ES2218163T3 - Anticuerpos monoclonales y sus derivados sinteticos y biotecnologicos que actuan como moleculas antagonistas del ngf. - Google Patents
Anticuerpos monoclonales y sus derivados sinteticos y biotecnologicos que actuan como moleculas antagonistas del ngf.Info
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Abstract
Un anticuerpo monoclonal, y sus derivados sintéticos y biotecnológicos, capaz de reconocer y unirse al receptor de alta afinidad del NGF (factor de crecimiento nervioso), con actividad de tirosina-quinasa, denominado TrkA, y de actuar como antagonista de la unión del NGF a TrkA.
Description
Anticuerpos monoclonales y sus derivados
sintéticos y biotecnológicos que actúan como moléculas antagonistas
del NGF.
El presente invento se refiere a anticuerpos
monoclonales, y a sus derivados sintéticos y biotecnológicos, que
actúan como moléculas antagonistas del NGF.
Más en particular, el invento se refiere a un
anticuerpo monoclonal, y a sus derivados sintéticos y recombinantes,
capaz de reconocer y unirse al receptor de alta afinidad del NGF
(del inglés, Nerve Growth Factor)
(factor de crecimiento nervioso), con actividad de
tirosina-quinasa, denominado TrkA, y de actuar como
antagonista de la unión del NGF a TrkA. El invento también concierne
a los usos diagnósticos y terapéuticos de esas moléculas y de
composiciones relacionadas.
Las neurotrofinas son una familia de factores de
crecimiento peptídicos (Barde, 1994), estructuralmente relacionados
con el primer miembro de la familia, el NGF (factor de crecimiento
nervioso, Levi-Montalicini, 1987). Las neurotrofinas
modulan la diferenciación y supervivencia neuronales, así como la
transmisión sináptica, tanto de las neuronas periféricas como de las
del sistema nervioso central. Además, el NGF actúa sobre varios
tejidos y células no neuronales, como las células del sistema
inmunitario.
El NGF actúa a través de dos receptores de
membrana presentes en las células diana, el receptor p75 de baja
afinidad, y la glicoproteína transmembranal TrkA, de alta afinidad
y de 140 kDa (Kaplan y col., 1991, Klein y col., 1991) que tiene
actividad de tirosina-quinasa. La TrkA se expresa en
las neuronas de las crestas neurales, en las neuronas del sistema
simpático así como en neuronas colinérgicas del prosencéfalo basal
y del cuerpo estriado, en las que representa el mediador crucial de
las actividades del NGF (Holtzman y col., 1992, Verge y col.,
1992). La TrkA también se expresa en algunos tejidos y células no
neuronales, que incluyen los linfocitos B (Torcia y col., 1996).
La técnica anterior sugiere el uso potencial del
NGF en el tratamiento de diferentes patologías neurodegenerativas,
que incluyen la enfermedad de Alzehimer (Lindsay y col., 1994;
Ebendal y col., 1991), y otras patologías, como diabetes
mellitus y lepra (Anand y col., 1996). Sin embargo, los
ensayos clínicos iniciales fueron desalentadores, complicados por
las dificultades de suministro, por la farmacocinética en el sistema
nervioso central, y por las propiedades agonistas negativas del NGF
contra otras dianas periféricas, fuera del sistema nervioso
central, que conducen a estímulos excesivos y no deseados.
Por lo tanto, hace falta desarrollar moléculas
antagonistas selectivas de la interacción
NGF-receptor TrkA y derivados farmacológicamente
activos de las mismas, que sean suministradas con facilidad.
Además, la sobreproducción de NGF en diferentes
trastornos inflamatorios se había relacionado con el aumento de la
sensibilidad al dolor de los nociceptores primarios aferentes,
contribuyendo así a la presencia de un estado de dolor crónico. La
población de neuronas sensitivas que son sensibles a daños
tisulares (nociceptores) es particularmente dependiente de NGF.
Además, considerando los inconvenientes y limitaciones de las dos
clases de fármacos analgésicos existentes (fármacos
anti-inflamatorios no esteroideos y opioides), la
provisión de una nueva diana diferente, como es el NGF, representa
un progreso en la técnica (Snider y McMahon, 1998). Y además, según
lo sugerido por Levine (Levine, 1988), el NGF proporciona una diana
potencial para el diseño de nuevos tratamientos para el dolor,
especialmente para aquellos dolores resultantes de trastornos
inflamatorios o neuropáticos, para los que los fármacos
convencionales son menos efectivos. Por último, estudios recientes
han mostrado una relación directa entre el dolor y el sistema TrkA,
demostrando, en cuatro casos no relacionados de insensibilidad
crónica al dolor de tipo 4, con anhidrosis, la presencia de
mutaciones del gen TrkA y, en consecuencia, la ausencia de
receptores funcionales para NGF (Indo y col., 1996; Wood, 1996).
Por consiguiente, el sistema
NGF-TrkA proporciona una diana potencial para
diseñar tratamientos para el dolor, es decir, tratamientos capaces
de antagonizar el síndrome del dolor neuropático por medio de
antagonistas efectivos frente a TrkA (Levine, 1998; Sneider y
Mcmahon, 1998).
La expresión aberrante del mRNA de receptores
TrkA se había relacionado también con patologías neoplásicas. El
pronóstico de tumores que expresan TrkA, su diagnóstico mediante
"formación de imágenes" así como su tratamiento, representan
un área de aplicación de anticuerpos que tienen una elevada
afinidad por TrkA. De hecho, en estos tumores, los agentes que se
unen a TrkA representan herramientas útiles para el diagnóstico
clínico, el pronóstico y los tratamientos terapéuticos (Kramer y
col., 1997).
Los anticuerpos recombinantes (Vaughan y col.,
1998) representan reactivos de partida de elección para el
desarrollo de moléculas pequeñas que mimeticen su actividad (Le
Sauteur y col., 1995).
Debeir y col., PNAS, Marzo, 1.999, Vol. 96, págs.
4067-4072, describen un péptido pequeño que inhibe
la interacción entre NGF y TrkA.
Un anticuerpo monoclonal agonista de TrkA fue
descrito por Le Sauteur y col., 1996, en la solicitud de PCT n.º
WO97/21732. La actividad agonista del único anticuerpo descrito
(5C3) le hace no adecuado para los objetivos del presente invento y
para todas las situaciones en las que debe evitarse la
hiperactivación del receptor TrkA. La solicitud de PCT n.º
WO97/21732 describe el uso en pruebas diagnósticas de "formación
de imágenes" del anticuerpo agonista 5C3. Sin embargo este
anticuerpo, debido a su actividad agonista, no puede ser utilizado
para la aplicación anteriormente mencionada, a menos que la
activación del receptor no esté impedida.
Por lo tanto, resulta evidente que es necesario
desarrollar nuevas moléculas adecuadas para interferir con la unión
del NGF a TrkA, para proporcionar nuevas actividades terapéuticas
y, en particular, para proporcionar un anticuerpo TrkA que actúe
como antagonista y sea por ello ideal para bloquear la activación
del receptor producida por un ligando endógeno (NGF), y que no
presente actividad de activación del receptor. Además ese anticuerpo
podría utilizarse ventajosamente en el desarrollo de reactivos, es
decir, de fragmentos sintéticos y recombinantes que bloqueen la
interacción NGF-TrkA.
El autor del presente invento ha aislado varios
anticuerpos monoclonales capaces de interaccionar con la unión
NGF-receptor, denominados TrkA. Entre estos
anticuerpos monoclonales, un anticuerpo, el denominado MNAC13,
actúa como un potente antagonista de TrkA, inhibiendo la unión del
NGF a TrkA. Este anticuerpo representa una herramienta muy efectiva
en la prevención de la activación funcional de TrkA por NGF en
diversos sistemas biológicos.
El anticuerpo se obtuvo mediante inmunización
congénica de ratones Balb/C, con un receptor TrkA natural humano,
expresado en células Balb/C 3T3. El escrutinio se basó en la
capacidad de los anticuerpos para inhibir la unión del NGF a las
células que expresan TrkA. Esto condujo al aislamiento de
anticuerpos capaces de unirse a TrkA en su dominio de unión a NGF,
impidiendo así la unión de NGF. El anticuerpo MNAC13 es muy
efectivo para prevenir la activación funcional de TrkA producida
por NGF en diferentes sistemas biológicos. El autor del presente
invento ha clonado también los genes que codifican las regiones
variables del anticuerpo MNAC13 y, mediante técnicas de DNA
recombinante, ha ensamblado esas regiones en un polipéptido
funcional de tamaño reducido (fragmento Fv de cadena sencilla,
scFvMNAC13), confirmando que este polipéptido conserva las
propiedades del anticuerpo de origen.
Anticuerpo agonista significa un anticuerpo capaz
de activar el antígeno del receptor en ausencia del ligando natural
del propio receptor.
Anticuerpo antagonista significa un anticuerpo
dirigido contra el sitio activo del receptor antigénico, y que es
capaz de inhibir la actividad del ligando natural que está en
competición con el anticuerpo mencionado por la unión al mismo
receptor.
Derivados sintéticos y biotecnológicos de un
anticuerpo significan cualquier fragmento construido por ingeniería
genética, sintetizado por técnicas químicas o recombinantes, que
conserva las propiedades funcionales del anticuerpo.
Un objetivo del presente invento es un anticuerpo
monoclonal y sus derivados sintéticos y biotecnológicos, capaz de
reconocer y de unirse al receptor de alta afinidad del NGF (factor
de crecimiento nervioso), con actividad de
tirosina-quinasa, denominado TrkA, y de actuar como
antagonista de la unión del NGF a TrkA.
Según una realización preferida, el anticuerpo
del invento tiene la región variable de la cadena ligera
constituida esencialmente por la secuencia que va desde el aa 23
hasta el aa 134 de SEQ ID No. 2.
Según otra realización preferida, el anticuerpo
del invento tiene la región variable de la cadena pesada
constituida esencialmente por la secuencia que va desde el aa 152
hasta el aa 276 de SEQ ID No. 2.
Según otra realización preferida, el derivado
biotecnológico del invento es un fragmento ScFv que comprende:
a) la región variable de la cadena ligera del
anticuerpo del invento o de sus derivados funcionales, y
b) la región variable de la cadena pesada del
anticuerpo del invento o de sus derivados funcionales.
Preferiblemente, el fragmento ScFv comprende una
secuencia enlazadora situada entre las regiones variables de la
cadena ligera y de la cadena pesada. Más preferiblemente, el
fragmento ScFv tiene esencialmente la secuencia de SEQ ID No. 2.
Un objetivo más del invento es un derivado
sintético o biotecnológico del anticuerpo monoclonal, que comprende
al menos una de las regiones determinantes de la complementaridad
(CDR) del anticuerpo y que es capaz de actuar como antagonista de
la unión del NGF a TrkA. Preferiblemente la región está dentro de
la región variable de la cadena pesada, más preferiblemente la
región está incluida en la secuencia que va desde el aa 152 hasta
el aa 276 de SEQ ID No. 2.
Dentro del alcance del presente invento está un
ácido nucleico que codifica el anticuerpo o sus derivados del
presente invento. Preferiblemente el ácido nucleico codifica el
fragmento ScFv de SEQ ID No. 2, más preferiblemente el ácido
nucleico tiene la secuencia de SEQ ID No. 1.
Los ácidos nucleicos del invento pueden
utilizarse ventajosamente como transgenes para obtener animales
transgénicos no humanos, preferiblemente ratones, en los que el
anticuerpo se expresa de un modo inducible, o bajo el control de
promotores que determinan la expresión en el animal adulto. Estos
animales pueden utilizarse ventajosamente para estudiar y probar
fármacos para patologías humanas en las que la interacción NGF/TrkA
está inhibida, y en particular, en patologías neurodegenerativas.
Animales transgénicos no humanos pueden obtenerse con técnicas
estándar, es decir, como las descritas en Allen y col., 1987.
Los modelos transgénicos (Smeyne y col., 1994)
basados en la represión del gen TrkA, muestran un fenotipo letal en
el plazo de 1-2 semanas desde el nacimiento, y por
lo tanto no son adecuados para estudiar TrkA en el sistema nervioso
adulto o maduro. Animales transgénicos que expresan anticuerpos se
encuentran descritos por Piccioli y col., 1991, 1995.
Dentro del alcance del presente invento está un
fago o un vector procariótico que comprende y es capaz de expresar
de manera correcta y efectiva el ácido nucleico del invento.
Dentro del alcance del presente invento está un
vector eucariótico recombinante que comprende y es capaz de expresar
de manera correcta y efectiva el ácido nucleico del invento, así
como una composición farmacológica que comprende el vector
recombinante para la terapia génica de patologías neurológicas. Las
patologías comprenden pero no se limitan a ellas, el siguiente
grupo: dolor crónico, dolor agudo, neuromas, tumores neoplásicos que
expresan TrkA.
Dentro del alcance del presente invento está una
composición farmacológica que comprende una cantidad efectiva del
anticuerpo monoclonal del invento, o de sus derivados sintéticos o
biotecnológicos, capaz de reconocer y unirse al receptor de NGF
(factor de crecimiento nervioso) de alta afinidad, con actividad de
tirosina-quinasa, denominado TrkA, y de actuar como
antagonista de la unión del NGF a TrkA, y un excipiente
farmacéuticamente aceptable. La composición del invento puede
utilizarse ventajosamente para el tratamiento de patologías
neurológicas que comprenden, pero no se limitan a ellas, el
siguiente grupo: dolor crónico, dolor agudo, neuromas, tumores
neoplásicos que expresan TrkA.
En consideración al hecho de que NGF puede
presentar algunos efectos colaterales no deseados en un tratamiento,
el invento se refiere también a una composición farmacéutica que
comprende una cantidad farmacéuticamente activa de NGF y del
anticuerpo o sus derivados según el invento. Esa composición debe
ser capaz de inhibir a nivel periférico los efectos no deseados del
NGF.
Un objetivo más del presente invento es la
construcción por ingeniería genética de células capaces de expresar
el anticuerpo del invento o sus derivados biotecnológicos o
sintéticos, así como una composición farmacéutica que comprende
dichas células para terapia génica de patologías neurológicas que
comprenden, pero no se limitan a ellas, el siguiente grupo: dolor
crónico, dolor agudo, neuromas, tumores neoplásicos que expresan
TrkA.
En vista de la especificidad del anticuerpo del
invento y en ausencia de efectos inducidos no deseados, el
anticuerpo puede utilizarse ventajosamente en una composición para
pruebas diagnósticas in vivo de "formación de
imágenes".
El presente invento será descrito en relación con
ejemplificar, pero no limitar, sus realizaciones. Se hará
referencia a las siguientes Figuras.
Figura 1. Inhibición de la unión del
^{125}I-NGF a células Balb/C 3T3 TrkA+. Los
sobrenadantes de los hibridomas se preincubaron con células Balb/C
3T3 TrkA+, antes de la adición de ^{125}I-NGF. El
histograma presenta la inhibición de la unión específica
NGF-célula producida por diferentes anticuerpos. La
unión específica se evaluó restando de la unión total la obtenida
en presencia de un exceso de NGF no marcado. Los valores presentados
son la media de valores triplicados.
Figura 2. MNAC13 reconoce el dominio
extracelular del receptor TrkA. Los receptores solubles TrkA y
TrkB, construidos por ingeniería genética como inmunoadhesinas, se
utilizaron como antígenos en fase sólida para un ensayo de ELISA y
se incubaron con 2 ó 20 ng/ml del anticuerpo MNAC13 purificado.
Figura 3. MNAC13 reconoce el receptor TrkA
sobre células vivas. Células Balb/C 3T3 o células Balb/C 3T3
TrkA+, se incubaron con el anticuerpo MNAC13 y se sometieron a un
análisis de FAGS.
Figura 4. MNAC13 marca los receptores
asociados a TrkA sobre neuronas del prosencéfalo basal de ratas.
Secciones de la corona del prosencéfalo basal de ratas P10 se
incubaron en presencia (A) o en ausencia (B) del anticuerpo MNAC13.
Línea de escala: 98 \mum.
Figura 5. MNAC13 inhibe la diferenciación de
células PC12 de rata, inducida por NGF. Las células PC12 se
transfirieron a un medio libre de suero y se incubaron en ausencia
(A) o en presencia (B, C y D) de NGF en concentración de 20 ng/ml,
durante aproximadamente 4 días. El anticuerpo MNAC13 (4 \mug/ml)
inhibe totalmente la supervivencia y diferenciación inducida por
NGF, mientras que el anticuerpo de control 9E10 no las inhibe
(D).
Figura 6. El implante de células secretoras de
MNAC13 en cerebro de rata reduce significativamente el número de
neuronas colinérgicas del prosencéfalo basal. El fenotipo
colinérgico de neuronas del prosencéfalo basal de ratas P9 se
determinó mediante inmunorreactividad con la
colina-acetiltransferasa (ChAT), después del
implante intraventricular de hibridomas secretores de MNAC13 (B), de
células de mieloma de control (A), en el día P2. Nótese la notable
reducción del número de neuronas positivas a ChAT en las ratas en
las que se ha implantado el hibridoma secretor de MNAC13 (B). Línea
de escala: 65 \mum.
Figura 7. Formas recombinantes del mAB MNAC13
se unen a TrkA. Se utilizaron fagos con scFvMNAC13 (A), con
scFvMNAC13 soluble (B) y con el anticuerpo monoclonal MNAC13 de
origen (C) en un ensayo de ELISA, utilizando la inmunoadhesina TrkA
como antígeno en fase sólida, en presencia de concentraciones
crecientes de una inmunoadhesina TrkA soluble competidora.
\blacksquare: dilución de diez veces del anticuerpo con respecto a
\blacktriangle.
Figura 8. Inhibición del crecimiento de las
neuritas de células PC12, inducido por NGF, producida por el
anticuerpo recombinante ScFvMNAC13. La fracción periplásmica que
contiene el ScFvMNAC13 (B) o el fragmento de control ScFv (antifox
ScFv) se añadieron, junto con una concentración de 10 ng/ml de NGF,
a células PC12 inducidas durante 7 días con una concentración de 50
ng/ml de NGF, y sembradas en placa de nuevo al comienzo del ensayo.
El anticuerpo recombinante ScFvMNAC13 en B inhibe el nuevo
crecimiento de neuritas en las células PC12 resembradas e inducidas
con NGF, mediado por la activación de TrkA producida por NGF.
Células Balb/C 3T3 transfectadas, que expresan
10^{6} moléculas de TrkA humana por célula, se utilizaron en un
protocolo de inmunización congénica. Tres grupos de ratones Balb/C
hembras se inmunizaron con 10^{5}, 5x10^{5} y 10^{6} células
vivas por ratón, respectivamente. Después de cinco inyecciones a
intervalos de dos semanas, los sueros pre-fusión se
ensayaron con respecto a su capacidad para inhibir la unión del NGF
al receptor TrkA sobre células Balb/C 3T3 TrkA+. La mayor
inhibición de la unión del NGF se encontró en los sueros de ratones
a los que se habían inyectado 5x10^{5} células (inhibición de la
unión con una dilución 1/100).
Tres días después de una inyección de refuerzo de
células Balb/C 3T3 TrkA+, los ratones se sacrificaron, se extrajeron
los bazos y los esplenocitos se fusionaron con un mieloma NSO
(proporción 10:1) con polietilenglicol (PEG 1500), según la manera
descrita (Novak y col., 1991). El crecimiento de los hibridomas y
su selección se llevaron a cabo conforme a métodos estándar (Galfre
y Milstein, 1981).
Se purificó NGF 2,5 S a partir de glándulas
submandibulares de ratones y se yodó hasta alcanzar una actividad
específica del 10^{5} cpm/ng según la manera descrita (Cattaneo
y col., 1983). Una cantidad de 5x10^{4} células Balb/C 3T3 TrkA+
se sembraron en cada uno de los pocillos de microplacas de 96
pocillos, en un volumen de 50 \mul de medio de cultivo (DMEM con
FCS al 10%). Partes alícuotas de 50 \mul de sobrenadante de los
hibridomas se incubaron durante 1 hora con las células, seguido de
la adición de una disolución de ^{125}I-NGF
(5x10^{4} cpm/pocillo). Las placas se procesaron según la manera
descrita (Cattaneo y col., 1988). La unión inespecífica se
determinó en pocillos paralelos, en presencia de un exceso (5
\mug/ml) de NGF no marcado. En los pocillos paralelos, la unión
se llevó a cabo en presencia de un sobrenadante de un hibridoma no
relevante (Rab50) o de un anticuerpo neutralizador
anti-NGF (mAB \alphaD11, Cattaneo y col.,
1988).
Los receptores solubles TrkA y TrkB se
construyeron por ingeniería genética como inmunoadhesinas (Charnow y
Ashkenazi, 1996) uniendo el dominio extracelular del receptor TrkA
humano con la porción Fc de IgG2, constituida por una secuencia de
35 aminoácidos, seguida de los dominios CH2 y CH3. Las secuencias
de DNA que codifican las inmunoadhesinas TrkA y TrkB
(TrkA-IgG y TrkB-IgG) se clonaron
en baculovirus (virus de la polihedrosis nuclear de Autographa
californica, AcNPV) para su expresión en células de insectos
(kit de transfección Baculogold, Pharmigen
Ing.) y las proteínas se purificaron por cromatografía en
Sepharose-Proteína A a partir de medio de cultivo
libre de suero, de células de insectos High Five. Para el
ensayo de ELISA, TrkA-IgG y TrkB-IgG
se incubaron en una concentración de 2 \mug/ml y luego con 2 ó 20
ng/ml de MNAC13 e IgG anti-ratón, previamente
preabsorbidos sobre inmunoglobulinas de camélidos).
El anticuerpo monoclonal MNAC13 se purificó a
partir de sobrenadantes de hibridomas libres de suero mediante
cromatogarfía en Sepharose-Proteína A. Una cantidad
de 5x10^{4} células Balb/C 3T3 TrkA+ se incubaron con anticuerpo
MNAC13 purificado y se analizaron en un clasificador de células
activadas (FACS). Para determinar la inmunofluorescencia, las
células adherentes se fijaron con paraformaldehído al 3,7% en PBS,
se incubaron con MNAC13 purificado, y después con IgG
anti-ratón marcada con FITC, y se analizaron por
microscopía confocal (Olympus).
Células PC12 de rata (Greene y Tischler, 1976) se
incubaron en RPMI con suero de caballo inactivado por calor al 10% y
FCS al 5%. Para el ensayo biológico las células se transfirieron a
medio libre de suero y se incubaron con una concentración de 20
ng/ml de NGF durante de 4 a 6 días, en presencia o ausencia de
anticuerpos MNAC13 o de su versión Fv recombinante de cadena
sencilla (scFvMNAC13). Como alternativa, las células se incubaron
con una concentración de 50 ng/ml de NGF durante una semana y
después se separaron mecánicamente las neuritas para resembrarlas
en placa en presencia de una concentración de 10 ng/ml de NGF y la
adición del anticuerpo apropiado. El crecimiento de neuritas se
valoró 24-48 horas después.
La inyección intraventricular del hibridoma y el
análisis del fenotipo colinérgico de las neuronas del prosencéfalo
basal se realizaron esencialmente según la manera descrita (Molnar
y col., 1997 y 1998). Brevemente expuesto, células de hibridoma
MNAC13 y células de mieloma de control (células P3X63Ag8) se
resuspendieron en disolución de Hank (HBBS) a una densidad de
2x10^{5} células/\mul, y se inyectaron en el ventrículo lateral
derecho de ratas Wistar según la manera descrita (Molnar y col.,
1998). La inyección se llevó a cabo en el día 2
post-natal (P2) y los animales se sacrificaron para
los análisis en el día P8. Después de una perfusión bajo anestesia
los cerebros se procesaron para un estudio inmunohistoquímico con
ChAT según la manera descrita (Molnar y col., 1997 y 1998). El
nivel de anticuerpos MNAC13 en el fluido cerebroespinal se
determinó mediante un ensayo de ELISA, utilizando receptores
solubles TrkA como antígenos en fase sólida.
Para el estudio inmunoquímico con MNAC13, los
animales se anestesiaron con éter, y se perfundieron con PB (0,1 M,
pH 7,4) y luego con paraformaldehído al 4% en PB, a 4ºC durante 2
horas. Después de la disección, los cerebros se fijaron en
paraformaldehído al 4% en PB, a 4ºC durante 2 horas, se
transfirieron a sacarosa al 25% en PBS, luego se congelaron en
isopentano a -20ºC y se seccionaron con un criostato. Las secciones
de la corona que contienen el prosencéfalo basal se recogieron
sobre portaobjetos gelatinizados y se almacenaron a -20ºC hasta el
momento de ser procesados. Después de bloquear la unión
inespecífica en una disolución de FCS al 10%/BSA al 5% en
Tris-HCl 0,1 M, pH 7,4, Tritón
X-100 al 0,05%, las secciones se incubaron durante
la noche a 4ºC con anticuerpo anti-TrkA (6
\mug/ml) en FCS al 10%/BSA al 2% en Tris-HCl
0,1M, pH 7,4, Tritón X-100 al 0,05%. En los días
siguientes, las secciones se incubaron con IgG
anti-ratón biotinilada, durante 2 horas a
temperatura ambiente y durante 1 hora en el kit ABC
(Vector). La reacción se reveló en
3,3'-diaminobenzidina-HCl. Después
de la deshidratación, las secciones se montaron en DPX.
La clonación de las regiones variables del mAb
MNAC13 se llevó a cabo a partir de mRNA del hibridoma mediante una
PCR de las regiones variables. La PCR de las regiones variables se
llevó a cabo con una colección de cebadores oligonucleotídicos
correspondientes a inmunoglobulinas de ratón (Krebber y col.,
1997). Las regiones variables VH y VK amplificadas se ensamblaron en
un formato de scFv mediante PCR y se clonaron en un vector pDNA
(Bradbury y col., 1996). Después de un análisis de determinación de
la huella genética con la endonucleasa de restricción BstNI, que
confirmó una diversidad limitada de los fragmentos scFv
resultantes, las partículas fágicas que presentaban fragmentos scFv
se sometieron a un ensayo de ELISA utilizando
TrkA-IgG como antígeno en fase sólida. El ensayo se
desarrolló con anticuerpos secundarios anti-M13
acoplados a HRP. Los fagos identificados positivamente se analizaron
de nuevo y por último se utilizaron para producir fragmentos scFv
solubles en E. coli. Los sobrenadantes bacterianos se
ensayaron por ELISA frente a TrkA-IgG, utilizando
un anticuerpo monoclonal dirigido contra una secuencia marcadora SV5
(Hanke y col., 1992) presente en el fragmento scFv, seguido de IgG
anti-ratón conjugada con HRP.
Con el fin de producir anticuerpos capaces de
interferir con la actividad de unión a neurotrofinas del receptor
TrkA, se utilizó un protocolo de inmunización congénica. Células
Balb/C-3T3 que expresan el receptor TrkA humano,
producidas mediante la transfección del
proto-oncogén trk humano, se utilizaron para la
inmunización de un ratón Balb/C. Se encontró que el número de
células era crítico para la inducción de los anticuerpos séricos
que neutralizan la unión del NGF a las células diana.
Los sobrenadantes de los hibridomas se sometieron
a un análisis de su capacidad para inhibir la unión del ^{125}I a
células 3T3-TrkA+. Del total de 1.266 pocillos en
los que el crecimiento de los hibridomas estaba teniendo lugar,
solamente 4 mostraron una actividad de neutralización de NGF. Las
células correspondientes se subclonaron obteniéndose los clones
MNAC13, C30, C191 y C232. La capacidad de los anticuerpos
producidos por estos clones para inhibir la unión del NGF a células
3T3-TrkA+ se muestra en la Figura 1. Estos
anticuerpos anti-TrkA inhiben la unión del NGF tan
eficientemente como el anticuerpo neutralizador \alphaD11
anti-NGF (Figura 1). Mientras que este último
anticuerpo se une al sitio activo de NGF, los primeros anticuerpos
mencionados se unen al receptor TrkA, muy probablemente en el sitio
de reconocimiento para NGF o cerca de él. El anticuerpo IgG MNAC13
se seleccionó para estudios posteriores.
La inhibición de la unión del NGF se obtiene
mediante interacción directa de los anticuerpos con la porción
extracelular del receptor TrkA, según se demuestra por medio de
diversos estudios de unión realizados con una forma soluble del
receptor TrkA humano, construido por ingeniería genética en forma de
una inmunoadhesina (Chamow y Ashkenazi, 1996) en el que la porción
extracelular del receptor está fusionada a los dominios FC de las
inmunoglobulinas de camélidos (véase Métodos). La Figura 2 muestra
que el anticuerpo MNAC13 se une a la inmunoadhesina TrkA en un
ensayo de ELISA, mientras que no reacciona con la inmunoadhesina
TrkB. Esto confirma que el anticuerpo MNAC13 se une
específicamente a la porción extracelular de TrkA.
La Figura 3 muestra el resultado de un análisis
de FACS realizado con células 3T3 TrkA+, que demuestra que el
anticuerpo MNAC13 interacciona con el receptor humano expresado
sobre la membrana de células vivas. Un análisis de
inmunofluorescencia confirma este resultado.
La especificidad de especie de los anticuerpos
MNAC13 se ensayó con respecto a su capacidad para reconocer
receptores TrkA sobre neuronas de rata. Se tomaron secciones de
cerebro de rata de la región del prosencéfalo basal (Figura 4) que
es rica en neuronas positivas a TrkA. La intensa tinción obtenida
en el prosencéfalo basal con el anticuerpo MNAC13 (Figura 4A)
muestra que este anticuerpo, obtenido contra el receptor TrkA
humano, reconoce también su análogo en rata. El anticuerpo no tiñe
regiones cerebrales, tales como los núcleos habenulares mediales,
que se sabe que carecen de neuronas positivas a TrkA (Holtzmann y
col., 1995).
La capacidad del anticuerpo MNAC13 para inhibir
in vivo la activación biológica del receptor TrkA por acción
del ligando NGF, se estudió por lo tanto en células PC12, tanto
in vitro (Figura 5) como in vivo (Figura 6).
La diferenciación de las células PC12 inducida
por NGF (Figura 5B) se inhibe totalmente mediante la incubación de
los cultivos con anticuerpo MNAC13 (Figura 5C) en comparación con
la incubación con un anticuerpo no relevante (Figura 5D).
Las neuronas colinérgicas del prosencéfalo basal
son dianas muy conocidas para la acción del NGF en el sistema
nervioso central (Korsching, 1986; Holzmann y col., 1992). Las
células de hibridoma que secretan el anticuerpo MNAC13 se
implantaron en el ventrículo lateral de ratas recién nacidas dos
días después de su nacimiento y el fenotipo colinérgico de las
neuronas se estudió una semana más tarde mediante estudios
inmunohistoquímicos con anticuerpos dirigidos contra
colina-acetiltransferasa (ChAT). Esta estrategia
experimental se ha utilizado recientemente para estudiar los efectos
de células implantadas que secretan el anticuerpo monoclonal
\alphaD11 anti-NGF (Berardi y col., 1994; Molnar
y col., 1997 y 1998). Una semana después del implante, el nivel de
anticuerpos anti-TrkA encontrado en el fluido
cerebroespinal, determinado por ELISA, fue de 1,4 ng/\mul. Los
resultados de la Figura 8 muestran que el número de células
positivas a ChAT se reduce enormemente en los cerebros en los que
se implantó el anticuerpo anti-TrkA con respecto a
los controles (en los que se inyectó un mieloma no relevante). Una
evaluación cuantitativa del número de las neuronas positivas a ChAT
mostró que este número se reduce en el 70% en el tabique medial y
en el 77% en la banda diagonal de las ratas en las que se implantó
el anticuerpo MNAC13, con respecto a los controles. Una extensión
de este estudio a diferentes edades postnatales, comparando los
efectos obtenidos en un estudio previo, con un implante de células
que secretan un anticuerpo neutralizador anti-NGF
(Molnar y col., 1997, 1998), mostró que los efectos de privación del
sistema colinérgico del prosencéfalo basal, obtenidos con el
anticuerpo MNAC13 anti-TrkA, son mucho más
importantes.
Con el fin de expandir la variedad de la
aplicación, las regiones variables de este anticuerpo se clonaron y
se manipularon por ingeniería genética dando lugar a un anticuerpo
recombinante de menor tamaño.
La clonación de las regiones variables de
anticuerpos monoclonales a partir del correspondiente hibridoma
puede ser complicada, conduciendo a la clonación de regiones
variables de artefacto. Por ello, el autor del invento utilizó la
técnica según Winter y col., (1994). Las regiones variables de la
cadena pesada (VH) y de la cadena ligera (VL) del anticuerpo MNAC13
se amplificaron por PCR a partir de un cDNA derivado del mRNA del
hibridoma, utilizando cebadores oligonucleotídicos específicos de
IgG de ratón. Las regiones variables se ensamblaron formando un
fragmento Fv de cadena sencilla (scFv) mediante PCR y se clonaron
en el vector pDAN para permitir la expresión de fragmentos de
anticuerpo clonados, sobre la superficie del fago filamentoso. Los
fragmentos scFv representan un derivado biotecnológico del
anticuerpo de origen (Bird y col., 1988) y están constituidos por
las regiones variables de la cadena ligera y de la cadena pesada
unidas a un péptido enlazador que enlaza el extremo
C-terminal de la región VL con el extremo
N-terminal de la región VH. La secuencia de
nucleótidos del fragmento específico ScMNAC13 se muestra en SEQ ID
No. 1. La secuencia de aminoácidos se muestra en SEQ ID No. 2, en
la que la región VL va desde el aa 23 hasta el aa 134, y la región
VH va desde el aa 152 hasta el aa 276.
Las CDR (regiones determinantes de la
complementaridad del anticuerpo) son tres para cada una de las
cadenas, y en concreto son:
\newpage
VL CDR1 aa 46-55 de SEQ ID. No.
2;
VL CDR2 aa 71-77 de SEQ ID. No.
2;
VL CDR3 aa 110-1.119 de SEQ ID.
No. 2;
VH CDR1 aa 176-185 de SEQ ID. No.
2;
VH CDR2 aa 200-216 de SEQ ID. No.
2;
VH CDR3 aa 249-262 de SEQ ID. No.
2;
Las secuencias de las regiones variables de las
cadenas ligera y pasada del anticuerpo MNAC13 se comparó con la del
anticuerpo descrito en la solicitud de Patente, PCT n.º WO97/21732,
según se muestra en las Tablas 1 y 2.
Los fragmentos ScFv ensamblados por PCR se
expresaron en el fago filamentoso, en forma de una fusión con la
proteína del fago p3. La minibiblioteca de partículas del fago se
sometió a escrutinio con un ensayo de ELISA realizado con los fagos,
utilizando la inmunoadhesina TrkA como antígeno en fase sólida.
Esto condujo al aislamiento de los fagos positivos que expresan
sobre su superficie la versión ScFv del anticuerpo MNAC13 de origen
(scFvMNAC13). Las propiedades de unión de este fago, así como las
del fragmento scFv soluble derivado de este fago, se caracterizaron
mediante un ensayo de competición de ELISA (Figura 7). La
inmunoadhesina TrkA se acopló en la fase sólida y se incubó con las
partículas del fago que expresan MNAC13 (Figura 7A), con el
anticuerpo soluble ScFvMNAC13 (Figura 7B) o con el anticuerpo
MNAC13 de origen (Figura 7C), en presencia de cantidades solubles
de inmunoadhesina TrkA soluble competidora. Los resultados
confirman que la versión ScFv del anticuerpo monoclonal de origen,
ya sea la del fago o ya sea la secretada por E. coli, se une
a TrkA igual de eficientemente que el anticuerpo monoclonal de
origen.
La actividad biológica de ScFVMNAC13 se ensayó en
células PC12. Las células se incubaron durante una semana con 50
ng/ml de NGF, pasada la cual se volvieron a sembrar en placa en
presencia de NGF y del fragmento ScFVMNAC13 del anticuerpo. Como se
muestra en la Figura 8, el fragmento ScFVMNAC13 inhibe radicalmente
la extensión de las neuritas de las células PC12, confirmando que
el fragmento Fv recombinante, de cadena sencilla, del anticuerpo
MNAC13 conserva las propiedades de neutralización del anticuerpo de
origen. El pequeño tamaño de este anticuerpo polipeptídico sencillo
expande la variedad de aplicaciones del anticuerpo del invento,
facilitando su suministro y expresión en el sistema nervioso.
El anticuerpo MNAC13 se utilizó en una prueba de
nocicepción para determinar la sensibilidad al dolor por medio de la
"prueba de la placa caliente". Este experimento se llevó a
cabo según McMahon y col., (1995), utilizando el anticuerpo MNAC13
como inmunoadhesina. El anticuerpo se infundió por vía subcutánea
en una pata trasera de una rata adulta durante un período de tres
semanas o por medio de una minibomba osmótica. La sensibilidad a la
nocicepción se evaluó a intervalos utilizando la prueba de la placa
caliente (Eddy y Leimbach, 1953), que simula situaciones de
hiperalgesia después de una inflamación o un daño parcial en el
nervio. El estímulo nociceptivo induce en este caso una respuesta
(lamer la pata y/o saltar) que supone una coordinación integrada
mayor que la de un simple reflejo. Según el ensayo, el animal se
coloca en una jaula que contiene una placa calentada a la
temperatura deseada como inicial, usualmente 56ºC. La latencia de
cualquiera de las dos respuestas (lamer la pata y/o saltar) se mide
en animales de control (tratados con un anticuerpo no relevante) y
en los animales tratados con anticuerpo anti-TrkA.
El resultado del experimento demostró la manifestación de una
hipoalgesia notable, como lo indica un aumento significativo de la
latencia en el grupo tratado con MNAC13.
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<120> Anticuerpo monoclonal...
\vskip0.400000\baselineskip
<130>Novach
\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
\vskip0.400000\baselineskip
<160>2
\vskip0.400000\baselineskip
<170>PatentIn Versión 2.0
\vskip0.400000\baselineskip
<210>1
\vskip0.400000\baselineskip
<211>888
\vskip0.400000\baselineskip
<212>DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213>anticuerpo ScFv humano
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221>CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222>(1)...(888)
\vskip0.400000\baselineskip
<400>1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210>2
\vskip0.400000\baselineskip
<211>295
\vskip0.400000\baselineskip
<212>PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213>anticuerpo ScFv humano
\vskip0.400000\baselineskip
<400>2
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (24)
1. Un anticuerpo monoclonal, y sus derivados
sintéticos y biotecnológicos, capaz de reconocer y unirse al
receptor de alta afinidad del NGF (factor de crecimiento nervioso),
con actividad de tirosina-quinasa, denominado TrkA,
y de actuar como antagonista de la unión del NGF a TrkA.
2. Un anticuerpo monoclonal, y sus derivados
sintéticos y biotecnológicos según la reivindicación 1, en el que la
región variable de la cadena ligera tiene esencialmente la secuencia
que va desde el aa 23 hasta el aa 134 de SEQ ID No. 2.
3. Un anticuerpo monoclonal, y sus derivados
sintéticos y biotecnológicos según la reivindicación 1, en el que la
región variable de la cadena pesada tiene esencialmente la secuencia
que va desde el aa 152 hasta el aa 276 de SEQ ID No. 2.
4. Un anticuerpo monoclonal, y sus derivados
sintéticos y biotecnológicos según cualquiera de las
reivindicaciones previas, en el que la región variable de la cadena
ligera tiene esencialmente la secuencia que va desde el aa 23 hasta
el aa 134 de SEQ ID No. 2 y la región variable de la cadena pesada
tiene esencialmente la secuencia que va desde el aa 152 hasta el aa
276 de SEQ ID No. 2.
5. Un fragmento ScFv del anticuerpo monoclonal
según cualquiera de las reivindicaciones previas, que comprende al
menos una de las regiones variables de la cadena ligera o de la
cadena pesada del anticuerpo descrito en la reivindicación 1.
6. Un fragmento ScFv según la reivindicación 5,
que comprende una región variable de la cadena ligera y de la cadena
pesada del anticuerpo descrito en la reivindicación 1.
7. El fragmento ScFv según la reivindicación 6,
que comprende una secuencia enlazadora situada entre la región
variable de la cadena ligera y la región variable de la cadena
pesada.
8. El fragmento ScFv según la reivindicación 7,
en el que dicho fragmento ScFv tiene esencialmente la secuencia de
SEQ ID No. 2.
9. Un derivado sintético o biotecnológico según
la reivindicación 1, que comprende al menos una de las regiones
determinantes de la complementaridad (CDR) del anticuerpo, y que es
capaz de actuar como antagonista de la unión del NGF a TrkA.
10. Un derivado sintético o biotecnológico según
la reivindicación 9, en el que dicha región determinante de la
complementaridad (CDR) del anticuerpo y que es capaz de actuar como
antagonista de la unión del NGF a TrkA, está dentro de la región
variable de la cadena pesada que va desde el aa 152 hasta el aa 276
de SEQ ID No. 2.
11. Un ácido nucleico que codifica el anticuerpo
o sus derivados según cualquiera de las reivindicaciones
precedentes.
12. Un ácido nucleico según la reivindicación 11,
que codifica el fragmento ScFv de SEQ ID No. 2.
13. Un ácido nucleico según la reivindicación 12,
que tiene esencialmente la secuencia de SEQ ID No. 1.
14. El uso de un ácido nucleico según cualquiera
de las reivindicaciones 11-13, para la producción de
animales transgénicos no humanos, preferiblemente ratones, en el que
el anticuerpo o su derivado según las reivindicaciones
1-10, se expresa de un modo inducible o bajo el
control de promotores que determinan la expresión en el animal
adulto.
15. Un animal transgénico no humano que se
transforma con un ácido nucleico según las reivindicaciones
11-13, expresándose dicho ácido nucleico de un modo
inducible o bajo el control de promotores que determinan la
expresión en el animal adulto.
16. Un fago o un vector procariótico recombinante
que comprende y es capaz de expresar de manera correcta y efectiva
el ácido nucleico según una cualquiera de las reivindicaciones
11-13.
17. Un vector eucariótico recombinante que
comprende y es capaz de expresar de manera correcta y efectiva el
ácido nucleico según una cualquiera de las reivindicaciones
11-13.
18. Una composición farmacológica que comprende
una cantidad efectiva del vector según la reivindicación 17 y un
excipiente farmacéuticamente aceptable, para la terapia génica de
patologías neurológicas comprendidas dentro del siguiente grupo:
dolor crónico, dolor agudo, neuromas, tumores neoplásicos que
expresan TrkA.
19. Una composición farmacológica que comprende
una cantidad efectiva del anticuerpo monoclonal o de sus derivados
sintéticos o biotecnológicos según cualquiera de las
reivindicaciones 1-10, capaz de reconocer y unirse
al receptor de alta afinidad del NGF (factor de crecimiento
nervioso), con actividad de tirosina-quinasa,
denominado TrkA, y de actuar como antagonista de la unión del NGF a
TrkA, y un excipiente farmacéuticamente aceptable.
20. Una composición farmacológica según la
reivindicación 19, para el tratamiento de patologías neurológicas
comprendidas dentro del siguiente grupo: dolor crónico, dolor agudo,
neuromas, tumores neoplásicos que expresan TrkA.
21. Una composición farmacéutica que comprende
cantidades farmacéuticamente activas de NGF y del anticuerpo o de
sus derivados según cualquiera de las reivindicaciones
1-10.
22. Células eucarióticas manipuladas por
ingeniería genética, capaces de expresar el anticuerpo o sus
derivados según una cualquiera de las reivindicaciones
1-10.
23. Una composición farmacológica que comprende
células según la reivindicación 22, y un excipiente
farmacéuticamente aceptable, para la terapia génica de patologías
neurológicas comprendidas dentro del siguiente grupo: dolor crónico,
dolor agudo, neuromas, tumores neoplásicos que expresan TrkA.
24. Una composición que comprende una cantidad
efectiva del anticuerpo monoclonal o de sus derivados sintéticos o
biotecnológicos según cualquiera de las reivindicaciones
1-10, capaz de reconocer y unirse al receptor de
alta afinidad del NGF (factor de crecimiento nervioso), con
actividad de tirosina-quinasa, denominado TrkA, y de
actuar como antagonista de la unión del NGF a TrkA, y un excipiente
diagnósticamente aceptable para usar en pruebas diagnósticas in
vivo de "formación de imágenes".
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