CN101232897A - 含有肾上腺髓质素作为有效成分的血管生成剂 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种血管生成剂，其含有选自以肾上腺髓质素、抑制肾上腺髓质素分解酶活性的物质、肾上腺髓质素受体活性修饰蛋白、降钙素受体样受体以及肾上腺髓质素受体所组成群组中的至少一种作为有效成分。

Description

含有肾上腺髓质素作为有效成分的血管生成剂
技术领域
本发明涉及含有肾上腺髓质素作为有效成分的血管生成剂。
背景技术
在日本，心肌梗塞及脑梗塞等缺血性疾病是主要的死亡原因。因此，随着人口的老龄化，这些缺血性疾病的治疗医学的发展正成为社会的一大需求。作为针对缺血性疾病的新治疗方法，最近正在研究基因治疗及骨髓单核细胞移植等的血管生成疗法。作为目前的血管生成疗法的一大问题，可举出：因为再生的血管脆弱，所以血管通透性高，导致水肿或出血、或者暂时形成的血管在治疗结束后再次萎缩等难以使血管长期张开的问题。另外，将以血管内皮细胞生长因子(VEGF)为代表的生长因子应用于血管生成疗法，这同时孕藏着促进动脉硬化病变发展的危险性。今后，为了将血管生成疗法作为针对缺血性疾病的安全且有效的标准治疗而开展下去，必须解决上述各问题，并改善治疗后的长期预后。
在脑缺血性疾病中，解除缺血同时处置脑水肿是急性期治疗的一大课题。脑梗塞治疗的要点在于谋求神经细胞功能的恢复同时保护损害未发展的组织。在脑梗塞急性期，在梗塞部分及其周围会产生脑水肿，若水肿程度加重，则未受损伤的组织受到头盖骨挤压而扩大伤害范围，或者压迫脑干部而危及生命预后。目前，治疗脑水肿的现状是，除投予高渗透压物质以外还没有有效的治疗方法；尽管具有重要性，但对与脑梗塞并发的脑水肿的治疗或改善药物的开发在近数十年间未见有大的进步。
作为脑水肿的处置，是投予甘油或甘露醇等高渗透压物质。有报道称，在荟萃分析中(meta-analysis)中，投予这些高渗透压物质可有意义地减少脑梗塞发病后14天以内的死亡率。但是，对于长期预后及功能预后的效果尚存疑问。为了改善脑梗塞后的生命预后及功能预后，期待开发出着眼于脑水肿发病机制的新治疗方法。
肾上腺髓质素(AM)是1993年由北村、寒川等人发现的由52个氨基酸构成的肽。AM在发现当初是作为具有血管扩张作用的血管活性物质而受到业界关注，由其后的研究获知，除血管扩张作用以外，AM还具有控制细胞的游走、分化，抗炎症作用，体液量调节作用，强心作用等多种生理活性。
本发明者已建立了血管特异性地过度表达AM基因的转基因小鼠、AM基因敲除小鼠，进而还建立了AM家族的降血钙素基因相关肽(CGRP)敲除小鼠，并报告了一系列的研究成果(Circulation.2000；101：2309；Circulation.2001；104：1964；Circ Res.2001，89，983；Circ Res.2002；90：657；Arterioscler Thromb Vasc Biol.2002 22：1310-5；Circulation.2004；109：1789；Circ Res.2004；95：415)。另外有报道，AM敲除小鼠的杂合体在对肾脏施加缺血再灌注损伤时的器官损害亢进，相对于此，转基因小鼠反而抑制器官损害，因此AM不仅是血管扩张物质而且还是具有器官保护作用的生理活性物质。进一步报道了，AM敲除小鼠的纯合体中血管生长并不成熟同时血管壁结构自身发现有大的异常，在胎生第14天由于弥散性出血或全身性水肿的原因而死亡(Circulation.2001；104：1964)。
发明内容
本发明提供一种含有肾上腺髓质素作为有效成分的血管生成剂。
本发明者为解决上述课题而进行了努力研究。于是发现，AM与血管的成熟、稳定化有关，并且抑制血管通透性，从而最终完成本发明。
即，本发明为如下。
(1)一种血管结构的稳定化剂，其特征在于：其含有肾上腺髓质素作为有效成分。
(2)一种血管结构的稳定化剂，其特征在于：其含有选自以抑制肾上腺髓质素分解酶活性的物质、肾上腺髓质素受体活性修饰蛋白、降血钙素受体样受体以及肾上腺髓质素受体所组成群组中的至少一种作为有效成分。
(3)根据(2)所述的稳定化剂，其特征在于：肾上腺髓质素受体活性修饰蛋白为RAMP1、RAMP2或者RAMP3。
(4)一种血管通透性的抑制剂，其特征在于：其含有肾上腺髓质素作为有效成分。
(5)一种血管通透性的抑制剂，其特征在于：其含有选自以抑制肾上腺髓质素分解酶活性的物质、肾上腺髓质素受体活性修饰蛋白、降血钙素受体样受体以及肾上腺髓质素受体所组成群组中的至少一个作为有效成分。
(6)根据(5)所述的抑制剂，其特征在于：肾上腺髓质素受体活性修饰蛋白为RAMP1、RAMP2或者RAMP3。
(7)一种血管生成剂，其特征在于：其含有肾上腺髓质素作为有效成分。
(8)一种血管生成剂，其特征在于：其含有选自以抑制肾上腺髓质素分解酶活性的物质、肾上腺髓质素受体活性修饰蛋白、降血钙素受体样受体以及肾上腺髓质素受体所组成群组中的至少一种作为有效成分。
(9)根据(8)所述的血管生成剂，其特征在于：肾上腺髓质素受体活性修饰蛋白为RAMP1、RAMP2或者RAMP3。
(10)根据(7)所述的血管生成剂，其特征在于：血管生成是由于肾上腺髓质素稳定血管结构的作用所致。
(11)根据(7)所述的血管生成剂，其特征在于：血管生成是由于肾上腺髓质素抑制血管的通透性的作用所致。
(12)根据(7)～(11)中任一项所述的血管生成剂，其特征在于：用于治疗或者预防缺血性疾病或者水肿。
(13)根据(12)所述的血管生成剂，其特征在于：缺血性疾病为选自以脑梗塞、心肌梗塞、心绞痛、闭塞性动脉硬化症以及伯格氏病所组成群组中的至少一个。
(14)根据(12)所述的血管生成剂，其特征在于：水肿为脑水肿。
(15)一种用于针对缺血性疾病或者水肿的联合疗法的医药组合物，其特征在于：含有肾上腺髓质素与选自以血管生长因子、抑制肾上腺髓质素分解酶活性的物质、肾上腺髓质素受体活性修饰蛋白、降血钙素受体样受体以及肾上腺髓质素受体所组成群组中的至少一种。
(16)根据(15)所述的医药组合物，其特征在于：血管生长因子为选自以血管内皮细胞生长因子、肝细胞生长因子、成纤维细胞生长因子-2、促血管生成素、缺氧诱导因子-1α以及转化生长因子-β所组成群组中的至少一个。
(17)根据(15)所述的医药组合物，其特征在于：肾上腺髓质素受体活性修饰蛋白为RAMP1、RAMP2或者RAMP3。
(18)根据(15)所述的医药组合物，其特征在于：缺血性疾病为选自以脑梗塞、心肌梗塞、心绞痛、闭塞性动脉硬化症以及伯格氏病所组成群组中的至少一个。
(19)根据(15)所述的医药组合物，其特征在于：水肿为脑水肿。
(20)一种哺乳动物中的血管结构的稳定化方法，其特征在于：将选自以肾上腺髓质素、血管生长因子、抑制肾上腺髓质素分解酶活性的物质、肾上腺髓质素受体活性修饰蛋白、降血钙素受体样受体以及肾上腺髓质素受体所组成群组中的至少一种投予哺乳动物，或者使其于哺乳动物体内获得表达。
(21)一种哺乳动物中的血管结构的稳定化方法，其特征在于：将选自以编码肾上腺髓质素的基因、编码血管生长因子的基因、编码肾上腺髓质素受体活性修饰蛋白的基因、编码降血钙素受体样受体的基因以及编码肾上腺髓质素受体的基因所组成群组中的至少一个投予哺乳动物。
(22)一种哺乳动物中的血管通透性的抑制方法，其特征在于：将选自以肾上腺髓质素、血管生长因子、抑制肾上腺髓质素分解酶活性的物质、肾上腺髓质素受体活性修饰蛋白、降血钙素受体样受体以及肾上腺髓质素受体所组成群组中的至少一种投予哺乳动物，或者使其于哺乳动物体内获得表达。
(23)一种哺乳动物中的血管通透性的抑制方法，其特征在于：将选自以编码肾上腺髓质素的基因、编码血管生长因子的基因、编码肾上腺髓质素受体活性修饰蛋白的基因、编码降血钙素受体样受体的基因以及编码肾上腺髓质素受体的基因所组成群组中的至少一个投予哺乳动物。
(24)根据(22)或(23)所述的方法，其特征在于：血管生长因子为选自以血管内皮细胞生长因子、肝细胞生长因子、成纤维细胞生长因子-2、促血管生成素、缺氧诱导因子-1α以及转化生长因子-β所组成群组中的至少一个。
(25)根据(22)或(23)所述的方法，其特征在于：肾上腺髓质素受体活性修饰蛋白为RAMP1、RAMP2或者RAMP3。
(26)一种哺乳动物中的血管生成方法，其特征在于：将肾上腺髓质素投予哺乳动物。
(27)根据(26)所述的方法，其特征在于：血管生成是由于肾上腺髓质素稳定血管结构的作用所致。
(28)根据(26)所述的方法，其特征在于：血管生成是由于肾上腺髓质素抑制血管的通透性的作用所致。
(29)一种哺乳动物中的血管生成方法，其特征在于：将选自以肾上腺髓质素、血管生长因子、抑制肾上腺髓质素分解酶活性的物质、肾上腺髓质素受体活性修饰蛋白、降血钙素受体样受体以及肾上腺髓质素受体所组成群组中的至少一种投予哺乳动物，或者使其于哺乳动物体内获得表达。
(30)一种哺乳动物中的血管生成方法，其特征在于：将选自以编码肾上腺髓质素的基因、编码血管生长因子的基因、编码肾上腺髓质素受体活性修饰蛋白的基因、编码降血钙素受体样受体的基因、以及编码肾上腺髓质素受体的基因所组成群组中的至少一个投予哺乳动物。
(31)根据(29)或(30)所述的方法，其特征在于：血管生长因子为选自以血管内皮细胞生长因子、肝细胞生长因子、成纤维细胞生长因子-2、促血管生成素、缺氧诱导因子-1α以及转化生长因子-β所组成群组中的至少一个。
(32)根据(29)或(30)所述的方法，其特征在于：肾上腺髓质素受体活性修饰蛋白为RAMP1、RAMP2或者RAMP3。
(33)一种治疗或者预防哺乳动物的缺血性疾病或者水肿的方法，其特征在于：将根据上述(7)～(14)中任一项所述的血管生成剂或者根据上述(15)～(19)中任一项所述的医药组合物投予哺乳动物。
(34)一种治疗或者预防哺乳动物的缺血性疾病或者水肿的方法，其特征在于：将选自以编码肾上腺髓质素的基因、编码血管生长因子的基因、编码肾上腺髓质素受体活性修饰蛋白的基因、编码降血钙素受体样受体的基因、以及编码肾上腺髓质素受体的基因所组成群组中的至少一个投予哺乳动物。
(35)根据(34)所述的方法，其特征在于：血管生长因子为选自以血管内皮细胞生长因子、肝细胞生长因子、成纤维细胞生长因子-2、促血管生成素、缺氧诱导因子-1α以及转化生长因子-β所组成群组中的至少一个。
(36)根据(34)所述的方法，其特征在于：肾上腺髓质素受体活性修饰蛋白为RAMP1、RAMP2或者RAMP3。
(37)根据(34)所述的方法，其特征在于：缺血性疾病为选自以脑梗塞、心肌梗塞、心绞痛、闭塞性动脉硬化症以及伯格氏病所组成群组中的至少一个。
(38)根据(34)所述的方法，其特征在于：水肿为脑水肿。
(39)一种筛选方法，其特征在于：其是筛选具有稳定血管结构的作用的物质、具有抑制血管通透性的作用的物质、具有血管生成活性的物质或者促进血管生成活性的物质的方法；包括以下步骤：将被试验物质投予选自以编码肾上腺髓质素的基因、编码血管生长因子的基因、编码肾上腺髓质素受体活性修饰蛋白的基因、编码降血钙素受体样受体的基因、以及编码肾上腺髓质素受体的基因所组成群组的至少一个被减低的非人类动物，然后分析被试验物质在此非人类动物中的作用。
(40)一种筛选方法，其特征在于：其是在体外实验中筛选具有稳定血管结构的作用的物质、具有抑制血管通透性的作用的物质、具有血管生成活性的物质或者促进血管生成活性的物质的方法；包括以下步骤：使被试验物质与选自以编码肾上腺髓质素的基因、编码血管生长因子的基因、编码肾上腺髓质素受体活性修饰蛋白的基因、编码降血钙素受体样受体的基因、以及编码肾上腺髓质素受体的基因所组成群组中的至少一个被减低的细胞相接触，然后分析被试验物质在此细胞中的作用。
(41)一种筛选方法，其特征在于：其是筛选具有稳定血管结构的作用的物质、具有抑制血管通透性的作用的物质、具有血管生成活性的物质或者促进血管生成活性的物质的方法；包括以下步骤：使被试验物质与具有选自以肾上腺髓质素、血管生长因子、肾上腺髓质素受体活性修饰蛋白、降血钙素受体样受体、以及肾上腺髓质素受体所组成群组中的至少一个蛋白质的细胞相接触，再分析被试验物质在此细胞中的作用。
(42)一种筛选方法，其特征在于：其是筛选具有稳定血管结构的作用的物质、具有抑制血管通透性的作用的物质、具有血管生成活性的物质或者促进血管生成活性的物质的方法；包括以下步骤：使被试验物质与使选自以编码肾上腺髓质素的基因、编码血管生长因子的基因、编码肾上腺髓质素受体活性修饰蛋白的基因、编码降血钙素受体样受体的基因、以及编码肾上腺髓质素受体的基因所组成群组中的至少一个获得表达的细胞相接触，再分析被试验物质在此细胞中的作用。
(43)根据(39)～(42)中任一项所述的方法，其特征在于：血管生长因子为选自以血管内皮细胞生长因子、肝细胞生长因子、成纤维细胞生长因子-2、促血管生成素、缺氧诱导因子-1α以及转化生长因子-β所组成群组中的至少一个。
(44)根据(39)～(42)中任一项所述的方法，其特征在于：肾上腺髓质素受体活性修饰蛋白为RAMP1、RAMP2或者RAMP3。
附图说明
图1是表示AM纯合体基因敲除小鼠的发生的异常的图。
图2是表示AM纯合体基因敲除小鼠中处于发生阶段的血管结构异常的图。
图3是表示AM纯合体基因敲除小鼠的卵黄动脉基底膜的异常的图。
图4为激光多普勒灌注成像，是表示AM投予组小鼠的下肢血流恢复的图。
图5是表示AM投予组小鼠的下肢创伤获得改善的图。
图6是表示通过投予AM的血流恢复、以及增强血管生成的图。
图7是表示AM杂合体基因敲除小鼠以及AM22-52投予小鼠的血流、以及新生血管减少的图。
图8是表示在血管内皮与成纤维细胞的共培养体系中，使用抗PECAM-1抗体对管腔形成进行免疫染色的结果的图。
图9是表示并用AM与VEGF对血管内皮与成纤维细胞的共培养系统中的管腔形成的效果的图。
图10是表示AM增强由VEGF所引起的Akt以及eNOS的磷酸化的图。
图11是利用免疫印迹(Western blotting)来表示通过投予AM而增加VEGF的表达的图。
图12是利用实时聚合酶链反应(real-time PCR)来表示通过投予AM而增加VEGF表达的图。
图13是表示使用AM杂合体基因敲除小鼠进行恢复试验的结果的图。
图14是表示使用Flk-1基因敲除小鼠进行恢复试验的结果的图。
图15是表示使用基因微阵列来分析经过AM处理的表达基因的结果的图。
图16是表示AM抑制血管通透性的图。
图17是表示通过投予AM而减轻水肿的图。
图18是表示通过投予AM而改善脑水肿的图。
图19是表示RAMP2纯合体基因敲除小鼠的卵膜的图。
图20是表示RAMP2纯合体基因敲除小鼠第13.5天的胚胎的图。
图21是表示RAMP2纯合体基因敲除小鼠第13.5天的胚胎中的心包积水的图。
图22是表示RAMP2纯合体基因敲除小鼠第14.5天的胚胎中的出血的图。
图23是RAMP2纯合体基因敲除小鼠的卵黄动脉的电子显微镜照片的图。
图24是RAMP2纯合体基因敲除小鼠的大动脉壁的电子显微镜照片的图。
图25是RAMP2纯合体基因敲除小鼠的大动脉壁的荧光免疫染色的图。
图26是在野生型小鼠与RAMP2纯合体基因敲除小鼠之间，对胎生第13.5天的小鼠胎儿中的基因表达的变化进行比较的图。
图27是在野生型小鼠与RAMP2纯合体基因敲除小鼠之间，对胎生第13.5天的小鼠脐带动脉中的基因表达变化进行比较的图。
图28是表示在野生型小鼠胎儿的发育阶段的CRLR、AM、RAMP2以及RAMP3的表达量的时间经过的图。
图29是表示将胎生第10.5天的AGM(大动脉-生殖腺-中肾区域)在OP9细胞上进行培养，并使用PECAM-1进行免疫染色的结果的图。
图30是表示给在Matrigel上进行培养的HUVEC投予AM或者作为AM拮抗剂的AM22-52时，紧密连接蛋白-5(claudin-5)的基因表达水平的变化的图。
图3 1是表示对RAMP2杂合体基因敲除小鼠的成体的大动脉以及心脏中的RAMP2、RAMP3、CRLR以及AM的表达量进行测定的结果的图，以及RAMP2杂合体基因敲除小鼠以及野生型小鼠的成体的血压测定结果的图。
图32是表示使用RAMP2杂合体基因敲除小鼠成体进行Matrigel Plug分析的结果的图。
图33是局部注射高渗透压物质而形成的下肢水肿模型的图。
图34是表示使RAMP2稳定过度表达的内皮细胞株的建立的图。
图35是表示将使用使RAMP2稳定过度表达的内皮细胞株的RAMP2、RAMP3、AM、CRLR的表达量与对照细胞进行比较的结果的图。
图36是表示通过Matrigel检测来测定体外血管生成能力的结果的图。
图37是表示通过BrdU摄取检测对RAMP2过度表达细胞与对照细胞的细胞生长进行比较的结果的图、以及通过WST-8检测对RAMP2过度表达细胞与对照细胞的细胞生存进行比较的结果的图。
图38是表示在进行细胞凋亡刺激时对RAMP2过度表达细胞与对照细胞的细胞死亡进行比较的结果的图、以及细胞凋亡相关基因的表达的图。
具体实施方式
以下详细说明本发明。以下的实施方式是用于说明本发明的例示，本发明并不仅限定于此实施形态。只要不脱离本发明的要点，则可通过各种方式实施本发明。
另外，本说明书中所引用的文献、以及公开公报、专利公报、其他专利文献是作为参照而摘录入本说明书中。
本发明涉及一种血管生成剂、以及使用这些物质的哺乳动物的血管生成方法；其中，血管生成剂含有选自以肾上腺髓质素、抑制肾上腺髓质素分解酶活性的物质、肾上腺髓质素受体活性修饰蛋白、降血钙素受体样受体以及肾上腺髓质素受体所组成群组中的至少一个作为有效成分。
以下，对本发明的血管生成剂进行详细说明。
1.肾上腺髓质素或者其相关蛋白质
被用作本发明的血管生成剂的肾上腺髓质素(AM)，是1993年由北村、寒川等人从人类嗜铬细胞瘤组织中分离鉴定的由52个氨基酸构成的肽(序列编号2)。AM广泛分布于以血管为代表的全身组织中，在发现当初AM是作为具有血管扩张作用的血管活性物质而受到关注，根据其后的研究获知，除血管扩张作用以外，AM还具有控制细胞的游走及分化、抗炎症作用、调节体液量作用、强心作用等的多种生理活性。
本发明中所使用的肾上腺髓质素，除由序列编号2中所表示的氨基酸序列所构成的蛋白质以外，还包括由氨基酸序列2中有1个或数个氨基酸发生缺失、置换或者附加而成的氨基酸序列所构成并且具有肾上腺髓质素(AM)活性的蛋白质(变异型AM)。具体来说，也可使用：
(i)序列编号2中所表示的氨基酸序列中有1个或数个(优选为1个或数个(例如1个～10个、更优选为1个～5个))氨基酸发生缺失的氨基酸序列、
(ii)序列编号2所表示的氨基酸序列中有1个或数个(优选为1个或数个(例如1个～10个、更优选为1个～5个))氨基酸被其他氨基酸置换的氨基酸序列、
(iii)在序列编号2所表示的氨基酸序列中附加1个或数个(优选为1个或数个(例如1个～10个、更优选为1个～5个))其他氨基酸的氨基酸序列、或者
(iv)由将上述(i)～(iii)组合而成的氨基酸序列所构成，并且具有与上述AM同样作用的变异型AM肽。
另外，对于本发明中所使用的AM，只要具有AM活性，也可以使用与上述氨基酸序列具有同源性的肽。可列举：与上述AM肽的氨基酸序列具有约85％以上、优选为约90％以上、更优选为约95％以上相同性的氨基酸序列等。
这种将序列编号2中所表示的氨基酸序列中有1或数个氨基酸发生缺失、插入或者附加而成的氨基酸序列加以编码的DNA，可依照《Molecular Cloning，A LaboratoryManual第2版.》(Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989))、Kunkel(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：488-92、Kunkel(1988)Method.Enzymol.85：2763-6等中所记载的部位特异性诱变法等方法进行制备。
另外，为了在DNA中导入变异，可以使用利用Kunkel法或Gapped duplex法等部位特异性突变诱发法的导入变异用试剂盒，例如QuikChangeTM Site-Directed MutagenesisKit(Stratagene公司制造)、GeneTailorTM Site-Directed Mutagenesis System(Invitrogen公司制造)、TaKaRa Site-Directed Mutagenesis System(Mutan-K、Mutan-Super Express Km等：Takara-Bio公司制造)等导入变异。
此处，所谓AM活性，是指通过使血管结构稳定以及/或者抑制血管通透性而促进血管生成的活性。所谓“使血管结构稳定”，是指通过血管内皮细胞间的粘附的稳定化、内皮细胞与基底膜的粘附的稳定化、基底膜结构的稳定化、血管平滑肌的层结构的稳定化等，而长时间维持稳定的血管管腔结构。另外，所谓“抑制血管通透性”，是指血管内的水份及血细胞成分不会从血管中漏出从而抑制出血及水肿的发生等；也包括通过使血管结构稳定而抑制通透性。
可通过使用电子显微镜的形态学观察、对AM缺损敲除小鼠的血管结构的观察(后述)、粘附因子或基底膜构成因子的表达、体外血管形成测试等，来确认血管结构被稳定化。另外，可通过体外血管通透性测试(后述)、对基因敲除小鼠的血管通透性的观察、水通道的基因表达等，来确认血管通透性被抑制。
上述AM肽，可通过肽合成而直接获得，但也可以采用通常的基因工程学方法(《Molecular Cloning，A Laboratory Manual第2版》(Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989))使其表达而获得。
将编码AM的DNA的碱基序列揭示于序列编号1(人类)以及序列编号13(小鼠)中。作为编码AM的DNA，除由在序列编号1或13、或者这些成熟蛋白质编码区域(序列编号1为439～594号，序列编号13为2548～2697号)中所揭示的碱基序列所构成的DNA以外，还包括：由与由揭示于上述序列编号1或13、或者这些蛋白质编码区域中的碱基序列所构成的DNA成互补的碱基序列构成的DNA、及对在严格条件下进行杂交且具有上述AM活性的蛋白质进行编码的DNA。对具有这种活性的AM蛋白质进行编码的DNA，可通过以从所属领域技术人员众所周知的方法并使用适当的片段来制作探针，再使用此探针并以菌落杂交、噬菌斑杂交、印迹杂交(Southern blot)等众所周知的杂交法，从cDNA库或者基因组库中获得。作为上述杂交中时的严格条件，例如可列举如下条件：于杂交中，清洗时的盐浓度为100～900mM、优选为150～300mM，温度为50～70℃、优选为55～65℃。杂交法的详细步骤，可参照《Molecular Cloning，ALaboratory Manual第2版》(Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)、《CurrentProtocols in Molecular Biology》(John Wiley&Sons(1987-1997)等。作为进行杂交的DNA，可列举：含有相对于序列编号1或13或者这些成熟蛋白质编码区域的碱基序列，具有至少50％以上、优选为70％、更优选为80％、更优选为90％(例如95％以上、进而99％)相同性的碱基序列的DNA。
另外，本发明中，不仅是AM，而且抑制AM分解酶活性的物质、AM受体活性修饰蛋白(RAMP)、降血钙素受体样受体(CRLR)以及肾上腺髓质素受体(AMR)等也可作为本发明的血管结构稳定化剂、血管通透性抑制剂、或者血管生成剂而加以使用。本说明书中将这些蛋白质称为AM相关蛋白质。AM及AM相关蛋白质的氨基酸序列、以及编码这些蛋白质的基因示于如下。
上述基因以及蛋白质的注册号(Accession Number)以及序列编号如表1所示。
表1
名称 注册号 碱基序列 氨基酸序列
人类AM  D14874 序列编号1 序列编号2
人类CRLR  NM_005795 序列编号3 序列编号4
人类AMR  NM_007264 序列编号5 序列编号6
人类RAMP1  NM_005855 序列编号7 序列编号8
人类RAMP2  NM_005854 序列编号9 序列编号10
人类RAMP3  NM_005856 序列编号11 序列编号12
小鼠AM  D78349 序列编号13 序列编号14
小鼠CRLR  NM_018782 序列编号15 序列编号16
小鼠AMR  NM_007412 序列编号17 序列编号18
小鼠RAMP1  NM_016894 序列编号19 序列编号20
小鼠RAMP2  NM_019444 序列编号21 序列编号22
小鼠RAMP3  NM_019511 序列编号23 序列编号24
另外，在AM相关蛋白质中，作为抑制AM分解酶活性的物质，可列举omaptrilat等肽酶抑制剂。
编码上述蛋白质的基因及其变异型、以及蛋白质及其变异型，可利用注册号的信息进行制备，或者以与上述AM及其变异体所记载的同样的方式进行制备，再使用于本发明。
2.血管生成
血管生成是个体的成长过程中自血管发生初期起可见于各器官或各组织中的生理现象之一。本发明中，是指向创伤治愈或者发生坏死的组织的血管再生等向本来不存在血管的组织中形成新的血管、以及向因疾病原因而缺失或受伤害的组织(本来不存在血管的组织)再生血管这两种情况。
此处，血管生成的机制包括：
(a)分泌促进新的毛细血管形成的因子即血管生长因子，此因子作用于附近的血管而使血管内皮细胞活化的步骤、
(b)经活化的血管内皮细胞内的酶分解基底膜的步骤、
(c)血管内皮细胞的游走及增殖步骤、以及
(d)血管内皮细胞形成血管腔的步骤。
本发明除此血管生成机制以外，还揭示了AM或者AM相关蛋白质使血管结构稳定而促进血管生成的机制，由此明确AM具有促进血管生成的作用。以下，本发明中，为了方便有时在AM或者AM相关蛋白质中，以例示AM来进行说明。
可通过如上所述使用电子显微镜的形态学观察、对AM缺损敲除动物的血管结构的观察、粘附因子或基底膜构成因子的表达、体外血管形成测试等，来确认AM使血管结构稳定。例如，可制作使AM缺失的敲除小鼠，将其与野生型动物进行比较，观察经基因敲除的情况下的异常。基因敲除动物(小鼠)可采用众所周知的方法进行制作。此处，可以利用通常的基因敲除小鼠制作技术(Circulation 104：1964-71，2001)等使AM发生缺失。例如，通过制作以抗新霉素基因将AM基因的一部分置换而成的打靶载体(targeting vector)并将此打靶载体导入ES细胞中，而人为地产生与原来的基因组序列之间的同源重组，从而制作将AM基因破坏的ES细胞。通过将此ES细胞显微注射至小鼠胚泡中，而制作嵌合体小鼠，进而由此嵌合体小鼠制作基因敲除小鼠。
纯合体AM敲除小鼠中，可见卵黄动脉的发育不全、胎儿中的出血及水肿、心包积水(图1)。另外，如果用电子显微镜观察此纯合体AM敲除小鼠的血管内腔，则发现发育阶段的血管结构异常(图2)。进而，如果以HE染色、荧光免疫染色、免疫电子显微观察纯合体AM敲除小鼠中的卵黄动脉基底膜，则发现卵黄动脉基底膜上有异常(图3)。由此显示，AM是正常的血管发生及结构维持所必需的。
此外，本发明中，除上述机制以外，还揭示了AM具有通过抑制血管通透性来促进血管生成的机制，由此明确AM具有促进血管生成的作用。此处，通过抑制血管通透性而促进血管生成的机制如下所示。即，在血管内皮细胞之间有一种称作紧密结合的紧密结构较为发达，通常情况下即使低分子也无法自由地通过。但是，在血管内皮细胞发生损害而引起炎症的部位，此细胞之间的间隙会打开，因此通常无法通过的血浆蛋白质渗漏至血管外。因此，对于如发生损害的血管内皮细胞，期望尽可能地抑制血管通透性。通过抑制此血管通透性而促进血管生成。
AM抑制血管通透性，这可通过体外血管通透性测试来确认。所谓体外血管通透性测试，是指如下测试：将底面是由半透过性膜制成的容器放置在培养皿上，将细胞在容器内以形成膜状单层的方式进行培养，利用所形成的物质测定添加于容器内的物质有多少程度转移至培养皿中。具体来说，通过在这种容器内的细胞层上添加AM等供给血管通透性试验的物质之后，从细胞层的上方添加经FITC标记的葡聚糖，再测定转移至培养皿侧的荧光，而测定通透性。由此，可调查AM的细胞通透性抑制活性。
血管生长因子包括具有促进由上述4个步骤组成的血管生成的功能的物质。作为这种血管生长因子，例如可列举：血管内皮细胞生长因子(VEGF)、肝细胞生长因子(HGF)、成纤维细胞生长因子-2(FGF-2)、促血管生成素、缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)以及转化生长因子-β(TGF-β)等，可将这些因子中的1种或多种与AM并用。例如，根据血管生成的体外模型即对在血管内皮细胞的管腔侧所表达的PECAM-1(Platelet EndothelialCell Adhesion Molecule-1，血小板内皮细胞粘附分子-1)进行免疫染色而获得的结果，可明确将AM和VEGF共同投予动物的情况与将AM以及VEGF分别单独投予动物的情况相比，更加促进血管生成(图8、9)。
另外，AM具有诱导其他血管生长因子或粘附因子的表达的作用。所谓粘附因子，是指具有促进细胞彼此结合的活性的物质。作为AM诱导其他血管生长因子等的表达的例子，可列举：经由PI3K-Akt-eNOS途径表达一氧化氮(NO)的情况。一氧化氮(NO)作为抑制炎症、并且诱导血管形成的血管生长因子而广为人知。此经由PI3K-Akt-eNOS途径表达NO的机制如下所述。即，VEGF或HGF(肝细胞成长因子)等血管生长因子，是经由磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)诱导蛋白质激酶Akt向活性型转变，其次活性型Akt将内服细胞的NO合成酶(eNOS)磷酸化而使其转化为活性型，由此促进NO的表达。此处，AM通过VEGF促进Akt以及eNOS的磷酸化，而有助于促进NO的合成(图10)。作为可由被AM诱导其表达的其他血管生长因子，例如可列举：PDGF-A(platelet derivedgrowth factor-A：血小板源生长因子-A)、PDGFRβ(PDGF receptorβ：PDGF受体β)、Tie-2、TGF-β、β-聚糖、eNOS等。另外，作为被AM诱导其表达的其他粘附因子、基底膜因子，可列举：VCAM-1(vascular cell adhesion molecule-1：血管细胞粘附分子-1)、钙粘蛋白家族、粘合素、骨桥蛋白、紧密连接蛋白-5、连环蛋白-α1或者2、4型胶原蛋白、层粘蛋白等。
另外，AM受体、以及AM的受体修饰因子即受体活性修饰蛋白(RAMP，receptoractivity modifying protein)也有助于血管结构的稳定。RAMP是一次性贯穿细胞膜的蛋白质，已知存在RAMP1～3。此RAMP如果与降血钙素受体样受体(calcitonin receptorlike receptor，CRLR)共同表达，则RAMP1与CRLR共同构成降血钙素基因相关肽受体，进而，作为类似分子的RAMP2或RAMP3也可同样地与CRLR结合，而构成肾上腺髓质素受体，因此可了解向细胞膜的转运以及决定配体特异性的机制。本发明者发现，RAMP2敲除小鼠在发育过程中显示血管结构的破坏，并产生明显的水肿或出血。另一方面，发现如果使RAMP2在内皮细胞内过度表达，则血管结构较为稳定，并促进血管生成。由此明确，RAMP对于稳定血管结构、抑制血管通透性、血管生成是必需的。
因此，本发明中，为了实现上述血管生成，可利用使血管结构稳定的作用、或者抑制血管通透性的作用。
为了确认AM受体以及RAMP使血管结构稳定的情况，可通过RAMP基因的基因打靶来制作RAMP基因敲除动物，利用电子显微镜下的观察、免疫染色、以及基因表达等方法将其与野生型动物进行比较，观察基因敲除动物体内有无血管异常。可利用从所属领域技术人员通常使用的方法进行基因打靶。若观察由此RAMP敲除动物获得的卵膜或胎儿，则发现水肿以及不形成血管等异常现象。具体来说，看到卵黄动脉的发育抑制、胚胎水肿、心包积水、出血等。作为出血或水肿的原因，可列举：血管内皮细胞从基底膜上脱离、大动脉中的血管平滑肌层变薄、大动脉血管壁的4型胶原蛋白以及α肌动蛋白的表达下降等，但并不局限于这些原因。进而，使用纯合体敲除的胎儿或脐带动脉等，对作为细胞粘附因子的钙粘附蛋白-3(cadherin3)、紧密连接蛋白-5，以及基底膜的主要构成成分即4型胶原蛋白等的基因表达进行比较，发现在RAMP纯合体敲除的胎儿中，这些细胞粘附因子及基底膜因子的表达下降。因此，认为RAMP与这些因子的表达调节有关。另外，从纯合体敲除小鼠胎儿体内摘取作为血管原基的大动脉、生殖腺、中肾区域，将其在OP9细胞上进行培养，确认血管的发育减弱。另一方面，在RAMP杂合体敲除小鼠成体中，血管中的RAMP的表达减半，Matrigel Plug测试的血管生成也减少。由此表示，RAMP对于正常的血管发育、血管构建的稳定化是必需的。另外，AM-RAMP的信号系统可使细胞粘附及血管基底膜结构稳定化，有助于稳定血管结构。因此表示，AM受体以及AM的受体修饰因子RAMP对血管形成(血管生成)也是必需的。
此处可认为，经由RAMP调节AM信号的物质(AM样物质)，也可使细胞粘附及血管基底膜结构稳定，有助于稳定血管结构。因此，这种AM样物质也与血管形成(血管生成)有关。这种AM样物质，是例如在表达RAMP的细胞中诱导细胞内信号传递的物质。
3.RAMP2过度表达细胞株的建立
本发明着眼于RAMP2，使用将取自人脐带静脉的内皮细胞进行细胞株化的EAhy926细胞，以建立过度表达RAMP2基因的细胞株。具体来说，将人类RAMP2 cDNA约580bp插入众所周知的表达载体中并加以连接，然后将表达载体导入宿主中，由此获得细胞株。另外，表达载体以及宿主，如果是可表达目标基因的表达载体以及宿主，则无特别的限制，例如除EAhy926细胞以外，还可使用HUVEC细胞等作为宿主。
由此，可制作过度表达RAMP2基因的量为对照细胞约1000倍的细胞。
RAMP2过度表达细胞的性质如下所述。
RAMP2过度表达细胞株的细胞生长能力比对照细胞低，但对细胞凋亡刺激的应答，与对照细胞比较却显示抗性，Matrigel上的管腔形成能力在RAMP2过度表达细胞中明显地亢进。
另外，在Matrigel上培养的RAMP2过度表达细胞中，形成内皮细胞的紧密连接的重要因子即紧密连接蛋白-5的基因表达亢进。此情况可利用实时PCR法进行确认。
这样，RAMP2强制表达系统可利用于通过将细胞内cAMP活性提高等作为标记，筛选显示AM样活性并促进血管生成的物质。
4.血管结构稳定化剂、血管通透性抑制剂、血管生成剂以及医药组合物
本发明的血管结构稳定化剂、血管通透性抑制剂以及血管生成剂，是以治疗或者预防缺血性疾病或者水肿为目的，含有AM作为有效成分。另外，上述AM相关蛋白质即其他众所周知的血管生长因子、抑制AM分解酶活性的物质、RAMP、CRLR、AMR(AM受体)(也称为“血管生长因子等”)也与血管生成有关。因此，本发明的血管结构稳定化剂、血管通透性抑制剂、血管生成剂，含有血管生长因子、抑制AM分解酶活性的物质、RAMP、CRLR或AMR或者这些的组合(AM相关蛋白质)作为有效成分。
因此，本发明中，为了促进血管生成，可单独使用这些AM或AM相关蛋白质，或者将这些蛋白质适当组合使用。即，本发明提供一种含有选自以AM、血管生长因子、抑制肾上腺髓质素分解酶活性的物质、RAMP、CRLR以及AMR所组成群组中的至少一个的缺血性疾病或者水肿的治疗或预防剂。
另外，本发明提供一种医药组合物，该医药组合物是用于联合投予AM与血管生长因子、抑制AM分解酶活性的物质、RAMP、CRLR及AMR中的任一个或者组合(AM相关蛋白质)。所谓“联合投予”，是指将AM与血管生长因子等混合后同时投予的方法、投予其中一个后再投予另一个的方法(投予顺序无规定)中的任一种方法。只要是在同一投予计划内投予AM与AM相关蛋白质，则包括在本发明的“联合投予”中。
作为抑制AM分解酶的物质，具体可列举omaptrilat等肽酶抑制剂，但并不局限于这些。
所谓缺血性疾病，是指由于循环系统障碍导致器官血流量下降而产生的疾病，具有代表性的是动脉硬化性疾病。作为动脉硬化性疾病等缺血性疾病，例如可列举：脑梗塞、心肌梗塞、心绞痛、闭塞性动脉硬化症、伯格氏病(也称为血栓闭塞性脉管炎(thromboangiitis obliterans))、其他动脉硬化性疾病。另外，心肌梗塞、心绞痛、脑梗塞、闭塞性动脉硬化症以及伯格氏病是动脉硬化性疾病同时也是缺血性疾病，为方便起见，本说明书中将其作为缺血性疾病的一部分加以说明。
所谓水肿，是指水份异常地储溜于细胞间隙的状态，水肿可全身性地发生也可局部性地发生。发生水肿的全身性因素，是肾中的水与钠的排泄障碍；局部因素，是经过毛细血管壁的水份交流、淋巴流、组织的水保持力等。这些因素复杂地交织而发生水肿。水肿包括：脑水肿、心水肿、肾水肿、肝水肿、营养性(低蛋白质性)水肿、血管性水肿、血管神经性水肿、炎症性水肿、过敏性水肿、视网膜水肿、小腿水肿等，优选脑水肿。
在使用本发明的血管结构稳定化剂、血管通透性抑制剂、血管生成剂或者医药组合物时，对其适用部位没有特别限定，可将血管、关节、皮肤、眼、鼻、肿瘤等作为对象而加以应用。另外，本发明中，上述缺血性疾病或者水肿的种类并不限定为1种，多种疾病或者水肿并发的情况也可作为适用的对象。
可将本发明的血管结构稳定化剂、血管通透性抑制剂、血管生成剂或者医药组合物投予需要生成血管的哺乳动物。作为成为投予对象的哺乳动物，例如除人类以外，还可列举：牛、马、绵羊、山羊等家畜；狗、猫等宠物；小鼠、大鼠、豚鼠、兔子等实验动物；但不限定于这些动物。
本发明的血管结构稳定化剂、血管通透性抑制剂、血管生成剂或者医药组合物的投予方式可为口服、非口服投予中的任一种。在进行口服投予时，例如可使用片剂、胶囊剂、颗粒剂、散剂或者糖浆剂等进行投予。在进行非口服投予时，可列举：注射剂、栓剂或者滴眼剂等，吸入剂型(例如使用喷雾器等的剂型)，经鼻腔投予剂型，经皮投予剂型(例如软膏、霜剂)等。在投与方式为注射剂型时，例如可通过点滴等静脉内注射、肌内注射、腹腔内注射、皮下注射等进行全身或者局部投予。可使用赋形剂、润滑剂、粘合剂、崩解剂、稳定剂、矫味矫臭剂、稀释剂等医药上许可的添加剂，通过众所周知的方法来制造这些制剂。
作为赋形剂，例如可列举：马铃薯淀粉、玉米淀粉等淀粉，乳糖，结晶纤维素，磷酸氢钙等。
作为润滑剂(包衣剂)，例如可列举：乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、虫胶、滑石粉、巴西棕榈蜡、石蜡等。
作为粘合剂，例如可列举：聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇以及与前述赋形剂相同的化合物。
作为崩解剂，例如可列举：与上述赋形剂相同的化合物以及交联羧甲基纤维素钠、羧甲基淀粉钠、交联聚乙烯吡咯烷酮等经化学修饰的淀粉及纤维素类。
作为稳定剂，例如可列举：对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯等对羟基苯甲酸酯类；氯丁醇、苯甲醇、苯乙醇等醇类；苯扎氯铵；苯酚、甲酚等酚类，进而可列举：硫柳汞、脱氢醋酸以及山梨酸。
作为矫味矫臭剂，例如可列举通常使用的甜味料、酸味料、香料等。
另外，作为用于制造液剂的溶剂，可使用乙醇、苯酚、氯甲酚、纯化水、蒸馏水等。
作为表面活性剂或者乳化剂，例如可列举：聚山梨酸酯80、硬脂酸聚烃氧酯40、等。
上述添加物等，可根据本发明的血管生成剂的剂型从上述之中单独选择一个或者选择后加以适当组合。例如，于作为注射用制剂使用时，可使用将经精制的AM溶解于溶剂(例如生理盐水、缓冲液、葡萄糖溶液等)中，再向其中加入Tween 80、Tween 20、明胶、人血清白蛋白等而形成的制剂。或者，也可使用为了形成使用前进行溶解的剂型而进行冷冻干燥的制剂。作为冷冻干燥用赋形剂，例如可使用甘露醇、葡萄糖等糖醇或糖类。
本发明的血管结构稳定化剂、血管通透性抑制剂、血管生成剂或者医药组合物的投予量，根据年龄、性别、症状、投予途径、投予次数、剂型而不同。根据患者的年龄、症状来适当选择投予方法。关于有效投予量，例如可以50ng/小时的剂量持续给药，每次每公斤体重为1.0～5.0μg/小时。但是，上述血管结构稳定化剂、血管通透性抑制剂以及血管生成剂的投予量并不限制于这些投予量。
本发明的血管结构稳定化剂、血管通透性抑制剂以及血管生成剂中，也可与如上所述的众所周知的血管生长因子并用。本发明中所使用的血管生长因子中有血管内皮细胞生长因子(VEGF)、肝细胞生长因子(HGF)、成纤维细胞生长因子-2(FGF-2)、促血管生成素、缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)以及TGF-β，但并不限定于这些。
本发明的联合疗法用医药组合物中，上述AM与AM相关蛋白质的投予量根据年龄、性别、症状、投予途径、投予次数、剂型而不同。根据患者的年龄、症状来适当选择投予方法。关于有效投予量，例如可以50ng/小时的剂量进行持续投予，每次每公斤体重为1.0～5.0μg/小时，但并不限制于这些投予量
可进行如下试验来研究本发明的血管结构稳定化剂、血管通透性抑制剂、血管生成剂以及医药组合物的效果。例如，可使用下肢缺血模型小鼠来评价血管生成能力(参照实施例)。
另外，可进行使用AM敲除小鼠的恢复试验。AM表达量下降的AM敲除小鼠在制作下肢缺血模型时血管生成能力会下降，但如果将AM外源性地向AM敲除小鼠补充投予，则可确认血管生成能力恢复。将此试验称为“恢复试验”。
进而，本发明中，通过将AM或AM相关蛋白质(血管生长因子、抑制肾上腺髓质素分解酶活性的物质、肾上腺髓质素受体活性修饰蛋白、降血钙素受体样受体以及肾上腺髓质素受体)向需要血管生成的哺乳动物(人或者非人类哺乳动物)投予，可生成血管；或者，通过使上述AM或AM相关蛋白质在需要血管生成的哺乳动物体内获得表达(例如基因表达)，可在此哺乳动物体内生成血管。所谓“表达”，是指在哺乳动物内产生AM或AM相关蛋白质。在进行基因治疗时，其特征为，将AM基因、编码血管生长因子的基因、编码RAMP的基因、编码CRLR的基因、编码AMR的基因单独向哺乳动物投予，或者进行适当组合后向哺乳动物投予。
在进行基因治疗时，除了通过注射各基因而进行直接投予的方法以外，还可列举投予经核酸导入的载体的方法。作为上述载体，可列举：腺病毒载体、腺相关病毒载体、疱疹病毒载体、牛痘病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体等，通过使用这些病毒载体可高效地进行投予。
另外，也可将上述基因导入脂质体等的磷脂质小泡体中，再投予此小泡体。例如，利用脂质转染法(lipofection)将保持上述基因的小泡体导入特定的细胞中。于是，将所获得的细胞以例如静脉内、动脉内等方式进行全身投予。也可将上述细胞向脑等部位进行局部投予。
本发明的血管结构稳定化剂、血管通透性抑制剂、血管生成剂或者医药组合物的投予量，根据年龄、性别、症状、投予途径、投予次数、剂型而不同，在进行基因治疗时，例如使用腺病毒时的投予量为1日1次约106～1011个。
为了将基因治疗中所使用的AM基因及RAMP基因等导入目标组织或者器官中，也可使用市售的基因导入试剂盒(例如Adeno-X PRLS：Clonetech公司)。
进而，利用本发明的血管结构稳定化剂、血管通透性抑制剂、血管生成剂或血管生成方法可治疗或者预防缺血性疾病或者水肿的情况，例如可通过进行如下的局部注射高渗透压物质形成下肢水肿模型的试验来确认(参照实施例)。
5.筛选方法
本发明提供一种利用AM或者AM相关蛋白质的表达低下(减低)的细胞或者动物(例如实验哺乳动物)，来筛选具有稳定血管结构作用的物质、具有抑制血管通透性作用的物质、具有血管生成活性的物质或者促进血管生成活性的物质的方法。例如，将被试验物质投予AM基因或者AM相关基因表达低下(减低)的动物，然后分析被试验物质在此动物体内的作用(例如有无对血管生成的改善)，由此可获得目标物质。
另外，本发明还提供一种使用具有AM或AM相关蛋白质的细胞、或者使AM或AM相关蛋白质过度表达的细胞，使被试验物质与这些细胞接触，再分析被试验物质在细胞内的作用，由此筛选具有稳定血管结构的作用的物质、具有抑制血管通透性的作用的物质、具有血管生成活性的物质或者促进血管生成活性的物质的方法(例如体外筛选方法)。
所谓“被试验物质的作用”，是指通过候补物质与上述经表达的蛋白质结合，而在细胞内引起特定现象的作用；包括促进以及抑制AM或AM相关蛋白质的活性的作用这两个作用。所谓“分析”，是指测定通过这些相互作用是否具有血管生成活性、或者是否促进血管生成活性。相互作用的机制包括：与受体的相互作用、细胞内的信号传递等。一般来说，筛选以治疗以及预防上述必须生成血管的疾病为目的的激动剂或者拮抗剂。
具体筛选方法为：使被试验物质与AM或AM相关蛋白质(例如RAMP2)过度表达的细胞相接触，然后测定有无此细胞内的信号传递，再选择显示有与AM相同的信号传递的物质。
可使用能够在市场上购得的检测测试试剂盒来测定细胞内的信号传递。例如，可将细胞内cAMP、cGMP、钙离子、三磷酸肌醇等第二信使；腺苷酸环化酶、磷脂酶等第二信使合成酶；酪氨酸/苏氨酸激酶等蛋白质激酶；蛋白脱磷酸酶；低分子型GTP结合蛋白(G蛋白、ras蛋白等)；半胱氨酸蛋白酶等的活性提高作为指标。
成为本发明筛选方法的对象的物质，是具有稳定血管结构的作用的物质、具有抑制血管通透性的作用的物质、具有血管生成活性的物质或者促进血管生成活性的物质，特别是经由RAMP而与AM受体结合的AM样物质。
所谓“具有稳定血管结构的作用的物质”，是指具有上述术语“稳定血管结构”中所定义的作用的物质，是指具有通过稳定血管内皮细胞之间的粘附、稳定内皮细胞与基底膜的粘附、稳定基底膜结构、稳定血管平滑肌的层结构等，而长期维持稳定的血管管腔结构的作用的物质。
所谓“具有抑制血管通透性的作用的物质”，是指具有上述术语“抑制血管通透性”中所定义的作用的物质，是指具有通过稳定血管结构，而使血管内的水份或血细胞成分不从血管中漏出，从而抑制出血或水肿等发生的作用的物质。
所谓“具有血管生成活性的物质”，是指本身具有血管生成活性的物质，可列举与VEGF等的生长因子具有相同功能的物质。
另外，“促进血管生成活性的物质”是指以下两种物质：使具有血管生成活性的物质的表达及活性表现出亢进的物质；以及通过对抑制血管生成活性的物质的表达及活性加以抑制，而产生血管生成活性的物质。
作为供于筛选的被试验物质，例如可列举：肽、多肽、合成化合物、微生物、微生物代谢物、从动植物的组织或细胞中提取的物质、或者这些物质的库。作为这些物质的库，可列举：合成化合物库(组合库等)、肽库(组合库等)等。作为供于筛选的物质，可为天然物也可为合成物，而且，既可对成为候补的单个化学物质进行独立试验，亦可对若干成为候补的化学物质的混合物(包括库等)进行试验。另外，对于细胞提取物，也可反复进行分离而分离出具有所需活性的物质。
目的物质是否具有稳定血管结构的作用，可利用上述所说明的任意方法进行判断或者确认，例如使用电子显微镜的形态学观察、基因敲除小鼠的血管结构的观察、粘附因子或基底膜构成因子的表达、体外血管形成测试等，对其方法并无任何限制。也可通过进行上述恢复试验来判断或确认。
另外，是否具有抑制血管通透性作用，可通过体外血管通透性试验、基因敲除小鼠的血管通透性观察、水通道的基因的表达等来判断或者确认，并无任何限制。也可通过进行上述恢复试验来判断或确认。
目的物质是否具有血管生成作用、或者是否具有促进血管生成作用，例如可通过进行上述恢复试验来判断或者确认(但是，并不限定于恢复试验)。而且，对于AM或者AM相关蛋白质敲除小鼠，可将是否发现卵黄动脉发育不全、胎儿体内的出血以及水肿、心包积水等的改善，血管是否发生及结构是否得以维持作为指标。对于血管的发生及结构维持，可通过HE染色、免疫荧光染色、电子显微镜观察等来进行上述判断。
在使用细胞进行体外筛选时，向使AM受体或RAMP过度表达的细胞投予候补物质。在体外的Matrigel培养上导致管腔结构亢进的物质、或者引起细胞内的cAMP活化或者PI3K-Akt-eNOS系统活化的物质，可判断为经由AM受体或RAMP而促进血管生成的物质。
以下，通过实施例更具体地说明本发明。但是，本发明并不限定于这些实施例。
[实施例1]AM基因敲除小鼠的制作
用抗新霉素基因将小鼠AM基因的exon1～3以及4的一部分加以置换，而制作打靶载体。
即，将AM基因的cDNA作为探针，从来自129小鼠基因组的λ噬菌体库中筛选出含有AM基因序列的λ噬菌体克隆体。利用限制性内切酶，从此克隆中切出AM基因的exon1的5′侧约7.8kb的片段、及exon4的中间起至3′侧的约1kb的片段，以将这2个片段间夹有抗新霉素基因(PGK-neor)而亚克隆成pBluescript的方式，制作打靶载体。以下述方式进行设计：通过使在此打靶载体与基因组DNA之间产生同源重组，而将含有AM基因的exon1～3及exon4的一部分的2.4kb基因组DNA加以破坏。
用细胞膜电穿孔法将所获得的载体导入小鼠ES细胞中。筛选出将导入基因与基因组序列进行同源置换的ES细胞，将此ES细胞显微注射至小鼠胚泡中，制作嵌合体小鼠。使嵌合体小鼠与野生型小鼠交配，挑选出继承了导入基因的小鼠，获得AM杂合体基因敲除小鼠。通过使杂合体小鼠彼此交配，而获得纯合体小鼠。
其结果，在胎生13.5天的AM纯合体基因敲除小鼠中，可见卵黄动脉发育不全、胎儿中的出血以及水肿、心包积水；显示AM是正常的血管发育及结构维持所必需的(图1)。
图1中，图A表示卵膜、胎盘，图B表示胎儿，图C表示胎儿的心脏、心囊。图的上排是属于野生型，下排是属于AM纯合体基因敲除小鼠。
另外，用电子显微镜观察胎生12.5天的AM纯合体基因敲除小鼠的血管内腔，看到发育阶段的血管结构异常(图2)。图2中，图A的左侧是扫描式电子显微镜照片，右侧是透射电子显微镜照片，图B表示透射式电子显微镜照片的模式图。正常小鼠(图A及图B的“+/+”)正常地形成血管，相对于此，纯合体敲除小鼠(图A及图B的“-/-”)在血管中产生很多空隙。
进而，用HE染色、免疫荧光染色、免疫电子显微观察纯合体AM敲除小鼠中的卵黄动脉基底膜，结果发现形成卵黄动脉基底膜的4型胶原蛋白的表达上有异常(图3)。图3中，图A表示HE染色图像，图B表示免疫染色图像，图C表示免疫电子显微镜照片。
因为纯合体AM敲除小鼠(AM-/-)在胎生时死亡，所以在以下实验中使用杂合体AM敲除小鼠。
[实施例2]使用下肢缺血模型小鼠评价血管生成能力的试验
首先，通过以下方法制作小鼠下肢缺血模型。
用戊巴比妥钠将C3H小鼠麻醉，然后切开一侧下肢的皮肤，露出大腿动脉。上侧在腹股沟部下侧在膝窝部结扎大腿动脉，将此范围的大腿动脉切除，制作下肢缺血模型。观察由于大腿动脉切除后的侧枝循环的发育所导致的血流恢复。
将6月龄的C3H小鼠分成AM投予组、VEGF投予组、对照组3组。对AM处理组的小鼠，使用渗透泵持续注射AM(50ng/h)。在VEGF组中，给每只小鼠肌内注射20μl的VEGF(5ng/h)，以此作为阳性对照。给对照组的小鼠持续注射PBS。
使用激光多普勒血流成像仪观察下肢缺血模型中的血流。另外，调查了AM的创伤治愈效果。其结果，在AM投予组的小鼠中，确认下肢血流恢复得到改善(图4，“AM”)。图4中，可知在缺血模型制作当天(Day0)，形成缺血的脚部几乎未看到血流，但在第7天以及第12天，AM投予组的血流开始恢复。另外，在AM投予小鼠中观察到创伤缩小，在缺血后截断下肢以及下肢缩短的现象减少(图5)。图5中，在AM投予小鼠中，下肢正常或者创伤轻微的小鼠超过80％，截断下肢的小鼠或者创伤严重的小鼠比对照组少。
图中，“*”表示p＜0.05。本说明书中，以下相同。
如果以形成缺血一侧(左侧：L)的下肢血流与未形成缺血的一侧(右侧：R)的下肢血流之比(L/R)来表示而将血流恢复定量化，则确认通过投予AM而有意义地使血流恢复(图6，图A)。进而，在进行手术的一侧的下肢的肌肉内，新生血管的数量增加(图6，图B)。相对于此，在AM杂合体基因敲除小鼠(AM+/-)、以及投予由AM的氨基酸序列中的22号至52号氨基酸序列所构成的切断型变异体“AM22-52”(AM拮抗剂)的小鼠中，血流恢复以及血管生成被抑制(图7)。图7中，“**”表示p＜0.01。本说明书中，以下相同。
[实施例3]使用在内皮细胞与成纤维细胞的共培养系统中的血管生成的体外模型，来评价投予AM以及VEGF时的血管生成能力的试验
如果将来自人类皮肤的成纤维细胞与来自人类脐带静脉的内皮细胞(HUVEC)进行11天共培养，再使用PECAM-1(Platelet Endothelial Cell Adhesion Molecule-1，血小板内皮细胞粘附分子-1)抗体进行免疫染色，则可绘出管腔结构形成。使用此系统，可在体外对血管生成能力进行评价。因此，将AM或VEGF投予此培养系统中，对血管生成能力进行评价。
结果示于图8以及图9。图8中，图A表示对照，图B表示投予VEGF时的结果，图C表示投予AM时的结果，图D表示将AM与VEGF联合投予时的结果。另外，图9中，图A表示单独使用AM时的血管长度(相对比)，图B表示将AM与VEGF并用时的血管长度(相对比)，图C表示细胞数(相对比)。在内皮细胞以及成纤维细胞中，共同投予AM与VEGF后进行培养的情况，与单独投予AM或者VEGF的情况相比，通过PECAM-1染色可较多地绘出管腔结构(图8，图D)。其结果显示，通过并用AM与VEGF而使血管生成亢进。
另外，如果并用AM与VEGF，则可浓度依赖性地增强管腔形成(图9，图B)。另外，在另一实验中，在培养系统中确认了血管内皮细胞的细胞增殖，结果确认，并用VEGF与AM的情况和分别单独投予VEGF或者AM的情况相比，细胞数的增加更为亢进(图9，图C)。图9中，“##”表示与AM单独投予组进行比较时的p＜0.01。
[实施例4]由于投予VEGF及AM而导致Akt及eNOS的磷酸化
向取自人脐带静脉的内皮细胞(HUVEC)的培养系统，单独投予AM(10-11～10-7M)、或者联合投予AM与VEGF(10ng/ml)，从细胞中提取蛋白质，进行免疫印迹，对Akt及eNOS的磷酸化进行研究。
其结果，AM增强了由于VEGF所导致的Akt及eNOS的磷酸化(图10)。图10中，图A表示Akt的磷酸化，图B表示eNOS的磷酸化。由此确认，AM增强了VEGF的信号系统即PI3K-Akt-eNOS途径。
[实施例5]由于AM导致VEGF的表达增强
在与实施例2同样制作的小鼠缺血下肢模型中，以颈椎脱臼方式处死小鼠后，对大腿部肌肉进行取样，从其中提取蛋白质，进行免疫印迹。
结果示于图11。图11中，图A表示AM投予组及对照组的缺血下肢样本的VEGF的免疫印迹，图B表示将图A定量化的图，图C表示AM敲除小鼠及野生型小鼠的缺血下肢样本的VEGF的免疫印迹，图D表示将图C定量化的图。
投予AM的小鼠中的VEGF的表达，在缺血手术后的初期(第1天)开始逐渐增加(图11，图A及图B)。相对于此，AM杂合体基因敲除小鼠(AM+/-)与野生型相比，VEGF的表达下降(图11，图C及图D)。
另外，利用RT-PCR法来分析人动脉内皮细胞(HAEC)中的VEGF表达。
结果示于图12。图12中，图A表示VEGF表达的AM浓度依赖性，图B表示VEGF表达的AM刺激时间依赖性。通过投予AM，而浓度依赖性及时间依赖性地使VEGF的表达增加(图12，图A及图B)。
[实施例6]使用AM敲除小鼠以及Flk-1敲除小鼠的恢复试验
本实施例中，与实施例2同样地制作小鼠下肢缺血模型，向AM杂合体基因敲除小鼠(AM+/-)外源性地补充投予AM或者VEGF，观察此时的血流恢复。
AM表达量下降的AM+/-中，血流恢复下降(图13，图A的“●”)，如果向此AM敲除小鼠补充投予AM(图13，图A的“▲”)、或者补充投予VEGF(图13，图A的“□”)，则可确认其血管生成能力得到恢复。
进而，通过向AM+/-补充投予AM或者VEGF，而与野生型小鼠同等地使新生血管的生成得到恢复(图13，图B)。
另一方面，作为与以上相反的恢复实验，是使用将VEGF受体之一的Flk-1敲除的小鼠，进行AM的补充投予实验。Flk-1敲除小鼠与野生型相比，血流恢复下降。如果向野生型小鼠外源性地投予AM，则血流恢复亢进，但即使向Flk-1敲除小鼠外源性投予AM也未确认血流的恢复(图14)。
根据以上确认，在生物体中，AM的血管生成作用是经由VEGF的信号而产生。
[实施例7]使用基因阵列对表达基因的检测
本实施例中，使用小鼠下肢缺血模型的样本，利用基因阵列来观察由于投予AM而使表达水平发生变化的基因群。
其结果，AM诱导了多个血管生长因子或粘附因子的表达。图15表示基因阵列的一例。与对照组相比，通过投予AM而使eNOS、骨桥蛋白(Osteopontin)、VEGF、VCAM-1等的表达提高。
另外，将在对AM投予组与对照组进行比较、以及对野生型小鼠与AM杂合体基因敲除小鼠进行比较时高度表达的基因示于表2。
表2
    AM(+)/对照组     野生型/AM+/-
  eNOS骨桥蛋白VEGFVCAM-1TGFββ-多聚糖Tie-2COL18A1PAI-1PDGF-APDGFRβ     1.711.931.503.654.046.763.612.721.795.601.58     2.207.801.703.551.703.222.812.611.926.062.08
[实施例8]体外血管通透性测试
将由半通透性膜制的容器放置在培养皿上，以HUVEC在膜上形成单层的方式进行培养(培养条件：EBM-2培养基、5％CO2、37℃、24小时)。向此培养后的培养皿中添加供于血管通透性试验的物质，然后从细胞层的上方添加经FITC标记的葡聚糖，通过测定向培养皿侧移动的荧光而测定通透性。其结果，VEGF使血管通透性亢进，相对于此，在添加AM时血管通透性被抑制。进而，通过向VEGF中追加投予AM，而抑制由于VEGF所导致的血管通透性亢进(图16)。
[实施例9]局部注射高渗透压物质而形成的下肢水肿模型
如果向小鼠脚底的脚垫中局部投予高渗透压物质角叉菜胶，则可形成一过性水肿。通过每小时测定脚的厚度，来评价所形成的水肿的程度。
其结果，与对照组中产生水肿(图17，“●”)相反，AM持续投予小鼠中下肢水肿的形成被抑制(图17，“▲”)。
本实施例的结果显示，AM抑制血管通透性，并对治疗下肢水肿有效。
[实施例10]对脑水肿的抑制
用戊巴比妥钠将小鼠麻醉后，打开头盖骨，将零下80度的滚筒在硬膜上推滚而造成损伤。24小时后处死小鼠，摘出脑，对由于发生脑水肿而导致脑重量的增加进行定量。另外，在同样的脑水肿模型中，从尾静脉注射经荧光标记的葡聚糖，使用荧光平面阅读器对在脑中漏出至血管外的荧光色素进行定量。
结果示于图18。图18中，图A表示血管通透性的测定结果，图B表示脑重量的测定结果。AM投予组与对照相比，血管通透性被抑制(图18，图A)，脑重量也有减少(图18，图B)。脑中的血管通透性的亢进与脑水肿有关，因此本实施例的结果表示，AM对治疗脑水肿有效。
[实施例11]RAMP2基因敲除小鼠的制作
本实施例中，用与实施例1同样的方法制作肾上腺髓质素受体活性修饰蛋白2(receptor activity modifying protein 2：RAMP2)的基因敲除小鼠。
RAMP2纯合体基因敲除小鼠，与AM纯合体基因敲除小鼠同样地在胎生中期死亡。其原因是与AM纯合体基因敲除小鼠同样地与血管发育异常伴发的水肿及出血。AM受体是通过CRLR(calcitonin receptor like receptor，降钙素受体样受体)与RAMP2或者RAMP3的组合而形成，根据其结果显示，作为AM的血管生成中的RAMP，重要的是RAMP2。
RAMP2纯合体基因敲除小鼠(RAMP2-/-)的卵膜与野生型相比，较为肿胀(图19，图A)。另外，RAMP2-/-(图19，图C)在卵膜上游走的卵黄动脉的发育与野生型(图19，图B)相比，受到抑制(图19，图C)。进而，在胎生第13.5天，RAMP2-/-与野生型相比，全身产生水肿(图20)。另外，RAMP2-/-中，确认有心包积水(图21，图B、D)。另外，图21的图C及图D分别是野生型小鼠及RAMP2-/-的心脏及心囊的切片的显微镜照片。
在第14.5天的胚胎中，在RAMP2-/-中看到明显的出血(图22)。图22中，图A是胎生第14.5天的胎儿的照片，图B及图C分别是野生型小鼠、RAMP2-/-的肝脏组织的HE染色图像。在肝脏组织中，在RAMP2-/-中，看到由于血管破裂而导致的出血观察结果。
以上的变化是与肾上腺髓质素纯合体敲除同样的观察结果，表示肾上腺髓质素-RAMP2的信号对于正常的血管发生是必需的。
[实施例12]RAMP2纯合体敲除的血管异常
本实施例中，对RAMP2纯合体敲除小鼠(RAMP2-/-)胎生第13.5天的胎儿的血管构造进行详细分析。在电子显微镜的观察中，在RAMP2-/-中观察到卵黄动脉的血管内皮细胞从基底膜上脱离的图像(图23，箭头)。进而，在大动脉中，RAMP2-/-的血管平滑肌层比野生型薄(图24，箭头)。
在利用荧光免疫染色法对大动脉的观察中，血管壁的4型胶原蛋白以及α肌动蛋白的表达下降(图25)。这样的血管异常是导致RAMP2-/-的出血及水肿的原因，表示肾上腺髓质素-RAMP2的信号对于稳定血管构建是必需的。
[实施例13]RAMP2纯合体敲除的胎儿、以及脐带动脉中的基因表达变化
使用胎生第13.5天小鼠胎儿样本，利用实时PCR法研究基因表达变化。RAMP2纯合体基因敲除小鼠(RAMP2-/-)的胎儿中，由于肾上腺髓质素-RAMP2的信号消失，因此看到代偿性的肾上腺髓质素的表达亢进，但在肾上腺髓质素受体CRLR以及另一种肾上腺髓质素受体活性修饰蛋白(receptor activity modifying protein)RAMP3中，却未看到表达的变化(图26)。
以上结果显示，在血管发生中，RAMP2与RAMP3之间不存在互补性，血管的正常发生必须有肾上腺髓质素-RAMP2的信号。
进而，在胎生第13.5天，利用实时PCR对小鼠脐带动脉中的基因表达进行研究。其结果，在RAMP2纯合体基因敲除的情况下，确认作为细胞粘附的因子钙粘附蛋白-3、紧密连接蛋白-5，以及基底膜的主要构成成分即4型胶原蛋白的表达下降(图27)。
根据以上情况显示，肾上腺髓质素-RAMP2的信号系统发挥使细胞粘附及血管底膜结构稳定，从而稳定血管结构的作用。
[实施例14]CRLR、AM、RAMP2以及RAMP3的表达量的测定
(1)使用野生型小鼠胎儿，利用实时PCR法测定CRLR、AM、RAMP2以及RAMP3的表达量。
测定是在胎生第11.5天(E11.5)、第12.5天(E12.5)、第13.5天(E13.5)以及第14.5天(E14.5)进行。
其结果显示，RAMP2在胎生中期表达亢进(图28)。
(2)接着，将胎生第10.5天的AGM(大动脉-生殖腺-中肾区域)在OP9细胞上进行培养，用PECAM-1进行免疫染色，结果显示，由于胎儿AGM区域培养而导致血管生成，在RAMP2纯合体基因敲除小鼠(RAMP2-/-)中减弱(图29)。由此显示，RAMP2对于血管生成是必需的。
[实施例15]在Matrigel上培养HUVEC中的基因表达
(1)向在Matrigel上进行培养的HUVEC外源性地投予肾上腺髓质素，刺激24小时后，回收细胞再提取RNA，通过实时PCR法研究紧密连接蛋白-5的基因表达。
结果示于图30。图30中，左图是刺激后12小时、24小时以及48小时紧密连接蛋白-5的基因表达的对比。由于投予AM，而使内皮细胞的紧密连接蛋白-5的表达亢进(图30左图)。
(2)同样地向在Matrigel上培养的HUVEC，投予由AM的氨基酸序列中的22号至52号氨基酸序列所构成的切断型变异体“AM22-52”，对基因表达进行研究。其结果，如果投予“AM22-52”，则紧密连接蛋白-5的表达反而会下降(图30右图)。
[实施例16]对RAMP2+/-的大动脉以及心脏中的RAMP2、RAMP3、CRLR以及AM的表达量的研究
(1)通过实时PCR法，对RAMP2杂合体基因敲除小鼠(RAMP2+/-)以及野生型小鼠成体的大动脉以及心脏中的RAMP2、RAMP3、CRLR以及AM的表达量进行比较。
其结果显示，在RAMP2+/-中，循环系统(大动脉以及心脏)中的RAMP2的表达减半(图31左图)。
进而，用尾血压计(Tailcuff)测定小鼠的收缩期血压，RAMP2+/-小鼠的收缩期血压与野生型相比有意义地提高。即，RAMP2+/-中显示RAMP2的表达被抑制，血压也较高(图31右图)。
(2)使用RAMP2+/-的Matrigel Plug测试
将含有bFGF的Matrigel注入小鼠皮下，1星期后切开注射部的皮肤，观察进入Matrigel中的新生血管。
其结果显示，RAMP2+/-的血管生成与野生型相比减弱(图32)。
(3)局部注射高渗透压物质的下肢水肿模型
如果向小鼠脚底的脚垫中局部投予高渗透压物质角叉菜胶，则可形成一过性水肿。其后，每小时测定脚的厚度，由此评价RAMP2+/-以及野生型小鼠中所形成的水肿的程度。
其结果显示，RAMP2+/-小鼠的下肢水肿亢进(图33)。
[实施例17]使用RAMP2稳定过度表达细胞株的研究
(1)RAMP2稳定过度表达细胞株的制作
本实施例中，使用将取自人类脐带静脉的内皮细胞进行细胞株化的EAhy926细胞，向其中导入RAMP2基因，制作RAMP2稳定过度表达细胞株。
其方法为：将人RAMP2 cDNA约580bp插入表达载体pcDNA3.1中，利用限制性内切酶(Sal I)处理使此表达载体(图34)而形成单链DNA，然后使用QIAGEN公司制造的转染试剂Effectene，将基因导入EAhy926细胞中。将新霉素添加至培养液中，选择活菌落，由此来筛选导入基因的细胞菌落。
其结果，获得过度表达RAMP2基因的量是对照细胞约1000倍的细胞(图34)。
对此细胞的增殖能力、针对细胞凋亡刺激的应答、在Matrigel上的管腔形成能力等进行如下研究。
(2)RAMP2、RAMP3、AM以及CRLR的表达量
将已导入RAMP2基因的细胞、及已导入对照载体的对照细胞，在普通培养皿上或者涂有Matrigel的培养皿上进行培养。从这些培养细胞中提取RNA，利用实时PCR法对RAMP2、RAMP3、AM以及CRLR的基因表达进行比较研究。其结果，RAMP2基因导入细胞，无论在普通培养皿上还是在Matrigel培养皿上进行培养，都确认有RAMP2的过度表达。RAMP3、AM以及CRLR在RAMP2基因导入细胞中的表达，与对照细胞相比并没有发现差异(图35)。
(3)RAMP2过度表达细胞的管腔形成能力
如果将EAhy926细胞在涂有Matrigel的培养皿中继续培养，则在Matrigel内形成管腔结构。在RAMP2过度表达细胞与对照细胞中，对在Matrigel中的管腔形成进行比较，RAMP2过度表达细胞的管腔形成能力明显地亢进(图36)。
(4)细胞增殖以及生存试验
通过BrdU的摄入，对RAMP2过度表达细胞与对照细胞的细胞增殖能力进行比较研究。其结果，RAMP2过度表达细胞的细胞增殖与对照细胞相比反而下降(图37左图)。另一方面，通过细胞生存测试(WST-8测试)测定添加TNFα时的生存细胞数，在RAMP2过度表达细胞中添加400ng/ml的TNFα时的生存细胞数与对照细胞比较，为有意义地多(图37右图)。
(5)TNFα诱导细胞凋亡
通过对从发生细胞凋亡的细胞中漏出至培养上清液中的LDH(lactosedehydrogenase，乳糖脱氢酶)进行定量，来研究TNFα诱导性细胞凋亡的反应性。另外，用TNFα对细胞进行24小时处理后，提取RNA，利用RT-PCR法对细胞凋亡相关基因的表达进行研究。
其结果，RAMP2过度表达细胞中，由于细胞凋亡而导致细胞死亡的情况减少(图38的左图)。另外，细胞凋亡的促进因子bax-α的表达下降(图38的右图)。
由此显示，RAMP2过度表达细胞与对照细胞相比，对细胞凋亡更具有抗性。
[产业上的可利用性]
根据本发明可提供一种含有肾上腺髓质素作为有效成分的血管生成剂。另外，根据本发明可提供一种含有选自以抑制肾上腺髓质素分解酶活性的物质、肾上腺髓质素受体活性修饰蛋白、降血钙素受体样受体以及肾上腺髓质素受体所组成群组中的至少一种作为有效成分的血管生成剂。
AM发挥稳定血管结构的作用，进而兼有抗动脉硬化作用，因此期待本发明成为解决目前血管生成疗法中的各种问题的新方法。
进而，确认AM具有其他血管生长因子中未发现的独特性质，即抑制血管通透性的作用，因而认为AM可有效地治疗脑梗塞、脑出血、脑水肿等。
序列表
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Claims (44)

1.一种血管结构的稳定化剂，其特征在于：其含有肾上腺髓质素作为有效成分。
2.一种血管结构的稳定化剂，其特征在于：其含有选自以抑制肾上腺髓质素分解酶活性的物质、肾上腺髓质素受体活性修饰蛋白、降钙素受体样受体以及肾上腺髓质素受体所组成群组中的至少一种作为有效成分。
3.根据权利要求2所述的稳定化剂，其特征在于：肾上腺髓质素受体活性修饰蛋白为RAMP1、RAMP2或者RAMP3。
4.一种血管通透性的抑制剂，其特征在于：其含有肾上腺髓质素作为有效成分。
5.一种血管通透性的抑制剂，其特征在于：其含有选自以抑制肾上腺髓质素分解酶活性的物质、肾上腺髓质素受体活性修饰蛋白、降钙素受体样受体以及肾上腺髓质素受体所组成群组中的至少一种作为有效成分。
6.根据权利要求5所述的抑制剂，其特征在于：肾上腺髓质素受体活性修饰蛋白为RAMP1、RAMP2或者RAMP3。
7.一种血管生成剂，其特征在于：其含有肾上腺髓质素作为有效成分。
8.一种血管生成剂，其特征在于：其含有选自以抑制肾上腺髓质素分解酶活性的物质、肾上腺髓质素受体活性修饰蛋白、降钙素受体样受体以及肾上腺髓质素受体所组成群组中的至少一种作为有效成分。
9.根据权利要求8所述的血管生成剂，其特征在于：肾上腺髓质素受体活性修饰蛋白为RAMP1、RAMP2或者RAMP3。
10.根据权利要求7所述的血管生成剂，其特征在于：血管生成是由于肾上腺髓质素稳定血管结构的作用所致。
11.根据权利要求7所述的血管生成剂，其特征在于：血管生成是由于肾上腺髓质素抑制血管的通透性的作用所致。
12.根据权利要求7～11中任一项所述的血管生成剂，其特征在于：其是用于治疗或者预防缺血性疾病或者水肿。
13.根据权利要求12所述的血管生成剂，其特征在于：缺血性疾病为选自以脑梗塞、心肌梗塞、心绞痛、闭塞性动脉硬化症以及伯格氏病所组成群组中的至少一种。
14.根据权利要求12所述的血管生成剂，其特征在于：水肿为脑水肿。
15.一种用于针对缺血性疾病或者水肿的联合疗法的医药组合物，其特征在于：其含有肾上腺髓质素与选自以血管生长因子、抑制肾上腺髓质素分解酶活性的物质、肾上腺髓质素受体活性修饰蛋白、降血钙素受体样受体以及肾上腺髓质素受体所组成群组中的至少一种。
16.根据权利要求15所述的医药组合物，其特征在于：血管生长因子为选自以血管内皮细胞生长因子、肝细胞生长因子、成纤维细胞生长因子-2、促血管生成素、缺氧诱导因子-1α以及转化生长因子-β所组成群组中的至少一种。
17.根据权利要求15所述的医药组合物，其特征在于：肾上腺髓质素受体活性修饰蛋白为RAMP1、RAMP2或者RAMP3。
18.根据权利要求15所述的医药组合物，其特征在于：缺血性疾病为选自以脑梗塞、心肌梗塞、心绞痛、闭塞性动脉硬化症以及伯格氏病所组成群组中的至少一种。
19.根据权利要求15所述的医药组合物，其特征在于：水肿为脑水肿。
20.一种哺乳动物的血管结构的稳定化方法，其特征在于：将选自以肾上腺髓质素、血管生长因子、抑制肾上腺髓质素分解酶活性的物质、肾上腺髓质素受体活性修饰蛋白、降血钙素受体样受体以及肾上腺髓质素受体所组成群组中的至少一种投予哺乳动物，或者使其于哺乳动物体内获得表达。
21.一种哺乳动物的血管结构的稳定化方法，其特征在于：将选自以编码肾上腺髓质素的基因、编码血管生长因子的基因、编码肾上腺髓质素受体活性修饰蛋白的基因、编码降血钙素受体样受体的基因以及编码肾上腺髓质素受体的基因所组成群组中的至少一种投予哺乳动物。
22.一种哺乳动物的血管通透性的抑制方法，其特征在于：将选自以肾上腺髓质素、血管生长因子、抑制肾上腺髓质素分解酶活性的物质、肾上腺髓质素受体活性修饰蛋白、降血钙素受体样受体以及肾上腺髓质素受体所组成群组中的至少一种投予哺乳动物，或者使其于哺乳动物体内获得表达。
23.一种哺乳动物的血管通透性的抑制方法，其特征在于：将选自以编码肾上腺髓质素的基因、编码血管生长因子的基因、编码肾上腺髓质素受体活性修饰蛋白的基因、编码降血钙素受体样受体的基因以及编码肾上腺髓质素受体的基因所组成群组中的至少一种投予哺乳动物。
24.根据权利要求22或23所述的方法，其特征在于：血管生长因子为选自以血管内皮细胞生长因子、肝细胞生长因子、成纤维细胞生长因子-2、促血管生成素、缺氧诱导因子-1α以及转化生长因子-β所组成群组中的至少一种。
25.根据权利要求22或23所述的方法，其特征在于：肾上腺髓质素受体活性修饰蛋白为RAMP1、RAMP2或者RAMP3。
26.一种哺乳动物的血管生成方法，其特征在于：将肾上腺髓质素投予哺乳动物。
27.根据权利要求26所述的方法，其特征在于：血管生成是由于肾上腺髓质素稳定血管结构的作用所致。
28.根据权利要求26所述的方法，其特征在于：血管生成是由于肾上腺髓质素抑制血管通透性的作用所致。
29.一种哺乳动物的血管生成方法，其特征在于：将选自以肾上腺髓质素、血管生长因子、抑制肾上腺髓质素分解酶活性的物质、肾上腺髓质素受体活性修饰蛋白、降血钙素受体样受体以及肾上腺髓质素受体所组成群组中的至少一种投予哺乳动物，或者使其于哺乳动物体内获得表达。
30.一种哺乳动物的血管生成方法，其特征在于：将选自以编码肾上腺髓质素的基因、编码血管生长因子的基因、编码肾上腺髓质素受体活性修饰蛋白的基因、编码降血钙素受体样受体的基因、以及编码肾上腺髓质素受体的基因所组成群组中的至少一种投予哺乳动物。
31.根据权利要求29或30所述的方法，其特征在于：血管生长因子为选自以血管内皮细胞生长因子、肝细胞生长因子、成纤维细胞生长因子-2、促血管生成素、缺氧诱导因子-1α以及转化生长因子-β所组成群组中的至少一种。
32.根据权利要求29或30所述的方法，其特征在于：肾上腺髓质素受体活性修饰蛋白为RAMP1、RAMP2或者RAMP3。
33.一种治疗或者预防哺乳动物的缺血性疾病或者水肿的方法，其特征在于：将根据权利要求7～14中任一项所述的血管生成剂或者根据权利要求15～19中任一项所述的医药组合物投予哺乳动物。
34.一种治疗或者预防哺乳动物的缺血性疾病或者水肿的方法，其特征在于：将选自以编码肾上腺髓质素的基因、编码血管生长因子的基因、编码肾上腺髓质素受体活性修饰蛋白的基因、编码降血钙素受体样受体的基因、以及编码肾上腺髓质素受体的基因所组成群组中的至少一个投予哺乳动物。
35.根据权利要求34所述的方法，其特征在于：血管生长因子为选自以血管内皮细胞生长因子、肝细胞生长因子、成纤维细胞生长因子-2、促血管生成素、缺氧诱导因子-1α以及转化生长因子-β所组成群组中的至少一个。
36.根据权利要求34所述的方法，其特征在于：肾上腺髓质素受体活性修饰蛋白为RAMP1、RAMP2或者RAMP3。
37.根据权利要求34所述的方法，其特征在于：缺血性疾病为选自以脑梗塞、心肌梗塞、心绞痛、闭塞性动脉硬化症以及伯格氏病所组成群组中的至少一个。
38.根据权利要求34所述的方法，其特征在于：水肿为脑水肿。
39.一种筛选方法，其为筛选具有稳定血管结构的作用的物质、具有抑制血管通透性的作用的物质、具有血管生成活性的物质或者促进血管生成活性的物质的方法；其特征在于包括以下步骤：将被试验物质投予选自以编码肾上腺髓质素的基因、编码血管生长因子的基因、编码肾上腺髓质素受体活性修饰蛋白的基因、编码降血钙素受体样受体的基因、以及编码肾上腺髓质素受体的基因所组成群组中的至少一个被减低的非人类动物，然后分析被试验物质对此非人类动物的作用。
40.一种筛选方法，其为在体外筛选具有稳定血管结构的作用的物质、具有抑制血管通透性的作用的物质、具有血管生成活性的物质或者促进血管生成活性的物质的方法；其特征在于包括以下步骤：使被试验物质与选自以编码肾上腺髓质素的基因、编码血管生长因子的基因、编码肾上腺髓质素受体活性修饰蛋白的基因、编码降血钙素受体样受体的基因、以及编码肾上腺髓质素受体的基因所组成群组中的至少一个被减低的细胞相接触，然后分析被试验物质对此细胞的作用。
41.一种筛选方法，其为筛选具有稳定血管结构的作用的物质、具有抑制血管通透性的作用的物质、具有血管生成活性的物质或者促进血管生成活性的物质的方法；其特征在于包括以下步骤：使被试验物质与具有选自以肾上腺髓质素、血管生长因子、肾上腺髓质素受体活性修饰蛋白、降血钙素受体样受体、以及肾上腺髓质素受体所组成群组中的至少一个蛋白质的细胞相接触，再分析被试验物质对此细胞的作用。
42.一种筛选方法，其为筛选具有稳定血管结构的作用的物质、具有抑制血管通透性的作用的物质、具有血管生成活性的物质或者促进血管生成活性的物质的方法；其特征在于包括以下步骤：使被试验物质与使选自以编码肾上腺髓质素的基因、编码血管生长因子的基因、编码肾上腺髓质素受体活性修饰蛋白的基因、编码降血钙素受体样受体的基因、以及编码肾上腺髓质素受体的基因所组成群组中的至少一个获得表达的细胞相接触，再分析被试验物质在细胞中的作用。
43.根据权利要求39～42中任一项所述的方法，其特征在于：血管生长因子为选自以血管内皮细胞生长因子、肝细胞生长因子、成纤维细胞生长因子-2、促血管生成素、缺氧诱导因子-1α以及转化生长因子-β所组成群组中的至少一个。
44.根据权利要求39～42中任一项所述的方法，其特征在于：肾上腺髓质素受体活性修饰蛋白为RAMP1、RAMP2或者RAMP3。
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