BR122020010360B1 - Uso da proteína de ligação a antígeno isolada que se liga especificamente ao receptor do peptídeo relacionado ao gene da calcitonina humano - Google Patents

Uso da proteína de ligação a antígeno isolada que se liga especificamente ao receptor do peptídeo relacionado ao gene da calcitonina humano Download PDF

Info

Publication number
BR122020010360B1
BR122020010360B1 BR122020010360-4A BR122020010360A BR122020010360B1 BR 122020010360 B1 BR122020010360 B1 BR 122020010360B1 BR 122020010360 A BR122020010360 A BR 122020010360A BR 122020010360 B1 BR122020010360 B1 BR 122020010360B1
Authority
BR
Brazil
Prior art keywords
group
seq
antigen
sequence
amino acid
Prior art date
Application number
BR122020010360-4A
Other languages
English (en)
Inventor
Thomas C. Boone
David W. Brankow
Colin V. Gegg, Jr.
Shaw-Fen Sylvia Hu
Chadwick T. King
Hsieng Sen Lu
Licheng Shi
Cen Xu
Original Assignee
Amgen Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Amgen Inc filed Critical Amgen Inc
Publication of BR122020010360B1 publication Critical patent/BR122020010360B1/pt

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2869—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against hormone receptors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/04—Centrally acting analgesics, e.g. opioids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/06—Antimigraine agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/515—Animal cells
    • A61K2039/5156—Animal cells expressing foreign proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/32—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency specific for a neo-epitope on a complex, e.g. antibody-antigen or ligand-receptor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Cardiology (AREA)

Abstract

Proteínas de ligação a antígeno que se ligam ao receptor CGRP humano (CGRP R) são fornecidas. Ácidos nucléicos codificando a proteína de ligação a antígeno, vetores e células codificando os mesmos também são fornecidos. As proteínas de ligação a antígeno podem inibir a ligação de CGRP R a CGRP, e são úteis em uma série de distúrbios relacionados a CGRP R, incluindo o tratamento e/ou a prevenção de dores de cabeça de enxaqueca.

Description

FUNDAMENTOS
[001] O presente pedido contém uma Listagem de Sequências que foi submetida via EFS-Web e é aqui incorporada por referência em sua totalidade. A referida cópia ASCII, criada em 14 de Dezembro de 2009, é nomeada A1472PCT.txt, e tem 312,447 bytes de tamanho.
[002] A superfamília de calcitonina dos peptídeos inclui pelo menos cinco membros conhecidos: a calcitonina, amilina, adrenomedulina, e dois peptídeos relacionados ao gene da calcitonina ("CGRP"), o CGRP1 (também conhecido como ctCGRP, ou CGRP) e o CGRP2 (também conhecido como βCGRP). O CGRP é um neuropeptídeo vasoativo com 37 aminoácidos expressos em ambos os sistemas nervoso periférico e central, e tem se mostrado um potente vasodilatador na periferia, onde os neurônios contendo CGRP estão intimamente associados com os vasos sanguíneos. A vasodilatação mediada poCGRP R também está associada com inflamação neurogênica, como parte de uma cascata de eventos que resulta em extravasamento do plasma e vasodilatação da microvasculatura e está presente na enxaqueca. A amilina também tem sítios de ligação específicos no SNC e é considerada para regular o esvaziamento gástrico e têm um papel no metabolismo de carboidratos. A adrenomedulina é um potente vasodilatador. A adrenomedulina tem receptores específicos em astrócitos e seu RNA mensageiro é sobreregulado nos tecidos do SNC que estão sujeitos à isquemia. (Zimmermann, et al., Identification of adrenomedullin receptors in cultured rat astrocytes e in neuroblastoma glioma hybrid cells (NG108- 15), Brain Res., 724:238-245 (1996); Wang et al., Discovery of adrenomedullin in rat ischemic cortex e evidence for its role in exacerbating focal brain ischemic damage, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:11480-11484 (1995)).
[003] A calcitonina está envolvida no controle do metabolismo ósseo e é também ativa no sistema nervoso central (SNC). As atividades biológicas de CGRP incluem a regulação das junções neuromusculares, da apresentação de antígenos no sistema imunológico, do tônus vascular e da neurotransmissão sensorial. (Poyner, D. R., Calcitonin gene-related peptide: multiple actions, multiple receptors, Pharmacol. Ther., 56:23-51 (1992); Muff et al., Calcitonin, calcitonin gene related peptide, adrenomedullin e amylin: homologous peptides, separate receptors e overlapping biological actions, Eur. J. Endocrinol., 133: 17-20 (1995)). Três peptídeos estimulantes do receptor da calcitonina (CRSPs) também foram identificados em uma série de espécies de mamíferos, os CRSPs podem formar uma nova subfamília da família de CGRP. (Katafuchi, T e Minamino, N, Structure e biological properties of three calcitonin receptorstimulating peptides, novel members of the calcitonin gene- related peptide family, Peptides, 25(11):2039-2045 (2004)).
[004] Os peptídeos da superfamília da calcitonina agem através de sete receptores acoplados à proteína-G do domínio transmembrana (GPCRs). O receptor da calcitonina ("CT", "CTR" ou "receptor CT") e receptores de CGRP são GPCRs do tipo II ("família B"), cuja família inclui outros GPCRs que reconhecem os peptídeos reguladores, como a secretina, glucagon e polipeptídeo intestinal vasoativo (VIP). As variantes de splice melhor caracterizadas do receptor da calcitonina humana diferem dependendo da presença (anteriormente CTRII + ou CTR1, agora conhecido como CT(b)) ou ausência (a principal variante de junção, anteriormente CTRII ou CTR2, agora conhecido como CT(a)) com 16 aminoácidos na primeira alça intracelular. (Gorn et al., Expression of two human skeletal calcitonin receptor isoforms cloned from a giant cell tumor of bone: the first intracellular domain modulates ligand binding e signal transduction, J. Clin. Invest., 95:2680-2691 (1995); Hay et al., Amylin receptors: molecular composition e pharmacology, Biochem. Soc. Trans., 32:865-867 (2004); Poyner et al., 2002). A existência de pelo menos dois subtipos de receptores de CGRP foi proposta a partir de afinidades antagonistas diferenciais e potências agonista em uma variedade de bioensaios in vivo e in vitro. (Dennis et al., CGRP8-37, A calcitonin gene-related peptide antagonist revealing calcitonin gene-related peptide receptor heterogeneity in brain e periphery, J. Pharmacol. Exp. Ther., 254:123-128 (1990); Dennis et al., Structure activity profile of calcitonin gene-related peptide in peripheral e brain tissues. Evidence for multiplicity, J. Pharmacol. Exp. Ther., 251:718-725 (1989); Dumont et al., A potent e seletive CGRP2 agonist, [Cys(Et)2,7]hCGRP: comparison in prototypical CGRP1 e CGRP2 in vitro assays, Can. J. Physiol. Pharmacol., 75:671-676 (1997)).
[005] O subtipo do receptoCGRP R1 foi verificado ser sensível ao fragmento CGRP (8-37) antagonista. (Chiba et al., Calcitonin gene-related peptide receptor antagonist human CGRP-(8-37), Am. J. Physiol., 256:E331-E335 (1989); Dennis et al. (1990); Mimeault et al., Comparative affinities e antagonistic potencies of various human calcitonin gene- related peptide fragments on calcitonin gene-related peptide receptors in brain e periphery, J. Pharmacol. Exp. Ther., 258:1084-1090 (1991)). Por outro lado, o receptoCGRP R2 foi sensível aos análogos de CGRP humana linear (hCGRP), em que os resíduos de cisteína nas posições 2 e 7 foram derivatizados (por exemplo, com acetoaminometil [Cys (ACM) 2,7] etilamida ou [Cys (Et) 2,7]), mas o receptoCGRP R2 foi insensível ao fragmento (8-37) CGRP. (Dennis et al (1989);. Dennis et al (1990);. Dumont et al (1997)).
[006] A especificidade do ligante do receptor da calcitonina e do receptor tipo calcitonina ("CL", "CLR" ou "CRLR") depende da coexpressão de membros de uma família de proteínas acessórias chamadas proteínas modificadoras da atividade do receptor (RAMPs). A família de RAMP inclui três polipeptídeos (RAMP1, RAMP2 e RAMP3) que atuam como moduladores do receptor que determinam a especificidade do ligante de receptores para os membros da família da calcitonina. As RAMPs são proteínas transmembrana tipo I que compartilham cerca de 30% de identidade de sequência de aminoácidos e uma topologia prevista comum, com terminal-C citoplasmático curto, um domínio transmembrana e terminal-N extracelular grande, que são responsáveis pela especificidade (McLatchie et al., (1998) RAMPs regulate the transport e ligand specificity of the calcitonin-receptorlike receptor, Nature, 393:333-339; Fraser et al., (1999)). O terminal amino das proteínas modificadoras da atividade do receptor é um determinante crítico do estado de glicosilação e ligação do ligando do receptor tipo receptor da calcitonina, Molecular Pharmacology, 55:1054-1059).
[007] Em 1998, o receptoCGRP R1 foi identificado como um heterodímero composto de uma nova proteína acessória de domínio transmembrana único, a proteína 1 modificadora da atividade do receptor (RAMP1), e CRLR. (McLatchie et al., supra). Os experimentos de reticulação sugeriram que o receptor de CGRP consistia em um arranjo estequiométrico uma-um de CRLR e RAMP1 (Hilairet et al. JBC 276, 42182-42190 (2001)), estudos mais recentes usando diversas metodologias, tais como BRET e BiFC revelaram que o complexo do receptor de CGRP funcional pode ser composto de homo-oligômero assimétrico de CRLR e monômero de RAMP1 (Heroux et al. JBC 282, 31610-31620 (2007)).
[008] Um domínio N-terminal de CRLR purificado demonstrou se ligar especificamente a 125I-CGRP (Chauhan et al. Biochemistry 44, 782 (2005)), confirmando a importante e direta interação entre o CRLR com ligante CGRP. Em particular, acredita-se que a Leu 24 e Leu 34 de CRLR constituem o sítio de ancoragem do Phe37 C-terminal de CGRP (Banerjee et al. BMC Pharmacol. 6, 9 (2006)). Além disso, Koller et al. (FEBS Lett 531, 464-468 (2002)) obtiveram evidências de que os 18 resíduos de aminoácidos do N- terminal de CRLR contribuem com a interação seletiva com CGRP ou adrenomedulina e Ittner et al. (Biochemistry 44, 5749-5754 (2005) ) sugeriram que 23 a 60 resíduos de aminoácido no N-terminal de CRLR medeiam a associação com RAMP1.
[009] A análise da função da estrutura de RAMP1 identificou os 91 a 103 resíduos, os quais se correlacionam com a "hélice 3" (Simms et al Biophys J. 91, 662 -669 (2006)), como potencialmente significativos na interação com CRLR, e os resíduos Trp74 e Phe92 como potencialmente interagindo com o ligante CGRP em relação com sua ligação ao complexo do receptoCGRP R. Estudos de ligação ao ligante usando uma quimera de RAMP1 humano/rato sugerem que o sítio de ligação para determinados inibidores de molécula pequena de CGRP R (por exemplo, BIBN4096BS), está localizada dentro de uma região que inclui 66-102 aminoácidos de RAMP1 (Mallee et al. JBC 277, 14294-14298 (2002)).
[010] O CRLR tem 55% de identidade de sequências de aminoácidos globais com CTR, embora os domínios transmembrana sejam quase 80% idênticos. (McLatchie et al. (1998); Poyner et al., International union of pharmacology. XXXII. The mammalian calcitonin gene-related peptides, adrenomedullin, amylin e calcitonin receptors, Pharmacol. Rev., 54:233-246 (2002)) .
[011] O CRLR mostrou formar um receptor de alta afinidade para CGRP, quando associado a RAMP1, ou, preferencialmente se ligar a adrenomedulina quando associado a RAMP2 ou RAMP3. (McLatchie et al. (1998); Sexton et al., Receptor activity modifying proteins, Cellular Signaling, 13:73-83 (2001); Conner et al., Interaction of calcitoningene-related peptide with its receptors, Biochemical Society Transactions 30(Parte 4): 451-454 (2002)). O estado de glicosilação CRLR está associado à sua farmacologia. As RAMPs 1, 2 e 3 transportam p CRLR para a membrana plasmática com eficiências semelhantes, porém a RAMP1 apresenta CRLR como uma glicoproteína madura terminalmente glicosilada, e um receptor de CGRP, enquanto que as RAMPS 2 e 3 apresentam o CRLR como um receptor de adrenomedulina com núcleo glicosilado, imaturo, ("AM "ou" AMR" ou "receptor AM". (Fraser et al. (1999)). A caracterização de receptores CRLR/RAMP2 e CRLR/RAMP3 nas células HEK293T por ligação radioligante (125I-adrenomedulina como radioligante), ensaio funcional (medição de cAMP), ou análise bioquímica (SDS- eletroforese em gel de poliacrilamida) revelou que eles são indistinguíveis, apesar da RAMP2 e 3 compartilhar a apenas 30% de identidade de sequência de aminoácidos. (Fraser et al. 1999)). As diferenças foram observadas, no entanto, na farmacologia para CRLR expresso com RAMP 2 versus RAMP 3. Ambos CGRP e CGRP8-37, bem como a adrenomedulina e os 22-52 peptídeos AM derivados de adrenomedulina, são ativos no heterodímero de RAMP 3, indicando que este complexo pode atuar tanto como uma CGRP quanto como um receptor AM. (Howitt et al, British Journal of Pharmacology, 140:477-486 (2003); Muff et al, Hypertens Res, 26: S3-S8 (2003)). A Coexpressão de CRLR humano com rato RAMP1, e vice-versa, sugeriu que as espécies de RAMP1 determinaram as características farmacológicas do complexo CRLR/RAMP1 com respeito aos antagonistas de receptor de CGRP de pequenas moléculas testados. (Mallee et al., Receptor Activity-Modifying Protein 1 determines the species seletivity of non-peptide CGRP receptor antagonists, J. Biol. Chem., 277(16):14294- 14298 (2002)). A menos que não associado a uma RAMP, o CRLR não é conhecido por se ligar a qualquer ligante endógeno; este é atualmente o único entendimento sobre GPCR a se comportar desta forma. (Conner et al., A key role for transmembrane prolines in calcitonin receptor-like agonist binding e signaling: implications for family B G-protein- coupled receptors, Molec. Pharmacol., 67(1):20-31 (2005)) .
[012] O receptor da calcitonina (CT) também demonstrou formar complexos heterodiméricos com RAMPS, que são conhecidos como receptores de amilina ("AMY", "AMY R" ou "receptor AMY"). Geralmente, os receptores CT/RAMP1 (referidos como "AMY1" ou "AMY1") têm alta afinidade para calcitonina de salmão, amilina e CGRP, e menor afinidade por calcitoninas de mamíferos. Para os receptores CT/RAMP2 ("AMY2" ou "AMY2") e receptores CT/RAMP3 ("AMY3" ou "AMY3"), um padrão similar é principalmente observado, apesar da afinidade de CGRP é menor e não poder ser significativa em concentrações fisiologicamente relevantes de ligante. O fenótipo do receptor preciso depende do tipo de célula e da variante de junção de CTR (CT(a) ou CT(b)), particularmente para os receptores de amilina gerados por RAMP2. Por exemplo, uma população pura de células tipo osteoclasto supostamente expressaram RAMP2, CTR, e CRLR, mas não a RAMP1 ou RAMP3. (Hay et al. (2004); Christopoulos et al., Multiple amylin receptors arise from receptor activity-modifying protein interaction with the calcitonin receptor gene product, Molecular Pharmacology, 56:235-242 (1999); Muff et al., An amylin receptor is revealed following co-transfection of a calcitonin receptor with receptor activity modifying proteins-1 or -3, Endocrinology, 140:2924-2927 (1999); Sexton et al. (2001); Leuthauser et al., Receptor-activity-modifying protein 1 forms heterodimers with two G-protein- coupled receptors to define ligand recognition, Biochem. J., 351:347-351 (2000); Tilakaratne et al., Amylin receptor phenotypes derived from human calcitonin receptor/RAMP co-expression exhibit pharmacological differences dependent on receptor isoform e host cell environment, J. Pharmacol. Exp. Ther., 294:61-72 (2000); Nakamura et al., Osteoclast-like cells express receptor activity modifying protein 2: application of laser capture microdissection, J. Molec. Endocrinol., 34:257-261 (2005)).
[013] A tabela 1, abaixo, resume a relação dos componentes de receptores discutidos acima. Tabela 1 Componente do Receptor CRLR (CL) CT (receptor calcitonina) RAMP1 receptoCGRP R receptor AMY1 RAMP2 receptor AM1 receptor AMY2 RAMP3 receptor AM2 receptor AMY3
Figure img0001
[014] Usos terapêuticos dos antagonistas de CGRP têm sido propostos. Noda et al. descreveram o uso de derivados de CGRP ou CGRP para inibir a agregação plaquetária e para o tratamento ou prevenção de arteriosclerose ou trombose. (EP 0385712 B1). Liu et al. Divulgaram agentes terapêuticos que modulam a atividade de CTR, incluindo peptídeos conjugados a veículo tais como a calcitonina e αCGRP humana. (WO 01/83526 A2; EUA 2002/0090646 A1). Os antagonistas de peptídeo CGRP vasoativos e seu uso em um método para inibir a ligação de CGRP aos receptores de CGRP foram divulgados por Smith et al;. Os antagonistas de peptídeo CGRP mostraram inibir a ligação de CGRP às membranas da artéria coronária e relaxar as artérias coronárias do porco tratadas com capsaicina. (Patente US 6.268.474 B1; e Patente US 6.756.205). Rist et al. divulgaram peptídeos análogos com atividade antagonista do receptor de CGRP e seu uso em um medicamento para o tratamento e profilaxia de uma variedade de distúrbios. (DE 19732944 A1).
[015] O CGRP é um potente vasodilatador que tem sido implicado na patologia de uma série de sintomas vasomotores, tais como todas as formas de cefaleia vascular, incluindo enxaqueca (com ou sem aura) e cefaleia em salvas. Durham, N. Engl. J. Med. 350:1073-1 075 de 2004. A fisiopatologia da enxaqueca envolve a ativação dos gânglios trigêmeos, onde o CGRP é localizado, e os níveis de CGRP aumentam significativamente durante uma crise de enxaqueca. Este, por sua vez, promove a dilatação dos vasos sanguíneos cranianos e inflamação e sensibilização neurogênica. (Doods, H., Curr. Opin. Investig. Drugs, 2:1261-1268 (2001)). Além disso, os níveis séricos de CGRP na veia jugular externa são elevados em pacientes durante a enxaqueca. Goadsby et al., Ann. Neurol. 28:183-7, 1990. Administração intravenosa de ci-CGRP humano induziu cefaleia e enxaqueca em pacientes que sofrem de enxaqueca sem aura, suportando a visão de que CGRP tem um papel causal na enxaqueca (Lassen et al, Cephalalgia 22:5461, 2002).
[016] A enxaqueca é uma condição neurológica complexa, comum que se caracteriza por ataques episódicos graves de cefaleia e aspectos associados, que podem incluir náuseas, vômitos, sensibilidade à luz, som ou movimento. Em alguns pacientes, a cefaleia é precedida ou acompanhada por uma aura. A cefaleia pode ser grave e também pode ser unilateral em determinados pacientes. Os ataques de enxaqueca são prejudiciais à vida diária. Nos EUA e Europa Ocidental, a prevalência global de pacientes com enxaqueca é de 11% da população geral (6% do sexo masculino; 15 a 18% do sexo feminino). Além disso, a frequência média da de ataques em um indivíduo é de 1,5/mês. Apesar de ter uma série de tratamentos disponíveis para aliviar ou reduzir os sintomas, a terapia preventiva é recomendada para aqueles pacientes com mais de 3-4 ataques de enxaqueca por mês. Goadsby, et al. New Engl. J. Med. 346 (4): 257-275, 2002. Alguns pacientes com enxaqueca têm sido tratados com topiramato, um anticonvulsivante que bloqueia os canais de sódio dependente de voltagem e certos receptores de glutamato (AMPA-kainato), potencializa a atividade do receptor GABA-A, e bloqueia a anidrase carbônica. O sucesso relativamente recente de agonistas do receptor de serotonina 5HT-IB/ID e/ou 5HT-1a, tal como o sumatriptano, em alguns pacientes levou pesquisadores a propor uma etiologia serotonérgica da doença. Infelizmente, enquanto alguns pacientes respondem bem a este tratamento, outros são relativamente resistentes aos seus efeitos.
[017] O possível envolvimento de CGRP na enxaqueca tem sido a base para o desenvolvimento e teste de uma série de compostos que inibem a liberação de CGRP (por exemplo, sumatriptano), antagonizam o receptor de CGRP (por exemplo, BIBN4096BS derivado de dipeptídeo (Boehringer Ingelheim), CGRP (8 - 37)), ou interagem com uma ou mais das proteínas associadas a receptoras, como RAMP1. Brain, S. et al., Trends in Pharmacological Sciences 23:51-53, 2002. Os subtipos alfa-2 adreno receptores e receptores de adenosina Al também controlam (inibem) a liberação de CGRP e ativação trigeminal (Goadsby et al, Brain 125:1392 -. 401, 2002). Por outro lado, o tratamento com compostos que inibem exclusivamente a inflamação neurogênica (por exemplo, antagonistas dos receptores de taquicininas NKI) ou ativação trigeminal (por exemplo, agonistas do receptor 5HT10) parecem ser relativamente ineficazes como tratamentos agudos para a enxaqueca, levando alguns a questionarem se a liberação de inibição da CGRP é a base dos tratamentos eficazes antienxaqueca. Arulmani et al. Eur. J. Pharmacol. 500:315330, 2004.
[018] Embora a fisiopatologia precisa da enxaqueca ainda não seja bem compreendida, o uso terapêutico de antagonistas de CGRP e aptâmeros alvos de tCGRP tem sido proposto para o tratamento da enxaqueca e outros distúrbios. (Por exemplo, Olesen et al., Calcitonin gene-related peptide receptor antagonist BIBN 4096 BS for the acute treatment of migraine, New Engl. J. Med., 350:1104-1110 (2004); Perspective: CGRP-receptor antagonists--a fresh approach to migraine, New Engl. J. Med., 350:1075 (2004); Vater et al., Short bioactive Spiegelmers to migraine-associated calcitonin gene-related peptide rapidly identified by a novel approach: tailored-SELEX, Nuc. Acids Res., 31(21 e130):1-7 (2003); WO 96/03993). Além disso, um antagonista de CGRP potente de molécula pequena mostrou aliviar os ataques de enxaqueca moderada a grave, incluindo dor de enxaqueca e sintomas associados a enxaqueca, em um teste clínico de fase III recente (Connor, et al. Efficacy e Safety of telcagepant (MK-0974), a Novel Oral CGRP Receptor Antagonist, for Acute Migraine Attacks. Poster, European Headache e Migraine Trust International Congress, Londres, Inglaterra, setembro de 2008).
[019] O CGRP também pode estar envolvido em síndromes de dor crônica que não sejam a enxaqueca. Em roedores, o CGRP distribuído de forma intratecal induz dor severa, e os níveis de CGRP são intensificados em uma série de modelos de dor. Além disso, os antagonistas de CGRP bloqueiam parcialmente a nocicepção na pancreatite aguda em roedores (Wick, et al., (2006) Surgery, 139 Volume, 2 a Edição, páginas 197-201). Juntas, essas observações implicam que um antagonista do receptor de CGRP potente e seletivo pode ser uma terapêutica eficaz para o tratamento da dor crônica, incluindo enxaqueca.
[020] SUMÁRIO
[021] Anticorpos isolados, fragmentos de ligação de antígeno dos mesmos e outras proteínas isoladas de ligação a antígeno que se ligam a CGRP R, particularmente CGRP R primata, por exemplo, CGRP R humanos, são aqui descritos. As proteínas isoladas de ligação a antígeno podem inibir seletivamente CGRP R de primata (em comparação com receptores de AM1 de primata, AM2, CT ou amilina) e podem se ligar a ambos os componentes CRLR e RAMP1 de CGRP R. As proteínas de ligação CGRP R foram verificadas inibir, interferir com, ou modular, pelo menos uma das respostas biológicas relacionadas com CGRP R, e como tal, são úteis para amenizar os efeitos de doenças ou distúrbios relacionados com CGRP R. A ligação de certas proteínas de ligação a antígenos a CGRP R pode, portanto, ter uma ou mais das seguintes atividades: inibição, interferência com, ou modulação de CGRP R, inibição da vasodilatação, diminuição da inflamação neurogênica, e alivio, amenização, tratamento, prevenção ou redução dos sintomas de dor crônica ou enxaqueca.
[022] Em um aspecto exemplar, as proteínas isoladas de ligação a antígeno inibem seletivamente os receptores de CGRP humano (em comparação com os receptores de AM1 humano, AM2 ou amilina). Em algumas modalidades, a proteína isolada de ligação a antígeno inibe seletivamente o receptor de CGRP humano com uma razão de seletividade de 50 ou mais, 75 ou mais, 100 ou mais, 150 ou mais, 200 ou mais, 250 ou mais, 300 ou mais, 400 ou mais, 500 ou mais, 750 ou mais ou 1.000 ou mais. O grau de inibição seletiva pode ser determinado usando qualquer método adequado, por exemplo, usando um ensaio de cAMP como descrito nos exemplos deste documento. Em algumas modalidades, a proteína isolada de ligação a antígeno se liga especificamente tanto a CRLR humano quanto à RAMP1, e não se liga especificamente a AM1 humano, AM2 humano ou um receptor de amilina humana (por exemplo, AMY1 AMY2). Por exemplo, a proteína isolada de ligação a antígeno pode se ligar especificamente a CGRP R humano com um KD < 1 μM, < 100 nM, < 10 nM, ou < 5 nM. Em algumas modalidades, a proteína isolada de ligação a antígeno se liga especificamente ao CGRP R humano com um KD < 100 nM, < 10 nM, ou < 5 nM como determinado usando um ensaio de ligação FACS e analisados, por exemplo, usando métodos descritos em Rathanaswami, et al., Biochemical e Biophysical Research Communications 334 (2005) 1004-1013. Em algumas modalidades, a proteína isolada de ligação a antígeno tem um Ki de < 100 nM, < 10 nM, <1 nM, < 0,5 nM ou < 0,1 nM em um ensaio de competição de ligação CGRP. Em algumas modalidades, a proteína isolada de ligação a antígeno tem um Ki de < 100 nM, < 50 nM, < 20 nM, < 10 nM, <1 nM, < 0,5 nM ou < 0,1 nM em um ensaio de competição de ligação radiomarcado com 125I- CGRP a membranas das células expressando CGRP R humano, por exemplo, o ensaio descrito no Exemplo 5 deste documento.
[023] Em outro aspecto exemplar, as proteínas isoladas de ligação a antígeno competem pela ligação ao CGRP R humano, por exemplo, a porção extracelular de CGRP R, com um anticorpo de referência compreendendo uma região variável da cadeia pesada compreendendo uma sequência selecionada do grupo consistindo na SEQ ID NO :158-170 e uma região variável da cadeia leve que compreende uma sequência selecionada do grupo consistindo na SEQ ID NO :137-153. Em algumas modalidades, a competição de ligação é avaliada através de um ensaio de combinação (binning), por exemplo, usando uma análise Biacore, por exemplo, como descrito no Exemplo 7 neste documento. Em algumas modalidades, a proteína isolada de ligação a antígeno concorre para a ligação a CGRP R humano com um anticorpo de referência, o anticorpos de referência compreendendo (i) uma região variável da cadeia pesada compreendendo uma sequência selecionada do grupo consistindo nas SEQ ID NOs: 161, 163, 164, 166 e 168, e (ii) uma região variável da cadeia leve que compreende uma sequência selecionada do grupo consistindo nas SEQ ID NOs: 140, 143, 146, 148 e 150. Em certas modalidades, o anticorpo de referência compreende (i) uma cadeia pesada definida por uma sequência selecionada do grupo consistindo nas SEQ ID NOs: 32, 34, 35, 37 e 39, e (ii) uma cadeia leve definida por uma sequência selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 15, 18, 21, 23 e 25. Em modalidades mais específicas, o anticorpo de referência compreende uma cadeia pesada e uma cadeia leve definida por um dos seguintes pares de sequências: (i) SEQ ID NO: 32 e SEQ ID NO: 15; (ii) SEQ ID NO: 34 e SEQ ID NO: 18; (iii) SEQ ID NO: 35 e SEQ ID NO: 21; (iv) SEQ ID NO: 37 e SEQ ID NO: 23; e (v) SEQ ID NO: 39 e SEQ ID NO: 25. Em uma modalidade, o anticorpo de referência compreende uma cadeia pesada compreendendo a SEQ ID NO: 32 e compreendendo uma cadeia leve SEQ ID NO: 15. Em outra modalidade, o anticorpo de referência compreende uma cadeia pesada compreendendo a SEQ ID NO: 34 e uma cadeia leve compreendendo a SEQ ID NO: 18. Em outra modalidade, o anticorpo de referência compreende uma cadeia pesada compreendendo a SEQ ID NO: 35 e uma cadeia leve compreendendo a SEQ ID NO: 21. Em outra modalidade, o anticorpo de referência compreende uma cadeia pesada compreendendo a SEQ ID NO: 37 e uma cadeia leve compreendendo a SEQ ID NO: 23. Em outra modalidade, o anticorpo de referência compreende uma cadeia pesada compreendendo a SEQ ID NO: 39 e uma cadeia leve compreendendo a SEQ ID NO: 25.
[024] Em certas modalidades, as proteínas isoladas de ligação a antígeno que competem para a ligação com CGRP R humano também inibem seletivamente o receptor de CGRP humano, por exemplo, com uma razão de seletividade de 100 ou mais, 250 ou mais, 500 ou mais, 750 ou mais, 1000 ou mais, 2.500 ou mais, 5.000 ou mais ou 10 mil ou mais, e tal seletividade pode ser determinada, por exemplo, usando um ensaio de cAMP como descrito nos exemplos deste documento. Em modalidades relacionadas, as proteínas isoladas de ligação a antígeno que competem para a ligação com CGRP R humano se ligam especificamente ao CGRP R humano com um KD < 1 mM, < 100 nM, < 10 nM, ou < 5 nM, por exemplo, como determinado usando um ensaio de ligação FACS e analisada, por exemplo, usando métodos descritos em Rathanaswami, et al., Biochemical e Biophysical Research Communications 334 (2005) 1004-1013. Em modalidades relacionadas, as proteínas isoladas de ligação a antígeno que competem para a ligação com CGRP R humano tem um Ki de < 100 nM, < 10 nM, < 1 nM, < 0,5 nM ou < 0,1 nM em um ensaio de competição de ligação a CGRP, por exemplo, em um ensaio de competição de ligação 125I-CGRP radiomarcado às membranas das células expressando CGRP R humano, por exemplo, o ensaio descrito no Exemplo 5 neste documento.
[025] Em qualquer das modalidades acima mencionadas, a proteína isolada de ligação a antígeno que compete para a ligação com CGRP R humano pode ser, por exemplo, um anticorpo monoclonal, um anticorpo policlonal, um anticorpo recombinante, um anticorpo humano (por exemplo, completamente humano), um anticorpo humanizado, um anticorpo quimérico, um anticorpo multiespecífico, ou um fragmento de ligação a antígeno do mesmo. Além disso, o fragmento de anticorpo da proteína isolada de ligação a antígeno que compete para a ligação com CGRP R humano pode ser um fragmento Fab, e um fragmento Fab', um fragmento (Fab')2, um fragmento Fv, um diacorpo ou uma molécula de anticorpo de cadeia única, e pode ser, por exemplo, um anticorpo monoclonal humano, por exemplo, um anticorpo tipo IgG1-, IgG2-, IgG3-, ou IgG4-. Em certas modalidades, as proteínas isoladas de ligação a antígeno que competem pela ligação ao CGRP R humano podem ser proteínas de neutralização de ligação do antígeno.
[026] Em certos aspectos exemplares, as proteínas isoladas de ligação a antígeno descritas, por exemplo, anticorpos isolados ou fragmentos dos mesmos, compreendem (A) um ou mais regiões de determinação de complementaridade de cadeia pesada (CDRHs) selecionadas do grupo consistindo em: (i) uma CDRH1 tendo SEQ ID NO: 134; (ii) uma CDRH2 tendo SEQ ID NO: 135; (iii) uma CDRH3 tendo SEQ ID NO: 136; e, opcionalmente, (iv) uma CDRH de (i), (ii) e (iii) que contém uma ou mais substituições de aminoácido (por exemplo, substituições conservativas de aminoácidos), deleções ou inserções que coletivamente totalizam não mais de quatro aminoácidos; (B) uma ou mais regiões determinantes de complementaridade da cadeia leve (CDRLs) selecionado do grupo consistindo em: (i) uma CDRL1 selecionada do grupo consistindo nas NOs SEQ ID: 107, 111 e 118; (ii) ums CDRL2 selecionada do grupo consistindo nas SEQ ID NOs: 108, 112 e 119, (iii) uma CDRL3 selecionada do grupo consistindo nas posições SEQ ID: 109, 113 e 120, e opcionalmente (iv) uma CDRL de (i), (ii) e (iii) que contém um ou mais, por exemplo, um, dois, três, quatro ou mais, substituições (por exemplo, substituições conservativas de aminoácidos), deleções ou inserções de aminoácidos que coletivamente totalizam não mais de quatro aminoácidos, ou (C) uma ou mais CDRHs de cadeia pesada (A) e uma ou mais CDRLs de cadeia leve (B).
[027] Em algumas modalidades, as CDRHs são adicionalmente selecionadas a partir do grupo que consiste em: (i) uma CDRH1 tendo a SEQ ID NO: 131; (ii) uma CDRH2 tendo a SEQ ID NO:132; (iii) uma CDRH3 tendo a SEQ ID NO:133; e opcionalmente (iv) uma CDRH de (i), (ii) e (iii) que contém uma ou mais, por exemplo, uma, duas, três, quatro ou mais substituições (por exemplo, substituições conservativas de aminoácidos), deleções ou inserções de aminoácidos que coletivamente totalizam mais de três aminoácidos. Em modalidades relacionadas, as CDRHs são adicionalmente selecionadas a partir do grupo que consiste em: (i) uma CDRH1 selecionada do grupo que consiste na SEQ ID NO:76, 88, 100, 121, 125 e 128; (ii) uma CDRH2 selecionada do grupo que consiste na SEQ ID NO: 89, 101, 122, 124, 126, e 129; (iii) uma CDRH3 selecionada do grupo que consiste na SEQ ID NO: 78, 90, 102, 123, 127, e 130; e opcionalmente (iv) uma CDRH de (i), (ii) e (iii) que contém uma ou mais, por exemplo, uma, duas, três, quatro ou mais substituições (por exemplo, substituições conservativas de aminoácidos), deleções ou inserções de aminoácidos que coletivamente totalizam não mais de dois aminoácidos. Em outras modalidades relacionadas, as CDRHs são adicionalmente selecionadas do grupo que consiste em: (i) uma CDRH1 selecionada do grupo que consiste na SEQ ID NO: 73, 76, 79, 82, 85, 88, 92, 97, e 100; (ii) uma CDRH2 selecionada do grupo que consiste na SEQ ID NO: 74, 77, 80, 83, 86, 89, 91, 93, 95, 98, 101, e 129; (iii) uma CDRH3 selecionada do grupo que consiste na SEQ ID NO: 75, 78, 81, 84, 87, 90, 96, 99, 102, e 123; e opcionalmente (iv) uma CDRH de (i), (ii) e (iii) que contém uma ou mais, por exemplo, uma, duas, três, quatro ou mais substituições (por exemplo, substituições conservativas de aminoácidos), deleções ou inserções de aminoácidos que coletivamente totalizam não mais de dois aminoácidos.
[028] Em algumas modalidades, as CDRLs são adicionalmente selecionadas do grupo que consiste em: (i) uma CDRL1 selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs:107, 111 e 115; (ii) uma CDRL2 selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 108, 112 e 116; (iii) uma CDRL3 selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 109, 113 e 117; e opcionalmente (iv) uma CDRL de (i), (ii) e (iii) que contém uma ou mais, por exemplo, uma, duas, três, quatro ou mais substituições (por exemplo, substituições conservativas de aminoácidos), deleções ou inserções de aminoácidos. Em algumas modalidades, as substituições (por exemplo, substituições conservativas de aminoácidos), deleções ou inserções de aminoácidos coletivamente totalizam não mais de três aminoácidos por CDRL. Em algumas modalidades, as substituições de aminoácidos, deleções ou inserções coletivamente totalizam não mais de dois aminoácidos por CDRL. Em modalidades relacionadas, as CDRLs são adicionalmente selecionadas do grupo que consiste em: (i) uma CDRL1 selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 42, 45, 51, 57, 62, 69, 103, e 110; (ii) uma CDRL2 selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 43, 52, 55, 58, 63, 70, 104, 108, e 114; (iii) uma CDRL3 selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 44, 47, 53, 56, 59, 64, 105, e 106; e opcionalmente (iv) uma CDRL de (i), (ii) e (iii) que contém uma ou mais, por exemplo, uma, duas, três, quatro ou mais substituições (por exemplo, substituições conservativas de aminoácidos), deleções ou inserções de aminoácidos que coletivamente totalizam não mais de dois aminoácidos. Em modalidades adicionais, as CDRLs são adicionalmente selecionadas do grupo que consiste em: (i) uma CDRL1 selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 42, 45, 48, 51, 54, 57, 62, 65, 66, e 69; (ii) uma CDRL2 selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 43, 46, 49, 52, 55, 58, 61, 63, 67, e 70; (iii) uma CDRL3 selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 44, 47, 50, 53, 56, 59, 64, 68, 71, e 72; e opcionalmente (iv) uma CDRL de (i), (ii) e (iii) que contém uma ou mais, por exemplo, uma, duas, três, quatro ou mais substituições (por exemplo, substituições conservativas de aminoácidos), deleções ou inserções de aminoácidos. Em uma modalidade, o número total de substituições, deleções ou inserções é de não mais de dois aminoácidos por CDR. Em outra modalidade, as substituições de aminoácidos são substituições conservativas.
[029] Em outra modalidade, a proteína isolada de ligação a antígeno compreende pelo menos uma ou duas CDRH de qualquer uma das mencionadas acima (A) e pelo menos uma ou duas CDRL de qualquer uma das mencionadas acima (B). Em ainda outra modalidade, a proteína isolada de ligação a antígeno compreende (i) pelo menos três CDRH de qualquer uma das mencionadas acima (A), onde as três CDRHs incluem CDRH1, uma CDRH2 e uma CDRH3, e (ii) pelo menos três CDRL de qualquer uma das mencionadas acima (B), onde as três CDRLs incluem CDRL1, uma CDRL2 e uma CDRL3. Em modalidades adicionais, as proteínas isoladas de ligação a antígeno descritas acima compreendem uma primeira sequência de aminoácidos compreendendo pelo menos uma CDRH e uma segunda sequência de aminoácidos compreendendo pelo menos uma CDRL. Em uma modalidade, a primeira e a segunda sequências de aminoácidos são covalentemente ligadas umas as outras.
[030] Em outro aspecto, a proteína isolada de ligação a antígeno inclui uma CDRH1, uma CDRH2 e uma CDRH3. Em uma modalidade, a CDRH1 compreende a SEQ ID NO:73, a CDRH2 compreende a SEQ ID NO:74 e a CDRH3 compreende a SEQ ID NO:75. Em outra modalidade, a CDRH1 compreende a SEQ ID NO:76, a CDRH2 compreende a SEQ ID NO:77 e a CDRH3 compreende a SEQ ID NO:78. Em outra modalidade, a CDRH1 compreende a SEQ ID NO:79, a CDRH2 compreende a SEQ ID NO:80 e a CDRH3 compreende a SEQ ID NO:81. Em outra modalidade, a CDRH1 compreende a SEQ ID NO:82, a CDRH2 compreende a SEQ ID NO:83 e a CDRH3 compreende a SEQ ID NO:84. Em outra modalidade, a CDRH1 compreende a SEQ ID NO:85, a CDRH2 compreende a SEQ ID NO:86 e a CDRH3 compreende a SEQ ID NO:87. Em outra modalidade, a CDRH1 compreende a SEQ ID NO:88, a CDRH2 compreende a SEQ ID NO:89 e a CDRH3 compreende a SEQ ID NO:90. Em outra modalidade, a CDRH1 compreende a SEQ ID NO:76, a CDRH2 compreende a SEQ ID NO:91 e a CDRH3 compreende a SEQ ID NO:78. Em outra modalidade, a CDRH1 compreende a SEQ ID NO:92, a CDRH2 compreende a SEQ ID NO:93 e a CDRH3 compreende a SEQ ID NO:94. Em outra modalidade, a CDRH1 compreende a SEQ ID NO:76, a CDRH2 compreende a SEQ ID NO:95 e a CDRH3 compreende a SEQ ID NO:78. Em outra modalidade, a CDRH1 compreende a SEQ ID NO:73, a CDRH2 compreende a SEQ ID NO:74 e a CDRH3 compreende a SEQ ID NO:96. Em outra modalidade, a CDRH1 compreende a SEQ ID NO:97, a CDRH2 compreende a SEQ ID NO:98 e a CDRH3 compreende a SEQ ID NO:99. Em outra modalidade, a CDRH1 compreende a SEQ ID NO:100, a CDRH2 compreende a SEQ ID NO:101 e a CDRH3 compreende a SEQ ID NO:102.
[031] Em outro aspecto, a proteína isolada de ligação a antígeno inclui uma Sequência de CDRL1, uma sequência de CDRL2 e uma sequência de CDRL3. Em uma modalidade, a CDRL1 compreende a SEQ ID NO:42, a CDRL2 compreende a SEQ ID NO:43 e a CDRL3 compreende a SEQ ID NO:44. Em outra modalidade, a CDRL1 compreende a SEQ ID NO:45, a CDRL2 compreende a SEQ ID NO:46 e a CDRL3 compreende a SEQ ID NO:47. Em outra modalidade, a CDRL1 compreende a SEQ ID NO:48, a CDRL2 compreende a SEQ ID NO:49 e a CDRL3 compreende a SEQ ID NO:50. Em outra modalidade, a CDRL1 compreende a SEQ ID NO:51, a CDRL2 compreende a SEQ ID NO:52 e a CDRL3 compreende a SEQ ID NO:53. Em outra modalidade, a CDRL1 compreende a SEQ ID NO:54, a CDRL2 compreende a SEQ ID NO:55 e a CDRL3 compreende a SEQ ID NO:56. Em outra modalidade, a CDRL1 compreende a SEQ ID NO:57, a CDRL2 compreende a SEQ ID NO:58 e a CDRL3 compreende a SEQ ID NO:59. Em outra modalidade, a CDRL1 compreende a SEQ ID NO:60, a CDRL2 compreende a SEQ ID NO:55 e a CDRL3 compreende a SEQ ID NO:56. Em outra modalidade, a CDRL1 compreende a SEQ ID NO:45, a CDRL2 compreende a SEQ ID NO:61 e a CDRL3 compreende a SEQ ID NO:47. Em outra modalidade, a CDRL1 compreende a SEQ ID NO:62, a CDRL2 compreende a SEQ ID NO:63 e a CDRL3 compreende a SEQ ID NO:64. Em outra modalidade, a CDRL1 compreende a SEQ ID NO:65, a CDRL2 compreende a SEQ ID NO:55 e a CDRL3 compreende a SEQ ID NO:56. Em outra modalidade, a CDRL1 compreende a SEQ ID NO:66, a CDRL2 compreende a SEQ ID NO:67 e a CDRL3 compreende a SEQ ID NO:68. Em outra modalidade, a CDRL1 compreende a SEQ ID NO:69, a CDRL2 compreende a SEQ ID NO:70 e a CDRL3 compreende a SEQ ID NO:71. Em outra modalidade, a CDRL1 compreende a SEQ ID NO:69, a CDRL2 compreende a SEQ ID NO:70 e a CDRL3 compreende a SEQ ID NO:72.
[032] Em outro aspecto, a proteína isolada de ligação a antígeno inclui uma sequência de CDRL1, uma sequência de CDRL2, uma sequência de CDRL3, uma sequência de CDRH1, uma sequência de CDRH2 e uma sequência de CDRH3. Em uma modalidade, a CDRL1 compreende a SEQ ID NO:42, a CDRL2 compreende a SEQ ID NO:43, a CDRL3 compreende a SEQ ID NO:44, a CDRH1 compreende a SEQ ID NO:73, a CDRH2 compreende a SEQ ID NO:74 e a CDRH3 compreende a SEQ ID NO:75. Em outra modalidade, a CDRL1 compreende a SEQ ID NO:45, a CDRL2 compreende a SEQ ID NO:46, a CDRL3 compreende a SEQ ID NO:47, a CDRH1 compreende a SEQ ID NO:76, a CDRH2 compreende a SEQ ID NO:77 e a CDRH3 compreende a SEQ ID NO:78. Em outra modalidade, a CDRL1 compreende a SEQ ID NO:48, a CDRL2 compreende a SEQ ID NO:49, a CDRL3 compreende a SEQ ID NO:50, a CDRH1 compreende a SEQ ID NO:79, a CDRH2 compreende a SEQ ID NO:80 e a CDRH3 compreende a SEQ ID NO:81. Em outra modalidade, a CDRL1 compreende a SEQ ID NO:51, a CDRL2 compreende a SEQ ID NO:52, a CDRL3 compreende a SEQ ID NO:53, a CDRH1 compreende a SEQ ID NO:82, a CDRH2 compreende a SEQ ID NO:83 e a CDRH3 compreende a SEQ ID NO:84. Em outra modalidade, a CDRL1 compreende a SEQ ID NO:54, a CDRL2 compreende a SEQ ID NO:55, a CDRL3 compreende a SEQ ID NO:56, a CDRH1 compreende a SEQ ID NO:85, a CDRH2 compreende a SEQ ID NO:86 e a CDRH3 compreende a SEQ ID NO:87. Em outra modalidade, a CDRL1 compreende a SEQ ID NO:57, a CDRL2 compreende a SEQ ID NO:58, a CDRL3 compreende a SEQ ID NO:59, a CDRH1 compreende a SEQ ID NO:88, a CDRH2 compreende a SEQ ID NO:89 e a CDRH3 compreende a SEQ ID NO:90. Em outra modalidade, a CDRL1 compreende a SEQ ID NO:60, a CDRL2 compreende a SEQ ID NO:55, a CDRL3 compreende a SEQ ID NO:56, a CDRH1 compreende a SEQ ID NO:85, a CDRH2 compreende a SEQ ID NO:86 e a CDRH3 compreende a SEQ ID NO:87. Em outra modalidade, a CDRL1 compreende a SEQ ID NO:45, a CDRL2 compreende a SEQ ID NO:61, a CDRL3 compreende a SEQ ID NO:47, a CDRH1 compreende a SEQ ID NO:76, a CDRH2 compreende a SEQ ID NO:91 e a CDRH3 compreende a SEQ ID NO:78. Em outra modalidade, a CDRL1 compreende a SEQ ID NO:62, a CDRL2 compreende a SEQ ID NO:63, a CDRL3 compreende a SEQ ID NO:64, a CDRH1 compreende a SEQ ID NO:92, a CDRH2 compreende a SEQ ID NO:93 e a CDRH3 compreende a SEQ ID NO:94. Em outra modalidade, a CDRL1 compreende a SEQ ID NO:45, a CDRL2 compreende a SEQ ID NO:61, a CDRL3 compreende a SEQ ID NO:47, a CDRH1 compreende a SEQ ID NO:76, a CDRH2 compreende a SEQ ID NO:95 e a CDRH3 compreende a SEQ ID NO:78. Em outra modalidade, a CDRL1 compreende a SEQ ID NO:65, a CDRL2 compreende a SEQ ID NO:55, a CDRL3 compreende a SEQ ID NO:56, a CDRH1 compreende a SEQ ID NO:85, a CDRH2 compreende a SEQ ID NO:86 e a CDRH3 compreende a SEQ ID NO:87. Em outra modalidade, a CDRL1 compreende a SEQ ID NO:42, a CDRL2 compreende a SEQ ID NO:43, a CDRL3 compreende a SEQ ID NO:44, a CDRH1 compreende a SEQ ID NO:73, a CDRH2 compreende a SEQ ID NO:74 e a CDRH3 compreende a SEQ ID NO:96. Em outra modalidade, a CDRL1 compreende a SEQ ID NO:66, a CDRL2 compreende a SEQ ID NO:67, a CDRL3 compreende a SEQ ID NO:68, a CDRH1 compreende a SEQ ID NO:97, a CDRH2 compreende a SEQ ID NO:98 e a CDRH3 compreende a SEQ ID NO:99. Em outra modalidade, a CDRL1 compreende a SEQ ID NO:69, a CDRL2 compreende a SEQ ID NO:70, a CDRL3 compreende a SEQ ID NO:71, a CDRH1 compreende a SEQ ID NO:100, a CDRH2 compreende a SEQ ID NO:101 e a CDRH3 compreende a SEQ ID NO:102. Em outra modalidade, a CDRL1 compreende a SEQ ID NO:69, a CDRL2 compreende a SEQ ID NO:70, a CDRL3 compreende a SEQ ID NO:72, a CDRH1 compreende a SEQ ID NO:100, a CDRH2 compreende a SEQ ID NO:101 e a CDRH3 compreende a SEQ ID NO:102.
[033] Em qualquer das modalidades definidas pelas sequências acima mencionadas, a proteína isolada de ligação a antígeno pode ser, por exemplo, um anticorpo monoclonal, um anticorpo policlonal, um anticorpo recombinante, um anticorpo humano (por exemplo, completamente humano), um anticorpo humanizado, um anticorpo quimérico, um anticorpo multiespecífico, ou um fragmento de ligação de antígeno do mesmo. Além disso, o fragmento de anticorpo das proteínas isoladas de ligação a antígeno pode ser um fragmento Fab, e um fragmento Fab', um fragmento F(ab')2, um fragmento Fv, um diacorpo, ou uma molécula de anticorpo de cadeia única. Por exemplo, a proteína isolada de ligação a antígeno pode ser um anticorpo monoclonal humano, e pode ser, por exemplo, um anticorpo do tipo IgG1, IgG2, IgG3, ou IgG4. Além disso, as proteínas isoladas de ligação a antígeno podem ser proteínas de neutralização de ligação do antígeno.
[034] Em qualquer das modalidades definidas de sequências mencionadas acima, a proteína isolada de ligação a antígeno pode se ligar especificamente tanto a s CRLR humano quanto a RAMP1 humana e não se ligam especificamente a AM1, AM2 ou a um receptor de amilina humana (por exemplo, AMY1), por exemplo, a proteína isolada de ligação a antígeno pode se ligar especificamente a CGRP R humano com um KD < 1 μM, < 100 nM, < 10 nM, ou < 5 nM, por exemplo, como determinado através de um ensaio de ligação FACS e analisado, por exemplo, usando métodos descritos em Rathanaswami, et al., Biochemical and Biophysical Research Communications 334 (2005) 1004-1013. Em qualquer das modalidades definidas de sequências mencionadas acima, a proteína isolada de ligação a antígeno pode inibir seletivamente o CGRP R humano, em relação aos receptores de AM1, AM2 ou AMY1 humanos, por exemplo, com uma razão de seletividade de 100 ou mais, 250 ou mais, 500 ou mais, 750 ou mais, 1.000 ou mais, 2.500 ou mais, 5.000 ou mais ou 10 mil ou mais, onde o grau de inibição seletiva pode ser determinado usando qualquer método adequado, por exemplo, usando um ensaio de cAMP, conforme descrito nos exemplos deste documento. Em qualquer das modalidades definidas de sequências mencionadas acima, a proteína isolada de ligação a antígeno pode ter um Ki de < 100 nM, < 10 nM, <1 nM <, 0,5 nM ou < 0,1 nM em um ensaio de competição de ligação de CGRP, por exemplo, em um ensaio de competição de ligação de 125I-CGRP radiomarcado às membranas das células expressando CGRP R humano, por exemplo, o ensaio descrito no Exemplo 5 deste documento.
[035] Outro conjunto de modalidades inclui proteínas isoladas de ligação a antígeno que incluem uma CDR ou uma combinação de CDRs tendo as sequências consenso descritas abaixo e, opcionalmente, se ligam a CGRP R humano. As sequências consenso são derivadas de sequências de CDR relacionadas filogeneticamente. Em um aspecto, as CDRs dos vários grupos podem ser misturadas e combinadas em qualquer proteína isolada de ligação a antígeno particular que se liga a CGRP R humano. Em outro aspecto, a proteína de ligação a antígeno compreende CDRs de cadeia pesada e leve que são derivadas do mesmo grupo de clones de anticorpo relacionados filogeneticamente. As sequências consenso de CDR exemplares são as seguintes: K1 Consenso
[036] CDR1 RASQGIRX1DLG (SEQ ID NO:103), em que X1 é selecionado do grupo consistindo em N e K.
[037] CDR2 X1ASSLQS (SEQ ID NO:104), em que X1 é selecionado do grupo consistindo em A e G.
[038] CDR3 LQYNX1X2PWT (SEQ ID NO:105), em que X1 é selecionado do grupo consistindo em I e S, e X2 é selecionado do grupo consistindo em Y e F. K4 Consenso
[039] CDR3 QQYGNSLX1R (SEQ ID NO:106), em que X1 é selecionado do grupo consistindo em S e C. K1,4 Consenso
[040] CDR1 RASQX1X2X3X4GX5LX6 (SEQ ID NO:107), em que X1 é selecionado do grupo consistindo em S e G, X2 é selecionado do grupo consistindo em V e I, X3 é selecionado do grupo consistindo em S e R, X4 é selecionado do grupo consistindo em S, N e K, X5 é selecionado do grupo consistindo em Y e D, e X6 é selecionado do grupo consistindo em T e G.
[041] CDR2 X1ASSX2X3X4 (SEQ ID NO:108), em que X1 é selecionado do grupo consistindo em G e A, X2 é selecionado do grupo consistindo em R e L, X3 é selecionado do grupo consistindo em A e Q, e X4 é selecionado do grupo consistindo em T e S.
[042] CDR3 X1QYX2X3X4X5X6X7 (SEQ ID NO:109), em que X1 é selecionado do grupo consistindo em Q e L, X2 é selecionado do grupo consistindo em G e N, X3 é selecionado do grupo consistindo em N e T, X4 é selecionado do grupo consistindo em S, Y e F, X5 é selecionado do grupo consistindo em L e P, X6 é selecionado do grupo consistindo em C, W e S, e X7 é selecionado do grupo consistindo em R e T. K3 Consenso
[043] CDR1 KSSQSLLHSX1GX2X3YLY (SEQ ID NO:110), em que X1 é selecionado do grupo consistindo em D e A, X2 é selecionado do grupo consistindo em R e K, e X3 é selecionado do grupo consistindo em N e T. K2,3 Consenso
[044] CDR1 X1SSQSLLHSX2GX3X4YLX5 (SEQ ID NO:111), em que X1 é selecionado do grupo consistindo em R e K, X2 é selecionado do grupo consistindo em F, D e A, X3 é selecionado do grupo consistindo em Y, R e K, X4 é selecionado do grupo consistindo em N e T, e X5 é selecionado do grupo consistindo em D e Y.
[045] CDR2 X1X2SNRX3S (SEQ ID NO:112), em que X1 é selecionado do grupo consistindo em L e E, X2 é selecionado do grupo consistindo em G e V, e X3 é selecionado do grupo consistindo em A e F.
[046] CDR3 MQX1X2X3X4PX5T (SEQ ID NO:113), em que X1 é selecionado do grupo consistindo em A e S, X2 é selecionado do grupo consistindo em L e F, X3 é selecionado do grupo consistindo em Q e P, X4 é selecionado do grupo consistindo em T e L, e X5 é selecionado do grupo consistindo em F e L. Lm3 Consenso
[047] CDR2 RX1NQRPS (SEQ ID NO:114), em que X1 é selecionado do grupo consistindo em N e S. Lm1,2,3 Consenso
[048] CDR1 SGSSSNIGX1NX2VX3 (SEQ ID NO:115), em que X1 é selecionado do grupo consistindo em N e S, X2 é selecionado do grupo consistindo em Y e T, e X3 é selecionado do grupo consistindo em S, N e Y.
[049] CDR2 X1X2NX3RPS (SEQ ID NO:116), em que X1 é selecionado do grupo consistindo em D, T e R, X2 é selecionado do grupo consistindo em N e S, e X3 é selecionado do grupo consistindo em K e Q.
[050] CDR3 X1X2X3DX4X5LX6X7VV (SEQ ID NO:117), em que X1 é selecionado do grupo consistindo em G e A, X2 é selecionado do grupo consistindo em T e A, X3 é selecionado do grupo consistindo em W e R, X4 é selecionado do grupo consistindo em S e D, X5 é selecionado do grupo consistindo em R e S, X6 é selecionado do grupo consistindo em S e N, e X7 é selecionado do grupo consistindo em A e G. LmAll Consenso
[051] CDR1 X1GX2X3SX4X5X6X7X8X9X10X11 (SEQ ID NO:118), em que X1 é selecionado do grupo consistindo em S e Q, X2 está presente ou ausente, e se presente é S, X3 é selecionado do grupo consistindo em S e D, X4 está presente ou ausente, e se presente é N, X5 é selecionado do grupo consistindo em I e L, X6 é selecionado do grupo consistindo em G e R, X7 é selecionado do grupo consistindo em N e S, X8 é selecionado do grupo consistindo em N e F, X9 é selecionado do grupo consistindo em Y e T, X10 é selecionado do grupo consistindo em V e A, e X11 é selecionado do grupo consistindo em S, N e Y.
[052] CDR2 X1X2NX3RPS (SEQ ID NO:119), em que X1 é selecionado do grupo consistindo em D, G, T, e R, X2 é selecionado do grupo consistindo em N, K e S, e X3 é selecionado do grupo consistindo em K, N e Q.
[053] CDR3 X1X2X3DX4X5X6X7X8X9V (SEQ ID NO:120), em que X1 é selecionado do grupo consistindo em G, N e A, X2 é selecionado do grupo consistindo em T, S e A, X3 é selecionado do grupo consistindo em W e R, X4 é selecionado do grupo consistindo em S e D, X5 é selecionado do grupo consistindo em R e S, X6 é selecionado do grupo consistindo em L e V, X7 é selecionado do grupo consistindo em S, Y e N, X8 é selecionado do grupo consistindo em A, H e G, e X9 é selecionado do grupo consistindo em V e L. HC1 Consenso
[054] CDR1 X1YYMX2 (SEQ ID NO:121), em que X1 é selecionado do grupo consistindo em G e D, X2 é selecionado do grupo consistindo em H e Y.
[055] CDR2 WIX1PNSGGTNYAQKFQG (SEQ ID NO:122), em que X1 é selecionado do grupo consistindo em N e S.
[056] CDR3 X1X2X3SX4X5X6X7X8GX9X10X11X12YYX13GMDV (SEQ ID NO:123), em que X1 é selecionado do grupo consistindo em D e G, X2 é selecionado do grupo consistindo em Q e G, X3 é selecionado do grupo consistindo em M e Y, X4 é selecionado do grupo consistindo em I e G, X5 é selecionado do grupo consistindo em I e Y, X6 é selecionado do grupo consistindo em M e A, X7 está presente ou ausente, e se presente é L, X8 está presente ou ausente, e se presente é R, X9 é selecionado do grupo consistindo em V e L, X10 é selecionado do grupo consistindo em F e Y, X11 é selecionado do grupo consistindo em P e S, X12 é selecionado do grupo consistindo em P e H, e X13 está presente ou ausente, e se presente é Y. HC2 Consenso
[057] CDR2 RIKSX1TDGGTTDYX2APVKG (SEQ ID NO:124), em que X1 é selecionado do grupo consistindo em K e T, e X2 é selecionado do grupo consistindo em T e A. HC3 Consenso
[058] CDR1 X1YX2MX3 (SEQ ID NO:125), em que X1 é selecionado do grupo consistindo em T e S, X2 é selecionado do grupo consistindo em S e A, e X3 é selecionado do grupo consistindo em N e S.
[059] CDR2 X1ISX2SX3X4X5X6YYADSVKG (SEQ ID NO:126), em que X1 é selecionado do grupo consistindo em S e A, X2 é selecionado do grupo consistindo em S e G, X3 é selecionado do grupo consistindo em S e G, X4 é selecionado do grupo consistindo em S e G, X5 é selecionado do grupo consistindo em Y e R, e X6 é selecionado do grupo consistindo em R e T.
[060] CDR3 X1X2X3X4X5X6X7PYSX8X9WYDYYYGMDV (SEQ ID NO:127), em que X1 é selecionado do grupo consistindo em E e D, X2 é selecionado do grupo consistindo em G e Q, X3 é selecionado do grupo consistindo em V e R, X4 é selecionado do grupo consistindo em S e E, X5 é selecionado do grupo consistindo em G e V, X6 é selecionado do grupo consistindo em S e G, X7 está presente ou ausente, e se presente é S, X8 é selecionado do grupo consistindo em I e S, e X9 é selecionado do grupo consistindo em S e G. HC4 Consenso
[061] CDR1 SX1GMH (SEQ ID NO:128), em que X1 é selecionado do grupo consistindo em F e Y.
[062] CDR2 VISX1DGSX2KYX3X4DSVKG (SEQ ID NO:129), em que X1 é selecionado do grupo consistindo em F e Y, X2 é selecionado do grupo consistindo em I e H, X3 é selecionado do grupo consistindo em S e Y, e X4 é selecionado do grupo consistindo em V e A.
[063] CDR3 X1RX2X3X4X5X6SX7X8YYX9X10X11YYGX12X13V (SEQ ID NO:130), em que X1 é selecionado do grupo consistindo em D e E, X2 é selecionado do grupo consistindo em L e K, X3 é selecionado do grupo consistindo em N e R, X4 é selecionado do grupo consistindo em Y e V, X5 é selecionado do grupo consistindo em Y e T, X6 é selecionado do grupo consistindo em D e M, X7 é selecionado do grupo consistindo em S e T, X8 é selecionado do grupo consistindo em G e L, X9 é selecionado do grupo consistindo em H e Y, X10 está presente ou ausente, e se presente é Y, X11 é selecionado do grupo consistindo em K e F, X12 é selecionado do grupo consistindo em M e L, e X13 é selecionado do grupo consistindo em A e D. HCA Consenso
[064] CDR1 X1X2X3MX4 (SEQ ID NO:131), em que X1 é selecionado do grupo consistindo em N e S, X2 é selecionado do grupo consistindo em A, Y e F, X3 é selecionado do grupo consistindo em W, A e G, e X4 é selecionado do grupo consistindo em S e H.
[065] CDR2 X1IX2X3X4X5X6GX7X8X9X10X11X12X13X14VKG (SEQ ID NO:132), em que X1 é selecionado do grupo consistindo em R, A e V, X2 é selecionado do grupo consistindo em K, S e W, X3 é selecionado do grupo consistindo em S, G, F e Y, X4 está presente ou ausente, e se presente, é selecionado do grupo consistindo em K e T, X5 está presente ou ausente, e se presente é T, X6 é selecionado do grupo consistindo em D e S, X7 é selecionado do grupo consistindo em G e S, X8 é selecionado do grupo consistindo em T, R, I, N e H, X9 é selecionado do grupo consistindo em T e K, X10 é selecionado do grupo consistindo em D e Y, X11 é selecionado do grupo consistindo em Y e S, X12 é selecionado do grupo consistindo em T, A e V, X13 é selecionado do grupo consistindo em A e D, e X14 é selecionado do grupo consistindo em P e S.
[066] CDR3 X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14X15X16X17GX18X19V (SEQ ID NO:133), em que X1 é selecionado do grupo consistindo em D, A e E, X2 é selecionado do grupo consistindo em R, Q e G, X3 é selecionado do grupo consistindo em T, R, L, G e K, X4 é selecionado do grupo consistindo em G, E, N, I e R, X5 é selecionado do grupo consistindo em Y, V e A, X6 é selecionado do grupo consistindo em S, G, Y, A e T, X7 é selecionado do grupo consistindo em I, P, D, A e M, X8 está presente ou ausente, e se presente, é selecionado do grupo consistindo em S e Y, X9 está presente ou ausente, e se presente, é selecionado do grupo consistindo em W, S e T, X10 é selecionado do grupo consistindo em S, G e L, X11 é selecionado do grupo consistindo em S, G, L e Y, X12 está presente ou ausente, e se presente, é selecionado do grupo consistindo em W e Y, X13 é selecionado do grupo consistindo em Y e H, X14 está presente ou ausente, e se presente, é selecionado do grupo consistindo em Y e D, X15 é selecionado do grupo consistindo em Y, K e F, X16 está presente ou ausente, e se presente é Y, X17 está presente ou ausente, e se presente é Y, X18 é selecionado do grupo consistindo em M e L, e X19 é selecionado do grupo consistindo em D e A. HCB Consenso
[067] CDR1 X1X2X3X4X5 (SEQ ID NO:134), em que X1 é selecionado do grupo consistindo em N, G, D, S e A, X2 é selecionado do grupo consistindo em A, F e Y, X3 é selecionado do grupo consistindo em W, Y, A e G, X4 é selecionado do grupo consistindo em M e L, e X5 é selecionado do grupo consistindo em S e H.
[068] CDR2 X1IX2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14X15X16X17G (SEQ ID NO:135), em que X1 é selecionado do grupo consistindo em R, W, A, V, S e F, X2 é selecionado do grupo consistindo em K, N, S, W e R, X3 é selecionado do grupo consistindo em S, P, G, F e Y, X4 está presente ou ausente, e se presente, é selecionado do grupo consistindo em K, T e R, X5 está presente ou ausente, e se presente, é selecionado do grupo consistindo em T e A, X6 é selecionado do grupo consistindo em D, N, H, S e Y, X7 é selecionado do grupo consistindo em G e S, X8 é selecionado do grupo consistindo em G e S, X9 é selecionado do grupo consistindo em T, G, R, I, N, H e Y, X10 é selecionado do grupo consistindo em T, K, R e P, X11 é selecionado do grupo consistindo em D, N, Y e E, X12 é selecionado do grupo consistindo em Y e S, X13 é selecionado do grupo consistindo em T, A e V, X14 é selecionado do grupo consistindo em A, Q e D, X15 é selecionado do grupo consistindo em P, K e S, X16 é selecionado do grupo consistindo em V e F, e X17 é selecionado do grupo consistindo em K e Q.
[069] CDR3 X1X2X3X4X5SX6X7X8X9X10X11X12X13X14X15X16GX17X18V (SEQ ID NO:136), em que X1 é selecionado do grupo consistindo em D, G, A e E, X2 é selecionado do grupo consistindo em R, G e Q, X3 é selecionado do grupo consistindo em T, M, Y, R, L, G e K, X4 é selecionado do grupo consistindo em G, S, E, N, I e R, X5 é selecionado do grupo consistindo em Y, I, G, V e A, X6 é selecionado do grupo consistindo em S, I, Y, G, A e T, X7 é selecionado do grupo consistindo em I, M, A, P e D, X8 está presente ou ausente, e se presente, é selecionado do grupo consistindo em S, L e Y, X9 está presente ou ausente, e se presente, é selecionado do grupo consistindo em W, R, S e T, X10 é selecionado do grupo consistindo em S, G e L, X11 é selecionado do grupo consistindo em S, V, L, G e Y, X12 está presente ou ausente, e se presente, é selecionado do grupo consistindo em F, Y e W, X13 é selecionado do grupo consistindo em Y, P, S e H, X14 está presente ou ausente, e se presente, é selecionado do grupo consistindo em Y, P, D e H, X15 é selecionado do grupo consistindo em Y, K e F, X16 está presente ou ausente, e se presente é Y, X17 está presente ou ausente, e se presente é Y e X18 é selecionado do grupo consistindo em M e L.
[070] Em qualquer uma das modalidades definidas de sequências consenso mencionadas acima, a proteína isolada de ligação a antígeno pode ser, por exemplo, um polipeptídeo AVÍMERO, um anticorpo monoclonal, um anticorpo policlonal, um anticorpo recombinante, um anticorpo humano (por exemplo, completamente humano), um anticorpo humanizado, um anticorpo quimérico, um anticorpo multiespecífico, ou um fragmento de ligação a antígeno do mesmo. Além disso, o fragmento de anticorpo das proteínas isoladas de ligação a antígeno pode ser um fragmento Fab, um fragmento Fab', um fragmento F(ab')2, um fragmento Fv, um diacorpo, ou uma molécula de anticorpo de cadeia única. Por exemplo, a proteína isolada de ligação a antígeno pode ser um anticorpo monoclonal humano, e pode ser, por exemplo, um anticorpo tipo IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4. Além disso, as proteínas isoladas de ligação a antígeno podem ser proteínas de neutralização de ligação do antígeno.
[071] Em qualquer uma das modalidades definidas de sequências consenso mencionadas acima, a proteína isolada de ligação a antígeno pode se ligar especificamente tanto a CRLR humano quanto a e RAMP1 e não se ligam especificamente a AM1, AM2 ou um receptor de amilina humana (por exemplo, AMY1), por exemplo, a proteína isolada de ligação a antígeno pode se ligar especificamente a CGRP R humano com um KD < 1 μM, < 100 nM, < 10 nM, ou < 5 nM, por exemplo, como determinado através de um ensaio de ligação FACS e analisado, por exemplo, usando métodos descritos em Rathanaswami, et al., Biochemical and Biophysical Research Communications 334 (2005) 1004-1013. Em qualquer uma das modalidades definidas de sequências consenso mencionadas acima, a proteína isolada de ligação a antígeno pode inibir seletivamente o CGRP R humano, em relação aos receptores de AM1, AM2 ou AMY1 humanos, por exemplo, com uma razão de seletividade de 100 ou mais, 250 ou mais, 500 ou mais, 750 ou mais, 1.000 ou mais, 2.500 ou mais, 5.000 ou mais ou 10 mil ou mais, onde o grau de inibição seletiva pode ser determinado usando qualquer método adequado, por exemplo, usando um ensaio de cAMP, conforme descrito nos exemplos deste documento. Em qualquer uma das modalidades definidas de sequências consenso mencionadas acima, a proteína isolada de ligação a antígeno pode ter um Ki de < 100 nM, < 10 nM, < 1 nM, < 0,5 nM ou < 0,1 nM em um ensaio de competição de ligação a CGRP, por exemplo, em um ensaio de competição de ligação a 125I- CGRP radiomarcado às membranas das células expressando CGRP R humano, por exemplo, o ensaio descrito no Exemplo 5 deste documento.
[072] Algumas das proteínas isoladas de ligação a antígeno descritas compreendem uma sequência de região variável de cadeia pesada (VH) que tem pelo menos 80%, 85% e 90% ou 95% de identidade de sequência com uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo nas SEQ ID NOs :158-170. Algumas das proteínas isoladas de ligação a antígeno descritas compreendem uma sequência da região variável de cadeia leve (VL) que tem pelo menos 80%, 85% e 90% ou 95% de identidade de sequência com uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo nas SEQ ID NOs :137-153. Algumas das proteínas isoladas de ligação a antígeno descritas compreendem uma sequência de VH que tem pelo menos 80%, 85%, 90% ou 95% de identidade de sequência com uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo nas SEQ ID NOs :158-170, e uma VL que tem pelo menos 80%, 85%, 90% ou 95% de identidade de sequência com uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo nas SEQ ID NOs :137-153.
[073] Em algumas modalidades, as proteínas isoladas de ligação a antígeno compreendem (A) uma região variável de cadeia pesada (VH) compreendendo uma sequência (i) selecionada do grupo consistindo nas SEQ ID NOs :158-170, ou (ii) como definido por (i) e contendo uma ou mais substituições (por exemplo, cinco, dez, quinze ou vinte) (por exemplo, substituições conservativas de aminoácidos), deleções ou inserções de aminoácidos; (B) uma VL compreendendo uma sequência (iii) selecionada do grupo consistindo das SEQ ID NOs:137-153, ou (iv) como definido por (iii) contendo uma ou mais substituições (por exemplo, cinco, dez, quinze ou vinte) (por exemplo, substituições conservativas de aminoácidos), deleções ou inserções de aminoácidos; ou (C) uma VH de (A) e uma VL de (B). Em algumas modalidades, as proteínas isoladas de ligação a antígeno compreendem uma região variável de cadeia pesada (VH) compreendendo uma sequência selecionada do grupo consistindo nas SEQ ID NOs:158-170 e uma VL compreendendo uma sequência selecionada do grupo consistindo nas SEQ ID NOs :137-153.
[074] Em uma modalidade, a proteína isolada de ligação a antígeno compreende uma região variável de cadeia pesada (VH) compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo em (i) SEQ ID NO: 158, (ii) uma sequência que é pelo menos 90% ou 95% idêntica à sequência definida por (i) e (iii) uma sequência tal como definida por (i) contendo até dez substituições (por exemplo, substituições conservativas de aminoácidos), deleções ou inserções de aminoácidos. Em outra modalidade, a proteína isolada de ligação a antígeno compreende uma VH compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo em (i) SEQ ID NO: 159, (ii) uma sequência que é, pelo menos, 90% ou 95% idêntica à sequência definida por (i) e (iii) uma sequência tal como definida por (i) contendo até dez substituições (por exemplo, substituições conservativas de aminoácidos), deleções ou inserções de aminoácidos. Em outra modalidade, a proteína isolada de ligação a antígeno compreende uma VH compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo em (i) SEQ ID NO: 160, (ii) uma sequência que é, pelo menos, 90% ou 95% idêntica à sequência definida por (i) e (iii) uma sequência tal como definida por (i) contendo até dez substituições (por exemplo, substituições conservativas de aminoácidos), deleções ou inserções de aminoácidos. Em outra modalidade, a proteína isolada de ligação a antígeno compreende uma VH compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo em (i) SEQ ID NO: 161, (ii) uma sequência que é, pelo menos, 90% ou 95% idêntica à sequência definida por (i) e (iii) uma sequência tal como definida por (i) contendo até dez substituições (por exemplo, substituições conservativas de aminoácidos), deleções ou inserções de aminoácidos. Em outra modalidade, a proteína isolada de ligação a antígeno compreende uma VH compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo em (i) SEQ ID NO: 162, (ii) uma sequência que é, pelo menos, 90% ou 95% idêntica à sequência definida por (i) e (iii) uma sequência tal como definida por (i) contendo até dez substituições (por exemplo, substituições conservativas de aminoácidos), deleções ou inserções de aminoácidos. Em outra modalidade, a proteína isolada de ligação a antígeno compreende uma VH compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo em (i) SEQ ID NO: 163, (ii) uma sequência que é, pelo menos, 90% ou 95% idêntica à sequência definida por (i) e (iii) uma sequência tal como definida por (i) contendo até dez substituições (por exemplo, substituições conservativas de aminoácidos), deleções ou inserções de aminoácidos. Em outra modalidade, a proteína isolada de ligação a antígeno compreende uma VH compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo em (i) SEQ ID NO: 164, (ii) uma sequência que é, pelo menos, 90% ou 95% idêntica à sequência definida por (i) e (iii) uma sequência tal como definida por (i) contendo até dez substituições (por exemplo, substituições conservativas de aminoácidos), deleções ou inserções de aminoácidos. Em outra modalidade, a proteína isolada de ligação a antígeno compreende uma VH compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo em (i) SEQ ID NO: 165, (ii) uma sequência que é, pelo menos, 90% ou 95% idêntica à sequência definida por (i) e (iii) uma sequência tal como definida por (i) contendo até dez substituições (por exemplo, substituições conservativas de aminoácidos), deleções ou inserções de aminoácidos. Em outra modalidade, a proteína isolada de ligação a antígeno compreende uma VH compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo em (i) SEQ ID NO: 166, (ii) uma sequência que é, pelo menos, 90% ou 95% idêntica à sequência definida por (i) e (iii) uma sequência tal como definida por (i) contendo até dez substituições (por exemplo, substituições conservativas de aminoácidos), deleções ou inserções de aminoácidos. Em outra modalidade, a proteína isolada de ligação a antígeno compreende uma VH compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo em (i) SEQ ID NO: 167, (ii) uma sequência que é, pelo menos, 90% ou 95% idêntica à sequência definida por (i) e (iii) uma sequência tal como definida por (i) contendo até dez substituições (por exemplo, substituições conservativas de aminoácidos), deleções ou inserções de aminoácidos. Em outra modalidade, a proteína isolada de ligação a antígeno compreende uma VH compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo em (i) SEQ ID NO: 168, (ii) uma sequência que é, pelo menos, 90% ou 95% idêntica à sequência definida por (i) e (iii) uma sequência tal como definida por (i) contendo até dez substituições (por exemplo, substituições conservativas de aminoácidos), deleções ou inserções de aminoácidos. Em outra modalidade, a proteína isolada de ligação a antígeno compreende uma VH compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo em (i) SEQ ID NO: 169, (ii) uma sequência que é, pelo menos, 90% ou 95% idêntica à sequência definida por (i) e (iii) uma sequência tal como definida por (i) contendo até dez substituições (por exemplo, substituições conservativas de aminoácidos), deleções ou inserções de aminoácidos. Em outra modalidade, a proteína isolada de ligação a antígeno compreende uma VH compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo em (i) SEQ ID NO: 170, (ii) uma sequência que é, pelo menos, 90% ou 95% idêntica à sequência definida por (i) e (iii) uma sequência tal como definida por (i) contendo até dez substituições (por exemplo, substituições conservativas de aminoácidos), deleções ou inserções de aminoácidos.
[075] Em uma modalidade, a proteína isolada de ligação a antígeno compreende uma região variável de cadeia leve (VL) compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo em (i) SEQ ID NO: 137, (ii) uma sequência que é pelo menos 90% ou 95% idêntica à sequência definida por (i) e (iii) uma sequência tal como definida por (i) contendo até dez substituições (por exemplo, substituições conservativas de aminoácidos), deleções ou inserções de aminoácidos. Em outra modalidade, a proteína isolada de ligação a antígeno compreende uma VL compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo em (i) SEQ ID NO: 138, (ii) uma sequência que é, pelo menos, 90% ou 95% idêntica à sequência definida por (i) e (iii) uma sequência tal como definida por (i) contendo até dez substituições (por exemplo, substituições conservativas de aminoácidos), deleções ou inserções de aminoácidos. Em outra modalidade, a proteína isolada de ligação a antígeno compreende uma VL compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo em (i) SEQ ID NO: 139, (ii) uma sequência que é, pelo menos, 90% ou 95% idêntica à sequência definida por (i) e (iii) uma sequência tal como definida por (i) contendo até dez substituições (por exemplo, substituições conservativas de aminoácidos), deleções ou inserções de aminoácidos. Em outra modalidade, a proteína isolada de ligação a antígeno compreende uma VL compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo em (i) SEQ ID NO: 140, (ii) uma sequência que é, pelo menos, 90% ou 95% idêntica à sequência definida por (i) e (iii) uma sequência tal como definida por (i) contendo até dez substituições (por exemplo, substituições conservativas de aminoácidos), deleções ou inserções de aminoácidos. Em outra modalidade, a proteína isolada de ligação a antígeno compreende uma VL compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo em (i) SEQ ID NO: 141, (ii) uma sequência que é, pelo menos, 90% ou 95% idêntica à sequência definida por (i) e (iii) uma sequência tal como definida por (i) contendo até dez substituições (por exemplo, substituições conservativas de aminoácidos), deleções ou inserções de aminoácidos. Em outra modalidade, a proteína isolada de ligação a antígeno compreende uma VL compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo em (i) SEQ ID NO: 142, (ii) uma sequência que é, pelo menos, 90% ou 95% idêntica à sequência definida por (i) e (iii) uma sequência tal como definida por (i) contendo até dez substituições (por exemplo, substituições conservativas de aminoácidos), deleções ou inserções de aminoácidos. Em outra modalidade, a proteína isolada de ligação a antígeno compreende uma VL compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo em (i) SEQ ID NO: 143, (ii) uma sequência que é, pelo menos, 90% ou 95% idêntica à sequência definida por (i) e (iii) uma sequência tal como definida por (i) contendo até dez substituições (por exemplo, substituições conservativas de aminoácidos), deleções ou inserções de aminoácidos. Em outra modalidade, a proteína isolada de ligação a antígeno compreende uma VL compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo em (i) SEQ ID NO: 144, (ii) uma sequência que é, pelo menos, 90% ou 95% idêntica à sequência definida por (i) e (iii) uma sequência tal como definida por (i) contendo até dez substituições (por exemplo, substituições conservativas de aminoácidos), deleções ou inserções de aminoácidos. Em outra modalidade, a proteína isolada de ligação a antígeno compreende uma VL compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo em (i) SEQ ID NO: 145, (ii) uma sequência que é, pelo menos, 90% ou 95% idêntica à sequência definida por (i) e (iii) uma sequência tal como definida por (i) contendo até dez substituições (por exemplo, substituições conservativas de aminoácidos), deleções ou inserções de aminoácidos. Em outra modalidade, a proteína isolada de ligação a antígeno compreende uma VL compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo em (i) SEQ ID NO: 146, (ii) uma sequência que é, pelo menos, 90% ou 95% idêntica à sequência definida por (i) e (iii) uma sequência tal como definida por (i) contendo até dez substituições (por exemplo, substituições conservativas de aminoácidos), deleções ou inserções de aminoácidos. Em outra modalidade, a proteína isolada de ligação a antígeno compreende uma VL compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo em (i) SEQ ID NO: 147, (ii) uma sequência que é, pelo menos, 90% ou 95% idêntica à sequência definida por (i) e (iii) uma sequência tal como definida por (i) contendo até dez substituições (por exemplo, substituições conservativas de aminoácidos), deleções ou inserções de aminoácidos. Em outra modalidade, a proteína isolada de ligação a antígeno compreende uma VL compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo em (i) SEQ ID NO: 148, (ii) uma sequência que é, pelo menos, 90% ou 95% idêntica à sequência definida por (i) e (iii) uma sequência tal como definida por (i) contendo até dez substituições (por exemplo, substituições conservativas de aminoácidos), deleções ou inserções de aminoácidos. Em outra modalidade, a proteína isolada de ligação a antígeno compreende uma VL compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo em (i) SEQ ID NO: 149, (ii) uma sequência que é, pelo menos, 90% ou 95% idêntica à sequência definida por (i) e (iii) uma sequência tal como definida por (i) contendo até dez substituições (por exemplo, substituições conservativas de aminoácidos), deleções ou inserções de aminoácidos. Em outra modalidade, a proteína isolada de ligação a antígeno compreende uma VL compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo em (i) SEQ ID NO: 150, (ii) uma sequência que é, pelo menos, 90% ou 95% idêntica à sequência definida por (i) e (iii) uma sequência tal como definida por (i) contendo até dez substituições (por exemplo, substituições conservativas de aminoácidos), deleções ou inserções de aminoácidos. Em outra modalidade, a proteína isolada de ligação a antígeno compreende uma VL compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo em (i) SEQ ID NO: 151, (ii) uma sequência que é, pelo menos, 90% ou 95% idêntica à sequência definida por (i) e (iii) uma sequência tal como definida por (i) contendo até dez substituições (por exemplo, substituições conservativas de aminoácidos), deleções ou inserções de aminoácidos. Em outra modalidade, a proteína isolada de ligação a antígeno compreende uma VL compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo em (i) SEQ ID NO: 152, (ii) uma sequência que é, pelo menos, 90% ou 95% idêntica à sequência definida por (i) e (iii) uma sequência tal como definida por (i) contendo até dez substituições (por exemplo, substituições conservativas de aminoácidos), deleções ou inserções de aminoácidos. Em outra modalidade, a proteína isolada de ligação a antígeno compreende uma VL compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo em (i) SEQ ID NO: 153, (ii) uma sequência que é, pelo menos, 90% ou 95% idêntica à sequência definida por (i) e (iii) uma sequência tal como definida por (i) contendo até dez substituições (por exemplo, substituições conservativas de aminoácidos), deleções ou inserções de aminoácidos.
[076] Em qualquer uma das modalidades definidas de sequências de VL e VH mencionadas acima, a proteína isolada de ligação a antígeno pode ser, por exemplo, por exemplo, um anticorpo monoclonal, um anticorpo policlonal, um anticorpo recombinante, um anticorpo humano (por exemplo, completamente humano), um anticorpo humanizado, um anticorpo quimérico, um anticorpo multiespecífico, ou um fragmento de ligação de antígeno do mesmo. Além disso, o fragmento de anticorpo das proteínas isoladas de ligação a antígeno pode ser um fragmento Fab, e um fragmento Fab', um fragmento F(ab')2, um fragmento Fv, um diacorpo, ou uma molécula de anticorpo de cadeia única. Por exemplo, a proteína isolada de ligação a antígeno pode ser um anticorpo monoclonal humano, e pode ser, por exemplo, um anticorpo do tipo IgG1, IgG2, IgG3, ou IgG4. Além disso, as proteínas isoladas de ligação a antígeno podem ser proteínas de neutralização de ligação do antígeno.
[077] Em qualquer uma das modalidades definidas de sequências de VL e VH mencionadas acima, a proteína isolada de ligação a antígeno pode se ligar especificamente tanto a CRLR humano quanto a RAMP1 e não se ligam especificamente ao receptor de AM1, AM2 ou de amilina humana (por exemplo, AMY1), por exemplo, a proteína isolada de ligação a antígeno pode se ligar especificamente a CGRP R humano com um KD < 1 μM, < 100 nM, < 10 nM, ou < 5 nM, por exemplo, como determinado através de um ensaio de ligação FACS e analisado, por exemplo, usando métodos descritos em Rathanaswami, et al., Biochemical and Biophysical Research Communications 334 (2005) 1004-1013. Em qualquer uma das modalidades definidas de sequências de VL e VH mencionadas acima, a proteína isolada de ligação a antígeno pode inibir seletivamente CGRP R humano, em relação aos receptores AM1, AM2 ou AMY1 humanos, por exemplo, com uma razão de seletividade de 100 ou mais, 250 ou mais, 500 ou mais, 750 ou mais, 1.000 ou mais, 2.500 ou mais, 5.000 ou mais ou 10 mil ou mais, onde o grau de inibição seletiva pode ser determinado usando qualquer método adequado, por exemplo, usando um ensaio de cAMP como descrito nos exemplos deste documento. Em qualquer uma das modalidades definidas de sequências de VL e VH mencionadas acima, a proteína isolada de ligação a antígeno pode ter um Ki de ^ 100 nM, ^ 10 nM, ^ 1 nM, ^ 0,5 nM ou ^ 0,1 nM em um ensaio de competição de ligação de CGRP, por exemplo, em um ensaio de competição de ligação a 125I-CGRP radiomarcado às membranas das células expressando CGRP R humano, por exemplo, o ensaio descrito no Exemplo 5 deste documento.
[078] Em um aspecto, as proteínas isoladas de ligação a antígeno compreendem uma sequência de cadeia pesada que tem pelo menos 80%, 85%, 90% ou 95% de identidade de sequência com uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo nas SEQ ID NOs :29-41 . Algumas das proteínas isoladas de ligação a antígeno compreendem uma sequência de cadeia leve descrita que tem pelo menos 80%, 85%, 90% ou 95% de identidade de sequência com uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo nas SEQ ID NOs :12-28. Algumas das proteínas isoladas de ligação a antígeno compreendem uma sequência de cadeia pesada que tem pelo menos 80%, 85%, 90% ou 95% de identidade de sequência com uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo nas SEQ ID NOs: 29-41, e uma sequência de cadeia leve que tem pelo menos 80%, 85%, 90% ou 95% de identidade de sequência com uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo nas SEQ ID NOs: 12-28. Em algumas modalidades, as proteínas isoladas de ligação a antígeno compreendem (A) uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de (i) selecionado do grupo consistindo nas SEQ ID NOs: 29-41, ou (ii) como definido por (i) e contendo uma ou mais substituições (por exemplo, cinco, dez, quinze ou vinte) (por exemplo, substituições conservativas de aminoácidos), deleções ou inserções de aminoácidos; (B) uma cadeia leve compreendendo uma sequência (iii) selecionada do grupo consistindo nas SEQ ID NOs : 12-28, ou (iv) como definido por (iii) contendo uma ou mais substituições de aminoácidos (por exemplo, cinco, dez, quinze ou vinte) (por exemplo, substituições conservativas de aminoácidos), deleções ou inserções, ou (C) uma pesada corrente de (A) e uma cadeia leve de (B). Em algumas modalidades, as proteínas isoladas de ligação a antígeno compreendem uma cadeia pesada compreendendo uma sequência selecionada do grupo consistindo nas SEQ ID NOs: 29-41 e uma cadeia leve compreendendo uma sequência selecionada do grupo consistindo nas SEQ ID NOs: 12-28 .
[079] Em uma modalidade, a proteína isolada de ligação a antígeno compreende (A) uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo em (i) SEQ ID NO: 29, (ii) uma sequência que é, pelo menos, 90% ou 95 % idêntica à sequência definida por (i) e (iii) uma sequência tal como definida por (i) contendo até dez substituições (por exemplo, substituições conservativas de aminoácidos), deleções ou inserções de aminoácidos, e (B) uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo em (i) SEQ ID NO: 12, (ii) uma sequência que é, pelo menos, 90% ou 95% idêntica à sequência definida por (i) e (iii) uma sequência como definido por (i) contendo até dez substituições (por exemplo, substituições conservativas de aminoácidos), deleções ou inserções de aminoácidos.
[080] Em outra modalidade, a proteína isolada de ligação a antígeno compreende (A) uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo em (i) SEQ ID NO: 30, (ii) uma sequência que é, pelo menos, 90% ou 95 % idêntica à sequência definida por (i) e (iii) uma sequência tal como definida por (i) contendo até dez substituições (por exemplo, substituições conservativas de aminoácidos), deleções ou inserções de aminoácidos, e (B) uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo em (i) SEQ ID NO: 13, (ii) uma sequência que é, pelo menos, 90% ou 95% idêntica à sequência definida por (i) e (iii) uma sequência como definido por (i) contendo até dez substituições (por exemplo, substituições conservativas de aminoácidos), deleções ou inserções de aminoácidos.
[081] Em outra modalidade, a proteína isolada de ligação a antígeno compreende (A) uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo em (i) SEQ ID NO: 31, (ii) uma sequência que é, pelo menos, 90% ou 95 % idêntica à sequência definida por (i) e (iii) uma sequência tal como definida por (i) contendo até dez substituições (por exemplo, substituições conservativas de aminoácidos), deleções ou inserções de aminoácidos, e (B) uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo em (i) SEQ ID NO: 14, (ii) uma sequência que é, pelo menos, 90% ou 95% idêntica à sequência definida por (i) e (iii) uma sequência como definido por (i) contendo até dez substituições (por exemplo, substituições conservativas de aminoácidos), deleções ou inserções de aminoácidos.
[082] Em outra modalidade, a proteína isolada de ligação a antígeno compreende (A) uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo em (i) SEQ ID NO: 32, (ii) uma sequência que é, pelo menos, 90% ou 95 % idêntica à sequência definida por (i) e (iii) uma sequência tal como definida por (i) contendo até dez substituições (por exemplo, substituições conservativas de aminoácidos), deleções ou inserções de aminoácidos, e (B) uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo em (i) SEQ ID NO: 15, (ii) uma sequência que é, pelo menos, 90% ou 95% idêntica à sequência definida por (i) e (iii) uma sequência como definido por (i) contendo até dez substituições (por exemplo, substituições conservativas de aminoácidos), deleções ou inserções de aminoácidos.
[083] Em outra modalidade, a proteína isolada de ligação a antígeno compreende (A) uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo em (i) SEQ ID NO: 33, (ii) uma sequência que é, pelo menos, 90% ou 95 % idêntica à sequência definida por (i) e (iii) uma sequência tal como definida por (i) contendo até dez substituições (por exemplo, substituições conservativas de aminoácidos), deleções ou inserções de aminoácidos, e (B) uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo em (i) SEQ ID NO: 16, (ii) uma sequência que é, pelo menos, 90% ou 95% idêntica à sequência definida por (i) e (iii) uma sequência como definido por (i) contendo até dez substituições (por exemplo, substituições conservativas de aminoácidos), deleções ou inserções de aminoácidos.
[084] Em outra modalidade, a proteína isolada de ligação a antígeno compreende (A) uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo em (i) SEQ ID NO: 29, (ii) uma sequência que é, pelo menos, 90% ou 95 % idêntica à sequência definida por (i) e (iii) uma sequência tal como definida por (i) contendo até dez substituições (por exemplo, substituições conservativas de aminoácidos), deleções ou inserções de aminoácidos, e (B) uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo em (i) SEQ ID NO: 17, (ii) uma sequência que é, pelo menos, 90% ou 95% idêntica à sequência definida por (i) e (iii) uma sequência como definido por (i) contendo até dez substituições (por exemplo, substituições conservativas de aminoácidos), deleções ou inserções de aminoácidos.
[085] Em outra modalidade, a proteína isolada de ligação a antígeno compreende (A) uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo em (i) SEQ ID NO: 34, (ii) uma sequência que é, pelo menos, 90% ou 95 % idêntica à sequência definida por (i) e (iii) uma sequência tal como definida por (i) contendo até dez substituições (por exemplo, substituições conservativas de aminoácidos), deleções ou inserções de aminoácidos, e (B) uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo em (i) SEQ ID NO: 18, (ii) uma sequência que é, pelo menos, 90% ou 95% idêntica à sequência definida por (i) e (iii) uma sequência como definido por (i) contendo até dez substituições (por exemplo, substituições conservativas de aminoácidos), deleções ou inserções de aminoácidos.
[086] Em outra modalidade, a proteína isolada de ligação a antígeno compreende (A) uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo em (i) SEQ ID NO: 33, (ii) uma sequência que é, pelo menos, 90% ou 95 % idêntica à sequência definida por (i) e (iii) uma sequência tal como definida por (i) contendo até dez substituições (por exemplo, substituições conservativas de aminoácidos), deleções ou inserções de aminoácidos, e (B) uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo em (i) SEQ ID NO: 19, (ii) uma sequência que é, pelo menos, 90% ou 95% idêntica à sequência definida por (i) e (iii) uma sequência como definido por (i) contendo até dez substituições (por exemplo, substituições conservativas de aminoácidos), deleções ou inserções de aminoácidos.
[087] Em outra modalidade, a proteína isolada de ligação a antígeno compreende (A) uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo em (i) SEQ ID NO: 29, (ii) uma sequência que é, pelo menos, 90% ou 95 % idêntica à sequência definida por (i) e (iii) uma sequência tal como definida por (i) contendo até dez substituições (por exemplo, substituições conservativas de aminoácidos), deleções ou inserções de aminoácidos, e (B) uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo em (i) SEQ ID NO: 20, (ii) uma sequência que é, pelo menos, 90% ou 95% idêntica à sequência definida por (i) e (iii) uma sequência como definido por (i) contendo até dez substituições (por exemplo, substituições conservativas de aminoácidos), deleções ou inserções de aminoácidos.
[088] Em outra modalidade, a proteína isolada de ligação a antígeno compreende (A) uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo em (i) SEQ ID NO: 35, (ii) uma sequência que é, pelo menos, 90% ou 95 % idêntica à sequência definida por (i) e (iii) uma sequência tal como definida por (i) contendo até dez substituições (por exemplo, substituições conservativas de aminoácidos), deleções ou inserções de aminoácidos, e (B) uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo em (i) SEQ ID NO: 21, (ii) uma sequência que é, pelo menos, 90% ou 95% idêntica à sequência definida por (i) e (iii) uma sequência como definido por (i) contendo até dez substituições (por exemplo, substituições conservativas de aminoácidos), deleções ou inserções de aminoácidos.
[089] Em outra modalidade, a proteína isolada de ligação a antígeno compreende (A) uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo em (i) SEQ ID NO: 36, (ii) uma sequência que é, pelo menos, 90% ou 95 % idêntica à sequência definida por (i) e (iii) uma sequência tal como definida por (i) contendo até dez substituições (por exemplo, substituições conservativas de aminoácidos), deleções ou inserções de aminoácidos, e (B) uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo em (i) SEQ ID NO: 22, (ii) uma sequência que é, pelo menos, 90% ou 95% idêntica à sequência definida por (i) e (iii) uma sequência como definido por (i) contendo até dez substituições (por exemplo, substituições conservativas de aminoácidos), deleções ou inserções de aminoácidos.
[090] Em outra modalidade, a proteína isolada de ligação a antígeno compreende (A) uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo em (i) SEQ ID NO: 37, (ii) uma sequência que é, pelo menos, 90% ou 95 % idêntica à sequência definida por (i) e (iii) uma sequência tal como definida por (i) contendo até dez substituições (por exemplo, substituições conservativas de aminoácidos), deleções ou inserções de aminoácidos, e (B) uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo em (i) SEQ ID NO: 23, (ii) uma sequência que é, pelo menos, 90% ou 95% idêntica à sequência definida por (i) e (iii) uma sequência como definido por (i) contendo até dez substituições (por exemplo, substituições conservativas de aminoácidos), deleções ou inserções de aminoácidos.
[091] Em outra modalidade, a proteína isolada de ligação a antígeno compreende (A) uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo em (i) SEQ ID NO: 38, (ii) uma sequência que é, pelo menos, 90% ou 95 % idêntica à sequência definida por (i) e (iii) uma sequência tal como definida por (i) contendo até dez substituições (por exemplo, substituições conservativas de aminoácidos), deleções ou inserções de aminoácidos, e (B) uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo em (i) SEQ ID NO: 23, (ii) uma sequência que é, pelo menos, 90% ou 95% idêntica à sequência definida por (i) e (iii) uma sequência como definido por (i) contendo até dez substituições (por exemplo, substituições conservativas de aminoácidos), deleções ou inserções de aminoácidos.
[092] Em outra modalidade, a proteína isolada de ligação a antígeno compreende (A) uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo em (i) SEQ ID NO: 33, (ii) uma sequência que é, pelo menos, 90% ou 95 % idêntica à sequência definida por (i) e (iii) uma sequência tal como definida por (i) contendo até dez substituições (por exemplo, substituições conservativas de aminoácidos), deleções ou inserções de aminoácidos, e (B) uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo em (i) SEQ ID NO: 24, (ii) uma sequência que é, pelo menos, 90% ou 95% idêntica à sequência definida por (i) e (iii) uma sequência como definido por (i) contendo até dez substituições (por exemplo, substituições conservativas de aminoácidos), deleções ou inserções de aminoácidos.
[093] Em outra modalidade, a proteína isolada de ligação a antígeno compreende (A) uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo em (i) SEQ ID NO: 39, (ii) uma sequência que é, pelo menos, 90% ou 95 % idêntica à sequência definida por (i) e (iii) uma sequência tal como definida por (i) contendo até dez substituições (por exemplo, substituições conservativas de aminoácidos), deleções ou inserções de aminoácidos, e (B) uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo em (i) SEQ ID NO: 25, (ii) uma sequência que é, pelo menos, 90% ou 95% idêntica à sequência definida por (i) e (iii) uma sequência como definido por (i) contendo até dez substituições (por exemplo, substituições conservativas de aminoácidos), deleções ou inserções de aminoácidos.
[094] Em outra modalidade, a proteína isolada de ligação a antígeno compreende (A) uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo em (i) SEQ ID NO: 40, (ii) uma sequência que é, pelo menos, 90% ou 95 % idêntica à sequência definida por (i) e (iii) uma sequência tal como definida por (i) contendo até dez substituições (por exemplo, substituições conservativas de aminoácidos), deleções ou inserções de aminoácidos, e (B) uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo em (i) SEQ ID NO: 26, (ii) uma sequência que é, pelo menos, 90% ou 95% idêntica à sequência definida por (i) e (iii) uma sequência como definido por (i) contendo até dez substituições (por exemplo, substituições conservativas de aminoácidos), deleções ou inserções de aminoácidos.
[095] Em outra modalidade, a proteína isolada de ligação a antígeno compreende (A) uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo em (i) SEQ ID NO: 41, (ii) uma sequência que é, pelo menos, 90% ou 95 % idêntica à sequência definida por (i) e (iii) uma sequência tal como definida por (i) contendo até dez substituições (por exemplo, substituições conservativas de aminoácidos), deleções ou inserções de aminoácidos, e (B) uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo em (i) SEQ ID NO: 27, (ii) uma sequência que é, pelo menos, 90% ou 95% idêntica à sequência definida por (i) e (iii) uma sequência como definido por (i) contendo até dez substituições (por exemplo, substituições conservativas de aminoácidos), deleções ou inserções de aminoácidos.
[096] Em outra modalidade, a proteína isolada de ligação a antígeno compreende (A) uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo em (i) SEQ ID NO: 41, (ii) uma sequência que é, pelo menos, 90% ou 95 % idêntica à sequência definida por (i) e (iii) uma sequência tal como definida por (i) contendo até dez substituições (por exemplo, substituições conservativas de aminoácidos), deleções ou inserções de aminoácidos, e (B) uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo em (i) SEQ ID NO: 28, (ii) uma sequência que é, pelo menos, 90% ou 95% idêntica à sequência definida por (i) e (iii) uma sequência como definido por (i) contendo até dez substituições (por exemplo, substituições conservativas de aminoácidos), deleções ou inserções de aminoácidos.
[097] Em qualquer uma das modalidades definidas de sequências de cadeia pesada e leve mencionadas acima, a proteína isolada de ligação a antígeno pode compreender a sequência de cadeia pesada e/ou leve especificada, mas com um peptídeo sinal diferente ou sem peptídeo sinal. Em qualquer uma das modalidades definidas de sequências de cadeia pesada e leve mencionadas acima, a proteína isolada de ligação a antígeno pode ser, por exemplo, um anticorpo monoclonal, um anticorpo policlonal, um anticorpo recombinante, um anticorpo humano (por exemplo, completamente humano), um anticorpo humanizado, um anticorpo quimérico, um anticorpo multiespecífico, ou um fragmento de ligação a antígeno do mesmo. Além disso, o fragmento de anticorpo das proteínas isoladas de ligação a antígeno pode ser um fragmento Fab, um fragmento Fab’, um fragmento F(ab’)2, um fragmento Fv, um diacorpo, ou uma molécula de anticorpo de cadeia única. Por exemplo, a proteína isolada de ligação a antígeno pode ser um anticorpo monoclonal humano, e pode ser, por exemplo, um anticorpo tipo IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4. Além disso, as proteínas isoladas de ligação a antígeno podem ser proteínas de neutralização de ligação do antígeno.
[098] Em qualquer uma das modalidades definidas de sequências de cadeia pesada e leve mencionadas acima, a proteína isolada de ligação a antígeno pode se ligar especificamente tanto a CRLR humano quanto a RAMP1 e não se ligam especificamente ao receptor de AM1, AM2 ou de amilina humana (por exemplo, AMY1), por exemplo, a proteína isolada de ligação a antígeno pode se ligar especificamente a CGRP R humano com um KD < 1 μM, < 100 nM, < 10 nM, ou < 5 nM, por exemplo, como determinado através de um ensaio de ligação FACS e analisado, por exemplo, usando métodos descritos em Rathanaswami, et al., Biochemical and Biophysical Research Communications 334 (2005) 1004-1013. Em qualquer uma das modalidades definidas de sequências de cadeia pesada e leve mencionadas acima, a proteína isolada de ligação a antígeno pode inibir seletivamente CGRP R humano, em relação aos receptores AM1, AM2 ou AMY1 humanos, por exemplo, com uma razão de seletividade de 100 ou mais, 250 ou mais, 500 ou mais, 750 ou mais, 1.000 ou mais, 2.500 ou mais, 5.000 ou mais ou 10 mil ou mais, onde o grau de inibição seletiva pode ser determinado usando qualquer método adequado, por exemplo, usando um ensaio de cAMP como descrito nos exemplos deste documento. Em qualquer uma das modalidades definidas de sequências de cadeia pesada e leve mencionadas acima, a proteína isolada de ligação a antígeno pode ter um Ki de < 100 nM, < 10 nM, < 1 nM, < 0,5 nM ou < 0,1 nM em um ensaio de competição de ligação de CGRP, por exemplo, em um ensaio de competição de ligação a 125I-CGRP radiomarcado às membranas das células expressando CGRP R humano, por exemplo, o ensaio descrito no Exemplo 5 deste documento.
[099] Em um outro aspecto, também são fornecidos polinucleotídeos isolados de ácido nucleico que codificam qualquer uma das proteínas de ligação a antígeno resumidas acima. Em uma modalidade, o polinucleotídeo isolado compreende uma sequência selecionada do grupo consistindo nas SEQ ID NOs: 175, 176, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 186, 187, 188, 189, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209 e 210. Em outra modalidade, o polinucleotídeo isolado compreende uma sequência selecionada do grupo consistindo nas SEQ ID NOs :224-258. Em outra modalidade, o polinucleotídeo isolado compreende uma sequência capaz de hibridação em condições severas de hibridização com uma sequência selecionada do grupo consistindo nas SEQ ID NOs :224-258. Em outra modalidade, o polinucleotídeo isolado compreende uma sequência que é de cerca de 80%, 85%, 90% ou 95% ou mais idêntica a uma sequência selecionada do grupo consistindo nas SEQ ID NOs :224-258. Em alguns casos, as moléculas isoladas de ácido nucleico são operavelmente ligadas a uma sequência de controle. Em modalidades relacionadas, os polinucleotídeos isolados são incorporados em um vetor de expressão.
[100] Também estão incluídas linhagens de células transformadas com vetores de expressão compreendendo polinucleotídeos isolados como descrito acima. Em um aspecto relacionado, são também fornecidos vetores de expressão e células hospedeiras transformadas ou transfectadas com os vetores de expressão que compreendem as moléculas isoladas de ácido nucléico que codificam as proteínas de ligação a antígeno de CGRP acima descritas.
[101] Em outro aspecto, também é fornecido um método para preparar as proteínas de ligação a antígenos que inclui a etapa de preparar a proteína de ligação a antígeno de uma célula hospedeira que secreta a proteína de ligação a antígeno. Em algumas modalidades, a proteína de ligação a antígeno é gerada através de um imunogene compreendendo receptor de CGRP solúvel. Em algumas modalidades, tal receptor de CGRP solúvel é obtido pela coexpressão e purificação de um domínio extracelular N-terminal (ECD) da CRLR humano e um ECD de RAMP1 humana, por exemplo, um ECD de CRLR humano, compreendendo a SEQ ID NO: 6 e um ECD de RAMP1 compreendendo a SEQ ID NO: 8, por exemplo, como descrito nos exemplos 1 e 2 deste documento.
[102] Em outro aspecto, uma composição farmacêutica é fornecida compreendendo pelo menos uma das proteínas de ligação a antígenos acima resumidas e um excipiente farmaceuticamente aceitável. Em uma modalidade, a composição farmacêutica pode compreender um agente ativo adicional que é selecionado do grupo que consiste em radioisótopo, radionuclídeo, uma toxina, ou uma terapêutica e um grupo quimioterápico.
[103] Em um aspecto, a proteína isolada de ligação a antígeno é eficaz para inibir vasodilatação e/ou diminuir a inflamação neurogênica, quando administrada a um paciente. Em uma modalidade, a proteína isolada de ligação a antígeno é eficaz para reduzir a frequência e/ou gravidade das dores de cabeça, por exemplo, dores de cabeça de enxaqueca. Por exemplo, a proteína de ligação a antígeno pode ser usada como um tratamento agudo da enxaqueca, e/ou como um tratamento profilático para evitar ou reduzir a frequência e/ou gravidade dos sintomas, particularmente os sintomas da dor, associados a uma crise de enxaqueca.
[104] Outros aspectos ainda fornecem métodos para tratar ou prevenir uma condição associada com CGRP R em um paciente, compreendendo administrar a um paciente uma quantidade eficaz de pelo menos uma proteína isolada de ligação a antígeno acima resumida. Em uma modalidade, a condição é uma cefaleia, por exemplo, uma enxaqueca ou uma cefaleia em salvas ou outro tipo de dor, por exemplo, uma dor crônica, em outra modalidade a mesma é o diabetes mellitus (tipo II), em outra modalidade a mesma é inflamação , particularmente, inflamação neurogênica; em outra modalidade a mesma é um distúrbio cardiovascular, em outra modalidade, é um desarranjo hemodinâmico associado com endotoxemia e sepse, em outra modalidade é vasodilatação.
[105] Em um outro aspecto, também é fornecido um método para inibição da ligação de CGRP ao ser humano CGRP R, por exemplo, a porção extracelular de CGRP R, em um paciente compreendendo administrar uma quantidade eficaz de pelo menos uma das proteínas de ligação a antígenos fornecida neste documento e/ou resumidas acima.
[106] Estes e outros aspectos serão descritos em maior detalhe aqui. Cada um dos aspectos previstos pode abranger várias modalidades aqui fornecidas. Portanto, é previsível que cada uma das modalidades envolvendo um elemento ou combinações de elementos pode ser incluída em cada aspecto descrito, e todas essas combinações dos aspectos e modalidades acima são expressamente considerados. Outras características, objetos e vantagens da invenção são aparentes na descrição detalhada que se segue. BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[107] A Fig. 1 mostra um alinhamento de sequências de RAMP1 de humano, macaco cinomolgos e rato.
[108] A Fig. 2 mostra um alinhamento de sequências CRLR de humano, macaco cinomolgos e rato.
[109] As Figs 3A e 3B mostrar alinhamentos de sequência filogeneticamente baseadas de CDRs de cadeia leve dos clones de anticorpos de receptores anti-CGRP indicados tendo cadeias leves kappa e certas sequências consenso correspondentes.
[110] A Fig. 4 mostra alinhamentos de sequência filogeneticamente baseadas de CDRs de cadeia leve dos clones de anticorpos de receptores anti- CGRP indicados tendo cadeias leves lambda, e certas sequências consenso correspondentes.
[111] A Figs. 5A, 5B, 5C, 5D e 5E mostram alinhamentos de sequência filogeneticamente baseadas de CDRs de cadeia pesada dos clones de anticorpos de receptores anti-CGRP indicados, e certas sequências consenso correspondentes.
[112] A Fig. 5F mostra sequências consenso exemplares das CDRs de cadeia pesada de anticorpos de receptor anti- CGRP divulgadas neste documento.
[113] A Fig. 6 é uma plotagem de dados de dois experimentos mostrando o percentual de inibição de ligante a CGRP R marcado por 1.092 sobrenadantes de hibridoma anti- CGRP R (diamantes) e 68 sobrenadantes de controle negativo (quadrados).
[114] As Figs. 7 A a D mostram dados exemplares de IC50 do ensaio de cAMP de células que expressam receptor de hCGRP (Fig. 7A), hAM1 (Fig. 7B), hAM2 (Fig. 7C) e receptores de amilina humana (Fig. 7D) por três mAbs anti-CGRP R indicados.
[115] A Fig. 8 mostra um exemplo de dados de ligação de 125I-CGRP tal como podem ser usados para determinar a Ki dos mAbs para o receptor de CGRP humano.
[116] A Figs. 9A a D mostram dados de competição da Biacore por anticorpos selecionados divulgados neste documento.
[117] A Fig. 10 mostra uma determinação de Kd por FACS de mAb 12G8.
[118] A Fig. 11 mostra um alinhamento de sequências de cinomolgos, humanos, quimeras de humanos, rato, e RAMP1de rhesus.
[119] As Figs. 12A a B mostram um alinhamento sequências de humanos, cinomolgos, rhesus, rato, quimera de humano e CRLR consenso.
[120] A Figs. 13A a 13C mostram dados de FACS representativos de diferentes receptores de CGRP quimérico que se ligam aos anticorpos anti- CGRP R.
[121] A Fig. 14 mostra mapas de peptídeos derivados de digestões de AspN de CGRP R individualmente (cromatograma A) e da digestão de uma amostra de controle contendo anticorpo monoclonal CGRP R 12G8 (B cromatograma).
[122] A Fig. 15 mostra digestões de AspN de CGRP R na presença de diferentes concentrações de anticorpos de neutralização CGRP R.
[123] A Fig. 16 mostra digestões de AspN de CGRP R na presença de diferentes concentrações de anticorpos de neutralização CGRP R, 4E4.
[124] A Fig. 17 mostra a intensidade de coloração da imunohistoquímica de células que expressam vários componentes de receptores com 32H7 de anticorpos.
DESCRIÇÃO DETALHADA
[125] Os cabeçalhos das seções aqui usados são apenas para fins de organização e não devem ser interpretados como limitantes da matéria em questão descrita.
[126] A menos que definido de outra forma, os termos científicos e técnicos usados em conexão com o presente pedido terão os significados que são comumente entendidos por aqueles versados na técnica Além disso, a menos que requerido de outra forma pelo contexto, termos singulares devem incluir pluralidades e termos plurais devem incluir o singular.
[127] Geralmente, as nomenclaturas usadas em conexão com, e técnicas de, cultura de tecidos e células, biologia molecular, imunologia, microbiologia, genética e química de proteínas e ácidos nucleicos e hibridização descritas neste documento são bem conhecidas e usadas comumente no estado da técnica. Os métodos e técnicas do presente pedido são geralmente realizados de acordo com os métodos convencionais conhecidas no estado da técnica e como descritos em várias referências gerais e mais específicas que são citadas e discutidas ao longo do presente relatório descritivo salvo indicação em contrário. Ver, por exemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001), Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1992), and Harlow and Lane Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1990), que são incorporados aqui por referência. As reações enzimáticas e técnicas de purificação são realizadas de acordo com as especificações do fabricante, como é comumente feito no estado da técnica ou como aqui descrito. A terminologia usada em conexão com, e os procedimentos e técnicas de laboratório de, química analítica, química orgânica sintética, e química medicinal e farmacêutica descritos neste documento são bem conhecidos e usados comumente no estado da técnica. As técnicas padrões podem ser usadas para sínteses químicas, análises químicas, preparações farmacêuticas, formulação e distribuição, e tratamento de pacientes.
[128] Deve ser entendido que esta invenção não se limita à metodologia específica, protocolos e reagentes, etc., aqui descritos e, como tal, pode variar. A terminologia usada neste documento tem a finalidade de descrever modalidades particulares apenas, e não se destina a limitar o escopo da presente invenção, que é definido unicamente pelas reivindicações.
[129] Diferente dos exemplos de operação, ou quando indicado em contrário, todos os números que expressam quantidades de ingredientes ou condições de reação usados neste documento devem ser entendidos como modificados em todos os casos pelo termo "cerca de". O termo "cerca de" quando usado em conexão com porcentagens significa ± 1%. Definições
[130] O "polinucleotídeo" ou "ácido nucléico" inclui tanto polímeros de nucleotídeos com filamento único quanto com filamento duplo. Os nucleotídeos compreendendo o polinucleotídeo podem ser ribonucleotídeos ou desoxirribonucleótidos ou uma forma modificada de qualquer tipo de nucleotídeos. Referidas modificações incluem modificações de bases, tais como bromouridina e derivados de inosina, modificações da ribose tais como 2', 3'- didesoxirribose, e modificações da ligação internucleotídeo como fosforotioato, fosforoditioato, fosforoselenoato, fosforodiselenoato, fosforoanilotioato, fosforaniladato e fosforoamidato.
[131] O "oligonucleotídeo" significa um polinucleotídeo compreendendo 200 nucleotídeos ou menos. Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos são de 10 a 60 bases de comprimento. Em outras modalidades, oligonucleotídeos são de 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 a 40 nucleotídeos de comprimento. Os oligonucleotídeos podem ser de filamento simples ou filamento duplo, por exemplo, para uso na construção de um gene mutante. Os oligonucleotídeos podem ser oligonucleotídeos sense ou antisense. Um oligonucleotídeo pode incluir uma marcação, incluindo uma radiomarcação, uma marcação fluorescente, um hapteno ou uma marcação antigênica, para ensaios de detecção. Os oligonucleotídeos podem ser usados, por exemplo, como iniciadores de PCR, iniciadores de clonagem ou sondas de hibridização.
[132] Uma "molécula de ácido nucléico isolado" significa um DNA ou RNA de origem genômica, mRNA, cDNA, ou sintética ou alguma combinação dos mesmos que não está associada com a totalidade ou uma porção de um polinucleotídeo em que o polinucleotídeo isolado é encontrado na natureza, ou é ligado a um polinucleotídeo o qual não está ligado na natureza. Para os fins desta divulgação, deve-se compreender que "uma molécula de ácido nucléico compreendendo" uma sequência de nucleotídeos específica não abrange os cromossomos intactos. As moléculas de ácido nucléico isoladas "compreendendo" sequências de ácidos nucleicos especificadas podem incluir, além das sequências especificadas, sequências de codificação para até dez ou mesmo até vinte outras proteínas ou porção das mesmas, ou podem incluir sequências reguladoras operavelmente ligadas que controlam a expressão da região de codificação das sequências de ácidos nucleicos recitadas, e/ou podem incluir sequências de vetores.
[133] Salvo disposição em contrário, a extremidade esquerda de qualquer sequência de polinucleotídeo de filamento único aqui discutidos é a extremidade 5'; a direção do lado esquerdo das sequências de polinucleotídeo de filamento duplo é referida como a direção 5'. A direção de 5' para 3' além das transcrições de RNA nascente é referida como a direção de transcrição; as regiões da sequência no filamento de DNA com a mesma sequência como o transcrito de RNA, que são 5' para a extremidade 5' do transcrito de RNA são referidas como "sequências a montante"; as regiões da sequência no filamento de DNA tendo a mesma sequência como o transcrito de RNA, que são 3' para a extremidade 3' do transcrito de RNA são referidas como "sequências a jusante".
[134] O termo "sequência de controle" se refere a uma sequência de polinucleotídeos que pode afetar a expressão e processamento das sequências de codificação a qual a mesma é ligada. A natureza das sequências de controle pode depender do organismo hospedeiro. Em modalidades particulares, as sequências de controle para procariontes podem incluir um promotor, um sítio de ligação ribossomal, e uma sequência de terminação de transcrição. Por exemplo, as sequências de controle para eucariontes podem incluir promotores compreendendo um ou uma pluralidade de sítios de reconhecimento para fatores de transcrição, sequências intensificadoras da transcrição, e sequência de terminação de transcrição. As "sequências de controle" podem incluir sequências de líder e/ou sequências de parceiro de fusão.
[135] O termo "vetor" significa qualquer molécula ou entidade (por exemplo, ácidos nucléicos, bacteriófagos, plasmídeos ou vírus) usada para transferir informações de codificação de proteínas em uma célula hospedeira.
[136] O termo "vetor de expressão" ou "construto de expressão" se refere a um vetor que é adequado para a transformação de uma célula hospedeira e contém sequências de ácidos nucleicos que direcionam e/ou controlam (em conjunto com a célula hospedeira) a expressão de uma ou mais regiões de codificação heterólogas operavelmente ligadas. Um construto de expressão pode incluir, mas não está limitado a, sequências que afetam ou controlam a transcrição, tradução e, se íntrons estão presentes, afetam splicing de RNA de uma região de codificação operavelmente ligada aos mesmos.
[137] Como usado aqui, "operavelmente ligado" significa que os componentes para o qual o termo é aplicado estão em uma relação que lhes permite desempenhar as suas funções inerentes em condições adequadas. Por exemplo, uma sequência de controle em um vetor que é "operavelmente ligado" a uma sequência de codificação de proteínas é ligada aos mesmos de modo que a expressão da sequência de codificação de proteína seja alcançada em condições compatíveis com a atividade transcricional das sequências de controle.
[138] O termo "célula hospedeira" significa uma célula que foi transformada, ou é capaz de ser transformada com uma sequência de ácido nucléico e, portanto, expressa um gene de interesse está presente. O termo inclui os descendentes da célula de origem, se o descendente é ou não idêntico na morfologia ou na constituição genética da célula de origem, desde que o gene de interesse está presente.
[139] O termo "transdução" significa a transferência de genes de uma bactéria para outra, geralmente por bacteriófagos. A "transdução" também se refere à aquisição e transferência de sequências celulares eucarióticas por replicação defeituosa retrovírus.
[140] O termo "transfecção" significa a absorção de DNA estranho ou exógeno por uma célula, e uma célula foi "transfectada" quando o DNA exógeno foi introduzido no interior da membrana celular. Várias técnicas de transfecção são bem conhecidas no estado da técnica e são divulgadas neste documento. Ver, por exemplo, Graham et al., 1973, Virology 52:456; Sambrook et al., 2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, supra; Davis et al., 1986, Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier; Chu et al., 1981, Gene 13:197. Essas técnicas podem ser usadas para introduzir um ou mais porções de DNA exógeno em células hospedeiras adequadas.
[141] O termo "transformação" se refere a uma mudança nas características genéticas de uma célula, e uma célula que foi transformada quando a mesma foi modificada para conter novo DNA ou RNA. Por exemplo, uma célula é transformada onde é geneticamente modificada a partir do seu estado nativo através da introdução de novo material genético via transfecção, transdução, ou outras técnicas. Após a transfecção ou transdução, a transformação de DNA pode recombinar com a célula, pela interação de forma física em um cromossomo da célula, ou pode ser mantida transitoriamente como um elemento epissomal sem ser replicado, ou pode replicar independentemente como um plasmídeo. A célula é considerada como tendo sido "estavelmente transformada", quando o DNA é replicado transformando com a divisão da célula.
[142] Os termos "polipeptídeo" ou "proteína" são usados intercambiavelmente aqui para se referir a um polímero de resíduos de aminoácidos. Os termos também se aplicam aos polímeros de aminoácidos em que um ou mais resíduos de aminoácidos é um análogo ou mimético de um aminoácido de ocorrência natural correspondente, bem como a polímeros de aminoácidos que ocorrem naturalmente. Os termos também podem abranger os polímeros de aminoácidos que foram modificados, por exemplo, pela adição de resíduos de carboidratos para formar glicoproteínas, ou fosforilados. Os polipeptídeos e proteínas podem ser produzidos por uma célula de ocorrência natural e não recombinante, ou são produzidos por uma célula geneticamente modificada ou recombinante, e compreendem moléculas tendo a sequência de aminoácidos da proteína nativa, ou moléculas tendo deleções, adições e/ou substituições de um ou mais aminoácidos da sequência nativa. Os termos "polipeptídeo" e "proteínas" especificamente englobam as proteínas de ligação a antígeno, por exemplo, proteínas de ligação a antígeno CGRP R, proteínas de ligação CGRP R, anticorpos, sequências que têm deleções, adições e/ou substituições de um ou mais aminoácidos de uma proteína de ligação a antígenos. O "fragmento de polipeptídico" se refere a um polipeptídeo que tem uma deleção amino-terminal, uma deleção carboxil-terminal, e/ou uma deleção interna, em comparação com a proteína de comprimento completo. Tais fragmentos podem também conter aminoácidos modificados em comparação com a proteína de comprimento completo. Em certas modalidades, os fragmentos têm cerca de cinco a 500 aminoácidos de comprimento. Por exemplo, os fragmentos podem ter pelo menos 5, 6, 8, 10, 14, 20, 50, 70, 100, 110, 150, 200, 250, 300, 350, 400, ou 450 aminoácidos de comprimento. Os fragmentos de polipeptídeos úteis incluem fragmentos imunologicamente funcionais de anticorpos, incluindo domínios de ligação. No caso de um anticorpo de ligação de CGRP R, os fragmentos úteis incluem, mas não estão limitados a, uma região de CDR, um domínio variável de uma cadeia pesada ou leve, uma porção de uma cadeia de anticorpo ou apenas seu domínio variável incluindo duas CDRs, e semelhantes. O "receptor de CGRP", ou "CGRP R", é entendido como incluindo a RAMP1 e CRLR.
[143] O termo "proteína isolada" (por exemplo, proteína isolada de ligação a antígeno), "polipeptídeo isolado" ou "anticorpo isolado" significa que uma proteína, polipeptídeo ou anticorpo em questão (1) é livre de pelo menos algumas outras proteínas com as quais normalmente seriam encontradas, (2) é essencialmente livre de outras proteínas da mesma fonte, por exemplo, da mesma espécie, (3) é expresso por uma célula de uma espécie diferente, (4), foi separada de pelo menos cerca de 50 por cento dos polinucleotídeos, lipídios, carboidratos, ou outros materiais com os quais é associado na natureza, (5) é operavelmente associado (por meio da interação covalente ou não covalente) com um polipeptídeo com o qual não está associado na natureza, ou (6) não ocorrem na natureza. Normalmente, uma "proteína isolada", "polipeptídeo isolado" ou "anticorpo isolado" constitui, pelo menos, cerca de 5%, pelo menos, cerca de 10%, pelo menos cerca de 25%, ou pelo menos cerca de 50% de uma determinada amostra. O DNA genômico, mRNA, cDNA ou outro RNA, de origem sintética, ou qualquer combinação dos mesmos pode codificar proteínas como um fato isolado. De preferência, o anticorpo ou polipeptídeo de proteína isolada é substancialmente livre de outras proteínas ou outros polipeptídeos ou outros contaminantes que são encontrados em seu ambiente natural que possam interferir com a sua terapêutica, diagnóstico, pesquisa, profilaxia ou outro uso.
[144] Uma "variante" de um polipeptídeo (por exemplo, uma proteína de ligação a antígeno, ou um anticorpo) compreende uma sequência de aminoácidos na qual um ou mais resíduos de aminoácidos estão inseridos, deletados e/ou substituídos na sequência de aminoácidos em relação à outra sequência de polipeptídeo. As variantes incluem proteínas de fusão.
[145] Um "derivado" de um polipeptídeo é um polipeptídeo (por exemplo, uma proteína de ligação a antígeno, ou um anticorpo) que foi quimicamente modificado de alguma maneira distinta das variantes de inserção, deleção ou substituição, por exemplo, via conjugação a outro grupamento químico.
[146] O termo "ocorrência natural", como usado em todo o relatório descritivo em conjunto com materiais biológicos, tais como polipeptídeos, ácidos nucléicos, células hospedeiras, e similares, se refere a materiais que são encontrados na natureza.
[147] Uma "proteína de ligação a antígeno" como aqui usado significa uma proteína que se liga especificamente a um antígeno alvo específico, como CGRP R, principalmente de primatas, por exemplo, CGRP R humano. Uma proteína de ligação a antígeno CGRP R se liga especificamente ao receptor de CGRP humano.
[148] Uma proteína de ligação a antígeno é dito "se ligar especificamente" a seu alvo quando a constante de dissociação (KD) é <10-6 M. O anticorpo se liga especificamente ao antígeno alvo com “alta afinidade” quando o KD é <1x 10-8 M. Em uma modalidade, o anticorpo vai se ligar a CGRP R, ou CGRP R humana com um KD <5x 10-7; em outra modalidade os anticorpos vão se ligar com um KD <1x 10-7; em outra modalidade os anticorpos vão se ligar com um KD <5x 10-8; em outra modalidade os anticorpos vão se ligar com um KD <1x 10-8; em outra modalidade os anticorpos vão se ligar com um KD <5x 10-9; em outra modalidade os anticorpos vão se ligar com um KD <1x 10-9; em outra modalidade os anticorpos vão se ligar com um KD <5x 10-10; em outra modalidade os anticorpos vão se ligar com um KD <1x 10-10.
[149] Um anticorpo, fragmento de ligação a antígeno do mesmo ou proteína de ligação a antígeno "inibe seletivamente" um receptor específico em relação a outros receptores quando o IC50 do anticorpo, fragmento de ligação a antígeno do mesmo ou proteína de ligação a antígeno em um ensaio de inibição do receptor específico é pelo menos 50 vezes menor que o IC50 em um ensaio de inibição de outro receptor de "referência". A "razão de seletividade" é o IC50 do receptor de referência dividido pelo IC50 do receptor específico. Um anticorpo, fragmento de ligação a antígeno do mesmo de antígeno ou proteína de ligação inibe seletivamente o receptor de CGRP humano se o IC50, do anticorpo, fragmento de ligação a antígeno do mesmo ou proteína de ligação a antígeno em um ensaio de cAMP, por exemplo, o ensaio de inibição de cAMP, como descrito no Exemplo 4 aqui, é pelo menos 50 vezes menor do que o IC50 desse mesmo, do anticorpo, fragmento de ligação a antígeno do mesmo ou proteína de ligação a antígeno em um ensaio de inibição do receptor de AM1, AM2 humano ou de uma amilina humana (por exemplo, AMY1). Por meio de exemplos não limitantes, se o IC50 de um anticorpo anti-CGRP R específico em um ensaio de cAMP de hCGRP R é, por exemplo, entre 0,1 nM e 20 nM, e o IC50 do mesmo anticorpo em um ensaio de cAMP de hAM1, hAM2 ou receptor de AMY1 humana é 1000 nM ou mais, que o anticorpo que inibe seletivamente o receptor hCGRP. Uma proteína de ligação a antígeno que inibe seletivamente um receptor específico é entendida como uma proteína de neutralização de ligação a antígeno em relação a esse receptor.
[150] A "região de ligação a antígeno" significa uma proteína, ou uma porção de uma proteína, que se liga especificamente a um antígeno específico. Por exemplo, a porção de uma proteína de ligação a antígeno que contém os resíduos de aminoácidos que interagem com um antígeno e confere à proteína de ligação a antígeno a sua especificidade e afinidade para o antígeno é referida como "região de ligação a antígeno". Uma região de ligação a antígeno tipicamente inclui uma ou mais "região de ligação de complementaridade" ("CDRs"). Certas regiões de ligação a antígeno também incluem uma ou mais regiões de "estrutura". A "CDR" é uma sequência de aminoácidos que contribui para a especificidade e afinidade de ligação a antígeno. As regiões de "estrutura" podem ajudar na manutenção da conformação adequada das CDRs para promover a ligação entre a região de ligação a antígeno e um antígeno.
[151] Em certos aspectos, as proteínas recombinantes de ligação a antígeno que se ligam a proteína de CGRP R, ou CGRP R humano são fornecidas. Neste contexto, a "proteína recombinante" é uma proteína feita usando técnicas recombinantes, ou seja, através da expressão de um ácido nucleico recombinante como aqui descrito. Os métodos e técnicas para a produção de proteínas recombinantes são bem conhecidos no estado da técnica.
[152] O termo "anticorpo" se refere a uma imunoglobulina intacta de qualquer isotipo, ou um fragmento de ligação a antígeno do mesmo que pode competir com o anticorpo intacto para ligação específica ao antígeno alvo, e incluir, por exemplo, anticorpos quiméricos, humanizados, completamente humanos, e biespecíficos. Um "anticorpo", como tal, é uma espécie de uma proteína de ligação a antígeno. Um anticorpo intacto geralmente compreenderá pelo menos duas cadeias pesadas de comprimento completo e duas cadeias leves de comprimento completo, mas em alguns casos podem incluir menos cadeias tais como as de anticorpos de ocorrência natural em camelídeos que podem compreender apenas cadeias pesadas. Os anticorpos podem ser derivados somente a partir de uma única fonte, ou podem ser "quiméricos", isto é, porções diferentes do anticorpo podem ser derivadas de dois anticorpos diferentes, conforme descrito mais adiante. As proteínas de ligação a antígeno, anticorpos, ou fragmentos de ligação podem ser produzidas em hibridomas, através de técnicas de DNA recombinante, ou por clivagem enzimática ou química de anticorpos intactos. Salvo indicação em contrário, o termo "anticorpo" inclui, além dos anticorpos compreendendo duas cadeias pesadas de comprimento completo e duas cadeias leves de comprimento completo, derivativos, variantes, fragmentos, e mutações dos mesmos, exemplos dos quais são descritos abaixo.
[153] O termo "cadeia leve" inclui uma cadeia leve de comprimento completo e fragmentos das mesmas tendo a sequência da região variável suficiente para conferir especificidade de ligação. A cadeia leve de comprimento completo inclui um domínio de região variável, VL, e um domínio de região constante, CL. O domínio da região variável da cadeia leve está no amino terminal do polipeptídeo. As cadeias leves incluem as cadeias kappa e as cadeias lambda.
[154] O termo "cadeia pesada" inclui uma cadeia pesada de comprimento completo e fragmentos das mesmas tendo a sequência da região variável suficiente para conferir a especificidade de ligação. Uma cadeia pesada de comprimento completo inclui um domínio de região variável, VH, e três domínios de região constante, CH1, CH2, CH3 e. O domínio VH está no amino-terminal do polipeptídeo, e os domínios de CH estão no carboxil-terminal, com a CH3 estando mais próxima do carboxil-terminal do polipeptídeo. As cadeias pesadas podem ser de qualquer isotipo, incluindo IgG (incluindo os subtipos IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4), IgA (incluindo os subtipos IgA1 e IgA2), IgM e IgE.
[155] O termo "sequência sinal", "sequência de líder" ou "peptídeo sinal" se refere a uma cadeia curta de peptídeo (3-60 aminoácidos de comprimento) que direciona o transporte de uma proteína. Os peptídeos sinal também podem ser chamados de sinais alvos, sequências sinais, peptídeos transientes, ou sinais de localização. Alguns peptídeos sinais são clivados da proteína pela peptidase sinal após as proteínas serem transportados, de modo que a forma biologicamente ativa da proteína (por exemplo, uma proteína de ligação a antígeno como aqui descrita) é a forma, clivada mais curta. Assim, os termos como "anticorpo compreendendo uma cadeia pesada ...", "anticorpo compreendendo uma cadeia leve ...", etc., onde o anticorpo é caracterizado como tendo uma cadeia pesada e/ou cadeia leve com uma sequência identificada, específica são entendidos como incluindo anticorpos tendo as sequências específicas identificadas, anticorpos tendo as sequências específicas identificadas, exceto que as sequências sinais são substituídas por sequências sinais diferentes, bem como os anticorpos tendo as sequências identificadas, menos qualquer sequência sinal.
[156] O termo "fragmento de ligação a antígeno" (ou simplesmente "fragmento") de um anticorpo ou cadeia de imunoglobulina (cadeia pesada ou leve), como usado neste documento, compreende uma porção (independentemente de como essa porção é obtida ou sintetizada) de um anticorpo que não apresenta pelo menos alguns dos aminoácidos presentes em uma cadeia de comprimento completo, mas que é capaz de se ligar especificamente a um antígeno. Tais fragmentos são biologicamente ativos na medida em que se ligam especificamente ao antígeno alvo e podem competir com outras as proteínas de ligação a antígeno, incluindo anticorpos intactos, para ligação específica a um epítopo dado. Em um aspecto, tal fragmento irá manter pelo menos uma CDR presente na cadeia pesada ou leve de comprimento completo e, em algumas modalidades, será compreenderá uma cadeia pesada e/ou de cadeia leve única ou porção da mesma. Estes fragmentos biologicamente ativos podem ser produzidos por técnicas de DNA recombinante, ou podem ser produzidos por clivagem enzimática ou química de proteínas de ligação a antígeno, incluindo anticorpos intactos. Os fragmentos de imunoglobulina imunologicamente funcionais incluem, mas não estão limitados a, Fab, Fab', F(ab')2, Fv e anticorpos do domínio e anticorpos de cadeia única, e pode ser derivado de qualquer fonte de mamíferos, incluindo mas não limitada a, humano, camundongo, rato camelídeo, ou coelho. É contemplado, ainda, que uma porção funcional das proteínas de ligação a antígeno divulgadas neste documento, por exemplo, uma ou mais CDRs, poderia ser covalentemente ligada a uma segunda proteína ou uma molécula pequena para criar um agente terapêutico direcionado a um alvo particular no corpo , possuindo propriedades terapêuticas bifuncionais, ou tendo uma meia-vida sérica prolongada.
[157] Um "fragmento Fab" é constituído por uma cadeia leve e as regiões variáveis e CH1 de uma cadeia pesada. A cadeia pesada de uma molécula Fab não pode formar uma ligação de dissulfeto com outra molécula da cadeia pesada.
[158] Uma região de "Fc" contém dois fragmentos de cadeia pesada compreendendo os domínios CH1 e CH2 de um anticorpo. Os dois fragmentos de cadeia pesada são mantidos juntos por duas ou mais ligações de dissulfeto e por interações hidrofóbicas dos domínios CH3.
[159] Um “fragmento Fab'” contém uma cadeia leve e uma porção de uma cadeia pesada que contém o domínio de VHe o domínio CH1 e também a região entre os domínios e CH1 e CH2, de tal forma que uma ligação de dissulfeto intercadeias pode ser formada entre as duas cadeias pesadas de dois fragmentos Fab' para formar uma molécula de F(ab') 2.
[160] Um "fragmento F(ab ')2" contém duas cadeias leves e duas cadeias pesadas contendo uma porção da região constante entre os domínios CH1 e CH2, de tal forma que uma ligação de dissulfeto intercadeias é formada entre as duas cadeias pesadas. Um fragmento F(ab ')2, portanto, é composto de dois fragmentos Fab' que são mantidos juntos por uma ligação dissulfeto entre as duas cadeias pesadas.
[161] A "região de Fv" compreende regiões variáveis de ambas as cadeias pesadas e leves, mas não tem as regiões constantes.
[162] Os "anticorpos de cadeia única" são moléculas de Fv em que as regiões variáveis de cadeia leve e pesada foram ligadas por um ligante flexível para formar uma cadeia polipeptídica única que formam uma região de ligação a antígenos. Os anticorpos de cadeia única são discutidos em detalhe na Publicação Internacional de pedido de patente WO 88/01649 e patente dos Estados Unidos 4.946.778 e 5.260.203, as divulgações das quais são sendo incorporadas aqui por referência.
[163] Um "anticorpo do domínio" é um fragmento de imunoglobulina imunologicamente funcional contendo apenas a região variável de uma cadeia pesada ou a região variável de uma cadeia leve. Em alguns casos, duas ou mais regiões de VH são covalentemente unidas com um ligante de peptídeo para criar um anticorpo de domínio bivalente. As duas regiões de VH de um anticorpo de domínio bivalente podem ter como alvo os mesmos antígenos ou antígenos diferentes.
[164] Uma "proteína de ligação ao antígeno bivalente" ou "anticorpo bivalente" compreende dois sítios de ligação a antígeno. Em alguns casos, os dois sítios de ligação têm as mesmas especificidades de antígeno. As proteínas de ligação a antígeno bivalente e anticorpos bivalentes podem ser biespecíficas, ver, infra.
[165] A "proteína de ligação a antígeno multiespecífica" ou "anticorpo multiespecífico" é uma que tem como alvo mais de um antígeno ou epítopo.
[166] Uma proteína ou anticorpo de ligação ao antígeno "biespecífico", "duplo-específico" ou "bifuncional" é uma proteína ou anticorpo de ligação a antígeno híbrido, respectivamente, tendo dois sítios de ligação a antígenos diferentes. Proteínas e anticorpos de ligação a antígeno biespecífico ou anticorpos são uma espécie de proteína de ligação a antígeno multiespecífico ou anticorpos multiespecífico e podem ser produzidas por uma variedade de métodos, incluindo, mas não limitado a, fusão de hibridomas ou ligação de fragmentos Fab'. Ver, por exemplo, Songsivilai and Lachmann, 1990, Clin. Exp. Immunol. 79:315-321; Kostelny et al. , 1992, J. Immunol. 148:1547-1553. Os dois sítios de ligação de uma proteína ou anticorpo de ligação a antígeno biespecífico se ligarão a dois epítopos diferentes, que podem residir nos mesmos ou diferentes alvos de proteínas.
[167] O termo "proteína de neutralização de ligação a antígeno" ou "anticorpo de neutralização" se refere a uma proteína ou anticorpo de ligação a antígeno, respectivamente, que se liga a um ligante, impede a ligação do ligante ao seu parceiro de ligação e interrompe a resposta biológica que, de outra forma, resultaria da ligação do ligante ao seu parceiro de ligação. Ao avaliar a ligação e especificidade de uma proteína de ligação a antígeno, por exemplo, um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno imunologicamente funcional do mesmo, um anticorpo ou fragmento inibirá substancialmente a ligação de um ligante ao seu parceiro de ligação quando um excesso de anticorpo reduz a quantidade de parceiros de ligação ligados ao ligante pelo menos cerca de 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99% ou mais (como medido em um ensaio de ligação competitiva in vitro). No caso de uma proteína de ligação a CGRP R, tal molécula de neutralização irá diminuir a capacidade de CGRP R se ligar a CGRP.
[168] O termo "compete", quando usado no contexto de proteínas de ligação a antígeno que podem se ligar a mesma região em um antígeno alvo, significa que a competição entre as proteínas de ligação a antígeno é determinada por um ensaio em que a proteína de ligação a antígeno (por exemplo, anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno imunologicamente funcional do mesmo) em teste impede ou inibe a ligação específica de uma proteína de referência de ligação a antígeno (por exemplo, um ligante ou um anticorpo de referência) a um antígeno comum (por exemplo, CGRP R ou um fragmento de ligação a antígeno do mesmo). Qualquer um de uma série de ensaios de ligação competitiva pode ser usado, por exemplo: radioimunoensaio direto ou indireto em fase sólida (RIA), imunoensaio de enzima direto ou indireto em fase sólida (EIA), ensaio de competição de sanduíche (ver, por exemplo, Stahli et al., 1983, Methods in Enzymology 9:242-253); solid phase direct biotin-avidin EIA (see, e.g., Kirkland et al. , 1986, J. Immunol. 137:3614-3619) solid phase direct labeled assay, solid phase direct labeled sandwich assay (see, e.g., Harlow and Lane, 1988, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press); solid phase direct label RIA using I-125 label (see, e.g., Morel et al., 1988, Molec. Immunol. 25:7-15); solid phase direct biotin- avidin EIA (see, e.g., Cheung, et al., 1990, Virology 176:546-552); and direct labeled RIA (Moldenhauer et al. , 1990, Scand. J. Immunol. 32:77-82)). Tal ensaio pode envolver o uso de antígeno purificado ligado a uma superfície sólida ou células que portam qualquer um destes, uma proteína de ligação a antígeno teste não marcado e uma proteína de referência de ligação a antígeno marcado. A inibição competitiva pode ser medida pela determinação da quantidade de marcação ligada à superfície sólida ou células na presença da proteína de ligação a antígeno teste. As proteínas de ligação a antígeno identificadas por ensaio de competição (proteínas de ligação a antígeno de competição) incluem proteínas de ligação a antígeno que se ligam ao mesmo epítopo na medida em que as proteínas de ligação a antígeno de referência e proteínas de ligação a antígeno se ligam a um epítopo adjacente suficientemente proximal ao epítopo ligado pela proteína de referência de ligação a antígeno para o obstáculo esteárico ocorrer. Normalmente, quando uma proteína de competição de ligação a antígeno está presente em excesso, isso irá inibir a ligação específica de uma proteína de referência de ligação a antígeno a um antígeno comum por pelo menos 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70 % ou 75%. Em alguns casos, a ligação é inibida por pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, ou 97% ou mais. A inibição competitiva também pode ser medida pela imobilização de uma proteína de referência de ligação a antígeno a um substrato, por exemplo, um "chip sensor", capturando antígeno sobre o substrato através da ligação ao anticorpo de referência, e ensaiando se uma proteína de ligação a antígeno diferente (uma proteína de competição de ligação a antígeno) pode adicionalmente se ligar ao antígeno. Um exemplo do último ensaio de ligação competitiva emprega uma análise da Biacore, e é descrito no Exemplo 7 neste documento.
[169] O termo "antígeno" ou "imunogeno" se refere a uma molécula ou uma porção de uma molécula capaz de ser ligada por um agente de ligação seletiva, como uma proteína de ligação a antígeno (incluindo, por exemplo, um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno imunológico funcional do mesmo) e, adicionalmente, capaz de ser usado em um animal para produzir anticorpos capazes de se ligar ao antígeno. Um antígeno pode possuir um ou mais epítopos que são capazes de interagir com as proteínas de ligação a antígeno diferentes, por exemplo, anticorpos.
[170] O termo "epítopo" é a porção de uma molécula que está ligada por uma proteína de ligação a antígeno (por exemplo, um anticorpo). O termo inclui qualquer determinante capaz de se liga especificamente a uma proteína de ligação a antígeno, tal como um anticorpo ou um receptor de células T. Um epítopo pode ser contíguo ou não contíguo (por exemplo, (i) em resíduos de aminoácidos, polipeptídeo de cadeia única, que não são contíguos entre si na sequência polipeptídica, mas que dentro do contexto da molécula estão ligados pela proteína de ligação a antígeno, ou (ii) em um receptor multimérico, por exemplo, CGRP R, que compreende dois ou mais componentes individuais, por exemplo, RAMP1 e CRLR, resíduos de aminoácidos presentes em dois ou mais dos componentes individuais, mas que, no contexto do receptor multimérico são ligados pela proteína de ligação a antígeno). Em certas modalidades, os epítopos podem ser miméticos na medida na medida em que compreendem uma estrutura tridimensional que é semelhante a um epítopo usado para gerar a proteína de ligação a antígeno, mas não compreendem nenhum ou apenas alguns dos resíduos de aminoácidos encontrados no epítopo usado para gerar a proteína de ligação a antígeno. Na maioria das vezes, os epítopos residem em proteínas, mas em alguns casos, podem residir em outros tipos de moléculas, tais como ácidos nucléicos. Os determinantes de epítopo podem incluir agrupamentos de superfície quimicamente ativa de moléculas tais como aminoácidos, cadeias laterais de açúcares, grupos fosforil ou sulfonil, e podem ter três características estruturais dimensionais específicas e/ou características de carga específica. Geralmente, os anticorpos específicos para um antígeno alvo em particular preferencialmente reconhecem um epítopo no antígeno alvo em uma mistura complexa de proteínas e/ou macromoléculas.
[171] O termo "identidade" se refere a uma relação entre as sequências de duas ou mais moléculas de polipeptídeos ou duas ou mais moléculas de ácidos nucléicos, como determinado pelo alinhamento e comparação das sequências. A "identidade percentual" significa a porcentagem de resíduos idênticos entre os aminoácidos ou nucleotídeos nas moléculas comparadas e é calculada com base no tamanho da menor das moléculas que estão sendo comparadas. Para estes cálculos, os gaps nos alinhamentos (se houver) devem ser direcionados por um determinado modelo matemático ou programa de computador (ou seja, um "algoritmo"). Os métodos que podem ser usados para calcular a identidade dos ácidos nucléicos ou polipeptídeos alinhados incluem aqueles descritos em Computational Molecular Biology, (Lesk, A. M., ed.), 1988, New York: Oxford University Press; Biocomputing Informatics e Genome Projects, (Smith, D. W., ed.), 1993, New York: Academic Press; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, (Griffin, A. M., e Griffin, H. G., eds.), 1994, New Jersey: Humana Press; von Heinje, G., 1987, Sequence Analysis in Molecular Biology, New York: Academic Press; Sequence Analysis Primer, (Gribskov, M. e Devereux, J., eds.), 1991, New York: M. Stockton Press; e Carillo et al., 1988, SIAM J. Applied Math. 48:1073.
[172] No cálculo da identidade percentual, as sequências comparadas são alinhadas de uma forma que dá a maior combinação entre as sequências. O programa de computador usado para determinar a identidade percentual é o pacote de programa GCG, que inclui GAP (Devereux et al., 1984, Nucl. Acid Res. 12:387; Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, WI). O algoritmo GAP de computador é usado para alinhar os dois polipeptídeos ou polinucleotídeos para os quais a identidade percentual de sequência deve ser determinada. As sequências são alinhadas para combinação ideal de seus respectivos aminoácidos ou nucleotídeos (a "amplitude combinada", como determinado pelo algoritmo). Uma penalidade de abertura de gap (que é calculada como 3x a diagonal média, em que a "diagonal média" é a média da diagonal da matriz de comparação a ser usada, a "diagonal" é a pontuação ou o número atribuído a cada combinação perfeita de ácido amino pela matriz de comparação particular) e uma penalidade da amplitude para gap (que é geralmente 1/10 vezes a penalidade de abertura de gap), bem como uma matriz de comparação como o PAM 250 ou BLOSUM 62 são usados em conjunto com o algoritmo. Em certas modalidades, uma matriz de comparação padrão (ver, Dayhoff et al., 1978, Atlas of Protein Sequence and Structure 5:345-352 for the PAM 250 comparison matrix; Henikoff et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:10915-10919 para a matriz de comparação BLOSUM 62) também é usada pelo algoritmo.
[173] Os parâmetros recomendados para determinar a identidade percentual para polipeptídeos ou sequências de nucleotídeos usando o programa GAP são os seguintes:
[174] Algoritmo: Needleman et al., 1970, J. Mol. Biol. 48:443-453;
[175] Matriz de comparação: BLOSUM 62 from Henikoff et al., 1992, supra;
[176] Penalidade para Gap: 12 (mas com nenhuma penalidade para gaps de extremidade);
[177] Penalidade para comprimento de Gap: 4;
[178] Limiar de Similaridade: 0.
[179] Certos esquemas de alinhamento para alinhar duas sequências de aminoácidos podem resultar na combinação de apenas uma região curta de duas sequências, e esta pequena região alinhada pode ter identidade de sequência muito alta mesmo que não haja nenhuma relação significativa entre as duas sequências de comprimento completo. Assim, o método de alinhamento selecionado (programa GAP) pode ser ajustado se assim o desejar a resultar em um alinhamento que se estende por pelo menos 50 aminoácidos contíguos do polipeptídeo alvo.
[180] Como usado aqui, "substancialmente puro" significa que as espécies descritas de molécula é a presente espécie predominante, ou seja, em uma base molar é mais abundante do que qualquer outra espécie individual na mesma mistura. Em certas modalidades, uma molécula substancialmente pura é uma composição em que a espécie em questão compreende pelo menos 50% (em uma base molar) de todas as espécies macromoleculares presentes. Em outras modalidades, uma composição substancialmente pura compreenderá pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, ou 99% de todas as espécies macromoleculares presentes na composição. Em outras modalidades, a espécie em questão é purificada para homogeneidade essencial onde a espécie contaminante não pode ser detectada na composição por métodos de detecção convencionais e, assim, a composição consiste em uma única espécie macromolecular detectável.
[181] O termo "tratar" se refere a qualquer indício de sucesso no tratamento ou amenização de uma lesão, patologia ou condição, incluindo qualquer parâmetro objetivo ou subjetivo, tais como redução; remissão, diminuição dos sintomas ou tornando a lesão, patologia ou condição mais tolerável para o paciente; redução na taxa de degeneração ou declínio; tornar o ponto final da degeneração menos debilitante, melhorar o bem-estar físico ou mental do paciente. O tratamento ou amenização dos sintomas pode ser baseado em parâmetros objetivos ou subjetivos, incluindo os resultados de um exame físico, de exames neuropsiquiátricos e/ou de uma avaliação psiquiátrica. Por exemplo, certos métodos aqui apresentados tratam com sucesso a enxaqueca seja profilaticamente ou como um tratamento agudo, diminuindo a frequência das enxaquecas, diminuindo a severidade da enxaqueca e/ou amenizando um sintoma associado à enxaqueca.
[182] Uma "quantidade eficaz" é geralmente uma quantidade suficiente para reduzir a gravidade e/ou frequência dos sintomas, eliminar os sintomas e/ou causa subjacente, prevenir a ocorrência de sintomas e/ou a sua causa subjacente, e/ou melhorar ou remediar o dano que resulta de ou está associado com a enxaqueca. Em algumas modalidades, a quantidade eficaz é uma quantidade terapeuticamente eficaz ou uma quantidade profilaticamente eficaz. A "quantidade terapeuticamente eficaz" é uma quantidade suficiente para remediar um estado de doença (por exemplo, enxaqueca) ou sintomas, particularmente um estado ou sintoma associado com o estado da doença, ou de outra forma, impedir, dificultar, retardar ou reverter a progressão do estado da doença ou qualquer outro sintoma indesejável associado com a doença de qualquer forma. Uma "quantidade profilaticamente eficaz" é uma quantidade de uma composição farmacêutica que, quando administrada a um sujeito, terá o efeito profilático pretendido, por exemplo, prevenir ou retardar o início (ou recorrência) da enxaqueca, ou reduzir a probabilidade do início (ou recorrência) da enxaqueca ou sintomas da enxaqueca. O pleno efeito terapêutico ou profilático não ocorre necessariamente pela administração de uma dose, e pode ocorrer apenas após a administração de uma série de doses. Assim, uma quantidade terapeuticamente ou profilaticamente eficaz pode ser administrada em uma ou mais administrações.
[183] O "Aminoácido" inclui o seu significado normal no estado da técnica. Os vinte aminoácidos de ocorrência natural e suas abreviaturas seguem o uso convencional. Veja, Immunology-A Synthesis, 2° Edição, (E. S. Golub e D. R. Green, eds.), Sinauer Associates: Sunderland, Mass. (1991), aqui incorporado como referência para qualquer propósito. Os estereoisômeros (por exemplo, D-aminoácidos) dos vinte aminoácidos convencionais, aminoácidos não naturais, tais como os aminoácidos α, a-dissubstituídos, N-alquil aminoácidos, e outros aminoácidos não convencionais também podem ser componentes adequados para polipeptídeos e são incluídos no termo "aminoácidos". Exemplos de aminoácidos não convencionais incluem: 4-hidroxiprolina, y- carboxiglutamato, ε-N, N, N-trimetillisina, ε-N-acetilisina, O-fosfoserina, N-acetilserina, N- Formilmetionina, 3- metilhistidina, 5-hidroxilisina, o-N-metilarginina, e outros aminoácidos e iminoácidos semelhantes (por exemplo, 4- hidroxiprolina). Na notação do polipeptídeo aqui usada, a direção do lado esquerdo é a direção do amino terminal e a direção do lado direito é a direção do carboxil-terminal, de acordo com o uso padrão e convenção. Visão Geral
[184] As proteínas de ligação a antígenos que se ligam a proteína CGRP R, incluindo a proteína de CGRP R humano (hCGRP R) são fornecidas aqui. As proteínas de ligação a antígeno fornecidas são polipeptídeos em que uma ou mais regiões determinantes de complementaridade (CDRs), como descritos aqui, são incorporados e/ou associados. Em algumas proteínas de ligação a antígeno, as CDRs são incorporadas em uma região de "estrutura", que orienta as CDR(s) de tal forma que as propriedades de ligação a antígeno adequado da CDR(s) sejam alcançadas. Em geral, as proteínas de ligação a antígeno que são fornecidas podem interferir com, bloquear, reduzir ou modular a interação entre CGRP e CGRP R.
[185] Certas proteínas de ligação a antígeno descritas aqui são anticorpos ou são derivadas de anticorpos. Em certas modalidades, a estrutura polipeptídica das proteínas de ligação a antígeno é baseada em anticorpos, incluindo, mas não limitado a, anticorpos monoclonais, anticorpos biespecíficos, minicorpos, anticorpos de domínio, anticorpos sintéticos (por vezes referidos aqui como "miméticos de anticorpos"), anticorpos quiméricos, anticorpos humanizados, anticorpos humanos, fusões de anticorpos (por vezes referidas aqui como "conjugados de anticorpos"), e fragmentos dos mesmos. As várias estruturas são ainda mais descritas neste documento a seguir.
[186] As proteínas de ligação a antígeno fornecidas neste documento demonstraram se ligar a CGRP R, em particular a CGRP R humano. Conforme descrito nos exemplos abaixo, certas proteínas de ligação a antígeno foram testadas e verificou-se que as mesmas se ligam a epítopos diferentes daqueles ligados a uma série de outros anticorpos dirigidos contra um ou outro dos componentes de CGRP R. As proteínas de ligação a antígeno que são fornecidas competem com CGRP e, assim, evitam que o CGRP se ligue ao seu receptor. Como consequência, as proteínas de ligação a antígeno contidas neste documento são capazes de inibir a atividade de CGRP R. Em particular, as proteínas de ligação a antígeno que se ligam a estes epítopos podem ter uma ou mais das seguintes atividades: inibção, inter alia, indução das vias de transdução de sinal de CGRP R, inibição da vasodilatação, causando vasoconstrição, diminuição da inflamação, por exemplo, inflamação neurogênica, e outros efeitos fisiológicos induzidos por CGRP R sobre a ligação de CGRP.
[187] As proteínas de ligação a antígeno que são divulgadas aqui tem uma variedade de utilidades. Algumas das proteínas de ligação a antígeno, por exemplo, são úteis em ensaios de ligação específico, purificação por afinidade de CGRP R, em particular hCGRP R ou seus ligantes e em ensaios de triagem para identificar outros antagonistas da atividade de CGRP R. Algumas das proteínas de ligação a antígenos são úteis para a inibição da ligação de CGRP a CGRP R.
[188] As proteínas de ligação a antígeno podem ser usadas em uma variedade de aplicações de tratamento, como explicado aqui. Por exemplo, certas proteínas de ligação a antígeno CGRP R são úteis para tratar condições associadas com a sinalização mediada CGRP R, como a redução, alívio, ou tratamento da frequência e/ou gravidade da enxaqueca, redução, alívio ou tratamento das cefaleias em salvas, redução, alívio ou tratamento da dor crônica, alívio ou tratamento de diabetes mellitus (tipo II), redução, alívio ou tratamento dos distúrbios cardiovasculares e redução, alívio ou tratamento dos distúrbios hemodinâmicos associados a endotoxemia e septicemia em um paciente. Outros usos para as proteínas de ligação a antígeno incluem, por exemplo, o diagnóstico de doenças ou condições associadas a CGRP R e ensaios de triagem para determinar a presença ou ausência de CGRP R. Algumas das proteínas de ligação a antígeno aqui descritas são úteis no tratamento das consequências, sintomas, e/ou patologia associada com atividade de CGRP R. Estes incluem, mas não estão limitados a, vários tipos de enxaqueca.
Recepto CGRP R
[189] As proteínas de ligação a antígeno divulgadas neste documento se ligam a CGRP R, em particular CGRP R humano. CGRP R é um multímero que inclui tanto CRLR quanto RAMP1. A sequência de nucleotídeos de CRLR humana é fornecida aqui como SEQ ID NO: 1. A sequência de aminoácidos de CRLR humana é fornecida aqui como SEQ ID NO: 2. A sequência de nucleotídeos de RAMP1 humana é fornecida aqui como SEQ ID NO: 3. A sequência de aminoácidos de RAMP1 humana é fornecida aqui como SEQ ID NO: 4. As proteínas de ligação a antígeno aqui descritas se ligam a porção extracelular de CGRP R, que compreende a porção extracelular de CRLR e RAMP1. Um domínio extracelular exemplar ("ECD") de CRLR humana é codificado pela sequência de nucleotídeos apresentada como SEQ ID NO: 5, e tem a sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID NO: 6. Esta sequência inclui um peptídeo sinal, um CRLR ECD maduro exemplar (menos o peptídeo sinal) tem a sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID NO: 10. Um ECD exemplar de RAMP1 humana é codificado pela sequência de nucleotídeos apresentada como SEQ ID NO: 7, e tem a sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID NO: 8. Esta sequência inclui um peptídeo sinal, um RAMP1 ECD maduro exemplar (menos o peptídeo sinal) tem a sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID NO: 11. Como descrito a seguir, as proteínas CGRP R também podem incluir fragmentos. Como usado aqui, os termos são usados intercambiavelmente para designar um receptor, em particular, salvo indicação em contrário especificada, um receptor humano que se liga especificamente a CGRP.
[190] O termo CGRP R também inclui modificações pós- translacionais da sequência de aminoácido de CGRP R, por exemplo, possíveis sítios de glicosilação N-ligados. Assim, as proteínas de ligação a antígeno podem se ligar a ou ser geradas a partir de proteínas glicosiladas em uma ou mais das posições. Proteínas de Ligação a Receptor CGRP R
[191] Uma variedade de agentes de ligação seletiva úteis para regular a atividade de CGRP R é fornecida. Estes agentes incluem, por exemplo, proteínas, antígeno de ligação que contêm um domínio de ligação do antígeno (por exemplo, anticorpos de cadeia única, os anticorpos de domínio, imunoadesões e polipeptídeos com uma região de ligação a antígeno) e se ligam especificamente a CGRP R, em particular CGRP R humano. Alguns dos agentes, por exemplo, são úteis para inibir a ligação de CGRP a CGRP R, e pode assim ser usado para inibir, interferir ou modular uma ou mais atividades relacionadas com a sinalização de CGRP R.
[192] Em geral, as proteínas de ligação a antígeno que são fornecidas normalmente incluem uma ou mais CDRs como descritas aqui (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5 ou 6). Em alguns casos, a proteína de ligação a antígeno compreende (a) uma estrutura de polipeptídeo e (b) uma ou mais CDRs que são inseridas e/ou unidas à estrutura polipeptídica. A estrutura polipeptídica pode assumir uma variedade de formas diferentes. Por exemplo, a mesma pode ser, ou compreender, a estrutura de um anticorpo que ocorre naturalmente, ou fragmento ou variante do mesmo, ou pode ser completamente sintética na natureza. Exemplos de várias estruturas polipeptídicas estão descritos abaixo.
[193] Em certas modalidades, a estrutura polipeptídica das proteínas de ligação a antígeno é um anticorpo ou é derivada de um anticorpo, incluindo, mas não limitado a, anticorpos monoclonais, anticorpos biespecíficos, minicorpos, anticorpos de domínio, anticorpos sintéticos (por vezes referido aqui como "anticorpo miméticos"), anticorpos quiméricos, anticorpos humanizados, anticorpos de fusões (por vezes referido como "conjugados de anticorpos"), e porções ou fragmentos de cada um, respectivamente. Em alguns casos, a proteína de ligação a antígeno é um fragmento imunológico de um anticorpo (por exemplo, uma Fab, um Fab ', um F(ab')2, ou um scFv). As várias estruturas são ainda descritas e definidas neste documento.
[194] Algumas das proteínas de ligação a antígeno como aqui fornecidas se ligam especificamente a CGRP R humano. Em uma modalidade específica, a proteína de ligação a antígeno se liga especificamente a proteína humana CGRP R compreendendo CRLR humano com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 e RAMP1 humana, tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4.
[195] Em modalidades onde a proteína de ligação a antígeno é usada para aplicações terapêuticas, uma proteína de ligação a antígeno pode inibir, interferir ou modular uma ou mais atividades biológicas de CGRP R. Neste caso, uma proteína de ligação a antígeno se liga especificamente e/ou substancialmente inibe a ligação de CGRP humano a CGRP R quando um excesso de anticorpos reduz a quantidade de CGRP R humano ligado a CGRP, ou vice-versa, por pelo menos cerca de 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99% ou mais (por exemplo, através da medição da ligação em um ensaio de ligação competitiva in vitro). Estrutura de Anticorpo de Ocorrência Natural
[196] Algumas das proteínas de ligação a antígeno que são fornecidas têm a estrutura tipicamente associada com ocorrência natural de anticorpos. As unidades estruturais destes anticorpos normalmente incluem um ou mais tetrâmeros, cada uma composta por duas duplas idênticas de cadeias polipeptídicas, embora algumas espécies de mamíferos também produzam anticorpos tendo apenas uma cadeia pesada única. Em um anticorpo típico, cada par ou dupla inclui uma cadeia "leve" de comprimento completo (em certas modalidades, cerca de 25 kDa) e uma cadeia "pesada" de comprimento completo (em certas modalidades, cerca de 50-70 kDa). Cada cadeia de imunoglobulina individual é composta por vários "domínios de imunoglobulina", cada uma consistindo em cerca de 90 a 110 aminoácidos e expressando um padrão de dobradura característico. Estes domínios são as unidades básicas das quais os polipeptídeos de anticorpo são compostos. A porção amino-terminal de cada cadeia geralmente inclui um domínio variável que é responsável pelo reconhecimento do antígeno. A porção carboxil-terminal é mais conservada evolutivamente do que outra extremidade da cadeia e é referida como a "região constante" ou "região C". As cadeias leves humanas em geral são classificadas como cadeias leves kappa e lambda, e cada uma delas contém um domínio variável e um domínio constante. As cadeias pesadas são normalmente classificadas como mu, delta, gama, alfa, ou cadeias épsilon, e estas definem o isotipo do anticorpo como IgM, IgD, IgG, IgA e IgE, respectivamente. A IgG tem vários subtipos, incluindo, mas não limitado a, IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. Os subtipos de IgM incluem IgM1 e IgM2. Os subtipos de IgA incluem IgA1 e IgA2. Em humanos, o isotipos IgA e IgD contém quatro cadeias pesadas e quatro cadeias leves, o isotipos IgG e IgE contêm duas cadeias pesadas e duas cadeias leves, e do isotipo IgM contém cinco cadeias pesadas e cinco cadeias leves. A região C da cadeia pesada geralmente compreende um ou mais domínios que podem ser responsáveis pela função efetora. O número de domínios da região constante de cadeia pesada dependerá do isotipo. As cadeias pesadas de IgG, por exemplo, cada um contém três domínios da região C conhecidos como CH1, CH2 e CH3. Os anticorpos que são fornecidos podem ter qualquer um destes isotipos e subtipos. Em certas modalidades, o anticorpo de CGRP R é do subtipo IgG1, IgG2, ou IgG4.
[197] Nas cadeias pesadas e leves de comprimento completo, as regiões variáveis e constantes são unidas pela região "J" de cerca de doze ou mais aminoácidos, com a cadeia pesada também incluindo uma região "D" com cerca de mais dez aminoácidos. Ver, por exemplo, Fundamental Immunology, 2° ed., Cap. 7 (Paul, W., ed.) 1989, New York: Raven Press (incorporado aqui por referência em sua totalidade para todos os efeitos). As regiões variáveis de cada par de cadeia leve/pesada geralmente formam o sítio de ligação ao antígeno.
[198] Um exemplo de domínio constante pesado de IgG2 de um anticorpo monoclonal de CGRP R exemplar tem a sequência de aminoácidos: ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFP AVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPP VAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPRE EQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLP PSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLT VDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (os últimos 326 resíduos da sequência mostrados como SEQ. ID NO:29).
[199] Um exemplo de um domínio constante de leve kappa de um anticorpo monoclonal exemplar de CGRP R tem a sequência de aminoácidos: RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQE SVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (os últimos 107 resíduos da sequência mostrados como a SEQ ID NO: 14).
[200] As regiões variáveis das cadeias de imunoglobulina, geralmente, apresentam a mesma estrutura global, compreendendo as regiões de estrutura (FR) relativamente conservadas unidas por três regiões hipervariáveis, mais frequentemente chamadas de "regiões determinantes de complementaridade" ou CDRs. As CDRs das duas cadeias de cada par de cadeia pesada / cadeia leve mencionado acima normalmente são alinhados pelas regiões de estrutura para formar uma estrutura que se liga especificamente com um epítopo específico na proteína alvo (por exemplo, CGRP R). Do N-terminal para o C-terminal, ambas as regiões variáveis de cadeia leve e pesada de ocorrência natural normalmente estão em conformidade com a seguinte ordem desses elementos: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 e FR4. Um sistema de numeração foi concebido para atribuir números de aminoácidos que ocupam posições em cada um desses domínios. Este sistema de numeração é definido nas sequências de Kabat das proteínas de interesse imunológico (1987 e 1991, NIH, Bethesda, MD), ou Chothia & Lesk, 1987, J. Mol. Biol. 196:901-917; Chothia et al., 1989, Nature 342 :878-883.
[201] As várias regiões variáveis de cadeia leve e de cadeia pesada fornecidas neste documento são descritas na Tabela 3. Cada uma dessas regiões variáveis pode ser fixa às regiões constantes de cadeia pesada e de cadeia leve acima para formar uma cadeia pesada e leve de anticorpos completos, respectivamente. Além disso, cada uma das sequências de cadeia pesada e leve geradas pode ser combinada para formar uma estrutura de anticorpos completos. Deve ser entendido que as regiões variáveis de cadeia pesada e cadeia leve fornecidas neste documento também podem ser fixas a outros domínios constantes tendo sequências diferentes das sequências exemplares listadas acima.
[202] Exemplos específicos de algumas das cadeias pesadas e leves de comprimento completo dos anticorpos que são fornecidas e suas sequências de aminoácidos respectivas estão resumidos nas Tabelas 2A e 2B. A Tabela 2A mostra sequências de cadeia leve exemplares, e a Tabela 2B mostra sequências de cadeia pesada exemplares. Tabela 2A - Sequências Exemplares de Aminoácidos de Cadeia Leve de Anticorpo
Figure img0002
Figure img0003
Figure img0004
Figure img0005
Figure img0006
Figure img0007
Figure img0008
Figure img0009
Figure img0010
Figure img0011
[203] Os primeiros 22 aminoácidos de cada uma das sequências de cadeia leve na Tabela 2A, exceto 32H7 e 32H7 CS, é uma sequência sinal. No caso de 32H7 e 32H7 CS, a sequência sinal é de 20 aminoácidos. Da mesma forma, os primeiros 22 aminoácidos de cada uma das sequências de cadeia pesada na Tabela 2B é uma sequência sinal. Os peptídeos sinais podem ser mudados para sinalizar peptídeos tendo sequências diferentes, por exemplo, para a expressão mais ideal em determinadas células do hospedeiro. Será, portanto, entendido que a invenção também inclui anticorpos tendo sequências de cadeia pesada e/ou leve conforme especificado nas Tabelas 2A e 2B, mas com diferentes sequências sinais.
[204] Mais uma vez, cada uma das cadeias pesadas exemplares (H1, H2, H3 etc.) listadas na Tabela 2B pode ser combinada com qualquer uma das cadeias leves exemplares mostradas na Tabela 2A para formar um anticorpo. Exemplos de tais combinações incluem H1 combinado com qualquer L1 através de L17; H2 combinado com qualquer L1 através de L17; H3 combinado com qualquer L1 através de L17, e assim por diante. Em alguns casos, os anticorpos incluem pelo menos uma cadeia pesada e uma cadeia leve daquelas listadas nas Tabelas 2A e 2B. Em alguns casos, os anticorpos compreendem duas diferentes cadeias pesadas e duas diferentes cadeias leves listadas nas Tabelas 2A e 2B. Em outros casos, os anticorpos contêm duas cadeias leves idênticas e duas cadeias pesadas idênticas. Como exemplo, um anticorpo ou fragmento imunologicamente funcional pode incluir duas cadeias pesadas H1 e duas cadeias leves L1, ou duas cadeias pesadas H2 e duas cadeias leves L2, ou duas cadeias pesadas H3 e duas cadeias leves L3 e outras combinações semelhantes de pares de cadeias leves e pares de cadeias pesadas como listado nas Tabelas 2A e 2B.
[205] Outras proteínas de ligação a antígeno que são fornecidas são variantes de anticorpos formadas pela combinação das cadeias pesadas e leves nas Tabelas 2A e 2B e compreendem cadeias leves e/ou pesadas em que cada uma tem pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97% ou 99% de identidade com as sequências de aminoácidos destas cadeias. Em alguns casos, tais anticorpos incluem pelo menos uma cadeia pesada e uma cadeia leve, enquanto em outros casos, as formas variantes contêm duas cadeias leves idênticas e duas cadeias pesadas idênticas.
Domínios Variáveis de Anticorpos
[206] Também são fornecidas proteínas de ligação a antígeno que contêm um anticorpo da região variável de cadeia pesada selecionado do grupo consistindo em VH1, VH2, VH3, VH4, VH5, VH6, VH7, VH8, VH9, VH10, VH11, VH12, e VH13, e/ou uma região variável de cadeia leve de anticorpo selecionada do grupo consistindo em VL1, VL2, VL3, VL4, VL5, VL6, VL7, VL8, VL9, VL10, VL11, VL12, VL13, VL14, VL15, VL16, e VL17, como mostrado na Tabela 3 abaixo, e fragmentos imunologicamente funcionais, derivados, muteínas e variantes destas regiões variáveis de cadeia pesada e de cadeia leve.
[207] Os alinhamentos de sequências das várias regiões variáveis de cadeia leve e pesada, respectivamente, são fornecidos nas Figs. 1A e 1B.
[208] As proteínas de ligação a antígenos deste tipo geralmente podem ser designadas pela fórmula "VHx/ VLy", onde "x" corresponde ao número de regiões variáveis de cadeia pesada e "y" corresponde ao número de regiões variáveis de cadeia leve. Tabela 3: Sequências Exemplares de Aminoácidos de Cadeia VH e VL
Figure img0012
Figure img0013
Figure img0014
Figure img0015
Figure img0016
Figure img0017
[209] Cada uma das regiões variáveis de cadeia pesada listadas na Tabela 3 pode ser combinada com qualquer uma das regiões variáveis de cadeia leve mostradas na Tabela 3 para formar uma proteína de ligação a antígeno. Exemplos de tais combinações incluem VH1 combinado com qualquer um dentre VL1, VL2, VL3, VL4, VL5, VL6, VL7, VL8, VL9, VL10, VL11, VL12, VL13, VL14, VL15, VL16, ou VL17; VH2 combinado com qualquer um dentre VL1, VL2, VL3, VL4, VL5, VL6, VL7, VL8, VL9, VL10, VL11, VL12, VL13, VL14, VL15, VL16, ou VL17; VH3 combinado com qualquer um dentre VL1, VL2, VL3, VL4, VL5, VL6, VL7, VL8, VL9, VL10, VL11, VL12, VL13, VL14, VL15, VL16, ou VL17; e assim por diante.
[210] Em alguns casos, a proteína de ligação a antígeno inclui pelo menos uma região variável de cadeia pesada e/ou uma região variável da cadeia leve das listadas na Tabela 3. Em alguns casos, a proteína de ligação a antígeno inclui pelo menos duas diferentes regiões variáveis de cadeia pesada e/ou regiões variáveis de cadeia leve das listados na Tabela 3. Um exemplo de tal um antígeno proteína de ligação compreende (a) uma VH1, e (b) um dentre VH2, VH3, VH4, VH5, VH6, VH7, VH8, VH9, VH10, VH11, VH12, ou VH13. Um outro exemplo compreende (a) uma VH2, e (b) uma de VH1, VH3, VH4, VH5, VH6, VH7, VH8, VH9, VH10, VH11, VH12, ou VH13. Novamente um outro exemplo compreende (a) uma VH3, e (b) uma de VH1, VH2, VH4, VH5, VH6, VH7, VH8, VH9, VH10, VH11, VH12, ou VH13, etc. Novamente um outro exemplo de tal proteína de ligação a antígeno compreende (a) uma VL1, e (b) uma de VL2, VL3, VL4, VL5, VL6, VL7, VL8, VL9, VL10, VL11, VL12, VL13, VL14, VL15, VL16, ou VL17, VL18, VL19, VL20, ou VL21. Novamente um outro exemplo de tal proteína de ligação a antígeno compreende (a) uma VL2, e (b) uma de VL1, VL3, VL4, VL5, VL6, VL7, VL8, VL9, VL10, VL11, VL12, VL13, VL14, VL15, VL16, VL17, VL18, VL19, VL20, ou VL21. Novamente um outro exemplo de tal proteína de ligação a antígeno compreende (a) uma VL3, e (b) uma de VL1, VL2, VL4, VL5, VL6, VL7, VL8, VL9, VL10, VL11, VL12, VL13, VL14, VL15, VL16, VL17, VL18, VL19, VL20, ou VL21, etc.
[211] As várias combinações de regiões variáveis da cadeia pesada podem ser combinadas com qualquer uma das várias combinações de regiões variáveis de cadeia leve como é evidente para uma pessoa versada na técnica.
[212] Em outros casos, a proteína de ligação a antígeno contém duas regiões variáveis de cadeia leve idênticas e/ou duas regiões variáveis de cadeia pesadas idênticas. Como um exemplo, a proteína de ligação a antígeno pode ser um anticorpo ou fragmento imunologicamente funcional, que inclui duas regiões variáveis de cadeia leve e duas regiões variáveis de cadeia pesada em combinações de pares de regiões variáveis da cadeia leve e pares de regiões variáveis de cadeia pesada conforme listado na Tabela 3.
[213] Algumas proteínas de ligação a antígeno que são fornecidas compreendem um domínio variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos que difere da sequência de um domínio variável de cadeia pesada selecionado de VH1, VH2, VH3, VH4, VH5, VH6, VH7, VH8, VH9, VH10, VH11, VH12, e VH13 em apenas 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 15 resíduos de aminoácidos, em que cada diferença de sequência é independente ou uma deleção, inserção ou substituição de um aminoácido, com as deleções, inserções e/ou substituições, resultando em não mais de 15 mudanças de aminoácidos em relação às sequências de domínios variáveis anteriores. A região variável de cadeia pesada em algumas proteínas de ligação a antígeno é composta por uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97% ou 99% de identidade de sequência as sequências de aminoácidos da região variável de cadeia pesada de VH1, VH2, VH3, VH4, VH5, VH6, VH7, VH8, VH9, VH10, VH11, VH12, e VH13.
[214] Certas proteínas de ligação a antígeno compreendem um domínio variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos que difere da sequência de um domínio variável de cadeia leve selecionado de VL1, VL2, VL3, VL4, VL5, VL6, VL7, VL8, VL9, VL10, VL11, VL12, VL13, VL14, VL15, VL16, ou VL17 em apenas 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 15 resíduos de aminoácidos, em que cada diferença de sequência é independente ou uma deleção, inserção ou substituição de um aminoácido, com as deleções, inserções e/ou substituições, resultando em não mais de 15 mudanças de aminoácidos as sequências de domínio variável anteriores. A região variável de cadeia leve em algumas proteínas de ligação a antígeno compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97% ou 99% de identidade de sequência as sequências de aminoácidos da região variável de cadeia leve de VL1, VL2, VL3, VL4, VL5, VL6, VL7, VL8, VL9, VL10, VL11, VL12, VL13, VL14, VL15, VL16, ou VL17.
[215] Em casos adicionais, as proteínas de ligação a antígeno compreendem os seguintes pares de domínios variáveis de cadeia pesada e cadeia leve: VL1 com VH1, VL2 com VH2, VL3 com VH3, VL4 com VH4, VL5 com VH5, VL6 com VH1, VL7 com VH6, VL8 com VH5, VL9 com VH1, VL10 com VH7, VL11 com, H8, VL12 com VH9, VL12 com VH10, VL13 com VH5, VL14 com VH11, VL15 com VH12, VL16 com VH13, e VL17 com VH13. Em alguns casos, as proteínas de ligação a antígeno nos pares acima podem compreender sequências de aminoácidos que têm 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97% ou 99% de identidade de sequência com os domínios variáveis especificados.
[216] Ainda outras proteínas de ligação a antígeno, por exemplo, anticorpos ou fragmentos imunologicamente funcionais, incluem formas variantes de uma cadeia variante pesada e uma cadeia variante leve como descrito.
[217] CDRs
[218] As proteínas de ligação a antígeno divulgadas aqui são polipeptídeos nos quais uma ou mais CDRs são enxertadas, inseridas e/ou unidas. Uma proteína de ligação a antígeno pode ter 1, 2, 3, 4, 5 our 6 CDRs. Uma proteína de ligação a antígeno assim pode ter, for example, uma CDR1 de cadeia pesada (“CDRH1”), e/ou uma CDR2 de cadeia pesada (“CDRH2”), e/ou uma CDR3 de cadeia pesada (“CDRH3”), e/ou uma CDR1 de cadeia leve (“CDRL1”), e/ou uma CDR2 de cadeia leve (“CDRL2”), e/ou uma CDR3 de cadeia leve (“CDRL3”). Algumas proteínas de ligação a antígeno incluem tanto uma CDRH3 quanto uma CDRL3. As CDRs de cadeia pesada e leve específicas são identificadas nas Tabelas 4A e 4B, respectivamente.
[219] Regiões determinantes de complementaridade (CDRs) e regiões de estrutura (FR) de um anticorpo dado podem ser identificadas usando o sistema descrito por Kabat et al. em Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5° Ed., US Dept. of Health and Human Services, PHS, NIH, NIH Publicação no. 91-3242, 1991. Certos anticorpos que são divulgados aqui compreendem uma ou mais sequências de aminoácidos que são idênticas ou que têm identidade de sequência substancial para as sequências de aminoácidos de uma ou mais das CDRs apresentadas na Tabela 4A (CDRHs) e na Tabela 4B (CDRLs). Table 4A: Sequências Exemplares de Aminoácidos de CDR de Cadeia Pesada
Figure img0018
Figure img0019
Figure img0020
Table 4B: Sequências Exemplares de Aminoácidos de CDR de Cadeia Leve
Figure img0021
Figure img0022
Figure img0023
[220] A estrutura e as propriedades das CDRs dentro de um anticorpo de ocorrência natural foram descritas, supra. Resumidamente, em um anticorpo tradicional, as CDRs são incorporadas dentro de uma estrutura na região variável de cadeia pesada e leve onde eles constituem as regiões responsáveis pela ligação e reconhecimento do antígeno. A região variável compreende pelo menos três CDRs de cadeia pesada ou leve, ver, supra (Kabat et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Public Health Service N.I.H., Bethesda, MD; veja também Chothia e Lesk, 1987, J. Mol. Biol. 196:901-917; Chothia et al. , 1989, Nature 342: 877-883), dentro de uma região de estrutura (designadas regiões de estrutura 1-4, FR1, FR2, FR3, e FR4, por Kabat et al., 1991, supra; veja também Chothia e Lesk, 1987, supra). As CDRs fornecidas neste documento, no entanto, não podem ser usadas apenas para definir o domínio de ligação a antígeno de uma estrutura de anticorpos tradicional, mas podem ser incorporadas em uma variedade de outras estruturas polipeptídicas, como descrito aqui.
[221] Em um aspecto, as CDRs fornecidas são (a) uma CDRH selecionada do grupo consistindo em (i) uma CDRH1 selecionada do grupo que consiste na SEQ ID NO:73, 76, 79, 82, 85, 88, 92, 97, e 100; (ii) uma CDRH2 selecionada do grupo que consiste na SEQ ID NO:74, 77, 80, 83, 86, 89, 91, 93, 95, 98, 101, e 129; (iii) uma CDRH3 selecionada do grupo que consiste na SEQ ID NO:75, 78, 81, 84, 87, 90, 96, 99, 102, e 123; e (iv) uma CDRH de (i), (ii) e (iii) que contém uma ou mais, por exemplo, uma, duas, três, quatro ou mais substituições (por exemplo, substituições conservativas de aminoácidos), deleções ou inserções de aminoácidos de não mais que cinco, quatro, três, dois ou um aminoácidos; (B) uma CDRL selecionada do grupo consistindo em (i) uma CDRL1 selecionada do grupo que consiste na SEQ ID NO:42, 45, 48, 51, 54, 57, 62, 65, 66, e 69; (ii) uma CDRL2 selecionada do grupo que consiste na SEQ ID NO:43, 46, 49, 52, 55, 58, 61, 63, 67, e 70; (iii) uma CDRL3 selecionada do grupo que consiste na SEQ ID NO:44, 47, 50, 53, 56, 59, 64, 68, 71, e 72; e (iv) uma CDRL de (i), (ii) e (iii) que contém um ou mais, por exemplo, um, dois, três, quatro ou mais substituições (por exemplo, substituições conservativas de aminoácidos), deleções ou inserções de aminoácidos de não mais de cinco, quatro, três, dois, ou um aminoácidos.
[222] Em outro aspecto, uma proteína de ligação a antígeno inclui 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 formas variantes das CDRs listadas nas Tabelas 4A e 4B, cada uma com pelo menos 80%, 85%, 90% ou 95% de identidade de sequência a uma sequência de CDR listada nas Tabelas 4A e 4B. Algumas proteínas de ligação a antígeno incluem 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 das CDRs listadas nas Tabelas 4A e 4B, cada uma diferindo por não mais de 1, 2, 3, 4 ou 5 aminoácidos das CDRs listadas nessas tabelas.
[223] Em outro aspecto, as CDRs divulgadas neste documento incluem sequências consenso derivadas de grupos de relacionados a anticorpos monoclonais. Como descrito aqui, uma "sequência consenso" se refere às sequências de aminoácidos tendo aminoácidos conservados comuns entre um número de sequências e aminoácidos variáveis que variam dentro de uma dada sequência de aminoácidos. As sequências consenso de CDR fornecida incluem CDRs correspondentes a cada uma dentre CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2 e CDRL3.
[224] Em ainda outro aspecto, uma proteína de ligação a antígeno inclui as seguintes associações de CDRL1, CDRL2 e CDRL3: SEQ ID NOs: 42, 43, e 44; SEQ ID NOs: 45, 46, e 47; SEQ ID NOs: 48, 49, e 50; SEQ ID NOs: 51, 52, e 53; SEQ ID NOs: 54, 55, e 56; SEQ ID NOs: 57, 58, e 59; SEQ ID NOs: 60, 55, e 56; SEQ ID NOs: 45, 61, e 47; SEQ ID NOs: 62, 63, e 64; SEQ ID NOs: 65, 55, e 56; SEQ ID NOs: 66, 67, e 68; SEQ ID NOs: 69, 70, e 71; e SEQ ID NOs: 69, 70, e 72.
[225] Em uma aspecto adicional, uma proteína de ligação a antígeno inclui a seguinte associação de CDRH1, CDRH2 e CDRH3: SEQ ID NOs: 73, 74, e 75; SEQ ID NOs: 76, 77, e 78; SEQ ID NOs: 79, 80, e 81; SEQ ID NOs: 82, 83, e 84; SEQ ID NOs: 85, 86, e 87; SEQ ID NOs: 88, 89, e 90; SEQ ID NOs: 76, 91, e 78; SEQ ID NOs: 92, 93, e 94; SEQ ID NOs: 76, 95, e 78; SEQ ID NOs: 73, 74, e 96; SEQ ID NOs: 97, 98, e 99; e SEQ ID NOs: 100, 101, e 102.
[226] Em um outro aspecto, uma proteína de ligação a antígeno inclui a seguinte associação de CDRL1, CDRL2 e CDRL3 com CDRH1, CDRH2 e CDRH3: SEQ ID NOs: 42, 43, e 44 com SEQ ID NOs: 73, 74, e 75; SEQ ID NOs: 45, 46, e 47 com SEQ ID NOs: 76, 77, e 78; SEQ ID NOs: 48, 49, e 50 com SEQ ID NOs: 79, 80, e 81; SEQ ID NOs: 51, 52, e 53 com SEQ ID NOs: 82, 83, e 84; SEQ ID NOs: 54, 55, e 56 com SEQ ID NOs: 85, 86, e 87; SEQ ID NOs: 57, 58, e 59 com SEQ ID NOs: 88, 89, e 90; SEQ ID NOs: 60, 55, e 56 com SEQ ID NOs: 85, 86, e 87; SEQ ID NOs: 45, 61, e 47 com SEQ ID NOs: 76, 91, e 78; SEQ ID NOs: 62, 63, e 64 com SEQ ID NOs: 92, 93, e 94; SEQ ID NOs: 45, 61, e 47 com SEQ ID NOs: 76, 95, e 78; SEQ ID NOs: 65, 55, e 56 com SEQ ID NOs: 85, 86, e 87; SEQ ID NOs: 42, 43, e 44 com SEQ ID NOs: 73, 74, e 96; SEQ ID NOs: 66, 67, e 68 com SEQ ID NOs: 97, 98, e 99; SEQ ID NOs: 69, 70, e 71 com SEQ ID NOs: 100, 101, e 102; e SEQ ID NOs: 69, 70, e 72 com SEQ ID NOs: 100, 101, e 102.
[227] As sequências consenso foram determinadas usando análises filogênicas padrões das CDRs correspondentes a VH e VL de anticorpos anti-CGRP R. As sequências consenso foram determinadas mantendo as CDRs contíguas dentro da mesma sequência correspondente a uma VH ou VL.
[228] Como ilustrado nas Figs. 3A, 3B, 4, 5A, 5B, 5C, 5D e 5E, a análise de linhagem de uma variedade de proteínas de ligação a antígeno contidas neste documento resultou em grupos de sequências relacionadas, designadas como grupos de CDR de cadeia leve K1, K2, K3, e K4 (Figs. 3A e 3B), grupos de CDR de cadeia leve L1, L2, L3, e L4 (Fig. 4), e grupos de CDR de cadeia pesada HC1 (Fig. 5A), HC2 (Fig. 5B), HC3 (Fig. 5C), HC4 (Fig. 5C), HC5 (Fig. 5D) e HC6 (Fig. 5E). Alguns dos grupos acima foram usados para gerar sequências consenso adicionais, como ilustrado nas Figs. 3A, 3B, 4, e 5F, para produzir grupos de CDR de cadeia leve K1,4 (Fig. 3A), K2,3 (Fig. 3B), L1,2,3 (Fig, 4), e LAll (Fig. 4), e grupos de CDR de cadeia pesada HCA e HCB (Fig. 5F).
[229] As sequências consenso de vários grupos da região CDR são fornecidas abaixo: K1 Consenso
[230] CDR1 RASQGIRX1DLG (SEQ ID NO:103), em que X1 é selecionado do grupo consistindo em N e K.
[231] CDR2 X1ASSLQS (SEQ ID NO:104), em que X1 é selecionado do grupo consistindo em A e G.
[232] CDR3 LQYNX1X2PWT (SEQ ID NO:105), em que X1 é selecionado do grupo consistindo em I e S, e X2 é selecionado do grupo consistindo em Y e F. K4 Consenso
[233] CDR3 QQYGNSLX1R (SEQ ID NO:106), em que X1 é selecionado do grupo consistindo em S e C. K1,4 Consenso
[234] CDR1 RASQX1X2X3X4GX5LX6 (SEQ ID NO:107), em que X1 é selecionado do grupo consistindo em S e G, X2 é selecionado do grupo consistindo em V e I, X3 é selecionado do grupo consistindo em S e R, X4 é selecionado do grupo consistindo em S, N e K, X5 é selecionado do grupo consistindo em Y e D, e X6 é selecionado do grupo consistindo em T e G.
[235] CDR2 X1ASSX2X3X4 (SEQ ID NO:108), em que X1 é selecionado do grupo consistindo em G e A, X2 é selecionado do grupo consistindo em R e L, X3 é selecionado do grupo consistindo em A e Q, e X4 é selecionado do grupo consistindo em T e S.
[236] CDR3 X1QYX2X3X4X5X6X7 (SEQ ID NO:109), em que X1 é selecionado do grupo consistindo em Q e L, X2 é selecionado do grupo consistindo em G e N, X3 é selecionado do grupo consistindo em N e T, X4 é selecionado do grupo consistindo em S, Y e F, X5 é selecionado do grupo consistindo em L e P, X6 é selecionado do grupo consistindo em C, W e S, e X7 é selecionado do grupo consistindo em R e T. K3 Consenso
[237] CDR1 KSSQSLLHSX1GX2X3YLY (SEQ ID NO:110), em que X1 é selecionado do grupo consistindo em D e A, X2 é selecionado do grupo consistindo em R e K, e X3 é selecionado do grupo consistindo em N e T. K2,3 Consenso
[238] CDR1 X1SSQSLLHSX2GX3X4YLX5 (SEQ ID NO: 111), em que X1 é selecionado do grupo consistindo em R e K, X2 é selecionado do grupo consistindo em F, D e A, X3 é selecionado do grupo consistindo em Y, R e K, X4 é selecionado do grupo consistindo em N e T, e X5 é selecionado do grupo consistindo em D e Y.
[239] CDR2 X1X2SNRX3S (SEQ ID NO: 112), em que X1 é selecionado do grupo consistindo em L e E, X2 é selecionado do grupo consistindo em G e V, e X3 é selecionado do grupo consistindo em A e F.
[240] CDR3 MQX1X2X3X4PX5T (SEQ ID NO: 113), em que X1 é selecionado do grupo consistindo em A e S, X2 é selecionado do grupo consistindo em L e F, X3 é selecionado do grupo consistindo em Q e P, X4 é selecionado do grupo consistindo em T e L, e X5 é selecionado do grupo consistindo em F e L. Lm3 Consenso
[241] CDR2 RX1NQRPS (SEQ ID NO: 114), em que X1 é selecionado do grupo consistindo em N e S. Lm1,2,3 Consenso
[242] CDR1 SGSSSNIGX1NX2VX3 (SEQ ID NO: 115), em que X1 é selecionado do grupo consistindo em N e S, X2 é selecionado do grupo consistindo em Y e T, e X3 é selecionado do grupo consistindo em S, N e Y.
[243] CDR2 X1X2NX3RPS (SEQ ID NO: 116), em que X1 é selecionado do grupo consistindo em D, T e R, X2 é selecionado do grupo consistindo em N e S, e X3 é selecionado do grupo consistindo em K e Q.
[244] CDR3 X1X2X3DX4X5LX6X7VV (SEQ ID NO: 117), em que X1 é selecionado do grupo consistindo em G e A, X2 é selecionado do grupo consistindo em T e A, X3 é selecionado do grupo consistindo em W e R, X4 é selecionado do grupo consistindo em S e D, X5 é selecionado do grupo consistindo em R e S, X6 é selecionado do grupo consistindo em S e N, e X7 é selecionado do grupo consistindo em A e G. LAll Consenso
[245] CDR1 X1GX2X3SX4X5X6X7X8X9X10X11 (SEQ ID NO:118), em que X1 é selecionado do grupo consistindo em S e Q, X2 está presente ou ausente, e se presente é S, X3 é selecionado do grupo consistindo em S e D, X4 está presente ou ausente, e se presente é N, X5 é selecionado do grupo consistindo em I e L, X6 é selecionado do grupo consistindo em G e R, X7 é selecionado do grupo consistindo em N e S, X8 é selecionado do grupo consistindo em N e F, X9 é selecionado do grupo consistindo em Y e T, X10 é selecionado do grupo consistindo em V e A, e X11 é selecionado do grupo consistindo em S, N e Y.
[246] CDR2 X1X2NX3RPS (SEQ ID NO:119), em que X1 é selecionado do grupo consistindo em D, G, T, e R, X2 é selecionado do grupo consistindo em N, K e S, e X3 é selecionado do grupo consistindo em K, N e Q.
[247] CDR3 X1X2X3DX4X5X6X7X8X9V (SEQ ID NO:120), em que X1 é selecionado do grupo consistindo em G, N e A, X2 é selecionado do grupo consistindo em T, S e A, X3 é selecionado do grupo consistindo em W e R, X4 é selecionado do grupo consistindo em S e D, X5 é selecionado do grupo consistindo em R e S, X6 é selecionado do grupo consistindo em L e V, X7 é selecionado do grupo consistindo em S, Y e N, X8 é selecionado do grupo consistindo em A, H e G, e X9 é selecionado do grupo consistindo em V e L. HC1 Consenso
[248] CDR1 X1YYMX2 (SEQ ID NO:121), em que X1 é selecionado do grupo consistindo em G e D, X2 é selecionado do grupo consistindo em H e Y.
[249] CDR2 WIX1PNSGGTNYAQKFQG (SEQ ID NO:122), em que X1 é selecionado do grupo consistindo em N e S.
[250] CDR3 X1X2X3SX4X5X6X7X8GX9X10X11X12YYX13GMDV (SEQ ID NO:123), em que X1 é selecionado do grupo consistindo em D e G, X2 é selecionado do grupo consistindo em Q e G, X3 é selecionado do grupo consistindo em M e Y, X4 é selecionado do grupo consistindo em I e G, X5 é selecionado do grupo consistindo em I e Y, X6 é selecionado do grupo consistindo em M e A, X7 está presente ou ausente, e se presente é L, X8 está presente ou ausente, e se presente é R, X9 é selecionado do grupo consistindo em V e L, X10 é selecionado do grupo consistindo em F e Y, X11 é selecionado do grupo consistindo em P e S, X12 é selecionado do grupo consistindo em P e H, e X13 está presente ou ausente, e se presente é Y. HC2 Consenso
[251] CDR2 RIKSX1TDGGTTDYX2APVKG (SEQ ID NO:124), em que X1 é selecionado do grupo consistindo em K e T, e X2 é selecionado do grupo consistindo em T e A. HC3 Consenso
[252] CDR1 X1YX2MX3 (SEQ ID NO:125), em que X1 é selecionado do grupo consistindo em T e S, X2 é selecionado do grupo consistindo em S e A, e X3 é selecionado do grupo consistindo em N e S.
[253] CDR2 X1ISX2SX3X4X5X6YYADSVKG (SEQ ID NO:126), em que X1 é selecionado do grupo consistindo em S e A, X2 é selecionado do grupo consistindo em S e G, X3 é selecionado do grupo consistindo em S e G, X4 é selecionado do grupo consistindo em S e G, X5 é selecionado do grupo consistindo em Y e R, e X6 é selecionado do grupo consistindo em R e T.
[254] CDR3 X1X2X3X4X5X6X7PYSX8X9WYDYYYGMDV (SEQ ID NO:127), em que X1 é selecionado do grupo consistindo em E e D, X2 é selecionado do grupo consistindo em G e Q, X3 é selecionado do grupo consistindo em V e R, X4 é selecionado do grupo consistindo em S e E, X5 é selecionado do grupo consistindo em G e V, X6 é selecionado do grupo consistindo em S e G, X7 está presente ou ausente, e se presente é S, X8 é selecionado do grupo consistindo em I e S, e X9 é selecionado do grupo consistindo em S e G. HC4 Consenso
[255] CDR1 SX1GMH (SEQ ID NO:128), em que X1 é selecionado do grupo consistindo em F e Y.
[256] CDR2 VISX1DGSX2KYX3X4DSVKG (SEQ ID NO:129), em que X1 é selecionado do grupo consistindo em F e Y, X2 é selecionado do grupo consistindo em I e H, X3 é selecionado do grupo consistindo em S e Y, e X4 é selecionado do grupo consistindo em V e A.
[257] CDR3 X1RX2X3X4X5X6SX7X8YYX9X10X11YYGX12X13V (SEQ ID NO:130), em que X1 é selecionado do grupo consistindo em D e E, X2 é selecionado do grupo consistindo em L e K, X3 é selecionado do grupo consistindo em N e R, X4 é selecionado do grupo consistindo em Y e V, X5 é selecionado do grupo consistindo em Y e T, X6 é selecionado do grupo consistindo em D e M, X7 é selecionado do grupo consistindo em S e T, X8 é selecionado do grupo consistindo em G e L, X9 é selecionado do grupo consistindo em H e Y, X10 está presente ou ausente, e se presente é Y, X11 é selecionado do grupo consistindo em K e F, X12 é selecionado do grupo consistindo em M e L, e X13 é selecionado do grupo consistindo em A e D. HCA Consenso
[258] CDR1 X1X2X3MX4 (SEQ ID NO:131), em que X1 é selecionado do grupo consistindo em N e S, X2 é selecionado do grupo consistindo em A, Y e F, X3 é selecionado do grupo consistindo em W, A e G, e X4 é selecionado do grupo consistindo em S e H.
[259] CDR2 X1IX2X3X4X5X6GX7X8X9X10X11X12X13X14VKG (SEQ ID NO:132), em que X1 é selecionado do grupo consistindo em R, A e V, X2 é selecionado do grupo consistindo em K, S e W, X3 é selecionado do grupo consistindo em S, G, F e Y, X4 está presente ou ausente, e se presente, é selecionado do grupo consistindo em K e T, X5 está presente ou ausente, e se presente é T, X6 é selecionado do grupo consistindo em D e S, X7 é selecionado do grupo consistindo em G e S, X8 é selecionado do grupo consistindo em T, R, I, N e H, X9 é selecionado do grupo consistindo em T e K, X10 é selecionado do grupo consistindo em D e Y, X11 é selecionado do grupo consistindo em Y e S, X12 é selecionado do grupo consistindo em T, A e V, X13 é selecionado do grupo consistindo em A e D, e X14 é selecionado do grupo consistindo em P e S.
[260] CDR3 X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14X15X16X17GX18X19V (SEQ ID NO:133), em que X1 é selecionado do grupo consistindo em D, A e E, X2 é selecionado do grupo consistindo em R, Q e G, X3 é selecionado do grupo consistindo em T, R, L, G e K, X4 é selecionado do grupo consistindo em G, E, N, I e R, X5 é selecionado do grupo consistindo em Y, V e A, X6 é selecionado do grupo consistindo em S, G, Y, A e T, X7 é selecionado do grupo consistindo em I, P, D, A e M, X8 está presente ou ausente, e se presente, é selecionado do grupo consistindo em S e Y, X9 está presente ou ausente, e se presente, é selecionado do grupo consistindo em W, S e T, X10 é selecionado do grupo consistindo em S, G e L, X11 é selecionado do grupo consistindo em S, G, L e Y, X12 está presente ou ausente, e se presente, é selecionado do grupo consistindo em W e Y, X13 é selecionado do grupo consistindo em Y e H, X14 está presente ou ausente, e se presente, é selecionado do grupo consistindo em Y e D, X15 é selecionado do grupo consistindo em Y, K e F, X16 está presente ou ausente, e se presente é Y, X17 está presente ou ausente, e se presente é Y, X18 é selecionado do grupo consistindo em M e L, e X19 é selecionado do grupo consistindo em D e A. HCB Consenso
[261] CDR1 X1X2X3X4X5 (SEQ ID NO:134), em que X1 é selecionado do grupo consistindo em N, G, D, S e A, X2 é selecionado do grupo consistindo em A, F e Y, X3 é selecionado do grupo consistindo em W, Y, A e G, X4 é selecionado do grupo consistindo em M e L, e X5 é selecionado do grupo consistindo em S e H.
[262] CDR2 X1IX2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14X15X16X17G (SEQ ID NO:135), em que X1 é selecionado do grupo consistindo em R, W, A, V, S e F, X2 é selecionado do grupo consistindo em K, N, S, W e R, X3 é selecionado do grupo consistindo em S, P, G, F e Y, X4 está presente ou ausente, e se presente, é selecionado do grupo consistindo em K, T e R, X5 está presente ou ausente, e se presente, é selecionado do grupo consistindo em T e A, X6 é selecionado do grupo consistindo em D, N, H, S e Y, X7 é selecionado do grupo consistindo em G e S, X8 é selecionado do grupo consistindo em G e S, X9 é selecionado do grupo consistindo em T, G, R, I, N, H e Y, X10 é selecionado do grupo consistindo em T, K, R e P, X11 é selecionado do grupo consistindo em D, N, Y e E, X12 é selecionado do grupo consistindo em Y e S, X13 é selecionado do grupo consistindo em T, A e V, X14 é selecionado do grupo consistindo em A, Q e D, X15 é selecionado do grupo consistindo em P, K e S, X16 é selecionado do grupo consistindo em V e F, e X17 é selecionado do grupo consistindo em K e Q.
[263] CDR3 X1X2X3X4X5SX6X7X8X9X10X11X12X13X14X15X16GX17X18V (SEQ ID NO:136), em que X1 é selecionado do grupo consistindo em D, G, A e E, X2 é selecionado do grupo consistindo em R, G e Q, X3 é selecionado do grupo consistindo em T, M, Y, R, L, G e K, X4 é selecionado do grupo consistindo em G, S, E, N, I e R, X5 é selecionado do grupo consistindo em Y, I, G, V e A, X6 é selecionado do grupo consistindo em S, I, Y, G, A e T, X7 é selecionado do grupo consistindo em I, M, A, P e D, X8 está presente ou ausente, e se presente, é selecionado do grupo consistindo em S, L e Y, X9 está presente ou ausente, e se presente, é selecionado do grupo consistindo em W, R, S e T, X10 é selecionado do grupo consistindo em S, G e L, X11 é selecionado do grupo consistindo em S, V, L, G e Y, X12 está presente ou ausente, e se presente, é selecionado do grupo consistindo em F, Y e W, X13 é selecionado do grupo consistindo em Y, P, S e H, X14 está presente ou ausente, e se presente, é selecionado do grupo consistindo em Y, P, D e H, X15 é selecionado do grupo consistindo em Y, K e F, X16 está presente ou ausente, e se presente é Y, X17 está presente ou ausente, e se presente é Y, e X18 é selecionado do grupo consistindo em M e L.
[264] Em alguns casos a proteína de ligação a antígeno compreende pelo menos uma CDR1 de cadeia pesada, CDR2, ou CDR3 tendo uma das sequências consenso acima. Em alguns casos, a proteína de ligação a antígeno compreende pelo menos uma CDR1 de cadeia leve, CDR2, ou CDR3 tendo uma das sequências consenso acima. Em outros casos, a proteína de ligação a antígeno compreende pelo menos duas CDRs de cadeia pesada de acordo com as sequências consenso acima, e/ou pelo menos duas CDRs de cadeia leve de acordo com as sequências consenso acima. Ainda em outros casos, a proteína de ligação a antígeno compreende pelo menos três CDRs de cadeia pesada de acordo com as sequências consenso acima, e/ou pelo menos três CDRs de cadeia leve de acordo com as sequências consenso acima. Proteínas de Ligação a Antígeno Exemplares
[265] De acordo com um aspecto, é fornecida uma proteína isolada de ligação a antígeno que se liga a CGRP R compreendendo (A) uma ou mais regiões determinantes de complementaridade de cadeia pesada (CDRHs) selecionadas do grupo consistindo em: (i) uma CDRH1 selecionada do grupo que consiste na SEQ ID NO:73, 76, 79, 82, 85, 88, 92, 97, e 100; (ii) uma CDRH2 selecionada do grupo que consiste na SEQ ID NO:74, 77, 80, 83, 86, 89, 91, 93, 95, 98, 101, e 129; (iii) uma CDRH3 selecionada do grupo que consiste na SEQ ID NO:75, 78, 81, 84, 87, 90, 96, 99, 102, e 123; e (iv) uma CDRH de (i), (ii) e (iii) que contém uma ou mais, por exemplo, uma, duas, três, quatro ou mais substituições, deleções ou inserções de aminoácidos de não mais que cinco, quatro, três, dois ou um aminoácidos; (B) uma ou mais regiões determinantes de complementaridade de cadeia leve (CDRLs) selecionadas do grupo consistindo em: (i) uma CDRL1 selecionada do grupo que consiste na SEQ ID NO:42, 45, 48, 51, 54, 57, 62, 65, 66, e 69; (ii) uma CDRL2 selecionada do grupo que consiste na SEQ ID NO:43, 46, 49, 52, 55, 58, 61, 63, 67, e 70; (iii) uma CDRL3 selecionada do grupo que consiste na SEQ ID NO:44, 47, 50, 53, 56, 59, 64, 68, 71, e 72; e (iv) uma CDRL de (i), (ii) e (iii) que contém uma ou mais, por exemplo, uma, duas, três, quatro ou mais substituições, deleções ou inserções de aminoácidos de não mais que cinco, quatro, três, dois ou um aminoácidos; ou (C) uma ou mais CDRHs de cadeia pesada de (A) e uma ou mais CDRLs de cadeia leve de (B).
[266] Em ainda outra modalidade, a proteína isolada de ligação a antígeno pode compreender (A) uma CDRH selecionada do grupo consistindo em (i) uma CDRH1 selecionada do grupo que consiste na SEQ ID NO:73, 76, 79, 82, 85, 88, 92, 97, e 100; (ii) uma CDRH2 selecionada do grupo que consiste na SEQ ID NO:74, 77, 80, 83, 86, 89, 91, 93, 95, 98, 101, e 129; e (iii) uma CDRH3 selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO:75, 78, 81, 84, 87, 90, 96, 99, 102, e 123; (B) uma CDRL selecionada do grupo consistindo em (1) uma CDRL1 selecionada do grupo que consiste na SEQ ID NO:42, 45, 48, 51, 54, 57, 62, 65, 66, e 69; (ii) uma CDRL2 selecionada do grupo que consiste na SEQ ID NO:43, 46, 49, 52, 55, 58, 61, 63, 67, e 70; e (iii) uma CDRL3 selecionada do grupo que consiste na SEQ ID NO:44, 47, 50, 53, 56, 59, 64, 68, 71, e 72; ou (C) uma ou mais CDRHs de cadeia pesada de (A) e uma ou mais CDRLs de cadeia leve de (B). Em uma modalidade, a proteína isolada de ligação a antígeno pode incluir (A) uma CDRH1 de SEQ ID NO:73, 76, 79, 82, 85, 88, 92, 97, e 100, a CDRH2 de SEQ ID NO:74, 77, 80, 83, 86, 89, 91, 93, 95, 98, 101, e 129, e a CDRH3 de SEQ ID NO:75, 78, 81, 84, 87, 90, 96, 99, 102, e 123, e (B) uma CDRL1 de SEQ ID NO:42, 45, 48, 51, 54, 57, 62, 65, 66, e 69, a CDRL2 de SEQ ID NO:43, 46, 49, 52, 55, 58, 61, 63, 67, e 70, e a CDRL3 de SEQ ID NO:44, 47, 50, 53, 56, 59, 64, 68, 71, e 72.
[267] Em outra modalidade, a região variável de cadeia pesada (VH) possui pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97% ou 99% de identidade de sequência com uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste na SEQ ID NO:158-170, e/ou a VL possui pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97% ou 99% de identidade de sequência com uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste na SEQ ID NO:137-153. Em uma modalidade adicional, a VH é selecionada do grupo que consiste na SEQ ID NO: 158-170, e/ou a VL é selecionada do grupo que consiste na SEQ ID NO: 137-153.
[268] Em outro aspecto, também é fornecida uma proteína isolada de ligação a antígeno que se liga especificamente a um epítopo formado por resíduos de aminoácidos tanto de CRLR quanto de RAMP1 e componentes de CGRP R.
[269] Em ainda outra modalidade, a proteína isolada de ligação a antígeno descrita aqui acima compreende uma primeira sequência de aminoácidos que compreende pelo menos uma das sequências consenso de CDRH divulgadas neste documento, e uma segunda sequência de aminoácidos que compreende pelo menos uma das sequências consenso de CDRL divulgadas neste documento. Em um aspecto, a primeira sequência de aminoácidos compreende pelo menos duas das sequências consenso de CDRH, e/ou a segunda sequência de aminoácidos compreende pelo menos duas das sequências consenso de CDRL.
[270] Em certas modalidades, a primeira e a segunda sequência de aminoácidos são covalentemente unidas umas as outras.
[271] Em uma modalidade adicional, a primeira sequência de aminoácidos da proteína isolada de ligação a antígenos inclui a CDRH3 de SEQ ID NO:75, 78, 81, 84, 87, 90, 96, 99, 102, e 123, CDRH2 de SEQ ID NO:74, 77, 80, 83, 86, 89, 91, 93, 95, 98, 101, e 129, e CDRH1 de SEQ ID NO:73, 76, 79, 82, 85, 88, 92, 97, e 100, e/ou a segunda sequência de aminoácidos da proteína isolada de ligação a antígeno compreende a CDRL3 de SEQ ID NO:44, 47, 50, 53, 56, 59, 64, 68, 71, e 72, CDRL2 de SEQ ID NO:43, 46, 49, 52, 55, 58, 61, 63, 67, e 70, e CDRL1 de SEQ ID NO:42, 45, 48, 51, 54, 57, 62, 65, 66, e 69.
[272] Em uma modalidade adicional, a proteína de ligação a antígeno compreende pelo menos duas sequências de CDRH das sequências de cadeia pesada H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, ou H13, como mostrado na tabela 5A. Novamente em uma modalidade adicional, a proteína de ligação a antígeno compreende pelo menos duas sequências de CDRL das sequências de cadeia leve L1, L2, L3, L4, L5, L6, L7, L8, L9, L10, L11, L12, L13, L14, L15, L16, ou L17, como mostrado na tabela 5B. Novamente em uma modalidade adicional, a proteína de ligação a antígeno compreende pelo menos duas sequências de CDRH das sequências de cadeia pesada H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, ou H13, como mostrado na tabela 5A, e pelo menos duas CDRLs das sequências de cadeia leve L1, L2, L3, L4, L5, L6, L7, L8, L9, L10, L11, L12, L13, L14, L15, L16, ou L17, como mostrado na tabela 5B.
[273] Novamente em outra modalidade, a proteína de ligação a antígeno compreende as sequências de CDRH1, CDRH2, e CDRH3 das sequências de cadeia pesada H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, ou H13, como mostrado na tabela 5A. Em ainda outra modalidade, a proteína de ligação a antígeno compreende as sequências CDRL1, CDRL2, e CDRL3 das sequências de cadeia leve L1, L2, L3, L4, L5, L6, L7, L8, L9, L10, L11, L12, L13, L14, L15, L16, ou L17, como mostrado na tabela 5B.
[274] Em ainda outra modalidade, a proteína de ligação a antígeno compreende todas as seis CDRs de L1 e H1, ou L2 e H2, ou L3 e H3, ou L4 e H4, ou L5 e H5, ou L6 e H1, ou L7 e H6, ou L8 e H5, ou L9 e H1, ou L10 e H7, ou L11 e H8, ou L12 e H9, ou L12 e H10, ou L13 e H5, ou L14 e H11, ou L15 e H12, ou L16 e H13, ou L17 e H13, como mostrado na tabelas 5A e 5B. Tabela 5A - Regiões Exemplares de Sequência de Aminoácidos de Cadeia Pesada
Figure img0024
Figure img0025
Tabela 5B – Regiões Exemplares de Sequência de Aminoácidos de Cadeia Leve
Figure img0026
Figure img0027
[275] Em um aspecto, as proteínas isoladas de ligação a antígenos fornecidas neste documento podem ser um anticorpo monoclonal, um anticorpo policlonal, um anticorpo recombinante, um anticorpo humano, um anticorpo humanizado, um anticorpo quimérico, um anticorpo multiespecífico, ou um fragmento de ligação a antígeno de anticorpo dos mesmos.
[276] Em outra modalidade, o fragmento de anticorpo das proteínas isoladas de ligação a antígeno fornecidas neste documento podem ser um fragmento Fab, um fragmento Fab', um fragmento F(ab' )2, um fragmento Fv, um diacorpo, ou uma molécula de anticorpo de cadeia única.
[277] Em uma modalidade adicional, a proteína isolada de ligação a antígeno fornecida neste documento é um anticorpo humano e pode ser do tipo IgG1, IgG2 IgG3-ou IgG4.
[278] Em outra modalidade, a proteína de ligação a antígeno é composta apenas de uma cadeia leve ou uma cadeia pesada de polipeptídeo conforme estabelecido nas Tabelas 5A- 5B. Em algumas modalidades, a proteína de ligação a antígeno é composta apenas de um domínio variável de cadeia pesada ou variável de cadeia leve, como os listado nas Tabelas 5A-5B. As proteínas de ligação a antígeno podem ser peguiladas com uma ou mais moléculas de PEG.
[279] Em outro aspecto, a proteína isolada de ligação a antígeno fornecida neste documento pode ser acoplada a um grupo de marcação e pode competir pela ligação à porção extracelular de CGRP R humano com uma proteína de ligação a antígeno de uma das proteínas isoladas de ligação a antígeno fornecidas neste documento. Em uma modalidade, a proteína isolada de ligação a antígeno fornecida neste documento pode reduzir a quimiotaxia de monócitos, inibir a migração de monócitos em tumores ou inibir o acúmulo e a função dos macrófagos associados a tumor em um tumor, quando administrada a um paciente.
[280] Como será apreciado por aqueles versados na técnica, para qualquer proteína de ligação a antígeno com mais de uma CDR a partir das sequências apresentadas, qualquer combinação de CDRs independentemente selecionadas a partir das sequências apresentadas é útil. Assim, as proteínas de ligação a antígeno com um, dois, três, quatro, cinco ou seis CDRs independentemente selecionadas podem ser geradas. No entanto, como serão apreciadas por aqueles versados na técnica, as modalidades específicas geralmente usam combinações de CDRs que não são repetitivas, por exemplo, proteínas de ligação a antígeno geralmente não são feitas com duas regiões CDRH2, etc..
[281] Algumas das proteínas de ligação a antígeno fornecidas são discutidas em mais detalhes a seguir. Proteínas de Ligação a Antígeno e Epítopos de Ligação e Domínios de ligação
[282] Quando uma proteína de ligação a antígeno é dita se ligar um epítopo, como um ou ambos os componentes de CGRP R, ou o domínio extracelular de CGRP R, por exemplo, o que se entende é que a proteína de ligação a antígeno se liga especificamente a uma porção específica de CGRP R, que pode ser em CRLR, RAMP1, ou porções de extensão de ambos os CRLR e RAMP1. Nos casos em que a proteína de ligação a antígeno se liga apenas a CRLR (e não a RAMP1), não seria de se esperar que a proteína de ligação a antígeno se ligasse seletivamente a CGRP R porque CRLR está compartilhado, inter alia, com os receptores AM1 e AM1. Da mesma forma, nos casos em que a proteína de ligação a antígeno se liga apenas a RAMP1 (e não CRLR), não seria de se esperar que proteína de ligação a antígeno se ligasse seletivamente a CGRP R porque RAMP1 está compartilhada, inter alia, com o receptor de AMY1. Nos casos em que a proteína de ligação a antígeno interage tanto com CRLR quanto com RAMP1, espera-se que a proteína de ligação a antígeno se ligue a resíduos ou sequências de resíduos, ou em regiões de CRLR e RAMP1. Em nenhuma das modalidades anteriores espera-se que uma proteína de ligação a antígeno entre em contato com todos os resíduos dentro de CRLR ou RAMP1. Da mesma forma, nem todas as substituições de aminoácido ou deleções dentro de CRLR, RAMP1 ou seus domínios extracelulares são esperados para afetar significativamente a afinidade de ligação.
[283] Métodos detalhados, por exemplo, no Exemplo 10, podem ser usados para avaliar quais regiões de receptores multiméricos, tal como o CGRP R, podem estar envolvidas na ligação às proteínas de ligação a antígeno selecionadas. Proteínas de Competição de Ligação a Antígeno
[284] Em outro aspecto, as proteínas de ligação a antígeno que competem com um dos anticorpos de "referência" ou fragmentos funcionais de ligação ao epítopo exemplificados descritos acima para a ligação específica de CGRP R são fornecidas. As proteínas de ligação a antígeno também podem se ligar ao mesmo epítopo como uma das proteínas de ligação a antígeno aqui exemplificadas, ou um epítopo de sobreposição. As proteínas e fragmentos de ligação a antígeno que competem com, ou se ligam ao mesmo epítopo como o exemplificado ou proteínas de referência de ligação a antígeno são esperados mostrar propriedades funcionais semelhantes. As proteínas de ligação a antígeno exemplificada e fragmentos incluem aquelas com as cadeias pesadas e leves, os domínios da região variável VL1- VL17 e VH1- VH13, e CDRs incluídas nas tabelas 2A, 2B, 3, 4A, 4B, 5A e 5B. Assim, como um exemplo específico, as proteínas de ligação a antígeno que são fornecidas incluem aquelas que competem com um anticorpo tendo (a) todas as 6 CDRs listadas para um anticorpo listado nas Tabelas 5A e 5B, (b) uma VH e uma VL selecionada a partir de VL1-VL17 e VH1-VH13 e listados nas tabelas 5A e 5B, ou (c) duas cadeias leves e duas cadeias pesadas conforme especificado para um anticorpo listado nas Tabelas 5A e 5B. Outros exemplos de anticorpos de referência adequados incluem aqueles que possuem uma região variável de cadeia pesada tendo uma sequência correspondente a qualquer uma das sequências identificadas como SEQ ID NO: 158-170 e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência correspondente a qualquer uma das sequências identificadas como SEQ ID NO: 137-153.
[285] A competição por ligação pode ser avaliada, por exemplo, usando um ensaio de combinação, tal como o ensaio da Biacore descrito no Exemplo 7, abaixo. Nesse exemplo, 19 anticorpos descritos aqui foram testados contra cada um dos seis anticorpos de "referência" - cinco anticorpos de neutralização (11D11, 3B6, 4H6, 12G8, e 9F5) e um anticorpo não neutralizante (34E3). Os resultados do ensaio, mostrados na Tabela 13, indicam que todos os anticorpos de neutralização testados (1E11, 1H7, 2E7, 3B6, 3C8, 4E4, 4H6, 5F5, 9D4, 9F5, 10E4, 11D11, 11H9, 12E8, 12G8, 13H2 e 32H7) se ligam a essencialmente à mesma região de CGRP R, que é diferente da região de CGRP R que é ligada pelos anticorpos não neutralizantes testados (32H8, 33B5, 33E4 e 34E3). Com base nestes dados, qualquer um dos anticorpos de neutralização fariam proteínas de referência de ligação a antígeno exemplares em um ensaio de competição, particularmente qualquer um dos anticorpos de neutralização, que foram imobilizados no ensaio descrito no Exemplo 7 ---11D11, 3B6, 4H6, 12G8, e 9F5. Anticorpos Monoclonais
[286] As proteínas de ligação a antígeno que são fornecidas incluem anticorpos monoclonais que se ligam a CGRP R. Os anticorpos monoclonais podem ser produzidos usando qualquer técnica conhecida no estado da técnica, por exemplo, por células do baço de imortalização colhidas do animal transgênico após a conclusão do esquema de imunização. As células do baço podem ser imortalizadas usando qualquer técnica conhecida no estado da técnica, por exemplo, pela fusão das mesmas com células de mieloma para a produção de hibridomas. As células do mieloma para uso nos procedimentos de fusão para produção de hibridomas preferencialmente não são produtores de anticorpos, têm elevada eficiência de fusão, e deficiências enzimáticas que os tornam incapazes de crescer em certos meios seletivos que suportam o crescimento apenas das células fundidas desejadas (hibridomas). Exemplos de linhagens de células adequadas para uso em fusões de camundongos incluem include Sp-20, P3-X63/Ag8, P3-X63- Ag8.653, NS1/1.Ag 4 1, Sp210-Ag14, FO, NSO/U, MPC-11, MPC11- X45-GTG 1.7 e S194/5XXO Bul; exemplos de linhagens de células usadas em fusões de ratos incluem R210.RCY3, Y3-Ag 1.2.3, IR983F e 4B210. Outras linhagens de células úteis para fusões de células são U-266, GM1500-GRG2, LICR-LON-HMy2 e UC729-6. Um método exemplar de preparação de anticorpos monoclonais é descrito no Exemplo 2 abaixo.
[287] Em alguns casos, uma linhagem de células de hibridoma é produzida através da imunização de um animal (por exemplo, um animal transgênico tendo sequências de imunoglobulina humana) com um imunogene de CGRP R; colheita de células do baço do animal imunizado; fusão das células do baço colhidas a uma linhagem de células de mieloma, gerando assim células de hibridoma; determinação de linhagens celulares de hibridoma a partir de células de hibridoma, e identificação de uma linhagem de células de hibridoma que produz um anticorpo que se liga a CGRP R (por exemplo, como descrito nos Exemplos 1-3, abaixo). As linhagens de células de hibridoma tais e anticorpos anti-CGRP R monoclonais produzidos por eles, são aspectos do presente pedido.
[288] Os anticorpos monoclonais secretados por uma linhagem de células de hibridoma podem ser purificados usando qualquer técnica conhecida na arte. Os hibridomas ou mAbs podem ser ainda selecionados para identificar mAbs com propriedades particulares, tais como a capacidade de se ligar a células que expressam CGRP, capacidade de bloquear ou interferir a ligação do ligante CGRP ou peptídeo CGRP8-37, ou a capacidade de bloquear o receptor funcionalmente, por exemplo, usando um ensaio de cAMP, por exemplo, conforme descrito abaixo. Anticorpos Humanizados e Quiméricos
[289] Anticorpos quiméricos e humanizados baseados nas sequências anteriores também são fornecidos. Os anticorpos monoclonais para uso como agentes terapêuticos podem ser modificados de várias maneiras antes do uso. Um exemplo é o anticorpo quimérico, que é um anticorpo composto por segmentos de proteína de diferentes anticorpos que são covalentemente unidos para produzir cadeias pesadas ou leves de imunoglobulina ou porções imunologicamente funcionais dos mesmos. Geralmente, uma porção da cadeia pesada e/ou da cadeia leve é idêntica ou homóloga a uma sequência correspondente em anticorpos derivados de uma determinada espécie ou pertencentes a uma classe ou subclasse de anticorpos particular, enquanto o restante da(s) cadeia (s) é / são idêntico ou homólogo a uma sequência correspondente em anticorpos derivados de outra espécie ou pertencente a outra classe ou subclasse de anticorpos. Para os métodos relacionados com anticorpos quiméricos, ver, por exemplo, Patente dos Estados Unidos 4.816.567; e Morrison et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855, que são aqui incorporados por referência. O enxerto de CDR é descrito, por exemplo, na Patente dos Estados Unidos 6.180.370, 5.693.762, 5.693.761, 5.585.089, e 5.530.101.
[290] Geralmente, o objetivo de fazer um anticorpo quimérico é criar uma quimera na qual o número de aminoácidos das espécies do paciente pretendido é maximizado. Um exemplo é o "anticorpo CDR-enxertado", em que o anticorpo compreende uma ou mais regiões determinantes de complementaridade (CDRs) de uma determinada espécie ou pertencentes a uma classe ou subclasse de anticorpos específicos, enquanto o restante da cadeia de anticorpo(s) é/são idêntico(s) ou homólogo(s) a uma sequência correspondente em anticorpos derivados de outra espécie ou pertencente a outra classe ou subclasse de anticorpos. Para uso em humanos, a região variável ou CDRs selecionadas de um anticorpo de roedor, muitas vezes é enxertada em um anticorpo humano, substituindo as regiões variáveis de ocorrência natural ou CDRs dos anticorpos humanos.
[291] Um tipo útil de anticorpo quimérico é um anticorpo "humanizado". Geralmente, um anticorpo humanizado é produzido a partir de um anticorpo monoclonal criado inicialmente em um animal não humano. Certos resíduos de aminoácidos neste anticorpo monoclonal, normalmente a partir das porções de reconhecimento de não antígenos do anticorpo, são modificados para serem homólogos aos resíduos correspondentes em um anticorpo humano de isotipo correspondente. A humanização pode ser realizada, por exemplo, usando vários métodos pela substituição de pelo menos uma porção de uma região variável de roedor para as regiões correspondentes de um anticorpo humano (ver, por exemplo, Patente dos Estados Unidos 5.585.089, e 5.693.762; Jones et al., 1986, Nature 321:522-525; Riechmann et al. , 1988, Nature 332:323-27; Verhoeyen et al. , 1988, Science 239:1534-1536).
[292] Em um aspecto, as CDRs das regiões variáveis de cadeia leve e pesada de anticorpos fornecidos neste documento (ver, Tabela 4) são enxertadas nas regiões de estrutura (FRs) a partir dos anticorpos da mesma, ou uma espécie filogenética, diferente. Por exemplo, as CDRs das regiões variáveis de cadeia leve e pesada VH1, VH2, VH3, VH4, VH5, VH6, VH7, VH8, VH9, VH10, VH11, VH12, e VH13, e/ou VL1, VL2, VL3, VL4, VL5, VL6, VL7, VL8, VL9, VL10, VL11, VL12, VL13, VL14, VL15, VL16, e VL17 podem ser enxertadas em FRs consenso humanas. Para criar FRs consenso humanas, as FRs das várias sequências de aminoácidos de cadeia pesada ou cadeia leve humana podem ser alinhadas para identificar uma sequência consenso de aminoácidos. Em outras modalidades, as FRs de uma cadeia pesada ou de cadeia leve divulgadas neste documento são substituídas pelas FRs a partir de uma cadeia leve ou cadeia pesada diferente. Em um aspecto, os aminoácidos raros nas FRs das cadeias pesadas e leves do anticorpo anti-CGRP R não são substituídos, enquanto o resto dos aminoácidos da FR é substituído. Um "aminoácido raro" é um aminoácido específico que está em uma posição em que este aminoácido em particular não é normalmente encontrado em uma FR. Alternativamente, as regiões variáveis enxertadas de uma cadeia pesada ou leve podem ser usadas com uma região constante que é diferente da região constante da cadeia pesada ou leve particular, como aqui divulgada. Em outras modalidades, as regiões variáveis enxertadas são parte de um anticorpo Fv de cadeia única.
[293] Em certas modalidades, as regiões constantes de espécies diferentes da humana podem ser usadas junto com a(s) região (ões) variáveis humana(s) para produzir anticorpos híbridos. Anticorpos Humanos de Comprimento Completo
[294] Os anticorpos completamente humanos também são fornecidos. Os métodos estão disponíveis para preparar anticorpos completamente humanos específicos para um dado antígeno, sem expor os seres humanos contra o antígeno ("anticorpos completamente humanos"). Um meio específico fornecido para a implementação da produção de anticorpos completamente humanos é a "humanização" do sistema imune humoral de camundongo. A introdução do loci de imunoglobulina humana (Ig) em camundongos nos quais os genes de Ig endógenos foram inativados é um meio para produzir anticorpos monoclonais completamente humanos (mAbs) em camundongos, um animal que pode ser imunizado com qualquer antígeno desejável. Usando anticorpos completamente humanos que minimizam as respostas alérgicas e imunogênicas que às vezes podem ser causadas pela administração de mAbs derivados de camundongo ou derivados de rato aos humanos como agentes terapêuticos.
[295] Os anticorpos completamente humanos podem ser produzidos por imunização de animais transgênicos (geralmente camundongos) que são capazes de produzir um repertório de anticorpos humanos, na ausência de produção de imunoglobulina endógena. Os antígenos para esta finalidade normalmente têm seis ou mais aminoácidos contíguos e, opcionalmente, são conjugados a um carreador, tal como um hapteno. Ver, por exemplo, Jakobovits et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2551-2555; Jakobovits et al., 1993, Nature 362:255-258; and Bruggermann et al. , 1993, Year in Immunol. 7:33. Em um exemplo de tal método, os animais transgênicos são produzidos pela incapacitação do loci de imunoglobulina do camundongo endógeno que codifica as cadeias de imunoglobulina pesada e leve do camundongo no mesmo, e inserção nos fragmentos grandes do genoma do camundongo do DNA do genoma humano contendo o loci que codifica as proteínas de cadeia leve e pesada humana. Os animais parcialmente modificados, que têm menos do que o complemento total do loci de imunoglobulina humana, são então híbridos para obter um animal com todas as modificações do sistema imune desejadas. Quando administrado um imunogene, estes animais transgênicos produzem anticorpos que são imunoespecíficos para o imunogene, mas têm sequências de aminoácidos humana, em vez de murino, incluindo as regiões variáveis. Para mais detalhes sobre tais métodos, ver, por exemplo, WO96/33735 e WO94/02602. Métodos adicionais relacionados com camundongos transgênicos para a produção de anticorpos humanos são descritos nas Patentes dos Estados Unidos 5.545.807, 6.713.610; 6.673.986; 6.162.963; 5.545.807; 6.300.129; 6.255.458; 5.877.397; 5.874.299 e 5.545.806, nas publicações de PCT WO91/10741, WO90/04036, e na EP 546 073B1 e EP 546 073A1.
[296] Os camundongos transgênicos descritos acima, aqui referidos como camundongos "HuMab", contêm um minilocus de gene de imunoglobulina humana que codifica sequências de imunoglobulina de cadeia leve [kappa] e pesada ( [mu] e [gamma]) humana não rearranjadas, juntamente com as mutações alvo que inativam o loci de cadeia [kappa] e endógena [mu] e (Lonberg et al., 1994, Nature 368:856-859). Assim, os camundongos apresentam expressão reduzida de IgM de camundongo ou [kappa] e em resposta à imunização, e os transgenes de cadeia pesada e leve humana introduzidos passam por troca de classe e mutação somática para gerar anticorpos monoclonais de IgG [kappa] humana de alta afinidade (Lonberg et al., supra.; Lonberg e Huszar, 1995, Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93; Harding e Lonberg, 1995, Ann. N.Y Acad. Sci. 764:536-546). A preparação de camundongos HuMab é descrita em detalhes em Taylor et al., 1992, Nucleic Acids Research 20:6287-6295; Chen et al. , 1993, International Immunology 5:647-656; Tuaillon et al. , 1994, J. Immunol. 152:2912-2920; Lonberg et al., 1994, Nature 368:856-859; Lonberg, 1994, Handbook of Exp. Pharmacology 113:49-101; Taylor et al., 1994, International Immunology 6:579-591; Lonberg e Huszar, 1995, Intern. Rev. Immunol. 13:65-93; Harding e Lonberg, 1995, Ann. N.Y Acad. Sci. 764:536-546; Fishwild et al., 1996, Nature Biotechnology 14:845-851; as referências anteriores sendo aqui incorporadas por referência em sua totalidade para todos os propósitos. Veja ainda as Patentes dos Estados Unidos 5.545.806; 5.569.825; 5.625.126; 5.633.425; 5.789.650; 5.877.397; 5.661.016; 5.814.318; 5.874.299; e 5.770.429; bem como a Patente dos Estados Unidos 5.545.807; Publicações internacionais WO 93/1227; WO 92/22646; e WO 92/03918, a divulgação de todas as quais sendo aqui incorporadas por referência em sua totalidade para todos os propósitos. As tecnologias usadas para a produção de anticorpos humanos nesses camundongos transgênicos são divulgadas também no WO 98/24893, e Mendez et al., 1997, Nature Genetics 15:146-156, que são incorporadas aqui por referência. Por exemplo, as cepas de camundongos transgênico HCo7 e HCo12 podem ser usadas para gerar anticorpos anti- CGRP R. Mais detalhes sobre a produção de anticorpos humanos usando camundongos transgênicos são fornecidos nos exemplos abaixo.
[297] Usando a tecnologia de hibridoma, os mAbs humanos específicos para antígeno com a especificidade desejada podem ser produzidos e selecionados a partir de camundongos transgênicos, como os descritos acima. Tais anticorpos podem ser clonados e expressos usando um vetor adequado e célula hospedeira, ou os anticorpos podem ser colhidos a partir de células de hibridoma cultivadas.
[298] Os anticorpos completamente humanos também podem ser derivados bibliotecas de exibição de fagos (conforme divulgado em Hoogenboom et al., 1991, J. Mol. Biol. 227:381; and Marks et al., 1991, J. Mol. Biol. 222:581). As técnicas de exibição de fagos mimetizam a seleção imune através da exibição de repertórios de anticorpos na superfície de bacteriófagos filamentosos, e seleção subsequente de fagos por sua ligação a um antígeno de escolha. Uma dessas técnicas é descrita na Publicação de PCT WO 99/10494 (incorporada aqui por referência), que descreve o isolamento de alta afinidade e anticorpos agonísticos funcionais para MPL e receptores- msk usando essa abordagem. Proteínas de Ligação a Antígeno Biespecífico ou Bifuncional
[299] As proteínas de ligação a antígeno que são fornecidas incluem também anticorpos biespecíficos e bifuncionais que incluem uma ou mais CDRs ou uma ou mais regiões variáveis como descritas acima. Um anticorpo biespecífico ou bifuncional, em alguns casos é um anticorpo artificial híbrido tendo dois pares de cadeia pesada/leve diferentes e dois sítios de ligação diferentes. Os anticorpos biespecíficos podem ser produzidos por uma variedade de métodos incluindo, mas não limitados a, fusão de hibridomas ou ligação dos fragmentos Fab'. Veja, por exemplo, Songsivilai e Lachmann, 1990, Clin. Exp. Immunol. 79:315321; Kostelny et al., 1992, J. Immunol. 148:1547-1553. Várias Outras Formas
[300] Algumas das proteínas de ligação a antígeno que são fornecidas são formas variantes de proteínas de ligação a antígeno divulgadas acima (por exemplo, aquelas que têm as sequências nas tabelas 2-5). Por exemplo, algumas das proteínas de ligação a antígeno têm uma ou mais substituições conservativas de aminoácidos em uma ou mais das cadeias leves ou pesadas, regiões variáveis ou CDRs nas tabelas 2-5.
[301] Os aminoácidos de ocorrência natural podem ser divididos em classes com base nas propriedades comuns da cadeia lateral: 1) hidrofóbica: norleucina, Met, Ala, Val, Leu, Ile; 2) hidrofílica neutral: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln; 3) acida: Asp, Glu; 4) básica: His, Lys, Arg; 5) resíduos que influenciam a orientação da cadeia: Gly, Pro; e 6) aromático: Trp, Tyr, Phe.
[302] As substituições conservativas de aminoácidos podem envolver troca de um membro de uma dessas classes com outro membro da mesma classe. As substituições conservativas de aminoácidos podem abranger resíduos de aminoácidos de ocorrência não natural, que são tipicamente incorporados por síntese química de peptídeos, em vez de por síntese em sistemas biológicos. Estes incluem peptidomiméticos e outras formas revertidas ou invertidas de grupamentos de aminoácidos.
[303] As substituições não conservativas podem envolver a troca de um membro de uma das classes acima de um membro de outra classe. Tais resíduos substituídos podem ser introduzidos nas regiões do anticorpo que são homólogas com anticorpos humanos, ou nas regiões não homólogas da molécula.
[304] Ao fazer tais mudanças, de acordo com certas modalidades, o índice hidropático de aminoácidos pode ser considerado. O perfil hidropático de uma proteína é calculado pela atribuição a cada aminoácido de um valor numérico ("índice de hidropatia") e, em seguida, repetidamente cálculo desses valores ao longo da cadeia peptídica. Cada aminoácido foi atribuído um índice hidropático com base em suas características de hidrofobicidade e carga. São eles: isoleucina (+4,5); valina (+4,2); leucina (+3,8); fenilalanina (+2,8); cisteína / cistina (+2,5); metionina (+1,9); alanina (+1,8); glicina (- 0,4); treonina (-0,7); serina (-0,8); triptofano (-0,9); tirosina (-1,3); prolina (-1,6); histidina (-3,2); glutamato (-3,5); glutamina (3,5); aspartato (-3,5); asparagina (-3,5); lisina (-3,9) e arginina (-4,5).
[305] A importância do perfil hidropático em conferir função biológica interativa em uma proteína é entendida no estado da técnica (ver, por exemplo, Kyte et al., 1982, J. Mol. Biol. 157:105-131). Sabe-se que certos aminoácidos podem ser substituídos por outros aminoácidos tendo um índice hidropático semelhante ou pontuação e ainda mantém uma atividade biológica semelhante. Ao fazer mudanças com base no índice hidropático, em certas modalidades, a substituição de aminoácidos cujos índices hidropáticos estão dentro de ± 2 é incluída. Em alguns aspectos, aqueles que estão dentro de ± 1 são incluídos, e em outros aspectos, aqueles dentro de ± 0,5 são incluídos.
[306] Entende-se igualmente do estado da técnica que a substituição de aminoácidos semelhantes pode ser feita de forma eficaz com base na hidrofilicidade, particularmente onde a proteína ou peptídeo biologicamente funcional assim criado é destinado ao uso em modalidades imunológicas, como no caso presente. Em certas modalidades, a maior média de hidrofilicidade local de uma proteína, como regidas pela hidrofilicidade de seus aminoácidos adjacentes, correlaciona-se com a sua imunogenicidade e imunogenicidade de ligação a antígenos ou imunogenicidade, ou seja, com uma propriedade biológica da proteína.
[307] Os seguintes valores de hidrofilicidade foram atribuídos a estes resíduos de aminoácidos: arginina (+3,0); lisina (+3,0); aspartato (+3,0 ± 1); glutamato (+3,0 ± 1); serina (+0,3); asparagina (+ 0,2); glutamina (+0,2); glicina (0); treonina (-0,4); prolina (-0,5 ± 1); alanina (-0,5); histidina (-0,5); cisteína (-1,0); metionina (-1,3); valina (-1,5); leucina (-1,8); isoleucina (-1,8); tirosina (-2,3); fenilalanina (-2,5) e triptofano (-3,4). Ao fazer mudanças com base em valores de hidrofilicidade similares, em certas modalidades, a substituição de aminoácidos cujos valores de hidrofilicidade estão dentro de ± 2 é incluída, em outras modalidades, aquelas que estão dentro de ± 1 são incluídas, e ainda em outras modalidades, aquelas dentro de ± 0,5 são incluídas. Em alguns casos, pode-se também identificar epítopos de sequências de aminoácidos primárias com base na hidrofilicidade. Essas regiões também são referidas como "regiões centrais epitópicas".
[308] As substituições conservativas Exemplares de Aminoácidos são as estabelecidas na Tabela 6. Tabela 6: Substituições Conservativas de Aminoácidos
Figure img0028
[309] Um técnico no assunto será capaz de determinar as variantes de polipeptídeos adequadas como aqui estabelecidas usando técnicas bem conhecidas. Um técnico no assunto pode identificar áreas adequadas da molécula que pode ser mudada sem destruir a atividade, tendo como alvo regiões não acreditadas como sendo importantes para a atividade. O técnico no assunto também será capaz de identificar resíduos e porções de moléculas que são conservados entre os polipeptídeos similares. Em modalidades adicionais, mesmo as áreas que podem ser importantes para a atividade biológica ou para a estrutura podem estar sujeitas a substituições conservativas de aminoácidos, sem destruir a atividade biológica ou sem prejudicar a estrutura polipeptídica.
[310] Além disso, um técnico no assunto pode rever estudos de função de estrutura que identificam resíduos em polipeptídios semelhantes que são importantes para a atividade ou a estrutura. Em vista de tal comparação, pode- se prever a importância dos resíduos de aminoácidos em uma proteína que corresponde aos resíduos de aminoácidos importantes para a atividade ou estrutura em proteínas semelhantes. Um técnico no assunto pode optar por substituições de aminoácidos quimicamente semelhantes para tais resíduos de aminoácidos importantes previstos.
[311] Um técnico no assunto também pode analisar a estrutura 3-dimensional e sequência de aminoácidos em relação a essa estrutura em polipeptídios semelhantes. Em vista de tais informações, um técnico no assunto pode predizer o alinhamento dos resíduos de aminoácidos de um anticorpo com respeito à sua estrutura tridimensional. Um técnico no assunto pode optar por não fazer mudanças radicais para resíduos de aminoácidos previstos como estando na superfície da proteína, uma vez que esses resíduos podem estar envolvidos em interações importantes com outras moléculas. Além disso, um técnico no assunto pode gerar variantes de teste contendo uma única substituição de aminoácidos em cada resíduo de aminoácido desejado. Essas variantes podem ser rastreadas por meio de ensaios para a atividade de neutralização de CGRP R, (veja exemplos abaixo) assim produzindo informações em relação à qual dos aminoácidos pode ser mudado e qual não deve ser mudado. Em outras palavras, com base na informação colhida a partir de tais experimentos de rotina, um técnico no assunto pode facilmente determinar as posições de aminoácidos, onde substituições adicionais devem ser evitadas isoladamente ou em combinação com outras mutações.
[312] Um número de publicações científicas têm se dedicado à predição da estrutura secundária. Ver, Moult, 1996, Curr. Op. in Biotech. 7:422-427; Chou et al., 1974, Biochem. 13:222-245; Chou et al., 1974, Biochemistry 113:211-222; Chou et al. , 1978, Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol. 47:45-148; Chou et al., 1979, Ann. Rev. Biochem. 47:251-276; and Chou et al., 1979, Biophys. J. 26:367-384. Além disso, programas de computador estão atualmente disponíveis para auxiliar nas previsões de estrutura secundária. Um método de previsão de estrutura secundária é baseado na modelagem de homologia. Por exemplo, dois polipeptídeos ou proteínas que têm uma identidade de sequência maior que 30%, ou similaridade maior que 40% podem ter topologias estruturais semelhantes. O recente crescimento das bases de dados de proteínas estruturais (PDB) tem proporcionado maior previsibilidade da estrutura secundária, incluindo o número potencial de dobras dentro de uma estrutura de polipeptídeo ou proteína. Ver, Holm et al., 1999, Nucl. Acid. Res. 27:244-247. Foi sugerido (Brenner et al. , 1997, Curr. Op. Struct. Biol. 7:369-376) que há um número limitado de dobras em um dado polipeptídeo ou proteína e que uma vez que um número crítico de estruturas foi resolvido, a previsão estrutural vai se tornar dramaticamente mais precisa.
[313] Métodos adicionais para prever a estrutura secundária incluem "threading" (Jones, 1997, Curr. Opin. Struct. Biol. 7:377-387; Sippl et al., 1996, Structure 4:1519), "análise de perfil" (Bowie et al., 1991, Science 253:164-170; Gribskov et al. , 1990, Meth. Enzym. 183:146-159; Gribskov et al. , 1987, Proc. Nat. Acad. Sci. 84:4355 4358), e "ligação evolucionária" (Holm, 1999, supra; and Brenner, 1997, supra).
[314] Em algumas modalidades, as substituições de aminoácidos que são feitas: (1) reduzem a susceptibilidade à proteólise, (2) reduzem a susceptibilidade à oxidação, (3) alteram a afinidade de ligação para a formação de complexos de proteína, (4) alteram as afinidades de ligação a antígeno ou ligante, e/ou (4) conferem ou modificam outras propriedades físico-químicas ou funcionais sobre tais polipeptídeos. Por exemplo, substituições de aminoácidos simples ou múltiplas (em certas modalidades, substituições conservativas de aminoácidos) podem ser feitas na sequência de ocorrência natural. As substituições podem ser feitas na porção do anticorpo que se encontra fora do (s) domínio (s) que forma contatos intermoleculares). Em tais modalidades, as substituições conservativas de aminoácidos podem ser usadas de modo que não alteram substancialmente as características estruturais da sequência de origem (por exemplo, uma ou mais substituição de aminoácidos que não rompam a estrutura secundária que caracteriza a proteína de ligação a antígeno nativa ou de origem). Exemplos de estruturas secundárias e terciárias de polipeptídeos reconhecidas na arte são descritos em Proteínas, Estruturas e Princípios Moleculares (Creighton, Ed.), 1984, W. H. New York: Freeman and Company; Introduction to Protein Structure (Branden and Tooze, eds.), 1991, New York: Garland Publishing; e Thornton et al., 1991, Nature 354:105, que são cada aqui incorporados aqui por referência.
[315] Variantes adicionais de anticorpos preferidos incluem variantes de cisteína em que um ou mais resíduos de cisteína na sequência de aminoácido nativo ou de origem são excluídos ou substituídos por outro aminoácido (por exemplo, serina). As variantes de cisteína são úteis, inter alia, quando os anticorpos devem ser redobrados para uma conformação biologicamente ativa. As variantes cisteína podem ter menos resíduos de cisteína que o anticorpo nativo, e normalmente têm um número par para minimizar as interações resultantes de cisteínas desemparelhadas.
[316] As cadeias pesadas e leves, domínios de regiões variáveis e CDRs que são divulgadas podem ser usados para preparar polipeptídeos que contêm uma região de ligação a antígeno que pode se ligar especificamente a CGRP R. Por exemplo, uma ou mais das CDRs listadas nas Tabelas 4 e 5 podem ser incorporadas em uma molécula (por exemplo, um polipeptídeo) covalentemente ou não covalentemente para fazer uma imunoadesão. Uma imunoadesão pode incorporar a (s) CDR (s) como parte de uma cadeia polipeptídica maior, pode se ligar covalentemente a(s) CDR (s) para outra cadeia polipeptídica, ou pode incorporar a (s) CDR (s) não covalentemente. A (s) CDR (s) permitem que a imunoadesão se ligue especificamente a um antígeno de interesse particular (por exemplo, CGRP R ou epítopo mesmo).
[317] Os miméticos (por exemplo, "miméticos de peptídeos" ou "peptidomiméticos") baseados em domínios de região variável e CDRs que são descritas aqui são também fornecidos. Esses análogos podem ser peptídeos, não- peptídeos ou combinações de regiões de peptídeos e não- peptídeos. Fauchere, 1986, Adv. Drug Res. 15:29; Veber e Freidinger, 1985, TINS p. 392; e Evans et al., 1987, J. Med. Chem. 30:1229, que são incorporados aqui por referência para qualquer finalidade. Os miméticos de peptídeos que são estruturalmente similares aos peptídeos terapeuticamente úteis podem ser usados para produzir um efeito terapêutico ou profilático semelhante. Tais compostos são, muitas vezes, desenvolvidos com o auxílio da modelagem molecular computadorizada. Geralmente, os peptidomiméticos são proteínas que são estruturalmente similares a um anticorpo exibindo uma atividade biológica desejada, tal como aqui, a capacidade de se ligarem especificamente a CGRP R, mas tendo uma ou mais ligações peptídicas opcionalmente substituídas por uma ligação selecionada de: -CH2NH,-CH2S -,-CH2-CH2-,-CH- CH-(cis e trans), COCH2-,-CH (OH) CH2-, e-CH2SO, através de métodos bem conhecidos no estado da técnica. A substituição sistemática de um ou mais aminoácidos de uma sequência consenso com um D-aminoácido do mesmo tipo (por exemplo, D- lisina no lugar de L-lisina) pode ser usada em certas modalidades para gerar proteínas mais estáveis. Além disso, os peptídeos constrangidos compreendendo uma sequência consenso ou uma variação da sequência consenso substancialmente idêntica podem ser gerados por métodos conhecidos no estado da técnica (Rizo e Gierasch, 1992, Ann. Rev. Biochem. 61:387), aqui incorporado por referência), por exemplo, pela adição de resíduos de cisteína interna capazes de formar pontes de dissulfeto intramoleculares que ciclizam o peptídeo.
[318] Derivados das proteínas de ligação a antígeno que são descritos aqui são também fornecidos. As proteínas de ligação a antígeno derivatizadas podem compreender qualquer molécula ou substância que dá uma propriedade desejada para o anticorpo ou fragmento, como o aumento da meia-vida em um uso particular. A proteína de ligação a antígeno derivatizada pode compreender, por exemplo, um grupamento (ou marcação) detectável (por exemplo, um radioativo, colorimétrico, antigênico, ou molécula enzimática, uma microesfera detectável (como uma microesfera magnética ou eletrodensa (por exemplo, o ouro)), ou uma molécula que se liga a outra molécula (por exemplo, biotina ou estreptavidina)), um grupamento terapêutico ou de diagnóstico (por exemplo, um grupamento, radioativo citotóxico ou farmaceuticamente ativo), ou uma molécula que aumenta a adequação da proteína de ligação a antígeno para um determinado uso (por exemplo, a administração a um sujeito, como um sujeito humano, ou outros usos in vivo ou in vitro). Exemplos de moléculas que podem ser usadas para derivatizar uma proteína de ligação a antígeno incluem albumina (por exemplo, albumina sérica humana) e polietileno glicol (PEG). Os derivativos (ou derivados) PEGylados e ligados a albumina de proteínas de ligação a antígeno podem ser preparados usando técnicas bem conhecidas no estado da técnica. Certas proteínas de ligação a antígeno incluem um polipeptídeo de cadeia única peguilada como aqui descrito. Em uma modalidade, a proteína de ligação a antígeno é conjugada ou ligada a transtirretina (TTR) ou uma variante de TTR. A variante de TTR ou TTR pode ser quimicamente modificada com, por exemplo, uma substância química selecionada do grupo consistindo em dextrana, poli (n-vinil pirrolidona), glicóis de polietileno, homopolímeros de propropileno glicol, óxido de polipropileno / copolímeros de óxido de etileno, polióis polioxietilados e álcoois polivinílicos.
[319] Outros derivados incluem conjugados covalentes ou agregadores de proteínas de ligação a CGRP R com outras proteínas ou polipeptídeos, tais como pela expressão de proteínas de fusão recombinantes compreendendo polipeptídeos heterólogos fundidos ao N-terminal ou C-terminal de uma proteína de ligação a CGRP R. Por exemplo, o peptídeo conjugado pode ser um polipeptídeo sinal heterólogo (ou líder), por exemplo, o líder de fator alfa de levedura, ou um peptídeo, como um tag de epítopo. As proteínas de fusão contendo proteínas de ligação a antígeno CGRP podem compreender peptídeos adicionados para facilitar a purificação ou a identificação da proteína de ligação a CGRP R (por exemplo, poli-His). Uma proteína de ligação a CGRP R também pode ser ligada ao peptídeo FLAG, conforme descrito em Hopp et al., 1988, Bio/Technology 6:1204;. e Patente dos Estados Unidos 5.011.912. O peptídeo FLAG é altamente antigênico e proporciona um epítopo reversivelmente ligado por um anticorpo monoclonal específico (mAb), permitindo ensaio rápido e fácil purificação da proteína recombinante expressa. Os reagentes úteis para preparar as proteínas de fusão em que o peptídeo FLAG é fundido a um polipeptídeo dado estão disponíveis comercialmente (Sigma, St. Louis, MO).
[320] Oligômeros que contêm uma ou mais proteínas de ligação a CGRP R podem ser empregados como antagonistas do CGRP R. Oligômeros podem estar na forma de dímeros covalentemente ligados ou não-covalentemente ligados, trímeros, ou oligômeros superiores. Os oligômeros compreendendo duas ou mais proteínas de ligação a CGRP R são contemplados para utilização, com um exemplo sendo um homodímero. Outros oligômeros incluem heterodímeros, homotrímeros, heterotrímeros, homotetrâmeros, heterotetrâmeros, etc.
[321] Uma modalidade é direcionada para oligômeros compreendendo múltiplos polipeptídeos de ligação CGRP R unidos através de interações covalentes ou não covalentes entre frações de peptídeo fundidas às proteínas de ligação a CGRP R. Tais peptídeos podem ser ligantes de peptídeo (espaçadores), ou peptídeos que têm a propriedade de promover a oligomerização. Os zíperes leucina e certos polipeptídeos derivados dos anticorpos estão entre os peptídeos que podem promover a oligomerização das proteínas de ligação a CGRP R anexas a ele como descrito em mais detalhes abaixo.
[322] Em modalidades particulares, os oligômeros compreendem de duas a quatro proteínas de ligação a CGRP R. As frações da proteína de ligação a CGRP R do oligômero podem estar em qualquer uma das formas descritas acima, por exemplo, variantes ou fragmentos. De preferência, os oligômeros compreendem as proteínas de ligação a CGRP R que podem ter atividade de ligação a CGRP R.
[323] Em uma modalidade, um oligômero é preparado com polipeptídios derivados de imunoglobulinas. A preparação das proteínas de fusão compreendendo certos polipeptídeos heterólogos fundidos a várias porções de polipeptídeos derivados de anticorpos (incluindo o domínio Fc) foi descrita, por exemplo, por Ashkenazi et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:10535; Byrn et al. , 1990, Nature 344:677; e Hollenbaugh et al., 1992 "Construction of Immunoglobulin Fusion Proteins", in Current Protocols in Immunology, Suppl. 4, páginas 10.19.1-10.19.11.
[324] Uma modalidade é direcionada a um dímero composto por duas proteínas de fusão criadas pela fusão de uma proteína de ligação a CGRP R à região Fc do anticorpo. O dímero pode ser feito, por exemplo, pela inserção de uma fusão de gene codificando a proteína de fusão em um vetor de expressão apropriado, expressando a fusão do gene em células hospedeiras transformadas com o vetor de expressão recombinante, e permitindo que a proteína de fusão expressa monte bem como as moléculas de anticorpo, onde as pontes de dissulfeto de intercadeia se formam entre as frações Fc para produzir o dímero.
[325] O termo "polipeptídeo Fc" como aqui utilizado inclui formas nativas e de muteína de polipeptídeos derivados da região Fc de um anticorpo. Formas truncadas de tais polipeptídeos contendo a região de dobradiça que promove a dimerização também estão incluídas. As proteínas de fusão compreendendo as frações Fc (e oligômeros formados daí) oferecem a vantagem da purificação fácil por cromatografia de afinidade através das colunas de Proteína A ou Proteína G.
[326] Um polipeptídeo Fc adequado, descrito no pedido PCT WO 93/10151 e Patente dos Estados Unidos. N° 5.426.048 e N° 5.262.522, é uma única cadeia polipeptídica que se estende desde a região de dobradiça N-terminal para o término C nativo da região Fc de um anticorpo IgG1 humano. Outro polipeptídeo Fc útil é a muteína Fc descrita na Patente dos Estados Unidos No. 5.457.035, e em Baum et al., 1994, EMBO J. 13:3992-4001. A sequência de aminoácidos desta muteína é idêntica a da sequência Fc nativa apresentada na WO 93/10151, exceto pelo fato de que o aminoácido 19 foi alterado de Leu para Ala, o aminoácido 20 foi alterado de Leu para Glu, e o aminoácido 22 foi alterado de Gly para Ala. O muteína apresenta afinidade reduzida para receptores de Fc.
[327] Em outras modalidades, a porção variável das cadeias pesadas e/ou cadeias leves de uma proteína de ligação a CGRP R, como aqui divulgado pode ser substituída para a porção variável de uma cadeia pesada e/ou leve de anticorpo.
[328] Alternativamente, o oligômero é uma proteína de fusão compreendendo múltiplas proteínas de ligação a CGRP R, com ou sem ligantes de peptídeo (peptídeos espaçadores). Entre os ligantes de peptídeo adequados estão os descritos nas Patentes dos Estados Unidos. N° 4.751.180 e N° 4.935.233.
[329] Outro método para a preparação de derivados de proteína de ligação a CGRP R oligoméricos envolve o uso de um zíper de leucina. Os domínios do zíper de leucina são peptídeos que promovem a oligomerização das proteínas em que eles são encontrados. Os zíperes de leucina foram originalmente identificados em várias proteínas de ligação de DNA (Landschulz et al., 1988, Science 240:1759), e já foram encontrados em uma variedade de proteínas diferentes. Entre os zíperes de leucina conhecidos estão os peptídeos de ocorrência natural e seus derivados que dimerizam ou trimerizam. Exemplos de domínios de zíper de leucina adequados para a produção de proteínas oligoméricos solúveis são descritos no pedido PCT WO 94/10308, o zíper de leucina derivado da proteína surfactante pulmonar D (SPD) descrito em Hoppe et al., 1994, FEBS Letters 344:191, incorporado aqui a título de referência. O uso de um zíper de leucina modificado que permite a trimerização estável de uma proteína heteróloga fundida ao mesmo é descrito em Fanslow et al., 1994, Semin. Immunol. 6:267-278. Em uma abordagem, as proteínas de fusão recombinantes compreendendo um fragmento de proteína de ligação a CGRP R ou derivado fundido a um peptídeo do zíper leucina são expressas em células hospedeiras adequadas, e os fragmentos de proteína de ligação a CGRP R oligoméricos solúveis ou derivados que se formam são recuperados a partir do sobrenadante da cultura.
[330] Em certas modalidades, a proteína de ligação do antígeno tem um KD (afinidade de ligação de equilíbrio) de menos de 1 pM, 10 pM, 100 pM, 1 nM, 2 nM, 5 nM, 10 nM, 25 nM ou 50 nM.
[331] Outro aspecto fornece uma proteína de ligação a antígeno tendo uma meia-vida de pelo menos um dia in vitro ou in vivo (por exemplo, quando administrada a um ser humano). Em uma modalidade, a proteína de ligação do antígeno tem uma meia-vida de pelo menos três dias. Em outra modalidade, o anticorpo ou porção dele tem uma meia-vida de quatro dias ou mais. Em outra modalidade, o anticorpo ou porção dele tem uma meia-vida de oito dias ou mais. Em outra modalidade, o anticorpo ou porção de ligação do antígeno do mesmo é derivatizado ou modificado de tal forma que ele tenha uma meia-vida maior em comparação com o anticorpo não derivatizado ou não modificado. Em outra modalidade, a proteína de ligação do antígeno contém mutações pontuais para aumentar a meia-vida sérica, como descrito no WO 00/09560, publicado em 24 de fevereiro de 2000, incorporado aqui a título de referência. Glicosilação
[332] A proteína de ligação do antígeno pode ter um padrão de glicosilação, que é diferente ou alterado daquele encontrado nas espécies nativas. Como é conhecida na técnica, os padrões de glicosilação podem depender tanto da sequência da proteína (por exemplo, a presença ou ausência de resíduos de aminoácidos de glicosilação particulares, discutido abaixo), ou a célula hospedeira ou organismo no qual a proteína é produzida. Sistemas de expressão particulares são discutidos abaixo.
[333] A glicosilação de polipeptídeos é tipicamente ou ligada a N ou ligada a O. Ligada a N refere-se à fixação da fração de carboidrato à cadeia lateral de um resíduo de asparagina. As sequências de tri-peptídeo asparagina-X- serina e asparagina X-treonina, onde X é qualquer aminoácido, exceto prolina, são as sequências de reconhecimento para a fixação enzimática da fração de carboidrato à cadeia lateral de asparagina. Assim, a presença de qualquer uma dessas sequências de tri-peptídeo em um polipeptídeo cria um sítio de glicosilação potencial. A glicosilação ligada a O refere- se à fixação de um dos açúcares N-acetilgalactosamina, galactose ou xilose, a um hidroxiaminoácido, mais comumente serina ou treonina, embora 5-hidroxiprolina ou 5- hidroxilisina também possa ser usada.
[334] A adição de sítios de glicosilação à proteína de ligação do antígeno é convenientemente realizada, alterando a sequência de aminoácido tal que contenha uma ou mais das sequências de tri-peptídeo descritas acima (para sítios de glicosilação ligados a N). A alteração também pode ser feita pela adição de, ou substituição por, um ou mais resíduos de serina ou treonina para a sequência de partida (para sítios de glicosilação ligados a O-). Para facilitar, a sequência de aminoácido da proteína de ligação a antígeno pode ser alterada por mudanças no nível do DNA, particularmente através da mutação do DNA que codifica o polipeptídeo alvo em bases pré-selecionadas de tal modo que os códons são gerados que irão traduzir-se em aminoácidos desejados.
[335] Outro meio de aumentar o número de moléculas de carboidratos sobre a proteína de ligação do antígeno é por acoplamento químico ou enzimático de glicosídeos para a proteína. Estes procedimentos são vantajosos na medida em que não requerem a produção da proteína em uma célula hospedeira que tenha capacidades de glicosilação para a glicosilação ligada a N- e O-. Dependendo do modo de acoplamento utilizado, o(s) açúcar(es) podem ser ligados a (a) arginina e histidina, (b) grupos carboxila livre, (c) grupos sulfidrila livre, como os de cisteína, (d) grupos hidroxila livres, tais como os da serina, treonina, ou hidroxiprolina, (e) resíduos aromáticos como os de fenilalanina, tirosina ou triptofano, ou (f) o grupo amida da glutamina. Esses métodos são descritos no WO 87/05330 publicado em 11 de setembro de 1987, e em Aplin e Wriston, 1981, CRC Crit. Rev, Biochem., pp. 259-306.
[336] A remoção de frações de carboidratos presentes na proteína de ligação do antígeno de partida pode ser realizada quimicamente ou enzimaticamente. A deglicosilação química exige a exposição da proteína para o ácido trifluormetanosulfônico composto, ou um composto equivalente. Este tratamento resulta na clivagem da maioria ou todos os açúcares, exceto pelo fato de que o açúcar de ligação (N-acetilglicosamina ou N-acetilgalactosamina), deixando intacto o polipeptídeo. A deglicosilação química é descrita por Hakimuddin et al., 1987, Arch. Biochem. Biophys. 259:52 e por Edge et al. , 1981, Anal. Biochem. 118:131. A clivagem enzimática das frações de carboidratos em polipeptídeos pode ser alcançada através da utilização de uma variedade de endo- e exo-glicosidases, como descrito por Thotakura et al., 1987, Meth. Enzymol. 138:350. A glicosilação em sítios de glicosilação potenciais pode ser evitada pelo uso do composto tunicamicina como descrito por Duskin et al., 1982, J. Biol. Chem. 257:3105. A tunicamicina bloqueia a formação das ligações da proteína-N-glicosídeo.
[337] Assim, os aspectos incluem as variantes de glicosilação das proteínas de ligação do antígeno em que o número e/ou o tipo de sítio(s) de glicosilação foi alterado em comparação com as sequências de aminoácidos do polipeptídeo principal. Em certas modalidades, as variantes de proteína de anticorpo compreendem um maior ou menor número de sites de glicosilação ligados a N do que o anticorpo nativo. Um sítio de glicosilação ligado a N- é caracterizado pela sequência: Asn-X-Ser ou Asn-X-Thr, onde o resíduo de aminoácido designado como X pode ser qualquer resíduo de aminoácido, exceto prolina. A substituição dos resíduos de aminoácidos para criar esta sequência fornece um novo sítio potencial para a adição de uma cadeia de carboidrato ligada a N-. Alternativamente, as substituições que eliminam ou alteram esta sequência impedirão a adição de uma cadeia de carboidratos ligada a N- presente no polipeptídeo nativo. Por exemplo, a glicosilação pode ser reduzida pela deleção de um Asn ou pela substituição do Asn com um aminoácido diferente. Em outras modalidades, um ou mais novos sítios ligados a N- são criados. Anticorpos normalmente têm um sítio de glicosilação ligado a N- na região Fc. Marcações e Grupos Efetores
[338] Em algumas modalidades, a ligação do antígeno compreende um ou mais marcações. O termo "grupo de marcação" ou "marcação" significa qualquer marcação detectável. Exemplos de grupos de marcação adequados incluem, mas não estão limitados ao seguinte: radioisótopos ou radionuclídeos ((por exemplo, 3H, 14C, 15N, 35S, 90Y, 99Tc, 111In, 125I, 131I)), grupos fluorescentes ((por exemplo, FITC, rodamina, fosfóros de lantanídeos), grupos enzimáticos ((por exemplo, peroxidase de raiz forte, β-galactosidase, luciferase, fosfatase alcalina)), grupos de quimioluminescência, grupos biotinila, ou epítopos de polipeptídeo pré-determinados reconhecidos por um repórter secundário (por exemplo, sequências de par de zíper de leucina, sítios de ligação para anticorpos secundários, domínios de ligação de metal, tags de epítopo). Em algumas modalidades, o grupo de marcação é acoplado à proteína de ligação do antígeno através de braços espaçadores de vários comprimentos para reduzir o impedimento estérico potencial. Vários métodos para marcar proteínas são conhecidos na técnica e podem ser usados como parecerem melhor.
[339] O termo "grupo efetor" significa qualquer grupo acoplado a uma proteína de ligação a antígeno que atua como um agente citotóxico. Exemplos de grupos efetores adequados são radioisótopos ou radionuclídeos ((ex., 3H, 14C, 15N, 35S, 90Y, 99Tc, 111In, 125I, 131I).. Outros grupos apropriados incluem toxinas, grupos terapêuticos ou grupos quimioterapêuticos. Exemplos de grupos adequados incluem caliqueamicina, auristatinas, geldanamicina e maitansina. Em algumas modalidades, o grupo efetor é acoplado à proteína de ligação do antígeno através de braços espaçadores de vários comprimentos para reduzir o impedimento estérico potencial.
[340] Em geral, as marcações caem em uma variedade de classes, dependendo do ensaio no qual devem ser detectados: a) tags isotópicos, que podem ser isótopos radioativos ou pesados; b) marcações magnéticas (por exemplo, partículas magnéticas); c) frações ativas redox; d) corantes óticos; grupos enzimática (por exemplo, peroxidase, β-galactosidase, luciferase, fosfatase alcalina); e) grupos biotinilados, e f) epítopos de polipeptídeo pré-determinados reconhecidos por um repórter secundário (por exemplo, sequências de par de zíper de leucina, sítios de ligação para anticorpos secundários, domínios de ligação de metal, tags de epítopo, etc.). Em algumas modalidades, o grupo de marcação é acoplado à proteína de ligação do antígeno através de braços espaçadores de vários comprimentos para reduzir o impedimento estérico potencial. Vários métodos para marcar as proteínas são conhecidos na técnica.
[341] Marcações específicas incluem corantes ópticos, incluindo, mas não se limitando a, cromóforos, fósforos e fluoróforos, com o último sendo específico em muitos casos. Os fluoróforos podem ser ou flúores de "pequena molécula" ou flúores proteináceos.
[342] Por "marcação fluorescente" compreende-se qualquer molécula que pode ser detectada através de suas propriedades fluorescentes inerentes. Marcações fluorescentes adequadas incluem, mas não estão limitados a, fluoresceína, rodamina, tetrametilrodamina, eosina, eritrosina, cumarina, metil-cumarinas, pireno, verde malaquita, estilbeno, Amarelo Lúcifer, Azul Cascata, Vermelho Texas, IAEDANS, EDANS, FL BODIPY, LC Red 640, Cy 5, Cy 5.5, Red LC 705, Oregon verde, tinturas de Alexa Fluor (Alexa Fluor 350, Alexa Fluor 430, Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 546, Alexa Fluor 568, Alexa Fluor 594, Alexa Fluor 633 , Alexa Fluor 647, Alexa Fluor 660, Alexa Fluor 680), Azul Cascata, Amarelo Cascata e R-ficoeritrina (PE) (Molecular Probes, Eugene, OR), FITC, rodamina e vermelho Texas (Pierce, Rockford, IL), Cy5, Cy5.5, Cy7 (Amersham Life Science, Pittsburgh, PA). Corantes óticos adequado, incluindo fluoróforos, são descritos em MOLECULAR PROBES HANDBOOK por Richard P. Haugland, expressamente incorporado aqui a título de referência.
[343] Marcações fluorescentes de proteináceos adequadas também incluem, mas não estão limitadas a, proteína verde fluorescente, incluindo uma espécie Renilla, Ptilosarcus, ou Aequorea de GFP (Chalfie et al., 1994, Science 263:802-805), EGFP (Clontech Labs., Inc., Genbank Accession Number U55762), proteína fluorescente azul (BFP, Quantum Biotechnologies, Inc., Quebec, Canadá; Stauber, 1998, Biotechniques 24:462-471; Heim et al. , 1996, Curr. Biol. 6:178-182), proteína fluorescente amarela intensificada (EYFP, Clontech Labs., Inc.), luciferase (Ichiki et al. , 1993, J. Immunol. 150:5408-5417), β galactosidase (Nolan et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:2603-2607) e Renilla (WO92/15673, WO95/07463, WO98/14605, WO98/26277, WO99/49019, Patentes dos Estados Unidos No. 5292658, No. 5418155, No. 5683888, No. 5741668, No. 5777079, No. 5804387, No. 5874304, No. 5876995, No. 5925558). Sequências de Ácido Nucleico Codificando as Proteínas de ligação a antígeno
[344] Os ácidos nucleicos que codificam para as proteínas de ligação a antígeno aqui descritas, ou porções deles, também são fornecidos, incluindo os ácidos nucléicos codificando uma ou ambas as cadeias de um anticorpo, ou um fragmento, derivados, muteína, ou sua variante, polinucleotídeos codificando regiões variáveis de cadeia pesada ou CDRs somente, polinucleotídeos suficiente para uso como sondas de hibridização, iniciadores PCR ou iniciadores de sequenciamento para identificar, analisar, mutar ou amplificar um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo, ácidos nucléicos anti-sense para inibir a expressão de um polinucleotídeo, e as sequências complementares do exposto. Os ácidos nucléicos podem ser de qualquer tamanho. Eles podem ser, por exemplo, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 750, 1.000, 1.500 ou mais nucleotídeos de comprimento, e/ou podem compreender uma ou mais sequências adicionais, por exemplo, sequências reguladoras, e/ou ser parte de um ácido nucléico maior, por exemplo, um vetor. Os ácidos nucléicos podem ser de cadeia única ou de cadeia dupla e podem incluir nucleotídeos de RNA e/ou DNA, e variantes artificiais do mesmo (por exemplo, ácidos nucléicos de peptídeos).
[345] A Tabela 7 mostra sequências de ácidos nucleicos exemplares codificando uma região constante de cadeia pesada IgG2, uma região constante de cadeia leve kappa e uma região constante de cadeia leve HCL-1 lambda. Qualquer região variável fornecida aqui pode ser associada a essas regiões constantes para formar sequências de cadeia pesada e leve completas. No entanto, deve ser entendido que essas sequências de regiões constantes são fornecidas como exemplos específicos somente - uma pessoa versada na técnica pode utilizar outras regiões constantes, incluindo a região constante de cadeia pesada IgG1, regiões constantes de cadeia pesada IgG3 ou IgG4, qualquer uma das sete regiões constantes de leve lambda, incluindo hCL-1, hCl-2, hCL-3 e hCl-7; regiões constantes que foram modificadas para melhorar a estabilidade, expressão, capacidade de fabricação ou outras características desejadas, e assim por diante. Em algumas modalidades, as sequências de região variável são unidas a outras sequências de região constante que são conhecidas na técnica. Sequências de ácidos nucleicos exemplares codificando as regiões variáveis de cadeia leve e pesada são fornecidas na Tabela 8. Tabela 7: Sequências de Ácidos Nucleicos de Região Constante de Cadeia Leve e Pesada Exemplares
Figure img0029
Figure img0030
[346] A Tabela 8 mostra as sequências de ácidos nucleicos exemplares codificando as regiões variáveis de cadeia pesada e cadeia leve, na quais vários CDRL1, CDRL2 e CDRL3, ou CDRH1, CDRH2 e CDRH3, as sequências são incorporadas. Tabela 8: Sequências de Ácidos Nucleicos de Região Variável de Cadeia Leve e Pesada Exemplares
Figure img0031
Figure img0032
Figure img0033
Figure img0034
Figure img0035
Figure img0036
Figure img0037
Figure img0038
Figure img0039
Figure img0040
Figure img0041
Figure img0042
Figure img0043
[347] A Tabela 9 mostra os SEQ ID NOs de sequências de ácidos nucleicos exemplares codificando as cadeias pesadas e leves, bem como as regiões variáveis de cadeia leve e pesada, de proteínas de ligação a antígeno exemplares, especificamente, proteínas de ligação a hCGRP R, divulgados neste documento. Tabela 9 - SEQ ID NOs da Sequência de Ácido Nucléico de VH e VL HC, LC Exemplares
Figure img0044
Figure img0045
[348] Os ácidos nucleicos que codificam certas proteínas de ligação a antígeno, ou porções delas (por exemplo, anticorpos de comprimento total, de cadeia pesada ou leve, de domínio variável, ou CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2, ou CDRL3) podem ser isoladas a partir de células B de ratos que foram imunizados com CGRP R ou componentes imunogênicos deste, por exemplo, através da imunização com CGRP R de comprimento total (compreendendo tanto CRLR e RAMP1), com o domínio extracelular de CGRP R (compreendendo domínios extracelulares de CRLR e RAMP1), com células inteiras expressando CGRP R, com as membranas preparadas a partir das células que expressam CGRP R, com proteínas de fusão, por exemplo, fusões Fc, compreendendo CRLR, RAMP1 (ou domínios extracelulares do mesmo) fundido a Fc, e outros métodos conhecidos na técnica, por exemplo, como descrito nos Exemplos 1 a 3 do presente documento. O ácido nucléico pode ser isolado através de procedimentos convencionais, tais como reação em cadeia de polimerase (PCR). A apresentação por fago é outro exemplo de uma técnica conhecida pela qual os derivados de anticorpos e outras proteínas de ligação a antígeno podem ser preparados. Em uma abordagem, os polipeptídeos que são componentes de uma proteína de ligação a antígeno de interesse são expressos em qualquer sistema de expressão recombinante adequado, e os polipeptídeos expressos estão autorizados a se reunir para formar moléculas de proteína de ligação a antígeno.
[349] Os ácidos nucléicos fornecidos nas Tabelas 7 a 9 são exemplares apenas. Devido à degeneração do código genético, cada uma das sequências polipeptídicas listadas nas Tabelas 2 a 5 ou de outra forma aqui descritas são também codificadas por um grande número de outras sequências de ácido nucléico além das fornecidas. Uma pessoa versada na técnica apreciará que o presente pedido, portanto, fornece uma descrição escrita adequada e capacitação para cada sequência de nucleotídeos degenerada codificando cada proteína de ligação a antígeno.
[350] Um aspecto adicional fornece ácidos nucleicos que hibridizam para outros ácidos nucléicos (por exemplo, ácidos nucléicos compreendendo uma sequência de nucleotídeo listada na Tabela 7, Tabela 8, Tabela 9 e/ou SEQ ID NOs :224 a 258) sob condições de hibridização particulares. Métodos de hibridização de ácidos nucléicos são bem conhecidos na técnica. Ver, ex., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6. Como aqui definido, uma condição de hibridação moderadamente rigorosa utiliza uma solução de pré-lavagem contendo 5x cloreto de sódio/citrato de sódio (SSC), 0,5% SDS, 1,0 mM EDTA (pH 8,0), tampão de hibridação de cerca de 50% formamida, 6x SSC, e uma temperatura de hibridação de 55°C (ou outras soluções de hibridação semelhantes, como uma contendo cerca de 50% de formamida, com uma temperatura de hibridização de 42°C), e condições de lavagem de 60°C, em 0,5x SSC, 0,1% SDS. A condição de hibridação rigorosa hibridiza em 6x SSC a 45°C, seguido por uma ou mais lavagens em 0,1 x SSC, 0,2% SDS a 68°C. Além disso, uma pessoa versada na técnica pode manipular as condições de hibridação e/ou lavagem para aumentar ou diminuir o rigor da hibridação de tal forma que os ácidos nucléicos compreendendo as sequências de nucleotídeos que são pelo menos 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% ou 99% idênticas umas às outras geralmente permanecem hibridizada umas às outras.
[351] Os parâmetros básicos que afetam a escolha das condições de hibridização e orientação para a elaboração de condições adequadas estão definidos, por exemplo, Sambrook, Fritsch e Maniatis (2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., supra; e Current Protocols in Molecular Biology, 1995, Ausubel et al., eds., John Wiley & Sons, Inc., sections 2.10 e 6.3-6.4), e podem ser prontamente determinados por aqueles versados na técnica com base em, ex., comprimento e/ou composição da base do ácido nucléico.
[352] As mudanças podem ser introduzidas pela mutação em um ácido nucléico, levando a alterações na sequência de aminoácidos de um polipeptídeo (por exemplo, um anticorpo ou derivado de anticorpos) que ele codifica. As mutações podem ser introduzidas utilizando qualquer técnica conhecida na técnica. Em uma modalidade, um ou vários resíduos de aminoácidos são alteradas usando, por exemplo, um protocolo de mutagênese direcionado para sítio. Em outra modalidade, um ou mais resíduos aleatoriamente selecionados são alterados usando, por exemplo, um protocolo de mutagênese aleatório. No entanto, é feito, um polipeptídeo mutante que pode ser expresso e selecionado para uma propriedade desejada.
[353] As mutações podem ser introduzidas em um ácido nucléico sem alterar significativamente a atividade biológica de um polipeptídeo que ele codifica. Por exemplo, uma pessoa pode fazer substituições de nucleotídeos levando a substituições de aminoácidos em resíduos de aminoácidos não essenciais. Alternativamente, uma ou mais mutações podem ser introduzidas em um ácido nucléico que seletivamente muda a atividade biológica de um polipeptídeo que ele codifica. Por exemplo, a mutação pode quantitativa ou qualitativamente mudar a atividade biológica. Exemplos de mudanças quantitativas incluem o aumento, redução ou eliminação da atividade. Exemplos de mudanças qualitativas incluem alteração da especificidade do antígeno de um anticorpo. Em uma modalidade, um ácido nucléico codificando qualquer proteína de ligação a antígeno descrito aqui pode ser modificado para alterar a sequência de aminoácidos utilizando técnicas de biologia molecular que estão bem estabelecidas na técnica.
[354] Outro aspecto fornece moléculas de ácido nucléico que são adequadas para uso como iniciadores ou sondas de hibridização para a detecção da sequência de ácidos nucleicos. Uma molécula de ácido nucléico pode incluir apenas uma porção de uma sequência de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo de comprimento completo, por exemplo, um fragmento que pode ser usado como uma sonda ou iniciador ou um fragmento que codifica uma porção ativa (por exemplo, uma porção de ligação CGRP R) de um polipeptídeo.
[355] As sondas com base na sequência de um ácido nucléico podem ser usadas para detectar o ácido nucléico ou ácidos nucléicos similares, por exemplo, transcritos codificando um polipeptídeo. A sonda pode incluir um grupo de marcação, por exemplo, um radioisótopo, um composto fluorescente, uma enzima, ou um cofator de enzima. Tais sondas podem ser usadas para identificar uma célula que expressa o polipeptídeo.
[356] Outro aspecto fornece vetores compreendendo um ácido nucléico codificando um polipeptídeo ou uma porção dele (por exemplo, um fragmento contendo uma ou mais CDRs ou um ou mais domínios de região variável). Exemplos de vetores incluem, mas não estão limitados a, plasmídeos, vetores virais, vetores de mamíferos não epissomais e vetores de expressão, por exemplo, vetores de expressão recombinante. Os vetores de expressão recombinante podem incluir um ácido nucléico em uma forma adequada para a expressão do ácido nucléico em uma célula hospedeira. Os vetores de expressão recombinante incluem uma ou mais sequências reguladoras selecionadas com base nas células hospedeiras a serem utilizadas para expressão, que são operavelmente ligadas à sequência de ácido nucleico a ser expressa. As sequências reguladoras incluem aquelas que direcionam a expressão constitutiva de uma sequência de nucleotídeos em muitos tipos de células hospedeiras (por exemplo, intensificador de gene precoce SV40, promotor de vírus Rous sarcoma e promotor de citomegalovírus), aqueles que direcionam a expressão da sequência de nucleotídeos apenas em certas células hospedeiras (por exemplo, sequências reguladoras de tecidos- específicos, ver, Voss et al., 1986, Trends Biochem. Sci. 11:287, Maniatis et al., 1987, Science 236:1237, incorporados por referência em suas totalidades), e aqueles que direcionam a expressão induzível de uma sequência de nucleotídeos em resposta a determinado tratamento ou condição (por exemplo, o promotor de metalotionina em células de mamíferos e o promotor tet-responsivo e/ou responsivo a estreptomicina em ambos os sistemas procarióticos e eucarióticos ((see, id.). Será apreciado por aqueles versados na técnica que o projeto do vetor de expressão pode depender de fatores como a escolha da célula hospedeira a ser transformada, o nível de expressão da proteína desejada, etc. Os vetores de expressão podem ser introduzidos em células hospedeiras para assim produzir proteínas ou peptídeos, incluindo as proteínas ou peptídeos de fusão, codificados por ácidos nucléicos como aqui descritos.
[357] Outro aspecto fornece células hospedeiras nas quais foi introduzido um vetor de expressão recombinante. Uma célula hospedeira pode ser quaisquer células procarióticas (por exemplo, E. coli) ou célula eucariótica (por exemplo, células de levedura, inseto ou de mamíferos (por exemplo, células de CHO)). O DNA do vetor pode ser introduzido em células procarióticas ou eucarióticas através da transformação convencional ou técnicas de transfecção. Para a transfecção estável de células de mamíferos, sabe-se que, dependendo do vetor de expressão e técnica de transfecção usada, apenas uma pequena fração das células pode integrar o DNA estranho em seu genoma. A fim de identificar e selecionar esses integrantes, um gene que codifica um marcador selecionável (por exemplo, para a resistência a antibióticos) é geralmente introduzido na célula hospedeira juntamente com o gene de interesse. Marcadores selecionáveis preferidos incluem aqueles que conferem resistência a fármacos, como G418, higromicina e metotrexato. As células estavelmente transfectadas com o ácido nucléico introduzido podem ser identificadas através da seleção de medicamento (por exemplo, células que incorporaram o gene marcador selecionável irão sobreviver, enquanto as outras células morrem), entre outros métodos. Preparação de Proteínas de ligação a antígeno
[358] Anticorpos não humanos que são fornecidos podem ser, por exemplo, provenientes de qualquer animal produtor de anticorpos, como camundongo, rato, coelho, cabra, burro, ou primatas não humanos (como o macaco (por exemplo, macaco cinomolgo ou resus) ou gorila (por exemplo, o chimpanzé)). Anticorpos não humanos podem ser usados, por exemplo, na cultura de células in vitro e aplicações baseadas em cultura de células, ou qualquer outra aplicação onde uma resposta imune ao anticorpo não ocorra ou seja insignificante, pode ser prevenida, não é uma preocupação, ou é desejada. Em certas modalidades, os anticorpos podem ser produzidos através da imunização dos animais usando métodos conhecidos na técnica, como o descrito acima e/ou nos Exemplos 1 a 3 abaixo. Os exemplos descrevem a geração de anticorpos anti CGRP R usando três diferentes preparações de imunogene - (i) células inteiras expressando versões de comprimento completo de dois componentes principais do CGRP R - RAMP1 e CRLR; (ii) extratos da membrana de tais células, e (iii) CGRP R solúvel obtido pela coexpressão e purificação dos domínios extracelulares N-terminais de CRLR e RAMP1. Os anticorpos podem ser policlonais, monoclonais, ou podem ser sintetizados em células hospedeiras pela expressão do DNA recombinante. Os anticorpos completamente humanos podem ser preparados como descrito acima pela imunização dos animais transgênicos contendo locais de imunoglobulina humana ou pela seleção de uma biblioteca de apresentação de fago que está expressando um repertório de anticorpos humanos.
[359] Os anticorpos monoclonais (mAbs) podem ser produzidos por uma variedade de técnicas, incluindo a metodologia de anticorpo monoclonal convencional, por exemplo, a técnica de hibridação de célula somática padrão de Kohler e Milstein, 1975, Nature 256:495. Alternativamente, outras técnicas para a produção de anticorpos monoclonais podem ser empregadas, por exemplo, a transformação viral ou oncogênica de B-linfócitos. Um sistema animal adequado para a preparação de hibridomas é o sistema de murino, que é um procedimento muito bem estabelecido. Os protocolos de imunização e técnicas para o isolamento dos esplenócitos imunizados para a fusão são conhecidos na técnica e abordagens ilustrativas são descritas nos exemplos abaixo. Para tais procedimentos, as células B dos camundongos imunizados são tipicamente fundidas com um parceiro de fusão imortalizado adequado, como uma linhagem celular de mieloma de murino. Se desejado, ratos e outros mamíferos podem ser imunizados em vez de ratos e as células B de tais animais podem ser fundidas com a linhagem celular de mieloma de murino para formar hibridomas. Alternativamente, uma linhagem celular de mieloma de uma fonte que não o camundongo pode ser usada. Procedimentos de fusão para fazer os hibridomas também são bem conhecidos.
[360] Os anticorpos de cadeia única que são fornecidos podem ser formados pela ligação dos fragmentos de domínio variável de cadeia pesada e leve (região Fv) através de uma ponte de aminoácido (ligante de peptídeo curto), resultando em uma única cadeia polipeptídica. Tais Fvs de cadeia única (scFvs) podem ser preparadas pela fusão do DNA que codifica um ligante de peptídeo entre os DNAs codificando os dois polipeptídeos de domínio variável (VL e VH). Os polipeptídeos resultantes podem dobrar sobre si mesmos para formar os monômeros de ligação de antígeno, ou eles podem formar multímeros (por exemplo, dímeros, trímeros ou tetrâmeros), dependendo do comprimento de um ligante flexível entre os dois domínios variáveis (Kortt et al., 1997, Prot. Eng. 10:423; Kortt et al., 2001, Biomol. Eng. 18:95-108). Ao combinar diferentes polipeptídeos compreendendo VL e VH, pode-se formar scFvs multiméricos que se ligam a diferentes epítopos (Kriangkum et al. , 2001, Biomol. Eng. 18:31-40). Técnicas desenvolvidas para a produção de anticorpos de cadeia única incluem aquelas descritas nas Pat. US. No. 4.946.778; Bird, 1988, Science 242:423; Huston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:5879; Ward et al., 1989, Nature 334:544, de Graaf et al. , 2002, Methods Mol Biol. 178:379-387. Os anticorpos de cadeia única derivados de anticorpos fornecidos neste documento incluem, mas não estão limitados a scFvs compreendendo as combinações de domínio variável das regiões variáveis de cadeia pesada e leve retratadas na Tabela 3, ou combinações de domínios variáveis de cadeia leve e pesada que incluem CDRs descritos nas Tabelas 4A e 4B.
[361] Os anticorpos fornecidos aqui que são de uma subclasse podem ser alterados para anticorpos de uma subclasse diferente utilizando métodos de comutação de subclasse. Assim, os anticorpos IgG podem ser derivados de um anticorpo IgM, por exemplo e vice versa. Tais técnicas permitem que a preparação de novos anticorpos que possuem as propriedades de ligação de antígeno de um anticorpo determinado (o anticorpo principal), mas também apresentam propriedades biológicas associadas com um isotipo ou subclasse de anticorpo diferente daqueles do anticorpo principal. Técnicas de DNA recombinante podem ser empregadas. O DNA clonado codificando polipeptídeos de anticorpo específicos pode ser empregado em tais procedimentos, por exemplo, DNA que codifica o domínio constante de um anticorpo do isotipo desejado. Ver, por exemplo, Lantto et al., 2002, Methods Mol Biol. 178:303-316.
[362] Assim, os anticorpos que são fornecidos incluem os que constituem, por exemplo, as combinações de domínio variável descritas, supra, tendo um isotipo desejado (por exemplo, IgA, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgE e IgD) assim como bem como fragmentos de Fab ou F(ab ')2 dos mesmos. Além disso, se uma IgG4 é desejada, também pode ser desejado introduzir uma mutação pontual (CPSCP -> CPPCP) na região da dobradiça, conforme descrito em Bloom et al., 1997, Protein Science 6:407, incorporado por referência neste documento) para aliviar uma tendência a formar ligações de dissulfeto intra-H cadeia que podem levar a heterogeneidade nos anticorpos IgG4.
[363] Além disso, técnicas para derivar os anticorpos tendo propriedades diferentes (isto é, afinidades variáveis para o antígeno ao qual eles se ligam) também são conhecidas. Uma dessas técnicas, denominada como embaralhamento de cadeia, envolve exibir epertórios de gene de domínio variável de imunoglobulina na superfície do bacteriófago filamentoso, muitas vezes referido como exibição de fago. O embaralhamento de cadeia tem sido usada para preparar os anticorpos de alta afinidade para hapteno 2-feniloxazol-5-ona, como descrito por Marks et al., 1992, BioTechnology 10:779.
[364] Modificações conservativas podem ser feitas para as regiões variáveis de cadeia pesada e leve descritas na Tabela 3, ou as CDRs descritas nas Tabelas 4A e 4B (e modificações correspondentes aos ácidos nucléicos de codificação) para produzir uma proteína de ligação de CGRP R com certas características funcionais e bioquímicas desejáveis. Métodos para alcançar essas modificações são descritos acima.
[365] As proteínas de ligação a antígeno de CGRP podem ser ainda modificadas de várias maneiras. Por exemplo, se elas devem ser utilizadas para fins terapêuticos, elas podem ser conjugadas com polietilenoglicol (peguilado) para prolongar a meia-vida sérica ou para melhorar a distribuição de proteína. Alternativamente, a região V dos anticorpos do indivíduo ou fragmentos dos mesmos pode ser fundida com a região Fc de uma molécula de anticorpo diferente. A região Fc usada para essa finalidade pode ser modificada para que não ligue o complemento, reduzindo assim a probabilidade de induzir a lise celular no paciente quando a proteína de fusão é usada como agente terapêutico. Além disso, os anticorpos do indivíduo ou fragmentos funcionais dos mesmos poderão ser conjugados com albumina de soro humana para aumentar a meia- vida sérica do anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno dos mesmos. Outro parceiro de fusão útil para as proteínas de ligação a antígeno ou fragmentos dos mesmos é a transtirretina (TTR). A TTR tem a capacidade de formar um tetrâmero, portanto, uma proteína de fusão de anticorpo TTR pode formar um anticorpo multivalente que pode aumentar a sua avidez de ligação.
[366] Alternativamente, alterações substanciais nas características funcionais e/ou bioquímicas das proteínas de ligação a antígeno descritas aqui podem ser alcançadas através da criação de substituições na sequência de aminoácidos das cadeias pesadas e leves que diferem significativamente em seus efeitos sobre a manutenção (a) da estrutura da estrutura principal molecular na área da substituição, por exemplo, como uma conformação em folha ou helicoidal, (b) da carga ou hidrofobicidade da molécula no sítio alvo, ou (c) da grossura da cadeia lateral. Uma "substituição de aminoácido conservativa" pode envolver uma substituição de um resíduo de aminoácido nativo com um resíduo não-nativo que tem pouco ou nenhum efeito sobre a polaridade ou carga do resíduo de aminoácido nessa posição. Ver, Tabela 4, acima. Além disso, qualquer resíduo nativo no polipeptídeo também pode ser substituído por alanina, como foi descrito anteriormente para a mutagênese de varredura de alanina.
[367] As substituições de aminoácidos (seja conservativa ou não conservativa) dos anticorpos do indivíduo podem ser implementadas por aqueles versados na técnica através da aplicação de técnicas de rotina. As substituições de aminoácidos podem ser usadas para identificar resíduos importantes dos anticorpos fornecidos aqui, ou para aumentar ou diminuir a afinidade destes anticorpos para CGRP R humanos ou para modificar a afinidade de ligação de outras proteínas de ligação a antígeno descritas aqui. Métodos de Expressão de Proteínas de ligação a antígeno
[368] Os sistemas de expressão e construtos na forma de plasmídeos, vetores de expressão, transcrição ou cassetes de expressão que compõem pelo menos um polinucleotídeo como descrito acima também são fornecidas aqui, bem como células hospedeiras compreendendo tais sistemas de expressão ou construtos.
[369] As proteínas de ligação a antígeno fornecidas aqui podem ser preparadas por qualquer uma de uma série de técnicas convencionais. Por exemplo, as proteínas de ligação a antígeno CGRP R podem ser produzidas por sistemas de expressão recombinantes, utilizando qualquer técnica conhecida na técnica. Ver, ex., Monoclonal Antibodies, Hybridomas: A New Dimension in Biological Analyses, Kennet et al. (eds.) Plenum Press, New York (1980); e Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow and Lane (eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1988).
[370] As proteínas de ligação a antígeno podem ser expressas em linhagens celulares de hibridoma (por exemplo, em especial anticorpos podem ser expressos em hibridomas) ou em linhagens celulares que não hibridomas. Os construtos de expressão codificando os anticorpos podem ser usados para transformar uma célula hospedeira de mamíferos, inseto ou microbiana. A transformação pode ser realizada usando qualquer método conhecido para a introdução de polinucleotídeos em uma célula hospedeira, incluindo, por exemplo, a embalagem do polinucleotídeo em um vírus ou bacteriófago e transdução de uma célula hospedeira com o construto por procedimentos de transfecção conhecidos na técnica, como exemplificado pela Patente dos Estados Unidos n° 4.399.216; No. 4.912.040; No. 4.740.461; No. 4.959.455. O procedimento de transformação ótimo utilizado vai depender de que tipo de célula hospedeira está sendo transformada. Métodos para a introdução de polinucleotídeos heterólogos em células de mamíferos são bem conhecidos na técnica e incluem, mas não estão limitados a, transfecção mediada por dextrana, precipitação de fosfato de cálcio, transfecção mediada por polibreno, fusão de protoplastos, eletroporação, encapsulação do polinucleotídeo(s) em lipossomas, mistura do ácido nucléico com lipídeos com carga positiva, e microinjeção direta do DNA em núcleos.
[371] Os construtos de expressão recombinante geralmente compreendem uma molécula de ácido nucléico codificando um polipeptídeo compreendendo um ou mais dos seguintes: uma ou mais CDRs contidas aqui, uma região constante de cadeia leve; uma região variável de cadeia leve; uma região constante de cadeia pesada ((ex., CH1, CH2 e/ou CH3), e/ou outra porção de estrutura de uma proteína de ligação a antígeno CGRP R. Estas sequências de ácido nucleico são inseridas em um vetor de expressão adequado utilizando técnicas de ligação padrão. Em uma modalidade, a região constante de cadeia pesada ou leve é anexada ao C-terminal da região variável de cadeia pesada ou leve específica anti- CGRP R e é ligada em um vetor de expressão. O vetor é tipicamente selecionado para ser funcional na célula hospedeira particular empregada (ou seja, o vetor é compatível com o maquinário celular do hospedeiro, permitindo que a ampliação e/ou expressão do gene possa ocorrer). Em algumas modalidades, os vetores são usados que empregam ensaios de complementação de fragmento de proteína usando repórteres de proteína, como diidrofolato redutase (ver, por exemplo, Pat. US. No. 6.270.964, que é aqui incorporada por referência). Vetores de expressão adequados podem ser comprados, por exemplo, da Invitrogen Life Technologies ou BD Biosciences (anteriormente "Clontech"). Outros vetores úteis para clonagem e expressão dos anticorpos e fragmentos incluem aqueles descritos em Bianchi and McGrew, 2003, Biotech. Biotechnol. Bioeng. 84:439-44, que é aqui incorporado por referência. Vetores de expressão adicionais adequados são discutidas, por exemplo, em Methods Enzymol., vol. 185 (D. V. Goeddel, ed.), 1990, New York: Academic Press.
[372] Normalmente, os vetores de expressão usados em qualquer uma das células hospedeiras conterão sequências para a manutenção do plasmídeo e para a clonagem e expressão das sequências de nucleotídeos exógenas. Tais sequências, referidas coletivamente como "sequências de flanqueamento" em certas modalidades irão geralmente incluir uma ou mais das seguintes sequências de nucleotídeos: um promotor, uma ou mais sequências de intensificador, uma origem de replicação, uma sequência de terminação de transcrição, uma sequência de íntron completa contendo um sítio de junção doador e receptor, uma sequência codificando uma sequência líder para a secreção de polipeptídeos, um sítio de ligação de ribossomo, uma sequência de poliadenilação, uma região de poliligante para inserir o ácido nucléico que codifica o polipeptídio a ser expresso, e um elemento marcador selecionável. Cada uma dessas sequências é discutida abaixo.
[373] Opcionalmente, o vetor pode conter uma sequência de codificação de "tag", ou seja, uma molécula de oligonucleotídeo localizada na extremidade 5' ou 3' da sequência de codificação de proteína de ligação a CGRP R; a sequência de oligonucleotídeo codifica poliHis (como hexaHis) , ou outro "tag" como FLAG®, HA (vírus da influenza de hemaglutinina), ou myc, para o qual existem anticorpos comercialmente disponíveis. Este tag é normalmente fundida ao polipeptídeo mediante a expressão do polipeptídeo, e pode servir como um meio para a purificação de afinidade ou detecção da proteína de ligação de CGRP R a partir da célula hospedeira. A purificação de afinidade pode ser realizada, por exemplo, por cromatografia em coluna utilizando anticorpos contra o tag como uma matriz de afinidade. Opcionalmente, o tag pode, posteriormente, ser retirado da proteína de ligação R CGRP purificada por vários meios como o uso de certas peptidases para a clivagem.
[374] As sequências de flanqueamento podem ser homólogas (isto é, da mesma espécie e/ou cepa como a célula hospedeira), heterólogas (ou seja, de uma espécie diferente da espécie da célula hospedeira ou cepa), híbridas (ou seja, uma combinação de sequências de flanqueamento de mais de uma fonte), sintéticas ou nativas. Como tal, a fonte de uma sequência de flanqueamento pode ser qualquer organismo procariótico ou eucariótico, qualquer organismo vertebrado ou invertebrado, ou qualquer planta, desde que a sequência de flanqueamento seja funcional, e pode ser ativada pelo maquinário celular hospedeiro.
[375] Sequências de flanqueamento úteis nos vetores podem ser obtidas por qualquer um dos vários métodos conhecidos na técnica. Tipicamente, as sequências de flanqueamento úteis aqui terão sido previamente identificadas pelo mapeamento e/ou pela digestão de endonuclease de restrição e podem, portanto, ser isoladas da fonte de tecido apropriada usando as endonucleases de restrição apropriadas. Em alguns casos, a sequência de nucleotídeo completa de uma sequência de flanqueamento pode ser conhecida. Aqui, a sequência de acompanhamento pode ser sintetizada usando os métodos descritos aqui para a síntese de ácidos nucleicos ou clonagem.
[376] Se toda ou apenas uma porção da sequência de flanqueamento é conhecida, pode ser obtida usando a reação em cadeia de polimerase (PCR) e/ou pela triagem de uma biblioteca genômica com uma sonda adequada, como um oligonucleotídeo e/ou fragmento de sequência de flanqueamento da mesma ou de outra espécie. Onde a sequência de flanqueamento não é conhecida, um fragmento de DNA contendo uma sequência de flanqueamento pode ser isolado de um pedaço maior de DNA que podem conter, por exemplo, uma sequência de codificação ou mesmo outro gene ou genes. O isolamento pode ser obtido pela digestão da endonuclease de restrição para produzir o fragmento de DNA adequado seguido pelo isolamento utilizando a purificação em gel de agarose, cromatografia em coluna de Qiagen® (Chatsworth, CA), ou outros métodos conhecidos por uma pessoa versada na técnica. A seleção das enzimas adequadas para realizar este objetivo será facilmente perceptível para uma pessoa versada na técnica.
[377] Uma origem de replicação é tipicamente uma parte desses vetores de expressão procarióticos adquiridos comercialmente, e a origem auxilia na amplificação do vetor em uma célula hospedeira. Se o vetor de escolha não contém uma origem do sítio de replicação, pode ser quimicamente sintetizado com base em uma sequência conhecida, e ligado ao vetor. Por exemplo, a origem da replicação do plasmídeo pBR322 (New England Biolabs, Beverly, MA) é adequada para a maioria das bactérias gram-negativas e diversas origens virais (por exemplo, SV40, polioma, adenovírus, vírus da estomatite vesicular (VSV), ou papilomavírus, como HPV ou BPV) são úteis para vetores de clonagem em células de mamíferos. Geralmente, a origem do componente de replicação não é necessária para vetores de expressão de mamíferos (por exemplo, a origem de SV40 é muitas vezes usada apenas porque ela também contém o promotor do vírus precoce).
[378] A sequência de terminação de transcrição é geralmente localizada em 3' para a extremidade de uma região de codificação de polipeptídeo e serve para terminar a transcrição. Normalmente, uma sequência de terminação de transcrição em células procarióticas é um fragmento rico em G - C seguido por uma sequência poli-T. Enquanto a sequência é facilmente clonada a partir de uma biblioteca ou mesmo comprada comercialmente como parte de um vetor, ela também pode ser facilmente sintetizada através de métodos para a síntese de ácidos nucléicos tais como os aqui descritos.
[379] Um gene marcador selecionável codifica uma proteína necessária para a sobrevivência e crescimento de uma célula hospedeira cultivada em um meio de cultura seletivo. Genes marcadores de seleção típicos codificam as proteínas que (a) conferem resistência aos antibióticos ou outras toxinas, por exemplo, ampicilina, tetraciclina, canamicina para células hospedeiras procariótico; (b) complementam as deficiências auxotróficas da célula, ou (c) fornecem nutrientes essenciais não disponíveis a partir do meio complexo ou definido. Os marcadores selecionáveis específicos são o gene de resistência a canamicina, o gene de resistência a ampicilina, e o gene de resistência a tetraciclina. Vantajosamente, um gene de resistência a neomicina também pode ser usado para seleção tanto em células hospedeiras procarióticas quanto eucarióticas.
[380] Outros genes selecionáveis podem ser usados para amplificar o gene que será expresso. A amplificação é o processo em que os genes são necessários para a produção de uma proteína fundamental para o crescimento ou a sobrevivência da célula é reiterada em conjunto dentro dos cromossomos de gerações sucessivas de células recombinantes. Exemplos de marcadores selecionáveis adequados para células de mamíferos incluem diidrofolato redutase (DHFR) e genes da quinase timidina sem promotor. Transformantes de células de mamíferos são colocados sob pressão de seleção em que apenas os transformantes são exclusivamente adaptados para sobreviver em virtude do gene selecionável presente no vetor. A pressão de seleção é imposta pela cultura das células transformadas em condições em que a concentração do agente de seleção no meio é sucessivamente aumentada, levando à amplificação de ambos o gene selecionável e o DNA que codifica outro gene, como uma proteína de ligação a antígeno que se liga ao CGRP R. Como resultado, quantidades aumentadas de um polipeptídeo tal que uma proteína de ligação do antígeno seja sintetizada a partir do DNA amplificado.
[381] Um sítio de ligação de ribossomo é geralmente necessário para a iniciação da tradução do mRNA e é caracterizado por uma sequência de Shine-Dalgarno (procariontes) ou uma sequência de Kozak (eucariontes). O elemento é normalmente localizado em 3' para o promotor e 5' para a sequência de codificação do polipeptídeo a ser expresso.
[382] Em alguns casos, tais como onde a glicosilação é desejada em um sistema de expressão de célula hospedeira eucariótico, pode-se manipular as várias pré ou pró- sequências para melhorar a glicosilação ou rendimento. Por exemplo, pode-se alterar o sítio de clivagem da peptidase de um peptídeo de sinal particular, ou adicionar pró- sequências, que também podem afetar a glicosilação. O produto de proteína final pode ter, na posição -1 (relativa ao primeiro aminoácido da proteína madura), um ou mais aminoácidos adicionais incidentes para expressão, que podem não ter sido totalmente removidos. Por exemplo, o produto de proteína final pode ter um ou dois resíduos de aminoácidos encontrados no sítio de clivagem da peptidase, ligado ao amino-término. Alternativamente, o uso de alguns sítios de clivagem da enzima pode resultar em uma forma ligeiramente truncada do polipeptídeo desejado, se os cortes de enzimas em tal área dentro do polipeptídeo maduro.
[383] A expressão e clonagem normalmente conterá um promotor que é reconhecido pelo organismo hospedeiro e operavelmente ligado à molécula que codifica uma proteína de ligação a CGRP R. Os promotores são sequências não transcritas localizadas a montante (isto é, 5') para o códon de partida de um gene estrutural (geralmente dentro de cerca de 100 a 1000 bp) que a transcrição de controle do gene estrutural. Os promotores são convencionalmente agrupados em uma das duas classes: promotores induzíveis e promotores constitutivos. Os promotores induzíveis iniciam níveis aumentados de transcrição a partir do DNA sob seu controle em resposta a alguma mudança nas condições de cultura, como a presença ou ausência de um nutriente ou uma mudança na temperatura. Os promotores constitutivos, por outro lado, uniformemente transcrevem um gene ao qual estão operavelmente ligados, ou seja, com pouco ou nenhum controle sobre a expressão gênica. Um grande número de promotores reconhecidos por uma variedade de células hospedeiras potenciais são bem conhecidos. Um promotor adequado é operavelmente ligado ao DNA que codifica a cadeia pesada ou leve compreendendo uma proteína de ligação de CGRP R através da remoção do promotor do DNA da fonte pela digestão da enzima de restrição e inserção da sequência promotora desejada para o vetor.
[384] Promotores adequados para uso com leveduras hospedeiras também são bem conhecidos na técnica. Intensificadores de levedura são vantajosamente usados com promotores de levedura. Os promotores adequados para uso com células hospedeiras de mamíferos são bem conhecidos e incluem, mas não estão limitados a, aqueles obtidos a partir do genoma de vírus como o vírus polioma, vírus da bouba aviária, adenovírus (como Adenovirus 2), vírus do papiloma bovino, vírus do sarcoma aviário , citomegalovírus, retrovírus, vírus da hepatite-B, e Vírus Simian 40 (SV40). Outros promotores de mamíferos adequados incluem promotores heterólogos de mamíferos, por exemplo, promotores de choque térmico e o promotor de actina.
[385] Promotores adicionais que podem ser de interesse incluem, mas não estão limitados a: promotor precoce de SV40 (Benoist and Chambon, 1981, Nature 290:304-310); promotor de CMV (Thornsen et al., 1984, Proc. Natl. Acad. U.S.A. 81:659 663), o promotor contido na repetição do terminal longo 3' do vírus do sarcoma de Rous (Yamamoto et al., 1980, Cell 22:787-797); promotor da quinase timidina do herpes (Wagner et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:1444-1445); promotor e sequências reguladoras do gene de metalotionina (Prinster et al. , 1982, Nature 296:39-42); e promotores procarióticos, como o promotor da beta-lactamase (Villa- Kamaroff et al. , 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 75:37273731); ou o promotor tac (DeBoer et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80:21-25). Também de interesse são as seguintes regiões de controle transcricionais animais, que exibem especificidade de tecido e têm sido utilizadas em animais transgênicos: a região de controle do gene da elastase I que está ativo em células acinares pancreáticas (Swift et al., 1984, Cell 38:639-646; Ornitz et al., 1986, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50:399-409; MacDonald, 1987, Hepatology 7:425-515); a região de controle do gene da insulina que está ativa em células beta pancreáticas (Hanahan, 1985, Nature 315:115-122); a região de controle do gene da imunoglobulina que está ativo em células linfóides (Grosschedl et al. , 1984, Cell 00:647-658; Adames et al. , 1985, Nature 318:533-538; Alexander et al., 1987, Mol. Cell. Biol. 7:1436-1444);. a região de controle do vírus do tumor mamário de camundongo que está ativa no testículo, mama, células linfóides e mastócitos (Leder et al., 1986, Cell 00:485-495); a região de controle do gene da albumina que está ativa no fígado (Pinkert et al., 1987, Genes and Devel. 0:268-276), a região de controle do gene da alfa-feto- proteína que está ativa no fígado (Krumlauf et al., 1985, Mol. Cell. Biol. 5:1639-1648; Hammer et al. , 1987, Science 253:53-58); a região de controle do gene da alfa 1- antitripsina que está ativa no fígado (Kelsey et al., 1987, Genes and Devel. 1:161-171), a região de controle do gene beta-globina que está ativa em células mielóides (Mogram et al. , 1985, Nature 315:338-340; Kollias et al. , 1986, Cell 46:89-94); a região de controle do gene da proteína básica de mielina que está ativa em células de oligodendrócitos no cérebro (Readhead et al. , 1987, Cell 48:703-712); a região de controle do gene de cadeia-2 leve de miosina que está ativa no músculo esquelético (Sani, 1985, Nature 314:283286); e a região de controle do gene de hormônio liberador de gonadotrofinas que está ativa no hipotálamo (Mason et al., 1986, Science 234:1372-1378).
[386] Uma sequência intensificadora pode ser inserida no vetor para aumentar a transcrição do DNA codificando a cadeia leve ou cadeia pesada compreendendo uma proteína de ligação de CGRP R humana por eucariotos superiores. Intensificadores são elementos de ação cis do DNA, geralmente de cerca de 10-300 bp de comprimento, que atuam sobre o promotor para aumentar a transcrição. Intensificadores são relativamente independentes de orientação e posição, tendo sido encontrados em ambas as posições 5' e 3' para a unidade de transcrição. Várias sequências de intensificador disponíveis a partir de genes de mamíferos são conhecidas (por exemplo, globina, elastase, albumina, alfa-feto proteína e insulina). Tipicamente, no entanto, um intensificador de um vírus é utilizado. O intensificador SV40, o intensificador do promotor do citomegalovírus precoce, o intensificador de polioma e intensificadores de adenovírus conhecidos na técnica são elementos de intensificação exemplares para a ativação de promotores eucarióticos. Enquanto um intensificador pode ser posicionado no vetor ou 5' ou 3' para uma sequência de codificação, é normalmente localizado em um sítio 5' a partir do promotor. Uma sequência codificando uma sequência de sinal nativa ou heteróloga apropriada (sequência líder ou peptídeo de sinal) pode ser incorporada em um vetor de expressão, para promover a secreção extracelular do anticorpo. A escolha do peptídeo de sinal ou líder depende do tipo de células hospedeiras em que o anticorpo deve ser produzido, e uma sequência de sinal heteróloga pode substituir a sequência de sinal nativa. Exemplos de peptídeos de sinal que são funcionais em células hospedeiras de mamíferos incluem os seguintes: a sequência de sinal para interleucina 7 (IL-7) descrita na Patente US No. 4.965.195, a sequência de sinal do receptor da interleucina-2 descrita em Cosman et al.,1984, Nature 312:768; o peptídeo de sinal do receptor da interleucina-4 descrito na Patente EP No. 0367 566; peptídeo de sinal do receptor da interleucina-1 tipo I descrito na Patente US 4.968.607, o peptídeo de sinal do receptor da interleucina-1 tipo II descrito na Patente EP 460 0 846.
[387] Os vetores de expressão que são fornecidos podem ser construídos a partir de um vetor de partida, como um vetor disponível comercialmente. Tais vetores podem ou não conter todas as sequências de flanqueamento desejadas. Sempre que uma ou mais das sequências de flanqueamento aqui descritas não estiverem presentes no vetor, podem ser obtidas individualmente e ligadas ao vetor. Os métodos utilizados para a obtenção de cada uma das sequências de flanqueamento são bem conhecidos por uma pessoa versada na técnica.
[388] Após o vetor ter sido construído e uma molécula de ácido nucléico codificando uma cadeia leve, uma pesada corrente, ou uma cadeia leve e uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de ligação de antígeno CGRP R ter sido inserida no próprio sítio do vetor, o vetor preenchido poderá ser inserido em uma célula hospedeira apropriada para a amplificação e/ou expressão de polipeptídeos. A transformação de um vetor de expressão para uma proteína de ligação a antígeno em uma célula hospedeira selecionada pode ser obtida por métodos bem conhecidos, incluindo transfecção, infecção, coprecipitação de fosfato de cálcio, eletroporação, microinjeção, lipofecção, transfecção mediada por DEAE-dextrano, ou outras técnicas conhecidas. O método escolhido será em parte uma função do tipo de célula hospedeira a ser usada. Estes métodos e outros métodos adequados são bem conhecidos para a pessoa versada na técnica, e são expostos, por exemplo, em Sambrook et al., 2001, supra.
[389] Uma célula hospedeira, quando cultivada em condições adequadas, sintetiza uma proteína de ligação a antígeno que pode ser posteriormente coletada do meio de cultura (se a célula hospedeira a secreta para o meio) ou diretamente a partir da célula hospedeira que a produz (se não é secretada). A seleção de uma célula hospedeira apropriada dependerá de vários fatores, tais como níveis de expressão desejados, modificações de polipeptídeo que são desejáveis ou necessárias para a atividade (tais como glicosilação ou fosforilação) e facilidade de dobra em uma molécula biologicamente ativa.
[390] Linhagens celulares de mamíferos disponíveis como hospedeiras para a expressão são bem conhecidas na técnica e incluem, mas não estão limitadas a, linhagens celulares imortalizadas disponíveis a partir da American Type Culture Collection (ATCC), incluindo, mas não limitado a células do ovário de hamster chinês (CHO), células HeLa, células do rim de hamster filhote (BHK), células de rim de macaco (COS), células de carcinoma hepatocelulares humanas (por exemplo, Hep G2), e um número de outras linhagens celulares. Em certas modalidades, as linhagens celulares podem ser selecionadas através da determinação de quais linhagens celulares têm níveis de alta expressão e constitutivamente produzem proteínas de ligação a antígeno com propriedades de ligação de CGRP R. Em outra modalidade, uma linhagem celular a partir da linhagem de células B que não faz seu próprio anticorpo, mas tem uma capacidade de fazer e secretar um anticorpo heterólogo pode ser selecionada. Uso de Proteínas de ligação a antígeno de CGRP Humanas para Fins de Diagnóstico e Terapêuticos
[391] As proteínas de ligação a antígeno são úteis para detectar CGRP R em amostras biológicas e na identificação de células ou tecidos que produzem CGRP R. Por exemplo, as proteínas de ligação do antígeno CGRP R pode ser usadas em ensaios diagnósticos, por exemplo, ensaios de ligação para detectar e/ou quantificar CGRP R expressas em um tecido ou célula. As proteínas de ligação a antígeno que se ligam especificamente a R CGRP também podem ser usadas no tratamento de doenças relacionadas a CGRP R em um paciente em necessidade do mesmo. Além disso, as proteínas de ligação a antígeno de CGRP R podem ser utilizadas para inibir CGRP R de formar um complexo com o seu CGRP ligante, modulando assim a atividade biológica de CGRP R em uma célula ou tecido. Exemplos de atividades que podem ser moduladas incluem, mas não estão limitadas a, inibição da vasodialação e/ou diminuição da inflamação neurogênica. Proteínas de ligação a antígeno que se ligam a CGRP R, portanto, podem modular e/ou bloquear a interação com outros compostos de ligação e como tal pode ter uso terapêutico na melhoria de doenças relacionadas a CGRP R. Indicações
[392] Uma doença ou condição associada à CGRP R humana inclui qualquer doença ou condição cujo início em um paciente é causado, pelo menos em parte, pela interação de CGRP R com seu ligante, CGRP. A gravidade da doença ou condição também pode ser aumentada ou diminuída pela interação de CGRP R com CGRP. Exemplos de doenças e condições que podem ser tratadas com as proteínas de ligação a antígeno descritas aqui incluem dores de cabeça, tais como enxaquecas, cefaléia, incluindo dores de cabeça de cefaléia, dor crônica, diabetes melitus tipo II, inflamação, por exemplo, inflamação neurogênica, distúrbios cardiovasculares e desarranjos hemodinâmicos associados com endotoxemia e sepse.
[393] Em particular, as proteínas de ligação a antígeno aqui descritas podem ser usadas para tratar a cefaléia, seja como tratamento agudo com início após uma crise de enxaqueca, e/ou como um tratamento profilático administrado, por exemplo, diária, semanal, quinzenal, mensal, bimestral, bianualmente, etc.) para prevenir ou reduzir a frequência e/ou gravidade dos sintomas, por exemplo, sintomas de dor, associados a crises de enxaqueca. Métodos de Diagnóstico
[394] As proteínas de ligação a antígeno aqui descritas podem ser usadas para fins de diagnóstico para detectar, diagnosticar ou monitorar doenças e/ou condições associadas com CGRP R. Também são fornecidos métodos para a detecção da presença de CGRP R em uma amostra utilizando os métodos imunohistológicos clássicos conhecido por aqueles versados na técnica (por exemplo, Tijssen, 1993, Practice and Theory of Enzyme Immunoassays, Vol 15 (Eds R.H. Burdon and P.H. van Knippenberg, Elsevier, Amsterdam); Zola, 1987, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, pp. 147-158 (CRC Press, Inc.); Jalkanen et al., 1985, J. Cell. Biol. 101:976-985; Jalkanen et al., 1987, J. Cell Biol. 105:3087 3096). A detecção de CGRP R pode ser realizada in vivo ou in vitro.
[395] As aplicações de diagnóstico contidas neste documento incluem o uso de proteínas de ligação a antígeno para detectar a expressão de CGRP R e ligação dos ligantes à CGRP R. Exemplos de métodos úteis na detecção da presença de CGRP R incluem imunoensaios, como o ensaio imunoabsorvente ligado à enzima (ELISA) e radioimunoensaio (RIA).
[396] Para aplicações de diagnóstico, a proteína de ligação a antígeno geralmente será marcada com um grupo de marcação detectável. Exemplos de grupos de marcação adequados incluem, mas não estão limitados aos seguintes: radioisótopos ou radionuclídeos ((por exemplo, 3H, 14C, 15N, 35S, 90Y, 99Tc, 111In, 125I, 131I)), grupos fluorescentes ((por exemplo, FITC, rodamina, fosfóros de lantanídeos), grupos enzimáticos ((por exemplo, peroxidase de raiz forte, β- galactosidase, luciferase, fosfatase alcalina)), grupos de quimioluminescência, grupos biotinila, ou epítopos de polipeptídeo pré-determinados reconhecidos por um repórter secundário (por exemplo, sequências de par de zíper de leucina, sítios de ligação para anticorpos secundários, domínios de ligação de metal, tags de epítopo). Em algumas modalidades, o grupo de marcação é acoplado à proteína de ligação do antígeno através de braços espaçadores de vários comprimentos para reduzir o impedimento estérico potencial. Vários métodos para marcar as proteínas são conhecidos na técnica e podem ser usados.
[397] Em outro aspecto, uma proteína de ligação a antígeno pode ser usada para identificar uma célula ou células que expressam CGRP R. Em uma modalidade específica, a proteína de ligação a antígeno é marcada com um grupo de marcação e de ligação da proteína de ligação a antígeno marcada a CGRP R é detectada. Em uma modalidade mais específica, a ligação da proteína de ligação do antígeno a CGRP R é detectada in vivo. Em uma modalidade adicional específica, a proteína de ligação a antígeno CGRP R é isolada e medida utilizando técnicas conhecidas na técnica. Ver, por exemplo, Harlow and Lane, 1988, Antibodies: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor (ed. 1991 and periodic supplements); John E. Coligan, ed., 1993, Current Protocols In Immunology New York: John Wiley & Sons.
[398] Outro aspecto fornece a detecção da presença de uma molécula de teste que compete para a ligação ao CGRP R com as proteínas de ligação do antígeno fornecidas. Um exemplo de um desses ensaios envolveria a detecção da quantidade da proteína de ligação a antígeno livre em uma solução contendo uma quantidade de CGRP R na presença ou ausência da molécula de teste. Um aumento na quantidade da proteína de ligação a antígeno livre (isto é, a proteína de ligação do antígeno não ligada a CGRP R) indicaria que a molécula de teste é capaz de competir para a ligação de CGRP R com a proteína de ligação do antígeno. Em uma modalidade, a proteína de ligação do antígeno é marcada com um grupo de marcação. Alternativamente, a molécula de teste está marcada e a quantidade da molécula de teste livre é monitorada na presença e ausência de uma proteína de ligação do antígeno. Métodos de tratamento: Formulações Farmacêuticas, Rotas de Administração
[399] Métodos de usar das proteínas de ligação do antígeno também são fornecidos. Em alguns métodos, uma proteína de ligação a antígeno é fornecida para um paciente. A proteína de ligação do antígeno inibe a ligação de CGRP a CGRP R humana.
[400] Composições farmacêuticas que compreendem uma quantidade terapeuticamente eficaz de um ou uma pluralidade de proteínas de ligação a antígeno e um diluente, carreador, solubilizante, emulsificante, conservante, e/ou adjuvante farmaceuticamente aceitável também são fornecidas. Além disso, os métodos de tratamento de um paciente, por exemplo, para a enxaqueca, através da administração de tal composição farmacêutica estão incluídos. O termo "paciente" inclui pacientes humanos.
[401] Materiais de formulação aceitáveis são atóxicos aos recebedores nas doses e concentrações utilizadas. Nas modalidades específicas, as composições farmacêuticas compreendendo uma quantidade terapeuticamente eficaz das proteínas de ligação a antígeno CGRP R humanas são fornecidas.
[402] Em certas modalidades, materiais de formulação aceitáveis de preferência são atóxicos aos recebedores nas doses e concentrações utilizadas. Em certas modalidades, a composição farmacêutica pode conter materiais de formulação para modificar, manter ou conservar, por exemplo, o pH, osmolaridade, viscosidade, claridade, cor, isotonicidade, odor, esterilidade, estabilidade, taxa de dissolução ou liberação, absorção e penetração da composição. Em tais modalidades, materiais de formulação adequados incluem, mas não estão limitados a, aminoácidos (tais como glicina, glutamina, asparagina, arginina ou lisina); agentes antimicrobianos; antioxidantes (tais como ácido ascórbico, sulfito de sódio ou sulfito de sódio-hidrogênio); tampões (tais como borato, bicarbonato, Tris-HCl, citratos, fosfatos ou outros ácidos orgânicos); agentes de volume (como manitol ou glicina); agentes quelantes (tais como ácido etilenodiamina etilenodiaminotetracético (EDTA)); agentes complexantes (como cafeína, polivinilpirrolidona, beta- ciclodextrina ou hidroxipropil-beta-ciclodextrina); enchimentos; monossacarídeos; dissacarídeos; e outros carboidratos (tais como a glicose, manose ou dextrina); proteínas (como a albumina, gelatina ou imunoglobulinas); agentes de coloração, aromatizantes e de diluição, agentes emulsificantes, polímeros hidrofílicos (tais como polivinilpirrolidona); polipeptídeos de baixo peso molecular; contraíons formadores de sal (tais como sódio); conservantes (tais como cloreto de benzalcônio, ácido benzóico, ácido salicílico, timerosal, álcool fenetílico, metilparabeno, propilparabeno, clorexidina, ácido sórbico ou peróxido de hidrogênio); solventes (como a glicerina, propilenoglicol ou polietileno glicol); álcoois de açúcar (como manitol ou sorbitol); agentes de suspensão, surfactantes ou agentes umectantes (tais como plurônicos, PEG, ésteres de sorbitano, polissorbatos como polisorbato 20, polisorbato, triton, trometamina, lecitina, colesterol, tiloxapal); agentes de intensificação de estabilidade (tais como sacarose ou sorbitol); agentes intensificadores de tonicidade (tais como haletos de metais alcalinos, de preferência cloreto de sódio ou de potássio, sorbitol manitol); veículos de distribuição; diluentes; excipientes e/ou adjuvantes farmacêuticos. Ver, REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 18° Edição, (A.R. Genrmo, ed.), 1990, Mack Publishing Company.
[403] Em certas modalidades, a composição farmacêutica ideal será determinada por uma pessoa versada na técnica, dependendo, por exemplo, da rota de administração pretendida, formato de distribuição e dosagem desejada. Ver, por exemplo, REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCES, supra. Em certas modalidades, tais composições podem influenciar o estado físico, estabilidade, taxa de liberação in vivo e taxa de afastamento in vivo das proteínas de ligação do antígeno divulgadas. Em certas modalidades, o veículo ou carreador principal em uma composição farmacêutica pode ser aquoso ou não aquoso na natureza. Por exemplo, um veículo ou carreador adequado pode ser água para injeção, solução salina fisiológica ou líquido cefalorraquidiano artificial, eventualmente complementado com outros materiais comuns em composições para administração parenteral. Solução salina tamponada ou soro fisiológico neutro misturado com albumina sérica são ainda veículos exemplares. Em modalidades específicas, as composições farmacêuticas compreendem tampão Tris de pH de cerca de 7,0 a 8,5, ou tampão de acetato de pH de cerca de 4,0 a 5,5, e pode incluir ainda sorbitol ou um substituto adequado. Em certas modalidades, as composições de proteína de ligação a antígeno CGRP R humanas podem ser preparadas para o armazenamento através da mistura da composição selecionada tendo o grau desejado de pureza com agentes de formulação opcionais (REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCES, supra) na forma de um bolo liofilizado ou uma solução aquosa. Além disso, em certas modalidades, a proteína de ligação do antígeno R humana pode ser formulada como um liofilizado usando excipientes adequados, tais como a sacarose.
[404] As composições farmacêuticas podem ser selecionadas para a distribuição parenteral. Alternativamente, as composições podem ser selecionadas para a inalação ou para distribuição através do trato digestivo, como por via oral. As preparações de tais composições farmaceuticamente aceitáveis estão contidas no estado da técnica.
[405] Os componentes da formulação estão presentes de preferência em concentrações que sejam aceitáveis para o sítio de administração. Em certas modalidades, tampões são usados para manter a composição no pH fisiológico ou em um pH ligeiramente inferior, normalmente dentro de uma faixa de pH de cerca de 5 a cerca de 8.
[406] Quando a administração parenteral é contemplada, as composições terapêuticas podem ser fornecidas sob a forma de uma solução aquosa livre de pirogênio, parenteralmente aceitável compreendendo a proteína de ligação de CGRP R humana desejada em um veículo farmaceuticamente aceitável. Um veículo particularmente adequado para injeção parenteral é água destilada estéril na que a proteína de ligação do antígeno CGRP R humana é formulada como uma solução estéril, isotônica, devidamente preservada. Em certas modalidades, a preparação pode envolver a formulação da molécula desejada com um agente, como microesferas injetáveis, partículas biodegradáveis, compostos poliméricos (como o ácido polilático ou ácido poliglicólico), contas ou lipossomas, que podem fornecer liberação controlada ou sustentada do produto que pode ser entregue via injeção de depósito. Em certas modalidades, o ácido hialurônico também pode ser utilizado, tendo o efeito de promover a duração sustentada na circulação. Em certas modalidades, dispositivos de distribuição de medicamentos implantáveis podem ser usados para introduzir a proteína de ligação a antígeno desejada.
[407] Certas composições farmacêuticas são formuladas para inalação. Em algumas modalidades, as proteínas de ligação do antígeno CGRP R humanas são formuladas como um pó seco, inalável. Em modalidades específicas, as soluções para inalação da proteína de ligação a antígeno CGRP R humano também podem ser formuladas com um propulsor para distribuição em aerossol. Em certas modalidades, as soluções podem ser nebulizadas. Métodos de administração pulmonar e de formulação, portanto, são ainda descritos no Pedido de Patente Internacional No. PCT/US94/001875, que é incorporado por referência e descreve a distribuição pulmonar de proteínas quimicamente modificadas. Algumas formulações podem ser administradas por via oral. As proteínas de ligação a antígeno CGRP R humano que são administradas desta forma podem ser formuladas com ou sem carreadores habitualmente usados na composição de formas de dose sólidas, como comprimidos e cápsulas. Em certas modalidades, a cápsula pode ser projetada para liberar a porção ativa da formulação no ponto no trato gastrointestinal, quando a biodisponibilidade é maximizada e a degradação pré-sistêmica é minimizada. Agentes adicionais podem ser incluídos para facilitar a absorção da proteína de ligação do antígeno CGRP R humano. Diluentes, aromatizantes, ceras de baixo ponto de fusão, óleos vegetais, lubrificantes, agentes de suspensão, agentes de desintegração de comprimido, e aglutinantes também podem ser empregados.
[408] Algumas composições farmacêuticas compreendem uma quantidade efetiva de um ou uma pluralidade de proteínas de ligação a antígeno CGRP R humano em uma mistura com os excipientes não-tóxicos que são adequados para a fabricação de comprimidos. Pela dissolução dos comprimidos em água estéril, ou outro veículo apropriado, as soluções podem ser preparadas em forma de dose unitária. Excipientes apropriados incluem, mas não estão limitados a, diluentes inertes, como carbonato de cálcio, carbonato de sódio ou bicarbonato, lactose, ou fosfato de cálcio, ou agentes de ligação, como amido, gelatina ou acácia; ou agentes lubrificantes como estearato de magnésio, ácido esteárico, ou talco.
[409] As composições farmacêuticas adicionais serão evidentes para aqueles versados na técnica, incluindo as formulações envolvendo as proteínas de ligação a antígeno CGRP R humano em formulações de distribuição sustentada ou controlada. Técnicas para a formulação de uma variedade de outros meios de distribuição sustentada ou controlada, tais como carreadores de lipossomas, micropartículas biodegradáveis ou grânulos porosos e injeções de depósito, também são conhecidos por aqueles versados na técnica. Ver, por exemplo, Pedido de Patente International No. PCT/US93/00829, que é incorporado por referência e descreve a liberação controlada de micropartículas poliméricas porosas para distribuição de composições farmacêuticas. As preparações de liberação sustentada podem incluir matrizes de polímero semipermeáveis na forma de artigos moldados, por exemplo, filmes ou microcápsulas. Matrizes de liberação sustentada podem incluir poliésteres, hidrogéis, polilactídeos (conforme divulgado na Patente US 3.773.919 e Publicação de Pedido de Patente Européia EP 058.481 PE, cada um dos quais sendo aqui incorporado por referência), copolímeros de ácido L-glutâmico e gama etil-L- glutamato (Sidman et al. , 1983, Biopolymers 2:547-556), poly (2- hydroxyethyl-inethacrylate) (Langer et al., 1981, J. Biomed. Mater. Res. 15:167-277 e Langer, 1982, Chem. Tech. 12:98105), acetato de etileno vinil (Langer et al, 1981, supra) ou ácido poli-D (-)-3-hidroxibutírico (Publicação de Pedido de Patente Européia n° EP 133.988). Composições de liberação sustentada também podem incluir lipossomas que podem ser preparados por qualquer um dos vários métodos conhecidos na técnica. Ver, ex., Eppstein et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82:3688-3692; Publicação de Pedido de Patentes Européias EP 036676; EP 088046 e EP 143949, incorporados por referência.
[410] As composições farmacêuticas utilizadas para administração in vivo são normalmente fornecidas como preparações estéreis. A esterilização pode ser realizada pela filtragem através de membranas de filtragem estéreis. Quando a composição é liofilizada, a esterilização usando este método pode ser realizada antes ou após a liofilização e reconstituição. As composições para a administração parenteral podem ser armazenadas na forma liofilizada ou em uma solução. As composições parenterais geralmente são colocadas em um recipiente tendo uma porta de acesso estéril, para exemplo, uma bolsa de solução intravenosa ou frasco tendo uma rolha perfurável por uma agulha de injeção hipodérmica.
[411] Em certas modalidades, as células que expressam uma proteína de ligação a antígeno recombinante, como aqui divulgado são encapsuladas para distribuição (ver, Invest. Ophthalmol Vis Sci 43:3292-3298, 2002 and Proc. Natl. Acad. Sciences 103:3896-3901, 2006).
[412] Em certas formulações, uma proteína de ligação a antígeno tem uma concentração de pelo menos 10 mg/ml, 20 mg/ml, 30 mg/ml, 40 mg/ml, 50 mg/ml, 60 mg/ml, 70 mg/ml, 80 mg/ml, 90 mg/ml, 100 mg/ml ou 150 mg/ml. Algumas formulações contêm um tampão, sacarose e polissorbato. Um exemplo de uma formulação é uma contendo de 50 a 100 mg/mL de proteína de ligação a antígeno, 5 a 20 mM de acetato de sódio, 5 a 10% de sacarose p/v, e 0,002 a 0,008 % p/v de polissorbato. Certas, as formulações, por exemplo, contêm de 65 a 75 mg/ml de uma proteína de ligação a antígeno em 9 a 11 mM de tampão de acetato de sódio mM, 8 a 10% de sacarose p/v, e 0,005 a 0,006% p/v de polissorbato. O pH de tais formulações está na faixa de 4,5 a 6. Outras formulações têm um pH de 5,0 a 5,5 (por exemplo, pH de 5,0, 5,2 ou 5,4).
[413] Uma vez que a composição farmacêutica foi formulada, pode ser armazenada em frascos estéreis como uma solução, suspensão, gel, emulsão, cristal, sólido, ou como um pó desidratado ou liofilizado. Tais formulações podem ser armazenadas em uma forma pronta-para-usar ou em uma forma (por exemplo, liofilizado) que é reconstituída antes da administração. Kits para produzir uma unidade de administração de dose única também são fornecidos. Certos kits contem um primeiro recipiente tendo uma proteína seca e um segundo recipiente tendo uma formulação aquosa. Em certas modalidades, os kits contendo seringas pré-carregadas com única e multicâmaras (por exemplo, seringas de líquido e lioseringas) são fornecidos. A quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição farmacêutica contendo a proteína de ligação a antígeno CGRP R humano a ser empregada irá depender, por exemplo, do contexto e objetivos terapêuticos. Uma pessoa versada na técnica apreciará que os níveis de dose adequados para o tratamento irá variar de acordo, em parte, com a molécula entregue, a indicação para a qual a proteína de ligação a antígeno CGRP R humano está sendo usada, a rota de administração, e o tamanho (peso corporal, superfície corpórea ou tamanho do órgão) e/ou condição (a idade e a saúde geral) do paciente. Em certas modalidades, o clínico pode titular a dose e modificar a rota de administração para obter o efeito terapêutico ideal.
[414] Uma dose típica pode variar entre cerca de 1 μg/kg a até cerca de 30 mg/kg ou mais, dependendo dos fatores mencionados acima. Em modalidades específicas, a dosagem pode variar de 10 μg/kg até cerca de 30 mg/kg, opcionalmente de 0,1 mg/kg até cerca de 30 mg/kg, em alternativa a partir de 0,3 mg/kg até cerca de 20 mg/kg. Em algumas aplicações, a dose é de 0,5 mg/kg a 20 mg/kg. Em alguns casos, uma proteína de ligação do antígeno é administrado em doses de 0,3 mg/kg, 0,5 mg/kg, 1 mg/kg, 3 mg/kg, 10 mg/kg, ou 20 mg/kg. A programação de dose em alguns regimes de tratamento é, a uma dose de 0,3 mg/kg qW, 0,5 mg/kg qW, 1 mg/kg qW, 3 mg/kg qW, 10 mg/kg qW, ou 20 mg/kg qW.
[415] A frequência de dosagem dependerá dos parâmetros farmacocinéticos da proteína de ligação do antígeno CGRP R humano particular na formulação utilizada. Normalmente, um clínico administra a composição até uma dose ser obtida que alcança o efeito desejado. A composição, portanto, pode ser administrada como uma dose única, ou como duas ou mais doses (que podem ou não conter a mesma quantidade da molécula desejada) ao longo do tempo, ou como uma infusão contínua através de um dispositivo de implantação ou catéter. Doses adequadas podem ser determinadas através da utilização de equipamento de dados de dose-resposta. Em certas modalidades, as proteínas de ligação do antígeno podem ser administradas a pacientes através de um período de tempo prolongado. A administração crônica de uma proteína de ligação do antígeno minimiza a resposta imunológica ou alérgica adversa comumente associada com as proteínas de ligação de antígeno que não são plenamente humanas, por exemplo, um anticorpo cultivado contra um antígeno humano em um animal não humano, por exemplo, um anticorpo não plenamente humano ou anticorpo não humano produzido em uma espécie não humana.
[416] A rota de administração da composição farmacêutica está de acordo com os métodos conhecidos, por exemplo, por via oral, através da injeção por via intravenosa, intraperitoneal, intracerebral (intraparenquimatosa), intracerebroventricular, intramuscular, intraocular, intra-arterial, intraportal, ou rotas intralesionais; por sistemas de liberação sustentada, ou por dispositivos de implantação. Em certas modalidades, as composições podem ser administradas por injeção de bólus ou continuamente por infusão ou pelo dispositivo de implantação.
[417] A composição também pode ser administrada localmente através da implantação de uma membrana, esponja ou outro material adequado no qual a molécula desejada foi absorvida ou encapsulada. Em certas modalidades, onde um dispositivo de implantação é utilizado, o dispositivo pode ser implantado em qualquer órgão ou tecido adequado e a distribuição da molécula desejada pode ser por meio de difusão, bólus de liberação programada ou administração contínua.
[418] Também pode ser desejável usar composições farmacêuticas de proteína de ligação a antígeno CGRP R humano ex vivo. Nesses casos, as células, tecidos ou órgãos que foram removidos do paciente são expostos às composições farmacêuticas da proteína de ligação do antígeno CGRP R humano após o que as células, tecidos e/ou órgãos são posteriormente implantados de volta para o paciente.
[419] Em particular, as proteínas de ligação de antígeno CGRP R humano podem ser entregues pelo implante de certas células que foram geneticamente modificadas, usando métodos, como os descritos neste documento, para expressar e secretar o polipeptídeo. Em certas modalidades, tais células podem ser células animais ou humanas, e podem ser autólogas, heterólogas, ou xenogênicas. Em certas modalidades, as células podem ser imortalizadas. Em outras modalidades, para diminuir a chance de uma resposta imunológica, as células podem ser encapsuladas para evitar a infiltração dos tecidos circundantes. Em modalidades adicionais, os materiais de encapsulação são normalmente biocompatíveis, invólucros poliméricos semipermeáveis ou membranas que permitem a liberação do produto(s) da proteína, mas impedem a destruição das células pelo sistema imunológico do paciente ou por outros fatores prejudiciais dos tecidos circundantes.
[420] Os exemplos a seguir, incluindo os experimentos realizados e os resultados alcançados, são fornecidos apenas para fins ilustrativos e não devem ser interpretados como limitantes do escopo das reivindicações anexas.
EXEMPLO 1 GERAÇÃO DE RECEPTOR DE CGRP COMO ANTÍGENOS A. Clonagem molecular de CRLR humano e RAMP1
[421] O cDNA de CRLR humano (No. de acesso no banco de genes. U17473; SEQ ID NO:1) e RAMP1 cDNA (No. de acesso no banco de genes AJ001014; SEQ ID NO:3) foram clonados em vetores de expressão de células de mamíferos pcDNA3.1-Zeo e pcDNA3.1-Hyg (Invitrogen, Carlsbad, CA), respectivamente, para trasnfecções de Células HEK 293EBNA (Invitrogen) como foi descrito abaixo. O DNA de hCRLR e DNA hRAMP1 foram também clonados em vetor pDSRα24 (Kim, H. Y. et al. J. Inv. Derm. Symp. Proc. (2007) 12 : 48-49) para transfecções de Células AM-1 CHO (Patente US 6.210.924).
B. Linhagens celulares estavelmente transfectadas 1. Expressão estável de CGRP R humano em células 293EBNA
[422] Células HEK 293EBNA (disponíveis de ATCC ou Invitrogen) foram cultivadas em uma densidade de 1,5x106 células por 100mm de placa. Depois de 24 horas, as células foram co-trasnfectadas com 6μg de DNAs linearizados de huRAMP1/pcDNA3.1-Hyg e huCRLR/pcDNA3.1-Zeo com FuGene6 (Invitrogen, Carlsbad, CA) seguindo as instruções fornecidas por Invitrogen. Depois de dois dias, as células foram tripsinizadas e subcultivadas no meio de crescimento contendo 400μg/ml de higromicina + 250μg/ml de zeocina. Depois de duas semanas, as colônias resistentes às drogas resultantes foram tripsinizadas e combinadas em pools. As pools foram submetidas a quatro rodadas de FACS selecionando um análogo de peptídeo CGRP8-37 marcado com Alexa 647- (descrito abaixo). As células com mais de 5% de expressão de células foram coletas em cada rodada. 2. Expressão humana de CGRP R humano em Células AM-1 CHO
[423] Células AM-1 CHO (uma variante adaptada em meio de crescimento livre de soro de Linhagem celular deficiente de CHO DHFR descrita em Urlaub e Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. 77, 4216 (1980), foram cultivadas em 1,5x106 células por 100mm placa. Depois de 24 horas, as células foram co- trasnfectadas com 4 μg de DNAs linearizados cada um de pDSRα24/huRAMP1 e pDSRα24/huCRLR com FuGene6 (Invitrogen, Carlsbad, CA) seguindo as instruções fornecidas por Invitrogen. As células transfectadas foram tripsinizadas 2 dias depois da transfecção e cultivadas em CHO DHFR meio de crescimento coletivo contendo 10% de FBS dializado e sem suplemento de hipoxantina/timidina. Depois de 2 semanas, as colônias transfectadas resultantes foram tripsinizadas e reservadas. As pools foram submetidas a Análise de seleção por FACS. 3. Expressão humana de adrenomedulina humana (AM1) em Células HEK 293EBNA
[424] As Células 293EBNA foram cultivadas em placas de 100mm em 1,5x106 células / placa em DMEM (alta glicose) + 5% FBS + 1% de aminoácidos não essenciais MEM + 1% de piruvato de sódio. No dia seguinte as células foram co-transfectadas usando reagente de transfecção FuGENE 6 (Roche) com pcDNA3.1/zeocina/huCRLR mais pcDNA3.1/higromicina/huRAMP2. Ambos os construtos de DNA foram linearizados com FspI. Depois de 48 horas as células foram subcultivadas em placas de 100mm em 3 densidades celulares (8x105, 3,2x105, e 8x104 células / placa) em meio de crescimento contendo 200μg/ml de zeocina. O meio foi mudado duas vezes semanalmente. Depois de uma semana as placas foram alimentadas com meio contendo 200μg/ml de higromicina + 200μg/ml de zeocina. Depois de duas semanas, 96 colônias foram isoladas com anéis de clonagem. As colônias restantes foram coletadas em uma única cultura de pool (agrupamentos). Os clones e pools foram ensaiados pela sua resposta para a simulação pelo agonista receptor ou forscolina. Vários clones apresentaram uma boa resposta, e um foi selecionado para uso nos experimentos subsequentes. 4. Expressão Estável de CGRP R de cinomolgo em Células HEK 293EBNA
[425] Células 293EBNA foram cultivadas em placas de 100mm em 1,5x106 células / placa em DMEM (alta glicose) + 5% de FBS + 1% de aminoácidos não essenciais MEM + 1% de piruvato de sódio. No dia seguinte as células foram co-transfectadas usando FuGENE 6 com pcDNA3.1/zeocina/cinoCRLR mais pcDNA3.1/higromicina/cinoRAMP1. Ambos os construtos foram linearizados com FspI. Depois de 48 horas as células foram subcultivadas no meio de crescimento contendo 200μg/ml de zeocina + 400μg/ml de higromicina em diluições de 1:20, 1:40, 1:100, e 1:200. O meio foi mudado duas vezes semanalmente. Depois de duas semanas, 96 colônias transfectadas foram isoladas usando anéis de clonagem. Os clones foram ensaiados pela sua resposta para estimulação por Ligante de CGRP. Vários clones apresentaram altos níveis de resposta semelhantes e um foi selecionado para uso em experimentos subsequentes.
C. Isolamento de células de receptor de CGRP com alta expressão
[426] Um análogo de peptídeo CGRP8-37 foi sintetizado (Midwest Bio-Tech Inc. Fishers, IN) com a sequência abaixo:
[427] Ac-WVTHRLAGLLSRSGGVVRCNFVPTDVGPFAF-NH2 (SEQ ID NO:9)
[428] O peptídeo foi marcado com Alexa 647-NHS seguindo as instruções do fabricante (Molecular Probes, Inc. Cat A 2006). O CGRP8-37 marcado com Alexa 647- apresentou o tingimento específico de Células transfectadas de Receptor de CGRP e não as células de origem não-transfectadas e foi usado como o Reagente de FACS.
[429] Os 293EBNA transfectados com Receptor huCGRP e pools de células AM-1 CHO (geradas conforme descrito acima) foram selecionados repetidamente em pools até quatro vezes usando peptídeo CGRP8-37 marcado com Alexa 647. Células com alta expressão foram coletadas em cada seleção, expandidas e depois da seleção final foram congeladas em frascos. As células AM-1 CHO/huCGRP R foram usadas para imunização como foi descrito abaixo, e as células 293EBNA/huCGRP R foram usadas para titulação de soro de camundongo depois da imunização e em seleções de ligação dos sobrenadantes de hibridoma.
D. Geração de Receptor de CGRP solúvel
[430] Polipeptídeos de Receptor de CGRP solúvel contendo os domínios extracelulares N-terminais (ECDs) de CRLR humano (SEQ ID NO:6) e RAMP1 humano (SEQ ID NO:8) foram gerados por meio de co-transfecção transiente de células 293 6E (Durocher, et al., Nucleic Acids Res. 30:E9 (2002)) com vetores contendo os cDNAs correspondentes (SEQ ID NO:5 ou SEQ ID NO:7) como foi descrito abaixo. Os tags normalmente usados (polyHis, Flag, HA e/ou Fc) foram empregados para facilitar a secreção e/ou subsequente purificação.
[431] A um CGRP R ECD heterodimérico solúvel fundido com Fc foi preparado por clonagem de PCR com os iniciadores adequados no vetor de expressão transiente TT5 (Durocher, et al., supra). O CRLR N-terminal ECD-Fc consistiu do domínio extracelular N-terminal de CRLR (SEQ ID NO:6) fundido em IgG1 Fc humano. O RAMP1 ECD-Fc contém domínio extracelular de RAMP1 (SEQ ID NO:8) fundido com IgG1 Fc humano. Em ambos os casos, houve um ligante consistindo de cinco glicinas consecutivas entre o domínio ECD e Fc.
[432] O Receptor de CGRP heterodimérico solúvel foi expresso pela co-transfecção de dois construtos conforme a seguir. As células 293-6E em 1x106 células/ml em frascos de agitação foram transfectadas com 0,5mg/L DNA (hCRLR N-ter ECD-Fc/pTT5 e huRAMP1 ECD-Fc/pTT5) com 3ml PEI/mg DNA em meio FreeStyle 293 (Invitrogen). Células foram cultivadas em suspensão em meio de expressão de FreeStyle 293 suplementado com Plurônico 0,1% F68 e 50 μg/ml de Geneticina por 7 dias e coletadas para purificação.
[433] Purificações de meios condicionados (“CM”) foram realizadas por meio de tampão com CM com a adição de Tris 50mM, citrato de sódio 400mM, e ajustando o pH para 8,5. O CM tamponado foi então passado sobre uma coluna de afinidade de Proteína A equilibrada em Tris 50mM, citrato de sódio 400mM e pH ajustado para pH 8,5. A Coluna de proteína A foi lavada com PBS e a Fc proteína de fusão foi eluída com HOAc 0,1 N. O pico eluído continha ambos os componentes CRLR e RAMP1 quando testados por meio de western blot usando anticorpos individuais específicos tanto para CRLR ou RAMP1. LC-MS adicional e sequenciamento N-terminal confirmou a presença tanto de CRLR:RAMP1 heterodímero quanto de homodímero CRLR:CRLR em razão de aproximadamente (2:3). Este “Receptor de CGRP solúvel” mostrou competir na ligação de CGRP8-37 marcado com Alexa647 com as células recombinantes expressando Receptor de CGRP na análise de FMAT, apesar de falha na ligação com o ligante de CGRP como determinado usando os testes da Biacore. O material foi usado como um imunogene conforme descrito no Exemplo, apesar da sua heterogeneidade e ausência de ligação do Ligante de CGRP. E. Geração de extratos de membrana de Células que expressam receptor de CGRP recombinante
[434] Extratos de membrana foram preparados a partir de Células que expressam receptor de CGRP usando um método descrito por Bossé, R. et al., (Journal of Biomolecular Screening, 3(4): 285-292 (1998)). Brevemente, aproximadamente 5 gramas de pasta celular foram peletizadas em 50 ml de PBS em 3.000 rpm por 10 min a 4oC e ressuspensas em 30 ml de tampão de lise gelado (HEPES25 mM, pH 7,4, MgCl2 3 mM mais um tablete de coquetel de inibidor de protease Roche / 50mL). O lisado foi homogeneizado com Glas-Col (homogenizador Teflon-vidro) com ~20 cursos em 5.000 rpm e centrifugado em um rotor JA21 a 20.000 rpm por 15 min a 4oC. Esse processo foi repetido mais uma vez e o produto final peletizado foi ressuspenso em ~1-5 ml de tampão para ‘produto peletizado final’ (HEPES 25 mM, pH 7,4, MgCl2 3 mM, sacarose 10 % (p/v) mais um tablete inibidor de protease Roche / 50mL). Os extratos de membrana foram cortados passando através de agulhas 16 G e 25 G, de 2 a 3 vezes. A concentração total de proteína da membrana foi determinada com um ensaio de Proteína BCA em Microplaca (Pierce).
EXEMPLO 2 GERAÇÃO DE ANTICORPOS PARA RECEPTOR DE CGRP A. Imunização
[435] Imunizações foram conduzidas usando as seguintes formas de Antígenos de receptor de CGRP preparados conforme descritos em Exemplo 1: (i) AM-1 CHO transfectantes expressando CRLR humano de comprimento completo e RAMP1 na superfície da célula, obtido por meio de co-transfecção de células CHO com cDNA de CRLR humano de comprimento completo (SEQ ID NO:1) codificando um polipeptídeo com a sequência SEQ ID NO:2, e cDNA de RAMP1 (SEQ ID NO:3) codificando um polipeptídeo com a sequência SEQ ID NO:4 (ii) extrato de membrana das células descritas (i) acima; e (iii) Receptor de CGRP solúvel obtido por meio de coexpressão e purificação do ECD N-terminal de CRLR (SEQ ID NO:6) e o domínio extracelular (ECD) de RAMP1 (SEQ ID NO:8) como descrito em Exemplo 1.
[436] Animais tipo XENOMOUSE foram imunizados com Proteína de Receptor de CGRP solúvel purificada e membranas CGRP R purificadas preparadas a partir de Células AM-1 CHO que expressam estavelmente CGRP R da mesma forma usando doses de 10 μg/camundongo e 150 μg/camundongo respectivamente. A membranas de CGRP foram preparadas usando métodos descritos acima.
[437] Subsequentes reforços (boosts) foram administrados em doses de 10 μg/camundongo de CGRP R solúvel ou 75 μg de membranas de CGRP R purificados. Animais tipo XENOMOUSE foram também imunizados com células que expressam Receptor de CGRP usando doses de 3,4 x 106 células de CGRP R transfectadas/camundongo e subsequentes reforços foram de 1,7 x 106 células de CGRP R transfectadas/camundongo. Os locais de injeção usados foram sítios de combinações de subcutâneas na base da cauda e intraperitoneal. Imunizações foram realizadas de acordo com métodos apresentados na Patente US 7.064.244, depositada em 19 de fevereiro de 2002, cuja divulgação é incorporada por referência no presente documento. Adjuvantes TiterMax Gold (Sigma; cat. # T2684), Alum (E.M. Sergent Pulp e Chemical Co., Clifton, NJ, cat. # 1452-250) foram preparados de acordo com as instruções dos fabricantes e misturados em uma razão de 1:1 da emulsão de adjuvante para a solução de antígeno.
[438] Soro foi coletado 4 - 6 semanas depois da primeira injeção e as titulações específicas foram determinadas por tingimento com FACs de células 293EBNA que expressam Receptor de CGRP recombinante.
[439] Os Camundongos foram imunizados tanto com células /membranas expressando células CGRP R de comprimento completo ou domínio extracelular de CGRP R solúvel, com uma variação de 11 - 17 imunizações durante um período de aproximadamente um até três meses e meio. Os camundongos com titulação de soro mais alta foram identificados e preparados para geração de hibridoma. As imunizações foram realizadas em grupos de múltiplos camundongos, tipicamente dez. Os linfonodos inguinais e poplíteos e tecidos do baço foram tipicamente obtidos a partir de cada grupo para a geração de fusões.
B. Preparação de Anticorpos Monoclonais
[440] Animais apresentando titulações adequadas foram identificados, e os linfócitos foram obtidos pela drenagem dos linfonodos e, se necessário, reservados para cada coorte. Os linfócitos foram dissociados a partir de tecido linfoide em um meio adequado (por exemplo, Dulbecco’s Modified Eagle Medium; DMEM; que pode ser obtido da Invitrogen, Carlsbad, CA) para liberar as células dos tecidos, e suspensos em DMEM. As células B foram selecionadas e /ou expandidas usando um método adequado, e fundidas com um parceiro de fusão adequado, por exemplo, células de mieloma P3X63Ag8.653 não secretoras (American Type Culture Collection CRL 1580; Kearney et al, J. Immunol. 123, 1979, 1548-1550).
[441] Os linfócitos foram misturados com células de parceiros de fusão em razões de 1:4. A mistura celular foi brandamente peletizada por meio de centrifugação em 400 x g por 4 minutos, o sobrenadante foi decantado, a mistura celular foi brandamente misturada usando uma pipeta de 1 ml. A fusão foi induzida com PEG/DMSO (polietileno glicol/dimetil sulfóxido; obtido de Sigma-Aldrich, St. Louis MO; 1 ml por milhão de linfócitos). PEG/DMSO foi lentamente adicionado com agitação branda durante um minuto seguido por um minuto de mistura. IDMEM (DMEM sem glutamina; 2 ml por milhão de células B), foi então adicionado durante 2 minutos com agitação branda, seguida por mais IDMEM (8 ml por milhões de células B) que foi adicionado durante 3 minutos.
[442] As células associadas foram brandamente peletizadas (400 x g 6 minutos) e ressuspensas em 20 ml Meio de seleção (por exemplo, DMEM contendo Azaserina e Hipoxantina [HA] e outros materiais de suplemento conforme necessário) por milhões de células B. As células foram incubadas por 20-30 minutos a 37°C e então ressuspensas em 200 ml de Meio de seleção e cultivadas por 3 até 4 dias em frascos T175 antes de serem colocadas em placas de 96 poços.
[443] As células foram distribuídas em placas de 96 poços usando técnicas padrões para maximizar a capacidade de clonagem das colônias resultantes. Depois de alguns dias de cultivo, os sobrenadantes de hibridoma foram coletados e submetidos aos ensaios de triagem conforme detalhado nos exemplos abaixo, incluindo a confirmação de ligação com o Receptor de CGRP humano, identificação dos anticorpos bloqueadores por um ensaio de competição de ligação a ligante e avaliação da reatividade cruzada com outros receptores relacionados com Receptor de CGRP (por exemplo, receptor de adrenomedulina humana). As células positivas foram ainda selecionadas e submetidas à clonagem padrão e técnicas de subclonagem. As linhagens de clonagens foram expandidas in vitro, e os anticorpos humanos secretados foram obtidos para análise.
C. Análise de Sequência dos Anticorpos Monoclonais selecionados
[444] Os Anticorpos Monoclonais subclonados selecionados foram sequenciados usando métodos padrões de RT-PCR. A tabela 2A mostra as sequencias de aminoácidos das cadeias leves de exemplos de anticorpos apresentados aqui. A tabela 2B mostra as sequencias de aminoácidos das cadeias pesadas dos exemplos de anticorpos apresentados no presente documento.
[445] As Sequencias de aminoácidos correspondentes das regiões de CDR dos anticorpos sequenciados foram alinhadas e os alinhamentos foram usados para agrupar os clones por similaridade.
[446] Os alinhamentos da sequência das CDRs de cadeia leve com clones tendo cadeias leves kappa, e certas sequências consenso correspondentes são mostrados nas Figs 3A e 3B.
[447] Os alinhamentos da sequência das CDRs de cadeia leve de clones com cadeias leves lambda, e certas sequências consenso correspondentes são mostrados na Fig. 4.
[448] Os alinhamentos da sequência das CDRs de cadeia pesada de exemplos de anticorpos apresentados no presente documento, e certas sequências consenso correspondentes são mostrados nas Figs. 5A, 5B, 5C, 5D e 5E.
[449] Certas sequências consenso de CDRs de cadeias pesadas apresentadas no presente documento são mostradas na Fig. 5F.
EXEMPLO 3 IDENTIFICAÇÕA DE ANTICORPOS ESPECÍFICOS DE RECEPTOR DE CGRP A. Seleção de anticorpos de ligação específica para Receptor de CGRP por FMAT
[450] Depois de 14 dias de cultivo, os sobrenadantes de hibridoma foram submetidos à triagem por Tecnologia de ensaio de microvolume fluorimétrico específico para Anticorpos Monoclonais de CGRP R (FMAT) (Applied Biosystems, Foster City, CA). Os sobrenadantes foram submetidos à triagem contra as células AM-1 CHO huCGRP R ou células recombinantes HEK 293 que foram transfectadas com CGRP R humano e submetida à contra-triagem contra células de origem HEK293 (preparadas conforme descritas em Exemplo 1).
[451] Brevemente, as células e o meio Freestyle (Invitrogen, Carlsbad, CA) foram cultivadas em placas de 384 poços FMAT em um volume de 50 μL/poço em uma densidade de aproximadamente 4000 células/ poço para os transfectantes estáveis, e em uma densidade de aproximadamente 16.000 células/ poço para as células de origem, e as células foram incubadas durante a noite a 37°C. Então, 10 μL/poço de sobrenadante foram adicionados e as placas foram incubadas por aproximadamente uma hora a 4°C, depois disso 10 μL/poço de anticorpo secundário anti-humano IgG-Cy5 (Jackson Immunoresearch, West Grove, PA) foi adicionado em uma concentração de 2.8 μg/ml (400ng/ml concentração final). As placas foram então incubadas por uma hora a 4°C, e a fluorescência foi lida usando um scanner FMAT macro-confocal (Applied Biosystems, Foster City, CA).
[452] Para as contra-triagems, as células de origem AM-1 CHO ou células HEK 293 foram semeadas de forma semelhante e os sobrenadantes foram submetidos à triagem por FMAT nessas células em paralelo para diferenciar e eliminar os hibridomas que se ligam em proteínas celulares, mas não ao receptor de CGRP.
B. Identificação de anticorpos bloqueadores por meio de ensaio de competição de ligação a ligante através de FMAT
[453] Um método de competição de ligação a ligante foi desenvolvido para identificar anticorpos (nos sobrenadantes do hibridoma) que se ligam com Receptor de CGRP e bloqueiam a ligação com ligante de CGRP. Placas com 384 poços (Corning Costar, Cat:#3712) foram preparadas com 5.000 células AM-1 huCGRP R Pool 2 e 20.000 células CHO-S não transfectadas em cada poço. 20μl de sobrenadante de hibridoma anti-CGRP R foram adicionados em cada poço, e as placas foram incubadas por 1 hora em temperatura ambiente. 10μl de 2,8μg/ml Alexa647- peptídeo CGRP8-37 foram então adicionados em cada poço e as placas foram incubadas por mais 3 horas em temperatura ambiente. A quantidade de Alexa647-CGRP8-37 ligada nas células foi ensaiada em um sistema de detecção celular FMAT 8200 (Applied Biosystems). Os dados de saída foram valores numéricos de FL1 de intensidade de sinal (altos valores de FL1 indicam maior intensidade de sinal) e também uma imagem das células.
[454] Os experimentos incluíram sobrenadantes de hibridoma de controle negativo. O valor médio de FL1 observado nestes experimentos de controle negativo foi adotado como o sinal máximo possível para o ensaio. Os sobrenadantes experimentais foram comparados com este sinal máximo e um percentual de inibição foi calculado para cada poço (% inibição = (1-(FL1 de sobrenadante de hibridoma anti- CGRP R /sinal máximo de FL1)).
[455] Uma visão geral dos dados é mostrada na Fig. 6. Neste experimento, 1092 sobrenadantes de anti-CGRP R foram testados usando o ensaio de ligante de receptor. Os dados foram ordenados por classificação usando a inibição percentual média. Noventa sobrenadantes tiveram >25% de inibição média, 31 destes tiveram >50% e 7 tiveram >70% de inibição média.
[456] Um conjunto abreviado de dados é mostrado na tabela 10, abaixo. Amostra de ID Nos. 1-5 ilustra os exemplos de sobrenadantes de hibridoma anti-CGRP R que inibiram a ligação de Alexa647-CGRP8-37 peptídeo com o Receptor de CGRP e Amostras de ID Nos 536 - 540 ilustram os exemplos de sobrenadantes de hibridoma anti-CGRP R que não inibiram a ligação de Alexa647-CGRP8-37 peptídeo com o Receptor de CGRP.
[457] Tabela 10 - Exemplos de dados do ensaio FMAT de competição de ligação a ligante
Figure img0046
Figure img0047
[458] Com base nos ensaios de competição de ligação aproximadamente 30 sobrenadantes foram selecionados para adicional caracterização.
EXEMPLO 4 ATIVIDADE DE ANTICORPOS MONOCLONAIS DE BLOQUEIO ESPECÍFICOS DE RECEPTOR DE CGRP EM UM ENSAIO FUNCIONAL DE cAMP A. Atividade de anticorpo de receptor de CGRP.
[459] Os anticorpos de Receptor de CGRP selecionados foram submetidos à triagem em um ensaio cAMP in vitro mediado por Receptor de CGRP para determinar a potencia intrínseca. O ensaio cAMP in vitro usou uma linhagem celular derivada de neuroblastoma humano (SK-N-MC; Spengler, et al., (1973) In Vitro 8: 410) obtido de ATCC (Número ATCC HTB-10; “células HTB-10”). As células HTB-10 expressam CRLR e RAMP1, que formam o Receptor de CGRP (L. M. McLatchie et al, 1998). Uma linhagem celular 293EBNA expressando CGRP R de cinomolgos recombinante foi gerada como descrito no Exemplo 1, e uma linhagem celular de rato L6 expressando o Receptor de CGRP de rato foi obtida da ATCC (CRL-1458).
[460] O kit de ensaio LANCE cAMP (PerkinElmer, Boston, MA) foi usado na triagem. Os ensaios foram realizados em placas brancas de 96 poços em um volume total de 60 μL. Resumidamente, no dia do ensaio, as células congeladas HTB- 10 foram descongeladas a 37oC, as células foram lavadas uma vez com tampão de ensaio e 12 μL de suspensão celular contendo 10.000 células misturadas com anticorpo anti-cAMP marcado com Alexa foram adicionadas nas 96 placas brancas em metade da área. Depois de adicionar 12μL de anticorpo de Receptor de CGRP, a mistura foi incubada por 30 min em temperatura ambiente. Então 12μL de α-CGRP agonista humano de Receptor de CGRP (1nM de concentração final) foram adicionados e incubados por 15 min em temperatura ambiente. Depois da estimulação com α-CGRP humano, 24 μL de mistura de detecção foram adicionados e incubados por 60 minutos em temperatura ambiente e as placas forma lidas em um instrumento EnVision (PerkinElmer, Boston, MA) em Em665nM. Os dados foram processados e analisados por Prizm (GraphPad Software Inc.) ou ActivityBase (IDBS).
[461] A Fig. 7A mostra dados exemplares obtidos como descritos acima usando a linhagem celular HTB-10 que expressa Receptor de hCGRP para três anticorpos - 3C8, 13H2 e 1E11. Os dados foram representados graficamente como percentagem sobre controle (“POC”) como uma função da concentração do anticorpo (3C8, 13H2 ou 1E11), e são ajustados com curvas padrões de regressão não linear para produzir os valores de IC50 mostrados no final da figura. B. Ausência de atividade de anticorpo em receptores relacionados.
[462] As células expressando receptores AM1 relacionados (HEK 293 células expressando hCRLR+hRAMP2; D. R. Poyner, et al, Pharmacological review, 54:233-246, 2002), AM2 (CHO células expressando hCRLR+hRAMP3; D. R. Poyner, et al, Pharmacological review, 54:233-246, 2002) ou receptor de AMY1 de amilina humana (MCF-7 células hCTR+hRAMP1; Wen-Ji Chen, et al, Molecular pharmacology, 52: 1164-1175, 1997) foram usadas para determinar a seletividade dos anticorpos testados. A linhagem celular HEK 293 expressando AM1 foi gerada como descrito no Exemplo 1, acima. A linhagem celular de CHO expressando AM2 foi comprada de EuroScreen (agora PerkinElmer, Inc.); e a linhagem celular de MCF-7 expressando receptor de AMY1 de amilina humana (Zimmermann, et al, Journal of Endocrinology, 423-431, 1997), foi obtido de ATCC (HTB-22). Exemplos de resultados representados graficamente como descritos acima são mostrados nas Figs. 7B (células hAM1-HEK), 7C (células hAM2-CHO) e 7D (células hAMY-MCF-7). Observe que nenhum dos anticorpos testados apresentou significante atividade inibidora contra receptores de hAM1, hAM2 ou hAMY1 dentre as abrangências testadas.
[463] Experimentos semelhantes foram realizados usando células recombinantes HEK expressando Receptor de CGRPs de cinomolgos e células de rato L6 expressando Receptor de CGRP de rato (ATCC). Os dados desses estudos, bem como dados adicionais de IC50 obtidos como descrito na parte A deste Exemplo são apresentados nas colunas “cAMP” na Tabela 11, abaixo. Observe que os valores de IC50 contra os Receptores de CGRPs humano e cinomolgos estão em uma abrangência nanomolar, enquanto as atividades contra Receptor de CGRP de rato, e receptores humanos de AM1, AM2 e AMY1, bem como células MCF7 expressando calcitonina (dados não mostrados) são todos maiores do que 1 micromolar. A diferença em IC50 entre Receptor de CGRP humano e receptores humanos de AM1, AM2, amilina e calcitonina ilustram a maior seletividade desses anticorpos para o Receptor de CGRP sobre receptores relacionados formados em parte dos mesmos componentes receptores. Os IC50 obtidos usando Receptores de CGRPs humanos e de cinomolgos foram similares, enquanto os anticorpos testados não apresentaram reação cruzada com Receptor de CGRP de rato.
Figure img0048
Figure img0049
EXEMPLO 5 ENSAIO DE LIGAÇÃO DE CGRP DE RADIOLIGANTE PARA DETERMINAÇÃO DE Ki DE ANTICORPOS BLOQUEADORES DE RECEPTOR
[464] CGRP marcado com 125I (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) e membranas celulares de células HTB-10 (PerkinElmer Inc., Waltham, Massachusetts) foram usadas para experimentos de ligação de radioligante na presença de várias concentrações dos anticorpos de testes para determinar os valores de Ki correspondentes. O ensaio de ligação de CGRP foi estabelecido em temperatura ambiente em placas de 96 poços contendo: 110 μl de tampão de ligação (20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 5,0 mM MgSO4, 0,2% BSA (Sigma), 1 tablete de tampão CompleteTM/50 ml (um inibidor de protease)); 20 μl de composto de teste (10X); 20 μl 125I-hαCGRP (Amersham Biosciences; 10X); e 50 μl suspensão de membrana de neuroblastoma de célula humana (HTB-10) (10 μg por poço, PerkinElmer). As placas forma incubadas em temperatura ambiente por 2 horas com agitação em 60 rpm, e então os conteúdos de cada poço foram filtrados sobre placas de filtro de 96 poços GF/C 96 tratadas com polietileneimina 0,5% (PEI) (por pelo menos uma hora). As placas de filtro GF/C foram lavadas seis vezes com Tris 50 mM gelado, pH 7,5 e secas em um forno a 55°C por 1 hora. Os fundos das placas GF/C foram então vedados. 40 μl de MicroscintTM 20 foi adicionado em cada poço, o topo das placas GF/C foi vedado com TopSealTM-A (uma película de vedação adesiva por pressão), e as placas GF/C foram contadas com TopCount NXT (Packard). Os dados foram analisados usando Prizm (GraphPad Software Inc.)
[465] Os dados exemplares e valores de Ki obtidos usando anticorpos 3C8, 12H2 e 1E11 são mostrados na Fig. 8.
[466] A coluna mais superior na Tabela 11, acima, lista os valores de Ki dos mAbs indicados no ensaio de ligação de competição de 125I-CGRP radiomarcado para membranas celulares de HTB-10. Os dados demonstram que os anticorpos de Receptor de CGRP foram altamente competitivos (toda a faixa subnanomolar) contra a ligação de CGRP.
EXEMPLO 6 ENSAIO DE LIGAÇÃO POR FACS PARA DETERMINAÇÃO DE KD DE ANTICORPOS BLOQUEADORES DE RECEPTOR DE CGRP
[467] As afinidades de anti-CGRP R mAbs para Receptor de CGRPs expressos em células foram determinadas usando a método FACS. Resumidamente, células que expressam AM-1 CHO huCGRP R , preparadas como descrito acima, foram colocadas em placas de 96 poços em densidades de 16.000 ou 160.000 células por poço em meio de DMEM contendo FBS 10%, NEAA, PS, L Glut, NaPyr e azida de sódio 0,05%. Os anticorpos de Receptor de CGRP foram titulados no mesmo meio de 50 nM para 1 pM e incubados com células. Depois de uma incubação durante a noite a 4°C em um volume total de 120 μl, em um agitador de placas, as células foram lavadas 2X com PBS+FBS2%, centrifugadas e descartando o sobrenadante a cada momento. 100 μl/ poço de G anti-Hu Fc Cy5 (5μg/mL; Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc., West Grove, PA, USA) contendo 7AAD (5μl/poço) foi então adicionado e incubado a 4°C por 40 min. As células foram lavadas 2X com PBS+2%FBS, centrifugando e descartando o sobrenadante a cada vez. 100 μl PBS+2%FBS de tampão foi então adicionado e analisado por FACS para determinar a média geométrica (geomean) de ligação. O Kd foi calculado usando software KinExA tomando a média geométrica negativa em cada concentração de anticorpo conforme a quantidade de Ab livre presente. Rathanaswami, et al., Biochemical e Biophysical Research Communications 334 (2005) 1004-1013. Os dados obtidos em duas concentrações celulares diferentes data foram analisados por uma análise de curva-n par determinar o Kd e o intervalo de confiança de 95% como descrito em Rathanaswami, et al., Biochemical e Biophysical Research Communications 334 (2005) 1004-1013.
[468] Exemplos de dados com as correspondentes adequações de curvas são apresentados na Fig. 10 para anticorpo 12G8.2. Os dados de oito anticorpos bloqueadores gerados com suporte da presente divulgação estão apresentados na Tabela 12. Um dos anticorpos (3B6) foi analisado em dois dias diferentes. A razão de 0,9 obtida para o experimento com células 16K indica que a concentração de antígeno é prevista em 0,9X o Kd e, portanto, a curva obtida por meio desse experimento é uma curva Kd controlada. Pode ser observado que os valores Kd obtidos dessa forma foram na faixa nanomolar baixa de único dígito para todos os anticorpos testados.
Figure img0050
EXEMPLO 7 LIGAÇÃO DE ANTICORPOS BLOQUEADORES DE RECEPTOR DE CGRP POR COMPETIÇÃO DE LIGAÇÃO EM BIACORE
[469] Análises em Biacore (Karlsson, R. et al, Methods; A Companion to Methods in Enzimology, 6: 99-110 (1994) foram realizadas como segue. A imobilização de anticorpos de receptores anti-CGRP à superfície do chip sensor CM5 foi realizada de acordo com as instruções do fabricante, utilizando um fluxo contínuo de HEPES10mM, NaCl 0,15M, EDTA 3,4mM, P-20 0,005%, pH 7,4 (tampão HBS-EP). Os grupos carboxil na superfície do chip sensor foram ativados pela injeção de 60 μL de uma mistura contendo N-etil- N'(dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC) 0,2 M e N- hidroxisuccinimida (NHS) 0,05 M. As superfícies específicas foram obtidas pela injeção de 180 μL de anticorpos de receptor anti-CGRP diluído em acetato 10 mM, pH 4,0 em uma concentração de 30 μg/mL. O excesso de grupos reativos sobre as superfícies foram desativados pela injeção de 60 μL de etanolamina 1M. Os níveis imobilizados finais para os anticorpos individuais, foram os seguintes: Anticorpo Unidades de Ressonância (RU) 11D11 ~5.900 3B6 ~7.200 4H6 ~8.000 12G8 ~7.800 9F5 ~6.600 34E3 ~3.700
[470] Uma superfície de referência falso-acoplada em branco também foi preparada no chip sensor. O receptor huCGRP solúvel em uma concentração de 100 nM foi capturado em chips sensores tendo um dos seis anticorpos imobilizados referenciados acima (11D11, 3B6, 4H6, 12G8, 9F5 ou 34E3). Cada um dos 20 anticorpos anti-receptor de CGRP de teste foi então injetado sobre o receptor huCGRP capturado. Se o anticorpo injetado reconheceu um epítopo distinto em relação ao reconhecido pelo anticorpo imobilizado, um segundo evento de ligação seria observado. Se os anticorpos reconhecem epítopos iguais ou muito semelhantes, só a ligação do receptor huCGRP seria observada.
[471] Exemplos de dados obtidos usando-se um chip sensor revestido com anticorpo 3B6 imobilizado são mostrados na fig. 9A. Os quatro traços são dados obtidos utilizando anticorpos 1E11, 4E4, 2E7 e 12G8 na solução injetada. Os eventos durante o experimento são representados por letras, com "A" correspondente à injeção de receptor huCGRP-Fc, "B" correspondente ao final da injeção de receptor huCGRP-Fc, "C" correspondente à injeção do segundo mAb, e "D" correspondente ao final de injeção do segundo mAb e início da lavagem de tampão. Note que não há nenhuma indicação de qualquer sinal de ligação de qualquer um dos anticorpos injetados na superfície de anticorpo imobilizado, indicando que os quatro anticorpos injetados aparentemente reconhecem o(s) mesmo(s) epítopo(s) ou epítopo(s) muito semelhante(s), conforme o anticorpo imobilizado. Essencialmente os mesmos resultados foram observados com todos os anticorpos bloqueadores testados, lavados em cada uma das cinco superfícies de anticorpos de neutralização imobilizados, indicando que todos os anticorpos bloqueadores de receptores anti-huCGRP testados reconhecem o(s) mesmo(s) epítopo(s) ou epítopo(s) muito semelhante(s) e fortemente sobreposto(s).
[472] Em contraste, como mostrado em parte nas Figs. 9B, 9C e 9D, os quatro anticorpos específicos de receptor de CGRP não bloqueadores testados, 32H8, 33B5, 33E4 e 34E3 não conseguiram competir com 11D11 (dados não mostrados), 3B6 (Fig. 9B), 12G8 (Fig. 9C) e 9F5 (dados não mostrados), embora 34E3 tenha sido capaz de competir com 4H6 (Fig. 9D) e fracamente com 32H7 (dados não mostrados). O 32H8 não conseguiu competir com 3B6, 4H6, 12G8, 9F5 ou o anticorpo não bloqueador 34E3, mas 33B5 e 33E4 puderam competir com o anticorpo não bloqueador 34E3. Os dados de todos os anticorpos bloqueadores e não bloqueadores são resumidos na Tabela 13, abaixo. "NL" indica que não há ligação; "+" indica ligação significante, e "Fraco" indica ligação fraca.
Figure img0051
[473] Como pode ser avaliado a partir dos dados, todos os anticorpos bloqueadores ou neutralizantes testados ligam à mesma região como os cinco anticorpos bloqueadores imobilizados, ou seja, todos os anticorpos de neutralização testados ligam-se à mesma região da molécula do receptor de CGRP. Por outro lado, os anticorpos não bloqueadores em geral não competem com os anticorpos bloqueadores imobilizados, indicando que os anticorpos não bloqueadores ligam-se principalmente a uma região diferente do receptor de CGRP.
EXEMPLO 8 LIGAÇÃO DE ANTICORPOS DO RECEPTOR DE CGRP AO RECEPTOR DE CGRP SOLÚVEL EM WESTERN BLOT
[474] Três anticorpos bloqueadores de receptor de CGRP representantes foram testados utilizando Western blots para ligação a uma proteína de fusão muFc- receptor de CGRP solúvel.
[475] 100ng de receptor de CGRP-muFc purificado (produzido e purificado como descrito acima, para o receptor de CGRP-huFc, exceto o Fc do camundongo foi usado e o ligante entre RAMP1 ou CRLR ECD e muFC foi mudado para "GGGGGVDGGGGGV" (SEQ ID N°: 213)), foi diluído em PBS com tampão de amostra de PAGE com (reduzido) ou sem (não reduzido) beta-mercaptoetanol (βME) na concentração de 13,3%. A amostra contendo βME foi então fervida por 4 min. As amostras reduzidas e não reduzidas foram carregadas em géis Tris-glicina 4-20% (Invitrogen) separados, com alternância de faixas de proteínas Fc- receptor de CGRP e marcadores de peso molecular (Invitrogen). Os géis foram submetidos ao processo de transferência de proteínas para membrana de nitrocelulose (eletroblotting) em filtros de nitrocelulose 0,2 μm (Invitrogen). As manchas (blots) foram lavadas com salina Tris-tamponada + 1% de Tween 20 (TBST) e, em seguida, bloqueadas com TBST + 5% de leite em pó seco por 30min. As manchas (blots) foram cortadas em tiras ao longo das faixas de marcador de peso molecular. Uma tira de cada com receptor de CGRP-muFc reduzido e não reduzido foi incubada com anticorpos de receptor huCGRP purificados 4E4, 9F5, ou 3B6 (diluição de 1:500 em TBST + 5% de leite), anti- huRAMP1 N-20 de cabra (1:500 ; Santa Cruz Biotechnology, Inc), anti- IgG-Fc-HRP de camundongo de coelho (1:10.000) (Pierce), ou anti- IgG-Fc-HRP humana de cabra (1:10.000) (Pierce). As manchas foram incubadas com os anticorpos por uma hora, seguido de lavagens de 3x10min com TBST + 1% de leite. As manchas tratadas com os anticorpos de receptor huCGRP foram então incubadas com anti- IgG-Fc-HRP de camundongo de cabra (1:10.000 em TBST + 1% de leite) e as manchas tratadas com anti-huRAMP1 (anticorpo policlonal de cabra anti-RAMP1 N-20, Santa Cruz Biotech, CA) foram incubadas com anti- IgG-Fc-HRP de cabra de coelho (1:10.000) por 20min. As manchas foram lavadas 3x15min com TBST. As manchas de anticorpo de receptor huCGRP e de anti-huRAMP1 foram tratadas com o reagente de detecção Pierce Supersignal West Pico, e as manchas de anti- IgG-Fc-HRP humana e anti- camundongo foram tratadas com reagente de detecção padrão Pierce (1 min.). As manchas foram expostas com filme Kodak Biomax MS X-ray.
[476] Todos os três anticorpos de receptores de CGRP, 4E4, 9F5 e 3B6 foram capazes de detectar o receptor de CGRP- muFc solúvel (contendo RAMP1-ECD e CRLR ECD) sob condição não reduzida, mas não sob condição reduzida, indicando que o epítopo de ligação desses anticorpos de receptor de CGRP foi conformacional e sensível às ligações dissulfeto (3 pares em RAMP1-ECD e 3 pares em CRLR N-ter ECD). Em contraste, o anticorpo anti-RAMP1 N-20 comercial (Santa Cruz Biotech) ligou RAMP1 sob ambas condições reduzidas e não reduzidas, indicando que o sítio de ligação para anticorpo N-20 foi principalmente linear e não sensível a ligações dissulfeto.
EXEMPLO 9 LIGAÇÃO DE ANTICORPOS BLOQUEADORES DE RECEPTOR DE CGRP À RECEPTORES QUIMÉRICOS
[477] Os receptores de CGRP formados de qualquer RAMP1 nativo com CRLR quimérico, ou CRLR nativo com RAMP1 quimérico foram usados para identificar sequências de receptores de CGRP envolvidas na ligação do anticorpo. Como todos os anticorpos bloqueadores de receptor de CGRP humano testados não apresentaram atividade funcional ao receptor de CGRP de camundongo, os componentes quiméricos continham regiões de sequência de camundongo em um fundo de sequência humana. As seguintes quimeras foram geradas para a análise de ligação por FACS: 1. Quimera de RAMP1 # 1 (Q28 a A34); SEQ ID N°: 217
[478] Resíduos de aminoácidos Q28 a A34 na RAMP1 humana foram substituídos com as sequências correspondentes de RAMP1 de camundongo. Este trecho incluiu cinco resíduos de aminoácidos que são diferentes entre a RAMP1 humana e de camundongo. Quimera de RAMP1 # 2 (Q43 a E53); SEQ ID N°: 218
[479] Resíduos de aminoácidos Q43 a E53 na RAMP1 humana foram substituídos com as sequências correspondentes de RAMP1 de camundongo. Este trecho incluiu seis resíduos de aminoácidos que são diferentes entre RAMP1 humana e de camundongo. Quimera de RAMP1 # 3 (R67 a E78); SEQ ID N°: 219
[480] Resíduos de aminoácidos R67 a E78 na RAMP1 humana foram substituídos com as sequências correspondentes de RAMP1 de camundongo. Este trecho incluiu sete resíduos de aminoácidos que são diferentes entre a RAMP1 humana e a de camundongo. Quimera de CRLR # 1 (L24 a Q33); SEQ ID N°: 223
[481] Resíduos de aminoácidos L24 a Q33 no CRLR humano foram substituídos com as sequências correspondentes de CRLR de camundongo. Este trecho incluiu oito resíduos de aminoácidos que são diferentes entre o CRLR humano e o de camundongo.
[482] A Fig. 11 mostra um alinhamento de sequências de aminoácidos RAMP1 de macaco cinomolgos (SEQ ID N°: 215), humano (SEQ ID N°: 4), rato (SEQ ID N°: 214) e do macaco rhesus (SEQ ID N°: 216), juntamente com sequências de quimera de RAMP1 # 1 (SEQ ID N°: 217), quimera # 2 (SEQ ID N°: 218) e quimera # 3 (SEQ ID N°: 219). As Figs. 12A e 12B mostram um alinhamento de sequência de aminoácido de CRLR humano (SEQ ID N°: 2), macaco cinomolgos (SEQ ID N°: 221), macaco rhesus (SEQ ID N°: 222), rato (SEQ ID N°: 220) e, bem como a sequência de aminoácidos de quimera de CRLR # 1 (SEQ ID N°: 223).
[483] As células 293-6E foram transitoriamente transfectadas com construtos de DNA de quimera de receptor de CGRP (CRLR wt + RAMP1 Q28-A34; CRLR wt + RAMP1 P43-E53; CRLR wt + RAMP1 R67-E78; CRLR L24-Q33 + RAMP wt; CRLR wt + RAMP1 wt; controle de vetor pTT5). As células foram colhidas após 72h, lavadas com PBS + BSA 0,5%, e contadas. Cada linhagem de células transfectadas foi ressuspensa em uma diluição de 5x105 células por 100μl de PBS / BSA. 100μl da suspensão celular foi a alíquota por poço em uma placa de 96 poços de fundo redondo (Falcon). As células foram peletizadas a 1200 rpm por 5 min. O sobrenadante foi removido e substituído por 100μl contendo 0,5μg de anticorpos de receptor huCGRP purificados 1H7, 2E7, 3B6, 9F5, 4H6, 12G8, 3C8, 10E4, 11D11, 32H8, ou 33B5. Os poços controle foram tratados com anti-DNP huIgG2 (0.5μg), peptídeo Alexa647-CGRP (0,5μg), ou PBS / BSA sozinho. As células foram incubadas em gelo por 1 hora e, em seguida, lavadas duas vezes com PBS / BSA. As células foram ressuspensas em 100μl/poço de PBS / BSA contendo anti-hug-Fc-FITC (0.5μg) (exceto para células tratadas Alexa647-CGRP). As células foram incubadas no gelo no escuro por 1hr e, em seguida, lavadas duas vezes com PBS / BSA. As células foram ressuspensas em 200μl de PBS / BSA e analisadas utilizando um FACS Calibur.
[484] Dez anticorpos de bloqueio representantes (3B6, 9F5, 4H6, 12G8, 3C8, 10E4, 32H7, 4E4, 11D11 e 1H7) e dois anticorpos não bloqueadores (32H8 e 33B5) foram testados. Dados representativos (anticorpo 9F5) são mostrados nas Figs. 13A, 13B e 13C. A Fig. 13A mostra ligação ao receptor de CGRP do tipo selvagem; a Fig. 13B mostra a ligação aos receptores de CGRP contendo a quimera de CRLR L24-Q33, e a Fig. 13C mostra a ligação aos receptores de CGRP contendo quimera de RAMP1 Q28-A34. A análise FACS mostrou que todos os 12 anticorpos ligam o receptor de CGRP humano do tipo selvagem controle como esperado. Todos os 12 anticorpos mostraram uma redução significativa de ligação com qualquer um dos três RAMP1 (Q28-A34) quimera de RAMP1, (Q43-E53) e (R67 - E78). Isto poderia resultar de (1) o nível de expressão do receptor de quimera foi muito mais baixo, (2) a quimera de RAMP1 prejudicou o cruzamento com CRLR humano e alterou a conformação do complexo receptor, e/ou (3) estas três regiões selecionadas em RAMP1 estão diretamente envolvidas na ligação destes anticorpos ao receptor de CGRP.
[485] Quando o traçado FACS foi controlado para incluir apenas as populações de células "de expressão" muito pequenas, os anticorpos não bloqueadores 33B5 e 32H8 apareceram de forma consistente ligando menos poços (menor Geo- Meios) à quimera de RAMP1 Q43-E53, em comparação com os anticorpos bloqueadores , sugerindo que a ligação com a região de RAMP1 Q43-E53 pode ser mais importante para os anticorpos não bloqueadores. Por outro lado, 33B5 e 32H8 ligam-se consistentemente melhor à quimera de RAMP1 R67-E78 do que os anticorpos bloqueadores, o que sugere que a sequência de RAMP1 R67-E78 pode ser mais importante para os anticorpos bloqueadores.
[486] Todos os anticorpos de receptores de CGRP testados ligaram razoavelmente bem à quimera CRLR (L24-Q33), sugerindo que este sítio não é essencial para a ligação de anticorpos bloqueadores.
[487] Em resumo, os dados mostram que três regiões descontínuas na RAMP1 - (Q28-A34), (Q43 - E53) e (R67-E78) - poderiam ser envolvidas em ligação de anticorpo de receptor de CGRP, com (R67-E78) mais importante aos anticorpos bloqueadores. As sequências N-terminal (L24-Q33) de CRLR não pareceram ser criticamente envolvidas na ligação aos anticorpos de receptor de CGRP como analisado por este método. Esta abordagem não exclui sítios de ligação adicionais que compartilham sequências idênticas ou semelhantes entre os receptores de CGRP humanos e os de ratos que não foram alvo da análise.
EXEMPLO 10 IDENTIFICAÇÃO DE EPÍTOPOS DE RECEPTOR DE CGRP HUMANO PARA ANTICORPOS DE NEUTRALIZAÇÃO ANTI- RECEPTOR DE CGRP PELO ENSAIO DE PROTEÇÃO DE PROTEASE
[488] A porção de CRLR na forma madura da molécula de fusão CRLR-Fc (com peptídeo sinal removido; divulgada aqui como SEQ ID N°: 10) contém 116 aminoácidos (anterior ao ligante de glicina), e tem três grandes estruturas de laço (loop) criadas pela formação de três ligações de dissulfeto. As três ligações de dissulfeto no CRLR são Cis1 na posição de sequência 26 (todas as posições de sequência de CRLR listadas neste parágrafo são com relação à sequência madura apresentada como SEQ ID N°: 10) ligada à Cis3 na posição de sequência 52 (referida como CRLR C1- C3), Cis2 na posição de sequência 43 ligada à Cis5 na posição de sequência 83 (referida como C2-C5 CRLR), Cis4 na posição de sequência 66 ligada à Cis6 na posição de sequência 105 (referida como CRLR C4-C6). A porção de RAMP1 na forma madura de molécula de fusão RAMP1-Fc contém 91 aminoácidos (SEQ ID N°: 11) que precede o ligante de glicina, que também forma três ligações dissulfeto intramoleculares. As três ligações dissulfeto em RAMP1 são Cis1 na posição de sequência 1 (todas as posições de sequência RAMP1 listadas neste parágrafo são com relação à sequência madura apresentada como SEQ ID N°: 11) ligada à Cis5 na posição de sequência 56 (referida como RAMP1 C1C5), Cis2 na posição de sequência 14 ligada à Cis4 na posição de sequência 46 (referida como RAMP1 C2-C4), Cis3 na posição de sequência 31 ligada à Cis6 na posição de sequência 78 (referida como RAMP1 C3-C6).
[489] Regiões da proteína do receptor de CGRP humano ligadas por anticorpos monoclonais de neutralização anti- CGRP foram identificadas fragmentando o receptor h CGRP em peptídeos com proteases específicas, e determinando a sequência dos peptídeos de receptor de CGRP h resultantes (ou seja, tanto fragmentos de peptídeos contendo dissulfeto e não dissulfeto para porções de CRLR e RAMP1). Um ensaio de proteção de protease foi então realizado para determinar a digestão proteolítica do receptor hCGRP na presença de anticorpos monoclonais de ligação. O princípio geral deste ensaio é que a ligação de um mAb ao receptor de CGRP pode resultar na proteção de certos sítios específicos de clivagem da protease e esta informação pode ser usada para determinar a região ou porção de receptor de CGRP onde o mAb se liga.
[490] Resumidamente, os digestos de peptídeo foram submetidos a mapeamento de peptídeos em HPLC; os picos individuais foram coletados, e os peptídeos identificados e mapeados pela análise de ionização por eletrospray LC-MS (ESI-LC-MS) on-line, e/ou por sequenciamento N-terminal. Todas as análises de HPLC para estes estudos foram realizadas usando uma coluna C18 de fase reversa calibre estreito (2,1 mm de diâmetro x 15 cm de comprimento; Zorbax 300SB, 5 μm, Agilent Technologies) para análise off-line, e usando uma coluna de fase reversa C18 capilar (0,5 mm de diâmetro x 25 cm Vydac C18 MS, 5 μm; The Separation Group) para LC-MS. O mapeamento peptídico em HPLC foi realizado com um gradiente linear de ácido trifluoroacético 0,05% (fase móvel A) acetonitrila 90% em ácido trifluoroacético 0,05%. As colunas foram desenvolvidas por mais de 90 minutos a uma vazão de 0,25 ml/min para o HPLC de calibre estreito, para análises LC-MS off-line ou on-line, e 0,018 ml/min para HPLC capilar para análises LC-MS on-line.
[491] A forma madura do receptor de CGRP humano foi digerido com AspN (que cliva após o ácido aspártico e alguns resíduos de ácido glutâmico no terminal amino), incubando cerca de 100 μg de receptor de CGRP em 1,0 mg/ml em fosfato de sódio 0,1 M (pH 6,5) por 20 horas a 37°C com 2 μg de AspN.
[492] A cromatografia de HPLC do digesto de AspN gerou um perfil de peptídeo como mostrado na figura 14 (cada 30μg de amostra injetada), cromatograma classificado como A para receptor de CGRP sozinho (concentração de 1 mg/ml), enquanto a digestão de controle com uma quantidade similar de anticorpos de neutralização de receptor de CGRP, clone 12G8, mostra que o anticorpo é essencialmente resistente a endoproteinase AspN (cromatograma classificado como B; receptor de CGRP: taxa de anticorpos, 100:2; 100:7, 100:20 peso por peso, respectivamente). As Análises de sequência foram realizadas por LC-MS/MS on-line e por sequenciamento de Edman nos picos de peptídeo recuperado do HPLC. As análises ESI LC-MS on-line do digesto de peptídeo foram realizadas para determinar a massa exata e a sequência dos peptídeos que foram separados por HPLC. As identidades de vários peptídeos presentes nos picos de peptídeo a partir da digestão de AspN foram assim determinadas (indicado como picos numerados na figura 14). A tabela 14, abaixo, mostra a localização dessas sequências de peptídeos no componente correspondente (CRLR ou RAMP1) do receptor hCGRP. Uma letra maiúscula C seguida por um número ou X representa um peptídeo identificado como um peptídeo de CRLR; uma letra maiúscula R seguida por um número ou X é um peptídeo RAMP1 e "Fc" representa o grande fragmento Fc não digerido liberado das moléculas de fusão CRLR-Fc e RAMP1-Fc. Tabela 14 Peptídeos de CRLR e RAMP1 identificados pelo mapeamento de peptídeo de digestão de AspN de receptor de CGRP.
Figure img0052
[493] A Fig. 15 mostra uma comparação de um experimento de digestão de AspN (cada 30μg de amostra injetada), com receptor de CGRP individualmente (cromatograma rotulados A) com um realizado na presença de anticorpos de neutralização 12G8 (cromatograma classificado como B). A taxa de peso de receptor de CGRP:anticorpo foi de 1:1. Vários picos (C5, C6 e C7) mostram uma diminuição na altura do pico no cromatograma B em relação ao cromatograma A, enquanto dois outros picos (C-X e R-X) mostram um aumento da altura do pico no cromatograma B em relação ao cromatograma A. Um padrão de mapa de peptídeo semelhante também foi observado se um anticorpo anti-receptor de CGRP neutralizante diferente (10E4, 3B6, 3C8 ou 4E4) em uma quantidade semelhante estava presente na amostra de digestão, como visto no cromatograma classificado como C. Ambos C6 e C7 são peptídeos ligados a dissulfeto, que cobrem a porção principal da molécula CRLR enquanto C5 é um peptídeo contendo não dissulfeto de CRLR que reside no final N- terminal da molécula e é penúltimo ao peptídeo de dissulfeto C7. O Pico C-X contém três ligações dissulfeto de CRLR com várias sequências, indicando que pelo menos dois a três peptídeos estão ligados entre si por pontes de dissulfeto. O fato de que o pico C-X aumentou a altura do pico no digesto de receptor de CGRP na presença de anticorpos de neutralização de CGRP indica que o anticorpo protegeu o receptor de CGRP da digestão de AspN em diversos sítios de clivagem relacionados ao Glu25 e ao Asp55. O anticorpo não parece ter um efeito protetor significativo na Asp33 e Asp72 como a intensidade do pico para os peptídeos C2 e C4 não diminuiu ao todo. Portanto, o anticorpo parece se ligar a uma região do CRLR que inclui a região de dissulfeto CRLR C1-C3 e CRLR C4-C6 juntamente com a região de laço (loop) entre Cis53 e Cis66.
[494] O mapeamento AspN do receptor hCGRP também identificou um peptídeo de dissulfeto de RAMP1 (R2) e um peptídeo de não dissulfeto RAMP1 (R1) (ver Tabela 14 e Figura 14). Na presença de qualquer um dos anticorpos de neutralização mencionados acima (12G8, 10E4, 4E4, 3B6 ou 3C8), o peptídeo R-X foi recuperado em uma intensidade de pico significativamente maior do que o que foi obtido a partir da digestão sem anticorpos na amostra. As análises de massa e sequência mostraram que R-x contém uma única cadeia polipeptídica correspondente à sequência de RAMP1 entre Cis1 e Arg86. Estes experimentos indicam que o anticorpo neutralizante de receptor de CGRP pode proteger uma região significativa de RAMP1 a partir de digestão proteolítica de AspN.
[495] Para avaliar se o efeito protetor da proteólise AspN de receptor de CGRP é específica para anticorpos de neutralização (bloqueador) de receptor de CGRP (em comparação com anticorpos não neutralizantes anti-receptor de CGRP), uma digestão de AspN de receptor de CGRP foi realizada na presença de um anticorpo monoclonal de controle não relacionado que não neutraliza a atividade de receptor de CGRP. Os resultados são mostrados na fig. 15 no cromatograma D. O anticorpo não neutralizante não mostra qualquer efeito bloqueador significativo na proteólise de AspN de receptor de CGRP; na verdade, o perfil de mapa de peptídeo (cromatograma D) é quase indistinguível nos aspectos relevantes ao perfil derivado da digestão de receptor de CGRP sozinho (cromatograma A).
[496] O efeito de proteção de proteólise foi dependente da concentração adicionada à amostra de digestão. Como pode ser visto na fig. 16, uma quantidade fixa de receptor de CGRP na amostra (100μg), com quantidades variáveis de anticorpo neutralizante anti- receptor de CGRP 4E4 (receptor de CGRP: taxa de anticorpo em microgramas, 100:2; 100:7, 100:20, peso por peso, respectivamente) foi realizada para a proteólise de Aspen. O perfil de proteção pode ser observado e a proteção é dependente da concentração de anticorpo.
[497] Em conjunto, estes dados demonstram que os anticorpos anti-receptor de CGRP neutralizantes ou bloqueadores divulgados neste documento podem bloquear o receptor de CGRP (em ambos componentes CRLR e RAMP1) a partir de proteólise de AspN, sugerindo que os anticorpos bloqueadores ligam-se a ambos CRLR e RAMP1 quando estes anticorpos ligam-se ao receptor de CGRP. Além disso, o efeito de proteção é dependente da concentração de anticorpo. Estes resultados também indicam que os anticorpos de neutralização de receptor de CGRP ligam-se a regiões comuns no receptor de CGRP humano que estão próximos aos sítios de clivagem AspN.
EXEMPLO 11 ANTICORPOS ANTI- RAMP1 E ANTI- CRLR COMERCIALMENTE DISPONÍVEIS EM UM ENSAIO FUNCIONAL DE cAMP.
[498] Anticorpos disponíveis comercialmente direcionados contra um ou outros componentes (RAMP1 ou CRLR) do receptor de CGRP humano foram testados no ensaio de cAMP mediado pelo receptor de CGRP usando células HTB-10, como descrito no Exemplo 4, acima, para determinar se os anticorpos têm atividade biológica. Os dados são apresentados na Tabela 15, abaixo. Os anticorpos não tiveram nenhuma atividade biológica detectável ("ND"), muito fraca ("MF") ou fraca ("F") ao longo de uma faixa de concentração, onde os anticorpos exemplares divulgados neste documento tiveram forte atividade biológica. Tabela 15 A atividade de anticorpos comercialmente disponíveis
Figure img0053
Figure img0054
EXEMPLO 12 COLORAÇÃO IMUNOHISTOQUÍMICA DE CÉLULAS QUE EXPRESSAM DIFERENTES COMPONENTES DE RECEPTOR
[499] 2-4x106 células foram injetadas por meio de colla plug (Integra LifeSciences Co., Plainsboro, NJ). Colla plugs foram incluídos em meio OCT (Sakura Finetek Inc., Torrance, CA), congelados a -20°C e cortados em seções de 20μm utilizando um criostato. As seções foram fixadas com paraformaldeído 4% por 1 hora à temperatura ambiente (RT) e, posteriormente, lavadas em tampão fosfato (PBS). A peroxidase endógena foi bloqueada com H2O2/PBS 3% por 15 min e as seções foram incubadas em solução bloqueadora (PBS com 3% de soro normal de cabra (Vector Labs, Burlingame, CA) e 0,3% triton X-100) por 1 hora. Posteriormente, as seções foram incubadas em anticorpo primário anti-receptor de CGRP humano (32H7, 0,03-0,1 μg/ml) a 4°C durante a noite, lavado em PBS e incubado em anticorpo secundário (fragmento Fc anti- IgG humana de cabra biotinilado, 1:800, Jackson Immunoresearch, West Grove, PA) em 1% de soro normal de cabra/PBS por 1 hora em temperatura ambiente. A imunorreatividade foi amplificada utilizando o Kit Vector Elite de acordo com as instruções do fabricante (Vector Labs, Burlingame, CA) e a coloração foi desenvolvida utilizando 3,3 '-diaminobenzidina-níquel como cromógeno (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). As seções foram clareadas com xileno e cobertas com uma lâmina com Permount (Fisher Chemicals, Fair Lawn, NJ). A imunorreatividade foi analisada usando um microscópio Nikon E-800 e software associado (Nikon, Melville, NY).
[500] Dados de células que expressam diferentes componentes de receptores (como identificado abaixo) usando anticorpo 32H7, como descrito acima revelou coloração acentuada de células CHO expressando receptor de CGR humano recombinante (CRLR + RAMP1; ‘’células CHO / receptor de CGRP") e coloração mais fraca de células SK-N-MC que expressam receptores de CGRP endogenamente (devido a densidade do receptor bem menor). Coloração não foi observada na linhagem de células parentes CHO, as células CHO expressando uma proteína recombinante não relacionada (TRPM8), células CHO/receptor de CGRP após pré-absorção com o antígeno correspondente 32H7, células CHO expressando receptor adrenomedulina humana recombinante 2 (CRLR + RAMP3), células MCF -7 expressando receptores de amilina endogenamente, células HEK expressando receptor de adrenomedulina humana recombinante 1 (CRLR + RAMP2), ou as células HEK parentes. Os dados desses experimentos estão resumidos na Tabela 16, abaixo. Tabela 16 Intensidade de coloração imunohistoquímica de células indicadas
Figure img0055
[501] Todas as patentes e outras publicações identificadas são expressamente incorporadas aqui por referência com o objetivo de descrever e divulgar, por exemplo, as metodologias descritas em tais publicações que podem ser usadas em conexão com a matéria revelada aqui. Estas publicações são fornecidas unicamente para a sua divulgação antes da data do depósito do presente pedido. Nada a esse respeito deve ser interpretado como uma admissão de que os inventores não possuem o direito de anteceder tal divulgação em virtude de invenção anterior, ou por qualquer outro motivo. Todas as declarações quanto à data ou representação quanto ao conteúdo destes documentos é baseado nas informações disponíveis aos requerentes e não constituem qualquer admissão quanto à exatidão dos dados ou conteúdos desses documentos.

Claims (9)

1. Uso da proteína de ligação a antígeno isolada que se liga especificamente ao receptor do peptídeo relacionado ao gene da calcitonina (CGRP) humano, caracterizado por ser na preparação de uma composição farmacêutica para tratar uma condição associada a receptor CGRP em um paciente, em que a proteína de ligação a antígeno isolada é um anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, e em que o anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende (i) uma região variável da cadeia pesada compreendendo as regiões determinantes de complementaridade CDRH1, CDRH2 e CDRH3, e (ii) uma região variável da cadeia leve compreendendo as regiões determinantes da complementaridade CDRL1, CDRL2 e CDRL3, em que CDRH1, CDRH2 e CDRH3 têm a sequência de SEQ ID NOs: 73, 74 e 75, respectivamente, e CDRL1, CDRL2 e CDRL3 têm a sequência de SEQ ID NOs: 42, 43 e 44, respectivamente.
2. Uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o anticorpo monoclonal isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma região variável de cadeia leve (VL) que compreende a sequência de SEQ ID NO: 142 e uma região variável de cadeia pesada (VH) que compreende a sequência de SEQ ID NO: 158.
3. Uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o anticorpo monoclonal isolado compreende uma cadeia leve compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 17 menos qualquer sequência de sinal e uma cadeia pesada compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 29 menos qualquer sequência de sinal.
4. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o anticorpo monoclonal isolado é selecionado a partir do grupo que consiste em um anticorpo totalmente humano, um anticorpo humanizado e um anticorpo quimérico.
5. Uso, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o anticorpo monoclonal é um anticorpo do tipo IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4.
6. Uso, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o anticorpo monoclonal é um anticorpo IgG1 ou IgG2.
7. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que a condição é dor de cabeça.
8. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que a condição é enxaqueca.
9. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que o tratamento compreende tratamento profilático.
BR122020010360-4A 2008-12-23 2009-12-18 Uso da proteína de ligação a antígeno isolada que se liga especificamente ao receptor do peptídeo relacionado ao gene da calcitonina humano BR122020010360B1 (pt)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US20356908P 2008-12-23 2008-12-23
US61/203,569 2008-12-23
US26462209P 2009-11-25 2009-11-25
US61/264,622 2009-11-25
PCT/US2009/068858 WO2010075238A1 (en) 2008-12-23 2009-12-18 Human cgrp receptor binding proteins

Publications (1)

Publication Number Publication Date
BR122020010360B1 true BR122020010360B1 (pt) 2022-08-16

Family

ID=41718325

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
BRPI0922505-6A BRPI0922505B1 (pt) 2008-12-23 2009-12-18 Anticorpo monoclonal isolado ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que inibe seletivamente o receptor do peptídeo relacionado ao gene da calcitonina (cgrp) humano, polinucleotídeo isolado que codifica o referido anticorpo,vetor de expressão, método para fazer o referido anticorpo e composição farmacêutica
BR122020010360-4A BR122020010360B1 (pt) 2008-12-23 2009-12-18 Uso da proteína de ligação a antígeno isolada que se liga especificamente ao receptor do peptídeo relacionado ao gene da calcitonina humano

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
BRPI0922505-6A BRPI0922505B1 (pt) 2008-12-23 2009-12-18 Anticorpo monoclonal isolado ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que inibe seletivamente o receptor do peptídeo relacionado ao gene da calcitonina (cgrp) humano, polinucleotídeo isolado que codifica o referido anticorpo,vetor de expressão, método para fazer o referido anticorpo e composição farmacêutica

Country Status (40)

Country Link
US (5) US9102731B2 (pt)
EP (3) EP2379594B8 (pt)
JP (6) JP5761805B2 (pt)
KR (4) KR20190054181A (pt)
CN (2) CN102348722B (pt)
AR (1) AR074857A1 (pt)
AU (2) AU2009330175C1 (pt)
BR (2) BRPI0922505B1 (pt)
CA (1) CA2746858C (pt)
CL (1) CL2011001578A1 (pt)
CO (1) CO6400232A2 (pt)
CR (1) CR20110400A (pt)
CY (3) CY1119465T1 (pt)
DK (2) DK3184546T3 (pt)
EA (2) EA201891500A3 (pt)
ES (2) ES2746571T3 (pt)
HR (2) HRP20171690T1 (pt)
HU (3) HUE034506T2 (pt)
IL (2) IL213429A (pt)
JO (2) JO3382B1 (pt)
LT (3) LT3184546T (pt)
LU (1) LUC00095I2 (pt)
MA (1) MA32982B1 (pt)
ME (1) ME03601B (pt)
MX (1) MX2011006804A (pt)
MY (1) MY180564A (pt)
NL (1) NL300961I2 (pt)
NO (2) NO2379594T3 (pt)
NZ (2) NZ606090A (pt)
PE (1) PE20120427A1 (pt)
PL (2) PL2379594T3 (pt)
PT (2) PT2379594T (pt)
RS (2) RS56567B1 (pt)
SG (2) SG10201401879TA (pt)
SI (2) SI2379594T1 (pt)
TN (1) TN2011000283A1 (pt)
TW (4) TW202241950A (pt)
UA (1) UA108066C2 (pt)
WO (1) WO2010075238A1 (pt)
ZA (1) ZA201105418B (pt)

Families Citing this family (110)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2433251T5 (es) 2005-11-14 2020-03-13 Teva Pharmaceuticals Int Gmbh Anticuerpos antagonistas dirigidos contra un péptido relacionado con el gen de la calcitonina y procedimientos que utilizan los mismos
WO2009070243A2 (en) * 2007-11-21 2009-06-04 Amgen Inc. Wise binding agents and epitopes
RU2522493C2 (ru) 2008-03-04 2014-07-20 Пфайзер Лимитед Способы лечения хронической боли
KR101519192B1 (ko) 2009-08-28 2015-05-11 리나트 뉴로사이언스 코프. 칼시토닌 유전자-관련된 펩티드에 대해 지시된 길항제 항체의 투여에 의한 내장 통증의 치료 방법
TWI646111B (zh) 2011-05-20 2019-01-01 艾爾德生物控股有限責任公司 抗降血鈣素基因相關胜肽（ａｎｔｉ－ｃｇｒｐ）組成物及其用途
AU2012258980B8 (en) 2011-05-20 2017-06-15 H. Lundbeck A/S Use of anti-CGRP antibodies and antibody fragments to prevent or inhibit photophobia or light aversion in subjects in need thereof, especially migraine sufferers
US9855332B2 (en) 2011-05-20 2018-01-02 Alderbio Holdings Llc Use of anti-CGRP antibodies and antibody fragments to treat diarrhea in subjects with diseases or treatments that result in elevated CGRP levels
CA2904722C (en) * 2013-03-15 2023-01-03 Amgen Inc. Methods and compositions relating to anti-ccr7 antigen binding proteins
SG11201507416WA (en) 2013-03-15 2015-10-29 Amgen Inc Human pac1 antibodies
KR102160389B1 (ko) 2013-08-05 2020-09-28 트위스트 바이오사이언스 코포레이션 드 노보 합성된 유전자 라이브러리
EP3501575B1 (en) 2013-10-24 2021-12-01 Amgen Inc. Drug delivery system with temperature-sensitive-control
BR112016008946B1 (pt) 2013-10-24 2022-12-27 Amgen Inc Injetores e método para montar os injetor
WO2015119906A1 (en) 2014-02-05 2015-08-13 Amgen Inc. Drug delivery system with electromagnetic field generator
MX2016012188A (es) 2014-03-21 2017-04-27 Teva Pharmaceuticals Int Gmbh Anticuerpos antagonistas dirigidos contra el peptido relacionado con el gen de calcitonina y metodos que usan los mismos.
US10556945B2 (en) 2014-03-21 2020-02-11 Teva Pharmaceuticals International Gmbh Antagonist antibodies directed against calcitonin gene-related peptide and methods using same
EP3139977B1 (en) 2014-05-07 2021-02-17 Amgen Inc. Autoinjector with shock reducing elements
SG11201609966SA (en) 2014-06-03 2016-12-29 Amgen Inc Drug delivery system and method of use
UY36302A (es) 2014-09-15 2016-04-29 Amgen Inc Proteína de unión a antígenos, bi-específicos del receptor anti-cgrp/receptor pac1 y usos de las mismas
MX2021014323A (es) 2014-10-14 2023-02-02 Amgen Inc Dispositivo de inyección de fármaco con indicadores visuales y audibles.
EP3689394A1 (en) 2014-12-19 2020-08-05 Amgen Inc. Drug delivery device with live button or user interface field
EP3848072A1 (en) 2014-12-19 2021-07-14 Amgen Inc. Drug delivery device with proximity sensor
AU2016206457B2 (en) 2015-01-16 2021-11-11 Juno Therapeutics, Inc. Antibodies and chimeric antigen receptors specific for ROR1
WO2016126882A1 (en) 2015-02-04 2016-08-11 Twist Bioscience Corporation Methods and devices for de novo oligonucleic acid assembly
EP3556411B1 (en) 2015-02-17 2021-06-30 Amgen Inc. Drug delivery device with vacuum assisted securement and/or feedback
EP3261690B1 (en) 2015-02-27 2021-12-15 Amgen Inc. Drug delivery device having a needle guard mechanism with a tunable threshold of resistance to needle guard movement
US9981239B2 (en) 2015-04-21 2018-05-29 Twist Bioscience Corporation Devices and methods for oligonucleic acid library synthesis
JOP20200116A1 (ar) * 2015-04-24 2017-06-16 Amgen Inc طرق لعلاج أو الوقاية من الصداع النصفي
US10464983B2 (en) 2015-05-13 2019-11-05 The Board Of Regents Of The University Of Oklahoma Variants of adrenomedullin and calcitonin gene-related peptide and methods of use
WO2017039786A1 (en) 2015-09-02 2017-03-09 Amgen Inc. Syringe assembly adapter for a syringe
EP3350314A4 (en) 2015-09-18 2019-02-06 Twist Bioscience Corporation BANKS OF OLIGONUCLEIC ACID VARIANTS AND SYNTHESIS THEREOF
KR20180058772A (ko) 2015-09-22 2018-06-01 트위스트 바이오사이언스 코포레이션 핵산 합성을 위한 가요성 기판
US11351308B2 (en) 2015-12-09 2022-06-07 Amgen Inc. Auto-injector with signaling cap
WO2017120178A1 (en) 2016-01-06 2017-07-13 Amgen Inc. Auto-injector with signaling electronics
MX2018009011A (es) 2016-02-02 2018-11-19 Hutchinson Fred Cancer Res Anticuerpos anti receptor 1 transmembrana de tirosina-proteina cinasa (ror1) y usos de los mismos.
ES2814287T3 (es) 2016-03-15 2021-03-26 Amgen Inc Reducir la probabilidad de rotura de cristal en dispositivos de administración de fármaco
TWI770020B (zh) 2016-04-15 2022-07-11 丹麥商Ｈ朗德貝克公司 人類化抗pacap 抗體及其用途
WO2017189089A1 (en) 2016-04-29 2017-11-02 Amgen Inc. Drug delivery device with messaging label
US11389588B2 (en) 2016-05-02 2022-07-19 Amgen Inc. Syringe adapter and guide for filling an on-body injector
WO2017197222A1 (en) 2016-05-13 2017-11-16 Amgen Inc. Vial sleeve assembly
WO2017200989A1 (en) 2016-05-16 2017-11-23 Amgen Inc. Data encryption in medical devices with limited computational capability
WO2017209899A1 (en) 2016-06-03 2017-12-07 Amgen Inc. Impact testing apparatuses and methods for drug delivery devices
EP3478342A1 (en) 2016-07-01 2019-05-08 Amgen Inc. Drug delivery device having minimized risk of component fracture upon impact events
WO2018034784A1 (en) 2016-08-17 2018-02-22 Amgen Inc. Drug delivery device with placement detection
US10417457B2 (en) 2016-09-21 2019-09-17 Twist Bioscience Corporation Nucleic acid based data storage
KR20190066607A (ko) 2016-09-23 2019-06-13 테바 파마슈티컬스 인터내셔널 게엠베하 불응성 편두통의 치료
WO2018055573A1 (en) 2016-09-23 2018-03-29 Teva Pharmaceuticals International Gmbh Treating cluster headache
WO2018081234A1 (en) 2016-10-25 2018-05-03 Amgen Inc. On-body injector
WO2018132572A1 (en) * 2017-01-11 2018-07-19 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University R-spondin (rspo) surrogate molecules
AU2018210301A1 (en) 2017-01-17 2019-08-01 Amgen Inc. Injection devices and related methods of use and assembly
AU2018211985A1 (en) 2017-01-26 2019-07-18 Surrozen Operating, Inc. Tissue-specific Wnt signal enhancing molecules and uses thereof
CA3048520A1 (en) 2017-02-17 2018-08-23 Amgen Inc. Drug delivery device with sterile fluid flowpath and related method of assembly
US11369736B2 (en) 2017-02-17 2022-06-28 Amgen Inc. Cannula insertion and retraction mechanisms
CA3054303A1 (en) 2017-02-22 2018-08-30 Twist Bioscience Corporation Nucleic acid based data storage
WO2018160897A1 (en) 2017-03-02 2018-09-07 Beth Israel Deaconess Medical Center, Inc. Preventing post-ictal headaches
JP2020508803A (ja) 2017-03-06 2020-03-26 アムジエン・インコーポレーテツド 作動防止特徴部を備える薬物送達デバイス
SG11201908058UA (en) 2017-03-07 2019-09-27 Amgen Inc Needle insertion by overpressure
KR102619150B1 (ko) 2017-03-09 2023-12-27 암겐 인코포레이티드 약물 전달 장치용 삽입 메커니즘
SI3600491T1 (sl) 2017-03-28 2023-11-30 Amgen Inc. Sistem in postopek za sestavljanja droga bata in brizge
AU2018280054B2 (en) 2017-06-08 2023-07-13 Amgen Inc. Syringe assembly for a drug delivery device and method of assembly
CN110709121B (zh) 2017-06-08 2022-06-24 安进公司 扭矩驱动式药物递送装置
MX2019015472A (es) 2017-06-22 2020-02-19 Amgen Inc Reduccion del impacto/choque de la activacion del mecanismo.
WO2018237225A1 (en) 2017-06-23 2018-12-27 Amgen Inc. ELECTRONIC DRUG DELIVERY DEVICE COMPRISING A CAP ACTIVATED BY A SWITCH ASSEMBLY
EP3651832B1 (en) 2017-07-14 2023-12-13 Amgen Inc. Needle insertion-retraction system having dual torsion spring system
MA49626A (fr) 2017-07-21 2020-05-27 Amgen Inc Élément d'étanchéité perméable aux gaz pour récipient à médicament et procédés d'assemblage
MA49676A (fr) 2017-07-25 2020-06-03 Amgen Inc Dispositif d'administration de médicament doté d'un système d'accès à un récipient et procédé d'assemblage associé
EP3658203B1 (en) 2017-07-25 2022-08-31 Amgen Inc. Drug delivery device with gear module and related method of assembly
WO2019032482A2 (en) 2017-08-09 2019-02-14 Amgen Inc. HYDRAULIC-PNEUMATIC PRESSURE CHAMBER DELIVERY SYSTEM
EP3668567A1 (en) 2017-08-18 2020-06-24 Amgen Inc. Wearable injector with sterile adhesive patch
US11103636B2 (en) 2017-08-22 2021-08-31 Amgen Inc. Needle insertion mechanism for drug delivery device
MA50611A (fr) 2017-10-04 2020-08-12 Amgen Inc Adaptateur d'écoulement destiné à un dispositif d'administration de médicament
WO2019070552A1 (en) 2017-10-06 2019-04-11 Amgen Inc. DRUG DELIVERY DEVICE COMPRISING A LOCKOUT ASSEMBLY AND ASSOCIATED ASSEMBLY METHOD
US11464903B2 (en) 2017-10-09 2022-10-11 Amgen Inc. Drug delivery device with drive assembly and related method of assembly
GB2583590A (en) 2017-10-20 2020-11-04 Twist Bioscience Corp Heated nanowells for polynucleotide synthesis
MA50527A (fr) 2017-11-03 2020-09-09 Amgen Inc Système et approches pour stériliser un dispositif d'administration de médicament
EP3707075A1 (en) 2017-11-06 2020-09-16 Amgen Inc. Fill-finish assemblies and related methods
EP3706830B1 (en) 2017-11-06 2024-08-07 Amgen Inc. Drug delivery device with placement and flow sensing
CN111225696B (zh) 2017-11-10 2023-07-18 安进公司 用于药物递送装置的柱塞
AU2018368340B2 (en) 2017-11-16 2024-03-07 Amgen Inc. Door latch mechanism for drug delivery device
JP7339262B2 (ja) 2018-01-12 2023-09-05 アムジェン インコーポレイテッド Ｐａｃ１抗体及びその使用
MA52202A (fr) 2018-04-02 2021-02-17 Amgen Inc Compositions d'érénumab et utilisations de celles-ci
JP7465215B2 (ja) 2018-04-12 2024-04-10 アムジェン インコーポレイテッド 安定なタンパク質組成物を製造する方法
CN112639130B (zh) 2018-05-18 2024-08-09 特韦斯特生物科学公司 用于核酸杂交的多核苷酸、试剂和方法
US10835685B2 (en) 2018-05-30 2020-11-17 Amgen Inc. Thermal spring release mechanism for a drug delivery device
US11083840B2 (en) 2018-06-01 2021-08-10 Amgen Inc. Modular fluid path assemblies for drug delivery devices
MA53375A (fr) 2018-07-24 2021-06-02 Amgen Inc Dispositifs d'administration pour l'administration de médicaments
WO2020023220A1 (en) 2018-07-24 2020-01-30 Amgen Inc. Hybrid drug delivery devices with tacky skin attachment portion and related method of preparation
US12115360B2 (en) 2018-07-24 2024-10-15 Amgen Inc. Hybrid drug delivery devices with grip portion
MA53379A (fr) 2018-07-24 2021-06-02 Amgen Inc Dispositifs d'administration pour l'administration de médicaments
US12109389B2 (en) 2018-07-31 2024-10-08 Amgen Inc. Fluid path assembly for a drug delivery device
US20210346601A1 (en) 2018-09-24 2021-11-11 Amgen Inc. Interventional dosing systems and methods
AU2019350660B2 (en) 2018-09-28 2024-09-26 Amgen Inc. Muscle wire escapement activation assembly for a drug delivery device
CN117159846A (zh) 2018-10-02 2023-12-05 安进公司 具有内部力传递的用于药物递送的注射系统
CA3112214A1 (en) 2018-10-05 2020-04-09 Amgen Inc. Drug delivery device having dose indicator
MA53912A (fr) 2018-10-15 2022-01-19 Amgen Inc Dispositif d'administration de médicament comprenant un mécanisme d'amortissement
MX2021002791A (es) 2018-10-15 2021-05-12 Amgen Inc Proceso de ensamblaje de plataforma para un dispositivo de administracion de farmacos.
EP3873563A1 (en) 2018-11-01 2021-09-08 Amgen Inc. Drug delivery devices with partial drug delivery member retraction
US11213620B2 (en) 2018-11-01 2022-01-04 Amgen Inc. Drug delivery devices with partial drug delivery member retraction
TWI831847B (zh) 2018-11-01 2024-02-11 美商安進公司 部分針頭縮回之藥物遞送裝置及其操作方法
JP2022516956A (ja) * 2019-01-08 2022-03-03 ハー・ルンドベック・アクチエゼルスカベット 抗ｃｇｒｐ抗体を用いた頭痛の急性治療及び迅速治療
WO2020176678A1 (en) * 2019-02-26 2020-09-03 Twist Bioscience Corporation Variant nucleic acid libraries for glp1 receptor
CA3137360A1 (en) 2019-04-24 2020-10-29 Amgen Inc. Syringe sterilization verification assemblies and methods
WO2020239014A1 (zh) * 2019-05-30 2020-12-03 山东博安生物技术有限公司 抗cgrp抗体及其应用
EP3990493A1 (en) 2019-06-28 2022-05-04 Amgen Inc. Anti-cgrp receptor/anti-pac1 receptor bispecific antigen binding proteins
WO2021041067A2 (en) 2019-08-23 2021-03-04 Amgen Inc. Drug delivery device with configurable needle shield engagement components and related methods
AU2020356471A1 (en) 2019-09-23 2022-04-21 Twist Bioscience Corporation Variant nucleic acid libraries for CRTH2
WO2022185224A1 (en) 2021-03-02 2022-09-09 Mark Hasleton Treatment and/or reduction of occurrence of migraine
US20240208680A1 (en) 2021-05-21 2024-06-27 Amgen Inc. Method of optimizing a filling recipe for a drug container
WO2023026205A1 (en) 2021-08-24 2023-03-02 Cgrp Diagnostics Gmbh Preventative treatment of migraine
WO2023215829A1 (en) * 2022-05-05 2023-11-09 Amgen Inc. Heteromultimer binding dll3 and cd3
WO2024102742A1 (en) 2022-11-07 2024-05-16 Amgen Inc. Methods for treating obesity

Family Cites Families (99)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3773919A (en) 1969-10-23 1973-11-20 Du Pont Polylactide-drug mixtures
US4263428A (en) 1978-03-24 1981-04-21 The Regents Of The University Of California Bis-anthracycline nucleic acid function inhibitors and improved method for administering the same
US4399216A (en) 1980-02-25 1983-08-16 The Trustees Of Columbia University Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
IE52535B1 (en) 1981-02-16 1987-12-09 Ici Plc Continuous release pharmaceutical compositions
EP0088046B1 (de) 1982-02-17 1987-12-09 Ciba-Geigy Ag Lipide in wässriger Phase
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
HUT35524A (en) 1983-08-02 1985-07-29 Hoechst Ag Process for preparing pharmaceutical compositions containing regulatory /regulative/ peptides providing for the retarded release of the active substance
US4615885A (en) 1983-11-01 1986-10-07 Terumo Kabushiki Kaisha Pharmaceutical composition containing urokinase
US4740461A (en) 1983-12-27 1988-04-26 Genetics Institute, Inc. Vectors and methods for transformation of eucaryotic cells
US4751180A (en) 1985-03-28 1988-06-14 Chiron Corporation Expression using fused genes providing for protein product
US4935233A (en) 1985-12-02 1990-06-19 G. D. Searle And Company Covalently linked polypeptide cell modulators
WO1987005330A1 (en) 1986-03-07 1987-09-11 Michel Louis Eugene Bergh Method for enhancing glycoprotein stability
US4959455A (en) 1986-07-14 1990-09-25 Genetics Institute, Inc. Primate hematopoietic growth factors IL-3 and pharmaceutical compositions
DE3785186T2 (de) 1986-09-02 1993-07-15 Enzon Lab Inc Bindungsmolekuele mit einzelpolypeptidkette.
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
US5260203A (en) 1986-09-02 1993-11-09 Enzon, Inc. Single polypeptide chain binding molecules
US4912040A (en) 1986-11-14 1990-03-27 Genetics Institute, Inc. Eucaryotic expression system
US5011912A (en) 1986-12-19 1991-04-30 Immunex Corporation Hybridoma and monoclonal antibody for use in an immunoaffinity purification system
US4965195A (en) 1987-10-26 1990-10-23 Immunex Corp. Interleukin-7
US4968607A (en) 1987-11-25 1990-11-06 Immunex Corporation Interleukin-1 receptors
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
AU643427B2 (en) 1988-10-31 1993-11-18 Immunex Corporation Interleukin-4 receptors
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
JPH02229119A (ja) 1989-02-28 1990-09-11 Toyo Jozo Co Ltd 動脈硬化予防および治療剤
US5683888A (en) 1989-07-22 1997-11-04 University Of Wales College Of Medicine Modified bioluminescent proteins and their use
US5292658A (en) 1989-12-29 1994-03-08 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Boyd Graduate Studies Research Center Cloning and expressions of Renilla luciferase
JP3068180B2 (ja) 1990-01-12 2000-07-24 アブジェニックス インコーポレイテッド 異種抗体の生成
US6713610B1 (en) 1990-01-12 2004-03-30 Raju Kucherlapati Human antibodies derived from immunized xenomice
US6673986B1 (en) 1990-01-12 2004-01-06 Abgenix, Inc. Generation of xenogeneic antibodies
WO1991018982A1 (en) 1990-06-05 1991-12-12 Immunex Corporation Type ii interleukin-1 receptors
US5874299A (en) 1990-08-29 1999-02-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5877397A (en) 1990-08-29 1999-03-02 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5789650A (en) 1990-08-29 1998-08-04 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US6255458B1 (en) 1990-08-29 2001-07-03 Genpharm International High affinity human antibodies and human antibodies against digoxin
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US6300129B1 (en) 1990-08-29 2001-10-09 Genpharm International Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
ATE158021T1 (de) 1990-08-29 1997-09-15 Genpharm Int Produktion und nützung nicht-menschliche transgentiere zur produktion heterologe antikörper
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5814318A (en) 1990-08-29 1998-09-29 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
EP0575319B1 (en) 1991-03-11 1999-11-10 The University Of Georgia Research Foundation, Inc. Cloning and expression of renilla luciferase
EP0590076A4 (en) 1991-06-14 1997-02-12 Dnx Corp Production of human hemoglobin in transgenic pigs
WO1993001227A1 (en) 1991-07-08 1993-01-21 University Of Massachusetts At Amherst Thermotropic liquid crystal segmented block copolymer
US5262522A (en) 1991-11-22 1993-11-16 Immunex Corporation Receptor for oncostatin M and leukemia inhibitory factor
ES2131107T3 (es) * 1992-03-17 1999-07-16 Novartis Ag Anticuerpos obtenidos mediante ingenieria genetica.
ES2301158T3 (es) 1992-07-24 2008-06-16 Amgen Fremont Inc. Produccion de anticuerpos xenogenicos.
PT672141E (pt) 1992-10-23 2003-09-30 Immunex Corp Metodos de preparacao de proteinas oligomericas soluveis
US5766880A (en) * 1992-10-27 1998-06-16 Queen's University At Kingston Isolated nucleic acid molecules encoding multidrug resistance proteins
US5457035A (en) 1993-07-23 1995-10-10 Immunex Corporation Cytokine which is a ligand for OX40
ATE400651T1 (de) 1993-09-10 2008-07-15 Univ Columbia Verwendung von grünem fluoreszenzprotein
WO1995021191A1 (en) 1994-02-04 1995-08-10 William Ward Bioluminescent indicator based upon the expression of a gene for a modified green-fluorescent protein
WO1996003993A2 (en) 1994-08-05 1996-02-15 The Rockefeller University Modulation of thymocyte and t cell functional activity
JPH10504457A (ja) 1994-08-16 1998-05-06 ヒューマン ジノーム サイエンシーズ， インコーポレイテッド カルシトニンレセプター
US5777079A (en) 1994-11-10 1998-07-07 The Regents Of The University Of California Modified green fluorescent proteins
DE69637481T2 (de) 1995-04-27 2009-04-09 Amgen Fremont Inc. Aus immunisierten Xenomäusen stammende menschliche Antikörper gegen IL-8
US5874304A (en) 1996-01-18 1999-02-23 University Of Florida Research Foundation, Inc. Humanized green fluorescent protein genes and methods
US5804387A (en) 1996-02-01 1998-09-08 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University FACS-optimized mutants of the green fluorescent protein (GFP)
US5876995A (en) 1996-02-06 1999-03-02 Bryan; Bruce Bioluminescent novelty items
US5925558A (en) 1996-07-16 1999-07-20 The Regents Of The University Of California Assays for protein kinases using fluorescent protein substrates
US5976796A (en) 1996-10-04 1999-11-02 Loma Linda University Construction and expression of renilla luciferase and green fluorescent protein fusion genes
US6255455B1 (en) 1996-10-11 2001-07-03 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Rh(D)-binding proteins and magnetically activated cell sorting method for production thereof
KR20080059467A (ko) 1996-12-03 2008-06-27 아브게닉스, 인크. 복수의 ｖｈ 및 ｖｋ 부위를 함유하는 사람 면역글로불린유전자좌를 갖는 형질전환된 포유류 및 이로부터 생성된항체
US6458547B1 (en) 1996-12-12 2002-10-01 Prolume, Ltd. Apparatus and method for detecting and identifying infectious agents
CA2196496A1 (en) 1997-01-31 1998-07-31 Stephen William Watson Michnick Protein fragment complementation assay for the detection of protein-protein interactions
DE19732944A1 (de) 1997-07-31 1999-02-04 Thomae Gmbh Dr K Peptidische CGRP-Antagonisten
US6342220B1 (en) 1997-08-25 2002-01-29 Genentech, Inc. Agonist antibodies
DE69938293T2 (de) 1998-03-27 2009-03-12 Bruce J. Beverly Hills Bryan Luciferase, gfp fluoreszenzproteine, kodierende nukleinsaüre und ihre verwendung in der diagnose
US6268474B1 (en) 1998-04-30 2001-07-31 Creighton University Peptide antagonists of CGRP-receptor superfamily and methods of use
US6210924B1 (en) 1998-08-11 2001-04-03 Amgen Inc. Overexpressing cyclin D 1 in a eukaryotic cell line
AU770555B2 (en) 1998-08-17 2004-02-26 Abgenix, Inc. Generation of modified molecules with increased serum half-lives
CA2396460A1 (en) * 1999-12-02 2001-06-07 Myriad Genetics, Inc. Protein-protein interactions
US20020090646A1 (en) 2000-05-03 2002-07-11 Amgen Inc. Calcitonin-related molecules
FR2821080B1 (fr) 2001-02-20 2003-12-19 Sanofi Synthelabo Anticorps specifique de l'adrenomedulline humaine, composition pharmaceutique le contenant, ses applications therapeutiques
CA2461917C (en) 2001-09-27 2012-01-17 Merck & Co., Inc. Isolated dna molecules encoding humanized calcitonin gene-related peptide receptor, related non-human transgenic animals and assay methods
US7658924B2 (en) 2001-10-11 2010-02-09 Amgen Inc. Angiopoietin-2 specific binding agents
AR039067A1 (es) * 2001-11-09 2005-02-09 Pfizer Prod Inc Anticuerpos para cd40
AU2003280410B8 (en) * 2002-01-18 2009-04-23 Zymogenetics, Inc. Cytokine receptor zcytor17 multimers
US20040110170A1 (en) 2002-05-18 2004-06-10 The Regents Of The University Of California Cloning and characterization of calcitonin gene related peptide receptors
US20070071744A1 (en) * 2002-06-07 2007-03-29 Gotz Munch Agents which bind to epitopes of glycoprotein VI
DK1556020T3 (da) * 2002-08-12 2009-06-22 Birkir Sveinsson Anvendelse af CGRP-antagonistforbindelser til behandling af psoriasis
US20040176577A1 (en) * 2002-09-10 2004-09-09 Eva Rojer Immunoassays for specific determination of SCCA isoforms
WO2004097421A2 (en) 2003-04-29 2004-11-11 Bayer Healthcare Ag Diagnostics and therapeutics for diseases associated with calcitonin receptor-like receptor (calcrl)
BRPI0507594A (pt) 2004-02-11 2007-07-03 Amylin Pharmaceuticals Inc polipetìdeos hìbridos com propriedades selecionáveis
US7423128B2 (en) * 2004-11-03 2008-09-09 Amgen Fremont Inc. Anti-properdin antibodies, and methods for making and using same
RS52036B (en) 2004-12-21 2012-04-30 Medimmune Limited ANGIOPOETIN-2 ANTIBODIES AND ITS USES
CN101232897A (zh) 2005-06-16 2008-07-30 新藤隆行 含有肾上腺髓质素作为有效成分的血管生成剂
GB0521139D0 (en) 2005-10-18 2005-11-23 Univ Sheffield Therapeutic agent
US8168592B2 (en) 2005-10-21 2012-05-01 Amgen Inc. CGRP peptide antagonists and conjugates
ES2433251T5 (es) 2005-11-14 2020-03-13 Teva Pharmaceuticals Int Gmbh Anticuerpos antagonistas dirigidos contra un péptido relacionado con el gen de la calcitonina y procedimientos que utilizan los mismos
WO2007076336A1 (en) * 2005-12-22 2007-07-05 Eli Lilly And Company Treatment of migraine with anti-cgrp antibodies
BRPI0715141A2 (pt) * 2006-08-03 2013-06-04 Astrazeneca Ab agente de ligaÇço alvejante, anticorpo isolado, fragmento de anticorpo isolado, molÉcula de Ácido nucleico, vetor, cÉlula hospedeira, mÉtodos para produzir um agente de ligaÇço alvejado, para produzir um anticorpo, para produzir um fragmento de anticorpo, para tratar um tumor maligno em um animal, para tratar inflamaÇço, e para inibir a interaÇço de alfabeta6 com seu ligando, e, conjugado
GB0708002D0 (en) * 2007-04-25 2007-06-06 Univ Sheffield Antibodies
BRPI0908276B8 (pt) 2008-03-04 2021-05-25 Labrys Biologics Inc uso de um anticorpo antagonista anti-cgrp para a fabricação de um medicamento para a prevenção e/ou tratamento de dor de osteoartrite
FR2934597B1 (fr) * 2008-07-31 2013-04-19 Univ Aix Marseille Ii Anticorps se liant aux recepteurs de l'adrenomedulline et leurs utilisations comme medicament.
KR101519192B1 (ko) 2009-08-28 2015-05-11 리나트 뉴로사이언스 코프. 칼시토닌 유전자-관련된 펩티드에 대해 지시된 길항제 항체의 투여에 의한 내장 통증의 치료 방법
US9401875B2 (en) 2012-06-01 2016-07-26 Nippon Telegraph And Telephone Corporation Packet transfer processing method and packet transfer processing device
US9300829B2 (en) 2014-04-04 2016-03-29 Canon Kabushiki Kaisha Image reading apparatus and correction method thereof

Also Published As

Publication number Publication date
HUE034506T2 (en) 2018-02-28
KR101853393B1 (ko) 2018-05-02
PL2379594T3 (pl) 2018-01-31
LTC2379594I2 (lt) 2020-04-10
CY1122658T1 (el) 2021-03-12
JOP20190017B1 (ar) 2023-03-28
TWI688403B (zh) 2020-03-21
CN102348722B (zh) 2016-06-08
KR20110106409A (ko) 2011-09-28
JP2012513214A (ja) 2012-06-14
CA2746858A1 (en) 2010-07-01
CN106084045B (zh) 2020-02-11
EP2379594B1 (en) 2017-08-09
EA031320B1 (ru) 2018-12-28
ES2746571T3 (es) 2020-03-06
US9862771B2 (en) 2018-01-09
TN2011000283A1 (en) 2012-12-17
MY180564A (en) 2020-12-02
EA201891500A3 (ru) 2019-03-29
US20210179723A1 (en) 2021-06-17
KR20190054181A (ko) 2019-05-21
NZ623541A (en) 2015-12-24
NZ606090A (en) 2014-08-29
LUC00095I1 (pt) 2018-12-28
NL300961I2 (nl) 2019-01-15
TW201032823A (en) 2010-09-16
HUE045966T2 (hu) 2020-01-28
UA108066C2 (uk) 2015-03-25
JP2016026224A (ja) 2016-02-12
JP2021036912A (ja) 2021-03-11
LT3184546T (lt) 2019-09-10
JP2019062907A (ja) 2019-04-25
IL213429A (en) 2016-02-29
JO3382B1 (ar) 2019-03-13
HUS1800047I1 (hu) 2018-12-28
KR101740615B1 (ko) 2017-05-26
JP6261132B2 (ja) 2018-01-17
TW202241950A (zh) 2022-11-01
AU2013205271C1 (en) 2018-10-04
JP2014210815A (ja) 2014-11-13
AU2013205271B2 (en) 2016-07-14
US20150376286A1 (en) 2015-12-31
MA32982B1 (fr) 2012-01-02
HRP20191341T8 (hr) 2020-02-07
LT2379594T (lt) 2017-11-27
RS56567B1 (sr) 2018-02-28
US20180142029A1 (en) 2018-05-24
CY2018032I1 (el) 2019-07-10
US20210179722A1 (en) 2021-06-17
US20130071410A1 (en) 2013-03-21
PT3184546T (pt) 2019-09-16
IL243784A (en) 2016-11-30
DK2379594T3 (en) 2017-10-30
EP3569620A1 (en) 2019-11-20
KR20170061182A (ko) 2017-06-02
CY1119465T1 (el) 2018-03-07
CN102348722A (zh) 2012-02-08
LUC00095I2 (pt) 2019-12-24
IL213429A0 (en) 2011-07-31
SG172307A1 (en) 2011-07-28
ME03601B (me) 2020-07-20
AU2009330175B2 (en) 2014-01-16
SG10201401879TA (en) 2014-06-27
EP3184546A1 (en) 2017-06-28
AU2009330175A1 (en) 2011-06-23
KR20180043850A (ko) 2018-04-30
EP2379594A1 (en) 2011-10-26
TWI574697B (zh) 2017-03-21
JOP20190017A1 (ar) 2017-06-16
US9102731B2 (en) 2015-08-11
TWI754176B (zh) 2022-02-01
JP5761805B2 (ja) 2015-08-12
EA201100892A1 (ru) 2012-01-30
LTPA2018017I1 (lt) 2019-01-10
MX2011006804A (es) 2011-09-27
SI2379594T1 (sl) 2017-12-29
NO2379594T3 (pt) 2018-01-06
EA201891500A2 (ru) 2018-11-30
PL3184546T3 (pl) 2019-12-31
CY2018032I2 (el) 2019-07-10
HRP20191341T1 (hr) 2019-10-18
HRP20171690T1 (hr) 2017-12-15
CA2746858C (en) 2017-10-03
ZA201105418B (en) 2012-02-29
DK3184546T3 (da) 2019-09-30
EP3184546B1 (en) 2019-07-17
PT2379594T (pt) 2017-11-16
TW202026312A (zh) 2020-07-16
RS59343B1 (sr) 2019-10-31
BRPI0922505B1 (pt) 2021-08-03
AU2013205271A1 (en) 2013-05-02
CR20110400A (es) 2011-10-12
SI3184546T1 (sl) 2019-09-30
CL2011001578A1 (es) 2012-01-20
PE20120427A1 (es) 2012-05-13
EP3184546B8 (en) 2019-10-30
US20100172895A1 (en) 2010-07-08
AU2009330175C1 (en) 2018-10-04
TW201703796A (zh) 2017-02-01
AR074857A1 (es) 2011-02-16
NO2018042I1 (no) 2018-12-17
ES2643835T3 (es) 2017-11-24
WO2010075238A1 (en) 2010-07-01
IL243784A0 (en) 2016-04-21
CO6400232A2 (es) 2012-03-15
CN106084045A (zh) 2016-11-09
BRPI0922505A2 (pt) 2016-07-05
JP2023116783A (ja) 2023-08-22
EP2379594B8 (en) 2020-12-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20210179723A1 (en) Human cgrp receptor binding proteins
US10294298B2 (en) Human PAC1 antibodies
AU2018203471B2 (en) Human CGRP receptor binding proteins
US12122841B2 (en) Human CGRP receptor binding proteins

Legal Events

Date Code Title Description
B07A Application suspended after technical examination (opinion) [chapter 7.1 patent gazette]
B350 Update of information on the portal [chapter 15.35 patent gazette]
B09B Patent application refused [chapter 9.2 patent gazette]
B09T Decision of refusal: decision cancelled [chapter 9.2.1 patent gazette]

Free format text: ANULADA A PUBLICACAO CODIGO 9.2 NA RPI NO 2633 DE 22/06/2021 POR TER SIDO INDEVIDA.

B09B Patent application refused [chapter 9.2 patent gazette]
B09T Decision of refusal: decision cancelled [chapter 9.2.1 patent gazette]

Free format text: ANULADA A PUBLICACAO CODIGO 9.2 NA RPI NO 2672 DE 22/03/2022 POR TER SIDO INDEVIDA.

B09A Decision: intention to grant [chapter 9.1 patent gazette]
B16A Patent or certificate of addition of invention granted [chapter 16.1 patent gazette]

Free format text: PRAZO DE VALIDADE: 20 (VINTE) ANOS CONTADOS A PARTIR DE 18/12/2009, OBSERVADAS AS CONDICOES LEGAIS. PATENTE CONCEDIDA CONFORME ADI 5.529/DF, QUE DETERMINA A ALTERACAO DO PRAZO DE CONCESSAO.