MXPA04002834A

MXPA04002834A - Inhibidores de anticuerpos de gdf-8 y sus usos.

Info

Publication number: MXPA04002834A
Application number: MXPA04002834A
Authority: MX
Inventors: Bouxsein Mary
Original assignee: Wyeth Corp
Priority date: 2001-09-26
Filing date: 2004-03-25
Publication date: 2005-09-28
Also published as: BR0212809A; US9505831B2; NO336528B1; NZ532034A; ZA200402265B; WO2003027248A8; WO2003027248A3; US7320789B2; PT1438068E; ZA200606082B; JP4452077B2; CA2469230C; WO2003027248A2; AU2002347773B2; US20120107928A1; EP1438068A2; JP2009067798A; NO20041582L; EP2316851A1; US20030138422A1

Abstract

La presente invencion se refiere a novedosos anticuerpos contra el factor 8 de crecimiento y diferenciacion (GDF-8), incluyendo fragmentos de anticuerpos, los cuales inhiben la actividad del GDF-8 tanto in vitro como in vivo. Tambien se describen metodos para el diagnostico, la prevencion o el tratamiento de desordenes degenerativos del musculo, hueso o del metabolismo de la insulina.

Description

INHIBIDORES DE ANTICUERPOS DE GDF-8 Y SUS USOS Campo de la Invención La invención se refiere a inhibidores de proteínas del Factor 8 de Crecimiento y Diferenciación (GDF-8) y a métodos para el uso de tales inhibidores. Más particularmente, la invención provee nuevos anticuerpos y fragmentos de anticuerpos que son específicamente reactivos con proteínas del GDF-8 in vitro e in vivo. La invención es particularmente útil para el diagnóstico, prevención o tratamiento de desórdenes en seres humanos o animales, en los que sería terapéuticamente benéfico un aumento en el tejido muscular. Los ejemplos de los desórdenes incluyen a desórdenes neuromusculares (por ejemplo, distrofia muscular y atrofia muscular), enfermedad pulmonar obstructiva congestiva, síndrome de emaciación muscular, sarcopenia y caquexia, desórdenes de tejido adiposo (por ejemplo, obesidad); diabetes tipo 2 y enfermedad ósea degenerativa (por ejemplo, osteoporosis).

Antecedentes de la Invención La solicitud reivindica la prioridad de la solicitud de patente provisional de los Estados Unidos de América con número de serie 60/324,528, presentada el 26 de septiembre de 2001. El Factor 8 de Crecimiento y Diferenciación (GDF-8), también conocido como miostatina, es un miembro de la súper familia de factores de crecimiento estructuralmente relacionados con el Factor beta de Crecimiento de Transformación (TGF-ß), la totalidad de los cuales poseen importantes propiedades morfogenéticas y reguladoras del crecimiento (Kingsley et al. (1994) Genes Dev. 8:133-46; Hoodless et al. (1998) Curr. Topics Microbiol. Immunol. 228:235-72). El GDF-8 es un regulador negativo de la masa muscular esquelética, y existe un interés considerable en la identificación de factores que regulen su actividad biológica. Por ejemplo, el GDF-8 es altamente expresado en el músculo esquelético en desarrollo y de adulto. La nula mutación del GDF-8 en ratones transgénicos se caracteriza por una notable hipertrofia e hiperplasia del músculo esquelético (McPherron et al. (1997) Nat re 387:83-90). Incrementos similares en la masa del músculo esquelético son evidentes en mutaciones que ocurren de manera natural del GDF-8 en ganado (Ashmore et al. (1974) Growth 38:501-507; Swatland and Kieffer (1994) J. Anim. Sci. 38: 752-757; McPherron and Lee (1997) Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 94: 12457-12461; y Kambadur et al. (1997) Genome Res. 7: 910-915). Puesto que el GDF-8 es expresado tanto en músculos en desarrollo como en músculos de adulto, no es claro si regula la masa muscular durante el desarrollo o en adultos. De esta forma, la cuestión de si el GDF-8 regula o no la masa muscular en adultos es importante desde una perspectiva científica y terapéutica. Estudios recientes también han demostrado que la emaciación muscular asociada con infección por VIH en seres humanos es acompañada por aumentos en la expresión de proteína del GDF-8 (Gonzalez-Cadavid et al. (1998) PNAS 95: 14938-43). Además, el GDF-8 puede regular la producción de enzimas específicas de músculo (por ejemplo, cinasa de creatina) y modular la proliferación de células mioblastos (WO 00/43781). Un gran número de desórdenes en seres humanos y animales están asociados con la pérdida de o con tejido muscular funcionalmente dañado, incluyendo la distrofia muscular, atrofia muscular, enfermedad pulmonar obstructiva congestiva, síndrome de emaciación muscular, sarcopenia, y caquexia. Hasta la fecha, existen muy pocas terapias confiables y efectivas para estos desórdenes. Sin embargo, los terribles síntomas asociados con estos desórdenes podrían ser reducidos de manera importante mediante el empleo de terapias que aumenten la cantidad de tejido muscular en pacientes que padecen de estos desórdenes. Si bien no curan estas condiciones, tales terapias mejorarían de manera importante la calidad de vida de estos pacientes y podrían mejorar algunos de los efectos de estas enfermedades. De esta manera, existe en el estado de la técnica la necesidad de identificar nuevas terapias que puedan contribuir a un aumento global en el tejido muscular en pacientes que sufren de estos desórdenes. Además de sus propiedades reguladoras del crecimiento y morfogenéticas en el músculo esquelético, el GDF-8 también puede estar involucrado en un gran número de otros procesos fisiológicos, incluyendo la homeostasis de la glucosa en el desarrollo de la diabetes tipo 2 y desórdenes del tejido adiposo, tales como la obesidad. Por ejemplo, el GDF-8 modula la diferenciación del preadipocito en adipocitos (Kim et al. (2001) B.B.R.C. 281: 902-906). También existe un gran número de condiciones asociadas con la pérdida de hueso, incluyendo la osteoporosis, especialmente en personas de la tercera edad y mujeres post menopáusicas. Las terapias que actualmente se encuentran disponibles para estas condiciones trabajan inhibiendo la reabsorción del hueso. Sería una alternativa deseable para o en adición a estas terapias, una terapia que promoviera la formación de hueso nuevo. De manera similar que con el TGF-ß-?, -2 y -3, la proteína del GDF-8 es sintetizada como una proteína precursora que consiste en un propéptido con terminación amino y un dominio maduro con terminación carboxi (McPherron and Lee, 1997, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 94: 12457-12461). Antes de la segmentación, la proteína precursora de GDF-8 forma un homodímero. El propéptido con terminación amino es entonces escindido del dominio maduro. El propéptido segmentado puede permanecer unido de manera no covalente al dímero del dominio maduro, inhibiendo su actividad biológica (Miyazono et al. (1998) J. Biol. Chem. 263: 6407-6415; Wakefield et al. (1998) J. Biol. Chem. 263 : 7646-7654; y Brown et al. (1990) Growth Factors 3: 35-43). Se cree que dos propéptidos del GDF-8 se unen al dímero maduro del GDF-8 (Thies et al. (2001) Growth Factors 18: 251-259). Debido a esta propiedad de inactivación, se conoce al propéptido como el "péptido asociado con la latencia" (LAP), y el complejo del dominio maduro y el propéptido generalmente se refieren como el "pequeño complejo latente" (Gentry and Nash (1990) Biochemistry 29: 6851-6857; Derynck et al. (1995) Nature 316: 701-705; y Massague (1990) Am. Rev. Cell. Biol. 12: 597-641). También se conoce que otras proteínas se unen al GDF-8 o a proteínas estructuralmente relacionadas e inhiben su actividad biológica. Dichas proteínas inhibidoras incluyen a la folistatina (Gamer et al. (1999) Dev. Biol. 208: 222-232). Se cree que el dominio maduro está activo como un homodímero cuando el propéptido es eliminado.

El GDF-8 está altamente conservado en secuencia y en función a través de las especies. La secuencia de aminoácidos del GDF-8 de murino y humano es idéntica, como lo es el patrón de la expresión del ARNm (McPerron et al (1997) Nature 387: 83-90; Gonzalez-Cadavid et al. (1998) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 95: 14938-14943). Esta conservación de secuencia y función sugiere que la inhibición del GDF-8 en humanos es probable que tenga un efecto similar a la inhibición del GDF-8 en ratones. El GDF-8 está involucrado en la regulación de muchos procesos biológicos críticos. Debido a su función clave en estos procesos, el GDF-8 puede ser un objetivo deseable para la intervención terapéutica. En particular, pueden utilizarse agentes terapéuticos que inhiban la actividad del GDF-8 para tratar desórdenes en seres humano o animales en los que sería terapéuticamente benéfico un aumento en el tejido muscular, particularmente desórdenes del tejido muscular y adiposo, enfermedades degenerativas óseas, desórdenes neuromusculares y diabetes, como se describió anteriormente.

Compendio de la Invención La presente invención provee novedosos inhibidores de proteína que comprenden anticuerpos y fragmentos de anticuerpos que son específicamente reactivos con la proteína madura del GDF-8, sea que esté en una forma monomérica, forma dimérica activa, o en forma de complejo en el complejo latente del GDF-8. En una modalidad de la invención, los anticuerpos se unen a un epitope de la proteína madura del GDF-8, lo cual resulta en la reducción de una o más de las actividades biológicas asociadas con el GDF-8, relativas a la proteína madura del GDF-8 que no es ligada por el mismo anticuerpo. En una modalidad de la invención, los anticuerpos que se están describiendo reducen la actividad del GDF-8 asociada con la regulación negativa de la masa del músculo esquelético y/o densidad ósea.

Los anticuerpos que se están describiendo en la presente poseen propiedades biológicas únicas e inesperadas. Por ejemplo, alguien con conocimientos normales en la técnica típicamente esperaría que buenos anticuerpos de neutralización se unieran de manera vigorosa a la proteína activa del GDF-8 in vilro, formando un complejo inhibidor estable con la proteína. Un anticuerpo de neutralización también llamado un anticuerpo inhibidor, que tiene una alta afinidad por una proteína particular, se esperará típicamente que provea niveles más elevados de neutralización con relación a un anticuerpo de afinidad más baja para la misma proteína. Sin embargo, de manera inesperada, los presentes inventores han descubierto anticuerpos que solo se unen débilmente a y neutralizan la proteína activa del GDF-8 in viíro, y que todavía son efectivos in vivo. El descubrimiento de dichos anticuerpos condujo, a su vez, a la identificación de un sitio específico en el GDF-8 al cual se unen los anticuerpos. Por lo tanto se espera que cualquier anticuerpo que se una específicamente al sitio identificado poseyera de manera similar propiedades de neutralización in vivo. Adicionalmente, los anticuerpos que actualmente se están describiendo poseen propiedades únicas e inesperadas. Por ejemplo, los anticuerpos no solo reconocen a la proteína madura del GDF-8 en sus formas monomérica y dimérica, sino que también reconocen el complejo latente de GDF-8 intacto. Los anticuerpos que se están describiendo pueden ser administrados en una dosis terapéuticamente efectiva para tratar o prevenir condiciones médicas en las que sería terapéuticamente benéfico un aumento en la masa del tejido muscular o en la densidad ósea. Las enfermedades y los desórdenes que pueden ser tratados mediante estos anticuerpos de GDF-8 incluyen desórdenes musculares o neuromusculares tales como la distrofia muscular, atrofia muscular, enfermedad pulmonar obstructiva congestiva, síndrome de emaciación muscular, sarcopenia y caquexia; desórdenes del tejido adiposo tales como la obesidad; desórdenes metabólicos tales como la diabetes tipo 2, tolerancia dañada a la insulina, síndromes metabólicos (por ejemplo, síndrome X), resistencia a la insulina inducida por trauma (por ejemplo, quemaduras); y enfermedades degenerativas óseas tales como la osteoporosis, especialmente en gente de la tercera edad y/o mujeres posmenopáusicas. Enfermedades y desórdenes metabólicos adicionales que pueden ser tratados con estos anticuerpos de GDF-8 incluyen baja masa ósea debido a terapia de glucocorticoides crónica, falla gonadal prematura, supresión de andrógenos, deficiencia de vitamina D, hiperparatiroidismo secundario, deficiencias nutricionales y anorexia nervosa. Además, los anticuerpos que se describen en la presente pueden ser utilizados como una herramienta de diagnóstico para detectar de manera cuantitativa o cualitativa la proteína madura del GDF-8 o fragmentos de ésta sin importar si está en una forma monomérica, forma activa dimérica, o formando un complejo en el complejo latente del GDF-8. Por ejemplo, los anticuerpos pueden ser utilizados para detectar cuantitativamente o cualitativamente proteína de GDF-8 maduro en una célula, fluido corporal, tejido o un órgano. La presencia o la cantidad de proteína madura del GDF-8 detectada se correlaciona entonces con una o más de las condiciones médicas de la lista anterior. Los anticuerpos que aquí se describen pueden ser proveídos en un equipo de diagnóstico. El equipo puede contener otros componentes que ayuden a la detección de la proteína madura del GDF-8, y ayuden a correlacionar los resultados con una o más de las condiciones médicas descritas anteriormente.

Breve Descripción de las Secuencias Breve Descripción de los Dibujos La Figura 1 muestra los péptidos sintéticos de GDF-8 /SEQ ID NOs: 11 -13, 65, 105, 114 y 129, todas derivados de la SEQ ID NO: 14) utilizados para caracterizar la especificidad de unión de JA-16. Los aminoácidos subrayados indican las posiciones en donde las cisternas nativas han sido reemplazadas con serbias. La Figura 2 muestra la unión de JA-16 a los péptidos sintéticos de GDF-8, La Figura 3 indica las diferencias en las secuencias de aminoácidos de GDF-8 maduro (SEQ ID NO: 15) y BMP-11 (SEQ ID NO: 16). La Figura 4 muestra la comparación de las características de unión de JA-16 al péptido Gl (SEQ ID NO: 10, un péptido derivado del GDF-8) conjugado a albúmina de suero de bovino (BSA) y péptido Bl (SEQ ID NO: 9, un péptido derivado de BMP-11) conjugado a BSA. La Figura 5 muestra una comparación de las características de unión de JA-16 a Gl-BSA (SEQ ID NO: 10) después de que JA-16 es pre-íncubado con Gl, Bl, GDF-8, o BMP-11. Las Figuras 6 A y 6B muestran estudios de mapeo de la unión de JA-16 usando secuencias de péptido sintético 13-mero de traslape procedentes de GDF-8. Las Figuras 7A y B muestran los resultados de un análisis de supresión y sustitución de la región de epitope de JA-16 de GDF-8, Gly-Leu-Asp-Ser-Asp-Glu-His-Ser-Thr-Glu-Ser-Arg-Ser (SEQ ID NO: 18), usando síntesis de punto. La Figura 8 muestra la unión de GDF-8 biotinilado al receptor de ActRUB. Las Figuras 9A y 9B muestran la inhibición de la unión de GDF-8 biotinilado al receptor de ActRIIB en la presencia y en la ausencia de JA-16. La Figura 10 muestra un ensayo de gene reportero que evalúa el efecto de neutralización de JA-16 sobre la actividad del GDF-8 in vitro. La Figura 11 muestra el efecto in vivo del JA-16 en ratones durante un estudio de 4 semanas. Ratones BALB/c hembra de siete semanas de edad fueron tratados durante cuatro semanas con JA-16 mediante inyección intraperitoneal a 50 mh/Kg dos veces por semana. La gráfica de la izquierda muestra el cambio en la masa magra y de grasa durante el periodo de tratamiento según se determinó mediante análisis dexascan (dual energy x-ray, rayos x de doble energía). La gráfica de la derecha muestra la masa de tejidos seccionados. Una diferencia estadísticamente importante, p<0.01 para una prueba de investigador, se indica mediante un asterisco. La Figura 12 muestra el efecto in vivo del JA- 16 en la masa corporal total de ratones durante un estudio de 14 semanas. Los ratones C57BL macho utilizados en este estudio eran ya sea de tipo salvaje en el locus agutí (a) o portadores de la mutación amarilla letal (Ay) en ese locus. La mutación Ay causa el surgimiento de obesidad y diabetes en adultos. Ratones adultos jóvenes fueron tratados con inyecciones intraperitoneales semanalmente de 60 mg/kg de anticuerpo JA- 16 o de control. Además, al inicio del periodo del tratamiento los ratones fueron cargados con 60 mg/kg en forma intraperitoneal y 10 mg/kg en forma intravenosa del mismo anticuerpo. Estas gráficas muestran el peso corporal semanal para cada grupo de ratones. Las barras de error muestran el error estándar de la media para cada punto de información. La Figura 13 muestra el efecto in vivo de JA- 16 en la masa muscular total en ratones durante un estudio de 14 semanas. Al final del estudio los músculos fueron seccionados y pesados. Estas gráficas muestran el promedio de masa muscular para cada grupo de ratones. Se indica mediante un asterisco una diferencia estadísticamente importante, pO.01 para una prueba de investigador. La Figura 14 muestra el efecto in vivo de JA- 16 en la masa de grasa total en ratones durante un estudio de 14 semanas. Al final del estudio se seccionaron almohadillas de grasa y se pesaron. Estas gráficas muestran la masa promedio de almohadillas de grasa para cada grupo de ratones. La Figura 15 muestra el efecto in vivo de JA-16 en los niveles de glucosa en sangre en ratones durante un estudio de 14 semanas. Después de 12 semanas de tratamiento, los ratones C57BL-Ay/a se sometieron a ayuno durante toda la noche y se midió su nivel de glucosa en sangre. La Figura 16 muestra la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada de JA-16 (SEQ ID NO: 1). Las regiones determinantes complementarias (CDRs) están subrayadas. En la SEQ ID NO: 6 se proporciona la correspondiente secuencia de ácido nucleico. La Figura 17 muestra una comparación in vivo de Myo-19 y JA-16. Se trataron ratones C57B6/scid de siete semanas de edad durante cinco semanas con JA-16, Myo-19, o vehículo mediante inyección intraperitoneal, Al final del estudio se seccionaron y se pesaron músculos. Estas gráficas muestran la masa muscular promedio para cada grupo de ratones. Se indica mediante un asterisco una diferencia estadísticamente importante, p<0.01 para una prueba t de investigador. La Figura 18 muestra resultados de la inmunoprecipitación de GDF-8 con JA-16 y Myo-19. Las Figuras 19A y 19B muestran resultados de tratamiento con JA-16 en ratones BALB/c hembra durante cuatro semanas. Los ratones eran de 21 meses o 4 meses de edad al final del estudio. (19A) masa de cuadríceps seccionada para ratones tratados con JA-16 y tratadazos con vehículo al final del estudio. (19B) se determinó la fuerza del miembro delantero mediante una prueba de agarre para ratones tratados con JA-16 y para ratones tratados con vehículo después de siete semanas de tratamiento. Cada barra o punto de información indica el valor promedio para el grupo indicado ± el error estándar; (**) indica que p < 0.01 para pruebas t de investigador comparando el grupo de JA-16 con el grupo de vehículo; n = 8 para cada grupo. Las Figuras 20A-20D muestran resultados de tratamiento con JA-16 en ratones mdx. (20A) Los ratones tratados con JA-16 tuvieron un aumento importante de peso de EDL en comparación con los controles de mdx (19.72±0.50 vs. 14.63±0.69 mg; n=12; pO.0001). (20B) Los ratones tratados con JA-16 tuvieron un aumento importante de masa muscular para la proporción de peso corporal (peso de EDL/peso corporal) en comparación con el control (0.6±0.02 vs. 0.5±0.02; n=12; p<0.014). (20C) Los ratones tratados con JA-16 generaron una fuerza importantemente mayor durante una contracción de crispamiento isométrica en comparación con el control (177.32±8.37 vs. 132.28il2.45 mN; n=12; p<0.03). (20D) Los ratones tratados con JA-16 generaron una fuerza importante mayor durante una contracción tetánica isométrica en comparación con el control (491.23±16.34 vs. 370.74±19.21 mN; n=12; p<0.003).

Definiciones El término "anticuerpo" se refiere a uno o más anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales, composiciones de anticuerpos, anticuerpos que tienen mono o poli-especificidad, anticuerpos humanizados, anticuerpos de cadena sencilla, anticuerpos quiméricos, anticuerpos injertados a CDR, fragmentos de anticuerpos tales como Fab, F(ab')2, Fv, y otros fragmentos de anticuerpos que mantienen la función de unión a antígeno del anticuerpo padre. El término "anticuerpos quiméricos" se refiere a moléculas en las que una parte de la cadena pesada y/o ligera es idéntica u homologa a secuencias correspondientes procedentes de una especie particular (o que pertenece a una clase o subclase de anticuerpo particular), en tanto que el resto de la(s) cadena(s) es(son) idéntica(s) u homóloga(s) a secuencias correspondientes derivadas de una especie diferente (o que pertenece a una clase o subclase de anticuerpo diferente). Tales anticuerpos quiméricos se describen por Morrison, et al. (1984) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 81: 6851-6855. El término "epitope" se refiere a una molécula o porción de una molécula que es capaz de reaccionar de manera específica con un anticuerpo monoclonal de GDF-8. Los epitopes pueden comprender proteínas, fragmentos de proteína, péptidos, carbohidratos, lípidos, u otras moléculas, pero son más comunes las proteínas, oligopéptidos cortos o combinaciones de estos. El término "polipéptido de GDF" y "proteína de GDF" se refiere generalmente a cualesquiera factores de crecimiento y diferenciación que estén estructural o funcionalmente relacionados con el GDF-8. El término "inhibidor de GDF" incluye cualquier agente capaz de inhibir la actividad, expresión, procesamiento, o secreción de una proteína de GDF. Tales inhibidores incluyen proteínas, anticuerpos, péptidos, peptidomiméticos, ribozimas, oligonucleótidos anti-sentido, ARN de doble cadena, y otras pequeñas moléculas que inhiben de manera específica a las proteínas de GDF. Los términos "GDF-8," o "proteína de GDF-8" se refieren a un factor específico de crecimiento y diferenciación. Los términos incluyen a la forma precursora no procesada de longitud completa de la proteína, así como también la forma madura y de propéptido que resultan de la segmentación postraducción. Los términos también se refieren a cualesquiera fragmentos del GDF-8 que mantienen las actividades biológicas asociadas que se conocen con la proteína, como se describe aquí, incluyendo secuencias que han sido modificadas con cambios conservativos o no conservativos a la secuencia de aminoácidos. Estas moléculas de GDF-8 pueden ser derivadas de cualquier fuente, natural o sintética. La forma humana de la proteína de GDF-8 maduro se proporciona en la SEQ ID NO: 15. Sin embargo, la presente invención también abarca moléculas de GDF-8 provenientes de todas las otras fuentes, incluyendo GDF-8 de bovino, pollo, murino, rata, porcino, ovino, pavo, mandril y pez. Estas varias moléculas de GDF-8 han sido descritas en McPerron et al. (1997) Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 94: 12457-12461. "GDF-8 maduro" se refiere a la proteína que es segmentada del dominio con terminación carboxi de la proteína precursora del GDF-8. El GDF-8 maduro puede estar presente como un monómero, homodímero, o puede estar presente en un complejo latente de GDF-8. Dependiendo de las condiciones in vivo o in vitro, puede existir un equilibrio entre cualquiera o la totalidad de estas formas diferentes. Se cree que el GDF-8 es biológicamente activo como un homodímero. En su forma biológicamente activa, el GDF-8 maduro también es referido como "GDF-8 activo." "Propéptido de GDF-8" se refiere al polipéptido que es segmentado del dominio con terminación amino de la proteína precursora del GDF-8. El propéptido de GDF-8 es capaz de unirse al dominio de unión de propéptido en el GDF-8 maduro. "Un complejo latente de GDF-8" se refiere al complejo de proteínas formado entre el homodímero de GDF-8 maduro y el propéptido de GDF-8. Se cree que dos propéptidos de GDF-8 se asocian con un homodímero de GDF-8 para formar un complejo tetramérico inactivo. El complejo latente puede incluir otros inhibidores de GDF-8 en lugar de o en adición a uno o más de los propéptidos de GDF-8. La frase "inhibidor de GDF-8" incluye cualquier agente capaz de inhibir la actividad, expresión, procesamiento, o secreción de una proteína de GDF-8. Tales inhibidores incluyen proteínas, anticuerpos, péptidos, peptidomiméticos, ribozimas, oligonucleótidos anti-sentido, ARN de doble cadena, y otras pequeñas moléculas que inhiben de manera específica la actividad de la proteína del GDF-8. Se dice que tales inhibidores "neutralizan" o "reducen" la actividad biológica de la proteína del GDF-8.

La frase "actividad de GDF-8" se refiere a una o más actividades reguladoras del crecimiento o morfogenéticas, asociadas con la proteína del GDF-8 activo. Por ejemplo, el GDF-8 activo es un regulador negativo del músculo esquelético. El GDF-8 activo también puede modular la producción de enzimas específicas de músculo (por ejemplo, cinasa de creatina), estimular la proliferación de células mioblasto, y modular la diferenciación de los preadipocitos a adipositos. Los términos "aislado" o "purificado" se refieren a una molécula que está substancialmente libre de su medio ambiente natural. Por ejemplo, una proteína aislada está substancialmente libre de material celular u otras proteínas contaminantes provenientes de la célula o de la fuente de tejido de la cual se deriva. La frase "substancialmente libre de material celular" se refiere a preparaciones en donde la proteína aislada es cuando menos 70% a 80% pura (peso/peso), opcionalmente cuando menos 80-89% (peso/peso) pura, opcionalmente 90-95% pura, y opcionalmente cuando menos 96%, 97%, 98%, 99% o 100% pura (peso/peso). El término "mamífero" para propósitos de tratamiento se refiere a cualquier animal clasificado como mamífero, incluyendo a los seres humanos y animales domésticos y de granja, así como de zoológico, de deportes o mascotas tales como perros, caballos, gatos, ovejas, cerdos, vacas, etc. En una modalidad preferida de la invención el mamífero es un ser humano. El término "anticuerpo monoclonal" se refiere a uno o más anticuerpos procedentes de una población de anticuerpos substancialmente homogénea que está dirigida contra un solo epitope antigénico. El término abarca anticuerpos humanizados, anticuerpos de una sola cadena, anticuerpos quiméricos, anticuerpos injertados a CDR, fragmentos de anticuerpos tales como Fab, F(ab')2, Fv, y otros fragmentos de anticuerpos que mantienen la función de unión a antígeno del anticuerpo padre. Adicionalmente, el término "anticuerpo monoclonal" no está limitado a ninguna especie o fuente en particular del anticuerpo, o la forma en la que se prepara. Los anticuerpos monoclonales puede ser preparados a través de técnicas tradicionales de hibridoma (Kohler and Milstein (1975) Nature, 256: 495-499), métodos de ADN recombinante (Patente de los Estados Unidos de América No. 4,816,567) o bibliotecas de anticuerpos de fago (Claxon et al. (1991) Nature, 352: 624-628; Marks et al. (1991) J. Mol. Biol. 222: 581-597. Los anticuerpos monoclonales de cualquier mamífero o especie no mamífera pueden ser utilizados en esta invención. Por ejemplo, los anticuerpos pueden ser derivados de primates (por ejemplo, humanos, orangutanes, etc.) de aves (por ejemplo, pollos, pavos, etc.), bovino, murino, rata, cerdo, ovino o pez. En una modalidad de la invención, los anticuerpos son de rata, murino o de origen humano. Los términos "neutralizar" y "neutralización" se refieren a una reducción en la actividad del GDF-8 por un inhibidor del GDF-8, con relación a la actividad de una molécula de GDF-8 que no es unida por el mismo inhibidor. De esta manera, un anticuerpo de "neutralización" reduce la actividad del GDF-8 con relación a la actividad de una molécula de GDF-8 no unida por el mismo anticuerpo. La actividad de la proteína de GDF-8 cuando es unida por uno o más de los inhibidores del GDF-8 que actualmente se describen (por ejemplo los anticuerpos que se están describiendo) se reduce cuando menos aproximadamente 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50 o 55%, opcionalmente cuando menos aproximadamente 60%, 62%, 64%, 66%, 68%, 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 82%, 84%, 86% u 88%, opcionalmente cuando menos aproximadamente 90%, 91%, 92%, 93%> o 94%, y opcionalmente cuando menos aproximadamente 95% a 100% con relación a una proteína de GDF-8 que no es ligada por uno o más de los inhibidores de GDF-8 que se describen en la presente. El término "interacción específica" o "se une específicamente" o similares, significa que dos moléculas forman un complejo que es relativamente estable bajo condiciones fisiológicas. El término también es aplicable en donde, por ejemplo, un dominio de unión a antígeno es específico para un epitope particular, el cual es portado por un gran número de antígenos, en cuyo caso el miembro de unión específico que porta el dominio de unión a antígeno será capaz de unirse a varios antígenos que portan en epitope. La unión específica se caracteriza por una elevada afinidad y capacidad de baja a moderada. La unión no específica usualmente tiene una baja afinidad con una capacidad de moderada a alta. Típicamente, se considera a la unión específica cuando la constante de afinidad Ka es más alta que 106 M"1, o puede ser mayor de 108 M"1. Si es necesario, la unión no específica puede reducirse sin afectar de manera importante la unión específica variando las condiciones de unión. Se conocen tales condiciones en la técnica, y una persona capacitada en la técnica, utilizando técnicas rutinarias, puede seleccionar las condiciones apropiadas. Usualmente las condiciones son definidas en términos de la concentración de los anticuerpos, fuerza iónica de la solución, temperatura, tiempo permitido para la unión, concentración de moléculas no relacionadas (por ejemplo, albúmina de suero, caseína de leche), etc. En el Ejemplo 4 se establecen condiciones ejemplares. El término "súper familia de TGF-ß" se refiere a una familia de factores de crecimiento estructuralmente relacionados, la totalidad de los cuales poseen propiedades reguladoras del crecimiento y morfogenéticas, que son fisiológicamente importantes. Esta familia de factores de crecimiento relacionados se conoce bien en la técnica (Kingsley et al. Genes Dev. 8: 133-46; y Hoodless et al. (1998) Curr. Topics Microbiol. Immunol. 228: 235-72). La súper familia de TGF-ß incluye Proteínas Morfogenéticas de Hueso (BMPs), Activinas, Inhibinas, Sustancia de Inhibición Mulleriana, Factor Neurotrófico Derivado de Glial, y un todavía un creciente número de Factores de Crecimiento y Diferenciación (GDFs), tales como GDF-8 (miostatin). Muchas de estas proteínas están relacionadas en estructura al GDF-8, tal como la BMP-11; y/o en actividad, tal como la activina. El término "tratamiento" se refiere tanto a tratamiento terapéutico como a medidas profilácticas o preventivas. Aquellos que necesitan tratamiento pueden incluir a individuos que ya tienen un desorden médico particular así como también a aquellos que finalmente pueden adquirir el desorden (esto es, aquellos de requieren de medidas preventivas).

Descripción Detallada de las Modalidades Preferidas Anticuerpos Los anticuerpos intactos normalmente son glicoproteínas heterotetraméricas de aproximadamente 150,000 daltons, compuestas de dos cadenas ligeras (L) idénticas y dos cadenas pesadas (H) idénticas. Cada cadena ligera está ligada a una cadena pesada mediante un enlace disulfuro covalente, en tanto que el número de uniones disulfuro varía entre las cadenas pesadas de isotipos de inmunoglobulma diferentes. Cada cadena pesada y ligera también tiene puentes disulfuro intra cadenas espaciados de manera regular. Cada cadena pesada tiene cuando menos un dominio variable (VH) seguido de un número de dominios constantes. Cada cadena ligera tiene un dominio variable en un extremo (VL) y un dominio constante en su otro extremo; el dominio constante de la cadena ligera está alineado con el primer dominio constante de la cadena pesada, y el dominio variable de la cadena ligera está alineado con el dominio variable de la cadena pesada. Se cree que residuos aminoácido particulares forman una interfase entre los dominios variables de cadena ligera y de cadena pesada (Clothia et al. (1995) J. Mol. Biol, 186: 651 -663; Novotny and Haber (1985) Proc Nati AcadSci USA, 82: 4592-4596). Dependiendo de la secuencia de aminoácidos del dominio constante de sus cadenas pesadas, las inmunoglobulinas pueden ser asignadas a diferentes clases. Existen cinco clases principales de inmunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, y varias de éstas pueden ser divididas adicionalmente en subclases (isotipos), por ejemplo, IgAl e IgA2 para IgA; IgGl, IgG2, IgG3 e IgG4 para IgG en humanos, e IgGl, IgG2a, IgG2b e IgG3 para IgG en ratones. Los dominios constantes de cadena pesada que corresponden a las clases principales de inmunoglobulinas se denominan a, d, e, ? y µ, respectivamente. Se conocen bien en la técnica las estructuras de sub-unidad y las configuraciones tridimensionales de diferentes clases de inmunoglobulinas. Para una revisión de la estructura de los anticuerpos, ver Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, eds. Harlow et al. 1988. Brevemente, cada cadena ligera está compuesta por un dominio (V) variable (VL) con terminación N y un dominio constante (C), (CL). Cada cadena pesada está compuesta por un dominio V con terminación N, tres o cuatro dominios C y una región de gozne. El dominio CH más cercano a VH es designado como CHI . El dominio VH y VL consiste de cuatro regiones de secuencia relativamente conservada denominadas regiones marco (FR1, FR2, FR3 y FR4), las cuales forman un andamiaje para tres regiones de secuencia hipervariable (regiones de determinación de complementariedad, CDRs) Las CDRs contienen la mayoría de los residuos responsables de interacciones específicas con el antígeno. Las CDRs son referidas como CDR1, CDR2 y CDR3. En consecuencia, los constituyentes de CDR en la cadena pesada son referidos como Hl , H2 y H3, en tanto que los constituyentes de CDR en la cadena ligera son referidos como Ll, L2 y L3. La CDR3 es la fuente más grande de diversidad molecular dentro del sitio de unión de anticuerpo. H3, por ejemplo, puede ser tan corta como dos residuos aminoácido o mayor de 26. Las ubicaciones de dominios variables de inmunoglobulina en un anticuerpo dado pueden ser determinadas como se describe, por ejemplo, en Sequences of Proteins of Immunological Interest (Secuencias de Proteínas de Interés Inmunológico), U. S. Department of Health and Human Services (Departmento de Salud y Servicios Humanos de los Estados Unidos de América), eds. Rabat et al. 1991.

La diversidad de anticuerpos se crea mediante el uso de múltiples genes de línea germinal que codifican para regiones variables y una variedad de eventos somáticos. Los eventos somáticos incluyen la recombinación de segmentos de gene variable con segmentos de gene de diversidad (D) y de unión (J) para hacer una región VH completa y la recombinación de segmentos de gene variable y de unión para hacer una región VL completa. El proceso de recombinación mismo es impreciso, resultando en la pérdida o adición de aminoácidos en las uniones de V(D)J. Estos mecanismos de diversidad ocurren en la célula B de desarrollo antes de la exposición del antígeno. Después de la estimulación antigénica, los genes de anticuerpos expresados en las células B experimentan una mutación somática. Sobre la base del número estimado de segmentos de gene de línea germinal, podría producirse la recombinación aleatoria de estos segmentos, y el apareamiento aleatorio de VH-VL, hasta 1.6 x 107 diferentes anticuerpos (Fundamental Immunology, 3rd ed., Paul Raven Press, New Cork, NY, 1993). Cuando se toman en cuenta otros procesos que contribuyen a la diversidad de anticuerpos (tal como la mutación somática), se piensa que podrían generarse hacia arriba de 1 x 1010 anticuerpos diferentes (Immunoglobulin Genes, 2nd ed. Jonio et al., Academia Press, San Diego, CA, 1995). Debido a los muchos procesos involucrados en la generación de diversidad de anticuerpos, no es probable que anticuerpos monoclonales derivados en forma independiente con la misma especificidad de antígeno tengan secuencias de aminoácidos idénticas. Pueden hacerse surgir anticuerpos contra cualquier porción de una proteína que provea un epitope antigénico. En una modalidad de la presente invención, los anticuerpos que actualmente se describen se unen de manera específica a un epitope en una proteína que pertenece a la súper familia de las proteínas del TGF-ß. La proteína es opcionalmente una Proteína Morfogenética de Hueso (BMP), Activina, Inhibina, Sustancia de Inhibición Mülleriana, Factor Neurotrópico Derivado del Glial, o Factores de Crecimiento y Diferenciación (GDFs). Opcionalmente, la proteína es BMP-11, Activina, o GDF-8. La proteína es opcionalmente una proteína del GDF-8 maduro. En una modalidad, los anticuerpos que se están describiendo en la presente se unen a una proteína de GDF-8 maduro como se establece en la SEQ ID NO: 15, opcionalmente entre el aminoácido 1 y el aminoácido 50; opcionalmente entre el aminoácido 1 y el aminoácido 25, y opcionalmente entre el aminoácido 1 y el aminoácido 15 de la SEQ ID NO: 15. En otra modalidad, los anticuerpos que se están describiendo en la presente se unen de manera específica a la secuencia Asp-Glu-His-Xaa-Thr (SEQ ID NO: 2) en una de las proteínas que pertenecen a la súper familia del TGF-ß, en donde Xaa es Ala, Gly, His, Met, Asn, Arg, Ser, Thr, o Trp. Opcionalmente los anticuerpos se unen específicamente a la secuencia de péptido de Asp-Glu-His-Xaa-Thr (SEQ ID NO: 2) en GDF-8, en donde Xaa es Ala, Gly, His, Met, Asn, Arg, Ser, Thr o Trp. Opcionalmente los anticuerpos se unen específicamente a Asp-GIu-His-Ser-Thr (SEQ ID NO: 3) en la proteína de GDF-8 maduro (SEQ ID NO: 15). Opcionalmente los anticuerpos que se describen en la presente, se unen específicamente a la secuencia de péptido de Asp-Phe-Gly-Leu-Asp-Cys-Asp-Glu-His-Xaa-Thr-Glu-Ser-Arg-Cys (SEQ ID NO: 5) en una cualquiera de las proteínas que pertenecen a la súper familia del TGF-ß, en donde Xaa es Ala, Gly, His, Met, Asn, Arg, Ser, Thr, o Trp. Opcionalmente los anticuerpos se unen específicamente a la secuencia de péptido de Asp-Phe-Gly-Leu-Asp-Cys-Asp-Glu-His-Xaa-Thr-Glu-Ser-Arg-Cys (SEQ ID NO: 5) en GDF-8, en donde Xaa es Ala, Gly, His, Met, Asn, Arg, Ser, Thr o Trp. Opcionalmente los anticuerpos se unen específicamente a la secuencia de péptido de Asp-Phe-Gly-Leu-Asp-Cys-Asp-Glu-His-Ser-Thr-Glu-Ser-Arg-Cys (SEQ ID NO: 8) en la proteína madura del GDF-8 (SEQ ID NO: 15). La proteína del GDF-8 a la cual pueden unirse los anticuerpos que actualmente se están describiendo opcionalmente es cuando menos aproximadamente 75%-80% idéntica a la SEQ ID NO: 15, opcionalmente cuando menos aproximadamente 81% a aproximadamente 85% idéntica a la SEQ ID NO: 15, opcionalmente cuando menos aproximadamente 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93% o 94% idéntica a la SEQ ID NO: 15, y opcionalmente cuando menos aproximadamente 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% idéntica a la SEQ ED NO: 15. La proteína de GDF-8 opcionalmente comprende a la SEQ ID NO: 15. En una modalidad alternativa, los anticuerpos que actualmente se están describiendo pueden unirse de manera específica a la proteína de la BMP-11. La proteína de la BMP-11 es opcionalmente cuando menos aproximadamente 75%-80% idéntica a la SEQ ED NO: 16, opcionalmente cuando menos aproximadamente 81% a aproximadamente 85% idéntica a la SEQ ID NO: 16, opcionalmente cuando menos aproximadamente 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%>, 93%, o 94% idéntica a la SEQ ID NO: 16, y opcionalmente cuando menos aproximadamente 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% idéntica a la SEQ ID NO: 16. La proteína de la BMP-11 opcionalmente comprende a la SEQ ED NO: 16. En una modalidad particular, denominada JA- 16, el anticuerpo comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ED NO: 1 como una parte de la región variable de la cadena pesada. En otras modalidades, el anticuerpo comprende cuando menos una sola cadena CDR seleccionada de los aminoácidos 30-35 de la SEQ ED NO: 1, aminoácidos 50-66 de la SEQ ID NO: 1, y aminoácidos 99-102 de la SEQ ID NO: 1. Alguien capacitado en la técnica reconocerá que los anticuerpos de la invención pueden contener cualquier número de cambios conservativos o no conservativos a sus respectivas secuencias de aminoácidos sin alterar sus propiedades biológicas. Los cambios se pueden hacer ya sea en el marco (FR) o en las regiones CDR. Mientras los cambios en las regiones de marco usualmente están diseñados para mejorar la estabilidad y la inmunogenicidad del anticuerpo, los cambios en las CDRs usualtneíite están diseñados para aumentar la afinidad del anticuerpo para su blanco. Tales cambios que aumentan la afinidad se determinan típicamente en forma empírica alterando la región CDR y probando el anticuerpo. Dichas alteraciones pueden ser hechas de acuerdo con los métodos descritos en Antibody Engineering, 2nd ed. Oxford University Press, ed. Borrebaeck, 1995. Las modificaciones conservativas de aminoácido están basadas en la similitud relativa de los sustituyentes de cadena lateral de aminoácido, por ejemplo, su hidrofobicidad, carga, tamaño y similares. Se conocen bien por aquellos capacitados en la técnica sustituciones conservativas ejemplares que toman en consideración varias de las características precedentes e incluyen: arginina y Usina; glutamina y aspartato, serina y treonina; glutamina y asparragina; y valina, leucina e isoleucina. Detalles adicionales de tales cambios se describen en las siguientes secciones. De manera diferente a las CDRs, pueden hacerse cambios no conservativos más importantes en regiones de marco de estructura (FRs) sin afectar de manera adversa las propiedades de unión de un anticuerpo. Los cambios en FRs incluyen, pero no se limitan a, humanización de un marco derivado de no humano o la manipulación de ciertos residuos de marco que son importantes para contacto de antígeno o para la estabilización del sitio de unión, por ejemplo, cambiando la clase o subclase de la región constante, cambiando residuos aminoácido específicos que pudieran alterar una función efector tal como unión de receptor de Fe (Luna et al. (1991) J. Immun. 147: 2657-2662 y Morgan et al. (1995) Immunology 86: 319-324), o cambiando las especies de las cuales la región constante se deriva como se describió anteriormente. En una modalidad, los anticuerpos que actualmente se están describiendo se unen específicamente a proteína madura del GDF-8, sin importar si está en forma monomérica, en forma de dímero activo, o en forma de complejo en un complejo latente de GDF-8, con una afinidad de entre aproximadamente 106 y aproximadamente 10u M"1, opcionalmente aproximadamente 108 y aproximadamente 1011 M"1. Los anticuerpos de la presente invención pueden comprender anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales, composiciones de anticuerpos, anticuerpos que tienen mono o poli-especificidad, anticuerpos humanizados, anticuerpos de una sola cadena, anticuerpos injertados a CDR, fragmentos de anticuerpos tales como Fab, F(ab')2, Fv y otros fragmentos de anticuerpos que mantienen la función de unión a antígeno del anticuerpo padre. Los anticuerpos que se están describiendo también pueden ser modificados a anticuerpos quiméricos. Por ejemplo, una región Fe humana puede ser fusionada a una región de unión de GDF-8 procedente de un anticuerpo de murino para generar un anticuerpo quimérico. Mediante el reemplazo de otras porciones del anticuerpo de murino (fuera de la región de unión de antígeno) con correspondientes fragmentos de anticuerpo de humano, puede producirse un anticuerpo humanizado. Dichos anticuerpos quiméricos o humanizados pueden exhibir especificidad biológica mejorada o estabilidad in vivo. Ellos son particularmente útiles en el diseño de anticuerpos para terapias en humanos. Se comprende que los capacitados en la técnica están familiarizados con los materiales fuente estándares que describen condiciones específicas y procedimientos para la construcción, manipulación, producción, y aislamiento de anticuerpos (ver, por ejemplo, Harlow and Lañe (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New Cork). La presente invención también provee células, tales como hibridomas, que producen cualquiera de los anticuerpos que han sido descritos en la presente. Alguien capacitado en la técnica está familiarizado con las muchas células que son adecuadas para la producción de anticuerpos. Puede utilizarse cualquier célula compatible con la presente invención para producir los anticuerpos que se han descrito en la presente. En una modalidad, los anticuerpos descritos aquí se producen mediante una célula de hibridoma. Una línea celular de hibridoma, la cual produce anticuerpos de JA-16 de anti-GDF-8 de murino ha sido depositada con la American Tissue Culture Collection (Número de Designación de Depósito PTA-4236) el 18 de abril de 2002. La dirección del depositario es 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110. Métodos de Tratamiento de Enfermedades Los anticuerpos de la presente invención son útiles para prevenir, diagnosticar o tratar varios desórdenes médicos en seres humanos y animales. Los anticuerpos se utilizan para inhibir o reducir una o más de las actividades asociadas con la proteína del GDF, con relación a una proteína del GDF no unida por el mismo anticuerpo. Opcionalmente, los anticuerpos inhiben o reducen una o más de las actividades del GDF-8 maduro (sin importar si está en forma monomérica, forma de dímero activo, o en forma compleja en un complejo latente de GDF-8) con relación a una proteína madura del GDF-8 que no es unida por los mismos anticuerpos. En una modalidad, la actividad de la proteína madura del GDF-8, cuando es unida por uno o más de los anticuerpos que se describen en la presente, es inhibida cuando menos 50%, opcionalmente cuando menos 60%, 62%, 64%, 66%, 68%, 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 82%, 84%, 86% u 88%, opcionalmente cuando menos 90%, 91%, 92%, 93% o 94%, y opcionalmente cuando menos 95% a 100% con relación a una proteína del GDF-8 maduro que no es ligada por uno o más de los anticuerpos que se describen en la presente. El desorden médico que está siendo diagnosticado, tratado o prevenido por los anticuerpos que se describen en la presente es opcionalmente un desorden muscular y neuromuscular; un desorden del tejido adiposo tal como la obesidad, diabetes tipo 2, tolerancia dañada a la glucosa, síndromes metabólicos (por ejemplo, síndrome X), resistencia a la insulina inducida por trauma tal como quemadura; o enfermedades degenerativas óseas tales como la osteoporosis. La condición médica es opcionalmente un desorden muscular o neuromuscular, tal como distrofia muscular y atrofia muscular, enfermedad pulmonar obstructiva congestiva, síndrome de emaciación muscular, sarcopenia, o caquexia y desórdenes asociados con la pérdida de hueso, los cuales incluyen osteoporosis, especialmente en las personas de la tercera edad y/o mujeres postmenopáusicas, osteoporosis inducida por glucocorticoide, osteopenia, y fracturas relacionadas con la osteoporosis. Otras enfermedades y desórdenes óseos metabólicos que son blanco y que son susceptibles de tratamiento con los anticuerpos de GDF-8 de la invención incluyen la masa ósea baja debido a terapia crónica con glucocorticoides, falla gonadal prematura, supresión de andrógenos, deficiencia de vitamina D, hiperparatiroidismo secundario, deficiencias nutricionales y anorexia nervosa. Los anticuerpos son opcionalmente utilizados para prevenir, diagnosticar o tratar tales desórdenes médicos en mamíferos, opcionalmente en seres humanos. Los anticuerpos o composiciones de anticuerpos de la presente invención se administran en cantidades terapéuticamente efectivas. Como se emplea aquí, una "cantidad efectiva" del anticuerpo es una dosis que es suficiente para reducir la actividad de proteínas de GDF para lograr una respuesta biológica deseada (por ejemplo, aumento de la masa o fuerza muscular). Generalmente, una cantidad terapéuticamente efectiva puede variar con la edad, peso, condición física y sexo del sujeto, así como también con la severidad de la condición médica en dicho sujeto. La dosis puede ser determinada por un médico y ajustada, según se requiera, para adaptarse a los efectos observados del tratamiento. Generalmente, las composiciones se administran de manera que los anticuerpos se proporcionen en una dosis de entre 1 µ?/Kg y 20 mg/Kg. Opcionalmente, los anticuerpos se dan como una dosis de bolo, para maximizar los niveles circulantes de los anticuerpos para la longitud de tiempo más larga después de la dosis. También puede ser utilizada la infusión continua después de la dosis de bolo. Los métodos para el tratamiento, el diagnóstico o la prevención de las condiciones médicas antes señaladas con los anticuerpos que se describen en la presente también pueden ser empleados en otras proteínas que se encuentran en la súper familia del TGF-ß. Muchas de estas proteínas, por ejemplo la BMP-11 , están relacionadas en estructura con el GDF-8. En consecuencia, en otra modalidad, la presente invención provee métodos para el tratamiento de los desórdenes antes mencionados mediante la administración a un sujeto de un anticuerpo que es capaz de inhibir la BMP-11 o activina, ya sea solo o en combinación con otros inhibidores del TGF-ß, tal como un anticuerpo de neutralización contra el GDF-8.

Los anticuerpos de la presente invención pueden ser utilizados para detectar la presencia de proteínas que pertenecen a la süper familia del TGF-ß, tal como la BMP-1 1 y el GDF-8. Mediante la correlación de la presencia o nivel de estas proteínas con una condición médica, alguien capacitado en la técnica puede diagnosticar la condición médica asociada. Las condiciones médicas que pueden ser diagnosticadas mediante los anticuerpos que se están describiendo en la presente se establecieron anteriormente. Tales métodos de detección se conocen bien en la técnica e incluyen la prueba de ELISA, inmunoensayo, inmunomanchado, western blot, inmunofluorescencia, inmunoprecipitación, y otras técnicas comparables. Los anticuerpos pueden ser proveídos además en un equipo de diagnóstico que incorpore una o más de estas técnicas para detectar una proteína (por ejemplo, GDF-8). Dicho equipo puede contener otros componentes, empaque, instrucciones u otros materiales para ayudar a la detección de la proteína y el uso del equipo. En donde se tiene la intención de que los anticuerpos se utilicen para propósitos de diagnóstico, puede ser deseable modificarlos, por ejemplo con un grupo ligando (tal como biotina) o un grupo marcador detectable (tal como un grupo fluorescente, un radioisótopo o una enzima). Si se desea, los anticuerpos (sean policlonales o monoclonales) pueden ser marcados utilizando técnicas convencionales. Las etiquetas adecuadas incluyen fluorforos, cromóforos, átomos radiactivos, reactivos densos de electrón, enzimas, y ligandos que tengan socios de unión específica. Las enzimas son típicamente detectadas mediante su actividad. Por ejemplo la peroxidasa de raíz fuerte usualmente es detectada por su capacidad de convertir a la 3,3',5,5'-tetrametilbencidina (TMB) a un pigmento azul, susceptible de ser cuantificado con un espectrofotómetro. Otras etiquetas adecuadas incluyen, por ejemplo, uno de los socios de unión tal como la biotina y avidita o estreptavidina, IgG y proteína A, y varias parejas de receptor-ligando que se conocen en la técnica. Otras permutaciones y posibilidades serán fácilmente claras para aquellos capacitados en la técnica, y se consideran como equivalentes dentro del alcance de la presente invención. Composiciones de Anticuerpos La presente invención provee composiciones que comprenden los anticuerpos que se describen en la presente. Tales composiciones pueden ser adecuadas para uso y administración farmacéutica a pacientes. Las composiciones típicamente comprenden uno o más de los anticuerpos de la presente invención y un excipiente farmacéuticamente aceptable. Como se emplea aquí, la frase "excipiente farmacéuticamente aceptable" incluye todos y cada uno de los disolventes, medios de dispersión, revestimientos, agentes antibacterianos y antifungicidas, agentes isotónicos y de retardación de la absorción, y similares, que son compatibles con la administración farmacéutica. Se conoce bien en la técnica el uso de tales medios y agentes para substancias farmacéuticamente activas. Las composiciones farmacéuticas también pueden contener otros compuestos activos que proporcionan funciones terapéuticas complementarias, adicionales o mejoradas. Las composiciones farmacéuticas también pueden estar incluidas en un contenedor, paquete o despachador conjuntamente con instrucciones para su administración. Una composición farmacéutica de la invención se formula para que sea compatible con su ruta de administración pretendida. Los métodos para llevar a cabo la administración se conocen por aquellos con conocimientos normales en la técnica. También puede ser posible obtener composiciones que puedan ser tópica u oralmente administradas, o que puedan ser capaces de transmitirse a través de membranas mucosas. La administración puede, por ejemplo, ser intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, intracavidades, subcutánea o transdérmica.

Las soluciones o suspensiones utilizadas para aplicación intradérmica o subcutánea típicamente incluyen uno o más de los siguientes componentes: un diluyente estéril tal como agua para inyección, solución salina, aceites fijados, polietilen glicoles, glicerina, propilen glicol u otros disolventes sintéticos; agentes antibacterianos tales como el alcohol de bencilo o parabenos de metilo; antioxidantes tales como el ácido ascórbico o el bisulfito de sodio; agentes quelantes tales como el ácido etilendiaminotetraacético; reguladores tales como los acetatos, citratos o fosfatos; y agentes para el ajuste de tonicidad tales como el cloruro de sodio o la dextrosa. El pH puede ser ajustado con ácidos o bases, tales como el ácido clorhídrico o el hidróxido de sodio. Tales preparaciones pueden estar encerradas en ampolletas, jeringas desechables o frascos de dosis múltiples hechos de vidrio o plástico.

Las composiciones farmacéuticas adecuadas para inyección incluyen soluciones o dispersiones acuosas estériles y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles. Para la administración intravenosa, los portadores adecuados incluyen solución salmuera fisiológica, agua bacterioestática, Cremophor ELMR (BASF, Parsippany, NJ) o solución salina regulada de fosfato (PBS). En todos los casos, la composición debe ser estéril y debe fluir al grado de que exista un fácil manejo con la jeringa. Debe ser estable bajo condiciones de fabricación y almacenamiento y debe conservarse contra la acción de contaminación de microorganismos tales como bacterias y hongos. El portador debe ser un disolvente o medio de dispersión que contenga, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilen glicol y polietilen glicol líquido, y similares), así como mezclas adecuadas de éstos. La fluidez apropiada puede mantenerse, por ejemplo, mediante el uso de un revestimiento tal como la lecitina, mediante la conservación del tamaño de partícula requerida en el caso de una dispersión y mediante el uso de tensoactivos. La prevención de la acción de microorganismos puede lograrse mediante varios agentes antibacterianos o anti-hongos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido ascórbico, timerosal y similares. En muchos casos, será preferible incluir en la composición agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes tales como el manitol, sorbitol, cloruro de sodio. La absorción prolongada de las composiciones inyectables puede fomentarse mediante la inclusión en la composición de una agente que demore la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.

Las composiciones orales generalmente incluyen un diluyente inerte o un portador comestible. Por ejemplo, pueden estar encerradas en cápsulas de gelatina o comprimidas en tabletas. Para propósitos de administración terapéutica oral, los anticuerpos pueden estar incorporados con excipientes y utilizados en forma de tabletas, trociscos, o cápsulas. Agentes de unión farmacéuticamente compatibles y/o materiales adyuvantes pueden incluirse como parte de la composición. Las tabletas, pildoras, cápsulas, trociscos y similares pueden contener cualquiera de los siguientes ingredientes, o compuestos de una naturaleza similar; un ligador tal como celulosa microcristalina, goma de tragacanto o gelatina; un excipiente tal como almidón o lactosa, un agente de desintegración tal como ácido algínico, Primogel, o almidón de maíz; un lubricante tal como estearato de magnesio o Sterotes; un glidant tal como dióxido de silicio coloidal; un agente edulcorante tal como sucrosa o sacarina; o un agente saborizante tal como menta, salicilato de metilo o saborizante de naranja. Para la administración por inhalación, los anticuerpos pueden ser liberados en forma de un rocío en aerosol desde un recipiente o despachador a presión que contenga un propelente adecuado, por ejemplo, un gas tal como dióxido de carbono, o un nebulizador.

La administración sistémica también puede ser por medios transmucosales o transdérmicos. Para la administración transmucosal o transdérmica, se utilizan en la formulación agentes de penetración apropiados para que la barrera sea penetrada. Dichos agentes de penetración generalmente se conocen en la técnica e incluyen, por ejemplo, para la administración transmucosal detergentes, sales biliares y derivados del ácido fusídico. La administración transmucosal puede ser llevada a cabo a través del uso de aspersiones nasales o supositorios. Para la administración transdérmica, los compuestos activos se formulan en ungüentos, bálsamos, geles o cremas, como se conoce generalmente en la técnica. Los anticuerpos también pueden estar preparados en forma de supositorios (por ejemplo, con bases convencionales para supositorios tales como mantequilla de cacao y otros glicéridos) o enemas de retención para liberación rectal. En una modalidad, los anticuerpos se preparan con portadores que protegerán al compuesto en contra de la eliminación rápida del cuerpo, tales como una formulación de liberación controlada, incluyendo implantes y sistemas de liberación microencapsulados. Pueden utilizarse polímeros biodegradables y biocompatibles, tales como el vinil acetato de etileno, polianhídridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres y ácido poliláctico. Para aquellos capacitados en la técnica serán claros los métodos para la preparación de tales formulaciones. Los materiales también pueden obtenerse comercialmente en Alza Corporation y Nova Pharmaceuticals, Inc. También pueden utilizarse como portadores farmacéuticamente aceptables a las suspensiones liposomales que contengan los anticuerpos que actualmente se describen. Estas pueden ser preparadas de acuerdo con los métodos que se conocen por aquellos capacitados en la técnica, por ejemplo, como se describe en la patente de los Estados Unidos de América número 4,552,811. Es especialmente ventajoso el formular composiciones orales o parenterales en forma de dosis unitaria para una fácil administración y para uniformidad de la dosis. La forma de dosis unitaria, como se usa aquí, se refiere a unidades físicamente discretas que son adecuadas como dosis unitarias para el sujeto que va a ser tratado; cada unidad contiene una cantidad predeterminada de compuesto activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el portador farmacéuticamente requerido. La especificación para las formas de unidad de dosis de la invención está dictadas por y dependen directamente de las características únicas del compuesto activo y del efecto terapéutico particular que se va a lograr, así como de las limitaciones inherentes en la técnica de la formulación de combinados de dicho compuesto activo para el tratamiento de individuos. La toxicidad y la eficacia terapéutica de tales compuestos pueden determinarse mediante procedimientos farmacéuticos estándares en cultivos de células o animales experimentales, por ejemplo, para la determinación de la LD5o (la dosis letal para el 50% de la población) y la ED5o (la dosis terapéuticamente efectiva en 50% de la población). La proporción de dosis entre los efectos tóxicos y terapéuticos es el índice terapéutico y puede expresarse como la relación LD5o/ED5o. Se prefieren los propéptidos de GDF que presentan grandes índices terapéuticos. Pueden utilizarse los datos obtenidos a partir de ensayos de cultivos de células y estudios en animales, en la formulación de un intervalo de dosis para uso en seres humanos.

La dosificación de tales compuestos recae preferiblemente dentro de un intervalo de concentraciones circulatorias que incluyen la ED50 con poca o nula toxicidad. La dosificación puede variar dentro de este intervalo dependiendo de la forma de dosis empleada y de la ruta de administración utilizada. Para cualquier anticuerpo que se utiliza en la presente invención, la dosis terapéuticamente efectiva puede ser estimada inicialmente a partir de ensayos en cultivos de células. Una dosis puede ser formulada de modelos de animal para lograr un intervalo de concentración de plasma circulatoria que incluya el IC50 (esto es, la concentración del anticuerpo de prueba que logra una inhibición media-máxima de los síntomas) según se determina en un cultivo de células. Los niveles de plasma pueden ser medidos, por ejemplo, mediante cromatografía líquida de alta resolución. Los efectos de cualquier dosis particular pueden ser monitoreada mediante un bioensayo adecuado. Ejemplos de bioensayos adecuados incluyen ensayos de replicación de ADN, ensayos basados en la trascripción, ensayos de unión receptor/proteína de GDF, ensayos de cinasa de creatina, ensayos basados en la diferenciación de pre-adipocitos, ensayos basados en la absorción de glucosa en adipocitos, y ensayos inmunológicos. Anticuerpos Modificados Se comprende por alguien con conocimientos regulares en la técnica que ciertos aminoácidos pueden ser substituidos por otros aminoácidos en una estructura de proteína sin afectar de manera adversa la actividad de la proteína, por ejemplo, las características de un anticuerpo. Se contempla por lo tanto por los inventores que pueden hacerse varios cambios en las secuencias de aminoácidos de los anticuerpos que se están describiendo, o las secuencias de ADN que codifican para dichos anticuerpos, sin pérdida apreciable de su utilidad o actividad biológica. Tales cambios pueden incluir, pero no se limitan a, supresiones, inserciones, cortes, substituciones, fusiones entremezclado de secuencias motivo y similares. En la realización de tales cambios, puede considerarse el índice hidropático de los aminoácidos. Generalmente se comprende en la técnica la importancia del índice hidropático de aminoácidos al conferir función biológica interactiva en una proteína (Kyte and Doolittle (1982) J. Mol. Biol. 157: 105-132). Se acepta que el carácter hidropático relativo del aminoácido contribuye a la estructura secundaria de la proteína resultante, la cual a su vez define la interacción de la proteína con otras moléculas, por ejemplo, substratos, receptores, ADN, anticuerpos, antígenos y similares. A cada aminoácido se le ha sido asignado un índice hidropático sobre la base de su hidrofobicidad y características de carga (Kyte and Doolittle, 1982, supra); estos son isoleucina (+4.5), valina (+4.2), leucina (+3.8), fenilalanina (+2.8), cisteina/cistina (+2.5), metionina (+1.9), alanina (+1.8), glicina (-0.4), treonina (-0.7), serina (-0.8), triptófano (-0.9), tirosina (-1.3), prolina (-1.6), histidina (-3.2), glutamato (-3.5), glutamina (-3.5), aspartato (-3.5), esparraguina (-3.5), Usina (-3.9), y arginina (-4.5). Al hacer dichos cambios, se prefiere la substitución de aminoácidos cuyos índices hidropáticos están dentro de ±2, se prefieren de manera particular aquellos que se encuentran dentro de ±1, y todavía son de manera particular más preferibles aquellos que se encuentran dentro de ±0.5. También se comprende en la técnica que la substitución de aminoácidos similares puede ser hecha de manera efectiva sobre la base de la hidrofílidad. Por ejemplo, la patente de los Estados Unidos de América número 4,554,101 establece que la hidrofílidad promedio local más grande de una proteína, según se gobierna por la hidrofílidad de sus aminoácidos adyacentes, se correlaciona con una propiedad biológica de la proteína. Como se detalla en la patente de los Estados Unidos de América número 4,554,110, los siguientes valores de hidrofílidad han sido asignados a los residuos de aminoácidos: arginina (+3.0), Usina (+3.0), aspartato (+3.0±1), glutamato (+3.0±1), serina (+3.0), esparraguina (+2.0), glutamina (+2.0), glicina (0), treonina (-0.4), prolina (-0.5±1), alanina (-0.5), histidina (-0.5), cisteina -(1.0), metionina (-1.3), valina (-1.5), leucina (-1.8), isoleucina (-1.8), tirosina (-2.3), fenilalanina (-2.5) y triptofan (-3.4). En la realización de dichos cambios, se prefiere la substitución de aminoácidos cuyos valores de hidrofílidad están dentro de ±2, se prefieren de manera particular aquellos que se encuentran dentro de ±1, y todavía son de manera particular más preferibles aquellos que se encuentran dentro de ±0.5. Las modificaciones pueden ser conservativas de manera tal que la estructura o función biológica de la proteína no es afectada por el cambio. Dichas modificaciones de aminoácido conservativas se basan en la similitud relativa de los substituyentes de la cadena lateral de aminoácidos, por ejemplo, su hidrofobicidad, hidrofilidad, carga, tamaño y similares. Se conocen bien en la técnica las substituciones conservativas ejemplares que toman en consideración varias de las características precedentes, e incluyen: arginina y Usina; glutamato y aspartato; serina y treonina; glutamina y esparraguina; y valina, leucina e isoleucina. La secuencia de aminoácidos de los anticuerpos que se están describiendo puede ser modificada para que tenga cualquier número de cambios conservativos, en tanto que la unión del anticuerpo a su antígeno blanco no se afecte de manera adversa. Dichos cambios pueden ser introducidos dentro o fuera de la porción de unión de antígeno del anticuerpo. Por ejemplo, los cambios introducidos dentro de la porción de unión de antígeno del anticuerpo pueden estar diseñados para aumentar la afinidad del anticuerpo por su blanco.

Además de los cambios a la secuencia de aminoácidos delineados anteriormente, los anticuerpos pueden ser glucosilados, asociados a PEG o unidos a albúmina o a un polímero proteináceo. Por ejemplo, los anticuerpos que se están describiendo pueden ser ligado a uno de una variedad de polímeros no proteináceos, por ejemplo, polietilen glicol, propilen glicol, o polioxialquilenos, en la forma que se establece en las patentes de los Estados Unidos de América números 4,640,835; 4,496,689; 4,301,144; 4,670,417; 4,791, 192 o 4,179,337. Los anticuerpos son químicamente modificados mediante conjugación covalente a un polímero para incrementar su vida media circulatoria. Por ejemplo, ciertos polímeros y los métodos para unirlos a péptidos también se describen en las patentes de los Estados Unidos de América números 4,766,106; 4,179,337; 4,495,285 y 4,609,546. En otra modalidad, el anticuerpo puede ser modificado para que tenga un patrón de glucosilación alterado (esto es, alterado del patrón de glucosilación nativo u original). Como se emplea aquí, "alterado" significa que tiene una o más fracciones carbohidrato suprimidas, y/o que tiene uno o más sitios de glucosilación agregadas al anticuerpo original.

La glucosilación de anticuerpos es típicamente ya sea con enlace N o con enlace O. Enlace N se refiere a la unión de la fracción de carbohidrato a la cadena lateral de un residuo esparraguina. Las secuencias de tripéptido esparraguina-X*serina y esparraguina-X-treonina, en donde X es cualquier aminoácido excepto prolina, son las secuencias de reconocimiento para unión enzimática de la f acción de carbohidrato a la cadena lateral de esparraguina. De esta manera, la presencia de cualquiera de estas secuencias de tripéptido en un polipéptido crea un sitio de glucosilación potencial. Glucosilación con enlace O se refiere a la unión de uno o más azúcares N-acetilgalactosamina, galactosa o xilosa a un hidroxiaminoácido, más comúnmente serina o treonina, aunque también puede usarse la 5-hidroxiprolina o 5-hidroxilisina. La adición de sitios de glucosilación a los anticuerpos que se están describiendo se lleva a cabo de manera conveniente mediante la alteración de la secuencia de aminoácidos tal que contenga o se omita una o más de las secuencias de tripéptido anteriormente descritas (para sitios de glucosilación con enlace N). La alteración también puede ser llevada a cabo mediante la adición de, o la substitución por, uno o más residuos de serina o treonina a la secuencia de los anticuerpos originales (para sitios de glucosilación con enlace O). Por facilidad, la secuencia de aminoácidos del anticuerpo opcionalmente se altera a través de cambios a nivel de ADN. Otros medios para aumentar el número de fracciones de carbohidrato en los anticuerpos son mediante acoplamiento químico o enzimático de glucósidos a los residuos aminoácido del anticuerpo. Estos procedimientos son ventajosos ya que estos no requieren de la producción del inhibidor del péptido de GDF en una célula hospedera que tenga capacidades de glucosilación para glucosilación con unión N o unión O. Dependiendo del modo de acoplamiento utilizado, el(los) azúcar(es) puede(n) ser unido(s) a (a) arginina e histidina; (b) grupos carboxilo libres; (c) grupos sulfhidrilo libres tales como aquellos de cisteina; (d) grupos hidroxilo libres tales como aquellos de serina, treonina o hidroxiprolina; (e) residuos aromáticos tales como aquellos de fenilalanina, tirosina o triptofan; o (f) el grupo amida de glutamina. Estos métodos se describen en WO 87/05330, así como en Aplin and Wriston (1981 ) CRC Crit. Rev. Biochem., 22: 259-306. La remoción de cualquier fracción de carbohidrato presente en el propéptido de GDF puede ser llevada a cabo de manera química o enzimática. La deglucosilación química requiere de la exposición del anticuerpo al compuesto de ácido trifluorometanosulfónico, o a un compuesto equivalente. Este tratamiento resulta en la segmentación de la mayoría de la totalidad de los azúcares, excepto el azúcar de unión (N-acetilglucosamina o N-acetilgalactosamina), en tanto que se deja intacta la secuencia de aminoácidos.

La deglucosilación química se describe por Hakimuddin et al. (1987) Arch. Biochem. Biophys. 259:52 y por Edge et al. (1981) Anal. Biochem. 1 18:131. La segmentación enzimática de fracciones de carbohidrato en inhibidores de péptido de GDF puede lograrse mediante el uso de una variedad de endo- y exo-glucosidasas como se describe por Thotakura et al. (1987) Meth. Enzymol. 138:350. Análisis de Secuencia Si bien no siempre es necesario, si se desea, alguien con conocimientos normales en la técnica puede determinar las secuencias de aminoácidos o de ácido nucleico de los anticuerpos que se están describiendo en la presente. La presente invención incluye estas secuencias de aminoácidos y de ácido nucleico. La presente invención también incluye variantes, homólogos y fragmentos de estas secuencias de aminoácidos y de ácido nucleico. Por ejemplo, el anticuerpo puede comprender una secuencia de región variable de cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 1, o una secuencia de ácido nucleico que codifique para la SEQ ID NO: 1 (por ejemplo, SEQ ID NO: 6). La secuencia de ácido nucleico o de aminoácidos opcionalmente comprende una secuencia cuando menos 70% a 79% idéntica a la secuencia de ácido nucleico o de aminoácidos de la región de cadena pesada variable que se está describiendo en la presente, opcionalmente cuando menos 80% a 89% idéntica, opcionalmente cuando menos 90% a 95% idéntica, y opcionalmente cuando menos 96% a 100% idéntica. Alguien capacitado en la técnica reconocerá que la región CDR, la cual determina las propiedades de unión a antígeno de un anticuerpo, puede tolerar menos variación de secuencia que las otras porciones del anticuerpo que no están involucradas en la unión a antígeno. De esta forma, estas regiones de no-unión del anticuerpo pueden contener variaciones importantes sin alterar de manera importante las propiedades de unión del anticuerpo. Sin embargo, alguien con conocimientos normales en la técnica reconocerá que pueden hacerse muchos cambios a la región CDR que estén específicamente diseñados para aumentar la afinidad del anticuerpo por su blanco. Tales cambios que aumentan la afinidad típicamente se determinan de manera empírica alterando la región CDR y probando el anticuerpo. La totalidad de dichas alteraciones, sea dentro de la CDR o fuera de la CDR, están incluidos dentro del alcance de la presente invención.

La similitud o identidad de secuencia relativa puede determinarse utilizando los programas "Best Fit" o "Gap" del Sequence Análisis Software PackageMR (Versión 10, Genetics Computer Group, Inc., University of Wisconsin Biotecnology Center, Madison, WI). "Gap" utiliza el algoritmo de Needleman and Wunsch (Needleman and Wunsch, 1970) para encontrar el alineamiento de dos secuencias que maximiza el número de empates y reduce el número de aberturas. "Best Fit" realiza un alineamiento óptimo del mejor segmento de similitud entre dos secuencias. Los alineamientos óptimos se encuentran insertando aberturas para maximizar el número de empates usando el algoritmo de homología local de Smith and Waterman (Smith and Waterman, 1981 ; Smith et al., 1983). El Sequence Análisis Software PackageMR descrito anteriormente contiene un número de herramientas de análisis de secuencia útiles para la identificación de homólogos de las secuencias de nucleótidos y aminoácidos que se describen en la presente. Por ejemplo, el programa "BLAST" (Alschul, et al. 1990) investiga secuencias similares a una secuencia pregunta (ya sea péptido o ácido nucleico) en una base de datos específica (por ejemplo, bases de datos de secuencias mantenidas en el Nacional Center for Biotechnology Information (NCBI) en Bethesda, Maryland, E.U.A.), "FastA" (Lipman and Pearson, 1985; ver también Pearson and Lipman, 1988; Pearson, et al., 1990) realiza una búsqueda de similitudes de Pearson and Lipman entre una secuencia pregunta y un grupo de secuencias del mismo tipo (ácido nucleico o proteína); "TfastA" realiza una búsqueda de similitudes de Pearson and Lipman entre una secuencia pregunta de proteína y cualquier grupo de secuencias de nucleótidos (traduce las secuencias de nucleótidos en todos los seis marcos de lectura antes de efectuar la comparación); "FastX" realiza una búsqueda de similitudes de Pearson and Lipman entre una secuencia pregunta de nucleótidos y un grupo de secuencias de proteína, tomando en cuenta cambios de marco. "TfastX" realiza una búsqueda de similitudes de Pearson and Lipman entre una secuencia pregunta de proteína y cualquier grupo de secuencias de nucleótidos, tomando en cuenta cambios de marco (traduce ambas cadenas de la secuencia de ácido nucleico antes de realizar la comparación.

Los siguientes ejemplos proporcionan modalidades preferidas de la invención. Alguien con conocimientos normales en la técnica reconocerá que pueden llevarse a cabo numerosas modificaciones y variantes sin alterar el espíritu o alcance de la presente invención. Se cree que tales modificaciones y variaciones están abarcadas dentro del alcance de la invención. Los ejemplos no limitan de manera alguna la invención. El contenido completo de todas las referencias, patentes y solicitudes de patente publicadas que se han sido citadas a lo largo de esta descripción se incorporan a la presente mediante esta referencia.

Ejemplo 1 : Purificación del GDF-8 Medio acondicionado proveniente de una línea celular seleccionada que expresa proteína de GDF-8 humano de longitud completa (GDF-8 maduro + propéptido de GDF-8) se acidificó a un pH de 6.5 y se aplicó a una columna de intercambio aniónico POROS HQ de 80 x 50 mm, en tandeo, a una columna de intercambio catiónico POROS SP de 80 x 50 mm (PerSeptive Biosystems, Foster City, CA). El flujo a través de éstas se ajustó a pH 5.0 y se aplicó a una columna de intercambio catiónico POROS SP de 75 x 20 mm (PerSeptive Biosystems) y se eluyó con un gradiente de NaCl. Las fracciones que contenían el GDF-8, como se indicaba por electroforesis en dodecil sulfato de sodio - gel de poliacrilamida (SDS-PAGE), se acumularon, acidificaron con ácido trifluoroacético (TFA) a un pH 2-3, posteriormente se llevaron hasta 200 mi con TFA al 1% para bajar la viscosidad. El acumulado se aplicó posteriormente a una columna de C5 de 250 x 21.2 mm (Phenomenex) precedida por una columna guard de 60 x 21.2 mm (Phenomenex) y se eluyó con un gradiente de TFA/CH3CN, para separar el GDF-8 maduro del propéptido de GDF-8. Las fracciones acumuladas que contenían GDF-8 maduro se concentraron mediante liofilización para eliminar el acetonitrilo y se agregaron 20 mi de TFA al 0.1%. La muestra se aplicó entonces a una columna de C5 de 250 x 10 mm (Phenomenex) calentada a 60 °C para ayudar en la separación. Esto se repitió hasta que ya no pudo lograrse separación adicional. Las fracciones que contenían GDF-8 maduro se acumularon entonces y se llevaron a acetonitrilo al 40% y se aplicaron a una columna de exclusión por tamaño BioSep S-3000 de 600 x 21.2 (Phenomenex) precedida por una columna guard de 60 x 21.2. Las fracciones que contenían GDF-8 maduro y purificado se acumularon y se concentraron para uso en experimentos subsecuentes.

Las fracciones de la columna de C5 que contenían propéptido de GDF-8 se acumularon, se eliminó el acetonitrilo por evaporación, se agregaron 20 mi de TFA al 1%, y las muestras se inyectaron después en la columna de C5 de 250 x 10 mm a 60 °C. Esto se repitió hasta que ya no se logró separación adicional. Las fracciones que contenían propéptido de GDF-8 se acumularon entonces y se llevaron a acetonitrilo al 40% y se aplicaron a una columna de exclusión por tamaño BioSep S-3000 de 600 x 21.2 (Phenomenex) precedida por una columna guard de 60 x 21.2. Las fracciones que contenían propéptido de GDF-8 purificado se acumularon y se concentraron para uso en experimentos subsecuentes. En el análisis SDS-PAGE, el GDF-8 maduro y purificado emigró tanto como una banda ancha a 25 kDa bajo condiciones no reductoras y 13 kDa bajo condiciones reductoras. Se ha reportado un perfil de SDS-PAGE similar para GDF-8 de murino (McPherron et al. (1997) Nature 387:83-90), y refleja la naturaleza dimérica de la proteina madura. El peso molecular aparente del propéptido de GDF-8 purificado era de 38 kDa bajo tanto condiciones reductoras como no reductoras. Esto indica que el propéptido de GDF-8 por si mismo es monomérico. La diferencia entre el peso molecular aparente y el peso molecular pronosticado del propéptido de GDF-8, ~26 kDa, puede reflejar la adición de carbohidrato, puesto que su secuencia de aminoácidos contiene un potencial sitio de glucosilación ligado a N (McPherron et al, (1997), supra).

Ejemplo 2: Características del GDF-8 Humano Recombinante y Purificado Se mezclaron 50 g de GDF-8 maduro y purificado y propéptido de GDF-8 purificado y se dializaron en fosfato de sodio 50 mM, pH 7.0, y se sometieron a cromatografía en una columna de exclusión por tamaño BioSep S-3000 de 300 x 7.8 (Phenomenex). El peso molecular del complejo de GDF-8 maduro/propéptido se determinó a partir del tiempo de elución, utilizando estándares de peso molecular (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) sometidos a cromatografía en la misma columna. Cuando el propéptido de GDF-8 purificado se incubó con GDF-8 maduro y purificado, a un pH neutro, las dos proteínas parecieron formando un complejo, como se indica por el perfil de exclusión por tamaño. El pico de proteína principal que eluyó a los 12.7 minutos tenía un peso molecular estimado de 78 kDa a partir de estándares de peso molecular (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) sometidos a cromatografía en la misma columna. El tamaño del complejo es más consistente con un dímero del GDF-8 maduro que se asocia con dos monómeros de propéptido. Para confirmar esta observación, una preparación que contenía tanto GDF-8 maduro como propéptido de GDF-8 se incubó con o sin clorhidrato de l-etil-3-[3-dimetilaminopropil]carbodiimida 100 mM (EDC, Pierce) durante 1 hora a temperatura ambiente, se acidificó con HC1 a un pH de 2-3, y se concentró con un concentrador Amicon Micron- 10 (Millipore, Bedford, MA) para SDS-PAGE, usando un gel de acrilamida al 10% regulado con tricina. Las proteínas fueron visualizadas mediante teñido con azul de Coomassie. Se observó, en la presencia de EDC, un complejo reticulado con un peso molecular aparente de 75 kDa. El ADN del propéptido del GDF-8 y la secuencia de aminoácidos se presentan en McPherron and Lee (1997) Proc Nati. Acad. Sel USA, 94: 12457-12461.

Ejemplo 3: Producción de Anticuerpos de anti-GDF-8 Para desarrollar un anticuerpo capaz de inhibir la actividad del GDF-8, se inmunizó un grupo de ratones narcotizados de GDF-8 cada dos semanas oon proteína madura de GDF-8 (purificada como se describe en el Ejemplo 1) mezclado en adyuvante completo de Freunds para las primeras dos inmunizaciones, y posteriormente adyuvante de Freunds incompleto. A lo largo de todo el periodo de inmunización, se muestreo sangre y se probó para determinar la presencia de anticuerpos de circulación. A la semana 9 se seleccionó un animal con anticuerpos de circulación, se inmunizó durante tres días consecutivos, y se sacrificó. Se retiró el bazo y se homogeneizó en células. Las células del bazo se fusionaron a un socio de fusión de mieloma (línea P3-x63-Ag8.653) usando PEG 1500 al 50% mediante un procedimiento (Oi & Hersenberg (1989) Selected Methods in Cellular Immunology, W. J. Freeman Co., San Francisco, CA, p. 351). Las células fusionadas se colocaron en placa de placas de micro-titulación de 96 pozos a una densidad de 2 x 105 células/pozo. Después de 24 horas, las células fueron sometidas a selección de HAT (Littlefield (1964) Science, 145: 709) matando de manera efectiva cualesquiera células de mieloma no fusionadas y fusionadas de manera improductiva. Se identificaron a las células de hibridoma fusionadas de manera exitosa, que secretaban anticuerpos de anti-GDF-8 mediante pruebas ELISA de fase sólida y en solución. La proteína madura de GDF-8 se preparó a partir de células CHO como se describió anteriormente y se revistieron en poliestireno (para ensayos de fase sólida) o se biotinaron (para ensayo en base solución). También se emplearon ensayos de neutralización en donde el receptor de AcRITB se revistió sobre una placa de poliestireno y la unión de GDF-8 de biotina se inhibió mediante la adición de sobrenadante de hibridoma. Los resultados identificaron hibridomas que expresaban anticuerpos de GDF-8. Estas clonas positivas fueron cultivadas y expandidas para estudio adicional. Estos cultivos permanecieron estables cuando se expandieron y las líneas celulares se clonaron mediante dilución limitante y se conservaron de manera criogénica. A partir de estos cultivos, se desarrolló un panel de anticuerpos que reconocían de manera específica GDF-8 maduro. Se determinó el isotipo de los anticuerpos usando un equipo de isotipo de inmunoglobulina de ratón (Zymed Laboratorios, San Francisco, CA). Una de las clonas de anticuerpo, designada JA- 16, se estudió adicionalmente.

Ejemplo 4: Caracterización de la Especificidad de Unión de JA- 16 Para determinar la especificidad de unión de JA- 16 se produjo un panel de péptidos sintéticos correspondientes a porciones de la secuencia de la proteína de GDF-8. La Figura 1 muestra los péptidos sintéticos de GDF-8 usados en este estudio. Los péptidos de número par (N2-N14) fueron biotinados en la amina primaria. Los péptidos biotinados N2, N4, N6, N8, N10, N12, N14, y un péptido irrelevante DAE-10 fueron recubiertos a 1 µg/ml durante 2 horas a temperatura ambiente en placas de 96 pozos de poliestireno recubiertas con Reacti-Bind™ Streptavidin (Pierce, Rockford, IL, No. de Catálogo 15124) siguiendo el protocolo del fabricante. Después del bloqueo, se agregó JA- 16 o un control de anticuerpo monoclonal no relacionado a la placa de ELISA a 100, 10 y 1 nM (JA-16 solo), y se incubó durante 30 minutos. Después del lavado de la placa, se agregó un anticuerpo secundario (IgG (H+L)-HRP de anti-murino de cabra, Calbiochem, San Diego, CA, No. de Catálogo 401215) a una dilución de 1 : 1000 y se incubó durante 30 minutos a temperatura ambiente. La placa se lavó cuatro veces y se agregó sustrato de TMB ( PL, Gathersburg, MD, No. de Catálogo 50-76-04). Se hicieron mediciones colorimétricas a 450 nm en un lector de placas de Molecular Devices. Los resultados se muestran en la Figura 2. La JA- 16 se unió fuertemente y de manera específica al péptido con terminación N biotinado N8 (SEQ ID NO: 65). El GDF-8 maduro y la BMP-11 madura son 90% homólogos en el nivel aminoácido (Figura 3). Tres de estos cambios están presentes dentro del péptido N8. Para comparar la especificidad de JA- 16 hacia GDF-8 y BMP-11 se diseñaron péptidos más cortos Gl y Bl específicos para GDF-8 y BMP-11, respectivamente. Las diferencias entre Gl y Bl se indican con un subrayado.

Gl : Asp-Phe-Gly-Leu-Asp-Ser-Asp-Glu-His-Ser-Thr-Glu-Ser-Arg-Cvs (SEQ ID NO: 10) Bl Asn-Leu-Gly-Leu-Asp-Ser-Asp-Glu-His-Ser-Ser-Glu-Ser-Arg-Cys (SEQ ID NO: 9).

Los péptidos Gl y Bl fueron conjugados a BSA usando un equipo de conjugación PIERCE (No. de Catálogo 77116ZZ) siguiendo el protocolo del fabricante. Gl-BSA y Bl-BSA fueron revestidos en placas de ensayo de fondo plano de 96 pozos (Costar, NY, No. de Catálogo 3590) a 1 µ&/??1 en regulador de carbonato de sodio 0.2 M durante toda la noche a 4 °C. Las placas fueron lavadas y bloqueadas con PBS, 1 mg/ml de BSA, Tween al 0.05% durante 1 hora a temperatura ambiente. La JA-16 (5 nM) fue diluida en serie (1 :2). Las diluciones se agregaron a la placa de ELISA y se incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente. Después de 4 lavados, se agregó un anticuerpo secundario (IgG (H+L)-HRP de anti-murino de cabra, Calbiochem, No. de Catálogo 401215) a una dilución de 1 :1000 y se incubó durante 30 minutos a temperatura ambiente. Las placas fueron lavadas cuatro veces, y se agregó sustrato de TMB (KPL, No. de Catálogo 50-76-04). Las mediciones colorimétricas se hicieron a 450 nm en un lector de micro placas de Molecular Devices. La Figura 4 muestra que la JA- 16 se une a Bl-BSA en una forma dependiente de la concentración, pero no a B 1-BSA, aún a la concentración más elevada. Para examinar adicionalmente respecto a la especificidad de la JA-16, el Gl-BSA se recubrió como se describió anteriormente, pero esta vez, la JA-16 a 5 nM se pre-incubó ya sea con péptido Gl o péptido Bl, GDF-8 o BMP-11 a varias concentraciones. En la Figura 5 se muestran los resultados. El péptido B 1 específico de BMP-11 no inhibe la unión de JA-16 a Gl-BSA, pero el Gl si. El IC50 para el GDF-8 es de 0.8 µ/ml, en tanto que el IC50 de la BMP- 1 1 es de 3.8 g/ml, demostrando que la JA-16 reconoce al GDF-8 con una afinidad 5 veces más alta que la de la BMP-11.

Ejemplo 5: Mapeo del Epitope de JA-16 Con el objeto de mapear el epitope exacto de la JA-16, péptidos de 13-mero de traslape (SEQ ID NOs: 17-64, ver Figura 6A) correspondientes a las porciones de la secuencia de GDF-8 se sintetizaron directamente en papel de celulosa usando la técnica de síntesis spot (Molina et al. (1996) Peptide Research, 9:151-155; Frank et al. (1992) Tetrahedron, 48: 9217-9232). En este arreglo, los residuos de cisteína fueron reemplazados con serina con el fin de reducir las complicaciones químicas que son causadas por la presencia de las cisternas. Las membranas de celulosa modificadas con polietilen glicol y aminoácidos protegidos con Fmoc fueron adquiridos en Abimed (Lagenfield, Alemania). El arreglo se definió en la membrana mediante acoplamiento de un espaciador de ß-alanina y los péptidos fueron sintetizados usando química de acoplamiento de DIC estándar (diisopropil/carbodiimida) HOBt (hidroxibenzotriazol) como se describió previamente (Molina et al (1996) Peptide Research, 9: 151-155; Frank et al. (1992) Tetrahedron, 48: 9217-9232). Los aminoácidos activados fueron manchados usando un robot ASP 222 de Abimed. Las etapas de lavado y de desprotección se llevaron a cabo de manera manual y los péptidos fueron acetilados en la terminación N después del ciclo de síntesis final. Enseguida a la síntesis del péptido, se lavó la membrana en metanol durante 10 minutos y en bloqueador (TBST (Salmuera regulada con Tris con Tween 20 al 0.1% (v/v) + caseína al 1% (p/v)) durante 10 minutos. La membrana fue entonces incubada con 2.5 µg/ml de JA-16 en bloqueador durante 1 hora con agitación suave. Después del lavado con bloqueador 3 veces durante 10 minutos, la membrana se incubó con anticuerpo secundario marcado con HRP (0.25 µg/ml en bloqueador) durante 30 minutos. La membrana fue lavada entonces 3 veces durante 10 minutos cada una con bloqueador y 2 veces durante 10 minutos cada una con TBST. Se visualizó el anticuerpo unido usando reactivo SuperSignal West (Pierce) y una cámara digital (Alphalnnotech Fluorlmager). En la Figura 6B se muestran los resultados. La JA-16 se unió a los primeros 4 péptidos del arreglo (SEQ ID NOs: 17-20) que corresponde a 18 residuos en la terminación N del GDF-8. Con el fin de caracterizar adicionalmente al epitope de JA-16, se llevaron a cabo análisis de supresión y sustitución del péptido Gly-Leu-Asp-Ser-Asp-Glu-His-Ser-Thr-Glu-Ser-Arg-Ser (SEQ ID NO: 18) usando síntesis spot. En el análisis de sustitución, cada residuo de este péptido se reemplazó de manera individual con cada uno de 20 aminoácidos naturales excepto cisterna, generando las SEQ JD NO: 3, 18, 66-104, 106-113 y 115-128. Los ensayos de síntesis y unión se llevaron a cabo como se describió anteriormente. Los resultados se muestran en la Figura 7. Las sustituciones en los 4 aminoácidos de terminación N y los 4 aminoácidos de terminación C fueron bien toleradas, sugiriendo que estos aminoácidos no fueron requeridos para la unión de JA-16 a GDF-8 maduro. Sin embargo, no se toleraron cambios en el segmento intermedio de este péptido Asp-Glu-His-Ser-Thr (SEQ ID NO: 3), excepto por una cuantas sustituciones en el residuo serina, sugiriendo que esta secuencia de péptido era requerida para la unión de JA-16. Además, la secuencia Asp-Glu-His-Ser-Thr (SEQ ID NO: 3) fue el péptido más pequeño al cual la unión podía ser detectada en el análisis de supresión. De esta manera, los resultados sugieren que la JA-16 reconoce al epitope Asp-Glu-His-Ser-Thr (SEQ ID NO: 3) en GDF-8, con los residuos Asp, Glu, His y Thr (Asp-Glu-His-Xaa-Thr (SEQ ID NO: 2)) siendo importantes para la unión.

Ejemplo 6: Caracterización de la JA-16 In Vitro Se llevaron a cabo dos ensayos para determinar la capacidad de la JA-16 en neutralizar la actividad del GDF-8 in vitro. Primero, se probó la JA-16 en cuanto a su capacidad de inhibir la unión de la proteína madura del GDF-8 al receptor de ActRIIB. Se recubrieron quimeras de ActRIIB. Fe recombinantes (R&D Systems, Minneapolis, MN, EUA, No. de Catálogo 339-RB/CF) en placas de ensayo de 96 pozos con fondo plano (Costar, NY, No. de Catálogo 3590) a 1 µ£/??1 en regulador de carbonato de sodio 0.2 durante toda la noche a 4 °C. Las placas posteriormente fueron bloqueadas con un 1 mg/ml de albúmina de suero de bovino y se lavaron siguiendo técnicas de ELISA estándar. Se agregaron 100 µ? de proteína de GDF-8 maduro biotinado, en varias concentraciones, a las placas de ELISA bloqueadas, se incubaron durante 1 hora y se lavaron. Se detectó la cantidad de proteína de GDF-8 maduro mediante Streptavidin-peroxidasa de raíz fuerte (SA-HRP, BD PharMingen, San Diego, CA, EUA, No. de Catálogo 13047E) seguido de la adición de TMB (KPL, No. de Catálogo 50-76-04). Las mediciones colorimétricas se realizaron a 450 nM en un lector de micro placas de Molecular Devices. Los resultados se muestran en la Figura 8. El GDF-8 maduro presentó un ED50 de 12 ng/ml. También se llevó a cabo el mismo protocolo después de la pre-incubación del anticuerpo de JA- 16 con proteína de GDF-8 maduro biotinada a 5 ng/ml durante 30 minutos. Se incluyó un anticuerpo monoclonal irrelevante como control negativo. La Figura 9 muestra que la JA- 16 tiene una actividad de neutralización in vitro muy débil de alrededor de 1 µ?. Esta información de in vitro sugiere que la JA- 16 es poco probable de ser un muy buen neutralizador del GDF-8 activo, particularmente bajo condiciones in vivo menos controladas. En un segundo grupo de ensayos, se llevó a cabo un ensayo de gene reportero para evaluar la actividad biológica de la proteína del GDF-8 activo in vitro. El ensayo utiliza un vector reportero, pGL3(CAGA)12, acoplado a luciferasa. Se reportó previamente que la secuencia CAGA era una secuencia que respondía a TGF-ß dentro del promotor del gene inducido por TGF-ß, PAI-1. El vector reportero que contiene 12 cajas CAGA se hizo utilizando el plásmido reportero básico, pGL3 (Promega Corporation, Madison, WI, No. de Catálogo E1751). La caja TATA y el sitio de iniciación de transcripción proveniente del promotor tardío principal de adenovirus (-35/+10) se insertaron entre los sitios Bglll y HindIII. Se recocieron oligonucleótidos que contenían doce repeticiones de AGCCAGACA de las cajas CAGA y se clonaron en el sitio Xhol. La linea celular de rabdomiosarcoma humano, A204 (ATCC HTB-82), se transfectó de manera transitoria con pGL3(CAGA)i2 usando reactivo de transfección FuGENE 6 (Roche Diagnostics, Indianápolis, MN, No. de Catálogo 1814443). Enseguida a la transfección, las células se cultivaron en placas de 48 pozos en medio 5 A de McCoy (Life Technologies, Rockville, Maryland, No. de Catálogo 21500-079) complementado con glutamina 2 nM, 100 U/ml de estreptomicina, 100 µ§/t??, de penicilina y suero de ternera fetal al 10% durante 16 horas. Las células fueron entonces tratadas con GDF-8, BMP- 11 o activina en medio 5 A de McCoy con glutamina, estreptomicina, penicilina y 1 mg/ml de albúmina de suero de bovino durante 6 horas a 37 °C. Se cuantificó la luciferasa en las células tratadas utilizando el Luciferase Assay System (Promega Corporation, Madison WI, No. de Catálogo El 483). El GDF-8 máximamente activó el constructo reportero 10 veces, con una ED50 de 10 ng/ml de GDF-8. La BMP-11, que era 90% idéntica al GDF-8 en el nivel de aminoácidos (Gamer et al. (1999) Dev. Biol. 208:222-232 y Nakashima et al. (1999) Mech. Dev. 80:185-189), y la activina produjeron una respuesta biológica similar. La actividad de neutralización de la JA- 16 se determinó mediante preincubación de la JA- 16 con proteína de GDF-8 maduro durante 30 minutos antes de la adición a las células A204. También se probaron un anticuerpo irrelevante (control monoclonal) así como un anticuerpo de GDF-8 humano derivado de la biblioteca de fagémido scFv usando tecnología de despliegue de fago (Myo-19). La Figura 10 muestra que, en este ensayo también, la JA- 16 es neutralizadora de forma débil con un IC50 de alrededor de 1 µ?, en tanto que el IC50 de Myo-19 es de alrededor de 100 nM, Sobre la base de estos datos in vitro, uno habría esperado que el anticuerpo Myo-19 fuera un neutralizador mejor de la proteína del GDF-8 activo que el del JA- 16 in vivo, lo cual no sucede así, como aquí se muestra.

Ejemplo 7: Inmunoprecipitación de GDF-8 con JA-16 Con el fin de evaluar la unión del JA-16 a complejos de GDF-8 maduro y GDF-8, se llevaron a cabo una serie de estudios de inmunoprecipitación.

Primero, para determinar si el JA- 16 puede inmunoprecipitar el complejo latente de GDF-8, se radiomarcaron con 35S-metionina y 35S-cisteína células CHO que expresaban GDF-8. 100 µ? de medio acondicionado procedente de estas células conteniendo complejo latente de GDF-8 se incubaron con 1 mg/ml de JA- 16 durante 1 hora a 4 °C. Se agregó a la mezcla Sepharose de proteína A, la cual fue entonces incubada durante toda la noche a 4 °C. Se recolectó el inmunoprecipitado, se lavó tres veces con regulador de PBS/Triton-XI 00, se re-suspendió en regulador de muestra de reducción y se analizó mediante SDS-PAGE. El gel se fijó durante toda la noche, se mejoró con solución de mejorador de autoradiografla, se secó y se desarrolló el autoradiograma. La Figura 18, pista 2, muestra que el JA- 16 puede inmunoprecipitar el complejo latente de GDF-8 y el GDF-8 no procesado. Segundo, para determinar para determinar si el JA- 16 puede inmunoprecipitar un complejo formado entre GDF-8 y folistatina, se radiomarcaron con 35S-metionina y 35S-cisteína células CHO que expresaban folistatina. 100 µ? de medio acondicionado que contenían folistatina radiomarcada se mezclaron con GDF-8 maduro para formar un complejo de GDF-8 con folistatina. La mezcla se incubó con 1 mg/ml de JA- 16 durante 1 hora a 4 °C. Se agregó a la mezcla Sepharose de proteína A, la cual fue entonces incubada durante toda la noche a 4 °C. Se recolectó el inmunoprecipitado y se analizó como se describió anteriormente. La Figura 18, pista 6, muestra que el JA- 16 puede co-inmunoprecipitar folistatina radiomarcada y en forma de complejo con el GDF-8. Tercero, para determinar si el JA- 16 puede inmunoprecipitar proteína de GDF-8 maduro, se activó con ácido medio acondicionado procedente de células CHO que contenían complejo latente de GDF-8 radiomarcado, para disociar el propéptido de GDF-8 y GDF-8 maduro (ver Van Waarde et al. (1997) Analytical Biochemisiry, 247, 45-51). Este material se incubó posteriormente con JA-16 durante 1 hora a 4 °C. Se llevó a cabo el resto del protocolo como se describió anteriormente. La Figura 18, pista 3, muestra que el JA-16 puede inmunoprecipitar el GDF-8 maduro. Los resultados indican que el JA-16 puede reconocer el complejo latente de GDF-8, el complejo de GDF-8 :folistatina, y el GDF-8 maduro. En contraste, el Myo-19 no pudo unir ninguno de los complejos de GDF-8 (Figuras 18, pistas 4 y 7) y solo puede inmunoprecipitar GDF-8 maduro (Figura 18, pista 5).

Ejemplo 8: Caracterización de JA-16 In Vivo Con el objeto de determinar si el anticuerpo JA-16 aumenta la masa muscular en ratones adultos, se llevó a cabo un estudio in vivo con ratones BALB/c hembra de siete semanas de edad. Los ratones fueron pesados y se distribuyeron de manera uniforme con respecto a su peso corporal en grupos de siete u ocho. JA-16 en PBS o un anticuerpo empatado de isotipo para veneno de serpiente (control) se inyectó a los ratones en forma intraperitoneal a 50 mg/kg dos veces por semana. El tratamiento continuó durante 4 semanas. Los animales fueron evaluados en cuanto a la ganancia de masa corporal magra sometiéndolos a análisis dexascan antes y después del periodo de tratamiento. Se evaluó la masa muscular cortando y pesando el gastrocnemio y el cuadríceps. También se retiró la almohadilla de grasa peri-uterina y se pesó. Los resultados de este estudio indicaron que el JA-16 inhibe de manera importante la actividad del GDF-8 in vivo, resultando en una masa muscular incrementada (Figura 11). También se llevó a cabo un estudio más largo en el que los anticuerpos fueron administrados en forma intraperitoneal a 60 mg/kg/semana durante 14 semanas. Estos ratones se cargaron al comienzo del estudio con 60 mg/kg en forma intraperitoneal y 10 mg/kg en forma intravenosa. Los ratones en este estudio eran ratones C57BL macho que eran ya sea de tipo salvaje en el locus agutí (a) o portadores de la mutación amarilla letal (Ay) en ese locus. La mutación Ay causa el surgimiento de obesidad y diabetes en adultos, lo cual nos permitió determinar el efecto del JA-16 en músculo, grasa en exceso, y glucosa en sangre en un antecedente diabético. La masa corporal total se midió semanalmente (Figura 12). La masa de músculo se evaluó cortando y pesando el gastrocnemio y el cuadríceps (Figura 13). También se retiraron y pesaron las almohadillas de grasa epididimario e inguinal (Figura 14). Dos semanas en el estudio, los ratones se dejaron ayunar y se midieron los niveles de glucosa en sangre (Figura 15). Como con el estudio de cuatro semanas, los resultados de este estudio indican que el JA-16 inhibe la actividad del GDF-8 in vivo causando un aumento en la masa muscular. Además, este estudio indica que en ratones obesos y diabéticos, la inhibición del GDF-8 conduce a niveles mejorados de glucosa en sangre. La actividad in vivo del JA-16 también se comparó con la actividad in vivo de otro anticuerpo de GDF-8, Myo-19. Ratones C57B6/scid se inyectaron en forma intraperitoneal durante cinco semanas con control de vehículo o con dosis de carga de 60 mg/kg más 60 mg/kg por semana de JA-16 o Myo-19. Se midió la masa corporal total en forma semanal y se evaluó la masa muscular cortando y pesando el gastrocnemio y el cuadríceps (Figura 17). Si bien cinco semanas de tratamiento con JA-16 conduce a un aumento en la masa muscular, el tratamiento con Myo-19 no afectó la masa de músculo. En otro experimento, el tratamiento con Myo-19 se extendió a 10 y a 15 semanas, y no se observó aumento en la masa corporal ni en la masa muscular para estos periodos de tiempo. De esta manera, a pesar del hecho de que la información in vitro sugería que el JA-16 era un neutralizador más débil que el Myo-19, los estudios de ratón claramente, pero en forma inesperada, demuestran que el JA-16 reduce de manera efectiva la actividad del GDF-8 in vivo en tanto que el Myo-19 no lo hace. Estos resultados indican que el sitio específico en el GDF-8 al cual se une el JA-16 es único en que este sitio es responsable de la formación de un complejo de GDF-8: anticuerpo estable e inhibidor, in vivo. De esta manera, se espera que cualquier anticuerpo que se une específicamente a sitio, como se identificó en el Ejemplo 4, poseerá propiedades de neutralización in vivo similares a o mejores que las del JA- 16.

Ejemplo 9: El JA-16 Aumenta la Fuerza Muscular En los seres humanos, el tamaño y la fuerza del músculo disminuye en aproximadamente 1% por año comenzando en la tercera década de vida. Para muchas personas de avanzada edad, la pérdida de la masa del músculo es significativamente debilitante. Esta condición se conoce como sarcopenia, o pérdida de músculo relacionada con la edad. Con el fin de determinar si el tratamiento con anti-GDF-8 es efectivo contra la sarcopenia, ratones de avanzada edad (19 meses de edad al comienzo del estudio y de 21 meses de edad al final del estudio) se trataron con JA-16 durante 8 semanas a 60 mg/kg una vez a la semana. En el mismo experimento, ratones jóvenes (2 meses de edad al inicio del estudio y 4 meses de edad al final del estudio) se trataron con la misma dosis de JA-16. Al final del estudio, ambos grupos de ratones tuvieron mayor masa muscular que los controles tratados con vehículo como se aprecia, por ejemplo, a partir de la comparación de masa del cuadríceps (Figura 19A). Con el fin de confirmar que el aumento en el tamaño del músculo conduce a un incremento en la fuerza del músculo, se llevaron a cabo pruebas de fuerza de agarre con ratones envejecidos y jóvenes tratados con JA-16 durante ocho semanas usando un metro adquirido en Columbia Instruments (Columbus, Ohio; modelo 1027csx). Se permitió que los ratones agarraran y jalaran al agarrar y se registró la fuerza pico del jalón. Se probaron cinco veces ratones no entrenados, en forma sucesiva y sin descanso. Se registró la fuerza pico para cada prueba y los resultados de las cinco pruebas se promediaron para cada ratón. Después de siete semanas de tratamiento, la fuerza pico para los ratones jóvenes tratados con JA-16 fue 10% mayor y para los ratones de mayor edad y tratados con JA-16 fue 13% mayor que la fuerza pico de los ratones tratados con vehículo (Figura 19B). Además, las mediciones longitudinales tomadas antes y después de las siete semanas del tratamiento mostraron que la fuerza de los ratones de mayor edad se incrementó en 17% (p < 0.01) con el tratamiento con JA-16, en tanto que la fuerza de los ratones de mayor edad que fueron tratados con vehículo no cambió de manera importante 3.3%, p = 0.66). Estos resultados confirman que la inhibición del GDF-8 conduce a un aumento en el tamaño y fuerza del músculo tanto en ratones jóvenes como en ratones de mayor edad, y que puede ser una terapia útil en la sarcopenia.

Ejemplo 10: El JA-16 Aumenta la Masa y la Fuerza Muscular en Músculo Distrófico Se probó la capacidad de inhibición in vivo del GDF-8 para mejorar la distrofia muscular en el modelo de ratón mdx de distrofia muscular de Duchenne (DMD). El modelo DMD ha sido descrito, por ejemplo, por Torres et al. {Brain (1987) 110, 269-299) y Hoffman et al. {Science (1987) 238, 347-350). Se trataron ratones mdx de cuatro semanas de edad con inyecciones intraperitoneales semanales de JA-16 (60 mg kg), y vehículo solo (grupo de control) durante 3 meses. Para cuantificar el aumento de la masa muscular, los animales fueron sacrificados y se cortaron los músculos extensores digitorun longus (EDL) y se pesaron. Como se muestra en la Figura 20A, los músculos EDL del grupo de ratones tratados pesaron significativamente más que los del control. Es de notar que el aumento relativo en la masa muscular fue mayor que el aumento en el peso corporal como se muestra en la Figura 20B. De manera consistente con esta información, se encontró que otros grupos de músculos que incluyen el gastrocnemio, tibialis anterior y cuadríceps tuvieran aumentos similares en peso. Para cuantificar la producción de fuerza absoluta o la fuerza muscular, registramos la fuerza isométrica máxima producida a la despolarización del músculo usando electrodos de campo. Las Figuras 20C y 20D muestran que los ratones mdx tratados con JA-16 fueron capaces de ejercer una fuerza máxima significativamente mayor durante ya sea un tirón repentino o tétanos. El aumento en la fuerza muscular fue proporcional al aumento en la masa muscular (Figura 20A, 20C y 20D). Estos resultados ofrecen evidencia fisiológica para la eficacia terapéutica pronosticada de inhibidores del GDF-8 tales como el JA-16 en el tratamiento de distrofia muscular y enfermedades relacionadas. Para verificar de manera independiente el mejoramiento de fenotipo distrófico observado en los diafragmas de mdx, así como para averiguar el mejoramiento en el estado patológico de la musculatura esquelética de mdx in toto, analizamos los niveles de cinasa de Creatina de suero (CK) de estos ratones. Se notaron de manera consistente niveles de C extremadamente altos con deficiencia de distrofina en ratones mdx y seres humanos debido a daño del sarcolema (Bulfíeld et al. (1984) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 81, 1189-1 192 y Matsuda et al. (1995) J. Biochem (Tokio) 1 18, 959-64). Al inicio de la prueba tanto el grupo tratado como el grupo de control de ratones mdx tuvieron elevaciones marcadas de CK en suero en comparación con los ratones normales. Sin embargo, después de tres meses del bloqueo de miostatina in vivo se produjo un descenso dramático en los niveles de CK en suero de los ratones mdx tratados (Figura 4C). La disminución en la degeneración del músculo y la fibrosis acoplada con la reducción de la CK ofrece evidencia histológica y bioquímica de un mejoramiento funcional en músculo de mdx producido por el bloqueo de la miostatina in vivo.

Ejemplo 11: Papel del GDF-8 In Vivo en el Hueso Trabecular La carga mecánica aumentada, ya sea debido a actividad muscular aumentada o peso corporal disminuido, se asociada con una masa ósea y una densidad ósea aumentadas. Por tanto, se evaluaron ratones narcotizados (KO) de GDF-8 en cuanto a masa ósea alterada y microarquitectura. Una evaluación inicial de ratones adultos mostró que la densidad ósea en la espina de los ratones KO era casi dos veces más alta que la de sus congéneres de tipo salvaje. Este aumento excedió por mucho lo que podría haberse esperado que fuese solamente debido a la masa muscular aumentada en los ratones KO de GDF-8. Se utilizó la generación de imágenes microtomográficas de alta resolución (µ??40, Scanco Medical, Suiza) para evaluar la fracción del volumen del hueso trabecular y la microarquitectura en la quinta vértebra lumbar y la geometría del hueso femoral distante y cortical en la diáfisis media femoral de ratones adultos de tipo salvaje (WT) y ratones adultos KO de GDF-8. Se tomaron especímenes de ratones macho de GDF-8 y hembra KO de 9-10 meses de edad y controles de congéneres (cuatro ratones de cada genotipo y sexo). Se barrió el cuerpo vertebral completo y el fémur usando tomografía micro computerizada a una resolución de 12 um. Se identificaron las regiones de interés que abarcaban el hueso trabecular del cuerpo vertebral o el hueso trabecular de la metafisis femoral distante (esto es, espongiosa secundaria) usando un algoritmo de contorneo semi-automatizado. Se computaron los siguientes parámetros usando evaluaciones de tres dimensiones: fracción de volumen de hueso (%), espesor trabecular (µp?), separación (µ??) y número (1/mm). Además, se evaluó la densidad de la conectividad, un indicador de que también está conectada la red trabecular, así como parámetros de hueso cortical en la región diafisiaria media en el fémur, incluyendo área total, área de hueso y espesor cortical. Tanto los ratones KO macho como hembra tuvieron densidad ósea trabecular aumentada de manera dramática en el cuerpo vertebral en comparación con sus congéneres WT (n=4, +93% y +70%, respectivamente, p<0.0001). Esta densidad ósea trabecular aumentada estuvo acompañada de un aumento del 14% en el espesor trabecular (p=0.03), un aumento del 38% en el número trabecular (p=0.0002), y una disminución del 10% en la separación trabecular (p=0.009). El efecto combinado de estos cambios en la arquitectura y la densidad resultaron en un aumento del 3.4 y 1.7 veces en la conectividad en ratones KO macho y hembra, respectivamente, respecto a sus congéneres WT (pO.001). Además, una medición no fina del nivel de mineralización del hueso trabecular indicó que el contenido mineral promedio de las trabeculas era del 8% más alto en los ratones KO con relación a los controles (p<0.0001). Existe una indicación de que el efecto es mayor en los ratones macho que en los ratones hembra, pero el tamaño de la muestra es demasiado pequeño para sacar conclusiones definitivas. En la Tabla 1 se muestran las características del hueso trabecular vertebral evaluadas mediante tomografia micro computarizada de alta resolución. En contraste a las observaciones en la espina, los ratones KO macho y hembra tuvieron densidad ósea trabecular más baja en el fémur distante que sus congéneres WT (n=4, p=0.05 para efecto de genotipo total) (Tabla 2). Esta disminución en la densidad ósea fue más pronunciada en ratones KO hembra que en ratones KO macho. Los ratones KO de GDF-8 tuvieron espesor trabecular similar que sus congéneres WT, pero tuvieron menos trabeculas y separación trabecular aumentada en comparación con sus congéneres de control. Sin embargo, no obstante que el espesor cortical en la diálisis media femoral era similar en los ratones KO de GDF-8 macho y sus congéneres de control, fue aproximadamente 10% mayor en los ratones KO de GDF-8 hembra que sus congéneres WT (n=4, p=0.04) (Ver Tabla 3). No existieron diferencias en el área ósea cortical o en la fracción del área ósea entre los dos genotipos.

Tabla 1 : Características del Hueso Trabecular Vertebral (media ± SEM) WT macho KO macho WT hembra KO hembra Fracción de volumen óseo (%) 23.3 ± 4.7 45.0 ± 5.5 27.5 ± 5.5 46.9 ± 10.8 Espesor trabecular ípm) 52 ± 3 58 ± 6 52 ± 5 61 ± 8 Separación trabecular (µ?p) 210 ± 21 145 ± 8 183 ± 21 169 ± 41 Número trabecular (1/mm) 4.6 ± 0.4 7.0 ± 0.4 5.2 ± 0.4 6.6 ± 1.3 Densidad de conectividad d/mm3) 137 ± 15 470 ± 114 198 ± 29 339 ± 81 Grado de anisotropía 1.68 ± 0.08 1.29 ± 0.02 1.54 ± 0.12 1.34 ± 0.03 Tabla 2: Características del Hueso Trabecular en Metafisis Femoral Distante media ± SEM Tabla 3: Características del Hueso Cortical en la Diáfisis Femoral Media media ± SEM Ejemplo 12: Tratamiento de Desórdenes Degenerativos de Músculo y Óseos Los inhibidores de GDF-8 tales como, por ejemplo, los anticuerpos inhibidores, son útiles para tratamientos dirigidos a masa muscular incrementada, y también para la prevención y tratamiento de la osteoporosis. Además, la inhibición del GDF-8 puede ser útil en otras instancias en donde se desea un efecto anabólico óseo, tal como el aumento de la curación ósea (esto es, reparación de una fractura, fusión de la espina, etc.). Los anticuerpos de anti-GDF-8 de la invención se utilizan para tratar un sujeto en el surgimiento de una enfermedad o que tiene establecida una enfermedad degenerativa de músculo o hueso. La eficacia de los anticuerpos de anti-GDF-8 para el tratamiento de desórdenes óseos, por ejemplo, osteoporosis, se confirmó usando modelos bien establecidos de osteoporosis. Por ejemplo, se han utilizado ratones a los que se les han extirpado los ovarios para probar la eficacia de nuevos tratamientos con fármacos contra la osteoporosis (Alexander et al. (2001) J. Bone Min. Res. 16: 1665-1673; y Anderson et al. (2001) J. Endocrino!. 170: 529-537). De manera similar a los seres humanos, estos roedores presentan una rápida pérdida de hueso enseguida a la extirpación de los ovarios, especialmente en hueso canceloso. Las evaluaciones resultantes están basadas en densidad de minerales óseos, marcadores bioquímicos del cambio óseo en suero y orina, fuerza del hueso e histología/histomorfometría. En un estudio, a ratones hembra normales y/o comprometidos desde el punto de vsita inmunológico se les extirparon los ovarios a las 12-16 semanas de edad y se permitió que perdieran hueso durante de cuatro a seis semanas. En seguida a este periodo de pérdida de hueso, se llevó a cabo un tratamiento con un anticuerpo de anti-GDF-8 tal como JA-16 (inyección intraperitoneal) o vehículo durante de uno a seis meses. El protocolo de tratamiento pudo variar, con pruebas de diferentes dosis y regímenes de tratamiento (por ejemplo, inyecciones diarias, semanales, o quincenales). Se anticipó que los ratones (o ratas) con ovarios extirpados, no tratados, perderían aproximadamente 10-30% de densidad ósea con relación a los ratones intactos (esto es, sin haberles extirpado los ovarios) y de la misma edad. Se anticipó que los ratones tratados con el anticuerpo de anti-GDF-8 habrían tenido de 10 a 50% mayor masa ósea y densidad ósea que aquellos ratones que recibieron placebo, y más aún, que este incremento en la densidad ósea estaría asociado con un aumento en la fuerza del hueso, particularmente en regiones con una mayor proporción de hueso canceloso comparado con hueso cortical. El objetivo de otro estudio es el de demostrar que un anticuerpo de anti-GDF-8, tal como el JA-16 es efectivo en la prevención de la disminución de la masa ósea, la micro arquitectura y la fuerza asociada con la deficiencia de estrógeno. De esta manera, el estudio tiene un diseño similar a aquel descrito anteriormente, excepto porque el tratamiento con anticuerpo de anti-GDF-8 sería iniciado inmediatamente después de la extirpación de los ovarios, más que después del periodo de pérdida de hueso. Se anticipaba que los ratones tratados con el anticuerpo perderían significativamente menos masa ósea en seguida a la extirpación de los ovarios que los ratones tratados con vehículo. Los anticuerpos inhibidores contra el GDF-8 también son utilizados para prevenir y/o reducir la severidad y/o los síntomas de la enfermedad. Se anticipaba que los anticuerpos de anti-GDF-8 serían administrados como una inyección subcutánea con tanta frecuencia como una vez por día y de manera tan poco frecuente como una vez por mes. La duración del tratamiento podría variar entre un mes y varios años.

Para probar la eficacia clínica del anti-GDF-8 en seres humanos, se identificaron mujeres posmenopáusicas con baja masa ósea mediante pruebas de densidad ósea y se asignaron aleatoriamente a un grupo de tratamiento. Los grupos de tratamiento incluyen un grupo de placebo y de uno a tres grupos recibieron anticuerpos (diferentes dosis). Los individuos fueron seguidos prospectivamente durante de uno a tres años para evaluar los cambios en marcadores bioquímicos del cambio óseo, cambios en la densidad de minerales óseos, y en la ocurrencia de fracturas por fragilidad. Se anticipaba que los individuos que recibieron tratamiento presentarían un aumento en la densidad de minerales óseos en el fémur proximal y la espina lumbar de 2-30% con relación a la línea de referencia, y que tendrían una incidencia disminuida de fracturas por fragilidad. Se anticipaba que los marcadores bioquímicos de la formación de hueso aumentarían. Los anticuerpos se administraron como el único compuesto activo o en combinación con otro compuesto o composición. Cuando se administró como el único compuesto activo o en combinación con otro compuesto o composición, la dosis podía ser de entre aproximadamente 1 µg kg y 20 mg/kg, dependiendo de la severidad de los síntomas y del avance de la enfermedad. La dosis efectiva apropiada se seleccionó mediante un médico clínico tratante a partir de los siguientes intervalos: 1 µ¾?¾ y 20 mg/kg, 1 µg kg y 10 mg/kg, 1 µg/kg y 1 mg/kg, 10 µg kg y 1 mg/kg, 10 µg/kg y 100 µg/kg, 100 µg/kg y 1 mg/kg, y 500 µg/kg y 1 mg/kg. En la Tabla 4 se resumen regímenes de tratamiento, así como los resultados.

Tabla 4 Ejemplo 13: Tratamiento de Desórdenes Metabólicos Los inhibidores de GDF-8, tales como, por ejemplo anticuerpos inhibidores, son útiles para el tratamiento de desórdenes metabólicos tales como diabetes tipo 2, tolerancia disminuida a la glucosa, síndrome metabólico (por ejemplo, síndrome X), resistencia a la insulina inducida por trauma (por ejemplo quemaduras) y desórdenes del tejido adiposo (por ejemplo, obesidad). Los anticuerpos de anti-GDF-8 de la invención se utilizan para tratar un sujeto en el surgimiento de una enfermedad o que tiene establecida una enfermedad metabólica. La eficiencia de los anticuerpos de anti-GDF-8 para el tratamiento de desórdenes metabólicos, por ejemplo, diabetes tipo 2 y/u obesidad, se confirmó usando modelos de murino bien establecidos de obesidad, resistencia a la insulina y diabetes tipo 2, incluyendo ob/ob, db/db, y cepas portadoras del la mutación amarilla letal. La resistencia a la insulina también es inducida mediante alimentación alta en grasas o calorías de ciertas cepas de ratones que incluyen C57BL/6J. De manera similar a los humanos, estos roedores desarrollaron resistencia a la insulina, hiperinsulinemia, dislipidemia y deterioro de la homeostasis de la glucosa resultante en hiperglicemia. Las evaluaciones resultantes están basadas en mediciones de la glucosa en suero, insulina y lípidos. La sensibilidad mejorada a la insulina puede determinarse mediante pruebas de tolerancia a la insulina y pruebas de tolerancia a la glucosa. Técnicas más sensibles incluirían el uso de pinzas euglicémicas-hiperinsulinémicas para evaluar las mejoras en el control glicénco y la sensibilidad a la insulina. Además, las técnicas de pinza permitirían una evaluación cuantitativa del papel de los tejidos principales en los que se deposita la glucosa (por ejemplo, muscular, adiposo e hígado) en el control glicénco mejorado. En un estudio, el tratamiento con anticuerpos de anti-GDF-8, tales como JA-16 (inyección intraperitoneal) o vehículo, se llevó a cabo durante de una semana a seis meses. El protocolo de tratamiento pudo variar, con pruebas de diferentes dosis y regímenes de tratamiento (por ejemplo, diariamente, semanalmente o quincenalmente). Se anticipó que los ratones tratados con el anticuerpo de anti-GDF-8 tendrían mayor absorción de glucosa, glicólisis incrementada y síntesis de glucógeno, menos ácidos grasos libres y triglicéridos en el suero en comparación con los ratones que recibieron tratamiento con placebo. Los anticuerpos inhibidores contra el GDF-8 también son útiles para prevenir y/o reducir la severidad y/o los síntomas de la enfermedad. Se anticipaba que los anticuerpos de anti-GDF-8 serían administrados como una inyección subcutánea tan frecuentemente como una vez por día y tan infrecuentemente como una vez por mes. La duración del tratamiento podría variar entre un mes y varios meses. Para probar la eficacia clínica del anti-GDF-8 en seres humanos, se identificaron sujetos que padecían de o que estaban en riego de diabetes tipo 2 y se asignaron aleatoriamente a un grupo de tratamiento. Los grupos de tratamiento incluían un grupo de placebo y de uno a tres grupos recibieron anticuerpo (dosis diferentes). Los individuos fueron seguidos prospectivamente durante de un mes a tres años para evaluar los cambios en el metabolismo de la glucosa. Se anticipaba que los individuos que recibieron tratamiento presentarían un mejoramiento. Los anticuerpos son administrados como el único componente activo o en combinación con otro compuesto o composición. Cuando se administró como el único compuesto activo o en combinación con otro compuesto o composición, la dosificación puede ser de entre aproximadamente 1 ,ug/ g y 20 mg/Kg, dependiendo de la severidad de los síntomas y del avance de la enfermedad. La dosis efectiva apropiada se seleccionó por el médico tratante a partir de los siguientes intervalos: 1 µg y 20 mg/Kg, 1 y 10 mg/Kg, 1 µg y 1 mg/Kg, 10 µg y 1 mg/Kg, 10 g y 100 µg/ g, 100 ig y 1 mg/Kg, y 500 µg y 1 mg/Kg. Los regímenes de tratamiento ejemplares y los resultados se resumen en la Tabla 5.

Tabla 5: Ejemplos de Casos Clínicos Paciente No. Estado entes del Régimen de Tratamiento Resultado Tratamiento Sin signos clínicos, 0.01-1 mgíKg cada 4 Prevención de diabetes Paciente 1 Historia familiar de semanas durante 48 tipo 2 diabetes tipo 2 semanas Tolerancia a la insulina 0.01-20 mglKg semanal metabolismo de la glucosa Paciente 2 Signos clínicos leves, de por más de 4 semanas mejorados , y presión síndrome X Sanguínea más baja Mejoramiento de los signos clínicos, reducción en la Paciente 3 Etapa avanzada de 0.01-20 mg/Kg dos veces severidad de los síntomas diabetes tipo 2 por semana durante 6 o y/o aumento de la más semanas proporción masa muscular/grasa corporal Mejoramiento de los signos 0.01-20 mg/Kg clínicos, reducción en la Pacíante 4 Severa resistencia a diariamente por 6 o más severidad de los síntomas insulina y/u obesidad semanas y/o disminución de la grasa Corporal

Claims

Novedad de la Invención 1. Un anticuerpo aislado que se une de manera específica a una proteína de GDF-8, en donde la proteína de GDF-8 comprende la secuencia de aminoácidos Asp-Glu-His-Xaa-Thr (SEQ ID NO: 2), en donde Xaa es Ala, Gly, His, Met, Asn, Arg, Ser, Thr o Trp, y en donde el anticuerpo reduce una o más actividades biológicas asociadas con la proteína de GDF-8, con relación a una proteína de GDF-8 que no se une al mismo anticuerpo. 2. El anticuerpo de la reivindicación 1, en donde el anticuerpo se une a la región desde el aminoácido 1 hasta el aminoácido 50 de la secuencia de la proteína del GDF-8. 3. El anticuerpo de la reivindicación 1, en donde el anticuerpo se une a la región desde el aminoácido 1 hasta el aminoácido 25 de la secuencia de la proteína del GDF-8. 4. El anticuerpo de la reivindicación 1, en donde el anticuerpo se une a la secuencia de aminoácidos Asp-Phe-Gly-Leu-Asp-Cys-Asp-Glu-His-Xaa-Thr-Glu-Ser-Arg-Cys (SEQ ID NO:5) en la proteína del GDF-8, en donde Xaa es Ala, Gly, His, Met, Asn, Arg, Ser, Thr o Trp. 5. El anticuerpo de la reivindicación 1, en donde el anticuerpo se une a la secuencia de aminoácidos Asp-Phe-Gly-Leu-Asp-Cys-Asp-Glu-His-Ser-Thr-Glu-Ser-Arg-Cys (SEQ ID NO:8) en una proteína del GDF-8. 6. El anticuerpo de la reivindicación 1, en donde el anticuerpo se une a la secuencia de aminoácidos Asp-Glu-His-Ser-Thr (SEQ ID NO:3) en la proteína del GDF-8. 7. El anticuerpo de la reivindicación 1, en donde la proteína del GDF-8 comprende una secuencia de aminoácidos que es cuando menos 75% idéntica a la SEQ ID NO:15. 8. El anticuerpo de la reivindicación 7, en donde la proteína del GDF-8 es la SEQ ID NO: 15. 9. El anticuerpo de la reivindicación 1, en donde el anticuerpo reconoce el complejo latente del GDF-8, complejo de GDF-8 con folistatina, o GDF-8 en un complejo con una proteína relacionada con la folistatina. 10. El anticuerpo de la reivindicación 1, en donde el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal. 11. El anticuerpo de la reivindicación 10, en donde el anticuerpo es el anticuerpo monoclonal JA-16 producido mediante una célula que tiene el Número de Designación de Depósito ATCC PTA-4236. 12. Una célula que produce el anticuerpo monoclonal de la reivindicación 10. 13. Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo de la reivindicación 1. 14. La composición de la reivindicación 13, la cual además comprende un excipiente farmacéuticamente aceptable. 15. Un método para el tratamiento de un paciente que padece un desorden médico, en donde el paciente se beneficiaría terapéuticamente con un aumento en la masa de tejido muscular, el cual comprende; la administración a un mamífero, de una dosis terapéuticamente efectiva de un anticuerpo que es capaz de unirse específicamente a una proteína de GDF-8, en donde la proteína de GDF-8 comprende la secuencia de aminoácidos Asp-Glu-His-Xaa-Thr (SEQ ID NO:2), en donde Xaa es Ala, Gly, His, Met, Asn, Arg, Ser, Thr o Trp, y en donde el anticuerpo reduce una o más actividades biológicas asociadas con la proteína de GDF-8 en el paciente, con relación a un paciente que no recibe el mismo anticuerpo. 16. El método de la reivindicación 15, en donde el anticuerpo se une a la proteína de GDF-8 en la región desde el aminoácido 1 hasta el aminoácido 50 de la secuencia de la proteína del GDF-8. 17. El método de la reivindicación 15, en donde el anticuerpo se une a la proteína de GDF-8 en la región desde el aminoácido 1 hasta el aminoácido 25 de la secuencia de la proteína del GDF-8. 18. El método de la reivindicación 15, en donde el anticuerpo se une a la secuencia de aminoácidos Asp-Phe-Gly-Leu-Asp-Cys-Asp-Glu-His-Xaa-Thr-Glu-Ser-Arg-Cys (SEQ ID N0:5) en la proteína del GDF-8, en donde Xaa es Ala, Gly, His, Met, Asn, Arg, Ser, Thr o Trp. 19. El método de la reivindicación 15, en donde el anticuerpo se une a la secuencia de aminoácidos Asp-Phe-Gly-Leu-Asp-Cys-Asp-Glu-His-Ser-Thr-Glu-Ser-Arg-Cys (SEQ ID NO: 8) en una pro teína del GDF-8. 20. El método de la reivindicación 15, en donde el anticuerpo se une a la secuencia de aminoácidos Asp-Glu-His-Ser-Thr (SEQ ID NO:3) en la proteína del GDF-8. 21. El método de la reivindicación 15, en donde la proteína del GDF-8 comprende una secuencia de aminoácidos que es cuando menos 75% idéntica a la SEQ ID NO: 15. 22. El método de la reivindicación 15, en donde la proteína del GDF-8 es la SEQ ID NO: 15. 23. El método de la reivindicación 15, en donde el anticuerpo reconoce el complejo latente del GDF-8, complejo de GDF-8 con folistatina, o GDF-8 en un complejo con una proteína relacionada con la folistatina. 24. El método de la reivindicación 15, en donde el anticuerpo es el anticuerpo monoclonal JA-16 producido mediante una célula que tiene el Número de Designación de Depósito ATCC PTA-4236. 25. El método de la reivindicación 15, en donde el desorden médico es un desorden muscular, desorden neuromuscular, desorden del tejido adiposo, diabetes o desorden óseo degenerativo. 26. El método de la reivindicación 15, en donde el desorden médico es un desorden muscular o desorden neuromuscular. 27. El método de la reivindicación 15, en donde el desorden médico es distrofia muscular, atrofia muscular, enfermedad pulmonar obstructiva congestiva, síndrome de emaciación muscular, sarcopenia o caquexia. 28. El método de la reivindicación 15, en donde el desorden médico es distrofia muscular. 29. El método de la reivindicación 15, en donde el desorden médico es obesidad, diabetes tipo 2, u osteoporosis. 30. Una célula que produce el anticuerpo monoclonal de la reivindicación 1. 31. Un ácido nucleico que codifica para el anticuerpo de la reivindicación 1. 32. Un equipo de diagnóstico que comprende el anticuerpo de la reivindicación 33. Un anticuerpo producido mediante la célula que tiene el Número de Designación de Depósito ATCC PTA-4236. 34. Un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos cuando menos 85% idéntica a la SEQ ID NO: 1. 35. El anticuerpo de la reivindicación 34, en donde la secuencia de aminoácidos es la SEQ ID NO: 1. 36. Un ácido nucleico que codifica para una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos cuando menos 85% idéntica a la SEQ ID NO: 1. 37 El ácido nucleico de la reivindicación 36, en donde la molécula del ácido nucleico comprende la SEQ ID NO: 6. 38. Un anticuerpo aislado que específicamente se une a una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos como se establece en la SEQ ID NO: 2. 39. El anticuerpo de la reivindicación 38, en donde el anticuerpo se une específicamente a una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos como se establece en la SEQ ID NO: 3. 40. El anticuerpo de la reivindicación 38, en donde el anticuerpo se une específicamente a una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos como se establece en la SEQ ID NO: 5. 41. El anticuerpo de la reivindicación 40, en donde el anticuerpo se une específicamente a una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos como se establece en la SEQ ID NO: 18. 42. El anticuerpo de la reivindicación 38, el cual se prepara utilizando una línea celular con el Número de Designación de Depósito ATCC PTA-4236. 43. El anticuerpo de la reivindicación 38, el cual comprende cuando menos una CDR de cadena sencilla seleccionada de los aminoácidos 30-35 de la SEQ ID NO: 1., aminoácidos 50-66 de la SEQ ID NO: 1, y aminoácidos 99-102 de la SEQ ID NO: 1. 44. Un método para aumentar la masa muscular, dicho método comprendiendo la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva del anticuerpo de la reivindicación 38 a un mamífero, incrementando de esta manera la masa muscular. 45. Un método para aumentar la densidad ósea trabecular, dicho método comprendiendo la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva del anticuerpo de la reivindicación 38 a un mamífero, incrementando de esta manera la densidad ósea trabecular. 46. Un método para aumentar la fuerza muscular, dicho método comprendiendo la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva del anticuerpo de la reivindicación 38 a un mamífero, incrementando de esta manera la fuerza muscular. 47. Un ácido nucleico que codifica para el anticuerpo de la reivindicación 38. 48. Un método para inhibir la actividad del GDF-8, el cual comprende el proveer el anticuerpo de la reivindicación 1 y permitir que éste inhiba la actividad del GDF-8. 49. Un anticuerpo aislado que específicamente se une a una proteína, en donde la proteína comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 9. 50. El anticuerpo de la reivindicación 49, en donde la proteína es B P-11 o un fragmento de ésta. 51. El anticuerpo de la reivindicación 49, el cual se prepara utilizando una línea celular con el Número de Designación de Depósito ATCC PTA-4236. 52. Un método para aumentar la masa muscular, dicho método comprendiendo la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva del anticuerpo de la reivindicación 49 a un mamífero, incrementando de esta manera la masa muscular. 53. Un método para aumentar la densidad ósea trabecular, dicho método comprendiendo la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva del anticuerpo de la reivindicación 49 a un mamífero, incrementando de esta manera la densidad ósea trabecular. 54. Un método para aumentar la fuerza muscular, dicho método comprendiendo la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva del anticuerpo de la reivindicación 49 a un mamífero, incrementando de esta manera la fuerza muscular.