NO336528B1

NO336528B1 - Antistoffinhibitorer av GDF-8 og anvendelse derav

Info

Publication number: NO336528B1
Application number: NO20041582A
Authority: NO
Inventors: Denise O'hara; Geertruida M Veldman; N N; Kristie Grove-Bridges; Lisa-Anne Whittermore
Original assignee: Wyeth Corp
Priority date: 2001-09-26
Filing date: 2004-04-19
Publication date: 2015-09-21
Also published as: BR0212809A; US9505831B2; NZ532034A; ZA200402265B; WO2003027248A8; WO2003027248A3; US7320789B2; PT1438068E; ZA200606082B; JP4452077B2; CA2469230C; WO2003027248A2; AU2002347773B2; US20120107928A1; EP1438068A2; JP2009067798A; NO20041582L; MXPA04002834A; EP2316851A1; US20030138422A1

Abstract

2004 -04- 47 SAMMENDRAG Oppfinnelsen tilveiebringer nye antistoffer mot vekst og differensieringsfaktor-8 (GDF-8), inklusive antistoffragmenter, som hemmer GDF-8-aktivitet in vitro og in vivo. Oppfinnelsen tilveiebringer også fremgangsmåter for å diagnostisere, hindre eller å behandle degenererende lidelser i muskler, ben eller insulinmetabolismen.

Description

Denne søknaden har prioritet i forhold til US foreløpige patentsøknad serienr. 60/324,528, innsendt 26. september 2001.

Foreliggende oppfinnelse angår inhibitorer av vekstdifferensieringsfaktor-8 (GDF-8) proteiner og fremgangsmåter for anvendelse av slike inhibitorer. Mer spesielt tilveiebringer oppfinnelsen nye antistoffer og antistoffragmenter, som er spesifikt reaktive med GDF-8-proteiner in vitro og in vivo. Oppfinnelsen kan spesielt brukes for diagnostisering, for å hindre eller å behandle lidelser eller symptomer hos mennesker eller dyr, hvor en økning av muskelvevet vil være terapeutisk fordelaktig. Eksempler på nevnte lidelser innbefatter nevromuskulære lidelser (f. eks. muskulær dystrofi og muskelatrofi), kongestiv hindrende lungesykdom, muskelsvinnsyndrom, sarkopeni og kakeksi; fettvevslidelser (f.eks. overvekt); diabetes type 2; og bendegenererende sykdommer (f.eks. osteoporose).

Vekst og differensieringsfaktor-8 (GDF-8), også kjent som myostatin, hører hjemme i den transformerende vekstfaktor-beta (TGF-P) superfamilien eller gruppen av strukturelt nærstående vekstfaktorer, som alle har fysiologisk viktige vekstregulerende og morfogenetiske egenskaper (Kingsley et al. (1994) Genes Dev., 8: 133-46; Hoodless et al. (1998) Curr. TopicsMicrobiol. Immunol, 228: 235-72). GDF-8 er en negativ regulator av skjelettmuskelmassen, og det er derfor av betydelig interesse å kunne identifisere faktorer som regulerer dens biologiske aktivitet. F.eks. blir GDF-8 sterkt uttrykt i utviklende og i voksne skjelettmuskler. GDF-8 nullmutasjonen i transgene mus erkarakterisert vedmarkant hypertrofi og hyperplasi i skjelettmusklene (McPherron et al. (1997) Nature, 387: 83-90). Lignende økninger av skjelettmuskelmassen lar seg også observere i naturlig forekommende mutasjoner av GDF-8 i kveg (Ashmore et al. (1974) Growth, 38: 501-507; Swatland and Kieffer (1994) J. Anim. Sei., 38: 752-757; Mc Pherron og Lee (1997) Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 94: 12457-12461; og Kambadur et al.

(1997) Genome Res., 7: 910-915). Ettersom GDF-8 blir uttrykt både i utviklende muskler og i muskler hos voksne personer, så er det ikke klart hvorvidt den regulerer muskelmassen under utvikling eller i voksne personer. Spørsmålet hvorvidt eller hvorvidt ikke GDF-8 regulerer muskelmassen hos voksne personer er således viktig både fra et vitenskapelig og et terapeutisk perspektiv. Senere undersøkelser har vist at muskelsvin assosiert med HIV-infeksjon hos mennesker er fulgt av en økning av GDF-8-proteinekspresjon (Gonzalez-Cadavid et al. (1998) PNAS, 95: 14938-43). I tillegg kan GDF-8 modulere produksjonen av muskelspesifikke enzymer (f.eks. kreatinkinase) og videre modulere myoblastcelledeling (WO 00/43781). WO 98/33887 beskriver en transgen «knockout»-mus, og viser at den transgene musen har økt muskelmasse. WO 98/33887 beskriver også polyklonale antistoffer rettet mot murint GDF-8.

En rekke sykdommer hos mennesker og dyr er assosiert med tap eller funksjonell svekkelse av muskelvev, blant annet muskulær dystrofi, muskelatrofi, kongestiv hindrende lungesykdom, muskelsvinnsyndrom, sarkopeni og kakeksi. Det eksisterer i dag meget få pålitelige eller effektive terapier for disse sykdommene. De fryktelige symptomer som er assosiert med disse lidelsene kan imidlertid reduseres i vesentlig grad ved å anvende terapier som øker mengden av muskelvev hos de pasienter som lider av disse sykdommene. Selv om en ikke helbreder selve tilstanden, så vil slike terapier i betydelig grad bedre livskvaliteten for pasientene og vil kunne lindre noen av sykdommenes effekter. Det er således et behov for å kunne identifisere nye terapier som kan bidra til en total økning av muskelvevet hos pasienter som lider av disse sykdommene.

I tillegg til sine vekstregulerende og morfogenetiske egenskaper i skjelettmuskulaturen, så kan GDF-8 også inngå i en rekke andre fysiologiske prosesser, så som glukose homeostase ved utviklingen av type 2 diabetes og fettvevslidelser, f.eks. overvekt. F.eks. er det vist at GDF-8 modulerer preadipocytt differensieringen til adipocytter (Kim et al. (2001) BBRC, 281: 902-906).

Det er også en rekke tilstander som er assosiert med bentap, så som osteoporose, noe som spesielt opptrer hos eldre og/eller postmenopausale kvinner. De terapier som for tiden er tilgjengelig for disse tilstander virker ved å hemme benresorpsjon. En terapi som fremmer ny bendannelse vil således være et ønskelig alternativ eller et tillegg til disse terapier.

På lignende måte som TGF-P-1, -2 og -3, blir GDF-8-proteinet syntetisert som et forløperprotein som består av et amino-terminalt propeptid og et karboksy-terminalt utviklet domene (McPherron og Lee, (1997) Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 94: 12457-12461). Før spalting vil forløper GDF-8-proteinet danne en homodimer. Det nevnte amino-terminale propeptidet blir så avspaltet fra det utviklede domenet. Det spaltede propeptidet forblir ikke-kovalent bundet til den utviklede domenedimeren, og inaktiverer dennes biologiske aktivitet (Miyazono et al. (1988) J. Biol. Chem., 263: 6407-6415; Wakefield et al. (1988) J. Biol. Chem., 263: 7646-7654; og Brown et al. (1990) Growth Factors, 3: 35-43). Det er antatt at to GDF-8 propeptider binder seg til den nevnte GDF-8 utviklede dimeren (Thies et al. (2001) Growth Factors, 18: 251-259). På grunn av denne inaktiverende evnen er propeptidet også kjent som det "latens-assosierte peptidet" (LAP), og komplekset av det utviklede domenet og propeptidet er ofte betegnet som det "lille latente komplekset" (Gentry og Nash (1990) Biochemistry, 29: 6851-6857; Derynck et al. (1995) Nature, 316: 701-705; og Massague (1990) Ann. Rev. CellBiol, 12: 597-641). Andre proteiner er også kjent for å kunne binde seg til GDF-8 eller strukturelt nærstående proteiner og hemme deres biologiske aktivitet. Slike hemmende proteiner innbefatter follistatin og muligens follistatin-relaterte proteiner (Garner et al. (1999) Dev. Biol., 208: 222-232). Det utviklede domenet antas å være aktiv som en homodimer når propeptidet blir fjernet.

GDF-8 har en sterkt konservert sekvens og funksjonerer i mange forskjellige arter. Aminosyresekvensen i mus og human GDF-8 er identisk, noe som også er tilfelle med mRNA-ekspresjonsmønsteret (McPherron et al. (1997) Nature 387: 83-90; Gonzalez-Cadavid et al. (1998) Proe. Nati. Acad. Sei. USA 95: 14938-14943). Denne konserveringen av sekvensen og funksjonen antyder at en inhibering av GDF-8 i mennesker også sannsynligvis vil ha en tilsvarende effekt med hensyn til å hemme GDF-8 i mus.

GDF-8 inngår i reguleringen av mange kritiske biologiske prosesser. På grunn av sin nøkkelfunksjon i disse prosessene vil GDF-8 være et ønskelig mål for terapeutisk inngrep. Spesielt vil terapeutiske midler som hemmer aktiviteten av GDF-8 kunne brukes for å behandle sykdommer både hos mennesker og dyr, hvor en økning av muskelvevet vil være terapeutisk fordelaktig, spesielt i muskel- og fettvevslidelser, bendegenererende sykdommer, nevromuskulære lidelser og diabetes slik dette er nevnt ovenfor.

Den foreliggende oppfinnelsen tilveiebringer nye proteininhibitorer som omfatter antistoffer og antistoffragmenter som er spesifikt reaktive med et modent GDF-8-protein, enten dette er i sin monomere form, sin aktive dimere form eller kompleksdannet i nevnte GDF-8 latente kompleks. I en utførelse av oppfinnelsen binder antistoffene seg til en epitop på det modne GDF-8-proteinet, og dette resulterer i en reduksjon av én eller flere av de biologiske aktiviteter, som er assosiert med GDF-8, i forhold til et utviklet GDF-8-protein som ikke er bundet av det samme antistoffet. I en utførelse av oppfinnelsen vil de her beskrevne antistoffer kunne redusere GDF-8-aktivitet som er assosiert med den negative reguleringen av skjelettmuskelmassen og/eller bentettheten.

De her beskrevne antistoffer har enestående og uventede biologiske egenskaper. F.eks. vil en person med innsikt typisk kunne forvente at gode nøytraliserende antistoffer vil binde seg sterkt til det aktive GDF-8-proteinet in vitro og danne et stabilt hemmende kompleks med proteinet. Et nøytraliserende antistoff som også kalles et hemmende antistoff, som har høy affinitet for et spesielt protein, vil typisk kunne forventes å gi bedre nøytralisering i forhold til et antistoff med lavere affinitet til det samme proteinet. Helt uventet har en imidlertid oppdaget antistoffer som bare binder seg svakt og samtidig nøytraliserer aktivt GDF-8-protein in vitro, men ikke desto mindre er effektivt in vivo. Oppdagelsen av slike antistoffer førte så til identifikasjon av et spesifikt sete på GDF-8 hvor antistoffene binder seg. Det er derved forventet at ethvert antistoff som spesifikt binder seg til det identifiserte setet, vil ha tilsvarende nøytraliserende egenskaper in vivo.

I tillegg har de her beskrevne antistoffer enestående og uventede egenskaper. F.eks. gjenkjenner antistoffene ikke bare modent GDF-8-protein i sine monomere og dimere former, men gjenkjenner også det intakte GDF-8 latente komplekset.

De her beskrevne antistoffer kan administreres i en terapeutisk effektiv dose for å behandle eller å hindre medisinske tilstander hvor en økning av muskelvevsmassen eller bentettheten vil være terapeutisk fordelaktig. Sykdommer og lidelser som kan behandles ved hjelp av disse GDF-8-antistoffer innbefatter muskel- og nevromuskulære lidelser, så som muskulær dystrofi, muskelatrofi, kongestiv hindrende lungesykdom, muskelsvinnsyndrom, sarkopeni og karcheksi, fettvevslidelser så som overvekt; metabolske lidelser så som type 2 diabetes, svekket glukosetoleranse, metabolske syndromer (f.eks. syndrom X), insulinresistensindusert traume (f.eks. brannsår), og bendegenererende sykdommer så som osteoporose, da spesielt hos eldre og/eller postmenopausale kvinner. Ytterligere metabolske bensykdommer og lidelser som kan behandles ved hjelp av disse GDF-8-antistoffene innbefatter lav benmasse som skyldes kronisk glukokortikoid terapi, prematur gonodal svikt, androgen suppresjon, vitamin D svikt, sekundær hyperparatyroidisme, sviktende næringsopptak og anorexia nervosa.

I tillegg til dette kan de her beskrevne antistoffer brukes som et diagnostisk verktøy for å kunne kvantifisere eller kvalitativt påvise modent GDF-8-protein eller fragmenter av dette, uansett om nevnte protein befinner seg i en monomer form, dimer aktiv form eller er kompleksdannet i nevnte GDF-8 latente kompleks. F.eks. kan antistoffene brukes for å påvise kvantitativt eller kvalitativt modent GDF-8-protein i en celle, kroppsvæske, vev eller i et organ. Nærværet eller mengden av det påviste modne GDF-8-proteinet kan så korreleres med én eller flere av de medisinske tilstander som er angitt ovenfor.

De her beskrevne antistoffer kan tilveiebringes i et diagnostisk sett. Settet kan inneholde andre komponenter som letter påvisningen av det nevnte modne GDF-8-proteinet og vil kunne hjelpe til å korrelere resultatene med én eller flere av de medisinske tilstander som er beskrevet ovenfor.

Kort beskrivelse av sekvensene

Kort beskrivelse av tegningene

Fig. 1 viser de GDF-8 syntetiske peptidene (SEKV. ID nr. 11-13, 65, 105, 114 og 129, alle avledet fra SEKV. ID nr. 14), som ble brukt for å karakterisere bindingsspesifisiteten for JA-16. De understrekede aminosyrene indikerer posisjoner hvor opprinnelige cysteiner er blitt erstattet med seriner.

Fig. 2 viser bindingen av JA-16 til de GDF-8 syntetiske peptidene.

Fig. 3 indikerer forskjellene i aminosyresekvensene for modent GDF-8 (SEKV. ID nr. 15) og BMP-11 (SEKV. ID nr. 16). Fig. 4 viser en sammenligning av bindingsegenskapene for JA-16 til Gl-peptid (SEKV. ID nr. 10, et peptid avledet fra GDF-8) konjugert til storfeserumalbumin (BSA) og Bl-peptid (SEKV. ID nr. 9, et peptid avledet fra BMP-11) konjugert til

BSA.

Fig. 5 viser en sammenligning av bindingsegenskapene for JA-16 til Gl-BSA (SEKV. ID nr. 10) etter at JA-16 er preinkubert med Gl, Bl, GDF-8 eller BMP-11. Fig. 6A og B viser kartleggingsundersøkelser av JA-16-binding ved å bruke de overlappende 13-mer syntetiske peptidsekvensene fra GDF-8. Fig. 7A og B viser resultatene av en delesjon og substitusjonsanalyse av JA-16-epitopområdet fra GDF-8, Gly-Leu-Asp-Ser-Asp-Glu-His-Ser-Thr-Glu-Ser-Arg-Ser (SEKV. ID nr. 18), ved å bruke punktsyntese.

Fig. 8 viser bindingen av biotinylert GDF-8 til ActRIIB-reseptoren.

Fig. 9A og 9B viser inhiberingen av biotinylert GDF-8-binding til ActRIIB-reseptoren i nærvær eller fravær av JA-16. Fig. 10 viser en reportergenprøve som bedømmer den nøytraliserende effekten av JA-16 på aktiviteten av GDF-8 in vitro. Fig. 11 viser in vivo effekten av JA-16 i mus i løpet av en 4 ukers undersøkelse. 7 uker gamle hunnlige BALB/c-mus ble behandlet i fire uker med JA-16 ved en intraperetonal injeksjon av 50 mg/kg to ganger i uken. Diagrammet på venstre side viser forandringen i mager muskelmasse og fettmasse under behandlingsperioden slik dette ble målt ved deksaskan (dobbeltenergi røntgen) analyse. Diagrammet på høyre side viser massen av utoperert vev. En statistisk signifikant forskjell, p<0,01 for en students test, er angitt ved en stjerne. Fig. 12 viser in vivo effekten av JA-16 på den totale kroppsmassen hos mus i løpet av en 14 ukers undersøkelse. Hannlige C57BL-mus i denne undersøkelsen var enten av villtypen med hensyn til agouti locus (a) eller hadde den letale gule mutasjonen (Ay) i dette lokus. Denne mutasjonen forårsaker overvekt og diabetes i voksen alder. Unge voksne mus ble behandlet én gang i uken med intraperetoneale injeksjoner av 60 mg/kg av JA-16 eller kontrollantistoff. Ved starten av behandlingsperioden ble musene i tillegg injisert 60 mg/kg intraperetonealt og 10 mg/kg intravenøst av det samme antistoffet. Disse diagrammene viser den ukentlige kroppsvekten for hver musegruppe. Feilstreken viser midlere standardavvik for hvert enkelt datapunkt. Fig. 13 viser in vivo effekten av JA-16 på den totale muskelmassen hos mus i løpet av en 14 ukers undersøkelse. Ved slutten av undersøkelsen ble musklene utoperert og veiet. Disse diagrammene viser den midlere muskelmassen for hver gruppe av mus. En statistisk signifikant forskjell, p<0,01 i en students test, er angitt med en stjerne. Fig. 14 viser in vivo effekten av JA-16 på den totale fettmassen hos mus i løpet av en 14 ukers undersøkelse. Ved slutten av undersøkelsen ble fettet utoperert og veiet. Disse diagrammene viser den midlere fettmassen for hver gruppe av mus. Fig. 15 viser in vivo effekten av JA-16 på blodglukosenivåene hos mus i løpet av en 14 ukers undersøkelse. Etter 12 ukers behandling ble C57BL-Ay/a-mus faset over natten og deres blodglukose ble så målt. Fig. 16 viser aminosyresekvensen for det JA-16 tungkjedevariable området (SEKV. ID nr. 1). De komplimenterende bestemmende områder (CDRs) er understreket. Den tilsvarende nukleinsyresekvensen er gitt i SEKV. ID nr. 6. Fig. 17 viser en in vivo sammenligning mellom Myo-19 og JA-16. Syv uker gamle hunnlige C57B6/scid-mus ble behandlet i fem uker med JA-16, Myo-19 eller en bærevæske ved intraperetoneal injeksjon. Ved slutten av undersøkelsen ble musklene utoperert og veiet. Disse diagrammene viser den midlere muskelmassen for hver gruppe av mus. En statistisk signifikant forskjell p<0,01 for en students t-test, er angitt med en stjerne. Fig. 18 viser resultater fra en immunoutfelling av GDF-8 med JA-16 og Myo-19. Fig. 19A og 19B viser resultatene av en JA-16-behandling i BALB/c hunnmus i 8 uker. Musene var 21 måneder eller 4 måneder gamle ved slutten av undersøkelsen.

(19A) Utoperert quadricepsmasse for JA-16-behandlede og bærevæskebehandlede mus ved slutten av undersøkelsen. (19B) Forbensstyrke bestemt ved en gripetest for JA-16-behandlede og bærevæskebehandlede mus etter syv ukers behandling. Hver strek eller datapunkt indikerer en middelverdi for den angitte gruppen + standardavvik; (<*>) indikerer at p<0,01 for Students t-test med en sammenligning mellom JA-16-gruppen og bærevæskegruppen; n = 8 for hver gruppe. ;Fig. 20A-20D viser resultatene av JA-16-behandling av mdx-mus. (20A) JA-16-behandlede mus hadde signifikant forøket EDL-vekt sammenlignet med mdx-kontroller (19,72 + 0,50 vs. 14,63 + 0,69 mg; n = 12; p<0,0001). (20B) JA-16-behandlede mus hadde signifikant forøket muskelmasse til kroppsvektsforhold (EDL vekt/kroppsvekt) sammenlignet med kontrollen (0,6 + 0,02 vs. 0,5 + 0,02; n = 12; p<0,014). (20C) JA-16-behandlede mus hadde signifikant større styrke eller kraft under en isometrisk vridningskontraksjon sammenlignet med kontrollen (177,32 + 8,37 vs. 132,38 + 12,45 mN; n = 12; p<0,03). (20D) JA-16-behandlede mus hadde signifikant høyere styrke under en isometrisk tetanisk kontraksjon sammenlignet med kontrollen (491,23 + 16,34 vs. 370,74 + 19,21 mN; n = 12; p<0,003). ;Definisjoner ;Begrepet "antistoff refererer seg til ett eller flere polyklonale antistoffer, monoklonale antistoffer, antistoffsammensetninger, antistoffer med mono- eller polyspesifisitet, humaniserte antistoffer, enkeltkjedede antistoffer, kimeriske antistoffer, CDR-podede antistoffer, antistoffragmenter så som Fab, F(ab')2, Fv og andre antistoffragmenter som har beholdt den antigenbindende funksjonen i det opprinnelige antistoffet. ;Begrepet "kimeriske antistoffer" refererer seg til molekyler hvor en del av den tunge og/eller lette kjeden er identisk eller homologe til tilsvarende sekvenser fra en spesiell art (eller hører til en spesiell antistoffklasse eller underklasse), mens den eller de gjenværende deler av kjeden er identisk eller homologe til de tilsvarende sekvenser som er avledet fra en annen art (eller hører til en annen antistoffklasse eller underklasse). Slike kimeriske antistoffer er beskrevet av Morrison et al. (1984) Proe. Nati. Acad. Sei. USA 81: 6851-6855. ;Begrepet "epitop" refererer seg til et molekyl eller en del av et molekyl som er i stand til spesifikt å reagere med et anti-GDF-8 monoklonalt antistoff. Epitoper kan omfatte proteiner, proteinfragmenter, peptider, karbohydrater, lipider eller andre molekyler, men omfatter vanligvis proteiner, korte oligopeptider eller kombinasjoner av slike. ;Begrepene "GDF-polypeptid" og "GDF-protein" refererer seg til alle typer vekst og differensieringsfaktorer som er strukturelt eller funksjonelt relatert til GDF-8. ;Begrepet "GDF-inhibitor" innbefatter ethvert middel som er i stand til å hemme aktivitet eller ekspresjon, bearbeiding eller sekresjon av et GDF-protein. Slike inhibitorer innbefatter proteiner, antistoffer, peptider, peptidomimetika eller ribosymer, anti-sens oligonukleotider, dobbelttrådet RNA og andre små molekyler som spesifikt hemmer GDF-proteiner. ;Begrepene "GDF-8" eller "GDF-8-protein" referere seg til en spesifikk vekst og differensieringsfaktor. Begrepet innbefatter en fullengde ubearbeidet forløperform av proteinet, så vel som fullt utviklede eller propeptidformer som er et resultat av en post-translatert spalting. Begrepet refererer seg også til alle typer fragmenter av GDF-8 som har beholdt de kjente biologiske aktiviteter, som er assosiert med proteinet, slik disse er beskrevet her, og innbefatter sekvenser som er blitt modifisert med konservative eller ikke-konservative forandringer i aminosyresekvensen. ;Disse GDF-8-molekylene kan være fremstilt eller avledet fra enhver kilde, enten naturlig eller syntetisk. Den humane formen av det modne GDF-8-proteinet er gitt i SEKV. ID nr. 15. Den foreliggende oppfinnelsen omfatter imidlertid også GDF-8-molekyler fra alle andre kilder, heri inngår GDF-8 fra storfe, kylling, mus, rotte, svin, sau, kalkun, bavian og fisk. Disse forskjellige GDF-8-molekylene er beskrevet i McPherron et al. (1997) Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 94: 12457-12461. ;"Modent GDF-8" refererer seg til det proteinet, som blir avspaltet fra det karboksy-terminale domenet i GDF-8-forløperproteinet. Det modne GDF-8 kan være tilstede som en monomer, homodimer eller i et GDF-8 latent kompleks. Avhengig av in vivo eller in vitro betingelsene kan det eksistere en likevekt mellom enhver av alle disse forskjellige formene. Det er antatt at GDF-8 er biologisk aktiv som homodimer. I sin biologisk aktive form er det modne GDF-8 også betegnet som "aktivt GDF-8". ;"GDF-8-propeptid" refererer seg til det polypeptid, som avspaltes fra det amino-terminale domenet i GDF-8-forløperproteinet. GDF-8-propeptidet er i stand til å binde seg til det propeptidbindende domenet i modent GDF-8. ;"GDF-8 latent kompleks" refererer seg til det kompleks av proteiner, som dannes mellom den modne GDF-8-homodimeren og GDF-8-propeptidet. Det er antatt at de to GDF-8-propeptidene er assosiert med en GDF-8-homodimer og danner et inaktivt tetramerisk kompleks. Det latente komplekset kan innbefatte andre GDF-8-inhibitorer istedenfor eller i tillegg til ett eller flere av GDF-8-propeptidene. ;Begrepet "GDF-8-inhibitor" innbefatter ethvert middel som er i stand til å hemme aktiviteten, ekspresjonen, bearbeidingen eller sekresjonen av GDF-8-proteinet. Slike inhibitorer innbefatter proteiner, antistoffer, peptider, peptidomimetika, ribosymer, anti-sens-oligonukleotider, dobbelttrådet RNA eller andre små molekyler som spesifikt hemmer aktiviteten for GDF-8-proteinet. Det er vanlig å angi at slike inhibitorer "nøytraliserer" eller "reduserer" den biologiske aktiviteten til GDF-8-proteinet. ;Begrepet "GDF-8-aktivitet" refererer seg til én eller flere av de vekstregulerende eller morfogenetiske aktiviteter som er assosiert med det aktive GDF-8-proteinet. F.eks. er aktivt GDF-8 en negativ regulator av skjelettmuskler. Aktivt GDF-8 kan også modulere produksjonen av muskelspesifikke enzymer (f.eks. kreatinkinase), stimulere myoblastcelledeling og modulere pre-adiopocyttdifferensiering til adipocytter. ;Begrepene "isolert" eller "renset" refererer seg til et molekyl som i alt vesentlig er frigjort fra sitt naturlige miljø. Et isolert protein er f.eks. i alt vesentlig fritt for cellulært materiale eller andre forurensende proteiner fra den cellen eller det vevet fra hvilket proteinet er avledet eller fremstilt. Begrepet "i alt vesentlig fritt for cellulært materiale" refererer seg til preparater hvor det isolerte proteinet er minst 70-80 % (vekt/vekt) rent, eventuelt minst 80-89 % (vekt/vekt) rent, eventuelt 90-95 % rent og eventuelt minst 96, 97, 98, 99 eller 100 % (vekt/vekt) rent. ;"Pattedyr" i forbindelse med behandling refererer seg til ethvert dyr som er klassifisert som pattedyr, og heri inngår mennesker, alle typer husdyr, dyr i zoologiske hager, dyr som er brukt for forskjellige sportsaktiviteter eller kjæledyr, og eksempler er hunder, hester, katter, sauer, griser, kuer, etc. Pattedyret er et menneske i en utførelse av oppfinnelsen. ;Begrepet "monoklonalt antistoff refererer seg til ett eller flere antistoffer fra en i alt vesentlig homogen antistoffpopulasjon som er rettet inn mot én enkelt antigen-epitop. Begrepet innbefatter humaniserte antistoffer, enkeltkjedede antistoffer, kimeriske antistoffer, CDR-podede antistoffer, antistoffragmenter så som Fab, F(ab')2, Fv og andre antistoffragmenter som har beholdt den antigenbindende funksjonen til det opprinnelige antistoffet. ;Begrepet "monoklonalt antistoff er videre ikke begrenset til en spesiell art eller kilde for antistoffet, eller én eller flere fremgangsmåter ved hjelp av hvilket det er fremstilt. Monoklonale antistoffer kan fremstilles via tradisjonell hybridomteknikk (Kohler og Milstein (1975) Nature, 256: 495-499), rekombinante DNA-metoder (US patent nr. 4 816 567) eller fagantistoffbiblioteker (Clackson et al. (1991) Nature, 352: 624-628; Marks et al. (1991) J. Mol. Biol, 222: 581-597). Monoklonale antistoffer av enhver pattedyr eller ikke-pattedyrart kan brukes i foreliggende oppfinnelse. F.eks. kan antistoffene være avledet fra primater (f.eks. mennesker, orangutanger, etc.) fra fugler (f.eks. kylling, kalkun, etc), fra storfe, mus, rotte, svin, sau eller fisk. I en utførelse av oppfinnelsen er antistoffene av rotte, mus eller human opprinnelse. ;Begrepene "nøytralisere" og "nøytraliserende" reduserer seg til en reduksjon av aktiviteten av GDF-8 ved en GDF-8-inhibitor i forhold til aktiviteten av et GDF-8-molekyl som ikke er bundet av den samme inhibitoren. Et "nøytraliserende" antistoff reduserer således aktiviteten av GDF-8 i forhold til aktiviteten av et GDF-8-molekyl som ikke er bundet av det samme antistoffet. GDF-8-proteinets aktivitet når det er bundet av én eller flere av de her beskrevne GDF-8-inhibitorene (f.eks. de her beskrevne antistoffene), er redusert med minst ca. 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 % eller 55 %, eventuelt minst 60 %, 62 %, 64 %, 66 %, 68 %, 70 %, 72 %, 72 %, 76 %, 78 %, 80 %, 82 %, 84 %, 86 %, eller 88 %, eventuelt minst ca. 90 %, 91 %, 92 %, 93 % eller 94 %, og eventuelt minst 95-100 % i forhold til et GDF-8-protein som ikke er bundet av én eller flere av de her beskrevne GDF-8-inhibitorer. ;Begrepet "spesifikk interaksjon" eller "spesifikt binder seg" eller lignende, betyr at to molekyler danner et kompleks som er relativt stabile under fysiologiske betingelser. Begrepet lar seg også anvende, f.eks. for et antigenbindende område som er spesifikt for en spesiell epitop, og som bæres av en rekke antigener, og hvor det spesifikt bindende molekylet som bærer det antigenbindende domenet, vil være i stand til å binde seg til de forskjellige antigener som bærer epitopen. Spesifikk binding erkarakterisert veden høy affinitet og lav til moderat kapasitet. Ikke-spesifikk binding har vanligvis lav affinitet med moderat til høy kapasitet. Typisk er bindingen angitt spesifikt når affinitetskonstanten Ka er høyere enn IO<6>M_<1>, eller kan bli høyere enn IO<8>M"<1>. Hvis det er nødvendig, kan den ikke-spesifikke bindingen reduseres uten at den vesentlig påvirker den spesifikke bindingen ved å variere bindingsbetingelsene. Slike betingelser er velkjente innen genteknologien, og en person med innsikt vil lett kunne bruke rutineteknikk for å kunne velge ut passende betingelser. Disse betingelsene er vanligvis definert på bakgrunn av konsentrasjonen av antistoffet, løsningens ionestyrke, temperatur og reaksjonstid for bindingen, konsentrasjonen av ikke-relaterte molekyler (f.eks. serumalbumin, melkekasein), etc. Eksempler på slike betingelser er angitt i eksempel 4. ;Begrepet "TGF-P-superfamilie" refererer seg til en familie eller gruppe av strukturelt relaterte vekstfaktorer som alle har fysiologisk viktige vekstregulerende og morfogenetiske egenskaper. Denne familien eller gruppen av relaterte vekstfaktorer er godt kjent innenfor bioteknologien (Kingsley et al. (1994) Genes Dev., 8: 133-146; Hoodless et al. (1998) Curr. Topics Microbiol. Immunol., 228: 235-272). TGF-P-superfamilien innbefatter benmorfogeniske proteiner (BMPs), aktiviner, inhibiner, mullerian hemmende stoff, glial-avledet nevrotropisk faktor, og et stadig voksende antall av vekst- og differensieringsfaktorer (GDFs), så som GDF-8 (myostatin). Mange av disse proteinene har en struktur som ligner på GDF-8, så som BMP-11, og/eller aktivitet, så som aktivin. ;Begrepet "behandling" refererer seg både til terapeutisk behandling og profylaktisk eller hindrende inngrep eller behandling. De som har behov for behandling kan innbefatte individer som allerede har en spesiell medisinsk lidelse eller sykdom, så vel som de som til slutt vil få lidelsen (f.eks. de som har behov for en profylaktisk behandling eller et profylaktisk inngrep). ;Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen ;Antistoffer ;Intakte antistoffer er vanligvis heterotetramere glykoproteiner med en molekylvekt på ca. 150000 dalton, sammensatt av to identiske lette (L) kjeder og to identiske tunge (H) kjeder. Hver lett kjede er forbundet med en tung kjede ved hjelp av en kovalent disulfidbinding, mens antallet disulfidbindinger mellom de tunge kjedene varierer i de forskjellige immunoglobulinisotypene. Hver tung og lett kjede har også med regelmessig mellomrom intrakjededisulfidbroer. Hver tung kjede har i én ende et variabelt domene (VH) fulgt av et antall konstante domener. Hver lett kjede har et variabelt domene i én ende (Vl) og et konstant domene i den andre enden, og det konstante domenet i den lette kjeden er opplinjert med det første konstante domenet i den tunge kjeden, og det variable domenet i den lette kjeden er opplinjert med det variable domenet i den tunge kjeden. Det er antatt at spesielle aminosyreresidua danner en interfase mellom de variable domenene i de lette og tunge kjedene (Clothia et al. (1985) J. Mol. Biol, 186: 651-663; Novotny og Haber (1985) Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 82: 4592-4596). ;Avhengig av aminosyresekvensen i det konstante domenet i de tunge kjedene, kan immunoglobuliner bli plassert i forskjellige klasser. Det er fem hovedklasser av immunoglobuliner: IgA, IgD, IgE, IgG og IgM, og flere av disse kan så videre oppdeles i underklasser (isotyper), f.eks. AgAl, og IgA2 for IgA; IgGI, IgG2, IgG3, IgG4 for IgG i mennesker, og IgGI, IgG2a, IgG2b og IgG3 for IgG i mus. De konstante domenene i den tunge kjeden som tilsvarer hovedklassene av immunoglobuliner er ofte kalt a, 8,8, y og \ i henholdsvis. Underenhetsstrukturene og de tredimensjonale konfigurasjonene for de forskjellige klassene av immunoglobuliner er vel kjent innenfor genteknologien. ;For en oversikt over antistoffstrukturen, se Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, red. Harlow et al., 1988. Kort beskrevet består hver lett kjede av et N-terminalt variabelt (V) domene (Vl), og et konstant (C) domene (Cl). Hver tung kjede er sammensatt av et N-terminalt V-domene, tre eller fire C-domener og et såkalt hengselområde. Det CH-domenet, som er mest proksimalt til Vh er betegnet ChI. Vh- og VL-domenene består av fire områder med relativt konservert sekvens, og betegnes rammeverksområder (FRI, FR2, FR3 og FR4), som kan danne en matrise for de tre områdene med hypervariable sekvenser (komplementerende bestemmende områder, CDRs). Nevnte CDRs kan inneholde mesteparten av de residua som er ansvarlig for de spesifikke interaksjonene med antigenet. Nevnte CDRs er ofte betegnet som CDR1, CDR2 og CDR3. Følgelig blir CDR-bestanddelene i den tunge kjeden betegnet som Hl, H2 og H3, mens CDR-bestanddelene i den lette kjeden er betegnet LI, L2 og L3. CDR3 er den største kilden til molekylær diversitet innenfor det antistoffbindende setet. H3 kan f.eks. være så kort som to aminosyreresidua eller større enn 26. Plasseringen av de immunoglobulinvariable domenene i et gitt antistoff, kan f.eks. bestemmes slik det er beskrevet i Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Department of Health and Human Services, red. Kabat et al., 1991. ;Antistoffdiversitet skapes ved å bruke multiple kimlinjegener som koder variable områder og en rekke forskjellige somatiske reaksjoner. Sistnevnte innbefatter en rekombinasjon av variable gensegmenter med diversitets (D) og forenende (J) gensegmenter som utgjør et fullstendig VH-område, og rekombinasjonen av variable og forbindende gensegmenter som utgjør et fullstendig VL-område. Selve rekombinasjonsprosessen er ikke presis, og dette resulterer i et tap eller addering av aminosyrer i V(D)J-sammenknytningspunktene. Disse diversitetsmekanismene opptrer i den utviklende B-cellen før antigeneksponering. Etter antigen stimulering vil de uttrykte antistoffgenene i B-celler gå gjennom en somatisk mutasjon. Basert på det beregnede antall germlinjegensegmenter, vil en få en vilkårlig rekombinasjon av disse segmentene, og en vilkårlig Vn-VL-paring, og det kan fremstilles opptil 1,6 x IO<7>forskjellige antistoffer (Fundamental Immunology, 3. utgave, red. Paul, Raven Press, New York, NY, 1993). Når en tar hensyn til andre prosesser som bidrar til antistoffdiversitet (så som somatisk mutasjon), så er det antatt at det kan utvikles opp mot 1 x IO<10>forskjellige antistoffer (Immunoglobulin Genes, 2. utgave, red. Jonio et al., Academic Press, San Diego, CA, 1995). Ettersom det er mange prosesser som inngår i utviklingen av antistoffdiversitet, så er det usannsynlig at uavhengig avledede eller fremstilte monoklonale antistoffer med den samme antigenspesifisiteten, har identiske aminosyresekvenser. ;Antistoffer kan utvikles mot enhver del av et protein som har en antigen epitop. ;De her beskrevne antistoffer binder seg til et modent eller fullt utviklet GDF-8-protein som angitt i SEKV. ID nr. 15, mellom aminosyre 1 og aminosyre 50; eventuelt mellom aminosyre 1 og aminosyre 25, og eventuelt mellom aminosyre 1 og 15 i SEKV. ID nr. 15. ;I en annen utførelse binder de her beskrevne antistoffer seg spesifikt til sekvensen Asp-Glu-His-Xaa-Thr (SEKV. ID nr. 2) i ethvert av de proteiner, som hører til TGF-P-superfamilien, hvor Xaa er Ala, Gly, His, Met, Asn, Arg, Ser, Thr, eller Trp. Eventuelt binder antistoffene seg spesifikt til peptidsekvensen Asp-Glu-His-Xaa-Thr (SEKV. ID nr. 2) i GDF-8, hvor Xaa er Ala, Gly, His, Met, Asn, Arg, Ser, Thr, eller Trp. Eventuelt binder antistoffene seg spesifikt til Asp-Glu-His-Ser-Thr (SEKV. ID nr. 3) i det modne GDF-8-proteinet (SEKV. ID nr. 15). ;Eventuelt binder de her beskrevne antistoffer seg spesifikt til peptidsekvensen Asp-Phe-Gly-Leu-Asp-Cys-Asp-Glu-His-Xaa-Thr-Glu-Ser-Arg-Cys (SEKV. ID nr. 5) i ethvert av de proteiner, som hører til TGF-P-superfamilien, hvor Xaa er Ala, Gly, His, Met, Asn, Arg, Ser, Thr eller Trp. Eventuelt binder antistoffene seg spesifikt til peptidsekvensen Asp-Phe-Gly-Leu-Asp-Cys-Asp-Glu-His-Xaa-Thr-Glu-Ser-Arg-Cys (SEKV. ID nr. 5) i GDF-8, hvor Xaa er Ala, Gly, His, Met, Asn, Arg, Ser, Thr eller Trp. Eventuelt binder antistoffene seg spesifikt til peptidsekvensen Asp-Phe-Gly-Leu-Asp-Cys-Asp-Glu-His-Ser-Thr-Glu-Ser-Arg-Cys (SEKV. ID nr. 8) i det modne GDF-8-proteinet (SEKV. ID nr. 15). ;Det GDF-8-protein til hvilket de her beskrevne antistoffer spesifikt binder seg til, er eventuelt minst 75-80 % identisk til SEKV. ID nr. 15, eventuelt ca. 81 % til ca. 85 % identisk med SEKV. ID nr. 15, eventuelt minst ca. 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93 eller 94 % identisk med SEKV. ID nr. 15, og eventuelt minst ca. 95, 96, 97, 98, 99 eller 100 % identisk med SEKV. ID nr. 15. GDF-8-proteinet kan eventuelt omfatte hele SEKV. ID nr. 15. ;I en alternativ utførelse kan de her beskrevne antistoffer binde seg spesifikt til BMP-11-proteinet. Dette proteinet er eventuelt minst 75-80 % identisk med SEKV. ID nr. 16, eventuelt minst ca. 81-85 % identisk med SEKV. ID nr. 16, eventuelt minst ca. 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93 eller 94 % identisk med SEKV. ID nr. 16, og eventuelt minst ca. 95, 96, 97, 98, 99 eller 100 % identisk med SEKV. ID nr. 16. BMP-11-proteinet kan eventuelt omfatte hele SEKV ID nr. 16. ;I en spesiell utførelse betegnet JA-16, omfatter antistoffet aminosyresekvensen i SEKV. ID nr. 1 som en del av det variable området i den tunge kjeden. I andre utførelser vil antistoffet omfatte minst ett enkeltkjedet CDR valgt fra aminosyrene 30-35 i SEKV. ID nr. 1, aminosyrene 50-66 i SEKV. ID nr. 1; og aminosyrene 99-102 i SEKV. ID nr. 1. ;For en person med innsikt i fagområdet er det innlysende at antistoffene ifølge foreliggende oppfinnelse kan inneholde en rekke konservative eller ikke-konservative foreninger med hensyn til sine aminosyresekvenser uten å derved endre deres biologiske egenskaper. Forandringene kan gjøres enten i rammeverket (FR) eller i CDR-områdene. Mens forandringer i rammeverkområdene vanligvis er utformet slik at de bedrer stabiliteten og antistoffets immunogenisitet, så er forandringer i CDR vanligvis utformet for å øke antistoffets affinitet til sitt mål. Slike affinitetsøkende forandringer vil typisk bli bestemt empirisk ved å endre CDR-området og så teste antistoffet. Slike endringer kan utføres ved hjelp av fremgangsmåter, som er beskrevet i Antibody Engineering, 2. utgave, Oxford University Press, red. Borrebaeck, 1995. Konservative aminosyremodifikasjoner er basert på den relative likheten mellom substituentene i aminosyresidekjedene, f.eks. deres hydrofobisitet, hydrofilisitet, ladning, størrelse og lignende. Eksempler på konservative substitusjoner som tar hensyn til de forannevnte egenskaper, er velkjente innenfor bioteknologien, og innbefatter arginin og lysin; glutamat og aspartat; serin og treonin, glutamin og asparagin, og valin, leucin og isoleucin. Ytterligere detaljer med hensyn til slike forandringer er beskrevet i de foregående avsnitt. I motsetning til i CDR-områdene, så kan det utføres vesentlige ikke-konservative forandringer i strukturen i rammeverksområdene (FRs), uten at man derved skadelig påvirker antistoffets bindende egenskaper. Forandringer i nevnte rammeverksområder innbefatter, men er ikke begrenset til humanisering av et ikke-humant avledet rammeverk eller en manipulering eller forandring av visse rammeverksresidua som er viktige for antigenkontakt, eller for å stabilisere bindingssetet, f.eks. å forandre klassen eller undreklassen på det konstante området, forandring av spesifikke aminosyreresidua som kan endre effektorfunksjonen, så som Fc-reseptorbinding (Lund et al. (1991) J. Immun. 147: 2657-2662 og Morgan et al. (1995) Immunology 86: 319-324), eller å forandre den arten, fra hvilket det konstante området er avledet, slik dette er beskrevet i det etterfølgende. ;I en utførelse vil de her beskrevne antistoffer spesifikt binde seg til et modent GDF-8-protein, uansett hvorvidt dette er i sin monomere form, aktive dimerform eller kompleksdannet i et GDF-8 latent kompleks, med en affinitet mellom ca. IO<6>og ca. IO11 M"1, eventuelt mellom ca. IO8 og IO11M"<1>. ;Antistoffene ifølge foreliggende beskrivelse kan omfatte polyklonale antistoffer, monoklonale antistoffer, antistoffsammensetninger, antistoffer med mono- eller polyspesifisitet, humaniserte antistoffer, enkeltkjedede antistoffer, CDR-podede antistoffer, antistoffragmenter så som Fab, F(ab')2, F v og andre antistoffragmenter som beholder det opprinnelige antistoffets antigenbindende funksjon. De her beskrevne antistoffer kan også være modifisert til kimeriske antistoffer. F.eks. kan et humant Fc-område være fusjonert til et GDF-8-bindende område fra et museantistoff for derved å utvikle et kimerisk antistoff. Ved å erstatte andre deler av museantistoffet (utenfor det antigenbindende området) med tilsvarende fragmenter fra et humant antistoff, så kan det fremstilles et såkalt humanisert antistoff. Slike kimeriske eller humaniserte antistoffer kan oppvise bedret biologisk spesifisitet eller in vivo stabilitet. De er spesielt fordelaktige og brukbare for å utforme antistoffer for humane terapier. Det er underforstått at personer med innsikt i fagfeltet er godt kjent med standardlitteraturen som spesifikt beskriver betingelser og fremgangsmåter for konstruksjon, manipulering, produksjon og isolering av antistoffer (se f.eks. Harlow og Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York). ;Den foreliggende beskrivelsen tilveiebringer også celler, så som hybridomer, som produserer ethvert av de her beskrevne antistoffer. Innenfor genteknologien er det kjent mange celler som er godt egnet for produksjon av antistoffer. Enhver celle som er forenlig med den foreliggende oppfinnelsen kan brukes for å fremstille de her beskrevne antistoffer. I en utførelse blir de her beskrevne antistoffer produsert av en hybridomcelle. En hybridomcellelinje, som fremstiller museanti-GDF-8 JA-16-antistoff, er levert til American Tissue Culture Collection (innleveringsbetegnelse nr. PTA-4236) 18. april 2002. Adressen til kultursamlingen er 10801 University Blvd. Manassas, VA 20110. ;Fremgangsmåter til å behandle sykdommer ;Antistoffene i den foreliggende beskrivelsen kan brukes til å hindre, diagnostisere eller behandle forskjellige medisinske lidelser og sykdommer i mennesker og dyr. Antistoffene kan brukes for å hemme eller redusere én eller flere aktiviteter som er assosiert med GDF-proteinet, i forhold til et GDF-protein som ikke er bundet ved hjelp av det samme antistoffet. Antistoffene kan hemme eller redusere én eller flere av aktivitetene for det modne eller fullt utviklede GDF-8 (uansett hvorvidt dette er i sin monomere form, aktive dimere form eller kompleksdannet i et GDF-8 latent kompleks), i forhold til et modent GDF-8-protein, som ikke er bundet av de samme antistoffene. I én utførelse er aktiviteten for det modne GDF-8-proteinet, når det er bundet av ett eller flere av de her beskrevne antistoffer, hemmet med minst 50 %, eventuelt minst 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 72, 76, 78, 80, 82, 84, 86 eller 88 %, eventuelt minst 90, 91, 92, 93 eller 94 %, og eventuelt minst 95 % til 100 % i forhold til et modent GDF-8-protein, som ikke er bundet av ett eller flere av de her beskrevne antistoffer. ;Den medisinske lidelse som kan diagnostiseres, behandles eller hindres ved hjelp av de her beskrevne antistoffer, er eventuelt en muskel- eller nevromuskulær lidelse; en fettvevslidelse så som overvekt; type 2 diabetes, svekket glukosetoleranse, metabolske syndromer (f.eks. syndrom X), insulinresistent indusert ved traumer, så som brannsår; eller bendegenererende sykdommer, så som osteoporose. Den medisinske tilstanden er eventuelt en muskel- eller nevromuskulær lidelse så som muskulær dystrofi, muskelatrofi, kongestiv hindrende lungesykdom, muskelsvinnsyndrom, sakropeni eller kakeksi og lidelser assosiert med bentap, som innbefatter osteoporose, da spesielt hos eldre og/eller postmenopausale kvinner, glukokortikoid-indusert osteoporose, osteopeni og osteoporose-relaterte brudd. Andre metabolske bensykdommer og lidelser som lar seg behandle med GDF-8-antistoffene ifølge foreliggende oppfinnelse, innbefatter lav benmasse som skyldes kronisk glukokortikoid terapi, for tidlig gonodal svikt, androgen suppresjon, vitamin D svikt, sekundær hyperparatyroidisme, sviktende opptak av forskjellige næringsstoffer og anorexia nervosa. Antistoffene kan eventuelt brukes for å hindre, diagnostisere eller behandle slike medisinske lidelser og sykdommer i pattedyr, eventuelt i mennesker. ;Antistoffene eller antistoffsammensetningene ifølge foreliggende oppfinnelse kan administreres i terapeutisk effektive mengder. Begrepet en "effektiv mengde" slik det brukes her, av et antistoff er en dose som er tilstrekkelig til å redusere aktiviteten av GDF-proteiner for å oppnå det forønskede biologiske resultat (f.eks. å øke muskelmassen eller styrken). Generelt vil en terapeutisk effektiv mengde variere med pasientens alder, tilstand og kjønn, så vel som graden av den medisinske tilstand som behandles i pasienten. Dosen kan bestemmes av en lege og justeres etter behov når en observerer effekten av behandlingen. Generelt vil sammensetningen bli administrert slik at antistoffene gis i en dose på mellom 1Hg/kg og 20 mg/kg. Eventuelt kan antistoffene gis som en såkalt bolusdose, for å maksimalisere nivået av antistoffer i sirkulasjon lengst mulig etter doseringen. Kontinuerlig infusjon kan også brukes etter bolusdosen. ;Fremgangsmåtene for å behandle, diagnostisere eller å hindre de ovennevnte medisinske tilstander med de her beskrevne antistoffer, kan også brukes på andre proteiner i TGF-P-superfamilien. Mange av disse proteinene, f.eks. BMP-11, har en struktur som er nærstående til GDF-8. I en annen utførelse tilveiebringer således oppfinnelsen fremgangsmåter for å behandle de forannevnte lidelser ved å administrere en pasient et antistoff som er i stand til å hemme BMP-11 eller aktivin, enten alene eller i kombinasjon med andre TGF-P-inhibitorer, så som et nøytraliserende antistoff mot GDF-8. ;Antistoffene ifølge foreliggende oppfinnelse kan brukes for å påvise nærværet av proteiner som hører til TGF-P-superfamilien, så som BMP-11 og GDF-8. Ved å korrelere nærværet eller nivået av disse proteinene med den medisinske tilstanden, er det mulig for en lege å diagnostisere den assosierte medisinske tilstanden. De medisinske tilstandene kan diagnostiseres ved hjelp av de her beskrevne antistoffer som beskrevet ovenfor. ;Slike påvisningsmetoder er velkjente innenfor genteknologien og innbefatter ELISA, radioimmunoprøver, immunoblott, western blott, immunofluorescens, immunoutfelling og andre sammenlignbare teknikker. Antistoffene kan videre tilveiebringes i et diagnostisk sett som inkorporerer én eller flere av disse teknikkene for å påvise et protein (f.eks. GDF-8). Et slikt sett kan inneholde andre komponenter, instruksjoner eller annet materiale som letter påvisningen av proteinet og bruken av settet. ;I de tilfeller hvor antistoffene er påtenkt å bli brukt for diagnostiske formål, kan det være ønskelig at de blir modifisert, f.eks. med en ligandgruppe (så som biotin), eller en påvisbar markørgruppe (så som en fluorescerende gruppe, en radioisotop eller et enzym). Hvis det er ønskelig kan antistoffene (enten disse er polyklonale eller monoklonale merkes ved hjelp av vanlig kjent teknikk. Egnede markører innbefatter fluoroforer, kromoforer, radioaktive atomer, elektrontette reagenser, enzymer og ligander med spesifikke bindende partnere. Enzymer blir typisk påvist ved hjelp av sin aktivitet. F.eks. blir pepperrotperoksidase vanligvis påvist ved dets evne til å omdanne 3,3',5,5'-tetrametylbenzidin (TMB) til et blått pigment som lar seg kvantifisere ved hjelp av et spektrofotometer. Andre egnede markører innbefatter f.eks. én av bindingspartnerne, så som biotin og avidin eller streptavidin, IgG og protein A og forskjellige andre reseptor-ligandpar som er kjent innen genteknologien. Andre variasjoner og muligheter vil være innlysende for de med innsikt i fagfeltet, og anses å være likeverdige innenfor oppfinnelsens intensjon. ;Antistoffsammensetninger ;Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer sammensetninger som omfatter de her beskrevne antistoffer. Slike sammensetninger kan være egnet for farmasøytisk bruk og administrering til pasienter. Sammensetningene vil typisk omfatte ett eller flere antistoffer ifølge oppfinnelsen og et farmasøytisk akseptabelt fortynningsmiddel. Med begrepet "farmasøytisk akseptabelt fortynningsmiddel", innbefattes ethvert og alle løsemidler, dispergeringsmedia, belegg, antibakterielle og antifungale midler, isotone og absorpsjonsforsinkende midler og lignende som er forenlig med den farmasøytiske administrering. Bruken av slike media og midler for farmasøytisk aktive stoffer er velkjente innen farmasien. Sammensetningene kan også inneholde andre aktive forbindelser som tilveiebringer supplerende, ytterligere eller bedrede terapeutiske funksjoner. De farmasøytiske sammensetningene kan inngå i en beholder, pakke eller dispenser sammen med instruksjon for administrering. ;En farmasøytisk sammensetning ifølge oppfinnelsen opparbeides slik at den er forenlig med den påtenkte administrasjonsveien. Fremgangsmåter i så henseende er velkjente innenfor den farmasøytiske industri. Det er også mulig å fremstille sammensetninger som kan administreres topisk eller oralt, eller som er i stand til å gjennomføre en transmisjon over slimhinner. Administreringen kan f.eks. være intravenøs, intraperetoneal, intramuskulær, i hulrom, subkutan eller transdermal. ;Løsninger eller suspensjoner som kan brukes for intradermal eller subkutan anvendelse vil typisk inneholde én eller flere av de følgende komponenter: et sterilt fortynningsmiddel så som vann for injeksjon, saltløsning, forskjellige typer oljer, polyetylenglykoler, glyserin, propylenglykol eller andre syntetiske løsemidler; antibakterielle midler så som benzylalkohol eller metylparabener; antioksidanter så som askorbinsyre eller natriumbisulfitt; gelateringsmidler så som etylendiamintetraeddiksyre; buffere så som acetater, sitrater eller fosfater, eller midler for å justere tonisiteten, så som natriumklorid eller dekstrose. pH kan justeres med syrer eller baser, f.eks. saltstyre eller natriumhydroksid. Slike preparater kan plasseres i ampuller, éngangssprøyter eller flerdoseampuller fremstilt av glass eller plast. ;Farmasøytiske sammensetninger som er egnet for injeksjon innbefatter sterile vandige løsninger eller dispersjoner og sterile pulver for ekstemporær fremstilling av sterile injiserbare løsninger eller dispersjoner. For intravenøs administrering er det mulig å bruke egnede bærestoffer så som fysiologisk saltoppløsning, bakteriostatisk vann, Cremophor EL™ (BASF, Parippany, NJ) eller fosfatbufret saltløsning (PBS). I alle tilfeller må sammensetningen være steril og tilstrekkelig flytende til at den lett lar seg administrere ved hjelp av en sprøyte. Den må videre være stabil under fremstillingsbetingelsene og under lagring og må være konservert mot forurensende virkninger av mikroorganismer, så som bakterier og sopp. Bæreren kan være et løsemiddel eller dispergerende medium som f.eks. kan inneholde vann, etanol, polyol (f.eks. glyserol, propylenglykol og flytende polyetylenglykol og lignende) eller egnede blandinger av disse. Passende fluiditet kan f.eks. opprettholdes ved å bruke et belegg så som lecitin, eller ved at man opprettholder den forønskede partikkelstørrelsen i forbindelse med dispersjoner og ved å bruke overflateaktive midler. En beskyttelse mot virkningen av mikroorganismer kan oppnås ved hjelp av forskjellige midler mot bakterier og sopp, f.eks. parabener, klorbutanol, fenol, askorbinsyre, timerosal og lignende. I mange tilfeller vil isotone midler så som sukre, polyalkoholer så som mannitol, sorbitol, og natriumklorid være tilsatt sammensetningen. Injiserbare sammensetninger med langvarig absorpsjon kan fremstilles ved at sammensetningen inneholder et middel som forsinker absorpsjonen, f.eks. aluminiummonostearat og gelatin. ;Orale sammensetninger vil generelt innbefatte et inert fortynningsmiddel eller en spiselig bærer. Sammensetningene kan være plassert i gelatinkapsler eller kan presses til tabletter. For oral terapeutisk administrering kan antistoffene inkorporeres sammen med fortynningsmidler og brukes i form av tabletter, drops eller kapsler. Farmasøytisk forenlige bindemidler og/eller adjuvanter kan inngå som en del av sammensetningen. Tablettene, pillene, kapslene, dropsene og lignende kan inneholde hver av de følgende bestanddeler eller forbindelser av lignende type, et bindemiddel så som mikrokrystallinsk cellulose, gummitragakant eller gelatin; et fortynningsmiddel så som stivelse eller laktose, et nedbrytningsmiddel så som algininsyre, primogel eller maisstivelse; et smøremiddel så som magnesiumstearat eller sterotes; et glidemiddel så som kolloidal silisiumdioksid, et søtningsmiddel så som sukrose eller sakkarin; eller et smaksstoff så som peppermynte, metylsalicylat eller et stoff med appelsinsmak. ;For administrering ved inhalering kan antistoffene tilføres i form av en aerosol fra en trykkbeholder eller dispenser, som inneholder et egnet drivmiddel, f.eks. en gass så som karbondioksid, eller ved hjelp av en forstøvningsanordning. ;Systematisk administrering kan også utføres gjennom slimhinner eller huden. For en slik administrering er det i preparatene mulig å bruke inntrengningsmidler som er passende for barrieren som skal gjennomtrenges. Slike inntrengningsmidler er generelt kjente innenfor den farmasøytiske industri, og innbefatter f.eks. for slimhinneadministrering rensemidler, gallesalter og fusidinsyrederivater. Administrering på slimhinnene kan også utføres ved hjelp av nesespray eller suppositorer. For transdermal administrering kan de aktive forbindelsene opparbeides i salver, geler eller kremer slik det er velkjent innenfor den farmasøytiske industri. ;Antistoffene kan også bearbeides i form av stikkpiller (sammen med vanlige kjente stikkpillebaser så som kakaosmør eller andre glyserider) eller retensjonsenema for rektal tilførsel. ;I én utførelse kan de her beskrevne antistoffer fremstilles sammen med bærestoffer som vil beskytte forbindelsen mot rask eliminering fra kroppen, f.eks. i form av preparater som gir en kontrollert frigjøring, og heri inngår implanterte preparater og systemer for tilførsel av mikrokapsler. Bionedbrytbare og bioforenlige polymerer kan brukes, f.eks. etylenvinylacetat, polyanhydrider, polyglykolinsyre, kollagen, polyortoestere og polymelkesyre. Fremgangsmåte for fremstilling av slike preparater er velkjente. De forskjellige bestanddelene kan også kjøpes kommersielt fra Alza Corporation og Nova Pharmaceuticals, Inc. Liposomale suspensjoner inneholdende de her beskrevne antistoffer kan også brukes som en farmasøytisk akseptabel bærer. Disse kan fremstilles ved hjelp av kjente fremgangsmåter, f.eks. som beskrevet i US patent nr. 4 522 811. ;Det er spesielt fordelaktig å opparbeide orale eller parenterale sammensetninger i form av enhetsdoser, noe som vil lette administreringen og sikre jevne doser. Begrepet doserings enhet slik det brukes her refererer seg til fysisk diskrete enheter som er egnet som enhetsdoser for den pasient som skal behandles, og hvor hver enhet inneholder en forutbestemt mengde av den aktive forbindelsen beregnet slik at den gir den forønskede terapeutiske effekt i assosiasjon med den nødvendige farmasøytiske bæreren. Spesifiseringen av doseenhetsformer ifølge foreliggende oppfinnelse står i et direkte forhold til den aktive forbindelsen og dennes egenskaper og den spesielle terapeutiske effekt som skal oppnås, og de begrensninger som forefinnes er de samme som ellers når det gjelder administrering av en aktiv forbindelse for behandling av pasienter. ;Toksisitet og terapeutisk effekt av slike forbindelser kan bestemmes ved hjelp av standard farmasøytiske fremgangsmåter i cellekulturer eller eksperimenter, f.eks. for å bestemme LD50(den dose som er dødelig for 50 % av populasjonen) og ED50(den terapeutiske dose som er effektiv i 50 % av befolkningen). Doseforholdet mellom toksiske og terapeutiske effekter er vanligvis angitt som den terapeutiske indeksen, og kan uttrykkes som forholdet LD50/ED50. Antistoffer som har høye terapeutiske indekser inngår som en utførelse av oppfinnelsen. ;De data som oppnås fra celledyrkningsprøver og dyreundersøkelser kan brukes for å definere et doseringsområde for bruk hos mennesker. Dosen av slike forbindelser ligger eventuelt innenfor et variasjons område med hensyn til såkalte sirkulerende konsentrasjoner, som innbefatter ED50med liten eller ingen toksisitet. Dosen kan således variere innenfor et slikt variasjonsområde avhengig av den doseringsform som brukes og den administreringsvei som anvendes. For ethvert antistoff som brukes i foreliggende oppfinnelse kan den terapeutisk effektive dosen lett bestemmes ut fra celledyrkningsprøver. En dose kan så fastlegges i dyremodeller slik at den oppnår et sirkulerende plasmakonsentrasjonsområde som innbefatter ICso-verdien (dvs. den konsentrasjon av det undersøkte antistoffet som oppnår en halvmaksimal inhibering av symptomene), slik dette kan bestemmes i cellekulturer. Nivået i plasma kan f.eks. måles ved høytrykks væskekromatografi. Effektene av en spesiell dose kan så kontrolleres ved hjelp av en egnet bioprøve. Eksempler på egnede bioprøver innbefatter DNA-replikasjonsprøver, transkripsjons-baserte prøver, GDF-protein/reseptorbindingsprøver, kreatinkinaseprøver, prøver basert på differensieringen av pre-adipocytter, prøver basert på glukoseopptaket i adipocytter og immunologiske prøver. ;Modifiserte antistoffer ;Det er underforstått av personer med en viss innsikt i genteknologiske fremgangsmåter at visse aminosyrer kan byttes ut med andre aminosyrer i en proteinstruktur uten at man derved skadelig påvirker proteinets aktivitet, f.eks. et antistoffs bindende egenskaper. Det er således antatt at det kan utføres forskjellige forandringer i aminosyresekvensen i de her beskrevne antistoffer eller DNA-sekvenser som koder antistoffene, uten at det skjer et betydelig tap av deres biologiske aktivitet eller anvendelse. Slike forandringer innbefatter delesjoner, innsettinger, forkortninger, substitusjoner, fusjoner, stokking av motivsekvenser og lignende. ;Ved utførelsen av slike forandringer er det nødvendig å ta hensyn til aminosyrenes såkalte hydropatiske indeks. Betydningen av den hydropatiske aminosyreindeksen for å tilveiebringe en interaktiv biologisk funksjon for et protein, er velkjent innenfor genteknologien (Kyte og Doolittle (1982) J. Mol. Biol, 157: 105-132). Det er akseptert og kjent at aminosyrens relative hydropatiske karakter bidrar til den sekundære strukturen på det resulterende proteinet, som igjen definerer dette proteinets interaksjon med andre molekyler, f.eks. enzymer, substrater, reseptorer, DNA, antistoffer, antigener og lignende. ;Hver aminosyre er blitt gitt en hydropatisk indeks på basis av dens hydrofobisitet og ladningsegenskaper (Kyte og Doolittle, 1982); således er isoleucin (+4,5), valin (+4,2), leucin (+3,8), fenylalanin (+2,8), cystein/cystin (+2,5), metionin (+1,9), alanin (+1,8), glysin (-0,4), treonin (-0,7), serin (-0,8), tryptofan (-0,9), tyrosin (-1,3), prolin (-1,6), histidin (-3,2), glutamat (-3,5), glutamin (-3,5), aspartat (-3,5), asparagin (-3,5), lysin (-3,9), og arginin (-4,5). ;Ved utføringen av slike forandringer er en substitusjon av aminosyrer viss hydropatiske indekser ligger innenfor + 2, en utførelse av oppfinnelsen, og optimale er også de som ligger innenfor + 1 og de som ligger innenfor + 0,5. ;Det er også underforstått at substitusjonen av like aminosyrer kan effektivt utføres på basis av hydrofilisitet. US patent 4 554 101 angir at et proteins høyeste lokale midlere hydrofilisitet, som styres av hydrofilisiteten til naboaminosyrene, er korrelert med en biologisk egenskap for proteinet. ;Som beskrevet i US patent 4 554 101, er de følgende hydrofilisitetsverdier blitt fastsatt for følgende aminosyreresidua: arginin (+3,0), lysin (+3,0), aspartat (+3,0+1), glutamat (+3,0+1), serin (+0,3), asparagin (+0,2), glutamin (+0,2), glysin (0), treonin (-0,4), prolin (-0,5+1), alanin (-0,5), histidin (-0,5), cystein (-1,0), metionin (-1,3), valin (-1,5), leucin (-1,8), isoleucin (-1,8), tyrosin (-2,3), fenylalanin (-2,5), og tryptofan (-3,4). ;Ved utføringen av slike forandringer så er substitusjonen av aminosyrer hvis hydrofilisitetsverdier ligger innenfor +2 en utførelse av oppfinnelsen, og de som ligger innenfor +1 er optimale, og de som ligger innenfor +0,5 er også optimale. ;Modifikasjonene kan være konservative slik at proteinets struktur eller biologiske funksjon ikke er påvirket av forandringen. Slike konservative aminosyremodifikasjoner er basert på den relative likheten mellom substituentene i aminosyresidekjeden, f.eks. deres hydrofobisitet, hydrofilisitet, ladning, størrelse og lignende. Eksempler på konservative substitusjoner som tar hensyn til de forannevnte egenskaper er velkjente innenfor genteknologien, og inkluderer arginin og lysin, glutamat og aspartat, srein og treonin, glutamin og asparagin, og valin, leucin og isoleucin. Aminosyresekvensen i de her beskrevne antistoffer kan modifiseres med et gitt antall konservative forandringer så lenge antistoffets binding til sitt målantigen ikke er skadelig påvirket. Slike forandringer kan innføres enten innenfor eller utenfor den antigenbindende delen av antistoffet. F.eks. kan forandringer innføres inne i antistoffets antigenbindende del være slik at det øker antistoffets affinitet for sitt mål. ;I tillegg til forandringer i aminosyresekvensen slik dette er beskrevet ovenfor, så kan antistoffene også være glykosylert, pegylert eller bundet til albumin eller til en ikke-proteinaktig polymer. F.eks. kan de her beskrevne antistoffer være forbundet til en rekke forskjellige ikke-proteinaktige polymerer, f.eks. polyetylenglykol, polypropylenglykol eller polyoksyalkylener, på den måten som er beskrevet i US patentene 4 640 835, 4 496 689, 4 301 144, 4 670 417, 4 791 192, eller 4 179 337. Antistoffene kan f.eks. være kjemisk modifisert ved en kovalent konjugering til en polymer for å øke deres sirkulerende halvliv. Visse polymerer og fremgangsmåter for tilfesting av disse til peptider, er beskrevet i US patentene 4 766 106, 4 179 337, 4 495 285, og 4 609 546. ;I en annen utførelse kan antistoffet være modifisert slik at det har et endret glykosyleringsmønster (dvs. endret i forhold til det opprinnelige eller native glykosyleringsmønsteret). Med begrepet "endret" forstås at én eller flere karbohydratgrupper er fjernet, og/eller at ett eller flere glykosyleringsseter er addert til det opprinnelige antistoffet. ;Glykosylering av antistoffer er typisk enten N-forbundet eller O-forbundet. N-forbundet refererer seg til at karbohydratgruppen er festet til sidekjeden i et asparaginresidu. Tripeptidsekvensene asparagin-X-serin og asparagin-X-treonin, hvor X er enhver aminosyre bortsett fra prolin, er det gjenkjennelsessekvenser for enzymatisk tilfesting av karbohydratgruppen til asparaginsidekjeden. Et nærvær av enhver av disse tripeptidsekvensene i et polypeptid skaper således et mulig glykosyleringssete. O-forbundet glykosylering refererer seg til tilfestingen av ett av sukrene N-acetylgalaktosamin, galaktose eller xylose til en hydroksyaminosyre, mest vanlig serin eller treonin, skjønt også 5-hydroksyprolin eller 5-hydroksylysin kan brukes. ;Addering av glykosyleringssetet til de her beskrevne antistoffer utføres vanligvis ved å endre aminosyresekvensen slik at den inneholder én eller flere av de ovenfor beskrevne tripeptidsekvenser (f.eks. N-forbundne glykosyleringsseter). Endringen kan også utføres ved å addere eller å substituere én eller flere serin- eller treoninresidua til sekvensen i de opprinnelige antistoffene (for O-forbundne glykoslyeringsseter). For letthets skyld kan eventuelt antistoff aminosyresekvensen endres via forandringer på DNA-nivået. ;Andre måter for å øke antallet karbohydratgrupper i antistoffene kan være en kjemisk eller enzymatisk kobling av glykosider til aminosyreresidua i antistoffet. Disse fremgangsmåtene er fordelaktige ved at de ikke krever en produksjon av GDF-peptidinhibitoren i en vertscelle som har glykosyleringsevne for N- eller O-forbundet glykosylering. Avhengig av den koblingsmetode som brukes, kan sukrene festes til (a) arginin og histidin, (b) frie karboksylgrupper, (c) frie sulfhydrylgrupper så som de som finnes i cystein, (d) frie hydroksylgrupper slik det forefinnes i serin, treonin eller hydroksyprolin, (e) aromatiske grupper, så som fenylalanin, tyrosin eller tryptofan, eller (f) amidgruppen i glutamin. Disse fremgangsmåtene er beskrevet i WO 87/05330 og i Aplin og Wriston (1981) CRC Crit. Rev. Biochem., 22: 259-306. ;Fjerning av eventuelle karbohydratgrupper som er tilstede på antistoffene kan utføres enten kjemisk eller enzymatisk. Kjemisk deglykosylering krever at antistoffet blir eksponert for trifluormetansulfonsyre eller en tilsvarende forbindelse. Denne behandlingen resulterer i en avspalting av de fleste eller alle sukre bortsett fra de forbindende sukrene (N-acetylglukosamin eller N-acetylgalaktosamin), mens aminosyresekvensen forblir intakt. ;Kjemisk deglykosylering er beskrevet av Hakmuddin et al. (1987) Arch. Biochem. Biophys., 259: 52; og Edge et al. (1981) Anal. Biochem. 118: 131. Avspalting av karbohydratgrupper fra GDF-peptidinhibitorer kan oppnås ved en rekke forskjellige endo- og ekso-glykosidaser slik disse er beskrevet av Thotakura et al. (1987) Meth. Enzymol., 138: 350. ;Sekvensanalvse ;Skjønt det ikke alltid er nødvendig, så kan en hvis det er ønskelig bestemme aminosyre- eller nukleinsyresekvensen i de her beskrevne antistoffene. Den foreliggende oppfinnelsen innbefatter disse aminosyre- og nukleinsyresekvensene. Oppfinnelsen innbefatter også varianter, homologer og fragmenter av disse nukleinsyre- og aminosyresekvensene. F.eks. kan antistoffet omfatte en sekvens for et tungkjedevariabelt område som omfatter SEKV. ID nr. 1, eller en nukleinsyresekvens som koder SEKV. ID nr. 1 (f.eks. SEKV. ID nr. 6). Nuklein-eller aminosyresekvensen omfatter eventuelt en sekvens som er minst 70-79 % identisk til nuklein- eller aminosyresekvensen i det her beskrevne variable tungkjedeområdet, eventuelt minst 80-89 % identisk, eventuelt 90-95 % identisk og eventuelt minst 96-100 % identisk. Det er velkjent at CDR-området som bestemmer antistoffets antigene bindingsegenskaper, tolererer mindre sekvens variasjon enn andre deler av antistoffet som ikke inngår i antigenbindingen. Disse ikke-bindende områdene av antistoffet kan således inneholde eller omfatte betydelige variasjoner uten at dette signifikant endrer bindingsegenskapene for antistoffet. Det er videre underforstått at en kan utføre forandringer som omformer CDR-området slik at dette øker antistoffets affinitet for sitt mål. Slike forandringer for å øke affiniteten blir typisk bestemt empirisk ved å endre CDR-området og så teste antistoffet. Alle slike endringer enten de ligger innenfor CDR eller utenfor CDR, inngår således i den foreliggende oppfinnelsen. ;Relativ sekvenslikhet eller identitet kan bestemmes ved å bruke "Best Fit" eller "Gap" programmene i Sequence Analysis Software Package™ (versjon 10, Genetics Computer Group, Inc., University of Wisconsin Biotechnology Center, Madison, WI). "Gap" anvender algoritmen til Needleman og Wunsch (Needleman og Wunsch, 1970), for å finne den alignment mellom de to sekvensene som maksimaliserer antallet tilpasninger og minimaliserer antallet gap. "Best Fit" utfører en optimal opplinjering av det segment som har den beste likheten i de to sekvensene. Optimal opplinjering kan finnes ved å innsette gap for å maksimalisere antall tilpasninger ved å bruke den lokale homologialgoritmen til Smith og Waterman (Smith og Waterman, 1981; Smith et al., 1983). ;Den programvare som er beskrevet ovenfor inneholder et stort antall andre sekvensanalyseredskaper for å identifisere homologier i de her beskrevne nukleotid-og aminosyresekvenser. F.eks. søker "BLAST"-programmet (Altschul et al., 1990) for sekvenser som er lik en såkalt spørrende sekvens (enten peptid eller nukleinsyre) i en spesifisert database (f.eks. de sekvensdatabaser som forefinnes ved the National Center for Biotechnology Information (NCBI) i Bethseda, MD); "FastA" (Lipman og Pearson, 1985; se også Pearson og Lipman, 1988; Pearson et al., 1990) utfører en Pearson og Lipman søk for likhet mellom nevnte spørrende sekvens og en gruppe av sekvenser av samme type (nukleinsyre eller protein), "TfastA" utfører en Pearson og Lipman søk for likhet mellom en proteinspørrende sekvens og enhver gruppe av nukleotidsekvensre (den oversetter nukleotidsekvensene i alle seks leserammene før den utfører sammenligningen); "FastX" utfører en Pearson og Lipman søk for likhet mellom en nukleotidspørrende sekvens og en gruppe av proteinsekvenser idet en tar hensyn til rammeskifte. "TfastX" utfører en Pearson og Lipman søk for likhet mellom en proteinspørrende sekvens og enhver gruppe av nukleotidsekvenser, idet en tar hensyn til rammeskift (den oversetter begge trådene i nukleinsyresekvensen før den utfører sammenligningen). ;EKSEMPLER ;Eksempel 1: Rensing av GDF- 8 ;Tilpassede media fra en utvalgt cellelinje som uttrykker fullengde humant GDF-8-protein (modent GDF-8 + GDF-8-propeptid) ble surgjort til pH 6,5 og påsatt en 80 x 50 mm POROS HQ anionutbytningskolonne i serie med en 80 x 50 mm POROS SP kationutbytningskolonne (PerSeptive Biosystems, Foster City, CA). Strømmen fra kolonnene ble justert til pH 5,0 og påsatt en 75 x 20 mm POROS SP kationutbytningskolonne (PerSeptive Biosystems) og eluert med en NaCl-gradient. De fraksjonene som inneholdt GDF-8, noe som ble påvist ved hjelp av natriumdodekylsulfat-polyakrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE), ble slått sammen, surgjort med trifluoreddiksyre (TFA) til pH 2-3, og så justert til 200 ml med 0,1 % TF A for å senke viskositeten. Løsningen ble så påsatt en 250 x 21,2 mm C5-kolonne (Phenomenex, Torrance, CA), etter en 60 x 21,2 mm vaktkolonne (Phenomenex) og eluert med en TFA/CH3CN-gradient for å skille modent eller fullt utviklet GDF-8 fra GDF-8-propeptid. De fraksjonene som inneholdt modent GDF-8 ble konsentrert ved frysetørring og for å fjerne acetonitrilen og så tilsette 20 ml 0,1 % TFA. Prøven ble så påsatt en 250 x 10 mm Cs-kolonne (Phenomenex) oppvarmet til 60°C for å lette separasjonen. Dette ble gjentatt inntil det ikke var mulig å oppnå ytterligere separasjon. De fraksjonene som inneholdt modent GDF-8 ble så slått sammen og justert til 40 % acetonitril og påsatt en 600 x 21,2 BioSep S-3000 størrelsessorteringskolonne (Phenomenex) plassert etter en 60 x 21,2 vaktkolonne. De fraksjonene som inneholdt det rensede modne GDF-8 ble slått sammen og konsentrert for bruk i de etterfølgende eksperimentene. ;C5-kolonnefraksjoner som inneholdt GDF-8-propeptidet blir slått sammen, og acetonitrilen blir fjernet ved fordampning, 20 ml 0,1 % TFA ble tilsatt, og prøven ble så injisert inn i en 250 x 10 mm Cs-kolonne ved 60°C. Dette ble gjentatt inntil det ikke var mulig å oppnå ytterligere separasjon. De fraksjonene som inneholdt GDF-8-propeptidet ble så slått sammen og deretter justert til å inneholde 40 % acetonitril, hvoretter løsningen ble påsatt en 600 x 21,2 BioSep S-3000 kolonne for størrelsesortering (Phenomenex), med en 60 x 21,2 vaktkolonne i forkant. De fraksjonene som inneholdt det rensede GDF-8-propeptidet ble slått sammen og konsentrert for bruk i de etterfølgende eksperimenter. ;På SDS-PAGE vandret det rensede modne GDF-8 som et bredt bånd ved 25 kDa under ikke-reduserende betingelser, og 13 kDa under reduserende betingelser. En lignende SDS-PAGE-profil er blitt rapportert for mus GDF-8 (McPherron et al., 1997, supra), og reflekterer det modne proteinets dimere natur. ;Den tilsynelatende molekylvekten for det rensede GDF-8-propeptidet var 38 kDa både under reduserende og ikke-reduserende betingelser. Dette indikerer at GDF-8-propeptidet i seg selv er monomerisk. Forskjellene mellom den tilsynelatende molekylvekten og den beregnede molekylvekten på GDF-8-propeptidet, dvs. ca. 26 kDa, kan være et resultat av en addering av karbohydrat, ettersom dens aminosyresekvens inneholder et mulig N-forbundet glykosyleringssete (McPherron et al., 1997, supra). ;Eksempel 2: Karakteristika for renset rekombinant human GDF- 8 ;50 ug av både renset modent GDF-8 og renset GDF-8-propeptid ble blandet og dialysert i 50 mM natriumfosfat, pH 7,0 og kromatografert på en 300 x 7,8 mm BioSep S-3000 kolonne for størrelsessortering (Phenomenex). Molekylvekten på det modne GDF-8 :propeptidkomplekset ble bestemt ut fra elueringstid, ved å bruke molekylvektstandarder (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) som ble kromatografert på den samme kolonnen. ;Når det rensede GDF-8-propeptidet ble inkubert med renset modent GDF-8 ved nøytral pH, så dannet de to proteinene et kompleks, noe som fremgikk av størrelsessorteringsprofilen. Den primære proteintoppen ble eluert ved 12,7 min. og hadde en beregnet molekylvekt på 78 kDa ut fra molekylvektstandarder (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA), som ble kromatografert på den samme kolonne. Størrelsen på komplekset er mest i overenstemmelse med én dimer av det modne GDF-8 assosiert med to monomerer av propeptidet. ;For å bekrefte denne observasjonen ble et preparat som inneholdt både modent GDF-8 og GDF-8-propeptid inkubert med eller uten 100 mM 1-etyl 3-(3-dimetylaminopropyl)karboddimidhydroklorid (EDC, Pierce) i 1 time ved romtemperatur (RT), deretter surgjort med HC1 til pH 2-3 og konsentrert ved hjelp av en Micron-10 Amicon-konsentrator (Millipore, Bedford, MA) for SDS-PAGE ved å bruke en tricinbufret 10 % akrylamidgel. Proteinene ble visualisert ved hjelp av Coomassie blåfarging på gelen. I nærværet av EDC kunne man observere et tverrbundet kompleks med en tilsynelatende molekylvekt på 75 kDa. ;DNA og aminosyresekvensen for GDF-8-propeptidet er angitt i McPherron og Lee ;(1997) Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 94: 12457-12461. ;Eksempel 3: Produksjon av anti- GDF- 8- antistoff ;For å utvikle et antistoff som er i stand til å hemme GDF-8-aktivitet, ble en gruppe av GDF-8 knockoutmus immunisert hver annen uke med modent GDF-8-protein (renset som beskrevet i eksempel 1), blandet i Freunds fullstendige adjuvans ved de to første immuniseringene, og deretter i ufullstendig Freunds adjuvans. Under hele immuniseringsperioden ble det tatt blodprøver og disse ble testet for nærvær av sirkulerende antistoffer. I uke 9 ble et dyr med sirkulerende antistoffer tatt ut, immunisert i de tre påfølgende dager og så avlivet. Milten ble fjernet og homogenisert til celler. Miltcellene blir så fusjonert til en myelom fusjonspartner (linje P3-x63-Ag8.653) ved å bruke 50 % PEG 1500 ved å bruke en velkjent fremgangsmåte (Oi & Herzenberg (1980) SelectedMethods in Cellular Immunology, W. J. Freeman Co., San Francisco, CA, side 351). De fusjonerte cellene blir så utplatet på 96-brønns mikrotitreringsplater i en tetthet på 2 x 10<5>celler/brønn. Etter 24 timer ble cellene underkastet en HAT-seleksjon (Littlefield ;(1964) Science, 145: 709), som effektivt dreper alle ufusjonerte og uproduktive fusjonerte myelomceller. ;De riktig fusjonerte hybridomcellene som skiller ut anti-GDF-8-antistoffer ble identifisert ved hjelp av ELISA-prøver både i fast fase og i løsningsfase. Modent GDF-8-protein ble fremstilt fra CHO-celler slik det er beskrevet ovenfor og deretter pålagt polystyren (for prøver i fast fase) eller biotinylert (for løsningsbaserte prøver). Nøytraliserende prøver ble også brukt hvor ActRIIB-reseptoren var belagt på en polystyrenplate og hvor biotin GDF-8-bindingen ble inhibert ved tilsetting av hybridomsupernatant. Resultatene identifisert i hybridomer som uttrykker GDF-8-antistoffer. Disse positive kloner ble dyrket og forøket for ytterligere undersøkelser. Disse kulturene forble stabile ved nevnte økning, og cellelinjer ble klonet ved såkalt begrensende fortynning og deretter bevart i dypfrosset tilstand. ;Ut fra disse cellekulturene ble det fremstilt en serie antistoffer som spesifikt gjenkjenner modent GDF-8. Isotype for antistoffene ble bestemt ved å bruke et museimmunoglobulin isotypifiseringssett (Zymed Laboratories, San Francisci, CA). En av antistoffklonene som ble gitt betegnelsen JA-16, ble så brukt for ytterligere undersøkelser. ;Eksempel 4: Karakterisering av JA- 16 bindingsspesifisitet ;For å bestemme bindingsspesifisiteten for JA-16 ble det produsert et utvalg av syntetiske peptider som tilsvarer deler av GDF-8-proteinsekvensen. Fig. 1 viser de GDF-8 syntetiske peptider som ble brukt i denne undersøkelsen. Peptidene med like tall (N2-N14) ble biotinylert på det primære aminet. De biotinylerte peptidene N2, N4, N6, N8, N10, NI2, NI4 og et irrelevant peptid DAE-10, ble belagt i en mengde på 1 ug/ml i 2 timer ved romtemperatur på Reacti-Bind™ Streptavidinbelagte polystyren 96-brønns plater (Pierce, Rockford, IL, katalog nr. 15124), ved å følge fabrikantens protokoll. ;Etter blokkering ble JA-16 eller en urelatert monoklonal antistoffkontroll tilsatt ELISA-platen i en mengde på 100, 10 og 1 nM (bare JA-16) og inkubert i 30 min. Etter vasking av platen ble et sekundært antistoff (geit anti-mus IgG (H+L)-HRP, Calbiochem, San Diego, CA, katalog nr. 401215) tilsatt i en fortynning på 1:1000 og inkubert i 30 min. ved romtemperatur. Platen ble vasket fire ganger og deretter tilsatt TMB-substrat (KPL, Gaithersburg, MD, katalog nr. 50-76-04). Kolorimetriske målinger ble utført ved 450 nm i en Molecular Devices mikroplateleser. Resultatene er vist på fig. 2. JA-16 binder seg sterkt og spesifikt til det biotinylerte N-terminale peptidet N8 (SEKV. ID nr. 65). ;Modent GDF-8 og BMP-11 er 90 % homologe på aminsyrenivået (fig. 3). Tre av disse forandringene er tilstede i N8-peptidet. For å sammenligne spesifisiteten for JA-16 mot GDF-8 og BMP-11, ble det fremstilt peptidet med betegnelsen Gl og Bl som er spesifikke for GDF-8 og BMP-11 henholdsvis. Forskjellene mellom Gl og Bl er angitt med understrekning. ; Peptidene Gl og Bl ble konjugert til BSA ved å bruke et PIERCE konjugeringssett (katalog nr. 77116ZZ) ved å bruke fabrikantens protokoll. Gl-BSA og Bl-BSA ble belagt på 96-brønns flatbunnede prøveplater (Costar, NY, katalog nr. 3590) i en mengde på 1 ug/ml i 0,2 M natriumkarbonatbuffer over natten ved 4°C. Platene ble vasket og blokkert med PBS, 1 mg/ml BSA, og 0,05 % Tween i 1 time ved romtemperatur. JA-16 (5 nM) ble så seriefortynnet (1:2). Fortynningene ble tilsatt ELISA-platen og inkubert i 30 min. ved romtemperatur. Etter fire vaskinger ble et sekundært antistoff (geit anti-mus IgG (H+L)-HRP Calbiochem, katalog nr. 401215) tilsatt i en fortynning på 1:1000 hvoretter platen ble inkubert i 30 min. ved romtemperatur. Platen ble så vasket fire ganger og tilsatt TMB-substrat (KPL, katalog nr. 50-76-04). Kolorimetriske målinger ble utført ved 450 nm ved hjelp av en Molecular Devices mikroplateleser. Fig. 4 viser at JA-16 binder seg til Gl-BSA på en konsentrasjonsavhengig måte, men ikke til Bl-BSA selv ved den høyeste konsentrasjonen. ;For videre å undersøke JA-16-spesifisiteten ble Gl-BSA belagt som beskrevet ovenfor, men denne gang ble JA-16 i en mengde på 5 nM preinkubert enten ved Gl-peptid eller Bl-peptid, GDF-8 eller BMP-11 i forskjellige konsentrasjoner. Resultatene er vist på fig. 5. Det BMP-11-spesifikke peptidet Bl hemmer ikke bindingen av JA-16 til Gl-BSA, noe som er tilfellet med Gl. IC50på GDF-8 er 0,8Hg/ml, mens BMP-11 har en IC50på 3,8 ug/ml, som viser at JA-16 gjenkjenner GDF-8 med fem gangers høyere affinitet enn BMP-11. ;Eksempel 5: Kartlegging av JA- 16- epitop ;For å kartlegge den nøyaktige epitopen for JA-16, ble overlappende 13-mer peptider (SEKV. ID nr. 17-64, se fig. 6A), som tilsvarer deler av GDF-8-sekvensen syntetisert direkte på cellulosepapir ved å bruke punktsynteseteknikken (Molina et al. (1996) Peptide Research, 9: 151-155; Frank et al. (1992) Tetrahedron, 48: 9217-9232). I denne matrisen ble cysteinresidua erstattet med serin for å redusere de kjemiske komplikasjoner, som forårsakes av nærværet av cysteiner. Cellulosemembraner som var modifisert med polyetylenglykol og Fmoc-beskyttede aminosyrer ble kjøpt fra Abimed (Lagenfeld, Tyskland). Matrisen ble definert på membranen ved kobling med en såkalt P-alaninspacer, og peptidene ble syntetisret ved å bruke standard DIC (diisopropylkarbodiimid)/HOBt (hydroksybenzotriazol) koblingskjemiske metoder slik disse er beskrevet tidligere (Molina et al. (1996) Peptide Research, 9: 151-155; Frank et al. (1992) Tetrahedron, 48: 9217-9232). ;Aktiverte aminosyrer ble påvist ved å bruke en Abimed ASP 222 robot. Vasking og avbeskyttelsestrinnene ble utført manuelt, hvoretter peptidene ble N-terminalt ;acetylert etter den avsluttende syntesesyklusen. Etter peptidsyntesen ble membranen vasket i metanol i 10 min. og i en blokkeringsløsning (TBST (Tris-bufret saltløsning med 0,1 % (v/v) Tween 20) + 1 % (vekt/volum) kasein) i 10 min. Membranen ble så inkubert med 2,5 ug/ml JA-16 i en blokkerende løsning i 1 time med forsiktig ;risting. Etter vasking med den blokkerende løsningen tre ganger i 10 min. ble membranen inkubert med HRP-merket sekundært antistoff (0,25 (xg/ml blokkerende løsning) i 30 min. Membranen ble så vasket tre ganger hver gang 10 min. med den blokkerende løsningen og så to ganger hver gang 10 min. med TBST. Bundet ;antistoff ble visualisert ved å bruke SuperSignal West reagens (Pierce) og et digitalt kamera (Alphalnnotech Fluorlmager). Resultatene er vist på fig. 6B. JA-16 er bundet til de første fire peptidene i matrisen (SEKV. ID nr. 17-20), som tilsvarer de 18 residuene på N-terminusdelen av GDF-8. ;For ytterligere å karakterisere JA-16-epitopen, ble det utført delesjons- og substitusjonsanalyser av peptidet Gly-Leu-Asp-Ser-Asp-Glu-His-Ser-Thr-Glu-Ser-Arg-Ser (SEKV. ID nr. 18) ved å bruke punktsyntese. I substitusjonsanalysen ble hvert residu i dette peptidet individuelt erstattet med hver av de 20 naturlige aminosyrene bortsett fra cystein, noe som utviklet SEKV. ID nr. 3, 18, 66-104, 106-113 og 115-128. Syntesen og bindingsprøvene ble utført som beskrevet ovenfor. Resultatene er vist på fig. 7. Substitusjoner i de 4 N-terminale aminosyrene og de 4 C-terminale aminosyrene ble godt tolerert, noe som antyder at disse aminosyrene er ikke nødvendig for JA-16-binding til det modne GDF-8. Det var imidlertid ingen toleranse for forandringer i det midlere segmentet av dette peptidet, dvs. Asp-Glu-His-Ser-Thr (SEKV. ID nr. 3), bortsett fra et par substitusjoner av serinresidiet, noe som antyder at denne peptidsekvensen er nødvendig for JA-16-binding. I tillegg var sekvensen Asp-Glu-His-Ser-Thr (SEKV. ID nr. 3) det minste peptidet hvor det kunne påvises en binding i delesjonsanalysen. Dette resultatet antyder således at JA-16 gjenkjenner epitopen Asp-Glu-His-Ser-Thr (SEKV. ID nr. 3) i GDF-8, og hvor Asp-, Glu-, His- og Thr-residuene (Asp-Glu-His-Xaa-Thr (SEKV. ID nr. 2)) er viktige for binding. ;Eksempel 6: Karakterisering av JA- 16 in vitro ;Det ble utført to prøver for å bestemme JA-16's evne til å nøytralisere GDF-8 in vitro. Først ble JA-16 testet for sin evne til å hemme moden GDF-8-proteinbinding til ActRIIB-reseptoren. Rekombinante ActRIIB.Fc-kimera (R&D Systems, Minneapolis, MN, katalog nr. 339-RB/CF) ble pålagt 96-brønners flatbunnede prøveplater (Costar, katalog nr. 3590) i en mengde på 1 ug/ml i 0,2 M natriumkarbonatbuffer over natten ved 4°C. Platene ble så blokkert med 1 mg/ml storfeserumalbumin og vasket ved å bruke standard ELISA-teknikk- ;100 \ il biotinylert modent GDF-8-protein i forskjellige konsentrasjoner ble tilsatt de blokkerte ELISA-platene, hvoretter disse ble inkubert i 1 time og vasket. Mengden av bundet modent GDF-8-protein ble påvist ved hjelp av streptavidin-pepperrotperoksidase (SA-HRP, BD PharMingen, San Diego, CA, katalog nr. 13047E) hvoretter det ble tilsatt TMB (KPL, katalog nr. 50-76-04). Kolorimetriske målinger ble utført ved 450 nm i en Molecular Devices mikroplateleser. Resultatene er vist på fig. 8. Det modne GDF-8 hadde en ED50på 12 ng/ml. ;Den samme protokollen ble brukt etter en preinkubering av JA-16-antistoffet med biotinylert modent GDF-8-protein i en mengde på 5 ng/ml i 30 min. Et irrelevant monoklonalt antistoff ble inkludert som en negativ kontroll. Fig. 9 viser at JA-16 har en meget svak in vitro nøytraliserende aktivitet på omkring 1 \ iM. Disse in vitro data antyder at JA-16 sannsynligvis ikke er en meget god nøytraliserende inhibitor av aktivt GDF-8, spesielt under mindre kontrollerte in vivo betingelser. ;I et nytt sett av prøver ble det utført en reportergenprøve for å bedømme den biologiske aktiviteten av aktivt GDF-8-protein in vitro. Prøven bruker en reportervektor, pGL3(CAGA)i2, koblet til lusiferase. Det er tidligere angitt at CaGA-sekvensen er en TGF-P-responsiv sekvens inne i promoteren for det TGF-P induserte genet, PAI-1. ;Reportervektoren med 12 CAGA-bokser ble fremstilt ved å bruke det grunnleggende reporterplasmidet pGL3 (Promega Corporation, Madison, WI, katalog nr. E1751). TATA-boksen og transkripsjonsstartsetet fra den adenovirus større senere promoteren (-35/+10) ble innsattmellom BgHI og Hindlll setene. Oligonukleotidene inneholdende 12 repetisjoner av CAGA-boksene AGCCAGACA, ble denaturert og klonet inn i Xhol- setet Den humane rhabdomyosarkomcellelinjen A204 (ATCC HTB-82) ble forbigående transfektert med pGL3(CAGA)i2ved å bruke FuGENE 6 transfeksjonsreagens (Roche Diagnostics, Indianapolis, MN, katalog nr. 1814443). Etter transfeksjon ble cellene dyrket på 48-brønns plater i McCoys 5A medium (Life Technology, Rockville, MD, katalog nr. 21500-079) supplert med 2 mM glutamin, 100 enheter/ml streptomycin, 100 ng/ml penicillin og 10 % kalvefosterserum i 16 timer. Cellene ble så behandlet med modent GDF-8, BMP-11 eller aktivin i McCoys 5A medium som inneholdt glutamin, streptomycin, penicillin og 1 mg/ml av storfeserumalbumin i 6 timer ved 37°C. Luciferase ble kvantifisert i de behandlede cellene ved å bruke Luciferase prøvesystemet (Promega Corporation Madison, WI, katalog nr. El483). GDF-8 aktiverte maksimalt reporterkonstruktet 10 ganger, med en ED50på 10 ng/ml GDF-8. BMP-11 som er 90 % identisk med GDF-8 på aminosyrenivå (Garner et al. (1999) Dev. Biol., 208(1): 222-32; Nakashima et al. (1999) Mech. Dev., 80(2): 185-9), og aktivin, ga en tilsvarende biologisk reaksjon. ;JA-16's nøytraliserende aktivitet ble bestemt ved å preinkubere JA-16 med modent GDF-8-protein i 30 min. før tilsetning til A204-cellene. Et irrelevant antistoff (monoklonal kontroll) så vel som et humant GDF-8-antistoff avledet fra et scFv phagemid-bibliotek ved å bruke fagpresenterende teknologi (Myo-19) ble også testet. ;Fig. 10 viser at også i denne prøven var JA-16 bare svakt nøytraliserende med en IC50omkring 1 \ iM, mens Myo-19 har en ICso-verdi omkring 100 nM. Basert på disse in vitro data skulle en forvente at Myo-19-antistoffet er et bedre nøytraliserende antistoff for aktivt GDF-8-protein enn JA-16 in vivo, noe som ikke er tilfelle som vist her. ;Eksempel 7: Immunoutfelling av GDF- 8 med JA- 16 ;For å bedømme bindingen av JA-16 til moden GDF-8 og GDF-8-komplekser ble det utført en serie immunoutfellingsundersøkelser. ;Først for å bestemme hvorvidt JA-16 kan immunoutfelle det GDF-8 latente komplekset, ble CHO-celler som uttrykker GDF-8 radiomerket med<35>S-metionin og<35>S-cystein. 100 (xl kondisjonert medium fra disse cellene inneholdende GDF-8 latent kompleks ble inkubert med 1 mg/ml JA-16 i 1 time ved 4°C. Protein A Sefarose ble tilsatt blandingen som så ble inkubert over natten ved 4°C. Immunoutfellingen ble oppsamlet, vasket tre ganger med PBS/Triton-X100-buffer, igjen suspendert i en reduserende prøvebuffer og analysert ved SDS-PAGE. Gelen ble fiksert over natten, forsterket med en autoradiografiforsterkende løsning, tørket hvoretter autoradiogrammet ble fremkalt. Fig. 18, kolonne 2, viser at JA-16 kan immunoutfelle det GDF-8 latente komplekset og ubearbeidet GDF-8. ;For det andre, for å bestemme hvorvidt JA-16 kan immunoutfelle et kompleks som er dannet mellom GDF-8 og follistatin, ble CHO-celler som uttrykker follistatin radiomerket med<35>S-metionin og<35>S-cystein. 100 (xl kondisjonert medium som inneholdt radiomerket follistatin ble blandet med modent GDF-8 slik at det dannet seg et kompleks av GDF-8 og follistatin. Blandingen ble inkubert med 1 mg/ml JA-16 i 1 time ved 4°C. Protein A Sefarose ble tilsatt blandingen som så ble inkubert over natten ved 4°C. Immunoutfellingen ble oppsamlet og analysert som beskrevet ovenfor. Fig. 18, kolonne 6, viser at JA-16 kan ko-immunopresipitat merket follistatin som er kompleksdannet med GDF-8. ;For det tredje, for å undersøke hvorvidt JA-16 kan immunoutfelle modent GDF-8-protein, ble tilpassede media fra CHO-celler inneholdende radiomerket GDF-8 latent kompleks syreaktivert for å dissosiere GDF-8 propeptidet og modent GDF-8 (se van Waarde et al. (1997) Analytical Biochemistry, 247, 45-51). Materialet ble så inkubert med JA-16 i 1 time ved 4°C. Den gjenværende delen av protokollen ble gjennomført som beskrevet ovenfor. Fig. 18, kolonne 3, viser at JA-16 kan immunoutfelle modent GDF-8. ;Disse resultatene indikerer at JA-16 kan gjenkjenne det GDF-8 latente komplekset, GDF-8:follistatinkomplekset og modent GDF-8. I motsetning til dette kan Myo-19 ikke binde noen GDF-8-komplekser (fig. 18, kolonnene 4 og 7), og kan bare immunoutfelle modent GDF-8 (fig. 18, kolonne 5). ;Eksempel 8: Karakterisering av JA- 16 in vivo ;For å bestemme hvorvidt antistoffet JA-16 øker muskelmassen hos voksne mus, ble det utført en in vivo undersøkelse med 7 uker gamle hunnlige BALB/c-mus. Musene ble veiet og fordelt med hensyn til kroppsvekt i grupper på 7 eller 8. JA-16 i PBS eller et isotypetilpasset antistoff til slangegift (kontroll) ble injisert i musene intraperetonealt i en dose på 50 mg/kg 2 ganger i uken. Behandlingen fortsatte i 4 uker. Dyrene ble undersøkt for en økning i den fettfrie kroppsmassen ved at de ble underkastet en deksaskananalyse før og etter behandlingsperioden. Muskelmassen ble bedømt ved utoperering og veiing av gastrocnemius og quadriceps. Peri-livmorfettputen ble også fjernet og veiet. Resultatene av denne undersøkelsen indikerer at JA-16 signifikant hemmer GDF-8-aktivitet in vivo, noe som resulterer i en øket muskelmasse (fig. 11). ;Det ble også utført en lengre undersøkelse hvor antistoffene ble administrert intraperitonealt i en dose på 60 mg/kg/uke i 14 uker. Disse musene ble ved begynnelsen av undersøkelsen tilført en dose på 60 mg/kg intraperitonealt og 10 mg/kg intravenøst. Musene i denne undersøkelsen var hannlige C57BL-mus som enten var av villtypen i agouti locus (a) eller hadde en dødelig gul mutasjon (Ay) i dette locus. Ay-mutasjonen gjør at de voksne musene utvikler overvekt og diabetes, noe som gjorde det mulig å bestemme effekten av JA-16 på musklene, overskudd av fett og blodglukose i en diabetesmodell. Den totale kroppsmassen ble veiet én gang i uken (fig. 12). Muskelmassen ble bedømt ved utoperering og veiing av gastrocnemius og quadriceps (fig. 13). De epididymale og inguniale fettputene ble også fjernet og veiet (fig. 14). Tolv uker inn i undersøkelsen ble musene fastet og blodglukosenivåene ble målt (fig. 15). Som for fire ukers undersøkelsen indikerte resultatene i denne sistnevnte undersøkelsen at JA-16 hemmer GDF-8-aktivitet in vivo, noe som gir en økning i muskelmassen. I tillegg indikerer denne undersøkelsen at i overvektige og diabetiske mus vil en inhibering av GDF-8 gi et bedret nivå med hensyn til blodglukose. ;In vivo aktiviteten av JA-16 ble også sammenlignet med in vivo aktiviteten for et annet GDF-8-antistoff, Myo-19. C57B6/scidmus ble injisert intraperitonealt i 5 uker enten med en kontroll bestående av bærervæsken eller med en dose på 60 mg/kg pluss 60 mg/kg/uke av JA-16 eller Myo-19. Den totale kroppsmassen ble målt én gang i uken og muskelmassen ble bedømt ved utoperering og veiing av gastrocnemius og quadriceps (fig. 17). Skjønt fem ukers behandling med JA-16 førte til en økning i muskelmassen, var dette ikke tilfelle med en behandling med Myo-19. I et annet eksperiment ble Myo-19-behandlingen forlenget til 10 og 15 uker, uten at det kunne observeres noen økning i kroppsmassen eller muskelmassen på disse tidspunktene. ;Til tross for det faktum at nevnte in vitro data antyder at JA-16 var et svakere nøytraliserende antistoff enn Myo-19, viser disse museundersøkelsene ikke desto mindre relativt uventet at JA-16 effektivt reduserer GDF-8-aktivitet in vivo, noe som ikke er tilfelle med Myo-19. Disse resultatene indikerer at det spesifikke setet på GDF-8 til hvilket JA-16 binder seg, er enestående, og at dette setet er ansvarlig for dannelsen av et stabilt hemmende GDF-8:antistoffkompleks in vivo. Det er således forventet at ethvert antistoffspesifikt bindingssete, slik dette er definert i eksempel 4, vil ha in vivo nøytraliserende egenskaper som er lik eller bedre enn de som blir påvist i JA-16. ;Eksempel 9: JA- 16 øker muskelstyrken ;Hos mennesker vil muskelstørrelsen og styrken avta med ca. 1 % pr. år og dette starter i 30 års alderen. For mange eldre personer vil tapet av muskelmasse føre til en signifikant svekkelse eller kraftløshet. Denne tilstanden er kjent som sarkopeni eller aldersrelatert muskeltap. For å bestemme hvorvidt anti-GDF-8-behandling er effektiv for sarkopeni, ble eldre mus (en alder på 19 måneder ved begynnelsen av undersøkelsen og 21 måneder ved slutten av undersøkelsen) behandlet med JA-16 i åtte uker i en dose på 60 mg/kg én gang i uken. I det samme eksperimentet ble unge mus (2 måneder gamle ved begynnelsen av undersøkelsen og 4 måneder gamle ved slutten av undersøkelsen) behandlet med den samme dosen av JA-16. Ved slutten av undersøkelsen hadde begge gruppene av mus større muskelmasse enn de bærevæskebehandlede kontrollgruppene, noe som fremgikk fra sammenligning mellom quadricepsmassene (fig. 19A). ;For å bekrefte at en økning i muskelstørrelsen fører til en økning i muskelstyrken, ble det gjennomført en gripestyrketest med gamle og unge mus behandlet med JA-16 i 8 uker ved å bruke en måler som var kjøpt fra Columbia Instruments (Columbus, Ohio; modell 1027csx). Musene fikk lov til å gripe og trekke et gradnett, og den høyeste trekkraften ble målt. Utrente mus ble testet fem ganger på rad uten hvile. Toppkraften for hver test ble målt, hvoretter en regnet ut middelverdien for de fem testene for hver enkelt mus. Etter syv ukers behandling var toppkraften for unge JA-16-behandlede mus 10 ganger større, og for de gamle JA-16-behandlede musene var kraften 13 % høyere enn toppkraften for bærevæskebehandlede mus (fig. 19B). I tillegg viste longitudinelle målinger som ble tatt før eller etter syv ukers behandling at styrken hos de eldre musene var øket med 17 % (p<0,01) med JA-16-behandling, mens styrken for bærervæskebehandlede gamle mus ikke var signifikant forandret (3,3 %, p = 0,66). Disse resultatene bekrefter at GDF-8-inhibering fører til en økning av muskelstørrelsen og styrken både hos yngre og eldre mus, og at dette kan brukes som terapi for sarkopeni. ;Eksempel 10: JA- 16 øker muskelmassen og styrken i dystrof muskel ;GDF-8's evne til en in vivo inhibering for derved å lindre muskulær dystrofi ble testet i/wfi&r-musemodellen på Duchennes muskulære dystrofi (DMD). DMD-modellen er blant annet beskrevet av Torres et al. ( Brain (1987) 110, 269-299) og Hoffman et al. ( Science (1987) 238, 347-350). ;Fire uker gamle hann mdx- mus ble behandlet én gang i uken ved intraperetoneale injeksjoner av JA-16 (60 mg/kg) eller bærevæske alene (kontrollgruppe) i 3 måneder. For å kvantifisere økningen av muskelmassen ble dyrene avlivet og extensor digitorum longus (EDL) musklene ble utoperert og veiet. Som vist på fig. 20A så hadde EDL-musklene fra den behandlede gruppen av dyr øket signifikant mer enn kontrollene. Det skal bemerkes at den relative økningen av muskelmassen var større enn økningen i kroppsvekten, noe som er vist på fig. 20B. I overenstemmelse med disse data hadde andre muskelgrupper inklusive gastrocnemius, tibialis anterior og quadriceps lignende vektøkninger. ;For å kvantifisere den absolutte kraftproduksjonen eller muskelstyrken målte man den maksimale isometriske kraften som blir produsert ved depolarisering av musklene ved å bruke feltelektroder. Fig. 20C og 20D viser at JA-16-behandlede mdx- mus var i stand til å utøve signifikant høyere maksimal styrke eller kraft under enten vridning eller tetanus. Denne økningen i muskelstyrken var proporsjonal med økningen av muskelmassen (fig. 20A, 20C og 20D). Disse resultatene er et fysiologisk bevis på den forutberegnede terapeutiske effekten av GDF-8-inhibitorer, f.eks. JA-16 ved behandling av muskulær dystrofi og nærstående sykdommer. ;For uavhengig å kunne verifisere lindringen av den dystrofe fenotype, som ble observert i mellomgulvet hos mdx- mus, så vel som å fastslå en forbedring med hensyn til den patologiske status for/wfi&r-skjelettmuskulatur in toto, analyserte en serumkreatinkinase (CK) nivåene i disse musene. Ekstremt høye nivåer av CK er alltid tilstede hos mdx- mus og mennesker med dystrofin-svikt, noe som skyldes sarkolemal skade (Bulfield et al. (1984) Proe. Nati. Acad. Sei. USA 81, 1189-1192 og Matsuda et al. (1995) J. Biochem. ( Tokyo) 118, 959-64). Ved begynnelsen av forsøket hadde de behandlede og kontrollgruppene av mdx- mus markant forhøyet serum CK sammenlignet med normal mus. Etter tre måneders in vivo myostatinblokkering var det imidlertid en dramatisk senkning av serum CK-nivået hos de behandlede mdx- mus (fig. 4c). En nedsatt muskeldegenerering og fibrose koblet med en reduksjon av CK er et histologisk og biokjemisk bevis på en funksjonell bedring av/wfi&r-muskler, noe som er fremkommet ved en myostatinblokkade in vivo. ;Eksempel 11: GDF- 8' s in vivo rolle i trabikulært ben ;Øket mekanisk belastning, enten dette skyldes øket muskelaktivitet eller øket kroppsvekt, er assosiert med øket benmasse og bentetthet. Derfor ble GDF-8 knockout (KO) mus undersøkt for endret benmasse og mikroarkitektur. En første undersøkelse av voksne mus viste at bentettheten i ryggraden hos nevnte KO-mus var nesten to ganger høyere enn for deres søsken av villtypen. Denne økningen var langt høyere enn det som skulle være forventet til utelukkende å skyldes den forøkede muskelmassen i GDF-8 KO-mus. ;Høyoppløselig mikrotomografisk bildedannelse (nCT40, Scanco Medical, Sveits) ble brukt for å bedømme den trabekulære benvolumfraksjonen og mikroarkitekturen i den femte lumbare ryggvirvelen og distal femora og den kortikale bengeometrien i den femorale midtere-diafysen hos voksne GDF-8 villtypen (WT) og KO-mus. Prøver ble tatt ut fra 9-10 måneder gamle GDF-8 hann- og hunnmus av begge typer og kontroller fra samme kull (fire mus av hver genotype og hvert kjønn). Hele ryggvirvelen og lårbenet ble skannet ved hjelp av mikroberegnet tomografi med en oppløsning på 12 \ im. Områder av interesse omfatter det trabekulære benet i ryggvirvelen eller det trabekulære benet i den distale femorale metafysen (sekundær spongiose), som ble identifisert ved å bruke en semi-automatisert konturdannende algoritme. De følgende parametere ble beregnet direkte ved hjelp av tredimensjonal bedømmelse, benvolumfraksjon (%), trabekulær tykkelse (\ im), separasjon (nm) og antall (l/mm). Til slutt ble bindingstettheten undersøkt, fordi denne er en indikator på hvor godt det trabekulære nettverket er festet, så vel som de kortikale benparameterne ved det middiafysiale området i lårbenet, heri inngår det totale areal, benareal og barktykkelsen. ;Både hannlige og hunnlige KO-mus hadde dramatisk forøket trabekulær bentetthet i ryggvirvelen sammenlignet med VT-mus fra samme kull (n = 4, +93 % og +70 % henholdsvis, p<0,0001). Denne forhøyede trabekulære bentettheten var fulgt av en 14 % økning i den trabekulære tykkelsen (p=0,03), en 38 % økning av det trabekulære antallet (p=0,0002), og en 10 % nedsatt trabekulær separasjon (p=0,009). Den samlede effekt av disse forandringer med hensyn til arkitektur og tetthet resulterte i en 3,4- og 1,7-gangers økning av konnektiviteten hos både hannlige og hunnlige KO-mus henholdsvis, sammenlignet med deres villtypesøsken fra samme kull (p<0,0001). I tillegg til dette indikerte et grovt mål på nivået av mineralisering i det trabekulære benet at det midlere mineralinnholdet i trabekula var 8 % høyere i KO-mus i forhold til kontrollene (p<0,0001). Dette antyder at effekten er større hos hanner enn hunner, men antall dyr var for lite til å trekke definitive konklusjoner. Trabekulære benkarakteristika for ryggvirvler er bedømt ved høyoppløselig mikroberegnet tomografi er vist i tabell 1. ;I motsetning til observasjonene i ryggraden hadde både hannlige og hunnlige KO-mus lavere trabekulær bentetthet i det distale lårbenet enn VT-mus fra samme kull (n = 4, p = 0,05 for hele genotypeeffekten) (tabell 2). Denne nedsatte bentettheten var mer fremtredende hos hunnlige KO enn hos hannlige KO-mus. GDF-8 KO-mus hadde samme trabekulære tykkelse som deres VT-mus fra samme kull, men hadde færre trabekkula og øket trabekulær separasjon sammenlignet med musene fra samme kull av villtypen. Skjønt den kortikale tykkelsen i midtstykket av lårbenet var lik hos hannlige GDF-8 KO og deres søskenkontroller, så var den imidlertid ca. ;10 % høyere i GDF-8 KO-hunnmus enn hos deres søsken hos villtypen (n = 4, p = 0,04) (se tabell 3). Det var ingen forskjell med hensyn det kortikale benarealet eller benarealfraksjonen mellom de to genotypene. ; Eksempel 12: Behandling av muskel- og bendegenererende sykdommer Inhibitorer av GDF-8, så som f.eks. hemmende antistoffer, kan brukes for behandlinger som har som mål å øke muskelmassen, dessuten for å hindre eller å behandle osteoporose. I tillegg vil en inhibering av GDF-8 også kunne brukes i andre tilfeller hvor det er ønskelig med en benanabol effekt, f.eks. å bedre generell benheling (f.eks. reparasjon etter brudd, ryggradsfusjon, etc). De anti-GDF-8-antistoffene ifølge foreliggende oppfinnelse kan brukes for å behandle en pasient når sykdommen har startet eller når pasienten har en etablert muskel- eller bendegenererende sykdom. ;Effekten av nevnte anti-GDF-8-antistoffene for behandling av benlidelser, f.eks. osteoporose, ble bekreftet ved å bruke velkjente modeller på osteoporose. F.eks. er mus hvor eggstokkene er blitt fjernet, blitt brukt for å teste effekten av nye osteoporosemedikamentbehandlinger (Alexander et al. (2001) J. Bone Min. Res. 16: 1665-1673; og Anderson et al. (2001) J. Endocrinol. 170:529-537). På samme måte som i mennesker opplever disse gnagerne et raskt bentap etter fjerning av eggstokkene, da spesielt i ben med kanaler. Undersøkelsen er basert på benmineraltetthet, biokjemiske markører på omsetningen av ben i serum og urin, benstyrke og histologi/histomorfometri. ;I én undersøkelse ble eggstokkene fjernet i normale hunnmus og i hunnmus med immunsvikt da disse var fra 12-16 uker gamle, hvoretter en lot svekkelse eller tap av ben utvikle seg fra 4-6 uker. Etter denne bentapsperioden ble det utført en behandling med anti-GDF-8-antistoff, f.eks. JA-16 (IP-injeksjon) eller bærevæske i fra 1-6 måneder. Selve behandlingsprotokollen varierte med testing av forskjellige doser og behandlingsregimer (f.eks. daglig, ukentlig eller injeksjoner to ganger i uken). Det ble antatt at ubehandlet mus hvor eggstokkene var fjernet (eller rotter) ville miste ca. 10-30 % av bentettheten i forhold til uopererte mus av samme alder. Det er videre antatt at mus behandlet med anti-GDF-8-antistoffet ville ha fra 10-50 % større benmasse og bentetthet enn de mus som bare fikk kontrollvæsken, og videre at denne økningen i bentettheten ville være assosiert med forsterket benstyrke, spesielt i områder hvor det er en større andel av kanalførende ben sammenlignet med kortikale ben. ;Målet med en annen undersøkelse var å vise at anti-GDF-8-antistoff, så som JA-16, er effektivt for å hindre en svekkelse av benmassen, mikroarkitekturen og den styrke som er assosiert med østrogensvikt. Undersøkelsen har således den samme utforming som beskrevet ovenfor, bortsett fra at behandlingen med anti-GDF-8-antistoffet startet umiddelbart etter utopereringen av eggstokkene, snarere enn etter bentapsperioden. Det er antatt at mus behandlet med antistoffet ville miste signifikant mindre benmasse etter eggstokkoperasjonen, enn mus som bare var behandlet med kontrollvæsken. ;De hemmende antistoffene mot GDF-8 ble også brukt for å hindre og/eller å redusere graden og/eller symptomene på sykdommen. Det er antatt at anti-GDF-8-antistoffer kan administreres som en subkutan injeksjon så ofte som én gang pr. dag eller med så lav frekvens som én gang pr. måned. Behandlingsperioden vil variere fra 1 måned til flere år. ;For å teste den kliniske effekten av anti-GDF-8 i mennesker ble postmenopausale kvinner med lav benmasse identifisert ved testing av bentettheten og deretter vilkårlig fordelt i behandlingsgrupper. Behandlingsgruppene innbefattet en placebogruppe og 1-3 grupper som fikk antistoff (forskjellige doser). De enkelte individene ble fulgt i en periode fra 1-3 år for å kunne bedømme forandringer i de biokjemiske markørene for benomsetning, eventuelle forandringer i benmineraltettheten og forekomsten av sprøhetsbrudd. Det er antatt at individer som mottar behandling ville oppvise en økning av benmineraltettheten i den proksimale femur og den lumbare ryggsøylen med fra 2-30 % i forhold til basislinjen, og vil dessuten ha en nedsatt forekomst av sprøhetsbrudd. Det er antatt at mengden av biokjemiske markører på bendannelse vil øke. ;Antistoffene ble administrert som den eneste aktive forbindelsen eller i kombinasjon med en annen forbindelse eller sammensetning. Ved administrasjon som den eneste aktive forbindelsen eller i kombinasjon med en annen forbindelse eller sammensetning, var dosen mellom ca. 1 ug/kg og 20 mg/kg avhengig av graden av symptomene og utviklingen av sykdommen. En passende effektiv dose kan velges av den behandlende legen i de følgende variasjonsområder: 1 ug/kg og 20 mg/kg, 1 ng/kg og 10 mg/kg, 1 ug/kg og 1 mg/kg, 10 ug/kg og 1 mg/kg, 10Hg/kg og 100 ug/kg, 100 ug og 1 mg/kg og 500 |xg/kg og 1 mg/kg. Eksempler på behandlingsregimer og resultatene av disse er angitt i tabell 4. ; Eksempel 13: Behandling av metabolsk lidelser ;Inhibitorer av GDF-8, så som f.eks. hemmende antistoffer, kan brukes for behandlingen av metabole lidelser så som type 2 diabetes, svekket glukosetoleranse, metabolsk syndrom (f.eks. syndrom X), insulinresistens indusert ved traume (f.eks. brannsår) og fettvevslidelser (f.eks. overvekt). De anti-GDF-8-antistoffene ifølge oppfinnelsen kan brukes for å behandle en pasient når sykdommen bryter ut eller hos pasienter med etablerte metabole sykdommer. ;Effekten av anti-GDF-8-antistoffer for behandling av metabole lidelser, f.eks. type 2 diabetes og/eller overvekt, blir bekreftet ved å bruke velkjente musemodeller på overvekt, insulinresistens og type 2 diabetes, heri inngår ob/ob, db/db og stammer som bærer den letale gule mutasjonen. Insulinresistens kan også induseres ved å anvende for med et meget høyt fettinnhold eller høyt innhold av kalorier til visse stammer av mus, så som C57BL/6J. På samme måte som hos mennesker utvikler disse gnagerne insulinresistens, hyperinsulemi, dyslipidemi og svekkelse av glykosehomeostase, noe som resulterer i hyperglykemi. Prøvene er basert på serummålinger av glukose, insulin og lipider. Bedret insulinfølsomhet kan bestemmes ved insulintoleransetester og glukosetoleransetester. Mer følsom teknikk vil kunne inkludere bruken av auglykemiske-hyperinsulinemiske klemmer for å bedømme bedringer av den glykemiske kontrollen og insulinfølsomheten. I tillegg vil denne klemmeteknikken gjøre det mulig med en kvantitativ bedømmelse av rollen til de viktigste glukoseforbrukende vev (f.eks. muskler, fett og lever) i en bedret glykemisk kontroll. ;I én undersøkelse ble behandling med et anti-GDF-8-antistoff, så som JA-16 (IP-injeksjon) eller kontrollvæske utført i en periode fra 1 uke til 6 måneder. Behandlingsprotokollen var variabel med testing med forskjellige doser og forskjellige behandlingsregimer (f.eks. daglig, ukentlig eller injeksjoner to ganger i uken). Det er antatt at mus behandlet med anti-GDF-8-antistoffet vil ha et større glukoseopptak, bedret glykolyse og glykogensyntese, lavere frie fettsyrer og triglyserider i serum sammenlignet med mus som fikk placebobehandling. ;De hemmende antistoffer mot GDF-8 ble også brukt for å hindre og/eller å redusere graden og/eller symptomene på sykdommen. Det er antatt at nevnte anti-GDF-8-antistoffer kan administreres som en subkutan injeksjon så ofte som én gang pr. dag eller med så lav frekvens som én gang pr. måned. Behandlingsperioden vil kunne variere fra 1 måned til flere år. ;For å teste den kliniske effekten av anti-GDF-8 i mennesker ble pasienter som led av eller hadde en risiko for type 2 diabetes identifisert og vilkårlig fordelt i behandlingsgrupper. Behandlingsgruppene innbefattet en placebogruppe og fra 1 -3 grupper som fikk antistoff (forskjellige doser). De enkelte pasientene ble så fulgt opp i en periode fra 1 måned til 3 år for å bedømme forandringer i glukosemetabolismen. Det er antatt at individer som mottok behandling ville oppvise en forbedring. ;Antistoffene ble administrert som den eneste aktive forbindelsen eller i kombinasjon med en annen forbindelse eller sammensetning. Ved administrasjon som den eneste aktive forbindelsen eller i kombinasjon med en annen forbindelse eller sammensetning, var dosen mellom ca. 1 ug/kg og 20 mg/kg avhengig av graden av symptomene og utviklingen av sykdommen. En passende effektiv dose kan velges av den behandlende legen i de følgende variasjonsområder: 1 |xg/kg og 20 mg/kg, 1 ug/kg og 10 mg/kg, 1 |xg/kg og 1 mg/kg, 10 |xg/kg og 1 mg/kg, 10Hg/kg og 100 ug/kg, 100 ug og 1 mg/kg og 500 ug/kg og 1 mg/kg. Eksempler på behandlingsregimer og resultatene av disse er angitt i tabell 5. *

Claims

1. Isolert monoklonalt antistoff som spesifikt binder til aminosyrene 1 til 50 i SEKV. ID nr. 15,karakterisert vedat antistoffet reduserer GDF-8-aktivitet som er assosiert med negativ regulering av muskelmasse.

2. Antistoff ifølge krav 1, hvor antistoffet binder seg spesifikt til området fra aminosyre 1 til aminosyre 25 i SEKV. ID nr. 15.

3. Antistoff ifølge krav 1, hvor antistoffet binder seg spesifikt til SEKV. ID nr. 8.

4. Antistoff ifølge krav 1, hvor antistoffet binder seg spesifikt til SEKV. ID nr. 3.

5. Isolert monoklonalt antistoff som spesifikt binder til SEKV. ID nr. 18, k a r a kterisert ved at antistoffet reduserer GDF-8-aktivitet som er assosiert med negativ regulering av skjelettmuskelmasse.

6. Isolert monoklonalt antistoff som spesifikt binder til SEKV. ID nr. 5, k a r a kterisert ved at antistoffet reduserer GDF-8-aktivitet som er assosiert med negativ regulering av skjelettmuskelmasse.

7. Antistoff ifølge krav 6, hvor antistoffet binder seg spesifikt til SEKV. ID nr. 2.

8. Antistoff ifølge hvilket som helst av krav 1-7, hvor antistoffet binder seg spesifikt til et kompleks valgt fra gruppen bestående av et GDF-8-latent kompleks, GDF-8 kompleksert med follistatin og GDF-8 kompleksert med et follistatin-relatert protein.

9. Antistoff ifølge hvilket som helst av krav 1-7, hvor antistoffet binder seg spesifikt til et GDF-8-latent kompleks.

10. Antistoff ifølge hvilket som helst av krav 1-9, hvor antistoffet er et fragment valgt fra et enkeltkjedet Fab-, F(ab')2- og Fv-antistoff.

11. Antistoff ifølge hvilket som helst av krav 1-10, hvor antistoffet er kimerisk.

12. Antistoff ifølge hvilket som helst av krav 1-11, hvor antistoffet er humanisert.

13. Antistoff ifølge krav 1, nevnte antistoff omfatter et tungkjedevariabelt område som omfatter en aminosyresekvens som er minst 85 % identisk med SEKV. ID nr. 1, hvor antistoffet binder seg spesifikt til modent GDF-8.

14. Antistoff ifølge krav 13 omfattende minst én enkeltkjede CDR valgt fra aminosyrene 30-35 i SEKV. ID nr. 1, aminosyrene 50-66 i SEKV. ID nr. 1 og aminosyrene 99-102 i SEKV. ID nr. 1.

15. Antistoff ifølge krav 13 eller 14, hvor aminosyresekvensen er minst 90 % identisk med SEKV. ID nr. 1.

16. Antistoff ifølge krav 15, hvor aminosyresekvensen er SEKV. ID nr. 1.

17. Antistoff ifølge krav 1, omfattende minst én enkeltkjede CDR valgt fra aminosyrene 30-35 i SEKV. ID nr. 1, aminosyrene 50-66 i SEKV. ID nr. 1 og aminosyrene 99-102 i SEKV. ID nr. 1, hvor antistoffet binder seg spesifikt til modent GDF-8.

18. Antistoff ifølge hvilket som helst av krav 13-17, hvor antistoffet er et enkeltkjede antistoff-fragment.

19. Antistoff ifølge hvilket som helst av krav 13-17, hvor antistoffet er et antistoff-fragment valgt fra Fab, F(ab')2og Fv.

20. Antistoff ifølge hvilket som helst av krav 13-19, hvor antistoffet er et kimerisk antistoff.

21. Antistoff ifølge hvilket som helst av krav 13-20, hvor antistoffet er humanisert.

22. Isolert antistoff slik som fremstilt av en celle med ATCC innleveringsbetegnelse nr. PTA-4236.

23. Isolert antistoff som har den samme aminosyresekvensen som et antistoff fremstilt av en celle med ATCC innleveringsbetegnelse nr. PTA-4236.

24. Cellekarakterisert vedå produsere det monoklonale antistoffet ifølge hvilket som helst av krav 1-23.

25. Cellekarakterisert vedå ha ATCC innleveringsbetegnelse nr. PTA-4236.

26. Nukleinsyrekarakterisert vedat den koder for antistoffet ifølge hvilket som helst av krav 1-23.

27. Diagnostisk sett,karakterisert vedå omfatte antistoffet ifølge hvilket som helst av krav 1-23.

28. Farmasøytisk sammensetning,karakterisert vedå omfatte antistoffet ifølge hvilket som helst av krav 1-23.

29. Anvendelse av antistoffet ifølge hvilket som helst av krav 1 -23 i fremstillingen av et medikament for behandling av en medisinsk forstyrrelse i et pattedyr.

30. Anvendelse ifølge krav 29, hvor den medisinske forstyrrelsen er en muskulær lidelse.

31. Anvendelse ifølge krav 30, hvor den medisinske forstyrrelsen er muskulær dystrofi, muskelatrofi, kongestiv obstruktiv lungesykdom, muskelsvinnsyndrom, sarkopeni eller kakeksi.

32. Anvendelse ifølge krav 30, hvor den medisinske forstyrrelsen er muskulær dystrofi.

33. Anvendelse av antistoffet ifølge hvilket som helst av krav 1-23 i fremstillingen av et medikament.

34. Antistoff ifølge hvilket som helst av krav 13-23, hvor antistoffet binder seg spesifikt til et modent GDF-8-protein med større affinitet enn til et modent BMP-11-protein.