DE60129278T2 - Gegen das SEMP1-Protein gerichtete Antikörper, Verfahren zu deren Herstellung, und deren Anwendungen - Google Patents

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Description

  • Die Erfindung umfasst Antikörper gegen das humane tight-Junction-Protein SEMP1, Verfahren zu ihrer Herstellung, und Verwendungen davon in Diagnose und Therapie.
  • Die extrazelluläre Umgebung von Säugerzellen bestimmt über Regulierung von Zelladhäsion und Zellproliferation ein normales, nicht tumorerzeugendes Verhalten von Zellen in vivo. Verluste dieser Hauptkontrollelemente sind Kennzeichen von Tumorbildung.
  • Vor kurzem wurden Occludin und Mitglieder der Claudin-Familie als die Hauptbestandteile des Zelladhäsionskomplexes tight-Junction identifiziert. Das Claudin-1 aus Maus stellt offensichtlich das Haupt-tight-Junction-Protein in Epithelzellen dar (Furuse, M. et al., J. Cell Biol. 141 (1998), 1539–1550; Furuse, M., et al., J. Cell Biol. 143 (1998), 391–401), und das humane Homolog SEMP1 (Seneszenz-assoziiertes Epithelmembranprotein, Swiss Prot. Acc. No. 095832, CLD1 human) wurde vor kurzem durch molekulargenetische Analyse identifiziert (Swisshelm, K. A., et al., Gene 226 (1999), 285–295). Es gibt reichlich Hinweise darauf, dass tight-Junction als Zell-Zell-Kontakt- und Verschlussprotein an Tumorbildung beteiligt sein könnte (Porvaznik, M., et al., J. Supramol. Struct. 10 (1979), 13–30; Swift, J. G., et al., J. Submicrosc. Cytol. 15 (1983), 799–810; Chochand-Prillet, B., et al., Ultrastruct. Pathol. 22 (1998), 413–420; Soler, A. P., et al., Carcinogenesis 20 (1999), 1425–1431; Woo, P. L., et al., J. Biol. Chem. 274 (1999), 32818–32828). Zusätzlich wurde vor kurzem gezeigt, dass die Expression von SEMP1 ausschließlich in Zellen und Gewebe epithelialen Ursprungs gefunden werden kann, aber dass sie in humanen Brustkrebstumorzellen in vitro nach unten reguliert oder vollständig verloren gegangen ist (Swisshelm, K. A., et al., Gene 226 (1999), 285–295).
  • Die Expression, bzw. deren Verlust, von tight-Junction-Proteinen oder assoziierten Molekülen bei der diagnostischen Bewertung von Tumorbildung und/oder Tumorprogression oder der therapeutischen Intervention in vivo oder ex vivo erfordert polyklonale oder monoklonale Antikörper. Die Erzeugung und Anwendung von Antikörpern, um Occludin zu identifizieren, wurde vor kurzem in vitro erfolgreich gezeigt (Furuse, M. et al., J. Cell Biol. 141 (1998), 1539–1550; Furuse, M., et al., J. Cell Biol. 143 (1998), 391–401). Es wurden jedoch signifikante Schwierigkeiten angetroffen, poly- oder monoklonale Antikörper gegen das humane SEMP1 oder sein Maushomolog Claudin-1 zu erzeugen. Es wurden auch enttäuschende Ergebnisse veröffentlicht hinsichtlich der Erzeugung von monoklonalen oder polyklonalen Antikörpern gegen Claudin-1 aus Maus (Furuse, M. et al., J. Cell Biol. 141 (1998), 1539–1550).
  • Vor kurzem wurde in Kaninchen ein polyklonaler Antikörper gegen die C-terminale intrazelluläre Domäne des Claudin-1-Proteins aus Maus erzeugt, der nicht mit anderem verwandtem endogenem Protein kreuzreagiert (Klon MH25, Zymed Laboratories Inc., 458 Carlton Court, South San Francisco, CA 94080, Katalog-Nr. 71–7800, http://www.zymed.com/products/71-7800.html), und ein monoklonaler Antikörper wurde in Ratten gegen die C-terminale Domäne von Claudin-1 aus Maus erzeugt (Furuse, M. et al., J. Cell Biol. 147 (1999), 891–903).
  • Die vorliegende Erfindung stellt daher polyklonale und monoklonale Antikörper bereit, welche an SEMP1-Polypeptid (CLD-1 human) in einer Weise binden, die äquivalent ist zu einem Antikörper, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus den Antikörpern DSM ACC2458, DSM ACC2459, DSM ACC2461 und DSM ACC2463.
  • Ein derartiger Antikörper gemäß der Erfindung bindet nicht in einem beträchtlichen Ausmaß an die C-terminale intrazelluläre Domäne von Claudin-1 aus Maus.
  • Obwohl Versuche fehlgeschlagen waren, anti-SEMP1-Antikörper unter Verwendung von SEMP1-Polypeptidfragmenten zur Immunisierung zu erzeugen, wurde herausgefunden, dass es überraschenderweise möglich ist unter Verwendung von DNA-Impfung, bevorzugt mit einem zusätzlichen Booster mit SEMP1-Polypeptid, SEMP1-spezifische Antikörper zu erzeugen. Gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren ist es nunmehr möglich, auf einfache Weise Antikörper gegen alle Teile von SEMP1 bereitzustellen, insbesondere gegen die extrazellulären Domänen, welche zur Modulierung der Signaltransduktion über SEMP1 geeignet sind.
  • Gemäß dem Stand der Technik ist DNA-Impfung möglich. Das Konzept der DNA-Immunisierung entstand aus der Beobachtung, dass nackte Plasmid-DNA, die in Muskeln von Mäusen injiziert wurde, in Transfektion von Muskelfasern, Expression des Transgens und Induktion sowohl einer CTL-Reaktion (zytotoxischen T-Zell-Reaktion) als auch einer Antikörperreaktion resultierte (Barry, M. A., et al., Biotechniques 16 (1994), 616–618 und 620; Davis, H. L., et al., Hum. Mol. Genet 2 (1993), 1847–1851; Davis, H. L., et al., Vaccine 12 (1994), 1503–1509; Davis, H. L., Curr. Opin. Biotechnol. 8 (1997), 635–646; Lowrie, D. B., Nat. Med. 4 (1998), 147–148; Ulivieri, C., et al., J. Biotechnol. 51 (1996), 191–194). Die zur DNA-Immunisierung verwendeten Konstrukte sind identisch zu denjenigen, welche für die Ablieferung von Reportergenen oder therapeutischen Genen verwendet werden. Grundsätzlich kann jeder der etablierten eukaryontischen Expressionsvektoren verwendet werden. Die meisten DNA-Immunisierungsvektoren umfassen eine starke virale Promoter/Enhancer-Sequenz, um hohe Niveaus der Expression an Transgen in einem breiten Spektrum von Wirtszellen anzutreiben. Eine Polyadenylierungssequenz, um die exprimierte RNA zu terminieren, ist ebenfalls erforderlich.
  • Wie hierin verwendet bedeutet der Begriff "bindet nicht zu einem beträchtlichen Ausmaß", dass eine Bindung von Antikörper durch die herkömmlichen Methoden zum Nachweis derartiger Bindungen, die im Stand der Technik bekannt sind, nicht nachgewiesen werden kann. Gewöhnlich wird Immunpräzipitation angewandt um die Bindung nachzuweisen. Die herkömmliche Fehlergrenze bei Immunpräzipitation (und somit in der Bedeutung "bindet nicht zu einem beträchtlichen Ausmaß") beträgt etwa ≤ 5%.
  • Wie hierin verwendet bedeutet der Begriff "C-Terminus von Claudin-1 aus Maus" die C-terminale intrazelluläre Domäne oder einen Teil davon. Diese Domäne besteht aus den Aminosäuren 185–211 von SEQ ID NO: 4.
  • Wie hierin verwendet bezeichnet der Begriff "Antikörper" ein Protein, das aus einem oder mehreren, im Wesentlichen durch Antikörpergene kodierten Polypeptiden besteht. Die bekannten Antikörpergene umfassen die verschiedenen Gene der konstanten Region sowie die zahlreichen Antikörpergene der variablen Region. Antikörper können in einer Reihe von Formen vorliegen, umfassend beispielsweise Fv, Fab, F(ab)2, sowie als Einzelketten (z.B. Houston et al., PNAS USA 85 (1988), 5879–5883; Bird, R. E., et al., Science 242 (1988), 423–426; und allgemein Hood et al., Immunology, Benjamin N.Y., zweite Ausgabe (1984), und Hunkapiller, T., und Hood, L., Nature 323 (1986), 15–16). Antikörper, erzeugt in von Mensch verschiedenen transgenen Tieren, welche FC-Rezeptoren exprimieren, sind besonders nützlich (siehe WO 99/00010 ), da derartige Antikörper den humanen Antikörpern ziemlich ähnlich sind. Bevorzugte Antikörper gemäß der Erfindung sind monoklonale Antikörper und Fragmente davon mit den gleichen Merkmalen in Bezug auf die SEMP1-Antigen-Wechselwirkung wie ein Antikörper, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus den Antikörpern DSM ACC2458, DSM ACC2459, DSM ACC2461 und DSM ACC2463.
  • Eine weitere Gruppe von Antikörpern (DSM 2460 und DSM 2462) ist auf die intrazelluläre Domäne von SEMP1 gerichtet (Epitop 2 (IC2), vgl. 4).
  • Der Antikörper umfasst bevorzugt mindestens zwei leichte Polypeptidketten und zwei schwere Polypeptidketten. Jede der schweren und der leichten Polypeptidketten enthält eine variable Region (im Allgemeinen der Aminoterminale Abschnitt der Polypeptidkette), welche eine Bindedomäne enthält, die mit Antigen wechselwirkt. Jede der schweren und der leichten Polypeptidketten umfasst auch eine konstante Region der Polypeptidketten (im Allgemeinen der Carboxy-terminale Abschnitt), welche die Bindung des Antikörpers an Wirtsgewebe oder Faktoren vermitteln kann, umfassend verschiedene Zellen des Immunsystems, manche phagozytische Zellen und eine erste Komponente (C1q) des klassischen Kompementsystems. Typischerweise sind die leichten und schweren Polypeptidketten vollständige Ketten, die jeweils im Wesentlichen aus einer variablen Region und einer vollständigen konstanten Region bestehen. Die variablen Regionen des erfindungsgemäßen Antikörpers können auf konstante Regionen anderer Isotypen aufgepfropft sein. Beispielsweise kann ein Polynukleotid, das für die variable Region einer schweren Kette des y1-Isotyps kodiert, auf ein Polynukleotid aufgepfropft sein, das für die konstante Region einer anderen Klasse (oder Subklasse) von schweren Ketten kodiert.
  • Darüber hinaus können eine oder mehrere Aminosäuresubstitutionen, insbesondere konservative Aminosäuresubstitutionen allgemein in der Aminosäuresequenz der Sequenz der schweren Kette und/oder der leichten Kette der vorliegenden Antikörper durchgeführt werden, ohne die Antigenbindung substantiell zu beeinträchtigen, und in manchen Ausführungsformen ohne die Antigenität des Antikörpers, wenn er in einen humanen Patienten injiziert wird, substantiell zu erhöhen. Bei manchen Variationen können Deletionen oder Additionen von einer bis zu mehreren Aminosäuren durchgeführt werden. Typischerweise werden die Substitutionen, Additionen oder Deletionen von Aminosäuren in konstanten Regionen oder variablen Regionen, Framework-Sequenzen und Komplementaritäts-bestimmenden Regionen (CDR) durchgeführt.
  • Eine konservative Aminosäuresubstitution ist eine Substitution einer Aminosäure durch Ersatz mit einer Aminosäure, welche ähnliche Charakteristika aufweist (z.B. diejenigen mit sauren Eigenschaften: Asp oder Glu). Eine konservative Aminosäuresubstitution sollte die strukturellen Eigenschaften der Ursprungssequenz nicht wesentlich ändern. Beispiele derartiger Polypeptidstrukturen sind beschrieben in Proteins, Structures and Molecular Principles, Creighton (Hrsg.), W. H. Freeman and Company, New York (1984), Introduction to Protein Structure, C. Brandon und J. Tooze, Garland Publishing, New York (1981), und in Thornton, J. M., et al., Nature 354 (1991), 105–106.
  • Beispielsweise können einzelne oder mehrfache Aminosäuresubstitutionen (bevorzugt konservative Aminosäuresubstitutionen) in der natürlich vorkommenden Sequenz durchgeführt werden (bevorzugt in dem Abschnitt des Polypeptids, welcher Antigen nicht direkt kontaktiert).
  • Mit den Antikörpern und Verfahren der Erfindung ist es möglich, eine große Anzahl von weiteren Antikörpern zu finden, die mit SEMP1 in einer analogen Weise wechselwirken. Derartige Antikörper können an SEMP1-Antigen in einer zu den hinterlegten Antikörpern äquivalenten Weise binden.
  • Unter dem Begriff "Antikörper, die in einer äquivalenten Weise binden können," sind Antikörper zu verstehen, bei denen eine Epitopüberlappung mit den fraglichen Antikörpern nachweisbar ist. Die Epitopüberlappung kann mit Hilfe eines kompetitiven Testsystems nachgewiesen werden. Für diesen Zweck, beispielsweise mit Hilfe eines Enzym-Immunoassays, wird das Ausmaß getestet, zu dem der Antikörper mit dem bekannten Antikörper um die Bindung an ein immobilisiertes SEMP1-Antigen kompetiert. Zu diesem Zweck wird ein geeignet immobilisiertes Antigen (z.B. eine Zelle, die an ihrer Oberfläche SEMP1 exprimiert) mit einem der hinterlegten Antikörper in markierter Form und einem Überschuss des fraglichen Antikörpers inkubiert. Durch Nachweis der gebundenen Markierung kann das Ausmaß, zu dem der fragliche Antikörper den definiten Antikörper von Binden verdrängen kann, leicht bestimmt werden. Wenn eine Verdrängung von mindestens 20%, bevorzugt mindestens 50% vorliegt, bei gleicher Konzentration oder in höheren Konzentrationen, bevorzugt bei einem 105-fachen Überschuss des fraglichen Antikörpers, bezogen auf einen der hinterlegten Antikörper, dann liegt die Epitopüberlappung vor.
  • Die Antikörper können als vollständige polyklonale oder monoklonale Antikörper, Fragmente davon (z.B. Fv, (Fv)2, Fab, Fab', F(ab)2), chimäre, humanisierte oder humane Antikörper verwendet werden, solange sie in einer geeigneten Weise an SEMP1 binden. Kurzkettige Antikörperfragmente, welche lediglich die CDR-Regionen oder Teile davon enthalten, welche die spezifische Bindung an CD30 vermitteln, sind ebenfalls geeignet, insbesondere wenn der Antikörper ein markierter ist. Antikörper des IgG1-Isotyps sind bevorzugt.
  • Betreffend die Herstellung von monoklonalen Antikörpern, siehe beispielsweise E. Harlow und D. Lane, Antibodies: A Laborstory Manual, Cold Spring Harbor Press (1988); Bessler, W. G., et al., Immunobiol. 170 (1985), 239–244; Jung, G., et al., Angewandte Chemie 97 (1985), 883–885; oder Cianfriglia, M., et al., Hybridoma 2 (1993), 451–457.
  • Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Herstellung von Antikörpern bereit, welche an das SEMP1-Antigen binden, bevorzugt an die Peptide 1–37, stärker bevorzugt an die Peptide 5, 21, 29, 30 und 37 (4), nachstehend genannt, wobei eine Säugerspezies mit einem SEMP1-DNA-Plasmid, kodierend für den offenen Leserahmen von SEMP1, und nachfolgend mit einem SEMP1-Polypeptid immunisiert wird, anti-SEMP1-Antikörper-produzierende B-Zellen isoliert und mit Myelomzelllinien fusioniert werden, die fusionierten Zelllinien isoliert und auf Antikörperaktivität gegen SEMP1 getestet werden, die Zelllinien, die Antikörper produzieren, die an SEMP1 binden, isoliert werden, monoklonale Antikörper (Mab) aus den Zelllinien produziert und isoliert werden, bevorzugt im Wesentlichen rein isoliert werden. Die Immunisierung wird bevorzugt über einen Zeitraum von etwa 3 bis 5 Monaten durchgeführt, mit wiederholten DNA-Immunisierungen in einmonatigen Abständen und mit einem täglichen Booster mit SEMP1-Polypeptid während etwa 3 Tagen vor der Isolierung von B-Zellen. Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren ist es möglich, monoklonale und/oder polyklonale Antikörper gegen alle immunogenen Regionen oder Domänen des SEMP1-Polypeptids herzustellen.
  • Polyklonale Antikörper (Pak) werden nach einer derartigen DNA-Immunisierung gemäß dem Stand der Technik gewonnen, bevorzugt gemäß den Protokollen, welche beschrieben sind in Harlow E. und Lane D., "Antibodies: A Laborstory Manual", Cold Spring Harbor Laborstory (1988).
  • Die vorliegende Erfindung stellt auch Derivate von Antikörpern gemäß der vorliegenden Erfindung bereit, welche die Bindungsspezifität davon aufweisen, aber mit Modifikationen in der Region, die für die Antigenbindung nicht wichtig ist. Diese Antikörperderivate können möglicherweise aus Antikörpern gemäß der vorliegenden Erfindung erhalten werden durch den Austausch einer oder mehrerer konstanter Domänen und/oder durch Verknüpfungen mit anderen Molekülen. Somit kann beispielsweise ein Austausch von konstanten Domänen für einen Isotyp durchgeführt werden, wo beispielsweise ein Antikörper der Klasse IgM in einen Antikörper der Klasse IgG überführt werden kann, unter Beibehaltung seiner Antigenspezifität. Dieser Isotyp-Switch kann durch zellbiologische oder molekularbiologische Methoden stattfinden, die gut bekannt sind (siehe beispielsweise Rothmann, P., et al., Mol. Cell. Biol. 10 (1990), 1672–1679).
  • Für die Herstellung von Mab mit reduzierter Immunogenität in Menschen ist ein Verfahren bevorzugt, bei dem variable Regionen von SEMP1-Antikörpern mit konstanten Regionen eines humanen Antikörpers verknüpft werden.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft auch die Verwendung eines Antikörpers gemäß der vorliegenden Erfindung für die Diagnose oder Therapie von z.B. Tumortherapie, Angiogenesekontrolle, Kontrolle der Blut-Hirn-Schranke unter Anwendung natürlicher oder chemischer Verbindungen oder Zellen, Kontrolle der Entzündungsreaktion, Kontrolle des Augendrucks, etc. Dabei ist es bevorzugt, einen Antikörper zu verwenden, ausgewählt aus der Gruppe von Antikörpern, die von den Zelllinien DSM ACC2458, DSM ACC2459, DSM ACC2461 und DSM ACC2463 sezerniert werden.
  • Da bevorzugte Antikörper, die durch das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung erhältlich sind, mit Oberflächen-gebundenen SEMP1-Molekülen und besonders bevorzugt mit der extrazellulären Domäne von SEMP1 binden können, sind sie ausgesprochen geeignet für den qualitativen oder quantitativen Nachweis von physiologischer oder pathophysiologischer Expression der tight-Junctions. Der Nachweis kann dabei auf bekannte Weise erfolgen mittels eines immunologischen Bestimmungsverfahrens, bevorzugt mittels eines ELISA. Verfahren dieses Typs sind gut bekannt und müssen hier nicht weiter erläutert werden. Die gemäß der vorliegenden Erfindung erhaltenen Antikörper können dabei in markierter und/oder immobilisierter Form verwendet werden.
  • Bei einem derartigen immunologischen Diagnoseverfahren wird jeweils eine Signaländerung nach Bindung mindestens eines erfindungsgemäßen Antikörpers, an den eine nachweisbare Markierung gebunden ist, bewertet.
  • Die diagnostische Signifikanz von SEMP1 ist bevorzugt der Nachweis einer Schädigung und der Permeabilität von Endothel-/Epithelzelllagen, die Identifizierung von einsetzender und/oder fortschreitender Tumorzellmetastasierung, und das Fortschreiten von Tumorbildung.
  • Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren bereit zur Verbesserung der Permeabilität von Adjuvantien von Impfstoffen, zum Verstärken der Permeabilität von Endothel-/Epithelgeweben für Arzneimittel zur therapeutischen oder prophylaktischen Behandlung von Krebs, akuten/chronischen Entzündungserkrankungen, Myokardischämie, Arteriosklerose, diabetischer Retinopathie, primärchronischer Polyarthritis, Darminfektion, wobei ein Antikörper oder ein Gemisch von mehreren Antikörpern gemäß der vorliegenden Erfindung verabreicht wird, der bzw. die bevorzugt an eine extrazelluläre Domäne von SEMP1 binden, gegebenenfalls zusammen mit herkömmlichem pharmazeutischem Träger, Adjuvans, Füllstoffen oder Additiven.
  • Um während pharmazeutischer Anwendung eine Immunreaktion zu verhindern, ist es bevorzugt, Antikörper zu verwenden, die so nahe wie möglich Antikörpern humanen Ursprungs gleichen (Glassy, M. C., und Dillman, R. 0., Mol. Biother. 1 (1988), 7–13). Bevorzugt werden Antikörper verwendet, bei denen die variable Region eines erfindungsgemäßen Antikörpers dahingehend weiter modifiziert ist, so dass ein Teil oder die gesamten SEMP1-bindenden Sequenzen des Antikörpers durch die entsprechenden Sequenzen von einer humanen variablen Region ersetzt sind. Derartige Antikörper sind beispielsweise chimäre oder humanisierte (CDR-grafted) Antikörper. Solche Antikörper werden üblicherweise aus einem monoklonalen Antikörper aus einem Nager hergestellt (für eine Übersicht, siehe z.B.: Morrison, S. L., Annu. Rev. Immunol. 10 (1992), 239-265; Winter, G., und Milstein, C., Nature 349 (1991), 293–299). In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden Tumorspezifische humane Antikörper (Borrebaeck, C. A. K., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (1988), 3995–3999; Borrebaeck, C. A. K., Immunol. Today 9 (1988), 355–359) für therapeutische Zwecke verwendet. Zusätzlich ist es besonders bevorzugt, humane Mab über Phage-Display-Libraries herzustellen, wie beispielsweise beschrieben von Griffiths, A. D., et al., EMBO J. 12 (1993), 725–734).
  • Rekombinant produzierte SEMP1-Antikörper der Erfindung können auf Basis der Sequenzdaten hergestellt werden, gemäß Verfahren, die in der Technik bekannt sind und beschrieben sind in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laborstory Manual, zweite Ausgabe (1989), Cold Spring Harbor, New York; und Berger und Kimmel, Methods in Enzymology, Vol. 152, Guide to Molecular Cloning Techniques (1987), Academic Press Inc., San Diego, CA. Polynukleotide der Erfindung werden bevorzugt aus synthetischen Oligonukleotiden gebildet.
  • Derartige rekombinante Polypeptide können nach Standardverfahren, die in der Technik bekannt sind, in eukaryontischen oder prokaryontischen Wirtszellen exprimiert werden; bevorzugt können Sängerzellen, wie etwa Lymphozytenzelllinien, als Wirtszellen verwendet werden. Typischerweise kodieren derartige Polynukleotidkonstrukte für eine vollständige humane Antikörper-schwere Kette und/oder eine vollständige humane Antikörperleichte Kette eines erfindungsgemäßen Antikörpers, bzw. eine schwere und/oder leichte Kette der variablen Region. Alternative Sequenzen der humanen konstanten Region (schwere und/oder leichte Kette) können vom Fachmann aus verschiedenen Referenzquellen ausgewählt werden, umfassend diejenigen, welche in E. A. Kabat et al. (1987) (37) aufgelistet sind, aber nicht darauf beschränkt. In einer Ausführungsform der Erfindung werden eine Polynukleotidsequenz, kodierend für eine leichte Kette eines Antikörpers, umfassend eine konstante Region einer humanen leichten Kette mit einer Amino-terminalen Peptidverknüpfung (d.h. eine Fusion im Leseraster) an eine variable Region der leichten Kette eines erfindungsgemäßen Antikörpers, und eine entsprechende schwere Kette exprimiert, und bilden Dimere von schwerer/leichter Kette und andere Antikörpertypen.
  • Da die durch das erfindungsgemäße Verfahren erhaltenen monoklonalen Antikörper an Zelloberflächen-gebundenes SEMP1-Antigen binden, das an Zelladhäsion beteiligt ist, können sie für eine in vivo Behandlung an Menschen verwendet werden. Somit stellt die vorliegende Erfindung auch eine pharmazeutische Zusammensetzung bereit, die einen oder mehrere Antikörper gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst, gegebenenfalls zusammen mit herkömmlichem pharmazeutischem Träger, Adjuvans, Füllstoffen oder Additiven. Eine derartige erfindungsgemäße Zusammensetzung verbessert, bevorzugt in der Wirkung eines Adjuvants, Permeabilität von Impfstoffen.
  • Für therapeutische Verwendungen wird eine sterile Zusammensetzung, enthaltend eine pharmakologisch wirksame Dosismenge eines oder mehrerer erfindungsgemäßer Antikörper einem Humanpatienten verabreicht, um vorstehend beschriebene Erkrankungen zu behandeln. Typischerweise wird die Zusammensetzung einen chimären oder humanisierten Antikörper umfassen, der für verringerte Immunogenität die CDR-Region eines erfindungsgemäßen Antikörpers enthält.
  • Die Zusammensetzungen für parenterale Verabreichung werden üblicherweise eine Lösung eines Antikörpers gemäß der vorliegenden Erfindung, aufgelöst in einem akzeptablen Träger, bevorzugt in einem wässrigen Träger, umfassen. Eine Reihe von wässrigen Trägern kann verwendet werden, z.B. Wasser, gepuffertes Wasser, 0,4% Salzlösung, 0,3% Glycin und dergleichen. Die Lösungen sind steril und im Allgemeinen von partikulärem Material. Die Zusammensetzungen können durch herkömmliche gut bekannte Techniken sterilisiert werden. Die Zusammensetzungen können pharmazeutisch akzeptable Hilfssubstanzen enthalten, wie etwa diejenigen, die erforderlich sind um näherungsweise physiologische Bedingungen zu ergeben, wie etwa Mittel zur Einstellung des pH-Werts und Puffermittel, Mittel zur Einstellung der Toxizität und dergleichen, beispielsweise Natriumacetat, Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Calciumchlorid, Natriumlactat, etc. Die Konzentrationen der erfindungsgemäßen Antikörper in diesen Formulierungen können über einen breiten Bereich variiert werden, z.B. von weniger als etwa 0,01%, üblicherweise mindestens etwa 0,1%, bis hin zu 5 Gew.-%, und sie werden primär auf Basis von Fluidvolumina, Viskosität, etc. ausgewählt, oder in Übereinstimmung mit dem besonderen ausgewählten Verabreichungsmodus.
  • Somit könnte eine typische pharmazeutische Zusammensetzung für intramuskuläre Injektion derart formuliert werden, so dass sie 1 ml steriles gepuffertes Wasser und etwa 0,1 bis 250 mg, bevorzugt 1 bis 10 mg erfindungsgemäßen Antikörper enthält.
  • Wie erwähnt können die erfindungsgemäßen Antikörper in eine Zusammensetzung aufgenommen werden, bevorzugt in eine pharmazeutische Zusammensetzung, die für parenterale Verabreichung geeignet ist. Bevorzugt wird der Antikörper als eine injizierbare gepufferte Lösung hergestellt, die 0,1 bis 500 mg/ml Antikörper und bevorzugt 0,1 bis 250 mg/ml Antikörper enthält, bevorzugt zusammen mit 1 bis 500 mMol/l Puffer. Die injizierbare Lösung kann sowohl in einer flüssigen als auch in einer lyophilisierten Dosierungsform vorliegen. Der Puffer kann beispielsweise Histidin sein (bevorzugt 1 bis 50 mM, optimal 5 bis 10 mM), bei einem pH-Wert von 5,0 bis 7,0 (optimal pH 6,0).
  • Andere geeignete Puffer umfassen Natriumsuccinat, Natriumcitrat, Natriumphosphat oder Kaliumphosphat, sind aber nicht darauf beschränkt. Natriumchlorid kann in einer Konzentration von 0–300 mM (optimal 150 mM für eine flüssige Dosierungsform) verwendet werden um die Toxizität der Lösung zu modifizieren. Für eine lyophilisierte Dosierungsform können Kälteschutzmittel aufgenommen werden, prinzipiell 0 bis 10% Sucrose (optimal 0,5 bis 1,0%). Andere geeignete Kälteschutzmittel umfassen Trehalose und Lactose. Für eine lyophilisierte Dosierungsform können Quellmittel aufgenommen werden, prinzipiell 1 bis 10% Mannitol. Stabilisatoren können sowohl in flüssigen als auch in lyophilisierten Dosierungsformen verwendet werden, prinzipiell 1 bis 50 mM L-Methionin (optimal 5 bis 10 mM).
  • Andere geeignete Quellmittel umfassen Glycin, Arginin, können aufgenommen werden, sowie 0–0,05% Polysorbat-80 (optimal 0,005–0,01%). Zusätzliche oberflächenaktive Mittel umfassen, sind aber nicht beschränkt darauf, Polysorbat-20 und oberflächenaktive Polyoxyethylenether, wie etwa BRIJ® Detergentien.
  • Eine geeignete Dosismenge des Antikörpers der vorliegenden Erfindung für medizinische Behandlungen beträgt etwa 0,01 bis 50 mg/kg Körpergewicht, wobei diese Dosismenge möglicherweise wiederholt zu verabreichen ist.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die pharmazeutische Zusammensetzung den Antikörper in einer Dosismenge von etwa 0,01 mg/kg bis 10 mg/kg pro Anwendung. Stärker bevorzugte Dosismengen des Antikörpers umfassen 1 mg/kg.
  • Der bevorzugte Verabreichungsmodus ist parenteral (z.B. intravenös, subkutan, intraperitoneal, intramuskulär). In einer bevorzugten Ausführungsform wird der Antikörper mittels intravenöser Infusion oder Injektion verabreicht. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform wird der Antikörper mittels intramuskulärer oder subkutaner Injektion verabreicht.
  • Pharmazeutische Zusammensetzungen müssen typischerweise steril und unter den Herstellungs- und Aufbewahrungsbedingungen stabil sein. Die Zusammensetzung kann formuliert werden als eine Lösung, Mikroemulsion, Dispersion, ein Liposom oder eine andere geordnete Struktur, die für eine hohe Konzentration an Arzneimittel geeignet ist. Sterile injizierbare Lösungen können hergestellt werden, indem man den Wirkstoff in der erforderlichen Menge in einem geeigneten Lösungsmittel aufnimmt, mit einem oder einer Kombination der vorstehend aufgezählten Inhaltsstoffe, je nach Bedarf, gefolgt von Filtersterilisierung. Dispersionen werden im Allgemeinen hergestellt, indem man den Wirkstoff in einem sterilen Vehikel aufnimmt, das ein Basisdispersionsmedium und die erforderlichen anderen Inhaltsstoffe von den vorstehend aufgezählten enthält. Für sterile, lyophilisierte Pulver für die Herstellung von sterilen injizierbaren Lösungen sind die bevorzugten Herstellungsverfahren Vakuumtrocknen und Sprühtrocknen, was ein Pulver des Wirkstoffs plus etwaigen zusätzlichen gewünschten Inhaltsstoffen aus einer zuvor steril filtrierten Lösung davon ergibt. Die korrekte Fluidität einer Lösung kann beispielsweise durch die Verwendung einer Beschichtung wie etwa Lecithin aufrecht erhalten werden, durch die Aufrechthaltung der erforderlichen Partikelgröße bei einer Dispersion, und durch die Verwendung von oberflächenaktiven Substanzen.
  • Eine Absorption von injizierbaren Zusammensetzungen über einen längeren Zeitraum kann bewerkstelligt werden, indem man ein Mittel in die Zusammensetzung aufnimmt, welches die Absorption verzögert, beispielsweise Monostearatsalze und Oleatin.
  • Die Antikörper und Antikörperteile der vorliegenden Erfindung können mittels einer Reihe von in der Technik bekannten Verfahren verabreicht werden, obwohl für viele therapeutische Anwendungen der bevorzugte Verabreichungsweg/modus subkutane Injektion, intravenöse Injektion oder Infusion ist. Wie vom Fachmann erkannt werden wird, wird der Verabreichungsweg und/oder -modus in Abhängigkeit von den gewünschten Ergebnissen variieren. In bestimmten Ausführungsformen kann der Wirkstoff mit einem Träger hergestellt werden, der den Stoff gegen rasche Freisetzung schützt, wie etwa eine Zusammensetzung zur gesteuerten Freisetzung, umfassend Implantate, transdermale Pflaster und mikroeingekapselte Ablieferungssysteme. Biologisch abbaubare, biokompatible Polymere können verwendet werden, wie etwa Ethylenvinylacetat, Polyanhydride, Polyglycolsäure, Kollagen, Polyorthoester und Polymilchsäure. Viele Verfahren zur Herstellung derartiger Formulierungen sind patentiert oder dem Fachmann allgemein bekannt, siehe z.B. Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson, Hrsg., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978.
  • Die Antikörper der vorliegenden Erfindung werden in flüssiger Form, Pulverform oder lyophilisierter Form verwendet und können mit einem geeigneten Verdünnungsmittel oder Träger kombiniert werden, wie etwa Wasser, einer Salzlösung, wässriger Dextrose, wässrigem Puffer und dergleichen. Konservierungsstoffe können ebenfalls zugegeben werden.
  • Die erfindungsgemäßen Antikörper können für die Lagerung lyophilisiert werden und vor Verwendung in einem geeigneten Träger rekonstituiert werden. Herkömmliche Techniken zur Lyophilisierung und Rekonstitution können angewandt werden. Es wird vom Fachmann erkannt werden, dass Lyophilisierung und Rekonstitution zu variierenden Graden eines Verlusts der biologischen Aktivität führen können, und dass die verwendeten Mengen zur Kompensation gegebenenfalls eingestellt werden müssen.
  • Unabhängig von dem ausgewählten Verabreichungsweg werden die Antikörper der vorliegenden Erfindung durch herkömmliche, dem Fachmann bekannte Verfahren zu pharmazeutisch akzeptablen Dosierungsformen formuliert. Die Antikörper können auch unter Verwendung pharmazeutisch akzeptabler saurer oder basischer Additionssalze formuliert werden. Darüber hinaus können die Verbindungen oder deren Salze in einer geeignet hydratisierten Form verwendet werden.
  • Unabhängig von dem ausgewählten Verabreichungsweg wird eine nicht toxische aber therapeutisch wirksame Menge eines oder mehrerer erfindungsgemäßer Antikörper in einer Behandlung verwendet. Das Dosierungsschema für eine Behandlung wird ausgewählt in Übereinstimmung mit einer Reihe von Faktoren, umfassend den Typ, das Alter, Gewicht, Geschlecht und den medizinischen Zustand des Patienten, den Tumortyp, den Verabreichungsweg und den besonderen, in der Behandlung verwendeten Antikörper. Ein Durchschnittsarzt kann die erforderliche wirksame Menge des Arzneimittels im Hinblick auf bekannte Antikörpertherapieansätze leicht bestimmen und verschreiben. Wenn er so vorgeht, könnte der Arzt zunächst relativ niedrige Dosismengen verwenden und später eine erhöhte Dosismenge, bis eine maximale Reaktion erhalten wird.
  • Das gereinigte SEMP1-Polypeptid, das während Immunisierung zum Boosten geeignet ist, kann in eukaryontischen Zellen rekombinant produziert werden. Da SEMP1 ein tight-Junction-Protein ist, das in Zell-Zell-Kontaktbereichen von Zellen lokalisiert ist und eine starke Tendenz zu Adhäsion aufweist (Furuse, M. et al., J. Cell Biol. 147 (1999), 891–903), ist es sehr schwierig, das Volllängenpolypeptid zu isolieren und zu reinigen. Aufgrund der Tatsache, dass SEMP1 ein Membran-assoziiertes Protein ist, ist es zusätzlich notwendig, das Protein aus der Membran freizusetzen. Verschiedene Versuche, SEMP1 unter Verwendung verschiedener Detergentien (CHAPS, 3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propansulfonat; Octylglucosid, Deoxycholsäure, Igepal®CA630, (Octylphenoxy)polyethoxyethanol; Triton®X-100 (Octylphenooxy); Thesit, Polyoxyethylen-9-laurylether; Digitonin) aus Zellmembranen freizusetzen, scheiterten jedoch. Es war jedoch überraschenderweise möglich, SEMP1 zu isolieren und weiter zu reinigen unter Verwendung von Zwittergent® (N-Dodecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propansulfonat, Roche Diagnostics GmbH, DE).
  • Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist daher ein Verfahren zur chromatographischen Reinigung von SEMP1-Polypeptid, wobei eine wässrige Zusammensetzung, die SEMP1-Polypeptid enthält, auf eine Chromatographiesäule aufgetragen wird. SEMP1-Polypeptid wird in der Gegenwart von N-Dodecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propansulfonat eluiert und aus dem Eluat gewonnen.
  • Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist ein Verfahren zur Freisetzung von SEMP1-Polypeptid aus einer Matrix wie einer Zellmembran, durch Behandeln des gebundenen SEMP1-Polypeptids in wässriger Lösung mit N-Dodecyl in einer solchen Weise, dass SEMP1-Polypeptid solubilisiert wird.
  • Die nachfolgenden, in der vorliegenden Erfindung erwähnten Zelllinien, welche Antikörper sezernieren, wurden von der F. Hoffmann-La Roche AG am 18. Mai 2000 bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM), Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig, Deutschland, hinterlegt:
    Zelllinie Antikörper
    DSM ACC2458 MAB anti-human SEMP1; Klon 3
    DSM ACC2459 MAB anti-human SEMP1; Klon 4
    DSM ACC2460 MAB anti-human SEMP1; Klon 5
    DSM ACC2461 MAB anti-human SEMP1; Klon 7
    DSM ACC2462 MAB anti-human SEMP1; Klon 38
    DSM ACC2463 MAB anti-human SEMP1; Klon 64
  • Ihre Bindungscharakteristiken sind:
    • – Klon 3, kompetierte mit Peptid 21 (Aminosäure (aa) 97–108, IC1) und 37 (160–171, EC2)
    • – Klon 4, kompetierte mit Peptid 21 (aa 97–108, IC1)
    • – Klon 7, kompetierte mit Peptid 5 (aa 31–42, EC1)
    • – Klon 64, kompetierte mit Peptid 29 (aa 136–147, EC2), 30 (aa 139–150, EC2) und 31 (aa 142–153, EC2)
    • – Klon 5, kompetierte mit Peptid 41 (aa 191–202, IC2)
    • – Klon 38, kompetierte mit Peptid 44 (aa 200–211, IC2)
    • – EC1: extrazelluläres Epitop 1 (aa 22–81)
    • – IC1: intrazelluläres Epitop 1 (aa 103–117)
    • – EC2: extrazelluläres Epitop 2 (aa 141–163)
    • – IC2: intrazelluläres Epitop 2 (aa 185–211)
    (in Klammern angegeben sind diejenigen Bereiche von SEMP1, an welche die Antikörper binden, bestätigt durch das 3D-Computer-Strukturvorhersage-Modell Signal P (http://genome.cbs.dtu.uk/services/SignalP/), Aminosäurenummerierung gemäß der Aminosäureposition des SEMP1-Genprodukts.
  • Die nachfolgenden Beispiele, das Sequenzprotokoll und die Figuren werden bereitgestellt, um beim Verständnis der vorliegenden Erfindung zu helfen, deren tatsächlicher Schutzumfang in den beigefügten Ansprüchen angegeben ist.
    • SEQ ID NO: 1 Fusionspeptid
    • SEQ ID NO: 2 Fusionspeptid
    • SEQ ID NO: 3 SEMP1 DNA-Sequenz
    • SEQ ID NO: 4 SEMP1 Polypeptidsequenz
  • Beschreibung der Figuren
  • 1 Reinigung des SEMP1-Proteins. His-tagged SEMP1 wurde in SEMP1-Baculovirus-infizierten Sf9-Insektenzellen (Research Diagnostic Inc., NJ, USA, www.researchd.com) exprimiert. His-tagged SEMP1 wurde aus rohem Überstand von lysierten Sf9-Zellen durch Säulenreinigungen gereinigt, und höchste Ausbeute und Reinheit wurden erhalten durch eine 200 mM Imidazol-Elution von einer Ni-Chelat-Säule. Der Pfeil gibt die Lokalisierung des His-tag-SEMP1-Proteins an.
  • 2 Spezifität und Zellabhängigkeit von SEMP1-Expression. Analyse der Spezifität von monoklonalem SEMP1-Antikörper durch Western-Blot-Analyse. SEMP1-negative (hämatopoietische K562, Brustkrebs MDA-MB435) und -positive Zellen (SAEC, small airway epithelial cells (Epithelzellen von kleinen Luftwegen, Adenokarzinom Caco-2, Brustkrebs MDA-MB435, transduziert mit SEMP1-Retrovirus) wurden auf Konfluenz angezüchtet, lysiert und einer Analyse mittels Wetsern-Blot unterzogen. Der Pfeil gibt die Position des nativen SEMP1-Proteins an.
  • 3 Expression von SEMP1 in Brustkrebszellen. SEMP1-Expression in SEMP1-transduzierten MDA-MB435 Massenkulturzellen wurde mittels Fluoreszenzmikroskopie analysiert. Die Spezifität der Expression und Eingliederung an Zell-Zell-Kontaktstellen wird durch ein sigmoidales Anfärbemuster von SEMP1 angezeigt.
  • 4 Domänenstruktur von SEMP1 und Epitop-Mapping von SEMP1 Mab5. Die Aminosäuren (aa) 22–81 von SEQ ID NO: 4 stellen die erste extrazelluläre Domäne (EC1) dar, aa 103–117 stellen die erste intrazelluläre Domäne (IC1) dar, aa 141–163 stellen die zweite extrazelluläre Domäne (EC2) dar, aa 185–211 stellen die C-terminale intrazelluläre Domäne (IC2) dar, aa 1–21 (N-terminal), 82-102, 118–140 und 164–184 stellen Membrandomänen dar.
  • 5 SEMP1-Proteinexpression in normalem humanem Brustgewebe. Anfärbung von SEMP1-Protein erfolgte mit anti-SEMP1/anti-Maus-POD und Hämatoxilin-Gegenfärbung. (Felder A und B). Gegenfärbung mit sekundärem Antikörper anti-Maus-POD ist in den Feldern B und C gezeigt. Die Rechtecke in den Feldern A und C zeigen die Bereiche an, die in den Feldern B und D vergrößert gezeigt sind.
  • 6 Vergleich der Expression von SEMP1 in normalem Brust- und Darmgewebe, im Vergleich zu Brust- und Darmtumorgewebe. Die Anfärbung war wie bei 5 beschrieben. Brust bezeichnet Brust; Darm bezeichnet Darm; transformiert bezeichnet Tumorgewebe.
  • 7 Anfärbung von SEMP1-Protein in verschiedenen Brusttumorgeweben von verschiedenen Spendern, im Vergleich zu normalem Brustgewebe. Die Anfärbung war wie bei 5 beschrieben.
  • Beispiel 1
  • Zellkultur
  • a) Sf9-Insektenzellen
  • Für Routinepassage wurden Sf9-Zellen (ATCC CRL 1711) in T25-Kolben angezüchtet, in IPL 41 Medium (Gibco), ergänzt mit 10% Serum (Gibco/Yeastolate (Gibco)/Pluronic F-68, Gentamycin (Gibco)). Für Isolierung von mit SEMP1-Baculovirus infizierten Sf9-Zellen wurden Zellen in einem 7 I Fermenter für Chargenverfahren kultiviert und 3 Tage nach dem Animpfen geerntet.
  • b) SEMP1-Hybridom
  • Die anti-SEMP1-sezernierenden Hybridomzellen wurden kultiviert in RPMI1640-Medium, ergänzt mit 10% FCS/2 mM 1-Glutamin (Roche Molecular Biochemicals)/1 × nicht-essentielle Aminosäuren (Biochrom AG)/1 mM Natriumpyruvat (Biochrom AG) und Nutridoma (Roche Molecular Biochemicals). Zur Erzeugung von mit anti-SEMP1 angereichertem Hybridomüberstand wurden SEMP1-Hybridomklone in einer Heraeus miniPerm classic, MWCO 12,5 k Kulturvorrichtung angeimpft, und das Medium wurde mehrmals wöchentlich geerntet nachdem die Zellkonzentration 1 × 10E7 Zellen pro ml erreicht hatte.
  • c) SEMP1-Retrovirus-Produzentenzelllinie AM12
  • Eine Retrovirus-produzierende amphotrope Zelllinie HSR BM01 (DSM ACC2235, WO 99/60143 ) (MoMuLV Grundgerüst), transduziert mit SEMP1 und I-NGFR (Rezeptor für den Nervenwachstumsfaktor mit geringer Affinität), WO 95/06723 wurde in DMEM-Medium/10%FCS/2 mM 1-Glutamin (Roche Molecular Biochemicals)/1 × nicht-essentielle Aminosäuren (Biochrom AG)/1 mM Natriumpyruvat (Biochrom AG) kultiviert. Um einen Überstand mit hohem Titer zu erhalten wurde zu subkonfluenten Kulturen frisches Medium zugegeben; der konditionierte Überstand wurde 24 h später geerntet (Macht, A. W., Cytometry 29 (1997), 371–374) und unmittelbar für die Transduktion von Zelllinien verwendet.
  • d) MDA-MB 435
  • Die SEMP1-negative humane Brustkrebszelllinie MDA-MB 435 sowie ihr mit SEMP1 transduziertes Gegenstück wurden in RPMI/10%FCS/2 mM 1-Glutamin (Roche Molecular Biochemicals)/1 × nicht-essentielle Aminosäuren (Biochrom AG)/1 mM Natriumpyruvat (Biochrom AG) kultiviert. Retrovirale SEMP-1 Transduktion wurde durchgeführt mittels Inkubation einer subkonfluenten Kultur während 24 h mit einem Überstand, der Retroviren enthielt, hergestellt gemäß Beispiel 1c. SEMP1-exprimierende MDA-MB 435 Zellklone wurden produziert durch Aussortieren von einzelnen Zellen, Bindung an FITC-markierte Antikörper gegen I-NGFR aus Massenkulturen mittels FACS (FACS Vantage, Becton Dickinson).
  • Beispiel 2
  • Vektorkonstruktion und Expression von SEMP1
  • Das N-terminal hexa-his-tagged SEMP1 wurde mittels Standardverfahren in den Vektor pBlueBacHis2B kloniert. Sf9-Zellen wurden mit dem His-SEMP1-Plasmid transfiziert und SEMP1 linearisierte Baculovirus-DNA-Überstände wurden 3 Tage nach Infektion geerntet (Invitrogen, Bac'NBlue System). Dieser Virusvorrat mit hohem Titer wurde zur Reinfektion von Sf9-Zellen verwendet. Zellen wurden nach einer dreitägigen Infektion bei 27°C geerntet und Gesamtprotein wurde durch Beschallung der Sf9-Zellen extrahiert (Extraktionspuffer: 50 mM NaP, 150 mM NaCl, pH 7,2). Der Proteinextrakt wurde 20 min bei 30.000 G zentrifugiert und das Pellet wurde in 50 mM NaP, 150 mM NaCl, 2% Zwittergent® (N-Dodecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propansulfonat, zwitterrionisch, Roche Molecular Biochemicals) aufgelöst.
  • Hexa-his-tagged SEMP1 wurde aus dem rohen Lysat mittels Affinitätschromatographie extrahiert, unter Verwendung einer Ni-Chelat-Sepharosesäule (Pharmingen). Die Säule wurde mit 300 mM NiCl2 beladen, mit Äquilibrierungspuffer (50 mM Tris, 500 mM NaCl, pH 8, 0,5% Zwittergent®) gewaschen, mit der rohen Proteinfraktion beladen, und mit Äquilibrierungspuffer/10 mM Imidazol gewaschen. Die Elution erfolgte mit Äquilibrierungspuffer/200 mM Imidazol. Aufgrund des N-terminalen His-Tag und Enterokinase-Tag steigt die Größe des Molekulargewichts des modifizierten SEMP1-Proteins von 23 auf 27 kD.
  • Beispiel 3
  • Immunisierungsprozedur
  • Weibliche BALB/c-Mäuse wurden in einem Alter von 6–8 Wochen immunisiert. Vor der Immunisierung wurde Muskeldegeneration/regeneration durch bilaterale intramuskuläre Injektion von 100 μl Cardiotoxin (10 μM in PBS) (LATOXAN, L-8102; Rosans, Frankreich) in den M. tibialis induziert (= Tag 0). 50 μg Plasmid-DNA, enthaltend den offenen SEMP1 Leserahmen, gereinigt auf einer Silikagelmembran-Säule (Qiagen, DE) in 50 μl steriler 0,9% NaCl wurden intramuskulär in den M. tibialis anterior jedes Hinterbeins injiziert. Alle 4 Wochen wurden fünf Dosismengen DNA injiziert. Serumaliquots wurden durch retrobulbäre Punktur am Tag 97 entnommen, 3 Tage vor Sezierung der Milz. Das Tier, das den höchsten Serumtiter aufwies, empfing intravenös einen Booster von 30 μg SEMP1-Protein, gereinigt aus Sf9-Zellen (siehe oben). Die Mäuse wurden am Tag 129 geopfert, und die Milzen wurden verwendet um nach Standardverfahren Hybridome zu erzeugen. Hybridomklone mit hoher Produktion wurden erzeugt mittels FACS-Zellsortierunsklonierung (FACS Vantage, Becton Dickinson) aus SEMP1-positiven Hybridommassenkulturen.
  • Anti-SEMP1 Western-Blot-Analyse
  • Die Western-Blot-Analyse wurde nach Standardverfahren durchgeführt, unter Verwendung des Novex NuPage Bis-Tris-Systems (Invitrogen). Nitrocellulosemembranen, die geblottet worden waren von Proteingelen, beladen mit unterschiedlichen Mengen an gereinigtem SEMP1 oder Zellextrakten von SEMP1-positiven oder SEMP1-negativen Kontrollzellen, wurden mit Überständen von Hybridomklonen, die SEMP1-Antikörper produzierten, inkubiert (Verdünnung 1:10 und 1:100). Das anti-SEMP1-Signal wurde unter Verwendung von Chemilumineszenz-Standardprotokollen (Roche Molecular Biochemicals) nachgewiesen.
  • Beispiel 4
  • Immunfluoreszenzmikroskopie
  • MDA-MB 435 Zellen wurden auf mit Poly-L-Lysin (Sigma) beschichteten Mikroskopträgern in Standardmedium in unterschiedlichen Dichten angezüchtet. Die Zellen wurden mit PBS gewaschen und danach 1 h bei Raumtemperatur mit 1% Paraformaldehyd/PBS fixiert. Permeabilisierung und Blockierung erfolgten mit einer einstündigen Inkubation in 0,05% Tween20/10% Albumin (Roche Diagnostics GmbH, DE)/PBS. Danach wurde indirekte Immunfluoreszenzanfärbung durchgeführt mit anti-SEMP1, gefolgt von anti-Maus F(ab)2, markiert mit Alexa488 (Molecular Probes). Die Fluoreszenzabbildung wurde aufgezeichnet.
  • Beispiel 5
  • Retroviruskonstrukt und virale Transduktion
  • Der SEMP1-Retrovirus wurde erzeugt unter Verwendung eines Vektors, der den I-NGFR-Zelloberflächenmarker als ein Reportermolekül enthielt (Macht, A. W., et al., Cytometry 29 (1997), 371–374). In kurzen Worten treibt der 5'-LTR-Promotor die Expression des I-NGFR-Markerproteins an. Der 3'-stromabwärts lokalisierte SV40-Promotor wurde durch einen CMV-Promotor substituiert, welcher die Expression von SEMP1 antreibt. SEMP1 wurde als ein ORF kloniert, mit Einführung einer idealen Kozak-Sequenz (Kozak, M., Nucleic Acids Res. 15 (1987) 8125–8148). Um infektiöse Retroviren zu erzeugen wurde das SEMP1/I-NGFR retrovirale Plasmid mit Lipofectamin (Gibco) in die Retrovirus-produzierende amphotrope Zelllinie HSR BM01 transfiziert, gemäß den Angaben des Herstellers. Retrovirus-produzierende HSR BM01 Zellklone mit einem hohen Titer wurden mittels FACS-Zellsortierung und nachfolgendem Testen auf effektive Transduktionsraten von konditionierten HSR BM01 Zellklonüberständen erzeugt.
  • Diese Zelllinie kann verwendet werden um Spezifität und korrekte Eingliederung von SEMP1-Protein zu beweisen, z.B. in onkologisch relevanten Brustkarzinomzellen.
  • Antikörperspezifität
  • Die SEMP1-Spezifität von verschiedenen monoklonalen Antikörpern wurde mittels Western-Blot-Analyse bestätigt. Ein typisches Ergebnis ist in 2 gezeigt (Pfeil, SEMP1-Klon c38). Nur SEMP1-positive Zellen wie SAEC (Epithelzellen von kleinen Luftwegen) und CACO-2 zeigen ein Signal beim erwarteten MW von etwa 23 kD. Wie erwartet ist die hämatopoietische Zelllinie K562 negativ für SEMP1. Zusätzlich zeigt die SEMP1-negative Brustkrebszelllinie MDAMB435 keine SEMP1-Proteinbande, während ihr retroviral transduziertes Gegenstück MDAMB435xSemp1 eine starke SEMP1-Bande zeigt. Neben dem SEMP1-Hybridomklon c38 wurde eine Reihe von verschiedenen SEMP1-Hybridomen erhalten, welche monoklonale Antikörper gegen verschiedene intra- und extrazelluläre Epitope von SEMP1 produzieren.
  • 3 zeigt die biologische Spezifität der Bindung von SEMP1-Antikörpern. SEMP1 ist als 4-Transmembran-Protein nur an Zell-Zell-Kontaktstellen lokalisiert (Pfeile, SEMP1-Klon c38).
  • Beispiel 6
  • Epitop-Mapping unter Verwendung komplementärer SEMP1-Antikörper
  • Für das nachfolgende Screening auf Epitope von SEMP1-Antikörpern wurde ein ELISA durchgeführt:
    • – Beschichtung von Kammern mit 96 Vertiefungen mit His-tagged SEMP1
    • – Blockierung von Kammern mit 1% Rinderalbumin
    • – Waschen (zweimal mit PBS/0,05% Tween 20)
    • – Inkubation mit Hybridomüberständen, die anti-SEMP1-Aktivität enthalten, positive Kontrolle mit anti-His-Antikörper
    • – Waschen
    • – Inkubation mit sekundärem, mit Peroxidase konjugiertem Antikörper
    • – Waschen
    • – Inkubation mit Peroxidase-Substrat (ABTS®-Lösung)
  • Um die Epitope der 66 verschiedenen Antikörper zu identifizieren wurde ein Komplementärpeptid-ELISA etabliert. Für diesen Zweck wurden 44 Peptide der hydrophilen Bereiche von SEMP1 synthetisiert und in Einzelreationen inkubiert, während der Inkubation der Überstände, die anti-SEMP1-Antikörper enthielten. Die Verwendung großer Mengen des Peptids verringert die Bindung von anti-SEMP1-Antikörpern mit passenden Epitopen and das His-tagged SEMP1.
  • Die Verringerung des chromogenen Signals wurde im Vergleich zu den Überständen, die keiner Kompetition unterlagen, gemessen.
  • Beispiel 7
  • Versuche, SEMP1-Antikörper unter Verwendung von SEMP1-Peptiden für die Immunisierung zu erzeugen
  • Fusionspeptide (QWRIYSAGD)-KLH (Peptid von SEQ ID NO: 1, gekoppelt an Keyhole Limpet Hämocyanin) und KLH-(MKCMKCLEDDEMQKM) (Peptid von SEQ ID NO: 2, gekoppelt an Keyhole Limpet Hämocyanin) in Freund-Adjuvans wurden zwei Kaninchen injiziert. Drei subkutane dorsale Stellen wurden verabreicht, insgesamt 0,1 mg Peptid pro Immunisierung. Injektionen wurden gegeben in den Wochen 0, 2, 6 und B. Das Serum zeigte einen hohen Antikörpertiter bei Verwendung der Peptide in einem Dot-Blot, funktionierte aber überhaupt nicht mit Zellextrakten oder in FACS-Analyse. Daher werden keine SEMP1-bindenden Antikörper erzeugt.
  • Beispiel 8
  • Enzymimmunoassay zur Bestimmung von SEMP1 nach dem ELISA-Prinzip
  • Reagenz 1:
    • – 1,25 μg/ml biotinylierter Mab-Klon 3 (Herstellung gemäß Peters, J. H., et al., "Monoklonale Antikörper", Springer Verlag, Berlin, 1985, Seiten 209–212)
    • – 10 mmol/l Citratpuffer
    • – 47 mmol/l Phosphatpuffer, pH 6,3
    • – 50 mU/ml Konjugat von Peroxidase und monoklonalem Antikörper Klon 5 (hergestellt gemäß Wilson, M. B., und Nakane, P. K., 1978, in Immunofluorescence and Related Staining Techniques, W. Knapp, K. Kolubar, G. Wick, Hrsg., Seiten 215–224, Elsevier/North Holland, Amsterdam; die angegebene Aktivität bezieht sich auf Peroxidase)
  • Reagenz 2:
    • – 100 mmol//l Phosphat-Citrat-Puffer, pH 4,4
    • – 3,2 mmol/l Natriumperborat
    • – 1,9 mmol/l ABTS® (2,2'-Azino-di-[3-ethyl-benzthiazolinsulfonat(6)]
  • Humanseren, zu denen 3, 5, 10 bzw. 25 ng/ml rekombinant produziertes SEMP1 zugegeben worden waren, wurden als Proben verwendet.
  • Die Reaktion wird ausgeführt unter Verwendung von kleinen, Streptavidinbeschichteten Polystyrolröhrchen (Herstellung gemäß EP-A 0 269 092 ).
  • Ausführung der Bestimmung:
  • 0,2 ml Probe werden in einem kleinen Röhrchen 60 Minuten bei 20–25°C mit 1 ml Reagenz 1 inkubiert, gefolgt von Absaugen und zweimaligem Waschen mit Leitungswasser. Danach wird Reagenz 2 zugegeben, es wird 30 min bei 20–25°C inkubiert, und die Extinktion bei 420 nm wird im Photometer bestimmt. Auf diese Weise wird eine Standardkurve erhalten, welche die Bestimmung der SEMP1-Konzentrationen der zu untersuchenden Proben ermöglicht.
  • Beispiel 9
  • Bestimmung von SEMP1 in normalem Gewebe und in Tumorgewebe
  • Um SEMP1-Protein in histologischen Schnitten nachzuweisen wurden Paraffinschnitte von normalem Gewebe und Brustkrebsgewebe untersucht. 5 zeigt einen Schnitt mit einer anti-SEMP1-Antikörper-Anfärbung (5 A und B) und mit einem nicht bindenden Antikörper (C, D) zur Kontrolle. Der erfindungsgemäße anti-SEMP1-Antikörper bindet spezifisch nur an die Epithelzellen der verschiedenen Drüsenstrukturen, während das umgebende mesenchymale Stromagewebe nicht angefärbt wird. Die Figur zeigt klar, dass dies eine Membran-lokalisierte Anfärbung ist, bei der alle der Epithelzellen angefärbt werden. In dieser Figur ist nicht gezeigt, dass in den Brustdrüsenabschnitten mit den erfindungsgemäßen Antikörpern neben den lobulären Strukturen (Epithelzellen) auch Ductusstrukturen (Endothelzellen) angefärbt werden können.
  • Im Gegensatz dazu ist die Expression von SEMP1 in Tumorgewebe signifikant niedriger als in normalem Gewebe. Dies ist in den 6 und 7 gezeigt. Während in normalem Gewebe aus Brust oder Darm SEMP1 speziell am Membranteil von Epithelzellen gefunden wird, wurde in Tumorzellen etwas Anfärbung für die Membran und das Zytoplasma gefunden. Die Anfärbung in Tumorgewebe war jedoch beträchtlich niedriger als in normalem Gewebe.
  • 7 zeigt einen Vergleich eines Schnitts von normalem Brustgewebe mit acht Schnitten Brusttumorgewebe. 7 zeigt, dass speziell lobuläre Strukturen angefärbt werden. In allen Fällen wird die Anfärbung an der Membran gefunden. In keinem der Schnitte von Brusttumorgewebe konnte eine Membran-lokalisierte Anfärbung, wie in normalem Brustgewebe gefunden, festgestellt werden. Für Brusttumorgewebe ist die Anfärbung immer eine niedrige gleichförmige zytosolische Anfärbung.
  • Diese Experimente zeigen, dass erfindungsgemäße anti-SEMP1-Antikörper effektiv für die Diagnose des tight-Junction-Status von Zellen verwendet werden können und daher ein wertvoller Marker für Tumorbildung und/oder Tumorweiterentwicklung sind.
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  • Figure 00340001
  • Figure 00350001
  • Figure 00360001

Claims (10)

  1. Antikörper, der an das SEMP1-Antigen bindet und dadurch gekennzeichnet ist, dass der Antikörper an SEMP1 mit einer nachweisbaren Epitopüberlappung gegenüber einem Antikörper bindet, der aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus den Antikörpern DSM ACC2458, DSM ACC2459, DSM ACC2461 und DSM ACC2463.
  2. Antikörper, erhältlich von einer Zelllinie, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus den Zelllinien DSM ACC2458, DSM ACC2459, DSM ACC2460, DSM ACC2461, DSM ACC2462 und DSM ACC2463.
  3. Antikörper nach Anspruch 1 oder 2, worin der Antikörper ein Fab-, Fab'-, F(ab)'2-Fragment ist.
  4. Die Zelllinien DSM ACC2458, DSM ACC2459, DSM ACC2460, DSM ACC2461, DSM ACC2462 und DSM ACC2463.
  5. Verfahren zur Herstellung eines Antikörpers, der an SEMP1 mit einer nachweisbaren Epitopüberlappung gegenüber einem Antikörper bindet, der aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus den Antikörpern DSM ACC2458, DSM ACC2459, DSM ACC2461 und DSM ACC2463, dadurch gekennzeichnet, dass eine nicht-humane Säugerspezies mit einer SEMP1-Nukleinsäure und nachfolgend mit SEMP1-Polypeptid immunisiert wird und der Antikörper aus Zellen oder Körperfluid der Spezies isoliert wird.
  6. Verfahren nach Anspruch 5, worin der Antikörper ein monoklonaler Antikörper ist und das Verfahren weiterhin dadurch gekennzeichnet ist, dass anti-SEMP1-Antikörper-produzierende B-Zellen isoliert und mit Myelomzelllinien fusioniert werden, die fusionierten Zelllinien isoliert und auf Antikörperaktivität gegen SEMP1 getestet werden, die Zellen, die Antikörper produzieren, die an SEMP1 binden, isoliert werden und der monoklonale Antikörper von den Zelllinien produziert und isoliert wird.
  7. Verwendung eines Antikörpers nach einem der Ansprüche 1 bis 3 zur Herstellung eines therapeutischen Mittels.
  8. Pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend einen Antikörper nach den Ansprüchen 1 bis 3 in einer Menge von 0,1 bis 500 mg/ml bei pH-Wert 5,0 bis 7,0.
  9. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 8, enthaltend einen Antikörper in einer Menge von 0,1 bis 250 mg/ml bei pH-Wert 5,0 bis 7,0.
  10. Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die einen Antikörper nach einem der Ansprüche 1 bis 3 enthält, wobei eine wässrige Lösung des Antikörpers vereinigt wird mit einer wässrigen Pufferlösung, so dass die Konzentration des Antikörpers in der pharmazeutischen Zusammensetzung 0,1 bis 500 mg/ml ist und der pH-Wert zwischen 5,0 und 7,0 ist.
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