KR101133289B1

KR101133289B1 - Ａｋａｐ１２를 함유하는 조성물 및 동물 모델로서ａｋａｐ１２ 돌연변이 제브라피쉬의 용도

Info

Publication number: KR101133289B1
Application number: KR1020080055700A
Authority: KR
Inventors: 김규원; 권혁범
Original assignee: 재단법인서울대학교산학협력재단
Priority date: 2008-06-13
Filing date: 2008-06-13
Publication date: 2012-04-05
Also published as: KR20090129664A; WO2009151304A2; US20110162092A1; WO2009151304A3

Abstract

본 발명은 AKAP12(A-Kinase anchoring protein 12)를 함유하는 조성물 및 동물 모델로서 AKAP12 돌연변이 제브라피쉬(zebrafish)의 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 제브라피쉬 akap12 mRNA를 넉다운(knckdown)시킨 제브라피쉬는 꼬리 쪽 부위가 휘거나 짧아진 형태를 나타내고 정상적인 운동 기능을 수행하지 못하고, 뇌의 미세혈관의 형태가 일정한 형태를 나타내지 못하며, 심장의 형태가 변화하고 심장박동이 불규칙적으로 약한 박동을 하며, 뇌실, 망막, 심장 및 몸통에서 전반적으로 출혈이 관찰되는 등 다양한 발생학적 결함이 나타나며, AKAP12 주입시 발생 결함이 치유됨을 확인함으로써 AKAP12는 이를 유효성분으로 함유하는 AKAP12의 결핍에 의해 야기되는 발생학적 결함 예방 및 치료용 조성물, 및 출혈 저해제로 이용될 수 있으며, AKAP12 결핍 돌연변이 제브라피쉬가 발생학적 결함 치료제 효과 검증 동물 모델로서 유용하게 이용될 수 있다.

제브라피쉬(zebrafish), AKAP12, 발생학적 결함, 동물 모델

Description

ＡＫＡＰ１２를 함유하는 조성물 및 동물 모델로서 ＡＫＡＰ１２ 돌연변이 제브라피쉬의 용도{A composition containing zebrafish AKAP１２ and a use of AKAP１２ mutant zebrafish as a animal model}

본 발명은 제브라피쉬(zebrafish) AKAP12(A-Kinase anchoring protein 12)를 유효성분으로 함유하는 AKAP12의 결핍에 의해 야기되는 발생학적 결함 예방 및 치료용 조성물, AKAP12를 유효성분으로 함유하는 출혈저해제 및 발생학적 결함 치료제 효과 검증 동물 모델로서 AKAP12 결핍 돌연변이 제브라피쉬의 용도에 관한 것이다.

제브라피쉬(zebrafish)(zebra danio, Danio rerio)는 열대성 어류의 한 종류로서 과학적 연구 모델로서 널리 이용되고 있는 동물이다. 제브라피쉬는 특히 척추동물의 발생학과 유전자 기능에 대한 연구에서 쥐와 같은 동물모델을 대체할 수 있는 동물로서 다른 척추동물에 비해 발생 시간이 짧고 배아가 크고 튼튼하며 투명하여 관찰하기가 용이하다는 장점이 있다. 그리고 모폴리노(Morpholino) 안티센 스(antisense) 기술을 이용하여 특정 유전자에 대한 RNA의 유전자 접합(gene splicing) 및 유전자 넉다운(gene knockdown)을 통한 유전자 발현의 양을 줄임으로써 특정 유전자 기능 연구에 활용될 수 있다(Froese, R., et al., Danio rerio . FishBase. Retrieved on 2007-04-07). 그러나 AKAP12 돌연변이 제브라피쉬를 발생학적 결함 치료제 효과 검증 동물 모델로 사용했다는 보고는 없다.

모폴리노(Morpholino)는 유전자 발현(gene expression)을 조절하는 분자의 일종으로서 RNA의 25개 이하의 염기쌍과 결합하여 상기 RNA의 번역(translation) 및 유전자 접합(splicing)을 차단함으로써 상기 유전자의 발현을 하향 조절(gene knockdown)하는 시약으로 널리 사용되고 있다(Nasevicius, A et al., Nature Genetics 26 (2): 216-220, 2000).

AKAP12(A-Kinase anchoring protein 12)(Gravin, SSeCKS(Src-suppressed C kinase substrate))는 세포 내에 존재하는 구조단백질(scaffolding protein)중 하나로써 src 또는 ras와 같은 종양유전자(oncogene)에 반응하여 그 기능이 감소(down-regulation)되는 단백질로서 처음 알려진 단백질이다(Frankfort BJ, et al., Biochem Biophys Res Commun , Jan 26;206(3):916-26, 1995). 특히, 베타 아들레날린 수용체(β adrenergic receptor), PKC, PKA, 포스포디에스테라제(Phosphodiesterase), 칼모듈린(Calmodulin) 및 F-액틴(F-actin)과 작용하여 세포 신호전달에 관여한다고 알려져 있으며(Wang HY, et al., Eur J Cell Biol ., Jul;85(7):643-50, 2006), 세포의 이주(cell migration), 세포 분열(mitosis), 혈관장벽(boold barrier) 및 세포자살(apoptosis)에 관여한다고 보고되었다(Weiser DC, et al., GENES & DEVELOPMENT 21:1559-1571, 2007; Xia W, Experimental Cell Research, Volume 277, Issue 2, p139-151, 2002; Choi YK, et al., The Journal of Neuroscience , April 18, 27(16):4472-4481, 2007; Lee SW, et al., Nature Medicine Article, 01 Jul, 2003; Yoon DK, et al., Cancer Letters , Volume 254, Issue 1, Pages 111-118, 2007). AKAP12가 제브라피쉬 초기배아 조직의 전체적 결함양상에 관여한다는 발생에 관한 일부 보고는 있으나(Weiser DC, et al., Genes Dev., Jun 15; 21(12):1559-71, 2007) 제브라피쉬의 심장 결함, 뇌혈관의 안정성 결함, 혈관 결함으로 인한 출혈과 같은 각 세부 기관의 결함을 제브라피쉬 akap12 알파형태 및 베타형태 2개의 아형(isoform)과 관련된 보고는 전무하다.

이에, 본 발명자들은 제브라피쉬에 모폴리노(morpholino)를 주사하여 제브라피쉬의 akap12 mRNA를 넉다운시킨 후 표현형(phenotype)을 관찰한 결과, 정상적인 제브라피쉬에 비해 다양한 발생학적 결함이 나타나는 것을 확인하여 AKAP12의 기능을 규명함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 AKAP12(A-Kinase anchoring protein 12)를 유효성분으로 함유하는 AKAP12의 결핍에 의해 야기되는 발생학적 결함 예방 및 치료용 조성물, AKAP12를 유효성분으로 함유하는 출혈 저해용 조성물, 및 발생학적 결함을 갖는 AKAP12 결핍 돌연변이 동물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 AKAP12(A-Kinase anchoring protein 12)를 유효성분으로 함유하는 AKAP12의 결핍에 의해 야기되는 발생학적 결함 예방 및 치료용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 AKAP12를 유효성분으로 함유하는 출혈 저해용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 AKAP12의 결핍에 의해 야기되는 발생학적 결함이 있는 개체에 약학적으로 유효한 양의 AKAP12를 투여하는 단계를 포함하는 발생학적 결함 치료방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 AKAP12의 결핍에 의해 야기되는 발생학적 결함이 있는 개체에 약학적으로 유효한 양의 AKAP12를 투여하는 단계를 포함하는 발생학적 결함 예방방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 발생학적 결함을 갖는 AKAP12 결핍 돌연변이 동물을 제공한 다.

아울러, 본 발명은

1) akap12 유전자를 넉아웃(knockout) 또는 넉다운(knockdown)시킨 동물에 발생학적 결함 예방 및 치료제 후보물질을 투여하는 단계;

2) 단계 1)의 발생학적 결함 예방 및 치료제 후보물질이 투여된 동물의 발생학적 발달 정도를 확인하는 단계; 및

3) 상기 후보물질을 투여하지 않은 대조군 동물과 비교하여 발생학적 발달 정도를 유의하게 회복시킨 후보물질을 선별하는 단계를 포함하는 발생학적 결함 예방 및 치료제 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명의 AKAP12(A-Kinase anchoring protein 12)는 외형, 운동 기능, 뇌의 미세혈관, 심장 등의 AKAP12의 결핍에 의해 야기되는 발생학적 결함을 정상적으로 발달시키고, 출혈을 저해하는 기능을 함으로써 AKAP12를 약학적으로 유효한 양으로 함유하는 조성물은 발생학적 결함 예방 및 치료제, 및 출혈 저해제로 사용될 수 있다. 또한, AKAP12 결핍 돌연변이 제브라피쉬는 상기와 같은 발생학적 결함을 나타냄으로써 발생학적 결함 예방 및 치료제를 스크리닝하기 위한 효과적인 동물 모델로서 유용하게 이용될 수 있다.

이하, 본 발명에서 사용하는 단어를 정의한다.

본 발명에 있어서, 용어 "넉아웃(knockout)"은 유전자의 결손이 유발된 DNA를 외부에서 도입하여 정상 유전자에 완전 불활성화를 유도하는 것을 의미한다.

본 발명에 있어서, 용어 "넉다운(knockdown)"은 RNAi 등을 이용해서 발현하는 mRNA를 퇴화(degradation)시켜서 유전자 발현량을 줄이는 것을 의미한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 AKAP12(A-Kinase anchoring protein 12)를 유효성분으로 함유하는 AKAP12의 결핍에 의해 야기되는 발생학적 결함 예방 및 치료용 조성물을 제공한다.

상기 AKAP12는 서열번호 1로 기재되는 AKAP12 알파 형태(alpha form) 또는 서열번호 2로 기재되는 AKAP12 베타 형태(beta form)인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

본 발명자들은 제브라피쉬 akap12 알파 형태 및 제브라피쉬 akap12 베타 형태를 클로닝(cloning)하였고, 제브라피쉬의 akap12 알파 형태 mRNA 및 제브라피쉬 akap12 베타 형태 mRNA를 넉다운(knockdown)시키기 위해 모폴리노(morpholino)를 제작하였다. 상기 제작한 모폴리노는 알파 형태 및 베타 형태 각각이 특이적으로 가지고 있는 변형 부위(variant region)가 스플라이싱(splicing)되는 위치에 결합하여 스플라이싱이 되는 것을 차단함으로써 성숙한 mRNA가 되는 것을 막게 제작되었다.

본 발명의 AKAP12는 외형, 운동 기능, 뇌의 미세혈관, 심장 또는 전체 혈관 의 발생학적 결함을 정상적으로 발달시킬 수 있으나 상기 부위는 이에 한정되지 않는다.

본 발명자들은 AKAP12가 발생학적으로 외형의 발달에 미치는 영향을 알아보기 위해 제브라피쉬(zebrafish) 배아(embryo)에 모폴리노(morpholino)를 주사하여 제브라피쉬 akap12 알파 형태(alpha form) 및 베타 형태(beta form)를 넉다운(knockdown)시킨 후 외형을 관찰하였다. 그 결과, 제브라피쉬의 akap12 mRNA를 넉다운시키지 않은 정상적인 제브라피쉬의 경우 꼬리 쪽 부위가 곧고 긴 일자형으로 운동시 정상적인 기능을 수행할 수 있는 반면에, 제브라피쉬의 akap12 mRNA 알파 형태 및 베타 형태를 넉다운시킨 제브라피쉬의 경우 꼬리 쪽 부위가 휘거나 짧아진 형태를 나타내었으며 운동시 정상적인 기능을 수행하지 못하였다.

또한, 본 발명자들은 제브라피쉬의 akap12 알파 형태에 대한 모폴리노를 제브라피쉬 배아에 주사하여 akap12 알파 형태를 넉다운시킨 제브라피쉬 중 각 결함 정도에 따른 akap12 알파 형태의 mRNA 발현 양상을 RT-PCR로써 확인하였다. 그 결과 결함의 정도가 심할수록 mRNA의 발현 정도가 낮은 것을 알 수 있었다(도 2 참조).

또한, 본 발명자들은 제브라피쉬의 akap12 알파 형태 및 akap12 베타 형태에 대한 모폴리노를 농도별로 순차적으로 주사한 결과, 베타 형태의 경우는 7.5ng 이상에서, 알파 형태의 경우 3.7ng 이상에서 상기와 같은 발생학적인 결함이 나타나는 것을 알 수 있었다(도 3 참조).

따라서, AKAP12는 발생학적으로 외형 또는 운동 기능을 발달시키는 것을 알 수 있다.

본 발명자들은 AKAP12가 뇌의 미세혈관 발달에 미치는 영향을 알아보기 위해, 혈관의 내피세포에 선택적으로 형광이 발현되는 유전자전환 제브라피쉬에서 akap12 알파 형태를 넉다운시킨 후 뇌의 미세혈관의 발생학적 결함 양상을 관찰하였다. 그 결과, akap12 알파 형태를 넉다운시킨 제브라피쉬는 정상적인 제브라피쉬에 비해 뇌의 미세혈관의 형태가 일정한 형태를 나타내지 않았고 형광물질이 미세혈관 내에서 벗어나 주변으로 분포하였다(도 4 참조).

따라서, AKAP12는 발생학적으로 뇌의 미세혈관을 발달시키는 것을 알 수 있다. 랫트(rat) akap12를 이용하여 랫트에서 AKAP12가 뇌 혈액 관문에서 혈관신생 및 폐쇄대(tight junction) 형성을 조절할 수 있다는 것을 보고(Lee SW, et al., Nat Med. Jul; 9(7): 900-6, 2003)한 바 있으며, 제브라피쉬 역시 AKAP12가 뇌의 미세혈관의 성숙도에 영향을 줄 수 있음을 보여주었다.

본 발명자들은 AKAP12가 심장의 발달에 미치는 영향을 알아보기 위해, 심근의 가변사슬(light chain)에 선택적으로 형광이 발현되는 유전자전환 제브라피쉬에서 akap12 알파 형태를 넉다운시킨 후 심장의 발생학적 결함 양상을 관찰하였다. 그 결과, akap12 알파 형태를 넉다운시킨 제브라피쉬는 정상적인 제브라피쉬에 비해 심방 및 심실의 형태 및 배열이 일정하게 나타내지 않았고, 심장박동이 불규칙적으로 약한 박동을 나타내었으며, 결함이 심할 경우 혈액 순환이 불가능한 것으로 관찰되었다(도 5 참조).

따라서, AKAP12는 발생학적으로 심장을 발달시키는 것을 알 수 있다.

본 발명자들은 AKAP12가 출혈에 미치는 영향을 알아보기 위해, akap12 알파 형태 및 베타 형태가 넉다운시킨 제브라피쉬의 배아를 관찰하였다. 그 결과, 2일 ~ 3일된 제브라피쉬에서 출혈이 일어나는 것을 관찰할 수 있었다. 상기 출혈은 제브라피쉬의 뇌실, 망막, 심장 및 몸통에서 전반적으로 관찰되었으며 통계적으로 제브라피쉬의 akap12 알파 형태 및 베타 형태에 대한 모폴리노의 양이 늘어날수록 전체 중 출혈이 일어난 제브라피쉬의 비율이 늘어나는 것을 관찰할 수 있었다(도 6, 도 7 및 도 8 참조).

또한, 본 발명자들은 출혈이 있는 제브라피쉬의 혈관의 변화를 알아보기 위해, 유전자전환 제브라피쉬를 이용하여 뇌 혈관 패턴을 관찰하였다. 그 결과, 출혈이 안 일어난 군의 경우, 모폴리노를 주사하지 않은 정상적인 제브라피쉬의 뇌혈관과 다르게 뇌혈관 패턴이 굴곡이 일어난 불규칙적인 양상을 나타내었지만 혈관의 형성자체는 이루어진 반면, 출혈이 일어난 군의 경우는 뇌혈관의 불규칙적인 패턴양상과 함께 뇌혈관 형성 자체도 가늘거나 퇴화(regression)된 것을 확인할 수 있었다(도 9 참조).

또한, 본 발명자들은 제브라피쉬의 akap12 알파 형태 및 베타 형태에 대한 모폴리노의 양을 이용하여 넉다운의 정도에 따른 발생학적 결함 양상을 관찰하였다. 그 결과, 제브라피쉬의 akap12 알파 형태에 대한 모폴리노 처리시 1ng ~ 2ng 까지는 출혈만 일어났고, 3ng ~ 4ng까지는 출혈과 심장 및 몸통의 혈관 결함이 동시에 일어났으며, 4ng 이상은 심장 및 다른 혈관의 결함이 심해 혈액의 순환이 원할하지 못해 출혈이 일어나는 정도가 줄어드는 것을 관찰할 수 있었다. 또한, 제브라피쉬의 akap12 베타 형태에 대한 모폴리노 처리시에는 7.5ng ~ 8ng 처리시에는 출혈과 심장 및 몸통의 혈관 결함이 동시에 일어났고, 9ng이상은 심장 및 몸통의 혈관 결함만 일어나는 것을 관찰할 수 있었다(도 10 참조).

따라서, AKAP12는 발생학적으로 혈관을 발달시켜 출혈을 저해하는 것을 알 수 있다.

본 발명자들은 상기 관찰된 발생학적 결함이 akap12 특이적인 넉다운에 의한 것인지 확인하기 위해 랫트(rat) akap12 mRNA를 이용하여 레스큐(rescue) 실험을 수행하였다. 그 결과, akap12 알파 형태에 대한 모폴리노만 주사한 대조군은 상기 관찰된 꼬리가 휘고 짧으며, 심장이 기형적으로 나타나는 결함 양상을 보이는 반면, 랫트 akap12 알파 형태의 mRNA를 같이 섞어 주사한 실험군에서는 상기 mRNA의 양이 늘어날수록 꼬리 및 심장의 결함 양상이 회복된 제브라피쉬의 비율이 늘어나는 것을 확인할 수 있었다(도 11 참조).

이상의 결과를 통해, 본 발명의 AKAP12는 외형 결함, 운동 기능 결함, 뇌의 미세혈관 결함, 심장 결함 및 혈관 결함으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 AKAP12의 결핍에 의해 야기되는 발생학적 결함을 억제 또는 완화하고 출혈을 저해하는 효과를 나타내는 것을 알 수 있다. 따라서 본 발명의 AKAP12는 AKAP12의 결핍에 의해 야기되는 발생학적 결함 예방 및 치료, 및 출혈 저해제로 사 용될 수 있다.

본 발명의 조성물은 AKAP12에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다. 투여를 위해서는 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 제조할 수 있다.

상기 AKAP12를 함유한 조성물은 임상 투여 시에 비경구로 투여가 가능하며 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있다. 즉, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.

상기 약제학적으로 허용 가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로스 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 이용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등을 이용하는 제형으로 제제화할 수 있다.

본 발명의 조성물은 동맥 주사, 정맥 주사, 경피 주사, 비강 내 투여, 경기관지 투여 또는 근육 내 투여 등의 당업자에게 잘 알려진 방법들로 투여될 수 있다.

본 발명의 조성물의 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다. 예를 들면, 일일 투여량은 0.01 ~ 5000 ㎎/㎏인 것이 바람직하고, 0.01 ~ 10 ㎎/㎏인 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 또한, 하루 일 회 내지 수 회에 나누어 투여하는 것이 더욱 바람직하다.

상기 발생학적 결함은 외형 결함, 운동 기능 결함, 뇌의 미세혈관 결함, 심장 결함 및 혈관 결함으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 투여량은 개체의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다. 예를 들면, 일일 투여량은 0.01 ~ 5000 ㎎/㎏인 것이 바람직하고, 0.01 ~ 10 ㎎/㎏인 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 또한, 하루 일 회 내지 수 회에 나누어 투여하는 것이 더욱 바람직하다.

상기 AKAP12 결핍 돌연변이는 akap12 유전자가 넉아웃(knockout) 또는 넉다운(knockdown)된 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 동물은 제브라피쉬, 마우스, 랫트, 돼지 또는 원숭이가 바람직하고, 제브라피쉬인 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다.

아울러, 본 발명은

1) akap12 유전자를 넉아웃 또는 넉다운시킨 동물에 발생학적 결함 예방 및 치료제 후보물질을 투여하는 단계;

3) 상기 후보물질을 투여하지 않은 대조군과 비교하여 발생학적 발달 정도를 유의하게 회복시킨 후보물질을 선별하는 단계를 포함하는 발생학적 결함 예방 및 치료제 스크리닝 방법을 제공한다.

상기 단계 1)의 동물은 제브라피쉬, 마우스, 랫트, 돼지 또는 원숭이가 바람직하고, 제브라피쉬인 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 단계 1)의 후보 물질은 펩티드, 단백질, 비펩티드성 화합물, 합성 화합 물, 발효 생산물, 세포 추출액, 식물 추출액, 동물 조직 추출액 또는 혈장 등이 있고 이러한 화합물들은 신규 화합물이어도 되고, 널리 알려진 화합물이어도 된다. 이러한 후보 물질은 염을 형성하고 있어도 된다. 후보 물질의 염으로는 생리학적으로 허용되는 산(예, 무기산 등)이나 염기(예, 유기산 등) 등의 염이 있고 이 중에서 생리학적으로 허용되는 산첨가염이 바람직하다. 이와 같은 염으로는 예를 들면, 무기산(예를 들면, 염산, 인산, 취화수소산 또는 황산 등)의 염 또는 유기산(예를 들면, 초산, 포름산, 프로피온산, 푸마르산, 말레산, 숙신산, 타르타르산, 시트르산, 말산, 옥살산, 안식향산, 메탄술폰산 또는 벤젠술폰산 등)의 염 등이 이용된다.

상기와 같은 후보 물질을 투여하는 방법으로는 예를 들면, 정맥주사, 피하투여, 피내투여 또는 복강투여 등 비경구 투여 중에서 대상 동물의 증상 및 후보 물질의 성질 등에 맞추어 적당히 선택할 수 있다. 또한 후보 물질의 투여량은 투여 방법 및 후보 물질의 성질 등에 맞추어 적당히 선택할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명을 한정하 지는 않는다.

< 실시예 1> 제브라피쉬 ( zebrafish )의 사육 및 발생배의 준비

일반형(wild type) 제브라피쉬는 국내 세진 수조관에서 구입하였고, 유전자전환 제브라피쉬는 오리건대학교(university of oregon)의 ZFIN 웹싸이트에서 구입하였다. 상기 제브라피쉬들은 조건(온도: 28℃, 명암: am 9:00 ~ pm 9:00 점등 그 외 시간 소등, 먹이: 브라인 슈림프(brine shrimp))하에서 사육되었다. 발생배는 교미를 시키기 전날 제브라피쉬 암컷과 수컷을 각각 칸막이로 나눠둔 뒤 다음날 아침에 밝게 해주면서 암컷과 수컷 사이의 칸막이를 없애 교미를 시켰다. 교미를 통해 얻은 제브라피쉬의 알을 아가 겔(agar gel)로 만든 틀에 옮겼다.

< 실시예 2> 제브라피쉬 ( zebrafish ) AKAP12 ( alpha 및 beta form ) 유전자 복제

본 발명자들은 제브라피쉬(zebrafish)의 akap12에 대한 연구를 수행하기 위해 제브라피쉬 akap12 알파 형태(alpha form) 및 제브라피쉬 akap12 베타 형태(beta form)를 클로닝(cloning)하였다. 국립 생물정보센터(National center for biotechnology information)(www.ncbi.nlm.nih.gov) 웹 싸이트를 통해 제브라피쉬의 akap12 알파 형태(유전자 코드번호: xm_690658.2) 및 akap12 베타 형태(유전자 코드번호: ef539208)로 예상되는 유전자 서열을 찾은 후, 제브라피쉬 염색체(chromosome) 21(유전자 코드번호: cr926887)번 서열과 정렬(align)을 해본 결과 제브라피쉬 크로모좀 21에 제브라피쉬 akap12 알파 형태 및 제브라피쉬 akap12 베 타 형태의 CDS가 존재한다는 것을 확인할 수 있었다. 본 발명자들은 클로닝을 하기 위해 상기 알파 형태 및 베타 형태의 CDS 중 시작 코돈과 BamHI 제한효소부위(restriction enzyme site)를 포함하는 포워드 프라이머(forward primer) 알파 형태: AAGGATCCATGGGAGCGACACCATCCGTGC(서열번호 3), 제브라피쉬의 5' UTR부위를 포함하는 포워드 프라이머 베타 형태: ACTTTCCAAAGCAGACAACCCTCGGG(서열번호 4), 종결코돈과 EcoRI 제한효소부위를 포함하는 리버스 프라이머(reverse primer) 알파 형태: AAGAATTCTCATGACACTGTGACAACCTCTGTGGAG(서열번호 5) 및 3' UTR부위를 포함하는 리버스 프라이머 베타 형태: AGACATGATTTTGTATCCATACTATTAACAGCTTG(서열번호 6)를 제작하였으며 이를 이용하여 알파 형태의 경우 pcDNA3.1 myc-his 벡터(vector)에 클로닝하였고, 베타 형태의 경우 T-easy 벡터에 클로닝하였다.

제브라피쉬에서 얻은 cDNA를 주형으로 하여 TAKARA Ex Tag polymerase(TAKARA 사)를 이용하여 PCR을 진행하였다. 상기 cDNA는 성체의 제브라피쉬에서 RNA를 추출한뒤 RT-PCR을 이용하여 획득하였다. 상기 RNA추출의 경우 트리졸(TRIZOL) 및 클로로포름(chloroform)을 이용한 RNA 추출 방법을 사용하였으며 RT-PCR의 경우는 MMLV RT enzyme(BEAMS 사)을 사용하였다. 상기 PCR은 전체 부피를 50ul로 하여 제브라피쉬의 cDNA를 2ul, 상기 포워드 및 리버스 프라이머를 각각 1ul, TAKARA Ex Tag polymerase를 0.3ul, 10X buffer 5ul, 및 2.5mM dNTP 6ul를 섞어 반응을 시켰다. 반응 조건으로는 95℃ 3분(1회), 95℃ 45초 → 55℃ 45초 → 72℃ 5분(25회), 72℃ 10분 → 4℃ 유지(1회)의 반응을 시켰다.

< 실시예 3> 제브라피쉬 AKAP12 ( alpha 및 beta form ) 넉다운(knockdown)을 위한 모폴리노( morpholino ) 제작

본 발명자들은 제브라피쉬의 akap12 알파 형태(alpha form) mRNA 및 제브라피쉬 akap12 베타 형태(beta form) mRNA를 넉다운(knockdown)시키기 위해 모폴리노(morpholino)를 제작하였다. 상기 모폴리노의 제작은 GENE TOOLS 사에 의뢰하였다. 모폴리노 제작은 참고문헌(Summerton, J. et al., Antisense & Nucleic Acid Drug Development 7: 187-95, 1997)에 기재되어 있다. 상기 제작한 모폴리노는 알파 형태 및 베타 형태 각각이 특이적으로 가지고 있는 변형 부위(variant region)가 스플라이싱(splicing)되는 위치에 결합하여 스플라이싱이 되는 것을 차단함으로써 성숙한 mRNA가 되는 것을 막게 제작되었으며 알파 형태의 모폴리노의 경우는 서열이 TCTTACCTGTTAGAGTTATTGTCCC(서열번호 7) 25 머(mer)로 akap12 알파 형태의 339번째 염기 부근에 결합하도록 하였고, 베타 형태의 모폴리노의 경우는 서열이 TACCTTGCCATCTGCGGTTTCTCCA(서열번호 8) 25 머(mer)로 akap12 베타 형태의 227번째 염기 부근에 결합하도록 설계되었다(도 1).

< 실험예 1> 제브라피쉬 ( zebrafish ) AKAP12 ( alpha 및 beta form )이 넉다운( knockdown)된 제브라피쉬의 발생학적 결함( developmental defect ) 조사

본 발명자들은 <실시예 3>에서 제작한 모폴리노를 제브라피쉬에 미량주사(microinjection)하여 제브라피쉬 akap12 mRNA를 넉다운시킨 후 표현형(phenotype)을 관찰하였다.

우선, 제브라피쉬 akap12 mRNA 알파 형태에 대한 모폴리노는 7ng 및 10ng을 제브라피쉬 배아에 미량주사(microinjection)하였고 akap12 mRNA 베타 형태에 대한 모폴리노는 7.5ng을 미량주사하였다. 그 결과, 제브라피쉬의 akap12 mRNA를 넉다운시키지 않은 정상적인 제브라피쉬의 경우 꼬리 쪽 부위가 곧고 긴 일자형으로 운동시 정상적인 기능을 수행할 수 있는 반면에, 제브라피쉬의 akap12 mRNA 알파 형태 및 베타 형태를 넉다운시킨 제브라피쉬의 경우 꼬리 쪽 부위가 휘거나 짧아진 형태를 나타내었으며 운동시 정상적인 기능을 수행하지 못하였다.

또한, 본 발명자들은 제브라피쉬의 akap12 알파 형태에 대한 모폴리노 7ng 및 10ng을 제브라피쉬 배아에 주사하여 akap12 알파 형태를 넉다운시킨 제브라피쉬 중 각 결함 정도에 따른 akap12 알파 형태의 mRNA 발현 양상을 RT-PCR로써 확인한 결과 결함의 정도가 심할수록 mRNA의 발현 정도가 낮은 것을 알 수 있었다(도 2).

또한, 본 발명자들은 제브라피쉬의 akap12 알파 형태 및 akap12 베타 형태에 대한 모폴리노를 3.7ng, 7.5ng 및 10ng 순차적으로 주사한 결과, 베타 형태의 경우는 7.5ng 정도에서, 알파 형태의 경우 3.7ng 정도에서 도 3과 같은 발생학적인 결함이 나타나는 것을 알 수 있었다(도 3).

< 실험예 2> 제브라피쉬 AKAP12 ( alpha form )이 넉다운된 제브라피쉬 뇌의 미세혈관 결함 조사

본 발명자들은 혈관의 내피세포에 선택적으로 녹색형광이 발현되는 tg(fli:egfp)라는 유전자전환(transgenic) 제브라피쉬를 이용하여 제브라피쉬 akap12 알파 형태가 넉다운된 경우, 뇌의 미세혈관의 결함 양상을 관찰하였다. 유전자전환 제브라피쉬(fli:egfp) 배아에 제브라피쉬의 akap12 알파 형태에 대한 모폴리노를 3ng 미세주사하여 제브라피쉬의 akap12 알파 형태를 넉다운시킨 후 3일 후에 제브라피쉬의 총기본정맥(common cardinal vein)을 통하여 붉은색 형광을 나타내는 라이신-고정 테트라메틸로다민-덱스트란(lysine-fixable tetramethylrhodamine-dextran)[로다민-덱스트란(rhodamine-dextran), 10kDa, 25mg/ml, 분자 프로브(Molecular Probes)]을 미세주사하여 LSM 510 META NLO 공초점현미경(confocal microscope)(Carl Zeiss, Germany)를 통해 관찰하였다.

그 결과, 모폴리노를 주사하지 않은 정상적인 제브라피쉬의 경우 붉은색 라이신-고정 테트라메틸로다민-덱스트란이 뇌의 미세 혈관 내에 머무르는 것이 관찰된 반면, akap12 알파 형태에 대한 모폴리노를 주사한 제브라피쉬의 경우는 뇌의 미세혈관의 형태가 일정한 형태를 나타내지 않았을 뿐만 아니라 붉은색 라이신-고정 테트라메틸로다민-덱스트란이 녹색을 띄는 미세혈관 주변으로 분포되는 것을 관찰할 수 있었다(도 4).

< 실험예 3> 제브라피쉬 AKAP12 ( alpha 및 beta form )이 넉다운된 제브라피쉬의 심장 결함 조사

본 발명자들은 심근의 가변사슬(light chain)에 녹색 형광이 특이적으로 발현되는 tg(cmlc:egfp)라는 유전자전환 제브라피쉬를 이용하여 제브라피쉬 akap12 알파형태를 넉다운시킨 후 제브라피쉬의 심장 결함을 관찰하였다. 유전자전환 제 브라피쉬(cmlc:egfp) 배아에 제브라피쉬의 akap12 알파 형태에 대한 모폴리노를 3.7ng 미세주사하여 제브라피쉬의 akap12 알파 형태을 넉다운시킨 뒤 1.5일 후에 제브라피쉬의 심장을 LSM 510 META NLO 공초점 현미경(Carl Zeiss, Germany)을 통해 관찰하였다.

그 결과, akap12 알파 형태에 대한 모폴리노를 주사한 제브라피쉬의 경우, 심방과 심실이 정상보다 길쭉하고 심방이 왼편에 심실이 오른편에 위치한 정상적인 제브라피쉬의 심장과 다르게 심방과 심실이 일직선상에 위치한 모습을 나타내었으며 심장박동도 일정한 리듬을 띄지 않고 불규칙적인 약한 박동을 나타내었다(도 5). 그리고 결함이 심할 경우 혈액 순환의 역할도 수행하지 못하는 것으로 관찰되었다.

< 실험예 4> 제브라피쉬 AKAP12 ( alpha 및 beta form )이 넉다운된 제브라피쉬의 출혈( hemorrhage ) 조사

본 발명자들은 제브라피쉬 akap12 알파 형태 및 베타 형태가 넉다운된 성숙한 제브라피쉬의 배아를 관찰한 결과, 2일 ~ 3일된 제브라피쉬에서 출혈이 일어나는 것을 관찰할 수 있었다. 상기 출혈은 제브라피쉬의 뇌실, 망막, 심장 및 몸통에서 전반적으로 관찰되었으며 통계적으로 제브라피쉬의 akap12 알파 형태에 대한 모폴리노를 1ng, 2ng 및 3ng 순차적으로 주사할 경우 모폴리노의 양이 늘어날수록 출혈이 일어난 제브라피쉬의 비율이 늘어나는 것을 관찰할 수 있었으며 제브라피쉬의 akap12 알파 형태 및 베타 형태에 대한 모폴리노를 주입한 후 2일 ~ 3일 후를 관찰했을 때 3일째가 출혈이 일어난 제브라피쉬의 비율이 늘어난 것을 확인할 수 있었다. 3일 후 관찰한 것을 기준으로 보았을 때, 제브라피쉬의 akap12 알파 형태에 대한 모폴리노 3ng 주입시 출혈이 일어난 제브라피쉬의 수는 전체의 약 50%, 제브라피쉬의 akap12 베타 형태에 대한 모폴리노 7.5ng 주입시에는 약 27%의 제브라피쉬가 출혈이 일어난 것을 관찰할 수 있었다(도 6, 도 7 및 도 8).

본 발명자들은 상기 관찰된 출혈이 있는 제브라피쉬의 뇌 혈관 패턴을 관찰하였다. 혈관 패턴을 관찰하기 위해 tg(fli:egfp) 유전자전환 제브라피쉬 배아에 제브라피쉬의 akap12 알파 형태에 대한 모폴리노를 미량주사한 뒤 3일 뒤 출혈이 일어난 군과 안 일어난 군으로 제브라피쉬를 나눈 뒤 LSM 510 META NLO 공초점 현미경(Carl Zeiss, Germany)을 통해 뇌 혈관을 관찰하였다.

그 결과, 출혈이 안 일어난 군의 경우, 모폴리노를 주사하지 않은 정상적인 제브라피쉬의 뇌혈관과 다르게 뇌혈관 패턴이 굴곡이 일어난 불규칙적인 양상을 나타내었지만 혈관의 형성자체는 이루어진 반면, 출혈이 일어난 군의 경우는 뇌혈관의 불규칙적인 패턴양상과 함께 뇌혈관 형성 자체도 가늘거나 퇴화(regression)되는 것을 확인할 수 있었다(도 9).

< 실험예 5> 모폴리노 ( morpholino ) 농도에 따른 제브라피쉬의 결함 양상 조사

본 발명자들은 제브라피쉬의 akap12 알파 형태 및 베타 형태에 대한 모폴리노를 이용하여 akap12 알파 형태 mRNA 및 베타 형태 mRNA를 넉다운시킨 경우, 각각의 모폴리노의 양에 따른 결함 양상을 관찰하였다.

그 결과, 제브라피쉬의 akap12 알파 형태에 대한 모폴리노 처리시 1ng 및 2ng 까지는 출혈만 일어나다가 3ng 및 4ng까지는 출혈과 심장 및 몸통의 혈관 결함이 동시에 일어나며 4ng부터는 심장과 다른 혈관의 결함이 심해 혈액의 순환이 원할하지 못해 출혈이 일어나는 정도가 줄어드는 것을 관찰할 수 있었다. 또한, 제브라피쉬의 akap12 베타 형태에 대한 모폴리노 처리시에는 7.5ng 및 8ng 처리시에는 출혈과 심장 및 몸통의 혈관 결함이 동시에 일어나며 9ng이상에서는 심장 및 몸통의 혈관 결함만 일어나는 것을 관찰할 수 있었다(도 10).

< 실험예 6> 제브라피쉬 AKAP12 ( alpha 및 beta form )이 넉다운된 제브라피쉬의 랫트( rat ) AKAP12 알파 형태 mRNA 에 의한 레스큐 ( rescue ) 실험

본 발명자들은 상기 <실험예 1> 내지 <실험예 5>에서 관찰된 결함이 akap12 특이적인 넉다운에 의한 것인지 확인하기 위해 랫트(rat) akap12 mRNA를 이용하여 레스큐(rescue) 실험을 수행하였다. 제브라피쉬의 akap12 알파 형태에 대한 모폴리노 4ng과 랫트 akap12 알파 형태의 mRNA 50pg 및 100pg을 각각 섞은 뒤 제브라피쉬 배아에 미량주사한 후 관찰하였다.

그 결과, akap12 알파 형태에 대한 모폴리노 4ng만 주사한 대조군은 상기 관찰된 꼬리가 휘고 짧고 심장이 기형적으로 나타나는 결함 양상을 보이는 반면에 랫트 akap12 알파 형태의 mRNA를 같이 섞어 미량주사한 실험군에서는 mRNA의 양이 늘어날수록 꼬리와 심장의 결함 양상이 회복된 제브라피쉬의 비율이 늘어나는 것을 확인할 수 있었다(도 11).

도 1은 제브라피쉬 akap12 알파 형태(alpha form) mRNA 및 제브라피쉬 akap12 베타 형태(beta form) mRNA에 모폴리노(morpholino)가 결합된 서열을 나타내는 그림이다(↔: 모폴리노의 결합 부위).

도 2는 제브라피쉬 akap12 알파 형태를 넉다운시킨 제브라피쉬 중 각 결함 정도(N, D1, D2 및 D3)에 따른 akap12 알파 형태의 mRNA 발현 양상을 RT-PCR로써 확인한 결과를 나타내는 그림이다.

도 3은 제브라피쉬의 akap12 알파 형태 및 akap12 베타 형태에 대한 모폴리노의 양을 순차적으로 주사하여 발생학적인 결함이 나타나는 최소의 양을 확인한 결과를 나타내는 그림이다.

도 4는 제브라피쉬 akap12 알파 형태를 넉다운시킨 제브라피쉬의 총기본정맥(common cardinal vein)을 통하여 붉은색 형광을 나타내는 라이신-고정 테트라메틸로다민-덱스트란(lysine-fixable tetramethylrhodamine-dextran)을 주사한 후 공초점현미경(confocal microscope)을 통해 관찰한 결과를 나타내는 그림이다:

uninj(uninjection): 제브라피쉬 akap12 알파 형태에 대한 모폴리노를 미량주사하지 않은 제브라피쉬군.

도 5는 제브라피쉬 akap12 알파 형태를 넉다운시킨 제브라피쉬의 심장을 공초점 현미경을 통해 관찰한 결과를 나타내는 그림이다.

도 6은 제브라피쉬 akap12 알파 형태 및 akap12 베타 형태를 넉다운시킨 제브라피쉬 배아의 2일 후 출혈 부위를 나타내는 그림이다:

Ventriode: 뇌실;

Retina: 망막;

Heart: 심장; 및

Trunk: 몸통.

도 7은 제브라피쉬 akap12 알파 형태 및 akap12 베타 형태를 넉다운시킨 제브라피쉬 배아의 3일 후 출혈 부위를 나타내는 그림이다:

Ventriode: 뇌실;

Retina: 망막;

Heart: 심장; 및

Trunk: 몸통.

도 8은 제브라피쉬의 akap12 알파 형태 및 akap12 베타 형태에 대한 모폴리노의 양에 따른 2일 및 3일 후 출혈이 일어난 제브라피쉬의 비율을 나타내는 그래프이다.

도 9는 tg(fli:egfp) 유전자전환 제브라피쉬 배아에 제브라피쉬의 akap12 알파 형태에 대한 모폴리노를 미량주사한 뒤 공초점 현미경을 통해 뇌 혈관을 관찰한 결과를 나타내는 그림이다:

A: 대조군;

B ~ D: akap12 모폴리노 주입 개체(morphants)(3 ng);

B: 비-출혈 모폴리노 주입 개체; 및

C, D: 뇌실 내 출혈.

도 10은 제브라피쉬 akap12 알파 형태 및 akap12 베타 형태 mRNA를 넉다운시키는 경우, 각각의 모폴리노의 양에 따른 결함 양상을 관찰한 결과를 나타내는 그림이다.

도 11은 제브라피쉬 akap12 알파 형태에 대한 모폴리노 및 상기 모폴리노와 랫트 akap12 알파 형태의 mRNA를 혼합한 것을 제브라피쉬 배아에 주사한 후 결함을 관찰한 결과를 나타내는 그림이다.

<110> Seoul National University Academic Corporation Foundation <120> A composition containing zebrafish AKAP12 and a use of AKAP12 mutant zebrafish as a animal model <130> 8p-02-20 <160> 8 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1577 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> zebrafish akap12 alpha form <400> 1 Met Gly Ala Thr Pro Ser Val Gln Arg Asp Ala Lys Gly Pro Glu Asp 1 5 10 15 Ala Pro Glu Asp Val Ser Ala Pro Leu Ser Asp Ala His Asp Gly Glu 20 25 30 Thr Ala Asp Gly Glu Pro Leu Gln Lys Asn Gly Gln Ile Ser Ile Ser 35 40 45 Ser Leu Asn Gly Lys Thr Asp Asp Gln Thr Glu Tyr Asn Gly His Thr 50 55 60 Glu Glu Asn Pro Pro Ala Glu Val Gly Gln Thr Asp Thr Ile Ser Pro 65 70 75 80 Lys Glu Asp Ser Pro Glu Thr Ile Glu Val His Gln Glu Glu Val Ala 85 90 95 Pro Gln Met Asn Gly Glu Lys Gly Asp Asn Ser Ala Asn Ala Asp Glu 100 105 110 Ile Thr Thr Ala Glu Glu Lys Val Val Glu Glu Lys Gln Glu Glu Ala 115 120 125 Asn Glu Val Gly Phe Lys Lys Ile Phe Arg Phe Val Gly Phe Lys Phe 130 135 140 Thr Leu Lys Lys Asp Lys Asn Glu Lys Thr Glu Pro Val Gln Leu Leu 145 150 155 160 Thr Val Lys Glu Ala Glu Ser Gly Ala Asp Ala Ala Thr Glu Glu Lys 165 170 175 Lys Glu Glu Pro Ala Ala Glu Glu Asp Arg Ser Val Glu Glu Lys Ser 180 185 190 Pro Glu Thr Thr Glu Asn Glu Ala Lys Ala Glu Glu Val Thr Glu Lys 195 200 205 Ala Glu Glu Pro Ala Glu Gln Thr Val Val Asp Ala Pro Ser Glu Thr 210 215 220 Glu Lys Val Ser Asp Ile Glu Thr Glu Lys Pro Ala Glu Glu Thr Gly 225 230 235 240 Thr Ile Ser Glu Lys Glu Pro Glu Pro Glu Val Pro Ala Glu Ser Pro 245 250 255 Thr Ser Pro Pro Ser Gln Glu Thr Gln Ser Pro Phe Lys Arg Phe Phe 260 265 270 Thr Gln Gly Ile Phe Ser Asn Leu Arg Lys Lys Ala Ser Phe Lys Lys 275 280 285 Pro Lys Asp Glu Glu His Val Lys Glu Lys Pro Ala Glu Glu Asp Ile 290 295 300 Lys Glu Thr Glu Glu Thr Ala Glu Gly Val Pro Glu Ala Thr Glu Glu 305 310 315 320 Ala Lys Val Asp Ala Glu Asn Glu Pro Ala Glu Gly Glu Gln Ile Glu 325 330 335 Lys Pro Ser Glu Thr Val Glu Thr Lys Ala Glu Thr Thr Thr Glu Thr 340 345 350 Thr Ala Glu Thr Thr Asn Glu Val Thr Pro Thr Glu Lys Glu Glu Gln 355 360 365 Gln Asp Leu Lys Val Glu Ala Glu Ala Thr Ser Glu Val Glu Thr Val 370 375 380 Thr His Thr Glu Pro Ala Gln Ala Pro Ala Val Glu Thr Thr Gln Pro 385 390 395 400 Thr Asp Asp Ala Lys Thr Ser Asp Lys Pro Asp Ile Ser Glu Glu Ala 405 410 415 Pro Ile Glu Pro Glu Ile Leu Ser Ser Gln Glu Lys Ser Lys Ala His 420 425 430 Gly Ser Pro Leu Lys Lys Leu Phe Thr Gly Ala Gly Leu Lys Lys Leu 435 440 445 Ser Ser Lys Lys His Lys Asn Lys Lys Asp Ala Glu Ser Lys Gln Thr 450 455 460 Glu Ser Ser Glu Gln Thr Ala Glu Thr Val Gln Ser Thr Glu Ser Thr 465 470 475 480 Glu Pro Gln Lys Pro Asp Ser Gly Ala Ser Ser Pro Glu Glu Ser Gly 485 490 495 Glu His Val Val Gly Glu Val Ala Gln Ala Glu Val Ala Gln Ala Val 500 505 510 Glu Pro Asp Gly Asp Ala Val Thr Ser Asp Gly Glu Lys Lys Lys Glu 515 520 525 Gly Ile Leu Pro Trp Ser Ser Phe Lys Lys Leu Val Thr Pro Lys Lys 530 535 540 Arg Val Lys Arg Pro Ser Glu Ser Glu Asp Glu Ala Pro Gly Asp Lys 545 550 555 560 Pro Lys Phe Ser Thr Leu Ser Ser Thr Glu Ser Ala Ile Ser Asp Glu 565 570 575 Lys Ala Asp Glu Pro Lys Pro Ser Glu Glu Val Pro Ser Lys Glu Glu 580 585 590 Leu Lys Glu Glu Ala Lys Glu Glu Ser Gln Ala Glu Ser Lys Thr Glu 595 600 605 Pro Lys Ala Glu Lys Ser Glu Ser Val Ala Glu Glu Pro Lys Arg Lys 610 615 620 Met Asp Thr Ser Val Ser Trp Glu Ala Leu Ile Cys Val Gly Ser Ser 625 630 635 640 Lys Lys Arg Ala Arg Lys Thr Ser Asp Ser Asp Asp Glu Glu Ala Lys 645 650 655 Ile Glu Glu Glu Val Gln Pro Ser Glu Glu Glu Pro Ile Lys Thr Ala 660 665 670 Glu Ser Pro Leu Val Ser Ser Gly Glu Ala Asp His Glu Asn Leu Ala 675 680 685 Ser Ser Pro Glu Pro Glu Gly Glu Leu Val Ser Thr Trp Glu Ser Phe 690 695 700 Lys Arg Leu Val Thr His Arg Lys Lys Ala Lys Ala Glu Asp Lys Ser 705 710 715 720 Asp Glu Ala Ser Gly Pro Glu Gln Thr Thr Ser Asp Ser Glu Thr Pro 725 730 735 Lys Glu Glu Ser Ser Phe Ser Leu Arg Lys Leu Ile Pro Arg Arg Lys 740 745 750 Lys Lys Ser Asp Gly Lys Gln Glu Gln Val Ser Ser Asp Val Gly Ser 755 760 765 Ala Glu Asp Asp Ser 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Val Glu Glu Glu Ser Leu Asn Gln Lys Pro Ser 980 985 990 Val Glu Ser Ala Thr Val Val Ser Gln Pro Leu Val Thr Glu Val Ala 995 1000 1005 Val Glu Glu Lys Thr Gln Glu Pro Glu Arg Val Thr Val Thr Glu Asp 1010 1015 1020 Glu Val His Glu Ala Gln Thr Ser Gly Val Gln Ala Glu Leu Lys Asp 1025 1030 1035 1040 Gln Pro Ile Glu Asn Ala Ile Glu Glu Lys Ala Gln Phe Glu Glu Ile 1045 1050 1055 Lys Asp Thr Pro Ile Ala Glu Thr Val Ala Asp Ile His Glu Val Ala 1060 1065 1070 Ala Val Lys Val Ala Val Ile Ser Ala Val Gln Gln Glu Pro Glu Ile 1075 1080 1085 Leu Glu Glu Pro Val Met Ala Glu Lys Ser Pro Glu Ile Glu Ser Ala 1090 1095 1100 Gly Pro Val Glu Ala Thr Val Glu Glu Ala Ile Cys Ala Gln Thr Ala 1105 1110 1115 1120 Glu Val Thr Glu Phe Ala Val Ala Glu Gly Glu Lys Val Gln Glu Leu 1125 1130 1135 Asp Asp Val Lys Glu Thr Val Ala Ala Val Glu Val Ala Ser Val Glu 1140 1145 1150 Asn Val Ser Thr Ala Val Thr Glu Glu Val Met Ala Thr Leu Pro Glu 1155 1160 1165 Val Pro Ala Ser Gln Ile Ala Gly Ser Thr Glu Asp Pro Ile Pro Val 1170 1175 1180 Val Ala Ala Thr Glu Glu Phe Ala Val Ile Lys Glu Thr Ile Cys Val 1185 1190 1195 1200 Ser Ser Ile Ser Glu Thr Thr Glu Ser His Ser Ala Asp Ile Ala Lys 1205 1210 1215 Glu Thr Leu Met Glu Asn Val Pro Val Val Leu Ser Thr Gly Asp His 1220 1225 1230 Lys Met Gln Val Ala Val Asn Glu Val Glu Val Val Ser Ala Gln Gly 1235 1240 1245 Val Val Glu Gly Asn Ile Glu Ala Ala Ser Thr Lys Leu Ser Val Ala 1250 1255 1260 Leu Glu Glu Val Thr Glu Asn Val Lys Glu Glu Thr Glu Val Ile Gln 1265 1270 1275 1280 Ala Thr Gln Val Thr Glu Ala Glu Ile Ile Glu Lys Gln Ser Ser Val 1285 1290 1295 Ile Val Gln Glu Ile Ile Gln Asn Val Val Glu Asn Phe Ala Glu Ala 1300 1305 1310 His Gly Glu Gln Asn Val Ser Glu Lys Thr Thr Glu Glu Ser Cys Ile 1315 1320 1325 Thr Ser Ala Glu Val Lys Val Asn Glu Ile Ser Val Glu Thr Thr Glu 1330 1335 1340 Glu Gly Ser Ser Thr Asp Lys Leu Ala Ala Ser Asp Asn Val Cys Lys 1345 1350 1355 1360 Asp Val Glu Glu Thr Arg Ile Val Thr Glu Lys Pro Pro Lys Ile Val 1365 1370 1375 Asn Glu Ala Ile Gln Ile Ala Glu Thr Val Pro Val Ser Ile Thr Asp 1380 1385 1390 Glu Ile Gln Ala Gln Asn Glu Glu Val Ala Ser Val Trp Val Ala Asp 1395 1400 1405 Val His Gln Glu Thr Glu Val Thr Lys Ser Glu Val Glu Leu Glu Ser 1410 1415 1420 Asp Leu Lys Glu Val Gln Ala Glu Ile Gln Gln Glu Ile Lys Ala Val 1425 1430 1435 1440 Pro Glu Glu Lys Thr Ala Glu Thr Ser Val Thr Val Ala Ser Gln Asp 1445 1450 1455 Gln Val Val Ala Glu Gln Cys Gln Val Thr Leu Thr Ala Val Gln Ile 1460 1465 1470 Glu Thr Ala Gln Glu Phe Asn Val Gly Val Val Asn Val Ile Asn Ala 1475 1480 1485 Asp Asp Val Pro Glu Thr Asn Met Lys Glu Asp Cys Ser Glu Gly Gln 1490 1495 1500 Glu Ser Thr Glu Asp Arg Pro Gln Asn Asp Leu Glu Glu Pro Gln Thr 1505 1510 1515 1520 Lys Val Ser Thr Asn Gln Glu Glu Ser Arg Gly Pro Asp Cys Gln Lys 1525 1530 1535 Thr Asp Ala Lys Asn Val Pro Ala Lys Leu Glu Ala Ala Ser Glu Met 1540 1545 1550 Thr Ser Asn Ala Thr Ala Ala Glu Glu Val Gly Asn Glu Ile Glu Pro 1555 1560 1565 Val Ser Thr Glu Val Val Thr Val Ser 1570 1575 <210> 2 <211> 1533 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> zebrafish akap12 beta form <400> 2 Met Leu Gly Thr Ile Thr Leu Thr Val Gly Gln Thr Asp Thr Ile Ser 1 5 10 15 Pro Lys Glu Asp Ser Pro Glu Thr Ile Glu Val His Gln Glu Glu Val 20 25 30 Ala Pro Gln Met Asn Gly Glu Lys Gly Asp Asp Ser Ala Asn Ala Asp 35 40 45 Glu Ile Thr Thr Ala Glu Glu Lys Val Val Glu Glu Lys Gln Glu Glu 50 55 60 Ala Asn Glu Val Gly Phe Lys Lys Ile Phe Arg Phe Val Gly Phe Lys 65 70 75 80 Phe Thr Leu Lys Lys Asp Lys Asn Glu Lys Thr Glu Pro Val Gln Leu 85 90 95 Leu Thr Val Lys Glu Ala Glu Ser Gly Ala Asp Ala Ala Thr Glu Glu 100 105 110 Lys Lys Glu Glu Pro Ala Ala Glu Glu Asp Arg Ser Val Glu Glu Lys 115 120 125 Ser Pro Glu Thr Thr Glu Asn Glu Ala Lys Ala Glu Glu Val Thr Glu 130 135 140 Lys Ala Glu Glu Pro Ala Glu Gln Thr Val Val Asp Ala Pro Ser Glu 145 150 155 160 Thr Glu Lys Val Ser Asp Ile Glu Thr Glu Lys Pro Ala Glu Glu Thr 165 170 175 Gly Thr Ile Ser Glu Lys Glu Pro Glu Pro Glu Val Pro Ala Glu Ser 180 185 190 Pro Thr Ser Pro Pro Ser Gln Glu Thr Gln Ser Pro Phe Lys Arg Phe 195 200 205 Phe Thr Gln Gly Ile Phe Ser Asn Leu Arg Lys Lys Ala Ser Phe Lys 210 215 220 Lys Pro Lys Asp Glu Glu His Val Lys Glu Lys Pro Ala Glu Glu Asp 225 230 235 240 Ile Lys Glu Thr Glu Glu Thr Ala Glu Gly Val Pro Glu Ala Thr Glu 245 250 255 Glu Ala Lys Val Asp Ala Glu Asn Glu Pro Ala Glu Gly Glu Gln Ile 260 265 270 Glu Lys Pro Ser Glu Thr Val Glu Thr Lys Ala Glu Thr Thr Thr Glu 275 280 285 Thr Thr Ala Glu Thr Thr Asn Glu Val Thr Pro Thr Glu Lys Glu Glu 290 295 300 Gln Gln Asp Leu Lys Val Glu Ala Glu Ala Thr Ser Glu Val Glu Thr 305 310 315 320 Val Thr His Thr Glu Pro Ala Gln Ala Pro Ala Val Glu Thr Thr Gln 325 330 335 Pro Thr Asp Asp Ala Lys Thr Ser Asp Lys Pro Asp Ile Ser Glu Glu 340 345 350 Ala Pro Thr Glu Pro Glu Ile Leu Ser Ser Gln Glu Lys Ser Lys Ala 355 360 365 His Gly Ser Pro Leu Lys Lys Leu Phe Thr Gly Ala Gly Leu Lys Lys 370 375 380 Leu Ser Ser Lys Lys His Lys Asn Lys Lys Asp Ala Glu Ser Lys Gln 385 390 395 400 Thr Glu Ser Ser Glu Gln Thr Ala Glu Thr Val Gln Ser Thr Glu Ser 405 410 415 Thr Glu Pro Gln Lys Pro Asp Ser Gly Ala Ser Ser Pro Glu Glu Ser 420 425 430 Gly Glu His Val Val Gly Glu Val Ala Gln Ala Glu Val Ala Gln Ala 435 440 445 Val Glu Pro Asp Gly Asp Ala Val Thr Ser Asp Gly Glu Lys Lys Lys 450 455 460 Glu Gly Ile Leu Pro Trp Ser Ser Phe Lys Lys Leu Val Thr Pro Lys 465 470 475 480 Lys Arg Val Lys Arg Pro Ser Glu Ser Glu Asp Glu Ala Pro Gly Asp 485 490 495 Lys Pro Lys Ser Ser Thr Leu Ser Ser Thr Glu Ser Ala Ile Ser Asp 500 505 510 Glu Lys Ala Asp Glu Pro Lys Pro Ser Glu Glu Val Pro Ser Lys Glu 515 520 525 Glu Leu Lys Glu Glu Ala Lys Glu Glu Ser Gln Ala Glu Ser Lys Thr 530 535 540 Glu Pro Lys Ala Glu Lys Ser Glu Ser Val Ala Glu Glu Pro Lys Arg 545 550 555 560 Lys Met Asp Thr Ser Val Ser Trp Glu Ala Leu Ile Cys Val Gly Ser 565 570 575 Ser Lys Lys Arg Ala Arg Lys Thr Ser Asp Ser Asp Asp Glu Glu Ala 580 585 590 Lys Ile Glu Glu Glu Val Gln Pro Ser Glu Glu Glu Pro Ile Lys Thr 595 600 605 Ala Glu Ser Pro Leu Val Ser Ser Gly Glu Ala Asp His Glu Asn Leu 610 615 620 Ala Ser Ser Pro Glu Pro Glu Gly Glu Leu Val Ser Thr Trp Glu Ser 625 630 635 640 Phe Lys Arg Leu Val Thr His Arg Lys Lys Ala Lys Ala Glu Asp Lys 645 650 655 Ser Asp Glu Ala Ser Gly Pro Glu Gln Thr Thr Ser Asp Ser Glu Thr 660 665 670 Pro Lys Glu Glu Ser Ser Phe Ser Leu Arg Lys Leu Ile Pro Arg Arg 675 680 685 Lys Lys Lys Ser Asn Gly Lys Gln Glu Gln Val Ser Ser Asp Val Gly 690 695 700 Ser Ala Glu Asp Asp Ser Asp Thr Pro Ala Val Val Pro Leu Ser Glu 705 710 715 720 Tyr Asp Ser Glu Pro Ser Ala Glu Ala Ala Val Lys Ala Glu Glu Val 725 730 735 Lys Gln Glu Ser Ala Thr Val Thr Gln Ala Lys Ala Ser Ala Glu Asp 740 745 750 Arg Ser Pro Ser Trp Ile Ser Thr Thr Val Glu Asn Val Glu Asp Glu 755 760 765 Thr Glu Gly Asn Gln Leu Ser Asp Ile Pro Glu Glu Gly Asp Thr Ala 770 775 780 Ala Thr Pro Lys Ser Thr Asp Asn Thr Ile Ala Glu Asp Ile Val Glu 785 790 795 800 Leu Thr Ser Glu Ala Val Thr Ala Leu Glu Gln Val Glu Glu Thr Glu 805 810 815 Met Val Ser 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<210> 6 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer of zebrafish akap12 beta form <400> 6 agacatgatt ttgtatccat actattaaca gcttg 35 <210> 7 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> morpholino of zebrafish akap12 alpha form <400> 7 tcttacctgt tagagttatt gtccc 25 <210> 8 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> morpholino of zebrafish akap12 beta form <400> 8 taccttgcca tctgcggttt ctcca 25

Claims

서열번호 1로 기재되는 AKAP12(A-Kinase anchoring protein 12) 알파 형태(alpha form)를 유효성분으로 함유하는 AKAP12 알파 형태의 결핍에 의해 야기되는 선천성 기형 예방 및 치료용 조성물.
서열번호 1로 기재되는 AKAP12 알파 형태를 유효성분으로 함유하는 AKAP12 알파 형태의 결핍에 의해 야기되는 선천성 운동장애 예방 및 치료용 조성물.
서열번호 1로 기재되는 AKAP12 알파 형태를 유효성분으로 함유하는 AKAP12 알파 형태의 결핍에 의해 야기되는 선천성 뇌 미세혈관 기형 예방 및 치료용 조성물.
서열번호 1로 기재되는 AKAP12 알파 형태를 유효성분으로 함유하는 AKAP12 알파 형태의 결핍에 의해 야기되는 선천성 심장 기형 예방 및 치료용 조성물.
삭제
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서열번호 1로 기재되는 AKAP12 알파 형태를 유효성분으로 함유하는 AKAP12 알파 형태의 결핍에 의해 야기되는 선천성 혈관 기형에 의한 출혈 저해용 조성물.
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서열번호 1로 기재되는 AKAP12 알파 형태의 결핍에 의해 야기되는 발생학적 결함이 있는 인간을 제외한 포유동물 또는 제브라피쉬(zebrafish)에 약학적으로 유효한 양의 AKAP12 알파 형태를 투여하는 단계를 포함하는 발생학적 결함 치료방법.
서열번호 1로 기재되는 AKAP12 알파 형태의 결핍에 의해 야기되는 발생학적 결함이 있는 인간을 제외한 포유동물 또는 제브라피쉬(zebrafish)에 약학적으로 유효한 양의 AKAP12 알파 형태를 투여하는 단계를 포함하는 발생학적 결함 예방방법.
발생학적 결함을 갖는 서열번호 1로 기재되는 AKAP12 알파 형태 결핍 돌연변이 동물.
제 12항에 있어서, 상기 돌연변이는 서열번호 1로 기재되는 AKAP12 알파 형태를 암호화하는 akap12 알파 형태 유전자를 넉아웃(knockout) 또는 넉다운(knockdown)하는 것을 특징으로 하는 AKAP12 돌연변이 동물.
삭제
제 12항에 있어서, 상기 동물은 제브라피쉬(zebrafish), 마우스, 랫트, 돼지 및 원숭이로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 AKAP12 돌연변이 동물.
제 15항에 있어서, 상기 동물은 제브라피쉬(zebrafish)인 것을 특징으로 하는 AKAP12 돌연변이 동물.
제 12항에 있어서, 발생학적 결함은 외형 결함, 운동 기능 결함, 뇌의 미세혈관 결함, 심장 결함 및 혈관 결함으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 AKAP12 돌연변이 동물.
1) 서열번호 1로 기재되는 AKAP12 알파 형태를 암호화하는 akap12 알파 형태(alpha form)를 넉아웃(knockout) 또는 넉다운(knockdown)시킨 동물에 발생학적 결함 예방 및 치료제 후보물질을 투여하는 단계;

2) 단계 1)의 발생학적 결함 예방 및 치료제 후보물질이 투여된 동물의 발생학적 발달 정도를 확인하는 단계; 및

3) 상기 후보물질을 투여하지 않은 대조군 동물과 비교하여 발생학적 발달 정도를 유의하게 회복시킨 후보물질을 선별하는 단계를 포함하는 발생학적 결함 예방 및 치료제 스크리닝 방법.
삭제
제 18항에 있어서, 상기 단계 1)의 동물은 제브라피쉬, 마우스, 랫트, 돼지 및 원숭이로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
제 20항에 있어서, 상기 동물은 제브라피쉬(zebrafish)인 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
제 18항에 있어서, 상기 단계 1)의 후보 물질은 펩티드, 단백질, 비펩티드성 화합물, 합성 화합물, 발효 생산물, 세포 추출액, 식물 추출액, 동물 조직 추출액 및 혈장으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 방법.
제 18항에 있어서, 상기 단계 1)의 발생학적 결함은 외형 결함, 운동 기능 결함, 뇌의 미세혈관 결함, 심장 결함 및 혈관 결함으로 이루어진 군으로부터 선택 된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.