JP4917226B2 - Ｎｇｆ−アンタゴニスト分子として作用するモノクローナル抗体、その合成及び生命工学的誘導体 - Google Patents
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Description
【０００１】
本発明は、ＮＧＦ−アンタゴニスト分子として作用するモノクローナル抗体、その合成及び生命工学的誘導体に関する。
さらに詳しくは、本発明は、ＴｒｋＡと称されるＮＧＦ［神経成長因子(Nerve Growth Factor) ］の高親和性チロシンキナーゼレセプターを認識することができ、及び結合することができ、またＮＧＦのＴｒｋＡへの結合に対するアンタゴニストとして作用するモノクローナル抗体、その合成及び組換え誘導体に関する。本発明はまた、このような分子の診断及び治療における使用及び関連組成物に関する。
【０００２】
神経栄養物質(neurotrophins) は、ファミリーの第一員であるＮＧＦ［神経成長因子(Nerve Growth Factor)、Levi-Montalicini,1987 ]に構造的に関連するペプチド成長因子のファミリーである(Barde,1994)。神経栄養物質は、末梢神経及び中枢神経系の両方の神経の分化及び生存、ならびにシナプス伝達を調整する。さらにまた、ＮＧＦは種々の非ニューロン組織及び免疫形細胞などの細胞に対して作用する。
ＮＧＦは標的細胞に存在する２種の膜レセプター、すなわち低親和性ｐ７５レセプター及び１４０ｋＤａ高親和性膜貫通糖タンパク質であるチロシンキナーゼ活性を有するＴｒｋＡ(Kaplan 等、1991,Klein等、1991) を介して作用する。ＴｒｋＡは、神経堤ニューロン、交感神経、ならびに基底前脳(basal forebrain) 及び線条体(corpus striatum) のコリン作用性ニューロンで発現され、ＮＧＦ活性に決定的なメディエーターである(Holtzman 等、1992;Verge等、1992) 。ＴｒｋＡはまた、Ｂリンパ細胞を包含する数種の非ニューロン組織及び細胞で発現される(Torcia 等、1996) 。
【０００３】
従来技術は、アルツハイマー病(Lindsay等、1994;Ebendal等、1991) 、及び真性糖尿病及びらい病(Anand等、1996) などのその他の疾病を包含する種々の神経変質性病気の処置のためのＮＧＦの使用の可能性を示唆している。しかしながら、初期の臨床試験は送達上の問題により、中枢神経系における薬物動力学により、及び過度の望ましくない刺激を導く中枢神経外のその他の末梢標的に対するＮＧＦのマイナスのアゴニスト物性により複雑化され、思わしくなかった。
従って、容易に送達されるＮＧＦ−ＴｒｋＡレセプター相互反応について選択性であるアンタゴニスト分子及びその薬理学的活性誘導体の開発に対するニーズがある。
【０００４】
さらにまた、種々の炎症状態におけるＮＧＦ過剰産生は、主要な求心性侵害受容器(primary afferent nociceptors)の痛覚感受性の増大に関連し、従って慢性の痛み症状の発生に関与する。組織損傷に対して敏感である一団の感覚ニューロン（侵害受容器）の数は、特にＮＧＦ依存性である。さらに、２種の現存する鎮痛薬（非ステロイド系抗炎症薬及びアヘン製剤）の欠点及び制限を考慮すると、ＮＧＦのような新しい相違する標的の提供は、当該技術に進歩をもたらす(Snider 及びMcMahon,1998) 。さらにまた、Levineにより示唆されているように(Levine,1998) 、ＮＧＦは慣用の医薬が効果的ではない痛み、特に炎症又は神経障害状態から生じる痛みの新しい治療法の設計に対して強力な標的を提供する。さらに、新しい研究は、無発汗症を伴うタイプ４痛み慢性無感覚の４種の非関連ケースにおいて、ＴｒｋＡ遺伝子の変異の存在及びその結果としての機能性ＮＧＦレセプターの不存在を立証して、痛みとＴｒｋＡ系との間の直接的関係を示した(Indo 等、1996; Wood,1996)。
【０００５】
従って、ＮＧＦ−ＴｒｋＡ系は痛み治療に対する強力な標的を提供する、すなわちＴｒｋＡ−有効アンタゴニストによる痛み神経障害症候群に拮抗することができる処置を提供する(Levine,1998;Snider 及びMcmahon,1998) 。
ＴｒｋＡレセプターｍＲＮＡの異常発現はまた、新生物疾病に関連していた。ＴｒｋＡ発現性腫瘍の予後、すなわち「造影」診断及び治療は、ＴｒｋＡに対して高親和性を有する抗体の適用領域もまた表わしている。事実として、これらの腫瘍において、ＴｒｋＡ結合剤は臨床診断、予後及び治療的処置の有用な道具である(Kramer 等、1997) 。
組換え抗体(Vaughan等、1998) は、それらの活性を擬装する小型分子の開発のために選択される出発剤を代表する(Le Sauteur 等、1995) 。
【０００６】
ＴｒｋＡ−アゴニストモノクローナル抗体は、Le Sauteur等、1996及びPCT出願No.WO97/21732 に開示された。開示されている唯一つの抗体（５Ｃ３）のアゴニスト活性は、これを本発明の目的に適するものにせず、またＴｒｋＡレセプターの過剰活性化を回避しなければならない状態の全部に対して適するものにしない。PCT 出願No.WO97/21732 は、アゴニスト抗体５Ｃ３の「造影」（“imaging ”）診断法としての使用を開示している。しかしながら、この抗体は、そのアゴニスト活性によって、レセプター活性化を防止しないかぎり、上記用途に使用することはできない。
【０００７】
従って、新規な治療活性を得るためには、特にアンタゴニストとして作用し、従って外因リガンド（ＮＧＦ）によるレセプター活性化を防止するのに理想的であり、また当該レセプターの活性化活性を有していないＴｒｋＡ抗体を提供するためには、ＮＧＦのＴｒｋＡへの結合を妨害するのに適する新規分子の開発が求められていることは明白である。さらにまた、このような抗体は、薬剤、すなわちＮＧＦ−ＴｒｋＡ相互反応を防止する合成及び組換えフラグメントの開発に有利に使用することができる。
本発明の発明者は、ＴｒｋＡと呼ばれるＮＧＦ−レセプターと相互反応することができる種々のモノクローナル抗体を単離した。これらの中で、ＭＮＡＣ１３と命名された抗体は、ＮＧＦのＴｒｋＡへの結合を阻害することによって、ＴｒｋＡの強力なアンタゴニストとして作用する。この抗体は、種々の生物学系において、ＮＧＦによるＴｒｋＡの機能的活性化の防止における非常に効果的な道具である。
【０００８】
この抗体は、Ｂａｌｂ／Ｃ３Ｔ３細胞上に発現されるヒト天然ＴｒｋＡレセプターによるＢａｌｂ／Ｃマウスの類遺伝子性免疫化(congenic immunization) により誘導された。このスクリーニングは、抗体のＮＧＦのＴｒｋＡ発現性細胞への結合の阻害能力に基づいている。このスクリーニングは、そのＮＧＦ結合性ドメインでＴｒｋＡに結合することができる抗体の単離を導き、これによりＮＧＦの結合が防止される。抗体ＭＮＡＣ１３は、種々の生物学系におけるＮＧＦによるＴｒｋＡの機能的活性化の防止に非常に有効である。本発明の発明者はまた、ＭＮＡＣ１３抗体の可変領域をコードする遺伝子をクローン化し、組換えＤＮＡ技術を用いることによって、減少されたサイズを有する機能的ポリペプチドへこのような領域を組立て（一本鎖Ｆｖフラグメント、ｓｃＦｖＭＮＡＣ１３）、これが親の抗体の性質を保有することを確認した。
【０００９】
アゴニスト抗体(agonist antibody)の用語は、レセプターそれ自体の固有リガンドの不存在下にレセプター抗原を活性化することができる抗体を意味する。
アンタゴニスト抗体(antagonist antibody) の用語は、抗原レセプターの活性部位を指向し、レセプターそれ自体に対する結合にかかわり固有リガンドと競合して、固有リガンドの活性を阻害することができる抗体を意味する。
抗体の合成及び生命工学的誘導体の用語は、当該抗体の機能上の性質を保有する化学的技術又は組換え技術により合成されるいずれの操作されたフラグメント(engineered fragment) をも意味する。
【００１０】
本発明の目的は、ＴｒｋＡと称されるＮＧＦ（神経成長因子）の高親和性チロシンキナーゼレセプターを認識することができ、及び結合することができ、またＮＧＦのＴｒｋＡへの結合に対するアンタゴニストとして作用するモノクローナル抗体、その合成及び生命工学的誘導体にある。
好適態様に従う場合、本発明の抗体は、配列番号：２のａａ．２３からａａ．１３４までの配列から本質的になる軽鎖可変領域を有する。
もう一つの好適態様に従う場合、本発明の抗体は、配列番号：２のａａ．１５２からａａ．２７６までの配列から本質的になる重鎖可変領域を有する。
もう一つの好適態様に従う場合、本発明の生命工学的誘導体は、
a)本発明の抗体又はその機能的誘導体の軽鎖可変領域、及び
b)本発明の抗体又はその機能的誘導体の重鎖可変領域、
を含むＳｃＦｖフラグメントである。
【００１１】
好ましくは、このＳｃＦｖフラグメントは、軽鎖の可変領域と重鎖の可変領域との間にリンカー配列を含有する。さらに好ましくは、このＳｃＦｖフラグメントは、配列番号：２の配列を本質的に有する。
本発明のもう一つの目的は、ＮＧＦのＴｒｋＡへの結合に対するアンタゴニストとして作用することができ、抗体の相補性を決定する領域（ＣＤＲ）を少なくとも一つ含む、モノクローナル抗体の合成及び生命工学的誘導体にある。好ましくは、この領域は重鎖の可変領域内にあり、さらに好ましくは、この領域は配列番号：２のａａ．１５２からａａ．２７６までの配列を包含する。
本発明の抗体又はその誘導体をコードする核酸は本発明の範囲内にある。好ましくは、この核酸は配列番号：２のＳｃＦｖフラグメントをコードし、さらに好ましくは、この核酸は配列番号：１の配列を有する。
【００１２】
本発明の核酸は、非ヒトトランスジェニック動物、好ましくはマウスを得るための導入遺伝子(transgenes)として有利に使用することができ、この場合、抗体は誘導可能な方法で、又は成熟動物における発現を決定するプロモーターの制御下に発現される。これらの動物は、ＮＧＦ／ＴｒｋＡ相互作用を阻害するヒト疾病、特に神経変質性疾病用の研究及び試験試薬として有利に使用することができる。トランスジェニック非ヒト動物は、標準的技術により、すなわちAllen 等、1987に記載された技術を用いて得ることができる。
ＴｒｋＡ遺伝子の抑制に基づくトランスジェニックモデル(Smeyne 等、1994)は、生後１〜２週間以内に致死的表現型(lethal phenotype)を示し、従って成熟し、老化した神経系におけるＴｒｋＡの研究には不適である。抗体発現性トランスジェニック動物は、Piccioli等、1991; 1995 により開示されている。
【００１３】
本発明の核酸を包含し、この核酸を正確に、また効果的に発現することができるファージ又は原核生物ベクター(prokaryotic vector)は、本発明の範囲内にある。
本発明の核酸を包含し、この核酸を正確に、また効果的に発現することができる組換え真核生物ベクター(eukaryotic vector) 及びこの神経学的疾病の遺伝子治療用組換えベクターを含有する医薬組成物はまた、本発明の範囲内にある。このような疾病には、これらに制限されないものとして、次の群：慢性の痛み、急性の痛み、神経腫、ＴｒＫＡ発現性新生物腫瘍が包含される。
【００１４】
ＴｒｋＡと称されるＮＧＦ（神経成長因子）の高親和性チロシンキナーゼレセプターを認識することができ、及びこれと結合することができ、またＮＧＦのＴｒｋＡへの結合に対するアンタゴニストとして作用するモノクローナル抗体、その合成又は生命工学的誘導体の有効量及び調剤上で許容される担体を含有する医薬組成物は、本発明の範囲内にある。本発明の組成物は、これらに制限されないものとして、次の群：慢性の痛み、急性の痛み、神経腫、ＴｒＫＡ発現性新生物腫瘍を包含する神経学的疾病の処置に有利に使用することができる。
ＮＧＦが治療において望ましくない或る種の付随作用を有することがあることを考慮して、本発明はまた、医薬活性量のＮＧＦ及び医薬活性量の本発明による抗体又はその誘導体を含有する医薬組成物に関する。このような組成物は、ＮＧＦの望ましくない作用を末梢レベルで阻害することができるはずである。
【００１５】
本発明のもう一つの目的は、本発明の抗体又はその生命工学的及び合成誘導体を発現することができる操作細胞(engineered cells)、ならびにこのような細胞を含有する医薬組成物であって、これらに制限されないものとして、次の群：慢性の痛み、急性の痛み、神経腫、ＴｒＫＡ発現性新生物腫瘍を包含する神経学的疾病の遺伝子治療用医薬組成物にある。
本発明による抗体の特異性及び望ましくない誘導作用の不存在の観点から、本発明による抗体は、インビボ「造影」診断用組成物に有利に使用することができる。
本発明を、例示的であるが制限的でないその態様に言及して説明する。添付の図面を参照することができる。
【００１６】
方法
免疫化方法
１０5 ヒトＴｒｋＡ分子／細胞を発現するＢａｌｂ／Ｃ ３Ｔ３トランスフェクションした細胞を、類遺伝子性コンジェニック免疫化法に使用した。３群の雌のＢａｌｂ／Ｃマウスを、それぞれ１０5 、５×１０5 及び１０6 の生存細胞／マウスで免疫化した。２週間の間隔で５回の注射後、融合前血清を、ＴｒｋＡ＋Ｂａｌｂ／Ｃ ３Ｔ３細胞におけるＮＧＦのＴｒｋＡレセプターに対する結合を阻害するそれらの能力について試験した。ＮＧＦ結合の最大阻害は、５×１０5 細胞を注射したマウスからの血清で見出された（１／１００稀釈における結合阻害）。
ハイブリドーマ製造
開示されているように(Novak等、1991) 、ＴｒｋＡ＋Ｂａｌｂ／Ｃ ３Ｔ３細胞のブースト注射後の３日目に、マウスを犠牲にし、脾臓を取り出し、次いで脾臓細胞を、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ１５００）によりＮＳＯ骨髄腫に融合させた（１０：１比）。ハイブリドーマ成長及び選択は、標準方法に従って行った(Galfre 及びMilstein、1981) 。
【００１７】
ＴｒｋＡ＋Ｂａｌｂ／Ｃ ３Ｔ３細胞に対する 125 Ｉ結合の阻害
開示されているように(Cattaneo 等、1983) 、２，５Ｓ ＮＧＦを、マウス顎下腺から精製し、１０5 ｃｐｍ／ｎｇの特異活性にヨウ素化した。５×１０4 ＴｒｋＡ＋Ｂａｌｂ／Ｃ ３Ｔ３細胞を、培養培地（ＦＣＳ１０％含有ＤＭＥＭ）５０μｌの容積で９６ウエルミクロプレートの各ウエル中にプレート形成した。ハイブリドーマ上清の５０μｌアリコートを、細胞とともに１時間にわたりインキュベートし、次いで125 Ｉ−ＮＧＦ溶液（５×１０4 ｃｐｍ／ウエル）を添加した。これらのプレートを開示されているように処理した(Cattaneo 等、1988) 。非特異的結合は、過剰（５μｇ／ｍｌ）の無標識ＮＧＦの存在下に、平行ウエルで測定した。平行ウエルにおいて、結合は無関係ハイブリドーマ上清（Ｒａｂ５０）又は中和性抗−ＮＧＦ（ｍＡＢαＤ１１、Cattaneo等、1988）の存在下に行った。
【００１８】
ＥＬＩＳＡ
可溶性ＴｒｋＡ及びＴｒｋＢレセプターを、ヒトＴｒｋＡレセプターの細胞外ドメインを３５アミノ酸配列から構成されているＩｇＧ２のＦｃ部分に結合させ、次いでＣＨ２及びＣＨ３ドメインに結合させることによって、イムノアドヘシンとして操作した(Chamow 及びAshkenazi 、1996) 。ＴｒｋＡ及びＴｒｋＡイムノアドヘシン（ＴｒｋＡ−ＩｇＧ及びＴｒｋＢ−ＩｇＧ）をコードするＤＮＡ配列を、昆虫細胞における発現にかかわりバキュロウイルス［オートグラファ カリホルニア ニュークレア ポリヘドロシス ウイルス(Autographa Califonica nuclear polyhedrosis virus)、ＡｃＮＰＶ］中にクローン化し［バキュロゴールド トランスフェクション キット(Baculogold transfection kit) 、Pharmingen Ing. ］、このタンパク質をハイ ファイブ(High Five) 昆虫細胞の血清を含まない培養培地からプロテインＡ−セファロースクロマトグラフイにより精製した。ＥＬＩＳＡアッセイするために、ＴｒｋＡ−ＩｇＧ及びＴｒｋＢ−ＩｇＧを２μｇ／ｍｌでインキュベートし、次いでラクダ免疫グロブリン上に予め予備吸着させた２又は２０ｎｇ／ｍｌのＭＮＡＣ１３及び抗マウスＩｇＧとともにインキュベートした。
【００１９】
免疫蛍光分析
ＭＮＡＣ１３モノクローナル抗体を、血清を含まないハイブリドーマ上清からプロテインＡ−セファロースクロマトグラフイにより精製した。５×１０4 ＴｒｋＡ＋３Ｔ３ Ｂａｌｂ／Ｃ細胞を、ＭＮＡＣ１３精製抗体とともにインキュベートし、次いで活性化された細胞選別装置(sorter)（ＦＡＣＳ）で分析した。免疫蛍光分析するために、付着性細胞をＰＢＳ中の３．７％パラホルムアルデヒドで固定し、精製ＭＮＡＣ１３とともに、次いでＦＩＴＣ標識した抗マウスＩｇＧとともにインキュベートし、次いで共焦点顕微鏡(Olympus) により分析した。
【００２０】
ＰＣ１２細胞によるＮＧＦバイオアッセイ
ラットＰＣ１２細胞(Greene 及びTischler、1976) を、１０％加熱不活性化ウマ血清及び５％ＦＣＳとともにＲＰＭＩで培養した。バイオアッセイのために、これらの細胞を血清を含まない培地に移し、ＭＮＡＣ１３抗体又はその一本鎖組換えＦｖバージョン（ｓｃＦｖＭＮＡＣ１３）の存在又は不存在下に４〜６日間、ＮＧＦ２０ｎｇ／ｍｌとともにインキュベートした。別法として、これらの細胞を、ＮＧＦ５０ｎｇ／ｍｌとともに１週間にわたりインキュベートし、次いで神経突起から機械的に分離し、相当する抗体の添加及びＮＧＦ１０ｎｇ／ｍｌの存在下に再プレート形成した。神経突起成長は、２４〜４８時間後に評価した。
【００２１】
脳室内ハイブリドーマ注入及び免疫化学
脳室内ハイブリドーマ注入及び基底前脳ニューロンのコリン作用性表現型の分析を本質的に、開示されている方法で行った(Molnar 等、1997及び1998) 。簡単に説明すると、開示されているように(Molnar 等、1998) 、ＭＮＡＣ１３ハイブリドーマ細胞及び対照骨髄腫細胞（Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８）細胞を、２×１０5 細胞／μｌでハンク(Hank)（ＨＢＢＳ）溶液に再懸濁し、次いでウイスター(Wistar)ラットの右側脳室中に注入した。この注入は、生後２日目（Ｐ２）に行い、Ｐ８日目に分析用に犠牲にした。麻酔下に潅流させた後、開示されているように(Molnar 等、1997及び1998) 、脳をａＣｈＡＴ免疫組織化学用に処理した。脳脊髄液（ＣＳＦ）中のＭＮＡＣ１３抗体のレベルを、固相抗原としてＴｒｋＡレセプターを用いるＥＬＩＳＡ分析により測定した。
【００２２】
ＭＮＡＣ１３による免疫組織化学試験の場合、動物をエーテルで麻酔し、ＰＢ（０．１Ｍ、ｐＨ７．４）を潅流させ、次いで４℃で２時間、４％パラホルムアルデヒド／ＰＢを潅流させた。解剖後、脳を４℃で２時間、４％パラホルムアルデヒド／ＰＢ中で固定し、２５％スクロース／ＰＢＳ中に移し、次いで−２０℃においてイソペンタン中で凍結させ、次いで低温保持装置を用いて切開した。基底前脳を含む脳室区分をゼラチン処理したスライド上に採取し、操作するまで、−２０℃で保存した。トリス(Tris)ＨＣｌ（０．１Ｍ、ｐＨ７．４）、０．０５％トリトン(Triton)−１００中の１０％ＦＣＳ／５％ＢＳＡ溶液中で非特異的結合をブロックした後、これらの区分を４℃で一夜にわたり、トリス(Tris)ＨＣｌ（０．１Ｍ、ｐＨ７．４）、０．０５％トリトン(Triton)−１００中の１０％ＦＣＳ／２％ＢＳＡ中で抗−ＴｒｋＡ（６μｇ／ｍｌ）と共にインキュベートした。翌日、これらの区分を室温で２時間、次いでＡＢＣキット(Vector)で１時間、ビオチニル化(biotynilated)抗マウスＩｇＧとともにインキュベートした。この反応は３，３´−ジアミノベンジジンＨＣｌ中で進展させた。脱水後、これらの区分をＤＰＸに配置した。
【００２３】
ｍＡｂＭＮＡＣ１３の可変領域のクローニング
ｍＡｂＭＮＡＣ１３の可変領域のクローニングは、可変領域ＰＣＲによりハイブリドーマｍＲＮＡから行った。可変領域ＰＣＲはマウス免疫グロブリン用の一組のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて行った(Krebber等、1997) 。増幅されたＶＨ及びＶＫ可変領域を、ＰＣＲによりｓｃＦｖホーマットで組立て、次いでｐＤＮＡベクター中にクローン化した(Bradbury 等、1996) 。ＢｓｔＮＩ制限エンドヌクレアーゼを用いるフィンガープリント分析後（これにより生成するｓｃＦＶｓの制限された多様性が確認される）、ｓｃＦＶフラグメントを表わすファージ粒子を、固相抗原としてＴｒｋＡ−ＩｇＧを用いるＥＬＩＳＡに付した。このアッセイは二次ＨＲＰ結合した抗Ｍ１３抗体により展開させた。陽性と同定されたファージをさらにアッセイし、最終的に、イー・コリ(E.coli)における可溶性ｓｃＦｖフラグメントの生成に使用した。細菌上清を、ｓｃＦｖフラグメント中に存在するＳＶ５タグに対するモノクローナル抗体を用いてＴｒｋＡ−ＩｇＧに対してＥＬＩＳＡによりアッセイし(Hanke等、1992) 、次いでＨＲＰ結合した抗マウスＩｇＧによりアッセイした。
【００２４】
結果
ＮＧＦのＴｒｋＡに対する結合を阻害するモノクローナル抗体の製造及び特徴確認
ＴｒｋＡレセプターの神経栄養物質結合活性を妨害することができる抗体を製造するために、類遺伝子性免疫化方法を使用した。ヒトtrkプロト癌遺伝子のトランスフェクションによって生成されたヒトＴｒｋＡレセプターを発現するＢａｌｂ／Ｃ−３Ｔ３細胞を、Ｂａｌｂ／Ｃマウスの免疫化に使用した。細胞数は標的細胞に結合するＮＧＦを中和する血清抗体の誘導に決定的であることが見出された。
【００２５】
ハイブリドーマ上清を３Ｔ３−ＴｒｋＡ＋細胞に対する125 Ｉの結合の阻害にかかわるそれらの能力について評価した。ハイブリドーマ成長が生じた１２６６個のウエルの中で、４個のみがＮＧＦ中和活性を示した。相当する細胞をサブクローニングし、ＭＮＡＣ１３、Ｃ３０、Ｃ１９１及びＣ２３２クローンを得た。これらのクローンにより産生される抗体の３Ｔ３−ＴｒｋＡ＋細胞に対するＮＧＦの結合を阻害する能力は、図１に示されている。これらの抗−ＴｒｋＡ抗体は、中和性抗−ＮＧＦαＤ１１抗体と同様に効果的に、ＮＧＦの結合を阻害する（図１）。後者はＮＧＦの活性部位に結合するのに対して、前者は、おそらくＮＧＦ認識部位又はその付近でＴｒｋＡレセプターに結合する。ＩｇＧＭＮＡＣ１３抗体を引き続く研究用に選択した。
【００２６】
ＮＧＦ結合の阻害は、可溶性形態のヒトＴｒｋＡレセプターに対する種々の結合性試験によって証明されるように、イムノアドヘシンとして操作された(Chamow及びAshkenazi、1996)ＴｒｋＡレセプターであって、レセプターの細胞外部分をラクダ免疫グロブリンのＦＣドメインに融合させるもの（方法の項参照）、の細胞外部分と抗体との直接的相互反応によって得られる。図２は、ＭＮＡＣ１３抗体が、ＥＬＩＳＡアッセイにおいてＴｒｋＡイムノアドヘシンに結合するが、ＴｒｋＢイムノアドヘシンとは反応しないことを示している。このことは、ＭＮＡＣ１３抗体がＴｒｋＡの細胞外部分に特異的に結合することを確認する。
【００２７】
図３は、３Ｔ３ＴｒｋＡ＋細胞に対するＦＡＣＳ分析の結果を示しており、ＭＮＡＣ１３抗体が生存している細胞の膜で発現されたヒトレセプターと相互作用することを証明している。免疫蛍光分析は、この結果を確認する。
ＭＮＡＣ１３抗体の種特異性を、ラットのニューロンにおけるそのＴｒｋＡレセプターを認識する能力に基づいて試験した。ラット脳の切片を、ＴｒｋＡ陽性ニューロンに富んでいる基底前脳領域から採取した（図４）。この基底前脳でＭＮＡＣ１３抗体により得られた強い染色は、このヒトＴｒｋＡレセプターに対して得られた抗体がまた、そのラット同等物を認識することを示す。この抗体は、陽性ＴｒｋＡニューロンに欠けていることが知られている中央小帯核(medial habenular nuclei)のような脳領域は染色しない(Holtzmann等、1995)。
【００２８】
ＭＮＡＣ１３抗体によるＴｒｋＡ媒介生物学的作用の機能的ブロック
従って、ＮＧＦリガンドによるＴｒｋＡレセプターの生物学的活性化のインビボ阻害にかかわるＭＮＡＣ１３抗体の能力をＰＣ１２細胞においてインビトロ（図５）及びインビボ（図６）で試験した。
ＰＣ１２細胞のＮＧＦ誘発分化（図５Ｂ）は、無関係抗体とのインキュベーション（図５Ｄ）に比較して、培養物をＭＮＡＣ１３抗体とともにインキュベートすることによって完全に阻害される（図５Ｃ）。
【００２９】
基底前脳のコリン作用性ニューロンは、中枢神経系におけるＮＧＦの作用にかかわる周知の標的である(Korsching、1986;Holtzman等、1992)。ＭＮＡＣ１３抗体を分泌するハイブリドーマ細胞を、生後２日目の新生児ラットの側脳室に移植し、次いでニューロンのコリン作用性表現型を、１週間後（Ｐ９）にコリンアセチルトランスフェラーゼ（ＣｈＡＴ）に対する抗体による免疫組織化学的方法により試験した。この実験手段は、最近に、抗−ＮＧＦモノクローナル抗体αＤ１１を分泌する移植細胞の効果の試験に使用されている(Berardi等、1994;Molnar等、1997及び1998)。移植後の１週間、ＥＬＩＳＡにより測定して、脳脊髄液中の抗−ＴｒｋＡ抗体レベルは、１．４ｎｇ／μｌであることが見出された。図６に示されている結果は、ＣｈＡＴ陽性細胞の数が、対照（無関係骨髄腫を注入）と比較して、抗−ＴｒｋＡ抗体を移植した脳で劇的に減少したことを示している。陽性ＣｈＡＴニューロンの数の定量的評価は、この数が対照に比較して、ＭＮＡＣ１３抗体移植ラットの中央隔壁(medial septum)で７０％まで減少し、またダイアゴナルバンド(diagonal band)で７７％まで減少することを示した。この試験を種々の生後日数について拡大試験により、抗−ＮＧＦ中和性抗体を分泌する細胞を移植した(Molnar等、1997;1998)、従来の試験で得られた効果と比較すると、抗−ＴｒｋＡ ＭＮＡＣ１３抗体により得られた基底前脳のコリン作用系の欠乏効果がよりいっそう厳しいものであることを示した。
【００３０】
格別に減少されたサイズを有する組換え機能性形態のｍＡＢ ＭＮＡＣ１３の単離
用途範囲を拡大させるために、この抗体の可変領域をクローン化し、より小さいサイズの組換え抗体に加工した。
相当するハイブリドーマからのモノクローナル抗体の可変領域のクローニングは、複雑であることがあり、人工的可変領域のクローニングに帰着する。従って、発明者は、Winter等による技術(1994)を使用した。ＭＮＡＣ１３抗体の可変重鎖（ＶＨ）及び可変軽鎖（ＶＬ）領域を、マウスＩｇＧ特異性オリゴヌクレオチドプライマーを用いて、ハイブリドーマｍＲＮＡから誘導されたｃＤＮＡからＰＣＲによって増幅させた。これらの可変領域を、ＰＣＲによって一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）中に組入れ、次いでｐＤＮＡベクター中にクローン化し、繊維状ファージの表面におけるクローン化した抗体フラグメントの発現を可能にした。ＳｃＦｖフラグメントは、元の抗体(Bird等、1988)の生命工学的誘導体の代表例であり、ＶＬ領域のＣ末端がＶＨ領域のＮ末端に結合するリンカーペプチドに結合した可変軽鎖領域及び可変重鎖領域からなる。ＳｃＭＮＡＣ１３特異性フラグメントのヌクレオチド配列を配列番号：１に示す。アミノ酸配列は、配列番号：２に示されており、この配列において、ＶＬ領域はａａ．２３からａａ．１３４までであり、ＶＨ領域はａａ．１５２からａａ．２７６までである。
【００３１】
これらのＣＤＲ（抗体相補性を決定する領域）は、各鎖について３個であり、特に下記のとおりである：
ＶＬ ＣＤＲ１ 配列番号：２のａａ．４６〜５５
ＶＬ ＣＤＲ２ 配列番号：２のａａ．７１〜７７
ＶＬ ＣＤＲ３ 配列番号：２のａａ．１１０〜１１１９
ＶＨ ＣＤＲ１ 配列番号：２のａａ．１７６〜１８５
ＶＨ ＣＤＲ２ 配列番号：２のａａ．２００〜２１６
ＶＨ ＣＤＲ３ 配列番号：２のａａ．２４９〜２６２。
表１及び２に示されているように、ＭＮＡＣ１３抗体の軽鎖可変領域及び重鎖可変領域の配列を、特許出願PCT No.WO97/21732に記載されている抗体の配列と比較した。
【００３２】
【００３３】
【００３４】
ＰＣＲ組込みＳｃＦＶフラグメントを、ｐ３ファージタンパク質への融合として、繊維状ファージ上で発現させた。このファージ粒子のミニライブラリイを、固相抗原としてＴｒｋＡイムノアドヘシンを用いて、ファージ上でＥＬＩＳＡアッセイによりスクリーニングした。このスクリーニングは、ＭＮＡＣ１３の親の抗体のｓｃＦｖバージョン（ｓｃＦｖＭＮＡＣ１３）を、それらの表面上で発現する陽性ファージの単離を導いた。このファージの結合物性及びこのファージから誘導されたｓｃＦｖ可溶性フラグメントの結合物性を、競合ＥＬＩＳＡアッセイにより特性決定した（図７）。ＴｒｋＡイムノアドヘシンを固相に結合し、次いで増加する量の競合する可溶性ＴｒｋＡイムノアドヘシンの存在下に、ＭＮＡＣ１３発現性ファージ粒子とともに（図７Ａ）、ＳｃＦｖＭＮＡＣ１３可溶性抗体とともに（図７Ｂ）又は親のＭＮＡＣ１３抗体とともに（図７Ｃ）、インキュベートした。この結果は、ファージ上の、又はＥ．ｃｏｌｉにより分泌される親のモノクローナル抗体のＳｃＦｖバージョンが、親のモノクローナル抗体と同様なほど効果的にＴｒｋＡに結合することを確証した。
【００３５】
ＳｃＦｖＭＮＡＣ１３の生物学的活性をＰＣ１２細胞で試験した。この細胞を、５０ｎｇ／ｍｌのＮＧＦとともに１週間にわたりインキュベートし、次いでこれらをＮＧＦ及び抗体ＳｃＦｖＭＮＡＣ１３フラグメントの存在下に再プレート形成した。図８に示されているように、ＳｃＦｖＭＮＡＣ１３フラグメントはＰＣ１２細胞からの神経突起の伸張を劇的に阻害した。このことは、ＭＮＡＣ１３抗体の組換え一本鎖Ｆｖが親の抗体の中和物性を保有することを確証する。この一本鎖ポリペプチド抗体の小さいサイズは、本発明の抗体の用途範囲を拡大し、神経組織内におけるその放出及び発現を助長する。
【００３６】
侵害受容試験 (nociception test)
ＭＮＡＣ１３抗体を侵害受容試験に使用し、「ホットプレート試験」により痛み感受性を測定した。この試験は、イムノアドヘシンとして抗体ＭＮＡＣ１３を使用して、McMahon等(1995)に従い行った。この抗体を成熟ラットの後肢に、３週間にわたり皮下注入するか又は浸透圧利用ミニポンプにより注入した。侵害受容感受性は、炎症又は神経の部分的損傷後の痛覚過敏状態を擬装するホットプレート試験(Eddy及びLeimbach、1953)を用いて或る間隔で評価した。侵害受容性刺激は、単純な反射よりも大きい集積した共同作用と見做される応答（足をなめる行為及び／又は跳躍）のような場合を誘発する。この試験に従い、動物を基礎温度として所望の温度（通常５６゜）に加熱したプレートを有するオリに入れる。２種の応答（足をなめる行為及び／又は跳躍）のいずれかの潜伏期間を、対照動物（無関係抗体で処置）及び抗−ＴｒｋＡ抗体で処置した動物で測定した。この試験結果は、ＭＮＡＣ１３処置群における潜伏期間の格別の増加によって指摘されるように、顕著な侵害受容の発現を証明した。
【００３７】
【００３８】
【図面の簡単な説明】
【図１】 125 Ｉ−ＮＧＦのＴｒｋＡ＋Ｂａｌｂ／Ｃ ３Ｔ３細胞への結合の阻害。ハイブリドーマ上清を、ＴｒｋＡ＋Ｂａｌｂ／Ｃ ３Ｔ３細胞とともにプレインキュベートし、次いで125Ｉ−ＮＧＦを添加した。このヒストグラムは、相違する抗体による特異的結合性ＮＧＦ細胞の阻害を示している。この特異的結合は、過剰の無標識ＮＧＦの存在下に得られた総結合からの控除によって評価した。報告されている数値は、３回の実施の平均値である。
【図２】 ＭＮＡＣ１３はＴｒｋＡレセプターの細胞外ドメインを認識する。イムノアドヘシン(immunoadhesins)として操作しされた可溶性ＴｒｋＡ及びＴｒｋＢレセプターを、ＥＬＩＳＡアッセイ用の固相抗原として使用し、次いで精製したＭＮＡＣ１３抗体２又は２０ｎｇ／ｍｌとともにインキュベートした。
【図３】 ＭＮＡＣ１３は生存している細胞でＴｒｋＡレセプターを認識する。Ｂａｌｂ／Ｃ ３Ｔ３又はＴｒｋＡ＋Ｂａｌｂ／Ｃ ３Ｔ３細胞を、ＭＮＡＣ１３抗体とともにインキュベートし、次いでＦＡＣＳ分析に付した。
【図４】 ＭＮＡＣ１３はラット基底前脳ニューロンでＴｒｋＡレセプターを識別する。Ｐ１０ラット基底前脳の線条体を、ＭＮＡＣ１３抗体の存在(A)又は不存在(B)下にインキュベートした。目盛りバー：９８μｍ。
【図５】 ＭＮＡＣ１３はラットＰＣ１２細胞のＮＧＦ誘発分化を阻害する。ＰＣ１２細胞を、血清を含まない培地に移し、ＮＧＦ２０ｎｇ／ｍｌの不存在下(A)又は存在下(B、C及びD)に、約４日間にわたりインキュベートした。ＭＮＡＣ１３抗体（４μｇ／ｍｌ）は、ＮＧＦ誘発生存及び分化を完全に阻害するが、対照抗体９Ｅ１０は阻害しない(D)。
【図６】 ラット脳へのＭＮＡＣ１３分泌細胞の移植はコリン作用性基底前脳ニューロンの数を格別に減少させる。Ｐ２日目に、対照骨髄腫(A)細胞のＭＮＡＣ１３ハイブリドーマ(B)を脳室内移植したのに加え、Ｐ９ラット基底前脳ニューロンのコリン作用性表現型を、コリンアセチルトランスフェラーゼ（ＣｈＡＴ）との免疫反応性によって測定した。ＭＮＡＣ１３移植ラット(B)のＣｈＡＴ陽性ニューロン(positive neurons)の数の格別の減少に留意すべきである。目盛りバー：６５μｍ。
【図７】 組換え型のＭＮＡＣ１３ｍＡＢはＴｒｋＡに結合する。増加する濃度の競合性可溶性ＴｒｋＡ−イムノアドヘシンの存在下に、固相抗原としてＴｒｋＡイムノアドヘシンを用いるＥＬＩＳＡアッセイにおいて、ｓｃＦｖＭＮＡＣ１３(A)を有するファージ、可溶性ｓｃＦｖＭＮＡＣ１３(B)及び親のモノクローナル抗体ＭＮＡＣ１３(C)を使用した。■：▲に対して１０倍の抗体稀釈。
【図８】 組換え抗体ＳｃＦｖＭＮＡＣ１３によるＰＣ１２細胞のＮＧＦ誘発神経突起成長の阻害。組換えＳｃＦｖＭＮＡＣ１３(B)又はＳｃＦｖ対照フラグメント（antifox ScFv)を含有する周辺質のフラクションを、ＮＧＦ１０ｎｇ／ｍｌとともに、ＮＧＦ５０ｎｇ／ｍｌにより７日間で誘導されたＰＣ１２細胞に添加し、次いでアッセイ開始時点で再度、プレート形成した。Ｂの組換えＳｃＦｖＭＮＡＣ１３抗体は、ＮＧＦによるＴｒｋＡの活性化により媒介される再プレート形成したＮＧＦ誘発Ｐ１２細胞の神経突起の再成長を阻害する。
【配列表】
本発明は、ＮＧＦ−アンタゴニスト分子として作用するモノクローナル抗体、その合成及び生命工学的誘導体に関する。
さらに詳しくは、本発明は、ＴｒｋＡと称されるＮＧＦ［神経成長因子(Nerve Growth Factor) ］の高親和性チロシンキナーゼレセプターを認識することができ、及び結合することができ、またＮＧＦのＴｒｋＡへの結合に対するアンタゴニストとして作用するモノクローナル抗体、その合成及び組換え誘導体に関する。本発明はまた、このような分子の診断及び治療における使用及び関連組成物に関する。
【０００２】
神経栄養物質(neurotrophins) は、ファミリーの第一員であるＮＧＦ［神経成長因子(Nerve Growth Factor)、Levi-Montalicini,1987 ]に構造的に関連するペプチド成長因子のファミリーである(Barde,1994)。神経栄養物質は、末梢神経及び中枢神経系の両方の神経の分化及び生存、ならびにシナプス伝達を調整する。さらにまた、ＮＧＦは種々の非ニューロン組織及び免疫形細胞などの細胞に対して作用する。
ＮＧＦは標的細胞に存在する２種の膜レセプター、すなわち低親和性ｐ７５レセプター及び１４０ｋＤａ高親和性膜貫通糖タンパク質であるチロシンキナーゼ活性を有するＴｒｋＡ(Kaplan 等、1991,Klein等、1991) を介して作用する。ＴｒｋＡは、神経堤ニューロン、交感神経、ならびに基底前脳(basal forebrain) 及び線条体(corpus striatum) のコリン作用性ニューロンで発現され、ＮＧＦ活性に決定的なメディエーターである(Holtzman 等、1992;Verge等、1992) 。ＴｒｋＡはまた、Ｂリンパ細胞を包含する数種の非ニューロン組織及び細胞で発現される(Torcia 等、1996) 。
【０００３】
従来技術は、アルツハイマー病(Lindsay等、1994;Ebendal等、1991) 、及び真性糖尿病及びらい病(Anand等、1996) などのその他の疾病を包含する種々の神経変質性病気の処置のためのＮＧＦの使用の可能性を示唆している。しかしながら、初期の臨床試験は送達上の問題により、中枢神経系における薬物動力学により、及び過度の望ましくない刺激を導く中枢神経外のその他の末梢標的に対するＮＧＦのマイナスのアゴニスト物性により複雑化され、思わしくなかった。
従って、容易に送達されるＮＧＦ−ＴｒｋＡレセプター相互反応について選択性であるアンタゴニスト分子及びその薬理学的活性誘導体の開発に対するニーズがある。
【０００４】
さらにまた、種々の炎症状態におけるＮＧＦ過剰産生は、主要な求心性侵害受容器(primary afferent nociceptors)の痛覚感受性の増大に関連し、従って慢性の痛み症状の発生に関与する。組織損傷に対して敏感である一団の感覚ニューロン（侵害受容器）の数は、特にＮＧＦ依存性である。さらに、２種の現存する鎮痛薬（非ステロイド系抗炎症薬及びアヘン製剤）の欠点及び制限を考慮すると、ＮＧＦのような新しい相違する標的の提供は、当該技術に進歩をもたらす(Snider 及びMcMahon,1998) 。さらにまた、Levineにより示唆されているように(Levine,1998) 、ＮＧＦは慣用の医薬が効果的ではない痛み、特に炎症又は神経障害状態から生じる痛みの新しい治療法の設計に対して強力な標的を提供する。さらに、新しい研究は、無発汗症を伴うタイプ４痛み慢性無感覚の４種の非関連ケースにおいて、ＴｒｋＡ遺伝子の変異の存在及びその結果としての機能性ＮＧＦレセプターの不存在を立証して、痛みとＴｒｋＡ系との間の直接的関係を示した(Indo 等、1996; Wood,1996)。
【０００５】
従って、ＮＧＦ−ＴｒｋＡ系は痛み治療に対する強力な標的を提供する、すなわちＴｒｋＡ−有効アンタゴニストによる痛み神経障害症候群に拮抗することができる処置を提供する(Levine,1998;Snider 及びMcmahon,1998) 。
ＴｒｋＡレセプターｍＲＮＡの異常発現はまた、新生物疾病に関連していた。ＴｒｋＡ発現性腫瘍の予後、すなわち「造影」診断及び治療は、ＴｒｋＡに対して高親和性を有する抗体の適用領域もまた表わしている。事実として、これらの腫瘍において、ＴｒｋＡ結合剤は臨床診断、予後及び治療的処置の有用な道具である(Kramer 等、1997) 。
組換え抗体(Vaughan等、1998) は、それらの活性を擬装する小型分子の開発のために選択される出発剤を代表する(Le Sauteur 等、1995) 。
【０００６】
ＴｒｋＡ−アゴニストモノクローナル抗体は、Le Sauteur等、1996及びPCT出願No.WO97/21732 に開示された。開示されている唯一つの抗体（５Ｃ３）のアゴニスト活性は、これを本発明の目的に適するものにせず、またＴｒｋＡレセプターの過剰活性化を回避しなければならない状態の全部に対して適するものにしない。PCT 出願No.WO97/21732 は、アゴニスト抗体５Ｃ３の「造影」（“imaging ”）診断法としての使用を開示している。しかしながら、この抗体は、そのアゴニスト活性によって、レセプター活性化を防止しないかぎり、上記用途に使用することはできない。
【０００７】
従って、新規な治療活性を得るためには、特にアンタゴニストとして作用し、従って外因リガンド（ＮＧＦ）によるレセプター活性化を防止するのに理想的であり、また当該レセプターの活性化活性を有していないＴｒｋＡ抗体を提供するためには、ＮＧＦのＴｒｋＡへの結合を妨害するのに適する新規分子の開発が求められていることは明白である。さらにまた、このような抗体は、薬剤、すなわちＮＧＦ−ＴｒｋＡ相互反応を防止する合成及び組換えフラグメントの開発に有利に使用することができる。
本発明の発明者は、ＴｒｋＡと呼ばれるＮＧＦ−レセプターと相互反応することができる種々のモノクローナル抗体を単離した。これらの中で、ＭＮＡＣ１３と命名された抗体は、ＮＧＦのＴｒｋＡへの結合を阻害することによって、ＴｒｋＡの強力なアンタゴニストとして作用する。この抗体は、種々の生物学系において、ＮＧＦによるＴｒｋＡの機能的活性化の防止における非常に効果的な道具である。
【０００８】
この抗体は、Ｂａｌｂ／Ｃ３Ｔ３細胞上に発現されるヒト天然ＴｒｋＡレセプターによるＢａｌｂ／Ｃマウスの類遺伝子性免疫化(congenic immunization) により誘導された。このスクリーニングは、抗体のＮＧＦのＴｒｋＡ発現性細胞への結合の阻害能力に基づいている。このスクリーニングは、そのＮＧＦ結合性ドメインでＴｒｋＡに結合することができる抗体の単離を導き、これによりＮＧＦの結合が防止される。抗体ＭＮＡＣ１３は、種々の生物学系におけるＮＧＦによるＴｒｋＡの機能的活性化の防止に非常に有効である。本発明の発明者はまた、ＭＮＡＣ１３抗体の可変領域をコードする遺伝子をクローン化し、組換えＤＮＡ技術を用いることによって、減少されたサイズを有する機能的ポリペプチドへこのような領域を組立て（一本鎖Ｆｖフラグメント、ｓｃＦｖＭＮＡＣ１３）、これが親の抗体の性質を保有することを確認した。
【０００９】
アゴニスト抗体(agonist antibody)の用語は、レセプターそれ自体の固有リガンドの不存在下にレセプター抗原を活性化することができる抗体を意味する。
アンタゴニスト抗体(antagonist antibody) の用語は、抗原レセプターの活性部位を指向し、レセプターそれ自体に対する結合にかかわり固有リガンドと競合して、固有リガンドの活性を阻害することができる抗体を意味する。
抗体の合成及び生命工学的誘導体の用語は、当該抗体の機能上の性質を保有する化学的技術又は組換え技術により合成されるいずれの操作されたフラグメント(engineered fragment) をも意味する。
【００１０】
本発明の目的は、ＴｒｋＡと称されるＮＧＦ（神経成長因子）の高親和性チロシンキナーゼレセプターを認識することができ、及び結合することができ、またＮＧＦのＴｒｋＡへの結合に対するアンタゴニストとして作用するモノクローナル抗体、その合成及び生命工学的誘導体にある。
好適態様に従う場合、本発明の抗体は、配列番号：２のａａ．２３からａａ．１３４までの配列から本質的になる軽鎖可変領域を有する。
もう一つの好適態様に従う場合、本発明の抗体は、配列番号：２のａａ．１５２からａａ．２７６までの配列から本質的になる重鎖可変領域を有する。
もう一つの好適態様に従う場合、本発明の生命工学的誘導体は、
a)本発明の抗体又はその機能的誘導体の軽鎖可変領域、及び
b)本発明の抗体又はその機能的誘導体の重鎖可変領域、
を含むＳｃＦｖフラグメントである。
【００１１】
好ましくは、このＳｃＦｖフラグメントは、軽鎖の可変領域と重鎖の可変領域との間にリンカー配列を含有する。さらに好ましくは、このＳｃＦｖフラグメントは、配列番号：２の配列を本質的に有する。
本発明のもう一つの目的は、ＮＧＦのＴｒｋＡへの結合に対するアンタゴニストとして作用することができ、抗体の相補性を決定する領域（ＣＤＲ）を少なくとも一つ含む、モノクローナル抗体の合成及び生命工学的誘導体にある。好ましくは、この領域は重鎖の可変領域内にあり、さらに好ましくは、この領域は配列番号：２のａａ．１５２からａａ．２７６までの配列を包含する。
本発明の抗体又はその誘導体をコードする核酸は本発明の範囲内にある。好ましくは、この核酸は配列番号：２のＳｃＦｖフラグメントをコードし、さらに好ましくは、この核酸は配列番号：１の配列を有する。
【００１２】
本発明の核酸は、非ヒトトランスジェニック動物、好ましくはマウスを得るための導入遺伝子(transgenes)として有利に使用することができ、この場合、抗体は誘導可能な方法で、又は成熟動物における発現を決定するプロモーターの制御下に発現される。これらの動物は、ＮＧＦ／ＴｒｋＡ相互作用を阻害するヒト疾病、特に神経変質性疾病用の研究及び試験試薬として有利に使用することができる。トランスジェニック非ヒト動物は、標準的技術により、すなわちAllen 等、1987に記載された技術を用いて得ることができる。
ＴｒｋＡ遺伝子の抑制に基づくトランスジェニックモデル(Smeyne 等、1994)は、生後１〜２週間以内に致死的表現型(lethal phenotype)を示し、従って成熟し、老化した神経系におけるＴｒｋＡの研究には不適である。抗体発現性トランスジェニック動物は、Piccioli等、1991; 1995 により開示されている。
【００１３】
本発明の核酸を包含し、この核酸を正確に、また効果的に発現することができるファージ又は原核生物ベクター(prokaryotic vector)は、本発明の範囲内にある。
本発明の核酸を包含し、この核酸を正確に、また効果的に発現することができる組換え真核生物ベクター(eukaryotic vector) 及びこの神経学的疾病の遺伝子治療用組換えベクターを含有する医薬組成物はまた、本発明の範囲内にある。このような疾病には、これらに制限されないものとして、次の群：慢性の痛み、急性の痛み、神経腫、ＴｒＫＡ発現性新生物腫瘍が包含される。
【００１４】
ＴｒｋＡと称されるＮＧＦ（神経成長因子）の高親和性チロシンキナーゼレセプターを認識することができ、及びこれと結合することができ、またＮＧＦのＴｒｋＡへの結合に対するアンタゴニストとして作用するモノクローナル抗体、その合成又は生命工学的誘導体の有効量及び調剤上で許容される担体を含有する医薬組成物は、本発明の範囲内にある。本発明の組成物は、これらに制限されないものとして、次の群：慢性の痛み、急性の痛み、神経腫、ＴｒＫＡ発現性新生物腫瘍を包含する神経学的疾病の処置に有利に使用することができる。
ＮＧＦが治療において望ましくない或る種の付随作用を有することがあることを考慮して、本発明はまた、医薬活性量のＮＧＦ及び医薬活性量の本発明による抗体又はその誘導体を含有する医薬組成物に関する。このような組成物は、ＮＧＦの望ましくない作用を末梢レベルで阻害することができるはずである。
【００１５】
本発明のもう一つの目的は、本発明の抗体又はその生命工学的及び合成誘導体を発現することができる操作細胞(engineered cells)、ならびにこのような細胞を含有する医薬組成物であって、これらに制限されないものとして、次の群：慢性の痛み、急性の痛み、神経腫、ＴｒＫＡ発現性新生物腫瘍を包含する神経学的疾病の遺伝子治療用医薬組成物にある。
本発明による抗体の特異性及び望ましくない誘導作用の不存在の観点から、本発明による抗体は、インビボ「造影」診断用組成物に有利に使用することができる。
本発明を、例示的であるが制限的でないその態様に言及して説明する。添付の図面を参照することができる。
【００１６】
方法
免疫化方法
１０5 ヒトＴｒｋＡ分子／細胞を発現するＢａｌｂ／Ｃ ３Ｔ３トランスフェクションした細胞を、類遺伝子性コンジェニック免疫化法に使用した。３群の雌のＢａｌｂ／Ｃマウスを、それぞれ１０5 、５×１０5 及び１０6 の生存細胞／マウスで免疫化した。２週間の間隔で５回の注射後、融合前血清を、ＴｒｋＡ＋Ｂａｌｂ／Ｃ ３Ｔ３細胞におけるＮＧＦのＴｒｋＡレセプターに対する結合を阻害するそれらの能力について試験した。ＮＧＦ結合の最大阻害は、５×１０5 細胞を注射したマウスからの血清で見出された（１／１００稀釈における結合阻害）。
ハイブリドーマ製造
開示されているように(Novak等、1991) 、ＴｒｋＡ＋Ｂａｌｂ／Ｃ ３Ｔ３細胞のブースト注射後の３日目に、マウスを犠牲にし、脾臓を取り出し、次いで脾臓細胞を、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ１５００）によりＮＳＯ骨髄腫に融合させた（１０：１比）。ハイブリドーマ成長及び選択は、標準方法に従って行った(Galfre 及びMilstein、1981) 。
【００１７】
ＴｒｋＡ＋Ｂａｌｂ／Ｃ ３Ｔ３細胞に対する 125 Ｉ結合の阻害
開示されているように(Cattaneo 等、1983) 、２，５Ｓ ＮＧＦを、マウス顎下腺から精製し、１０5 ｃｐｍ／ｎｇの特異活性にヨウ素化した。５×１０4 ＴｒｋＡ＋Ｂａｌｂ／Ｃ ３Ｔ３細胞を、培養培地（ＦＣＳ１０％含有ＤＭＥＭ）５０μｌの容積で９６ウエルミクロプレートの各ウエル中にプレート形成した。ハイブリドーマ上清の５０μｌアリコートを、細胞とともに１時間にわたりインキュベートし、次いで125 Ｉ−ＮＧＦ溶液（５×１０4 ｃｐｍ／ウエル）を添加した。これらのプレートを開示されているように処理した(Cattaneo 等、1988) 。非特異的結合は、過剰（５μｇ／ｍｌ）の無標識ＮＧＦの存在下に、平行ウエルで測定した。平行ウエルにおいて、結合は無関係ハイブリドーマ上清（Ｒａｂ５０）又は中和性抗−ＮＧＦ（ｍＡＢαＤ１１、Cattaneo等、1988）の存在下に行った。
【００１８】
ＥＬＩＳＡ
可溶性ＴｒｋＡ及びＴｒｋＢレセプターを、ヒトＴｒｋＡレセプターの細胞外ドメインを３５アミノ酸配列から構成されているＩｇＧ２のＦｃ部分に結合させ、次いでＣＨ２及びＣＨ３ドメインに結合させることによって、イムノアドヘシンとして操作した(Chamow 及びAshkenazi 、1996) 。ＴｒｋＡ及びＴｒｋＡイムノアドヘシン（ＴｒｋＡ−ＩｇＧ及びＴｒｋＢ−ＩｇＧ）をコードするＤＮＡ配列を、昆虫細胞における発現にかかわりバキュロウイルス［オートグラファ カリホルニア ニュークレア ポリヘドロシス ウイルス(Autographa Califonica nuclear polyhedrosis virus)、ＡｃＮＰＶ］中にクローン化し［バキュロゴールド トランスフェクション キット(Baculogold transfection kit) 、Pharmingen Ing. ］、このタンパク質をハイ ファイブ(High Five) 昆虫細胞の血清を含まない培養培地からプロテインＡ−セファロースクロマトグラフイにより精製した。ＥＬＩＳＡアッセイするために、ＴｒｋＡ−ＩｇＧ及びＴｒｋＢ−ＩｇＧを２μｇ／ｍｌでインキュベートし、次いでラクダ免疫グロブリン上に予め予備吸着させた２又は２０ｎｇ／ｍｌのＭＮＡＣ１３及び抗マウスＩｇＧとともにインキュベートした。
【００１９】
免疫蛍光分析
ＭＮＡＣ１３モノクローナル抗体を、血清を含まないハイブリドーマ上清からプロテインＡ−セファロースクロマトグラフイにより精製した。５×１０4 ＴｒｋＡ＋３Ｔ３ Ｂａｌｂ／Ｃ細胞を、ＭＮＡＣ１３精製抗体とともにインキュベートし、次いで活性化された細胞選別装置(sorter)（ＦＡＣＳ）で分析した。免疫蛍光分析するために、付着性細胞をＰＢＳ中の３．７％パラホルムアルデヒドで固定し、精製ＭＮＡＣ１３とともに、次いでＦＩＴＣ標識した抗マウスＩｇＧとともにインキュベートし、次いで共焦点顕微鏡(Olympus) により分析した。
【００２０】
ＰＣ１２細胞によるＮＧＦバイオアッセイ
ラットＰＣ１２細胞(Greene 及びTischler、1976) を、１０％加熱不活性化ウマ血清及び５％ＦＣＳとともにＲＰＭＩで培養した。バイオアッセイのために、これらの細胞を血清を含まない培地に移し、ＭＮＡＣ１３抗体又はその一本鎖組換えＦｖバージョン（ｓｃＦｖＭＮＡＣ１３）の存在又は不存在下に４〜６日間、ＮＧＦ２０ｎｇ／ｍｌとともにインキュベートした。別法として、これらの細胞を、ＮＧＦ５０ｎｇ／ｍｌとともに１週間にわたりインキュベートし、次いで神経突起から機械的に分離し、相当する抗体の添加及びＮＧＦ１０ｎｇ／ｍｌの存在下に再プレート形成した。神経突起成長は、２４〜４８時間後に評価した。
【００２１】
脳室内ハイブリドーマ注入及び免疫化学
脳室内ハイブリドーマ注入及び基底前脳ニューロンのコリン作用性表現型の分析を本質的に、開示されている方法で行った(Molnar 等、1997及び1998) 。簡単に説明すると、開示されているように(Molnar 等、1998) 、ＭＮＡＣ１３ハイブリドーマ細胞及び対照骨髄腫細胞（Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８）細胞を、２×１０5 細胞／μｌでハンク(Hank)（ＨＢＢＳ）溶液に再懸濁し、次いでウイスター(Wistar)ラットの右側脳室中に注入した。この注入は、生後２日目（Ｐ２）に行い、Ｐ８日目に分析用に犠牲にした。麻酔下に潅流させた後、開示されているように(Molnar 等、1997及び1998) 、脳をａＣｈＡＴ免疫組織化学用に処理した。脳脊髄液（ＣＳＦ）中のＭＮＡＣ１３抗体のレベルを、固相抗原としてＴｒｋＡレセプターを用いるＥＬＩＳＡ分析により測定した。
【００２２】
ＭＮＡＣ１３による免疫組織化学試験の場合、動物をエーテルで麻酔し、ＰＢ（０．１Ｍ、ｐＨ７．４）を潅流させ、次いで４℃で２時間、４％パラホルムアルデヒド／ＰＢを潅流させた。解剖後、脳を４℃で２時間、４％パラホルムアルデヒド／ＰＢ中で固定し、２５％スクロース／ＰＢＳ中に移し、次いで−２０℃においてイソペンタン中で凍結させ、次いで低温保持装置を用いて切開した。基底前脳を含む脳室区分をゼラチン処理したスライド上に採取し、操作するまで、−２０℃で保存した。トリス(Tris)ＨＣｌ（０．１Ｍ、ｐＨ７．４）、０．０５％トリトン(Triton)−１００中の１０％ＦＣＳ／５％ＢＳＡ溶液中で非特異的結合をブロックした後、これらの区分を４℃で一夜にわたり、トリス(Tris)ＨＣｌ（０．１Ｍ、ｐＨ７．４）、０．０５％トリトン(Triton)−１００中の１０％ＦＣＳ／２％ＢＳＡ中で抗−ＴｒｋＡ（６μｇ／ｍｌ）と共にインキュベートした。翌日、これらの区分を室温で２時間、次いでＡＢＣキット(Vector)で１時間、ビオチニル化(biotynilated)抗マウスＩｇＧとともにインキュベートした。この反応は３，３´−ジアミノベンジジンＨＣｌ中で進展させた。脱水後、これらの区分をＤＰＸに配置した。
【００２３】
ｍＡｂＭＮＡＣ１３の可変領域のクローニング
ｍＡｂＭＮＡＣ１３の可変領域のクローニングは、可変領域ＰＣＲによりハイブリドーマｍＲＮＡから行った。可変領域ＰＣＲはマウス免疫グロブリン用の一組のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて行った(Krebber等、1997) 。増幅されたＶＨ及びＶＫ可変領域を、ＰＣＲによりｓｃＦｖホーマットで組立て、次いでｐＤＮＡベクター中にクローン化した(Bradbury 等、1996) 。ＢｓｔＮＩ制限エンドヌクレアーゼを用いるフィンガープリント分析後（これにより生成するｓｃＦＶｓの制限された多様性が確認される）、ｓｃＦＶフラグメントを表わすファージ粒子を、固相抗原としてＴｒｋＡ−ＩｇＧを用いるＥＬＩＳＡに付した。このアッセイは二次ＨＲＰ結合した抗Ｍ１３抗体により展開させた。陽性と同定されたファージをさらにアッセイし、最終的に、イー・コリ(E.coli)における可溶性ｓｃＦｖフラグメントの生成に使用した。細菌上清を、ｓｃＦｖフラグメント中に存在するＳＶ５タグに対するモノクローナル抗体を用いてＴｒｋＡ−ＩｇＧに対してＥＬＩＳＡによりアッセイし(Hanke等、1992) 、次いでＨＲＰ結合した抗マウスＩｇＧによりアッセイした。
【００２４】
結果
ＮＧＦのＴｒｋＡに対する結合を阻害するモノクローナル抗体の製造及び特徴確認
ＴｒｋＡレセプターの神経栄養物質結合活性を妨害することができる抗体を製造するために、類遺伝子性免疫化方法を使用した。ヒトtrkプロト癌遺伝子のトランスフェクションによって生成されたヒトＴｒｋＡレセプターを発現するＢａｌｂ／Ｃ−３Ｔ３細胞を、Ｂａｌｂ／Ｃマウスの免疫化に使用した。細胞数は標的細胞に結合するＮＧＦを中和する血清抗体の誘導に決定的であることが見出された。
【００２５】
ハイブリドーマ上清を３Ｔ３−ＴｒｋＡ＋細胞に対する125 Ｉの結合の阻害にかかわるそれらの能力について評価した。ハイブリドーマ成長が生じた１２６６個のウエルの中で、４個のみがＮＧＦ中和活性を示した。相当する細胞をサブクローニングし、ＭＮＡＣ１３、Ｃ３０、Ｃ１９１及びＣ２３２クローンを得た。これらのクローンにより産生される抗体の３Ｔ３−ＴｒｋＡ＋細胞に対するＮＧＦの結合を阻害する能力は、図１に示されている。これらの抗−ＴｒｋＡ抗体は、中和性抗−ＮＧＦαＤ１１抗体と同様に効果的に、ＮＧＦの結合を阻害する（図１）。後者はＮＧＦの活性部位に結合するのに対して、前者は、おそらくＮＧＦ認識部位又はその付近でＴｒｋＡレセプターに結合する。ＩｇＧＭＮＡＣ１３抗体を引き続く研究用に選択した。
【００２６】
ＮＧＦ結合の阻害は、可溶性形態のヒトＴｒｋＡレセプターに対する種々の結合性試験によって証明されるように、イムノアドヘシンとして操作された(Chamow及びAshkenazi、1996)ＴｒｋＡレセプターであって、レセプターの細胞外部分をラクダ免疫グロブリンのＦＣドメインに融合させるもの（方法の項参照）、の細胞外部分と抗体との直接的相互反応によって得られる。図２は、ＭＮＡＣ１３抗体が、ＥＬＩＳＡアッセイにおいてＴｒｋＡイムノアドヘシンに結合するが、ＴｒｋＢイムノアドヘシンとは反応しないことを示している。このことは、ＭＮＡＣ１３抗体がＴｒｋＡの細胞外部分に特異的に結合することを確認する。
【００２７】
図３は、３Ｔ３ＴｒｋＡ＋細胞に対するＦＡＣＳ分析の結果を示しており、ＭＮＡＣ１３抗体が生存している細胞の膜で発現されたヒトレセプターと相互作用することを証明している。免疫蛍光分析は、この結果を確認する。
ＭＮＡＣ１３抗体の種特異性を、ラットのニューロンにおけるそのＴｒｋＡレセプターを認識する能力に基づいて試験した。ラット脳の切片を、ＴｒｋＡ陽性ニューロンに富んでいる基底前脳領域から採取した（図４）。この基底前脳でＭＮＡＣ１３抗体により得られた強い染色は、このヒトＴｒｋＡレセプターに対して得られた抗体がまた、そのラット同等物を認識することを示す。この抗体は、陽性ＴｒｋＡニューロンに欠けていることが知られている中央小帯核(medial habenular nuclei)のような脳領域は染色しない(Holtzmann等、1995)。
【００２８】
ＭＮＡＣ１３抗体によるＴｒｋＡ媒介生物学的作用の機能的ブロック
従って、ＮＧＦリガンドによるＴｒｋＡレセプターの生物学的活性化のインビボ阻害にかかわるＭＮＡＣ１３抗体の能力をＰＣ１２細胞においてインビトロ（図５）及びインビボ（図６）で試験した。
ＰＣ１２細胞のＮＧＦ誘発分化（図５Ｂ）は、無関係抗体とのインキュベーション（図５Ｄ）に比較して、培養物をＭＮＡＣ１３抗体とともにインキュベートすることによって完全に阻害される（図５Ｃ）。
【００２９】
基底前脳のコリン作用性ニューロンは、中枢神経系におけるＮＧＦの作用にかかわる周知の標的である(Korsching、1986;Holtzman等、1992)。ＭＮＡＣ１３抗体を分泌するハイブリドーマ細胞を、生後２日目の新生児ラットの側脳室に移植し、次いでニューロンのコリン作用性表現型を、１週間後（Ｐ９）にコリンアセチルトランスフェラーゼ（ＣｈＡＴ）に対する抗体による免疫組織化学的方法により試験した。この実験手段は、最近に、抗−ＮＧＦモノクローナル抗体αＤ１１を分泌する移植細胞の効果の試験に使用されている(Berardi等、1994;Molnar等、1997及び1998)。移植後の１週間、ＥＬＩＳＡにより測定して、脳脊髄液中の抗−ＴｒｋＡ抗体レベルは、１．４ｎｇ／μｌであることが見出された。図６に示されている結果は、ＣｈＡＴ陽性細胞の数が、対照（無関係骨髄腫を注入）と比較して、抗−ＴｒｋＡ抗体を移植した脳で劇的に減少したことを示している。陽性ＣｈＡＴニューロンの数の定量的評価は、この数が対照に比較して、ＭＮＡＣ１３抗体移植ラットの中央隔壁(medial septum)で７０％まで減少し、またダイアゴナルバンド(diagonal band)で７７％まで減少することを示した。この試験を種々の生後日数について拡大試験により、抗−ＮＧＦ中和性抗体を分泌する細胞を移植した(Molnar等、1997;1998)、従来の試験で得られた効果と比較すると、抗−ＴｒｋＡ ＭＮＡＣ１３抗体により得られた基底前脳のコリン作用系の欠乏効果がよりいっそう厳しいものであることを示した。
【００３０】
格別に減少されたサイズを有する組換え機能性形態のｍＡＢ ＭＮＡＣ１３の単離
用途範囲を拡大させるために、この抗体の可変領域をクローン化し、より小さいサイズの組換え抗体に加工した。
相当するハイブリドーマからのモノクローナル抗体の可変領域のクローニングは、複雑であることがあり、人工的可変領域のクローニングに帰着する。従って、発明者は、Winter等による技術(1994)を使用した。ＭＮＡＣ１３抗体の可変重鎖（ＶＨ）及び可変軽鎖（ＶＬ）領域を、マウスＩｇＧ特異性オリゴヌクレオチドプライマーを用いて、ハイブリドーマｍＲＮＡから誘導されたｃＤＮＡからＰＣＲによって増幅させた。これらの可変領域を、ＰＣＲによって一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）中に組入れ、次いでｐＤＮＡベクター中にクローン化し、繊維状ファージの表面におけるクローン化した抗体フラグメントの発現を可能にした。ＳｃＦｖフラグメントは、元の抗体(Bird等、1988)の生命工学的誘導体の代表例であり、ＶＬ領域のＣ末端がＶＨ領域のＮ末端に結合するリンカーペプチドに結合した可変軽鎖領域及び可変重鎖領域からなる。ＳｃＭＮＡＣ１３特異性フラグメントのヌクレオチド配列を配列番号：１に示す。アミノ酸配列は、配列番号：２に示されており、この配列において、ＶＬ領域はａａ．２３からａａ．１３４までであり、ＶＨ領域はａａ．１５２からａａ．２７６までである。
【００３１】
これらのＣＤＲ（抗体相補性を決定する領域）は、各鎖について３個であり、特に下記のとおりである：
ＶＬ ＣＤＲ１ 配列番号：２のａａ．４６〜５５
ＶＬ ＣＤＲ２ 配列番号：２のａａ．７１〜７７
ＶＬ ＣＤＲ３ 配列番号：２のａａ．１１０〜１１１９
ＶＨ ＣＤＲ１ 配列番号：２のａａ．１７６〜１８５
ＶＨ ＣＤＲ２ 配列番号：２のａａ．２００〜２１６
ＶＨ ＣＤＲ３ 配列番号：２のａａ．２４９〜２６２。
表１及び２に示されているように、ＭＮＡＣ１３抗体の軽鎖可変領域及び重鎖可変領域の配列を、特許出願PCT No.WO97/21732に記載されている抗体の配列と比較した。
【００３２】
ＰＣＲ組込みＳｃＦＶフラグメントを、ｐ３ファージタンパク質への融合として、繊維状ファージ上で発現させた。このファージ粒子のミニライブラリイを、固相抗原としてＴｒｋＡイムノアドヘシンを用いて、ファージ上でＥＬＩＳＡアッセイによりスクリーニングした。このスクリーニングは、ＭＮＡＣ１３の親の抗体のｓｃＦｖバージョン（ｓｃＦｖＭＮＡＣ１３）を、それらの表面上で発現する陽性ファージの単離を導いた。このファージの結合物性及びこのファージから誘導されたｓｃＦｖ可溶性フラグメントの結合物性を、競合ＥＬＩＳＡアッセイにより特性決定した（図７）。ＴｒｋＡイムノアドヘシンを固相に結合し、次いで増加する量の競合する可溶性ＴｒｋＡイムノアドヘシンの存在下に、ＭＮＡＣ１３発現性ファージ粒子とともに（図７Ａ）、ＳｃＦｖＭＮＡＣ１３可溶性抗体とともに（図７Ｂ）又は親のＭＮＡＣ１３抗体とともに（図７Ｃ）、インキュベートした。この結果は、ファージ上の、又はＥ．ｃｏｌｉにより分泌される親のモノクローナル抗体のＳｃＦｖバージョンが、親のモノクローナル抗体と同様なほど効果的にＴｒｋＡに結合することを確証した。
【００３５】
ＳｃＦｖＭＮＡＣ１３の生物学的活性をＰＣ１２細胞で試験した。この細胞を、５０ｎｇ／ｍｌのＮＧＦとともに１週間にわたりインキュベートし、次いでこれらをＮＧＦ及び抗体ＳｃＦｖＭＮＡＣ１３フラグメントの存在下に再プレート形成した。図８に示されているように、ＳｃＦｖＭＮＡＣ１３フラグメントはＰＣ１２細胞からの神経突起の伸張を劇的に阻害した。このことは、ＭＮＡＣ１３抗体の組換え一本鎖Ｆｖが親の抗体の中和物性を保有することを確証する。この一本鎖ポリペプチド抗体の小さいサイズは、本発明の抗体の用途範囲を拡大し、神経組織内におけるその放出及び発現を助長する。
【００３６】
侵害受容試験 (nociception test)
ＭＮＡＣ１３抗体を侵害受容試験に使用し、「ホットプレート試験」により痛み感受性を測定した。この試験は、イムノアドヘシンとして抗体ＭＮＡＣ１３を使用して、McMahon等(1995)に従い行った。この抗体を成熟ラットの後肢に、３週間にわたり皮下注入するか又は浸透圧利用ミニポンプにより注入した。侵害受容感受性は、炎症又は神経の部分的損傷後の痛覚過敏状態を擬装するホットプレート試験(Eddy及びLeimbach、1953)を用いて或る間隔で評価した。侵害受容性刺激は、単純な反射よりも大きい集積した共同作用と見做される応答（足をなめる行為及び／又は跳躍）のような場合を誘発する。この試験に従い、動物を基礎温度として所望の温度（通常５６゜）に加熱したプレートを有するオリに入れる。２種の応答（足をなめる行為及び／又は跳躍）のいずれかの潜伏期間を、対照動物（無関係抗体で処置）及び抗−ＴｒｋＡ抗体で処置した動物で測定した。この試験結果は、ＭＮＡＣ１３処置群における潜伏期間の格別の増加によって指摘されるように、顕著な侵害受容の発現を証明した。
【００３７】
【図面の簡単な説明】
【図１】 125 Ｉ−ＮＧＦのＴｒｋＡ＋Ｂａｌｂ／Ｃ ３Ｔ３細胞への結合の阻害。ハイブリドーマ上清を、ＴｒｋＡ＋Ｂａｌｂ／Ｃ ３Ｔ３細胞とともにプレインキュベートし、次いで125Ｉ−ＮＧＦを添加した。このヒストグラムは、相違する抗体による特異的結合性ＮＧＦ細胞の阻害を示している。この特異的結合は、過剰の無標識ＮＧＦの存在下に得られた総結合からの控除によって評価した。報告されている数値は、３回の実施の平均値である。
【図２】 ＭＮＡＣ１３はＴｒｋＡレセプターの細胞外ドメインを認識する。イムノアドヘシン(immunoadhesins)として操作しされた可溶性ＴｒｋＡ及びＴｒｋＢレセプターを、ＥＬＩＳＡアッセイ用の固相抗原として使用し、次いで精製したＭＮＡＣ１３抗体２又は２０ｎｇ／ｍｌとともにインキュベートした。
【図３】 ＭＮＡＣ１３は生存している細胞でＴｒｋＡレセプターを認識する。Ｂａｌｂ／Ｃ ３Ｔ３又はＴｒｋＡ＋Ｂａｌｂ／Ｃ ３Ｔ３細胞を、ＭＮＡＣ１３抗体とともにインキュベートし、次いでＦＡＣＳ分析に付した。
【図４】 ＭＮＡＣ１３はラット基底前脳ニューロンでＴｒｋＡレセプターを識別する。Ｐ１０ラット基底前脳の線条体を、ＭＮＡＣ１３抗体の存在(A)又は不存在(B)下にインキュベートした。目盛りバー：９８μｍ。
【図５】 ＭＮＡＣ１３はラットＰＣ１２細胞のＮＧＦ誘発分化を阻害する。ＰＣ１２細胞を、血清を含まない培地に移し、ＮＧＦ２０ｎｇ／ｍｌの不存在下(A)又は存在下(B、C及びD)に、約４日間にわたりインキュベートした。ＭＮＡＣ１３抗体（４μｇ／ｍｌ）は、ＮＧＦ誘発生存及び分化を完全に阻害するが、対照抗体９Ｅ１０は阻害しない(D)。
【図６】 ラット脳へのＭＮＡＣ１３分泌細胞の移植はコリン作用性基底前脳ニューロンの数を格別に減少させる。Ｐ２日目に、対照骨髄腫(A)細胞のＭＮＡＣ１３ハイブリドーマ(B)を脳室内移植したのに加え、Ｐ９ラット基底前脳ニューロンのコリン作用性表現型を、コリンアセチルトランスフェラーゼ（ＣｈＡＴ）との免疫反応性によって測定した。ＭＮＡＣ１３移植ラット(B)のＣｈＡＴ陽性ニューロン(positive neurons)の数の格別の減少に留意すべきである。目盛りバー：６５μｍ。
【図７】 組換え型のＭＮＡＣ１３ｍＡＢはＴｒｋＡに結合する。増加する濃度の競合性可溶性ＴｒｋＡ−イムノアドヘシンの存在下に、固相抗原としてＴｒｋＡイムノアドヘシンを用いるＥＬＩＳＡアッセイにおいて、ｓｃＦｖＭＮＡＣ１３(A)を有するファージ、可溶性ｓｃＦｖＭＮＡＣ１３(B)及び親のモノクローナル抗体ＭＮＡＣ１３(C)を使用した。■：▲に対して１０倍の抗体稀釈。
【図８】 組換え抗体ＳｃＦｖＭＮＡＣ１３によるＰＣ１２細胞のＮＧＦ誘発神経突起成長の阻害。組換えＳｃＦｖＭＮＡＣ１３(B)又はＳｃＦｖ対照フラグメント（antifox ScFv)を含有する周辺質のフラクションを、ＮＧＦ１０ｎｇ／ｍｌとともに、ＮＧＦ５０ｎｇ／ｍｌにより７日間で誘導されたＰＣ１２細胞に添加し、次いでアッセイ開始時点で再度、プレート形成した。Ｂの組換えＳｃＦｖＭＮＡＣ１３抗体は、ＮＧＦによるＴｒｋＡの活性化により媒介される再プレート形成したＮＧＦ誘発Ｐ１２細胞の神経突起の再成長を阻害する。
【配列表】
Claims (32)
- 軽鎖の可変領域が配列番号：２のａａ．２３からａａ．１３４までの配列を含み、及び重鎖の可変領域が配列番号：２のａａ．１５２からａａ．２７６までの配列を含む、ＴｒｋＡと称されるＮＧＦ（神経成長因子）の高親和性チロシンキナーゼレセプターを認識することができ、及び結合することができ、かつＮＧＦのＴｒｋＡへの結合に対するアンタゴニストとして作用する、モノクローナル抗体。
- ＴｒｋＡと称されるＮＧＦ（神経成長因子）の高親和性チロシンキナーゼレセプターを認識することができ、及び結合することができ、かつＮＧＦのＴｒｋＡへの結合に対するアンタゴニストとして作用する、配列番号：２の配列を含む、モノクローナル抗体のＳｃＦｖフラグメント。
- 請求項１又は２に記載の抗体をコードする核酸。
- 配列番号：２のＳｃＦｖフラグメントをコードする、請求項３に記載の核酸。
- 配列番号：１を含む、請求項４に記載の核酸。
- 非ヒトトランスジェニック動物、好ましくはマウスの製造における請求項３〜５のいずれかに記載の核酸の使用であって、請求項１又は２に記載の抗体を、誘導可能な方法で又は成熟動物における発現を決定するプロモーターの制御下に発現させる、上記使用。
- 請求項３〜５に記載の核酸により形質転換される非ヒトトランスジェニック動物であって、上記核酸が誘導可能な方法で又は成熟動物における発現を決定するプロモーターの制御下に発現される、上記非ヒトトランスジェニック動物。
- 請求項３〜５のいずれかに記載の核酸を含み、及び当該核酸を正確に、また効果的に発現することができるファージ又は原核生物組換えベクター。
- 請求項３〜５のいずれかに記載の核酸を含み、及びこの核酸を正確に、また効果的に発現することができる組換え真核生物ベクター。
- 有効量の請求項９に記載のベクター及び医薬上で許容される担体を含有する医薬組成物であって、次の群：慢性の痛み、急性の痛み、神経腫、ＴｒｋＡ発現性新生物腫瘍を包含する神経学的病気の遺伝子治療用医薬組成物。
- 有効量の請求項１又は２に記載されており、ＴｒｋＡと称されるＮＧＦ（神経成長因子）の高親和性チロシンキナーゼレセプターを認識することができ、及び結合することができ、かつＮＧＦのＴｒｋＡへの結合に対するアンタゴニストとして作用するモノクローナル抗体並びに医薬上で許容される担体を含有する医薬組成物。
- 次の群：慢性の痛み、急性の痛み、神経腫、ＴｒｋＡ発現性新生物腫瘍を包含する神経学的病気を処置するための請求項１１に記載の医薬組成物。
- 医薬活性量のＮＧＦ及び医薬活性量の請求項１又は２に記載の抗体を含有する医薬組成物。
- 請求項１又は２に記載の抗体を発現することができる真核生物操作細胞。
- 請求項１４に記載の細胞及び医薬上で許容される担体を含有する医薬組成物であって、次の群：慢性の痛み、急性の痛み、神経腫、ＴｒｋＡ発現性新生物腫瘍を包含する神経学的病気の遺伝子治療用医薬組成物。
- 有効量の請求項１又は２に記載されており、ＴｒｋＡと称されるＮＧＦ（神経成長因子）の高親和性チロシンキナーゼレセプターを認識することができ、及び結合することができ、かつＮＧＦのＴｒｋＡへの結合に対するアンタゴニストとして作用するモノクローナル抗体並びに診断上で許容される担体を含有する組成物であって、インビボ「造影」診断に使用するための組成物。
- ＴｒｋＡと称されるＮＧＦ（神経成長因子）の高親和性チロシンキナーゼレセプターを認識することができ、及び結合することができ、かつＮＧＦのＴｒｋＡへの結合に対するアンタゴニストとして作用し、かつＮＧＦによるＴｒｋＡの機能的活性を阻害し、かつ配列番号：２のａａ．４６から５５、配列番号：２のａａ．７１から７７及び配列番号：２のａａ．１１０から１１９で定義される軽鎖ＣＤＲ、並びに配列番号：２のａａ．１７６から１８５、配列番号：２のａａ．２００から２１６及び配列番号：２のａａ．２４９から２６２で定義される重鎖ＣＤＲであるＣＤＲによって特徴付けられる、モノクローナル抗体。
- 請求項１７に記載の抗体の軽鎖及び重鎖の可変領域を含む、請求項１７に記載のモノクローナル抗体のＳｃＦｖフラグメント。
- 軽鎖の可変領域と重鎖の可変領域の間のリンカー配列を含む、請求項１８に記載のＳｃＦｖフラグメント。
- 請求項１７〜１９のいずれかに記載の抗体をコードする核酸。
- 非ヒトトランスジェニック動物、好ましくはマウスの製造における請求項２０に記載の核酸の使用であって、請求項１７に記載の抗体又は請求項１８若しくは１９に記載のＳｃＦｖフラグメントを、誘導可能な方法で又は成熟動物における発現を決定するプロモーターの制御下に発現させる、上記使用。
- 請求項２０に記載の核酸により形質転換される非ヒトトランスジェニック動物であって、上記核酸が誘導可能な方法で又は成熟動物における発現を決定するプロモーターの制御下に発現される、上記非ヒトトランスジェニック動物。
- 請求項２０に記載の核酸を含み、及び当該核酸を正確に、また効果的に発現することができるファージ又は原核生物組換えベクター。
- 請求項２０のいずれかに記載の核酸を含み、及びこの核酸を正確に、また効果的に発現することができる組換え真核生物ベクター。
- 有効量の請求項２４に記載のベクター及び医薬上で許容される担体を含有する医薬組成物であって、次の群：慢性の痛み、急性の痛み、神経腫、ＴｒｋＡ発現性新生物腫瘍を包含する神経学的病気の遺伝子治療用医薬組成物。
- ＴｒｋＡと称されるＮＧＦ（神経成長因子）の高親和性チロシンキナーゼレセプターを認識することができ、及び結合することができ、かつＮＧＦのＴｒｋＡへの結合に対するアンタゴニストとして作用する、有効量の請求項１７に記載のモノクローナル抗体又は請求項１８若しくは１９に記載のＳｃＦｖフラグメント並びに医薬上で許容される担体を含有する医薬組成物。
- 次の群：慢性の痛み、急性の痛み、神経腫、ＴｒｋＡ発現性新生物腫瘍を包含する神経学的病気を処置するための請求項２６に記載の医薬組成物。
- 医薬活性量のＮＧＦ及び医薬活性量の請求項１７に記載の抗体又は請求項１８若しくは１９に記載のＳｃＦｖフラグメントを含有する医薬組成物。
- 請求項１７に記載の抗体又は請求項１８若しくは１９に記載のＳｃＦｖフラグメントを発現することができる真核生物操作細胞。
- 請求項２９に記載の細胞及び医薬上で許容される担体を含有する医薬組成物であって、次の群：慢性の痛み、急性の痛み、神経腫、ＴｒｋＡ発現性新生物腫瘍を包含する神経学的病気の遺伝子治療用医薬組成物。
- ＴｒｋＡと称されるＮＧＦ（神経成長因子）の高親和性チロシンキナーゼレセプターを認識することができ、及び結合することができ、かつＮＧＦのＴｒｋＡへの結合に対するアンタゴニストとして作用する、有効量の請求項１７に記載のモノクローナル抗体又は請求項１８若しくは１９に記載のＳｃＦｖフラグメント並びに診断上で許容される担体を含有する組成物であって、インビボ「造影」診断に使用するための組成物。
- 次の群：慢性の痛み、及び急性の痛みを包含する神経学的病気の治療のための医薬組成物の製造のための、ＴｒｋＡと称されるＮＧＦ（神経成長因子）の高親和性チロシンキナーゼレセプターを認識することができ、及び結合することができ、かつＮＧＦのＴｒｋＡへの結合に対するアンタゴニストとして作用し、かつＮＧＦによるＴｒｋＡへの機能的活性を阻害する、請求項１若しくは１７に記載のモノクローナル抗体又は請求項２、１８及び１９のいずれかに記載のＳｃＦｖフラグメントの使用。
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