitado, se lavó tres veces con un tampón PBS/Triton-X100, se resuspendió en tampón de muestra reductor y se analizó mediante SDS-PAGE. Se fijó el gel durante la noche, se mejoró con solución mejoradora de autorradiografía, se secó y se reveló el autorradiograma. La Figura 18, carril 2, muestra que JA-16 puede inmunoprecipitar el complejo latente de GDF-8 y GDF-8 sin procesar.

En segundo lugar, para determinar si JA-16 puede inmunoprecipitar un complejo formado entre GDF-8 y folistatina, se radiomarcaron con 35S-metionina y 35S-cisteína células CHO que expresan folistatina. Se mezclaron 100 l de medio condicionado que contiene folistatina radiomarcada con GDF-8 madura para formar un complejo de GDF-8 con folistatina. La mezcla se incubó con 1 mg/ml de JA-16 durante 1 h a 4 ºC. La proteína A sefarosa se añadió a la mezcla, que a continuación se incubó durante la noche a 4 ºC. El inmunoprecipitado se recogió y analizó como se describe anteriormente. La Figura 18, carril 6, muestra que JA-16 puede co-inmunoprecipitar a la folistatina marcada en complejo con GDF-8.

En tercer lugar, para investigar si JA-16 puede inmunoprecipitar a la proteína GDF-8 madura, se activó con un medio condicionado de células CHO que contenían complejo latente de GDF-8 radiomarcado para disociar el propéptido de GDF-8 y GDF-8 madura (véase van Waarde y col. (1997) Analytical Biochemistry, 247, 45-51). Este material se incubó a continuación con JA-16 durante 1 hora a 4 ºC. El resto del protocolo se llevó a cabo como se describe anteriormente. La Figura 18, carril 3, muestra que JA-16 puede inmunoprecipitar a GDF-8 madura.

Los resultados indican que JA-16 puede reconocer al complejo latente de GDF-8, al complejo GDF-8:folistatina, y a GDF-8 madura. Sin embargo, Myo-19 no puede unirse a cualquiera de los complejos de GDF-8 (Fig. 18, carriles 4 y 7) y solo puede inmunoprecipitar a GDF-8 madura (Fig. 18, carril 5).

Ejemplo 8: Caracterización de JA-16 in vivo

Para determinar si el anticuerpo JA-16 aumenta la masa muscular en ratones adultos, se llevó a cabo un estudio in vivo con ratones BALB/c hembras de siete semanas de edad. Los ratones se pesaron y se distribuyeron uniformemente respecto a su peso corporal en grupos de siete u ocho. Se inyectó en los ratones por vía intraperitoneal JA-16 en PBS o un anticuerpo de isotipo emparejado a veneno de serpiente (control) a 50 mg/kg dos veces a la semana. El tratamiento continuó durante cuatro semanas. Se evaluó el aumento de la masa corporal magra de los animales sometiéndolos a un análisis dexascan antes y después del periodo de tratamiento. La masa muscular se evaluó diseccionando y pesando los gastrocnemius y cuádriceps. También se retiró el panículo adiposo

peri-uterino y se pesó. Los resultados de estudio indican que JA-16 inhibe significativamente la actividad de GDF-8 in vivo lo que da lugar a una masa muscular aumentada (Fig. 11).

También se llevó a cabo un estudio de mayor duración en el que los anticuerpos se administraron intraperitonealmente a 60 mg/kg/semana durante 14 semanas. Estos ratones se cargaron al comienzo del estudio con 60 mg/kg intraperitonealmente y 10 mg/kg por vía intravenosa. Los ratones en este estudio eran ratones C57BL machos que eran o bien tipo silvestre en el locus de agutí (a) o portaban la mutación letal amarilla (Ay) en ese locus. La mutación Ay causa un desarrollo de obesidad y diabetes en adultos, lo que permitió determinar el efecto de JA-16 en músculo, exceso de grasa, y glucosa en sangre en un origen diabético. La masa corporal total se midió semanalmente (Fig. 12). La masa muscular se evaluó diseccionando y pesando el gastrocnemius y cuádriceps (Fig. 13). Los panículos adiposos epididimales e inguinales también se retiraron y pesaron (Fig. 14). A las doce semanas del estudio, los ratones se sometieron a ayuno y se midieron los niveles de glucosa en sangre (Fig. 15). Como en el caso del estudio de cuatro semanas, los resultados de este estudio indican que JA-16 inhibe la actividad GDF-8 in vivo causando un aumento de la masa muscular. Además, este estudio indica que en los ratones diabéticos y obesos, la inhibición de GDF-8 conduce a niveles mejorados de glucosa en sangre.

La actividad in vivo de JA-16 también se comparó con la actividad in vivo de otro anticuerpo de GDF-8, Myo-19. Se inyectó a ratones C57B6/scid intraperitonealmente durante cinco semanas con vehículo control o con 60 mg/kg de dosis de carga más 60 mg/kg por semana de JA-16 o Myo-19. La masa corporal total se midió semanalmente y la masa muscular se evaluó diseccionando y pesando los gastrocnemius y cuádriceps (Fig. 17). Mientras que cinco semanas de tratamiento con JA-16 condujeron un aumento en la masa muscular, el tratamiento con Myo-19 no afectó a la masa muscular. En otro experimento, el tratamiento con Myo-19 se extendió hasta 10 y 15 semanas, y no se observó aumento de masa corporal o masa muscular en estos periodos de tiempo.

Por tanto, a pesar del hecho de que los datos in vitro sugiriesen que JA-16 era un neutralizador más débil que Myo-19, los estudios en ratón demuestran claramente, pero inesperadamente, que JA-16 reduce la actividad de GDF-8 in vivo de manera efectiva mientras que Myo-19 no lo hace. Estos resultados indican que el sitio específico de GDF-8 al que se une JA-16 es único en tanto que este sitio es responsable de la formación de un complejo GDF-8:anticuerpo inhibidor estable in vivo. Por tanto, se espera que cualquier anticuerpo que se una específicamente a este sitio, como se identifica en el Ejemplo 4, posea propiedades neutralizantes in vivo similares o mejores que las de JA-16.

Ejemplo 9: JA-16 aumenta la fuerza muscular

En los seres humanos, el tamaño y fuerza muscular disminuye aproximadamente un 1 % por año empezando a partir de la tercera década de vida. Para mucha gente envejecida, la pérdida de masa muscular es significativamente debilitante. Esta afección se conoce como sarcopenia, o pérdida de músculo relacionada con la edad. Para determinar si el tratamiento con anti-GDF-8 es efectivo para la sarcopenia, se trataron con JA-16 ratones envejecidos (19 meses de edad al comienzo del estudio y 21 meses de edad al final del estudio) durante 8 semanas a 60 mg/kg una vez a la semana. En el mismo experimento, se trataron ratones jóvenes (2 meses de edad al comienzo del estudio y 4 meses de edad al final del estudio) con la misma dosis de JA-16. Al final del estudio, ambos grupos de ratones tenían mayor masa muscular que los controles tratados con el vehículo como se ve, por ejemplo, mediante la comparación de la masa del cuádriceps (Fig. 19A).

Para confirmar que el aumento de tamaño del músculo conduce a un aumento de la fuerza muscular, se efectuaron pruebas de fuerza de agarre con ratones envejecidos y jóvenes tratados con JA-16 durante ocho semanas empleando un medidor comprado a Columbia Instruments (Columbus, Ohio; modelo 1027csx). Se dejó que los ratones se agarrasen y tirasen de la rejilla, y se registró la fuerza de tirón más alta. Los ratones sin entrenar se evaluaron cinco veces en sucesión sin descanso. Se registró el pico de fuerza para cada prueba y los resultados de las cinco pruebas se promediaron para cada ratón. Después de siete semanas de tratamiento, el pico de fuerza para los ratones jóvenes tratados con JA-16 fue un 10 % mayor y para los ratones tratados con JA-16 envejecidos fue de un 13 % mayor que el pico de fuerza para los ratones tratados con el vehículo (Fig. 19B). Además, las medidas longitudinales tomadas antes y después de 7 semanas de tratamiento mostraron que la fuerza de los ratones envejecidos aumentó un 17 % (p < 0,01) con el tratamiento de JA-16, mientras que la fuerza de los ratones envejecidos tratados con vehículo no cambió significativamente (3,3 %, p = 0,66). Estos resultados confirman que la inhibición de GDF-8 conduce a un aumento en el tamaño muscular y fuerza tanto en ratones jóvenes y envejecidos y que puede ser una terapia útil para la sarcopenia.

Ejemplo 10: JA-16 aumenta la masa muscular y fuerza en músculo distrófico

La capacidad de inhibición in vivo de GDF-8 para mejorar la distrofia muscular se evaluó en el modelo de ratón mdx de distrofia muscular de Duchenne (DMD). El modelo de DMD se ha descrito, por ejemplo, por Torres y col. (Brain (1987) 110, 269-299) y Hoffman y col. (Science (1987) 238, 347-350).

Se trataron ratones machos mdx de cuatro semanas con inyecciones intraperitoneales de JA-16 (60 m/kg), y solo vehículo (grupo control) durante 3 meses. Para cuantificar el aumento de masa muscular, los animales se sacrificaron y se diseccionaron y pesaron los músculos extensores digitales largos (EDL). Como se muestra en la

Figura 20A, los músculos EDL del grupo de animales tratados pesaron significativamente más que los controles. Cabe destacar que el aumento relativo en masa muscular fue mayor que el aumento en peso corporal como se muestra en la Figura 20B. De manera coherente con estos datos, se vio que otros grupos musculares incluyendo los gastrocnemius, tibiales anteriores y cuádriceps tenían similares aumentos en peso.

Para cuantificar la producción absoluta de fuerza o fuerza muscular, se registró la máxima fuerza isométrica producida tras la despolarización de los músculos empleando electrodos de campo. Las Figuras 20C y 20D muestran que los ratones mdx tratados con JA-16 fueron capaces de ejercer una fuerza máxima significativamente mayor durante ya sea con tracción o tétanos. El aumento en la fuerza muscular fue proporcional al aumento en masa muscular (Figuras 20A, 20C, y 20D). Estos resultados ofrecen pruebas fisiológicas de la eficacia terapéutica predicha de los inhibidores de GDF-8 como JA-16 en el tratamiento de distrofia muscular y enfermedades relacionadas.

Para verificar independientemente la mejora del fenotipo distrófico observado en los diafragmas de mdx, así como determinar la mejora en el estado patológico de la musculatura esquelética de mdx en total, se analizaron los niveles de Creatinín quinasa (CK) en suero de estos ratones. Los niveles extremadamente altos de CK se observan de manera coherente con la deficiencia distrófica en ratones mdx y seres humanos debido a los daños del sarcolema (Bulfield y col. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 1189-1192 y Matsuda y col. (1995) J. Biochem. (Tokyo) 118, 959-64). Al comienzo del ensayo, tanto los grupos tratados como los grupos control de ratones mdx tenían elevaciones marcadas de CK en suero en comparación con ratones normales. Sin embargo, después de tres meses de bloqueo de miostatina in vivo hubo una disminución dramática en los niveles de CK en suero de los ratones mdx tratados (Figura 4c). El descenso en la degeneración muscular y fibrosis emparejada con la reducción de CK ofrece muestras histológicas y bioquímicas para una mejora funcional en el músculo de mdx producido por el bloqueo de miostatina in vivo.

Ejemplo 11: Papel in vivo de GDF-8 en el hueso trabecular

La carga mecánica aumentada, ya sea debido a una actividad muscular aumentada o a un peso corporal aumentado, se asocia con un aumento de la masa y densidad óseas. Por tanto, los ratones knockout en GDF-8 (KO) se evaluaron para masa ósea y microarquitectura alteradas. Una evaluación inicial de ratones adultos mostró que la densidad ósea en la columna de los ratones KO era aproximadamente dos veces mayor que la de sus compañeros de camada de tipo silvestre. Este aumento excedía ampliamente lo que se podría esperar únicamente debido a la masa muscular aumentada en los ratones KO de GDF-8.

Se empleó toma de imágenes de alta resolución microtomográficas (CT40, Scanco Medical, Suiza) para evaluar la fracción de volumen de hueso trabecular y microarquitectura en la 5ª vértebra lumbar y fémur distal y la geometría del hueso cortical en la diáfisis media femoral de ratones de tipo silvestre (TS) y KO en GDF-8. Se tomaron muestras de ratones machos y hembras KO en GDF-8 de 9-10 meses de edad y controles de la camada (cuatro ratones de cada genotipo y sexo). Se escanearon el cuerpo vertebral entero y el fémur usando tomografía microcomputerizada a una resolución de 12 m. Se identificaron regiones de interés que englobaban el hueso trabecular del cuerpo vertebral o el hueso trabecular de la metafisis femoral distal (es decir, esponjosa secundaria) usando un algoritmo de formación de contornos semiautomatizado. Se calcularon los siguientes parámetros usando evaluaciones en 3D directas: volumen de la fracción ósea (%), espesor trabecular (m), separación (m) y número (1/mm). Además, se evaluó la densidad de conectividad, un indicador de cómo está de bien conectada la red trabecular, así como parámetros de hueso cortical en la región centrodiafisárea en el fémur, incluyendo el área total, área de hueso, y espesor cortical.

Los ratones KO tanto machos como hembras tenían una densidad ósea trabecular dramáticamente aumentada en el cuerpo vertebral en comparación con los compañeros de camada de TS (n=4, +93 % y +70 %, respectivamente, p<0,0001). Esta densidad de hueso trabecular aumentada se acompañó por un aumento del 14 % en el espesor trabecular (p=0,03), un aumento del 38 % en el número trabecular (p=0,0002), y una disminución del 10 % en la separación trabecular (p=0,009). El efecto combinado de estos cambios en la arquitectura y densidad dieron como resultado un aumento de 3,4 y 1,7 veces en conectividad en ratones machos KO y hembra, respectivamente, en comparación con sus compañeros de camada de TS (p<0,0001). Además, una medida aproximada del nivel de mineralización del hueso trabecular indicó que el contenido mineral medio de las trabéculas era un 8 % mayor en los ratones KO en relación a los controles (p<0,0001). Parece observarse que el efecto es mayor en los ratones machos que en los ratones hembra, pero el tamaño de la muestra es demasiado pequeño para tomar conclusiones definitivas. Las características del hueso trabecular vertebral evaluadas mediante tomografía microcomputerizada de alta resolución se muestran en la Tabla 1.

En comparación con las observaciones en la columna vertebral, los ratones machos y hembras KO tenían una densidad ósea trabecular menor en el fémur distal que los compañeros de cama TS (n=4, p=0,05 para efecto genotípico general) (Tabla 2). Este descenso en la densidad ósea fue más pronunciado en las hembras KO que en los ratones KO machos. Los ratones KO en GDF-8 tenían un espesor trabecular similar al de sus compañeros de camada de TS, pero tenían menos trabéculas y una separación trabecular aumentada en comparación con los controles de camada. Sin embargo, aunque el espesor cortical en la diáfisis femoral fue similar en los ratones machos KO en GDF-8 y sus controles de camada, fue aproximadamente un 10 % mayor en los ratones hembra KO

en GDF-8 que en sus compañeros de camada TS (n=4, p=0,04) (véase Tabla 3). No hubo diferencias en el área de hueso cortical o fracción de área ósea entre los dos genotipos.

TABLA 1: Características del hueso trabecular vertebral (media  SEM)

TS Macho

KO Macho TS Hembra KO Hembra

Fracción de volumen óseo (%)

23,3  4,7 45,0  5,5 27,5  5,5 46,9  10,8

Espesor trabecular (m)

52  3 58  6 52  5 61  8

Separación Trabecular (m)

210  21 145  8 183  21 169  41

Número trabecular (1/mm)

4,6  0,4 7,0  0,4 5,2  0,4 6,6  1,3

Densidad de conectividad (1/mm3)

137 15 470 6 114 198  29 339  81

Grado de anisotropía

1,68  0,08 1,29  0,02 1,54  0,12 1,34  0,03

TABLA 2: Características del hueso trabecular en la metáfisis femoral distal (media  SEM)

TS Macho

KO Macho TS Hembra KO Hembra

Fracción de volumen óseo (%)

5,1  1,8 2,9  1,7 11,9  7,0 5,4  3,1

Espesor trabecular (m)

68  1,2 68  2,7 73  7 63  9

Separación Trabecular (m)

353  16 472  90 296  73 464  98

Número trabecular (1/mm)

2,84  0,12 2,24  0,51 3,46  0,69 2,26  0,57

Densidad de conectividad (1/mm3)

5,9  3,7 4,0  6,9 31,5  25,2 15,4  15,1

TABLA 3: Características del hueso cortical en la de la diáfisis media femoral (media  SEM)

TS Macho

KO Macho TS Hembra KO Hembra

Área ósea (mm2)

5,1  1,8 2,9  1,7 11,9  7,0 5,4  3,1

Espesor cortical (m)

68  1,2 68  2,7 73  7 63  9

Área ósea/Área total (%)

353  16 472  90 296  73 464  98

Ejemplo 12: Tratamiento de trastornos degenerativos de músculo y hueso

10 Los inhibidores de GDF-8, como por ejemplo anticuerpos inhibidores, son útiles para tratamientos dirigidos hacia masa muscular aumentada, y también para la prevención y tratamiento de osteoporosis. Además, la inhibición de GDF-8 puede ser útil en otros casos en los que se desea un efecto anabólico del hueso, como un aumento de la curación de hueso (es decir, reparación de fracturas, fusión espinal, etc.). Los anticuerpos anti-GDF-8 de la invención se usan para tratar a un sujeto al inicio de la enfermedad o que tiene establecida una enfermedad

15 degenerativa del músculo o del hueso.

La eficiencia de los anticuerpos anti-GDF-8 para el tratamiento de trastornos del hueso, por ejemplo, osteoporosis, se confirma usando modelos de osteoporosis bien establecidos. Por ejemplo, se han usado ratones ovariectomizados para probar la eficacia de nuevos tratamientos médicos contra la osteoporosis (Alexander y col. (2001) J. Bone Min. Res. 16: 1665-1673; y Anderson y col. (2001) J. Endocrinol. 170: 529-537). De manera similar a

20 los seres humanos, estos roedores muestran una rápida pérdida de hueso después de la ovariectomía, especialmente en el hueso esponjoso. La evaluación de los resultados se basa en la densidad mineral de hueso, marcadores bioquímicos de regeneración ósea en suero y orina, fuerza ósea, e histología/histomorfometría.

En un estudio, se ovariectomizan ratones hembra normales o inmunocomprometidos de 12-16 semanas de edad y se deja que pierdan hueso durante entre cuatro y seis semanas. Después de este periodo de pérdida ósea, se lleva 25 a cabo un tratamiento con un anticuerpo anti-GDF-8 como JA-16 (inyección IP) o vehículo durante uno a seis meses.

El protocolo de tratamiento puede variar, con ensayos de diferentes dosis y regímenes de tratamiento (por ejemplo, inyecciones diarias, semanales, o bisemanales). Se anticipa que los ratones (o ratas) ovariectomizados sin tratar pueden perder aproximadamente un 10-30 % de densidad ósea en relación a los ratones intactos (es decir, sin ovariectomizar) de edad coincidente. Se anticipa que los ratones tratados con el anticuerpo anti-GDF-8 pueden tener una masa ósea y densidad ósea entre un 10 y un 50 % mayor que aquellos ratones que reciben placebo, y además este aumento en la densidad ósea puede estar asociado con fuerza ósea aumentada, especialmente en las regiones con una mayor proporción de hueso esponjoso en comparación con hueso cortical.

El objetivo de otro estudio es demostrar que el anticuerpo anti-GDF-8 como JA-16 es efectivo en la prevención de la disminución de la masa, microarquitectura y fuerza ósea asociada con una deficiencia de estrógenos. Por tanto, el estudio tiene un diseño similar al descrito anteriormente, excepto que el tratamiento con anticuerpo anti-GDF-8 puede iniciarse inmediatamente después de la ovariectomía, en vez de después del periodo de pérdida ósea. Se anticipa que los ratones tratados con el anticuerpo pueden perder significativamente menos masa ósea después de la ovariectomía que los ratones tratados con vehículo.

Los anticuerpos inhibidores contra GDF-8 también se usan para prevenir y/o reducir la severidad y/o los síntomas de la enfermedad. Se anticipa que los anticuerpos anti-GDF-8 pueden administrarse como una inyección subcutánea con tanta frecuencia como una vez al día y tan infrecuentemente como una vez al mes. La duración del tratamiento puede variar entre un mes y varios años.

Para evaluar la eficiencia clínica de anti-GDF-8 en seres humanos, se identifican mujeres postmenopáusicas con baja masa ósea evaluando la densidad ósea y se asignan al azar a un grupo de tratamiento. Los grupos del tratamiento incluyen un grupo placebo y de uno a tres grupos que reciben anticuerpo (diferentes dosis). Se realiza un seguimiento prospectivo de los individuos durante uno a tres años para evaluar los cambios en los marcadores bioquímicos de regeneración ósea, cambios en la densidad mineral del hueso y la ocurrencia de fracturas de fragilidad. Se anticipa que los individuos que reciben tratamiento pueden mostrar un aumento en la densidad mineral ósea en el fémur proximal y la columna lumbar de un 2-30 % en relación a los de referencia, y pueden tener una incidencia disminuida de fracturas de fragilidad. Se anticipa que los marcadores bioquímicos de formación ósea pueden aumentar.

Los anticuerpos se administran como el único principio activo o en combinación con otro compuesto o composición. Cuando se administran como único principio activo o en combinación con otro compuesto o composición, la dosificación puede ser de entre aproximadamente 1 g/kg y 20 mg/kg, dependiendo de la severidad de los síntomas y la progresión de la enfermedad. La dosis apropiada efectiva se selecciona por un clínico tratante de entre los siguientes intervalos: 1 g/kg y 20 mg/kg, 1 g/kg y 10 mg/kg, 1 g/kg y 1 mg/kg, 10 g/kg y 1 mg/kg, 10 g/kg y 100 g/kg, 100 g y 1 mg/kg, y 500 g/kg y 1 mg/kg. Los regímenes de tratamiento ejemplares y resultados se resumen en la Tabla 4.

TABLA 4: Ejemplos de los casos clínicos

Paciente Nº

Estado antes del tratamiento Régimen de tratamiento Resultado

Paciente 1

Sin signos clínicos, postmenopáusica y/o mayor de 60 años de edad 0,01-1 mg/kg bisemanalmente durante 424 semanas Mantenimiento y/o aumento de la masa muscular/ósea

Paciente 2

Signos clínicos leves, pérdida de masa muscular y/o pérdida ósea 0,01-20 mg/kg semanalmente durante 4 o más semanas Mantenimiento y/o aumento de la masa muscular/ósea

Paciente 3

Estado de osteoporosis avanzado 0,01-20 mg/kg dos veces a la semana durante 6 o más semanas Mejora de los signos clínicos, mantenimiento y/o aumento de la masa muscular/ósea

Paciente 4

Pérdida ósea muscular y severa 0,01-20 mg/kg diariamente durante 6 o más semanas Mejora de los signos clínicos, reducción en la severidad de los síntomas y/o aumento de la masa muscular/ósea

Ejemplo 13: Tratamiento de trastornos metabólicos

Los inhibidores de GDF-8, como, por ejemplo anticuerpos inhibidores, son útiles para el tratamiento de trastornos metabólicos como diabetes de tipo 2, tolerancia impedida a la glucosa, síndrome metabólico (por ejemplo, síndrome X), resistencia a la insulina inducida por trauma (por ejemplo, quemaduras), y trastornos del tejido adiposo (por ejemplo, obesidad). Los anticuerpos anti-GDF-8 de la invención se usan para tratar a un sujeto al inicio de la enfermedad o que tiene un trastorno metabólico establecido.

La eficiencia de los anticuerpos anti-GDF-8 para el tratamiento de trastornos metabólicos, por ejemplo, diabetes tipo 2 y/u obesidad, se confirma empleando modelos murinos de obesidad, resistencia a la insulina y diabetes de tipo 2 bien establecidos, incluyendo ob/ob, db/db, y cepas que portan la mutación amarilla letal. La resistencia a la insulina también puede inducirse por alimentación alta en grasas o alta en calorías a ciertas cepas de ratón incluyendo C57BL/6J. De manera similar a los seres humanos, estos roedores desarrollan resistencia a la insulina, hiperinsulinemia, dislipidemia, y deterioración de la homeostasis de la glucosa que da como resultado hiperglucemia. La evaluación de los resultados se basa en medidas de glucosa, insulina, y lípidos en suero. La sensibilidad mejorada a la insulina puede determinarse por ensayos de tolerancia a la insulina y ensayos de tolerancia a la glucosa. Las técnicas más sensibles pueden incluir el uso de pinzas euglucémicas-hiperinsulinémicas para evaluar las mejoras en el control glucémico y sensibilidad a la insulina. Además, las técnicas de pinzas pueden permitir una evaluación cuantitativa del papel de los principales tejidos eliminadores de glucosa (por ejemplo, muscular, adiposo, y hepático) en un control glucémico mejorado.

En un estudio, el tratamiento con anticuerpo anti-GDF-8 como JA-16 (inyección IP) o vehículo se lleva a cabo durante entre una semana y seis meses. El protocolo de tratamiento puede variar, con evaluación de diferentes dosis y regímenes de tratamiento (por ejemplo, inyecciones diarias, semanales, o bisemanales). Se anticipa que los ratones tratados con el anticuerpo anti-GDF-8 pueden tener una captación mayor de glucosa, glucólisis y síntesis de glucógeno aumentadas, ácidos grasos libres y triglicéridos más bajos en suero, comparados con los ratones que reciben un tratamiento con placebo.

Los anticuerpos inhibidores contra GDF-8 también se usan para prevenir y/o reducir la severidad y/o los síntomas de la enfermedad. Se anticipa que los anticuerpos anti-GDF-8 pueden administrarse como inyección subcutánea tan frecuentemente como una vez al día y tan infrecuentemente como una vez al mes. La duración del tratamiento puede variar entre un mes y varios años.

Para evaluar la eficacia clínica de anti-GDF-8 en seres humanos, se identifican sujetos que padecen o están en riesgo de padecer diabetes de tipo 2 y se asignan al azar a un grupo de tratamiento. Los grupos de tratamiento incluyen un grupo del placebo y de uno a tres grupos que reciben anticuerpo (diferentes dosis). Se hace un seguimiento prospectivo de los pacientes durante entre un mes y tres años para evaluar los cambios en el metabolismo de la glucosa. Se anticipa que los individuos que reciben tratamiento pueden mostrar una mejoría.

Los anticuerpos se administran como el único principio activo o en combinación con otro compuesto o composición. Cuando se administran como el único principio activo o en combinación con otro compuesto o composición, la dosificación puede ser entre aproximadamente 1 g/kg y 20 mg/kg, dependiendo de la severidad de los síntomas y de la progresión de la enfermedad. La dosis efectiva apropiada se selecciona por un clínico tratante de entre los siguientes intervalos: 1 g/kg y 20 mg/kg, 1 g/kg y 10 mg/kg, 1 g/kg y 1 mg/kg, 10 g/kg y 1 mg/kg, 10 g/kg y 100 mg/kg, 100 g y 1 mg/kg, y 500 g/kg y 1 mg/kg. Los regímenes de tratamiento ejemplares y resultados se resumen en la Tabla 5.

TABLA 5: Ejemplos de los casos clínicos

Paciente Nº

Estado antes del tratamiento Régimen de tratamiento Resultado

Paciente 1

Sin signos clínicos, historia familiar de diabetes de tipo 2 0,01-1 mg/kg cada 4 semanas durante 48 semanas Prevención de la diabetes tipo 2

Paciente 2

Signos clínicos leves de síndrome X 0,01-20 mg/kg semanalmente durante 4 o más semanas Mejora de la tolerancia a la insulina y metabolismo de la glucosa, y menor presión sanguínea

Paciente 3

Estado avanzado de diabetes tipo 2 0,01-20 mg/kg dos veces a la semana durante 6 o más semanas Mejora de los signos clínicos, reducción en la severidad de los síntomas y/o aumento en la proporción masa muscular/grasa corporal

Paciente 4

Resistencia a la insulina severa y obesidad 0,01-20 mg/kg diariamente durante 6 o más semanas Mejora de los signos clínicos, reducción en la severidad de los síntomas y/o disminución en la grasa corporal.

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> Wyeth

<120> Anticuerpos inhibidores de GDF-8 y usos de los mismos

<130> 08702.00012-00304

5

<140> Sin asignar <141> <150> 60/324.528 <151>

10

<160> 131 <170> Patent In versión 3.1

15

<210> 1 <211> 113 <212> PRT <213> Homo sapiens

20

<220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> X es un aminoácido desconocido

25

<220> <221> misc_feature <222> (113)..(113) <223> X es un aminoácido desconocido

<400> 1

<210> 2

<211> 5

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<221> misc_feature

<222> (4)..(4) <223> X es un aminoácido desconocido

5

<400> 2

10

<210> 3 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 3

15

20

<210> 4 <211> 1128 <212> ADN <213> Homo sapiens

<400> 4

<210> 5

<211> 15

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<221> misc_feature

<222> (10)..(10)

<223> X es un aminoácido desconocido

<400> 5

<210> 6

<211> 339 10 <212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221>

misc_feature 15 <222> (1)..(3)

<223> N es un nucleótido desconocido

<220>

<221>

misc_feature 20 <222> (337)..(339)

<223> N es un nucleótido desconocido

<400> 6

<210> 7

<211> 1259

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 7

<210> 8

<211> 15

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 8

<210> 9

<211> 15

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 9

<210> 10

<211> 15

<212> PRT

<213> Homo sapiens 15

<400> 10

20 <210> 11

<211> 26

<212> PRT

<213> Homo sapiens

25 <400> 11

<210> 12 30 <211> 25

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 12 35

<210> 13

<211> 31

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 13

<210> 14

<211> 109

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 14

<210> 15

<211> 109

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 15

<210> 16

<211> 109

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 16

<210> 17

<211> 13

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 17

<210> 18

<211> 13

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 18

<210> 19

<211> 13

<212> PRT

<213> Homo sapiens 20

<400> 19

25 <210> 20

<211> 13

<212> PRT

<213> Homo sapiens

30 <400> 20

<210> 21 35 <211> 13

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 21 40

<210> 22

<211> 13

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 22

<210> 23

<211> 13

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 23

5 <210> 24

<211> 13

<212> PRT

<213> Homo sapiens

10 <400> 24

<210> 25 15 <211> 13

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 25 20

<210> 26

<211> 13

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 26

<210> 27

<211> 13

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 27

<210> 28

<211> 13

<212> PRT

<213> Homo sapiens 45

<400> 28

50 <210> 29

<211> 13

<212> PRT

<213> Homo sapiens

55 <400> 29

<210> 30

<211> 13

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 30

<210> 31

<211> 13

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 31

<210> 32

<211> 13

<212> PRT

<213> Homo sapiens 25

<400> 32

30 <210> 33

<211> 13

<212> PRT

<213> Homo sapiens

35 <400> 33

<210> 34 40 <211> 13

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 34 45

<210> 35

<211> 13

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 35

<210> 36

<211> 13

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 36

<210> 37

<211> 13

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 37

<210> 38

<211> 13

<212> PRT

<213> Homo sapiens 25

<400> 38

30 <210> 39

<211> 13

<212> PRT

<213> Homo sapiens

35 <400> 39

<210> 40 40 <211> 13

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 40 45

<210> 41

<211> 13

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 41

<210> 42

<211> 13

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 42

10 <210> 43

<211> 13

<212> PRT

<213> Homo sapiens

15 <400> 43

<210> 44 20 <211> 13

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 44 25

<210> 45

<211> 13

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 45

<210> 46

<211> 13

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 46

<210> 47

<211> 13

<212> PRT

<213> Homo sapiens 50

<400> 47

55 <210> 48

<211> 13

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 48

<210> 49

<211> 13

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 49

<210> 50

<211> 13

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 50

<210> 51

<211> 13

<212> PRT

<213> Homo sapiens 30

<400> 51

35 <210> 52

<211> 13

<212> PRT

<213> Homo sapiens

40 <400> 52

<210> 53 45 <211> 13

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 53 50

<210> 54

<211> 13

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 54

<210> 55

<211> 13

<212> PRT

<213> Homo sapiens 10

<400> 55

15 <210> 56

<211> 13

<212> PRT

<213> Homo sapiens

20 <400> 56

<210> 57 25 <211> 13

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 57 30

<210> 58

<211> 13

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 58

<210> 59

<211> 13

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 59

<210> 60

<211> 13

<212> PRT

<213> Homo sapiens 55

<400> 60

<210> 61 5 <211> 13

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 61 10

<210> 62

<211> 13

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 62

<210> 63

<211> 13

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 63

<210> 64

<211> 13

<212> PRT

<213> Homo sapiens 35

<400> 64

40 <210> 65

<211> 30

<212> PRT

<213> Homo sapiens

45 <400> 65

<210> 66 50 <211> 12

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 66

5 <210> 67

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens

10 <400> 67

<210> 68 15 <211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 68 20

<210> 69

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 69

<210> 70

<211> 8

<212> PRT 35 <213> Homo sapiens

<400> 70

<210> 71

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapiens 45

<400> 71

50 <210> 72

<211> 5

<212> PRT

<213> Homo sapiens

55 <400> 72

<210> 73

<211> 4 5 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 73

<210> 74

<211> 3

<212> PRT 15 <213> Homo sapiens

<400> 74

<210> 75

<211> 12

<212> PRT

<213> Homo sapiens 25

<400> 75

30 <210> 76

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens

35 <400> 76

<210> 77 40 <211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 77 45

<210> 78

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 78

<210> 79

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 79

10 <210> 80

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapiens

15 <400> 80

<210> 81 20 <211> 6

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 81 25

<210> 82

<211> 5

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 82

<210> 83

<211> 4

<212> PRT 40 <213> Homo sapiens

<400> 83

<210> 84

<211> 3

<212> PRT

<213> Homo sapiens 50

<400> 84

55 <210> 85

<211> 2

<212> PRT

<213> Homo sapiens

5 <400> 85

<210> 86 10 <211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 86 15

<210> 87

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 87

<210> 88

<211> 8

<212> PRT 30 <213> Homo sapiens

<400> 88

<210> 89

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapiens 40

<400> 89

45 <210> 90

<211> 6

<212> PRT

<213> Homo sapiens

50 <400> 90

<210> 91 55 <211> 5

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 91

5 <210> 92

<211> 4

<212> PRT

<213> Homo sapiens

10 <400> 92

<210> 93 15 <211> 3

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 93 20

<210> 94

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 94

<210> 95

<211> 9

<212> PRT 35 <213> Homo sapiens

<400> 95

<210> 96

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapiens 45

<400> 96

50 <210> 97

<211> 29

<212> PRT

<213> Homo sapiens

55 <400> 97

<210> 98

<211> 6 5 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 98

<210> 99

<211> 5

<212> PRT 15 <213> Homo sapiens

<400> 99

<210> 100

<211> 4

<212> PRT

<213> Homo sapiens 25

<400> 100

30 <210> 101

<211> 3

<212> PRT

<213> Homo sapiens

35 <400> 101

<210> 102 40 <211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 102 45

<210> 103

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 103

<210> 104

<211> 6

<212> PRT

<213> Homo sapiens 10

<400> 104

15 <210> 105

<211> 30

<212> PRT

<213> Homo sapiens

20 <400> 105

<210> 106 25 <211> 4

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 106 30

<210> 107

<211> 3 35 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 107

<210> 108

<211> 8

<212> PRT 45 <213> Homo sapiens

<400> 108

<210> 109

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 109

<210> 110

<211> 6

<212> PRT 10 <213> Homo sapiens

<400> 110

<210> 111

<211> 5

<212> PRT

<213> Homo sapiens 20

<400> 111

25 <210> 112

<211> 4

<212> PRT

<213> Homo sapiens

30 <400> 112

<210> 113 35 <211> 3

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 113 40

<210> 114

<211> 30

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 114

<210> 115

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapiens 5

<400> 115

10 <210> 116

<211> 6

<212> PRT

<213> Homo sapiens

15 <400> 116

<210> 117 20 <211> 5

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 117 25

30

<210> 118 <211> 4 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 118

35

40

<210> 119 <211> 3 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 119

45 50

<210> 120 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 120

<210> 121

<211> 5

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 121

5 <210> 122

<211> 4

<212> PRT

<213> Homo sapiens

10 <400> 122

<210> 123 15 <211> 3

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 123 20

25

<210> 124 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 124

30

35

<210> 125 <211> 4 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 125

40 45

<210> 126 <211> 3 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 126

50 <210> 127

<211> 4

<212> PRT

<213> Homo sapiens

55 <400> 127

<210> 128

<211> 3 5 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 128

<210> 129

<211> 29

<212> PRT 15 <213> Homo sapiens

<400> 129

<210> 130

<211> 375

<212> PRT

<213> Homo sapiens 25

<400> 130

<210> 131

<211> 263

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 131

Claims (33)

1. REIVINDICACIONES

   1.

   Un anticuerpo monoclonal aislado que se une específicamente a los aminoácidos 1 a 50 de SEC ID Nº: 15, en el que el anticuerpo reduce la actividad de GDF-8 asociada con la regulación negativa de la masa muscular esquelética.

2. 2.

   El anticuerpo de la reivindicación 1, en el que el anticuerpo se une específicamente a los aminoácidos 1 a 25 de SEC ID Nº: 15.

3. 3.

   El anticuerpo de la reivindicación 1, en el que el anticuerpo se une específicamente a SEC ID Nº: 8.

4. 4.

   El anticuerpo de la reivindicación 1, en el que el anticuerpo se une específicamente a SEC ID Nº: 3.

5. 5.

   Un anticuerpo monoclonal aislado que se une específicamente a SEC ID Nº: 18, en el que el anticuerpo reduce la actividad de GDF-8 asociada con una regulación negativa de la masa muscular esquelética.

6. 6.

   Un anticuerpo monoclonal aislado que se une específicamente a SEC ID Nº: 5, en el que el anticuerpo reduce la actividad de GDF-8 asociada con la regulación negativa de la masa muscular esquelética.

7. 7.

   El anticuerpo aislado de la reivindicación 6, en el que el anticuerpo se une específicamente a SEC ID Nº: 2.

8. 8.

   El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en el que el anticuerpo se une específicamente a un complejo seleccionado del grupo de entre un complejo latente de GDF-8, GDF-8 en complejo con folistatina, y GDF8 en complejo con una proteína relacionada con folistatina.

9. 9.

   El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en el que el anticuerpo se une específicamente a un complejo latente de GDF-8.

10. 10.

    El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en el que el anticuerpo es un fragmento seleccionado de entre un anticuerpo de cadena sencilla, Fab, F(ab’)2 y Fv.

11. 11.

    El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en el que el anticuerpo es quimérico.

12. 12.

    El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-11, en el que el anticuerpo está humanizado.

13. 13.

    Un anticuerpo monoclonal aislado de acuerdo con la reivindicación 1, comprendiendo dicho anticuerpo una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos al menos un 85 % idéntica a SEC ID Nº: 1, en el que el anticuerpo se une específicamente a GDF-8 madura.

14. 14.

    El anticuerpo de la reivindicación 13, que comprende al menos un CDR de cadena sencilla seleccionado de los aminoácidos 30-35 de SEC ID Nº: 1, de los aminoácidos 50-66 de SEC ID Nº: 1, y de los aminoácidos 99-102 de SEC ID Nº: 1.

15. 15.

    El anticuerpo de la reivindicación 13 o 14, en el que la secuencia de aminoácidos es al menos un 90 % idéntica a SEC ID Nº: 1.

16. 16.

    El anticuerpo de la reivindicación 15, en el que la secuencia de aminoácidos es SEC ID Nº: 1.

17. 17.

    Un anticuerpo monoclonal aislado de acuerdo con la reivindicación 1, comprendiendo dicho anticuerpo al menos una CDR de cadena sencilla seleccionada de entre los aminoácidos 30-35 de SEC ID Nº: 1, de los aminoácidos 5066 de SEC ID Nº: 1, y de los aminoácidos 99-102 de SEC ID Nº: 1, en el que el anticuerpo se une específicamente a GDF-8 madura.

18. 18.

    El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 13-17, en el que el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo de cadena sencilla.

19. 19.

    El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 13-17, en el que el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo seleccionado de Fab, F(ab’)2 y Fv.

20. 20.

    El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 13-19, en el que el anticuerpo es un anticuerpo quimérico.

21. 21.

    El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 13-20, en el que el anticuerpo está humanizado.

22. 22.

    Un anticuerpo aislado producido por una célula que tiene un Número de Designación de Depósito de ATCC PTA4236.

23. 23.

    Un anticuerpo aislado que tiene la misma secuencia de aminoácidos que un anticuerpo producido por una célula que tiene el Número de Designación de Depósito de ATCC PTA-4236.

24. 24.

    Una célula que produce el anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1-23.

25. 25.

    Una célula con Número de Designación de Depósito de ATCC PTA-4236.

26. 26.

    Un ácido nucleico que codifica el anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1-23.

27. 27.

    Un kit diagnóstico que comprende el anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-23.

    5 28. Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-23.

28. 29.

    Uso del anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-23 en la preparación de un medicamento para tratar un trastorno médico en un mamífero.

29. 30.

    El uso de la reivindicación 29, en el que el trastorno médico es un trastorno muscular.

30. 31. El uso de la reivindicación 30, en el que el trastorno médico es distrofia muscular, atrofia muscular, enfermedad 10 pulmonar obstructiva congestiva, síndrome de pérdida de masa muscular, sarcopenia o caquexia.

31. 32.

    El uso de la reivindicación 30, en el que trastorno médico es distrofia muscular.

32. 33.

    El uso del anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-23 en la preparación de un medicamento.

33. 34.

    El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 13-23 en el que el anticuerpo se une específicamente a una proteína GDF-8 madura con mayor afinidad que a una proteína BMP-11 madura.