ES2290072T3 - Anticuerpos frente a la proteina semp1, metodos para su produccion y usos de los mismos. - Google Patents
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Abstract
El anticuerpo que se une al antígeno de SEMP1 y que se caracteriza por que dicho anticuerpo se une a SEMP1 con un epítopo detectable solapado al anticuerpo seleccionado del grupo formado por los anticuerpos DSM ACC2458, DSM ACC2459, DSM ACC2461 y DSM ACC2463.
Description
Anticuerpos frente a la proteína SEMP1, métodos
para su producción y usos de los mismos.
La invención comprende anticuerpos dirigidos
frente a la proteína humana de las uniones intercelulares estrechas
SEMP1, métodos para su producción y usos diagnósticos y terapéuticos
de la misma.
El entorno extracelular de las células de
mamífero determina, mediante la regulación de la adhesión celular y
de la proliferación, un comportamiento normal no oncogénico de
células in vivo. La pérdida de estos elementos principales
de control supone una característica distintiva de la oncogenia.
Recientemente se han identificado la ocludina y
miembros de la familia de la claudina como los principales
constituyentes del complejo de adhesión intercelular de unión
estrecha. Es obvio que la claudina-1 murina
constituye la principal proteína de unión estrecha en las células
epiteliales (Furuse, M., et al., J. Cell Biol. 141 (1998)
1539-1550; Furuse, M., et al., J. Cell Biol.
143 (1998) 391-401), y el homólogo humano SEMP1
(proteína de membrana epitelial asociada a la senescencia, Núm. Acc.
de Swiss Prot. 095832, CLD1 humana) fue identificado recientemente
mediante análisis de genética molecular (Swisshelm, K.A., et
al., Gene 226 (1999) 285-295). Se dispone de
gran cantidad de datos que demuestran que las uniones estrechas como
forma de unión célula-célula y proteínas de unión
estanca pueden estar implicadas en la oncogenia (Porvaznik, M.,
et al., J. Supramol. Struct. 10 (1979)
13-30; Swift, J.G., et al., J. Submicrosc.
Cytol. 15 (1983) 799-810;
Chochand-Prillet, B., et al., Ultrastruct.
Pathol. 22 (1998) 413-420; Soler, A.P., et
al., Carcinogenesis 20 (1999) 1425-1431; Woo,
P.L., et al., J. Biol. Chem. 274 (1999)
32818-32828). Además, se ha demostrado recientemente
que la expresión de SEMP1 se puede encontrar exclusivamente en
células y tejidos de origen epitelial, pero se encuentra bajo
regulación negativa o bien totalmente anulada en células humanas
tumorales de cáncer de mama in vitro (Swisshelm, K.A., et
al., Gene 226 (1999) 285-295).
La pérdida o la expresión de proteínas de
uniones estrechas o de moléculas asociadas en la evaluación
diagnóstica de la oncogenia, de la progresión tumoral o de la
intervención terapéutica in vivo o ex vivo requiere
el uso de anticuerpos monoclonales o policlonales. La generación y
la aplicación de anticuerpos para identificar la ocludina se han
demostrado positivamente in vitro (Furuse, M., et al.,
J. Cell Biol. 141 (1998) 1539-1550; Furuse, M.,
et al., J. Cell Biol. 143 (1998) 391-401).
Sin embargo se encontraron dificultades importantes para generar
anticuerpos monoclonales o policlonales frente a la SEMP1 humana o
su homóloga murina claudina-1. También se
obtuvieron resultados decepcionantes en la generación de anticuerpos
monoclonales o policlonales frente a la claudina-1
murina (Furuse, M., et al., J. Cell Biol. 141 (1998)
1539-1550).
Más recientemente, se generó un anticuerpo
policlonal en conejos dirigido frente al dominio intracelular
C-terminal de la proteína
claudina-1 murina, que no produce reacción cruzada
con otras proteínas endógenas relacionadas (clon MH25, Zymed
Laboratories Inc., 458 Carlton Court, South San Francisco, CA 94080,
núm. de Catálogo 71-7800,
http://www.zymed.com/products/71-7800.html), y se
generó un anticuerpo monoclonal frente al dominio
C-terminal de la claudina-1 murina
en ratas (Furuse, M., et al., J. Cell Biol. 147 (1999)
891-903).
Por lo tanto, la presente invención proporciona
anticuerpos monoclonales y policlonales que se unen al polipéptido
SEMP1 (CLD-1 humana) de un modo equivalente a un
anticuerpo seleccionado del grupo formado por los anticuerpos DSM
ACC2458, DSM ACC2459, DSM ACC2461 y DSM ACC2463.
Un anticuerpo como el de la invención no se une
en gran medida al dominio intracelular C-terminal de
la claudina-1 murina.
Se halló de forma sorprendente que a pesar de
que fallaron los intentos de producir anticuerpos
anti-SEMP1 empleando fragmentos de polipéptido
SEMP1 para la inmunización, es posible generar anticuerpos
específicos para SEMP1 utilizando la vacunación por DNA,
preferiblemente con un refuerzo adicional con polipéptido SEMP1.
Según el método que propone la invención ahora es posible obtener de
un modo sencillo anticuerpos dirigidos frente a cualquiera de las
partes de SEMP1, especialmente frente a los dominios extracelulares,
que sirven para modular la transducción de señales a través de
SEMP1.
La vacunación por DNA es posible según el estado
más actual de la técnica. El concepto de inmunización por DNA
surgió a raíz de la observación de que el DNA plasmídico desnudo
inyectado en el músculo de ratones daba como resultado la
transfección de fibras musculares, la expresión del transgen y la
inducción de la respuesta tanto de linfocitos T citotóxicos, como
de la respuesta de los anticuerpos (Barry, M.A., et al.,
Biotechniques 16 (1994) 616-618 y 620; Davis, H.L.,
et al., Hum. Mol. Genet. 2 (1993)
1847-1851; Davis, H.L., et al., Vaccine 12
(1994) 1503-1509; Davis, H.L., Curr. Opin.
Biotechnol. 8 (1997) 635-646; Lowrie, D.B., Nat.
Med. 4 (1998) 147-148; Ulivieri, C., et al.,
J. Biotechnol. 51 (1996) 191-194). Los constructos
empleados para la inmunización con DNA son idénticos a los
empleados para la administración de genes terapéuticos o
indicadores. Esencialmente, es posible emplear cualquiera de los
vectores de expresión eucariotas establecidos. La mayor parte de los
vectores de inmunización por DNA comprenden una secuencia viral
promotora/activadora para impulsar unos niveles elevados de
expresión transgénica en una gran variedad de células huésped.
Además, es necesario que exista una secuencia de poliadenilación
para terminar el RNA expresado.
\newpage
Tal como se emplea aquí, la expresión "no se
une en gran medida" significa que la unión de anticuerpo no se
puede detectar por métodos convencionales de detección de este tipo
de unión conocidos en las técnicas que se utilizaban hasta el
momento. Según la práctica común, la precipitación inmunológica se
aplica para determinar la unión. El límite convencional de error en
la precipitación inmunológica (y, por tanto, en el significado de
"no se une en gran medida") es aproximadamente \leq 5%.
Tal como se emplea aquí, el término "extremo
C-terminal de la claudina-1
murina" se refiere al dominio intracelular
C-terminal o a una parte del mismo. Este dominio
consiste en los aminoácidos 185-211 del ID. de SEC.
NÚM.: 4.
El término "anticuerpo", como se emplea en
este documento, hace referencia a una proteína que consiste en uno
o más polipéptidos codificados de forma sustancial por genes de
anticuerpos. Los genes de anticuerpos reconocidos incluyen los
diferentes genes de las regiones constantes así como la infinidad de
genes de la región variable del anticuerpo. Los anticuerpos pueden
estar en una diversidad de formas que son, por ejemplo, Fv, Fab y
F(ab)_{2}, además de cadenas simples (p. ej. Houston
et al., PNAS USA 85 (1988) 5879-5883; Bird,
R.E., et al., Science 242 (1988) 423-426; y,
en general, Hood et al., Immunology, Benjamin N.Y., 2a
edición (1984) y Hunkapiller, T., y Hood, L., Nature 323 (1986)
15-16). En especial, son útiles los anticuerpos
producidos en animales transgénicos que expresan receptores Fc
humanos (véase WO 99/00010), dado que estos anticuerpos son
bastante similares a los anticuerpos humanos. Los anticuerpos
preferidos según la invención son anticuerpos monoclonales o
fragmentos de los mismos que presentan las mismas características
relativas a la interacción con el antígeno de SEMP1 que un
anticuerpo seleccionado del grupo formado por los anticuerpos DSM
ACC2458, DSM ACC2459, DSM ACC2461 y DSM ACC2463.
Existe otro grupo de anticuerpos (DSM 2460 y DSM
2462) dirigidos hacia el dominio intracelular (epítopo 2 (IC2), cf.
Fig. 4) de SEMP1.
El anticuerpo comprende de forma preferible al
menos dos cadenas polipeptídicas ligeras y dos pesadas. Cada una de
las cadenas polipeptídicas ligeras y pesadas contiene una región
variable (generalmente la porción aminoterminal de la cadena
polipeptídica) que contiene un dominio de unión que interacciona con
el antígeno. Cada una de las cadenas polipeptídicas ligeras y
pesadas también comprende una región constante de las cadenas
polipeptídicas (generalmente la porción del extremo carboxílico) que
puede intervenir en la unión del anticuerpo a los tejidos o
factores del huésped, incluyendo diversas células del sistema
inmunitario, algunos fagocitos y un primer componente (C1q) del
sistema clásico del complemento. Habitualmente las cadenas
polipeptídicas ligeras y pesadas son cadenas completas y cada una
de ellas consiste esencialmente en una región variable y una región
constante completa. Las regiones variables del anticuerpo según la
invención se pueden incluir en regiones constantes de otros
isotipos. Por ejemplo, un polinucleótido que codifica la región
variable de una cadena pesada del isotipo \gamma1 se puede
anexionar a un polinucleótido que codifique la región constante de
otra clase (o subclase) de cadena pesada.
Asimismo, generalmente es posible realizar de
una a varias sustituciones de aminoácidos, en especial sustituciones
conservativas, en la secuencia aminoacídica de las secuencias de
las cadenas ligeras o pesadas de los presentes anticuerpos sin
interferir de forma sustancial en la unión del antígeno y, en
algunos modos de realización, sin aumentar de forma sustancial la
antigenicidad del anticuerpo cuando se inyecta en un paciente
humano. En algunas variantes es posible llevar a cabo deleciones o
adiciones de uno a varios aminoácidos. Lo más característico es que
se realicen las sustituciones, adiciones o deleciones de aminoácidos
en las regiones constantes o variables, de las secuencias armazón y
de las secuencias de la región determinante de complementariedad
(CDR, por sus siglas en inglés).
Una sustitución conservativa de aminoácidos es
una sustitución de un aminoácido mediante el reemplazo de un
aminoácido que posee características similares (p. ej. aquellos que
poseen propiedades ácidas: Asp o Glu). Una sustitución conservativa
de un aminoácido no debe alterar en esencia las características
estructurales de la secuencia original. Se pueden encontrar
ejemplos descritos de estas estructuras polipeptídicas en Proteins,
Structures and Molecular Principles, Creighton (editor), W.H.
Freeman and Company, New York (1984); Introduction to Protein
Structure, C. Brandon and J. Tooze, Garland Publishing, New York
(1981) y en Thornton, J.M., et al., Nature 354 (1991)
105-106.
105-106.
Por ejemplo, es posible realizar sustituciones
únicas o múltiples de aminoácidos (preferiblemente sustituciones
conservativas) en la secuencia natural (preferiblemente en la
porción del polipéptido que no entra en contacto directo con el
antígeno).
A partir de los anticuerpos y los métodos de
acuerdo con la presente invención es posible encontrar una gran
cantidad de anticuerpos adicionales que interaccionen con SEMP1 de
un modo análogo. Estos anticuerpos permiten su unión al antígeno de
SEMP1 de forma equivalente a los anticuerpos depositados.
Por el término "anticuerpos que permiten su
unión de forma equivalente" debe entenderse que se trata de
anticuerpos en los que se puede detectar una superposición de
epítopos con los anticuerpos en cuestión. La detección de esta
superposición de epítopos se puede realizar con la ayuda de un
sistema competitivo de análisis. Por ejemplo, mediante un
inmunoensayo enzimático se analiza el grado de competencia del
anticuerpo con el anticuerpo conocido por la unión a un antígeno de
SEMP1 inmovilizado. Para ello, se toma un antígeno inmovilizado de
forma adecuada (p. ej. una célula que expresa SEMP1 en su
superficie) y se incuba con uno de los anticuerpos depositados
marcado y con un exceso del anticuerpo en cuestión. Mediante la
detección del marcaje unido es posible estimar fácilmente el grado
en que el anticuerpo en cuestión desplaza al anticuerpo determinado
respecto de la unión. En el caso de que haya un desplazamiento del
20% como mínimo, preferiblemente del 50% como mínimo, a la misma
concentración o a concentraciones más elevadas, preferiblemente en
el caso de un exceso de 10^{5} veces del anticuerpo en cuestión y
en referencia a uno de los anticuerpos depositados, entonces existe
una superposición de epítopos.
Los anticuerpos se pueden emplear como
anticuerpos policlonales o monoclonales completos, como fragmentos
de estos (p. ej. Fv, (Fv)_{2}, Fab, Fab',
F(ab)2), o como anticuerpos quiméricos, humanizados o
humanos, siempre y cuando se unan a SEMP1 de un modo adecuado.
También son adecuados los fragmentos de anticuerpos de cadena corta
que contienen solamente las regiones CDR o partes de las mismas que
confieren la especificidad de unión a CD30, especialmente si el
anticuerpo es uno que está marcado. Se prefieren los anticuerpos del
isotipo IgG1.
En lo que respecta a la producción de
anticuerpos monoclonales véase, por ejemplo, E. Harlow y D. Lane,
Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (1988);
Bessler, W.G., et al., Immunobiol. 170 (1985)
239-244; Jung, G., et al., Angewandte Chemie
97 (1985) 883-885; o Cianfriglia, M., et al.,
Hybridoma 2 (1993) 451-457.
La presente invención también proporciona un
proceso para la producción de anticuerpos que se unen al antígeno
de SEMP1, preferiblemente a los péptidos 1-37, más
preferiblemente a los péptidos 5, 21, 29, 30 y 37 (Fig. 4)
mencionados más adelante, proceso en el que se inmuniza una especie
de mamífero con un plásmido de DNA de SEMP1 que codifica el marco
abierto de lectura de SEMP1 y, posteriormente, con el polipéptido
SEMP1; seguidamente se aíslan linfocitos B productores de
anticuerpo anti-SEMP1 y se fusionan con líneas
celulares de mieloma; las líneas celulares fusionadas se aíslan y
se analizan en busca de actividad de anticuerpos frente a SEMP1; se
aíslan las líneas celulares que producen anticuerpos de unión a
SEMP1; y se producen y aíslan, preferiblemente hasta una pureza
sustancial, anticuerpos monoclonales (AcM) a partir de dichas líneas
celulares. Preferiblemente, la inmunización se lleva a cabo durante
un periodo de entre unos 3 y 5 meses con inmunizaciones de DNA
repetidas a intervalos mensuales y con un refuerzo diario con
polipéptido SEMP1 durante 3 días previamente al aislamiento de
linfocitos B. Gracias al proceso según la invención es posible
producir anticuerpos monoclonales o policlonales frente a todas las
regiones o dominios inmunogénicos del polipéptido SEMP1.
Los anticuerpos policlonales (Paks) se
recuperan, tras la mencionada inmunización con DNA, según las
técnicas de vanguardia, preferiblemente siguiendo los protocolos
descritos en Harlow E. y Lane D., "Antibodies - A Laboratory
Manual", Cold Spring Harbor Laboratory (1988).
La presente invención también proporciona
derivados de anticuerpos de acuerdo con la misma que poseen la
especificidad de unión de los mismos, pero que poseen
modificaciones en la región que no es importante para la unión del
antígeno. Estos derivados de anticuerpo se pueden obtener a partir
de anticuerpos según la presente invención mediante el intercambio
de uno o más dominios constantes o enlaces con otras moléculas. Por
lo tanto, por ejemplo, es posible llevar a cabo un intercambio de
dominios constantes por un isotipo en los casos en que, por
ejemplo, se pueda convertir un anticuerpo de clase IgM en un
anticuerpo de clase IgG manteniendo su especificidad antigénica.
Este intercambio de isotipos se puede realizar mediante métodos de
biología celular o biología molecular bien conocidos en el campo
(véase, por ejemplo, Rothman, P., et al., Mol. Cell. Biol. 10
(1990) 1672-1679).
Existe un proceso preferido para la producción
de AcM con una inmunogenicidad reducida en humanos, en el que las
regiones variables de anticuerpos frente a SEMP1 están unidas a las
regiones constantes de un anticuerpo humano.
La presente invención también concierne al uso
de un anticuerpo según la presente invención para el diagnóstico o
el tratamiento de, p. ej., el tratamiento tumoral, el control de la
angiogénesis, el control de la barrera hematoencefálica aplicando
compuestos naturales o sintéticos o bien células, el control de la
respuesta inflamatoria, el control de la presión ocular, etc. En
consecuencia, se prefiere el uso de un anticuerpo seleccionado del
grupo de anticuerpos secretados por las líneas celulares DSM
ACC2458, DSM ACC2459, DSM ACC2461 y DSM ACC2463.
Dado que los anticuerpos preferidos que se
pueden obtener mediante el proceso de acuerdo con la presente
invención poseen la capacidad de unirse a moléculas SEMP1 unidas a
la superficie o de unirse al dominio extracelular de SEMP1, lo cual
es especialmente preferido, estos son destacadamente adecuados para
la detección cualitativa o cuantitativa de la expresión fisiológica
o fisiopatológica de las uniones intercelulares estrechas. Así, la
detección se lleva a cabo del modo habitual siguiendo un proceso de
determinación inmunológica, preferiblemente empleando un ELISA. Los
procesos de esta clase son ampliamente conocidos y no procede
explicarlos con más detalle en esta ocasión. Los anticuerpos
obtenidos según la presente invención pueden por tanto emplearse en
forma marcada o inmovilizada.
En cada caso de este tipo de método inmunológico
de diagnóstico, se evalúa un cambio de señal que sigue a la unión
de al menos un anticuerpo según la presente invención, al cual se
encuentra unido un marcador detectable.
La importancia diagnóstica del SEMP1 radica
preferiblemente en la detección de la permeabilidad o de daños en
la capa celular endotelial o epitelial, en la identificación de la
aparición o la progresión de una metástasis de células tumorales y
en la detección de la progresión de la oncogenia.
La presente invención también proporciona un
proceso para mejorar la permeabilidad de los adyuvantes de las
vacunas, potenciar la permeabilidad de los tejidos
endoteliales/epiteliales frente a fármacos para el tratamiento o la
profilaxis del cáncer, enfermedades inflamatorias crónicas o agudas,
isquemia miocárdica, ateroesclerosis, retinopatía diabética,
artritis reumatoide o infección intestinal; proceso en el que se
administra un anticuerpo o una mezcla de varios anticuerpos según
la presente invención que se unan preferiblemente a un dominio
extracelular de SEMP1, de forma opcional junto con transportadores,
adyuvantes, materiales de relleno o aditivos farmacéuticos
convencionales.
Con el fin de prevenir una respuesta inmunitaria
durante la aplicación farmacéutica, se prefiere el uso de
anticuerpos que sean lo más parecidos posible a los anticuerpos de
origen humano (Glassy, M.C. y Dillman, R.O., Mol. Biother. 1 (1988)
7-13). Los anticuerpos empleados de forma preferible
son aquellos según la presente invención en los que la región
variable se encuentra modificada en esta parte o en todo el SEMP1 o
bien en los que todas las secuencias de unión a SEMP1 de dicho
anticuerpo están sustituidas por las secuencias correspondientes de
una región variable humana. Estos anticuerpos son, por ejemplo,
anticuerpos quiméricos o humanizados (con injerto de CDR).
Normalmente se generan a partir de un anticuerpo monoclonal de
roedor (para revisión véase, p. ej., Morrison, S.L., Annu. Rev.
Immunol. 10 (1992) 239-265 y Winter, G. y Milstein,
C., Nature 349 (1991) 293-299). En una realización
especialmente preferida de la invención se emplean anticuerpos
humanos específicos para tumores (Borrebaeck, C.A.K., et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (1988)
3995-3999; Borrebaeck, C.A.K., Immunol. Today 9
(1988) 355-359) con fines terapéuticos. Asimismo, se
prefiere específicamente la preparación de AcM humanos a partir de
genotecas mediante exposición de fagos (phage display), tal
como se describe, por ejemplo, en Griffiths, A.D., et al.,
EMBO J. 12 (1993) 725-734).
Es posible producir anticuerpos
anti-SEMP1 de la invención producidos de forma
recombinante, tomando como base los datos de secuencia siguiendo
los métodos conocidos en el ámbito y que se describen en Sambrook
et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a edición
(1989), Cold Spring Harbor, New York; y Berger y Kimmel, Methods in
Enzymology, Vol. 152, Guide to Molecular Cloning Techniques (1987),
Academic Press Inc., San Diego, CA. Los polinucleótidos de la
invención se forman preferiblemente a partir de oligonucleótidos
sintéticos. Tales polipéptidos recombinantes pueden expresarse a
través de células huésped eucariotas o procariotas, según los
métodos estándar conocidos en este campo; preferiblemente se
deberían usar células de mamíferos, tales como las líneas celulares
de linfocitos, como células huésped. Típicamente, tales
construcciones de polinucleótidos codifican una cadena pesada de
anticuerpos humanos completa y/o una cadena ligera de anticuerpos
humanos completa de un anticuerpo según la invención, con las
regiones variables de cadenas pesadas y/o ligeras, respectivamente.
Los expertos en la materia pueden seleccionar secuencias de regiones
constantes humanas alternativas (pesadas y/o ligeras) de varias
fuentes de referencia, incluyendo, entre otros, a los que se
incluyen en la lista de E.A. Kabat et al. (1987) (37). En un
modo de realización de la invención se expresa una secuencia de
polinucleótidos que codifica una cadena ligera de anticuerpos que
consta de una región constante de una cadena ligera humana, región
constante con un enlace peptídico aminoterminal de amina (es decir,
una fusión siguiendo la pauta de lectura)a una región
variable de la cadena ligera de un anticuerpo según la invención y
una cadena pesada correspondiente y forman dímeros de cadena
pesada/ligera y otros tipos de anticuerpos.
Debido a que los anticuerpos monoclonales
obtenidos mediante el proceso de la presente invención se unen al
antígeno SEMP1 unido a la superficie celular que está implicado en
la adhesión celular, se pueden utilizar en tratamientos in
vivo en humanos. Por lo tanto, la presente invención también
proporciona una composición farmacéutica que comprende uno o más
anticuerpos según la presente invención, que de modo opcional pueden
presentarse conjuntamente con transportadores, adyuvantes,
materiales de llenado o aditivos farmacéuticos convencionales.
Según la presente invención, dicha composición mejora
preferentemente la permeabilidad de los adyuvantes de las
vacunas.
Con fines terapéuticos, se administra al
paciente humano una composición estéril que contenga una dosis
farmacológicamente efectiva de uno o más anticuerpos según la
invención, para tratar las enfermedades descritas anteriormente.
Típicamente, la composición constará de un anticuerpo quimérico o
humanizado que contenga la región CDR de un anticuerpo según la
invención, para una la inmunogenia reducida.
Las composiciones para la administración
parenteral constarán, generalmente, de una solución de un anticuerpo
según la invención disuelta en un transportador aceptable,
preferentemente en un transportador acuoso. Se pueden utilizar una
gran variedad de transportadores acuosos, p. ej. agua, agua
tamponada, salino al 0,4%, glicina al 0,3% y similares. Las
soluciones son estériles y generalmente de sólidas. Las
composiciones se pueden esterilizar mediante técnicas
convencionales conocidas en este ámbito. Las composiciones pueden
contener coadyuvantes aceptables farmacéuticamente, como los que
son necesarios para aproximar condiciones fisiológicas, como los
ajustadores de pH y los tampones, agentes ajustadores de la
toxicidad y similares, como por ejemplo el acetato sódico, el
cloruro sódico, el cloruro potásico, el cloruro cálcico, el lactato
sódico, etc. Las concentraciones de los anticuerpos según la
invención en estas formulaciones pueden variar ampliamente, p. ej.
de menos del 0,01%, aproximadamente, que normalmente es como mínimo
del 0,1%, aproximadamente, hasta un 5% en peso y se seleccionará
principalmente en función de los volúmenes de líquido, la
viscosidad, etc., o según el modo concreto de administración
seleccionado.
Por lo tanto, se puede realizar una composición
farmacéutica característica para la inyección intramuscular que
contenga 1 ml de agua tamponada estéril y de 0,1 a 250 mg,
preferentemente de 1 a 10 mg de anticuerpo. según la invención.
Como se ha mencionado anteriormente, los
anticuerpos según la invención, se pueden incorporar en una
composición, preferentemente en un composición farmacéutica
adecuada para la administración parenteral. Preferentemente, el
anticuerpo se preparará como una solución inyectable tamponada que
contiene de 0,1 a 500 mg/ml de anticuerpo y preferentemente de 0.1
a 250 mg/ml de anticuerpo, preferentemente de modo conjunto con 1 a
500 mmol/l de tampón. La solución inyectable puede constar de una
forma farmacéutica líquida o liofilizada. El tampón puede ser, por
ejemplo, L-histidina (preferentemente de 1 a 50 mM,
óptimamente de 5 a 10 mM), a un pH de 5,0 a 7.0 (óptimamente un pH
de 6,0).
Otros tampones adecuados son el succinato
sódico, el citrato de sódico, el fosfato sódico o el fosfato
potásico, pero no se limitan sólo a estos. El cloruro sódico se
puede utilizar para modificar la toxicidad de la solución a una
concentración de 0-300 mM (óptimamente de 150 mM
para una forma farmacéutica líquida). Se pueden incluir
crioprotectores para una forma farmacéutica liofilizada,
principalmente de 0 a 10% de sacarosa (óptimamente de 0,5 a 1,0%).
Otros crioprotectores son la trehalosa y la lactosa. Los agentes de
carga se pueden incluir en una forma farmacéutica liofilizada,
principalmente de un 1 a un 10% de manitol. Los estabilizadores se
pueden utilizar en formas farmacéuticas líquidas y liofilizadas,
principalmente L-metionina de 1 a 50 mM de
(óptimamente de 5 a 10 mM).
Otros agentes de carga adecuados, como la
glicina la arginina, se pueden incluir como un
0-0,05% de polisorbato-80
(óptimamente 0,005-0,01%). Entre otros tensioactivos
adicionales se encuentran el polisorbato 20 y los tensioactivos
(éter de polioxietileno) como los detergentes BRIJ®.
Una dosis adecuada del anticuerpo según la
presente invención para los tratamientos médicos es de
aproximadamente de 0,01 a 50 mg/kg de peso corporal y esta dosis se
deberá administrar, posiblemente, repetidas veces.
En un modo de realización de la invención, la
composición farmacéutica incluye el anticuerpo a una dosis
aproximada de 0,01 mg/kg a 10 mg/kg por aplicación. Una dosis
preferente del anticuerpo es de 1 mg/kg.
El modo de administración preferido es el
parenteral (p. ej. intravenoso, subcutáneo, intraperitoneal,
intramuscular). En un modo de realización preferente, el anticuerpo
se administra por infusión intravenosa o inyección. En otro modo
de realización preferente, el anticuerpo se administra mediante
inyección intramuscular o subcutánea.
Las composiciones farmacéuticas deben ser
característicamente estériles y estables en las condiciones de
elaboración y almacenamiento. La composición se puede formular como
una solución, una microemulsión, una dispersión, un liposoma o
cualquier otra estructura ordenada adecuada para las concentraciones
de fármacos elevadas. Las soluciones inyectables estériles se
pueden preparar incorporando la cantidad necesaria del compuesto
activo en un solvente adecuado, con uno o la combinación de los
ingredientes nombrados anteriormente, según sea necesario, seguido
de una esterilización por filtración. Generalmente, las dispersiones
se preparan mediante la incorporación del compuesto activo dentro
de un vehículo estéril que contenga un medio de dispersión básico y
los otros ingredientes necesarios de los citados anteriormente. En
el caso de los polvos liofilizados estériles para la preparación de
soluciones inyectables estériles, los métodos preferidos de
preparación son el secado al vacío y el secado con dispersión que
produce un polvo del ingrediente activo, además de cualquier
ingrediente deseado adicional de una solución del mismo.
Previamente esterilizada por filtración. La fluidez adecuada de una
solución se puede mantener, por ejemplo, mediante el uso de un
recubrimiento como la lecitina, manteniendo el tamaño de la
partícula necesario, en el caso de la dispersión, mediante el uso de
tensioactivos.
La absorción prolongada de las composiciones
inyectables se puede provocar incluyendo en la composición un
agente que retrase la absorción en la composición, por ejemplo,
sales de monoestearato y gelatina.
Los anticuerpos y las porciones de anticuerpos
de la presente invención se pueden administrar mediante una gran
variedad de métodos conocidos en este ámbito, aunque para muchas
aplicaciones terapéuticas el modo preferente de administración es
la inyección subcutánea, la inyección intravenosa o la infusión.
Como se apreciará por los expertos en la materia, el modo de
administración variará en función de los resultados deseados. En
algunos modos de realización concretos, el compuesto activo puede
prepararse con un transportador que protegerá al compuesto de una
liberación rápida, como la formulación de liberación controlada,
incluyendo implantes, los parches transdérmicos y los sistemas de
liberación microencapsulada. Se pueden utilizar polímeros
biocompatibles y biodegradables como el acetato de
vinilo-etileno, polianhídridos, ácido poliglicólico,
colágeno, poliortoésteres y ácido poliláctico. Muchos métodos de
preparación de estas formulaciones están patentados o son conocidos
generalmente por los expertos en este campo; véase, por ejemplo,
Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R.
Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978.
Los anticuerpos de la presente invención se
utilizan en su forma líquida, en polvo o liofilizada y se pueden
combinar con un disolvente adecuado o transportador, como el agua,
una solución salina, dextrosa acuosa, tampón acuoso y similares.
También se pueden añadir conservantes.
Los anticuerpos según la invención se pueden
liofilizar para su almacenamiento y se pueden reconstituir en un
transportador adecuado antes de su uso. Se pueden emplear técnicas
de liofilización y reconstrucción convencionales. Los expertos en
la materia notarán que la liofilización y la reconstrucción pueden
llevar a diversos grados de pérdida de actividad biológica y que
los niveles de utilización tendrán que ser ajustados para
compensar.
Independientemente de la vía de administración
seleccionada, los anticuerpos de la presente invención se formulan
en dosis farmacéuticamente aceptables mediante métodos
convencionales conocidos por los expertos en este campo. Los
anticuerpos se deberán formular, también, utilizando ácidos o sales
de adición de bases farmacológicamente aceptables. Además, los
compuestos o sus sales se pueden utilizar en una formulación
hidratada adecuada.
Independientemente de la ruta de administración
seleccionada, en cualquier tratamiento se emplea una cantidad
terapéuticamente efectiva, pero no tóxica, de uno o más anticuerpos
de esta invención. La dosis de tratamiento se selecciona según una
gran variedad de factores, incluyendo la edad, el peso, el sexo y el
estado de salud del paciente, el tipo de tumor, la vía de
administración y el anticuerpo concreto utilizado en el tratamiento.
Un médico experto en la materia puede determinar y prescribir
fácilmente la cantidad efectiva de medicamento necesario, en
función de aproximaciones terapéuticas inmunológicas conocidas. En
este procedimiento, el médico puede emplear primero dosis
relativamente bajas y, posteriormente, aumentar la dosis hasta que
se obtenga una respuesta máxima.
El polipéptido SEMP1 purificado, de gran ayuda
para la estimulación durante la inmunización, se puede producir
recombinantemante en células eucariotas. Debido a que el SEMP1 es
una proteína de unión estrecha localizada en las áreas de contacto
intercelulares y presenta una marcada tendencia de adhesión (Furuse,
M., et al., J. Cell. Biol. 147 (1999)
891-903), es muy difícil aislar y purificar el
polipéptido completo. Además, debido al hecho de que el SEMP1 es
una proteína asociada a la membrana, es necesario liberar la
proteína de la membrana. No obstante, algunos intentos de aislar el
SEMP1 de las membranas celulares utilizando diferentes detergentes
(CHAPS,
3-[(3-colamidopropil)-dimetilamonio]-1-propano
sulfonato; octilglucósido, ácido desoxicólico, Igepal® CA630,
(octilfenoxi)polietoxietanol; Triton®X-100
(octilfenoxi); Thesit, polioxietileno-9- lauril
éter; Digitonina) no tuvieron éxito. Aunque, sorprendentemente, fue
posible aislar y purificar el SEMP1 adicional utilizando
Zwittergent®
(N-dodecil-N,N-dimetil-3-amonio-1-propanosulfonato,
Roche Diagnostics GmbH, Alemania).
Por lo tanto, un aspecto adicional de la
invención es un método para la purificación cromatográfica del
polipéptido SEMP1 a través del cual una composición acuosa que
contenga polipéptido SEMP1 es aplicada a una columna cromatográfica,
el polipéptido SEMP1 es eluido en presencia de
N-dodecil-N,N-dimetil-3-amonio-1-propanosulfonato
y recuperado del eluato.
Otro aspecto de la invención es un método para
la liberación del polipéptido SEMP1 desde una matriz como una
membrana celular, tratando dicho polipéptido SEMP1 unido en una
solución acuosa con N-dodecil de modo que el
polipéptido SEMP1 se solubiliza.
Las siguientes líneas celulares mencionadas en
la presente invención que secretan anticuerpos fueron depositadas
por F. Hoffmann-La Roche AG en la Deutsche Sammlung
von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM), Mascheroder Weg
1b, D-38124 Braunschweig, Alemania, el 18 de Mayo de
2000:
Sus características de enlace son:
- -
- clon 3, con el péptido 21 (amino ácido (aa) 97-108, IC1) y 37 (160-171, EC2)
- -
- clon 4, con el péptido 21 (aa 97-108, IC1)
- -
- clon 7, con el péptido 5 (aa 31-42, EC1)
- -
- clon 64, con el péptido 29 (aa 136-147, EC2), 30 (aa 139-150, EC2) y 31 (aa 142-153, EC2).
- -
- clon 5, con el péptido 41 (aa 191-202, IC2)
- -
- clone 38, con el péptido 44 (aa 200-211, IC2)
- -
- EC1: epítopo extracelular 1 (aa 22-81)
- -
- IC1: epítopo extracelular 1 (aa 103-117)
- -
- EC2: epítopo extracelular 2 (aa 141-163)
- -
- IC2: epítopo extracelular 2 (aa 185-211)
- \quad
- (Entre paréntesis se muestran las áreas de SEMP1 a las que se unen los anticuerpos, confirmado por el modelo Señal P de predicción de estructuras 3D por ordenador (http://genome.cbs.dtu.uk/services/SignalP/), la numeración de aminoácidos corresponde a la posición del amino ácido del producto génico de SEMP1.)
- \quad
- Los siguientes ejemplos, el listado de secuencias y las figuras se proporcionan para ayudar en la comprensión de la presente invención, el verdadero alcance de la cual se expone en las reivindicaciones anexadas.
- \quad
- ID. de SEC. Núm.: 1 Péptido de fusión.
- \quad
- ID. de SEC. Núm.: 2 Péptido de fusión.
- \quad
- ID. de SEC. Núm.: 3 secuencia de DNA de SEMP1.
- \quad
- ID. de SEC. Núm.: 4 secuencia del polipéptido SEMP1.
Figura 1 Purificación de la proteína SEMP1. La
SEMP1 marcada con una cola de histidinas se expresó en células de
insecto Sf9 infectadas con baculovirus SEMP1 (Research Diagnostic
Inc., NJ, USA, www.researchd.com). La SEMP1 marcada con una cola de
histidinas se purificó del sobrenadante bruto de las células Sf9
lisadas mediante purificaciones de columna y al más alto
rendimiento y la pureza se obtuvo mediante una elución de imidazol
de 200 mM de una columna de quelación con níquel. La flecha indica
la localización de la proteína SEMP1 marcada con una cola de
histidinas.
Figura 2 Especificidad y expresión de las
células dependientes de SEMP1. Análisis de la especificidad de los
anticuerpos SEMP1 monoclonales por análisis de inmunotransferencia.
Las células SEMP1 negativas (K562 hematopoyéticas, cáncer de mama
MDA-MB435) y positivas (células epiteliales de las
vías respiratorias pequeñas, (SAEC, por sus siglas en inglés),
adenocarcinoma Caco-2, cáncer de mama
MDA-MB435 transducido con un retrovirus SEMP1) se
cultivaron hasta alcanzar la confluencia, se lisaron y se sometieron
a un análisis de inmunotransferencia. La flecha indica la posición
de la proteína SEMP1 nativa.
Figura 3 Expresión de SEMP1 en las células del
cáncer de mama. Se analizó la expresión de SEMP1 en células de
cultivo en masa MDA-MB435 transducidas con SEMP1. La
especificidad de la expresión y alojamiento en los lugares de
contacto de célula con célula se indica mediante el patrón de
tinción sigmoide de SEMP1.
Figura 4 Estructura del dominio de SEMP1 y el
mapeo del epítopo de SEMP1 Mab5. Los aminoácidos (aa)
22-81 de ID. SEC. NÚM.: 4 representan el primer
dominio extracelular (EC1), los aa 103-117
representan el primer dominio intracelular (IC1), los aa
141-163 representan el segundo dominio extracelular
(EC2), los aa 185-211 representan el dominio
intracelular C terminal (IC2) y los aa 1-21
(N-term), 82-102,
118-140 y 164-184 representan
dominios de la membrana.
Figura 5 La expresión de la proteína SEMP1 en el
tejido mamario humano normal. Tinción de la proteína SEMP1 se
realizó con POD
anti-SEMP1/anti-ratón y una
contratinción de hematoxilina (cuadros A y B). La tinción de
control con anticuerpos anti-ratón secundarios se
muestra en los cuadros C y D. Los recuadros en los cuadros A y C
indican las áreas que se muestran ampliadas en los cuadros B y
D.
Figura 6 Comparación de la expresión de SEMP1 en
tejido mamario y de colon normal con tejido mamario y de colon
tumoral. La tinción se realizó según el método descrito en la figura
5.
Brust indica mama; Darm indica colon;
transformiert indica tejido tumoral.
Figura 7 Tinción de la proteína SEMP1 en
diferentes tejidos de tumores mamarios de diferentes donantes,
comparado con tejido mamario normal. La tinción se ha descrito en
la figura 5.
Para el pase rutinario de células Sf9 (ATCC CRL
1711) se cultivaron en frascos T25 en medio IPL 41 (Gibco) con un
suplemento de suero (Gibco / Yeastolate (Gibco) / Pluronic
F-68 al 10%, Gentamicina (Gibco). Para el
aislamiento a gran escala de las células Sf9 infectadas con
baculovirus con SEMP1, se cultivaron las células en un fermentador
de 7 l para proceso discontinuo y se recolectaron 3 días después de
la inoculación.
Las células del hibridoma secretoras de
anti-SEMP1 se cultivaron en medio RPMI1640 con un
complemento de FCS 10%/ l-Glutamina 2 mM (Roche
Molecular Biochemicals)/ 1 x aminoácidos no esenciales (Biochrom
AG)/ piruvato de sodio 1 mM (Biochrom AG) y Nutridoma (Roche
Molecular Biochemicals). Para la generación del sobrenadante del
hibridoma enriquecido con anti-SEMP1, se inocularon
clones del hibridoma con SEMP1 en un dispositivo de cultivo Heraeus
miniPerm classic, MWCO 12,5 k, y se recogió el medio varias veces
por semana después de que las células alcanzaran una concentración
de 1x10^{7} células por ml.
Una línea celular anfotrópica productora de
retrovirus HSR BM01 (DSM ACC2235, WO 99/60143) (MoMuLV backbone)
transducida con SEMP1 y 1-NGFR (receptor de baja
afinidad del factor de crecimiento nervioso), WO 95/06723, se
cultivó en un medio DMEM/ FCS 10% / l-Glutamina 2 mM
(Roche Molecular Biochemicals)/ 1 x aminoácidos no esenciales
(Biochrom AG)/ piruvato de sodio 1 mM (Biochrom AG). Para obtener un
sobrenadante de título elevado, se añadió medio fresco a los
cultivos subconfluentes, el sobrenadante condicionado se recolectó
24 horas más tarde (Machl, A.W., Cytometry 29 (1997)
371-374) y se utilizó inmediatamente para la
transducción de líneas celulares.
La línea celular del cáncer de mama humano
MDA-MB 435 SEMP1 negativa así como su equivalente
transducido con SEMP1 se cultivaron en RPMI/ FCS 10%/
l-Glutamina 2 mM (Roche Molecular Biochemicals)/ 1 x
aminoácidos no esenciales (Biochrom AG)/ piruvato de sodio 1 mM
(Biochrom AG). La transducción retroviral de SEMP1 se realizó
mediante incubación de un cultivo subconfluente durante 24 horas que
contenía los retrovirus del sobrenadante producidos de acuerdo con
el Ejemplo 1c. Los clones celulares MDA-MB 435 que
expresaban la SEMP1 se produjeron mediante la obtención de células
separadas, la unión a anticuerpos FITC marcados contra el
1-NGFR de cultivos en masa mediante FACS (FACS
Vantage, Becton Dickinson).
El polipéptido SEMP1 etiquetado con seis
histidinas en el extremo aminoterminal se clonó mediante
procedimientos estándar en el vector pBlueBacHis2B. Se
transfectaron células Sf9 con el plásmido His-SEMP1
y los sobrenadantes de DNA de baculovirus con SEMP1 linearizado se
recogieron 3 días después de la infección (Invitrogen, Bac'NBlue
System). Esta solución con un título viral elevado se utilizó para
la reinfección de células Sf9. Las células se recogieron después de
una infección de 3 días a 27ºC y se extrajo la proteína total
mediante sonicación de las células Sf9 (tampón de extracción: NaP
50 mM, NaCl 150 mM, pH 7,2). El extracto proteico se centrifugó a
30000 g durante 20 min y el sedimento se disolvió en NaP 50 mM, NaCl
150 mM, Zwittergent® 2%
(N-dodecil-N,N-dimetil-3-amonio-1-propanosulfo-nato,
zwitteriónico, Roche Molecular Biochemicals).
La SEMP1 etiquetada con seis histidinas se
extrajo del lisado crudo mediante cromatografía de afinidad
utilizando una columna sefarosa de quelación con níquel
(Pharmingen). La columna se cargó con NiCl_{2} 300 mM, se lavó
con tampón de equilibrado (Tris 50 mM, NaCl 500 mM, pH 8,
Zwittergent® 0,5%), se cargó con la fracción de proteína bruta y se
lavó con un tampón de equilibrado / imidazol 10 mM. Se procedió a la
elución con tampón de equilibrado / imidazol 200 mM. Debido a la
etiqueta de histidina aminoterminal y a la etiqueta de enteroquinasa
el peso molecular de la proteína SEMP1 modificada aumentó entre 23
y 27 kDa.
Se inmunizaron ratones hembra BALB/c cuando
tenían de 6 a 8 semanas de vida. Previamente a la vacunación, se
indujo la degeneración/regeneración muscular mediante inyección
intramuscular bilateral de 100 \mul de cardiotoxina (10 \muM en
PBS) (LATOXAN, L-8102; Rosans, Francia) en el M.
tibialis (= día 0). Se inyectaron intramuscularmente 50 \mug
de DNA del plásmido que contenía el marco de lectura abierto de
SEMP1, purificado en una columna de membrana de gel de sílice
(Qiagen, Alemania) en 50 \mul de solución estéril de NaCl 0,9%, en
el M. tibialis anterior de cada pata trasera. Se inyectaron
cinco dosis de DNA cada 4 semanas. Se obtuvieron alícuotas de suero
mediante punción retrobulbar en el día 97, 3 días antes de practicar
la disección del bazo. El animal que produjo un título sérico más
elevado se le administró una dosis de recuerdo intravenosa de 30
\mug de la proteína SEMP1 purificada a partir de células Sf9
(véase más arriba). Los ratones se sacrificaron en el día 129 y se
utilizaron los bazos para generar hibridomas siguiendo
procedimientos estándar. Se generaron clones con una producción
elevada de hibridomas mediante un separador celular (FACS Vantage,
Becton Dickinson) y se clonaron los cultivos en masa de hibridomas
SEMP1 positivos.
Se realizó un análisis de inmunotransferencia
mediante procedimientos estándar utilizando el sistema Novex NuPage
Bis-Tris (Invitrogen). Las membranas de
nitrocelulosa transferidas con geles de proteínas cargados con
diferentes cantidades de SEMP1 purificada o extractos celulares de
células control SEMP1-positivas o
SEMP1-negativas se incubaron con sobrenadantes de
clones de hibridoma productores de anticuerpos frente a SEMP1
(diluciones 1:10 y 1:100). La señal anti-SEMP1 se
detectó usando protocolos estándar de quimioluminiscencia (Roche
Molecular Biochemicals).
Las células MDA-MB 435 se
cultivaron sobre portaobjetos recubiertos de
poli-L-Lisina (Sigma) en medio
estándar de densidades diferentes. Las células se lavaron con PBS y
se fijaron posteriormente con paraformaldehído/PBS al 1% durante
una hora a temperatura ambiente. La permeabilización y el bloqueo se
realizaron con una incubación de una hora en Tween20 0,05% /
Albúmina 10% (Roche Diagnostics GmbH, DE)/ PBS. Después se realizó
una tinción por inmunofluorescencia indirecta con
anti-SEMP1 seguida de
anti-F(ab)_{2} de ratón marcado con
Alexa488 (Molecular Probes). La imagen de fluorescencia se
registró.
El retrovirus con la SEMP1 se generó utilizando
un vector que contenía el marcador de superficie celular
1-NGFR como molécula indicadora (Machl, A.W., et
al, Cytometry 29 (1997) 371-374). En breve, el
promotor 5'LTR dirige la expresión de la proteína marcadora
1-NGFR. El promotor SV40 ubicado en dirección 3' fue
sustituido por un promotor de CMV, que dirige la expresión de
SEMP1. Se clonó SEMP1 como ORF con la introducción de una secuencia
Kozak ideal (Kozak, M., Nucleic Acids Res. 15 (1987)
8125-8148). Para generar retrovirus infecciosos, el
plásmido retroviral SEMP1/1-NGFR se transfectó con
lipofectamina (Gibco) en la línea celular HSR BM01 anfotrófica
productora de retrovirus, de acuerdo con el manual del fabricante.
Los clones celulares de HSR BM01 productores de un título elevado
de retrovirus se generaron mediante separación celular por FACS y
posterior medición de las tasas de transducción efectiva de los
sobrenadantes de los clones celulares de HSR BM01
acondicionados.
Esta línea celular puede utilizarse para probar
la especificidad y localización correcta de la proteína SEMP1, por
ejemplo, en células de carcinoma de mama relevantes desde el punto
de vista oncológico.
La especificidad de diferentes anticuerpos
monoclonales hacia SEMP1 se ha confirmado mediante análisis de
inmunotransferencia. En la Fig. 2 se muestra un resultado típico
(flecha, clon 38 SEMP1). Sólo las células SEMP1 positivas como las
SAEC (siglas en inglés de células epiteliales pequeñas de las vías
aéreas) y CACO-2 muestran una señal en el PM
esperado de 23 kDa aproximadamente. Como cabía esperar, la línea
celular hematopoyética K562 es negativa para SEMP1. Además, las
líneas celulares MDAMB435 de cáncer de mama SEMP1 negativas no
presentan una banda de proteína SEMP1, mientras que su equivalente
retroviral transducido MDAMB435xSemp1 presenta una banda intensa de
SEMP1. Junto al clon c38 de hibridoma SEMP1, se obtuvieron una
variedad de diferentes hibridomas SEMP1 que producen anticuerpos
monoclonales contra diferentes epítopos intra y extracelulares de
SEMP1.
La Fig. 3 muestra la especificidad biológica de
unión de los anticuerpos contra SEMP1. El polipéptido SEMP1 como
proteína 4-transmembrana se encuentra sólo en las
zonas de contacto intercelular (flecha, clon c38 SEMP1).
Para el cribado subsiguiente de los epítopos de
los anticuerpos contra SEMP1 se realizó una técnica ELISA:
- recubrimiento de 96 pocillos con SEMP1
etiquetado con histidina.
- bloqueo de los pocillos con albúmina bobina al
1%
- lavado (dos veces con PBS/Tween 20 0,05%)
- incubación con los sobrenadantes de hibridoma
que contienen actividad anti-SEMP1, control positivo
anti-his-anticuerpo
-lavado
-incubación con anticuerpo secundario conjugado
con peroxidasa
-lavado
-incubación con sustrato de peroxidasa (ABTS®
Solution)
Para la identificación de epítopos de los 66
anticuerpos diferentes se estableció un ELISA para péptidos
complementarios. Con esta finalidad se sintetizaron 44 péptidos de
las áreas hidrófilas de SEMP1 y se incubaron en reacciones simples
durante la incubación de los sobrenadantes que contenían
anti-SEMP1. El uso de cantidades elevadas del
péptido reduce la unión de los anticuerpos
anti-SEMP1 con los epítopos que le corresponden de
la SEMP1 etiquetada con histidina. La reducción de la señal
cromogénica se determinó cuantitativamente en comparación con los
sobrenadantes que no competían.
Los péptidos de fusión
(QWRIYSAGD)-KLH (Péptido de ID. de SEC. Núm.: 1
acoplada a hemocianina de Megathura crenulata) y
KLH-(MKCMKCLEDDEMQKM) (Péptido de ID. de SEC. Núm.: 2 acoplada a
hemocianina de Megathura crenulata) en adyuvante de Freund
se inyectaron en dos conejos Se administró, en tres zonas
subcutáneas dorsales, un total de 0,1 mg de péptido por vacunación.
Las inyecciones se administraron a las 0, 2, 6 y 8 semanas. El
suero presentó un título elevado de anticuerpos utilizando los
péptidos en una técnica de transferencia dot blot, pero no
funcionó con extractos celulares o en análisis mediante FACS. Por lo
tanto, no se generan anticuerpos que se unan a la SEMP1.
- Clon 3 de AcM biotinado 1,25 \mug/ml
(preparación de acuerdo con Peters, J.H., et al.,
"Monoklonale Antikörper", Springer Verlag, Berlín, 1985, pp.
209-212)
- Tampón citrato 10 mmol/l
- Tampón fosfato 47 mmol/l, pH 6,3
- conjugado de peroxidasa y clon 5 de anticuerpo
monoclonal, 50 mU/ml (preparado de acuerdo con Wilson, M.B. y
Nakane, P.K., 1978, en Immunofluorescence and Related Staining
Techniques, W. Knapp, K. Kolubar, G. Wick eds., pp.
215-224, Elsevier/North Holland, Amsterdam; la
actividad mencionada se refiere a la peroxidasa)
- Tampón fosfato citrato 100 mmol/l, pH 4,4
- Perborato de sodio 3,2 mmol/l
- ABTS® 1,9 mmol/l
(2,2'-azino-di-[3-etil-benzotiazolina
sulfonato(6)]
Los sueros sanguíneos humanos a los que se les
había añadido la SEMP1 producida mediante recombinación en una
concentración de 3, 5, 10 y 25 ng/ml, respectivamente, se utilizaron
como muestras.
La reacción se lleva a cabo utilizando tubos
pequeños de poliestireno recubiertos con estreptavidina (la
preparación de acuerdo con la patente europea EP-A
0 269 092).
Se incuban muestras de 0,2 ml en un tubo pequeño
con 1 ml de reactivo 1 durante 60 minutos a 20-25ºC,
a continuación se procede a la succión y lavado dos veces con agua
corriente. Posteriormente, se añade el reactivo 2, se incuba
durante 30 minutos a 20-25ºC y la absorbancia se
determina en el fotómetro a 420 nm. De esta manera, se obtiene una
curva estándar que permite que se analicen las determinaciones de
las concentraciones de SEMP1 en las muestras.
Para detectar la proteína SEMP1 en secciones
histológicas, se analizaron secciones en parafina de tejido normal
y tejido mamario canceroso. La Fig. 5 muestra una sección con una
tinción de anticuerpo anti-SEMP1 (Figs. 5 A y B) y
con un anticuerpo que no se une (C, D) como control. El anticuerpo
anti-SEMP1 de acuerdo a la invención se une
específicamente sólo a las células epiteliales de diferentes
glándulas, mientras que el tejido del estroma mesenquimal
circundante no se tiñe. La figura muestra claramente que es una
tinción localizada en la membrana en la que todas las células
epiteliales se tiñen. En esta figura no se muestra que en las
secciones de la glándula mamaria, a parte de las estructuras
lobulares (células epiteliales), pueden teñirse también estructuras
ductales (células endoteliales) con los anticuerpos de acuerdo con
la invención.
Por el contrario, la expresión de SEMP1 en
tejido tumoral es significativamente inferior que en el tejido
normal. Este hecho se muestra en las Figs. 6 y 7. Mientras que en
tejido normal de la mama o el colon SEMP1 se encuentra
especialmente en la membrana de las células epiteliales, en el
tejido tumoral se observó una tinción en la membrana y el
citoplasma. Sin embargo, la tinción en el tejido tumoral era
considerablemente inferior a la del tejido normal.
La Fig. 7 muestra una comparación entre una
sección de tejido mamario normal con ocho secciones de tejido
mamario tumoral. La Fig. 7 muestra que la tinción se observa
especialmente en estructuras lobulares. En todos los casos, la
tinción se encuentra en la membrana. En ninguna de las secciones de
tejido mamario tumoral se detectó una tinción localizada en la
membrana como se observó en el tejido mamario normal. La tinción en
el tejido mamario tumoral es siempre una tinción citosólica poco
intensa y uniforme.
Estos experimentos demuestran que los
anticuerpos anti-SEMP1 de acuerdo con la invención
pueden usarse efectivamente para el diagnóstico del estado de unión
estrecha entre las células y por lo tanto son un marcador valioso
de la oncogenia y/o la progresión tumoral.
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<170> PatentIn Ver. 2.1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
péptido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gln Trp Arg Ile Tyr Ser Ala Gly Asp}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
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<212> PRT
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
péptido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Met Lys Cys Met Lys Cys Leu Glu Asp Asp Glu
Met Gln Lys Met}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 3443
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (221)..(853)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 211
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
Claims (10)
1. El anticuerpo que se une al antígeno de SEMP1
y que se caracteriza porque dicho anticuerpo se une a SEMP1
con un epítopo detectable solapado al anticuerpo seleccionado del
grupo formado por los anticuerpos DSM ACC2458, DSM ACC2459, DSM
ACC2461 y DSM ACC2463.
2. Anticuerpo obtenido de una línea celular
seleccionada del grupo formado por las líneas celulares DSM ACC2458,
DSM ACC2459, DSM ACC2460, DSM ACC2461, DSM ACC2462 y DSM
ACC2463.
3. El anticuerpo de acuerdo con las
reivindicaciones 1 o 2, en las que el anticuerpo es un fragmento
Fab, Fab',
F(ab)'_{2}.
F(ab)'_{2}.
4. Las líneas celulares DSM ACC2458, DSM
ACC2459, DSM ACC2460, DSM ACC2461, DSM ACC2462 y DSM ACC2463.
5. Un proceso para la producción de un
anticuerpo que se una a SEMP1 con un epítopo detectable solapado al
anticuerpo seleccionado del grupo formado por los anticuerpos DSM
ACC2458, DSM ACC2459, DSM ACC2461 y DSM ACC2463, se
caracteriza porque una especie de mamífero no humano se
vacuna con un ácido nucleico de SEMP1 y posteriormente con un
polipéptido SEMP1 y dicho anticuerpo se aísla de células o líquidos
corporales de dicha especie.
6. Un proceso de acuerdo con la reivindicación
5, en el que dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal y dicho
proceso además se caracteriza porque los linfocitos B
productores de anticuerpos anti-SEMP1 se aíslan y
fusionan con líneas celulares de mieloma, las líneas celulares
fusionadas se aíslan y se determina la actividad del anticuerpo
contra SEMP1, las células que producen anticuerpos que se unen a
SEMP1 se aíslan y se produce dicho anticuerpo monoclonal a partir
de esta línea celular y se aísla.
7. El uso de un anticuerpo de acuerdo con las
reivindicaciones 1 a 3 para la producción de un agente
terapéutico.
8. Una composición farmacéutica que contiene un
anticuerpo de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 3 en una
cantidad que oscila entre 0,1 y 500 mg/ml a un pH entre 5,0 y
7,0.
9. Una composición farmacéutica que contiene un
anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 8 en una cantidad que
oscila entre 0,1 y 250 mg/ml a un pH entre 5,0 y 7,0.
10. Un método para la producción de una
composición farmacéutica que contiene un anticuerpo de acuerdo con
las reivindicaciones 1 a 3, en el que una solución acuosa de dicho
anticuerpo se combina con una solución tampón acuosa de manera que
la concentración del anticuerpo en la composición farmacéutica
oscila entre 0,1 y 500 mg/ml y el valor de pH se encuentra entre
5,0 y 7,0.
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