EA031320B1 - Антитела, ингибирующие человеческий рецептор cgrp - Google Patents

Антитела, ингибирующие человеческий рецептор cgrp Download PDF

Info

Publication number
EA031320B1
EA031320B1 EA201100892A EA201100892A EA031320B1 EA 031320 B1 EA031320 B1 EA 031320B1 EA 201100892 A EA201100892 A EA 201100892A EA 201100892 A EA201100892 A EA 201100892A EA 031320 B1 EA031320 B1 EA 031320B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
seq
sequence
antibody
antigen
binding fragment
Prior art date
Application number
EA201100892A
Other languages
English (en)
Other versions
EA201100892A1 (ru
Inventor
Томас С. Бун
Дэвид В. Бранкоу
мл. Колин В. Джегг
Шо-Фен Сильвия Ху
Чэдвик Т. Кинг
Хсианг Сэнь Лу
Личэн Ши
Цэнь Сюй
Original Assignee
Амген Инк.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Амген Инк. filed Critical Амген Инк.
Publication of EA201100892A1 publication Critical patent/EA201100892A1/ru
Publication of EA031320B1 publication Critical patent/EA031320B1/ru

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2869—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against hormone receptors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/04—Centrally acting analgesics, e.g. opioids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/06—Antimigraine agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/515—Animal cells
    • A61K2039/5156—Animal cells expressing foreign proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/32—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency specific for a neo-epitope on a complex, e.g. antibody-antigen or ligand-receptor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Cardiology (AREA)

Abstract

Настоящее изобретение описывает антитела, которые избирательно ингибируют человеческий рецептор CGRP (CGRP R). Изобретение также описывает нуклеиновые кислоты, кодирующие антитела и их антигенсвязывающие фрагмены, векторы и клетки. Антитела могут ингибировать связывание CGRP R и CGRP, что является полезным при целом ряде расстройств, обусловленных CGRP R, включая лечение и/или профилактику головных болей, вызываемых мигренью.

Description

Настоящее изобретение описывает антитела, которые избирательно ингибируют человеческий рецептор CGRP (CGRP R). Изобретение также описывает нуклеиновые кислоты, кодирующие антитела и их антигенсвязывающие фрагмены, векторы и клетки. Антитела могут ингибировать связывание CGRP R и CGRP, что является полезным при целом ряде расстройств, обусловленных CGRP R, включая лечение и/или профилактику головных болей, вызываемых мигренью.
Уровень техники
Суперсемейство белков кальцитонина включает как минимум пять известных членов: кальцитонин, амилин, адреномедуллин и два пептида, кодируемых геном кальцитонина (CGRP): CGRP1 (также известен как ctCGRP или CGRP) и CGRP2 (также известен как PCGRP). CGRP является вазоактивным нейропептидом, состоящим из 37 аминокислот и экспрессируемым в центральной и периферической нервной системе; было показано, что данный нейропептид является сильным вазодилятатором периферических сосудов, где нейроны, содержащие CGRP, тесно связаны с кровеносными сосудами. Опосредованное CGRP расширение сосудов также связано с нейрогенным воспалением как часть каскада событий, приводящих к экстравазации плазмы и вазодилятации микроциркуляторной части сосудистого русла и, в конце концов, мигрени. Амилин также имеет специфические участки связывания в ЦНС и, как считается, регулирует опорожнение желудка и играет роль в метаболизме углеводов. Адреномедуллин является сильным сосудорасширяющим агентом и имеет специфические рецепторы на астроцитах, чья мРНК характеризуется повышенной экспрессией в тканях ЦНС, подвергнутых ишемии (Zimmermann, et al., Identification of adrenomedullin receptors in cultured rat astrocytes and in neuroblastoma glioma hybrid cells (NG108-15), Brain Res., 724:238-245 (1996); Wang et al., Discovery of adrenomedullin in rat ischemic cortex and evidence for its role in exacerbating focal brain ischemic damage, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:1148011484(1995)).
Кальцитонин задействован в контроле метаболизма кости и обладает активностью в центральной нервной системе (ЦНС). Биологическая активность CGRP включает регулирование нервно-мышечных соединений, представление антигена в иммунной системе, участие в тонусе сосудов и сенсорной нейротрансмиссии. (Poyner, D. R., Calcitonin gene-related peptide: multiple actions, multiple receptors, Pharmacol. Ther., 56:23-51 (1992); Muff et al., Calcitonin, calcitonin gene related peptide, adrenomedullin and amylin: homologous peptides, separate receptors and overlapping biological actions, Eur. J. Endocrinol., 133:17-20 (1995)). У целого ряда видов млекопитающих было выявлено три пептида, стимулирующих рецепторы к кальцитонину (ПСРК); ПСРК могут образовывать новое подсемейство в семействе ПСРК. (Katafuchi, T and Minamino, N, Structure and biological properties of three calcitonin receptor-stimulating peptides, novel members of the calcitonin gene-related peptide family, Peptides, 25(11):2039-2045 (2004)).
Суперсемейство белков кальцитонина действует посредством 7-сегментных трансмембранных доменов рецепторов, связанных с G-белком (GPCR). Рецептор к кальцитонину (СТ, CTR или КТрецептор) и рецепторы CGRP являются рецепторами GPCR II типа (семейство В); данное семейство включает другие GPCR, распознающие регуляторные пептиды, такие как секретин, глюкагон и вазоактивный интестинальный полипептид (ВИП). Хорошо изученные сплайс-варианты человеческого рецептора к кальцитонину отличаются в зависимости от наличия (ранее обозначалось как CTRII+ или CTR1, сейчас известен как СТ(Ь)) или отсутствия (основной сплайс-вариант, ранее обозначался как CTRII- или CTR2, сейчас известен как СТ(а)) 16 аминокислот в первой интрацеллюлярной петле. (Gorn et al., Expression of two human skeletal calcitonin receptor isoforms cloned from a giant cell tumor of bone: the first intracellular domain modulates ligand binding and signal transduction, J. Clin. Invest., 95:2680-2691 (1995); Hay et al., Amylin receptors: molecular composition and pharmacology, Biochem. Soc. Trans., 32:865-867 (2004); Poyner et al., 2002). Существование как минимум двух подтипов рецепторов CGRP было предположено, исходя из существования дифференциального сродства антагонистов и действенности агонистов, установленных в ряде in vivo и in vitro биологических анализов. (Dennis et al., CGRP8-37, A calcitonin gene-related peptide antagonist revealing calcitonin gene-related peptide receptor heterogeneity in brain and periphery, J. Pharmacol. Exp. Ther., 254:123-128 (1990); Dennis et al., Structure-activity profile of calcitonin gene-related peptide in peripheral and brain tissues. Evidence for multiplicity, J. Pharmacol. Exp. Ther., 251:718-725 (1989); Dumont et al., A potent and selective CGRP2 agonist [Cys(Et)2,7]hCGRP: comparison in prototypical CGRPi and CGRP2 in vitro assays, Can. J. Physiol. Pharmacol., 75:671-676 (1997)).
Было выявлено, что подтип рецептора CGRP1 чувствителен к фрагменту антагониста CGRP(8-37). (Chiba et al., Calcitonin gene-related peptide receptor antagonist human CGRP-(8-37), Am. J. Physiol., 256:E331-E335 (1989); Dennis et al. (1990); Mimeault et al., Comparative affinities and antagonistic potencies of various human calcitonin gene-related peptide fragments on calcitonin gene-related peptide receptors in brain and periphery, J. Pharmacol. Exp. Ther., 258:1084-1090 (1991)). В отличие от этого, рецептор CGRP2 был чувствителен к линейным аналогам человеческого CGRP (hCGRP), в которых цистеиновые остатки в положениях 2 и 7 были подвергнуты дериватизации (например, с помощью ацетаминометила [Cys(ACM)2,7] или этиламида [Cys(Et)2,7]), однако рецептор CGRP2 был нечувствителен к фрагменту CGRP(8-37). (Dennis et al. (1989); Dennis et al. (1990); Dumontetal. (1997)).
Специфичность рецептора кальцитонина или кальцитонин-подобного рецептора к лиганду (CL, CLR или CRLR) зависит от коэкспрессии членов семейства акцессорных белков, называемых белками, модифицирующими активность рецептора (БМАР). Семейство БМАР включает три полипептида (RAMP1, RAMP2 и RAMP3), действующих в качестве модуляторов рецепторов и определяющих специфичность лигандов рецепторов для членов семейства кальцитонина. БМАР являются трансмембранными белками I типа, которые имеют примерно 30% одинаковой аминокислотной последовательности и общую прогностическую топологию, короткий цитоплазматический С-конец, один трансмембранный до
- 1 031320 мен и большой экстрацеллюлярный N-конец, ответственные за специфичность. (McLatchie et al. (1998), RAMPs regulate the transport and ligand specificity of the calcitonin-receptor-like receptor, Nature, 393:333339; Fraser et al. (1999), The amino terminus of receptor activity modifying proteins is a critical determinant of glycosylation state and ligand binding of calcitonin receptor-like receptor, Molecular Pharmacology, 55:10541059).
В 1998 г. рецептор CGRPi был определен как гетеродимер, состоящий из ранее неизвестного трансмембранного домена акцессорного белка, белка 1, модифицирующего активность фермента (RAMP1), и CRLR. (McLatchie et al., supra). Тесты образования перекрестных связей позволили предположить, что рецептор CGRP состоит из стехиометрически расположенных CRLR и RAMP1 в соотношении 1:1 (Hilairet et al. JBC 276, 42182-42190 (2001)), а проведенные недавно исследования с использованием нескольких методологий, таких как BRET и BiFC, выявили, что функциональный комплекс рецептора CGRP может состоять из асимметричного гомоолигомера CRLR и мономера RAMP1 (Heroux et al., JBC 282, 31610-31620 (2007)).
Было показано, что очищенный N-терминальный домен CRLR специфически связывается с 125ICGRP (Chauhan et al. Biochemistry 44, 782 (2005)), что подтверждает важное и непосредственное взаимодействие между CRLR и лигандом CGRP. В частности, считается, что Лей 24 и Лей 34 CRLR образуют участок размещения Фен 37 на С-конце CGRP (Banerjee et al. ВМС Pharmacol. 6, 9 (2006)). Более того, Koller и соавт. (FEBS Lett. 531, 464-468 (2002)) было получено доказательство того, что 18 остатков аминокислот на N-конце CRLR способствуют селективному взаимодействию с CGRP или адреномедуллином, а Ittner и соавт. (Biochemistry 44, 5749- 5754 (2005)) предположили, что 23-60 аминокислотные остатки N-конца CRLR опосредуют взаимосвязь с RAMP1. Структурно-функциональный анализ RAMP1 определил остатки 91-103, которые коррелируют со спиралью 3 (Simms et al. Biophys. J. 91, 662 - 669 (2006)) и являются потенциально важными для взаимодействия с CRLR, а остатки Трп 74 и Фен 92 как потенциально взаимодействующие с лигандом CGRP при его связывании с комплексом рецептора CGRP. Исследования связывания с лигандом, использующие человеческую/крысиную химеру RAMP1, показали, что участок связывания для определенных низкомолекулярных ингибиторов CGRP R (например, BIBN4096BS), располагается в участке, включающем аминокислоты 66-102 RAMP1 (Mallee et al. JBC 277, 14294-14298 (2002)). В целом CRLR имеет 55% идентичной аминокислотной последовательности в сравнении с CTR, при этом идентичны примерно 80% трансмембранных доменов (McLatchie et al. (1998); Poyner et al., International union of pharmacology. XXXII. The mammalian calcitonin gene-related peptides, adrenomedullin, amylin and calcitonin receptors, Pharmacol. Rev., 54:233-246 (2002)).
Было показано, что CRLR образует высокоаффинный рецептор для CGRP при его связывании с RAMP1, или для предпочтительного связывания с адреномедуллином при его связывании с RAMP2 или RAMP3 (McLatchie et al. (1998); Sexton et al., Receptor activity modifying proteins, Cellular Signaling, 13:7383 (2001); Conner et al., Interaction of calcitonin-gene-related peptide with its receptors, Biochemical Society Transactions 30(Part 4): 451-454 (2002)). Состояние гликозилирования CRLR обусловлено его фармакологичными свойствами. RAMP 1, 2 и 3 транспортируют CRLR на цитоплазматическую мембрану с подобной степенью эффективности, однако RAMP1 представляет CRLR в виде терминально гликозилированного, зрелого гликопротеина и рецептора CGRP, в то время как RAMP 2 и RAMP 3 представляют CRLR в виде незрелого, корового гликозилированного рецептора адреномедуллина (AM, или AMR, или АМрецептора (Fraser et al. (1999)). Характеристика рецепторов CRLR/RAMP2 и CRLR/RAMP3 в клетках линии HEK293Т методом связывания радиолиганда (в качестве него использовался 125Надреномедуллин), функциональный анализ (измерение цАМФ) или биохимические анализы (электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия) выявили, что такие рецепторы неотличимы, даже при сходстве 30% аминокислотной последовательности у RAMP2 и RAMP3 (Fraser et al. 1999)). Различия были выявлены в фармакологических показателях CRLR, выраженных посредством RAMP 2 в сравнении с RAMP 3. Как CGRP, так и CGRP8-37, а также адреномедуллин и полученный из адреномедуллина пептид AM 22-52 являются активными относительно гетеродимера RAMP 3, указывая на то, что данный комплекс может действовать в виде CGRP-рецептора и АМ-рецептора (Howitt et al., British Journal of Pharmacology, 140:477-486 (2003); Muff et al., Hypertens. Res., 26:S3-S8 (2003)). Коэкспрессия человеческого CRLR с крысиным RAMP1 и наоборот позволила предположить, что виды RAMP1 определяли фармакологические характеристики комплекса CRLR/RAMP1 относительно некоторых исследуемых низкомолекулярных антагонистов рецептора CGRP (Mallee et al., Receptor Activity-Modifying Protein 1 determines the species selectivity of non-peptide CGRP receptor antagonists, J. Biol. Chem., 277(16): 1429414298 (2002)). За исключением случаев связывания с RAMP, неизвестно, связывается ли CRLR с какимлибо эндогенным лигандом; в настоящее время считается, что только один GPCR ведет себя подобным образом (Conner et al., A key role for transmembrane prolines in calcitonin receptor-like agonist binding and signaling: implications for family В G-protein-coupled receptors, Molec. Pharmacol., 67(1):20-31 (2005)).
Было показано, что рецептор кальцитонина (СТ) также образует гетеродимерные комплексы с RAMP, известные как рецепторы амилина (AMY, AMY R или AMY-рецептор). Как правило, рецепторы CT/RAMP1 (называемые AMY1 или AMY1) обладают высокой степенью аффинности относительно кальцитонина лососевых рыб, амилина и CGRP. Для рецепторов CT/RAMP2 (AMY2 или
- 2 031320
AMY2) и рецепторов CT/RAMP3 (AMY3 или AMY3) наблюдается аналогичная картина, несмотря на то, что аффинность относительно CGRP ниже и не может быть значительной при физиологически значимых концентрациях лиганда. Точный фенотип рецептора зависит от типа клетки и слайс-варианта CTR (СТ(а) или СТ(Ь)), особенно для амилиновых рецепторов, образованных при участии RAMP2. Например, по имеющимся данным чистая популяция остеокласт-подобных клеток экспрессирует RAMP2, CTR и CRLR, но не RAMP1 или RAMP3 (Hay et al. (2004); Christopoulos et al., Multiple amylin receptors arise from receptor activity-modifying protein interaction with the calcitonin receptor gene product, Molecular Pharmacology, 56:235-242 (1999); Muff et al., An amylin receptor is revealed following co-transfection of a calcitonin receptor with receptor activity modifying proteins-1 or -3, Endocrinology, 140:2924-2927 (1999); Sexton et al. (2001); Leuthauser et al., Receptor-activity-modifying protein 1 forms heterodimers with two G-proteincoupled receptors to define ligand recognition, Biochem. J., 351:347-351 (2000); Tilakaratne et al., Amylin receptor phenotypes derived from human calcitonin receptor/RAMP co-expression exhibit pharmacological differences dependent on receptor isoform and host cell environment, J. Pharmacol. Exp. Ther., 294:61-72 (2000); Nakamura et al., Osteoclast-like cells express receptor activity modifying protein 2: application of laser capture microdissection, J. Molec. Endocrinol., 34:257-261 (2005)).
В табл. 1 ниже обобщается взаимосвязь обсужденных выше компонентов рецептора.
Таблица 1
Компонент рецептора CRLR (CL) СТ (рецептор кальцитонина)
RAMP1 Рецептор CGRP Рецептор AMY1
RAMP2 Рецептор АМ1 Рецептор AMY2
RAMP3 Рецептор АМ2 Рецептор AMY3
Было предположено терапевтическое использование антагонистов CGRP. Noda и соавт. описали использование производных CGRP или CGRP для ингибирования агрегации тромбоцитов и для лечения или профилактики артериосклероза или тромбоза (ЕР 0385712 В1). Liu и соавт. обнаружили терапевтические агенты, модулирующие активность CTR, включая конъюгированные с носителем пептиды, такие как кальцитонин и человеческий aCGRP (WO 01/83526 А2; US 2002/0090646 А1). Вазоактивные пептидные антагонисты CGRP и их использование в способе для ингибирования связывания CGRP с рецепторами CGRP были выявлены Smith и соавт.; такие пептидные антагонисты CGRP ингибируют связывание CGRP с мембранами коронарной артерии и расслабляют коронарные артерии у свиней, подвергнутых воздействию капсаицина (патенты США № 6268474 В1 и 6756205 В2). Rist и соавт. обнаружили пептидные аналоги с активностью антагониста рецепторов CGRP, а также показали их использование в препаратах для лечения и профилактики ряда расстройств (DE 19732944 А1). CGRP является сильным сосудорасширяющим агентом, который задействован в патологии целого ряда вазомоторных симптомов, такие как все формы сосудистой головной боли, включая мигрени (с/без ауры) и сильные приступообразные головные боли (Durham, N. Engl. J. Med. 350:1073-1 075, 2004). Патофизиология мигрени включает активацию ганглия тройничного нерва, где локализован CGRP, при этом во время приступов мигрени концентрации CGRP значительно повышаются. Это, в свою очередь, способствует расширению кровеносных сосудов головы, нейрогенному воспалению и сенсибилизации (Doods, H., Curr. Opin. Investig. Drugs, 2:1261-1268 (2001)). Кроме того, в ходе приступов мигрени у пациентов повышаются сывороточные концентрации CGRP в наружной яремной вене (Goadsby et al., Ann. Neurol. 28:183-7, 1990). Внутривенное введение человеческого ci-CGRP индуцировало головную боль и мигрень у пациентов, страдающих мигренью без ауры, что поддерживает мнение о том, что CGRP обладает причинной ролью в развитии мигрени (Lassen et al., Cephalalgia 22:54-61, 2002).
Мигрень является сложным, общим неврологическим состоянием, которое характеризуется тяжелыми, эпизодическими приступами головной боли и ассоциированных симптомов, которые могут включать тошноту, рвоту, чувствительность к свету, звуку или движению. У некоторых пациентов головной боли предшествует аура, или аура может сопровождать головную боль. У некоторых пациентов головная боль может быть тяжелой и односторонней. Приступы мигрени действуют разрушающе на ежедневную жизнь. В США и Западной Европе общее количество людей, страдающих мигренью, составляет 11% от общего населения (6% мужчин, 15-18% женщин). Более того, медиана частоты приступов у отдельного человека составляет 1,5 приступа/месяц. В то время как существует целый ряд методов лечения для облегчения или снижения симптомов, для пациентов, имеющих более 3-4 приступов мигрени в месяц, рекомендуется проведение профилактической терапии (Goadsby, et al. New Engl. J. Med. 346(4): 257-275, 2002). Некоторые пациенты с мигренью были подвергнуты лечению топираматом, противосудорожным средством, которое блокирует потенциалозависимые натриевые каналы и определенные рецепторы глутамата (АМРА-каинат), усиливает активность рецептора ГАМК-А и блокирует карбоангидразу. Достигнутый относительно недавно успех использования серотонина 5HT-I B/ID и/или агонистов рецептора 5НТ-1, таких как суматриптан, у некоторых пациентов позволил исследователям предположить серотонинергическую этиологию расстройства. К несчастью, в то время как у некоторых пациентов отмечался хороший ответ на такое лечение, другие оставались относительно резистентными к его эффектам.
- 3 031320
Возможное участие CGRP в мигрени стало основой для разработки и испытаний целого ряда соединений, которые ингибируют высвобождение CGRP (например, суматриптан), антагонизируют рецептор CGRP (например, дипептидное производное BIBN4096BS (Boehringer Ingelheim), CGRP(8-37)) или взаимодействуют с одним или несколькими связанными с рецепторами белками, например, RAMP1 (Brain, S. et al., Trends in Pharmacological Sciences 23:51-53, 2002. Alpha-2 adrenoceptor subtypes and adenosine Al receptors also control (inhibit) CGRP release and trigeminal activation (Goadsby et al., Brain 125:1392401, 2002). С другой стороны, лечение соединениями, которые исключительно ингибируют нейрогенное воспаление (например, антагонисты рецептора тахикинина NKI) или активацию ганглия тройничного нерва (например, антагонисты рецептора 5НТ10), оказалось относительно неэффективным в качестве острого лечения мигрени, приводя в некоторых случаях к сомнению, является ли ингибирующее высвобождение CGRP основой для эффективных способов лечения мигрени (Arulmani et al., Eur. J. Pharmacol. 500:315-330, 2004). Несмотря на то что точная патофизиология мигрени еще окончательно не изучена, терапевтическое использование антагонистов CGRP и CGRP-направленных аптамеров было предложено для лечения мигрени и других расстройств (например, Olesen et al., Calcitonin gene-related peptide receptor antagonist BIBN 4096 BS for the acute treatment of migraine, New Engl. J. Med., 350:1104-1110 (2004); Perspective: CGRP-receptor antagonists--a fresh approach to migraine, New Engl. J. Med., 350:1075 (2004); Vater et al., Short bioactive Spiegelmers to migraine-associated calcitonin gene-related peptide rapidly identified by a novel approach: tailored-SELEX, Nuc. Acids Res., 31(21 e130):1-7 (2003); WO 96/03993). Более того, в ходе недавно проведенного клинического исследования III фазы было показано, что сильный низкомолекулярный антагонист CGRP облегчает умеренные/сильные приступы мигрени, включая вызываемую мигренью боль и связанные с мигренью симптомы (Connor, et al. Efficacy and Safety of telcagepant (MK-0974), a Novel Oral CGRP Receptor Antagonist, for Acute Migraine Attacks. Poster, European Headache and Migraine Trust International Congress, London, England, September 2008). CGRP также может принимать участие в других синдромах хронической боли, кроме мигрени. У грызунов при интратекальном введении CGRP отмечалась сильная боль, а уровни CGRP в целом ряде болевых моделей были повышены. Кроме того, антагонисты CGRP частично блокируют ноцицепцию при остром панкреатите у грызунов (Wick, et al. (2006), Surgery, Vol. 139, Issue 2, p. 197-201). В общей сложности, из таких наблюдений следует, что сильный антагонист рецептора CGRP избирательного действия может оказаться эффективным для лечения хронической боли, включая мигрень.
Сущность изобретения
Настоящее изобретение описывает изолированные антитела или их антигенсвязывающие фрагменты и другие изолированные антигенсвязывающие белки, которые связывают рецептор CGRP (CGRP R), в частности CGRP R приматов, например, человеческий CGRP R. Такие изолированные антигенсвязывающие белки могут избирательно ингибировать CGRP R приматов (в сравнении с рецепторами приматов АМ1, АМ2, СТ или рецепторами амилина) и связывать как CRLR-, так и RAMP1-компоненты CGRP R. Было обнаружено, что CGRP R-связывающие белки ингибируют, влияют на или модулируют как минимум один из биологических ответов, связанных с CGRP R, и, таким образом, могут использоваться для улучшения эффектов обусловленных CGRP R заболеваний или расстройств. Таким образом, связывание определенных антигенсвязывающих белков с CGRP R приводит к одному или нескольким следующим эффектам: ингибирование, взаимодействие или модулирование CGRP R, ингибирование расширения сосудов, снижение нейрогенного воспаления и облегчение, смягчение симптомов, лечение, профилактика или снижение симптомов хронической боли или мигрени. В одном аспекте изобретения изолированный антигенсвязывающий белок включает последовательность CDRL1, последовательность CDRL2, последовательность CDRL3, последовательность CDRH1, последовательность CDRH2 и последовательность CDRH3. В одном варианте исполнения изобретения CDRL1 содержит SEQ ID NO: 42, CDRL2 содержит SEQ ID NO: 43, CDRL3 содержит SEQ ID NO: 44, CDRH1 содержит SEQ ID NO: 73, CDRH2 содержит SEQ ID NO: 74 и CDRH3 содержит SEQ ID NO: 75. В другом варианте исполнения изобретения CDRL1 содержит SEQ ID NO: 45, CDRL2 содержит SEQ ID nO: 46, CDRL3 содержит SEQ ID NO: 47, CDRH1 содержит SEQ ID NO: 76, CDRH2 содержит SEQ ID NO: 77 и CDRH3 содержит SEQ ID NO: 78. В другом варианте исполнения изобретения CDRL1 содержит SEQ ID NO: 45, CDRL2 содержит SEQ ID NO: 61, CDRL3 содержит SEQ ID NO: 47, CDRH1 содержит SEQ ID NO: 76, CDRH2 содержит SEQ ID NO: 91 и CDRH3 содержит SEQ ID NO: 78. В другом варианте исполнения изобретения CDRL1 содержит SEQ ID NO: 62, CDRL2 содержит SEQ ID NO: 63, CDRL3 содержит SEQ ID NO: 64, CDRH1 содержит SEQ ID NO: 92, CDRH2 содержит SEQ ID NO: 93 и CDRH3 содержит SEQ ID NO: 94. В другом варианте исполнения изобретения CDRL1 содержит SEQ ID NO: 45, CDRL2 содержит SEQ ID NO: 61, CDRL3 содержит SEQ ID NO: 47, CDRH1 содержит SEQ ID NO: 76, CDRH2 содержит SEQ ID NO: 95 и CDRH3 содержит SEQ ID NO: 78. В другом варианте исполнения изобретения CDRL1 содержит SEQ ID NO: 42, CDRL2 содержит SEQ ID NO: 43, CDRL3 содержит SEQ ID NO: 44, CDRH1 содержит SEQ ID NO: 73, CDRH2 содержит SEQ ID NO: 74 и CDRH3 содержит SEQ ID NO: 96. В любом из указанных выше вариантах исполнения изобретения, определяемых по последовательности, изолированный антигенсвязывающий белок может быть представлен, например, моноклональным антителом, поликлональным антителом, рекомбинантным антителом, человеческим (т.е. полностью человеческим) антителом, гуманизи
- 4 031320 рованным антителом, химерным антителом, мультиспецифическим антителом или их антигенсвязывающими фрагментами. Кроме того, фрагмент изолированного антигенсвязывающего белка может быть представлен Fab фрагментом, Fab' фрагментом, F(ab')2 фрагментом, Fv фрагментом, диателом или одноцепочечной молекулой антитела. Например, изолированный антигенсвязывающий белок может быть представлен человеческим моноклональным антителом или, например, антителом типа IgG1-, IgG2-, IgG3- или IgG4-. Кроме того, изолированные антигенсвязывающие белки могут быть представлены нейтрализующими антигенсвязывающими белками. В любом из указанных выше вариантах исполнения изобретения, определяемых по последовательности, изолированный антигенсвязывающий белок может специфически связываться с человеческими CRLR и RAMP1, но не связываться специфически с АМ1, АМ2 или человеческим рецептором амилина (например, AMY1), например, изолированный антигенсвязывающий белок может специфически связываться с человеческим CGRP R с показателем KD <1 мкмоль, <100 нмоль, <10 нмоль или <5 нмоль, например, как это определено с использованием анализа связывания FACS и проанализировано с использованием методов, описанных, например, Rathanaswami, et al., Biochemical and Biophysical Research Communications 334 (2005), 1004-1013. В любом из указанных выше вариантах исполнения изобретения, определяемых по последовательности, изолированный антигенсвязывающий белок может избирательно ингибировать человеческий рецептор CGRP относительно человеческих рецепторов АМ1, АМ2 или AMY1, например, с индексом избирательности 100 или более, 250 или более, 500 или более, 750 или более, 1000 или более, 2500 или более, 5000 или более, или 10000 или более, и такая избирательность может быть определена любым подходящим методом, например, с использованием анализа цАМФ, как это описано в примерах текста данного изобретения. В любом из указанных выше вариантах исполнения изобретения, определяемых по последовательности, изолированный антигенсвязывающий белок может иметь показатель Ki <100, <10, <1, <0,5 или <0,1 нмоль, установленный в ходе анализа конкурентного связывания CGRP с использованием радиомеченного 125I-CGRP, связывающегося с мембранами клеток, экспрессирующих человеческий CGRP R (анализ описан в примере 5 данного изобретения). Некоторые описанные изолированные антигенсвязывающие белки состоят из последовательности вариабельного участка тяжелой цепи (VH), которая имеет идентичность как минимум 90 или 95% в сравнении с последовательностью аминокислот, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 158-170. Некоторые описанные изолированные антигенсвязывающие белки состоят из последовательности вариабельного участка легкой цепи (VL), которая имеет идентичность как минимум 90 или 95% в сравнении с последовательностью аминокислот, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 137-153. Некоторые описанные изолированные антигенсвязывающие белки состоят из VH последовательности, которая имеет идентичность как минимум 90 или 95% в сравнении с последовательностью аминокислот, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 158-170, и VL последовательности, которая имеет идентичность как минимум 90 или 95% в сравнении с последовательностью аминокислот, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 137-153. В некоторых вариантах исполнения изобретения изолированные антигенсвязывающие белки состоят из (А) вариабельного участка тяжелой цепи (VH), включающего последовательность (i), выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 158-170, или (ii) как это определено (i) и включая одну или несколько (например, пять, десять, пятнадцать или двадцать) замен аминокислот (например, замены консервативных аминокислот), делеций или вставок; (В) VL, включающего последовательность (iii), выбранную из группы, содержащей SEQ ID NO: 137-153, или (iv) как это определено (iii) и включая одну или несколько (например, пять, десять, пятнадцать или двадцать) замен аминокислот (например, замены консервативных аминокислот), делеций или вставок; или (С) VH, состоящего из (А), и VL, состоящего из (В). В некоторых вариантах исполнения изобретения изолированные антигенсвязывающие белки состоят из вариабельного участка тяжелой цепи (VH), включающего последовательность, выбираемую из группы, содержащей SEQ ID NO: 158-170, и VL, включающего последовательность, выбираемую из группы, содержащей SEQ ID NO: 137-153.
В одном варианте исполнения изобретения изолированный антигенсвязывающий белок содержит вариабельный участок тяжелой цепи (VH), включающий аминокислотную последовательность, выбираемую из группы, содержащей (i) SEQ ID NO: 158, (ii) последовательность, которая как минимум на 90 или 95% идентична последовательности, определяемой по (i), и (iii) последовательность, определяемую по (i) и содержащую до десяти аминокислотных замен (например, замены консервативных аминокислот), делеций или вставок. В другом варианте исполнения изобретения изолированный антигенсвязывающий белок содержит вариабельный участок VH, включающий аминокислотную последовательность, выбираемую из группы, содержащей (i) SEQ ID NO: 164, (ii) последовательность, которая как минимум на 90 или 95% идентична последовательности, определяемой по (i), и (iii) последовательность, определяемую по (i) и содержащую до десяти аминокислотных замен (например, замены консервативных аминокислот), делеций или вставок.
В другом варианте исполнения изобретения изолированный антигенсвязывающий белок содержит вариабельный участок VL, включающий аминокислотную последовательность, выбираемую из группы, содержащей (i) SEQ ID NO: 142, (ii) последовательность, которая как минимум на 90 или 95% идентична последовательности, определяемой по (i), и (iii) последовательность, определяемую по (i) и содержащую
- 5 031320 до десяти аминокислотных замен (например, замены консервативных аминокислот), делеций или вставок. В другом варианте исполнения изобретения изолированный антигенсвязывающий белок содержит вариабельный участок VL, включающий аминокислотную последовательность, выбираемую из группы, содержащей (i) SEQ ID NO: 146, (ii) последовательность, которая как минимум на 90 или 95% идентична последовательности, определяемой по (i), и (iii) последовательность, определяемую по (i) и содержащую до десяти аминокислотных замен (например, замены консервативных аминокислот), делеций или вставок.
В любом из указанных выше вариантов исполнения изобретения, определяемых по последовательностям VL и VH, изолированный антигенсвязывающий белок может быть представлен, например, моноклональным антителом, поликлональным антителом, рекомбинантным антителом, человеческим (т.е. полностью человеческим) антителом, гуманизированным антителом, химерным антителом, мультиспецифическим антителом или их антигенсвязывающими фрагментами. Кроме того, фрагмент изолированного антигенсвязывающего белка может быть представлен Fab фрагментом, Fab' фрагментом, F(ab')2 фрагментом, Fv фрагментом, диателом или одноцепочечной молекулой антитела. Например, изолированный антигенсвязывающий белок может быть человеческим моноклональным антителом и быть представлен, например, антителом типа IgG1-, IgG2-, IgG3- или IgG4-. Кроме того, изолированные антигенсвязывающие белки могут быть представлены нейтрализующими антигенсвязывающими белками.
В любом из указанных выше вариантов исполнения изобретения, определяемых по последовательности VL и VH, изолированный антигенсвязывающий белок может специфически связываться с человеческими CRLR и RAMP1, но не связываться специфически с АМ1, АМ2 или человеческим рецептором амилина (например, AMY1), например, изолированный антигенсвязывающий белок может специфически связываться с человеческим CGRP R с показателем KD <1 мкмоль, <100 нмоль, <10 нмоль или <5 нмоль, например, как это определено с использованием анализа связывания FACS и проанализировано с использованием методов, описанных, например, Rathanaswami, et al., Biochemical and Biophysical Research Communications 334 (2005), 1004-1013. В любом из указанных выше вариантов исполнения изобретения, определяемых по последовательности VL и VH, изолированный антигенсвязывающий белок может избирательно ингибировать человеческий рецептор CGRP относительно человеческих рецепторов АМ1, АМ2 или AMY1, например, с индексом избирательности 100 или более, 250 или более, 500 или более, 750 или более, 1000 или более, 2500 или более, 5000 или более, или 10000 или более, и такая избирательность может быть определена любым подходящим методом, например, с использованием анализа цАМФ, как это описано в примерах текста данного изобретения. В любом из указанных выше вариантов исполнения изобретения, определяемых по последовательности VL и VH, изолированный антигенсвязывающий белок может иметь показатель Ki <100, <10, <1, <0,5 или <0,1 нмоль, установленный в ходе анализа конкурентного связывания CGRP с использованием радиомеченного 125I-CGRP, связывающегося с мембранами клеток, экспрессирующих человеческий CGRP R (анализ описан в примере 5 изобретения). В одном аспекте изобретения, изолированные антигенсвязывающие белки состоят из последовательности тяжелой цепи, которая имеет идентичность как минимум 90 или 95% в сравнении с последовательностью аминокислот, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 29-41. Некоторые описанные изолированные антигенсвязывающие белки состоят из последовательности легкой цепи, которая имеет идентичность как минимум 90 или 95% в сравнении с последовательностью аминокислот, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 12-28. Некоторые изолированные антигенсвязывающие белки состоят из последовательности тяжелой цепи, которая имеет идентичность как минимум 90 или 95% в сравнении с последовательностью аминокислот, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 29-41, и последовательности легкой цепи, которая имеет идентичность как минимум 90 или 95% в сравнении с последовательностью аминокислот, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 12-28. В некоторых вариантах исполнения изобретения изолированные антигенсвязывающие белки состоят из (А) тяжелой цепи (VH), включающей последовательность (i), выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 29-41, или (ii) как это определено (i) и включая одну или несколько (например, пять, десять, пятнадцать или двадцать) замен аминокислот (например, замены консервативных аминокислот), делеций или вставок; (В) легкой цепи, включающей последовательность (iii), выбранную из группы, содержащей SEQ ID NO: 12-28, или (iv) как это определено (iii) и включая одну или несколько (например, пять, десять, пятнадцать или двадцать) замен аминокислот (например, замены консервативных аминокислот), делеций или вставок; или (С) тяжелой цепи (А) и легкой цепи (В). В некоторых вариантах исполнения изобретения изолированные антигенсвязывающие белки состоят из тяжелой цепи, включающей последовательность, выбираемую из группы, содержащей SEQ ID NO: 29-41, и легкой цепи, включающей последовательность, выбираемую из группы, содержащей SEQ ID NO: 12-28. В другом варианте исполнения изобретения изолированные антигенсвязывающие белки состоят из (А) тяжелой цепи, включающей последовательность аминокислот, выбранную из группы, состоящей из (i) SEQ ID NO: 29, (ii) последовательности, имеющей идентичность 90 или 95% в сравнении с последовательностью, определяемой (i), и (iii) последовательности, определяемой (i) и содержащей до десяти замен аминокислот (например, замены консервативных аминокислот), делеций или вставок; и (В) легкой цепи, включающей последовательность аминокислот, выбранную
- 6 031320 из группы, состоящей из (i) SEQ ID NO: 17, (ii) последовательности, имеющей идентичность 90 или 95% в сравнении с последовательностью, определяемой (i), и (iii) последовательности, определяемой (i) и содержащей до десяти замен аминокислот (например, замены консервативных аминокислот), делеций или вставок.
В другом варианте исполнения изобретения изолированные антигенсвязывающие белки состоят из (А) тяжелой цепи, включающей последовательность аминокислот, выбранную из группы, состоящей из (i) SEQ ID NO: 35, (ii) последовательности, имеющей идентичность 90 или 95% в сравнении с последовательностью, определяемой (i), и (iii) последовательности, определяемой (i) и содержащей до десяти замен аминокислот (например, замены консервативных аминокислот), делеций или вставок; и (В) легкой цепи, включающей последовательность аминокислот, выбранную из группы, состоящей из (i) SEQ ID NO: 21, (ii) последовательности, имеющей идентичность 90 или 95% в сравнении с последовательностью, определяемой (i), и (iii) последовательности, определяемой (i) и содержащей до десяти замен аминокислот (например, замены консервативных аминокислот), делеций или вставок.
В любом из указанных выше вариантах исполнения изобретений, основанных на последовательностях легкой и тяжелой цепей, изолированный антигенсвязывающий белок может содержать установленную последовательность тяжелой и/или легкой цепи, но с разной сигнальной последовательностью или без нее. В любом из указанных выше вариантов исполнения изобретения, определяемых по последовательностям легкой и тяжелой цепи, изолированный антигенсвязывающий белок может быть представлен, например, моноклональным антителом, поликлональным антителом, рекомбинантным антителом, человеческим (т.е. полностью человеческим) антителом, гуманизированным антителом, химерным антителом, мультиспецифическим антителом или их антигенсвязывающими фрагментами. Кроме того, фрагмент изолированного антигенсвязывающего белка может быть представлен Fab фрагментом, Fab' фрагментом, F(ab')2 фрагментом, Fv фрагментом, диателом или одноцепочечной молекулой антитела. Например, изолированный антигенсвязывающий белок может быть человеческим моноклональным антителом и быть представлен, например, антителом типа IgG1-, IgG2-, IgG3- или IgG4-. Кроме того, изолированные антигенсвязывающие белки могут быть представлены нейтрализующими антигенсвязывающими белками. В любом из указанных выше вариантов исполнения изобретения, определяемых по последовательности легкой и тяжелой цепи, изолированный антигенсвязывающий белок может специфически связываться с человеческими CRLR и RAMP1, но не связываться специфически с АМ1, АМ2 или человеческим рецептором амилина (например, AMY1), например, изолированный антигенсвязывающий белок может специфически связываться с человеческим CGRP R с показателем KD <1 мкмоль, <100 нмоль, <10 нмоль или <5 нмоль, например, как это определено с использованием анализа связывания FACS и проанализировано с использованием методов, описанных, например, Rathanaswami, et al., Biochemical and Biophysical Research Communications 334 (2005) 1004-1013. В любом из указанных выше вариантов исполнения изобретения, определяемых по последовательности легкой и тяжелой цепи, изолированный антигенсвязывающий белок может избирательно ингибировать человеческий рецептор CGRP относительно человеческих рецепторов АМ1, АМ2 или AMY1, например, с индексом избирательности 100 или более, 250 или более, 500 или более, 750 или более, 1000 или более, 2500 или более, 5000 или более, или 10 000 или более, и такая избирательность может быть определена любым подходящим методом, например, с использованием анализа цАМФ, как это описано в примерах текста данного изобретения. В любом из указанных выше вариантов исполнения изобретения, определяемых по последовательности легкой и тяжелой цепи, изолированный антигенсвязывающий белок может иметь показатель Ki <100, <10, <1, <0,5 или <0,1 нмоль, установленный в ходе анализа конкурентного связывания CGRP с использованием радиомеченного 125I-CGRP, связывающегося с мембранами клеток, экспрессирующих человеческий CGRP R (анализ описан в примере 5 данного изобретения). Еще в одном аспекте изобретения представлены изолированные полинуклеотиды (нуклеиновые кислоты), кодирующие один из описанных выше антигенсвязывающих белков CGRP R. В одном варианте исполнения изобретения изолированный полинуклеотид содержит последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 175, 176, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 186, 187, 188, 189, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209 и 210. В другом варианте исполнения изобретения изолированный полинуклеотид содержит последовательность, выбранную из группы, содержащей SEQ ID NO: 224-258. В другом варианте исполнения изобретения изолированный полинуклеотид содержит последовательность, обладающую способностями гибридизации при строгих условиях гибридизации и выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 224-258. В другом варианте исполнения изобретения изолированный полинуклеотид содержит последовательности обладающей 80, 85, 90, 95% или большим сходством с последовательностью, выбранной из группы, состоящей из последовательности SEQ ID NO: 224-258. В похожих вариантах исполнения изобретения изолированные полинуклеотиды включены в вектор экспрессии. Также включены клеточные линии, трансформированные с помощью вектора экспрессии и содержащие изолированные полинуклеотиды, как это описано выше. В подобном аспекте изобретения представлены векторы экспрессии и клетки-хозяева, трансформированные или трансфецированные векторами экспрессии, состоящими из указанных выше изолированных молекул нуклеиновых кислот, кодирующих описанные выше
- 7 031320 антигенсвязывающие белки CGRP R.
В другом аспекте изобретения также описан способ получения антигенсвязывающих белков, который включает этап получения антигенсвязывающего белка из клетки-хозяина, секретирующей антигенсвязывающий белок. В некоторых вариантах исполнения изобретения антигенсвязывающий белок получают с использованием иммуногена, содержащего растворимый рецептор CGRP. В некоторых вариантах исполнения изобретения такой растворимый рецептор CGRP получают методом коэкспрессии и очистки N-терминального экстрацеллюлярного домена (ЭЦД) человеческого CRLR и ЭЦД человеческого RAMP1, например, ЭЦД человеческого CRLR включает SEQ ID NO: 6, а ЭЦД RAMP1 включает SEQ ID NO: 8 (как это описано в примерах 1 и 2 настоящей заявки на изобретение). Еще в одном аспекте изобретения лекарственный препарат состоит как минимум из одного из представленных выше антигенсвязывающих белков и фармацевтически подходящего вспомогательного средства. В одном аспекте изобретения изолированный антигенсвязывающий белок эффективен в ингибировании расширения сосудов и/или снижении нейрогенного воспаления при введении пациенту. В одном варианте исполнения изобретения изолированный антигенсвязывающий белок эффективен в снижении частоты и/или тяжести головных болей, например, вызванных мигренью. Например, антигенсвязывающий белок может использоваться в качестве средства неотложного лечения мигрени и/или в качестве профилактического лечения для предотвращения или снижения частоты и/или тяжести симптомов, в частности, болевых симптомов, связанных с приступами мигрени.
Другие аспекты изобретения в дальнейшем описывают способы лечения или профилактики состояния, обусловленного CGRP R, у пациента, и включают введение пациенту эффективного количества как минимум одного изолированного антигенсвязывающего белка, описанного выше. В одном варианте исполнения изобретения такое состояние представлено головной болью, например головной болью, вызванной мигренью, или приступообразной головной болью, или болью другого типа, например, хронической болью.
Эти и другие аспекты изобретения будут описаны далее по тексту более подробно. Каждый аспект изобретения может включать несколько вариантов исполнения, представленных в данном изобретении на изобретение. Таким образом, ожидается, что каждый из вариантов исполнения изобретения, включающий один элемент или комбинации элементов, может быть включен в каждый представленный аспект изобретения, и все такие комбинации указанных выше аспектов и вариантов исполнения изобретения описаны в непосредственной форме. Другие особенности, цели и преимущества изобретения очевидны из подробного и представленного ниже описания.
Краткое описание чертежей
На фиг. 1 представлены последовательности RAMP-1 человека, яванской макаки и крысы.
На фиг. 2 представлены последовательности CRLR человека, яванской макаки и крысы.
На фиг. 3A и 3B представлены последовательности ГВУ легких цепей на основе филогенетического признака, полученные с помощью указанных клонов антител к рецептору CGRP, имеющих легкие каппацепи, и определенные соответствующие консенсусные последовательности.
На фиг. 4 представлены последовательности ГВУ легких цепей на основе филогенетического признака, полученные с помощью указанных клонов антител к рецептору CGRP, имеющих легкие лямбдацепи, и определенные соответствующие консенсусные последовательности.
На фиг. 5А, 5В, 5С, 5D и 5Е представлены последовательности ГВУ легких цепей на основе филогенетического признака, полученные с помощью указанных клонов антител к рецептору CGRP, и определенные соответствующие консенсусные последовательности. На фиг. 5F представлены консенсусные последовательности типичного ГВУ тяжелой цепи антитела к рецептору CGRP, описанного в данном тексте.
На фиг. 6 представлен график, построенный из данных, полученных в ходе двух экспериментов и указывающих на процентный показатель ингибирования связывания меченого лиганда с CGRP R в надосадочной жидкости гибридомы 1092 с антителами к CGRP R (ромбы) и надосадочной жидкости отрицательного контроля 68 (квадраты).
На фиг. 7A-7D представлен типичный анализ цАМФ данных IC50, полученных для клеток, экспрессирующих рецептор hCGRP (фиг. 7А), hAM1 (фиг. 7В), hAM2 (фиг. 7С) и человеческие рецепторы амилина (фиг. 7D) для трех указанных моноклональных антител к CGRP R.
На фиг. 8 приводится пример данных по связыванию 125I-CGRP, которые могут использоваться для определения Ki моноклональных антител к человеческому рецептору CGRP.
На фиг. 9A-9D представлены сравнительные данные, полученные с помощью Biacore для выбранных и описанных в данном тексте антител.
На фиг. 10 представлено определение FACS Kd для моноклональных антител 12G8.
На фиг. 11 представлено сравнение последовательностей RAMP1 яванской макаки, человека, человеческой химеры, крысы и макаки-резуса.
На фиг. 12А, 12В представлено сравнение последовательностей CRLR человека, яванской макаки, макаки-резуса, крысы, человека, человеческой химеры и консенсусных последовательностей CRLR.
На фиг. 13А-13С приводятся репрезентативные данные FACS-анализа, полученные для разных хи
- 8 031320 мерных рецепторов к CGRP, связывающихся с антителами к CGRP R.
На фиг. 14 представлены пептидные карты, полученные при расщеплении AspN с использованием только CGRP R (хроматограмма А) и при расщеплении контрольного образца, содержащего моноклональное антитело CGRP R 12G8 (хроматограмма В).
На фиг. 15 представлено расщепление CGRP R в присутствии разных концентраций нейтрализующего антитела к CGRP R.
На фиг. 16 представлено расщепление AspN CGRP R в присутствии разных концентраций нейтрализующего антитела к CGRP R (4E4).
На фиг. 17 представлена интенсивность иммуногистохимического окрашивания в клетках, экспрессирующих разные компоненты рецепторов с антителом 32Н7.
Подробное описание изобретения
Вторые заголовки, используемые в тексте данного изобретения, используются только в организационных целях, и не должны рассматриваться в качестве ограничения описанного объекта изобретения.
Если иное не указано в тексте, научные и технические термины, используемые в связи с данным изобретением, должны иметь значения, которые обычно понятны специалистам в данной области науки. Кроме того, если иное не подразумевается контекстом, термины в единственном числе могут включать множественные значения, и термины во множественном числе могут включать значения в единственном числе.
Как правило, используемая номенклатура, а также способы получения клеточных и тканевых культур, методы иммунологии, микробиологии, генетики, химии белков и нуклеиновых кислот и гибридизации, описанные в данном тексте, широко известны и используются в науке. Методы и способы изобретения обычно выполняются в соответствии со стандартными методами, широко известными науке и описанными в различных специальных руководствах, которые цитируются по тексту данного изобретения, если иное не указано. См., например, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001), Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1992), и Harlow and Lane Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1990) (включены в настоящую заявку посредством ссылки). Ферментативные реакции и способы очистки выполняются в соответствии с указаниями производителя, как это обычно осуществляется в науке или описано в тексте данного изобретения. Используемая терминология и лабораторные процедуры и методы аналитической химии, органического синтеза, медицинской и фармацевтической химии, описанные в данном изобретении, широко известны и используются в науке. Для химического синтеза, химических анализов, приготовления лекарственных препаратов, разработки рецептуры, доставки препаратов и лечения пациентов могут использоваться стандартные способы.
Следует понимать, что данное изобретение не ограничивается отдельной методологией, протоколами, реагентами и т. д., описываемыми в данном изобретении на изобретение, и, следовательно, такие методологии, протоколы, реагенты и т.д. могут различаться. Используемая в данном изобретении терминология предназначена для описания только отдельных вариантов исполнения изобретения и не должна ограничивать область применения данного изобретения, определяемую исключительно по формуле изобретения. Кроме рабочих примеров или если не указано иное, представленные количества ингредиентов или используемые условия реакций должны пониматься как модифицированные во всех случаях при наличии слова примерно. Слово примерно, при его использовании вместе со знаком процентов, обозначает ±1%.
Определения.
Термин полинуклеотид или нуклеиновая кислота включает одноцепочечные или двухцепочечные нуклеотидные полимеры. Нуклеотиды, образующие полинуклеотид, могут быть представлены рибонуклеотидами или дезоксирибонуклеотидами, или модифицированной формой любого типа нуклеотида. Упомянутые модификации включают модификации основания, например, производные бромуридина и инозина, модификации рибозы, например, 2',3'-дидезоксирибоза, и модификации межнуклеотидных связей, такие как фосфотиоат, фосфодитиоат, фосфоселенат, фосфодиселенат, фосфоанилотиоат, фосфоаниладат и фосфоамидат.
Термин олигонуклеотид означает полинуклеотид, состоящий из 200 или менее нуклеотидов. В некоторых вариантах исполнения изобретения, олигонуклеотиды имеют длину от 10 до 60 оснований. В других вариантах исполнения изобретения олигонуклеотиды имеют в длину 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или от 20 до 40 нуклеотидов. Олигонуклеотиды могут быть одноцепочечными или двухцепочечными, например, для использования в построении мутантного гена. Олигонуклеотиды могут быть смысловыми или антисмысловыми олигонуклеотидами. Олигонуклеотид может содержать метку, включая радиометку, флуоресцирующую метку, гаптен или антигенную метку, используемые при анализах выявления. Олигонуклеотиды могут использоваться, например, в качестве праймеров ПЦР, праймеров клонирования или зондов для гибридизации.
Термин изолированная молекула нуклеиновой кислоты означает ДНК или РНК генома, мРНК, кДНК, или синтетический аналог, или определенную комбинацию указанных соединений, которые не
- 9 031320 связаны со всем полинуклеотидом или его участком, в котором изолированный полинуклеотид встречается в природе, или связаны с полинуклеотидом в виде, не встречаемом в природе. В целях настоящей заявки на изобретение следует понимать, что молекула нуклеиновой кислоты, состоящая из... обозначает отдельную нуклеотидную последовательность, не охватывающую интактные хромосомы. Изолированные молекулы нуклеиновой кислоты включают особые последовательности нуклеиновой кислоты и, кроме таких особых последовательностей, также могут включать кодирующие последовательности для 10 или даже 20 других белков или их участков, или могут включать функционально связанные регуляторные последовательности, контролирующие экспрессию кодируемого участка перечисленных последовательностей нуклеиновых кислот, и/или могут включать векторные последовательности.
Если не указано иное, левый конец любой одноцепочечной полинуклеотидной последовательности, обсуждаемой выше, представлен 5'-концом; левостороннее направление последовательностей двухцепочечных полинуклеотидов называется 5'-направлением. Направление от 5' до 3' растущих транскриптов РНК называется направлением транскрипции; участки последовательности на цепи ДНК, имеющие одинаковую последовательность, что и транскрипт РНК (от 5'-конца к 6'-концу), называются восходящими последовательностями; участки последовательности на цепи ДНК, имеющие такую же последовательность, что и транскрипт РНК (от З'-конца к З'-концу), называются нисходящими последовательностями.
Термин контрольная последовательность относится к полинуклеотидной последовательности, которая может влиять на экспрессию и процессинг комплементарных кодирующих последовательностей. Природа таких кодирующих последовательностей может зависеть от организма-хозяина. В отдельных вариантах исполнения изобретения контрольные последовательности у прокариот могут включать промотор, участок связывания рибосом и стоп-кодон транскрипции. Например, контрольные последовательности у эукариот могут включать промоторы, состоящие из одного или нескольких участков распознавания факторов транскрипции, последовательностей энхансеров транскрипции и стоп-кодона транскрипции. Контрольные последовательности могут включать лидерные последовательности и/или последовательности белков слияния. Термин вектор обозначает любую молекулу или форму (например, нуклеиновая кислота, плазмида, бактериофаг или вирус), используемые для переноса информации по коду белка в клетку-хозяина.
Термин вектор экспрессии или модель экспрессии относится к вектору, подходящему для трансформации клетки-хозяина и содержащему последовательности нуклеиновых кислот, направляющих и/или контролирующих (в комбинации с клеткой-хозяином) экспрессию одного или нескольких функционально связанных гетерологичных кодирующих участков. Вектор экспрессии может включать (но не ограничиваться) последовательности, которые влияют или контролируют транскрипцию, трансляцию и, в случае присутствия интронов, влияют на сплайсинг РНК в функционально связанном кодирующем участке.
Использованное здесь понятие функционально связанный означает, что компоненты, к которым применим данный термин, находятся во взаимосвязи, которая позволяет им выполнять соответствующие функции в подходящих условиях. Например, контрольная последовательность в векторе, который функционально связан с последовательностью, кодирующей белок, связана с таким вектором и таким образом, что экспрессия кодирующей белок последовательности достигается в условиях, соответствующих транскрипционной активности контрольных последовательностей. Термин клетка-хозяин обозначает клетку, подвергнутую трансформации или имеющую способность к трансформации, содержащую последовательность нуклеиновой кислоты и, следовательно, экспрессирующий необходимый ген. Термин включает потомство материнской клетки, вне зависимости от того, идентична ли морфология материнской клетки потомству, до тех пор, пока в таком потомстве присутствует интересующий ген.
Термин трансдукция обозначает перенос генов от одной бактерии в другую, обычно с помощью бактериофага. Трансдукция также относится к получению и переносу эукариотических клеточных последовательностей путем репликации неполноценных ретровирусов.
Термин трансфекция обозначает захват чужеродной или экзогенной ДНК клеткой, при этом клетка оказывается транфицированной экзогенной ДНК при ее прохождении внутрь клетки через клеточную мембрану. Науке известен целый ряд технологий трансфекции, приводимых в данном тексте. См., например, Graham et al., 1973, Virology 52:456; Sambrook et al., 2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, supra; Davis et al., 1986, Basic Methods in Molecular Biology, Eisevier; Chu et al., 1981, Gene 1.3:197. Такие способы могут использоваться для введения одной или нескольких фрагментов экзогенной ДНК внутрь соответствующих клеток-хозяев.
Термин трансформация относится к изменению генных параметров клетки, при этом клетка оказывается трансформированной, имея модифицированную (новую) ДНК или РНК. Например, клетка оказывается трансформированной в случае генной модификации в сравнении со своим нативным состоянием путем введения нового генного материала путем трансфекции, трансдукции или другими способами. После трансфекции или трансдукции, трансформирующая ДНК может рекомбинировать с ДНК клетки путем физического встраивания в хромосому клетки, или может временно храниться в эписомальных элементах без репликации, или реплицироваться независимым образом в качестве плазмиды. Клетка
- 10 031320 считается стабильно трансформированной, если трансформирующая ДНК реплицируется в клетке.
Термины полипептид или белок используются в тексте на равных основаниях, означая полимер, состоящий из остатков аминокислот. Термины также применимы к полимерам аминокислот, в которых один или несколько аминокислотных остатков являются аналогами или миметиками соответствующей встречающейся в природе аминокислоты, а также встречающихся в природе полимеров аминокислот. Термины также описывают полимеры аминокислот, подвергнутые модификации, например, путем добавления углеводных остатков для образования гликопротеинов или фосфорилирования. Полипептиды и белки могут быть получены с помощью представленных в природе и не подвергнутых рекомбинации клеток; также они могут быть получены с помощью подвергнутых генной инженерии или рекомбинации клеток, состоя из молекул, имеющих аминокислотную последовательность нативного белка, или молекул, имеющих делеции, вставки и/или замены одной или нескольких аминокислот нативной последовательности. Термины полипептид и белок описывают, в частности, антигенсвязывающие белки, например антигенсвязывающие белки CGRP R, связывающиеся с CGRP R белки, антитела или последовательности, имеющие делеции, вставки и/или замены одной или нескольких аминокислот антигенсвязывающего белка. Термин фрагмент полипептида относится к полипептиду, имеющему делецию аминокислоты на терминальном конце, делецию карбоксильной группы на терминальном конце и/или внутреннюю делецию в сравнении с белком, имеющим полную длину. Такие фрагменты также могут включать модифицированные аминокислоты в сравнении с белком, имеющим полную длину. В некоторых вариантах исполнения изобретения фрагменты содержат от 5 до 500 аминокислот. Например, фрагменты могут содержать как минимум 5, 6, 8, 10, 14, 20, 50, 70, 100, 110, 150, 200, 250, 300, 350, 400 или 450 аминокислот. Полезные фрагменты полипептида включают иммунологически функциональные фрагменты антител, включая домены связывания. В случае CGRP R-связывающегося антитела, полезные фрагменты включают (но не ограничиваются) ГВУ, вариабельный домен тяжелой или легкой цепи, участок цепи антитела или только его вариабельный домен, включая два ГВУ и т.п. Под понятием CGRP-рецептор или CGRP подразумевается содержание RAMP1 и CRLR.
Термин изолированный белок (например, изолированный антигенсвязывающий белок), изолированный полипептид или изолированное антитело обозначает, что указанный белок, полипептид или антитело (1) не содержат как минимум других белков, с которыми они обычно связаны, (2) преимущественно не содержат других белков из этого же источника, например, одних и тех же видов, (3) экспрессируются клеткой, полученной у разных видов, (4) были сепарированы как минимум от 50% полинуклеотидов, липидов, углеводов или других материалов, с которыми они обычно встречаются в природе, (5) функционально связаны (ковалентными или нековалентными связями) с полипептидом, с которым не встречаются в природе, или (6) не встречаются в природе. Как правило, изолированный белок, изолированный полипептид или изолированное антитело составляют как минимум около 5%, как минимум около 10%, как минимум около 25% или как минимум около 50% указанной выборки. Такой изолированный белок может кодироваться геномной ДНК, кДНК, мРНК или другой РНК, включая нуклеиновые кислоты синтетического происхождения, или их комбинацией. Предпочтительно, чтобы изолированный белок, полипептид или антитело не содержали другие белки или другие полипептиды, или другие примеси, которые встречаются в природе и которые помешали бы терапевтическому, диагностическому, профилактическому, исследовательскому или другому применению.
Вариант полипептида (например, антигенсвязывающий белок или антитело) включает последовательность аминокислот, в которой имеется вставка, делеция и/или замена одного или нескольких аминокислотных остатков относительно другой полипептидной последовательности. Варианты включают белки слияния. Производное полипептида является полипептидом (например, антигенсвязывающий белок или антитело), который был химически модифицирован определенным образом и отличается от вариантов со вставкой, делецией или заменой, например, посредством конъюгации с другой химической группой.
Термин встречающийся в природе, используемый в тексте данного изобретения по отношению к биологическим материалам, таким как полипептиды, нуклеиновые кислоты, клетки-хозяева и т. п., относится к материалам, присутствующим в природе.
Термин антигенсвязывающи белок, используемый в тексте данного изобретения, относится к белку, который специфически связывается с антигеном-мишенью, например, CGRP R, в частности, приматов, например, человеческий CGRP R. Антигенсвязывающий белок CGRP R специфически связывается с человеческим рецептором CGRP.
Когда константа диссоциации (KD) составляет <10-6 М, говорится, что антигенсвязывающий белок специфически связан со своей мишенью. Антитело специфически связывается с антигеном-мишенью с высокой аффинностью, когда KD составляет <1х10-8 М. В одном варианте исполнения изобретения антитела будут связываться с CGRP R, или человеческим CGRP R с KD <5х10-7; в другом варианте исполнения изобретения антитела будут связываться с KD <1 х10-7; в другом варианте исполнения изобретения антитела будут связываться с KD <5х10-8; в другом варианте исполнения изобретения антитела будут связываться с KD <1 х10-8; в другом варианте исполнения изобретения антитела будут связываться с KD
- 11 031320 <5х10-9; в другом варианте исполнения изобретения антитела будут связываться с KD <1х10-9; в другом варианте исполнения изобретения антитела будут связываться с KD <5х10-10; в другом варианте исполнения изобретения антитела будут связываться с KD <1х10-10.
Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент либо антигенсвязывающий белок избирательно ингибируют специфический рецептор в сравнении с другими рецепторами, когда показатель IC50 антитела, его антигенсвязывающего фрагмента или антигенсвязывающего белка, установленный в ходе анализа ингибирования специфического рецептора, как минимум в 50 раз меньше, чем показатель IC50, установленный в ходе анализа ингибирования другого эталонного рецептора. Индекс избирательности представляет собой частное от деления значения IC50 эталонного рецептора на значение IC50 специфического рецептора. Антитело, его антигенсвязывающий фрагмент или антигенсвязывающий белок избирательно ингибирует человеческий рецептор CGRP в том случае, когда значение IC50 антитела, его антигенсвязывающего фрагмента или антигенсвязывающего белка, установленное в ходе цАМФ-анализа, например, цАМФ-анализа ингибирования, описанного в примере 4, как минимум в 50 раз меньше, чем значение IC50 такого же антитела, его антигенсвязывающего фрагмента или антигенсвязывающего белка, установленное в ходе анализа ингибирования человеческих рецепторов АМ1, АМ2 или рецептора амилина (например, AMY1). В качестве неограничивающего примера; если значение IC50 специфичного антитела к CGRP R, установленное в ходе цАМФ-анализа hCGRP R, составляет, например, от 0,1 до 20 нмоль, и значение IC50 для этого же антитела, установленное в ходе цАМФ-анализа hAM1, hAM2 или человеческого рецептора AMY1, составляет 1000 нмоль или более, такое антитело избирательно ингибирует рецептор hCGRP. Под антигенсвязывающим белком, который избирательно ингибирует специфический рецептор, также понимается нейтрализующий антигенсвязывающий белок относительно отдельного рецептора.
Антигенсвязывающий участок обозначает белок или его участок, который специфически связывается со специфическим антигеном. Например, участок антигенсвязывающего белка, содержащий аминокислотные остатки, взаимодействующий с антигеном и ответственный за специфичность и аффинность антигенсвязывающего белка, называется антигенсвязывающим участком. Антигенсвязывающий участок включает, как правило, один или несколько комплементарно связывающих участков (или гипервариабельных участков, ГВУ). Определенные антигенсвязывающие участки также включают один или несколько каркасных участков. ГВУ представлен последовательностью аминокислот, которая вносит свой вклад в специфичность и аффинность связывания антигена. Каркасные участки могут помогать в поддержании надлежащей конформации ГВУ для обеспечения связывания между антигенсвязывающим участком и антигеном.
В определенных аспектах изобретения представлены рекомбинантные антигенсвязывающие белки, связывающие белок CGRP R или человеческий CGRP R. В таком контексте рекомбинантный белок представлен белком, получаемым с помощью методов рекомбинации, например, посредством экспрессии рекомбинантной нуклеиновой кислоты, как это описано в тексте данного изобретения. Способы и методы получения рекомбинантных белков хорошо известны науке.
Термин антитело относится к интактному иммуноглобулину любого изотипа или его антигенсвязывающему фрагменту, который может конкурировать с интактным антителом за специфическое связывание с антигеном-мишенью, и включать, например, химерные, гуманизированные, полностью человеческие и биспецифические антитела. Таким образом, антитело является одним из видов антигенсвязывающего белка. Как правило, интактное антитело будет состоять как минимум из двух полных тяжелых цепей и двух полных легких цепей, но в некоторых случаях может включать меньшее количество цепей, как, например, антитела семейства верблюдовых, состоящих только из тяжелых цепей. Антитела могут быть получены только из одного источника, или могут быть химерными, т.е. разные части антитела могут быть получены из двух разных антител, как это будет в дальнейшем описано ниже. Антигенсвязывающие белки, антитела или их связывающие фрагменты могут быть получены с помощью гибридом, методами рекомбинации ДНК, или ферментативным или химическим расщеплением интактных антител. Если не указано иное, термин антитело включает, кроме антител из двух полных тяжелых цепей и двух полных легких цепей, производные, варианты, фрагменты и их мутации, примеры которых приводятся ниже.
Термин легкая цепь включает полную легкую цепь и ее фрагменты, имеющие последовательность вариабельного участка, достаточную для обеспечения специфичности связывания. Полная легкая цепь включает домен вариабельного участка (VL) и домен константной области (CL). Домен вариабельного участка легкой цепи находится на N-конце полипептида. Легкие цепи включают каппа-цепи и лямбдацепи.
Термин тяжелая цепь включает полную тяжелую цепь и ее фрагменты, имеющие последовательность вариабельного участка, достаточную для обеспечения специфичности связывания. Полная тяжелая цепь включает домен вариабельного участка (VH) и три домена константной области (CH1, CH2 и CH3). Домен VH находится на N-конце полипептида, а домены CH находятся на С-конце, причем домен CH3 наиболее ближе расположен к С-концу полипептида. Тяжелые цепи могут иметь любой изотип, включая
- 12 031320
IgG (включая подтипы IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4), IgA (включая подтипы IgA1 и IgA2), IgM и IgE. Термин сигнальная последовательность, лидерная последовательность или сигнальный пептид относятся к короткой пептидной цепи (3-60 аминокислот), регулирующей транспорт белка. Сигнальные пептиды также могут называться сигналами таргетинга, сигнальными последовательностями, транзитными пептидами или сигналами локализации. Некоторые сигнальные пептиды отщепляются от белка с помощью сигнальной пептидазы после транспорта белков, в результате чего отщепляется биологически активная и более короткая форма белка (например, описанного антигенсвязывающего белка). В соответствии с этим, такие термины, как антитело состоит из тяжелой цепи..., антитело состоит из легкой цепи... и т.д., когда антитело характеризуется как имеющее тяжелую и/или легкую цепь с отдельной определенной последовательностью, понимаются следующим образом: антитело, имеющее специфически определенные последовательности, антитело, имеющее специфические определенные последовательности за исключением замены сигнальных последовательностей другими сигнальными последовательностями, а также антитело, имеющее определенные последовательности за вычетом любой сигнальной последовательности. Термин антигенсвязывающий фрагмент (или просто фрагмент) антитела или цепи иммуноглобулина (тяжелой или легкой цепи), как это используется в данном тексте, описывает участок (в зависимости от способа получения или синтеза такого участка) антитела с отсутствием определенных аминокислот, присутствующих в полной цепи, способный специфически связываться с антигеном. Такие фрагменты являются биологически активными относительно специфического связывания с антигеноммишенью и могут конкурировать с другими антигенсвязывающими белками, включая интактные антитела, относительно специфического связывания с заданной антигенной детерминантой. В одном аспекте изобретения такой фрагмент будет содержать как минимум ГВУ, присутствующий в полной и тяжелой цепи, и в некоторых вариантах исполнения изобретения он будет состоять из единственной тяжелой цепи и/или легкой цепи, или участка цепи. Такие биологически активные фрагменты могут быть получены с помощью методов рекомбинации ДНК, или могут быть получены с помощью ферментативного или химического расщепления антигенсвязывающих белков, включая интактные антитела. Иммунологически функциональные фрагменты иммуноглобулина включают, но не ограничиваются, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, доменные антитела и одноцепочечные антитела, и могут быть получены из любого источника (вида млекопитающего), включая, но не ограничиваясь, человека, мышь, крысу, верблюда или кролика. В дальнейшем предполагается, что функциональный участок описываемых здесь антигенсвязывающих белков, например, одного или нескольких ГВУ, может быть ковалентно связан со вторым белком или небольшой молекулой для создания лекарственного препарата, направленного на определенную мишень в организме и обладающего бифункциональными терапевтическими свойствами, или имеющего продленное время полужизни в сыворотке.
Fab-фрагмент состоит из одной легкой цепи, CH1 и вариабельных участков одной тяжелой цепи. Тяжелая цепь Fab молекулы не может образовывать дисульфидный мостик с тяжелой цепью другой молекулы.
Fc-участок состоит из двух фрагментов тяжелой цепи, включающей домены CH1 и CH2 антитела. Два фрагмента тяжелой цепи удерживаются вместе с помощью двух или нескольких дисульфидных мостиков и гидрофобными взаимодействиями доменов CH3.
Fab'-фрагмент состоит из одной легкой цепи и участка тяжелой цепи, содержащего домен VH и домен CH1, а также участок между доменами CH1 и CH2, таким образом, между двумя тяжелыми цепями двух Fab'-фрагментов может образовываться дисульфидная связь, формируя F(ab')2-молекулу. F(ab')2фрагмент содержит две легкие цепи и две тяжелые цепи, состоящие из константного участка между доменами CH1 и CH2; таким образом, между двумя тяжелыми цепями образуется дисульфидный мостик. Следовательно, F(ab')2-фрагмент состоит из двух Fab'-фрагментов, которые удерживаются вместе с помощью дисульфидного мостика между двумя тяжелыми цепями. Fv-участок состоит из вариабельных участков тяжелых и легких цепей за исключением константных участков.
Одноцепочечные антитела представлены Fv молекулами, в которых вариабельные участки тяжелой и легкой цепи соединены гибким линкером с образованием одной полипептидной цепи, формирующей антигенсвязывающий участок. Одноцепочечные антитела подробно обсуждаются в международной заявке на патент, публикация WO 88/01649 и патентах США № 4946778 и 5260203 (представлены в данном тексте посредством ссылки). Доменное антитело является иммунологически функциональным фрагментом иммуноглобулина, содержащим только вариабельный участок тяжелой цепи или вариабельный участок легкой цепи. В некоторых случаях два или несколько участков VH ковалентно связаны с пептидным линкером с созданием бивалентного доменного антитела. Два участка VH бивалентного доменного антитела могут связываться с одним и тем же или несколькими антигенами. Бивалентный антигенсвязывающий белок или бивалентное антитело содержит два антигенсвязывающих участка. В некоторых случаях два центра связывания могут иметь одну и ту же специфичность относительно антигена. Бивалентные антигенсвязывающие белки и бивалентные антитела могут быть биспецифичными (см. ниже).
Мультиспецифичный антигенсвязывающий белок или мультиспецифичное антитело в качестве своей мишени имеет более одного антигена или эпитопа (антигенной детерминанты).
- 13 031320
Биспецифичный, двойной специфичный или бифункциональный антигенсвязывающий белок или антитело представлено гибридным антигенсвязывающим белком или антителом, соответственно, с наличием двух разных центров связывания антигена. Биспецифичные антигенсвязывающие белки и антитела являются видами мультиспецифичного антигенсвязывающего белка или мультиспецифичного антитела, и могут быть получены с использованием различных методов, включая, но не ограничиваясь, слияние гибридом или связывание Fab'-фрагментов. См., например, Songsivilai and Lachmann, 1990, Clin. Exp. Immunol. 79:315-321; Kostelny et al., 1992, J. Immunol. 148:1547-1553. Два центра связывания биспецифического антигенсвязывающего белка или антитела будут связываться с двумя разными антигенными детерминантами, которые могут быть направлены на одну и ту же или разные белковые мишени.
Термин нейтрализующий антигенсвязывающий белок или нейтрализующее антитело относится к антигенсвязывающему белку или антителу, соответственно, которое связывается с лигандом, предотвращает связывание лиганда со своим партнером по связыванию, а также прерывает биологический ответ, который в противном случае может возникнуть в результате связывания лиганда с партнером по связыванию. При оценке связывания и специфичности антигенсвязывающего белка, например, антитела или иммунологически функционального антигенсвязывающего фрагмента, антитело или фрагмент будет значительно ингибировать связывание лиганда с его партнером по связыванию, при этом избыточное количество антитела снижает количество партнера по связыванию, связанного с лигандом, как минимум на 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 97, 99% или более (измерено в ходе in vitro анализа конкурентного связывания). В случае белка связывания CGRP R, такая нейтрализующая молекула будет снижать способность CGRP R связывать CGRP.
Термин конкуренция, при его использовании в контексте антигенсвязывающих белков, могущих связываться с одним и тем же участком антигена-мишени, обозначает конкуренцию между антигенсвязывающими белками, определяемую с помощью анализа, в ходе которого антигенсвязывающий белок (например, антитело или его иммунологически функциональный антигенсвязывающий фрагмент), подвергнутый испытанию, предотвращает или ингибирует специфическое связывание эталонного антигенсвязывающего белка (например, лиганда или эталонного антитела) с обычным антигеном (например, CGRP R или его антигенсвязывающим фрагментом). Может использоваться любой анализ из числа анализов конкурентного связывания, например: твердофазный прямой или непрямой радиоиммунологический анализ (РИА), твердофазный прямой или непрямой иммуноферментный анализ (ИФА), сэндвичанализ конкурентного связывания (см., например, Stahli et al., 1983, Methods in Enzymology 9:242-253); твердофазный прямой ИФА с биотином и авидином (см., например, Kirkland et al., 1986, J. Immunol. 137:3614-3619), твердофазный прямой анализ, твердофазный прямой сэндвич-анализ (см., например, Harlow and Lane, 1988, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press); твердофазный прямой РИА с использованием метки I-125 (см., например, Morel et al., 1988, Molec. Immunol. 25:7-15); твердофазный прямой ИФА с биотином и авидином [см., например, Cheung, et al., 1990, Virology 176:546-552); твердофазный РИА (Moldenhauer et al., 1990, Scand. J. Immunol. 32:77-82). Такой анализ может включать использование очищенного антигена, связанного с твердой поверхностью или клетками, несущими немеченый исследуемый антигенсвязывающий белок или меченый эталонный антигенсвязывающий белок. Конкурентное ингибирование может быть измерено путем определения количества метки, связанной с твердой поверхностью или клетками в присутствии исследуемого антигенсвязывающего белка. Антигенсвязывающие белки, определенные с использованием анализа конкурентного связывания (конкурирующие антигенсвязывающие белки), включают антигенсвязывающие белки, связывающиеся с одним и тем же эпитопом, точно так же, как и эталонные антигенсвязывающие белки и антигенсвязывающие белки, связывающиеся с прилегающей антигенной детерминантой, располагающейся достаточно проксимально к эпитопу, связанному эталонным антигенсвязывающим белком для возникновения стерического несоответствия. Обычно при избытке конкурирующего антигенсвязывающего белка последний приведет к ингибированию специфического связывания эталонного антигенсвязывающего белка с обычным антигеном как минимум на 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70 или 75%. В некоторых случаях связывание ингибируется как минимум на 80, 85, 90, 95, 97% или более. Конкурентное связывание также может быть измерено путем иммобилизации эталонного антигенсвязывающего белка на субстрате, например, с помощью сенсорного чипа, захватывающего антиген на субстрате посредством связывания с эталонным антителом; в последующем производится анализ возможности дополнительного связывания разных антигенсвязывающих белков (конкурирующих антигенсвязывающих белков) с антигеном. Пример такого конкурентного антигенсвязывающего анализа может включать анализ Biacore (описан в примере 7 изобретения). Термин антиген или иммуноген относится к молекуле или участку молекулы, способным связываться с селективным связывающим агентом, например антигенсвязывающим белком (включая, например, антитело или его иммунологически функциональный антигенсвязывающий фрагмент), и, кроме того, могущим использоваться у животных для получения антител, способных связываться с таким антигеном. Антиген может характеризоваться одним или несколькими эпитопами, которые способны взаимодействовать с разными антигенсвязывающими белками, например, антителами.
Термин эпитоп (антигенная детерминанта) обозначает участок молекулы, который связывается с антигенсвязывающим белком (например, антителом). Термин включает любую антигенную детерминан
- 14 031320 ту, способную специфически связываться с антигенсвязывающим белком, например, антителом или Тклеточным рецептором. Детерминанта (эпитоп) может быть секвенциальная (непрерывная) или прерывистого типа (например, (i) в одноцепочечном полипептиде аминокислотные остатки, незаменимые относительно одна другой в полипептиде, служат участком связывания с антигенсвязывающим белком, или (ii) в мультимерном рецепторе, например, CGRP R, состоящим из двух или нескольких отдельных компонентов, например, RAMP1 и CRLR, аминокислотные остатки, присутствующие в двух или нескольких отдельных компонентах, в контексте мультимерного рецептора связываются антигенсвязывающим белком). В определенных вариантах исполнения изобретения эпитопы могут быть миметическими, т.е. они имеют трехмерную структуру, подобную таковой для эпитопа, используемого для получения антигенсвязывающего белка, при этом они не содержат (или содержат всего лишь несколько) аминокислотных остатков, находящихся в эпитопе, используемом для получения антигенсвязывающего белка. Наиболее часто эпитопы располагаются на белках, но в некоторых случаях могут располагаться и на молекулах другого типа, например, нуклеиновых кислотах. Антигенные детерминанты могут включать химически активные поверхностные группы молекул, например, аминокислот, боковые цепи Сахаров, фосфорильные или сульфонильные группы, и могут иметь специфические трехмерные структурные характеристики, и/или также специфические показатели заряда. Как правило, антитела, специфические относительно связывания с отдельным антигеном-мишенью, будут в большинстве своем распознавать эпитоп на антигене-мишени в сложной смеси белков и/или макромолекул.
Термин идентичность относится к взаимосвязи между последовательностями двух или нескольких полипептидных молекул или двух или нескольких молекул нуклеиновых кислот, что определяется по выравниванию и сравнению последовательностей. Процентный показатель идентичности обозначает процентный показатель идентичных остатков между аминокислотами или нуклеотидами в сопоставленных молекулах и рассчитывается на основе размера самой малой из сравниваемых молекул. Для таких расчетов разрывы при выравнивании (в случае их наличия) должны объясняться отдельной математической моделью или компьютерной программой (т.е. с помощью алгоритма). Методы, которые могут использоваться для расчета идентичности выровненных нуклеиновых кислот или полипептидов, включают методы, описанные в Computational Molecular Biology, (Lesk, A. M., ed.), 1988, New York: Oxford University Press; Biocomputing Informatics and Genome Projects, (Smith, D. W., ed.), 1993, New York: Academic Press; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, (Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds.), 1994, New Jersey: Humana Press; von Heinje, G., 1987, Sequence Analysis in Molecular Biology, New York: Academic Press; Sequence Analysis Primer, (Gribskov, M. and Devereux, J., eds.), 1991, New York; M. Stockton Press; и Carillo et al., 1988, SIAMJ. Applied Math. 48:1073.
При расчете процентного показателя идентичности, сравниваемые последовательности выравниваются таким образом, чтобы можно было получить наибольшее соответствие между последовательностями. Используемая для определения процентного показателя идентичности компьютерная программа представлена пакетом программ GCG, включающим GAP (Devereux et al., 1984, Nucl. Acid Res. 12:387; Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, WI). Компьютерный алгоритм GAP используется для выравнивания двух полипептидов или полинуклеотидов, для которых необходимо определить процентный показатель идентичности последовательности. Последовательности выравниваются для оптимального определения сходства их соответствующих аминокислот или нуклеотида (диапазон соответствия, определяемый алгоритмом). Штраф за открытие пропусков (который рассчитывается как 3х средняя диагональ, где средняя диагональ представляет собой среднее значение диагонали используемой матрицы сравнения; диагональ является показателем или числом, который присваивается каждой соответствующей аминокислоте в отдельной матрице сравнения) и штраф за продление пропусков (составляющий обычно 1/10 штрафа за открытие пропусков) вместе с матрицей сравнения, например, РАМ 250 или BLOSUM 62, используются в сочетании с данным алгоритмом. В определенных вариантах исполнения изобретения алгоритмом также используется стандартная матрица сравнения (см. Dayhoff et al., 1978, Atlas of Protein Sequence and Structure 5:345-352 для матрицы сравнения РАМ 250; Henikoff et al.,, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915-10919 для матрицы сравнения BLOSUM 62).
Рекомендуемые параметры для определения процентного показателя идентичности для полипептидов или нуклеотидных последовательностей с использованием программы GAP следующие:
алгоритм: Needleman et al., 1970, J. Mol. Biol. 48:443-453;
матрица сравнения: blosum 62 от henikoff et al., 1992, см. выше; штраф за пропуск: 12 (но без штрафа за концевые пропуски); штраф за длину пропуска: 4;
порог подобия: 0.
Определенные схемы выравнивания для выравнивания двух последовательностей аминокислот могут служить для сравнения только короткого участка двух последовательностей, и такой небольшой выровненный участок может иметь очень высокий показатель идентичности последовательности даже в случае отсутствия значительной взаимосвязи между двумя полными последовательностями. В соответствии с этим, выбранный метод выравнивания (программа GAP) может быть скорректирован, если это требуется для получения выравнивания, с размахом как минимум 50 заменимых аминокислот в отдельном
- 15 031320 полипептиде.
Как используется в данном тексте, термин существенно чистый обозначает, что описанные виды молекулы являются доминирующими присутствующими видами, т.е. на молярной основе это значит, что такие молекулы преобладают над любыми другими отдельными типами молекул в той же самой смеси. В определенных вариантах исполнения изобретения существенно чистая молекула представляет собой композицию, в которой указанный тип составляет как минимум 50% (на молярной основе) всех типов присутствующих макромолекул. В других вариантах исполнения изобретения существенно чистый состав будет состоять как минимум из 80, 85, 90, 95 или 99% всех видов макромолекул, присутствующих в составе. В других вариантах исполнения изобретения отдельные типы подлежат очистке для получения значительной степени однородности, при этом загрязняющие типы молекул не могут быть определены в составе с помощью используемых стандартно методов, и, таким образом, состав включает один определяемый тип макромолекул.
Термин лечение относится к любому признаку успеха в лечении или улучшении состояния поражения, патологии или состояния, включая любой объективный или субъективный параметр, такой как смягчение выраженности симптома, ремиссия, снижение симптомов или облегчение переносимости травмы, патологии или состояния для пациента, замедление скорости дегенерации или отклонения, снижение изнуряющего показателя конечной точки дегенерации, улучшение физического или морального самочувствия пациента. Лечение или улучшение состояния симптомов может основываться на объективных или субъективных параметрах, включая результаты физического обследования, нейропсихического обследования и/или психической оценки.
Например, в определенных представленных здесь методах описывается успешное лечение вызываемых мигренью головных болей в виде профилактики или острого лечения, снижающего частоту таких болей, уменьшающего степень тяжести вызываемых мигренью болей и/или улучшающего симптомы, связанные с вызываемыми мигренью головными болями.
Эффективное количество обычно обозначает количество, достаточное для снижения степени тяжести и/или частоты симптомов, элиминации симптомов и/или основной причины, предотвращения возникновения симптомов и/или их основной причины, и/или улучшения или устранения вреда, вызываемого или связанного с головными болями, обусловленными мигренью. В некоторых вариантах исполнения изобретения, эффективное количество представлено терапевтически эффективным количеством или профилактически эффективным количеством. Терапевтически эффективное количество является количеством, которое эффективно в улучшении состояния болезни (например, вызываемых мигренью головных болей) или симптомов, в частности состояния или симптомов, связанных с болезнью, или другим образом эффективно предотвращает, мешает, тормозит или обращает прогрессирование болезненного состояния или любого другого нежелательного симптома, связанного с болезнью в той или иной форме. Профилактически эффективное количество является количеством лекарственного препарата, которое, при введении пациенту, будет обладать установленным профилактическим эффектом, например, для предотвращения или замедления возникновения (или повторного возникновения) вызываемой мигренью головной боли, или снижения вероятности возникновения (или повторного возникновения) вызываемой мигренью головной боли или их симптомов. Необязательно, что полный терапевтический или профилактический эффект возникнет при введении одной дозы; он может возникнуть только после введения серии доз. Таким образом, терапевтически или профилактически эффективное количество может быть введено за один или несколько раз.
Термин аминокислота обозначает известное в науке понятие. Обычно используются двадцать встречаемых в природе аминокислот и их обозначения. См. Immunology-A Synthesis, 2nd Edition, (E. S. Golub and D. R. Green, eds.), Sinauer Associates: Sunderland, Mass. (1991), включен в данный документ для любых целей в виде ссылки. Стереоизомеры (например, D-аминокислоты) двадцати стандартных аминокислот, синтетических аминокислот, такие как α-,α-дизамещенные аминокислоты, N-алкильные аминокислоты и другие редко встречаемые аминокислоты, также могут служить подходящими компонентами для полипептидов и включаются в понятие аминокислота. Примеры редких аминокислот включают следующие: 4-гидроксипролин, γ-карбоксиглутамат, c-N.N.N-триметиллизин. e-N-ацетиллизин, Офосфосерин, N-ацетилсерин, N-формилметионин, 3-метилгистидин, 5-гидроксилизин, σ-Ν-метиларгинин и другие подобные аминокислоты и иминокислоты (например, 4-гидроксипролин). При обозначении полипептида в данном тексте левый конец представлен N-концом, а правый конец представлен С-концом (в соответствии со стандартно используемым понятием).
Общий обзор.
В данном изобретении представлены антигенсвязывающие белки, которые связывают белок CGRP R, включая человеческий CGRP R (hCGRP R). Представленные антигенсвязывающие белки являются полипептидами, в которых содержится и/или подсоединены один или несколько гипервариабельных участков (ГВУ). В некоторых антигенсвязывающих белках ГВУ встроены в каркасный участок, который ориентирует ГВУ таким образом, что это позволяет получить надлежащие антигенсвязывающие свойства ГВУ. В целом представленные антигенсвязывающие белки могут препятствовать, блокировать, сни
- 16 031320 жать или модулировать взаимодействие между CGRP и CGRP R.
Определенные описанные в данном тексте антигенсвязывающие белки представлены антителами или получены из антител. В определенных вариантах исполнения изобретения, полипептидная структура антигенсвязывающих белков основывается на антителах, включая, но не ограничиваясь, моноклональные антитела, биспецифические антитела, мини-антитела, доменные антитела, синтетические антитела (иногда указываемые как антитела-миметики), химерные антитела, гуманизированные антитела, человеческие антитела, антитела слияния (иногда указываемые как конъюгаты антитела) и их фрагменты. В тексте данного изобретения в дальнейшем описываются различные структуры.
Было показано, что представленные здесь антигенсвязывающие белки связываются с CGRP R, в частности, с человеческим CGRP R. Как это описано в примерах ниже, были подвергнуты тестированию определенные антигенсвязывающие белки, и было обнаружено, что они связываются с эпитопами, различными от эпитопов, связываемых рядом других антител, направленных относительно этих же или других компонентов CGRP R. Представленные антигенсвязывающие белки конкурируют с CGRP и, следовательно, препятствуют связыванию CGRP со своим рецептором. Как следствие этого, представленные антигенсвязывающие белки способны ингибировать активность CGRP R. В частности, связывание антигенсвязывающих белков с такими эпитопами может обладать одним или несколькими следующими действиями: ингибирование, в числе прочего, индукции путей передачи сигнала CGRP R, ингибирование расширения сосудов, сужение сосудов, снижение воспаления, например, нейрогенного воспаления, и другие физиологические эффекты, индуцированные CGRP R при связывании CGRP.
Представленные здесь антигенсвязывающие белки обладают целым рядом полезных свойств. Например, некоторые антигенсвязывающие белки могут использоваться при анализах специфического связывания, аффинной очистке CGRP R, в частности, hCGRP R или его лигандов, а также в анализах скрининга для идентификации других антагонистов активности CGRP R. Некоторые антигенсвязывающие белки могут использоваться в ингибировании связывания CGRP с CGRP R.
Антигенсвязывающие белки могут использоваться в целом ряде методов лечения, как это объяснено в тексте данного изобретения. Например, определенные антигенсвязывающие белки CGRP R могут использоваться для лечения состояний, вызванных CGRP R-опосредованной передачей сигнала, т.е. для снижения, улучшения или лечения частоты и/или степени тяжести головной боли, вызываемой мигренью, снижения, улучшения или лечения приступообразной головной боли, снижения, улучшения или лечения хронической боли, улучшения или лечения сахарного диабета (II типа), снижения, улучшения или лечения сердечно-сосудистых расстройств, а также снижения, улучшения или лечения гемодинамических нарушений, вызванных эндотоксикозом и сепсисом у пациента. Другие способы использования антигенсвязывающих белков включают, например, диагностику CGRP R-связанных заболеваний или состояний, а также анализы скрининга для определения присутствия или отсутствия CGRP R. Некоторые описанные здесь антигенсвязывающие белки могут использоваться при лечении последствий, симптомов и/или патологий, вызванных активностью CGRP R. Они включают, но не ограничиваются, разные типы головных болей, вызываемых мигренью.
Рецептор CGRP.
Было показано, что представленные здесь антигенсвязывающие белки связываются с CGRP R, в частности, с человеческим CGRP R. CGRP R является мультимером, включающим как CRLR, так и RAMP1. Нуклеотидная последовательность человеческого CRLR представлена здесь как SEQ ID NO: 1. Аминокислотная последовательность человеческого CRLR представлена здесь как SEQ ID NO: 2. Нуклеотидная последовательность человеческого RAMP1 представлена здесь как SEQ ID NO: 3. Аминокислотная последовательность человеческого RAMP1 представлена здесь как SEQ ID NO: 4. Описанные здесь антигенсвязывающие белки связываются с экстрацеллюлярным участком CGRP R, состоящим из экстрацеллюлярных участков CRLR и RAMP1. Типичный экстрацеллюлярный домен (ЭЦД) человеческого CRLR кодируется нуклеотидной последовательностью, представленной как SEQ ID NO: 5, и содержит аминокислотную последовательность, представленную как SEQ ID NO: 6. Такая последовательность включает сигнальный пептид; типичный зрелый (за вычетом сигнального пептида) ЭЦД CRLR имеет аминокислотную последовательность, представленную как SEQ ID NO: 10. Типичный ЭЦД человеческого RAMP1 кодируется нуклеотидной последовательностью, представленной как SEQ ID NO: 7, и содержит аминокислотную последовательность, представленную как SEQ ID NO: 8. Такая последовательность включает сигнальный пептид; типичный зрелый (за вычетом сигнального пептида) ЭЦД CRLR имеет аминокислотную последовательность, представленную как SEQ ID NO: 11. Как это описано ниже, белки CGRP R также могут включать фрагменты. Как уже было указано ранее, для обозначения рецептора, в частности, если иное не указано, человеческого рецептора, специфически связывающегося с CGRP, используются взаимозаменяемые термины.
Термин CGRP R также включает пост-трансляционные модификации аминокислотной последовательности CGRP R, например, возможные N-связанные участки гликозилирования. Таким образом, антигенсвязывающие белки могут связываться или быть получены из белков, подвергнутых гликозилированию в одном или нескольких положениях.
- 17 031320
Белки, связывающие CGRP рецептор.
Представлен целый ряд избирательно связывающих агентов, используемых для регулирования активности CGRP R. Такие агенты включают, например, антигенсвязывающие белки, содержащие антигенсвязывающий домен (например, одноцепочечные антитела, доменные антитела, иммуноадгезины и полипептиды с антигенсвязывающим участком) и специфически связывающиеся с CGRP R, в частности, человеческим CGRP R. Некоторые агенты, например, могут использоваться для ингибирования связывания CGRP и CGRP R, и, таким образом, применяться для ингибирования, препятствования или модуляции одной или нескольких типов активности, вызванных путем передачи сигнала CGRP R.
В целом представленные антигенсвязывающие белки обычно состоят из одного или нескольких ГВУ, как это описано в данном тексте (например, 1, 2, 3, 4, 5 или 6). В некоторых случаях антигенсвязывающий белок имеет (а) полипептидную структуру и (б) один или несколько ГВУ, которые вставлены и/или присоединены к полипептиду. Полипептидная структура может иметь целый ряд различных форм. Например, такая форма может быть представлена или включать каркас встречающегося в природе антитела, или его фрагмент, или вариант, или же может быть полностью синтетическим. Ниже описываются примеры разных структур полипептидов.
В определенных вариантах исполнения изобретения, полипептидная структура антигенсвязывающих белков представлена антителом или получена из антитела, включая, но не ограничиваясь, моноклональные антитела, биспецифические антитела, мини-антитела, доменные антитела, синтетические антитела (иногда указываемые как антитела-миметики), химерные антитела, гуманизированные антитела, человеческие антитела, антитела слияния (иногда указываемые как конъюгаты антитела) и их участки или фрагменты соответственно. В некоторых случаях антигенсвязывающий белок представлен иммунологическим фрагментов антитела (например, Fab, Fab', F(ab')2 или scFv). В тексте данного изобретения в дальнейшем описываются различные структуры. Как уже было указано ранее по тексту, определенные антигенсвязывающие белки специфически связываются с человеческим CGRP R. В отдельных вариантах исполнения изобретения, антигенсвязывающий белок специфически связывается с человеческим белком CGRP R, содержащим человеческий CGRP, имеющим аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, а также человеческий RAMP1, имеющим аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4.
В вариантах исполнения изобретения, когда антигенсвязывающий белок используется в терапевтических целях, антигенсвязывающий белок может ингибировать, нарушать или моделировать один или несколько видов биологической активности CGRP R. В таком случае антигенсвязывающий белок специфически связывается и/или существенно ингибирует связывание человеческого CGRP R с CGRP, когда избыточное количество антитела снижает количество человеческого CGRP R, связанного с CGRP, или наоборот, как минимум на 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 97, 99% или более (например, путем измерения связывания, определенного в ходе анализа конкурентного связывания in vitro).
Структура встречаемых в природе антител.
Некоторые представленные антигенсвязывающие белки имеют структуру, свойственную встречаемым в природе антителам. Структурные единицы таких антител обычно состоят из одного или нескольких тетрамеров, каждый из которых состоит из двух идентичных полипептидных цепей, однако у некоторых видов млекопитающих также вырабатываются антитела, имеющие только одну тяжелую цепь. В типичном антителе каждая пара включает одну полную легкую цепь (в определенных вариантах исполнения изобретения примерно 25 кДа) и одну полную тяжелую цепь (в определенных вариантах исполнения изобретения примерно 50-70 кДа). Каждая отдельная цепь иммуноглобулина состоит из нескольких иммуноглобулиновых доменов, каждый из которых состоит примерно из 90-110 аминокислот и обладает соответствующей пространственной структурой. Такие домены являются основными единицами, из которых состоят полипептиды антитела. N-конец каждой цепи обычно включает вариабельный домен, ответственный за распознавание антигена. С-конец эволюционно более консервативен, чем Nконец цепи, и называется константным участком или С-областью. Легкие цепи у человека обычно классифицируют как легкие каппа- и лямбда-цепи, каждая из которых состоит из одного вариабельного домена и одного константного домена. Тяжелые цепи обычно классифицируют как мю, дельта, гамма, альфа или эпсилон цепи, что определяет изотип антитела, т. е. IgM, IgD, IgG, IgA и IgE соответственно. IgG имеет несколько подтипов, включая, но не ограничиваясь, IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4. Подтипы IgM включают IgM и IgM2. Подтипы IgA включают IgA1 и IgA2. У людей изотипы IgA и IgD содержат четыре тяжелых цепи и четыре легких цепи; изотипы IgG и IgE содержат две тяжелые цепи и две легкие цепи; изотип IgM содержит пять тяжелых цепей и пять легких цепей. Тяжелая цепь С-области обычно состоит из одного или нескольких доменов, которые могут быть ответственны за функцию эффектора. Количество доменов тяжелой цепи константного участка зависит от изотипа. Например, каждая тяжелая цепь IgG содержит по три домена С-области, известных как CH1, CH2 и CH3. Представленные антитела могут иметь любые такие изотипы и подтипы. В определенных вариантах исполнения изобретения антитело CGRP R представлено подтипом IgG1, IgG2 или IgG4.
В полных тяжелых и легких цепях вариабельные и константные участки соединены J-сегментом, состоящим из около двенадцати или более аминокислот, при этом тяжелая цепь также включает Dсегмент, состоящий из десяти или более аминокислот. См., например, Fundamental Immunology, 2nd ed.,
- 18 031320
Ch. 7 (Paul, W., ed.), 1989, New York: Raven Press (включен в настоящий документ во всей своей полноте посредством ссылки для всех целей). Вариабельные участки каждой пары тяжелой/легкой цепи обычно образуют центр связывания антигена.
Один пример константного домена тяжелой цепи IgG2 типичного моноклонального антитела содержит следующую аминокислотную последовательность:
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVL
QSSGLYSLSSWTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPP VAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTK PREEQFNSTFRWSVLTWHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQ VYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGS FFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (последние 326 остатков известны как последовательность SEQ ID NO: 29).
Один пример константного домена легкой каппа-цепи типичного моноклонального антитела содержит следующую аминокислотную последовательность:
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESV TEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (последние 107 остатков известны как последовательность SEQ ID NO: 14).
Как правило, вариабельные участки цепей иммуноглобулина имеют такую же общую структуру, включая относительно консервативные каркасные участки (КУ), соединенные тремя гипервариабельными участками, наиболее часто называемыми определяющими комплементарность областями, или ГВУ. ГВУ двух цепей каждой пары тяжелой цепи/легкой цепи (см. выше) обычно выравниваются по каркасным участкам с образованием структуры, специфически связывающейся со специфическим эпитопом на белке-мишени (например, CGRP R). От N-конца до С-конца вариабельные участки встречающихся в природе легких и тяжелых цепей обычно соответствуют следующему порядку элементов; FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 и FR4. Была разработана система нумерации для присваивания номеров аминокислотам, занимающим позиции в каждом из таких доменов. Такая система нумерации описана в Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest (1987 and 1991, NIH, Bethesda, MD), или Chothia & Lesk, 1987, J. Mol. Biol. 196:901-917; Chothia et al., 1989, Nature 342:878-883.
В табл. 3 представлены различные описанные вариабельные участки тяжелой и легкой цепи. Каждый такой вариабельный участок прикрепляется к указанным выше константным участкам тяжелой и легкой цепи, образуя полную тяжелую и легкую цепь антитела соответственно. Кроме того, каждая из созданных таким образом последовательностей тяжелой и легкой цепи может быть объединена с созданием полной структуры антитела. Следует понимать, что представленные вариабельные участки тяжелой цепи и легкой цепи также могут быть прикреплены к другим константным доменам, имеющим разные последовательности относительно типичных и представленных выше последовательностей.
В табл. 2А и 2В обобщены специфические примеры некоторых полных легких и тяжелых цепей антител, а также их соответствующие аминокислотные последовательности. В табл. 2А представлены типичные последовательности легкой цепи, а в табл. 2В - типичные последовательности тяжелой цепи.
- 19 031320
Таблица 2 А
Типичные последовательности аминокислот в легкой цепи антитела
Номер последовательности SEQIDNO: Обозначение Содержание в клоне Последовательность
12 L1 01Е11 LC MDMRVPAQLLGLLLLWLRGARCQSVLTQPPSV SEAPGQKVTISCSGSSSNIGNNYVSWYQQLPGT APKLLIYDNNKRPSGIPDRFSGSKSGTSATLGIT GLQTGDEADYYCGTWDSRLSAWFGGGTKLTV LGQPKANPTVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDF YPGAVTVAWKADGSPVKAGVETTKPSKQSNNK YAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVE KTVAPTECS
13 L2 01Н7 LC MDMRVPAQLLGLLLLWLRGARCQSVLTQPPSA SGTPGQRVTISCSGSSSNIGSNYVYWYQQLPG AAPKLLIFRSNQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAI SGLRSEDEADYYCAAWDDSLSGWVFGGGTKLT VLGQPKANPTVTLFPPSSEELQANKATLVCLISD FYPGAVTVAWKADGSPVKAGVETTKPSKQSNN KYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTV EKTVAPTECS
14 L3 02Е7 LC MDMRVPAQLLGLLLLWLRGARCDIQMTQSPSS LSASVGDRVTITCRASQGIRNDLGWFQQKPGKA PKRLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISS LQPEDLATYYCLQYNIYPWTFGQGTKVEIKRTV AAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREA KVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLS STLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSF NRGEC
15 L4 03В6 LC MDMRVPAQLLGLLLLWLRGARCSSELTQDPTV SVALGQTVKITCQGDSLRSFYASWYQQKPGQA
- 20 031320
PVLVFYGKNNRPSGIPDRFSGSSSGNTASLTITG AQAEDEADYYCNSRDSSVYHLVLGGGTKLTVL GQPKANPTVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFY PGAVTVAWKADGSPVKAGVETTKPSKQSNNKY AASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEK TVAPTECS
16 L5 03С8 LC MDMRVPAQLLGLLLLWLRGARCDIILAQTPLSLS VTPGQPASISCKSSQSLLHSAGKTYLYWYLQKP GQPPQLLIYEVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTL KISRVEAEDVGIYYCMQSFPLPLTFGGGTKVEIK RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYP REAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTY SLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVT KSFNRGEC
17 L6 04E4 LC MDMRVPAQLLGLLLLWLRGARCQSVLTQPPSV SAAPGQKVTISCSGSSSNIGNNYVSWYQQLPGT APKLLIYDNNKRPSGIPDRFSGSKSGTSTTLGIT GLQTGDEADYYCGTWDSRLSAWFGGGTKLTV LGQPKANPTVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDF YPGAVTVAWKADGSPVKAGVETTKPSKQSNNK YAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVE KTVAPTECS
18 L7 04H6 LC MDMRVPAQLLGLLLLWLRGARCDIVMTQSPLSL PVTPGEPASISCRSSQSLLHSFGYNYLDWYLQK PGQSPQLLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFT LKISRVEAEDVGVYYCMQALQTPFTFGPGTKVD IKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNF YPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKD STYS LSSTLTLS KADYE KH KVYAC EVTH QG LS S PVTKSFNRGEC
19 L8 05F5 LC MDMRVPAQLLGLLLLWLRGARCDIILTQTPLSLS VTPGQPASISCKSSQSLLHSDGKTYLYWYLQKP GQPPQLLIYEVSNRFSGEPDRFSGSGSGTDFTL KISRVEAEDVGTYYCMQSFPLPLTFGGGTKVEIK
- 21 031320
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYP REAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTY SLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVT KSFNRGEC
20 L9 09D4 LC MDMRVPAQLLGLLLLWLRGARCQSVLTQPPSV SAAPGQKVTISCSGSSSNIGNNYVSWYQQFPG TAPKLLIYDNNKRPSGIPDRFSGSKSGTSATLGI TG LQTG D EAD YYCGTWDSRLSAWFGGGTKLT VLGQPKANPTVTLFPPSSEELQANKATLVCLISD FYPGAVTVAWKADGSPVKAGVETTKPSKQSNN KYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTV EKTVAPTECS
21 L10 09F5 LC MDMRVPAQLLGLLLLWLRGARCQSVLTQSPSA SGTPGQRVTISCSGSSSNIGSNYVYWYQQLPG AAPKLLILRNNQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLTI SGLRSEDEADYYCAAWDDSLSGWVFGGGTKLT VLGQPKANPTVTLFPPSSEELQANKATLVCLISD FYPGAVTVAWKADGSPVKAGVETTKPSKQSNN KYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTV EKTVAPTECS
22 L11 10E4 LC MDMRVPAQLLGLLLLWLRGARCQSVLTQPPSA SGTPGQRVTISCSGSSSNIGSNTVNWYQQLPG TAPKLLIYTNNQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAI SGLQSEDEADFYCAARDESLNGWFGGGTKLT VLGQPKANPTVTLFPPSSEELQANKATLVCLISD FYPGAVTVAWKADGSPVKAGVETTKPSKQSNN KYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTV EKTVAPTECS
23 L12 11D11 HL 11H9LC MDMRVPAQLLGLLLLWLRGARCQSVLTQPPSA SGTPGQRVTISCSGSSSNIGSNYVYWYQQLPG AAPKLLIFRNNQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAI SGLRSEDEADYYCAAWDDSLSGWVFGGGTKLT VLGQPKANPTVTLFPPSSEELQANKATLVCLISD FYPGAVTVAWKADGSPVKAGVETTKPSKQSNN
- 22 031320
KYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTV EKTVAPTECS
24 L13 12Е8 LC MDMRVPAQLLGLLLLWLRGARCDITLTQTPLSL SVSPGQPASISCKSSQSLLHSDGRNYLYWYLQK PGQPPQLLIYEVSNRFSGLPDRFSGSGSGTDFT LKISRVEAEDVGIYYCMQSFPLPLTFGGGTKVEI KRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFY PREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDST YSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPV TKSFNRGEC
25 L14 12G8 HL MDMRVPAQLLGLLLLWLRGARCQSVLTQPPSV SAAPGQKVTISCSGSSSNIGNNYVSWYQQLPGT APKLLIYDNNKRPSGIPDRFSGSKSGTSATLGIT GLQTGDEADYYCGTWDSRLSAWFGGGTKLTV LGQPKANPTVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDF YPGAVTVAWKADGSPVKAGVETTKPSKQSNNK YAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVE KTVAPTECS
26 L15 13H2 LC MDMRVPAQLLGLLLLWLRGARCDIQMTQSPSS LSASVGDRVTITCRASQGIRKDLGWYQQKPGKA PKRLIYGASSLQSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISS LQPEDFATYYCLQYNSFPWTFGQGTKVEIKRTV AAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREA KVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLS STLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSF NRGEC
27 L16 32H7 LC METPAQLLFLLLLWLPDTTGEIVLTQSPGTLSLS PGERATLSCRASQSVSSGYLTWYQQKPGQAPR LLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEP EDFAVYYCQQYGNSLCRFGQGTKLEIKRTVAAP SVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKV QWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSST LTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNR GEC
28 L17 32H7 CS LC METPAQLLFLLLLWLPDTTGEIVLTQSPGTLSLS PGERATLSCRASQSVSSGYLTWYQQKPGQAPR LLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEP EDFAVYYCQQYGNSLSRFGQGTKLEIKRTVAAP SVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKV QWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSST LTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNR GEC
- 23 031320
Таблица 2В Типичные последовательности аминокислот в тяжелой цепи антитела
Номер последовательности SEQIDNO: Обозначение Содержание в клоне Последовательность
29 Н1 01Е11 НС 04Е4 НС 09D4 НС MDMRVPAQLLGLLLLWLRGARCQVQLVESGG GWQPGRSLRLSCAASGFTFSSFGMHWVRQA PGKGLEWVAVISFDGSIKYSVDSVKGRFTISRD NSKNTLFLQMNSLRAEDTAVYYCARDRLNYYD SSGYYHYKYYGMAVWGQGTTVTVSSASTKGP SVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTV SWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTV PSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCC VECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTP EVTCWVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAK TKPREEQFNSTFRWSVLTWHQDWLNGKEYK CKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPP SREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNG QPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRW QQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
30 Н2 01Н7 НС MDMRVPAQLLGLLLLWLRGARCEVQLVESGG GLVKPGGSLRLSCAASGFTFSNAWMSWVRQA PGKGLEWVGRIKSTTDGGTTDYAAPVKGRFTIS RDDSKNTLYLQMNSLKTEDTAVYYCTTDRTGY
31 НЗ 02Е7 НС SISWSSYYYYYGMDVWGQGTTVTVSSASTKGP SVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTV SWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTV PSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCC VECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTP EVTCWVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAK TKPREEQFNSTFRWSVLTWHQDWLNGKEYK CKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPP SREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNG QPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRW QQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK MDMRVPAQLLGLLLLWLRGARCEVQLLESGGG LVQPGESLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPG KGLEWVSAISGSGGRTYYADSVKGRFTISRDN SKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDQREVGPY SSGWYDYYYGMDVWGQGTTVTVSSASTKGPS VFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVS WNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVP SSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCV ECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPE VTCVWDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKT KPREEQFNSTFRWSVLTWHQDWLNGKEYKC KVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPS REEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQ PENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQ QGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
32 Н4 03В6 НС MDMRVPAQLLGLLLLWLRGARCQVQLVQSGA EVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYMHWVRQA PGQGLEWMGWINPNSGGTNYAQKFQGRVTMT RDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYFCARDQMSII MLRGVFPPYYYGMDVWGQGTTVTVSSASTKG PSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVT VSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWT VPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKC
- 24 031320
CVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRT Р EVTCVWDVS Η Е D Р EVQ F N WYVD GVEVH N А KTKPREEQFNSTFRWSVLTWHQDWLNGKEY KCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLP PSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESN GQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSR WQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
33 Н5 03С8 НС 05F5 НС 12Е8НС MDMRVPAQLLGLLLLWLRGARCQVQLVESGG GWQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQA PGKGLEWVAVISYDGSHESYADSVKGRFTISRD ISKNTLYLQMNSLRAEDTAVYFCARERKRVTMS TLYYYFYYGMDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVF PLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSW NSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSS NFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVEC PPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVT CVWDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKP REEQFNSTFRWSVLTWHQDWLNGKEYKCKV SNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSRE EMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPE NNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQG NVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
34 Н6 04Н6 НС MDMRVPAQLLGLLLLWLRGARCEVQLVESGG GLVKPGRSLRLSCTASGFTFGDYAMSWFRQAP GKGLEWIGFIRSRAYGGTPEYAASVKGRFTISR DDSKTIAYLQMNSLKTEDTAVYFCARGRGIAAR WDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRST SESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGV HTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSNFGTQTYTC NVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVA GPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHE DPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTF RWSVLTWH Q DWLN G KE YKC KVS N KG L РАР I EKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSL
- 25 031320
TCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPM LDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMH EALHNHYTQKSLSLSPGK
35 Н7 09F5 НС MDMRVPAQLLGLLLLWLRGARCEVQLVESGG GLVKPGGSLRLSCAASGFTFSNAWMSWVRQA PGKGLEWVGRIKSKTDGGTTDYTAPVKGRFTIS RDDSKNTLYLQMNSLKAEDTAVYYCTTDRTGY SISWSSYYYYYGMDVWGQGTTVTVSSASTKGP SVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTV SWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTV PSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCC VECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTP EVTCVWDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAK TKPREEQFNSTFRWSVLTWHQDWLNGKEYK CKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPP SREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNG QPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRW QQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
36 Н8 10Е4 НС MDMRVPAQLLGLLLLWLRGARCQVQLVQSGA EVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMYWVRQA PGQGLEWMGWISPNSGGTNYAQKFQGRVTMT RDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCVRGGYSG YAGLYSHYYGMDVWGQGTTVTVSSASTKGPS VFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVS WNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVP SSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCV ECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPE VTCVWDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKT KPREEQFNSTFRWSVLTWHQDWLNGKEYKC KVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPS REEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQ PENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQ QGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
37 Н9 11D11 НС MDMRVPAQLLGLLLLWLRGARCEVQLVESGG
- 26 031320
GLVKPGGSLRLSCAASGFTFGNAWMSWVRQA PGKGLEWVGRIKSKTDGGTTDYAAPVKGRFTIS RDDSKNTLYLQMNSLKTEDTAVYFCTTDRTGY SISWSSYYYYYGMDVWGQGTTVTVSSASTKGP SVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTV SWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTV PSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCC VECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTP EVTCVWDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAK TKPREEQFNSTFRWSVLTWHQDWLNGKEYK CKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPP SREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNG QPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRW QQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
38 НЮ 11Н9 НС MDMRVPAQLLGLLLLWLRGARCEVQLVESGG GLVKPGGSLRLSCAASGFTFGNAWMSWVRQA PGKGLEWVGRIKSKTDGGTTDYAAPVKGRFTIS RDDSKNTLYLQMNSLKTEDTAVYYCTTDRTGY SISWSSYYYYYGMDVWGQGTTVTVSSASTKGP SVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTV SWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTV PSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCC VECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTP EVTCVWDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAK TKPREEQFNSTFRWSVLTWHQDWLNGKEYK CKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPP SREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNG QPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRW QQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
39 Н11 12G8 НС MDMRVPAQLLGLLLLWLRGARCQVQLVESGG GWQPGRSLRLSCAASGFTFSSFGMHWVRQA PGKGLEWVAVISFDGSIKYSVDSVKGRFTISRD NSKNTLFLQMNSLRAEDTAVYYCARDRLNYYD SSGYYHYKYYGLAVWGQGTTVTVSSASTKGPS
- 27 031320
VFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVS WNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVP SSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCV ECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPE VTCWVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKT KPREEQFNSTFRWSVLTWHQDWLNGKEYKC KVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPS REEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQ PENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQ QGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
40 Н12 13Н2 НС MDMRVPAQLLGLLLLWLRGARCEVQLVESGG GLVKPGGSLRLSCAASGYTFSTYSMNVWRQAP GKGLEVWSSISSSSSYRYYADSVKGRFTISRDN AKNSLYLQMSSLRAEDTAVYYCAREGVSGSSP YSISWYDYYYG М DVWGQGTTVTVSSASTKG Р SVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTV SWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTV PSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCC VECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTP EVTCWVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAK TKPREEQFNSTFRWSVLTWHQDWLNGKEYK CKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPP SREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNG QPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRW QQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
41 Н13 32Н7 НС MDMRVPAQLLGLLLLWLRGARCQVQLVESGG GWQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQA PGKGLEWVAVIWYDGSNKYYADSVKGRFIISRD KSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARAGGIAAA GLYYYYGMDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPL APCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNS GALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSNF GTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPP CPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCV
WDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPRE EQFNSTFRWSVLTWHQDWLNGKEYKCKVSN KGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEM TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENN YKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNV FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
Первые 22 аминокислоты каждой последовательности легкой цепи, представленной в табл. 2А, за исключением 32Н7 и 32Н7 CS, являются сигнальной последовательностью. В случае 32Н7 и 32Н7 CS сигнальная последовательность состоит из 20 аминокислот. Подобным образом, первые 22 аминокислоты каждой последовательности тяжелой цепи из табл. 2В представляют сигнальную последовательность. Сигнальные пептиды могут быть изменены на сигнальные пептиды с различными последовательности, например, для более оптимальной экспрессии в определенных клетках-хозяевах. Следовательно, в дальнейшем будет предполагаться, что изобретение также включает антитела, имеющие последовательности легкой и тяжелой цепей, как это указано в табл. 2А и 2В, но разные сигнальные последовательности.
Опять-таки, каждая из типичных тяжелых цепей (Н1, Н2, H3 и т.д.), указанных в табл. 2В, может быть объединена с любыми типичными легкими цепями из табл. 2А с образованием антитела. Примеры таких комбинаций включают Н1, соединенную с любой L1 посредством L17; Н2, соединенную с любой L1 посредством L17; H3, соединенную с любой L1 посредством L17 и т.д. В некоторых случаях антитела включают как минимум одну тяжелую цепь и одну легкую цепь из цепей, перечисленных в табл. 2А и 2В. В некоторых случаях антитела состоят из двух тяжелых цепей и двух легких цепей, перечисленных в табл. 2А и 2В. В некоторых случаях антитела содержат две идентичные легкие цепи и идентичные тяжелые цепи. Например, антитело или иммунологически функциональный домен может включать две тяжелые цепи Н1 и две легкие цепи L1, или две тяжелые цепи Н2 и две легкие цепи L2, или две тяжелые цепи H3 и две легкие цепи L3 и другие подобные комбинации пар легких цепей и пар тяжелых цепей, указанных в табл. 2А и 2В.
Другие представленные антигенсвязывающие белки являются вариантами антител, образованными путем комбинации тяжелых и легких цепей, представленных в табл. 2А и 2В, и состоят из легких и/или тяжелых цепей, каждая из которых как минимум на 70, 75, 80, 85, 90, 95, 97 или 99% идентична аминокислотным последовательностям таких цепей. В некоторых случаях подобные антитела включают как
- 28 031320 минимум одну тяжелую цепь и одну легкую цепь, в то время как в других случаях вариантные формы содержат две идентичные легкие цепи и две идентичные тяжелые цепи.
Вариабельные домены антител.
Представлены также антигенсвязывающие белки, которые содержат вариабельный участок тяжелой цепи антитела, выбранный из группы, включающей VH1, VH2, VH3, VH4, VH5, VH6, VH7, VH8, VH9, VH10, VH11, VH12 и VH13, и/или вариабельный участок легкой цепи антитела, выбранный из группы, включающей Vl1, Vl2, Vl3, Vl4, Vl5, Vl6, Vl7, Vl8, Vl9, Vl10, Vl11, Vl12, Vl13, Vl14, Vl15, Vl16 и Vl17, как это показано в табл. 3 ниже, а также иммунологически функциональные фрагменты, производные, мутеины и варианты таких вариабельных участков легкой и тяжелой цепей.
На фиг. 1А и 1В представлено выравнивание последовательностей различных вариабельных участков тяжелой и легкой цепей соответственно. Антигенсвязывающие белки подобного типа могут обычно обозначаться по формуле VHx/VLy, где х соответствует числу вариабельных участков тяжелой цепи, а у - числу вариабельных участков легкой цепи.
Таблица 3 Типичные аминокислотные последовательности цепей VH и VL .
Содержание в клоне Обозначение Номер последовательности SEQ ID NO Аминокислотная последовательность
1Е11 VL1 137 QSVLTQPPSVSEAPGQKVTISCSGSSSNIGN NYVSWYQQLPGTAPKLLIYDNNKRPSGIPD RFSGSKSGTSATLGITGLQTGDEADYYCGT WDSRLSAWFGGGTKLTVL
1Н7 Vl2 138 QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIG SNYVYWYQQLPGAAPKLLIFRSNQRPSGVP DRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCA AWDDSLSGWVFGGGTKLTVL
2Е7 VL3 139 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRN DLGWFQQKPGKAPKRLIYAASSLQSGVPSR FSGSGSGTEFTLTISSLQPEDLATYYCLQYNI YPWTFGQGTKVEIK
ЗВ6 VL4 140 SSELTQDPTVSVALGQTVKITCQGDSLRSFY ASWYQQKPGQAPVLVFYGKNNRPSGIPDR FSGSSSGNTASLTITGAQAEDEADYYCNSR DSSVYHLVLGGGTKLTVL
ЗС8 Vl5 141 DIILAQTPLSLSVTPGQPASISCKSSQSLLHS AGKTYLYWYLQKPGQPPQLLIYEVSNRFSG VPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGIYYC MQSFPLPLTFGGGTKVEIK
4Е4 VL6 142 QSVLTQPPSVSAAPGQKVTISCSGSSSNIGN NYVSWYQQLPGTAPKLLIYDNNKRPSGIPD RFSGSKSGTSTTLGITGLQTGDEADYYCGT WDSRLSAWFGGGTKLTVL
4Н6 Vl7 143 DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLH SFGYNYLDWYLQKPGQSPQLLIYLGSNRAS GVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVY YCMQALQTPFTFGPGTKVDIK
5F5 Vl8 144 DIILTQTPLSLSVTPGQPASISCKSSQSLLHS DGKTYLYWYLQKPGQPPQLLIYEVSNRFSG EPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGTYY CMQSFPLPLTFGGGTKVEIK
9D4 Vl9 145 QSVLTQPPSVSAAPGQKVTISCSGSSSNIGN NYVSWYQQFPGTAPKLLIYDNNKRPSGIPD RFSGSKSGTSATLGITGLQTGDEADYYCGT WDSRLSAWFGGGTKLTVL
- 29 031320
9F5 VL10 146 QSVLTQSPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIG SNYVYWYQQLPGAAPKLLILRNNQRPSGVP DRFSGSKSGTSASLTISGLRSEDEADYYCA AWDDSLSGWVFGGGTKLTVL
10Е4 VL11 147 QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIG SNTVNWYQQLPGTAPKLLIYTNNQRPSGVP DRFSGSKSGTSASLAISGLQSEDEADFYCA ARDESLNGWFGGGTKLTVL
11D11 11Н9 VL12 148 QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIG SNY*/YWYQQLPGAArKLLIFRNNQRrSGv'r DRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCA AWDDSLSGWVFGGGTKLTVL
12Е8 VL13 149 DITLTQTPLSLSVSPGQPASISCKSSQSLLHS DGRNYLYWYLQKPGQPPQLLIYEVSNRFSG LPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGIYYC MQSFPLPLTFGGGTKVEIK
12G8 VL14 150 QSVLTQPPSVSAAPGQKVTISCSGSSSNIGN NYVSWYQQLPGTAPKLLIYDNNKRPSGIPD RFSGSKSGTSATLGITGLQTGDEADYYCGT WDSRLSAWFGGGTKLTVL
13Н2 Vl15 151 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRK DLGWYQQKPGKAPKRLIYGASSLQSGVPSR FSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCLQYN SFPWTFGQGTKVEIK
32Н7 VL16 152 EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSS GYLTWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPD RFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQ YGNSLCRFGQGTKLEIK
32Н7 CS VL17 153 EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSS GYLTWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPD RFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQ YGNSLSRFGQGTKLEIK
32H8 Vl18 154 DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSILD SSNNDNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRE SGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAV YYCQQYYNTPFTFGPGTKVDIK
33B5 Vl19 155 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRN DLGWYQQKPGKAPKRLIYVASSLQSGVPSR FSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCLQYN TYPLTFGGGTKVEIK
33E4 Vl20 156 EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSVR SNLAWYQQKPGQAPRLLIHDASPRTAGIPA RFSGSGSGTEFTLTINSLQSEDFAVYYCQQ YNYWTPITFGQGTRLEIK
34 ЕЗ Vl21 157 QSVLTQPPSMSAAPGQKVTISCSGSSSNIG NNYVSWYQQLPGTAPKLLIYDNNKRPSGIP DRFSGSKSGTSATLGITGLQTGDEANYCCG TWDIGLSVWVFGGGTKLTVL
4E4 9D4 1E11 Vh1 158 QVQLVESGGGWQPGRSLRLSCAASGFTF SSFGMHWVRQAPGKGLEWVAVISFDGSIKY SVDSVKGRFTISRDNSKNTLFLQMNSLRAE DTAVYYCARDRLNYYDSSGYYHYKYYGMA VWGQGTTVTVSS
- 30 031320
1Н7 VH2 159 EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFS NAWMSWVRQAPGKGLEWVGRIKSTTDGG TTDYAAPVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLK TEDTAVYYCTTDRTGYSISWSSYYYYYGMD VWGQGTTVTVSS
2Е7 VH3 160 EVQLLESGGGLVQPGESLRLSCAASGFTFS SYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGRTY YADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAE DTAVYYCAKDQREVGPYSSGWYDYYYGMD VWGQGTTVTVSS
ЗВ6 VH4 161 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFT GYYMHWVRQAPGQGLEWMGWINPNSGGT NYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRS DDTAVYFCARDQMSIIMLRGVFPPYYYGMD VWGQGTTVTVSS
ЗС8 12Е8 5F5 Vh5 162 QVQLVESGGGWQPGRSLRLSCAASGFTF SSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVISYDGSHE SYADSVKGRFTISRDISKNTLYLQMNSLRAE DTAVYFCARERKRVTMSTLYYYFYYGMDV WGQGTTVTVSS
4Н6 Vh6 163 EVQLVESGGGLVKPGRSLRLSCTASGFTFG DYAMSWFRQAPGKGLEWIGFIRSRAYGGT PEYAASVKGRFTISRDDSKTIAYLQMNSLKT EDTAVYFCARGRGIAARWDYWGQGTLVTV SS
9F5 Vh7 164 EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFS NAWMSWVRQAPGKGLEWVGRIKSKTDGG TTDYTAPVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLK AE DTAVYYCTTD RTGYSIS WS S YYYYYG M D VWGQGTTVTVSS
10Е4 Vh8 165 QVQ LVQS GAEVKKP GASVKVSC KAS GYTFT DYYMYWVRQAPGQGLEWMGWISPNSGGT NYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRS D DTAVYYCVRG G YS G YAG LYS H YYG M DVW GQGTTVTVSS
11D11 Vh9 166 EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFG NAWMSWVRQAPGKGLEWVGRIKSKTDGG TTDYAAPVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLK ТЕ DTAVYFCTTDRTGYSISWSSYYYYYGM D VWGQGTTVTVSS
11Н9 Vh10 167 EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFG NAWMSWVRQAPGKGLEWVGRIKSKTDGG TTDYAAPVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLK ТЕ DTAVYYCTTD RTGYS IS WSSYYYYYGM D VWGQGTTVTVSS
12G8 Vh11 168 QVQLVESGGGWQPGRSLRLSCAASGFTF SSFGMHWVRQAPGKGLEWVAVISFDGSIKY SVDSVKGRFTISRDNSKNTLFLQMNSLRAE DTAVYYCARDRLNYYDSSGYYHYKYYGLAV WGQGTTVTVSS
- 31 031320
13Н2 VH12 169 EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGYTFS TYSMNWVRQAPGKGLEWVSSISSSSSYRY YADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMSSLRAE DTAVYYCAREGVSGSSPYSISWYDYYYGM DVWGQGTTVTVSS
32Н7 VH13 170 QVQLVESGGGWQPGRSLRLSCAASGFTF SSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSN KYYADSVKGRFIISRDKSKNTLYLQMNSLRA EDTAVYYCARAGGIAAAGLYYYYGMDVWG OGTTVTVSS
32Н8 VH14 171 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFT AYYLHWVRQAPGQGLEWMGWINPHSGGT NYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRS DDTAVFYCARGRQWLGFDYWGQGTLVTVS S
ЗЗЕ4 Vh15 172 QVQLQQWGAGLLKPSETLSLSCAVYGGSF GGYYWSWIRQPPGKGLEWIGEINHSGGTK YNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAAD TAVYFCARGDWGFFDYWGQGTLVTVSS
ЗЗВ5 Vh16 173 QVQLVQSGAEVKKSGASVKVSCKASGYTFT GYYMHWVRQAPGQGLEWMGWINPNSGGT NYVQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRS DDTAVYYCARNEYSSAWPLGYWGQGTLVT VSS
34E3 Vh17 174 QITLKESGPTLVKPTQTLTLTCTFSGFSLSTS GVGVAWIRQPPGKALEWLALIYWTDDKRYS PSLKSRLTITKDTSKNQWLRMTNMDPLDTA TYFCAHRPGGWFDPWGQGTLVTVSS
Каждый вариабельный участок тяжелой цепи из табл. 3 может быть объединен с любым вариабельным участком легкой цепи из табл. 3, образуя антигенсвязывающий белок. Примеры таких комбинаций включают VH1, объединенный с любым VL1, VL2, VL3, VL4, VL5, VL6, VL7, VL8, VL9, VL10, VL11, VL12, VL13, Vl14, Vl15, Vl16 или VL17; VH2, объединенный с любым VL1, VL2, VL3, VL4, VL5, VL6, VL7, VL8, Vl9, Vl10, Vl11, Vl12, Vl13, Vl14, Vl15, Vl16 или VL17; VH3, объединенный с любым VL1, VL2, VL3, Vl4, Vl5, Vl6, Vl7, Vl8, Vl9, Vl10, Vl11, Vl12, Vl13, Vl14, Vl15, Vl16 или VL17 и т.д.
В некоторых случаях антигенсвязывающий белок включает как минимум один вариабельный участок тяжелой цепи и/или один вариабельный участок легкой цепи из табл. 3. В некоторых случаях антигенсвязывающий белок включает как минимум два различных вариабельных участка тяжелой цепи и/или вариабельные участки легкой цепи из табл. 3. Например, антигенсвязывающий белок может состоять из (а) одной последовательности VH1 и (б) одной последовательности VH2, VH3, VH4, VH5, VH6, VH7, VH8, VH9, VH10, VH11, VH12 или VH13. Другой пример: антигенсвязывающий белок может состоять из (а) одной последовательности VH2 и (б) одной последовательности VH1, VH3, VH4, VH5, VH6, VH7, VH8, VH9, VH10, VH11, VH12 или VH13. Еще один пример; антигенсвязывающий белок может состоять из (а) одной последовательности VH3 и (б) одной последовательности VH1, VH2, VH4, VH5, VH6, VH7, VH8, VH9, VH10, VH11, VH12 или VH13 и т.д. Еще один пример: антигенсвязывающий белок может состоять из (а) одной последовательности VL1 и (б) одной последовательности VL2, VL3, VL4, VL5, VL6, VL7, VL8, VL9, VL10, VL11, VL12, VL13, VL14, VL15, VL16 или VL17, VL18, VL19, VL20 или VL21. Еще один пример: антигенсвязывающий белок может состоять из (а) одной последовательности VL2 и (б) одной последовательности Vl1, Vl3, Vl4, Vl5, Vl6, Vl7, Vl8, Vl9, Vl10, Vl11, Vl12, Vl13, Vl14, Vl15, Vl16, Vl17, Vl18, Vl19, Vl20 или VL21. Еще один пример: антигенсвязывающий белок может состоять из (а) одной последовательности VL3 и (б) одной последовательности VL1, VL2, VL4, VL5, VL6, VL7, VL8, VL9, VL10, VL11, VL12, VL13, Vl14, Vl15, Vl16, Vl17, Vl18, Vl19, Vl20 или VL21 и т.д.
Разные комбинации вариабельных участков тяжелой цепи могут быть объединены с любыми различными комбинациями вариабельных участков легкой цепи, что очевидно для любого специалиста в данной области наук.
В других случаях антигенсвязывающий белок состоит из двух идентичных вариабельных участков легкой цепи и/или двух идентичных вариабельных участков тяжелой цепи. Например, антигенсвязывающий белок может быть представлен антителом или иммунологически функциональным фрагментом, включающим два вариабельных участка легкой цепи и два вариабельных участка тяжелой цепи в сочетаниях пар вариабельных участков легкой цепи и вариабельных участков тяжелой цепи из табл. 3.
Некоторые представленные антигенсвязывающие белки состоят из вариабельного домена тяжелой
- 32 031320 цепи, включающего последовательность аминокислот, отличающейся от последовательности вариабельного домена тяжелой цепи, выбранной из VH1, VH2, VH3, VH4, VH5, VH6, VH7, VH8, VH9, VH10, VH11, VH12 и VH13, только на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 или 15 аминокислотных остатков, при этом каждая разница в последовательности представлена независимым образом делецией, вставкой или заменой одной аминокислоты, а делеции, вставки и/или замены представляют собой изменения не более чем в 15 аминокислотах относительно упомянутых последовательностей вариабельного домена. Вариабельный участок тяжелой цепи в некоторых антигенсвязывающих белках состоит из последовательности аминокислот, идентичной на 70, 75, 80, 85, 90, 95, 97 или 99% последовательности аминокислот в вариабельном участке тяжелой цепи VH1, VH2, VH3, VH4, VH5, VH6, VH7, VH8, VH9, VH10, VH11, VH12 и VH13.
Определенные антигенсвязывающие белки состоят из вариабельного домена легкой цепи, включающего последовательность аминокислот, отличающейся от последовательности вариабельного домена легкой цепи, выбранной из VL1, VL2, VL3, VL4, VL5, VL6, VL7, VL8, VL9, VL10, VL11, VL12, VL13, VL14, Vl15, Vl16 или Vl17, только на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 или 15 аминокислотных остатков, при этом каждая разница в последовательности представлена независимым образом делецией, вставкой или заменой одной аминокислоты, а делеции, вставки и/или замены представляют собой изменения не более чем в 15 аминокислотах относительно упомянутых последовательностей вариабельного домена. Вариабельный участок легкой цепи в некоторых антигенсвязывающих белках состоит из последовательности аминокислот, идентичной на 70, 75, 80, 85, 90, 95, 97 или 99% последовательности аминокислот в вариабельном участке легкой цепи VL1, VL2, VL3, VL4, VL5, VL6, VL7, VL8, VL9, VL10, VL11, VL12, VL13, VL14, VL15, VL16 или VL17. В дополнительных случаях антигенсвязывающие белки состоят из следующих пар вариабельных доменов легкой цепи и тяжелой цепи: VL1 с VH1, VL2 с VH2, VL3 с VH3, VL4 с VH4, Vl5 с Vh5, Vl6 с Vh1, Vl7 с Vh6, Vl8 с Vh5, Vl9 с Vh1, Vl10 с Vh7, Vl11 с Vh8, Vl12 с Vh9, Vl12 с Vh10, VL13 с VH5, Vl14 с VH11, VL15 с VH12, VL16 с VH13 и VL17 с VH13. В некоторых случаях антигенсвязывающие белки в указанных выше парах могут включать аминокислотные последовательности, идентичные на 70, 75, 80, 85, 90, 95, 97 или 99% относительно определенных вариабельных доменов.
Еще одни антигенсвязывающие белки, например, антитела или иммунологически функциональные фрагменты, включают вариантные формы варианта тяжелой цепи и варианта легкой цепи, как это уже было описано.
ГВУ.
Представленные антигенсвязывающие белки являются полипептидами, в которых привито, вставлено и/или присоединено один или несколько ГВУ. Антигенсвязывающий белок может иметь 1, 2, 3, 4, 5 или 6 ГВУ. Антигенсвязывающий белок может включать, например, ГВУ1 одной тяжелой цепи (CDRH1), и/или ГВУ2 одной тяжелой цепи (CDRH2), и/или ГВУ3 одной тяжелой цепи (CDRH3), и/или ГВУ1 одной легкой цепи (CDRL1), и/или ГВУ2 одной легкой цепи (CDRL2), и/или ГВУ3 одной легкой цепи (CDRL3). Некоторые антигенсвязывающие белки включают CDRH3 и CDRL3. В табл. 4А и 4В представлены специфические ГВУ тяжелой и легкой цепи соответственно.
Определяющие комплементарность участки, или гипервариабельные участки (ГВУ) и каркасные участки (КУ) отдельного антитела могут быть идентифицированы с использованием системы, описанной Kabat и соавт. в Sequences of Proteins of Immunologicat Interest, 5th Ed., US Dept. of Health and Human Services, PHS, NIH, NIH Publication no. 91-3242, 1991. Определенные описанные здесь антитела состоят из одной или нескольких аминокислотных последовательностей, идентичных или имеющих достаточную идентичность относительно аминокислотных последовательностей одного или нескольких ГВУ, представленных в табл. 4А (CDRH) и 4В (CDRL).
- 33 031320
Таблица 4А
Типичные аминокислотные последовательности ГВУ тяжелой цепи
№ п/п Номер последовательности SEQ ID NO: Указано в Руководстве Обозначение Последовательность
42 73 1E11HCDR1 4E4HCDR1 9D4HCDR1 12G8HCDR1 CDRH 1-1 SFGMH
43 76 1H7HCDR1 9F5HCDR1 11D11HCDR1 11H9HCDR1 CDRH 1-2 NAWMS
44 79 2E7HCDR1 CDRH 1-3 SYAMS
45 82 3B6HCDR1 CDRH 1-4 GYYMH
46 85 3C8HCDR1 5F5HCDR1 12E8HCDR1 CDRH 1-5 SYGMH
47 88 4H6HCDR1 CDRH 1-6 DYAMS
48 92 10E4HCDR1 CDRH 1-7 DYYMY
49 97 13H2HCDR1 CDRH 1-8 TYSMN
50 100 32H7HCDR1 CDRH 1-9 SYGMH
51 74 1E11HCDR2 4E4HCDR2 9D4HCDR2 12G8HCDR2 CDRH 2-1 VISFDGSIKYSVDS VKG
52 77 1H7HCDR2 CDRH 2-2 RIKSTTDGGTTDYA APVKG
- 34 031320
53 80 2E7HCDR2 CDRH 2-3 AISGSGGRTYYAD SVKG
54 83 3B6HCDR2 CDRH 2-4 WINPNSGGTNYAQ KFQG
55 86 3C8HCDR2 5F5HCDR2 12E8HCDR2 CDRH 2-5 VISYDGSHESYAD SVKG
56 89 4H6HCDR2 CDRH 2-6 FIRSRAYGGTPEY AASVKG
57 91 9F5HCDR2 CDRH 2-7 RIKSKTDGGTTDYT APVKG
58 93 10E4HCDR2 CDRH 2-8 WISPNSGGTNYAQ KFQG
59 95 11D11HCDR2 11H9HCDR2 CDRH 2-9 RIKSKTDGGTTDY AAPVKG
60 98 13H2HCDR2 CDRH 2-10 SISSSSSYRYYADS VKG
61 101 32H7HCDR2 CDRH 2-11 VIWYDGSNKYYAD SVKG
62 75 1E11HCDR3 4E4HCDR3 9D4HCDR3 CDRH 3-1 DRLNYYDSSGYYH YKYYGMAV
63 78 1H7HCDR3 9F5HCDR3 11D11HCDR3 11H9HCDR3 CDRH 3-2 DRTGYSISWSSYY YYYGMDV
64 81 2E7HCDR3 CDRH 3-3 DQREVGPYSSGW YDYYYGMDV
65 84 3B6HCDR3 CDRH 3-4 DQMSIIMLRGVFPP YYYGMDV
66 87 3C8HCDR3 5F5HCDR3 12E8HCDR3 CDRH 3-5 ERKRVTMSTLYYY FYYGMDV
67 90 4H6HCDR3 CDRH 3-6 GRGIAARWDY
68 94 10E4HCDR3 CDRH 3-7 GGYSGYAGLYSHY YGMDV
69 96 12G8HCDR3 CDRH 3-8 DRLNYYDSSGYYH YKYYGLAV
70 99 13H2HCDR3 CDRH 3-9 EGVSGSSPYSISW YDYYYGMDV
71 102 32H7HCDR3 CDRH 3-10 AGGIAAAGLYYYY GMDV
- 35 031320
Таблица 4В Типичные аминокислотные последовательности ГВУлегкой цепи
№ п/п Номер последовательности SEQID NO: Указано в Руководстве Обозначение Последовательность
72 42 1E11LCD1 4E4LCD1 9D4LCD1 12G8LCD1 CDRL 1-1 SGSSSNIGNNYVS
73 45 1H7LCD1 9F5LCD1 11D11LC1 11H9LCD1 CDRL 1-2 SGSSSNIGSNYVY
74 48 2E7LCD1 CDRL 1-3 RASQGIRNDLG
75 51 3B6LCD1 CDRL 1-4 QGDSLRSFYAS
76 54 3C8LCD1 CDRL 1-5 KSSQSLLHSAGKTYL Y
77 57 4H6LCD1 CDRL 1-6 RSSQSLLHSFGYNYL D
78 60 5F5LCD1 CDRL 1-7 KSSQSLLHSDGKTYL Y
79 62 10E4LCD1 CDRL 1-8 SGSSSNIGSNTVN
80 65 12E8LCD1 CDRL 1-9 KSSQSLLHSDGRNYL Y
81 66 13H2LCD1 CDRL 1-10 RASQGIRKDLG
82 69 32Н7 LCD1 32H7m LCD1 CDRL 1-11 RASQSVSSGYLT
83 43 1E11LCD2 4E4LCD2 9D4LCD2 12G8LCD2 CDRL 2-1 DNNKRPS
- 36 031320
84 46 1H7LCD2 CDRL 2-2 RSNQRPS
85 49 2E7LCD2 CDRL 2-3 AASSLQS
86 52 3B6LCD2 CDRL 2-4 GKNNRPS
87 55 3C8LCD2 5F5LCD2 12E8LCD2 CDRL 2-5 EVSNRFS
88 58 4H6LCD2 CDRL 2-6 LGSNRAS
89 61 9F5LCD2 11D11LC2 11H9LCD2 CDRL 2-7 RNNQRPS
90 63 10E4LCD2 CDRL 2-8 TNNQRPS
91 67 13H2LCD2 CDRL 2-9 GASSLQS
92 70 32Н7 LCD2 32H7m LCD2 CDRL 2-10 GASSRAT
93 44 1E11LCD3 4E4LCD3 9D4LCD3 12G8LCD3 CDRL 3-1 GTWDSRLSAW
94 47 1H7LCD3 9F5LCD3 11D11LC3 11H9LCD3 CDRL 3-2 AAWDDSLSGWV
95 50 2E7LCD3 CDRL 3-3 LQYNIYPWT
96 53 3B6LCD3 CDRL 3-4 NSRDSSVYHLV
97 98 99 56 59 64 3C8LCD3 5F5LCD3 12E8LCD3 4H6LCD3 10E4LCD3 CDRL 3-5 CDRL 3-6 CDRL 3-7 MQSFPLPLT MQALQTPFT AARDESLNGW
100 68 13H2LCD3 CDRL 3-8 LQYNSFPWT
101 71 32Н7 LCD3 CDRL 3-9 QQYGNSLCR
102 72 32Н7т LCD3 CDRL 3-10 QQYGNSLSR
Структура и свойства ГВУ в представленных в природе антителах описана выше. Вкратце можно отметить, что в обычном антителе ГВУ встроен вместе с каркасным участком в вариабельный домен тяжелой и легкой цепи, где они образуют участки, ответственным за связывание и распознавание антигена. Вариабельный участок состоит как минимум из трех ГВУ тяжелой или легкой цепи (см. выше Kabat et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Public Health Service N.I.H., Bethesda, MD; см. также Chothia and Lesk, 1987, J. Mol. Biol. 196:901-917; Chothia et al., 1989, Nature 342: 877-883) в каркасном участке (определенные каркасные участки 1-4, FR1, FR2, FR3 и FR4, установлено Kabat et al., 1991, см. выше; см. также Chothia and Lesk, 1987 выше). Представленные ГВУ могут использоваться не только для определения антигенсвязывающего домена в структуре обычного антитела, но могут принимать участие и в целом ряде других полипептидных структур, как это описано в тексте.
В одном аспекте изобретения представленные ГВУ являются (A) CDRH, выбранными из группы, включающей (i) CDRH1, выбранный из группы с последовательностями SEQ ID NO: 73, 76, 79, 82, 85, 88, 92, 97 и 100; (ii) CDRH2, выбранный из группы с последовательностями SEQ ID NO: 74, 77, 80, 83, 86, 89, 91, 93, 95, 98, 101 и 129; (iii) CDRH3, выбранный из группы с последовательностями SEQ ID NO: 75, 78, 81, 84, 87, 90, 96, 99, 102 и 123; и (iv) CDRH из (i), (ii) и (iii), содержащий одну или несколько, например одну, две, три, четыре или более аминокислотных замен (например, замен консервативных аминокислот), делеций или вставок не более пяти, четырех, трех, двух или одной аминокислот; (В) CDRL, выбранными из группы, включающей (i) CDRL1, выбранный из группы с последовательностями SEQ ID NO: 42, 45, 48, 51, 54, 57, 62, 65, 66 и 69; (ii) CDRL2, выбранный из группы с последовательностями SEQ ID NO: 43, 46, 49, 52, 55, 58, 61, 63, 67 и 70; (iii) CDRL3, выбранный из группы с последовательностями SEQ ID NO: 44, 47, 50, 53, 56, 59, 64, 68, 71 и 72; и (iv) CDRL из (i), (ii) и (iii), содержащий одну или несколько, например одну, две, три, четыре или более аминокислотных замен (напри
- 37 031320 мер, замен консервативных аминокислот), делеций или вставок не более пяти, четырех, трех, двух или одной аминокислот.
В другом аспекте изобретения антигенсвязывающий белок включает 1, 2, 3, 4, 5 или 6 вариантных форм ГВУ, перечисленных в табл. 4А и 4В, каждая из которых идентична как минимум на 80, 85, 90 или 95% относительно последовательности ГВУ из табл. 4 А и 4В. Некоторые антигенсвязывающие белки включают 1, 2, 3, 4, 5 или 6 ГВУ, перечисленных в табл. 4А и 4В, при этом каждый ГВУ отличается не более чем на 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислот в сравнении с ГВУ, представленными в данных таблицах.
Еще в одном аспекте изобретения, описанные здесь ГВУ включают консенсусные последовательности, полученные из групп соответствующих моноклональных антител. Как уже было описано в тексте ранее, термин консенсусная последовательность относится к аминокислотным последовательностям, включающим консервативные аминокислоты, общие для целого ряда последовательностей, а также вариабельные аминокислоты, различающиеся в заданных последовательностях аминокислот. Представленные консенсусные последовательности ГВУ включают ГВУ, соответствующие каждой CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2 и CDRL3. Еще в одном аспекте изобретения антигенсвязывающий белок включает следующие ассоциации CDRL1, CDRL2 и CDRL3: SEQ ID NO: 42, 43 и 44; SEQ ID NO: 45, 46 и 47; SEQ ID NO: 48, 49 и 50; SEQ ID NO: 51, 52 и 53; SEQ ID NO: 54, 55 и 56; SEQ ID NO: 57, 58 и 59; SEQ ID NO: 60, 55 и 56; SEQ ID NO: 45, 61 и 47; SEQ ID NO: 62, 63 и 64; SEQ ID NO: 65, 55 и 56; SEQ ID NO: 66, 67 и 68; SEQ ID NO: 69, 70 и 71; и SEQ ID NO: 69, 70 и 72.
В дополнительном аспекте изобретения антигенсвязывающий белок включает следующие ассоциации CDRH1, CDRH2 и CDRH3: SEQ ID NO: 73, 74 и 75; SEQ ID NO: 76, 77 и 78; SEQ ID NO: 79, 80 и 81; SEQ ID NO: 82, 83 и 84; SEQ ID NO: 85, 86 и 87; SEQ ID NO: 88, 89 и 90; SEQ ID NO: 76, 91 и 78; SEQ ID NO: 92, 93 и 94; SEQ ID NO: 76, 95 и 78; SEQ ID NO: 73, 74 и 96; SEQ ID NO: 97, 98 и 99; и SEQ ID NO: 100, 101 и 102.
В другом аспекте изобретения антигенсвязывающий белок включает следующие ассоциации CDRL1, CDRL2 и CDRL3 с CDRH1, CDRH2 и CDRH3: SEQ ID NO: 42, 43 и 44 с SEQ ID NO: 73, 74 и 75; SEQ ID NO: 45, 46 и 47 с SEQ ID NO: 76, 77 и 78; SEQ ID NO: 48, 49 и 50 с SEQ ID NO: 79, 80 и 81; SEQ ID NO: 51, 52 и 53 с SEQ ID NO: 82, 83 и 84; SEQ ID NO: 54, 55 и 56 с SEQ ID NO: 85, 86 и 87; SEQ ID NO: 57, 58 и 59 с SEQ ID NO: 88, 89 и 90; SEQ ID NO: 60, 55 и 56 с SEQ ID NO: 85, 86 и 87; SEQ ID NO: 45, 61 и 47 с SEQ ID NO: 76, 91 и 78; SEQ ID NO: 62, 63 и 64 с SEQ ID NO: 92, 93 и 94; SEQ ID NO: 45, 61 и 47 с SEQ ID NO: 76, 95 и 78; SEQ ID NO: 65, 55 и 56 с SEQ ID NO: 85, 86 и 87; SEQ ID NO: 42, 43 и 44 с SEQ ID NO: 73, 74 и 96; SEQ ID NO: 66, 67 и 68 с SEQ ID NO: 97, 98 и 99; SEQ ID NO: 69, 70 и 71 с SEQ ID NO: 100, 101 и 102; и SEQ ID NO: 69, 70 и 72 с SEQ ID NO: 100, 101 и 102.
Консенсусные последовательности были определены с использованием стандартных филогенетических анализов ГВУ, соответствующих VH и VL антител к CGRP R. Консенсусные последовательности были определены путем выстраивания заменимых ГВУ в последовательности, соответствующей VH или VL.
Как это показано на фиг. 3A, 3B, 4, 5А, 5В, 5С, 5D и 5Е, описанный здесь линейный анализ целого ряда антигенсвязывающих белков позволил получить группы соответствующих последовательностей, обозначаемых как группы K1, K2, K3 и K4 ГВУ легкой цепи (фиг. 3A и 3B), группы L1, L2, L3 и L4 ГВУ легкой цепи (фиг. 4), и группы HCl (фиг. 5А), НС2 (фиг. 5В), CH3 (фиг. 5С), НС4 (фиг. 5С), НС5 (фиг. 5D) и НС6 (фиг. 5Е) ГВУ тяжелой цепи. Некоторые из указанных выше групп использовались для получения дополнительных консенсусных последовательностей, как это показано на фиг. 3A, 3B, 4 и 5F, для получения групп K1,4 (фиг. 3A), K2,3 (фиг. 3B), L1,2,3 (фиг. 4) и LAII (фиг. 4) ГВУ легкой цепи и групп НСА и НСВ (фиг. 5F) ГВУ тяжелой цепи.
Консенсусные последовательности различных групп участков ГВУ представлены ниже.
Консенсусная последовательность K1.
CDR1 RASQGIRXiDLG (SEQ ID NO: 103), где X1 выбирается из группы, состоящей из N и K.
CDR2 X1ASSLQS (SEQ ID NO: 104), где X1 выбирается из группы, состоящей из А и G.
CDR3 LQYNX1X2PWT (SEQ ID NO: 105), где X1 выбирается из группы, состоящей из I и S, а X2 выбирается из группы, состоящей из Y и F.
Консенсусная последовательность K4.
CDR3 QQYGNSLX1R (SEQ ID NO: 106), где X1 выбирается из группы, состоящей из S и С. Консенсусная последовательность K1,4.
CDR1 RASQX1X2X3X4GX5LX6 (SEQ ID NO: 107), где X1 выбирается из группы, состоящей из S и G, Х2 выбирается из группы, состоящей из V и I, X3 выбирается из группы, состоящей из S и R, Х4 выбирается из группы, состоящей из S, N и K, Х5 выбирается из группы, состоящей из Y и D, и Х6 выбирается из группы, состоящей из Т и G.
CDR2 X1ASSX2X3X4 (SEQ ID NO: 108), где X1 выбирается из группы, состоящей из G и А, Х2 выбирается из группы, состоящей из R и L, Х3 выбирается из группы, состоящей из А и Q, и Х4 выбирается из группы, состоящей из Т и S.
CDR3 X1QYX2X3X4X5X6X7 (SEQ ID NO: 109), где X1 выбирается из группы, состоящей из Q и L, Х2 выбирается из группы, состоящей из G и N, Х3 выбирается из группы, состоящей из N и Т, Х4 выбирается
- 38 031320 из группы, состоящей из S, Y и F, Х5 выбирается из группы, состоящей из L и Р, и Х6 выбирается из группы, состоящей из С, W и S, и Х7 выбирается из группы, состоящей из R и Т.
Консенсусная последовательность K3.
CDR1 KSSQSLLHSXiGX2X3YLY (SEQ ID NO: 110), где X1 выбирается из группы, состоящей из D и А, Х2 выбирается из группы, состоящей из R и K, и Х3 выбирается из группы, состоящей из N и Т.
Консенсусная последовательность K2,3.
CDR1 X1SSQSLLHSX2GX3X4YLX5 (SEQ ID NO: 111), где X1 выбирается из группы, состоящей из R и K, Х2 выбирается из группы, состоящей из F, D и А, Х3 выбирается из группы, состоящей из Y, R и K, Х4 выбирается из группы, состоящей из N и Т, и Х5 выбирается из группы, состоящей из D и Y.
CDR2 XiX2SNRX3S (SEQ ID NO: 112), где X1 выбирается из группы, состоящей из L и Е, Х2 выбирается из группы, состоящей из G и V, и Х3 выбирается из группы, состоящей из А и F.
CDR3 MQXiX2X3X4PX5T (SEQ ID NO: 113), где X1 выбирается из группы, состоящей из А и S, Х2 выбирается из группы, состоящей из L и F, Х3 выбирается из группы, состоящей из Q и Р, Х4 выбирается из группы, состоящей из Т и L, и Х5 выбирается из группы, состоящей из F и L.
Консенсусная последовательность Lm3.
CDR2 RXiNQRPS (SEQ ID NO: 114), где X1 выбирается из группы, состоящей из N и S.
Консенсусная последовательность Lm1,2,3.
CDR1 SGSSSNIGX1NX2VX3 (SEQ ID NO: 115), где X1 выбирается из группы, состоящей из N и S, Х2 выбирается из группы, состоящей из Y и Т, и Х3 выбирается из группы, состоящей из S, N и Y.
CDR2 X1X2NX3RPS (SEQ ID NO: 116), где X1 выбирается из группы, состоящей из D, Т и R, Х2 выбирается из группы, состоящей из N и S, и Х3 выбирается из группы, состоящей из K и Q.
CDR3 X1QYX2X3X4X5X6X7 (SEQ ID NO: 117), где X1 выбирается из группы, состоящей из G и А, Х2 выбирается из группы, состоящей из Т и А, Х3 выбирается из группы, состоящей из W и R, Х4 выбирается из группы, состоящей из S и D, Х5 выбирается из группы, состоящей из R и S, и Х6 выбирается из группы, состоящей из С, S и N, и Х7 выбирается из группы, состоящей из А и G.
Последовательность LAII.
CDR1 X1GX2X3SX4X5X6X7X8X9X1oX11 (SEQ ID NO: 118), где X1 выбирается из группы, состоящей из S и Q, Х2 присутствует или отсутствует, а если присутствует, то представлен S, Х3 выбирается из группы, состоящей из S и D, Х4 присутствует или отсутствует, а если присутствует, то представлен N, Х5 выбирается из группы, состоящей из I и L, Х6 выбирается из группы, состоящей из G и R, Х7 выбирается из группы, состоящей из N и S, Х8 выбирается из группы, состоящей из N и F, Х9 выбирается из группы, состоящей из Y и Т, X10 выбирается из группы, состоящей из V и А, и X11 выбирается из группы, состоящей из S, N и Y.
CDR2 X1X2NX3RPS (SEQ ID NO: 119), где X1 выбирается из группы, состоящей из D, G, Т и R, X2 выбирается из группы, состоящей из N, K и S, и X3 выбирается из группы, состоящей из K, N и Q.
CDR3 X1X2X3DX4X5X6X7X8X9V (SEQ ID NO: 120), где X1 выбирается из группы, состоящей из G, N и А, Х2 выбирается из группы, состоящей из Т, S и А, X3 выбирается из группы, состоящей из W и R, X4 выбирается из группы, состоящей из S и D, X5 выбирается из группы, состоящей из R и S, X6 выбирается из группы, состоящей из L и V, Х7 выбирается из группы, состоящей из S, Y и N, X8 выбирается из группы, состоящей из А, Н и G, и X9 выбирается из группы, состоящей из V и L.
Консенсусная последовательность HC1.
CDR1 X1YYMX2 (SEQ ID NO: 121), где X1 выбирается из группы, состоящей из G и D, а X2 выбирается из группы, состоящей из Н и Y.
CDR2 WIX1PNSGGTNYAQKFQG (SEQ ID NO: 122), где X1 выбирается из группы, состоящей из N и S.
CDR3 X1X2X3SX4X5X6X7X8GX9X10X11X12YYX13GMDV (SEQ ID NO: 123), где X1 выбирается из группы, состоящей из D и G, Х2 выбирается из группы, состоящей из Q и G, X3 выбирается из группы, состоящей из М и Y, X4 выбирается из группы, состоящей из I и G, X5 выбирается из группы, состоящей из I и Y, X6 выбирается из группы, состоящей из М и А, Х7 присутствует или отсутствует, а если присутствует, то представлен L, X8 присутствует или отсутствует, а если присутствует, то представлен R, X9 выбирается из группы, состоящей из V и L, Х10 выбирается из группы, состоящей из F и Y, X11 выбирается из группы, состоящей из Р и S, X12 выбирается из группы, состоящей из Р и Н, и Х13 присутствует или отсутствует, а если присутствует, то представлен Y.
Консенсусная последовательность НС2.
CDR2 RIKSX1TDGGTTDYX2APVKG (SEQ ID NO: 124), где X1 выбирается из группы, состоящей из K и Т, а X2 выбирается из группы, состоящей из Т и А.
Консенсусная последовательность HC3.
CDR1 X1YX2MX3 (SEQ ID NO: 125), где X1 выбирается из группы, состоящей из Т и S, X2 выбирается из группы, состоящей из S и А, и X3 выбирается из группы, состоящей из N и S.
CDR2 X1ISX2SX3X4X5X6YYADSVKG (SEQ ID NO: 126), где X1 выбирается из группы, состоящей из S и А, X2 выбирается из группы, состоящей из S и G, X3 выбирается из группы, состоящей из S и G, X4 выбирается из группы, состоящей из S и G, Х5 выбирается из группы, состоящей из Y и R, и X6 выбира
- 39 031320 ется из группы, состоящей из R и Т.
CDR3 X1X2X3X4X5X6X7PYSX8X9WYDYYYGMDV (SEQ ID NO: 127), где X1 выбирается из группы, состоящей из Е и D, Х2 выбирается из группы, состоящей из G и Q, Х3 выбирается из группы, состоящей из V и R, Х4 выбирается из группы, состоящей из S и Е, Х5 выбирается из группы, состоящей из G и V, и Х6 выбирается из группы, состоящей из S и G, X- присутствует или отсутствует, а если присутствует, то представлен S, Х8 выбирается из группы, состоящей из I и S, и Х9 выбирается из группы, состоящей из S и G.
Консенсусная последовательность НС4.
CDR1 SX1GMH (SEQ ID NO: 128), где X1 выбирается из группы, состоящей из F и Y.
CDR2 VISX1DGSX2KYX3X4DSVKG (SEQ ID NO: 129), где X1 выбирается из группы, состоящей из F и Y, Х2 выбирается из группы, состоящей из I и Н, Х3 выбирается из группы, состоящей из S и Y, и Х4 выбирается из группы, состоящей из V и А.
CDR3 X1RX2X3X4X5X6SX7XeyyX9Xi0XnYYGXi2Xi3V (SEQ ID NO: 130), где X1 выбирается из группы, состоящей из D и Е, Х2 выбирается из группы, состоящей из L и K, X3 выбирается из группы, состоящей из N и R, X4 выбирается из группы, состоящей из Y и V, Х5 выбирается из группы, состоящей из Y и Т, Х6 выбирается из группы, состоящей из D и М, Х7 выбирается из группы, состоящей из S и Т, Х8 выбирается из группы, состоящей из G и L, Х9 выбирается из группы, состоящей из Н и Y, Х10 присутствует или отсутствует, а если присутствует, то представлен Y, X11 выбирается из группы, состоящей из K и F, X12 выбирается из группы, состоящей из М и L, и X13 выбирается из группы, состоящей из А и D.
Консенсусная последовательность НСА.
CDR2 Х1Х2Х3МХ4 (SEQ ID NO: 131), где X1 выбирается из группы, состоящей из N и S, Х2 выбирается из группы, состоящей из A, Y и F, Х3 выбирается из группы, состоящей из W, А и G, и Х4 выбирается из группы, состоящей из S и Н.
CDR2 X1IX2X3X4X5X6GX7X8X9X10X11X12X13X14VKG (SEQ ID NO: 132), где X1 выбирается из группы, состоящей из R, А и V, X2 выбирается из группы, состоящей из K, S и W, Х3 выбирается из группы, состоящей из S, G, F и Y, Х4 присутствует или отсутствует, а если присутствует, то выбирается из группы, состоящей из K и Т, Х5 присутствует или отсутствует, а если присутствует, то представлен Т, X6 выбирается из группы, состоящей из D и S, Х7 выбирается из группы, состоящей из G и S, Х8 выбирается из группы, состоящей из Т, R, I, N и Н, Х9 выбирается из группы, состоящей из Т и K, X10 выбирается из группы, состоящей из D и Y, X11 выбирается из группы, состоящей из Y и S, X12 выбирается из группы, состоящей из Т, А и V, X13 выбирается из группы, состоящей из А и D, и Х14 выбирается из группы, состоящей из Р и S.
CDR3 X1X2X3X4X5X6X-X8X9X1oX11X12X1зX14X15X16X1-GX18X19V (SEQ ID NO: 133), где X1 выбирается из группы, состоящей из D, А и Е, Х2 выбирается из группы, состоящей из R, Q и G, Х3 выбирается из группы, состоящей из Т, R, L, G и K, Х4 выбирается из группы, состоящей из G, E, N, I и R, Х5 выбирается из группы, состоящей из Y, V и А, X6 выбирается из группы, состоящей из S, G, Y, А и Т, Х7 выбирается из группы, состоящей из I, P, D, А и М, Х8 присутствует или отсутствует, а если присутствует, то выбирается из группы, состоящей из S и Y, Х9 присутствует или отсутствует, а если присутствует, то выбирается из группы, состоящей из W, S и Т, Х10 выбирается из группы, состоящей из S, G и L, X11 выбирается из группы, состоящей из S, G, L и Y, X12 присутствует или отсутствует, а если присутствует, то выбирается из группы, состоящей из W и Y, X13 выбирается из группы, состоящей из Y и Н, X14 присутствует или отсутствует, а если присутствует, то выбирается из группы, состоящей из Y и D, X15 выбирается из группы, состоящей из Y, K и F, X16 присутствует или отсутствует, а если присутствует, то представлен Y, Х17 присутствует или отсутствует, а если присутствует, то представлен Y, X18 выбирается из группы, состоящей из М и L, и Х19 выбирается из группы, состоящей из D и А.
Консенсусная последовательность НСВ.
CDR3 X1X2X3X4X5 (SEQ ID NO: 134), где X1 выбирается из группы, состоящей из N, G, D, S и А, Х2 выбирается из группы, состоящей из A, F и Y, Х3 выбирается из группы, состоящей из W, Y, А и G, Х4 выбирается из группы, состоящей из М и L, и Х5 выбирается из группы, состоящей из S и Н.
CDR2 X1IX2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14X15X16X17G (SEQ ID NO: 135), где X, выбирается из группы, состоящей из R, W, А, V, S и F, Х2 выбирается из группы, состоящей из K, N, S, W и R, Х3 выбирается из группы, состоящей из S, P, G, F и Y, Х4 присутствует или отсутствует, а если присутствует, то выбирается из группы, состоящей из K, Т и R, Х5 присутствует или отсутствует, а если присутствует, то выбирается из группы, состоящей из Т и А, Х6 выбирается из группы, состоящей из D, N, H, S и Y, Х7 выбирается из группы, состоящей из G и S, Х8 выбирается из группы, состоящей из G и S, Х9 выбирается из группы, состоящей из Т, G, R, I, N, Н и Y, X10 выбирается из группы, состоящей из Т, K, R и Р, X11 выбирается из группы, состоящей из D, N, Y и Е, X12 выбирается из группы, состоящей из Y и S, X13 выбирается из группы, состоящей из Т, А и V, X14 выбирается из группы, состоящей из A, Q и D, X15 выбирается из группы, состоящей из Р, K и S, X16 выбирается из группы, состоящей из V и F, и Х17 выбирается из группы, состоящей из K и Q.
CDR3 X1X2X3X4X5SX6X-X8X9X1oX11X12X1зX14X15X16GX1-X18V (SEQ ID NO: 136), где X1 выбирается
- 40 031320 из группы, состоящей из D, G, А и Е, Х2 выбирается из группы, состоящей из R, G и Q, Х3 выбирается из группы, состоящей из Т, М, Y, R, L, G и K, Х4 выбирается из группы, состоящей из G, S, Е, N, I и R, Х5 выбирается из группы, состоящей из Y, I, G, V и А, Х6 выбирается из группы, состоящей из S, I, Y, G, А и Т, Х7 выбирается из группы, состоящей из I, M, A, P и D, Х8 присутствует или отсутствует, а если присутствует, то выбирается из группы, состоящей из S, L и Y, Х9 присутствует или отсутствует, а если присутствует, то выбирается из группы, состоящей из W, R, S и Т, Х10 выбирается из группы, состоящей из S, G и L, Хп выбирается из группы, состоящей из S, V, L, G и Y, Х12 присутствует или отсутствует, а если присутствует, то выбирается из группы, состоящей из F, Y и W, Хв выбирается из группы, состоящей из Y, P, S и Н, Х14 присутствует или отсутствует, а если присутствует, то выбирается из группы, состоящей из Y, P, D и Н, Х15 выбирается из группы, состоящей из Y, K и F, Х16 присутствует или отсутствует, а если присутствует, то представлен Y, Х17 присутствует или отсутствует, а если присутствует, то представлен Y, и Х18 выбирается из группы, состоящей из М и L.
В некоторых случаях антигенсвязывающий белок состоит как минимум из одного CDR1, CDR2 или CDR3 тяжелой цепи, имеющей одну из указанных выше консенсусных последовательностей. В некоторых случаях антигенсвязывающий белок состоит как минимум из одного CDR1, CDR2 или CDR3 легкой цепи, имеющей одну из указанных выше консенсусных последовательностей. В других случаях антигенсвязывающий белок состоит как минимум из двух ГВУ тяжелой цепи в соответствии с представленными выше консенсусными последовательностями и/или как минимум из двух ГВУ легкой цепи в соответствии с представленными выше консенсусными последовательностями.
В других случаях антигенсвязывающий белок состоит как минимум из трех ГВУ тяжелой цепи в соответствии с представленными выше консенсусными последовательностями и/или как минимум из трех ГВУ легкой цепи в соответствии с представленными выше консенсусными последовательностями.
Типичные антигенсвязывающие белки.
Согласно одному аспекту изобретения, в нем представлен антигенсвязывающий белок, связывающий CGRP R и состоящий из (А) одного или нескольких гипервариабельных участков тяжелой цепи (CDRH), выбранных из группы, включающей (i) CDRH1, выбираемого из группы, включающей SEQ ID NO: 73, 76, 79, 82, 85, 88, 92, 97 и 100; (ii) CDRH2, выбираемого из группы, включающей SEQ ID NO: 74, 77, 80, 83, 86, 89, 91, 93, 95, 98, 101 и 129; (iii) CDRH3, выбираемого из группы, включающей SEQ ID NO: 75, 78, 81, 84, 87, 90, 96, 99, 102 и 123; и (iv) CDRH из (i), (ii) и (iii), содержащего одну или несколько, например одну, две, три, четыре или более аминокислотных замен, делеций или вставок не более чем пяти, четырех, трех, двух или одной аминокислоты; (В) одного или нескольких гипервариабельных участков легкой цепи (CDRL), выбранных из группы, включающей (i) CDRL1, выбираемого из группы, включающей SEQ ID NO: 42, 45, 48, 51, 54, 57, 62, 65, 66 и 69; (ii) CDRL2, выбираемого из группы, включающей SEQ ID NO: 43, 46, 49, 52, 55, 58, 61, 63, 67 и 70; (iii) CDRL3, выбираемого из группы, включающей SEQ ID NO: 44, 47, 50, 53, 56, 59, 64, 68, 71 и 72; и (iv) CDRL из (i), (ii) и (iii), содержащего одну или несколько, например одну, две, три, четыре или более аминокислотных замен, делеций или вставок не более чем пяти, четырех, трех, двух или одной аминокислоты; или (С) одного или нескольких CDRH тяжелой цепи (А) и одного или нескольких CDRL легкой цепи (В).
Еще в одном варианте исполнения изобретения изолированный антигенсвязывающий белок может состоять из (A) CDRH, выбираемого из группы, включающей (i) CDRH1, выбираемого из группы, включающей SEQ ID NO: 73, 76, 79, 82, 85, 88, 92, 97 и 100; (ii) CDRH2, выбираемого из группы, включающей SEQ ID NO: 74, 77, 80, 83, 86, 89, 91, 93, 95, 98, 101 и 129; и (iii) CDRH3, выбираемого из группы, включающей SEQ ID NO: 75, 78, 81, 84, 87, 90, 96, 99, 102 и 123; (В) CDRL, выбираемого из группы, включающей (i) CDRL1, выбираемого из группы, включающей SEQ ID NO: 42, 45, 48, 51, 54, 57, 62, 65, 66 и 69; (ii) CDRL2, выбираемого из группы, включающей SEQ ID NO: 43, 46, 49, 52, 55, 58, 61, 63, 67 и 70; и (iii) CDRL3, выбираемого из группы, включающей SEQ ID NO: 44, 47, 50, 53, 56, 59, 64, 68, 71 и 72; или (С) одного или нескольких CDRH тяжелой цепи (А) и одного или нескольких CDRL легкой цепи (В). В одном варианте исполнения изобретения изолированный антигенсвязывающий белок может состоять из (A) CDRH1 из SEQ ID NO: 73, 76, 79, 82, 85, 88, 92, 97 и 100, CDRH2 из SEQ ID NO: 74, 77, 80, 83, 86, 89, 91, 93, 95, 98, 101 и 129, и CDRH3 из SEQ ID NO: 75, 78, 81, 84, 87, 90, 96, 99, 102 и 123, и (В) CDRL1 из SEQ ID NO: 42, 45, 48, 51, 54, 57, 62, 65, 66 и 69, CDRL2 из SEQ ID NO: 43, 46, 49, 52, 55, 58, 61, 63, 67 и 70, и CDRL3 из SEQ ID NO: 44, 47, 50, 53, 56, 59, 64, 68, 71 и 72.
В другом варианте исполнения изобретения вариабельный участок тяжелой цепи (VH) идентичен как минимум на 70, 75, 80, 85, 90, 95, 97 или 99% аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 158-170, и/или VL идентичен как минимум на 70, 75, 80, 85, 90, 95, 97 или 99% аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 137-153. Еще в одном варианте исполнения изобретения VH выбирается из группы, включающей SEQ ID NO: 158170, и/или VL выбирается из группы, включающей SEQ ID NO: 137-153.
В другом аспекте изобретения также описывается изолированный антигенсвязывающий белок, специфически связывающийся с эпитопом, образованным из аминокислотных остатков компонентов CRLR и RAMP1 CGRP R.
Еще в одном варианте исполнения изобретения, изолированный описанный выше антигенсвязы
- 41 031320 вающий белок состоит из первой аминокислотной последовательности, включающей как минимум одну из описанных здесь консенсусных последовательностей CDRH, и второй аминокислотной последовательности, включающей как минимум одну из описанных здесь консенсусных последовательностей CDRL. В одном аспекте изобретения первая аминокислотная последовательности состоит как минимум из двух консенсусных последовательностей CDRH, и/или вторая аминокислотная последовательность состоит как минимум из двух консенсусных последовательностей CDRL.
В определенных вариантах исполнения изобретения первая и вторая аминокислотные консенсусные последовательности ковалентно связаны друг с другом.
В других вариантах исполнения изобретения первая аминокислотная последовательность изолированного антигенсвязывающего белка включает CDRH3 из SEQ ID NO: 75, 78, 81, 84, 87, 90, 96, 99, 102 и 123, CDRH2 из SEQ ID NO: 74, 77, 80, 83, 86, 89, 91, 93, 95, 98, 101 и 129, и CDRH1 из SEQ ID NO: 73, 76, 79, 82, 85, 88, 92, 97 и 100, и/или вторая аминокислотная последовательность изолированного антигенсвязывающего белка включает CDRL3 из SEQ ID NO: 44, 47, 50, 53, 56, 59, 64, 68, 71 и 72, CDRL2 из SEQ ID NO: 43, 46, 49, 52, 55, 58, 61, 63, 67 и 70, и CDRL1 из SEQ ID NO: 42, 45, 48, 51, 54, 57, 62, 65, 66 и 69.
В дополнительном варианте исполнения изобретения антигенсвязывающий белок состоит как минимум из двух последовательностей CDRH тяжелой цепи Н1, Н2, H3, Н4, Н5, Н6, Н7, Н8, Н9, H10, Н11, Н12 или Н13, как это указано в табл. 5А. Еще в одном варианте исполнения изобретения антигенсвязывающий белок состоит как минимум из двух последовательностей CDRL легкой цепи L1, L2, L3, L4, L5, L6, L7, L8, L9, L10, L11, L12, L13, L14, L15, L16 или L17, как это указано в табл. 5В. Еще в одном варианте исполнения изобретения антигенсвязывающий белок состоит как минимум из двух последовательностей CDRH тяжелой цепи Н1, Н2, H3, Н4, Н5, Н6, Н7, Н8, Н9, H10, Н11, Н12 или Н13, как это указано в табл. 5А, и как минимум из двух последовательностей CDRL легкой цепи L1, L2, L3, L4, L5, L6, L7, L8, L9, L10, L11, L12, L13, L14, L15, L16 или L17, как это указано в табл. 5В.
В другом варианте исполнения изобретения антигенсвязывающий белок состоит из последовательностей CDRH1, CDRH2 и CDRH3 тяжелой цепи Н1, Н2, H3, Н4, Н5, Н6, Н7, Н8, Н9, H10, Н11, Н12 или Н13, как это указано в табл. 5А. Еще в одном варианте исполнения изобретения антигенсвязывающий белок состоит из последовательностей CDRL1, CDRL2 и CDRL3 легкой цепи L1, L2, L3, L4, L5, L6, L7, L8, L9, L10, L11, L12, L13, L14, L15, L16 или L17, как это указано в табл. 5В.
Еще в одном варианте исполнения изобретения антигенсвязывающий белок состоит из всех шести последовательностей ГВУ L1 и Н1, или L2 и Н2, или L3 и H3, или L4 и Н4, или L5 и Н5, или L6 и Н1, или L7 и Н6, или L8 и Н5, или L9 и Н1, или L10 и Н7, или L11 и Н8, или L12 и Н9, или L12 и H10, или L13 и Н5, или L14 и Н11, или L15 и Н12, или L16 и Н13, или L17 и Н13, как это указано в табл. 5А и 5В.
- 42 031320
Таблица 5А Типичные участки последовательностей аминокислот в тяжелой цепи
Ссылка Группа полной тяжелой цепи Номер последовательности полной тяжелой цепи SEQIDNO Группа вариабельного участка тяжелой цепи Номер последовательности вариабельного участка тяжелой цепи SEQ ID NO Номер последовательности CDRH1 SEQ ID NO Номер последовательности CDRH2 SEQIDNO Номер последовательности CDRH3 SEQIDNO
1Е11 Н1 29 VH1 158 73 74 75
1Н7 Н2 30 Vh2 159 76 77 78
2Е7 НЗ 31 Vh3 160 79 80 81
ЗВ6 Н4 32 Vh4 161 82 83 84
ЗС8 Н5 33 Vh5 162 85 86 87
4Е4 Н1 29 Vh1 158 73 74 75
4Н6 Н6 34 Vh6 163 88 89 90
5F5 Н5 33 Vh5 162 85 86 87
9D4 Н1 29 Vh1 158 73 74 75
9F5 Н7 35 Vh7 164 76 91 78
10Е4 Н8 36 Vh8 165 92 93 94
11D11 Н9 37 Vh9 166 76 95 78
11Н9 НЮ 38 Vh10 167 76 95 78
12Е8 Н5 33 Vh5 162 85 86 87
12G8 Н11 39 Vh11 168 73 74 96
13Н2 Н12 40 Vh12 169 97 98 99
32Н7 Н13 41 VH13 170 100 101 102
32Н7 CS Н13 41 VH13 170 100 101 102
32Н8 Vh14 171
ЗЗВ5 VH15 172
33 Е4 VH16 173
34E3 Vh17 174
- 43 031320
Таблица 5В Типичные участки последовательностей аминокислот в легкой цепи
Ссылка Группа полной легкой цепи Номер последовательности полной легкой цепи SEQ ID NO Группа вариабельного участка легкой цепи
1Е11 L1 12 VL1
1Н7 L2 13 Vl2
2Е7 L3 14 VL3
ЗВ6 L4 15 Vl4
ЗС8 L5 16 Vl5
4Е4 L6 17 VL6
4Н6 L7 18 Vl7
5F5 L8 19 Vl8
9D4 L9 20 Vl9
9F5 L10 21 VL10
10Е4 L11 22 VL11
11D11 L12 23 Vl12
11Н9 L12 23 Vl12
12Е8 L13 24 VL13
12G8 L14 25 Vl14
13Н2 L15 26 Vl15
32Н7 L16 27 VL16
32Н7 CS L17 28 VL17
32Н8 Vl18
ЗЗВ5 Vl19
ЗЗЕ4 Vl20
34 ЕЗ Vl21
Номер последовательности вариабельного участка легкой цепи SEQ ID NO Номер последовательности CDRL1 SEQ ID NO Номер последовательности CDRL2 SEQIDNO Номер последовательности CDRL3 SEQ ID NO
137 42 43 44
138 45 46 47
139 48 49 50
140 51 52 53
141 54 55 56
142 42 43 44
143 57 58 59
144 60 55 56
145 42 43 44
146 45 61 47
147 62 63 64
148 45 61 47
148 45 61 47
149 65 55 56
150 42 43 44
151 66 67 68
152 69 70 71
153 69 70 72
154
155
156
157
В одном аспекте изобретения представленные антигенсвязывающие белки могут быть моноклональным антителом, поликлональным антителом, рекомбинантным антителом, человеческим антителом, гуманизированным антителом, химерным антителом, мультиспецифичным антителом или их антигенсвязывающими фрагментами.
В другом варианте исполнения изобретения, фрагмент антитела изолированного антигенсвязывающего белка может быть представлен Fab фрагментом, Fab' фрагментом, F(ab')2 фрагментом, Fv фрагментом, диателом или одноцепочечной молекулой антитела.
Еще в одном варианте исполнения изобретения представленный антигенсвязывающий белок может быть гуманизированным антителом типа IgG1, IgG2 IgG3 или IgG4.
В другом варианте исполнения изобретения антигенсвязывающий белок состоит только из полипептида с легкой или тяжелой цепью, как это указано в табл. 5А-5В. В некоторых вариантах исполнения изобретения антигенсвязывающий белок состоит только из вариабельного домена легкой цепи или вариабельного домена тяжелой цепи, перечисленных в табл. 5А-5В. Подобные антигенсвязывающие белки могут быть пэгилированы с помощью одной или нескольких молекул ПЭГ.
Еще в одном аспекте изобретения представленный антигенсвязывающий белок может быть соединен с меченой группой и может конкурировать за связывание с экстрацеллюлярным участком человеческого CGRP R с антигенсвязывающим белком из числа описанных здесь антигенсвязывающих белков. В одном варианте исполнения изобретения представленный антигенсвязывающий белок может снижать хемотаксис моноцитов, ингибировать миграцию моноцитов в опухоли или ингибировать накопление и функции опухоль-ассоциированных макрофагов в опухоль при введении белка пациенту.
Как это будет понятно для любого специалиста в данной области, для любого антигенсвязывающего белка с более чем одним ГВУ из указанных последовательностей возможно использовать любую комбинацию ГВУ, выбранных независимым образом из указанных последовательностей. Таким образом,
- 44 031320 могут быть получены антигенсвязывающие белки с одним, двумя, тремя, четырьмя, пятью или шестью ГВУ, выбранных независимым образом. Однако, как это будет очевидно для специалиста в данной области, специфические варианты исполнения изобретения обычно используют комбинации не повторяющихся ГВУ, например, антигенсвязывающие белки обычно не синтезируют с двумя участками CDRH2 и т.д.
Некоторые представленные антигенсвязывающие белки более подробно обсуждаются ниже.
Антигенсвязывающие белки, связывающие эпитопы и связывающие домены.
Когда говорится о том, что антигенсвязывающий белок связывается с эпитопом, коими являются один или оба компонента CGRP R, или экстрацеллюлярный домен CGRP R, это означает, что антигенсвязывающий белок специфически связывается со специфическим участком CGRP R, который может быть представлен CRLR, RAMP1, или участками последовательности CRLR и RAMP1. В случаях, когда антигенсвязывающий белок связывается только с CRLR (но не с RAMP1), такой антигенсвязывающий белок не будет избирательно связывать CGRP R, так как CRLR является общим, inter alia, для рецепторов АМ1 и АМ1. Подобным образом, в случаях, когда антигенсвязывающий белок связывается только с RAMP1 (но не с CRLR), такой антигенсвязывающий белок не будет избирательно связывать CGRP R, так как RAMP1 является общим, inter alia, для рецептора AMY1. В случаях, когда антигенсвязывающий белок взаимодействует как с CRLR, так и с RAMP1, ожидается, что такой антигенсвязывающий белок будет связываться с остатками или последовательностями, или участками как CRLR, так и RAMP1. Ни в одном из указанных выше вариантах исполнения изобретения антигенсвязывающий белок не контактирует с каждым остатком в CRLR или RAMP1. Подобным образом, не каждая замена или делеция аминокислоты в CRLR, RAMP1 или их экстрацеллюлярных доменах не будет значительно влиять на силу связывания.
Методы, описанные, например, в примере 10, могут использоваться для оценки участков мультимерных рецепторов, таких как CGRP R, которые могут быть задействованы в связывании с отдельными антигенсвязывающими белками.
Конкурирующие антигенсвязывающие белки.
В другом аспекте изобретения представленные антигенсвязывающие белки конкурируют с одним из представленных или эталонных антител, или их функциональными фрагментами, связывающимися с эпитопом (см. выше), за специфическое связывание с CGRP R. Такие антигенсвязывающие белки также могут связываться с таким же самым эпитопом, содержащимся в представленных антигенсвязывающих белках, или перекрывающимися антигенными детерминантами. Антигенсвязывающие белки и фрагменты, конкурирующие за связывание или связывающиеся с одним и тем же эпитопом представленных или антигенсвязывающих белков, обладают похожими функциональными свойствами. Представленные в качестве примеров антигенсвязывающие белки и фрагменты включают в своем составе тяжелые и легкие цепи, домены вариабельных участков VL1-VL17 и VH1-VH13, а также ГВУ (см. табл. 2А, 2В, 3, 4А, 4В, 5А и 5В). Таким образом, представленные антигенсвязывающие белки включают белки, конкурирующие с антителом и имеющие: (а) все 6 ГВУ, перечисленных для антител в табл. 5А и 5В; (b) VH и VL, выбранные из Vl1-Vl17 и VH1-VH13 и перечисленные для антител в табл. 5А и 5В; или (с) две легкие цепи и две тяжелые цепи, указанные для антител в табл. 5 А и 5В. Другие примеры подходящих эталонных антител включают антитела с вариабельным участком тяжелой цепи, имеющим последовательности, соответствующие любой последовательности, указанной как SEQ ID NO: 158-170, и вариабельным участком легкой цепи, имеющим последовательности, соответствующие любой последовательности, указанной как SEQ ID NO: 137-153.
Конкурентное связывание может быть оценено, например, с использованием анализов количественного измерения степени связывания, такого как Biacore анализ, описанный в примере 7 ниже. В данном примере было подвергнуто испытанию 19 описанных антител относительно шести эталонных антител - пяти нейтрализующих антител (11D11, 3B6, 4Н6, 12G8 и 9F5) и одного ненейтрализующего антитела (34E3). Результаты анализа, представленные в табл. 13, указывают на то, что все подвергнутые испытанию нейтрализующие антитела (1E11, 1H7, 2E7, 3B6, 3C8, 4E4, 4H6, 5F5, 9D4, 9F5, 10E4, 11D11, 11H9, 12E8, 12G8, 13H2 и 32Н7) связываются по существу с тем же участком CGRP R, который отличается от участка CGRP R, с которым связываются исследуемые ненейтрализующие антитела (32Н8, 33B5, 33E4 и 34E3). Основываясь на таких данных, любые нейтрализующие антитела в ходе анализа конкурентного связывания будут служить типичным эталоном антигенсвязывающих белков, в частности, любые нейтрализующие антитела, которые были иммобилизированы в ходе анализа, описанного в примере 7, т.е. 11D11, 3B6, 4Н6, 12G8 и 9F5.
Моноклональные антитела.
Представленные антигенсвязывающие белки включают моноклональные антитела, которые связываются с CGRP R. Моноклональные антитела могут быть получены с использованием любого известного науке способа, например, путем иммортализации клеток селезенки, полученных у трансгенных животных после завершения графика иммунизации. Клетки селезенки могут быть иммортализированы с использованием любого известного науке способа, например, путем слияния их с клетками миеломы для получения гибридом. Предпочтительно, чтобы клетки миеломы для использования в процедурах слияния
- 45 031320 для получения гибридом не вырабатывали антител, имели высокий показатель эффективности слияния и нехватку ферментов, делающих такие клетки неспособными расти в определенных избирательных средах, поддерживающих рост только необходимых клеток слияния (гибридом). Примеры подходящих клеточных линий для использования в процедурах слияния у мышей включают Sp-20, P3-X63/Ag8, P3-X63Ag8.653, NS1/1.Ag 4 1, Sp210-Ag14, FO, NSO/U, MPC-11, MPC11-X45-GTG 1.7 и S194/5XXO BuI; примеры подходящих клеточных линий для использования в процедурах слияния у крыс включают R210.RCY3, Y3-Ag 1.2.3, IR983F и 4В210. Другие клеточные линии, которые можно использовании для слияния клеток, представлены U-266, GM1500-GRG2, LICR-LON-HMy2 и UC729-6. Типичный способ получения моноклональных антител описан в примере 2 ниже. В некоторых случаях линию клеток гибридомы получают путем иммунизации животного (например, трансгенного животного, имеющего человеческую последовательность иммуноглобулинов) иммуногеном CGRP R; забором клеток селезенки у иммунизированного животного; слиянием отобранных клеток селезенки с линией клеток миеломы с получением клеток гибридомы; определением линии клеток гибридомы и идентифицированием линии клеток гибридомы, продуцирующей антитело, связывающееся с CGRP R (например, как это описано в примерах 1-3 ниже). Такие линии клеток гибридомы и полученные из них моноклональные антитела к CGRP R являются аспектами данного изобретения.
Моноклональные антитела, секретируемые линией клеток гибридомы, могут быть очищены с помощью любого известного науке способа. Гибридомы или моноклональные антитела в дальнейшем могут быть подвергнуты скринингу для идентификации моноклональных антител с отдельными свойствами, такими как способность связывать клетки, экспрессирующие CGRP, способность блокировать или интерферировать связывание лиганда CGRP или пептида CGRP8-37. или способность функционально блокировать рецептор, например, с использованием цАМФ-анализа, как это описано ниже.
Химерные и гуманизированные антитела.
Также представлены химерные и гуманизированные антитела, основанные на указанных выше последовательностях. Моноклональные антитела для использования в качестве терапевтических агентов могут быть модифицированы перед применением различными методами. Один пример описывает химерное антитело, которое состоит из белковых сегментов разных антител, ковалентно соединенных для выработки функциональных легких или тяжелых цепей иммуноглобулинов или их иммунологически функциональных фрагментов. Как правило, участок тяжелой цепи и/или легкой цепи идентичен или гомологичен соответствующей последовательности в антителах, полученных у отдельных видов или принадлежащих отдельному классу или подклассу антител, в то время как остальная часть цепи (цепей) идентична или гомологична соответствующей последовательности в антителах, полученных у другого вида или принадлежащих другому классу или подклассу антител. Способы, относящиеся к химерным антителам, представлены, например, в патенте США № 4816567; и Morrison et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (включено в настоящий документ посредством ссылки). ГВУ-привитие описано, например, в патентах США № 6180370, 5693762, 5693761, 5585089 и 5530101.
Как правило, целью получения химерного антитела является создание химеры, в которой максимально увеличено количество аминокислот относительно определенных видов пациентов. Пример ом ГВУ-привитого антитела может служить антитело, состоящее из одного или нескольких гипервариабельных участков (ГВУ), полученное у отдельного вида или принадлежащее отдельному классу или подклассу антител, при этом оставшаяся часть цепи (цепей) антитела идентична или гомологична соответствующей последовательности в антителах, полученных от других видов или принадлежащих другому классу или подклассу антител. Для использования у людей, вариабельный участок или ГВУ, выбранные из антител грызунов, часто прививаются на человеческое антитело, замещая естественные вариабельные участки или ГВУ человеческого антитела. Одним из используемых видов химерных антител является гуманизированное антитело. Как правило, гуманизированное антитело получают из моноклонального антитела, полученного изначально у другого животного. В таком моноклональном антителе определенные аминокислотные остатки, обычно с участков антитела, не ответственных за распознавание антигена, модифицированы для получения гомологичности с соответствующими остатками в человеческом антителе соответствующего изотипа. Гуманизация может проводиться, например, с использованием различных методов путем замены как минимум участка в вариабельном участке грызунов на соответствующие участки человеческого антитела (см., например, патенты США № 5585089 и 5693762; Jones et al., 1986, Nature 321:522-525; Riechmann et al., 1988, Nature 332:323-27; Verhoeyen et al., 1988, Science 239:15341536). В одном аспекте изобретения ГВУ вариабельных участков легкой цепи и тяжелой цепи представленных антител (см. табл. 4) прививаются к каркасным участкам (КУ) антител, полученных у одного и того же или филогенетически различного вида. Например, ГВУ вариабельных участков тяжелой цепи и легкой цепи Vh1, Vh2, Vh3, Vh4, Vh5, Vh6, Vh7, Vh8, Vh9, Vh10, Vh11, Vh12 и Vh13 и/или VL1, Vl2, Vl3, Vl4, Vl5, Vl6, Vl7, Vl8, Vl9, Vl10, Vl11, Vl12, Vl13, Vl14, Vl15, Vl16 и Vl17 могут быть привиты к консенсусной последовательности человеческих КУ. Для создания консенсусной последовательности человеческих КУ, могут быть соединены КУ из нескольких аминокислотных последовательностей человеческой легкой цепи и тяжелой цепи, что позволит выявить консенсусную аминокислотную последовательность. В других вариантах исполнения изобретения КУ тяжелой цепи и легкой цепи замещаются КУ
- 46 031320 другой тяжелой цепи и легкой цепи. В одном аспекте изобретения редкие аминокислоты в КУ тяжелой и легкой цепей антитела к CGRP R не подвергаются замене, в отличие от аминокислот других КУ. Редкая аминокислота является специфической аминокислотой, располагающейся в таком месте, в котором такая аминокислота обычно отсутствовала бы в КУ. С другой стороны, привитые вариабельные участки из одной тяжелой или легкой цепи могут использоваться наряду с константным участком, отличающимся от константного участка данной отдельной тяжелой или легкой цепи. В других вариантах исполнения изобретения привитые вариабельные участки являются частью одноцепочечного Fv антитела.
В определенных вариантах исполнения изобретения вместе с человеческими вариабельными участками (участком) могут использоваться и константные участки от других видов (кроме человека), что позволит получить гибридные антитела.
Полностью человеческие антитела.
Представлены также и полностью человеческие антитела. Существуют методы получения полностью человеческих антител, специфичных для отдельного антигена без необходимости подвергания воздействию человека антигеном (полностью гуманизированные антитела). Одним из специальных способов получения полностью человеческих антител является гуманизация гуморальной иммунной системы мыши. Введение локусов человеческого иммуноглобулина (Ig) мыши, у которой инактивированы гены эндогенного Ig, позволяет получить полностью человеческие моноклональные антитела (МА) у мыши, т.о. животное может быть иммунизировано любым желаемым антигеном. Использование полностью человеческих антител может свести к минимуму иммуногенные и аллергические ответы, которые иногда могут быть вызваны путем введения мышиных или полученных у мышей МА человеку в качестве терапевтических агентов.
Полностью человеческие антитела могут быть получены путем иммунизации трансгенных животных (как правило, мышей), способных вырабатывать набор человеческих антител при отсутствии выработки эндогенных иммуноглобулинов. Антигены, используемые для таких целей, обычно состоят из шести или более заменимых аминокислот, и, в некоторых случаях, могут быть конъюгированы с носителем, например, гаптеном. См., например, Jakobovits et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2551-2555; Jakobovits et al., 1993, Nature 362:255-258; и Bruggermann et al., 1993, Year in Immunol. 7:33. В одном примере такого способа трансгенные животные (мыши) были получены путем потери локусов в тяжелых и легких цепях, ответственных за способность кодировать эндогенные иммуноглобулины, с дальнейшей вставкой в мышиный геном больших фрагментов человеческой геномной ДНК, содержащей локусы, кодирующие тяжелые и легкие цепи белков человека. Частично модифицированные животные, имеющие неполный комплементарный набор локусов иммуноглобулинов человека, затем подлежат гибридизации для получения животного, имеющего все необходимые модификации иммунной системы. При введении иммуногена, такие трансгенные животные вырабатывают антитела, являющиеся иммуноспецифическими относительно иммуногена, но содержат скорее человеческие, а не мышиные последовательности аминокислот, включая вариабельные участки. Дополнительная информация о таких методах описана, например, в WO 96/33735 и WO 94/02602. Дополнительные методы, описывающие использование трансгенных мышей для получения человеческих антител, представлены в патентах США № 5545807; 6713610; 6673986; 6162963; 5545807; 6300129; 6255458; 5877397; 5874299 и 5545806; в публикациях РСТ WO 91/10741, WO 90/04036, и в ЕР 546073В1 и ЕР 546073А1.
Описанные выше трансгенные мыши, представленные здесь как мыши линии HuMab, содержат минилокус гена человеческого иммуноглобулина, кодирующего неизмененные иммуноглобулиновые последовательности тяжелой ([мю] и [гамма]) и легкой [каппа] цепи человека; наряду с направленными мутациями, это позволяет инактивировать эндогенные локусы [мю] и [каппа] цепи (Lonberg et al., 1994, Nature 368:856-859). В соответствии с этим, у мышей отмечается пониженная экспрессия мышиного IgM или [каппа] в ответ на иммунизацию, при этом введенные человеческие трансгены тяжелой и легкой цепи подвергаются изменению класса или соматической мутации, в результате чего получают человеческие IgG [каппа] моноклональные антитела с высокой аффинностью (Lonberg et al., supra.; Lonberg and Huszar, 1995, Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93; Harding and Lonberg, 1995, Ann. N.Y Acad. Sci. 764:536-546). Получение мышей линии HuMab подробно описано Taylor et al., 1992, Nucleic Acids Research 20:62876295; Chen et al., 1993, International Immunology 5:647-656; Tuaillon et al., 1994, J. Immunol. 152:2912-2920; Lonberg et al., 1994, Nature 368:856-859; Lonberg, 1994, Handbook of Exp. Pharmacology 113:49-101; Taylor et al., 1994, International Immunology 6:579-591; Lonberg and Huszar, 1995, Intern. Rev. Immunol. 13:65-93; Harding and Lonberg, 1995, Ann. N.Y Acad. Sci. 764:536-546; Fishwild et al., 1996, Nature Biotechnology 14:845-851; включено в настоящий документ во всей полноте посредством ссылки для любых целей. См. также патенты США № 5545806; 5569825; 5625126; 5633425; 5789650; 5877397; 5661016; 5814318; 5874299 и 5770429; а также патент США № 5545807; международная публикация WO 93/1227; WO 92/22646; и WO 92/03918 (включено в настоящий документ во всей полноте посредством ссылки для любых целей). Технологии, используемые для получения человеческих антител у таких трансгенных мышей, также описаны в WO 98/24893 и Mendez et al., 1997, Nature Genetics 15:146-156 (включено в настоящий документ посредством ссылки). Например, штаммы трансгенных мышей НСо7 и НСо12 могут использоваться для получения антител к CGRP R. Дополнительные сведения относительно получения
- 47 031320 человеческих антител с использованием трансгенных мышей представлены в примерах ниже.
С использованием технологии гибридомы могут быть получены антигенспецифичные человеческие моноклональные антитела с желаемой специфичностью с дальнейшей селекцией у трансгенных мышей (см. выше). Такие антитела могут быть клонированы и экспрессированы с использованием подходящего вектора и клетки-хозяина, или антитела могут быть собраны с выращенных клеток гибридомы.
Полностью человеческие антитела также могут быть получены из библиотек фаговых дисплеев (как это описано Hoogenboom et al., 1991, J. Mol. Biol. 227:381; и Marks et al., 1991, J. Mol. Biol. 222:581). Метод фаговых дисплеев имитирует иммунную селекцию посредством отображения репертуара антител на поверхности нитевидных бактериофагов с последующей селекцией фага по его связыванию с определенным антигеном. Один такой метод описан в публикации РСТ WO 99/10494 (включено в настоящий документ посредством ссылки), которая описывает изоляцию высокоаффинных и функционально агонистических антител для MPL- и msk-рецепторов с использованием такого метода.
Биспецифические или бифункциональные антигенсвязывающие белки.
Представленные антигенсвязывающие белки также включают биспецифические и бифункциональные антитела с одним или несколькими ГВУ или одним или несколькими вариабельными участками, как это описано выше. В некоторых случаях биспецифическое или бифункциональное антитело представлено искусственным гибридным антителом, имеющим две разные пары тяжелой/легкой цепи и два разных центра связывания. Биспецифические антитела могут быть получены с использованием целого ряда методов, включая, но не ограничиваясь, слияние гибридом или связывание Fab'-фрагментов. См., например, Songsivilai and Lachmann, 1990, Clin. Exp. Immunol. 79:315-321; Kostelny et al., 1992, J. Immunol. 148:15471553.
Различные другие формы.
Некоторые представленные антигенсвязывающие белки являются вариантными формами антигенсвязывающих белков, описанных выше (например, белков, имеющих последовательности, перечисленные в табл. 2-5). Например, некоторые антигенсвязывающие белки имеют одну или несколько замен консервативных аминокислот в одной или нескольких тяжелых или легких цепях, вариабельных участках или ГВУ, перечисленных в табл. 2-5. Встречающиеся в природе аминокислоты могут быть разделены на классы на основе общих свойств боковой цепи:
1) гидрофобные: норлейцин, Мет, Ала, Вал, Лей, Иле;
2) нейтральные гидрофильные: Цис, Сер, Тре, Асн, Глн;
3) кислотные: Асп, Глу;
4) основные: Гис, Лиз, Арг;
5) остатки, влияющие на ориентацию цепи: Глу, Про;
6) содержащие ароматическое кольцо: Трп, Тир, Фен.
Замены консервативных аминокислот могут включать обмен члена одного класса на другой член такого же класса. Замены консервативных аминокислот могут включать остатки аминокислот, не встречающихся в природе, которые обычно включаются в структуру методом химического синтеза пептида, а не синтезом в биологических системах. Сюда относят пептидомиметики и другие обращенные или инвертированные формы аминокислотных фрагментов. Замены неконсервативных аминокислот могут включать обмен члена одного из указанных выше классов на член из другого класса. Такие замещенные остатки могут быть включены в участки антитела, гомологичные человеческим антителам, или в негомологичные участки молекулы.
При проведении таких изменений в соответствии с определенными вариантами исполнения изобретения, должен учитываться индекс гидрофобности аминокислот. Профиль гиброфобности белка рассчитывается путем присваивания каждой аминокислоте числового значения (индекса гидрофобности), а затем повторного усреднения таких значений вдоль пептидной цепи. Каждой аминокислоте был присвоен индекс гидрофобности на основе ее гидрофобных свойств и характеристик заряда. Значения следующие: изолейцин (+4,5); валин (+4,2); лейцин (+3,8); фенилаланин (+2,8); цистеин/цистин (+2,5); метионин (+1,9); аланин (+1,8); глицин (-0,4); треонин (-0,7); серин (-0,8); триптофан (-0,9); тирозин (-1,3); пролин (-1,6); гистидин (-3,2); глутаминовая кислота (-3,5); глутамин (-3,5); аспартат (-3,5); аспарагин (-3,5); лизин (-3,9); аргинин (-4,5).
Важность гидрофобного профиля в представлении интерактивной биологической функции белка известна науке (см., например, Kyte et al., 1982, J. Mol. Biol. 157:105-131). Известно, что определенные аминокислоты могут быть замещены другими аминокислотами, имеющими подобный индекс или показатель гидрофобности при сохранении похожей биологической активности. При внесении изменений, основанных на индексе гидрофобности, в разных вариантах исполнения изобретения, предусмотрено замещение аминокислот с индексами гидрофобности в пре8делах ±2. В некоторых аспектах изобретения предусмотрены индексы гидрофобности ±1, в других аспектах изобретения - индексы гидрофобности ±0,5.
Науке также известно, что замещение подобных аминокислот может эффективно проводиться, основываясь на свойствах гидрофильности, в частности, если созданный биологически активный белок или
- 48 031320 пептид предназначены для использования в иммунологических вариантах исполнения изобретения, как и в данном случае. В определенных вариантах исполнения изобретения наибольшее локальное среднее значение гидрофильности белка, регулируемое гидрофильностью прилегающих аминокислот, коррелирует с его иммуногенностью и способностью связывать антиген, что является биологическим свойством белка.
Ниже представлены значения гидрофильности, присвоенные определенным аминокислотам: аргинин (+3,0); лизин (+3,0); аспартат (+3,0 ±1); глутаминовая кислота (+3,0±1); серин (+0,3); аспарагин (+0,2); глутамин (+0,2); глицин (0); треонин (-0,4); пролин (-0,5 ±1); аланин (-0,5); гистидин (-0,5); цистеин (-1,0); метионин (-1,3); валин (-1,5); лейцин (-1,8); изолейцин (-1,8); тирозин (-2,3); фенилаланин (-2,5) и триптофан (-3,4). При внесении изменений, основанных наподобие значений гидрофильности, в определенных вариантах исполнения изобретения, предусмотрено замещение аминокислот с показателем гидрофильности в пределах ±2; в других вариантах исполнения изобретения - с показателем гидрофильности в пределах ±1; еще в других вариантах исполнения изобретения - с показателем гидрофильности ±0,5. В некоторых случаях на основе гидрофильных показателей можно идентифицировать эпитопы в первичных последовательностях аминокислот. Такие участки также называют активными зонами антигенной детерминанты. Типичные замещения консервативных аминокислот представлены в табл. 6.
Таблица 6
Замены консервативных аминокислот
Специалист в данной области будет в состоянии определить подходящие варианты полипептидов с использованием известных методов. Кроме того, такой специалист может идентифицировать подходящие области молекулы, которые могут быть изменены без нарушения активности путем нацеливания на области, которые, как считается, не играют важной роли в активности молекулы. Специалист в данной области также сможет идентифицировать остатки и участки молекул, являющиеся консервативными в подобных полипептидах. В дополнительных вариантах исполнения изобретения замене консервативных аминокислот могут быть подвергнуты даже области, играющие важную роль для биологической активности или структуры молекулы без нарушения биологической активности или без отрицательного влия ния на структуру полипептида.
Кроме того, специалист в данной области может проанализировать структурно-функциональные исследования, идентифицирующие остатки в небольших полипептидах, играющие важную роль в актив ности или структуре молекулы.
При таком сравнении возможно спрогнозировать важность аминокислотных остатков в белке, соответствующих аминокислотным остаткам, играющим важную роль в активности или структуре подобных белков. Специалист в данной области может выбрать подобные замены аминокислот для прогнозирования наличия важных аминокислотных остатков. Специалист в данной области может также проанализи ровать трехмерную структуру и аминокислотную последовательность относительно структуры похожих
- 49 031320 полипептидов. С учетом таких данных, также можно спрогнозировать выравнивание аминокислотных остатков антитела относительно его трехмерной структуры. Специалист в данной области может и не проводить радикальных изменений в аминокислотных остатках, которые, согласно прогнозам, могут располагаться на поверхности белка, так как такие остатки могут быть задействованы в важных взаимодействиях с другими молекулами. Более того, специалист в данной области может получить данные испытаний вариантов с заменой одной аминокислоты в каждом указанном остатке аминокислоты. Такие варианты затем могут быть подвергнуты скринингу с использованием анализов на нейтрализующую активность CGRP R (см. примеры ниже), что позволит получить сведения относительно возможных замен аминокислот и того, какие аминокислоты не могут быть замещены. Другими словами, основываясь на информации, собранной в ходе таких стандартных экспериментов, специалист в данной области наук может с легкостью определить позиции аминокислот, в которых следует избежать замен либо независимым образом, либо в сочетании с другими мутациями.
Существует целый ряд научных публикаций, посвященных прогнозированию вторичной структуры. См. Moult, 1996, Curr. Op. in Biotech. 7:422-427; Chou et al., 1974, Biochem. 13:222-245; Chou et al., 1974, Biochemistry 113:211-222; Chou et al., 1978, Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol. 47:45-148; Chou et al., 1979, Ann. Rev. Biochem. 47:251-276; и Chou et al., 1979, Biophys. J. 26:367-384. Более того, в настоящее время имеются компьютерные программы, помогающие прогнозировать вторичную структуру. Один из методов прогнозирования вторичной структуры основан на гомологичном моделировании. Например, два полипептида или белка, имеющие показатель идентичности последовательности более 30%, или показатель подобия более 40%, могут иметь похожие структурные топологии. Увеличение информации в базе данных о структуре белков (PDB), наблюдаемое в последнее время, повысило возможности прогнозирования вторичной структуры, включая потенциальное количество изгибов в структуре полипептида или белка. См. Holm et al., 1999, Nucl. Acid. Res. 27:244-247. Было выдвинуто предположение (Brenner et al., 1997, Curr. Op. Struct. Biol. 7:369-376) об ограниченном числе изгибов в отдельном полипептиде или белке, поэтому очевидно, что после выяснения критического числа структур, прогнозирование структуры станет более точным. Дополнительные методы прогнозирования вторичной структуры включают протягивание (Jones, 1997, Curr. Opin. Struct Biol. 7:377-387; Sippl et al., 1996, Structure 4:15-19), анализ профиля (Bowie et al., 1991, Science 253:164-170; Gribskov et al., 1990, Meth. Enzym. 183:146-159; Gribskov et al., 1987, Proc. Nat. Acad. Sci. 84:4355-4358) и эволюционную связь (См. Holm, 1999, supra; and Brenner, 1997, выше).
В некоторых вариантах исполнения изобретения замены аминокислот производят для (1) снижения восприимчивости к протеолизу; (2) снижения восприимчивости к окислению; (3) изменения свойств связывания для образования комплексов белков; (4) изменения свойств связывания с лигандом или антигеном; (4) предоставления или модификации других физико-химических или функциональных свойств таких полипептидов. Например, замены одной или нескольких аминокислот (в определенных вариантах исполнения изобретения - замены консервативных аминокислот) могут выполняться в естественной последовательности. Такие замены могут выполняться в участке антитела, располагающимся снаружи от домена (доменов), образующего межмолекулярные контакты. В таких вариантах исполнения изобретения могут использоваться такие замены консервативных аминокислот, которые не приводят к значительному изменению структурных характеристик исходной последовательности (например, замена одной или нескольких аминокислот, которая не приводит к разрушению вторичной структуры, характеризующей исходный или нативный антигенсвязывающий белок). Примеры принятых в данной области наук вторичной и третичной структур полипептида описаны в Structures and Molecular Principles (Creighton, Ed.), 1984, W. H. New York: Freeman and Company; Introduction to Protein Structure (Branden and Tooze, eds.), 1991, New York: Garland Publishing; and Thornton et al., 1991, Nature 354:105 (включено в настоящий документ посредством ссылки).
Дополнительные предпочитаемые варианты антител включают варианты цистеина, в которых один или несколько цистеиновых остатков исходной или нативной аминокислотной последовательности были удалены или замещены другой аминокислотой (например, серином). Помимо всего прочего, варианты цистеина удобны, когда необходимо произвести рефолдинг антитела в его биологически активную конформацию. Цистеиновые варианты могут иметь меньшее количество цистеиновых остатков, чем нативное антитело, но обычно представлены четным числом для сведения к минимуму взаимодействий при нечетном количестве цистеиновых остатков.
Описанные тяжелые и легкие цепи, домены вариабельных участков и ГВУ могут использоваться для получения полипептидов, содержащих антигенсвязывающий участок, который может специфически связываться с CGRP R. Например, один или несколько ГВУ, перечисленных в табл. 4 и 5, могут быть введены в молекулу (например, полипептид) ковалентным или нековалентным образом для получения иммуноадгезии. Иммуноадгезия может включать ГВУ как часть большей полипептидной цепи, может способствовать ковалентному связыванию с ГВУ другой полипептидной цепи, или нековалентному связыванию ГВУ. ГВУ обусловливает иммуноадгезию, позволяющую специфически связываться с отдельным интересующим антигеном (например, CGRP R или его антигенной детерминантой).
Также представлены миметики (например, пептидные миметики или пептидомиметики), осно
- 50 031320 вываясь на доменах вариабельных участков и ГВУ. Такие аналоги могут быть представлены пептидами, непептидами или комбинациями пептидных и непептидных участков (Fauchere, 1986, Adv. Drug Res. 15:29; Veber and Freidinger, 1985, TINS p. 392; и Evans et al., 1987, J. Med. Chem. 30:1229, включено в настоящий документ посредством ссылки для любых целей). Пептидные миметики, имеющие структурное подобие с терапевтически полезными пептидами, могут использоваться для получения подобного терапевтического или профилактического эффекта. Такие соединения часто разрабатываются с помощью компьютерного молекулярного моделирования.
Как правило, пептидомиметики представлены белками, имеющими структурное сходство с антителом, характеризующимся желаемой биологической активностью, например, способностью специфически связываться с CGRP R, при этом такие пептидомиметики имеют одну или несколько пептидных связей, которые могут быть заменены следующими связями с использованием известных науке методов: -CH2NH-, -CH2S-, -СН2-СН2-, -СН-СН- (цис и транс), -СОСН2-, -СН(ОН)СН2- и -CH2SO-. В определенных вариантах исполнения изобретения для получения более устойчивых белков может использоваться систематическая замена одной или нескольких аминокислот в консенсусной последовательности Dаминокислотой подобного типа (например, D-лизин вместо L-лизина). Кроме того, могут быть получены связанные белки, содержащие консенсусную последовательность или существенно идентичную вариацию консенсусной последовательности, с помощью известных науке методов (Rizo and Gierasch, 1992, Ann. Rev. Biochem. 61.387, включено в настоящий документ посредством ссылки), например, путем добавления внутренних цистеиновых остатков, способных образовывать внутримолекулярные дисульфидные мостики, что придает белку циклическую структуру.
Также представлены производные описанных в тексте данного изобретения антигенсвязывающих белков. Производные антигенсвязывающих белков могут состоять из одной молекулы или вещества, наделяющего антитело или его фрагмент необходимым свойством, например, повышенным временем полужизни в отдельном случае. Производное антигенсвязывающего белка может состоять, например, из определяемого (или меченого) фрагмента (например, радиоактивной, колориметрической, антигенной или ферментной молекулы), определяемой гранулы (например, магнитной или электрически плотной (например), золотой гранулы), или молекулы, связывающейся с другой молекулой (например, биотина или стрептавидина), терапевтической или диагностической группы (например, радиоактивной, цитотоксической или фармацевтически активной группы), или молекулы, повышающей пригодность антигенсвязывающего белка для отдельного пользования (например, для введения субъекту, например, человеку, или другого in vivo или in vitro применения). Примеры молекул, которые могут использоваться для получения производного антигенсвязывающего белка, включают альбумин (например, человеческий сывороточный альбумин) и полиэтиленгликоль (ПЭГ). Связанные с альбумином и ПЭГилированные производные антигенсвязывающих белков могут быть получены с использованием хорошо известных науке методов.
Определенные антигенсвязывающие белки включают пэгилированный одноцепочечный полипептид, как это описано в тексте данного изобретения. В одном варианте исполнения изобретения антигенсвязывающий белок конъюгирован или связан иным образом с транстиретином (TTR) или TTRвариантом. TTR или TTR-вариант может быть химически модифицирован, например, химическим веществом из группы, включающей декстран, поли(п-винилпирролидон), полиэтиленгликоли, гомополимеры полипропиленгликоля, сополимеры полипропиленоксида/этиленоксида, полиоксиэтилированные полиолы и поливиниловые спирты.
Другие производные включают ковалентные или агрегированные конъюгаты CGRP Rсвязывающих белков с другими белками или полипептидами, например, при использовании экспрессии рекомбинантных белков слияния, состоящих из гетерологичных полипептидов, слитых с N-концом или С-концом CGRP R-связывающего белка. Например, конъюгированный белок может выступать в качестве гетерологичного сигнального (или лидерного) полипептида, например, лидер альфа-фактора дрожжей, или в качестве пептида, например, эпитопной метки. Антигенсвязывающие белки, связывающие CGRP и содержащие белки слияния, могут также включать пептиды, добавленные для облегчения очистки или идентификации CGRP R-связывающего белка (например, poly-His последовательность). CGRP Rсвязывающий белок также может быть связан с FLAG-пептидом, как это описано Норр et al., 1988, Bio/Technology 6:1204; и в патенте США № 5011912. FLAG-пептид имеет высокие антигенные свойства и обеспечивает реверсивное связывание антигенной детерминанты со специфическим моноклональным антителом (МА), позволяя производить быстрый анализ и легкую очистку экспрессируемого рекомбинантного белка. На рынке представлены реагенты, используемые для получения белков слияния, с помощью которых FLAG-пептид соединяется с отдельным полипептидом (Sigma, St. Louis, МО).
В качестве антагонистов CGRP R могут использоваться олигомеры, содержащие один или несколько CGRP R-связывающих белков. Олигомеры могут быть представлены в форме ковалентно-связанных или нековалентно-связанных димеров, тримеров или высших олигомеров. Предусмотрено использование олигомеров, содержащих два или несколько CGRP R-связывающих белков, при этом один из примеров представлен гомодимером. Другие олигомеры включают гетеродимеры, гомотримеры, гетеротримеры, гомотетрамеры, гетеротетрамеры и т.д.
- 51 031320
Один вариант исполнения изобретения предусматривает использование олигомеров, состоящих из множества CGRP R-связывающих полипептидов, соединенных посредством ковалентных или нековалентных связей между пептидными фрагментами, соединенными с CGRP R-связывающими белками. Такие пептиды могут быть представлены пептидными линкерами (спейсерами) или пептидами, имеющими свойство содействия олигомеризации. Среди пептидов, содействующих олигомеризации CGRP Rсвязывающих белков, представлены лейциновые молнии и определенные полипептиды, полученные из антител (подробное описание приводится ниже). В отдельных вариантах исполнения изобретения олигомеры состоят из двух-четырех CGRP R-связывающих белков. Фрагменты CGRP R-связывающих белков олигомера могут быть представлены в любой описанной выше форме, например, в форме вариантов или отдельный частей. Предпочтительно, чтобы олигомер состоял из CGRP R-связывающих белков, обладающих активностью связывания CGRP R.
В одном варианте исполнения изобретения олигомер получают с использованием полипептидов производных иммуноглобулинов. Получение белков слияния, содержащих определенные гетерологичные полипептиды, соединенные с различными участками полипептидов антител (включая Fc-домен), уже было описано ранее (например, Ashkenazi et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:10535; Byrn et al., 1990, Nature 344:677; и Hollenbaugh et al., 1992, Construction of Immunoglobulin Fusion Proteins, in Current Protocols in Immunology, Suppl. 4, pages 10.19.1-10.19.11).
Один вариант исполнения изобретения подразумевает использование димера, состоящего из двух белков слияния, созданных путем слияния CGRP R-связывающего белка с Fc-участком антитела. Димер может быть получен, например, путем вставки гибридного гена, кодирующего белок слияния, в соответствующий вектор экспрессии, экспрессирующий гибридный ген с клетках-хозяевах, трансформированных с помощью рекомбинантного вектора экспрессии; это позволит экспрессируемому белку слияния присоединить подобные молекулы антител, после чего образуются дисульфидные мостики между Fcфрагментами цепей, формируя димер.
Термин Fc-полипептид в контексте данного изобретения включает нативные и мутированные формы полипептидов, полученные с помощью Fc-участка антитела. Также представлены процессированные формы таких полипептидов, содержащие шарнирную область, способствующую димеризации. Белки слияния, включающие Fc-участки, и образованные из них олигомеры предоставляют преимущество легкой очистки методом аффинной хроматографии и колонок Белка А или Белка G.
Один из подходящих Fc-полипептидов, описанный в заявке РСТ WO 93/10151 и патентах США № 5426048 и 5262522, представлен одноцепочечным полипептидом, идущим от N-концевого шарнирного участка к нативному С-концевому Fc-участку человеческого антитела класса IgG1. Другой используемый Fc-полипептид представлен Fc-мутеином, описанным в патенте США № 5457035, и Baum et al., 1994, EMBO J. 13:3992-4001. Аминокислотная последовательность такого мутеина идентична таковой нативной Fc-последовательности, представленной в WO 93/10151, за исключением того, что 19-я аминокислота была изменена с Лей на Ала, 20-я аминокислота была изменена с Лей на Глу, и 22-я аминокислота была изменена с Гли на Ала. Мутеин обладает пониженной аффинностью относительно Fcрецепторов. В других вариантах исполнения изобретения вариабельный участок тяжелой и/или легкой цепей CGRP R-связывающего белка (как это описано в тексте данного изобретения) может быть замещен вариабельным участком тяжелой и/или легкой цепи антитела.
И наоборот, олигомер представлен белком слияния, состоящим из множества CGRP Rсвязывающих белков с/без пептидных линкеров (спейсеров). Подходящие пептидные линкеры описаны в патентах США № 4751180 и 4935233.
Другой метод получения олигомерных производных CGRP R-связывающего белка подразумевает использование лейциновой молнии. Домены лейциновой молнии представлены пептидами, способствующими олигомеризации белков, в которых они находятся. Лейциновые молнии изначально были обнаружены в нескольких ДНК-связывающих белках (Landschulz et al., 1988, Science 240:1759), а затем и в целом ряде других белков. Среди известных лейциновых молний имеются встречающиеся в природе пептиды и их производные, подвергающиеся димеризации или тримеризации.
Примеры доменов лейциновых молний, подходящих для получения растворимых олигомерных белков, описаны в заявке РСТ WO 94/10308, а лейциновая молния, полученная из белка легочного сурфактанта D (SPD), описана в Норре et al., 1994, FEBS Letters 344:191 (включено в настоящий документ посредством ссылки). Использование модифицированной лейциновой молнии, обуславливающей стабильную тримеризацию слитого гетерологичного белка, описано в Fanslow et al., 1994, Semin. Immunol. 6:267-278. В одном подходе рекомбинантные белки слияния, включающие фрагмент или производное CGRP R-связывающего белка, слиты с пептидом лейциновой молнии; такой комплекс экспрессируется в подходящих клетках-хозяевах, а из супернатанта культуры восстанавливают растворимые олигомерные фрагменты или производные CGRP R-связывающего белка.
В определенных вариантах исполнения изобретения антигенсвязывающий белок имеет показатель KD (равновесной константы связывания) менее 1, 10, 100 пмоль, 1 нмоль, 2, 5, 10, 25 или 50 нмоль.
Другой аспект изобретения предусматривает использование антигенсвязывающего белка со временем полужизни как минимум один день в условиях in vitro или in vivo (например, при введении челове
- 52 031320 ку). В одном варианте исполнения изобретения антигенсвязывающий белок имеет время полужизни как минимум три дня. В другом варианте исполнения изобретения антигенсвязывающий белок или его фрагмент имеет время полужизни четыре дня или более. В другом варианте исполнения изобретения антигенсвязывающий белок или его фрагмент имеет время полужизни восемь дней или более. В другом варианте исполнения изобретения антитело или его антигенсвязывающий фрагмент подвергается дериватизации или модификации таким образом, что он имеет большее время полужизни в сравнении с недериватизированным или немодифицированным антителом. В другом варианте исполнения изобретения антигенсвязывающий белок имеет точечные мутации, которые повышают время полужизни такого белка в сыворотке (как это описано в WO 00/09560, опубликовано 24 февраля 2000 г., включено в настоящий документ посредством ссылки).
Гликозилирование.
Антигенсвязывающий белок может характеризоваться схемой гликозилирования, отличной или измененной в сравнении со схемой гликозилирования нативных белков. Как это известно науке, схема гликозилирования может зависеть от последовательности белка (например, наличие или отсутствие специфичных гликозилированных аминокислотных остатков, обсуждаемых ниже), клетки-хозяина или организма, в которых вырабатывается белок. Ниже также обсуждаются отдельные системы экспрессии.
Гликозилирование полипептидов обычно представлено N-гликозилированием или Огликозилированием. N-гликозилирование осуществляется путем прикрепления углеводного остатка к боковой цепи остатка аспарагина. Трипептидные последовательности аспарагин-Х-серин и аспарагин-Хтреонин, где X - любая аминокислота, за исключением пролина, являются распознающими последовательностями для ферментативного присоединения углеводного остатка к боковой цепи аспарагина. Таким образом, наличие одной из таких трипептидных последовательностей в полипептиде создает потенциальный центр гликозилирования. О-гликозилирование осуществляется путем присоединения одного из Сахаров (N-ацетилгалактозамин, галактоза или ксилоза) к гидроксиаминокислоте, зачастую серину или треонину, хотя могут также использоваться 5-гидроксипролин или 5-гидроксилизин.
Добавление центров гликозилирования к антигенсвязывающему белку обычно сопровождается изменением аминокислотной последовательности, в результате чего такая последовательность включает одну или несколько описанных выше трипептидных последовательностей (для центров Nгликозилирования). Изменения также могут быть осуществлены путем добавления или замещения одного или нескольких остатков серина или треонина на пусковую последовательность (для центров Огликозилирования). Аминокислотная последовательность антигенсвязывающего белка может быть изменена на уровне ДНК, в частности, методом мутации ДНК, кодирующей определенный полипептид, на уровне предварительно выбранных оснований, таким образом, могут быть получены кодоны, транслирующие желаемые аминокислоты.
Другим способом увеличения числа углеводных фрагментов в антигенсвязывающем белке является химическое или ферментативное связывание гликозидов с белком. Такие процедуры эффективны, так как они не требуют выработки белка в клетке-хозяине, обладающей свойствами гликозилирования для N- и О-гликозилирования. В зависимости от используемого вида связывания, сахар(а) может быть присоединен к (а) аргинину и гистидину, (б) свободным карбоксильным группам, (в) свободным сульфогидрильным группам (например, цистеина), (г) свободным гидроксильным группам (например, серина, треонина или гидроксипролина), (д) остаткам ароматического кольца (например, фенилаланина, тирозина или триптофана) или (е) амидной группе глутамина. Такие методы описаны в WO 87/05330 (опубликовано 11 сентября 1987 г.) и Aplin and Wriston, 1981, CRC Crit. Rev, Biochem., p. 259-306,
Удаление остатков углеводов, присутствующих в исходном антигенсвязывающем белке, может сопровождаться химическим или ферментативным воздействием. Химическое дегликозилирование требует воздействия соединения трифторметансульфокислоты или эквивалентного соединения на белок. Такая обработка приводит к отщеплению большинства или всех Сахаров, за исключением связующего сахара (N-ацетилглюкозамина или N-ацетилгалактозамина), оставляя полипептид интактным. Химическое дегликозилирование описано Hakimudclin et al., 1987, Arch. Biochem. Biophys. 259:52 и Edge et al., 1981, Anal Biochem. 118:131. Ферментативное отщепление углеводных остатков от полипептида возможно осуществить путем использования целого ряда эндо- и экзогликозидаз, как это описано Thotakura et al., 1987, Meth. Enzymol. 1 38:350. Гликозилирование в потенциальных центрах гликозилирования можно предотвратить путем использования соединения туникамицин, как это описано Duskin et al., 1982, J. Biol. Chem. 257:3105. Туникамицин блокирует образование связей белок-Ы-гликозид.
Таким образом, аспекты данного изобретения включают варианты гликозилирования антигенсвязывающих белков, при этом был подвергнут изменениям целый ряд и/или типы центров гликозилирования в сравнении с аминокислотными последовательностями исходного полипептида. В определенных вариантах исполнения изобретения варианты антител содержат большее или меньшее количество центров N-гликозилирования в сравнении с нативным антителом. Центр N-гликозилирования характеризуется следующей последовательностью: Асн-Х-Сер или Асн-Х-Тре, где аминокислотный остаток, указанный как X, может быть представлен любым аминокислотным остатком, за исключением пролина. Замещение аминокислотных остатков для получения такой последовательности обеспечивает потенциал об
- 53 031320 разования нового центра для добавления N-гликозилированной цепи углевода. С другой стороны, наличие замен, элиминирующих или изменяющих такую последовательность, предотвратит добавление Nгликозилированной цепи углевода, присутствующей в нативном полипептиде. Например, гликозилирование может быть уменьшено путем делеции Асн или замены Асн другой аминокислотой. В других вариантах исполнения изобретения создаются один или несколько новых центров для N-гликозилирования. Центр N-гликозилирования в антителах обычно находится в Fc-фрагменте.
Метки и группы эффекторов.
В некоторых вариантах исполнения изобретения антигенсвязывающий белок содержит одну или несколько меток. Термин группа для мечения или метка обозначает любую определяемую метку. Примеры подходящих групп для мечения включают, но ограничиваются, следующие: радиоизотопы или радионуклиды (например, 3Н, 14С, 15N, 35S, 90Y, 99Тс, 111In, 125I, 131I), флуоресцентные группы (например, FITC, родамин, люминофоры на основе комплексов лантанидов), ферментативные группы (например, пероксидаза хрена, β-галактозидаза, люцифераза, щелочная фосфатаза), хемилюминесцентные группы, биотинилированные группы или предварительно определенные полипептидные антигенные детерминанты, распознаваемые вторичным репортером (например, парные последовательности лейциновой молнии, центры связывания для вторичных антител, домены связывания метала, эпитопные метки). В некоторых вариантах исполнения изобретения группа для мечения соединена с антигенсвязывающим белком посредством спейсерной ножки различной длины, что снижает потенциальное стерическое несоответствие. Науке известно много методов мечения белков, которые могут использоваться по мере необходимости.
Термин группа эффектора относится к любой группе, присоединенной к антигенсвязывающему белку, действуя в качестве цитотоксического агента. Примеры подходящих эффекторных групп включа-
дящие группы включают токсины, терапевтические группы или химиотерапевтические группы. Примеры подходящих групп включают калихимицин, ауристатины, гелданамицин и майтансин. В некоторых вариантах исполнения изобретения эффекторная группа соединена с антигенсвязывающим белком посредством спейсерной ножки различной длины, что снижает потенциальное стерическое несоответствие. В целом метки являются представителями разных классов, в зависимости от анализа, с помощью которого они определяются: а) изотопные метки, которые могут быть представлены радиоактивными или тяжелыми изотопами; б) магнитные метки (например, магнитные частицы); в) редокс-активные фрагменты; г) оптические красители; ферментативные группы (например, пероксидаза хрена, βгалактозидаза, люцифераза, щелочная фосфатаза); д) биотинилированные группы; и е) предварительно определенные полипептидные антигенные детерминанты, распознаваемые вторичным репортером (например, парные последовательности лейциновой молнии, центры связывания для вторичных антител, домены связывания метала, эпитопные метки и т.д.). В некоторых вариантах исполнения изобретения группа для мечения соединена с антигенсвязывающим белком посредством спейсерной ножки различной длины, что снижает потенциальное стерическое несоответствие. Науке известны различные методы мечения белков.
Специфические метки включают оптические красители, включая, но не ограничиваясь, хромофоры, люминофоры и флуорофоры, причем последние красители специфичны и используются во многих случаях. Флуорофоры могут быть представлены низкомолекулярными флуорофорами, или флуоресцентными белками.
Под флуоресцентной меткой понимается любая молекула, которая может быть выявлена с помощью свойственных ей свойств флуоресценции. Подходящие флуоресцентные метки включают, но не ограничиваются, следующие: флуоресцеин, родамин, тетраметилродамин, эозин, эритрозин, кумарин, метилкумарины, пирен, малазитовая зелень, стильбен, Lucifer Yellow, Cascade BlueJ, техасский красный, IAEDANS, EDANS, BODIPY FL, LC Red 640, Cy 5, Cy 5.5, LC Red 705, Oregon green, красители AlexaFluor (Alexa Fluor 350, Alexa Fluor 430, Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 546, Alexa Fluor 568, Alexa Fluor 594, Alexa Fluor 633, Alexa Fluor 647, Alexa Fluor 660, Alexa Fluor 680), Cascade Blue, Cascade Yellow и Rфикоэритрин (РЕ) (Molecular Probes, Eugene, OR), FITC, родамин и техасский красный (Pierce, Rockford, IL), Cy5, Cy5,5, Cy7 (Amersham Life Science, Pittsburgh, PA). Подходящие оптические красители, включая флуорофоры, описаны в Molecular Probes Handbook by Richard P. Haugland (включено в настоящий документ посредством ссылки).
Подходящие метки, представленные флуоресцентными белками, также включают, но не ограничиваются, следующие: зеленый флуоресцентный белок, включая виды Renilla, Ptilosarcus или Aequorea (Chalfie et al., 1994, Science 263:802-805), EGFP (Clontech Labs., Inc., Genbank Accession Number U55762), синий флуоресцентный белок (BFP, Quantum Biotechnologies, Inc., Quebec, Canada; Stauber, 1998, Biotechniques 24:462-471; Heim et al., 1996, Curr. Biol. 6:178-182), обогащенный желтый флуоресцентный белок (EYFP, Clontech Labs., Inc.), люциферазу (Ichiki et al., 1993, J. Immunol. 150:5408-5417), βгалактозидазу (Nolan et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2603-2607) и Renilla (WO 92/15673, WO 95/07463, WO 98/14605, WO 98/26277, WO 99/49019, патенты США № 5292658, 5418155, 5683888,
- 54 031320
5741668, 5777079, 5804387, 5874304, 5876995, 5925558).
Последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие CGRP-антигенсвязывающие белки.
Представлены также нуклеиновые кислоты, кодирующие описанные здесь антигенсвязывающие белки или их фрагменты, включая нуклеиновые кислоты, кодирующие одну или обе цепи антитела, или его фрагмента, производного, мутеина или варианта, полинуклеотиды, кодирующие вариабельные участки тяжелой цепи или только ГВУ, полинуклеотиды, которые можно использовать в качестве зондов при гибридизации, праймеры ПЦР или праймеры для секвенирования для идентификации, анализа, мутирования или амплификации полинуклеотида, кодирующего полипептид, антисмысловые нуклеиновые кислоты для ингибирования экспрессии полинуклеотида или комплементарные последовательности для вышеизложенного. Нуклеиновые кислоты могут иметь любую длину. Они могут содержать, например, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 750, 1000, 1500 или более нуклеотидов и/или состоять из одной или нескольких дополнительных последовательностей, например, регуляторной последовательности, и/или быть частью большей аминокислоты, например, вектором. Нуклеиновые кислоты могут быть одноцепочечными или двухцепочечными и состоять из нуклеотидов РНК и/или ДНК, а также их искусственно синтезированных вариантов (например, нуклеиновых кислот белка).
В табл. 7 представлены типичные последовательности нуклеиновых кислот, кодирующих константный участок тяжелой цепи lgG2, константный участок легкой каппа-цепи и константный участок легкой лямбда-цепи hCL-1. Любой представленный вариабельный участок может быть присоединен к таким константным участкам с образованием полных последовательностей тяжелой и легкой цепей. Однако следует понимать, что такие последовательности константных участков представлены только в качестве отдельных примеров; специалист в данной области наук может использовать другие константные участки, включая константный участок тяжелой цепи lgG1, константные участки тяжелой цепи lgG3 или lgG4, любой из семи константных участков легкой лямбда-цепи, включая hCL-1, hCL-2, hCL-3 и hCL-7; константные участки были модифицированы для улучшения стабильности, экспрессии, возможности производства или других необходимых характеристик и т.п. В некоторых вариантах исполнения изобретения последовательности вариабельных участков соединены с другими последовательностями константных участков, что известно науке. Типичные последовательности нуклеиновых кислот, кодирующих вариабельные участки тяжелой и легкой цепей представлены в табл. 8.
Таблица 7 Типичные последовательности нуклеиновых кислот в константных участках тяжелой и легкой цепей
Тип lgG2 тяжелая цепь
Последовательность нуклеиновых кислот/SEQ ID NO gctagcaccaagggcccatcggtcttccccctggcgccctgctccaggagcacctccgag agcacagcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcg tggaactcaggcgctctgaccagcggcgtgcacaccttcccagctgtcctacagtcctcag gactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcaacttcggcacccagaccta cacctgcaacgtagatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagacagttgagcgc aaatgttgtgtcgagtgcccaccgtgcccagcaccacctgtggcaggaccgtcagtcttcct cttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacgtgcgt ggtggtggacgtgagccacgaagaccccgaggtccagttcaactggtacgtggacggcg tggaggtgcataatgccaagacaaagccacgggaggagcagttcaacagcacgttccgt gtggtcagcgtcctcaccgttgtgcaccaggactggctgaacggcaaggagtacaagtgc aaggtctccaacaaaggcctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaaaccaaag
- 55 031320 ggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgacca agaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctaccccagcgacatcgccgtgg agtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacacctcccatgctgg actccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagc aggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaa gagcctctccctgtctccgggtaaatga [SEQ ID N0:259]
lgG2 легкая каппа-цепь cgtacggtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaa ctgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaag gtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagca aggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgaga aacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaag agcttcaacaggggagagtgttag [SEQ ID N0:260]
lgG2 легкая лямбда-цепь hCL-1 ggtcagcccaaggccaaccccactgtcactctgttcccgccctcctctgaggagctccaag ccaacaaggccacactagtgtgtctgatcagtgacttctacccgggagctgtgacagtggc ctggaaggcagatggcagccccgtcaaggcgggagtggagaccaccaaaccctccaa acagagcaacaacaagtacgcggccagcagctacctgagcctgacgcccgagcagtg gaagtcccacagaagctacagctgccaggtcacgcatgaagggagcaccgtggagaa gacagtggcccctacagaatgttcatag [SEQ ID N0:261]
В табл. 8 представлены типичные последовательности нуклеиновых кислот, кодирующих вариабельные участки тяжелой цепи и легкой цепи, в которые включены различные последовательности CDRL1, CDRL2 и CDRL3 или CDRH1, CDRH2 и CDRH3.
Таблица 8 Типичные последовательности нуклеиновых кислот в вариабельных участках тяжелой и легкой цепей
Ссылка Номер последовательности SEQ ID NO Последовательность нуклеиновых кислот
2E7 VL 175 gacatccagatgacccagtctccatcctccctgtctgcatctgta ggagacagagtcaccatcacttgccgggcaagtcagggcat tagaaatgatttaggctggtttcagcagaaaccagggaaagc ccctaagcgcctgatctatgctgcatccagtttgcaaagtgggg tcccatcaaggttcagcggcagtggatctgggacagaattca ctctcacaatcagcagcctgcagcctgaagatttagcaacttat tactgtctacagtataatatttacccgtggacgttcggccaagg gaccaaggtggaaatcaaa
13H2 VL 176 gacatccagatgacccagtctccatcctccctgtctgcatctgta ggagacagagtcaccatcacttgccgggcaagtcagggcat tagaaaggatttaggctggtatcagcagaaaccagggaaag cccctaagcgcctgatctatggagcatccagtttgcaaagtgg ggtcccatcaaggttcagcggcagtggatctgggacagaatt cactctcacaatcagcagcctgcagcctgaagattttgcaactt attactgtctacagtataatagtttcccgtggacgttcggccaag ggaccaaggtggaaatcaaa
33B5 VL 177 aggtgcagctggtgcagtctggggctgaggtgaagaagtctg gggcctcagtgaaggtctcctgcaaggcttctggatacaccttc accggctactatatgcactgggtgcgacaggcccctggacaa gggcttgagtggatgggatggatcaaccctaacagtggtggc acaaactatgtacagaagtttcagggcagggtcaccatgacc agggacacgtccatcagcacagcctacatggagctgagcag gctgagatctgacgacacggccgtgtattactgtgcgagaaat gagtatagcagtgcctggcccttggggtattggggccaggga accctggtcaccgtctctagt
- 56 031320
4Н6 VL 178 gatattgtgatgactcagtctccactctccctgcccgtcacccct ggagagccggcctccatctcctgcaggtctagtcagagcctc ctgcatagttttgggtacaactatttggattggtacctgcagaag ccagggcagtctccacagctcctgatctatttgggttctaatcgg gcctccggggtccctgacaggttcagtggcagtggatcaggc acagattttacactgaaaatcagcagagtggaggctgaggat gttggggtttattactgcatgcaagctctacaaactccattcactt tcggccctgggaccaaagtggatatcaaa
3C8 VL 179 gatattatactggcccagactccactttctctgtccgtcacccctg gacagccggcctccatctcctgcaagtctagtcagagcctcct gcacagtgctggaaagacctatttgtattggtacctgcagaag ccaggccagcctccacagctcctgatctatgaagtttccaacc ggttctctggagtgccagataggttcagtggcagcgggtcagg gacagatttcacactgaaaatcagccgggtggaggctgagg atgttgggatttattactgcatgcaaagttttccgcttccgctcact ttcggcggagggaccaaggtggagatcaaa
5F5 VL 180 gatattattctgacccagactccactttctctgtccgtcacccctg gacagccggcctccatctcctgcaagtctagtcagagcctcct gcacagtgatggaaagacctatttgtattggtacctgcagaag cccggccagcctccacagctcctgatctatgaagtttccaacc ggttctctggagagccagataggttcagtggcagcgggtcag ggacagatttcacactgaaaatcagccgggtggaggctgag gatgttgggacttattattgcatgcaaagttttccgcttccgctca ctttcggcggagggaccaaggtggagatcaaa
12E8 VL 181 gatattacactgacccagactccactttctctgtccgtctcccctg gacagccggcctccatctcctgcaagtctagtcagagcctcct gcacagtgatggaaggaactatctgtattggtacctgcagaag ccaggccagcctccacagctcctgatctatgaagtgtccaacc ggttctctggactgccagataggttcagtggcagcgggtcagg gacagatttcacactgaaaatcagccgggtggaggctgagg atgttgggatttattactgcatgcaaagttttccgcttccgctcact ttcggcggagggaccaaggtggagatcaaa
32H7 VL 182 gaaattgtgttgacgcagtctccaggcaccctgtctttgtctcca ggggaaagagccaccctctcctgcagggccagtcagagtgtt agcagcggctacttaacctggtaccagcagaaacctggcca ggctcccaggctcctcatctatggtgcatccagcagggccact ggcatcccagacaggttcagtggcagtgggtctgggacaga cttcactctcaccatcagcagactggagcctgaagattttgcag tgtattactgtcagcagtatggtaactcactgtgcaggtttggcc aggggaccaagctggagatcaaa
32H7 CS VL 183 gaaattgtgttgacgcagtctccaggcaccctgtctttgtctcca ggggaaagagccaccctctcctgcagggccagtcagagtgtt agcagcggctacttaacctggtaccagcagaaacctggcca ggctcccagactcctcatctatggtgcatccagcagggccact ggcatcccagacaggttcagtggcagtgggtctgggacgga cttcactctcaccatcagcagactggagcctgaagattttgcag tgtattactgtcagcagtatggtaactcactgagcaggtttggcc aggggaccaagctggagatcaaa
- 57 031320
ЗЗЕ4 Vl 184 gaaatagtgatgacgcagtctccagccaccctgtctgtgtctcc aggggaaagagccaccctctcctgtagggccagtcagagtg ttcgcagcaatttagcctggtaccagcagaaacctggccagg ctcccaggctcctcattcatgatgcatcccccaggaccgctggt atcccagccaggttcagtggcagtggatctgggacagaattc actctcaccatcaacagcctgcagtctgaagattttgcagtttatt actgtcagcagtataattactggactccgatcaccttcggccaa gggacacgactggagattaaa
32H8 Vl 185 gacatcgtgatgacccagtctccagactccctggctgtgtctct gggcgagagggccaccatcaactgcaagtccagccagagt attttagacagctccaacaatgataactacttagcttggtacca gcagaaaccaggacagcctcctaaactgctcatttactgggc atctacccgggaatccggggtccctgaccgattcagtggcag cgggtctgggacagatttcactctcaccatcagcagcctgcag gctgaagatgtggcagtttattactgtcagcaatattataatactc cattcactttcggccctgggaccaaagtggatatcaaa
1E11 Vl 186 cagtctgtgttgacgcagccgccctcagtgtctgaggccccag gacagaaggtcaccatctcctgctctggaagcagctccaaca ttgggaataattatgtatcctggtaccagcagctcccaggaac agcccccaaactcctcatttatgacaataataagcgaccctca gggattcctgaccgattctctggctccaagtctggcacgtcagc caccctgggcatcaccggactccagactggggacgaggcc gattattactgcggaacatgggatagccgcctgagtgctgtggt tttcggcggagggaccaagctgaccgtccta
4E4 VL 187 cagtctgtgttgacgcagccgccctcagtgtctgcggccccag gacagaaggtcaccatctcctgctctggaagcagctccaaca ttgggaataattatgtatcctggtaccagcagctcccaggaac agcccccaaactcctcatttatgacaataataagcgaccctca gg g attcctg a ccgattctctgg ctccaagtctgg cacgtca a c caccctgggcatcaccggactccagactggggacgaggcc gattattactgcggaacatgggatagccgcctgagtgctgtggt tttcggcggagggaccaagctgaccgtccta
9D4 VL 188 cagtctgtgttgacgcagccgccctcagtgtctgcggccccag gacagaaggtcaccatctcctgctctggaagcagctccaaca ttgggaataattatgtatcctggtaccagcagttcccaggaaca gcccccaaa ctcctcatttatgacaata ata ag eg a ccctca g ggattcctgaccgattctctggctccaagtctggcacgtcagcc accctgggcatcaccggactccagactggggacgaggccg attattactgcggaacatgggatagccgcctgagtgctgtggttt tcggcggagggaccaagctgaccgtccta
12G8 VL 189 cagtctgtgttgacgcagccgccctcagtgtctgcggccccag gacagaaggtcaccatctcctgctctggaagcagctccaaca ttgggaataattatgtatcctggtaccagcagctcccaggaac ag ccccca a a ctcctcatttatg аса ata ata a g eg a ccctca g gg attcctgaccgattctctg gctccaagtctgg cacgtcag c caccctgggcatcaccggactccagactggggacgaggcc gattattactgcggaacatgggatagccgcctgagtgctgtggt tttcggcggagggaccaagctgaccgtccta
- 58 031320
34 ЕЗ VL 190 cagtctgtgttgacgcagccgccctcaatgtctgcggccccag gacagaaggtcaccatctcctgctctggaagcagctccaaca ttgggaataattatgtatcctggtaccagcagctcccaggaac agcccccaaactcctcatttatgacaataataagcgaccctca gggattcctgaccgattctctggctccaagtctggcacgtcagc caccctgggcatcaccggactccagactggggacgaggcc aattactgctgcggaacatgggatatcggcctgagtgtttgggt gttcggcggagggaccaaactgaccgtccta
10Е4 VL 191 cagtctgtgctgactcagccaccctcagcgtctgggacccccg ggcagagggtcaccatctcttgttctggaagcagttccaatatc ggaagtaatactgtgaactggtaccagcagctcccaggaac ggcccccaaactcctcatctatactaataatcagcggccctca ggggtccctgaccgattctctggctccaagtctggcacctcag cctccctggccatcagtggactccagtctgaggatgaggctga tttttactgtgcagcgcgggatgagagcctgaatggtgtggtatt cggcggagggaccaagctgaccgtccta
11D11 VL 11H9 VL 192 cagtctgtgctgactcagccaccctcagcgtctgggacccccg ggcagagagtcaccatctcttgttctggaagcagctccaacat cggcagtaattatgtatactggtaccagcagctcccaggagc ggcccccaaactcctcatctttaggaataatcagcggccctca ggggtccctgaccgcttctctggctccaagtctggcacctcagc ctccctggccatcagtgggctccggtccgaggatgaggctgat tattactgtgcagcatgggatgacagcctgagtggttgggtgttc ggcggagggaccaagctgaccgtccta
1H7 VL 193 cagtctgtgctgactcagccaccctcagcgtctgggacccccg ggcagagagtcaccatctcttgttctggaagcagctccaacat cggcagtaattatgtatactggtaccagcagctcccaggagc ggcccccaaactcctcatctttaggagtaatcagcggccctca ggggtccctgaccgattctctggctccaagtctggcacctcag cctccctggccatcagtgggctccggtccgaggatgaggctg attattactgtgcagcatgggatgacagcctgagtggttgggtg ttcggcggagggaccaagctgaccgtccta
9F5 VL 194 cagtctgtgctgactcagtcaccctcagcgtctgggacccccg ggcagagagtcaccatctcttgttctggaagcagctccaacat cggcagtaattatgtatactggtaccagcagctcccaggagc ggcccccaaactcctcatccttaggaataatcagcggccctca ggggtccctgaccgattctctggctccaagtctggcacctcag cctccctgaccatcagtgggctccggtccgaggatgaggctg actattattgtgcagcatgggatgacagcctgagtggttgggtg ttcggcggagggaccaagctgaccgtccta
3B6 VL 195 tcttctgagctgactcaggaccctactgtgtctgtggccttggga cagacagtcaaaatcacatgccaaggagacagcctcagaa gtttttatgcaagctggtaccagcagaagccaggacaggccc ctgtacttgtcttctatggtaaaaacaaccggccctcagggatc ccagaccgattctctggctccagctcaggaaacacagcttcct tgaccatcactggggctcaggcggaagatgaggctgactatt attgtaattcccgggacagcagtgtttaccatctggtactcggc ggagggaccaagctgaccgtccta
- 59 031320
ЗВ6 Vh 196 caggtgcagttggtgcagtctggggctgaggtgaagaagcct ggggcctcagtgaaggtctcctgcaaggcttctggatacacctt caccggctactatatgcactgggtgcgacaggcccctggaca agggcttgagtggatgggatggatcaaccctaacagtggtgg cacaaactatgcacagaagtttcagggcagggtcaccatga ccagggacacgtccatcagcacagcctacatggagctgagc aggctgagatctgacgacacggccgtgtatttctgtgcgagag atcaaatgagtattattatgcttcggggagtttttcccccttactatt acggtatggacgtctggggccaagggaccacggtcaccgtct ctagt
10E4 VH 197 caggtgcagctggtgcagtctggggctgaggtgaagaagcct ggggcctcagtgaaggtctcctgcaaggcttctggatacacctt caccgactactatatgtactgggtgcgacaggcccctggaca agggcttgagtggatgggatggatcagccctaatagtggtgg cacaaactatgcccagaagtttcagggcagggtcaccatgac cagggacacgtctatcagcacagcctacatggagctgagta ggctgagatctgacgacacggccgtgtattactgtgtgagagg aggatatagtggctacgctgggctctactcccactactacggta tggacgtctggggccaagggaccacggtcaccgtctctagt
32H8 VH 198 caggtgcagctggtgcagtctggggctgaggtgaagaagcct ggggcctcagtgaaggtctcctgcaaggcttctggatacacctt caccgcctactatttacactgggtgcgacaggcccctggaca agggcttgagtggatgggatggatcaaccctcacagtggtgg cacaaactatgcacagaagtttcagggcagggtcaccatga ccagggacacgtccatcagcacagcctacatggagctgagc aggctgagatctgacgacacggccgtgttctactgtgcgaga ggaaggcagtggctgggctttgactactggggccagggaac cctggtcaccgtctctagt
- 60 031320
ЗЗВ5 Vh 199 gacatccagatgacccagtctccatcctccctgtctgcatctgta ggagacagagttaccattacttgccgggcaagtcagggcatt agaaatgatttaggctggtatcagcagaaaccagggaaagc ccctaagcgcctgatctatgttgcatccagtttgcaaagtgggg tcccatcaaggttcagcggcagtggatctgggacagaattca ctctcacaatcagcagcctgcagcctgaagattttgcaacttatt actgtctacagtataacacttacccgctcactttcggcggaggg accaaggtggagatcaag
11D11 Vh 200 gaggtacagctggtggagtctgggggaggcttggtaaagcct ggggggtccctcagactctcctgtgcagcctctggattcactttc ggtaacgcctggatgagctgggtccgccaggctccagggaa ggggctggagtgggttggccgtattaaaagcaaaactgatgg tgggacaacagactacgctgcacccgtgaaaggcagattca ccatctcaagagatgattcaaaaaacacgctgtatctgcaaat gaacagcctgaaaaccgaggacacagccgtgtatttctgtac cacagatcggaccgggtatagcatcagctggtctagttactac tactactacggtatggacgtctggggccaagggaccacggtc accgtctctagt
9F5 Vh 201 gaggtgcagctggtggagtctgggggaggcttggtaaagcct ggggggtcccttagactctcctgtgcagcctctggattcactttc agtaacgcctggatgagctgggtccgccaggctccagggaa ggggctggagtgggttggccgtattaaaagcaaaactgatgg tgggacaacagactacactgcacccgtgaaaggcagattca ccatctcaagagatgattcaaaaaacacgctgtatctgcaaat gaatagcctgaaagccgaggacacagccgtgtattactgtac cacagatcggaccgggtatagcatcagctggtctagttactac tactactacggtatggacgtctggggccaagggaccacggtc accgtctctagt
- 61 031320
11Н9 VH 202 gaggtacagctggtggagtctgggggaggcttggtaaagcct ggggggtcccttagactctcctgtgcagcctctggattcactttc ggtaacgcctggatgagctgggtccgccaggctccagggaa ggggctggagtgggttggccgtattaaaagcaaaactgatgg tgggacaacagactacgctgcacccgtgaaaggcagattca ccatctcaagagatgattcaaaaaacacgctgtatctgcaaat gaacagcctgaaaaccgaggacacagccgtgtattactgta ccacagatcggaccgggtatagcatcagctggtctagttacta ctactactacggtatggacgtctggggccaagggaccacggt caccgtctctagt
1H7 Vh 203 gaggtgcagctggtggagtctgggggaggcttggtaaagcct ggggggtcccttagactctcctgtgcagcctctggattcactttc agtaacgcctggatgagctgggtccgccaggctccagggaa ggggctggagtgggttggccgtattaaaagcacaactgatgg tgggacaacagactacgctgcacccgtgaaaggcagattca ccatctcaagagatgattcaaaaaacacgctgtatctgcaaat gaacagcctgaaaaccgaggacacagccgtgtattactgta ccacagatcggaccggatatagcatcagctggtctagttacta ctactactacggtatggacgtctggggccaagggaccacggt caccgtctctagt
13H2 Vh 204 gaggtgcagctggtggagtctgggggaggcctggtcaagcct ggggggtccctgagactctcctgtgcagcctctggatacacctt cagtacctatagcatgaactgggtccgccaggctccagggaa ggggctggagtgggtctcatccattagtagtagtagtagttaca gatattacgcagactcagtgaagggccgattcaccatctccag agacaacgccaagaactcactgtatctgcaaatgagtagcct gagagccgaggacacggctgtgtattactgtgcgagagaag gggtgtctggcagttcgccgtatagcatcagctggtacgacta ctattacggtatggacgtctggggccaagggaccacggtcac cgtctctagt
- 62 031320
2Е7 VH 205 gaggtgcagctattggagtctgggggaggcttggtacagcctg gggagtccctgagactctcctgtgcagcctctgggttcaccttta gcagctatgccatgagctgggtccgccaggctccagggaag gggctggagtgggtctcagctattagtggtagtggtggtcgcac atactacgcagactccgtgaagggccggttcaccatctccag agacaattccaagaacacgctgtatctgcaaatgaatagcct gagagccgaggacacggccgtatattactgtgcgaaagatc aaagggaggtagggccgtatagcagtggctggtacgactact actacggtatggacgtctggggccaagggaccacggtcacc gtctctagt
3C8 VH 12E8 Vh 5F5 Vh 206 caggtgcagctggtggagtctgggggaggcgtggtccagcct gggaggtccctgagactctcctgtgcagcctctggattcacctt cagtagctatggcatgcactgggtccgccaggctccaggcaa ggggctggagtgggtggcagttatttcatatgatggaagtcatg aatcctatgcagactccgtgaagggccgattcaccatctccag agacatttccaagaacacgctgtatctgcaaatgaacagcct gagagctgaggacacggctgtgtatttctgtgcgagagagag gaaacgggttacgatgtctaccttatattactacttctactacggt atggacgtctggggccaagggaccacggtcaccgtctctagt
4E4 v'h 9D4 VH 1E11 VH 207 caggtgcagctggtggaatctgggggaggcgtggiccagcct gggaggtccctgagactctcctgtgcagcctctggattcacctt cagtagctttggcatgcactgggtccgccaggctccaggcaa ggggctggagtgggtggcagttatatcatttgatggaagtatta agtattctgtagactccgtgaagggccgattcaccatctccaga gacaattcaaagaacacgctgtttctgcaaatgaacagcctg cgagccgaggacacggctgtgtattactgtgcgagagatcgg ctcaattactatgatagtagtggttattatcactacaaatactacg gtatggccgtctggggccaagggaccacggtcaccgtctcta gt
- 63 031320
12G8 VH 208 caggtgcagctggtggaatctgggggaggcgtggtccagcct gggaggtccctgagactctcctgtgcagcctctggattcacctt cagtagctttggcatgcattgggtccgccaggctccaggcaag gggctggagtgggtggcagttatatcatttgatggaagtattaa gtactctgtagactccgtgaagggccgattcaccatctccaga gacaattcaaagaacacgctgtttctgcaaatgaacagcctg cgagccgaggacacggctgtgtattactgtgcgagagatcgg ctcaattactatgatagtagtggttattatcactacaaatactacg gtctggccgtctggggccaagggaccacggtcaccgtctcta gt
4Н6 Vh 209 gaggtgcagctggtggagtctgggggaggcttggtaaagcc agggcggtccctgagactctcctgtacagcttctggattcacctt tggtgattatgctatgagctggttccgccaggctccagggaag gggctggagtggataggtttcattagaagcagagcttatggtg ggacaccagaatacgccgcgtctgtgaaaggcagattcacc atctcaagagatgattccaaaaccatcgcctatctgcaaatga acagcctgaaaaccgaggacacagccgtgtatttctgtgcta gaggacggggtattgcagctcgttgggactactggggccagg gaaccctggtcaccgtctctagt
32Н7 VH 210 caggtgcagctggtggagtctgggggaggcgtggtccagcct gggaggtccctgagactctcctgtgcagcgtctggattcacctt cagtagctatggcatgcactgggtccgccaggctccaggcaa ggggctggagtgggtggcagttatatggtatgatggaagtaat aaatactatgcagactccgtgaagggccgattcatcatctcca gagataaatccaagaacacgctgtatctgcaaatgaacagc ctgagagccgaggacacggctgtgtattactgtgcgagagcg gggggtatagcagcagctggcctctactactactacggtatgg acgtctggggccaagggaccacggtcaccgtctctagt
ЗЗЕ4 VH 211 caggtgcagttacagcagtggggcgcaggactgttgaagcct tcggagaccctgtccctcagctgcgctgtctatggtgggtccttc ggtggttactactggagctggatccgccagcccccagggaag gggctggagtggattggggaaatcaatcatagtggaggcac caagtacaacccgtccctcaagagtcgagtcaccatatcagt agacacgtccaagaaccagttctccctgaagctgagctctgtg accgccgcggacacggctgtgtatttctgtgcgagaggcgat gtagtaggtttctttgactattggggccagggaaccctggtcac cgtctctagt
В табл. 9 представлены номера последовательностей типичных нуклеиновых кислот, кодирующих полные тяжелые и легкие цепи, а также вариабельные участки тяжелых и легких цепей типичных изолированных антигенсвязывающих белков, в частности, описанных здесь hCGRP R-связывающих белков.
- 64 031320
Таблица 9 Типичные последовательности нуклеиновых кислот НС, LC, VH и VL
Нуклеиновые кислоты, кодирующие определенные антигенсвязывающие белки или их фрагменты (например, антитело с полной длиной, тяжелую или легкую цепь, вариабельный домен CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2, или CDRL3), могут быть изолированы из В-клеток мышей, которые были иммунизированы CGRP R или его иммуногенными компонентами, например, методом иммунизации с использованием CGRP R полной длины (включающего CRLR и RAMP1), экстрацеллюлярного домена CGRP R (с наличием экстрацеллюлярных доменов CRLR и RAMP1), целых клеток, экспрессирующих CGRP R, мембран, полученных из клеток, экспрессирующих CGRP R, белков слияния, например, Fc с наличием CRLR и RAMP1 (или их экстрацеллюлярных доменов), слитых с Fc, а также с использованием других известных науке методов, например, описанных в примерах 1-3 данного изобретения. Нуклеиновая кислота может быть изолирована с использованием стандартных процедур, например, с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР). Фаговый дисплей является другим примером известного метода, с помощью которого могут быть получены производные антител и другие антигенсвязывающие белки.
В одном подходе полипептиды, являющиеся компонентами отдельного антигенсвязывающего белка, экспрессируются в любой подходящей рекомбинантной системе экспрессии, и такие экспрессируемые полипептиды могут объединяться с образованием молекул антигенсвязывающих белков. Нуклеиновые кислоты в табл. 7-9 представлены только в качестве примера.
По причине дегенерации генетического кода, каждая последовательность полипептида, представленная в табл. 2-5 или в любом другом месте текста данного изобретения, также кодируется большим количеством других последовательностей нуклеиновых кислот, кроме представленных. Специалист в данной области наук оценит, что данная заявка на изобретение содержит соответствующее письменное описание, относящееся, кроме всего прочего, к каждой дегенерирующей нуклеотидной последовательности, кодирующей каждый антигенсвязывающий белок.
- 65 031320
Один из аспектов данного изобретения предусматривает нуклеиновые кислоты, гибридизирующие с другими нуклеиновыми кислотами (например, нуклеиновые кислоты, состоящие из нуклеотидной последовательности, перечисленной в табл. 7, 8, 9 и/или SEQ ID NO: 224-258) при соответствующих условиях гибридизации. Методы гибридизации нуклеиновых кислот хорошо известны в науке. См., например, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6. Как указано в данном источнике, умеренно строгие условия гибридизации включают раствор для предварительного промывания, содержащий 5х натрия хлорид/натрия цитрат (SSC), 0,5% додецилсульфата натрия, 1,0 ммоль ЭДТА (рН 8,0), буфер гибридизации, представленный 50% формамидом, 6х SSC, а также температуру гибридизации 55°С (или другие подобные растворы для гибридизации, например, содержащие 50% формамида при температуре гибридизации 42°С) и условия для промывания (60°С при 0,5х SSC, 0,1% додецилсульфата натрия). Более строгие условия гибридизации включают SSC при 45°С, после чего проводится одно или несколько промываний в 0,1х SSC, 0,2% додецилсульфата натрия при 68°С. Кроме того, специалист в данной области наук может манипулировать условиями гибридизации и/или промывания для увеличения или уменьшения строгости гибридизации, например, нуклеиновые кислоты, содержащие нуклеотидные последовательности, идентичные как минимум на 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98 или 99% друг другу, остаются, как правило, гибридизированными относительно друг друга.
Основные параметры, влияющие на выбор условий гибридизации, а также руководство по организации подходящих условий описаны, например, Sambrook, Fritsch, и Maniatis (2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., см. выше; и Current Protocols in Molecular Biology, 1995, Ausubel et al., eds., John Wiley & Sons, Inc., главы 2.10 и 6.3-6.4), и могут быть с легкостью определены любым специалистом в данной области наук, основываясь, например, на длине и/или составе оснований нуклеиновой кислоты.
Изменения могут быть внесены путем мутации нуклеиновой кислоты, приводя к изменениям в аминокислотной последовательности кодируемого полипептида (например, антитела или его производного). Мутации могут быть включены с использованием любого известного науке метода. В одном варианте исполнения изобретения один или несколько аминокислотных остатков изменены с помощью, например, протокола сайт-специфического мутагенеза. В другом варианте исполнения изобретения один или несколько выбранных случайным образом остатков изменены с помощью, например, протокола случайного мутагенеза. Независимо от способа мутации, мутантный полипептид может экспрессироваться и проходить отбор на предмет наличия желаемой характеристики.
Мутации могут быть включены в нуклеиновую кислоту без значительного изменения биологической активности кодируемого полипептида. Например, можно провести замены нуклеотидов, ведущие к замене остатков аминокислот, не являющихся незаменимыми. С другой стороны, одна или несколько мутаций могут быть включены в нуклеиновую кислоту, и такие мутации могут избирательно изменять биологическую активность кодируемого полипептида. Например, мутация может качественно или количественно изменять биологическую активность. Примеры количественных изменений включают увеличение, уменьшение или отсутствие активности. Примеры качественных изменений включают изменение специфичности антитела относительно антигена. В одном варианте исполнения изобретения нуклеиновая кислота, кодирующая любой описанный антигенсвязывающий белок, может мутировать для изменения аминокислотной последовательности с использованием хорошо известных науке методов молекулярной биологии.
Другой аспект изобретения описывает молекулы нуклеиновых кислот, подходящих для использования в качестве праймеров или зондов гибридизации для определения последовательностей нуклеиновых кислот. Молекула нуклеиновой кислоты может состоять только из фрагмента последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей полную длину полипептида, например, фрагмента, который может использоваться в качестве зонда или праймера, кодирующего активный фрагмент (например, CGRP Rсвязывающий белок) полипептида.
Для определения нуклеиновой кислоты или похожих нуклеиновых кислот, например, кодирующих полипептид транскриптов, могут использоваться зонды, основанные на последовательности нуклеиновой кислоты. Зонд может включать меченую группу, например, радиоизотоп, флуоресцирующее соединение, фермент или кофактор фермента. Такие зонды могут использоваться для идентификации клетки, экспрессирующей полипептид.
Другой аспект изобретения описывает векторы, состоящие из нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид или его фрагмент (например, фрагмент, содержащий один или несколько ГВУ, или один или несколько доменов вариабельных участков). Примеры векторов включают, но не ограничиваются, плазмиды, вирусные векторы, неэписомальные векторы млекопитающих и векторы экспрессии, например, рекомбинантные векторы экспрессии.
Рекомбинантные векторы экспрессии могут состоять из нуклеиновой кислоты в форме, подходящей для экспрессии нуклеиновой кислоты в клетке-хозяине. Рекомбинантные векторы экспрессии включают одну или несколько регулирующих последовательностей, выбранных на основе клеток-хозяев, которые предполагаются использовать для экспрессии, и такие последовательности функционально связаны с
- 66 031320 последовательностью нуклеиновой кислоты, которую необходимо экспрессировать. Регуляторные последовательности включают последовательности, которые могут контролировать основную экспрессию нуклеотидной последовательности в большинстве типов клеток-хозяев (например, энхансер раннего гена SV40, промотор вируса саркомы Рауса и промотор цитомегаловируса), последовательности, контролирующие непосредственную экспрессию нуклеотидной последовательности только в определенных клетках-хозяевах (например, тканеспецифичные регуляторные последовательности, см., Voss et al., 1986, Trends Biochem. Sci. 11:287, Maniatis et al., 1987, Science 236:1237, включено в настоящий документ во всей полноте посредством ссылки), а также последовательности, которые контролируют индуцируемую экспрессию нуклеотидной последовательности в ответ на отдельное лечение или состояние (например, промотор металлотионина в клетках млекопитающих и реагирующий на тетрациклин и/или стрептомицин промотор в системах прокариот и эукариот (см. тот же источник)). Специалист в данной области наук оценит, что структура вектора экспрессии может зависеть от таких факторов, как выбор клеткихозяина, которую необходимо трансформировать, степени экспрессии требуемого белка и т.д. Векторы экспрессии могут быть внедрены в клетки-хозяева с последующей выработкой белков или пептидов, включая белки слияния или пептиды, кодируемые нуклеиновыми кислотами в соответствии с представленным выше описанием.
Другой аспект изобретения описывает клетки-хозяева, в которые были внедрены рекомбинантные векторы экспрессии. Клетка-хозяин может быть представлена прокариотической клеткой (например, B.coli) или эукариотической клеткой (например, клетками дрожжей, насекомого или млекопитающего (например, клетки линии CHO)). Вектор ДНК может быть внедрен в прокариотические или эукариотические клетки посредством стандартных методов трансформации или трансфекции. Известно, что в зависимости от вектора экспрессии и используемого метода трансфекции, для стабильной трансфекции клеток млекопитающих только небольшая часть клеток может включить чужеродную ДНК в свой геном. Для идентификации и выбора таких интегратов, ген, кодирующий необходимый маркер (например, маркер устойчивости к антибиотикам), внедряется, как правило, в клетку-хозяина вместе с интересующим геном. Предпочтительные выбираемые маркеры включают маркеры, придающие устойчивость к лекарственным препаратам, например, G418, гигромицину и метотрексату. Клетки, подвергающиеся стабильному трансфецированию с помощью внедряемых нуклеиновых кислот, могут быть идентифицированы, кроме всего прочего, избирательностью относительно лекарственных препаратов (например, клетки с внедренным геном маркера выживут, в то время как другие клетки погибнут).
Получение антигенсвязывающих белков.
Описанные антитела животного происхождения могут быть получены, например, с помощью любого вырабатывающего антитела животного, например, мыши, кролика, крысы, козы, осла или примата (например, макаки (например, яванской макаки или макаки-резус) или обезьяны (например, шимпанзе)). Антитела животного происхождения могут использоваться, например, в клеточной культуре in vitro и подобных методах, или для любого другого применения при отсутствии иммунного ответа к антителу или его незначительности, или возможности предотвращения, а также в случае, когда такой иммунный ответ не имеет значения или желателен. В определенных вариантах исполнения изобретения антитела могут быть получены путем иммунизации животных с использованием известных науке методов, описанных выше и/или в примерах 1-3 ниже. Примеры описывают получение антител к CGRP R с применением трех разных способов, подразумевающих использование иммуногенов: (i) целые клетки, экспрессирующие целые версии двух основных компонентов CGRP R -RAMP1 и CRLR; (ii) мембранные экстракты из таких клеток; и (iii) растворимый CGRP R, полученный путем коэкспрессии и очистки Nконцевых экспрацеллюлярных доменов CRLR и RAMP1. Антитела могут быть поликлональными, моноклональными или могут быть синтезированы в клетках-хозяевах путем экспрессии рекомбинантной ДНК. Полностью человеческие антитела могут быть получены в соответствии с описанными выше методами иммунизации трансгенных животных, содержащих локусы человеческого иммуноглобулина, или путем выбора из библиотеки фаговых дисплеев с экспрессией набора человеческих антител.
Моноклональные антитела (МА) могут быть получены с использованием целого ряда методов, включая стандартную методологию получения моноклональных антител, например, стандартный метод гибридизации соматических клеток Kohler и Milstein, 1975, Nature 256:495. С другой стороны, могут использоваться и другие методы получения моноклональных антител, например, вирусная или онкогенная трансформация В-лимфоцитов. Одна из подходящих животных систем для получения гибридом представлена мышиной системой, являющейся хорошо известной процедурой. Протоколы иммунизации и методы изоляции иммунизированных спленоцитов для слияния известны науке, а иллюстративные подходы представлены в примерах ниже. Для таких процедур В-клетки иммунизированных мышей, как правило, сливаются с подходящим иммортализированным партнером, например, клеточной линией миеломы мышей. При желании, вместо мышей могут быть иммунизированы крысы или другие животные, и Вклетки таких животных могут быть слиты с клеточный линией миеломы мыши с образованием гибридом. С другой стороны, может использоваться линия клеток миеломы, полученная из другого животного. Процедуры слияния для получения гибридом также широко известны.
Описанные одноцепочечные антитела могут быть образованы путем соединения фрагментов вариа
- 67 031320 бельного домена тяжелой и легкой цепи (Fv-фрагмента) посредством мостика между аминокислотами (короткого пептидного линкера), приводя к образованию одной полипептидной цепи. Такие одноцепочечные Fv (scFv) могут быть получены путем слияния ДНК, кодирующей пептидный линкер, с ДНК, кодирующей два полипептида вариабельных участков (VL и VH). Получаемые полипептиды могут обратно сворачиваться, образуя антигенсвязывающие мономеры, или же могут образовывать мультимеры (например, димеры, тримеры или тетрамеры), в зависимости от длины гибкого линкера между двумя вариабельными доменами (Kortt et al., 1997, Prot. Eng. 10:423; Kortt et al., 2001, Biomol. Eng. 18:95-108). Путем комбинации различных полипептидов, содержащих VL и VH, можно получить мультимерные scFv, связывающиеся с различными антигенными детерминантами (Kriangkum et al., 2001, Biomol. Eng. 18:31-40). Методы, разработанные для получения одноцепочечных антител, включают методы, описанные в патенте США № 4946778; Bird, 1988, Science 242:423; Huston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879; Ward et al., 1989, Nature 334:544, de Graaf et al., 2002, Methods Mol Biol. 178:379-387. Одноцепочечные антитела, полученные из представленных антител, включают, но не ограничиваются, scFv вместе с комбинациями вариабельных доменов вариабельных участков легкой и тяжелой цепи, представленных в табл. 3, или комбинациями вариабельных доменов легкой и тяжелой цепи, которые включают ГВУ (см. табл. 4А и 4В). Представленные здесь антитела, включенные в один подкласс, могут быть заменены на антитела из других подклассов с помощью методов изменения подкласса. Таким образом, антитела к IgG могут быть получены из антител к IgM и наоборот. Подобные методы позволяют получать новые антитела, обладающие антигенсвязывающими свойствами отдельного антитела (исходного антитела), но также обладающие и биологическими свойствами, характерными для изотипа или подкласса антител, отличными от таковых исходного антитела. Могут использоваться методы рекомбинантной ДНК. В таких процедурах может использоваться клонированная ДНК, кодирующая полипептиды отдельного антитела, например, ДНК, кодирующая константный домен антитела требуемого изотипа (см., например, Lantto et al., 2002, Methods Mol. Biol. 178:303-316).
В соответствии с этим, представленные антитела включают антитела, состоящие, например, из комбинаций вариабельного домена (см. выше), и обладающие необходимым изотипом (например, IgA, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgE и IgD), а также фрагменты антител Fab или F(ab')2. Более того, если необходим IgG4, в шарнирный участок также можно включить точечную мутацию (CPSCP-^РРСР), как это описано Bloom et al., 1997, Protein Science 6:407 (включено в настоящий документ посредством ссылки), что поможет избежать тенденции образования дисульфидных мостиков в середине тяжелой цепи, приводящей к гетерогенности антител к IgG4.
Более того, также известны методы получения антител с различными свойствами (например, с разной аффинностью, с которой они связываются с антигеном). Один из таких методов, называемых перестановкой в цепи, включает отображение генного репертуара вариабельного домена иммуноглобулина на поверхности нитевидного бактериофага (часто такой метод называется фаговым дисплеем). Метод перестановки в цепи использовался для получения высокоаффинных антител к гаптен-2-фенилоксазол-5ону, как это описано et al., 1992, BioTechnology 10:779.
В вариабельных участках тяжелых и легких цепей могут быть представлены консервативные модификации, как это описано в табл. 3, или ГВУ, как это описано в табл. 4 А и 4В (с соответствующими модификациями кодирующих нуклеиновых кислот), для получения CGRP R-связывающего белка с определенными желаемыми функциональными и биохимическими характеристиками. Методы получения таких модификаций описаны выше. CGRP-антигенсвязывающие белки могут быть в дальнейшем модифицированы несколькими путями. Например, если они предназначены для использования в терапевтических целях, они могут быть конъюгированы с полиэтиленгликолем (пэгилированы), что продлевает время их полужизни в сыворотке или повышает показатель доставки белка. С другой стороны, V-участок рассматриваемых антител или их фрагментов может быть слит с Fc-фрагментом молекулы другого антитела. Fcфрагмент, используемый для этой цели, может быть модифицирован таким образом, чтобы не связываться с комплементом, снижая вероятность индуцирования лизиса клетки у пациента в случае использования в качестве терапевтического агента белка слияния. Кроме того, рассматриваемые антитела или их функциональные фрагменты могут быть конъюгированы с человеческим сывороточным альбумином для повышения времени полужизни антитела или его антигенсвязывающего фрагмента в сыворотке. Другим подходящим партнером для слияния с антигенсвязывающими белками или их фрагментами является транстиретин (ТТР). ТТР обладает способностью образовывать тетрамер, таким образом, комплекс антитело-ТТР может образовывать мультивалентное антитело, что может повысить его авидность.
С другой стороны, значительные модификации функциональных и/или биохимических характеристик описанных антигенсвязывающих белков могут быть достигнуты путем замен в аминокислотных последовательностях тяжелых и легких цепей, которые значительно отличаются относительно своего эффекта на поддержание (а) структуры молекулярного скелета в области замены, например, в виде спиральной или складчатой конформации, (б) заряда или гидрофобности молекулы в указанном месте, или (в) громоздкости боковой цепи. Замена консервативных аминокислот может включать замену нативного аминокислотного остатка ненативным остатком, обладающим незначительным или не обладающим вообще никаким эффектом на полярность или заряд аминокислотного остатка в данном положении (см.
- 68 031320 табл. 4 выше). Более того, любой нативный остаток в полипептиде также может быть замещен аланином, как это было описано ранее для аланин-сканирующего мутагенеза.
Аминокислотные остатки (консервативных или неконсервативных аминокислот) представленных антител могут быть включены специалистом в данной области путем применения стандартных методов. Для идентификации важных остатков представленных здесь аминокислот, или для повышения или понижения аффинности таких антител относительно человеческого CGRP R, или для модификации аффинности связывания других описанных здесь антигенсвязывающих белков могут использоваться замены аминокислот.
Методы экспрессирования антигенсвязывающих белков.
В данном изобретении также представлены системы экспрессии и их формы в виде плазмид, векторов экспрессии, кассеты транскрипции или экспрессии, состоящие как минимум из одного полинуклеотида, а также клетки-хозяева, включающие такие формы или системы экспрессии.
Представленные здесь антигенсвязывающие белки могут быть получены с использованием любого из целого ряда стандартных методов. Например, CGRP R-антигенсвязывающие белки могут быть получены с помощью рекомбинантных систем экспрессии и любого известного науке метода. См., например, Monoclonal Antibodies, Hybridomas: A New Dimension in Biological Analyses, Kennet et al. (eds.), Plenum Press, New York (1980); и Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow and Lane (eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1988).
Антигенсвязывающие белки могут быть экспрессированы в линиях клеток гибридомы (например, в гибридомах могут экспрессироваться отдельными антитела) или в других линиях клеток, кроме клеток гибридомы. Для трансформации клетки-хозяина млекопитающего, насекомого или микроорганизма могут использоваться векторы экспрессии, кодирующие антитела. Трансформация может быть выполнена с использованием любого известного метода внедрения полинуклеотидов в клетку-хозяина, включая, например, упаковку полинуклеотида в вирус или бактериофаг и трансдукцию клетки-хозяина вектором путем известных науке процедур трансфекции, как это описано, например, в патенте США № 4399216; 4912040; 4740461; 4959455. Оптимальная используемая процедура трансформации будет зависеть от типа клетки-хозяина, подвергаемой трансформации. Методы внедрения гетерологичных полинуклеотидов в клетки млекопитающих широко известны науке и включают, но не ограничиваются, декстранопосредованную трансфекцию, осаждение фосфатом кальция, полибрен-опосредованную трансфекцию, слияние протопластов, электрошоковое открытие клеточных пор, инкапсулирование полинуклеотида(ов) в липосомы, смешивание нуклеиновой кислоты с положительно-заряженными липидами и непосредственная микроинъекция ДНК в ядро.
Рекомбинантные векторы экспрессии обычно включают молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид, состоящий из одного или нескольких следующих компонентов: одного или нескольких описанных здесь ГВУ; константного участка легкой цепи; вариабельного участка легкой цепи; константного участка тяжелой цепи (например, CH1, CH2 и/или CH3); и/или другого каркасного участка CGRP R-антигенсвязывающего белка. Такие последовательности нуклеиновых кислот вставлены в соответствующий вектор экспрессии с помощью стандартных методов лигирования. В одном варианте исполнения изобретения константный участок тяжелой или легкой цепи прикрепляется к С-концу вариабельного участка тяжелой или легкой цепи антитела к CGRP R и лигирован с вектором экспрессии. Вектор обычно выбирается таким образом, чтобы обладать функциональностью во внедренной клеткехозяине (т.е. вектор совместим с механизмами клетки-хозяина, обеспечивая амплификацию и/или экспрессию гена). В некоторых вариантах исполнения изобретения используются векторы, участвующие в анализах комплементации белка-фрагмента с использованием белковых репортеров, таких как дигидрофолатредуктаза (см., например, патент США № 6270964, включено в настоящий документ посредством ссылки). Подходящие векторы экспрессии могут быть приобретены, например, в компаниях Invitrogen Life Technologies или BD Biosciences (ранее называлась Clontech). Другие подходящие векторы для клонирования и экспрессирования антител и фрагментов включают векторы, описанные Bianchi and McGrew, 2003, Biotech. Biotechnol. Bioeng. 84:439-44 (включено в настоящий документ посредством ссылки). Дополнительные векторы экспрессии обсуждаются, например, в Methods Enzymol., vol. 185 (D. V. Goeddel, ed.), 1990, New York: Academic Press.
Как правило, используемые в любой клетке-хозяине векторы экспрессии будут содержать последовательности для плазмид, клонирования и экспрессии экзогенных нуклеотидных последовательностей. Подобные последовательности, собирательно называемые фланкирующими последовательностями, в определенных вариантах исполнения изобретения будут обычно включать одну или несколько следующих нуклеотидных последовательностей: промотор, одна или несколько последовательностей энхансера, точка начала репликации, стоп-кодон транскрипции, полная последовательность интрона, включающая акцепторные и донорские сайты сплайсинга, последовательность, кодирующая лидерную последовательность для секреции полипептида, центр связывания рибосом, последовательность полиаденилирования, полилинкерный участок для вставки нуклеиновой кислоты, кодирующей необходимый полипептид и выбираемый маркерный элемент. Каждая из таких последовательностей обсуждается ниже.
При желании, вектор может содержать кодируемые маркеры последовательности, т.е. олигонук
- 69 031320 леотидную последовательность, расположенную на 5'- или 3'-конце последовательности, кодирующей CGRP R-связывающий белок, олигонуклотидной последовательности, кодирующей полиГис (например, гексаГис) или другой маркер, например FLAG®, HA (гемагглютинин вируса гриппа), или myc, для которого существует представленные на рынке антитела. Такой маркер обычно соединяется с полипептидом в процессе экспрессии полипептида и может служить в качестве средства аффинной очистки или определения CGRP R-связывающего белка в клетке-хозяине. Аффинная очистка может сопровождаться, например, колоночной хроматографией с использованием антител относительно маркеров в качестве матрикса аффинности. По желанию, маркер может в последующем быть удален из очищенного CGRP Rсвязывающего белка с помощью различных методов, например, определенных пептидаз для расщепления связей.
Фланкирующие последовательности могут быть гомологичными (т.е. от одного и того же вида и/или штамма, что и клетка-хозяин), гетерологичными (т.е. из других видов, отличных от вида или штамма клетки-хозяина), гибридными (т.е. комбинацией фланкирующих последовательностей более чем из одного источника), синтетическими или нативными. Таким образом, источником фланкирующей последовательности может служить любой прокариотический или эукариотический организм, любой позвоночный или беспозвоночный организм, или любое растение при условии, что фланкирующая последовательность функциональна и может быть активирована с учетом механизмов клетки-хозяина.
Фланкирующие последовательности, используемые в векторах, могут быть получены с помощью любого из нескольких известных науке методов. Как правило, используемые здесь фланкирующие последовательности в дальнейшем будут идентифицированы путем картирования и/или ферментативного гидролиза рестрикционной эндонуклеазы, и, таким образом, могут быть изолированы из соответствующей ткани-источника с использованием подходящих рестрикционных эндонуклеаз. В некоторых случаях может быть известна полная нуклеотидная последовательность фланкирующей последовательности. Таким образом, фланкирующая последовательность может быть синтезирована с использованием методов, описанных здесь для синтеза или клонирования нуклеиновых кислот.
В зависимости от того, известна ли вся фланкирующая последовательность или ее фрагмент, она может быть получена с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) и/или скрининга геномной библиотеки с использованием подходящего зонда, например, олигонуклеотида и/или фрагмента фланкирующей последовательности, полученного у одного и того же или другого вида. Если фланкирующая последовательность неизвестна, фрагмент ДНК, содержащей фланкирующую последовательность, может быть изолирован из большего фрагмента ДНК, который может включать, например, кодирующую последовательность или даже другой ген или гены. Изолирование может сопровождаться ферментативным гидролизом рестрикционной эндонуклеазы для выработки соответствующего фрагмента ДНК с последующим изолированием с помощью очистки в агарозном геле, использованием хроматографической колонки Qiagen® (Chatsworth, CA) или других методов, известных специалисту. Выбор соответствующих ферментов для данной цели будет очевиден для специалиста в данной области наук.
Точка начала репликации обычно является частью векторов экспрессии прокариотов, приобретенных у компаний, и такие точки являются вспомогательными в амплификации вектора в клетке-хозяине. Если выбранный вектор не содержит точки начала репликации, такая точка может быть химически синтезирована на основе известной последовательности и лигирована в вектор. Например, точка начала репликации из плазмиды pBR322 (New England Biolabs, Beverly, MA) подходит для большинства грамотрицательных бактерий, а вирусы различного происхождения (например, SV40, вирус полиомы, аденовирус, вирус везикулярного стоматита (ВВС) или папилломавирусы, такие как папилломавирус человека или вирус папилломы крупного рогатого скота) могут использоваться для клонирования векторов в клетках млекопитающих. Как правило, компонент точки начала репликации не является необходимым для векторов экспрессии млекопитающих (например, точка начала репликации SV40 часто используется только потому, что также содержит промотор ранних генов вируса).
Стоп-кодон транскрипции обычно располагается на 3'-конце кодирующего участка полипептида и служит для прекращения транскрипции. Как правило, стоп-кодон транскрипции в клетках прокариот представлен фрагментом, содержащим большое количеством Г-Ц, за которым идет последовательность с высоким содержанием Т. В то время как последовательность может быть легко клонирована из библиотеки или даже куплена у коммерческих компаний как часть вектора, она также может быть с легкостью синтезирована с использованием методов синтеза нуклеиновых кислот, например, представленных в тексте данного изобретения.
Ген выборочного маркера кодирует белок, необходимый для выживания и роста клетки-хозяина в выбранной питательной среде. Типичные гены выборочных маркеров кодируют белки, которые (а) придают устойчивости к антибиотикам или другим токсинам, например, ампициллину, тетрациклину или канамицину для прокариотических клеток-хозяев; (б) придает клетке ауксотрофности; или (в) поставляет важные питательные элементы, не доступные в комплексной или используемой среде. Специфические выборочные маркеры представлены геном устойчивости к канамицину, геном устойчивости к ампициллину и геном устойчивости к тетрациклину. Предпочтительно, чтобы использовался и ген устойчивости
- 70 031320 к неомицину в прокариотических и эукариотических клетках-хозяевах.
Другие выборочные гены могут использоваться для амплификации гена, который необходимо экспрессировать. Амплификация представляет собой процесс, когда гены, необходимые для выработки важного для выживания или роста клеток белка, неоднократно повторяются в тандеме с хромосомами успешных поколений рекомбинантных клеток. Примеры подходящих выборочных маркеров для клеток млекопитающих включают дигидрофолатредуктазу (DHFR) и лишенные промотора гены тимидинкиназы.
Трансформанты клеток млекопитающих помещаются в условия выбранного давления, при этом к выживанию адаптируются только те трансформанты, которые содержат в векторе выборочный ген. Выбранное давление устанавливается посредством культивирования трансформированных клеток в условиях, при которых концентрация выбранного агента в среде с успехом повышается, приводя, таким образом, к амплификации выборочного гена и ДНК, кодирующей другой ген, например, антигенсвязывающего белка, связывающегося с CGRP R. В результате этого с помощью амплифицированной ДНК синтезируются повышенные количества полипептида, например, антигенсвязывающего белка.
Центр связывания рибосом обычно необходим для начала трансляции мРНК и характеризуется последовательностью Шайн-Дальгарно (прокариоты) или последовательностью Козак (эукариоты). Элемент обычно располагается на 3'-конце к промотору и 5'-конце к кодируемой последовательности экспрессируемого полипептида.
В некоторых случаях, например, когда для системы экспрессии эукариотической клетки-хозяина необходимо гликозирование, можно манипулировать с различными пре- и про-последовательностями для улучшения гликозилирования или результата. Например, можно изменить сайт расщепления пептидазы отдельного сигнального пептида или добавить пропоследовательности, которые также могут повлиять на гликозилирование. Конечный белковый продукт может содержать в положении -1 (относительно первой аминокислоты зрелого белка) одну или несколько дополнительных аминокислот, добавленных в ходе экспрессии и не полностью удаленных. Например, конечный белковый продукт может содержать один или два аминокислотных остатка, находящихся в сайте расщепления пептидазы и прикрепленных к N-концу. С другой стороны, использование определенных сайтов расщепления фермента может привести к немного процессированной форме необходимого полипептида, если фермент расщепляет в данном сайте в пределах зрелого полипептида.
Экспрессия и клонирование будут типично включать промотор, распознаваемый организмомхозяином и функционально связанный с молекулой, кодирующей CGRP R-связывающий белок. Промоторы являются нетранскрибируемыми последовательностями, расположенными на 5'-конце относительно старт-кодона структурного гена (как правило, в пределах 100-1000 пар оснований), контролируя транскрипцию структурного гена. Промоторы обычно сгруппированы в один из двух классов: индуцируемых промоторов и конститутивных промоторов. Индуцируемые промоторы инициируют повышенные уровни транскрипции с ДНК при контроле в ответ на определенные изменения в условиях среды, например, присутствие или отсутствие питательных элементов или изменение температуры. С другой стороны, конститутивные промоторы однообразно транскрибируют ген, к которому они функционально привязаны, что, в легкой степени контролирует экспрессию гена. Широко известно большое количество промоторов, распознаваемых целым рядом потенциальных клеток-хозяев. Подходящий промотор функционально связан с ДНК, кодирующей тяжелую цепь или легкую цепь, составляющие CGRP Rсвязывающий белок, путем удаления промотора из ДНК-источника ферментативным гидролизом рестриктазы и вставки необходимой последовательности промотора в вектор.
Подходящие для использования промоторы в дрожжевых клетках-хозяевах также хорошо известны науке. Энхансеры дрожжей используются преимущественно с промоторами дрожжей. Подходящие для использования промоторы в клетках-хозяевах млекопитающих широко известны и включают, но не ограничиваются, промоторы, полученные из геномов вирусов, например, вируса полиомы, вируса оспы кур, аденовируса (например, аденовируса 2), вируса папилломы крупного рогатого скота, вируса саркомы птиц, цитомегаловируса, ретровируса, вируса гепатита В и вируса обезьяны 40 (SV40). Другие подходящие промоторы для млекопитающих включают гетерологичные промоторы млекопитающих, например, промоторы генов теплового шока и промоторы актина.
Дополнительные промоторы, которые могут представлять собой интерес, включают, но не ограничиваются, следующие: ранний промотор SV40 (Benoist and Chambon, 1981, Nature 290:304-310): промотор цитомегаловируса (Thornsen et al., 1984, Proc. Natl. Acad. USA 81:659-663); промотор, находящийся на 3'-конце вируса саркомы Рауса (Yamamoto et al., 1980, Cell 22:787-797); промотор тимидинкиназы вируса герпеса (Wagner et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1444-1445); промоторы и регуляторные последовательности гена металлотионина (Prinster et al., 1982, Nature 296:39-42); прокариотические промоторы, например, промотор бета-лакгамазы (Villa-Kamaroff et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:3727-3731); или tac-промотор (DeBoer et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:21-25). Кроме того, следующие контрольные области транскрипции у животных, обладающих тканеспецифичностью и используемых у трансгенных животных, могут представлять собой отдельный интерес: контрольная область гена эластазы I, активная в ацинарных клетках поджелудочной железы (Swift et al., 1984, Ceil
- 71 031320
38:639-646; Ornitz et al., 1986, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50:399-409; MacDonald, 1987, Hepatology 7:425-515); контрольная область гена инсулина, активная в бета-клетках поджелудочной железы (Hanahan, 1985, Nature 315:115-122); контрольная область гена иммуноглобулина, активная в лимфоидных клетках (Grosschedl et al., 1984, Cell 38:647-658; Adames et al., 1985, Nature 318:533-538; Alexander et al., 1987, Mol. Cell. Biol. 7:1436-1444); контрольная область в вирусе опухоли молочной железы мышей, активная в клетках яичника, молочной железы, лимфоидных и тучных клетках (Leder et al., 1986, Cell 45:485-495); контрольная область гена альбумина, активная в печени (Pinkert et al., 1987, Genes and Devel. 1:268-276); контрольная область гена альфа-фетопротеина, активная в печени (Krumlauf et al., 1985, Mol. Cell. Biol. 5:1639-1648; Hammer et al., 1987, Science 253:53-58); контрольная область гена альфа-1антитрипсина, активная в печени (Kelsey et al., 1987, Genes and Devel. 1:161-171); контрольная область гена бета-глобулина, активная в миелоидных клетках (Mogram et al., 1985, Nature 315:338-340; Kollias et al., 1986, Cell 46:89-94); контрольная область гена основного миелинового белка, активная в олигодендроцитах мозга (Readhead et al., 1987, Cell 48:703-712); контрольная область гена легкой цепи-2 миозина, активная в скелетных мышцах (Sani, 1985, Nature 314:283-286); и контрольная область гена гонадотропин-рилизинг гормона, активная в гипоталамусе (Mason et al., 1986, Science 234:1372-1378).
Последовательность энхансера может быть вставлена в вектор для увеличения транскрипции ДНК, кодирующей легкую цепь или тяжелую цепь, составляющие человеческий CGRP R-связывающий белок высших эукариот. Энхансеры являются действующими в цис-положении элементами ДНК, обычно имеющими в длину 10-300 пар оснований и действующими на промотор для повышения транскрипции. Энхансеры являются относительно независимыми в ориентации и расположении, находясь на 5'- 3'-концах транскрипционной единицы.
Известно несколько последовательностей энхансеров, полученных из генов млекопитающих (например, глобина, эластазы, альбумина, альфа-фетопротеина и инсулина). Однако может использоваться и энхансер, полученный из вируса. Энхансер SV40, энхансер раннего промотора цитомегаловируса, энхансер вируса полиомы и энхансеры аденовируса известны науке и являются типичными энхансерамиэлементами для активации промоторов эукариотов. В то время как энхансер может располагаться в векторе на 5'- или 3'-конце кодирующей последовательности, он обычно располагается на 6'-конце от промотора. Последовательность, кодирующая соответствующую нативную или гетерологичную сигнальную последовательность (лидерную последовательность или сигнальный пептид), может быть включена в вектор экспрессии для способствования экстрацеллюлярной секреции антитела. Выбор сигнального пептида или лидерной последовательности зависит от типа клетки-хозяина, с помощью которой будет получено антитело, а гетерологичная сигнальная последовательность может заменить нативную сигнальную последовательность. Примеры сигнальных пептидов, являющихся функциональными в клетках-хозяевах млекопитающих, включают следующие: сигнальная последовательность для интерлейкина-7 (ИЛ-7), описанная в патенте США № 4965195; сигнальная последовательность для рецептора к интерлейкину-2, описанная Cosman et al., 1984, Nature 312:768; сигнальная последовательность для рецептора к интерлейкину-4, описанная в европейском патенте № 0367566; сигнальный пептид к рецептору I типа интерлейкина-1, описанному в патенте США № 4968607; сигнальный пептид к рецептору II типа интерлейкина-1, описанного в европейском патенте № 0460846.
Представленные векторы экспрессии могут быть сконструированы из исходного вектора, например, представленного на рынке. Такие векторы могут содержать или не содержать все желаемые фланкирующие последовательности. Если в векторе отсутствует одна или несколько фланкирующих и описанных здесь последовательностей, они могут быть получены индивидуально и лигированы в вектор. Методы, используемые для получения каждой фланкирующей последовательности, широко известны специалисту в данной области наук. После конструирования вектора и встраивания молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей легкую цепь, тяжелую цепь или легкую цепь и тяжелую цепь, образующие CGRP Rантигенсвязывающую последовательность, в соответствующий сайт вектора, полный вектор может быть вставлен в подходящую клетку-хозяина для амплификации и/или экспрессии полипептида. Трансформация вектора экспрессии для антигенсвязывающего белка в выбранной клетке-хозяине может сопровождаться широко известными методами, включая трансфекцию, инфекцию, совместное осаждение кальция фосфатом, электрошоковое открытие клеточных пор, микроинъекцию, липофекцию, диэтиламиноэтилдекстран-опосредованную трансфекцию или другие известные методы. Выбранный метод будет частично зависеть от типа используемой клетки-хозяина. Такие методы и другие подходящие методы хорошо известны специалисту в данной области науки и описаны, например, в Sambrook et al., 2001 (см. выше).
При культивировании в соответствующих условиях, клетка-хозяин синтезирует антигенсвязывающий белок, который впоследствии может быть собран с питательной среды (если клетка-хозяин секретирует его в среду) или непосредственно с продуцирующей его клетки-хозяина (если белок не секретируется в среду). Выбор соответствующей клетки-хозяина будет зависеть от различных факторов, например, необходимого уровня экспрессии, модификаций полипептида, которые желательны или необходимы для активности (например, гликозилирование или фосфорилирование) и легкости сворачивания в биологически активную молекулу.
Линии клеток млекопитающих, подходящие для использования в качестве хозяев, хорошо известны
- 72 031320 науке и включают, но не ограничиваются, иммортализированные линии клеток, представленные в Американской коллекции типовых культур (АТСС), включая, но не ограничиваясь, клетки яичника китайского хомячка (CHO), клетки HeLa, клетки почек новорожденного хомяка (BHK), клетки почек обезьяны (COS), клетки гепатоклеточной карциномы человека (например, Hep G2) и целый ряд других линий клеток. В определенных вариантах исполнения изобретения линии клеток могут отбираться посредством определения, какие линии клеток имеют высокие уровни экспрессии и продуцируют антигенсвязывающие белки с CGRP R-связывающими свойствами. В другом варианте исполнения изобретения линия клеток из числа В-клеток, не вырабатывающих собственные антитела, обладает способностью вырабатывать и секретировать гетерологичные антитела.
Использование антигенсвязывающих белков, связывающихся с человеческим CGRP, в целях диагностики и лечения.
Антигенсвязывающие белки используются при определении CGRP R в биологических образцах и идентификации клеток или тканей, продуцирующих CGRP R. Например, CGRP R-антигенсвязывающие белки могут использоваться в диагностических анализах, например, анализах связывания для определения и/или количественного анализа CGRP R, экспрессируемого в клетке или ткани. Антигенсвязывающие белки, специфически связывающиеся с CGRP R, также могут использоваться в лечении заболеваний, обусловленных CGRP R. Кроме того, CGRP R-антигенсвязывающие белки могут использоваться для ингибирования образования CGRP R комплекса с лигандом CGRP, модулируя, таким образом, биологическую активность CGRP R в клетке или ткани. Примеры активности, которая может быть подвержена модуляции, включают, но не ограничиваются, ингибирование расширение сосудов и/или снижение нейрогенного воспаления. Таким образом, антигенсвязывающие белки, связывающиеся с CGRP R, могут модулировать и/или блокировать взаимодействие с другими связывающими соединениями и, вследствие этого, могут применяться в терапевтических целях при улучшениях состояний заболеваний, обусловленных CGRP R.
Показания.
Заболевание или состояние, обусловленное человеческим CGRP R, включает любое заболевание или состояние, возникновение которого у пациента вызвано, как минимум, частично, взаимодействием CGRP R со своим лигандом CGRP. Степень тяжести заболевания или состояния также может быть повышена или понижена при взаимодействии CGRP R с CGRP. Примеры заболеваний и состояний, которые могут подвергаться лечению с помощью описанных здесь антигенсвязывающих белков, включают головные боли, например, приступообразные головные боли, мигрень, включая вызываемые мигренью головные боли, хроническую боль, сахарный диабет II типа, воспаление, например, нейрогенное воспаление, сердечно-сосудистые расстройства и гемодинамические расстройства, вызванные эндотоксикозом и сепсисом.
В частности, описанные здесь антигенсвязывающие белки могут использоваться для лечения мигрени в качестве острого лечения, начатого после возникновения приступа мигрени, и/или в качестве профилактического лечения, принимаемого, например, ежедневно, еженедельно, один раз в 2 недели, ежемесячно, один раз в 2 месяца, один раз в 2 года и т.д., для предотвращения или снижения частоты возникновения и/или степени тяжести симптомов, например, болевых симптомов, связанных с приступами мигрени.
Методы диагностики.
Описанные здесь антигенсвязывающе белки могут использоваться в диагностических целях для выявления, диагностики или мониторинга заболеваний и/или состояний, обусловленных CGRP R. Также представлены методы для определения присутствия CGRP R в образце с использованием классических и известных науке иммунологических методов (например, Tijssen, 1993, Practice and Theory of Enzyme Immunoassays, Vol. 15 (Eds R.H. Burdon and P.H. van Knippenberg, Elsevier, Amsterdam); Zola, 1987, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, p. 147-158 (CrC Press, Inc.); Jalkanen et al., 1985, J. Cell. Biol. 101:976-985; Jalkanen et al., 1987, J. Cell Biol. 105:3087-3096). Определение CGRP R может проводиться в условиях in vivo или in vitro.
Представленные здесь способы применения в диагностических целях включают использование антигенсвязывающих белков для определения экспрессии CGRP R и связывания лигандов с CGRP R. Примеры методов, используемых для определения присутствия CGRP R, включают иммуноанализы, например, твердофазный иммуноферментный анализ (ИФА) и радиоиммуноанализ (РИА). Для диагностического применения антигенсвязывающий белок будет обычно меченым с использованием определяемой группой мечения. Подходящие группы для мечения включают, но не ограничиваются, следующие: радиоизотопы или радионуклиды (например, 3Н, 14С, 15N, 35S, 90Y, 99Тс, mIn, 125I, 131I), флуоресцентные группы (например, FITC, родамин, люминофоры на основе комплексов лантанидов), ферментативные группы (например, пероксидаза хрена, β-галактозидаза, люцифераза, щелочная фосфатаза), хемилюминесцентные группы, биотинилированные группы или предварительно определенные полипептидные антигенные детерминанты, распознаваемые вторичным репортером (например, парные последовательности лейциновой молнии, центры связывания для вторичных антител, домены связывания метала, эпитопные метки). В некоторых вариантах исполнения изобретения группа для мечения соединена с антиген
- 73 031320 связывающим белком посредством спейсерной ножки различной длины, что снижает потенциальное стерическое несоответствие. Науке известны различные методы мечения белков, которые могут с успехом использоваться.
В другом аспекте изобретения антигенсвязывающий белок может использоваться для идентификации клетки или клеток, экспрессирующих CGRP R. В отдельном варианте исполнения изобретения антигенсвязывающий белок помечен группой для мечения, в результате чего можно определить связывание антигенсвязывающего белка с CGRP R. Еще в одном варианте исполнения изобретения связывание антигенсвязывающего белка с CGRP R определяется в условиях in vivo. Еще в одном варианте исполнения изобретения антигенсвязывающийся белок, связывающийся с CGRP R, изолируется и измеряется с использованием известных науке методов. См., например, Harlow and Lane, 1988, Antibodies: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor (ed. 1991 and periodic supplements); John E. Coligan, ed., 1993, Current Protocols In Immunology New York: John Wiley & Sons.
Другой аспект изобретения предусматривает определение присутствия исследуемой молекулы, которая конкурирует за связывание с CGRP R с отдельным антигенсвязывающим белком. Пример одного такого анализа будет включать определение количества свободного антигенсвязывающего белка в растворе, содержащем определенное количество CGRP R в присутствии или отсутствии исследуемой молекулы. Увеличение количества несвязанного антигенсвязывающего белка (т.е. антигенсвязывающего белка, не связанного с CGRP R) будет указывать на то, что исследуемая молекула способна конкурировать за связывание CGRP R с антигенсвязывающим белком. В одном варианте исполнения изобретения антигенсвязывающий белок подлежит мечению соответствующей группой для мечения. С другой стороны, мечению может подвергаться и исследуемая молекула, а количества свободной исследуемой молекулы подлежат мониторингу в присутствии или отсутствии антигенсвязывающего белка.
Методы лечения: фармацевтический состав, пути введения.
Описаны способы использования антигенсвязывающих белков. В некоторых способах антигенсвязывающий белок вводится пациенту. Антигенсвязывающий белок ингибирует связывание CGRP с человеческим CGRP R.
Также представлены фармацевтические составы, содержащие терапевтически эффективное количество одного или нескольких антигенсвязывающих белков и фармацевтически подходящий разбавитель, носитель, солюбилизатор, эмульгатор, консервант и/или адъювант. Кроме того, включены методы лечения пациента, например от мигрени, путем введения подобного фармацевтического состава. Термин пациент включает пациентов-людей.
Допустимые компоненты рецептуры являются нетоксичными для реципиентов в представленных дозировках и концентрациях. В отдельных вариантах исполнения изобретения представлены фармацевтические составы, включающие терапевтически эффективное количество антигенсвязывающих белков, связывающихся с человеческим CGRP R.
В определенных вариантах исполнения изобретения допустимые компоненты рецептуры являются нетоксичными для реципиентов в представленных дозировках и концентрациях. В определенных вариантах исполнения изобретения фармацевтический состав может включать компоненты рецептуры для модификации, сохранения или консервации, например, относительно рН, осмоляльности, вязкости, прозрачности, цветности, изотоничности, запаха, стерильности, устойчивости, степени растворения или высвобождения, абсорбции или проникновения. В таких вариантах исполнения изобретения подходящие компоненты рецептуры включают, но не ограничиваются, аминокислоты (например, глицин, глутамин, аспарагин, аргинин или лизин); антибактериальные средства; антиоксиданты (например, аскорбиновая кислота, натрия сульфит или натрия гидросульфит); буферы (например, борный, бикарбонатный, TrisHCl, цитратный, фосфатный или буферы других органических кислот); объемообразующие агенты (например, маннит или глицин); хелатообразующие агенты (например, этилендиаминтетрауксусная кислота (EDTA)); комплексообразующие агенты (например, кофеин, поливинилпирролидон, бета-циклодекстрин или гидроксипропил-бета-циклодекстрин); наполнители; моносахариды; дисахариды и другие углеводы (например, глюкоза, манноза или декстрины); белки (например, сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины); красители, ароматизаторы и разбавители; эмульгаторы; гидрофильные полимеры (например, поливинилпирролидон); низкомолекулярные полипептиды; солеобразующие противоионы (например, натрий); консерванты (например, бензалкония хлорид, бензойная кислота, салициловая кислота, тимеросал, фенилэтиловый спирт, метилпарабен, пропилпарабен, хлоргексидин, сорбиновая кислота или пероксид водорода); разбавители (например, глицерин, пропиленгликоль или полиэтиленгликоль); спирты (например, маннит или сорбитол); суспендирующие агенты; сурфактанты или смачивающие агенты (например, плюроники, ПЭГ, сложные эфиры сорбита, полисорбаты, например, полисорбат 20, полисорбат, тритон, трометамин, лецитин, холестерин, тилоксапал); агенты, повышающие устойчивость (например, сахароза или сорбитол); агенты, повышающие тоничность (например, галиды щелочных металлов, предпочтительно натрия или калия хлорид, маннит, сорбит); носители; разбавители; вспомогательные средства и/или фармацевтические адъюванты. См. REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 18 Edition, (A.R. Genrmo, ed.), 1990, Mack Publishing Company.
В определенных вариантах исполнения изобретения оптимальный фармацевтический состав будет
- 74 031320 определяться специалистом в зависимости от, например, предполагаемого пути введения, формы доставки в организм и желаемой дозировки. См., например, REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, выше. В определенных вариантах исполнения изобретения такие составы могут влиять на физическое состояние, устойчивость, скорость высвобождения in vivo и in vivo, клиренс представленных антигенсвязывающих белков. В определенных вариантах исполнения изобретения основной носитель или носитель в фармацевтическом составе может быть на водной или безводной основе. Например, подходящий носитель или носитель может быть представлен водой для инъекций, физиологическим раствором или искусственной спинномозговой жидкостью, которая может дополняться другими компонентами, обычными в составах для парентерального введения. Нейтральный забуференный физиологический раствор или физиологический раствор, смешанный с сывороточным альбумином, в дальнейшем предполагаются как типичные носители. В отдельных вариантах исполнения изобретения фармацевтический состав включает Трис-буфер с рН 7,0-8,5 или ацетатный буфер с рН 4,0-5,5, и в дальнейшем может включать сорбит или подходящий заместитель. В определенных вариантах исполнения изобретения составы антигенсвязывающего белка, связывающегося с человеческим CGRP R, могут быть приготовлены для хранения путем смешивания выбранного состава с желаемой степенью чистоты с дополнительными компонентами смеси (см. REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES выше) в форме лиофилизированной таблетки или водного раствора. Далее, в определенных вариантах исполнения изобретения антигенсвязывающий белок, связывающийся с человеческим CGRP R, может быть представлен в виде лиофилизата с использованием соответствующих вспомогательных средств, например сахарозы.
Фармацевтические составы для парентерального введения могут быть различными. Также могут быть различными и составы для ингаляции или доставки через пищеварительный тракт, например, перорально. Приготовление подобных фармацевтически приемлемых составов должно быть известно специалисту в данной области наук.
Компоненты рецептуры присутствуют преимущественно в концентрациях, допустимых для места введения. В определенных вариантах исполнения изобретения для поддержания состава на уровне физиологического рН или немного пониженного рН (как правило, значение рН находится в интервале 5-8) используются буферы.
Если предусматривается парентеральное введение, терапевтические составы могут быть представлены в форме апирогенного, парентерально приемлемого водного раствора, включающего необходимый белок, связывающийся с человеческим CGRP R, вместе с фармацевтически подходящим носителем. В частности, подходящим носителем для парентерального введения является стерильная дистиллированная вода, в которой антигенсвязывающий белок, связывающийся с человеческим CGRP R, представлен в качестве стерильного, изотонического раствора с надлежащим консервантом. В определенных вариантах исполнения изобретения состав может включать рецептуру необходимой молекулы вместе с агентом, например, инъецируемыми микросферами, биоэродируемыми частицами, полимерными соединениями (например, полимолочная или полигликолевая кислота), гранулами или липосомами, которые могут обеспечить контролируемое или продолжительное высвобождение продукта, доставленного посредством инъекции вещества замедленного всасывания. В определенных вариантах исполнения изобретения также может использоваться гиалуроновая кислота, обладающая эффектом стимуляции длительного высвобождения в системе кровообращения. В определенных вариантах исполнения изобретения могут использоваться имплантируемые устройства ввода препаратов для введения необходимого антигенсвязывающего белка.
Разработаны определенные фармацевтические составы для ингаляции. В некоторых вариантах исполнения изобретения антигенсвязывающие белки, связывающиеся с человеческим CGRP, представлены в виде сухого ингалируемого порошка. В отдельных вариантах исполнения изобретения антигенсвязывающий белок, связывающийся с человеческим CGRP, представлен в виде растворов для ингаляций вместе с пропеллентом для возможности использования в качестве аэрозоля. В определенных вариантах исполнения изобретения растворы могут распыляться. Легочное введение и методы разработки состава более подробно описаны в международной заявке на патент PCT/US94/001875 (включено в настоящий документ посредством ссылки), описывающий легочную поставку химически измененных белков. Некоторые составы могут вводиться перорально. Антигенсвязывающие белки, связывающиеся с человеческим CGRP R, вводятся таким образом, что их состав может включать/исключать носители, которые обычно используются в рецептуре твердых лекарственных форм, например, таблеток и капсул. В определенных вариантах исполнения изобретения может быть разработана капсула для высвобождения активного участка состава в определенном месте желудочно-кишечного тракта; в данном случае биодоступность максимальна, а пресистемный распад сведен к минимуму. Для облегчения абсорбции антигенсвязывающего белка, связывающего с человеческим CGRP R, могут быть включены дополнительные агенты. Также могут быть включены разбавители, ароматизаторы, легкоплавкие воски, растительные масла, лубриканты, суспендирующие агенты, вещества для улучшения распадаемости таблеток и связующие вещества.
Некоторые фармацевтические составы содержат эффективное количество одного или нескольких антигенсвязывающих белков, связывающихся с CGRP R, находящихся в смеси с нетоксичными вспомо
- 75 031320 гательными веществами, подходящими для производства таблеток, при этом для приготовления единичной лекарственной формы таблетки растворяются в стерильной воде или другом подходящем носителе. Подходящие вспомогательные вещества включают, но не ограничиваются, инертные растворители, например, кальция карбонат, натрия карбонат или бикарбонат, лактозу или кальция фосфат, или связующие агенты, например, крахмал, желатин или камедь, или лубриканты, например, магния стеарат, стеариновую кислоту или тальк. Дополнительные фармацевтические составы будут очевидными для специалиста в данной области наук, включая составы, содержащие антигенсвязывающие белки, связывающиеся с человеческим CGRP R, с продленным или контролируемым высвобождением. Методы разработки состава целого ряда форм с продленным или контролируемым высвобождением, включая липосомальные носители, биоэродируемые частицы или поровые гранулы и инъекции вещества замедленного всасывания, широко известны специалисту в данной области наук. См., например, международную заявку на патент PCT/US93/00829 (включено в настоящий документ посредством ссылки), которая описывает контролируемое высвобождение поровых полимерных микрочастиц для доставки фармацевтических составов. Составы с продолжительным высвобождением могут включать полупроницаемые полимерные формы в виде профилированных частиц, например, пленок или микрокапсул. Формы для продолжительного высвобождения могут включать полиэфиры, гидрогели, полилактиды (как это описано в патенте США № 3773919 и заявке на европейский патент ЕР 058481; включенных в настоящий документ посредством ссылки), сополимеры L-глутаминовой кислоты и гамма этил-Ь-глутамата (Siclman et al., 1983, Biopolymers 2:547-556), поли(2-гидроксиэтил-инетакрилата) (Langer et al., 1981, J. Biomed. Mater. Res. 15:167-277 and Langer, 1982, Chem. Tech. 1 2:98-105), этиленвинилацетата (Langer et al., 1981, см. выше) или полиО(-)-3-гидроксимасляной кислоты (европейская заявка на патент EP 133988). Составы с продолжительным высвобождением могут также включать липосомы, которые могут быть получены с помощью любого известного науке метода. См., например, Eppstein et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688-3692; заявки на европейский патент EP 036676; ЕР 088046 и Р 143949 (включено в настоящий документ посредством ссылки).
Фармацевтические составы, используемые для in vivo введения, обычно представлены в виде стерильных препаратов. Стерилизация может сопровождаться фильтрацией через стерильные фильтрующие мембраны. В ходе лиофилизации состава, подобная стерилизация может проводиться до или после лиофилизации и восстановления. Составы для парентерального введения могут храниться в лиофилизированной форме или в форме раствора.
Обычно составы для парентерального введения помещают в контейнер со стерильным портом доступа, например, пакет с раствором для внутривенного введения или флакон с пробкой, поддающейся прокалыванию иглой для подкожного введения.
В определенных вариантах исполнения изобретения клетки, экспрессирующие рекомбинантный антигенсвязывающий белок, представлены в инкапсулированной форме для доставки в организм (см. Invest. Ophthalmol Vis Sci 43:3292-3298, 2002 и Proc. Natl. Acad. Sciences 103:3896-3901, 2006). В определенных вариантах исполнения изобретения антигенсвязывающий белок имеет концентрацию как минимум 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 или 150 мг/мл. Некоторые составы содержат буфер, сахарозу и полисорбат. Пример такого состава может содержать 50-100 мг/мл антигенсвязывающего белка, 5-20 ммоль натрия ацетата, 5-10% в/о сахарозы и 0,002-0,008% в/о полисорбата.
Определенные составы, например, содержат 65-75 мг/мл антигенсвязывающего белка в 9-11 ммоль буфера натрия ацетата, 8-10% в/о сахарозы и 0,005-0,006% в/о полисорбата. рН таких отдельных составов может быть 4,5-6. Другие составы имеют рН 5,0-5,5 (например, рН равен 5,0, 5,2 или 5,4).
Как только фармацевтический состав разработан, он может храниться в стерильных флаконах в виде раствора, суспензии, геля, эмульсии, твердого вещества, кристаллического вещества или в виде дегидрированного или лиофилизированного порошка. Такие составы могут храниться в готовом к использованию виде или в форме (например, лиофилизат), требующей восстановления перед введением. Также предоставляются наборы для получения однократной единицы дозы. Определенные наборы включают один контейнер с сухим белком и второй контейнер с составом на водной основе. В определенных вариантах исполнения изобретения представлены наборы, содержащие одно- и многокамерные предварительно заполненные шприцы (например, шприцы с жидкостью и лиофилизатом). Терапевтически эффективное количество состава, содержащего антигенсвязывающий белок, связывающийся с человеческим CGRP R, которое необходимо ввести, будет зависеть, например, от контекста лечения и его целей. Специалист в данной области оценит, что соответствующие уровни доз для лечения будут варьировать в зависимости, частично, от поставляемой молекулы, показаний для использования антигенсвязывающего белка, связывающегося с человеческим CGRP R, пути введения и размера (вес тела, поверхность тела или размер органа) и/или состояния (возраст и общее самочувствие) пациента. В определенных вариантах исполнения изобретения доктор может титровать дозу и модифицировать путь введения для получения оптимального терапевтического эффекта.
Стандартная доза может варьировать от 1 мкг/кг до 30 мг/кг или более, в зависимости от указанных выше факторов. В отдельных вариантах исполнения изобретения доза может варьировать от 10 мкг/кг до 30 мг/кг, в некоторых случаях от 0,1 до 30 мг/кг, в иных случаях от 0,3 до 20 мг/кг. При некоторых видах
- 76 031320 применения доза составляет от 0,5 до 20 мг/кг. В некоторых случаях антигенсвязывающий белок вводится в дозе 0,3, 0,5, 1, 3, 10 или 20 мг/кг. График введения дозы при определенных режимах лечения составляет 0,3 мг/кг 1 раз в неделю, 0,5 мг/кг 1 раз в неделю, 1 мг/кг 1 раз в неделю, 3 мг/кг 1 раз в неделю, 10 мг/кг 1 раз в неделю или 20 мг/кг 1 раз в неделю.
Частота введения дозы будет зависеть от фармакокинетических параметров отдельного антигенсвязывающего белка, связывающегося с человеческим CGRP R, в используемом составе. Как правило, доктор предписывает введение дозы до тех пор, пока не будет достигнут желаемый эффект. Таким образом, состав может вводиться в виде однократной дозы или в виде двух или более доз (при этом каждая такая доза может содержать или не содержать такое же количество необходимой молекулы) в течение определенного периода, или в виде непрерывной инфузии посредством имплантации устройства или катетера. Подходящие дозировки могут быть установлены посредством использования соответствующих данных о зависимости между дозой и эффектом. В определенных вариантах исполнения изобретения антигенсвязывающие белки могут вводиться пациентам в течение продолжительного периода. Хроническое введение антигенсвязывающего белка сводит к минимуму побочную реакцию иммунной системы или аллергическую реакцию, обычно обусловленную антигенсвязывающими белками, не являющимися полностью человеческими, например, у животного может отмечаться выработка антитела в ответ на человеческий антиген (это может отмечаться в случае выработки не полностью человеческого антитела или антитела животного происхождения у других видов, кроме человека).
Путь введения фармацевтического состава соответствует известным методам, например, он может осуществляться перорально, посредством внутривенной, интраперитонеальной, интрацеребральной (интрапаренхимной), интрацеребровентрикулярной, внутримышечной, внутриглазной, внутриартериальной, интрапортальной или внутриязвенной инъекции, а также с использованием систем длительного высвобождения или имплантируемых устройств. В определенных вариантах исполнения изобретения составы могут вводиться болюсно или с помощью непрерывной инфузии, или с помощью имплантируемого устройства.
Состав также может быть введен локально посредством имплантации мембраны, спонжа или другого подходящего материала, на который абсорбируется или инкапсулируется требуемая молекула. В определенных вариантах исполнения изобретения в случае использования имплантируемого устройства, такое устройство может быть имплантировано в любой подходящий орган или ткань, и доставка необходимой молекулы может осуществляться посредством диффузии, болюсного или непрерывного введения.
Также может быть желательным использование составов антигенсвязывающего белка, связывающегося с человеческим CGRP R в условиях ex vivo. В таких случаях клетки, ткани или органы, которые были извлечены из пациента, подвергаются воздействию фармацевтических составов антигенсвязывающего белка, связывающегося с человеческим CGRP R, после чего клетки, ткани и/или органы имплантируются обратно пациенту.
В частности, антигенсвязывающие белки, связывающиеся с человеческим CGRP R, могут быть доставлены путем имплантации определенных клеток, полученных методом генной инженерии, с использованием описанных здесь способов с целью экспрессии и секретирования полипептида. В определенных вариантах исполнения изобретения такие клетки могут быть представлены животными или человеческими клетками, и могут быть аутологичными, гетерологичными или ксеногенными. В определенных вариантах исполнения изобретения клетки могут быть иммортализированы. В других вариантах исполнения изобретения с целью снижения вероятности иммунного ответа, клетки могут быть инкапсулированы в целях избежания инфильтрации окружающими тканями. Еще в других вариантах исполнения изобретения используемые для инкапсуляции материалы обычно биосовместимые и могут быть представлены полупроницаемыми полимерными вкладышами или мембранами, позволяющими высвобождаться белковому продукту(ам), но предотвращающими разрушение клеток иммунной системой пациента или другими губительными факторами окружающих тканей.
Представленные ниже примеры, включая проведенные эксперименты и достигнутые результаты, приводятся только в иллюстративных целях и не должны рассматриваться как ограничивающие область применения прилагаемой формулы изобретения.
Пример 1. Получение CGRP-рецептора в виде антигенов.
A. Молекулярное клонирование человеческих CRLR и RAMP1.
Человеческие кДНК CRLR (GenBank Accession № U17473; SEQ ID NO: 1) и кДНК RAMP1 (GenBank Accession No. AJ001014; SEQ ID NO: 3) были клонированы в векторы экспрессии клеток млекопитающих pcDNA3.1-Zeo и pcDNA3.1-Hyg (Invitrogen, Carlsbad, СА), соответственно, для трансфекции клеток линии HEK 293EBNA (Invitrogen) как это описано ниже. кДНК hCRLR и кДНК hRAMP1 также были клонированы в вектор pDSRa24 (Kim, H.Y. et al. J. Inv. Derm. Symp. Proc. (2007), 12: 48-49) для трансфекции клеток линии АМ-1 СНО (патент США № 6210924).
B. Стабильно трансфицируемые линии клеток.
1. Стабильная экспрессия человеческого CGRP R в клетках 293EBNA.
Клетки HEK 293EBNA (представлены АТСС или Invitrogen) были засеяны с плотностью 1,5 х106 клеток/100 мм чашку. Спустя 24 ч клетки были котрансфецированы с использованием 66 мкг линеаризо
- 77 031320 ванных ДНК huRAMP1/pcDNA3.1-Hyg и huCRLR/pcDNA3.1-Zeo с FuGene6 (Invitrogen, Carlsbad, СА) с соблюдением предоставленных компанией Invitrogen инструкций. Спустя 2 дня клетки были трипсинизированы и пересеяны в питательную среду, содержащую 400 мкг/мл гигромицина + 250 мкг/мл зеоцина. Спустя две недели полученные устойчивые к действию препаратов колонии были трипсинизированы и объединены в пулы. Пулы были подвергнуты четырехразовой сортировке FACS с помощью Alexa 647меченого CGRP8-37 пептидного аналога (описано ниже). При каждой сортировке отбирались верхние 5% экспрессирующих клеток.
2. Стабильная экспрессия человеческого CGRP R в клетках АМ-1 CHO.
Клетки АМ-1 CHO (бессывороточный адаптированный к питательной среде вариант линии клеток CHO с нехваткой DHFR, описанный Urlaub and Chasm, Proc. Natl. Acad. Sci. 77, 4216 (1980)) были засеяны с плотностью 1,5х106 клеток/100 мм чашка Спустя 24 ч клетки были котрансфецированы с использованием 4 мкг ДНК pDSRa24/huRAMP1 и pDSRa24/huCRLR с FuGene6 (Invitrogen, Carlsbad, СА) с соблюдением предоставленных компанией Invitrogen инструкций. Трансфецированные клетки были трипсинизированы спустя 2 дня после трансфекции и пересеяны в избирательную питательную среду для CHO DHFR, содержащую 10% ФБС без добавления гипоксантина/тимидина. Спустя 2 недели полученные трансфецированные колонии были трипсинизированы и объединены в пулы. Пулы были подвергнуты анализу FACS методом сортировки.
3. Стабильная экспрессия человеческого адреномедуллина (АМ1) в клетках линии HEK 293EBNA.
Клетки 293EBNA были высеяны на чашки 100 мм с плотностью 1,5х106 клеток/чашка в среде DMEM (с высоким содержанием глюкозы) + 5% ФБС + 1% МОС с заменимыми аминокислотами + 1% натрия пируват. На следующий день клетки были котрансфецированы с использованием трансфекционного реагента FuGENE 6 (Roche) и pcDNA3.1/zeocin/huCRLR плюс pcDNA3.1/hygromycin/huRAMP2. Оба вектора ДНК были линеаризированы с помощью FspI. Спустя 48 ч клетки были пересеяны на чашки 100 мм с тремя разными значениями плотности (8х105, 3,2х105 и 8х104 клеток/чашка) и питательной средой, содержащей 200 мкг/мл зеоцина. Среда менялась два раза в неделю. Спустя одну неделю в чашки была добавлена среда, содержащая 200 мкг/мл гигромицина + 200 мкг/мл зеоцина. Спустя две недели с помощью клонзапирающих колец было изолировано 96 колоний. Оставшиеся колонии были собраны в один пул. Клоны и пулы были подвергнуты анализу на предмет своего ответа на стимуляцию агонистом рецептора или форсколина. Некоторые клоны обладали хорошим ответом, а один клон был выбран для использования в последующих экспериментах.
4. Стабильная экспрессия CGRP R яванской макаки в клетках HEK 293EBNA.
Клетки 293EBNA были высеяны на чашки 100 мм с плотностью 1,5х106 клеток/чашка в среде DMEM (с высоким содержанием глюкозы) + 5% ФБС + 1% МОС с заменимыми аминокислотами + 1% натрия пируват. На следующий день клетки были котрансфецированы с использованием FuGENE 6 и pcDNA3.1/zeocin/cynoCRLR плюс pcDNA3.1/hygromycin/cynoRAMP1. Оба вектора были линеаризированы с помощью FspI. Спустя 48 ч клетки были пересеяны в питательную среду, содержащую 200 мкг/мл зеоцина + 400 мкг/мл гигромицина в разведениях 1:20, 1:40, 1:100 и 1:200. Среда менялась два раза в неделю. Спустя две недели с помощью клонзапирающих колец было изолировано 96 трансфецированных колоний. Клоны были проанализированы на предмет своего ответа на стимуляцию лигандом CGRP. Некоторые клоны обладали похожими высокими уровнями ответа, а один клон был выбран для использования в последующих экспериментах.
C. Изоляция клеток с высокой экспрессией CGRP-рецептора.
С использованием данной последовательности был синтезирован пептидный аналог CGRP8-37 (Midwest Bio-Tech Inc. Fishers, IN):
Ac-WVTHRLAGLLSRSGGWRCNFVPTDVGPFAF-nh2 (SEQ ID N0:9)
Пептид был помечен Alexa 647-NHS в соответствии с инструкциями производителя (Molecular Probes, Inc. Cat A 2006). Меченый Alexa 647 CGRP8-37 характеризовался специфическим окрашиванием клеток, трансфецированных CGRP-рецептором, при этом не подвергнутые трансфекции материнские клетки отсутствовали, и такой пептид использовался в качестве реагента для FACS.
Пулы клеток 293EBNA и АМ-1 CHO, трансфецированные huCGRP-рецептором (получение см. выше), были повторно сортированы четыре раза с помощью меченого Alexa 647 пептида CGRP8-37. Клетки с высокой степенью экспрессии были собраны при каждой сортировке, обогащены и после последней сортировки были заморожены в пробирках. Клетки АМ-1 CHO/huCGRP R использовались для иммунизации (как это описано ниже), а клетки 293EBNA/huCGRP R использовались для титрации мышиной сыворотки после иммунизации, а также для связывания супернатанта гибридомы.
D. Получение растворимого CGRP-рецептора.
Растворимые полипептиды CGRP-рецептора, содержащие N-концевые экстрацеллюлярные домены (ЭЦД) человеческого CRLR (SEQ ID NO: 6) и человеческого RAMP1 (SEQ ID NO: 8) были получены с помощью быстрой котрансфекции клеток линии 293 6Е (Durocher, et al., Nucleic Acids Res. 30:E9 (2002)) с векторами, содержащими соответствующие кДНК (SEQ ID NO: 5 или SEQ ID NO: 7) Были внедрены обычно используемые фрагменты (polyHis, Flag, НА и/или Fc) для облегчения секреции и/или после- 78 031320 дующей очистки.
Растворимый гетеродимерный ЭЦД CGRP R был слит с Fc с помощью клонирующей ПЦР с соответствующими праймерами во временный вектор экспрессии рТТ5 (Durocher, et al., см. выше). N-конец ЭЦД-Fc CRLR состоит из N-концевого экстрацеллюлярного домена CRLR (SEQ ID NO: 6), слитого с человеческим IgG1 Fc. ЭЦД-Fc RAMP1 содержит экстрацеллюлярный домен RAMP1 (SEQ ID NO: 8), соединенный с человеческим IgG1 Fc. В обоих случаях имелся линкер, состоящий из пяти последовательных остатков глицина между ЭЦД и Fc.
Растворимый гетеродимерный CGRP-рецептор был экспрессирован путем котрансфекции двух векторов следующим образом: клетки 293-6Е при плотности 1х106 клеток/мл во встряхиваемых колбах были трансфецированы ДНК 0,5 мг/л (hCRLR N-концевой ЭЦД-Fc/pTT5 и huRAMP1 ЭЦД-Fc/pTT5) с 3 мл PEI/мг ДНК в среде Freestyle 293 (Invitrogen). Клетки были культивированы в течение 7 дней в суспензии среды для экспрессии FreeStyie 293 с добавлением 0,1% Pluronic F68 и 50 мкг/мл генетицина, затем были собраны для очистки.
Очистка от кондиционированной среды (КС) проводилась методом буферизации КС с добавлением 50 ммоль Триса, 400 ммоль натрия цитрата и приведении значения рН к 8,5. Забуференная КС затем была подвергнута прохождению через колонку для аффинной хроматографии с белком А с уравновешиванием в 50 ммоль Трис, 400 ммоль натрия цитрата и приведением рН к 8,5. Колонка с Белком А была промыта фосфатно-солевым буфером, и белок слияния Fc были элюирован с 0,1 N НОАс. Пик элюирования включал оба компонента CRLR и RAMP1 при тестировании методом вестерн-блоттинга с использованием индивидуальных антител, специфичных относительно CRLR или RAMP1. Далее LC-MS и Nконцевое секвенирование подтвердили присутствие гетеродимера CRLR:RAMP1 и гомодимера CRLR:CRLR в соотношении примерно 2:3. Было показано, что такой растворимый CGRP-рецептор конкурирует за связывание меченого Alexa647 пептида CGRP8-37 с CGRP-рецептором, экспрессируемым рекомбинантными клетками (установлено в ходе анализа FMAT), но не связывался с лигандом CGRP, как это было показано в тестах компании Biacore. Материал использовался в качестве иммуногена, как это описано в данном примере, несмотря на его гетерогенность и отсутствие связывания с лигандом CGRP.
Е. Получение мембранных экстрактов из рекомбинантных клеток, экспрессирующих CGRPрецептор.
Мембранные экстракты были получены из клеток, экспрессирующих CGRP-рецептор, с использованием методов, описанных Bosse, R. et al., (Journal of Biomolecular Screening, 3(4): 285-292 (1998)). 5 г клеточной пасты было осаждено в 50 мл фосфатно-солевого буфера при 3000 об/мин в течение 10 мин при температуре 4°С, а затем повторно суспендировано в 30 мл холодного лизисного буфера (25 ммоль HEPES, рН 7,4, 3 ммоль MgCl2 плюс одна таблетка смеси ингибиторов протеаз/50 мл производства компании Roche). Лизат был гомогенизирован с помощью Glas-Col (гомогенизатор из тефлона) с ~20 ударами при 5000 об/мин и подвергнут обработке в роторе JA21 при скорости 20000 об/мин в течение 15 мин при температуре 4°С. Этот процесс был повторен еще раз, и полученный осадок был повторно суспендирован в ~1-5 мл буфера для конечного осадка (25 ммоль HEPES, рН 7,4, 3 ммоль MgCl2, 10% (в/о) сахарозы плюс одна таблетка смеси ингибиторов протеаз/50 мл производства компании Roche). Мембранные экстракты были расщеплены путем пропускания через иглы 16 G и 25 G 2-3 раза. Общая концентрация мембранного белка определялась с помощью микропланшентного анализа Microplate BCA Protein Assay (Pierce).
Пример 2. Получение антител к CGRP-рецептору.
А. Иммунизация.
Иммунизация проводилась с использованием следующих форм антигенов CGRP-рецептора, полученных в соответствии с описанием из примера 1: (i) трансфектанты АМ-1 CHO, экспрессирующие человеческие CRLR и RAMP1 полной длины на поверхности клеток, полученных методом котрансфекции клеток линии CHO с человеческими кДНК CRLR полной длины (SEQ ID NO: 1), кодирующими полипептид с последовательностью SEQ ID NO: 2, и кДНК RAMP1 (SEQ ID NO: 3), кодирующими полипептид с последовательностью SEQ ID NO: 4 (ii) мембранный экстракт из клеток, описанных в (i) выше; и (iii) растворимый CGRP-рецептор, полученный методом коэкспрессии и очистки N-концевого ЭЦД CRLR (SEQ ID NO: 6) и экстрацеллюлярного домена (ЭЦД) RAMP1 (SEQ ID NO: 8), как это описано в примере 1.
Животные линии XENOMOUSE были иммунизированы очищенным растворимым белком CGRPрецептора и очищенными растворимыми CGRP R-мембранами, полученными из клеток линии АМ-1 СНО, стабильно экспрессирующих CGRP R одним и тем же образом с использованием доз 10 мкг/мышь и 150 мкг/мышь соответственно. CGRP-мембраны были получены с использованием описанных выше методов.
Последующие бустер-дозы вводились в размере 10 мкг/мышь растворимого CGRP R или 75 мкг очищенных CGRP R-мембран. Животные линии XENOMOUSE также были иммунизированы клетками, экспрессирующими CGRP рецептор с использованием доз 3,4х106 CGRP R транфицированных кле
- 79 031320 ток/мышь и последующих бустер-доз 1,7х106 CGRP R транфицированных клеток/мышь. Проводимые инъекции были представлены комбинациями подкожных инъекций в области основания хвоста и интраперитонеальных инъекций. Иммунизации проводились в соответствии с методами, описанными в патенте США № 7064244 от 19 февраля 2002 г. (включено в настоящий документ посредством ссылки). Адъюванты TiterMax Gold (Sigma; номер по каталогу Т2684), Alum (E.M. Sergent Pulp and Chemical Co., Clifton, NJ, номер по каталогу 1452-250) были приготовлены в соответствии с инструкциями производителя и смешаны в соотношении 1:1 (эмульсия адъюванта:раствор антигена).
Пробы сыворотки отбирались спустя 4-6 недель после первой инъекции, а методом FAC окрашивания рекомбинантных клеток линии 293EBNA, экспрессирующих CGRP-рецептор, были определены специфические титры. Мыши были иммунизированы клетками/мембранами, экспрессирующими CGRP R полной длины или растворимый экстрацеллюлярный домен CGRP R, при этом количество процедур иммунизации составило 11-17 в течение периода от одного до трех с половиной месяцев. Были определены мыши с наибольшим показателем титра сыворотки, которые затем были подготовлены для получения гибридом. Иммунизации проводились в группах из нескольких мышей, как правило, десяти. У каждой группы была отобрана и объединена ткань подколенных и паховых лимфатических узлов и селезенки.
B. Получение моноклональных антител.
Были определены животные с подходящими титрами, из лимфатических узлов которых были отобраны лимфоциты, объединенные, при необходимости, в каждой группе. Лимфоциты были диссоциированы от лимфоидной ткани в подходящей среде (например, модифицированной по способу Дульбекко среде Игла (DMEM), предоставленной Invitrogen, Carlsbad, CA) для получения клеток из тканей с последующим суспендированием в DMEM. В-клетки отбирались и/или обогащались с использованием подходящего метода, а затем сливались с подходящим партнером слияния, например, клетками несекреторной миеломы P3X63Ag8.653 (American Type Culture Collection CRL 1580; Kearney et al., J. Immunol. 123, 1979, 1548-1550).
Лимфоциты были смешаны с клетками партнера слияния в соотношении 1:4. Клеточная смесь была осторожно осаждена центрифугированием при скорости 400 об/мин в течение 4 мин, надосадочная жидкость была слита, и смесь клеток была осторожно перемешана с использованием пипетки 1 мл. Слияние было индуцировано ПЭГ/ДМСО (полиэтиленгликоль/диметилсульфоксид, предоставлен Sigma-Aldrich, St. Louis МО; 1 мл/1000000 лимфоцитов). ПЭГ/ДМСО осторожно добавлялся с медленным встряхиванием в течение 1 мин, затем проводилось перемешивание в течение 1 мин. Затем была добавлена IDMEM (DMEM без глутамина; 2 мл/1000000 В-клеток), после чего проводилось осторожное встряхивание в течение 2 мин с последующим добавлением IDMEM (8 мл/1 000 000 В-клеток) в течение 3 мин. Слившиеся клеток были осторожно осаждены (400 об/мин в течение 6 мин) и суспендированы в 20 мл выбранной среды (например, DMEM, содержащей азасерин и гипоксантин [НА] и другие вспомогательные компоненты при необходимости) на 1000000 В-клеток. Клетки были инкубированы в течение 20-30 мин при температуре 37°С, а затем вторично суспендированы в 200 мл выбранной среды и культивированы в течение трех-четырех дней в колбах Т175 перед посевом в 96 лунок.
Клетки были распределены по микропланшетам с 96 лунками с использованием стандартного метода с целью максимального повышения клональности полученных колоний. Спустя несколько дней культивирования были собраны супернатанты гибридомы, подвергнутые в дальнейшем скринингу, как это описано в примерах ниже, включая подтверждение связывания с человеческим CGRP-рецептором, идентификацию блокирующих антител методом конкурентного связывания с лигандом и оценку перекрестной реактивности с другими рецепторами, относящимися к CGRP-рецептору (например, рецептору адреномедуллина человека). В дальнейшем были отобраны положительные клетки, которые затем были подвергнуты стандартному клонированию и субклонированию. Клональные линии были обогащены в условиях in vitro, в результате чего получены секретируемые человеческие антитела для анализа.
C. Секвенирование выбранных моноклональных антител.
Выбранные субклонированные моноклональные антитела были секвенированы с использованием стандартных методов ОТ-ПЦР. В табл. 2 А представлены аминокислотные последовательности легких цепей типичных описанных здесь антител. В табл. 2В представлены аминокислотные последовательности тяжелых цепей типичных описанных здесь антител.
Аминокислотные последовательности, соответствующие участкам ГВУ секвенированных антител, были выровнены, что в дальнейшем использовалось для группировки клонов по степени подобия.
Выравнивание последовательностей ГВУ легкой цепи клонов, имеющих легкие каппа-цепи, и определенные соответствующие консенсусные последовательности представлены на фиг. 3A и 3B.
Выравнивание последовательностей ГВУ легкой цепи клонов, имеющих легкие лямбда-цепи, и определенные соответствующие консенсусные последовательности представлено на фиг. 4.
Выравнивание последовательностей ГВУ тяжелой цепи типичных представленных здесь антител и определенные соответствующие консенсусные последовательности представлены на фиг. 5А, 5В, 5С, 5D и 5Е.
Определенные консенсусные последовательности типичных, описанных здесь ГАК тяжелой цепи представлены на фиг. 5F.
- 80 031320
Пример 3. Идентификация антител к CGRP-рецептору.
A. Выбор антител, специфически связывающихся с CGRP-рецептором, с помощью FMAT.
Спустя 14 дней культивирования супернатанты гибридомы были подвергнуты скринингу на предмет наличия моноклональных антител к CGRP R с помощью технологии флуорометрического анализа в микрообъеме (FMAT) (Applied Biosystems, Foster City, CA). Супернатанты были подвергнуты скринингу относительно клеток АМ-1 CHO huCGRP R или рекомбинантных клеток HEK 293, которые были трансфецированы человеческим CGRP R, и контрскринингу относительно клеток родительской линии HEK293 (получено в соответствии с описанием из примера 1).
Клетки в среде Freestyle (Invitrogen, Carlsbad, CA) были высеяны в чашки FMAT с 384 лунками в объеме 50 мл/лунка и при плотности 4000 клеток/лунка для получения стабильных трансфектантов, а также при плотности клеток родительской линии 16000 клеток/лунка; клетки были инкубированы в течение ночи при температуре 37°С. Затем было добавлено 10 мкл/лунка супернатанта, и чашки были инкубированы в течение 1 ч при температуре 4°С, после чего было добавлено 10 мкл/лунка вторичного антитела к человеческому IgG-Су5 (Jackson Immunoresearch, West Grove, PA) в концентрации 2,8 мкг/мл (конечная концентрация 400 нг/мл). Затем чашки инкубировались в течение 1 ч при температуре 4°С, после чего определялась флуоресценция с использованием макроконфокального сканера FMAT (Applied Biosystems, Foster City, CA).
При контраскрининге клетки родительской линии АМ-1 CHO или клетки линии HEK 293 были высеяны подобным образом, после чего супернатанты были подвергнуты скринингу с использованием FMAT на таких клетках параллельно с дифференцированием и элиминацией гибридом, связывающихся с белками клеток, но не связывающихся с CGRP-рецептором.
B. Идентификация блокирующих антител путем анализа конкурентного связывания лиганда с использованием FMAT.
Метод конкурентного связывания лиганда был разработан для идентификации антител (в супернатантах гибридомы), связывающих CGRP-рецептор и блокирующих связывание лиганда CGRP. Было приготовлено 384 лунок (Corning Costar, номер по каталогу 3712) с 2 пулами 5000 АМ-1 huCGRP R и 20000 нетрансфецированных клеток CHO-S в каждой лунке. В каждую лунку было добавлено 20 мкл супернатанта гибридомы, содержащего антитела к CGRP R, и микропланшеты были инкубированы в течение 1 ч при комнатной температуре. Затем в каждую лунку было добавлено 10 мкл 2,8 мг/мл пептида Alexa647-CGRP8-37, после чего микропланшеты инкубировали в течение дополнительных 3 ч при комнатной температуре. С помощью клеточной системы определения FMAT 8200 (Applied Biosystems) определялось количество Alexa647-CGRP8-37, связанного с клетками. Выходные данные были представлены в виде числового значения FL1 интенсивности сигнала (более высокое значение FL1 указывает на более высокую интенсивность сигнала) и виде изображения клеток.
Эксперименты включали отрицательный контроль супернатантов гибридомы. Среднее значение FL1, отмечаемое в таких экспериментах с отрицательным контролем, было принято в качестве максимально возможного сигнала для анализа. Экспериментальные супернатанты были сопоставлены с таким максимальным сигналом, после чего для каждой лунки были рассчитан процентный показатель ингибирования (% ингибирования = (1-(FL1 супернатанта гибридомы с антителами к CGRP R/максимальный сигнал FL1)). Обзор данных представлен на фиг. 6. В ходе такого эксперимента супернатанты с антителами к CGRP R тестировались с помощью анализа связывания лиганд-рецептор. Данные были ранжированы с использованием среднего значения процентного показателя ингибирования. 90 супернатантов имели средний показатель ингибирования >25%, из них 31 супернатант имел средний показатель ингибирования >50%, а 7 супернатантов >70%. В табл. 10 ниже представлены сокращенные данные. Образцы № 1-5 иллюстрируют примеры супернатантов гибридомы с антителами к CGRP R, которые ингибировали связывание пептида Alexa647-CGRP8-37 с CGRP-рецептором, а образцы № 536-540 иллюстрируют примеры супернатантов гибридомы с антителами к CGRP R, которые не ингибировали связывание пептида Alexa647-CGRP8-37 с CGRP-рецептором.
- 81 031320
Таблица 10 Типичные , данные, полученные в ходе анализа конкурентного связывания лиганда FMAT
Образец № Эксперимент №1 Эксперимент №2
FL1 Изображ ение % ингибирован ия FL1 Изображ ение % ингибирован ия
1 2264 84% 2585 88%
2 3007 77% 2804 85%
3 3460 Η 72% 2929 84%
4 3650 и 70% 3294 79%
5 3764 Η 69% 3246 80%
536 10412 ш 0% 11142 -17%
537 10413 и 0% 9388 5%
538 10414 0% 9420 4%
539 10415 II 0% 10943 -14%
540 10415 ш 0% 10561 -10%
Основываясь на результатах анализов конкурентного связывания, 30 супернатантов были отобраны для дальнейшего изучения.
Пример 4. Активность специфических блокирующих моноклональных антител к CGRP-рецептору, измеренная в ходе функционального анализа цАМФ.
А. Активность антитела к CGRP-рецептору.
Выбранные антитела к CGRP-рецептору были подвергнуты скринингу в ходе CGRP-рецепторопосредованного цАМФ анализа in vitro для определения свойственной таким антителам активности. Анализ цАМФ в условиях in vitro предполагает использование линии клеток, полученных из нейробластомы человека (SK-N-MC; Spengler, et al. (1973), In Vitro 8: 410)), предоставленных АТСС (АТСС номер НТВ-10; клетки НТВ-10). Клетки НТВ-10 экспрессируют CRLR и RAMP1, образующие CGRPрецептор (L. M. McLatchie et al., 1998). Линия клеток 293EBNA, экспрессирующих рекомбинантные CGRP R яванской макаки, была получена в соответствии с описанием, представленным в примере 1, а линия клеток крысы L6, экспрессирующих крысиный CGRP-рецептор, была предоставлена АТСС (CRL1458).
В ходе скрининга использовался набор для анализа цАМФ LANCE (PerkinElmer, Boston, MA). Анализы проводились на белых микропланшетах с 96 лунками с общим объемом 60 мкл. В день анализа замороженные клетки НТВ-10 были оттаяны при температуре 37°С, затем клетки были промыты один раз используемым для анализа буфером, и 12 мкл клеточной суспензии, содержащей 10000 клеток, было смешано с антителом к цАМФ, меченым Alexa; полученная смесь была внесена в белый микропланшет с 96 лунками с половинным объемом. После добавления 12 мкл антитела к CGRP-рецептору, смесь была инкубирована в течение 30 мин при комнатной температуре. Затем в 12 мкл был добавлен агонист CGRP-рецептора, т.е. человеческий a-CGRP-рецептор (конечная концентрация 1 нмоль), с последующей инкубацией в течение 15 мин при комнатной температуре. После стимуляции человеческим a-CGRP, было добавлено 24 мкл смеси для определения с последующей инкубацией в течение 60 мин при комнатной температуре; затем микропланшеты были изучены с помощью прибора EnVision (PerkinElmer, Boston, MA) при Em665nM. Данные были обработаны и проанализированы с помощью программного обеспечения Prizm (GraphPad Software Inc.) или ActivityBase (IDBS).
На фиг. 7А представлены типичные данные, полученные в соответствии с описанной выше проце
- 82 031320 дурой при использовании линии клеток НТВ-10, экспрессирующих рецептор hCGRP, для трех антител: 3C8, 13Н2 и 1Е11. Данные были нанесены на график зависимости процентного показателя от контроля (ПОК) как функции концентрации антитела (3C8, 13Н2 или 1Е11), и полученная кривая была подогнана относительно стандартных нелинейных регрессионных кривых для получения значений IC50, указанных в нижней части фигуры.
В. Недостаточная активность антитела в родственных рецепторах.
Для определения избирательности исследуемых антител, использовались клетки, экспрессирующие родственные рецепторы АМ1 (клетки HEK 293, экспрессирующие hCRLR+hRAMP2; D.R. Poyner, et al., Pharmacological review, 54:233-246, 2002), AM2 (клетки CHO, экспрессирующие hCRLR+hRAMP3; D. R. Poyner, et al., Pharmacological review, 54:233-246, 2002) или человеческий рецептор амилина AMY1 (клетки MCF-7, экспрессирующие hCTR+hRAMP1; Wen-Ji Chen, et al., Molecular pharmacology, 52: 1164-1175, 1997). Линия клеток HEK293, экспрессирующих АМ1, была получена в соответствии с описанием, представленном в примере 1 выше. Линия клеток CHO, экспрессирующих АМ2, была приобретена у компании EuroScreen (сейчас PerkinElmer, Inc.); линия клеток MCF-7, экспрессирующих человеческий рецептор амилина AMY1 (Zimmermann, et al., Journal of Endocrinology, 423-431, 1997), была приобретена у АТСС (НТВ-22). Типичные результаты, нанесенные на график, представлены на фиг. 7В (клетки hAM1HEK), 7C (клетки hAM2-CHO) и 7D (клетки hAMY-MCF-7). Следует отметить, что ни одно из исследуемых антител не обладало значительной ингибирующей активностью относительно рецепторов hAM1, hAM2 или hAMY1 в рамках исследуемого диапазона.
Подобные эксперименты проводились с использованием рекомбинантных клеток линии HEK, экспрессирующих рецепторы CGRP яванской макаки, и линии клеток крысы L6, экспрессирующих крысиный рецептор CGRP (АТСС). Данные таких исследований, а также дополнительные данные IC50, полученные соответственно описанию, представленному в части А данного примера, приводятся в столбце цАМФ табл. 11 ниже. Следует отметить, что значения IC50 относительно рецепторов CGRP человека и яванской макаки представлены в наномолярном диапазоне, в то время как показатели активности относительно крысиного рецептора CGRP и человеческих рецепторов АМ1, АМ2 и AMY1, а также линии клеток MCF7, экспрессирующих кальцитонин (данные не приводятся) составляют более 1 мкмоль. Разница между значениями IC50 для человеческого рецептора CGRP, человеческих рецепторов АМ1, АМ2, рецепторов амилина и кальцитонина указывает на высокую степень избирательности таких антител относительно CGRP-рецептора в сравнении с родственными рецепторами, образованными частично такими же компонентами. Значения IC50, полученные с использованием рецепторов CGRP человека и яванской макаки, были подобными, в то время как исследуемые антитела не характеризовались перекрестным реагированием с крысиным рецептором CGRP.
ТаблицаЛ
Клон Анализ цАМФ Анализ 125|
hCGRP R IC50 (нмоль) CGRP R IC50 яванской макаки (нмоль) CGRP R IC50 крысы (нмоль) hAmylinl IC50 (нмоль) hAM1 IC50 (нмоль ) hAM2 IC50 (нмоль ) CGRP Ki человека (нмоль)
01Е11.2 1,77 2,79 >1000 >1000 >1000 >1000 0,030
01Н7.2 3,27 4,74 >1000 >1000 >1000 >1000 0,079
02А10.1 11,81 17,6 >1000 >1000 >1000 >1000 0,291
02Е7.2 6,30 5,51 >1000 >1000 >1000 >1000 0,117
03А5.1 9,89 28,9 >1000 >1000 >1000 >1000 0,093
03В6.2 2,74 2,22 >1000 >1000 >1000 >1000 0,033
03С8.2 6,66 5,32 >1000 >1000 >1000 >1000 0,044
03Н8.2 10,84 10,6 >1000 >1000 >1000 >1000 0,111
04Е4.2 2,38 3,52 >1000 >1000 >1000 >1000 0,015
04Н6.1 3,78 5,59 >1000 >1000 >1000 >1000 0,052
05F5.1 4,79 4,78 >1000 >1000 >1000 >1000 0,147
07В2.1 8,96 27,7 >1000 >1000 >1000 >1000 0,116
07В3.1 10,2 14,1 >1000 >1000 >1000 >1000 0,127
07F1.1 8,92 10,5 >1000 >1000 >1000 >1000 0,140
08В11.2 10,7 17,0 >1000 >1000 >1000 >1000 0,118
09D4.2 1,40 2,46 >1000 >1000 >1000 >1000 0,023
- 83 031320
09F5.2 3,06 4,44 >1000 >1000 >1000 >1000 0,043
10Е4.2 3,08 3,23 >1000 >1000 >1000 >1000 0,100
11А9.1 16,1 47,8 >1000 >1000 >1000 >1000 0,157
11D11. 1 4,93 3,85 >1000 >1000 >1000 >1000 0,044
11Н9.1 4,56 5,07 >1000 >1000 >1000 >1000 0,057
12Е8.2 2,93 4,13 >1000 >1000 >1000 >1000 0,097
12G8.2 2,14 2,74 >1000 >1000 >1000 >1000 0,017
13D6.2 8,23 11,8 >1000 >1000 >1000 >1000 0,055
13Е2.2 18,3 49,2 >1000 >1000 >1000 >1000 0,128
13Н2.2 1,95 8,41 >1000 >1000 >1000 >1000 0,033
32Н7.1 G 1,93 >1000 >1000 >1000
Пример 5. Анализ радиолигандного связывания CGRP для определения значения Ki блокирующих рецептор антител.
Для анализа радиолигандного связывания в присутствии различных концентраций исследуемых антител и с целью определения соответствующих значений Ki использовались CGRP, меченый 125I (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ), и клеточные мембраны из клеток линии НТВ-10 (PerkinElmer Inc., Waltham, Massachusetts). Анализ связывания CGRP проводился при комнатной температуре в микропланшетах с 96 лунками, содержащих следующее: 110 мкл буфера для связывания (20 ммоль Трис-HCl, рН 7,5, 5,0 ммоль MgSO4, 0,2% БСА (Sigma), 1 таблетка CompleteTM/50 мл буфера (ингибитора протеазы)); 20 мкл исследуемого соединения (10Х); 20 мкл 125I-haCGRP (Amersham Biosciences; 10Х); и 50 мкл суспензии мембран клеток нейробластомы человека (НТВ-10, 10 мкг на лунку, PerkinElmer). Микропланшеты инкубировались при комнатной температуре в течение 2 ч с центрифугированием при скорости 60 об/мин, затем содержимое каждой лунки было отфильтровано через пластины фильтра GF/C, обработанные 0,5% полиэтиленимином (РЭИ) (в течение как минимум 1 ч). Пластины фильтра GF/C промывались шесть раз с помощью ледяного 50 ммоль триса при рН 7,5 и были высушены в термостате при температуре 55°С в течение 1 ч. Нижние части пластин GF/C были герметично запакованы. В каждую лунку было добавлено 40 мкл Microscint™ 20, верхняя часть пластин GF/C была герметически упакована с использованием TopSeal™-A (герметизующая клейкая пленка), и пластины GF/C были подвергнуты анализу с использованием TopCount NXT (Packard). Данные были проанализированы с использованием программного обеспечения Prizm (GraphPad Software Inc.).
Типичные данные и значения Ki, полученные с использованием антител 3C8, 12Н2 и 1Е11, представлены на фиг. 8.
В крайнем правом столбце табл. 11 (см. выше) перечислены значения Ki указанных МА, полученные в ходе анализа конкурентного связывания с использованием радиомеченного 125I-CGRP и мембран клеток линии НТВ-10. Данные показывают, что антитела к рецептору CGRP обладали высокой конкурирующей способностью (при всех суб-наномолярных диапазонах) относительно связывания CGRP.
Пример 6. Анализ связывания FACS для определения значения Kd блокирующих рецептор CGRP антител.
Показатели аффинности МА к CGRP R для CGRP рецепторов, экспрессируемых клетками, были определены с использованием метода FACS. Клетки линии АМ-1 CHO, экспрессирующие huCGRP R, полученные в соответствии с описанным выше способом, были инокулированы на микропланшеты с 96 лунками с плотностью 16000 или 160000 клеток/лунка в среде DMEM, содержащей 10% ФБС, NEAA, PS, L Глу, NaPyr и 0,05% натрия азид. Антитела к рецептору CGRP были подвергнуты титрации в той же самой среде (от 50 нмоль до 1 пмоль) и инкубированы с клетками. После инкубации в течение ночи при температуре 4°С при общем объеме 120 мкл, с использованием качающегося шейкера клетки были промыты два раза с фосфатно-солевым буфером + 2% ФБС, центрифугированы (со сливанием надосадочной жидкости каждый раз). Затем было добавлено 100 мкл/лунку G anti-Hu Fc Cy5 (5 мкг/мл; Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc., West Grove, PA, USA) с 7AAD (5 мкл/лунка) и проведена инкубация в течение 40 мин при температуре 4°С. Клетки были промыты дважды с помощью фосфатно-солевого буфера + 2% ФБС, центрифугированы (со сливанием надосадочной жидкости каждый раз). Затем было добавлено 100 мкл фосфатно-солевого буфера + 2% ФБС и проанализировано с помощью FACS для определения геометрического среднего связывания. Значения Kd были рассчитаны с использованием программного обеспечения KinExA, принимая в качестве отрицательного геометрического среднего при каждой концентрации антитела количество свободного AT (Rathanaswami, et al., Biochemical and Biophysical Research Communications 334 (2005), 1004-1013). Данные, полученные для двух разных концентраций клеток, были проанализированы с помощью анализа n-кривой для определения значений Kd и 95% доверительного интервала, как это описано Rathanaswami, et al., Biochemical and Biophysical Research Communications 334 (2005), 1004-1013. Типичные данные с соответствующими подгонками кривой для антитела 12G8.2 представлены на фиг. 10. В табл. 12 представлены данные для восьми блокирующих антител, по
- 84 031320 лученные в качестве поддержки данного описания. Одно антитело (3B6) было проанализировано двумя различными методами. Соотношение 0,9, полученное для эксперимента с клетками линии 16К, показывает, что концентрация антигена может быть спрогнозирована на уровне 0,9Х Kd, и, следовательно, кривая, полученная в ходе данного эксперимента, представляет собой контрольную кривую Kd. Кроме того, значения Kd, полученные таким образом, находились в нижнем одноразрядном наномолярном диапазоне для всех исследуемых антител.
______________________________________Таблица 12
Анализ кривой N
Kd (нмоль) Значение Kd низкое (нмоль) Значение Kd высокое (нмоль) % ошибки Соотношение 16К
1Н7 1, 9 1, 5 3 3,8 0,001
2Е7 1,5 0,7 3,4 6,3 0,19
ЗВ6 (а) 1,7 1,1 2,7 5,3 0,060
ЗВ6 (Ь) 2,0 1,6 2,6 3,2 0,21
4Е4 1,3 0,9 2,05 3,9 0,16
4Н6 2,4 1,78 4,35 3,8 0,070
9D4 2,5 1,8 4,39 4,3 0,060
12Е8 2,3 1,58 3,36 3,7 0,55
12G8 1,4 0,92 2,21 3,6 0,94
Пример 7. Количественное измерение степени связывания антител, блокирующих рецептор CGRP, с помощью анализа конкурентного связывания BIACORE.
Анализы Biacore (Karlsson, R. et al., Methods; A Companion to Methods in Enzymology, 6: 99-110 (1994) выполнялись следующим образом. Иммобилизация антител к рецептору CGRP относительно поверхности сенсорного чипа СМ5 проводилась в соответствии с инструкциями производителя с использованием непрерывного потока 10 ммоль HEPES, 0,15М NaCl, 3,4 ммоль EDTA, 0,005% Р-20, рН 7,4 (буфер HBS-EP). Карбоксильные группы на поверхностях сенсорного чипа были активированы путем введения 60 мкл смеси, состоящей из 0,2 М №этил-№ (диметиламинопропил)карбодиимида (EDC) и 0,05 М Nгидроксисукцинимида (NHS). Специфические поверхности были получены путем введения 180 мкл антитела к рецептору CGRP, разведенного в 10 ммоль ацетата, рН 4,0 в концентрации 30 мкг/мл. Лишние реакционные группы на поверхностях были инактивированы путем введения 60 мкл 1М этаноламина. Конечные иммобилизированные уровни отдельных антител были следующими:
Антитело Резонансные единицы (РЕ)
11D11 -5,900
ЗВ6 -7,200
4Н6 -8,000
12G8 -7,800
9F5 -6,600
34E3 -3,700
Холостая эталонная поверхность с ложной связью также была представлена на сенсорном чипе. Растворимый рецептор huCGRP в концентрации 100 нмоль был иммобилизирован на сенсорном чипе с помощью одного из шести иммобилизирующих антител, указанных выше (11D11, 3B6, 4Н6, 12G8, 9F5 или 34E3). Затем на иммобилизированный рецептор huCGRP были введены все 20 исследуемых антител к huCGRP R. Если введенное антитело распознает отдельную антигенную детерминанту, относящуюся к данному иммобилизированному антителу, будет отмечаться второе явление связывания. Если антитела распознают те же самые или чрезвычайно подобные антигенные детерминанты, будет наблюдаться только связывание с рецептором huCGRP.
Типичные данные, полученные с использованием сенсорного чипа, покрытого иммобилизированным антителом 3B6, представлены на фиг. 9А. Четыре кривые являются данными, полученными с использованием антител 1B11, 4B4, 2B7 и 12G8 в инъецируемом растворе. Явления, которые в ходе эксперимента представлены буквами, обозначают следующее: А соответствует введению huCGRP R-Fc; В соответствует окончанию введения huCGRP R-Fc; С соответствует введению второго MA; D соответствует окончанию введения второго AT и началу промывания буфером. Следует отметить, что какоелибо указание на любой сигнал связывания любого из введенных антител на иммобилизированной поверхности отсутствует, указывая на то, что четыре введенных антитела с готовностью распознают одну и ту же или очень похожую антигенную детерминанту, что и иммобилизированное антитело. По существу, подобные результаты отмечались для всех исследуемых блокирующих антител, подвергнутых промыванию с пяти поверхностей с иммобилизированным нейтрализующим антителом, указывая на то, что все
- 85 031320 исследуемые блокирующие антитела к рецептору huCGRP распознают одну и ту же или очень похожую и сильно перекрывающуюся антигенную детерминанту (-ы).
В противовес этому, как это частично указано на фиг. 9В, 9С и 9D, четыре исследуемых неблокирующих антитела к рецептору CGRP (32H8, 33B5, 33E4 и 34E3) не конкурировали с 11D11 (данные не приводятся), 3B6 (фиг. 9В), 12G8 (фиг. 9С) и 9F5 (данные не приводятся), но 34E3 было способно конкурировать с 4Н6 (фиг. 9D) и слабо конкурировать с 32Н7 (данные не приводятся). 32Н8 не конкурировало с 3B6, 4Н6, 12G8, 9F5 или неблокирующим антителом 34E3, но 33B5 и 33E4 могли конкурировать с неблокирующим антителом 34E3. Данные для всех блокирующих и неблокирующих антител обобщены в табл. 13 ниже. ОС обозначает отсутствие связывания; + обозначает значительное связывание; Слабое обозначает слабое связывание.
Таблица 13
Иммобилизированные антитела
АТ в растворе 11D11 ЗВ6 4Н6 12G8 9F5 34E3
1Е11 ОС ОС ОС ОС ОС +
1Н7 ОС ОС ОС ОС ОС +
2Е7 ОС ОС ОС ОС ОС +
ЗВ6 ОС ОС ОС ОС ОС +
ЗС8 ОС ОС ОС ОС ОС +
4Е4 ОС ОС ОС ОС ОС +
4Н6 ОС ОС ОС ОС ОС ОС
5F5 ОС ОС ОС ОС ОС +
9D4 ОС ОС ОС ОС ОС +
9F5 ОС ОС ОС ОС ОС +
10Е4 ОС ОС ОС ОС ОС +
11D11 ОС ОС ОС ОС ОС +
11Н9 ОС ОС ОС ОС ОС +
12Е8 ОС ОС ОС ОС ОС +
12G8 ОС ОС ОС ОС ОС +
13Н2 ОС ОС ОС ОС ОС +
32Н7 ОС ОС ОС ОС ОС Слабо е
32Н8 + + + + + +
ЗЗВ5 + + + + + ОС
33 Е4 + + + + + ОС
Как следует из данных, все исследуемые блокирующие или нейтрализующие антитела связываются с одним и тем же участком, что и пять иммобилизированных блокирующих антител, т.е. все исследуемые нейтрализующие антитела связываются с одним и тем же участком молекулы CGRP R. С другой стороны, не блокирующие антитела, как правило, не конкурируют с иммобилизированными блокирующими антителами, указывая на то, что не блокирующие антитела преимущественно связываются с другим участком CGRP R.
Пример 8. Связывание антител к рецептору CGRP с растворимым CGRP рецептором в ходе вестерн-блоттинга.
Три репрезентативные блокирующие антитела к рецептору CGRP исследовались с использованием вестерн-блоттинга на предмет связывания с растворимым CGRP рецептором - белком слияния muFc.
Использовалось 100 нг очищенного CGRP R-muFc (получен и очищен в соответствии с представленным выше описанием для CGRP R-muFc, за исключением того, что использовался мышиный Fc, а линкер между RAMP1 или CRLR ECD и muFc был изменен на GGGGGVDGGGGGV (SEQ ID NO: 213)); данное количество было разведено в ФСБ с буфером для образца в полиакриламидном геле с (разбавленные образцы) или без (неразбавленные образцы) бета-меркаптоэтанола (ДМЭ) в концентрации 13,3%. Затем образец, содержащий ЗМЭ, был прокипячен в течение 4 мин. Разбавленные и неразбавленные образцы были погружены в отдельные гели (4-20% трис-глицин (Invitrogen)) с чередующимися полосами белка CGRP R-Fc и маркеров молекулярного веса (Invitrogen). Гели были подвергнуты разделению электрофорезом на 0,2 мкм фильтрах из нитрилцеллюлозы (Invitrogen). Блоты были промыты трисзабуференным физиологическим раствором + 1% Твин 20 (TBST), а затем блокированы с помощью (TBST) + 5% сухое порошковое молоко в течение 30 мин. Блоты были разрезаны на полоски вдоль линий маркеров молекулярного веса. Каждая полоска с разбавленным или неразбавленным CGRP R-muFc инкубировалась с очищенными антителами к huCGRP R 4Е4, 9F5 или 3B6 (разведение 1:500 в TBST + 5% молоко), антителами козы к huRAMP1 N-20 (1:500; Santa Cruz Biotechnology, Inc), антителами кролика к мышиному IgG-Fc-HRP (1:10 000) (Pierce) или антителами козы к человеческому IgG-Fc-HRP (1:10 000)
- 86 031320 (Pierce). Блоты были инкубированы с антителами в течение 1 ч, вслед за чем проводилось их промывание трижды с помощью TBST + 1% молока в течение 10 мин. Блоты, подвергнутые воздействию антител к huCGRP R, в дальнейшем были инкубированы с антителами козы к мышиному IgG-Fc-HRP (1:10000 в TBST + 1% молоко), а блоты, подвергнутые воздействию антител к huRAMP1 (N-20 поликлональное антитело козы к RAMP1, Santa Cruz Biotech, CA) были инкубированы с антителами кролика к IgG-Fc-HRP козы (1:10000) в течение 20 мин. Блоты были промыты трижды с помощью TBST в течение 15 мин. Блоты с huCGRP R и антителами к huRAMP1 были обработаны реагентом Pierce Supersignal West Pico Detection, а блоты с антителами к IgG-Fc-HRP человека и мыши были подвергнуты обработке стандартным реагентом для определения Pierce в течение 1 мин. Затем блоты были обработаны с помощью пленки для рентгенографии Kodak Biomax MS.
Все три антитела к рецептору CGRP (4E4, 9F5 и 3B6) были способны выявить растворимый CGRP R-muFc (содержащий ЭЦД RAMP1 и ЭЦД CRLR) в условиях отсутствия разбавления, но не в условиях разбавления, указывая на то, что антигенная детерминанта для связывания таких антител к CGRP R была конформационной и чувствительной к дисульфидным связям (3 пары в ЭЦД RAMP1 и 3 пары в Nконцевом ЭЦД CRLR). В отличие от этого, представленное на рынке антитело к RAMP1 N-20 (Santa Cruz Biotech) связывалось с RAMP1 при условии как наличия, так и отсутствия разбавления, указывая на то, что центр связывания с антителом N-20 был преимущественно линейным и не чувствительным к дисульфидным связям.
Пример 9. Связывание блокирующих антител к CGRP рецептору с химерными рецепторами.
CGRP рецепторы, образованные нативным RAMP1 с химерным CRLR или нативным CRLR с химерным RAMP1, использовались для идентификации последовательностей рецептора CGRP, задействованных в связывании антитела. Поскольку все исследуемые блокирующие антитела к человеческому CGRP рецептору не обладали функциональной активностью относительно крысиного рецептора CGRP, химерные компоненты содержали области последовательности крысы в основной последовательности человека. Для анализа связывания методом FACS были получены следующие химеры.
RAMP1 химера № 1 (О28-А34); SEQ ID NO: 217.
Аминокислотные остатки Q28^34 в человеческом RAMP1 были замещены соответствующими последовательностями RAMP1 крысы. Данный участок включал пять аминокислотных остатков, отличающихся между RAMP1 крысы и человека.
RAMP1 химера № 2 (Q43-R53): SEQ ID NO: 218.
Аминокислотные остатки Q43-L53 в человеческом RAMP1 были замещены соответствующими последовательностями RAMP1 крысы. Данный участок включал шесть аминокислотных остатков, отличающихся между RAMP1 крысы и человека.
RAMP1 химера № 3 Щ67-Е78): SEQ ID NO: 219.
Аминокислотные остатки R67-L78 в человеческом RAMP1 были замещены соответствующими последовательностями RAMP1 крысы. Данный участок включал семь аминокислотных остатков, отличающихся между RAMP1 крысы и человека.
CRLR химера № 1 (L24-Q33): SEQ ID NO: 223.
Аминокислотные остатки L24-Q33 в человеческом CRLR были замещены соответствующими последовательностями CRLR крысы. Данный участок включал восемь аминокислотных остатков, отличающихся между CRLR крысы и человека.
На фиг. 11 показано выравнивание аминокислотных последовательностей RAMP1 яванской макаки (SEQ ID NO: 215), человека (SEQ ID NO: 4), крысы (SEQ ID NO: 214) и макаки-резус (SEQ ID NO: 216), вместе с последовательностями RAMP1 химеры № 1 (SEQ ID NO: 217), химеры № (SEQ ID NO: 218) и химеры № 3 (SEQ ID NO: 219). На фиг. 12А и 12В представлено выравнивание аминокислотных последовательностей CRLR человека (SEQ ID NO: 2), яванской макаки (SEQ ID NO: 221), макаки-резус (SEQ ID NO: 222), крысы (SEQ ID NO: 220) и аминокислотной последовательности CRLR химеры № 1 (SEQ ID NO: 223). Клетки линии 293-6Е были кратковременно трансфецированы химерными векторами ДНК CGRP R (CRLR wt + RAMP1 Q28-A34; CRLR wt + RAMP1 Q43-E53; RCLR wt + RAMP1 R67-E78; CRLR L24-Q33 + RAMP wt; CRLR wt + RAMP1 wt; контрольный вектор рТТ5). Спустя 72 ч клетки были собраны, промыты ФСБ + 0,5% БСА и подсчитаны. Каждая трансфецированная линия клеток была повторно суспендирована при разведении 5х105 клеток на 100 мкл ФСБ/БСА. 100 мкл суспензии клеток было распределено аликвотами в каждую лунку круглодонного микропланшета с 96 лунками (Falcon). Клетки были отцентрифугированы при скорости 1200 об/мин в течение 5 мин. Надосадочная жидкость была удалена, вместо нее было внесено 100 мкл, содержащих 0,5 мкг очищенных антител к huCGRP R (1Н7, 2Е7, 3B6, 9F5, 4Н6, 12G8, 3C8, 10Е4, 11D11, 32Н8 или 33B5). Контрольные лунки были обработаны антителом к ДНК huIgG2 (0,5 мкг), пептидом Alexa647-CGRP (0,5 мкг) или только ФСБ/БСА. Клетки были инкубированы на льду в течение 1 ч и затем были промыты дважды с использованием ФСБ/БСА. Клетки были повторно суспендированы в 100 мкл/лунка ФСБ/БСА, содержащих антитело к hug-Fc-FITC (0,5мкг) (за исключением клеток, обработанных Alexa647-CGRP). Клетки были инкубированы на льду в течение 1 ч в темноте и затем были промыты дважды с использованием ФСБ/БСА. Клетки были повторно суспедированы в 200 мкл ФСБ/БСА и проанализированы с использованием FACS Calibur.
- 87 031320
Было протестировано десять репрезентативных блокирующих антител (3B6, 9F5, 4Н6 12,G8, 3C8, 10Е4, 32Н7, 4Е4, 11D11 и 1Н7) и два неблокирующего антитела (32Н8 и 33B5). Репрезентативные данные (для антитела 9F5) представлены на фиг. 13А, 13В и 13С. На фиг. 13А представлено связывание с рецептором CGRP дикого типа; на фиг. 13В представлено связывание с рецепторами CGRP, включающими химеру CRLR L24-Q33, и на фиг. 13С представлено связывание с рецепторами CGRP, включающими химеру RAMP1 Q28-A34. Как и ожидалось, анализ FACS показал, что все 12 антител связываются с контрольным человеческим рецептором CGRP дикого типа. Все 12 антител характеризовались существенно пониженным связыванием с любой из трех химер RAMP1: (Q28-A34), (Q43-E53) и (R67 - Е78). Это может объясняться тем, что (1) уровень экспрессии химерного рецептора был значительно ниже; (2) химера RAMP1 нарушала сворачивание с человеческим CRLR и изменяла конформацию комплекса рецептора, и/или (3) данные три выбранные области на RAMP1 непосредственно задействованы в связывании таких антител с рецептором CGRP.
Когда трассировка FACS была разблокирована для включения только очень небольших популяций экспрессирующих клеток, неблокирующие антитела 33B5 и 32Н8, как оказалось, последовательно связывались в гораздо меньшей степени (гораздо меньшие значения геометрических средних) с химерой RAMP1 Q43-E53 в сравнении с блокирующими антителами, что позволило предположить связывание с областью RAMP1 Q43-E53, могущую играть более важную роль для неблокирующих антител. С другой стороны, 33B5 и 32Н8 в более лучшей степени последовательно связывались с химерой RAMP1 R67-B78 в сравнении с блокирущими антителами, что позволило предположить, что последовательность RAMP1 R67-E78 может играть более важную роль для блокирующих антител.
Все исследуемые антитела к рецептору CGRP относительно хорошо связывались с химерой CRLR (L24-Q33), позволяя предположить, что данный сайт не является важным для связывания блокирующих антител. В заключение следует отметить, что данные указывают на то, что прерывистые участки на RAMP1 - (Q28-A34), (Q43 - Е53) и (R67-E78) - могут быть задействованы в связывании антитела к рецептору CGRP, при этом наибольшую важность для блокирующих антител играет (R67-E78). Как оказалось, N-концевые последовательности (L24-Q33) CRLR не были существенно задействованы в связывании антител к рецептору CGRP, как это было проанализировано с помощью данного метода. Подобный подход не исключает дополнительные центры связывания, имеющие идентичные или похожие последовательности между рецепторами CGRP человека и крысы, которые не были изучены в ходе анализа.
Пример 10. Идентификация антигенсвязывающих детерминант для человеческого CGRP R у нейтрализующих антител к CGRP R в ходе анализа защиты от действия протеазы.
Фрагмент CRLR в зрелой форме слившейся молекулы CRLR-Fc (с удалением сигнального пептида; представлено здесь как SEQ ID NO: 10) содержит 116 аминокислот (предшествующих линкеру глицина) и три большие петлевые структуры, созданные путем образования трех дисульфидных мостиков. Три дисульфидные связи в CRLR представлены Cys1 в положении последовательности 26 (все положения последовательностей CRLR, перечисленные в данном пункте, приводятся в соответствии со зрелой последовательностью, представленной как SEQ ID NO: 10), связанной с Cys3 в положении последовательности 52 (представлено как CRLR C1-C3), Cys2 в положении последовательности 43, связанной с Cys5 в положении последовательности 83 (представлено как CRLR C2-C5), Cys4 в положении последовательности 66, связанной с Cys6 в положении последовательности 105 (представлено как CRLR C4-C6). Фрагмент RAMP1 в зрелой форме слившейся молекулы RAMP1-Fc содержит 91 аминокислоту (SEQ ID NO: 11), предшествующую линкеру глицина, которые также образуют три внутримолекулярных дисульфидных связи. Три дисульфидных связи в RAMP1 представлены Cys1 в положении последовательности 1 (все положения последовательностей RAMP1, перечисленные в данном пункте, приводятся в соответствии со зрелой последовательностью, представленной как SEQ ID NO: 11), связанной с Cys5 в положении последовательности 56 (представлено как CRLR C1-C5), Cys2 в положении последовательности 14, связанной с Cys4 в положении последовательности 46 (представлено как RAMP1 С2-С4), Cys3 в положении последовательности 31, связанной с Cys6 в положении последовательности 78 (представлено как RAMP1 C3-C6).
Участки белка человеческого CGRP, связанные любыми нейтрализующими моноклинальными антителами к CGRP, были идентифицированы путем фрагментации h CGRP R на пептиды с помощью специфических протеаз, а также путем определения последовательности полученных пептидов h CGRP R (т.е. фрагменты областей CRLR и RAMP1, содержащих пептиды с наличием или отсутствием дисульфидных связей). Затем для определения протеолиза hCGRP R в присутствии связывающих моноклональных антител был проведен анализ защиты от действия протеазы. Общий принцип такого анализа состоит в том, что связывание МА с CGRP R может привести к защите определенных сайтов расщепления протеазы, и такая информация может использоваться для определения фрагмента или области CGRP R, с которыми связывается МА. Пептидные гидролизаты были подвергнуты пептидному картированию методом ВЭЖХ; были получены отдельные пики, а пептиды были идентифицированы и картированы с помощью анализов ионизации электрораспылением LC-MS (ESI-LC-MS) и/или N-терминального секвенирования. Все ВЭЖХ анализы для таких исследований проводились с использованием микронасадочных колонок с обращенными фазами С18 (внутренний диметр 2,1 мм х 15 см длина; Zorbax 300SB, 5 мкм,
- 88 031320
Agilent Technologies) для анализа в автономном режиме, а также с использованием капиллярной колонки с обращенными фазами С18 (внутренний диаметр 0,5 мм х 25 см Vydac C18 MS, 5 мкм; The Separation Group) для LC-MS. Пептидное картирование методом ВЭЖХ проводилось с линейным градиентом от 0,05% трифторуксусной кислоты (подвижная фаза А) до 90% ацетонитрила в 0,05% трифторуксусной кислоте. Колонки функционировали в течение 90 мин при скорости потока 0,025 мл/мин (микронасадочная колонка с обращенными фазами для автономных или интерактивных LC-MS анализов) и 0,018 мл/мин (капиллярная колонка для ВЭЖХ для интерактивных LC-MS анализов). Зрелый человеческий CGRP R подвергался расщеплению AspN (расщепление происходит после остатка аспартата и некоторых остатков глутамата на N-конце) путем инкубации 100 мкг CGRP R при 1,0 мг/мл 0,1 М натрия фосфата (рН 6,5) в течение 20 ч при температуре 37°С и 2 мкг AspN.
Хроматография методом ВЭЖХ гидролизатов AspN позволила получить пептидный профиль, представленный на фиг. 14 (введено по 30 мкг каждого образца); на хроматограмме А представлены данные только для CGRP R (концентрация 1 мг/мл); в то же самое время контрольный гидролиз с подобным количеством нейтрализующего антитела к CGRP R, клон 12G8, показывает, что антитело значительно устойчиво к эндопротеиназе AspN (хроматограмма В; соотношение CGRP R: антитело 100:2; 100:7; 100:20, в/в, соответственно). Секвенирование проводилось с использованием интерактивного анализа LC-MS/MS и секвенирование по Эдману проводилось на пиках пептидов, полученных при ВЭЖХ. Интерактивные ESI LC-MS анализы пептидного гидролизата были проведены для определения точной массы и последовательности пептидов, разделенных методом ВЭЖХ. Таким образом, была определена идентичность нескольких пептидов, присутствующих в пептидных пиках при расщеплении AspN (на фиг. 14 пики пронумерованы). В табл. 14 ниже представлены расположения таких пептидных последовательностей в соответствующем компоненте (CRLR или RAMP1) hCGRP R. Заглавная буква С после числа или X представляет собой пептид, идентифицированный как CRLR пептид; заглавная буква R после числа или X представляет собой пептид RAMP1, a Fc обозначает большой и не подвергнутый расщеплению фрагмент, высвободившийся от слившихся молекул CRLR-Fc и RAMP1-Fc.
Таблица 14 Пептиды CRLR and RAMP1, идентифицированные методом пептидного картирования ферментативного гидролиза CGRP R AspN
Пептид Расположение последовательности Дисульфидная связь (кол-во) Интактная масса Происхождение
С1 E111-V122 0 1059 CRLR
С2 D33-A38 0 670 CRLR
СЗ D55-M63 0 880 CRLR
С4 D68-Q71 0 571 CRLR
С5 D55-P67/D86-H110 n.d. CRLR
С6 D8-Y24 0 1938 CRLR
С7 E25-Q32/D48-N54 1 1933 CRLR
с-х 3 n.d. CRLR
R1 D32-A44 0 1622 RAMP1
R2 E12-V20/D45-A51 1 1939 RAMP1
R-X C1-R86 3 10049 RAMP1
Fc 20500 RAMP1/CRLR
На фиг. 15 представлено сравнение эксперимента ферментативного гидролиза AspN (в каждый образец вводилось 30 мкг) в присутствии CGRP R (хроматограмма А) или в присутствии нейтрализирующего антитела 12G8 (хроматограмма В). Весовое соотношение CGRP R:антитело составило 1:1. Несколько пиков (С5, С6 и С7) указывали на понижение высоты пика на хроматограмме В в сравнении с хроматограммой А, в то время как два других пика (С-Х и R-X) указывали на увеличение высоты пика на хроматограмме В в сравнении с хроматограммой А. Подобные пептидные карты также отмечались в случае присутствия различного нейтрализующего антитела к CGRP R (10E4, 3B6, 3C8 или 4Е4) в таком же самом количестве в образце для ферментативного гидролиза, как это наблюдалось на хроматограмме С. Оба пептида С6 и С7 связаны дисульфидными мостиками, которые охватывают большую часть молекулы CRLR, в то время как С5 является пептидом CRLR, не содержащим дисульфидные мостики, при этом CRLR располагается на N-конце молекулы и предшествует пептиду с дисульфидными мостиками С7. Пик С-Х содержит три дисульфидных мостика CRLR с несколькими последовательностями, указывая как минимум на два-три пептида, соединенных вместе дисульфидными мостиками. Тот факт, что пик С-Х имеет повышенную высоту пика в гидролизате CGRP R в присутствии нейтрализующего антитела CGRP, указывает на то, что антитело защищает CGRP R от ферментативного гидролиза AspN в несколь
- 89 031320 ких сайтах расщепления, связанных с Glu25 andAsp55. Как оказалось, антитело не обладает существенным защитным эффектом на Asp33 и Asp72, так как интенсивность пика для пептидов С2 и С4 в целом не снизилась. Таким образом, оказалось, что антитело связывается с участком CRLR, который включает участок с дисульфидными связями CRLR C1-C3 и CRLR C4-C6 вместе с участком петли Cys53 и Cys66.
Картирование AspN hCGRP R также позволило идентифицировать пептид с дисульфидными связями RAMP1 (R2) и пептид без дисульфидных связей RAMP1 (R1) (см. табл. 14 и фиг. 14). В присутствии любого из указанных выше нейтрализующих антител (12G8, 10Е4, 4Е4, 3B6 или 3C8) пептид R-X был восстановлен при значительно высокой интенсивности пика, чем таковая интенсивность, полученная при ферментативном гидролизе при отсутствии антитела в образце. Анализы масс и секвенирование показали, что R-x содержит одну полипептидную цепь, соответствующую последовательности RAMP1 между Cys1 и Arg86. Такие эксперименты указывают на то, что нейтрализующее антитело CGRP R может защищать значительный фрагмент RAMP1 от ферментативного гидролиза AspN.
Для оценки того, является ли защитный эффект протеолиза CGRP R AspN специфичным относительно CGRP R-нейтрализующих (блокирующих) антител (в сравнении с ненейтрализующими антителами к CGRP R), ферментативный гидролиз AspN CGRP R выполнялся в присутствии неродственного контроля (моноклонального антитела), которое не нейтрализует активность CGRP R. Результаты представлены на хроматограмме D (фиг. 15). Не обладающее нейтрализующей активностью антитело не оказывает какого-либо значительного блокирующего эффекта на протеолиз CGRP R AspN; в действительности же профиль пептидной карты (хроматограмма D) практически неразличим в отдельных аспектах от профиля, полученного при ферментативном гидролизе только CGRP R (хроматограмма А).
Эффект защиты от протеолиза зависел от концентрации, внесенной в образец для проведения ферментативного гидролиза. Как видно из фиг. 16, для протеолиза Aspen использовалось фиксированное количество CGRP R в образце (100 мкг) с варьирующими количествами нейтрализующего антитела к CGRP R 4E4 (соотношение CGRP R:антитело в микрограммах, 100:2; 100:7; 100:20, вес:вес, соответственно). Можно наблюдать профиль защиты, степень которой зависела от концентрации антитела.
Взятые вместе, такие данные указывают на то, что блокирующие или нейтрализующие и описанные здесь антитела к CGRP R могут блокировать CGRP R (т.е. оба компонента CRLR и RAMP1) в ходе протеолиза AspN, что позволяет предположить, что блокирующие антитела связываются с CRLR и RAMP1 при связывании с рецептором CGRP. Кроме того, защитный эффект зависит от концентрации антитела. Такие результаты также указывают на то, что нейтрализующие антитела к CGRP R связываются с общими участками на человеческом CGRP R, близко расположенными к сайтам расщепления Asp N.
Пример 11. Представленные на рынке антитела к RAMP1 и CRLR в ходе функционального анализа цАМФ.
Представленные на рынке антитела относительно одного из компонентов (RAMP1 или CRLR) человеческого рецептора CGRP были подвергнуты скринингу в ходе CGRP-рецептор-опосредованного анализа цАМФ с использованием клеток линии НТВ-10, как это описано в примере 4 выше, с целью определения наличия у таких антител биологической активности. Данные представлены в табл. 15 ниже. Антитела обладали не определяемой (НО), очень слабой (ОС) или слабой (С) биологической активностью в целом диапазоне концентраций, при которых описанные в тексте данного изобретения антитела обладали сильной биологической активностью.
- 90 031320
Таблица 15
Активность представленных на рынке антител
Название Источник Антиген или эпитоп Поставщик Активность клеток НТВ10
Антитело к CRLR (аЫ3164) Поликлональное кролика АТ N-концевой ЭЦД hCRLR Abeam Inc., Cambridge, МА НО
Антитело к CALCRL Поликлональное кролика АТ N-концевой ЭЦД hCRLR GenWay Biotech, Inc., San Diego, CA но
CRLR (N-18) Поликлональное козы АТ эпитоп возле Nконца hCRLR Santa Cruz Biotech ОС
CRLR (Н-42) Поликлональное кролика АТ аа23-64 hCRLR Santa Cruz Biotech но
Антитело к CALCRL (А01) Поликлональное мыши АТ аа23-133 hCRLR Novus Biologicals, Inc. ОС
RAMP1 (N-20) Поликлональное козы АТ эпитоп возле Nконца hCRLR Santa Cruz Biotech но
Антитело к RAMP1 (М01) Поликлональное АТ аа27-118 hRAMPI Novus Biologicals, с
мыши Inc., Littleton, CO
Антитело к RAMP1 (1F1) Моноклональное мыши АТ аа27-118 hRAMPI Novus Biologicals, Inc. но
Антитело к RAMP1 (аЬ67151) Поликлональное мыши АТ hRAMPI (полная длина) Abeam, Inc. с
RAMP1 (FL148) Поликлональное кролика АТ hRAMPI (полная длина) Santa Cruz Biotech, Santa Cruz, CA но
Пример 12. Иммуногистохимическое окрашивание клеток, экспрессирующих разные компоненты рецептора.
2-4х106 клеток было введено на коллагеновую мембрану CollaPlug (Integra LifeSciences Co., Plainsboro, NJ). Такие мембраны были погружены в среду ОСТ (Sakura Finetek Inc., Torrance, CA), замороженную при -20°С и разделенную на участки по 20 мкм с использованием криостата. Участки были фиксированы 4% параформальдегидом в течение 1 ч при комнатной температуре (КТ) и впоследствии промыты фосфатно-солевым буферным раствором (ФСБ). Эндогенная пероксидаза была блокирована 3% Н2О2/ФСБ в течение 15 мин, а участки были инкубированы в присутствии блокирующего раствора (ФСБ с 3% нормальной сывороткой козы (Vector Labs, Burlingame, CA) и 0,3% тритоном X-100)) в течение 1 ч. Впоследствии участки были инкубированы с первичным антителом к человеческому рецептору CGRP (32H7, 0,03-0,1 мкг/мл) при температуре 4°С в течение ночи, промыты ФСБ и инкубированы со вторичным антителом (биотинилированный фрагмент Fc IgG козы, 1:800, Jackson Immunoresearch, West Grove, PA) в 1% нормальной сыворотке козы/ФСБ в течение 1 ч при КТ. Иммунореактивность была амплифицирована с использованием набора Vector Elite Kit в соответствии с инструкциями производителя (Vector Labs, Burlingame, CA), а окрашивание было осуществлено с использованием 3,3'-диаминобензидина никеля в качестве хромогена (Sigma-Aldrich, St. Louis, МО). Участки были очищены с помощью ксилена и покрыты покровным стеклом в пермаунте (Fisher Chemicals, Fair Lawn, NJ).
Иммунореактивность анализировалась с использованием микроскопа Nikon E-800 и соответствующего программного обеспечения (Nikon, Melville, NY). Данные для клеток, экспрессирующих различные компоненты рецептора (как указано ниже), полученные с использованием антитела 32Н7, позволили выявить отличительное окрашивание клеток CHO, экспрессирующих рекомбинантный человеческий рецептор CGRP (CRLR+RAMP1; клетки CHO/CGRP R), и более слабое окрашивание клеток SK-N-MC, эндогенно экспрессирующих рецепторы CGRP (благодаря меньшей плотности рецептора). Окрашивание не отмечалось в клетках родительской линии CHO, клетках CHO, экспрессирующих неродственный ре
- 91 031320 комбинантный белок (TRPM8), клетках CHO/CGRP R после предварительной абсорбции соответствующим антигеном 32Н7, клетках CHO, экспрессирующих рекомбинантный человеческий рецептор адреномедуллина 2 (CRLR+RAMP3), клетках MCF-7, эндогенно экспрессирующих рецепторы амилина, клетках HEK, экспрессирующих рекомбинантный человеческий рецептор адреномедуллина 1 (CRLR+RAMP2), или клетках родительской линии HEK. Данные, полученные в ходе таких экспериментов, обобщены в табл. 16.
Таблица 16
Интенсивность иммуногистохимического окрашивания указанных клеток
Линия клеток Интенсивность окрашивания (визуальная шкала)
Все патенты и другие найденные публикации непосредственным образом включены в данный документ посредством ссылки в целях описания и раскрытия, например, методологий, представленных в таких публикациях, которые могут использоваться в связи с описанным здесь объектом изобретения. Такие публикации представлены исключительно в ознакомительных целях до даты заполнения данного изобретения. Ничто в этой связи не следует рассматривать в качестве разрешения на отсутствие у изобретателей права раскрывать такие документы задним числом посредством более раннего изобретения или по какой-либо иной причине. Все заявления относительно даты или предоставления содержания таких документов основываются на информации, доступной заявителям, и не предполагают собой какоголибо признания правильности дат или содержания таких документов.
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ <110> АМГЕН ИНК.
<120> АНТИТЕЛА, ИНГИБИРУЮЩИЕ ЧЕЛОВЕЧЕСКИЙ РЕЦЕПТОР CGRP <130> A-1472-WO-PCT <140>
<141>
<150> 61/264,622 <151> 2009-11-25 <150> 61/203,569 <151> 2008-12-23 <160> 261 <170> Патентная Версия 3.5 <210> 1 <211> 1419 <212> ДНК <213> Homo sapiens <400> 1 atgttataca gcatatttca ttttggctta atgatggaga aaaagtgtac cctgtatttt 60
- 92 031320
ctggttctct tgcctttttt tatgattctt gttacagcag aattagaaga gagtcctgag 120
gactcaattc agttgggagt tactagaaat aaaatcatga cagctcaata tgaatgttac 180
caaaagatta tgcaagaccc cattcaacaa gcagaaggcg tttactgcaa cagaacctgg 240
gatggatggc tctgctggaa cgatgttgca gcaggaactg aatcaatgca gctctgccct 300
gattactttc aggactttga tccatcagaa aaagttacaa agatctgtga ccaagatgga 360
aactggttta gacatccagc aagcaacaga acatggacaa attataccca gtgtaatgtt 420
aacacccacg agaaagtgaa gactgcacta aatttgtttt acctgaccat aattggacac 480
ggattgtcta ttgcatcact gcttatctcg cttggcatat tcttttattt caagagccta 540
agttgccaaa ggattacctt acacaaaaat ctgttcttct catttgtttg taactctgtt 600
gtaacaatca ttcacctcac tgcagtggcc aacaaccagg ccttagtagc cacaaatcct 660
gttagttgca aagtgtccca gttcattcat ctttacctga tgggctgtaa ttacttttgg 720
atgctctgtg aaggcattta cctacacaca ctcattgtgg tggccgtgtt tgcagagaag 780
caacatttaa tgtggtatta ttttcttggc tggggatttc cactgattcc tgcttgtata 840
catgccattg ctagaagctt atattacaat gacaattgct ggatcagttc tgatacccat 900
ctcctctaca ttatccatgg cccaatttgt gctgctttac tggtgaatct ttttttcttg 960
ttaaatattg tacgcgttct catcaccaag ttaaaagtta cacaccaagc ggaatccaat 1020
ctgtacatga aagctgtgag agctactctt atcttggtgc cattgcttgg cattgaattt 1080
gtgctgattc catggcgacc tgaaggaaag attgcagagg aggtatatga ctacatcatg 1140
cacatcctta tgcacttcca gggtcttttg gtctctacca ttttctgctt ctttaatgga 1200
gaggttcaag caattctgag aagaaactgg aatcaataca aaatccaatt tggaaacagc 1260
ttttccaact cagaagctct tcgtagtgcg tcttacacag tgtcaacaat cagtgatggt 1320

Claims (1)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Изолированное антитело, которое избирательно ингибирует человеческий рецептор CGRP, или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащее:
    (a) последовательности CDRL SEQ ID NO: 42, 43 и 44 и последовательности CDRH SEQ ID NO: 73, 74 и 75;
    (b) последовательности CDRL SEQ ID NO: 45, 46 и 47 и последовательности CDRH SEQ ID NO: 76, 77 и 78;
    (c) последовательности CDRL SEQ ID NO: 45, 61 и 47 и последовательности CDRH SEQ ID NO: 76, 91 и 78;
    (d) последовательности CDRL SEQ ID NO: 62, 63 и 64 и последовательности CDRH SEQ ID NO: 92, 93 и 94;
    (e) последовательности CDRL SEQ ID NO: 45, 61 и 47 и последовательности CDRH SEQ ID NO: 76, 95 и 78 или (f) последовательности CDRL SEQ ID NO: 42, 43 и 44 и последовательности CDRH SEQ ID NO: 73, 74 и 96.
    2. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.1, отличающиеся тем, что указанные антитело или его антигенсвязывающий фрагмент избирательно ингибируют человеческий рецептор CGRP по сравнению с человеческими рецепторами АМ1, АМ2 и AMY1.
    - 93 031320
    3. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.2, отличающиеся тем, что указанные антитело или его антигенсвязывающий фрагмент избирательно ингибируют человеческий рецептор CGRP с индексом избирательности 100 или более.
    4. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-3, отличающиеся тем, что указанные антитело или его антигенсвязывающий фрагмент специфически связываются с человеческим рецептором CGRP с показателем KD <100 нмоль.
    5. Изолированное антитело, которое избирательно ингибирует человеческий рецептор CGRP, или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащее:
    (i) последовательности CDRL SEQ ID NO: 42, 43 и 44 и (ii) последовательности CDRH SEQ ID NO: 73, 74 и 75.
    6. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.5, отличающиеся тем, что указанные антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержат последовательность вариабельного участка тяжелой цепи (VH), которая идентична как минимум на 90% последовательности SEQ ID NO: 158.
    7. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.6, отличающиеся тем, что указанные антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержат последовательность вариабельного участка тяжелой цепи (VH), которая идентична как минимум на 95% последовательности SEQ ID NO: 158.
    8. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.7, отличающиеся тем, что указанные антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержат последовательность вариабельного участка тяжелой цепи (VH), которая идентична как минимум на 98% последовательности SEQ ID NO: 158.
    9. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.5-8, отличающиеся тем, что указанные антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержат последовательность вариабельного участка легкой цепи (VL), которая идентична как минимум на 90% последовательности SEQ ID NO: 142.
    10. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.9, отличающиеся тем, что указанные антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержат последовательность вариабельного участка легкой цепи (VL), которая идентична как минимум на 95% последовательности SEQ ID NO: 142.
    11. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.10, отличающиеся тем, что указанные антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержат последовательность вариабельного участка легкой цепи (VL), которая идентична как минимум на 98% последовательности SEQ ID NO: 142.
    12. Изолированное антитело, которое избирательно ингибирует человеческий рецептор CGRP, или его антигенсвязывающий фрагмент, включающее вариабельный участок тяжелой цепи (VH), содержащий последовательность SEQ ID NO: 158, и вариабельный участок легкой цепи (VL), содержащий последовательность SEQ ID NO: 142.
    13. Антитело по любому из пп.5-12, отличающееся тем, что указанное антитело содержит последовательность легкой цепи, которая идентична как минимум на 90% последовательности SEQ ID NO: 17.
    14. Антитело по любому из пп.5-13, отличающееся тем, что указанное антитело содержит последовательность легкой цепи, которая идентична как минимум на 95% последовательности SEQ ID NO: 17.
    15. Антитело по любому из пп.5-14, отличающееся тем, что указанное антитело содержит последовательность легкой цепи, которая идентична как минимум на 98% последовательности SEQ ID NO: 17.
    16. Антитело по любому из пп.5-15, отличающееся тем, что указанное антитело содержит последовательность тяжелой цепи, которая идентична как минимум на 90% последовательности SEQ ID NO: 29.
    17. Антитело по любому из пп.5-16, отличающееся тем, что указанное антитело содержит последовательность тяжелой цепи, которая идентична как минимум на 95% последовательности SEQ ID NO: 29.
    18. Антитело по любому из пп.5-17, отличающееся тем, что указанное антитело содержит последовательность тяжелой цепи, которая идентична как минимум на 98% последовательности SEQ ID NO: 29.
    19. Изолированное антитело, которое избирательно ингибирует человеческий рецептор CGRP, включающее тяжелую цепь, содержащую последовательность SEQ ID NO: 29, и легкую цепь, содержащую последовательность SEQ ID NO: 17.
    20. Изолированное антитело, которое избирательно ингибирует человеческий рецептор CGRP, включающее тяжелую цепь, содержащую последовательность SEQ ID NO: 29 без сигнальной последовательности, и легкую цепь, содержащую последовательность SEQ ID NO: 17 без сигнальной последовательности.
    21. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-4, отличающиеся тем, что указанные антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержат:
    (i) CDRL последовательности SEQ ID NO: 45, 61 и 47 и (ii) CDRH последовательности SEQ ID NO: 76, 91 и 78.
    22. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.21, отличающиеся тем, что указанные антитело или его антигенсвязывающий фрагмент включают вариабельный участок тяжелой цепи (VH), содержащий последовательность SEQ ID NO: 164, и вариабельный участок легкой цепи (VL), содержащий последовательность SEQ ID NO: 146.
    23. Антитело по п.21, отличающееся тем, что указанное антитело включает тяжелую цепь (VH), содержащую последовательность SEQ ID NO: 35, и легкую цепь (VL), содержащую последовательность SEQ ID NO: 21.
    - 94 031320
    24. Антитело по п.21, отличающееся тем, что указанное антитело включает тяжелую цепь, содержащую последовательность SEQ ID NO: 35 без сигнальной последовательности, и легкую цепь, содержащую последовательность SEQ ID NO: 21 без сигнальной последовательности.
    25. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-4, отличающиеся тем, что указанные антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержат последовательность VH, которая идентична как минимум на 90% последовательности аминокислот, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 158, 159 и 164-168.
    26. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-4, отличающиеся тем, что указанные антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержат последовательность вариабельного участка легкой цепи (VL), которая идентична как минимум на 90% последовательности аминокислот, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 137, 138, 142, 145-148 и 150.
    27. Изолированное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-26, отличающиеся тем, что указанные антитело или его антигенсвязывающий фрагмент выбирают из группы, состоящей из моноклонального антитела, Fab фрагмента, Fab' фрагмента, F(ab')2 фрагмента, Fv фрагмента, диатела и одноцепочечного антитела.
    28. Изолированное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.27, отличающееся тем, что указанное выделенное антитело представлено моноклональным антителом, выбранным из группы, состоящей из полностью человеческого антитела, гуманизированного антитела и химерного антитела.
    29. Изолированное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.28, отличающееся тем, что моноклональное антитело представлено антителом типа IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4.
    30. Изолированное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.29, отличающееся тем, что моноклональное антитело представлено антителом типа IgG1 или IgG2.
    31. Изолированный полинуклеотид, кодирующий антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-30.
    32. Изолированный полинуклеотид по п.31, отличающийся тем, что полинуклеотид содержит последовательность, которая на 80% или более идентична последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 186, 187, 188, 189, 191, 192, 193, 194, 197, 200, 201, 202, 203, 207 и 208.
    33. Изолированный полинуклеотид по п.31, отличающийся тем, что полинуклеотид содержит последовательность, которая на 80% или более идентична последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 224, 225, 229, 232-236, 238, 242, 243, 247, 250-254 и 256.
    34. Изолированный полинуклеотид по п.31, отличающийся тем, что полинуклеотид содержит последовательность, способную к гибридизации при строгих условиях с последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 224, 225, 229, 232-236, 238, 242, 243, 247, 250-254 и 256.
    35. Вектор экспрессии, включающий изолированный полинуклеотид по любому из пп.31-34.
    36. Линия клеток, трансформированная вектором экспрессии по п.35.
    37. Способ получения антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп.1-30, включающий культивирование клетки-хозяина, содержащей вектор по п.35, в условиях, обеспечивающих синтез и секрецию в культуральную среду антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, кодируемого указанным вектором; и выделение указанного антитела или его антигенсвязывающего фрагмента из среды.
    38. Рекомбинантное антитело, которое избирательно ингибирует человеческий рецептор CGRP, содержащее тяжелую цепь и легкую цепь, при этом антитело выделено из клетки-хозяина, которая экспрессирует первую нуклеиновую кислоту, кодирующую тяжелую цепь, и вторую нуклеиновую кислоту, кодирующую легкую цепь, при этом первая нуклеиновая кислота содержит последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 242, 243, 247, 250-254 и 256, и вторая нуклеиновая кислота содержит последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 224, 225, 229, 232-236 и 238.
    39. Рекомбинантное антитело по п.38, отличающееся тем, что антитело выделяют из культуральной среды клетки-хозяина, секретирующей указанное антитело.
    40. Рекомбинантное антитело по п.38 или 39, выделенное из клетки-хозяина, которая экспрессирует:
    (a) первую нуклеиновую кислоту, содержащую последовательность SEQ ID NO: 242, и вторую нуклеиновую кислоту, содержащую последовательность SEQ ID NO: 224;
    (b) первую нуклеиновую кислоту, содержащую последовательность SEQ ID NO: 247, и вторую нуклеиновую кислоту, содержащую последовательность SEQ ID NO: 229;
    (c) первую нуклеиновую кислоту, содержащую последовательность SEQ ID NO: 250, и вторую нуклеиновую кислоту, содержащую последовательность SEQ ID NO: 232;
    (d) первую нуклеиновую кислоту, содержащую последовательность SEQ ID NO: 256, и вторую нуклеиновую кислоту, содержащую последовательность SEQ ID NO: 238;
    (e) первую нуклеиновую кислоту, содержащую последовательность SEQ ID NO: 252, и вторую нуклеиновую кислоту, содержащую последовательность SEQ ID NO: 234;
    (f) первую нуклеиновую кислоту, содержащую последовательность SEQ ID NO: 253, и вторую нук
    - 95 031320 леиновую кислоту, содержащую последовательность SEQ ID NO: 235;
    (g) первую нуклеиновую кислоту, содержащую последовательность SEQ ID NO: 254, и вторую нуклеиновую кислоту, содержащую последовательность SEQ ID NO: 236;
    (h) первую нуклеиновую кислоту, содержащую последовательность SEQ ID NO: 243, и вторую нуклеиновую кислоту, содержащую последовательность SEQ ID NO: 225; или (i) первую нуклеиновую кислоту, содержащую последовательность SEQ ID NO: 251, и вторую нуклеиновую кислоту, содержащую последовательность SEQ ID NO: 233.
    41. Рекомбинантное антитело по п.40, отличающееся тем, что антитело выделено из клеткихозяина, которая экспрессирует первую нуклеиновую кислоту, содержащую последовательность SEQ ID NO: 247, и вторую нуклеиновую кислоту, содержащую последовательность SEQ ID NO: 229.
    42. Рекомбинантное антитело по п.40, отличающееся тем, что антитело выделено из клеткихозяина, которая экспрессирует первую нуклеиновую кислоту, содержащую последовательность SEQ ID NO: 251, и вторую нуклеиновую кислоту, содержащую последовательность SEQ ID NO: 233.
    43. Фармацевтическая композиция для лечения или профилактики состояния, обусловленного рецептором CGRP, у пациента, включающая терапевтически эффективное количество антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп.1-30 и 38-42 и фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество.
    44. Способ лечения или профилактики состояния, обусловленного рецептором CGRP, у пациента, включающий введение пациенту эффективного количества антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп.1-30 и 38-42.
    45. Способ снижения проявления симптомов, обусловленных рецептором CGRP заболеваний или расстройств, у пациента, включающий введение пациенту эффективного количества антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп.1-30 и 38-42.
    46. Способ по п.44 или 45, отличающийся тем, что состояние или расстройство представлено головной болью.
    47. Способ по п.46, отличающийся тем, что состояние или расстройство представлено мигренью.
    48. Способ по п.44, который является профилактическим.
    CYNO_RAM₽1
    HIMAN_RAMP1
    RAT_RAMP1
    10 20 30 4050 ί 1) fiARAIjCRLPQRGLWLLLAHHL.FMATACQEAi'TYGALL.QELCL.TQFQVDMEAVGET (1} MARALCRLPRRGbWbbLAHHLFMTTACQEANYGAL.LRELCL.rQFQVDMEAVGEr (1) МАРСИаОЪРККСЬйЬЫ.АИНЬРМТТАСЙПРРУатыаЕЬСЬЗКРКЕЮМЕТГвКТ
    70 80 90100
    CYNO_RAMP1 ί 55) LWCDWGRTIGSYRELADCTWHMAEKLGCFWPliiAEVDRFFLAliHGHYFRACPISG
    HUMA1T_RAMP1 {55} LWCDWGRTIRSYRELADCTWHMAEKLGCFWPNAEVDRFFLAVHGRYFRSCPISG
    RAT_RAMP 1 (55) LWCDWGKTIGSYGELTHCTKLVANKIGCFWPNPEVDKFFIAVHHRYFSKCPVSG
    110 120 130140
    CYNC^BAMPl (109) RAWDPPGSVLYPFl'WPITVTLLVTALWWQSKHTEGIV
    EUMAN__RAMP1 (10 9) RAVRDPPGSILYPFI WPITVTLLVTALWWQSKRTEGIV
    RAT_RAMP1 (109} RALRDPPKSXLCPFXVLPITVTLLMTALWWRSKRTEGIV
    Фиг. 1
    - 96 031320
    CYNOCELR
    HUCRLR
    RATCRLR
    10 20 30 40 SO (1) -MEKKCTLYFLVLLPFFMlFVTAELESSPEDSIQLGVTRNKIMTAQYECiCKIMUDP (1) -MEKKCTLYFLVEiLPFFMILVTAELEESPEDSIQIjGVTRNKIMTAQYECYQKIMCDP (1) MMDKKCTLCFLFL,LLI.NMAL· IAAES EEGANQT- DLGVTRNKIMTAQYECYQKIMQDP
    CYNCCRLR
    HUCRLR
    RATCRLR
    70 60 90 100 110 (57) LC-QAEGVYCNRTWDGKLCWKNVAAGTESMQLCPDYFQDFDPSSKVTKTCDQDGNWFR (571 LQQABGVYCNRTWDGWLCnKDVAAGTESMQLCPDYFQOFDPSEK'/TKICDQDGiraFR (57) LQQGSGLYCNRTWDGWLCWNDVAAGTESMOYCPDYFQDFDPSEKVTKICDQDGNWFR
    CYNOCRLR(114)
    HUCRLR (114)
    RATCRLR (114)
    120 130 140 ISO 160 170
    HPASNRTWTNYTQCNVNTHEKVKTALNLFYLTIIGHGLSIASLLISLGIFFYFKSLS HPASNRTWTKTYTQCNVNTHEKVKTALNLFYLTIIGHGLSrASLLISLGIFFYFKSLS HPDSNRT/ITNYTLCNNSTHEKVKTALNLFYLTIaGHGLSIASLIISLIIFFYFKSLS
    CYNOCRLR(171)
    HUCRLR (171)
    RATCRLR (171)
    200
    220
    CQRITLHKNLFFSFVCNSWTIIHLTAVANNQALVATNFVSCKVSQFIHLYLMGCNY COR ITLHKNLFFSFVCNSVVTITHLTAVANNQALVATNPVSCKVSQFIHLYLMGCNY CQRITLHKNLFFS FVCNSIVTIIHbTAVANNQALVATNPVSCKVSQFIHLYLKGCNY
    CYNOCRLR(228)
    HUCRLR (228)
    RATCRLR (228)
    230 240 250 260 2.70 280
    FWMLCEGIYLHTLIWAVFAEK.QHLMKYYFLGWGFPLIPACIHAIARSLYYiJDNCWl FWMLCEGIYLHTLIWAVFAEKQHLMWYYFLGWGFPLIPACIKAIARSLYYNDIICWI ГИМЪСЕМУЪНТЫ'Л'ЛУЕАЕКОИЬММУУРШМбРРЬйРАСХНАХАКСЕУУНОМСК!
    CYNOCRLR'285)
    HUCRLR (285)
    RATCRLR -285)
    290 300 310 320 330 340
    SSOTHLLYI1HGPICAALLVNLFFLLNXVRVLITKLKVTHQAESNLYMKAVRATLIL SSDTHLLYIIHGPICAALLVNLFFLLNXVRVLITKLKVTHQAESNLYMKAVRATLIL SSDTHLbYIIHGPICAALLVNLFFLLNIVRVLITKLKVTHQAESNLYMKA’’7RATLIL
    CYNOCRLR(3 42)
    HUCRLR (342)
    RATCRLR (342)
    350 360 370 330 390
    У₽ЬЬа1ЕРУЪ1РИЕ₽ЗвК1АЕЕ7УОУ1МН1ЬМНР0аЬЬУ5Т1КСРР1.'5ЕУ0А1АККМ
    VPLLGIEFVLIPWRP3GKIAEEVYDYIMHILMHFQGLLVSTIFCFFNGEVQAILRRN
    VPLLGTEFW,FPWRP3GKVAEEVYDYV>rHTLW-:YQGLLVSTTFCFFNGEVQAILRRN
    CYNOCRLR(3 99)
    HUCRLR (399)
    RATCRLR (399)
    400 410 42-3 430 440 450
    WNQYKIQFGNS3SNS3ALRSASYTV£T:SD3PGYSHDCPS3I'LNGKSI-LrEIT.-,’LK
    WNQYKIQFGNSFSNSEALRSASYTVSTISDGPGYSHDCPSEHLNGKSIHDIENVLLK
    NNQYKXQFGNGFSHSDALRSASYTVSTISDVaGYSHDCPTEHLNGKSIQDIENVALK
    CYNOCRLR(456)
    HUCRLR (456)
    RATCRLR (456)
    60
    ΡΕΝΙΛΤΙ- - PENLYN--PEKMYDIjVM
    Фиг. 2
    Каппа K1 SEQ SEQ SEQ CDR1 ID NO: CDR2 ID NO: CDR3 ID NO: 2E7 RASQGIRNDLG 48 AASSLQS 49 LQYNIYPWT 50 13H2 RASQGIRKDLG 66 GASSLQS 67 LQYNSFPWT 68 K1 Консенсусная RASQGIRNDLG 103 AASSLQS 104 LQYNIYPWT 105 последовательность К G S F Каппа К4 SEQ SEQ SEQ CDR1 ID NO: CDR2 ID NO: CDR3 ID NO: 32Н7 RASQSVSSGYLT 69 GASSRAT 70 QQYGNSLCR 71 32Н7а RASQSVSSGYLT 69 GASSRAT 70 QQYGNS LSR 72 К4 Консенсусная RASQSVSSGYLT 69 GASSRAT 70 QQYGNS LSR 106 последовательность C SEQ SEQ SEQ CDR1 ID NO: CDR2 ID NO: CDR3 ID NO: Каппа К1,4 Коне RASQSVSSGYLT 107 GASSRAT 108 QQYGNSLCR 109 GIRN D G A LQS L NTYPWT К F S
    Фиг. 3A
    Каппа K2 SEQ ID NO: 57 CDR2 LGSNRAS SEQ ID NO: 58 CDR3 MQALQTPFT SEQ ID NO: 59 4H6 CDR1 RSSQSL LHSFGYNYLD Каппа КЗ SEQ SEQ SEQ CDR1 ID NO: CDR2 ID NO: CDR3 ID NO: 3C8 KSSQS L LHSAGKTY LY 54 EVSNRFS 55 MQSFPLPLT 56 5F5 KSSOSL LHSDGKTYLY 60 EVSNRFS 55 MQSF PLPL Ϊ 56 12E8 KSSQSLLHSDGRNYLY 65 EVSNRFS 55 MQSFPLPLT 56 КЗ Консенсусная KSSQSLLHSDGRNYLY 110 EVSNRFS 55 MQSFPLPLT 56 последовательность А КТ SEQ SEQ SEQ CDR1 ID NO: CDR2 ID NO: CDR3 ID NO: Каппа К2,3 Коне RSSQSLLHSFGYNYLD 111 LGSNRAS 112 MQALQTPFT 113 К D RT Y EV F SFPL L
    A К
    Фиг. 3B
    - 97 031320
    Лямбда L1 CDR1 SEQ ID NO: CDR2 SEQ ID NO: CDR3 SEQ ID NO: 1E11 SGSSSNI IGNNYVS 42 DNNKRPS 43 G TWOSRLSAVV 44 4E4 SGSSSN IGNNYVS 42 DNNKRPS 43 GTWDSRLSAW 44 9D4 SGSSSN IGNNYVS 42 DNNKRPS 43 GTWDSRL SAW 44 12G8 SGSSSN [GNNYVS 42 DNNKRPS 43 GTWDSRL SAW 44 L1 Консенсусная SGSSSN IGNNYVS 42 DNNKRPS 43 GTWDSRLSAW 44
    последовательность
    Лямбда L2 10E4 CDR1 SGSSSN t G S N T V N SEQ ID NO: 62 CDR2 TNNQRPS SEQ SEQ ID NO: 64 ID NO: 63 CDR3 AARDESLNGW Лямбда L3 SEQ SEQ SEQ CDR1 ID NO: CDR2 ID NO: CDR3 ID NO: 11D11 SGSSSN IGSNYVY 45 RNNQRPS 61 AAWDDSL SGWV 47 11H9 SGSSSN I GS N ΥVY 45 RNNQRPS 61 AAWDD S L S BWV 47 1H7 SGSSSN IGSNYVY 45 RSNQRPS 46 AAWDDSLSGWV 47 9F5 SGSSSN IGSNYVY 45 RNNQRPS 61 AAWDDSLSGWV 47 e e e e· n L.£ консенсусная *₽ w & ч» r* 1 У J 11 1 V 1 r. ii и ы n r- о ««ttmuocoutiv п осл едовател ь ность S Лямбда L4 SEQ SEQ SEQ CDR1 ID NO: CDR2 ID NO: CDR3 ID NO: 386 QG DS 1. RS F YAS 5' GKNNRPS 52 NSROSSVYHLV 53 SEQ SEQ SEQ CDR1 ID NO: CDR2 ID NO: CDR3 ID NO: Лям 1.1,2,3 Коне SGSSSN 1GNNYVS 115 DNNKRPS 116 GTWDSRLSAW 1V S T N TS Q AAR DS NG Y R SEQ SEQ SEQ CDR1 ID NO: CDR2 ID NO: CDR3 ID NO: Лямбда Все Коне SGSSSN 1 GNNYVS 118 DNNKRPS 119 GTWDSRLSAW 120 Q - D - L RS F TAN GK N NSR DSVYHL Y TS Q R AA NG
    Фиг. 4
    HC1 SEQ SEQ SEQ CDR1 ID NO: CDR2 ID NO: CDR3 ID NO: 3B6 GYYMH 82 W I NPNSGGTNYAQKFQG 83 DOMS I IMLRGVFPPYYYGMDV 84 10E4 DYYMY 92 W I ISPNSGGTNYAQKFQG 93 G G Y S G Υ Λ - - G L YS Η Y Y GMDV 94 HC1 Консенсусная GYYMH 121 W I NPNSGGTNYAQK FQG 122 DQMS1IMLRGVFPPYYYGMDV 123 последовательность D Y S GGY GYA - - LYSH
    Фиг. 5А
    HC2 CDR1 SEQ IO NO: CDR2 SEQ ID NO: CDR3 SEQ ID NO: 11D11 NAWMS 76 R I KSKTDGGTTDYAAPVKG 95 DRTGYS I SWSSYYYYYGMDV 78 9F5 NAWMS 76 R I KSKTDGGTTDYTAPVKG 91 DRTGYS ISWSSYYYYYGMDV 78 11H9 NAWMS 76 R I KSKTDGGTTDYAAPVKG 95 DRTGYS ISWSSYYYYYGMDV 78 1H7 NAWMS 76 R I i KSTTDGGTTDYAAPVKG 77 DRTGYS ISWSSYYYYYGMDV 78 HC2 Консенсусная NAWMS 76 R I I KSKTDGGTTDYTAPVKG 124 DRTGYSI ISWSSYYYYYGMDV 78
    последовательность т д
    Фиг. 5В
    HC3 SEQ ID NO: 97 79 CDR2 SEQ ID NO: 98 80 CDR3 EGVSGSSPYSISWYDYYYGMDV DQREVG-PYSSGWYDYYYGMDV SEQ ID NO: 99 81 13H2 2E7 CDR1 Т YSMN S YAMS S I A I I SSSSSYRYYADSVKG I SGSGGRTYYADSVKG НСЗ Консенсусная T YSMN 125 S I I SSSSSYRYYADSVKG 126 EGVSGSSPYSISWYDYYYGMDV 127 последовательность SAS A G GGRT DQREVG- SG HC4 SEQ SEQ SEQ CDR1 ID NO: CDR2 ID NO: CDR3 ID NO: 3C8 S YGMH 85 V I I SYDGSHESYADSVKG 86 ERKRVTMSTLYYY-FYYGMDV 87 4E4 S FGMH 73 V I I SFDGS I KYSVDSVKG 74 DRLNYYDSSGYYHYKYYGMAV 75 904 SFGMH 73 V I I SFDGS 1 KYSVDSVKG 74 DRLNYYDSSGYYHYKYYGMAV 75 1E11 S FGMH 73 V I 1 SFDGS 1 KYSVDSVKG 74 DRLNYYDSSGYYHYKYYGMAV 75 12E8 S YGMH 85 V I 1 SYDGSHESYADSVKG 86 ERKRVTMSTLYYY-FYYGMDV 87 5F5 S YGMH 85 V I 1 SYDGSHESYADSVKG 86 ERKRVTMSTLYYY-FYYGMDV 87 12G8 SFGMH 73 V I I SFDGS I KYSVDSVKG 74 DRLNYYDSSGYYHYKYYGLAV 96 HC4 Консенсусная S FGMH 128 V I 1 SFDGS 1 KYSVDSVKG 129 DRLNYYDSSGYYHYKYYGMAV 130 последовательность Y Y H YA E KRVTM TL Y-F LD
    Фиг. 5С
    HC5 SEQ SEQ SEQ CDR1 ID NO: CDR2 ID NO: CDR3 ID NO: 4H6 D Y AMS 88 FIRSRAYGGTPEYAASVKG 89 GRGIAARWOY 90
    Фиг. 5D
    НС6 SEQ SEQ SEQ
    CDR1 ID NO: CDR2 ID NO: CDR3 IO NO
    32H7SYGMH 100 V I W Υ D G S N К Υ Υ A D S V KG 101 AGG I AAAGLYYYYGMDV 102
    Фиг. 5Е
    - 98 031320
    CDR1 SEQ ID NO: CDR2 SEQ ID NO: CDR3 SEQ ID NO: НС Соп А NAWMS 131 R I KSKTDGGTTOYTAPVKG 132 DRTGYSISWSS-YYYYYGMDV 133 S Y А Н A SG - - • S SRKYSADS AQREVGPYSGGWHDK- - LAV FG V WFT I V EGLNAYD - - LYY - F Y N GI AA T L H KR TM SEQ SEQ SEQ CDR1 ID NO: CDR2 ID NO: CDR3 ID NO. НС Соп В NAWMS 134 R . I KSKTDGGTTDYTAPVKG 135 DRTGYSISWSS-YYYYYGMDV 135 GFYLH W N P - - N S SG К NSAQKFQ GGMS I 1MLRGVFPPK·· • L A 0 Y А A SGTAH RRY VDS AQYEGYA·-LLYSHF S G V WF R s I PE E RNVGPYS GWHD А S RY Y N L1AAD T Y - F H GR T Y К
    Фиг. 5F
    Анализ связывания лиганд-рецептор в клетках по методу FMAT: супернатант гибридомы 1092 с антителами к CGRP R, супернатант отрицательного контроля 68
    Фиг. 6
    Супернатант с антителами к CGRP R
    Супернатант с отрицательным контролем
    100%
    Содержание цАМФ в клетках, экспрессирующих hCGRP R при стимуляции 1 нмоль hCGRP
    -12 -11 -10 -9 -В -7 -6 -5
    Концентрация, log М
    Фиг. 7А
    -НЕК
    Концентрация, log М
    Фиг. 7В
    - 99 031320
    Содержание цАМФ в клетках линии hAM2-CHO с
    О ί <-ν ί 100 во
    Л ф
    40си
    120
    Q 0 4--------1--------1--------1--------1--------1--------1--------1--------1 с -13 -12 -11 -10 -9 -8 -7 -6 -5
    Концентрация, log М
    Фиг. 7С
    Фиг. 8
    - 100 031320
    Определение значения Kd для моноклональных антител (МА) 12G8 методом FACS
    1201 < 100 * 80
    X
    60 (X ей о 40
    X
    0--13
    Логарифмическая концентрация МА (М)
    Фиг. 10
    - 101 031320 cyno_RAEPl hurran_P.AMPl huRAMPl(Q2S-A34) huRAMPl(Q43-E53) huRAMPl(R67-E78) rat_RAMPl rhesus RAMP1
    MARALCRLPO M ARAL C R L P R MARALCRLPR KARALCRLPR KARALCRLPR EAPGLRGLPR KARALCRLPQ cyno_RAM₽l human_RAM?l huRAMPl(Q28-A34)} huRAMPl-Q43-E53) huRAMPl(R57-E78) rat__RAM?‘ rhesus RAMrl
    VGETLWCDWG VGETLWCDWG VGETLWCDWG IGKTLWCDWG VGETLWCDWG
    IGKTLWCDWG VGETLWCDWG
    RGLWLLLAHH
    RGLWLLLAHH RGLWLLLAHH RGLWLLLAHH
    RGLWLLLAHH RGLWLLLAHH RGLWLLLAHH
    RTIGSYRELA
    RTIRSYRELA
    RT7RSYRELA RTIRSYRELA
    RT1RSYGELT KTIGSYGELT RTIGSYRELA
    LFMATACQEA LFMTTACQEA LFMTTACRDP LFMTTACQEA LFMTTACQEA
    LFMVTACRDP LFMATACQEA
    DCTWHMAEKL DCTWHMAEKL DCTXiHMAEKL DCTWHMAEKL HCTKLVANKL HCTKLVANKI DCTWHMAEKL
    NYGALLQELC NYGALLRELC DYGTLLRELC NYGALLRELC NYGALLRELC
    DYGTL1QELC NYGALLQELC
    GCFWPNAEVD GCFWPNAEVD GC FWPNAEVD GCFWPNAEVD GCFWPNAEVD GCFWPNPEVD GCFWPNAEVD
    EC
    L7QFQVDMEA LTQFQVEMEA LTQFQVTΜΞΑ LTRFKEDMET
    LTQFQVLMEA LSRFKEDMET LTQFQVTMSA
    100
    RFFLAVHGHY RFFLAVHGRY RFFLAVHGRY
    RFFLAVHGRY RFFLAVHGRY KFFIAVHHRY RFFLAVHGHY
    Cyno_RAMPl human^RAMPl huRAMPl (Q28-A34) ) huRAMPl(Q43-E53) huRAMPl(R67-E7S) rat_RAMPl rhesus RAMP1 '01
    FRACPISGRA FRSCPISGRA. FRSCPISGRA FRSCPISGRA FRSCPISGRA FSKCPVSGRA FRACFISGRA
    VRDPPGSVLY VRDPPGSILY VRDPPGSILY VRDPPGSILY VRDPPGSILY LRDPPNSILC VRDPPGSVLY
    PFTWP’TVT PFIVVPITVT
    PFIWPITVT PFIWPITVT
    PFIWPITVT
    FFIVLPITVT
    PFIWPITVT
    LLVTALWWQ LLVTALWWQ LLVTALWWQ LLVTALWWQ LLVTALWWQ LLMTALWWR LLVTALWWQ
    148
    SKHTEGIV
    SKRTEG1V
    SKRTEGTV
    SKRTEGIV SKRTEGIV
    SKRTEGIV
    SKHTEGIV
    Фиг. 11 huCRLR cynoCRLR r-'nesusCRLR ratCRLR huCRLR{L24-Q33} Консенсусная последовательность
    MEKKCTLYF
    MEKKCTLYF
    MSKKCTLYr KMDKKCTLCF
    MEKKCTLYF
    MsKKCTLyF huCRLR cynoCRLR rhesusCRLR ratCRLR huCRLR(L24-Q33) Консенсусная последовательность
    QKIMQDPIQQ
    QKIMQDPIQQ
    QK1MQDPIQQ
    QKIMQDPIQQ
    QKIMQDPIQQ
    QKIMQDPIQQ huCRLR cynoCRLR rhesusCRLR ratCRLR huCRLR(L24-Q33) Консенсусная последовательность
    101
    KVTKICDQDG KVTKICDQDG KVTKICDQDG KVTKICDQDG KVTKICDQDG KVTKICDQDG huCRLR cynoCRLR rhesusCRLR ratCRLR huCRLR(L24-Q33' Консенсусная последовательность
    151
    GLSIASLLIS
    GLSIASLLIS
    GLSIASLLIS
    GLSIASLIIS
    GLSIASLLIS
    GLS1ASL-IS huCRLR cyr.oCRLR rhesusCRLR ratCRLR iuCRLR(L24-Q33) Консенсусная последовательность
    01
    NNQALVATNP
    NNQALVATNP
    NNQALVATHP
    NNQALVATNP NNQALVATNP NNQALVATNP huCRLR cynoCRLR rhesusCRLR ratCRLR huCRLR(L24-Q33) Консенсусная последовательность
    251
    QHLMWYYFLG
    QHLMWYYFLG
    QHLMWYYFLG QHLMWYYFLG QHLMWYYFLG QHLMWYYFLG
    LVLLPFFMIL LVLLPFFMIF LVLLPFFMIF LFLLLLNMAL LVLLPFFMIL
    LvLLpffMil
    AEGVYCNRTW AEGVYCNRTW AEGVYCNRTW
    GEGLYCNRTW AEGVYCNRTW aEG-YCKRTW
    NWFRHPASNR NWFRHPASNR NWFRHPASNR NWFRHPDSNR NWFRHPASNR NWFRHPaSNR
    LGIFFYFKSL
    LGIFFYFKSL
    LGIFFYFKSL
    LIIFFYFKSL LGIFFYFKSL
    LglFFYFKSL
    VSCKVSQFIH VSCKVSQFIH VSCKVSQFIH VSCKVSQFIH VSCKVSQFIH VSCKVSQFIH
    WGFPLIPACI WGFPLIPACI WGFPLIPACI WGFPLLPACI WGFPLIPACI WGFPL-PACI
    VTAELEESPE
    VTAELEESPE VTAELEESPE TAAESEEGAN
    VTAESEEGAN -tAE-EE--DGWLCWMDVA DGWLCWNNVA D3WLCWNVA DGWLCWNDVA DGWLCWNDVA DGWLCWN-VA
    TWTNYTQCNV TWTNYTQCW TWTNYTQCNV
    TWTNYTLCNN TWTNYTQCNV TWTNYTqCNv
    SCQRITLHKN SCQRITLHKN SCQRITLHKN SCQRITLHKN SCQRITLHKN
    SCQRITLHKN
    LYLMGCNYFW LYLMGCNYFW LYLMGCNYFW LYLMGCNYFW LYLMGCNYFW LYLMGCNYFW
    HAIARSLYYN HAIARSLYYN HAIARSLYYN HAIARSLYYN HAIARSLYYN HAIARSLYYN
    DSIQLGVTRN DSIQLGVTRN DSIQLGVTRN QT-DLGVTRN QT-DLGVTRN - — - LGVT’RN
    AGTESMQLCP AGTESMQLCP AGTESMQLCP AGTESMQYCP
    AGTESMQLCP
    AGTESMQ1CP
    NTHEKVKTAL NTHEKVKTAL NTHEKVKTAL STHEKVKTAL NTHEKVKTAL nTHEKVKTAL
    LFFSFVCNSV LFFSFVCNSV LFFSFVCNSV LFFSFVCNSI lffsfvcnsv LFFSFVCNSMLCEGIYLHT MLCEGIYLHT MLCEGIYLHT MLCEGIYLHT MLCEGIYLHT MLCEGIYLHT
    DNCWISSDTH DNCWISSDTH DNCWISSDTH DNCWISSDTH DNCWISSDTH DNCWISSDTH
    KIMTAQYECY KIMTAQYECY
    KIMTAQYECY KIMTAQYECY KIMTAQYECY KIMTAQYECY
    0 DYFQDFDPSE DYFQDFDPSE DYFQDFDFSE DYFQDFDPSE DYFQDFDPSE DYFQDFDPSE
    0
    NLFYLTI 1C.H NLFYLTIIGH NLFYLTTTGH NLFYLTIIGH NLFYLTIIGH NLFYLTIIGH
    2C 3
    VTITHLTAVA VTIIHLTAVA VTIIHLTAVA VTIIHLTAVA VT’IHLTAVc
    VTI1HLTAVA
    250
    LIWAVFAEK LIWAVFAEK LIWAVFAEK LIVVAVFAEK LIWAVFAEK LIWAVFAEK
    3C0
    LLYIIHGPjC LLYIIHGPIC LLYIIHGPIC LLYIIHGTIC LLYIIHGPIC
    LLYIIHGPIC
    Фиг. 12А
    - 102 031320 huCRLR cyr.oCRLR rhnsusCRLR ratCRLR huCRLR(L24-Q33) Консенсусная последовательность
    3C1
    AALLVNLFFL AALLVNLFrb AALLVNLFFL·
    AALLVNLFFL AALLVNLFrb AALLVNLFFL
    LN1VRVLITK LNIVRVLLTK LNIVRVLLTK LNIVRVLLTK LNTVRVLTTK LNIVRVLITK
    LKVTHQAESN LKVTHQAESN
    LKVTHQAESN LKVTHQAESN LKVTHQAESN LKVTHQAESN
    LYMKAVRATL LYMKAVRATL I.YMKAVRATL LYMKAVRATL LYMKAVRATL LYMKAVRATL,
    350
    ILVPLLGIEF ILVPLLGIEF ILVPLLGIEF ILVPLLGIEF ILVPLLGIEF ILVPLLGIEF huCRLR CynoCRLR rhesusCRLR ratCRLR huCRLR(L24-Q33} Консенсусная последовательность
    351
    VLIPKRPEGK VLIPWRPEGK VLIPWRPEGK VLFPWRPEGK VLIPWRPEGK VLiPWRFEGK huCRLR cynoCRLR rhesusCRLp4 ratCRLR 'r.uCRLR (L24-Q-33 j
    Консенсусная последовательность
    401
    L’QYKIQFGNS
    LTQYKIQFGNS
    NQYKLQFGNS
    NGYKZQFGNG
    NQYKIQFGNS
    NQYKIQFGNS
    TAEEVYDYIM
    IAEEVYDYIM IAEEVYDYIK VAEEVYDYVM LAEEVYDYIM -AEEVYDY-M
    FSNSEALRSA FSNSEALRSA FSNSEALRSA FSHSDALRSA FSNSEALRSA FSr.SeALRSA
    HILMKFOGLL NILMHFQGLL HILMHFQGLL· HILKHYQGLL HILEHFQGLL HILMH-QGLL sytvstisix} SYTVSTISEG SYTVSTISDG SYTVSTISDV SYTVSTISDG SYTVSTISDc
    VSTIFCFFNG VSTIFCFFNG VSTIFCFFNG VSTIFCFFNG VSTIFCFFNG VSTIFCFFNG
    PGYSHDCP5E FGYSWDCPSE PGYSHDCPSE QGYSHDCPTE PGYSHDCPSE pGYSHDCP-E
    400
    EVQAILRRN’H EVQAILRRNW EVQAILRRNW
    EVQAILRRRW EVQAILRRNW EVQAILRRNW
    5C
    HLNGKSLHL'l HLNGKSrirri HLNGKSIHET HLNGKSIQL1 HLNGKSIKDT HLNGKSIhEi
    451 huCRLR ENVLLKPENL YL’- - - cynoCRLR ENWLKPEKI. yn— rhesusCRLR ENWLKPENL ΪΝ--- ra;CRLR ENVALKPEKM YDLVM huCRLR(L24-Q33) EMVLLKPENL YN- - Консенсусная ENV-LKPEn- Y---- последовательность
    Фиг. 12В
    Фиг. 13В
    CRLR: RAN1P1 Q28-A34
    Фиг. 13С
    - 103 031320
    Ю 20 30 40 50 6Ό 70 80 90 mjn
    Фиг. 15
    20 30 40 50 60 70 min
    Фиг. 16
    - 104 031320
    Фиг. 17
EA201100892A 2008-12-23 2009-12-18 Антитела, ингибирующие человеческий рецептор cgrp EA031320B1 (ru)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US20356908P 2008-12-23 2008-12-23
US26462209P 2009-11-25 2009-11-25
PCT/US2009/068858 WO2010075238A1 (en) 2008-12-23 2009-12-18 Human cgrp receptor binding proteins

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA201100892A1 EA201100892A1 (ru) 2012-01-30
EA031320B1 true EA031320B1 (ru) 2018-12-28

Family

ID=41718325

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201891500A EA201891500A3 (ru) 2008-12-23 2009-12-18 Белки, связывающиеся с cgrp-рецепторами человека
EA201100892A EA031320B1 (ru) 2008-12-23 2009-12-18 Антитела, ингибирующие человеческий рецептор cgrp

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201891500A EA201891500A3 (ru) 2008-12-23 2009-12-18 Белки, связывающиеся с cgrp-рецепторами человека

Country Status (40)

Country Link
US (6) US9102731B2 (ru)
EP (3) EP3569620A1 (ru)
JP (6) JP5761805B2 (ru)
KR (4) KR101853393B1 (ru)
CN (2) CN106084045B (ru)
AR (1) AR074857A1 (ru)
AU (2) AU2009330175C1 (ru)
BR (2) BR122020010360B1 (ru)
CA (1) CA2746858C (ru)
CL (1) CL2011001578A1 (ru)
CO (1) CO6400232A2 (ru)
CR (1) CR20110400A (ru)
CY (3) CY1119465T1 (ru)
DK (2) DK2379594T3 (ru)
EA (2) EA201891500A3 (ru)
ES (2) ES2746571T3 (ru)
HR (2) HRP20171690T1 (ru)
HU (3) HUE045966T2 (ru)
IL (2) IL213429A (ru)
JO (2) JO3382B1 (ru)
LT (3) LT2379594T (ru)
LU (1) LUC00095I2 (ru)
MA (1) MA32982B1 (ru)
ME (1) ME03601B (ru)
MX (1) MX2011006804A (ru)
MY (1) MY180564A (ru)
NL (1) NL300961I2 (ru)
NO (2) NO2379594T3 (ru)
NZ (2) NZ623541A (ru)
PE (1) PE20120427A1 (ru)
PL (2) PL2379594T3 (ru)
PT (2) PT2379594T (ru)
RS (2) RS56567B1 (ru)
SG (2) SG172307A1 (ru)
SI (2) SI2379594T1 (ru)
TN (1) TN2011000283A1 (ru)
TW (4) TWI688403B (ru)
UA (1) UA108066C2 (ru)
WO (1) WO2010075238A1 (ru)
ZA (1) ZA201105418B (ru)

Families Citing this family (110)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101309704B (zh) 2005-11-14 2012-10-10 礼纳特神经系统科学公司 针对降钙素基因相关肽的拮抗剂抗体及其使用方法
KR20100099193A (ko) * 2007-11-21 2010-09-10 암젠 인크 Ｗｉｓｅ 결합 항체 및 에피토프
CA2716424C (en) 2008-03-04 2015-04-28 Pfizer Limited Methods of treating chronic pain
JO3382B1 (ar) * 2008-12-23 2019-03-13 Amgen Inc أجسام مضادة ترتبط مع مستقبل cgrp بشري
AU2010288194B2 (en) 2009-08-28 2013-08-29 Teva Pharmaceuticals International Gmbh Methods for treating visceral pain by administering antagonist antibodies directed against calcitonin gene-related peptide
AU2012258976B8 (en) 2011-05-20 2017-07-20 H. Lundbeck A/S Use of anti-CGRP or anti-CGRP-R antibodies or antibody fragments to treat or prevent chronic and acute forms of diarrhea
HUE055505T2 (hu) 2011-05-20 2021-11-29 H Lundbeck As Anti-CGRP készítmények és alkalmazásuk
DK2709663T3 (da) * 2011-05-20 2019-05-20 Alderbio Holdings Llc Anvendelse af anti-CGRP-antistoffer og antistoffragmenter til forebyggelse eller inhibering af fotofobi eller aversion mod lys hos individer med behov herfor, især migrænikere
AU2014236867A1 (en) * 2013-03-15 2015-09-24 Amgen Inc. Methods and compositions relating to anti-CCR7 antigen binding proteins
ES2770976T3 (es) 2013-03-15 2020-07-06 Amgen Inc Anticuerpos PAC1 humanos
WO2015021080A2 (en) 2013-08-05 2015-02-12 Twist Bioscience Corporation De novo synthesized gene libraries
EP3060281B1 (en) 2013-10-24 2019-01-30 Amgen Inc. Drug delivery system with temperature-sensitive control
PL3060275T3 (pl) 2013-10-24 2019-12-31 Amgen Inc. Wstrzykiwacz i sposób montażu
WO2015119906A1 (en) 2014-02-05 2015-08-13 Amgen Inc. Drug delivery system with electromagnetic field generator
US9896502B2 (en) * 2014-03-21 2018-02-20 Teva Pharmaceuticals International Gmbh Antagonist antibodies directed against calcitonin gene-related peptide and methods using same
US10556945B2 (en) 2014-03-21 2020-02-11 Teva Pharmaceuticals International Gmbh Antagonist antibodies directed against calcitonin gene-related peptide and methods using same
AU2015256082C1 (en) 2014-05-07 2020-09-10 Amgen Inc. Autoinjector with shock reducing elements
CN112237662B (zh) 2014-06-03 2022-10-21 安姆根有限公司 药物递送系统和使用方法
AU2015318008B2 (en) * 2014-09-15 2021-05-20 Amgen Inc. Bi-specific anti-CGRP receptor/PAC1 receptor antigen binding proteins and uses thereof
AU2015332557B2 (en) 2014-10-14 2020-05-14 Amgen Inc. Drug injection device with visual and audio indicators
JP6716566B2 (ja) 2014-12-19 2020-07-01 アムジエン・インコーポレーテツド 近接センサ付き薬物送達装置
ES2785311T3 (es) 2014-12-19 2020-10-06 Amgen Inc Dispositivo de administración de fármacos con botón móvil o campo de interfaz de usuario
EP3245231B1 (en) 2015-01-16 2020-08-12 Juno Therapeutics, Inc. Antibodies and chimeric antigen receptors specific for ror1
US10669304B2 (en) 2015-02-04 2020-06-02 Twist Bioscience Corporation Methods and devices for de novo oligonucleic acid assembly
CA2976935C (en) 2015-02-17 2020-03-10 Amgen Inc. Drug delivery device with vacuum assisted securement and/or feedback
ES2905870T3 (es) 2015-02-27 2022-04-12 Amgen Inc Dispositivo de suministro de fármacos que tiene un mecanismo de protección de aguja con un umbral de resistencia ajustable al movimiento de la protección de aguja
US9981239B2 (en) 2015-04-21 2018-05-29 Twist Bioscience Corporation Devices and methods for oligonucleic acid library synthesis
JOP20200116A1 (ar) 2015-04-24 2017-06-16 Amgen Inc طرق لعلاج أو الوقاية من الصداع النصفي
US10464983B2 (en) 2015-05-13 2019-11-05 The Board Of Regents Of The University Of Oklahoma Variants of adrenomedullin and calcitonin gene-related peptide and methods of use
WO2017039786A1 (en) 2015-09-02 2017-03-09 Amgen Inc. Syringe assembly adapter for a syringe
KR20180050411A (ko) 2015-09-18 2018-05-14 트위스트 바이오사이언스 코포레이션 올리고핵산 변이체 라이브러리 및 그의 합성
CN113604546A (zh) 2015-09-22 2021-11-05 特韦斯特生物科学公司 用于核酸合成的柔性基底
WO2017100501A1 (en) 2015-12-09 2017-06-15 Amgen Inc. Auto-injector with signaling cap
WO2017120178A1 (en) 2016-01-06 2017-07-13 Amgen Inc. Auto-injector with signaling electronics
CA3012827A1 (en) 2016-02-02 2017-08-10 Fred Hutchinson Cancer Research Center Anti-ror1 antibodies and uses thereof
EP3429663B1 (en) 2016-03-15 2020-07-15 Amgen Inc. Reducing probability of glass breakage in drug delivery devices
AU2017250807A1 (en) 2016-04-15 2018-10-25 H. Lundbeck A/S. Anti-PACAP antibodies and uses thereof
WO2017189089A1 (en) 2016-04-29 2017-11-02 Amgen Inc. Drug delivery device with messaging label
WO2017192287A1 (en) 2016-05-02 2017-11-09 Amgen Inc. Syringe adapter and guide for filling an on-body injector
MX2018013616A (es) 2016-05-13 2019-02-21 Amgen Inc Montaje de cubierta protectora de vial.
US11238150B2 (en) 2016-05-16 2022-02-01 Amgen Inc. Data encryption in medical devices with limited computational capability
WO2017209899A1 (en) 2016-06-03 2017-12-07 Amgen Inc. Impact testing apparatuses and methods for drug delivery devices
WO2018004842A1 (en) 2016-07-01 2018-01-04 Amgen Inc. Drug delivery device having minimized risk of component fracture upon impact events
US20190328965A1 (en) 2016-08-17 2019-10-31 Amgen Inc. Drug delivery device with placement detection
WO2018057526A2 (en) 2016-09-21 2018-03-29 Twist Bioscience Corporation Nucleic acid based data storage
AU2017331592A1 (en) 2016-09-23 2019-04-11 Teva Pharmaceuticals International Gmbh Treating cluster headache
KR20190066607A (ko) 2016-09-23 2019-06-13 테바 파마슈티컬스 인터내셔널 게엠베하 불응성 편두통의 치료
EP3532127A1 (en) 2016-10-25 2019-09-04 Amgen Inc. On-body injector
CA3049661A1 (en) 2017-01-11 2018-07-19 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University R-spondin (rspo) surrogate molecules
AU2018210301A1 (en) 2017-01-17 2019-08-01 Amgen Inc. Injection devices and related methods of use and assembly
WO2018140821A1 (en) 2017-01-26 2018-08-02 Surrozen, Inc. Tissue-specific wnt signal enhancing molecules and uses thereof
WO2018151890A1 (en) 2017-02-17 2018-08-23 Amgen Inc. Drug delivery device with sterile fluid flowpath and related method of assembly
MX2019009755A (es) 2017-02-17 2019-10-07 Amgen Inc Mecanismo de insercion para dispositivo de suministro de farmacos.
CA3054303A1 (en) 2017-02-22 2018-08-30 Twist Bioscience Corporation Nucleic acid based data storage
US20190071490A1 (en) 2017-03-02 2019-03-07 Beth Israel Deaconess Medical Center, Inc. Preventing Post-Ictal Headaches
EP3592403A1 (en) 2017-03-06 2020-01-15 Amgen Inc. Drug delivery device with activation prevention feature
IL268478B2 (en) 2017-03-07 2023-10-01 Amgen Inc Inserting a needle using super pressure
IL268386B2 (en) 2017-03-09 2023-11-01 Amgen Inc Insertion mechanism for a drug delivery device
EP4241807A3 (en) 2017-03-28 2023-10-11 Amgen Inc. Plunger rod and syringe assembly system and method
AU2018282077B2 (en) 2017-06-08 2023-11-23 Amgen Inc. Torque driven drug delivery device
AU2018280054B2 (en) 2017-06-08 2023-07-13 Amgen Inc. Syringe assembly for a drug delivery device and method of assembly
US11541183B2 (en) 2017-06-22 2023-01-03 Amgen Inc. Device activation impact/shock reduction
JP7475860B2 (ja) 2017-06-23 2024-04-30 アムジエン・インコーポレーテツド スイッチアセンブリにより起動されるキャップを含む電子薬物送達デバイス
ES2972207T3 (es) 2017-07-14 2024-06-11 Amgen Inc Sistema de inserción-retracción de agujas con sistema de resorte de torsión doble
MA49626A (fr) 2017-07-21 2020-05-27 Amgen Inc Élément d'étanchéité perméable aux gaz pour récipient à médicament et procédés d'assemblage
EP4085942A1 (en) 2017-07-25 2022-11-09 Amgen Inc. Drug delivery device with gear module and related method of assembly
EP3658206A1 (en) 2017-07-25 2020-06-03 Amgen Inc. Drug delivery device with container access system and related method of assembly
EP3664863A2 (en) 2017-08-09 2020-06-17 Amgen Inc. Hydraulic-pneumatic pressurized chamber drug delivery system
EP3668567A1 (en) 2017-08-18 2020-06-24 Amgen Inc. Wearable injector with sterile adhesive patch
US11103636B2 (en) 2017-08-22 2021-08-31 Amgen Inc. Needle insertion mechanism for drug delivery device
WO2019070472A1 (en) 2017-10-04 2019-04-11 Amgen Inc. FLOW ADAPTER FOR MEDICATION DELIVERY DEVICE
IL272636B1 (en) 2017-10-06 2024-06-01 Amgen Inc Drug delivery device with combination assembly and related assembly method
WO2019074579A1 (en) 2017-10-09 2019-04-18 Amgen Inc. DRUG DELIVERY DEVICE COMPRISING A DRIVE ASSEMBLY AND ASSEMBLY METHOD THEREOF
SG11202003574TA (en) 2017-10-20 2020-05-28 Twist Bioscience Corp Heated nanowells for polynucleotide synthesis
EP3703778A1 (en) 2017-11-03 2020-09-09 Amgen Inc. System and approaches for sterilizing a drug delivery device
WO2019089178A1 (en) 2017-11-06 2019-05-09 Amgen Inc. Drug delivery device with placement and flow sensing
WO2019090303A1 (en) 2017-11-06 2019-05-09 Amgen Inc. Fill-finish assemblies and related methods
SG11202002966QA (en) 2017-11-10 2020-05-28 Amgen Inc Plungers for drug delivery devices
IL273638B1 (en) 2017-11-16 2024-06-01 Amgen Inc Door lock mechanism for drug delivery device
TWI831762B (zh) 2018-01-12 2024-02-11 美商安進公司 Pac1抗體及其用途
JP2021519790A (ja) 2018-04-02 2021-08-12 アムジェン インコーポレイテッド エレヌマブ組成物及びその使用
AU2019250882A1 (en) 2018-04-12 2020-11-05 Amgen Inc. Methods for making stable protein compositions
GB2590196A (en) 2018-05-18 2021-06-23 Twist Bioscience Corp Polynucleotides, reagents, and methods for nucleic acid hybridization
US10835685B2 (en) 2018-05-30 2020-11-17 Amgen Inc. Thermal spring release mechanism for a drug delivery device
US11083840B2 (en) 2018-06-01 2021-08-10 Amgen Inc. Modular fluid path assemblies for drug delivery devices
WO2020023220A1 (en) 2018-07-24 2020-01-30 Amgen Inc. Hybrid drug delivery devices with tacky skin attachment portion and related method of preparation
US12042645B2 (en) 2018-07-24 2024-07-23 Amgen Inc. Delivery devices for administering drugs
WO2020023336A1 (en) 2018-07-24 2020-01-30 Amgen Inc. Hybrid drug delivery devices with grip portion
MX2021000749A (es) 2018-07-24 2021-03-29 Amgen Inc Dispositivos de suministro para administrar farmacos.
WO2020028009A1 (en) 2018-07-31 2020-02-06 Amgen Inc. Fluid path assembly for a drug delivery device
US20210346601A1 (en) 2018-09-24 2021-11-11 Amgen Inc. Interventional dosing systems and methods
CA3110371A1 (en) 2018-09-28 2020-04-02 Amgen Inc. Muscle wire escapement activation assembly for a drug delivery device
EP3860685A1 (en) 2018-10-02 2021-08-11 Amgen Inc. Injection systems for drug delivery with internal force transmission
EP3860686A1 (en) 2018-10-05 2021-08-11 Amgen Inc. Drug delivery device having dose indicator
CA3109988A1 (en) 2018-10-15 2020-04-23 Amgen Inc. Platform assembly process for drug delivery device
MA53912A (fr) 2018-10-15 2022-01-19 Amgen Inc Dispositif d'administration de médicament comprenant un mécanisme d'amortissement
US11213620B2 (en) 2018-11-01 2022-01-04 Amgen Inc. Drug delivery devices with partial drug delivery member retraction
TWI831847B (zh) 2018-11-01 2024-02-11 美商安進公司 部分針頭縮回之藥物遞送裝置及其操作方法
CA3113076A1 (en) 2018-11-01 2020-05-07 Amgen Inc. Drug delivery devices with partial drug delivery member retraction
MX2021008267A (es) * 2019-01-08 2021-08-05 H Lundbeck As Tratamiento agudo y tratamiento rapido de la cefalea usando anticuerpos anti-cgrp.
WO2020176678A1 (en) * 2019-02-26 2020-09-03 Twist Bioscience Corporation Variant nucleic acid libraries for glp1 receptor
MX2021012557A (es) 2019-04-24 2021-11-12 Amgen Inc Conjuntos y metodos de verificacion de esterilizacion de jeringuillas.
WO2020239014A1 (zh) * 2019-05-30 2020-12-03 山东博安生物技术有限公司 抗cgrp抗体及其应用
CA3143524A1 (en) 2019-06-28 2020-12-30 Amgen Inc. Anti-cgrp receptor/anti-pac1 receptor bispecific antigen binding proteins
MX2022002149A (es) 2019-08-23 2022-03-17 Amgen Inc Dispositivo de suministro de farmacos con componentes de acoplamiento de capuchon de aguja configurable y metodos relacionados.
KR20230157986A (ko) 2021-03-02 2023-11-17 체게에르페 다이어그노스틱스 게엠베하 편투통 발생의 치료 및/또는 저감
US20240208680A1 (en) 2021-05-21 2024-06-27 Amgen Inc. Method of optimizing a filling recipe for a drug container
WO2023026205A1 (en) 2021-08-24 2023-03-02 Cgrp Diagnostics Gmbh Preventative treatment of migraine
WO2023215829A1 (en) * 2022-05-05 2023-11-09 Amgen Inc. Heteromultimer binding dll3 and cd3
WO2024102742A1 (en) 2022-11-07 2024-05-16 Amgen Inc. Methods for treating obesity

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20050282252A1 (en) * 1996-10-11 2005-12-22 Siegel Donald L Rh(D)-binding proteins and magnetically activated cell sorting method for production thereof
WO2006068953A2 (en) * 2004-12-21 2006-06-29 Astrazeneca Ab Antibodies directed to angiopoietin-2 and uses thereof
WO2007076336A1 (en) * 2005-12-22 2007-07-05 Eli Lilly And Company Treatment of migraine with anti-cgrp antibodies

Family Cites Families (102)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3773919A (en) 1969-10-23 1973-11-20 Du Pont Polylactide-drug mixtures
US4263428A (en) 1978-03-24 1981-04-21 The Regents Of The University Of California Bis-anthracycline nucleic acid function inhibitors and improved method for administering the same
US4399216A (en) 1980-02-25 1983-08-16 The Trustees Of Columbia University Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
IE52535B1 (en) 1981-02-16 1987-12-09 Ici Plc Continuous release pharmaceutical compositions
EP0088046B1 (de) 1982-02-17 1987-12-09 Ciba-Geigy Ag Lipide in wässriger Phase
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
HUT35524A (en) 1983-08-02 1985-07-29 Hoechst Ag Process for preparing pharmaceutical compositions containing regulatory /regulative/ peptides providing for the retarded release of the active substance
DE3474511D1 (en) 1983-11-01 1988-11-17 Terumo Corp Pharmaceutical composition containing urokinase
US4740461A (en) 1983-12-27 1988-04-26 Genetics Institute, Inc. Vectors and methods for transformation of eucaryotic cells
US4751180A (en) 1985-03-28 1988-06-14 Chiron Corporation Expression using fused genes providing for protein product
US4935233A (en) 1985-12-02 1990-06-19 G. D. Searle And Company Covalently linked polypeptide cell modulators
AU597574B2 (en) 1986-03-07 1990-06-07 Massachusetts Institute Of Technology Method for enhancing glycoprotein stability
US4959455A (en) 1986-07-14 1990-09-25 Genetics Institute, Inc. Primate hematopoietic growth factors IL-3 and pharmaceutical compositions
US5260203A (en) 1986-09-02 1993-11-09 Enzon, Inc. Single polypeptide chain binding molecules
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
DE3785186T2 (de) 1986-09-02 1993-07-15 Enzon Lab Inc Bindungsmolekuele mit einzelpolypeptidkette.
US4912040A (en) 1986-11-14 1990-03-27 Genetics Institute, Inc. Eucaryotic expression system
US5011912A (en) 1986-12-19 1991-04-30 Immunex Corporation Hybridoma and monoclonal antibody for use in an immunoaffinity purification system
US4965195A (en) 1987-10-26 1990-10-23 Immunex Corp. Interleukin-7
US4968607A (en) 1987-11-25 1990-11-06 Immunex Corporation Interleukin-1 receptors
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
WO1990005183A1 (en) 1988-10-31 1990-05-17 Immunex Corporation Interleukin-4 receptors
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
JPH02229119A (ja) 1989-02-28 1990-09-11 Toyo Jozo Co Ltd 動脈硬化予防および治療剤
US5683888A (en) 1989-07-22 1997-11-04 University Of Wales College Of Medicine Modified bioluminescent proteins and their use
US5292658A (en) 1989-12-29 1994-03-08 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Boyd Graduate Studies Research Center Cloning and expressions of Renilla luciferase
EP0463151B1 (en) 1990-01-12 1996-06-12 Cell Genesys, Inc. Generation of xenogeneic antibodies
US6673986B1 (en) 1990-01-12 2004-01-06 Abgenix, Inc. Generation of xenogeneic antibodies
US6713610B1 (en) 1990-01-12 2004-03-30 Raju Kucherlapati Human antibodies derived from immunized xenomice
AU651596B2 (en) 1990-06-05 1994-07-28 Immunex Corporation Type II interleukin-1 receptors
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5814318A (en) 1990-08-29 1998-09-29 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5789650A (en) 1990-08-29 1998-08-04 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US6300129B1 (en) 1990-08-29 2001-10-09 Genpharm International Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5874299A (en) 1990-08-29 1999-02-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
DE69127627T2 (de) 1990-08-29 1998-02-19 Genpharm Int Produktion und Nützung nicht-menschliche transgentiere zur Produktion heterologe Antikörper
US6255458B1 (en) 1990-08-29 2001-07-03 Genpharm International High affinity human antibodies and human antibodies against digoxin
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5877397A (en) 1990-08-29 1999-03-02 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
WO1992015673A1 (en) 1991-03-11 1992-09-17 The University Of Georgia Research Foundation, Inc. Cloning and expression of renilla luciferase
EP0590076A4 (en) 1991-06-14 1997-02-12 Dnx Corp Production of human hemoglobin in transgenic pigs
WO1993001227A1 (en) 1991-07-08 1993-01-21 University Of Massachusetts At Amherst Thermotropic liquid crystal segmented block copolymer
US5262522A (en) 1991-11-22 1993-11-16 Immunex Corporation Receptor for oncostatin M and leukemia inhibitory factor
WO1993019180A1 (en) * 1992-03-17 1993-09-30 Ciba-Geigy Ag Genetically engineered antibodies
WO1994002602A1 (en) 1992-07-24 1994-02-03 Cell Genesys, Inc. Generation of xenogeneic antibodies
PT672141E (pt) 1992-10-23 2003-09-30 Immunex Corp Metodos de preparacao de proteinas oligomericas soluveis
US5766880A (en) * 1992-10-27 1998-06-16 Queen's University At Kingston Isolated nucleic acid molecules encoding multidrug resistance proteins
US5457035A (en) 1993-07-23 1995-10-10 Immunex Corporation Cytokine which is a ligand for OX40
US6146826A (en) 1993-09-10 2000-11-14 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Green fluorescent protein
WO1995021191A1 (en) 1994-02-04 1995-08-10 William Ward Bioluminescent indicator based upon the expression of a gene for a modified green-fluorescent protein
WO1996003993A2 (en) 1994-08-05 1996-02-15 The Rockefeller University Modulation of thymocyte and t cell functional activity
JPH10504457A (ja) 1994-08-16 1998-05-06 ヒューマン ジノーム サイエンシーズ， インコーポレイテッド カルシトニンレセプター
US5777079A (en) 1994-11-10 1998-07-07 The Regents Of The University Of California Modified green fluorescent proteins
EP1978033A3 (en) 1995-04-27 2008-12-24 Amgen Fremont Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US5874304A (en) 1996-01-18 1999-02-23 University Of Florida Research Foundation, Inc. Humanized green fluorescent protein genes and methods
US5804387A (en) 1996-02-01 1998-09-08 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University FACS-optimized mutants of the green fluorescent protein (GFP)
US5876995A (en) 1996-02-06 1999-03-02 Bryan; Bruce Bioluminescent novelty items
US5925558A (en) 1996-07-16 1999-07-20 The Regents Of The University Of California Assays for protein kinases using fluorescent protein substrates
US5976796A (en) 1996-10-04 1999-11-02 Loma Linda University Construction and expression of renilla luciferase and green fluorescent protein fusion genes
EP1500329B1 (en) 1996-12-03 2012-03-21 Amgen Fremont Inc. Human antibodies that specifically bind human TNF alpha
ATE290205T1 (de) 1996-12-12 2005-03-15 Prolume Ltd Vorrichtung und verfahren zum nachweis und identifizieren von infektiösen wirkstoffen
CA2196496A1 (en) 1997-01-31 1998-07-31 Stephen William Watson Michnick Protein fragment complementation assay for the detection of protein-protein interactions
DE19732944A1 (de) 1997-07-31 1999-02-04 Thomae Gmbh Dr K Peptidische CGRP-Antagonisten
US6342220B1 (en) 1997-08-25 2002-01-29 Genentech, Inc. Agonist antibodies
JP2002507410A (ja) 1998-03-27 2002-03-12 プロルーム・リミテッド ルシフェラーゼ、蛍光タンパク質、ルシフェラーゼおよび蛍光タンパク質をコードする核酸および、診断、高処理スクリーニングおよび新規アイテムにおけるその使用
US6268474B1 (en) 1998-04-30 2001-07-31 Creighton University Peptide antagonists of CGRP-receptor superfamily and methods of use
US6210924B1 (en) 1998-08-11 2001-04-03 Amgen Inc. Overexpressing cyclin D 1 in a eukaryotic cell line
EP1105427A2 (en) 1998-08-17 2001-06-13 Abgenix, Inc. Generation of modified molecules with increased serum half-lives
CA2396460A1 (en) * 1999-12-02 2001-06-07 Myriad Genetics, Inc. Protein-protein interactions
US20020090646A1 (en) 2000-05-03 2002-07-11 Amgen Inc. Calcitonin-related molecules
FR2821080B1 (fr) 2001-02-20 2003-12-19 Sanofi Synthelabo Anticorps specifique de l'adrenomedulline humaine, composition pharmaceutique le contenant, ses applications therapeutiques
DE60233509D1 (de) * 2001-06-20 2009-10-08 Fibron Ltd Fgfr3 blockierende antikörper, verfahren zum screening darauf und verwendungen davon
ATE453661T1 (de) 2001-09-27 2010-01-15 Merck & Co Inc Isolierte dna-moleküle, die für einen humanisierten calcitonin gene-related peptide receptor kodieren, damit verwandte, nichthumane transgene tiere und assayverfahren
US7658924B2 (en) 2001-10-11 2010-02-09 Amgen Inc. Angiopoietin-2 specific binding agents
AR039067A1 (es) 2001-11-09 2005-02-09 Pfizer Prod Inc Anticuerpos para cd40
SI1576112T1 (sl) * 2002-01-18 2012-10-30 Zymogenetics Inc Multimerni citokinski receptor zcitor17
US20040110170A1 (en) 2002-05-18 2004-06-10 The Regents Of The University Of California Cloning and characterization of calcitonin gene related peptide receptors
US20070071744A1 (en) * 2002-06-07 2007-03-29 Gotz Munch Agents which bind to epitopes of glycoprotein VI
KR101070213B1 (ko) * 2002-08-12 2011-10-06 액타비스 그룹 에이취에프. 건선 치료를 위한 ｃｇｒｐ 안타고니스트 화합물의 용도
US20040176577A1 (en) * 2002-09-10 2004-09-09 Eva Rojer Immunoassays for specific determination of SCCA isoforms
WO2004097421A2 (en) 2003-04-29 2004-11-11 Bayer Healthcare Ag Diagnostics and therapeutics for diseases associated with calcitonin receptor-like receptor (calcrl)
CN1961000B (zh) * 2004-02-11 2011-05-04 安米林药品公司 具有可选择特性的杂合多肽
US7423128B2 (en) 2004-11-03 2008-09-09 Amgen Fremont Inc. Anti-properdin antibodies, and methods for making and using same
CN101232897A (zh) 2005-06-16 2008-07-30 新藤隆行 含有肾上腺髓质素作为有效成分的血管生成剂
GB0521139D0 (en) 2005-10-18 2005-11-23 Univ Sheffield Therapeutic agent
US8168592B2 (en) 2005-10-21 2012-05-01 Amgen Inc. CGRP peptide antagonists and conjugates
CN101309704B (zh) 2005-11-14 2012-10-10 礼纳特神经系统科学公司 针对降钙素基因相关肽的拮抗剂抗体及其使用方法
AU2007348941B2 (en) * 2006-08-03 2011-08-04 Medimmune Limited Antibodies directed to alphaVbeta6 and uses thereof
GB0708002D0 (en) 2007-04-25 2007-06-06 Univ Sheffield Antibodies
KR101304085B1 (ko) 2008-03-04 2013-09-05 라브리스 바이올로직스 인코포레이티드 염증성 통증의 치료 방법
FR2934597B1 (fr) 2008-07-31 2013-04-19 Univ Aix Marseille Ii Anticorps se liant aux recepteurs de l'adrenomedulline et leurs utilisations comme medicament.
JO3382B1 (ar) * 2008-12-23 2019-03-13 Amgen Inc أجسام مضادة ترتبط مع مستقبل cgrp بشري
AU2010288194B2 (en) 2009-08-28 2013-08-29 Teva Pharmaceuticals International Gmbh Methods for treating visceral pain by administering antagonist antibodies directed against calcitonin gene-related peptide
JP5782185B2 (ja) 2012-06-01 2015-09-24 日本電信電話株式会社 パケット転送処理方法およびパケット転送処理装置
US9300829B2 (en) 2014-04-04 2016-03-29 Canon Kabushiki Kaisha Image reading apparatus and correction method thereof
AU2015318008B2 (en) * 2014-09-15 2021-05-20 Amgen Inc. Bi-specific anti-CGRP receptor/PAC1 receptor antigen binding proteins and uses thereof
JOP20200116A1 (ar) * 2015-04-24 2017-06-16 Amgen Inc طرق لعلاج أو الوقاية من الصداع النصفي
US11385238B2 (en) * 2017-06-30 2022-07-12 Amgen Inc. Methods of protein clips recovery
JP2021519790A (ja) * 2018-04-02 2021-08-12 アムジェン インコーポレイテッド エレヌマブ組成物及びその使用

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20050282252A1 (en) * 1996-10-11 2005-12-22 Siegel Donald L Rh(D)-binding proteins and magnetically activated cell sorting method for production thereof
WO2006068953A2 (en) * 2004-12-21 2006-06-29 Astrazeneca Ab Antibodies directed to angiopoietin-2 and uses thereof
WO2007076336A1 (en) * 2005-12-22 2007-07-05 Eli Lilly And Company Treatment of migraine with anti-cgrp antibodies

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CHAUHAN M, ET AL: "Studies on the effects of the N-terminal domain antibodies of calcitonin receptor-like receptor and receptor activity-modifying protein 1 on calcitonin gene-related peptide-induced vasorelaxation in rat uterine artery.", BIOLOGY OF REPRODUCTION, NEW YORK, NY [U.A.] : ACADEM. PRESS, US, vol. 70, no. 6, 1 June 2004 (2004-06-01), US, pages 1658 - 1663, XP002571487, ISSN: 0006-3363 *
DAVIS CARL D; XU CEN: "The Tortuous Road to an Ideal CGRP Function Blocker for the Treatment of Migraine", CURRENT TOPICS IN MEDICINAL CHEMISTRY, BENTHAM SCIENCE PUBLISHERS LTD.HILVERSUM, NL, vol. 8, no. 16, 1 November 2008 (2008-11-01), NL, pages 1468 - 1479, XP008119816, ISSN: 1568-0266, DOI: 10.2174/156802608786264218 *
DURHAM PAUL L: "CGRP-RECEPTOR ANTAGONISTS--A FRESH APPROACH TO MIGRAINE THERAPY?", NEW ENGLAND JOURNAL OF MEDICINE, THE - NEJM, MASSACHUSETTS MEDICAL SOCIETY, US, vol. 350, no. 11, 11 March 2004 (2004-03-11), US, pages 1073 - 1075, XP009082423, ISSN: 1533-4406, DOI: 10.1056/NEJMp048016 *
TAYLOR CHRISTOPHER K; SMITH D DAVID; HULCE MARTIN; ABEL PETER W: "PHARMACOLOGICAL CHARACTERIZATION OF NOVEL ALPHA-CALCITONIN GENE-RELATED PEPTIDE (CGRP) RECEPTOR PEPTIDE ANTAGONISTS THAT ARE SELECTIVE FOR HUMAN CGRP RECEPTORS", JOURNAL OF PHARMACOLOGY AND EXPERIMENTAL THERAPEUTICS, AMERICAN SOCIETY FOR PHARMACOLOGY AND EXPERIMENTAL THERAPEUTICS, US, vol. 319, no. 2, 1 November 2006 (2006-11-01), US, pages 749 - 757, XP009084228, ISSN: 0022-3565, DOI: 10.1124/jpet.106.108316 *

Also Published As

Publication number Publication date
US20210179723A1 (en) 2021-06-17
PL3184546T3 (pl) 2019-12-31
BRPI0922505A2 (pt) 2016-07-05
PL2379594T3 (pl) 2018-01-31
HRP20191341T8 (hr) 2020-02-07
LTPA2018017I1 (lt) 2019-01-10
CN106084045B (zh) 2020-02-11
JP2016026224A (ja) 2016-02-12
KR20110106409A (ko) 2011-09-28
UA108066C2 (uk) 2015-03-25
AR074857A1 (es) 2011-02-16
AU2009330175C1 (en) 2018-10-04
DK3184546T3 (da) 2019-09-30
JP2019062907A (ja) 2019-04-25
ES2746571T3 (es) 2020-03-06
LUC00095I1 (ru) 2018-12-28
US20210179722A1 (en) 2021-06-17
CA2746858C (en) 2017-10-03
US9862771B2 (en) 2018-01-09
MX2011006804A (es) 2011-09-27
HUE034506T2 (en) 2018-02-28
LTC2379594I2 (lt) 2020-04-10
EP3184546A1 (en) 2017-06-28
CA2746858A1 (en) 2010-07-01
SG172307A1 (en) 2011-07-28
MY180564A (en) 2020-12-02
LT2379594T (lt) 2017-11-27
TW201032823A (en) 2010-09-16
JP6261132B2 (ja) 2018-01-17
IL213429A (en) 2016-02-29
JO3382B1 (ar) 2019-03-13
US20100172895A1 (en) 2010-07-08
KR101853393B1 (ko) 2018-05-02
MA32982B1 (fr) 2012-01-02
JP2014210815A (ja) 2014-11-13
EP2379594B8 (en) 2020-12-30
DK2379594T3 (en) 2017-10-30
TW202026312A (zh) 2020-07-16
NL300961I2 (nl) 2019-01-15
IL243784A0 (en) 2016-04-21
US20180142029A1 (en) 2018-05-24
HUE045966T2 (hu) 2020-01-28
EA201100892A1 (ru) 2012-01-30
CL2011001578A1 (es) 2012-01-20
IL213429A0 (en) 2011-07-31
PE20120427A1 (es) 2012-05-13
KR101740615B1 (ko) 2017-05-26
CY2018032I2 (el) 2019-07-10
ME03601B (me) 2020-07-20
NZ606090A (en) 2014-08-29
BRPI0922505B1 (pt) 2021-08-03
HRP20171690T1 (hr) 2017-12-15
NZ623541A (en) 2015-12-24
JOP20190017B1 (ar) 2023-03-28
LT3184546T (lt) 2019-09-10
HRP20191341T1 (hr) 2019-10-18
TW201703796A (zh) 2017-02-01
EP2379594B1 (en) 2017-08-09
CN106084045A (zh) 2016-11-09
KR20180043850A (ko) 2018-04-30
JP5761805B2 (ja) 2015-08-12
IL243784A (en) 2016-11-30
SG10201401879TA (en) 2014-06-27
CO6400232A2 (es) 2012-03-15
AU2009330175B2 (en) 2014-01-16
HUS1800047I1 (hu) 2018-12-28
NO2018042I1 (no) 2018-12-17
CY1119465T1 (el) 2018-03-07
ZA201105418B (en) 2012-02-29
JOP20190017A1 (ar) 2017-06-16
AU2009330175A1 (en) 2011-06-23
EP2379594A1 (en) 2011-10-26
AU2013205271B2 (en) 2016-07-14
JP2021036912A (ja) 2021-03-11
EA201891500A2 (ru) 2018-11-30
PT2379594T (pt) 2017-11-16
TWI754176B (zh) 2022-02-01
US20150376286A1 (en) 2015-12-31
TN2011000283A1 (en) 2012-12-17
US20130071410A1 (en) 2013-03-21
WO2010075238A1 (en) 2010-07-01
LUC00095I2 (ru) 2019-12-24
CR20110400A (es) 2011-10-12
CN102348722A (zh) 2012-02-08
AU2013205271A1 (en) 2013-05-02
RS59343B1 (sr) 2019-10-31
CY1122658T1 (el) 2021-03-12
JP2012513214A (ja) 2012-06-14
PT3184546T (pt) 2019-09-16
JP2023116783A (ja) 2023-08-22
AU2013205271C1 (en) 2018-10-04
TW202241950A (zh) 2022-11-01
KR20190054181A (ko) 2019-05-21
EP3184546B8 (en) 2019-10-30
ES2643835T3 (es) 2017-11-24
BR122020010360B1 (pt) 2022-08-16
SI3184546T1 (sl) 2019-09-30
EP3569620A1 (en) 2019-11-20
EP3184546B1 (en) 2019-07-17
CY2018032I1 (el) 2019-07-10
TWI688403B (zh) 2020-03-21
US9102731B2 (en) 2015-08-11
KR20170061182A (ko) 2017-06-02
EA201891500A3 (ru) 2019-03-29
CN102348722B (zh) 2016-06-08
RS56567B1 (sr) 2018-02-28
SI2379594T1 (sl) 2017-12-29
TWI574697B (zh) 2017-03-21
NO2379594T3 (ru) 2018-01-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20210179722A1 (en) Human cgrp receptor binding proteins
TWI693234B (zh) 結合β-ＫＬＯＴＨＯ,ＦＧＦ受體及其複合物之人類抗原結合蛋白
US10294298B2 (en) Human PAC1 antibodies
AU2018203471B2 (en) Human CGRP receptor binding proteins

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KG MD TJ TM

ND4A Extension of term of a eurasian patent