DE69819911T2

DE69819911T2 - 88kda tumorgener wachstumsfaktor und antagonisten

Info

Publication number: DE69819911T2
Application number: DE69819911T
Authority: DE
Inventors: Ginette Serrero
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1997-05-23
Filing date: 1998-05-22
Publication date: 2004-09-02
Anticipated expiration: 2018-05-23
Also published as: US6309826B1; US6670183B2; EP1011723A1; EP1011723A4; AU7797898A; EP1356824A3; DK1011723T3; CA2290602A1; PT1011723E; EP1011723B1; US20040131618A1; EP1356824A2; CA2290602C; ES2213906T3; WO1998052607A1; ATE254476T1; US7592318B2; US20020061859A1; DE69819911D1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Diese Erfindung bezieht sich auf Zellbiologie, Physiologie und Medizin und betrifft einen Wachstumsfaktor in Form eines 88 kDa Glykoproteins („GP88") sowie Zusammensetzungen und Verfahren, die Auswirkungen auf die Expression und die biologische Aktivität von GP88 haben. Diese Zusammensetzungen und Methoden sind zur Diagnose und Behandlung von Krankheiten, unter anderem Krebs, nutzbar.
LITERATURVERZEICHNIS
Auf mehrere Veröffentlichungen wird hier mit arabischen Ziffern, welche in Klammer gesetzt sind, Bezug genommen. Vollständige Angaben der Fundstellen finden sich am Ende der Beschreibung unmittelbar vor den Ansprüchen.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Vermehrung und Differenzierung von Zellen in vielzelligen Organismen unterliegen einem in hohem Maße regulierten Prozess (1). Ein Unterscheidungsmerkmal für Krebszellen ist die fehlende Kontrolle über diesen Prozess; Vermehrung und Differenzierung werden nicht mehr reguliert, wodurch ein unkontrolliertes Wachstum entsteht. In der Forschung wurden bisher erhebliche Anstrengungen unternommen, um diesen Unterschied zwischen normalen Zellen und Tumorzellen besser zu verstehen. Ein Gebiet, auf das sich die Forschung konzentriert, sind Wachstumsfaktoren, genauer gesagt autokrine Wachstumsstimulation.
Wachstumsfaktoren sind Polypeptide, die Botschaften betreffend Wachstum, Differenzierung, Migration und Genexpression zu den Zellen transportieren (2). Normalerweise werden Wachstumsfaktoren in einer Zelle produziert und wirken auf eine andere Zelle, um die Vermehrung anzuregen. Allerdings zeigt sich bei bestimmten bösartigen Zellen in Kultur, dass sie sich mehr oder ausschließlich auf einen autokrinen Wachstumsmechanismus verlassen (3). Bösartige Zellen, die dieses autokrine Verhalten aufweisen, umgehen die Regulation der Produktion von Wachstumsfaktoren durch andere Zellen und sind daher in ihrem Wachstum unreguliert.
Eine Untersuchung der autokrinen Wachstumskontrolle fördert das Verständnis für die Mechanismen des Zellwachstums und führt zu wichtigen Fortschritten in der Diagnose und Behandlung von Krebs. Zu diesem Zweck wurde eine Reihe von Wachstumsfaktoren untersucht, darunter die insulinähnlichen Wachstumsfaktoren (IGF1 und IGF2, das „gastrin-releasing peptide" (GRP), die „transforming growth factors", alpha und beta (TGF-a und TGF-b) und der epidermale Wachstumsfaktor (EGF).
Die vorliegende Erfindung betrifft einen vor Kurzem entdeckten Wachstumsfaktor. Dieser Wachstumsfaktor wurde zuerst im Nährmedium hoch tumorgener „PC"-Zellen gefunden, einer insulinunabhängigen Variante, welche aus der aus Teratomen abgeleiteten adipogenen Zelllinie 1246 isoliert worden war. Dieser Wachstumsfaktor wird vorliegend „GP88" genannt. GP88 wurde aufgereinigt und strukturell charakterisiert (4). Die Sequenzierung der Aminosäuren von GP88 lässt darauf schließen, dass die Aminosäuresequenz von GP88 dem murinen Granulin-/Epithelin-Vorläufer ähnlich ist.
Granuline/Epitheline („grn/epi") sind 6 kDa-Polypeptide, die zu einer neuartigen Familie doppelter cysteinreicher Polypeptide (5, 6) gehören. US-Patent Nr. 5,416,192 (Shoyab et al.) zielt auf 6 kDa-Epitheline ab, insbesondere auf Epithelin 1 und Epithelin 2. Nach Shoyab sind beide Epitheline in einem gemeinsamen 63,5 kDa Vorläufer codiert, der in kleinere Formen umgewandelt wird, sobald er synthetisiert wird, so dass die einzigen natürlichen Produkte, die in biologischen Proben gefunden werden, die 6 kDa-Formen sind. Shoyab et al. führen aus, dass der Epithelin-Vorläufer biologisch inaktiv ist.
Im Gegensatz zu den Ausführungen von Shoyab et al. wurde im Labor des Erfinders gezeigt, dass der Vorläufer nicht immer umgewandelt wird, sobald er synthetisiert wird. Untersuchungen, die teilweise vom Erfinder durchgeführt wur den, haben gezeigt, dass der Vorläufer (d. h. GP88) tatsächlich in Form eines 88 kDA-Glykoproteins mit einem N-gekoppelten Kohlenhydratanteil von 20 kDa abgeschieden wird (4). Eine Analyse der N-terminalen Sequenz von GP88 lässt darauf schließen, dass GP88 bei Aminosäure 17 des grn/epi-Vorläufers beginnt, was zeigt, dass die ersten 17 Aminosäuren der aus der Vorläufer-cDNA abgeleiteten Proteinsequenz einem Signalpeptid, das sich für eine Lokalisierung an der Membran oder die Sekretien eignet, entsprechen (4).
Ebenfalls im Gegensatz zu den Ausführungen von Shoyab et al. ist GP88 biologisch aktiv und weist eine wachstumsfördernde Aktivität auf, insbesondere als ein autokriner Wachstumsfaktor für die produzierenden Zellen.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Der Erfinder hat nun überraschenderweise entdeckt, dass ein Glykoprotein (GP88), das in normalen Zellen in einer streng regulierten Weise exprimiert wird, in aus normalen Zellen abgeleiteten hoch tumorgenen Zellen übermäßig und unreguliert exprimiert wird, dass GP88 als zwingend erforderlicher Wachstumsstimulator für die tumorgenen Zellen wirkt und dass eine Hemmung der Expression oder der Wirkung von GP88 in den tumorgenen Zellen zu einer Hemmung der tumorgenen Eigenschaften der übermäßig produzierenden Zellen führt.
Ein Gegenstand dieser Erfindung ist es, GP88 antagonisierende Zusammensetzungen zu liefern, die in der Lage sind, die Expression oder die Aktivität von GP88 zu hemmen.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist es, Verfahren für die Behandlung von Krankheiten, die mit einem Defekt in der Menge oder Aktivität von GP88 zusammenhängen, zum Beispiel, aber nicht nur, Krebs bei Säugetieren, bereitzustellen.
Ein anderer Gegenstand der Erfindung ist es, Verfahren für die Bestimmung der Anfälligkeit von Probanden für Krankheiten, die mit einem Defekt in der Expression oder der Wirkung von GP88 einhergehen, bereitzustellen.
Noch ein anderer Gegenstand der Erfindung ist es, Verfahren für die Messung des Ansprechens auf eine GP88 antagonisierende Therapie bereitzustellen.
Noch ein anderer Gegenstand der Erfindung ist es, Methoden, Reagenzien und Kits für den in vitro- und in vivo-Nachweis von GP88 und tumorgener Aktivität in Zellen zu liefern.
Weitere Gegenstände und Vorteile der Erfindung werden zum Teil in der nun folgenden Beschreibung dargelegt, zum Teil werden sie aus der Beschreibung offenkundig oder ergeben sich aus der praktischen Durchführung der Erfindung.
Um die Ziele zu erreichen und in Übereinstimmung mit dem Zweck der Erfindung, wie er in dieser Anmeldung enthalten und ordnungsgemäß beschrieben wird, stellt die vorliegende Erfindung auch Zusammensetzungen für die Diagnose und Behandlung von Krankheiten, bei denen die Zellen eine veränderte Expression von GP88 oder eine veränderte Reaktion auf GP88 aufweisen, zum Beispiel, aber nicht nur, Krebs, bereit.
Eine Verwendung des Ausdrucks „veränderte Expression" in dieser Anmeldung bezeichnet eine erhöhte Expression oder übermäßige Expression von GP88 um einen Faktor von mindestens zwei, in einigen Fällen um einen Faktor von 10 oder mehr, auf der Grundlage des Gehalts an mRNA oder Protein und im Vergleich zu entsprechenden normalen Zellen oder umgebenden peripheren Zellen. Der Ausdruck „veränderte Expression" bezeichnet auch eine Expression, die unreguliert oder konstitutiv wurde, ohne notwendigerweise erhöht zu sein. Die Verwendung der Ausdrücke erhöhte oder veränderte „Reaktion" auf GP88 bezeichnet einen Zustand, bei dem eine Erhöhung einer beliebigen der durch GP88 vermittelten biologischen Funktionen (z. B. Wachstum, Differenzierung, Infektiosität von Viren) zu dem gleichen oder einem gleichartigen Zustand wie eine veränderte Expression von GP88 führt.
Die Verwendung des Ausdrucks „GP88" in dieser Beschreibung bezeichnet Epithelin/Granulin-Vorläufer in Zellextrakten und extrazellulären Flüssigkeiten und soll nicht nur GP88 gemäß den in 8 oder 9 aufgeführten Aminosäuresequenzen umfassen, welche von Mäusen und Menschen stammen, sondern auch GP88 anderer Arten. Außerdem umfasst der Ausdruck auch Funktionsderivate, die zusätzliche Bausteine aufweisen, beispielsweise einen Kohlenhydratanteil einschließlich eines Glykoproteins oder andere modifizierte Strukturen.
Mit dem Ausdruck GP88 ist auch jedes Polypeptidfragment gemeint, das mindestens 10 Aminosäuren aufweist, die in den oben genannten Sequenzen vorhanden sind. Sequenzen dieser Länge sind als Antigene sowie zur Herstellung immunogener Konjugate mit Trägern für die Produktion von Antikörpern nützlich, die für verschiedenerlei Epitope des gesamten Proteins, spezifisch sind. Derartige Polypeptide sind nützlich für das Screening solcher Antikörper und bei Verfahren zum Nachweis von GP88 in biologischen Flüssigkeiten. Es ist wohl bekannt, dass Peptide bei der Erzeugung von Antikörpern für größere Proteine nützlich sind (7). In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird gezeigt, dass Peptide mit einer Länge von 12–19 Aminosäuren erfolgreich für die Entwicklung von Antikörpern eingesetzt wurden, die GP88 in voller Länge erkennen.
Die Polypeptide dieser Erfindung können kovalent oder nicht kovalent an ein anderes Molekül gebunden vorkommen. Sie können beispielsweise über ein oder mehrere Peptidbindungen wie Glutathiontransferase, Polyhistidin oder Myc-Tag mit einen oder mehreren anderen Polypeptiden verschmolzen sein.
Das Polypeptid ist groß genug, um eine unterscheidbare antigene Determinante bzw. Epitop zu enthalten, um als Immunogen zum Reproduzieren oder Testen von Antikörpern gegen GP88 oder gegen funktionelle Derivate davon eingesetzt werden zu können.
Eine Ausführungsform umfasst die Polypeptide, die im Wesentlichen frei von anderen Säugetierpeptiden sind. GP88 der vorliegenden Erfindung kann biochemisch oder immunochemisch aus Zellen, Gewebe oder einer biologischen Flüssigkeit aufgereinigt werden. Alternativ davon kann das Polypeptid rekombinant in einem prokaryotischen oder eukaryotischen Expressionssystem und Wirtszellen hergestellt werden.
„Im Wesentlichen frei von anderen Säugetierpolypeptiden" bezeichnet den Umstand, dass das Polypeptid wahlfrei in einem prokaryotischen oder in einem eukaryotischen Organismus, bei dem es sich um ein Säugetier handeln kann oder auch nicht, synthetisiert werden kann. Alternativ davon sind bekannte Verfahren zur Synthese von Polypeptiden mit gewünschten Sequenzen durch chemische Synthese auf Festphasenträger mit anschließender Trennung vom Trägermedium verfügbar. Als Alternative kann das Protein aus Geweben oder Flüssigkeiten von Säugetieren aufgereinigt werden, in denen es natürlich vorkommt, so dass es zu wenigstens 90% (bezogen auf das Gewicht) oder sogar, falls erwünscht, zu 99% rein ist von anderen Säugetierpolypeptiden, so dass es als im Wesentlichen frei gilt. Dies lässt sich erreichen, indem man die Gewebsextrakte oder Flüssigkeiten einer Standardprozedur zur Proteinaufreinigung unterzieht, beispielsweise auf Immunabsorptionsmitteln mit gegen das Protein gerichteten Antikörpern. Eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung beschreibt Verfahren für die Aufreinigung von natürlich vorkommendem GP88 und von rekombinantem GP88, das in Baculovirusinfizierten Insektenzellen exprimiert wird. Alternativ kann die Aufreinigung aus diesen Geweben oder Flüssigkeiten auch durch eine Kombination von Standardmethoden erfolgen, beispielsweise, ohne darauf beschränkt zu sein, die in (4) genannten Verfahren.
Alternativ zu einem nativen aufgereinigten oder rekumbinanten Glykoprotein oder Polypeptid ist vorgesehen, dass „GP88" auch funktionelle Derivate davon umfasst. Mit funktionellem Derivat ist ein „Fragment", eine „Variante", ein „Analogon" oder ein „chemisches Derivat" des nachfolgend definierten Proteins oder Glykoproteins gemeint. In einem funktionellen Derivat bleibt mindestens ein Teil der Funktion des GP88 in seiner vollen Länge erhalten, so dass seine Brauchbarkeit gemäß der vorliegenden Erfindung gegeben ist.
Ein „Fragment" des GP88 betrifft eine beliebige Teilmenge des Moleküls, bei der es sich um ein kürzeres Peptid handelt. Es entspricht beispielsweise, ohne darauf beschränkt zu sein, Regionen wie K19T und S14R von murinem GP88, und E19V und A14R (äquivalent zu murinem K19T bzw. S14R) von menschlichem GP88.
Eine „Variante" des GP88 betrifft ein Molekül, das im Wesentlichen ähnlich entweder zu dem gesamten Peptid oder zu einem Fragment des Peptids ist.
Peptidvarianten können durch direkte chemische Synthese der Peptidvariante mit Hilfe von Verfahren aus dem Stand der Technik präpariert werden.
Alternativ können Varianten der Aminosäuresequenz des Peptids durch Modifizierung der DNA, die das synthetisierte Protein oder Peptid codiert, bereitgestellt werden. Diese Varianten schließen beispielsweise Deletionen, Insertionen oder Substitutionen von Resten innerhalb der Aminosäuresequenz von GP88 ein. Deletion, Insertion und Substitution können auch beliebig kombiniert werden, um das Endkonstrukt zu erhalten, sofern das Endprodukt über die gewünschte Aktivität verfügt. Die Mutation, die an der DNA, die die Peptidvariante codiert, vorgenommen wird darf das Leseraster nicht verändern und sollte vorzugsweise keine komplementären Regionen schaffen, die die Bildung sekundärer Strukturen der mRNA bedingen könnten. Auf genetischer Ebene geschieht die Bereitstellung dieser Varianten durch punktgenaue Mutagenese (8) von Nukleotiden in der das Peptidmolekül codierenden DNA, wodurch eine die Variante codierende DNA hergestellt wird, und anschließend die DNA in einer rekombinanten Zellkultur exprimiert wird. Eine repräsentative Variante weist die gleiche qualitative biologische Aktivität auf, wie das nicht veränderte Peptid.
Ein „Analogon" zum GP88-Protein bezeichnet ein nicht natürliches Molekül, das entweder dem gesamten Molekül oder einem Fragment des Moleküls im Wesentlichen ähnlich ist.
Ein „chemisches Derivat" enthält zusätzliche Anteile an chemischen Gruppen, die normalerweise nicht Teil des Peptids oder Proteins sind. Kovalente Modifizierungen des Peptids fallen ebenfalls unter diese Erfindung. Solche Modifizierungen können an dem Molekül vorgenommen werden, indem bestimmte Aminosäurereste des Peptids gezielt mit einem organischen derivatisierenden Agens, das mit ausgewählten Seitenketten oder terminalen Aminosäureresten reagieren kann, umgesetzt werden. Die Reste, die im Allgemeinen am häufigsten derivatisiert werden, sind Cysteinyl, Histidyl, Lysinyl, Arginyl, Tyrosyl, Glutaminyl, Asparaginyl und Reste am Aminoende. Hydroxylierung von Prolin und Lysin, Phosphorylierung der Hydroxylgruppen von Seryl und Threonylresten, Methylierung der alpha-Aminogruppen von Lysin, Histidin und Histidin-Seitenketten, Acetylierung des N-terminalen Amins und Amidierung der C-terminalen Carboxylgruppen sind vorgesehen. Solche derivatisierten Gruppen können die Löslichkeit, Absorption, biologische Halbwertszeit und ähnliches verbessern. Die Gruppen können auch eine unerwünschte Nebenwirkung des Proteins und dergleichen verhindern oder abschwächen. Außerdem ist eine Derivatisierung mit bifunktionellen Agenzien bei der Vernetzung des Peptids mit wasserunlöslichen Trägergerüsten oder mit anderen makromolekularen Trägern hilfreich. Zu den im Allgemeinen eingesetzten Vernetzungsmitteln gehören Glutaraldehyd, N-Hydroxysuccinimidester, homobifunktionelle Imidoester, 1,1-bis(-Diazo-Acetyl)-2-Phenylethan und bifunktionelle Maleimide. Derivatisierende Agenzien wie Methyl-3-[9p-azidophenyl)]dithiopropiomidat erzeugen photoaktivierbare Zwischenprodukte, die in der Lage sind, in Gegenwart von Licht Vernetzungen zu bilden.
Als Alternative können reaktive, wasserunlösliche Matrices wie Kohlenhydrate, die mittels Bromcyan aktiviert wurden, und die reaktiven Substrate, die in den US-Patenten 3,969,287 und 3,691,016 beschrieben werden, zur Proteinimmobilisierung eingesetzt werden.
Die Verwendung des Ausdrucks „antagonisierende Agenzien" von GP88 hierin betrifft beliebige Zusammensetzungen, die die Expression, Produktion oder Sekretion von GP88 hemmen oder blockieren, oder beliebige Zusammensetzungen, die biologische Aktivität von GP88 hemmen oder blockieren. Dies kann auf beliebige Weise erreicht werden, zum Beispiel, ohne darauf beschränkt zu sein:

(A) GP88 antagonisierende Agenzien umfassen jedes Reagenz oder Molekül, das die Expression oder Produktion von GP88 hemmt, einschließlich, jedoch ohne Beschränkung darauf:
(1) „antisense" DNA- oder RNA-Moleküle von GP88, die die Expression von GP88 durch Hemmung der Translation von GP88 hemmen;
(2) Reagenzien (Hormone, Wachstumsfaktoren, „small molecules"), die die Expression von GP88-mRNA und/oder GP88-Protein auf transkriptionaler, translationaler oder post-translationaler Ebene hemmen;
(3) Faktoren, Reagenzien oder Hormone, die die Sekretion von GP88 hemmen;
(B) GP88 antagonisierende Agenzien umfassen auch jedes Reagenz oder Molekül, das die Wirkung oder biologische Aktivität von GP88 hemmt, wie zum Beispiel, ohne darauf beschränkt zu sein:
(1) neutralisierende Antikörper gegen GP88, die das Protein binden und daran hindern, seine biologische Aktivität zu entfalten;
(2) Antikörper gegen den GP88-Rezeptor, die GP88 an der Bindung an seinen Rezeptor und an der Entfaltung seiner biologischen Aktivität hindern;
(3) kompetitive Inhibitoren der Bindung von GP88 an dessen Rezeptoren;
(4) Inhibitoren der Signalübertragungswege des GP88.

Die hier dargestellten spezifischen Beispiele liefern eine Beschreibung bevorzugter Ausführungsformen, insbesondere die Verwendung von neutralisierenden Antikörpern, um eine biologische Wirkung von GP88 und das Wachstum der hoch tumorgenen PC-Zellen zu hemmen; die Verwendung von antisense-GP88-cDNA und antisense-GP88-Oligonukleotiden, um die Expression von GP88 zu hemmen, um so die Hemmung der tumorgenen Eigenschaften der PC-Zellen herbeizuführen; Charakterisierung von GP88-Rezeptoren auf Zelloberflächen verschiedener Zelllinien, einschließlich der Brustgewebeepithelzelllinie C57MG, der Zelllinien 1246 und PC sowie der Lungenepithelzelllinie von Nerzen CCL64.
Bei einer der Ausführungsformen der Erfindung handelt es sich bei den GP88 antagonisierenden Agenzien um antisense-Oligonukleotide zu GP88. Die antisense-Oligonukleotide hemmen vorzugsweise die Expression von GP88 durch Hemmung der Translation des GP88-Proteins.
Alternativ kann eine derartige Zusammensetzung auch Reagenzien, Faktoren oder Hormone enthalten, die die Expression von GP88 durch Regulation der Transkriptionsaktivität des GP88-Gens hemmen. Eine derartige Zusammensetzung kann Reagenzien, Faktoren oder Hormone enthalten, die die post- translationale Modifikation von GP88 und dessen Sekretion hemmen. Eine derartige Zusammensetzung kann Reagenzien enthalten, die als GP88-Antagonisten wirken, die die Aktivität von GP88 blockieren, indem sie die Bindung von GP88 an Rezeptoren der Zelloberfläche kompetitiv hemmen. Alternativ kann eine derartige Zusammensetzung Faktoren und Reagenzien enthalten, die den GP88-Signalübertragungsweg hemmen, sobald GP88 sich an seine Rezeptoren auf erkrankten Zellen gebunden hat.
Alternativ kann die Zusammensetzung Reagenzien enthalten, die die Wirkung von GP88 blockieren, wie ein für GP88 spezifischer Antikörper, der dessen biologische Aktivität neutralisiert, oder ein Antikörper zu dem GP88-Rezeptor, der dessen Aktivität blockiert.
Die Antikörper der Erfindung (neutralisierende und andere) werden vorzugsweise bei der Behandlung von Krebs und anderen Krankheiten in Zellen, die eine erhöhte Expression von GP88 zeigen, eingesetzt. Unter dem Ausdruck „neutralisierend" ist zu verstehen, dass der Antikörper die Fähigkeit besitzt, die normale biologische Aktivität von GP88, einschließlich der Fähigkeit von GP88, bei Versuchstieren und bei Menschen Zellvermehrung zu stimulieren oder Tumorwachstum auszulösen, zu hemmen oder zu blockieren. Eine wirksame Menge eines anti-GP88-Antikörpers wird einem Tier, einschließlich dem Menschen, auf unterschiedlichen Wegen verabreicht. Bei einer alternativen Ausführungsform wird der anti-GP88-Antikörper als Mittel zur Diagnose zum Nachweis von Zellen, die eine veränderte (erhöhte) Expression von GP88 aufweisen, die bei Krankheiten, wie zum Beispiel Krebs, ohne darauf beschränkt zu sein, auftritt, und zur Identifikation von Zellen, deren Wachstum von GP88 abhängt und die auf eine GP88 antagonisierende Therapie ansprechen werden, verwendet. In noch einer weiteren Ausführungsform wird der anti-GP88-Antikörper dazu verwendet, Verbindungen wie zytotoxische Faktoren oder antisense-Oligonukleotide in Zellen, die GP88 exprimieren oder auf GP88 reagieren, einzuschleusen.
Die antisense-Oligonukleotide der Erfindung werden außerdem bei der Behandlung von Krebs in Zellen, die eine erhöhte Expression von GP88 aufweisen, eingesetzt. Eine wirksame Menge des antisense-Oligonukleotids wird einem Tier, einschließlich dem Menschen auf unterschiedlichen Wegen verabreicht.
Die vorliegende Erfindung stellt außerdem ein Verfahren für die Bestimmung der Anfälligkeit für Krankheiten, die mit einem Defekt der Expression oder der Wirkung von GP88 einhergehen, bereit; dieses enthält die Gewinnung einer Probe biologischer Flüssigkeit oder Gewebe und die Messung der Menge an GP88 in der Flüssigkeit oder dem Gewebe oder die Messung der Susceptibilität der Zellen für eine Reaktion auf GP88. Im Falle der Krebskrankheit ist die Menge an GP88 proportional zur Anfälligkeit an Krebs zu erkranken.
Die vorliegende Erfindung stellt außerdem ein Verfahren zur Messung des Schweregrades der Krebserkrankung bereit; dieses beinhaltet die Gewinnung einer Probe biologischer Flüssigkeit oder Gewebe und die Messung der Menge an GP88 in der Flüssigkeits- oder der Gewebeprobe, wobei die Menge an GP88 proportional zum Grad der Schwere der Krebserkrankung ist.
Die vorliegende Erfindung stellt außerdem ein Verfahren zur Messung der Ansprechbarkeit auf eine GP88 antagonisierende Therapie bereit; dieses beinhaltet die Gewinnung einer Probe des erkrankten Gewebes (Biopsie), das Halten der aus der Probe stammenden Zellen in Kultur, die Behandlung der aus dem Kulturmedium stammenden Zellen mit einem neutralisierenden anti-GP88-Antikörper und die Bestimmung, ob der neutralisierende Antikörper das Zellwachstum hemmt. Die Fähigkeit des Antikörpers, das Zellwachstum zu hemmen, ist ein Hinweis darauf, dass die Zellen für ihre Vermehrung von GP88 abhängig sind, und lässt darauf schließen, dass eine GP88 antagonisierende Therapie wirksam sein wird.
Die vorliegende Erfindung stellt außerdem ein Verfahren zur Bestimmung der Anfälligkeit für eine Krebserkrankung, die mit einem abnormen Gehalt oder Aktivität der GP88-Rezeptoren einhergeht; dieses beinhaltet die Gewinnung einer Gewebeprobe und die Messung der Menge an GP88-Rezeptorprotein oder mRNA in dem Gewebe oder die Messung der Tyrosinkinaseaktivität des Rezeptors in dem Gewebe (GP88 löst bei Bindung an seinen Rezeptor eine Tyrosinphosphorylierung von Zellproteinen, einschließlich des Rezeptors für GP88, aus).
Die vorliegende Erfindung stellt außerdem ein Verfahren bereit, womit GP88 antagonisierende Reagenzien gezielt zur erkrankten Stelle geleitet werden können, indem sie an einen anti-GP88-Antikörper oder einen anti-GP88-Rezeptor Antikörper konjugiert werden.
Die beigefügten Figuren sind Bestandteil dieser Schrift, erläutern Ausführungsformen der Erfindung und dienen zusammen mit der Beschreibung zur Erklärung des Grundgedankens der Erfindung.
KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
In 1A wird der Expressionslevel von GP88-Protein in den Zelllinien 1246, 1246-3A und PC verglichen. Als Kulturmedium für die Zellen diente DME-F12 versetzt mit 2% fötalem Rinderserum (FBS). Der GP88-Expressionslevel wurde mittels Immunpräzipitation und Westernblotanalyse mit einem anti-K19T-Antikörper gemessen.
In 1B wird der GP88-mRNA-Expressionslevel in den Zelllinien 1246, 1246-3A und PC verglichen. mRNA für RPL32 wird zur internen Kontrolle der gleichmäßgen RNA-Beladung eingesetzt.
In 1C wird die Expression von GP88-mRNA in 1246-Zellen (linker Teil) und in PC-Zellen (rechter Teil) in serumfreien und serumhaltigen Medien verglichen. Die Ergebnisse zeigen, dass die Expression von GP88 in 1246-Zellen durch die Zugabe von fötalem Rinderserum gehemmt wird, wohingegen eine solche Hemmung bei den hoch tumorgenen PC-Zellen nicht zu beobachten ist.
2 zeigt den Effekt der Behandlung der hoch tumorgenen PC-Zellen mit einem neutralisierenden anti-GP88-Antikörper in steigender Konzentration.
3 zeigt C3H-Mäuse, denen 10⁰ mit antisense-GP88 transfizierte PC-Zellen (unten) und PC-Kontrollzellen, die mit dem leerem Vektor transfiziert wurden, (oben) subkutan injiziert wurden.
4 zeigt den GP88-Expressionslevel in vivo in Tumorgewebe von C3H-Mäusen und in umgebendem normalen Gewebe.
5 zeigt den GP88-mRNA-Expressionslevel bei östrogenrezeptorpositiven und östrogenrezeptornegativen Zelllinien des menschlichen Mammakarzinoms.
6 zeigt den Effekt steigender Konzentrationen von GP88 auf das Wachstum der Brustgewebeepithelzelllinie C57 der Maus.
7 zeigt die Wachstumseigenschaften und die tumorgene Fähigkeit von PC-Zellen, die mit einem durch einen Zytomegalievirus Promotor kontrollierten Expressionsvektor, der GP88 in antisense-Orientierung enthielt, transfiziert wurden, und von PC-Zellen, die mit einem leeren Vektor transfiziert wurden.
8 zeigt die Nukleotid- und abgeleitete Aminosäurensequenz von murinem GP88. Peptidregionen, die als Antigene zur Bildung der anti-GP88-Antikörper K19T und S14R verwendet werden, sind unterstrichen. Die Region, die in antisense-Orientierung in den Säugetier-Expressionsvektor pCMV4 hineinkloniert wurde, ist in Klammern angegeben.
9A zeigt die Nukleotidsequenz menschlicher GP88-cDNA. In Klammern ist die Region angegeben, die in antisense-Orientierung in das Säugetier-Expressionssystem pcDNA3 hineinkloniert wurde; und
9B zeigt die abgeleitete Aminosäurensequenz von menschlichem GP88. Die Region E19V, die als Antigen zur Entwicklung des neutralisierenden antihuman-GP88-Antikörpers verwendet wird, ist unterstrichen. Sie zeigt außerdem die Region A14R, die der Region S14R bei der Maus entspricht.
10 zeigt die Aminosäuresequenz des murinen GP88 die so angeordnet ist, dass sie die siebeneinhalb Wiederholungen, die als Granuline g, f, B, A, C, D und e definiert werden (rechte Seite), darstellt. Diese Darstellung zeigt, dass die Regionen K19T und S14R, die verwendet werden, um GP88-Antikörper zur Entwicklung von neutralisierenden anti-GP88-Antikörpern zu bilden, sich zwischen zwei Epithelin/Granulin-Repeats in einer Region, die als variable Region angesehen wird, befinden. Auf der rechten Seite ist die Granulinklassifizierung der Repeats nach Bateman et al. (6) angegeben.
Granulin B und Granulin A werden nach Plowman et al., 1992 (5) ebenfalls als Epithelin 2 bzw. Epithelin 1 definiert.
11 zeigt eine schematische Darstellung von pCMV4 und einem GP88-cDNA-Klon mit Angabe der Restriktionsstellen, die verwendet wurden, um GP88-antisense-cDNA in den Expressionsvektor zu klonieren.
12 zeigt die Vernetzung von ¹²⁵I-rGP88 mit [GP88-]Rezeptoren der Zelloberfläche von CCL-64-Zellen. Die Vernetzungsreaktion wurde mit Disuccinimidylsuberat (DSS) durchgeführt. Die Reaktionsprodukte wurden mittels SDS-PAGE auf einem 7%igen Polyacrylamidgel analysiert.
13 zeigt die Vernetzung von ¹²⁵I-rGP88 mit [GP88-]Rezeptoren der Zelloberfläche von 3T3-Fibroblasten, PC-Zellen und C57MG-Brustgewebeepithelzellen. Die Ergebnisse zeigen, dass diese verschiedenen Zelllinien Zelloberflächenrezeptoren für GP88 mit einem ähnlichen Molekulargewicht wie diejenigen auf CCL64-Zellen (12) aufweisen.
14 zeigt den GP88-Expressionslevel in nicht-tumorgenen MCF 10A und in malignen (MCF 7, MDA-468) menschlichen Brustgewebeepithelzellen.
15 zeigt, dass die GP88-Expression durch eine Transfektion von antisense-GP88-cDNA in menschliche MDA-468-Brustkarzinomzellen gehemmt wird.
BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Nunmehr werden die derzeit bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung im Detail erläutert, die, zusammen mit den folgenden Beispielen, zur Erklärung des Grundgedankens der Erfindung dienen.
Biologische Aktivität von GP88
Die Erfindung betrifft GP88 sowie Antitumor- und Antivirus-Zusammensetzungen, die zur Behandlung und Diagnose von Krankheiten dienlich sind, die mit einer veränderten (erhöhten) Expression von GP88 verbunden sind. Alternativ wird diese Erfindung zur Behandlung und Diagnose von Krankheiten eingesetzt, die mit einer erhöhten Reaktionsbereitschaft auf GP88 verbunden sind. Mit Hilfe eines aus drei Zelllinien bestehenden murinen Modellsystems hat der Erfinder gezeigt, dass Zellen, die GP88 überexprimieren, Tumore bilden. Bei der Elternzelllinie, 1246, handelt es sich um eine adipogene Zelllinie der C3H-Maus, die sich in einem definierten Medium unter strenger Insulin-Regulation vermehrt und in Adipocyten differenziert (9, 10). Die 1246-Zellen können in einem syngenen Tier (C3H-Maus) keine Tumore bilden, selbst wenn sie mit hoher Zelldichte injiziert werden. Eine Insulin unabhängige Zelllinie, 1246-3A, wurde aus 1246-Zellen isoliert, die in einem insulinfreien Medium vorlagen (11). Die 1246-3A-Zellen verloren die Fähigkeit zur Differenzierung und Tumorbildung, wenn syngenen Mäusen 10⁶ subkutan injiziert wurden. Eine hoch tumorgene Zelllinie, PC, wurde mit Hilfe einer in vitro-/in vivo-Shuttletechnik aus 1246-3A-Zellen entwickelt. Die PC-Zellen bildeten Tumore, wenn syngenen Mäusen 10⁴ Zellen injiziert wurden (12).
GP88 wird in den Insulin unabhängigen, tumorgenen Zelllinien im Vergleich zu der nicht tumorgenen, Insulin abhängigen Elternzelllinie überexprimiert. Darüber hinaus korreliert der Grad der Überexpression von GP88 positiv mit dem Grad der Tumorgenität dieser Zellen, womit zum ersten Mal nachgewiesen wird, dass GP88 bei der Tumorgenese wichtig ist (1). Unter Verweis auf 1 ist zu sagen, dass der GP88-Gehalt in Zelllysaten und im Kulturmedium (CM) bestimmt wurde, da GP88 von Zellen synthetisiert, aber auch im Kulturmedium abgesondert wird. Alle Zellen wurden in einem DME/F12 Nährmedium, versetzt mit 2% fötalem Rinderserum, kultiviert. Als die Zellen konfluent wurden, wurde das Kulturmedium (CM) entnommen und durch Inkubation in einem Detergens haltigen Puffer Zelllysate hergestellt. Anschließend wurde mit 10.000 × gr. zentrifugiert. Zelllysat und konditioniertes Medium wurden entsprechend der Zellenzahl normalisiert. Proben des Zelllysats und des konditionierten Mediums wurden mittels Westernblotanalyse unter Verwendung eines anti-GP88-Antikörpers analysiert, wie weiter unten erläutert wird.
Die Entwicklung eines neutralisierenden Antikörpers bestätigte die Schlüsselrolle von GP88 bei der Tumorgenese. Wenn dem Kulturmedium ein anti-GP88-Antikörper gegen die Region K19T von murinem GP88 hinzugefügt wurde, wurde das Wachstum hoch tumorgener PC-Zellen dosisabhängig gehemmt (2). Zu 2 wurden PC-Zellen in 96-Well-Platten in einer Dichte von 2 × 10⁴ Zellen/Well in DME/F12-Medium kultiviert, dem menschliches Fibronektin (2 μg/ml) und menschliches Transferrin (10 μg/ml) zugesetzt worden war. Nach Anlagerung der Zellen wurden anti-GP88-IgG-Fraktionen in steigender Konzentration in die Wells gegeben. Kontrollzellen wurden mit gleichen Konzentrationen von nicht immunem IgG behandelt. Zwei Tage danach wurde in jedes Well für 6 Stunden 0,25 mCi ³H-Thymidin gegeben. Die Zellen wurden dann geerntet, um das in die DNA aufgenommene ³H-Thymidin als ein Maß für die Zellvermehrung zu zählen.
Wenn die Expression von GP88 speziell durch antisense-GP88-cDNA in PC-Zellen gehemmt war, war die Produktion von GP88 reduziert und diese PC-Zellen konnten in syngenen C3H-Mäusen keine Tumore mehr bilden. Außerdem gewannen diese PC-Zellen ihre Reaktionsfähigkeit auf Insulin zurück. Zu 3 und Tabelle 1 und 2 wurden weiblichen C3H-Mäusen 10⁶ PC-Zellen, die mit antisense-GP88 transfiziert waren (wie weiter unten beschrieben wird), oder 10⁶ PC-Zellen, die mit dem leeren Vektor transfiziert waren, subkutan injiziert. Die Mäuse wurden täglich auf das Auftreten von Tumoren hin untersucht. Fotos wurden 45 Tage nach Injektion der Zellen aufgenommen. Die Ergebnisse zeigen, dass die Mäuse, denen PC-Zellen mit antisense-GP88 injiziert worden waren, im Gegensatz zu den als Kontrolle verwendeten Mäusen, denen mit dem leeren Vektor transfizierte PC-Zellen injiziert worden waren, keine Tumore entwickeln.
Tabelle 1. VERGLEICH DER TUMORGENEN EIGENSCHAFTEN VON MIT ANTISENSE-GP88 TRANSFIZIERTEN ZELLEN, TRANSFIZIERTEN KONTROLLZELLEN UND PC-ZELLEN

PC:: Nicht transfizierte Kontrollzellen
P-14:: Mit leerem Vektor transfizierte PC-Kontrollzellen
ASGP88:: PC-Zellen, die mit einem Expressionsvektor transfiziert worden sind, der antisense-GP88-cDNA enthielt.

Die Tumore wurden am 45. Tag chirurgisch entfernt und gewogen. --- zeigt an, dass kein Tumor gebildet wurde.
TABELLE 2. VERGLEICH DER EIGENSCHAFTEN VON 1246-ZELLEN, PC-ZELLEN UND GP88-ANTISENSE-ZELLEN
Ein Vergleich der Expression von GP88 deutet darauf hin, dass der GP88-Gehalt in vivo in Tumoren erheblich höher ist als in normalen Geweben ( 4). C3H-Mäusen wurden 10⁶ PC-Zellen injiziert. Mit Tumoren befallene Mäuse wurden getötet. Tumore, Fettpolster und Bindegewebe wurden entnommen. Zelllysate wurden durch Inkubation in einen detergenshaltigen Puffer hergestellt, wie oben für 1 beschrieben ist. Die Proteinkonzentration der Gewebsextrakte wurde bestimmt, und gleich große Mengen an Proteinen je Probe wurden mittels SDS-PAGE, gefolgt von Westernblotanalyse unter Einsatz eines anti-GP88-Antikörpers analysiert, um den GP88-Gehalt in den Gewebsextrakten zu messen. Die Ergebnisse zeigten, dass der GP88-Gehalt in Tumorextrakten mindestens 10 Mal höher ist, als in umgebenden Binde- und Fettgeweben.
In normalen Zellen (1246-Zellen, Fibroblasten) wird die Expression von GP88 insbesondere durch Insulin reguliert und durch fötales Rinderserum gehemmt. In tumorgenen Zellen führt ein Verlust der Regulation normalen Wachstums zu einer erhöhten Expression von GP88 und zum Erwerb einer GP88-Abhängigkeit des Wachstums. Daher ist die Hemmung der Expression und/oder Wirkung von GP88 ein wirksamer Ansatz der Unterdrückung der Tumorgenese. Der Nachweis einer erhöhten Expression von GP88 in Biopsien bietet eine diagnostische Analyse von Tumoren, die auf eine Therapie durch Hemmung von GP88 ansprechen.
GP88 ist auch ein Tumor induzierender Faktor bei Krebserkrankungen des Menschen. Wie in der Zelllinie 1246-3A zu erkennen ist, wurde der Verlust der Reaktionsfähigkeit auf Insulin (oder IGF-I) und eine gleichzeitige Zunahme der Malignität von mehreren Krebsarten beim Menschen, einschließlich Brustkrebs, jedoch ohne darauf beschränkt zu sein, gut dokumentiert (13, 14). Genauer gesagt, geht das Brustkarzinom mit dem Erwerb einer autokrinen Insulin/IGF-I Rückkopplungsschleife einher, die auch den Ausgangspunkt für die Entwicklung tumorgener Eigenschaften in dem oben diskutierten Mausmodellsystem darstellt. Außerdem ist die Expression von GP88 in Brustkarzinomen beim Menschen erhöht. Genauer gesagt war unter Verweis auf 5 die Expression von menschlichem GP88 in östrogenrezeptorpositiven und auch in östrogenrezeptornegativen Insulin/IGF-I-unabhängigen, malignen Zellen hoch. Außerdem ist GP88 ein potenter Wachstumsfaktor für Brustgewebeepithelzellen (6). Die Daten in 5 wurden durch Kultivierung von MCF7-, MDA-MB-453- und MDA-MB-468-Zellen in DME/F12-Medium, dem 10% fötales Rinderserum zugesetzt wurde, ermittelt. Aus jeder Zelllinie wurde mittels der RNAzol-Methode RNA extrahiert und poly-A*-RNA präpariert. Die Expression von GP88-mRNA wurde mittels Northernblotanalyse mit 3 μg Poly-A*-RNA für jede Zelllinie unter Verwendung einer mit ³²P markierten GP88-cDNA-Sonde untersucht.
Für die Northernblotanalyse der Expression von GP88-mRNA in Zellen oder Gewebe von Nagetieren (Mäuse und Ratten) benutzten wir eine murine GP88-cDNA-Sonde mit einer Länge von 311 bp, beginnend bei Nukleotid 551 bis 862 (entsprechend der Aminosäuresequenz 160 bis 270). RNA kann mit verschiedenen Verfahren (Sambrook Molecular Biology manual: 35) extrahiert werden, die Personen mit üblichen Fachkenntnissen gut bekannt sind. Gewählt wurde die Methoden, RNA mit Hilfe von RNAzol-Lösungen (Cinnabiotech) oder Trizol-Lösungen (Gibco-BRL) zu extrahieren, die aus einer Extraktion in einem Schritt mittels Guanidium-Isothiozyanat und Phenol-Chloroform besteht.
Für die Northernblotanalyse der Expression von GP88-mRNA in menschlichen Zelllinien wurde eine menschliche GP88-cDNA-Sonde mit einer Länge von 672 bp entwickelt, entsprechend Nukleotid 1002 bis 1674 (entsprechend der Aminosäuresequenz 334 bis 558) des menschlichen GP88. Eine detaillierte und genaue Beschreibung der bei den bevorzugten Ausführungsformen benutzten Methode der Northernblotanalyse findet sich in Beispiel 8.
Bei 6 wurden C57MG-Zellen in Gegenwart steigender Konzentrationen von GP88, das aus einem mit PC-Zellen konditionierten Medium gereinigt wurde (oben), und rekombinantem GP88, das in Insektenzellen exprimiert wurde (unten), kultiviert, um den wachstumsstimulierenden Effekt steigender Konzentrationen von GP88 auf das Wachstum der murinen Brustgewebeepithelzelllinie C57MG darzustellen.
Der Zusammenhang zwischen der autokrinen Produktion von IGF-1 und der Malignität ist inzwischen auch bei Glioblastomen, Teratokarzinomen und Brustkarzinomen gut etabliert (2, 15, 16, 17). Bei diesen Krebsarten ist die Expression von GP88 in Tumoren des Menschen im Vergleich zu nicht tumorgenen menschlichen Fibroblasten und anderen menschlichen Zelllinien ebenfalls erhöht. GP88 fördert das Wachstum von Mammakarzinomzellen.
Anti-GP88-Antikörper
Die Erfindung stellt Zusammensetzungen zur Behandlung und Diagnose von Krankheiten, die mit einer erhöhten Expression von GP88 in Zusammenhang gebracht werden, bereit. Dies betrifft auch die Behandlung und Diagnose von Krankheiten, die mit einer erhöhten Reaktionsfähigkeit auf GP88 in Zusammenhang gebracht werden. Die Zusammensetzungen dieser Erfindung schließen anti-GP88-Antikörper mit ein, die die biologische Aktivität von GP88 neutralisieren.
Die vorliegende Erfindung richtet sich auch auf einen Antikörper, der spezifisch für ein Epitop von GP88 ist, und die Verwendung eines solchen Antikörpers zum Nachweis des Vorhandenseins des GP88-Moluküls oder zur Messung seiner Menge oder Konzentration eines Funktionsderivates davon oder eines Homologs aus einer anderen Tierart in einer Zelle, einem Zell- oder Gewebsextrakt, einem Kulturmedium oder einer biologischen Flüssigkeit. Darüber hinaus kann der Antikörper dazu verwendet werden, zytotoxische Moleküle zu einer bestimmten Stelle zu dirigieren.
Zur Verwendung als Antigen für die Entwicklung von Antikörpern wird das natürlich produzierte oder in rekombinanter Form exprimierte GP88-Protein oder ein Funktionsderivat, möglichst mit mindestens 9 Aminosäuren, gewonnen und dazu verwendet, ein Tier für die Produktion von polyklonalen oder monoklonalen Antikörpern zu immunisieren. Ein Antikörper gilt als geeignet, ein Molekül zu binden, wenn er geeignet ist, mit dem Molekül zu reagieren, um dadurch das Molekül an den Antikörper zu binden. Die spezifische Reaktion soll anzeigen, dass das Antigen sehr selektiv mit seinem entsprechenden Antikörper reagiert, nicht jedoch mit der Vielzahl sonstiger Antikörper, die durch andere Antigene hervorgerufen worden sein können.
Der hier verwendete Begriff Antikörper umfasst polyklonale menschliche und nicht menschliche Antikörper, monoklonale menschliche und nicht menschliche Antikörper (mAbs), chimäre Antikörper, anti-idiotypische Antikörper (anti-IdAb) und humanisierte Antikörper, er ist jedoch nicht darauf beschränkt. Polyklonale Antikörper sind heterogene Populationen von Antikörpermolekülen, die entweder aus Seren von Tieren, die mit einem Antigen immunisiert wurden, oder aus Hühnereiern stammen. Monoklonale Antikörper („mAbs") sind im Wesentlichen homogene Populationen von Antikörpern gegen bestimmte Antigene. Die mAbs können mit Methoden gewonnen werden, die Fachleuten bekannt sind (18, 19, 20 und U.S.-Patent Nr. 4,376,110). Diese Antikörper können jeder beliebigen immunologischen Klasse angehören, einschließlich IgG, IgM, IgE, IgA, IgD und allen Subklassen dieser Immunglobuline. Die Hybridomazellen produzierenden menschlichen und nicht menschlichen Antikörper gegen GP88 können in vitro oder in vivo kultiviert werden. Zur Herstellung einer großen Menge an monoklonalen Antikörpern (mAbs) werden derzeit in vivo-Verfahren bevorzugt. Kurz gesagt werden Zellen aus den einzelnen Hybridomen intraperitoneal in BALB/c-Mäuse oder Nacktmäuse gespritzt, die mit Pristan vorbehandelt worden sind, um Aszitesflüssigkeit mit einem hohen Gehalt der gewünschten monoklonalen Antikörper zu produzieren. Monoklonale Antikörper können mittels Standardmethoden der Chromatographie, die Fachleuten gut bekannt sind, aus diesen Aszitesflüssigkeiten oder aus Kulturüberständen gewonnen werden.
Menschliche monoklonale Antikörper gegen menschlichen GP88 können hergestellt werden, indem man gentechnisch veränderte Mäuse immunisiert, die menschliche Immunglobulingene exprimieren. Ein Hybridom, das unter Verwendung von Lymphozyten aus diesen transgenen Tieren gebildet wurde, produziert menschliches Immunglobulin an Stelle von murinem Immunglobulin.
Da die meisten monoklonalen Antikörper aus murinen Quellen und anderen nicht menschlichen Quellen stammen, kann ihre klinische Wirksamkeit wegen der Immunogenität von Nagetier-mAbs, die Menschen verabreicht werden, der schwachen Anregung der Effektorfunktion und der schnellen Clearance aus dem Serum begrenzt sein (25). Um diese Probleme zu umgehen, können die antigenbindenden Eigenschaften muriner Antikörper durch ein Humanisierung genanntes Verfahren auf menschliche Antikörper übertragen werden (25). Ein humanisierter Antikörper enthält die Aminosäuresequenzen für die 6 komplementdeterminierenden Regionen (CDRs) des murinen monoklonalen Eltern-Antikörpers, die auf das Gerüst eines menschlichen Antikörpers aufgepfropft werden. Der niedrige Gehalt an nicht menschlichen Sequenzen in humanisierten Antikörpern (etwa 5%) hat sich sowohl für die Reduzierung der Immunogenität als auch für die Verlängerung der Halbwertszeit des Serums im Menschen als wirkungsvoll erwiesen. Methoden zur Humanisierung monoklonaler Antikörper wie das monovalente Phage-Display und die Strategie einer kombinatorischen Bibliothek (26, 27) werden jetzt in weiten Bereichen bei der Humanisierung verschiedener Antikörper eingesetzt und sind Fachleuten bekannt. Diese humanisierten Antikörper und menschlichen Antikörper, die, wie oben beschrieben, mit transgenen Tieren entwickelt wurden, sind bei mehreren Krankheiten einschließlich Krebs, ohne darauf beschränkt zu sein, von großem therapeutischen Nutzen.
Hybridomaüberstände und Hybridomaseren werden mit Hilfe einer beliebigen Zahl von Immunoassays auf das Vorhandensein von Antikörpern, die für GP88 spezifisch sind, hin untersucht. Zu diesen Immunoassays gehören Dot-Blotting und Standard-Immunoassays (EIA oder ELISA), die in der Fachwelt gut bekannt sind. Sobald festgestellt worden ist, dass ein Überstand einen interessanten Antikörper enthält, kann er einer weiteren Untersuchung mittels Westernblotanalyse unterzogen werden, um die Größe desjenigen Antigens zu ermitteln, woran der Antikörper bindet. Eine Person mit üblichen Fachkenntnissen wird ohne unangemessenes Experimentieren wissen, wie derartige Hybridome herzustellen und einem Screening zu unterziehen sind, um einen gewünschten polyklonalen oder monoklonalen Antikörper zu gewinnen.
Chimäre Antikörper besitzen unterschiedliche Anteile, die von unterschiedlichen Tierarten stammen. Ein chimärer Antikörper könnte beispielsweise eine variable Region eines monoklonalen murinen Antikörpers und eine konstante Region eines menschlichen Immunglobulins besitzen. Chimäre Antikörper und Verfahren zu ihrer Herstellung sind Fachleuten ebenfalls bekannt (21–24).
Bei einem anti-idiotypischen Antikörper („anti-IdAb") handelt es sich um einen Antikörper, der einmalige Determinanten erkennt, die im Allgemeinen mit der Antigen-bindenden Stelle eines Antikörpers zusammenhängen. Ein anti-IdAb kann präpariert werden, indem man ein Tier derselben Art und von demselben Gentyp (z. B. Mausrasse) wie die Quelle des monoklonalen Antikörpers mit dem monoklonalen Antikörper immunisiert, für den ein anti-IdAb präpariert wird. Das immunisierte Tier wird die idiotypischen Determinanten des Immunisierungs-Antikörpers erkennen und darauf mit der Produktion von Antikörpern gegen diese idiotypischen Determinanten (anti-IdAb) reagieren. Der anti-IdAb kann auch als Immunogen zur Erzeugung einer Immunreaktion in noch einem weiteren Tier verwendet werden, wobei ein sogenannter anti-anti-IdAb entsteht. Der anti-anti-IdAb kann hinsichtlich seiner Epitope mit dem ursprünglichen monoklonalen Antikörper, der die Bildung des anti-IdAb ausgelöst hat, identisch sein. Somit ist es durch Verwendung von Antikörpern gegen die idiotypischen Determinanten eines monoklonalen Antikörpers möglich, andere Klone zu finden, die Antikörper mit identischer Spezifität exprimieren.
Dementsprechend können monoklonale Antikörper, die gegen GP88 erzeugt worden sind, dafür genutzt werden, die Bildung von menschlichen und nicht menschlichen anti-IdAb in geeigneten Tieren auszulösen. Milzzellen von solchen immunisierten Mäusen werden für die Herstellung von Hybridomen verwendet, die menschliche oder nicht menschliche monoklonale anti-Id-Antikörper abscheiden. Darüber hinaus können die monoklonalen anti-Id-Antikörper an einen Träger wie „keyhole limpet"-Hämocyanin (KLH) oder Albumin aus Rinderserum (BSA) gekoppelt werden und zur Immunisierung weiterer Mäuse verwendet werden. Die Seren dieser Mäuse enthalten menschliche oder nicht menschliche anti-anti-IdAb, die die Bindungseigenschaften des ursprünglichen mAbs, der für ein Polypeptid-Epitop von GP88 spezifisch war, besitzen. Somit verfügen die monoklonalen anti-Id-Antikörper über ihre eigenen idiotypischen Epitope oder über Idiotypen, die in ihrer Struktur dem Epitop, das ausgewertet wird, ähnlich sind.
Der Begriff „Antikörper" soll sowohl intakte Moleküle als auch Molekülfragmente, die sich an das Antigen binden können wie Fab und F(ab')2 miteinbeziehen. Den Fragmenten Fab und F(ab')2 fehlt das Fragment Fc des intakten Antikörpers, sie werden schneller aus dem Kreislauf entfernt und zeigen eventuell geringere unspezifische Gewebebindung als ein intakter Antikörper (28). Derartige Fragmente werden typischerweise durch proteolytische Spaltung mit Hilfe von Enzymen wie Papain (zur Erzeugung von Fab-Fragmenten) und Pepsin (zur Erzeugung von F(ab')2-Fragmenten) gewonnen. Fab und F(ab')2 und andere Fragmente der Antikörper, die in der vorliegenden Erfindung von Nutzen sind, können für den Nachweis und die Quantifizierung von GP88 und für die Behandlung von pathologischen Zuständen, die mit einer Expression von GP88 zusammenhängen, gemäß den Methoden, die vorliegend für intakte Antikörper-Moleküle beschrieben werden, verwendet werden.
Gemäß der vorliegenden Erfindung können Antikörper, die die Aktivität von GP88 in vitro neutralisieren, dazu verwendet werden, die Aktivität von GP88 in vivo bei der Behandlung von Krankheiten zu neutralisieren, die mit einer erhöhten Expression von GP88 oder einer erhöhten Reaktionsbereitschaft auf GP88 einhergehen, wie Krebs und Virusinfektionen, ohne darauf beschränkt zu sein. Ein Patient, vorzugsweise ein menschlicher Patient, der an einer mit einer erhöhten Expression von GP88 einhergehenden Krankheit leidet, wird mit einem Antikörper gegen GP88 behandelt. Eine derartige Behandlung kann in Verbindung mit einer anderen krebsbekämpfenden oder virusbekämpfenden Therapie durchgeführt werden. Ein typisches Vorgehen beinhaltet die Verabreichung einer wirksamen Menge des für GP88 spezifischen Antikörpers über einen Zeitraum von einer Woche oder von mehreren Wochen, eingeschlossen einen Zeitraum zwischen etwa ein und sechs Monaten. Der Antikörper der vorliegenden Erfindung kann auf jede beliebige Weise, die den gewünschten Zweck erfüllt, verabreicht werden. Eine Verabreichung ist beispielsweise auf unterschiedlichsten Wegen möglich, einschließlich subkutan, intravenös, intradermal, intramuskulär, intraperitoneal und oral, jedoch ohne Beschränkung darauf. Eine parenterale Verabreichung kann durch Bolusinjektion oder graduelle Perfusion über einen Zeitraum erfolgen. Zubereitungen für eine parenterale Verabreichung schließen sterile wässerige oder nicht-wässerige Lösungen, Suspensionen und Emulsionen, die im Stand der Technik bekannte Hilfs- oder Trägerstoffe enthalten können, ein. Pharmazeutische Zusammensetzungen wie Tabletten und Kapseln sind ebenfalls nach Routineverfahren herstellbar. Es versteht sich, dass die Dosierung von Alter, Geschlecht und Gewicht des Empfängers, von der Art einer eventuell gleichzeitig durchgeführten Therapie, der Häufigkeit der Therapie und der Art der erwünschten Wirkung abhängt. Die nachfolgend angegebenen wirksamen Dosierungen sind nicht als Einschränkung der Erfindung aufzufassen und stellen nur bevorzugte Dosierungen dar. Die am besten geeignete Dosis wird allerdings auf den einzelnen Patienten abgestimmt, wie von Fachleuten verstanden und bestimmbar ist. Die für eine Behandlung jeweils erforderliche Gesamtdosis kann in mehreren Dosen oder in einer einzigen Dosis verabreicht werden. Wirksame Antikörpermengen reichen von etwa 0,01 μg bis etwa 100 mg pro kg Körpergewicht, möglichst von etwa 10 μg bis etwa 50 mg pro kg. Antikörper können allein oder in Zusammenhang mit anderen Heilmitteln für die gleiche Krankheit verabreicht werden.
Gemäß der vorliegenden Erfindung und im Hinblick auf den neutralisierenden Antikörper können neutralisierende GP88-Antikörper in allen Therapiefällen eingesetzt werden, in denen es nötig ist, die biologische Aktivität von GP88 zu hemmen, selbst wenn nicht unbedingt eine Änderung in der Expression von GP88 vorliegt. Dies schließt auch Fälle ein, in denen eine Überexpression von Rezeptoren für GP88 auf der Zelloberfläche erfolgt und dies wiederum zu einer erhöhten biologischen Aktivität führt, oder bei einer Änderung an den Signalübertragungswegen oder Rezeptoren für GP88, die dazu führt, dass die Signalübertragungswege immer „eingeschaltet" sind. Neutralisierende Antikörper gegen Wachstumsfaktor und Wachstumsfaktorrezeptoren wurden bereits erfolgreich zur Hemmung des Wachstums von Zellen eingesetzt, deren Vermehrung von diesem Wachstumsfaktor abhängt. Dies gilt für den IGF-I-Rezeptor in menschlichen Brustkrebszellen (14) und Bombesin bei Lungenkrebs (29). Der GP88-Antikörper kann auch zur Einschleusung von Verbindungen dazu verwendet werden, wie zytotoxische Reagenzien wie Toxine, Onkotoxine, Mitotoxine und Immunotoxine oder antisense-Oligonukleotide, ohne darauf beschränkt zu sein, um sie speziell gegen Zellen wirken zu lassen, die GP88 exprimieren oder darauf reagieren (30).
Eine der Regionen, die es einem Antigen ermöglichen, einen neutralisierenden GP88-Antikörper zu entwickeln, ist die Aminosäureregion 19, die im murinen GP88 mit K19T und im menschlichen GP88 mit E19V bezeichnet wird und sich nicht zwischen den repetitiven 6-kDa-Epithelin-/Granulin-Sequenzen, sondern zwischen diesen repetitiven Sequenzen befindet, insbesondere zwischen Granulin A (Epithelin 1) und Granulin C (5) in einer als variable Region angesehenen Region (siehe 10). Ohne an die Theorie gebunden sein zu wollen, wird angenommen, dass die für die biologische Aktivität von GP88 wichtige Region außerhalb der wiederholten Epithelin-Sequenzen liegt.
Die Antikörper oder Antikörperfragmente, die in der vorliegenden Erfindung von Nutzen sind, können auch dafür eingesetzt werden, das Vorhandensein von Zellen, die das GP88-Protein exprimieren, quantitativ oder qualitativ zu bestimmen. Dies kann mit Hilfe von Immunfluoreszenztechniken unter Verwendung von einem Antikörper, in den ein Fluoreszenzmarker eingeführt wurde (siehe unten), und Nachweis mittels Fluoreszenzmikroskopie, Durchflusszytometrie oder Fluorometrie, erreicht werden. Die Reaktion der Antikörper und Polypeptide der vorliegenden Erfindung kann durch Immunoassay-Verfahren bestimmt werden, die beim Stand der Technik wohl bekannt sind (20).
Die Antikörper der vorliegenden Erfindung können in der Histologie wie in der Lichtmikroskopie, Immunfluoreszenz- oder Immunoelektronenmikroskopie für den in situ-Nachweis des GP88-Proteins in Gewebeproben oder Biopsien, eingesetzt werden. Der in situ-Nachweis kann durch Entnahme einer histologischen Probe von einem Patienten und Anwendung des entsprechend markierten Antikörpers der vorliegenden Erfindung erfolgen. Der Antikörper (oder das Fragment) wird bevorzugt bereitgestellt, indem der markierte Antikörper (oder das Fragment) der biologischen Probe appliziert oder überschichtet wird. Mit Hilfe eines derartigen Verfahrens ist es möglich, nicht nur das Vorhandensein des GP88-Proteins, sondern auch seine Verteilung in dem untersuchten Gewebe zu bestimmen. Mit Hilfe der vorliegenden Erfindung werden Personen mit üblichen Fachkenntnissen leicht erkennen, dass vielfältige histologische Methoden (wie Färbetechniken) so modifiziert werden können, dass ein derartiger in situ-Nachweis erreicht wird.
Tests auf GP88 umfassen typischerweise die Inkubation einer biologischen Probe, beispielsweise einer biologischen Flüssigkeit, eines Gewebsextrakts, frisch geernteter oder kultivierter Zellen oder deren Kulturmedium, in Gegenwart eines Antikörpers, der mit einer nachweisbaren Markierung versehen ist und der in der Lage ist, das GP88-Protein zu erkennen, und anschließender Bestimmung des Antikörpers durch eine beliebige Technik aus einer Reihe von Techniken, die beim Stand der Technik wohl bekannt sind.
Für die biologische Probe kann ein Festphasenträger wie Nitrozellulose oder ein anderer fester Träger verwendet werden, der in der Lage ist, Zellen, Zellpartikel oder lösliche Proteine zu immobilisieren. Der Träger kann dann gewaschen werden und anschließend mit dem detektierbar markierten anti-GP88-Antikörper behandelt werden. Darauf folgt ein Waschen des Trägers, um nicht gebundene Antikörper zu entfernen. Die Menge der auf dem betreffenden Träger gebundenen Markierung kann dann mit konventionellen Methoden bestimmt werden. Mit Festphasenträger sind alle Trägermaterialien gemeint, die in der Lage sind, Antigene oder Antikörper zu binden, wie Glas, Polystyrol, Polypropylen, Nylon, modifizierte Zellulose oder Polyacrylamid, ohne darauf beschränkt zu sein.
Die Bindungsaktivität einer gegebenen Menge von Antikörpern an das GP88-Protein kann mit Hilfe wohl bekannter Verfahren festgestellt werden. Fachleute sind in der Lage durch Routineexperimente für jeden Nachweis funktionierende oder optimale Testbedingungen zu bestimmen.
Der Nachweis des GP88-Proteins oder eines Funktionsderivats dieses Proteins und eines speziellen Antikörpers für das Protein kann mit Hilfe unterschiedlicher Immunoassay-Verfahren erfolgen, die aus dem Stand der Technik wohl bekannt sind, beispielsweise Enzymimmuntests wie „enzyme linked immunoassays" (ELIA) oder Radioimmunoassays (RIA). Diese Tests sind aus dem Stand der Technik wohl bekannt, und ein Fachmann wird ohne Weiteres wissen, wie diese Tests unter Verwendung der anti-GP88-Antikörper und des GP88-Proteins der vorliegenden Erfindung durchzuführen sind.
Derartige Immunoassays sind für den Nachweis und die Quantifizierung von GP88-Protein in Serum oder anderer biologischer Flüssigkeit sowie in Geweben, Zellen, Zellextrakten oder Biopsien nützlich. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die GP88-Konzentration in einer Gewebeprobe als Mittel zur Diagnose von Krebs oder anderen Krankheiten, die mit einer erhöhten Expression von GP88 einhergehen, bestimmt.
Das Auftreten bestimmter Krebsarten und der Grad ihrer Malignität gelten als eine Steigerung des Gehalts an GP-88-Protein „proportional". Der hier verwendete Begriff „proportional" soll nicht auf eine lineare oder gleichbleibende Beziehung zwischen dem Proteingehalt und den malignen Charakter der Krebserkrankung beschränkt sein. Der hier verwendete Begriff „proportional" soll bedeuten, dass ein erhöhter Gehalt an GP88-Protein mit dem Auftreten, dem erneuten Auftreten oder der Entfaltung von malignen Eigenschaften einer Krebserkrankung oder sonstigen Krankheiten verbunden ist, die mit einer erhöhten Expression von GP88 in Konzentrationen des Proteins einhergeht, die von einem Fachmann ohne Weiteres bestimmt werden können.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung betrifft die Bewertung der Wirksamkeit eines Medikaments oder Mittels gegen Krebs oder Viren durch Messung der Fähigkeit des Medikaments oder Mittels, die Expression oder Produktion von GP88 zu hemmen. Die Antikörper der vorliegenden Erfindung sind bei einem Verfahren zur Bewertung von Medikamenten gegen Krebs oder Viren insofern nützlich, als sie zur Bestimmung des Gehalts an GP88-Protein in einem der oben genannten Immunoassays verwendet werden können. Alternativ wird die Menge des produzierten GP88-Proteins durch einen Bioassay (Zellvermehrungstest) gemessen, wie vorliegend beschrieben wird. Bioassay und Immunoassay können für eine genauere Beurteilung kombiniert werden.
Eine weitere Ausführungsform zielt auf einen Test für die Diagnose von Krebserkrankungen und anderen Krankheiten ab, die mit einer erhöhten Expression von GP88 einhergehen, beruhend auf der Messung der in einem Gewebe oder einer biologischen Flüssigkeit vorhandenen Menge an mRNA-Sequenzen, die GP88 oder ein Funktionsderivat von GP88 codieren, wobei vorzugsweise ein RNA-DNA-Hybridisierungsassay benutzt wird. Das Vorhandensein bestimmter Krebserkrankungen und der Grad der Malignität ist proportional zur vorhandenen mRNA-Menge. Bei diesen Tests stammt die mRNA aus Biopsien und umgebendem Gewebe. Die bevorzugte Technik für die Messung der mRNA-Menge ist ein Hybridisierungsassay unter Verwendung von DNA mit einer komplementären Basensequenz.
Eine weitere verwandte Ausführungsform zielt auf einen Test für die Diagnose von Krebserkrankungen oder anderen Krankheiten, die mit einer erhöhten Reaktionsbereitschaft auf GP88 einhergehen, ab und beruht auf einer Messung einer Gewebsbiopsie, ob die Behandlung mit einem neutralisierenden anti-GP88-Antikörper dessen Wachstum oder sonstige biologische Aktivität hemmen wird.
Eine weitere verwandte Ausführungsform ist ein Verfahren zur Messung der Wirksamkeit eines Medikaments oder Mittels gegen Krebs oder Viren, beinhaltend die Schritte der Messung der Wirkung des Mittels auf die Hemmung der Expression von mRNA für GP88. Ebenso kann dieses Verfahren zur Feststellung oder Bewertung der Wirksamkeit von GP88 antagonisierenden Agenzien verwendet werden, indem die Fähigkeit des genannten Agens, die Produktion von GP88-mRNA zu hemmen, bestimmt wird.
Als Grundlage für Nukleinsäurenachweise, insbesondere für Hybridisierungsassays, kann jedes beliebige Merkmal des Nukleinsäuremoleküls, wie seine Größe, Sequenz oder Anfälligkeit für Verdau durch Restriktionsendonukleasen dienen. Die Empfindlichkeit dieser Tests kann durch Änderung der Art und Weise, wie der Nachweis dem Beobachter vermittelt oder angezeigt wird, erhöht werden. Eine Vielzahl von Markern wurde extensiv entwickelt und hat unter Personen mit üblichen Fachkenntnisse weite Verbreitung gefunden, einschließlich enzymatischer, radioisotopischer, fluoreszierender, chemischer Macker und modifizierter Basen.
Ein Verfahren, um die begrenzte Empfindlichkeit für den Nukleinsäurenachweis zu überwinden, besteht in einer selektiven Amplifikation der Nukleinsäure vor dem Durchführen des Tests. Dieses Verfahren wird als „Polymerase-Kettenreaktion" oder PCR bezeichnet (31 und US-Patente Nr. 4,683,202 und 4,582,788). Die PCR-Reaktion bietet ein Verfahren für die selektive Steigerung der Konzentration einer bestimmten Nukleinsäuresequenz, selbst wenn die betreffende Sequenz nicht zuvor aufgereinigt worden ist und nur in einer einzigen Kopie in einer bestimmten Probe vorliegt.
GP88-antisense-Komponenten
Diese Erfindung liefert auch GP88-antisense-Komponenten. Es wurde nachgewiesen, dass die konstitutive Expression von antisense-RNA in Zellen die Expression von mehr als 20 Genen hemmt, und diese Zahl steigt weiter an (32–34). Mögliche Mechanismen für antisense-Wirkungen sind Blockieren der Translation oder Verhindern von Splicing, die beide in vitro beobachtet wurden. Die Beeinflussung des Splicing erlaubt die Verwendung von Intronsequenzen (30), die schwächer konserviert sein sollten und daher zu einer größeren Spezifität führen, wobei die Expression eines Genprodukts in einer bestimmten Spezies gehemmt wird, nicht jedoch eines Homologs in einer anderen Spezies.
Der Begriff antisense-Komponente entspricht einer RNA-Sequenz ebenso wie einer diese RNA-Sequenz codierenden DNA-Sequenz, deren Komplementarität für ein bestimmtes mRNA-Molekül, für das die antisense-RNA spezifisch ist, ausreicht, um eine molekulare Hybridisierung zwischen der antisense-RNA und der mRNA zu bewirken, so dass die Translation der mRNA gehemmt wird. Eine derartige Hybridisierung kann unter in vivo-Bedingungen erfolgen. Die Wirkung der antisense-RNA führt zu einer spezifischen Hemmung der Genexpression in den Zellen (32–35).
Gemäß der vorliegenden Erfindung hemmt die Transfektion tumorgener Zellen mit DNA die antisense-Orientierung zur GP88-cDNA die endogene Expression von GP88 und hemmt die Tumorgenität der mit antisense-cDNA transfizierten Zellen. Diese antisense-DNA muss eine ausreichende, etwa 18 bis 30 Nukleotide lange Komplementarität zum GP88-Gen besitzen, so dass die antisense-RNA mit dem GP88-Gen (oder der mRNA) hybridisieren und die Expression des GP88-Gens hemmen kann, und zwar unabhängig davon, ob die Wirkung beim Splicing, bei der Transkription oder bei der Translation eintritt. Der Grad der Hemmung ist für einen Fachmann ohne unangemessenes Experimentieren auf Grund der vorliegenden Lehre leicht erkennbar und er reicht vorzugsweise für eine Hemmung des Wachstums von Zellen, deren Vermehrung von der Expression von GP88 abhängt, aus. Eine Person mit üblichen Fachkenntnissen wird erkennen, dass der Ansatz mit antisense-RNA nur einer aus einer Reihe von bekannten Mechanismen ist, die zur Blockierung einer Expression bestimmter Gene eingesetzt werden können.
Die antisense-Komponenten der vorliegenden Erfindung können mit einem beliebigen der verschiedenen Abschnitte der Ziel-GP88-cDNA hybridisiert werden, einschließlich der Codierungssequenz, der nicht übersetzten 3'- oder 5'-Regionen oder anderen Intronsequenzen oder GP88-mRNA. Wie für eine Person mit üblichen Fachkenntnissen leicht erkennbar ist, entspricht das Mindestmaß an Homologie, das für die vorliegende Erfindung benötigt wird, der Homologie, die ausreicht, um eine Hybridisierung mit der DNA oder mRNA von GP88 und eine Hemmung der Transkription der DNA oder der Translation oder Funktion der mRNA herbeizuführen, vorzugsweise ohne Beeinträchtigung der Funktion anderer mRNA-Moleküle und der Expression anderer nicht verwandter Gene.
Das Einschleusen von antisense-RNA in eine Zelle erfolgt durch Transformation oder Transfektion über einen Vektor, einschließlich Retrovirusvektoren und Plasmide, worin DNA eingebaut wurde, welche die antisense-RNA mit den entsprechenden Regulationssequenzen einschließlich eines Promotors, der zu einer Expression der antisense-RNA in einer Wirtszelle führt, codiert. Es sind bereits stabile Transfektionen verschiedener antisense-Expressionsvektoren, die Fragmente von GP88-cDNA in antisense-Orientierung enthielten, durchgeführt worden. Das Einschleusen von antisense-Komponenten in Zellen kann auch mit Hilfe eines Retrovirusvektors erfolgen. Außerdem ist ein Einschleusen mittels Liposomen möglich.
Für die Anwendung der antisense-Technologie in einer in vivo-Therapie wird zur Zeit das Verfahren mit antisense-Oligonukleotiden (32, 36) anstelle der Durchführung einer stabilen Transfektion eines antisense-cDNA-Fragments, das in einen Expressionsvektor eingebaut worden ist, bevorzugt. Antisense-Oligonukleotide mit einer Länge von 15 bis 30 Basen und mit Sequenzen, die mit einem beliebigen der verschiedenen Abschnitte der Ziel-GP88-cDNA, einschließlich der Codierungssequenz, der nicht übersetzten 3'- oder 5'-Regionen oder anderen Intronsequenzen oder GP88-mRNA, hybridisiert werden können, werden bevorzugt. Als Sequenzen der antisense-Oligonukleotide für GP88 werden vorzugsweise diejenigen ausgewählt, die die stärksten antisense-Wirkungen aufweisen (37, 38). Faktoren für den Zielort der antisense-Oligonukleotidsequenz sind auf die Länge des Oligonukleotids, die Bindungsstärke und die Zugänglichkeit der Zielsequenz bezogen. Die Sequenzen können in vitro auf die Stärke ihrer antisense-Aktivität hin untersucht werden, indem man die Hemmung der Translation von GP88-Protein und eines mit GP88 verwandten Phänotyps misst, beispielsweise die Hemmung der Zellvermehrung in Zellen in Kultur. Generell ist bekannt, dass die meisten Regionen der RNA (nicht übersetzte 5'- und 3'-Regionen, AUG-Initiationscodon, Codierung, Spleißstellen und Introns) mit Hilfe von antisense-Oligonukleotiden als Targets dienen können.
Als GP88-antisense-Oligonukleotide werden diejenigen Oligonukleotide bevorzugt, die stabil sind, die eine hohe Stabilität gegenüber Nukleasen (Enzyme mit dem Potential, Oligonukleotide abzubauen) aufweisen, deren Pharmakokinetik es ihnen ermöglicht, in nicht toxischen Dosierungen zu erkranktem Gewebe zu wandern, und die die Fähigkeit haben, Plasmamembranen zu durchdringen.
Phosphorothioat-antisense-Oligonukleotide können verwendet werden (39). Die Wirkung kann durch Modifizierung der Phosphodiesterbindung sowie des Heterozyklus oder des Zuckers erhöht werden. Im Hinblick auf die Modifizierung der Phosphodiesterbindung kann Phosphorothioat verwendet werden. Es wurde beschrieben, dass eine N3'-P5'-Phosphoramidatbindung Oligonukleotide gegenüber Nukleaseangriff stabilisiert und die Bindung an die RNA stärkt (40). Die Peptidnukleinsäurebindung (PNA-Bindung) stellt einen vollständigen Ersatz der Ribose-Phosphodiesterhauptkette dar und ist gegenüber Nukleasen stabil, erhöht die Stärke der Bindung an die RNA und verhindert die Spaltung durch RNAse N Aktivität. Ihre Grundstruktur ist außerdem Modifizierungen zugänglich, die ihre Optimierung als antisense-Komponente ermöglichen können. Im Hinblick auf Modifizierungen des Heterozyklus ist nachgewiesen worden, dass bestimmte Modifizierungen am Heterozyklus die antisense-Wirkung steigern, ohne die Aktivität der RNAse H zu beeinflussen. Ein Beispiel für derartige Modifizierungen ist die C-5-Thiazol-Modifizierung. Schließlich kann auch eine Modifizierung des Zuckers in Betracht gezogen werden. Modifizierungen der 2'-O-Propyl- und 2'-Methoxyethoxy-Ribose stabilisieren Oligonukleotide gegenüber Nukleaseangriff in Zellkultur und in vivo. Tumorexperimente, die in Zellkulturen und in vivo durchgeführt wurden und bei denen diese Arten von Oligonukleotiden, die auf c-raf-1 gerichtet waren, verwendet wurden, führten zu einer verbesserten Wirkung. Bezüglich antisense-Oligonukleotiden wird allgemein auf (32 bis 34) hingewiesen.
Als Weg der Einschleusung wird der Weg gewählt, der die beste antisense-Wirkung bietet, die anhand der oben genannten Kriterien ermittelt wird. In in vitro-Zellkulturtests und in vivo-Tumonroachstumstests unter Verwendung von antisense-Oligonukleotiden wurde gezeigt, dass eine durch kationische Liposomen vermittelte Einschleusung, eine Einschleusung durch Retrovirusvektoren und eine direkte Einschleusung wirkungsvoll sind (36, 41– 43). Eine weitere Einschleusungsmöglichkeit besteht in einem Targeting der Marker für die Tumorzellen auf der Zelloberfläche mittels Antikörper. Ein Antikörper gegen GP88 oder dessen Rezeptor kann hierzu dienen.
Rekombinantes GP88
Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem DNA-Expressionssysteme für die Expression eines rekombinanten GP88-Polypeptids oder eines Funktionsderivats dieses GP88-Polypeptids, das im Wesentlichen frei von anderen Säugetier-DNA-Sequenzen ist. Diese DNA kann doppel- oder einzelsträngig sein. Die DNA-Sequenz sollte vorzugsweise etwa 20 oder mehr Nukleotide besitzen, um eine Hybridisierung mit einem anderen Polynukleotid zu ermöglichen. Um eine höhere Spezifität der Hybridisierung zu erreichen, die durch das Fehlen einer Hybridisierung mit anderen Sequenzen als denjenigen gekennzeichnet ist, die das GP88-Protein oder ein Homolog oder Funktionsderivat des GP88-Proteins codieren, sollte die Länge bevorzugt mindestens 50 Nukleotide betragen.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch die oben genannten DNA-Moleküle, exprimierbare Vehikel oder Vektoren sowie Wirte, die mit den Transportmitteln transfiziert oder transformiert wurden und in der Lage sind, das Polypeptid zu exprimieren. Diese Wirte können prokaryotisch, vorzugsweise Bakterien, oder eukaryotisch, vorzugsweise Hefe- oder Säugetierzellen, sein. Ein bevorzugtes Vektorsystem beinhaltet Baculovirus, der in Insektenzellen exprimiert wird. Die DNA kann mittels Transformation, Transduktion, Transfektion, Infektion oder verwandten Methoden aus dem Stand der Technik, die bekannt sind, in Wirtsorganismen eingebaut werden. Zusätzlich zu DNA- und mRNA-Sequenzen, die das GP88-Polypeptid codieren, stellt die Erfindung auch Verfahren für die Expression der Nukleinsäuresequenz bereit. Außerdem ermöglichen die genetischen Sequenzen und Oligonukleotide eine Identifizierung und Klonierung zusätzlicher Polypeptide, deren Sequenz zum vorliegend beschriebenen GP88-Polypeptid homolog ist.
Ein Expressionsvektor ist ein Vektor, der (wegen des Vorhandenseins geeigneter Transkriptions- und/oder Translationssteuersequenzen) in der Lage ist, ein DNA-Molekül (oder cDNA-Molekül) zu exprimieren, das in den Vektor kloniert wurde, und dadurch ein Polypeptid oder Protein produziert. Die Expression der klonierten Sequenz erfolgt, sobald der Expressionsvektor in eine geeignete Wirtszelle eingeschleust wird. Bei Verwendung eines prokaryotischen Expressionsvektors wäre jede prokaryotische Zelle, die zur Expression der klonierten Sequenz fähig ist, eine geeignete Wirtszelle. Entsprechend wäre bei Verwendung eines eukaryotischen Expressionssystems jede eukaryotische Zelle, die zur Expression der klonierten Sequenz fähig ist, eine geeignete Wirtszelle. Der Baculovirusvektor kann beispielsweise dazu verwendet werden, GP88-cDNA zu klonieren und die cDNA anschließend in Insektenzellen zu exprimieren.
Eine DNA-Sequenz, die das GP88-Polypeptid oder dessen Funktionsderivate codiert, kann mittels konventioneller Techniken mit Vektor-DNA rekombiniert werden, unter anderem „blunt-ended"-Ligation oder Ligation mit versetzten Enden, Restriktionsenzymverdau zur Bereitstellung geeigneter Enden, gegebenenfalls Auffüllung mit kohäsiven Enden, Behandlung mit alkalischer Phosphatase zur Verhinderung unerwünschter Verbindungen sowie Ligation mit geeigneten Enzymligasen. Techniken für solche Veränderungen werden in (35) diskutiert.
Ein Nukleinsäuremolekül ist zur Expression eines Polypeptids fähig, wenn es Nukleotidsequenzen enthält, die Regulationsinformationen für Transkription und Translation enthalten, und wenn diese Sequenzen aktivierbar an Nukleotidsequenzen, die das Polypeptid codieren, gekoppelt sind. Bei einer aktivierbaren Kopplung handelt es sich um eine Kopplung, in der die DNA-Regulationssequenzen und die DNA-Sequenz, die exprimiert werden soll, derart miteinander verbunden sind, dass eine Genexpression möglich ist. Die genaue Beschaffenheit der für die Genexpression benötigten Regulationsregionen kann bei den unterschiedlichen Organismen variieren, sollte aber im Allgemeinen eine Promotorregion umfassen, die in Prokaryoten sowohl den Promotor (der die Initiation der RNA-Transkription regelt) als auch die DNA-Sequenzen enthält, die bei der Transkription in RNA die Initiation der Proteinsynthese signalisieren. Normalennreise umfassen diese Regionen diejenigen nicht codierenden 5'-Sequenzen, die an der Initiation von Transkription und Translation beteiligt sind, wie z. B. die TATA-Box, die Capping-Sequenz, die CAAT-Sequenz u. ä.
Auf Wunsch kann die nicht codierende 3'-Region für die Gensequenz, die das Protein codiert, durch Verfahren gewonnen werden, die bereits beschrieben worden sind (Screening der entsprechenden cDNA-Bank oder PCR-Amplifikation). Diese Region kann aufgrund des Vorhandenseins von Regulationssequenzen für die Transkriptionstermination, wie Termination und Polyadenylierung erhalten werden. Durch Erhalten der 3'-Region, die von Natur aus an die DNA-Sequenz, die das Protein codiert, angrenzt, können die Transkriptionsterminationssignale bereitgestellt werden. Wenn die Transkriptionsterminationssignale nicht bereit gestellt werden oder in den Expressionswirtszellen nicht zufriedenstellend wirken, kann als Ersatz eine 3'-Region aus einem anderen Gen verwendet werden.
Zwei DNA-Sequenzen, wie die Sequenz einer Promotorregion und eine Sequenz, die GP88 codiert, gelten als operativ gekoppelt, wenn die Beschaffenheit der Kopplung zwischen den Sequenzen (1) weder zur Einschleppung einer Rasterverschiebungsmutation führt noch (2) die Fähigkeit der Promotorsequenz beeinflusst, die Transkription der Polypeptidgensequenz zu regeln.
Die Promotorsequenzen können prokaryotisch, eukaryotisch oder viral sein. Geeignete Promotoren sind induzierbar, reprimierbar oder konstitutiv. Beispiele geeigneter prokaryotischer Promotoren werden in Fundstellen (44–46) untersucht.
Zu den eukaryotischen Promotoren gehören, ohne darauf beschränkt zu sein, der Promotor des murinen Gens für Metallothionein I (47), der TK-Promotor des Herpesvirus (48), der Promotor für das gal4-Gen (49), der frühe SV40-Promotor (50), der Promotor für den murinen Mammatumorvirus (MMTV) und der Promotor für den Zytomegalie-Virus (CMV) (51). Starke Promotoren werden bevorzugt. Beispiele für derartige Promotoren sind Promotoren, die die Polymerasen T3, SP6 und T7 erkennen, der PL-Promotor des Bakteriophagen Lambda, der recA-Promotor, der Promotor des Gens für Metallothionein 1 der Maus, der SV40-Promotor und der CMV-Promotor.
Es versteht sich, dass die Anwendung der Lehren der vorliegenden Erfindung auf ein bestimmtes Problem oder in einer bestimmten Umgebung innerhalb der Fähigkeiten einer Person liegt, die vor dem Hintergrund der in dieser Beschreibung enthaltenen Lehren über die üblichen Fachkenntnisse verfügt. Die vorliegende Erfindung wird in den folgenden Beispielen näher erläutert, wobei die Beispiele nicht einschränkend sind.
BEISPIEL 1
Isolierung der PC-Zelllinie
Die Rolle, die die autokrine Produktion des Wachstumsfaktors beim Verlust der Differenzierungsfähigkeit und beim Erwerb tumorgener Eigenschaften in Säugetierzellen spielt, wurde anhand eines vom Erfinder entwickelten murinen Modellsystems untersucht. Es besteht aus der adipogenen Zelllinie 1246 der C3H-Maus (9), einer Reihe von Zelllinien, die in ihrer Differenzierung defiziert sind und zunehmend tumorgene Eigenschaften aufweisen. 1246-Zellen vermehren und differenzieren sich in einem definierten serumfreien Medium (9). In einem definierten Medium benötigen 1246-Zellen zur Proliferation und Differenzierung unbedingt Insulin (10). Für die Proliferation kann Insulin durch den insulinähnlichen Wachstumsfaktor I (IGF-I) ersetzt werden, nicht jedoch für die Differenzierung. Aus 1246-Zellen, die in Abwesenheit von Insulin gehalten wurden, wurden insulinabhängige Zelllinien isoliert (11).
1246-3A wurde besonders genau untersucht. Die 1246-3A-Zellen hatten die Fähigkeit zur Differenzierung verloren und waren in vivo tumorgen geworden (11). 1246-3A-Zellen bildeten Tumore, wenn 10⁶-Zellen innerhalb von 6 Wochen in syngene C3H-Mäuse injiziert wurden, wohingegen 1246-Zellen nicht tumorgen waren. Anschließend wurden hoch tumorgene insulinunabhängige Zelllinien mit Hilfe einer in vitro-/in vivo-Shuttletechnik isoliert und analysiert (12).
Bei der Shuttletechnik wurden 1246-3A-Zellen (10⁶ Zellen/Maus) syngenen C3H-Mäusen subkutan injiziert. Der aus der Injektion der Zellen resultierende Tumor wurde dann zerkleinert und in einer Primärkultur in einem definierten Medium vorgelegt, dem Insulin entzogen worden war (Nährmedium DME-F12 im Mischungsverhältnis 1 : 1, mit Fibronektin, Transferrin und FGF versetzt). Zellen, die begonnen hatten zu wachsen, wurden subkultiviert, sobald sie konfluent waren, und dann: (1) entweder in Gegenwart von 10% fötalem Rinderserum und 10% Dimethylsulfoxid (DMSO) zur langfristigen Konservierung eingefroren; (2) C3H-Mäusen in unterschiedlichen Zelldichten (10⁶, 10⁵, 10⁴ Zellen/Maus) subkutan injiziert. Die Häufigkeit des Auftretens von Tumoren und die Tumorgröße wurden beobachtet. Die aufgetretenen Tumore wurden in dem insulinfreien Medium erneut kultiviert. Zellen, die unter diesen Bedingungen wuchsen, wurden wieder in das Tier injiziert.
Mit Hilfe dieser in vitro-/in vivo-Shuttletechnik wurden insulinunabhängige Zellen mit zunehmend tumorgenen Eigenschaften gewonnen. Insbesondere wurde die hoch tumorgene Zelllinie namens PC isoliert (12). PC-Zellen können selbst dann Tumore bilden, wenn syngenen C3H-Mäusen 10⁴ Zellen subkutan injiziert wurden.
Die PC-Zelllinie weist zumindest folgende Merkmale auf:

1. Diese Zellen stellen ein ausgezeichnetes Modellsystem für Studien zur Tumorgenität dar: Diese Zellen können sich in einer einfachen definierten DME-F12-Nährmischung, die mit 2 μg/ml Fibronektin und 10 μg/ml Transferrin versetzt wurde, vermehren, sie können in syngene Wirte injiziert werden und erfordern nicht die Verwendung von Nacktmäusen, die teuer sind und besonders behandelt werden müssen.
2. Wenn die PC-Zellen konfluent werden, können die Zellen in einem vollständig serumfreien und faktorenfreien Medium gehalten werden. Ihr Wachstum wird ausschließlich vom Nährmedium und denjenigen Faktoren aufrecht erhalten, die die Zellen in ihr konditioniertes Medium abgeben. Somit ist ein konditioniertes Medium eine gute Quelle für die Charakterisierung und Aufreinigung von Faktoren, die für die Vermehrung von Tumorzellen erforderlich sind.

BEISPIEL 2
GP88 ist ein autokriner Wachstumsfaktor für die hoch tumorctenen PC-Zellen.
Es wurde gezeigt, dass konditioniertes Medium für PC-Zellen eine wachstumsfördernde Aktivität aufwies, die durch chromatographische Verfahren aufgereinigt wurde (4). Der gereinigte Faktor namens GP88-Vorläufer wurde sequenziert, und es wurde gezeigt, dass er dem Epithelin-/Granulin-Vorläufer ähnlich ist.
Anhand von Experimenten wurde untersucht, ob die Produktion von GP88 durch PC-Zellen das Wachstum der Zellen in autokriner Weise stimulierte. Hierzu wurden die PC-Zellen in Gegenwart eines GP88-Antikörpers kultiviert, der die Aktivität von GP88 neutralisieren kann. Die DNA-Synthese der PC-Zellen wurde bei zunehmenden Mengen entweder des nicht immunen IgG oder des anti-K19T IgG gemessen.
Wie 2 zu entnehmen ist, wurde das Wachstum von PC-Zellen durch Zugabe von anti-GP88-IgG dosisabhängig gehemmt, womit direkt demonstriert wird, dass die GP88-Produktion durch die PC-Zellen für ihr Wachstum erforderlich ist. Nicht immunes IgG zeigte keinen Effekt. Dabei wurden PC-Zellen in 96-Well-Platten in einer Dichte von 2 × 10⁴ Zellen/Well in DME/F12-Medium vorgelegt, dem 2 μg/ml Fibronektin und 10 μg/ml Transferrin zugesetzt worden war (2F-Medium). Nach 6 Stunden, als die Zellen anhafteten, wurde eine anti-GP88-IgG-Fraktion zugefügt. 36 Stunden später wurde ³H-Thymidin (0,25 μCi/ml) für weitere 8 Stunden zugefügt. Die Zellen wurden durch Trypsinisierung auf Glasfiltern mit einem Zellerntegerät entnommen, und die Radioaktivität, die dem in die DNA eingeschleusten ³H-Thymidin entsprach, wurde mit Hilfe eines Flüssigkeitsszintillationszählers gezählt. Die Werte ( 2) werden in % der Kontroll-IgG ausgedrückt, das entspricht der Menge Thymidin, die in die PC-Zellen eingeschleust worden ist, die mit gleich großen Mengen von nicht immunem IgG behandelt worden sind.
Ähnliche Ergebnisse ergaben sich bei der Verwendung von monoklonalen anti-K19T-Antikörpern und anti-E19V-Antikörpern. Der monoklonale anti-K19T-Antikörper hemmte dosisabhängig das Wachstum von PC-Zellen und von Leukämiezellen von Ratten. Außerdem wurde das Wachstum der Zelllinie MCF7 des menschlichen Brustkarzinoms durch den monoklonalen anti-E19V-Antikörper mit einem ED₅₀ von 100 μg/ml gehemmt.
BEISPIEL 3
Expression von GP88 in den Zelllinien 1246, 1246-3A und PC
Da das GP88-Protein aus einem konditionieren PC-Zellen-Medium aufgereinigt worden war, wurden Experimente durchgeführt, um die Expression von GP88-mRNA und Protein in den drei Zelllinien zu vergleichen.
Vergleichsstudien der Tumorgenität an 1246-, 1246-3A- und PC-Zelllinien in C3H-Mäusen zeigten, dass die PC-Zellen im Vergleich zu 1246-3A-Zellen hoch tumorgen sind, da sie Tumore entwickeln können, wenn C3H-Mäusen 10⁴ Zellen/Maus injiziert werden. 1246-3A-Zellen bilden Tumore, wenn 10⁶ Zellen/Maus injiziert werden, wohingegen 1236-Zellen bei syngenen Wirten nicht tumorgen sind (12).
Die folgenden Verfahren wurden bei den vergleichenden Untersuchungen des GP88-Gehalts im Modellsystem, das aus den drei Zelllinien 1246, 1246-3A und PC bestand, angewandt.
Zellkultur
1246-Stammzellen wurden in DME/F12-Nährmedium gehalten (Dulbecco's modifiziertes Eagle-Medium und Ham's F12-Nährmedium im Mischungsverhältnis 1 : 1), versetzt mit 10% fötalem Rinderserum (FBS). 1246-3A-Stammzellen und PC-Stammzellen wurden in definiertem Medium gehalten. Für die PC-Stammzellen bestand es aus DME-F12-Medium, versetzt mit 2 μg/ml menschlichem Plasmafibronektin und 10 μg/ml menschlichem Plasmatransferrin (2F-Medium). Für die 1246-3A-Stammzellen bestand das definierte Medium namens 3F-Medium aus DME-F12-Medium, versetzt mit 2 μg/ml menschlichem Plasmafibronektin und 10 μg/ml menschlichem Plasmatransferrin und 1 ng/ml basischem Fibroblastenwachstumsfaktor (bFGF). Für Vergleichsuntersuchungen wurden die drei Zelllinien in DME-F12-Medium vorgelegt, das mit 2% FBS versetzt war.
RNA-Isolierung und Northernblotanalyse
Für die Northernblotanalyse der Expression von GP88-mRNA in Zellen oder Gewebe von Nagetieren (Mäuse und Ratten) benutzten wir eine cDNA-Sonde von GP88 der Maus mit einer Länge von 311 bp, beginnend bei Nukleotid 551 bis 862 (entsprechend der Aminosäuresequenz 160 bis 270). Die Sonde wurde mittels Random-Priming mit ³²p markiert.
Die gesamte Zell-RNA wurde mittels RNAzol-Lösung (Cinnabiotech) oder Trizol-Lösung (Life Technologies) auf der Grundlage einer Modifikation der einstufigen Guanidinisothiozyanat-Phenol-Chloroform-Verfahren (52) isoliert.
Fünfzehn oder zwanzig Mikrogramm der Gesamt-RNA pro Probe wurden einer Elektrophorese auf einem denaturierenden 1,2%igen Agarosegel unterzogen, das 0,22 M Formaldehyd in 1 × MOPS (10 × MOPS: 0,2 M MOPS, 50 mM NaOAc, 10 mM EDTA) enthielt. Die RNA wurde mittels Übernacht-Kapillarentransfer in 10 × SSC (20 × SSC = 3M NaCl, 0,3 M Na Citrat, pH 7,0) auf eine Nitrozellulosemembran (MSI Inc. Westboro, MA) geblottet. Die Filter wurden 2 Stunden lang bei 80°C unter Vakuum erhitzt und dann 4 Stunden lang bei 42°C in einer Hybridisierungslösung vorhybridisiert, die aus 50 Formamid, 5 × SSPE (1 × SSPE = 0,16 M Natriumchlorid, 50 mM Natriumphosphat, pH-Wert 7,4, 1 mM EDTA), 1% SDS, 5 × Denhardts-Lösung (1 × Denhardts-Lösung = je 0,02% Polyvinylpyrrolidon, Ficoll und Albumin aus Rinderserum), 1 μg/ml Poly-A und 100 μg/ml denaturierter Lachssperma-DNA bei 42°C bestand. Die Hybridisierung erfolgte über Nacht bei 42°C in derselben Lösung mit 10⁶ cpm/ml einer GP88-cDNA-Sonde, die mittels Random-Priming mit ³²P markiert worden war. Die Filter wurden zweimal 25 Min. lang bei 42°C in 2 × SSC und 1% SDS und anschließend zweimal 15 Min. lang bei 56°C in 0,2 × SSC und 1% SDS gewaschen. Die getrockneten Filter wurden bei –70°C mit einem Kodak XAR-5-Film (Kodak, Rochester, NY) mit einem Verstärkerfilm (Dupont, Boston, MA) exponiert. Die Ergebnisse wurden mittels densitometrischem Scan quantifiziert. Das ribosomale Protein L₃₂ mRNA wurde als interner Standard für die Normierung der RNA-Ladung entdeckt.
Präparation von Zelllysat, Immunpräzipitation und Westernblotanalyse
Zellen in 10-cm-Kulturschalen wurden einmal mit PBS-Puffer gewaschen und 10 Min. lang auf Eis mit 1 ml PBS-Puffer, der 1% Triton X-100 enthielt, lysiert. Das Zelllysat wurde 10 Sekunden lang auf Eis beschallt, 10 Min. lang bei 10.000 × g zentrifugiert, und dann wurde der Überstand entnommen und bis zur Verwendung bei –70°C gelagert.
Die Mengen an Zelllysat und Kulturmedium, die analysiert werden sollten, wurden anhand der Zellenzahl 18 × 10⁵ bzw. 3 × 10⁵ normalisiert. Die Proteaseinhibitoren 200 μM PMSF, 1 μM Leupeptin, 0,5 μM Aprotinin und 1 μM EDTA wurden jeder Probe zugefügt. Jede Probe wurde 4 Stunden lang bei 4°C mit 5 μg affinitätsgereinigtem, mit Agarose konjugiertem anti-K19T-IgG unter Schütteln inkubiert. Präzipitate wurden mittels Zentrifugation gesammlt, dreimal mit PBS-Puffer gewaschen, erneut in 20 μl SDS-Probenpuffer mit 5% β-Mercaptoethanol suspendiert, 5 Min. lang gekocht und dann mittels SDS-PAGE auf 10% Polyacrylamidgel entsprechend der Laemmli-Methode abgeschieden. Die Proteine wurden mittels Elektrotransfer in Immobilon-Membranen übertragen, und GP88 wurde mit Hilfe eines anti-K19T-Antikörpers, der mit Meerrettichperoxidase konjugiert, mittels verstärkter Chemilumineszenzbestimmung nachgewiesen.
Wenn die Expression von GP88-mRNA in den drei Zelllinien, die in DME/F12-Medium kultiviert worden waren, dem 2% fötales Rinderserum (FBS) zugesetzt worden war, [...] unser Labor, als Sonde, zeigen die Ergebnisse, dass das höchste Niveau an mRNA-Expression für GP88 in den hoch tumorgenen PC-Zellen gefunden wird (1B).
Die Höhe der GP88-Proteinexpression wurde mittels Westernblotanalysen unter Verwendung eines anti-K19-Antikörpers sowohl in den Zelllysaten als auch im Kulturmedium von 1246-, 1246-3A- sowie PC-Zellen untersucht, wie oben beschrieben wurde. Wie in 1A zu erkennen ist, war der GP88-Gehalt im Kulturmedium für 1246-Zellen, 3T3- und 1246-3A-Zellen nicht bestimmbar und nahm im Kulturmedium der hoch tumorgenen PC-Zellen drastisch zu. Die gleichen Ergebnisse ergaben sich für die GP88-Expression in Zelllysaten.
Die GP88-Expression wurde in 1246-Zellen unter verschiedenen Kulturbedingungen wie definiertem Medium und serumhaltigem Medium, untersucht. Es zeigte sich, dass die Höhe der Expression von GP88-mRNA (durch Northernblotanalyse gemessen) und von Protein (durch Westernblotanalyse gemessen) in 1246-Zellen und in 1246-3A-Zellen gehemmt wird, wenn die Zellen mit 2% fötalem Rinderserum behandelt werden; ein Hinweis auf das Vorhandensein von zirkulierenden Inhibitoren einer GP88-Expression in fötalem Rinderserum (1C). Diese Hemmung der GP88-Expression wurde auch beobachtet, wenn die Aktivität des an ein Luciferase-Reportergen gekoppelten GP88-Promotors gemessen wurde, was zeigt, dass diese Inhibitoren die Transkriptionsaktivität des GP88-Gens wirksam hemmen. Diese Inhibitoren können bei der Entwicklung von GP88 antagonisierenden Agenzien, die in der Antitumor- und Antivirustherapie von Nutzen sind, helfen. Wir haben auch gezeigt, dass die Expression von GP88-mRNA durch EGF in den 1246-Zellen und durch Insulin in den menschlichen Mammakarzinomzellen MDA MB-453 stimuliert wird.
BEISPIEL 4
Expression und biologische Aktivität von GP88 in Mamma-Epithelzellen.
(a) GP88-Expression in Brustkarzinomzellen.
Es wurden Experimente durchgeführt, um die Höhe der GP88-Expression im Brustkarzinom zu untersuchen und um zu prüfen, ob GP88 ein Wachstumsfaktor für Brustgewebeepithelzellen ist. Diese Möglichkeit wird folgendermaßen begründet: GP88 ist ein potenter Wachstumsstimulator für Brustgewebeepithelzellen (siehe nächster Abschnitt); Rezeptoren für GP88 (unsere Untersuchungen) und Epithelin 1 in der umgewandelten Form (54) wurden auf Brustgewebeepithelzellen charakterisiert; Brustkarzinomzelllinien mit unterschiedlichen Graden an Hormonabhängigkeit stehen für Untersuchungen zur Verfügung; und schließlich wird in der Literatur immer häufiger die Bedeutung des Insulin-/IGF-Wegs bei der Steuerung des Wachstums von Brustgewebezellen betont; was anzeigt, dass diese Regulation in malignen Brustkarzinomen umgangen wird (14, 15). Da PC-Zellen, die eine übermäßige Expression von GP88 aufweisen, insulin-/IGF-unabhängig sind, würde dies die Annahme einer Deregulation von GP88 in menschlichem Brustkarzinom, stützen.
Wir haben die Höhe der Expression von GP88-mRNA in drei gut untersuchten menschlichen Brustkarzinomzelllinien untersucht, und zwar MCF-7, die östrogenrezeptorpositiv (ER+) ist, und zwei Zelllinien, MDA-MB-453 und 468, die östrogenrezeptornegativ (ER–) sind. MDA-MB-468 wurde weiter durch einen Defekt bei der Signalisierung von Insulin und des insulinartigen Wachstumsfaktors charakterisiert (53). 5 zeigt, dass GP88-mRNA in den drei Zelllinien exprimiert wird, dass aber die Höhe der Expression in den östrogenrezeptornegativen Zelllinien, MDA-MB-453 und 468, über dem Wert der östrogenrezeptorpositiven MCF7-Zellen liegt; ein Hinweis darauf, dass eine erhöhte Bösartigkeit bei menschlichem Brustkarzinom möglicherweise mit einer erhöhten GP88-Expression einhergeht.
(b) Biologische Aktivität von GP88 in Mamma-Enithelzellen
Wir haben die Auswirkungen von GP88 auf die Vermehrung verschiedener Zelllinien untersucht, darunter Fibroblaste und Brustgewebeepithelzellen. Wir fanden heraus, dass GP88 einen weitreichenden wachstumsfördernden Effekt auf die murine Brustgewebeepithelzelllinie C57MG hatte. Wie 6 zu entnehmen ist, wurde bei einer Konzentration von 150 ng/ml (2 nM) entweder mit GP88, der aus PC-Zellen aufgereinigt worden war, oder mit rekombinantem, in Insektenzellen exprimiertem GP88 eine Verfünftachung der DNA-Synthese beobachtet.
Die Fähigkeit von GP88, das aus PC-Zellen aufgereinigt worden war (obere Spalte), und rekombinantem GP88, rGP88 (untere Spalte), die DNA-Synthese in C57MG-Zellen zu stimulieren, wurde durch Einbau von ³H-Thymidin in ruhenden Zellen, die unter Serummangel litten, gemessen. Interessanterweise gibt es Berichte, dass das 6-kDa-Epithelin 2 (epi 2) im Gegensatz zu der wachstumsfördernden Wirkung auf Brust-Epithelzellen als Wachstumshemmer wirkt, zumindest für MDA-MB-468-Zellen, wenn es in Konzentrationen von bis zu 100 nM (54) hinzugefügt wird. Diese Daten deuten darauf hin, dass der Vorläufer, d. h. GP88, und die umgewandelte Form, d. h. epi 2, entgegengesetzte Effekte auf das Wachstum von Brustgewebeepithelzellen haben.
BEISPIEL 5
Klonen von GP88-cDNA
GP88-Protein, das aus einem konditionierten PC-Zellen-Medium aufgereinigt wurde, wurde nach Verdau mit Bromzyan und Trypsin sequenziert. Sequenzen von N-terminalen Regionen und 6 Peptiden wurden gewonnen. Redundante, zu den gewonnenen Aminosäuresequenzen komplementäre sense- und antisense-Oligonukleotidprimer wurden synthetisiert und in der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) eingesetzt. Dabei wurde nach der „touchdown"-PCR-Methode vorgegangen, wobei die Erststrang-cDNA von PC-Zellen als Matrize diente. Aus der „touchdown"-PCR unter Verwendung des Primärpaares SCV157 und ANG300 wurde ein amplifiziertes Produkt mit 444 bp gewonnen. Diese cDNA wurde dann dazu benutzt, eine Lambda-ZAP-cDNA-Bank, die aus PC-Zellen in unserem Labor präpariert worden war, einem Screening zu unterziehen. Eine Million nicht amplifizierter Plaques wurden mittels Plaque-Hybridisierung einem Screening mit einem mittels PCR erzeugten cDNA-Fragment, das mittels PCR mit ³²P markiert worden war, unterzogen. Positive Klone wurden mit Hilfe von 3 zusätzlichen Durchgängen der Aufreinigung mittels Plaques isoliert. Ein Klon der GP88-cDNA in voller Länge wurde gewonnen und sequenziert. In voller Länge war die cDNA 2137 Nukleotide lang, wobei sich das erste ATG bei 23 bp vom 5'-Ende aus befand sowie ein offenes Leseraster (ORF) mit einer Länge von 1770 Nukleotiden und eine nicht übersetzte 3'-Region mit einem Poly-A-Schwanz an Position 2127 vorhanden war. Die Sequenz war mit dem veröffentlichten Maus-Granulin identisch (5), mit Ausnahme eines Nukleotids (T anstelle von G) an Position 1071 der GP88-cDNA (Position 1056 des Maus-Granulins). Dies führte zu einem Wechsel der Aminosäure von Arginin zu Leucin und zu einem Nukleotidersatz an Position 1483 ohne Wechsel der Aminosäure (8). Diese Untersuchung zeigte, dass GP88 dem Epithelin-/Granulin-Vorläufer ähnlich ist, und lieferte cDNA, um unsere Untersuchung der GP88-Expression weiter zu verfolgen.
BEISPIEL 6
Expression von muriner GP88-cDNA in Baculovirus
Für die Produktion von rekombinantem GP88 bestand die Methode der Wahl in einer Expression von GP88 im Baculovirus-System. Eine GP88-cDNA in voller Länge (die durch Screening einer PC-Zellen-cDNA-Bank gewonnen wurde), einschließlich des Signalpeptids, wurde in den Baculovirus-Transfervektor pVL1392 (in Vitrogen, San Diego, CA) ligiert. Plasmid-pVL1392-GP88 wurde für eine Cotransfektion von Sf9-Insektenzellen mit Baculovirus-DNA verwendet. Rekombinante Viren, die GP88 codierten, wurden isoliert und über Plaques gereinigt. Zur Infektion und Produktion von rekombinantem GP88 wurde Grace-Medium, das 10% fötales Rinderserum (FBS) enthielt, in T75 cm²-Kolben mit Sf9-Zellen geimpft. Nach Infektion mit rekombinantem Baculovirus-GP88 wurden die Insektenzellen 48 Stunden lang bei 27°C in Grace-Medium belassen. Das konditionierte Medium wurde durch Zentrifugieren abgetrennt und der rekombinante GP88 (rGP88) wurde in einem zweistufigen Reinigungsvorgang, bestehend aus Heparin-Sepharose und Immun-Affinitätschromatographie, wie in Beispiel 6 beschrieben wird, gereinigt. Eine Analyse des rGP88 mittels SDS-PAGE zeigte, dass rGP88 schneller wandert als GP88, das aus PC-Zellen stammt und einem apparenten MW von 76 kDa entspricht. Eine N-terminale Sequenzanalyse des rGP88 zeigte, dass es mit aus PC-Zellmedium aufgereinigtem GP88 identisch war. Der Unterschied beim Molekulargewicht zwischen GP88 und rGP88 geht auf einen Unterschied im Glycosylierungszustand von GP88 in Insektenzellen zurück. Wie in 6 gezeigt, war die biologische Aktivität von rGP88 mit der von GP88 identisch, der aus PC-Zellen aufgereinigt worden war, was anzeigt, dass der unterschiedliche Glycosylierungsstatus von GP88 in Insektenzellen und Säugetierzellen keine Auswirkungen auf die biologische Wirksamkeit des Proteins hatte.
Der aus Insektenzellen produzierte rGP88 kann für biologische Untersuchungen und Bindungsstadien verwendet werden und um monoklonale Antikörper gegen den intakten GP88 zu entwickeln.
BEISPIEL 7
Reinigung von GP88 und rekombinantem GP88 durch Affinitätschromatographie
Das konditionierte Medium (2000 ml) aus PC-Zellen wurde mit derselben Menge H₂O verdünnt und damit eine 2,5 ml CL-6B-Heparin-Sepharose-Säule, die mit 10 mM Natriumphosphatpuffer, der 75 mM NaCl enthielt, (Pharmacia, Uppsala, Schweden) auf einen pH 7,4 äquilibriert, beladen. Die Säule wurde mit mindestens 10 Bettvolumen desselben Äquilibrierungspuffers gewaschen, woran sich ein Waschen mit 10 mM Natriumphosphatpuffer, die 0,15 M NaCl enthielt, anschloss. Die GP88-haltige Fraktion wurde mit 5 Bettvolumen 0,4 M NaCl, 10 mM Tris-HCl, pH-Wert 7,5, eluiert. Das Eluat wurde bei –20°C zur weiteren Reinigung gelagert. Ein synthetisches K19T-Peptid (Sequenz: KKVIAPRRLPDPQILKSDT) wurde verwendet, damit sich die Antiseren gegen den GP88 bildeten, der in der Immunaffinitätsphase verwendet wurde. Das K19T-Peptid wurde gemäß der vom Hersteller (Pharmacia, Uppsala, Schweden) vorgegebenen Verfahren an CNBr-aktivierte Sepharose 4B gekoppelt. Der spezifische anti-K19-Antikörper wurde unter Verwendung der K19T-Peptid-Affinitätssäule mittels Elution bei einem sauren pH-Wert aufgereinigt. Genauer gesagt wurde anti-K19T-IgG mit einer Durchflussrate von 0,8 ml/Std. auf eine Peptid-Sepharose 4B-Säule, die mit 10 mM Natriumphosphat, pH 6,5 (Puffer A), äquilibriert wurde, gegeben und über Nacht bei 4°C umgewälzt. Nach Waschen der Säule mit 7 ml des Puffers A wurde das Konjugat mit 1 ml HCl, pH 2,9, und dann mit 1 ml HCl, pH-Wert 2,5, mit einer Durchflussrate von etwa 0,1 ml/Min. in einem Röhrchen eluiert, das 0 1 ml 1 M Natriumphosphatpuffer, pH-Wert 7,0, enthielt, um den pH-Gehalt zu neutralisieren. Die Konzentration des affinitätsgereinigten IgG wurde Absorption bei 280 nm bestimmt.
Der aufgereinigte Ab-K19T (1 mg) wurde an 1 ml Agarosekügelchen (Sulfolink Kopplungsgel, Pierce, Rockford, IL) gemäß Herstellervorschrift konjugiert. Nach Abschluss der Kopplung enthielt die Säule 600 μg anti-K19T/ml Gel. Die Ab-K19T-Agarose wurde in eine Säule gepackt und ausgiebig mit PBS gewaschen. Das Eluat aus der Heparin-Sepharose-CL-6B-Säule wurde mit 3 Volumina H₂O verdünnt und damit die Ab-K19T-Säule beladen. Nach Waschen der Säule mit Puffer bestehend aus 750 mM NaCl in 10 mM NaPO₄, pH-Wert 7,5, wurde die GP88-haltige Fraktion mit Elutionspufter (150 mM NaCl mit einem pH-Wert von 2,5 (HCl)) eluiert. Zur Neutralisierung wurde dem Eluat 1/10 Volumen (v/v) 1 M Natriumphosphat, pH-Wert 6,5, zugegeben, und die Proteinkonzentration wurde mittels Aminosäureanalyse oder micro-BCA-Kit (Bio-Rad, Richmond, CA) bestimmt. Im Allgemeinen wurden 50 μg GP88 aus einer 350 μl-Säule aufgereinigt.
Dieses Verfahren eignet sich auch für die Aufreinigung von rekombinantem GP88, der beispielsweise in einem Baculovirus-Expressionsvektor eingebaut und in Insektenzellen exprimiert wird. Dieses Verfahren ist außerdem für eine Aufreinigung von menschlichem GP88 geeignet, der in der Immunaffinitätsphase von menschlichem GP88-Antikörper, der mit einem adäquaten Träger (Sepharose oder Agarose) konjugiert ist, verwendet wird.
BEISPIEL 8
Entwicklung eines neutralisierenden Antikörpers für GP88
Peptide, die verschiedenen Regionen von murinem und menschlichem GP88 entsprechen, wurden synthetisiert und mittels der „Glutaraldehydmethode" mit „keyhole limpet"-Hämocyanin (KLH) konjugiert. Das Konjugat aus Peptid und KLH wurde Chinchillakaninchen injiziert, damit sich ein anti-GP88-Antikörper bildet. Es stellte sich heraus, dass zwei Peptide, K19T und S14R, siehe unten, neutralisierende Antikörper hervorriefen. Äquivalente Regionen wie E19V der humanen GP88-Aminosäuresequenzen wurden verwendet um neutralisierende monoklonale anti-human-GP88-Antikörper zu entwickeln.

Es handelte sich um folgende Peptide:

P12T von P₂₀₈ bis T₂₁₉	PDAKTQCPDDST
K19T von K₃₄₄ bis T₃₆₂	KKVIAPRRLPDPQILKSDT
S14R von S₅₆₂ bis R₅₇₅	SARGTKCLRKKIPR
E19V (humanes GP88)	EKAPAHLSLPDPQALKRDV
A14R (humanes GP88)	ARRGTKCLRREAPR

Die Antiseren hatten folgende Eigenschaften:

(1) Anti-K19T-, anti-S14R- und anti-E19V-Antikörper erkennen ein GP88 mit einem Molekulargewicht von 88 kDa in einem konditionierten Zellmedium in Kultur, in Zelllysaten und in Gewebsextrakten. Die Verteilung der Expression des GP88-Proteins im Gewebe zeigt, dass seine Expression weit verbreitet ist und dass die meisten Gewebe den nicht umgewandelten Vorläufer, d. h. GP88, nicht jedoch umgewandelte 6-kDa-Formen, d. h. epi 1 und 2, exprimieren. GP88 findet sich in Serum (Mausserum enthält etwa 150 ng (pro ml] GP88 mit einem Molekulargewicht von 88 kDa) und wird in adipösem Gewebe, im Gehirn (wobei das Molekulargewicht zwischen 45 und 88 kDa schwankt), in den Hoden, den Eierstöcken, der Leber und in der Niere exprimiert.
(2) Der anti-K19T-Antikörper ist ein neutralisierender Antikörper. Der anti-K19T-Antikörper neutralisiert die biologische Wirkung von GP88, der von PC-Zellen abgeschieden wird und für ihr Wachstum erforderlich ist (2). Die Zugabe von anti-K19T-IgG in Kulturmedium von PC-Zellen führt zu einer dosisabhängigen Hemmung des Wachstums der PC-Zellen. Nicht immunes IgG zeigte keine Auswirkungen. Eine Hemmung der Vermehrung von Zellen, die GP88 exprimieren, wurde auch durch den Einsatz eines monoklonalen K19T-Antikörpers für PC-Zellen, Rattenleukämiezelllinien und durch den Einsatz eines monoklonalen E19V-Antikörpers zur Neutralisierung von menschlichem GP88 in menschlichen Brustkarzinomen erreicht. Das zeigt, dass die E19V-Region beim menschlichen GP88 (und die K19T-Region beim murinen GP88) eine Region mit großer biologischer Bedeutung ist und dass man durch jeden Antikörper gegen diese Region einen neutralisierenden Antikörper erhält, der zur Behandlung von Krankheiten wegen erhöhter GP88-Expression oder erhöhter Reaktionsfähigkeit auf GP88 eingesetzt werden kann. Das gleiche gilt für die S14R-Region des murinen GP88 und für die A14R-Region des menschlichen GP88.
(3) Der monoklonale anti-E19V-Antikörper ist ein neutralisierender Antikörper. Wir haben gezeigt, dass der E19V-Antikörper in einer Dosis von 100 μg/ml das Wachstum der Zelllinie MCF7 des menschlichen Brustkarzinoms um 50% hemmt, wenn ein Test zum ³H-Thymidin-Einbau, entsprechend der oben beschriebenen PC-Zellen, verwendet wird.

BEISPIEL 9
Wachstumseigenschaften und tumorgene Eigenschaften von Zellen, die mit einem Expressionsvektor transfiziert worden sind, der GP88-cDNA in Antisenseorientierung enthält.
Die oben genannten Beispiele zeigen, dass GP88 in der hoch tumorgenen PC-Zelllinie überexprimiert wird. Da die Kultivierung von PC-Zellen in Gegenwart eines neutralisierenden anti-GP88-Antikörpers zu einer Hemmung des Wachstums geführt hatte, zeigte dies, dass GP88 für das Wachstum von PC-Zellen erforderlich ist. Um zu testen, ob Überexpression von GP88 für die hoch tumorgenen Eigenschaften der PC-Zellen in vivo verantwortlich ist, haben wir die Wachstumseigenschaften und die tumorgenen Fähigkeiten von PC-Zellen untersucht, die mit einem Expressionsvektor transfiziert waren, der durch den Promotor für den Zytomegalie-Virus kontrolliert wurde und GP88-cDNA in antisense-Orientierung enthielt, um eine hohe Transkription von antisense-RNA zu erreichen. Als Kontrolle benutzten wir PC-Zellen, die mit dem leeren Vektor transfiziert waren.
Ein 228 bp-Fragment der GP88-cDNA wurde in antisense-Orientierung in dem pCMV4-Expressionsvektor kloniert (Andersson, S., et al., 1989) (51), der einen CMV-Promotor und hGH-Transkriptionsterminations- und Polyadenylierungssignale (pCMV4-GP88AS) enthielt. PC-Zellen wurden mit Hilfe der Calciumphosphatmethode mit den 20 μg antisense-pCMV4-GP88AS und dem 2 μg pRSVneo-Expressionsvektor, der das gegen Neomycin resistente Gen enthält, cotransfiziert. Kontrollzellen wurden wie vorstehend beschrieben mit dem leeren pCMV4-Vektor und pRSVneo cotransfiziert. Die transfizierten Zellen wurden in Gegenwart von Neomycin selektiert. Gegen Neomycin resistente Kolonien wurden kloniert, und die Zellen wurden zunächst einem Assay unterzogen, indem die Gegenwart von pCMV4-GP88AS mittels PCR festgestellt wurde. Vierundzwanzig positive, gegen Neomycin resistente Klone, die das antisense-pCMV4-GP88AS enthielten, wurden isoliert. Neun wurden isoliert und auf Expression des antisense-Transkripts hin durchgesehen. Drei Klone wurden weitergehend charakterisiert. Eine Westernblotanalyse der Zelllysate und des konditionierten Mediums mittels anti-GP88-Antiserum (d. h. anti-K19T-Antikörper) wurde durchgeführt, um die Höhe der GP88-Expression in den transfizierten antisense-Zellen und den Kontrollzellen zu bestimmen (7). Das Kulturmedium und die Zelllysate wurden mittels Immunpräzipitation mit einem anti-K19T-Antikörper präpariert. Proteinproben, die 3 × 10⁶ Zellen/Bahn entsprachen, wurden einer Westernblotanalyse mittels anti-GP88-Antikörper unterzogen. Die Ergebnisse weisen darauf hin, das die GP88-Gehalte in den transfizierten antisense-Zellen wesentlich geringer waren als in den transfizierten Kontrollzellen, insbesondere bei den AS1- und AS18-Klonen.
Stabile Transfektion von antisense-GP88-cDNA in PC-Zellen
PC-Zellen wurden mit einem 228 bp-antisense-cDNA-Fragment des GP88 einschließlich der Startcodonregion transfiziert, das durch Verdau des GP88-cDNA-Klons mit Sma I und Xba I und Klonierung des gewonnenen cDNA-Fragments in antisense-Orientierung an den Ort Xba I und Sma I des Säugetier-Expressionsvektors pCMV4 gewonnen wurde, wie in 11 dargestellt ist. Die stabile Transfektion der PC-Zellen erfolgte mit Hilfe der Calciumphosphat-Methode (55) in DME-Medium (Dulbecco's modifiziertes Eagle-Medium), das 3,7 g/L Natriumhydrogencarbonat enthielt und mit 10% FBS versetzt war. 2–4 Stunden vor der Transfektion erfolgte eine Calciumphosphatfällung mit 20 μg Plasmid-pCMV4, das mit antisense-GP88-cDNA konstruiert war, 2 μg selektierbarem Plasmid tragendem Neomycin-Resistenzmarker (pRSVNEO) und 20 μg pSK als Träger-DNA. Nach 25 Minuten wurde das Präzipitat tropfenweise den Zellen hinzugefügt. Nach 7 Stunden wurde das Medium abgesaugt, und die Zellen wurden 2 bis 3 Min. lang einem Schock mit 10% DMSO in PBS ausgesetzt, zweimal gewaschen und danach mit Vollmedium (DME, dem 10% FBS zugesetzt war) versorgt. Einen Tag nach der Transfektion wurden die Zellen im Verhältnis 1 : 3 geteilt und entsprechend ihrer Resistenz gegen 400 μg/ml Geneticin (G-418-Sulfat, Gibco-BRL) selektiert. Das Medium wurde 2 Tage später ausgetauscht, um tote Zellen zu entfernen, und danach alle 3–4 Tage. 10–14 Tage nach der Aufteilung 1 : 3 wurden die Kolonien mit einem Klonierungsring abgeimpft, in eine 48-Well-Platte und dann nacheinander in eine 24-Well-Platte, 12-Well-Platte und eine 60-mm-Schale übertragen. Die Transfektanten wurden analysiert oder eingefroren. Mit Hilfe einer Cotransfektion des leeren pCMV4-Vektors und des pRSVNEO wurden die Kontrolltransfektanten mit leerem Vektor hergestellt.
Nachdem die transfizierten Klone entsprechend ihrer Fähigkeit, in Gegenwart von Geneticin zu wachsen, selektiert worden waren, wurden sie in zwei Assays analysiert, wie nachfolgend beschrieben wird:
Die Gegenwart des antisense-cDNA-Konstrukts wird mittels PCR-Analyse der genomischen DNA transfizierter Klone bestimmt, wobei ein Oligonukleotid, das sich im CMV-Promotor befindet (5'-CCTACTTGGCAGTACATCTACGTA-3'), und ein Oligonukleotid, das dem Startcodon der GP88-cDNA entspricht (5'-CGAGAATTCAGGCAGACCATGTGGGTC-3'), als Primer verwendet werden. Diese Primer würden ein 551 bp-DNA-Fragment genomischer DNA von transfizierten Zellen amplifizieren, die das oben beschriebene antisense-DNA-Konstrukt enthielten.
Dann wurde der Gehalt an GP88-Protein in antisense-transfizierten Klonen mittels Westernblotanalyse von Zelllysaten und konditionierten Medien bestimmt, die aus den transfizierten Klonen entnommen worden waren. Dabei kam der anti-K19T-Antikörper zum Einsatz, um die Effizienz zu bestimmen, mit der die endogene Expression von GP88-Protein durch den antisense-GP88 gehemmt wurde. Antisense-Klone, die die größte Hemmung von GP88-Expression aufwiesen, wurden zur Analyse ihrer Wachstumseigenschaften in vivo selektiert, wie unten beschrieben wird. Gleichzeitig erfolgte eine Analyse der GP88-Expression in Klonen, die mit dem leeren Vektor als Kontrolle transfiziert waren.
Es folgt eine detaillierte Beschreibung der Verfahren, die bei diesen verschiedenen Assays angewandt wurden.
PCR-Selektion der Transfektanten
Die Gegenwart des antisense-Konstrukts in den transfizierten Zellen wurde mittels PCR-Analyse ihrer genomischen DNA bestimmt, wobei SP647 (5'-CCTACTTGGCAGTACATCTACGTA-3'), der der CMV-Promotorregion entspricht, als sense-Primer und SP7 (5'-CGAGAATTCAGGCAGACCATGTGGGTC-3'), der der Startcodonregion von GP88 entspricht, als antisense-Primer verwendet wurden. Der sense-Primer SP647 und der antisense-Primer AP912 (5'-CTGACGGTTCACTAAACGAGCTC-3'), die sich beide im CMV4-Promotor finden, wurden zur Feststellung genutzt, ob der CMV-Promotor in die genomische DNA von Kontroll-Transfektanten, die mit dem leeren pCMV4-Vektor transfiziert worden waren, eingeschleust wurden.
Zur Extraktion genomischer DNA für die PCR-Analyse wurden die Transfektanten mittels Puffer A (100 mM KCl, 10 mM Tris-HCl [pH 8,3], 0,45% Tween 20 and 0,45% NP40) und 120 μg/ml Proteinase K lysiert, 1 Std. lang bei 60°C inkubiert und dann 15 Minuten lang gekocht. 50–100 ng DNA von jedem Klon wurden als Matrize für die PCR-Reaktion verwendet. Nicht transfizierte PC-Zellen wurden zur Negativkontrolle genutzt. Konstruierte Plasmid-DNA wurde zur Positivkontrolle genutzt.
Die PCR-Reaktion erfolgte in 20 μl Reaktionsmischung, die sich aus 10 mM Tris-HCl, pH 9,0, 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl₂, 0,1% Triton X-100, 0,2 mM dNTPs, 0,5 Einheiten Taq DNA Polymerase, 3,2 pMol von jedem Primer und 50–100 ng der Matrizen-DNA zusammensetzte. Die Reaktionsröhrchen wurden 3 Minuten lang auf 95°C erhitzt und dann in einem programmierbaren Themperiergerät für 40 Zyklen je 1 Minute lang bei 94°C, 2 Minuten lang bei 55°C und 3 Minuten lang bei 72°C mit einer 10-minütigen Verlängerung bei 72°C unterzogen. Die Produkte wurden auf einem 1%-Agarosegel analysiert, das mit Ethidiumbromid gefärbt war. Die erwartete Größe des amplifizierten Fragments, das der Gegenwart des antisense-Konstrukts entsprach, betrug bei den gewählten Primern 551 bp.
Messung der Expression von GP88-Protein in transfizierten antisense-Klonen und in Kontrollklonen
Die Funktion der Transfektion von antisense-GP88-DNA in den Zellen ist die Hemmung der endogenen GP88-Expression. Daher wurden die transfizierten Klone von Zellen, die durch die oben beschriebenen Assays selektiert worden waren (d. h. Resistenz gegen Neomicin und Vorhandensein von antisense-DNA in der genomischen DNA), untersucht, um den Grad der Hemmung der endogenen GP88-Expression zu bestimmen. Zur Untersuchung wurde der Gehalt an GP88 in Zelllysaten und in konditioniertem Medium von Klonen, die mit dem antisense-Vektor transfiziert waren, und von Kontrollklonen, die mit dem leeren Vektor transfiziert waren, mittels Immunpräzipitation und Westernblotanalyse unter Verwendung des anti-K19T-Antikörpers mit den bereits beschriebenen Verfahren gemessen. Die transfizierten Klone, die den größten Grad an Hemmung der GP88-Expression aufwiesen, wurden weiter analysiert, um ihre Wachstumseigenschaften in vitro und in vivo zu untersuchen.
Zellwachstumsassay
Zellen wurden in einer Dichte von 3 × 10⁴ Zellen/Well (12-Well-Platten, Corning) in 2 ml DME/F-12-Medium (Mischungsverhältnis 1 : 1), dem 2% FBS oder 2 μg/ml menschliches Fibronektin und 10 μg/ml menschliches Transferrin zugesetzt worden war, ausgesät. Fünf Tage später wurden die Zellen mit PBS gewaschen, und die Zellenzahl je Well wurde durch Zählung der Zellen aus Well-Doppeln mit Hilfe eines Coulter-Zählgeräts nach Trypsinisierung bestimmt.
Die Ergebnisse zeigten, dass die mit antisense-GP88 transfizierten PC-Klone ein langsameres Wachstum aufwiesen, wenn sie sowohl in serumhaltigem Medium als auch in definiertem Medium (2F-Medium) kultiviert wurden, als die mit dem leeren Vektor transfizierten Kontroll-PC-Zellen, die unter gleichartigen Bedingungen kultiviert wurden. Diese Ergebnisse stimmen mit der Tatsache überein, dass die PC-Zellen zur Vermehrung GP88 benötigen. Da dessen Expression durch die antisense-Konstrukte gehemmt wird, führt dies zu einer Hemmung des Wachstums der mit antisense-Konstrukten transfizierten Zellen.
Tumorgenitätassay
Für die Assays der Tumorgenität wurden sechs Wochen alte weibliche C3H-Mäuse verwendet. Sense-/antisense- oder Kontroll-Transfektanten wurden syngenen C3H-Mäusen subkutan in einer Dichte von 10⁶ Zellen pro Tier injiziert. Auftreten und Größe von Tumoren wurden untersucht. Die Mäuse wurden 45–50 Tage nach der Injektion getötet. Die Tumore wurden herausgeschnitten, ihr Gewicht festgestellt, und dann wurden die Tumore rasch eingefroren und bei –70°C aufbewahrt.
In vivo-Studien zur Tumorgenität wurden mittels subkutaner Injektion von 10⁶ antisense- und Kontrollzellen (mit dem leeren Vektor transfizierte Zellen oder nicht transfizierte PC-Zellen) in syngene weibliche C3H-Mäuse durchgeführt. Die Mäuse wurden täglich auf das Auftreten von Tumoren hin untersucht, wobei der Zeitpunkt des Tumorauftretens und die Größe des Tumors vermerkt wurde. Nach 50 Tagen wurden die Mäuse getötet, und Blut wurde durch Herzpunktion entnommen. Die Tumore wurden herausgeschnitten, gewogen und entweder zur pathologischen Untersuchung fixiert oder rasch in Flüssigstickstoff eingefroren. Andere Organe der Mäuse wurden ebenfalls entnommen und untersucht.
Die antisense-Klone und Kontrollklone wurden auf ihre Tumorgenität hin untersucht und mit den Wildtyp-PC-Zellen verglichen. Tabelle 1 weiter oben zeigt die Ergebnisse, die bei einer solchen erzielt wurden. 3 zeigt das Bild einer Tumor befallenen Maus, bei der der Tumor mit 10⁶ transfizierten Kontrollzellen nachgewiesen wurde, und einer Maus, der der antisense-Klon injiziert wurde. Die mit dem leeren Vektor als Kontrolle transfizierten Klone behielten ähnliche tumorgene Eigenschaften wie die PC-Elternzellen, wohingegen bei den Mäusen, denen antisense-Klone injiziert worden waren, keine Tumorbildung beobachtet wurde. Selbst nach 90 Tagen wiesen diese Mäuse immer noch keine Tumore auf. Dieses Experiment wurde zweimal wiederholt. Darüber hinaus wurden noch zusätzliche Klone (2 antisense-Klone und 2 Kontrollklone) untersucht. Gleiche Ergebnisse wurden mit anderen antisense-Klonen erzielt.
Antisense-cDNA für menschlichen GP88
Der oben beschriebenen Ansatz für eine stabile Transfektion von antisense-GP88-cDNA in PC-Zellen wurde auch für die Hemmung der GP88-Expression in menschlichen Brustkarzinomzelllinien verfolgt.
In diesem Fall bestand das menschliche antisense-cDNA-Konstrukt aus einem 400 bp-cDNA-Fragment, das in antisense-Orientierung in den kommerziell erhältlichen Säugetier-Expressionsvektor pcDNA3 (In Vitrogen, San Diego, CA) eingeschleust wurde, der den CMV-Promotor für den Zytomegalie-Virus pCMV4 und das gegen Neomycin resistente Gen enthält, so dass eine doppelte Transfektion von pCMV4 und pRSVneo, wie es oben für PC-Zellen beschrieben wurde, nicht erforderlich ist.
Zur Erzeugung des antisense-cDNA-Fragments wurden folgende Primärpaare mit den entsprechenden Restriktionsenzymstellen synthetisiert und in der PCR-Reaktion verwendet:
A-hGP88: 5'-A1000ATCCACGGAGTTGTTACCTGATC-3' (Position nt: 362– 344)
H-hGP88: 5'-A10GAATT000AGGCAGACCATGTGGAC-3' (Position nt: –12 bis +8)
Das amplifizierte cDNA-Fragment mit den Restriktionsstellen EcoRI und BamHI wurde in antisense-Orientierung an die Stellen EcoRI und BamHI des Säugetier-Expressionsvektors pcDNA3 eingebaut. Dieses Expressionsvektorkonstrukt mit der Bezeichnung pCAS wurde in DME-F12-Medium, das mit fötalem Rinderserum versetzt war, mittels der Calciumphosphatmethode (55) in die menschliche Mammakarzinom-Zelllinie MCF7 und MDA-MB-468 transfiziert. Die Selektion der transfizierten Zellen erfolgte durch Kultivierung der Zellen in Gegenwart von 800 μg/ml Geneticin, um Zellen zu selektieren, die gegen Neomicin resistent sind. Gegen Neomicin resistente Klone wurden mit Hilfe von Klonierungsringen abgeimpft und in ein Medium übertragen, dem 10% fötales Rinderserum (FBS) und Geneticin (800 μg/ml) zugegeben worden waren. Transfizierte Klone, die wegen ihrer Resistenz gegen Geneticin selektiert worden waren, wurden mit Hilfe von ähnlichen Methoden wie diejenigen, die oben für PC-Zellen beschrieben wurden, die mit muriner GP88 antisense-cDNA transfiziert waren, weiter untersucht. Das Vorhandensein des antisense-cDNA-Konstrukts in genomischer DNA wurde mittels PCR-Analyse geprüft, wobei der Primer T7 im Expressionsvektor pCDNA3 und der oben beschriebene Primer H-hGP88 als Primer für die PCR-Reaktion verwendet wurden. Durch die PCR-Reaktion wurde ein 420 bp-DNA-Fragment in Zellen amplifiziert, die das transfizierte menschliche GP88-antisense-DNA-Fragment exprimierten.
Die Expression von endogenem GP88 wurde durch Westernblotanalyse von Zelllysaten und von konditioniertem Medium transfizierter Klone bestimmt, wobei anti-E19V-Antiserum zur Selektion von antisense-Klonen verwendet wurde, die eine maximale Hemmung der GP88-Expression aufwiesen. Selektierte antisense-Klone wurden weiter analysiert, um ihre Wachstumseigenschaften in vitro und in vivo zu untersuchen. Als Kontrolle für diese Experimente wurde eine Transfektion des leeren pCDNA3-Vektors in MCF7-Zellen und MDA-MB-468-Zellen durchgeführt.
Ein Alternativverfahren zur Transfektion von antisense-cDNA ist die Verwendung von antisense-Oligonukleotiden. Aus dem Stand der Technik ist bekannt, dass Sequenzen rund um die Initiationsstelle für die Translation (wobei ATG das erste Methionin codiert) gut geeignete Sequenzen für eine wirksame antisense-Aktivität bieten. Zweitens steigern Sequenzen, die über einen geeigneten GC-Gehalt verfügen und entweder mit einem G oder einem C beginnen, die Wirksamkeit und Stabilität bei der Bildung eines Hybrids mit entsprechender sense-Sequenz (32, 37, 38). Auf der Grundlage dieser Annahme wird erwartet, dass die folgenden zwei Sequenzen als antisense-Oligonukleotide für menschlichen GP88 wirksam sein werden. Bei der ersten handelt es sich um ein 22-mer namens HGPAS1, das 11 Nukleotide stromaufwärts des ersten ATG (Methionincodon) beginnt: HGPAS1 (22): 5'-GGGTCCACATGGTCTGCCTGC-3'. Bei dem zweiten Oligomer handelt es sich um ein 24-mer namens HGPAS2 (24), das sich 21 Nukleotide 3' (stromabwärts) des ersten ATG befindet: HGPAS2 (24): 5'-GCCACCAGCCCTGCTGTTAAGGCC-3'. Andere antisense-Sequenzen von Oligonukleotiden können von Personen mit üblichen Fachkenntnissen, denen die vorliegenden Lehren zur Verfügung stehen, erforscht werden. Um die Wirksamkeit einer Sequenz bei der Hemmung der GP88-Expression zu beurteilen, werden Oligonukleotide in steigender Dosis Brustkarzinomzellen in Kultur oder anderen menschlichen Zelltypen, die Gegenstand von Untersuchungen sind, hinzugefügt. Die Zellen werden zu unterschiedlichen Zeitpunkten (12 Stunden bis mehrere Tage) entnommen, um die Höhe der Expression von GP88-Protein mittels Westernblotanalyse oder EIA unter Verwendung eines anti-human-GP88-Antikörpers mit Hilfe von Techniken zu bestimmen, die Personen mit üblichen Fachkenntnissen bekannt sind. Kontrollzellen werden mit einem nonsense- oder sense-Oligomer behandelt.
BEISPIEL 10
Hemmung des Tumorwachstums beim Menschen
Dieses Beispiel stellt Folgendes bereit:

1. Vergleich der Expression von GP88-mRNA und GP88-Protein in den nicht tumorgenen Brustgewebeepithelzellen MCF10A und in malignen MCF7-Zellen und MDA-MB-468-Zellen.
2. Wachstum der malignen MCF7-Zellen und MDA-MB-468-Zellen in Gegenwart eines neutralisierenden anti-human-GP88-Antikörpers (monoklonaler Antihuman-E19V-Antikörper) führt zur Hemmung der Zellproliferation.
3. In vitro-Proliferation und in vivo-Tumorgenität menschlicher Brustkarzinomzellen werden durch die Hemmung der GP88-Expression durch antisense-GP88-DNA gehemmt.

Vergleich der GP88-Expression in nicht tumorgenen menschlichen Brustgewebeepithelzellen und in tumorgenen Brustkarzinomzelllinien
Wir haben die Expression von GP88-mRNA und GP88-Protein in drei menschlichen Brustzelllinien untersucht: Zelllinie MCF10A, bei der es sich um eine nicht tumorgene menschliche Brustgewebeepithelzelllinie handelt, und zwei menschliche Brustkarzinomzelllinien, MCF7, die östrogenrezeptorpositiv ist, und MDA-MB-468, die östrogenrezeptornegativ ist.
Die Expression der GP88-mRNA-Expression erfolgte mittels Northernblotanalyse der gesamten, aus diesen Zellen extrahierten RNA mit Hilfe einer radioaktiv markierten human-GP88-cDNA-Sonde.
Die Messung der Expression des GP88-Proteins erfolgte mittels Westernblotanalyse von GP88, das durch Immunpräzipitation gewonnen wurde, entweder unter Verwendung eines polyklonalen anti-human-GP88-Antikörpers vom Kaninchen oder des monoklonalen anti-human-E19V-Antikörpers. Dieser zweite Antikörper wurde durch Immunisierung von Mäusen mit humanem E19V-Peptid, das wie in Beispiel 8 beschrieben mit Protein konjugiert wurde, entwickelt.
An anti-human-GP88-Antikörpern stehen uns nun zur Verfügung: Ein polyklonaler anti-human-GP88-Antikörper, der in Kaninchen entwickelt wurde, wobei als Antigen ein 37-kDa-Fragment von menschlichem GP88 verwendet wurde, das als Histidin-markiertes Protein in Bakterien exprimiert wurde, und der anti-human-GP88-Antikörper (polyklonal und monoklonal), für dessen Entwicklung E19V-Peptid, das mit „keyhole limpet"-Hämocyanin konjugiert wurde, als Antigen verwendet wurde. Die Entwicklung dieser Antikörper (polyklonal und monoklonal) wird oben beschrieben. Alle diese Antikörper können für die Immunpräzipitation und die Westernblotanalyse von menschlichem GP88 in menschlichen Geweben und menschlichen Zellen verwendet werden.
Die Northernblotanalyse zeigt, dass die Expression der GP88-mRNA in den nicht tumorgenen MCF10A-Zellen sehr gering ist und sich in den menschlichen Brustkarzinomzellen MCF7 und MDA-MB-468 um das mindestens 5- bis 10fache erhöht (14).
Die Ergebnisse der Westernblotanalyse der drei Zelllinien zeigen, dass die Expression von GP88-Protein in Kulturmedium, das aus den nicht tumorgenen MCF10A-Zellen entnommen wurde, nicht nachweisbar ist, wohingegen es in Medien, die mit den MCF7-Zellen und den MDA-MB-468-Zellen konditioniert wurden, 10 bis 20 Mal so hoch ist. GP88-Protein wird nicht nur im Kulturmedium der Brustkarzinomzellen abgeschieden, sondern auch in großen Mengen in Zelllysaten der malignen Zellen exprimiert, wohingegen es in den nicht tumorgenen MCF10A-Zellen nicht nachgewiesen wird.
Diese Daten bestätigen, dass die menschlichen Brustkarzinomzellen GP88 im Vergleich zu nicht tumorgenen menschlichen Brustgewebezellen überexprimieren.
Hemmung des Wachstums der malignen MCF7-Zellen und der MDA-MB-468-Zellen in Gegenwart eines neutralisierenden Antihuman-GP88-Antikörpers (monoklonaler Antihuman-E19V-Antikörper)
Es wurden Experimente durchgeführt, bei denen menschliche Brustkarzinom-MCF7-Zellen mit einem monoklonalen anti-human-GP88-Antikörper (IgG-Fraktion des anti-E19V-Peptids) in unterschiedlichen Dosierungen inkubiert wurden. Die Vermehrung wurde mittels Einbau von [³H] Thymidin in die DNA gemessen. Die Kontrollzellen bestanden aus Zellen, die mit der gleichen Menge von nicht verwandtem murinem IgG inkubiert wurden. Die Ergebnisse zeigen, dass eine Inkubation der MCF7-Zellen mit 25 μg/ml eines monoklonalen anti-GP88-Antikörpers zu einer 50%igen Hemmung des Einbaus von Thymidin führt, wohingegen 100 μg/ml zu einer 80%igen Hemmung der Vermehrung führten. Für MDA-MB-468-Zellen waren die Ergebnisse ähnlich, wie oben angegeben ist. Diese Daten bestätigen erneut, dass (i) der anti-human-E19V-Antikörper das menschliche GP88 neutralisiert, und dass (ii) maligne menschliche Zellen, die in Kulturmedium große Mengen an GP88 abscheiden und GP88 zur Vermehrung benötigen, wirksam durch eine Behandlung mit einem neutralisierenden anti-human-GP88-Antikörper gehemmt werden können, womit gezeigt wird, dass die Hemmung der Wirkung von GP88 auf Tumorzellen eine wirksame Therapie für die Hemmung des Tumorwachstums von Zellen ist, die GP88 überexprimieren.
In vitro-Vermehrung und in vivo-Tumorgenität menschlicher Brustkarzinomzellen werden durch die Hemmung der GP88-Expression durch antisense-GP88-DNA gehemmt
Menschliche MDA-MB-468-Brustkarzinomzellen wurden stabil mit menschlichem antisense-GP88-cDNA-Konstrukt (400 bp-Fragment, das in den Expressionsvektor pCDNA3 eingebaut wurde) transfiziert. Dieses Konstrukt wird in Beispiel 9 beschrieben. Stabile antisense-Klone wurden isoliert und charakterisiert. Insbesondere wurden antisense-Klone aufgrund der Tatsache selektiert, dass die Expression von GP88 wirksam gehemmt wurde. Dies wurde durch Messung der GP88-Expression in antisense-Zellen und Kontrollzellen mit leerem Vektor mittels Westernblotanalyse von Zellextrakten und konditioniertem Medium unter Verwendung eines anti-GP88-Antikörper festgestellt. Mehrere Klone wurden gewonnen und charakterisiert. Ähnliche Ergebnisse wurden mit allen isolierten antisense-Klonen erzielt. Die hier vorgestellten Daten betreffen einen antisense-Klon namens 468AS. Wie 15 zu entnehmen ist, führte die Transfektion der antisense-GP88-cDNA in MDA-MB-468-Zellen (468 AS) im Vergleich zu MDA-MB-468-Kontrollzellen mit leerem Vektor (468 Cont) zu einer Hemmung der Expression von GP88-Protein.
Eine Messung der Proliferationsrate von antisense-GP88-Zellen und Kontrollzellen mit leerem Vektor ergab, dass die antisense-Zellen im Vergleich zu den mit dem leeren Vektor transfizierten Zellen eine 80%ige Hemmung der Zellvermehrung aufwiesen. Unsere Daten mit allen analysierten Klonen zeigten außerdem, dass ein direkter Zusammenhang zwischen dem Ausmaß der Wachstumshemmung und der Rate der Hemmung der GP88-Expression in den antisense-Klonen bestand.
Menschliche antisense-468AS-Brustzellen, die die größte Hemmung der GP88-Expression aufwiesen, und Kontrollzellen mit leerem Vektor (468 Cont) wurden weiblichen Nacktmäusen subkutan im Brustbereich in einer Dichte von 2 × 10³ Zellen/Maus injiziert, wobei 4 Mäuse pro Zelllinie verwendet wurden. Das Tumorauftreten wurde durch visuelle Prüfung der Mäuse beobachtet. Nach 4 Wochen wurden die Mäuse abgetötet, die Tumore wurden herausgeschnitten und gewogen (siehe nachstehende Tabelle 3).
Tabelle 3 Effekt der Hemmung der GP88-Expression durch die Transfektion von antisense-GP88-cDNA auf das Tumorwachstum bei menschlichen Brustkrebszellen MDA-MB-468 bei Nacktmäusen
Die Ergebnisse zeigen, dass die Hemmung der GP88-Expression zu einer 75%igen Hemmung des Tumorwachstums bei menschlichen Brustkarzinomzellen führte.
Dieses Experiment zeigte, dass die Hemmung der GP88-Expression in menschlichen Brustkarzinomzelllinien zu einer Hemmung der Tumorgenität führt.
BEISPIEL 11
Diagnostischer Test auf Tumorgenität
Bei Teratomen und bei Brustkrebs geht der Anstieg der tumorgenen Eigenschaften mit einem Anstieg der GP88-Expression oder einem Anstieg der Reaktionsbereitschaft auf GP88 einher.
Darüber hinaus zeigt 4, dass die Höhe der GP88-Expression in Tumorgewebe im Vergleich zum umgebenden Gewebe zunimmt. Dementsprechend kann der Anstieg des GP88-Gehalts als diagnostischer Ansatz für den Tumornachweis genutzt werden. Bei menschlichen Tumorbiopsien weist eine Veränderung (ein Anstieg) bei der GP88-Expression im Vergleich zum GP88-Gehalt in entsprechenden normalen Geweben auf die Tumorgenität oder Bösartigkeit in der analysierten Gewebsbiopsie hin. Ein Anstieg der Expression von GP88 kann auf der Ebene der mRNA oder auf Proteinebene gemessen werden. Die Expression von GP88-mRNA kann entweder mittels Northernblotanalyse, RNAse Protection Assay oder RT-PCR gemessen werden.
Die Expression von GP88-Protein wird mittels ELISA, EIA oder RIA unter Verwendung eines anti-GP88-Antikörpers quantifiziert.
Die Möglichkeit, die GP88-Expression in Gewebsextrakten im Vergleich zu entsprechendem Gewebe eines normalen Probanden zu messen, kann dazu verwendet werden, den Grad der Tumorgenität einer bestimmten Krebserkrankung zu prognostizieren oder um festzustellen, ob diese bestimmte Krebserkrankung auf eine anti-GP88-Therapie ansprechen wird.
Für die Diagnose von Krankheiten, die mit einem Anstieg der Reaktionsfähigkeit auf GP88 einhergehen, werden Gewebsbiopsien, die analysiert werden sollen, mit neutralisierenden anti-GP88-Antikörpern oder gegen GP88-Rezeptoren gerichtete Antikörpern behandelt, um festzustellen, ob diese Behandlung das Zellwachstum hemmt. Alternativ zeigt die Fähigkeit von GP88-antisense-Oligonukleotiden, das Wachstum zu hemmen, dass die Expression von GP88 für in vivo-Wachstum erforderlich ist.
BEISPIEL 12
Eigenschaften der GP88-Zelloberflächenrezeptoren
Die Bindung von jodiertem GP88 an verschiedene Zelllinien, CCL64, 1246, PC und Brustgewebeepithelzellen C57MG wurde bestimmt, um die biochemischen Eigenschaften der GP88-Zelloberflächenrezeptoren mittels der unten beschriebenen Methoden zu untersuchen. Für diese Untersuchungen benutzten wir affinitätsgereinigtes rekombinantes GP88 (rGP88) aus dem Kulturmedium von Baculovirus-infizierten SF9-Insektenzellen als Ligand. Die Methoden zur Präparation von rGP88 wurden bereits erläutert.
a) Jodierung von GP88.
Rekombinanter GP88 (rGP88) wurde bei 4°C mit der Chloramin-T-Verfahren jodiert. Es können auch andere bekannte Verfahren angewendet werden. Kurz gesagt wurde 1 μg GP88 2 Min. lang mit ¹²⁵I Na (100 μCi) inkubiert, das zuvor 90 Sekunden lang mit 2 μg Chloramin-T vorinkubiert worden war. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 100 μl gesättigtem Tyrosin, 10 μl einer 1%igen Lösung Rinderserumalbumin (BSA) und 2 μg Natriummetadisulfit beendet. Nach Zugabe von 100 μl PBS wurde das jodierte Protein durch Gelfiltration in einer Sephadex G50-Säule von freiem Na¹²⁵ abgetrennt. Die Säule war zuvor mit PBS, das 1% Rinderserumalbumin enthielt, vorinkubiert und dann gründlich mit PBS gewaschen worden, um unspezifische Bindungen zu reduzieren. Die markierten Proteine wurden mit PBS eluiert und die Fraktionen auf Radioaktivität hin überprüft. Die Menge der eingebauten Radioaktivität wurde mittels TCA-Präzipitation geschätzt. Die spezifische Aktivität von ¹²⁵I-GP88 lag im typischen Fall bei 30 bis 50 μCi/μg. Diese und andere Verfahren für die Jodierung von Proteinen sind unter Fachleuten gut bekannt und können auch für die Jodierung von GP88, der aus PC-Zellen stammt, anstelle von rGP88 oder rGP88-Derivaten verwendet werden.
b) Bindung von ¹²⁵I-GP88.
Das hier vorgestellte Beispiel beschreibt einen Binding-Assay mit der Nerzlungenepithelzelllinie CCL64, ist aber auch schon bei mehreren Zelllinien verwendet worden, einschließlich der Zelllinien 1246 und PC sowie der Brustgewebeepithelzelllinie C57MG. Die Binding Assays wurden an Zellsuspension durchgeführt. Die CCL64-Zellen wurden als Einzelschicht in DME-Medium kultiviert, das mit mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) versetzt war, bis sie konfluent wurden. Zu diesem Zeitpunkt wurden die Zellen mit PBS gewaschen und mittels Inkubation mit einer Lösung aus 0,25 mg/ml Trypsin und 1 mM EDTA abgelöst. Die Zellen wurden mittels Zentrifugierung geerntet, mit Kulturmedium gewaschen und einem Hämocytometer gezählt. Für die Binding Assays wurden 10⁶ Zellen erneut in 500 μl Bindungspuffer aus DME-Medium, das mit 1% Rinderserumalbumin versetzt war, in 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen resuspendiert und 2 Stunden lang bei 25°C mit 10⁵ cpm ¹²⁵I-rGP88 und kaltem rGP88, dessen Konzentration von 1 auf 100 ng/ml gesteigert wurde, inkubiert. Die Bindung wurde durch Zentrifugieren der Zellen, woran sich 3 aufeinanderfolgende Waschungen mit kaltem Bindungspuffer bei 4°C anschlossen, gefolgt von Zentrifugieren, gestoppt. Die Zellpellets wurden mit einem Gammazähler gezählt. Mit einem Liganden-Computerprogramm wurde eine Scatchard-Analyse der Bindungsdaten durchgeführt. Die Werte entsprechen dem Durchschnitt von drei einzelnen Experimenten mit Parallelbestimmungen an jedem Versuchspunkt.
Die Scatchard-Analyse der Bindung von ¹²⁵I-GP88 an CCL64-Zellen war gekrümmt, was dem Vorhandensein von zwei Klassen von Zelloberflächenrezeptoren entspricht: eine hoch affine Klasse mit einem Kd von 4,3 ± 1,5 × 10^–11 M, 560 ± 170 Stellen/Zelle, und eine gering affine Klasse von Rezeptoren mit einem Kd von 3,9 ± 1,9 × 10^–9 M, 17.000 ± 5900 Stellen/Zelle.
c) Untersuchungen der Vernetzung von ¹²⁵I-GP88 mit CCL64 und anderen Zelllinien
Die Vernetzung von ¹²⁵I-GP88 an Zelloberflächenrezeptoren wurde unter Verwendung von Disuccinimidylsuberat (DSS) durchgeführt. Für die Vernetzungsuntersuchungen wurden 5 × 10⁵ Zellen in 250 μl Bindungspuffer in Eppendorf-Röhrchen suspendiert. ¹²⁵I-GP88 wurde in 50 μl Bindungspuffer (DME-Medium mit 1% BSA) mit oder ohne 100fachem unmarkiertem GP88-Ligand zugegeben. Die Bindung wurde wie im vorangegangenen Abschnitt beschrieben durchgeführt. Am Ende der Inkubationszeit wurden die Zellen einmal mit 0,2% BSA-DME und einmal mit PBS gewaschen, ehe die Vernetzung durchgeführt wurde. Disuccinimidylsuberat (DSS) wurde direkt vor der Verwendung bei 100 mM in DMSO aufgelöst. Die Zellen wurden in 200 μl PBS, das 1 mM Disuccinimidylsuberat (DSS) enthielt, 15 Min. lang bei Raumtemperatur resuspendiert. Nach der Vernetzung wurden die Zellen zentrifugiert, gewaschen und mit 25 μl Extraktionspuffer (PBS, das 1% Triton X-100, 0,1% SDS, 0,5 mM Phenylmethylsulfonylfluorid [PMSF] enthielt) bei 4°C extrahiert. Die Proben wurden 5 Min. lang mit 13.000 × g zentrifugiert, und 25 μl Überstand aus jeder Probe wurden mit 4 μl 20% SDS und 15 μl 3 × Laemmli's Probenpuffer (56), die b-Mercaptoethanol enthielt, gemischt und 5 Min. lang gekocht. Die Proben wurden einer Elektrophorese auf 7%-SDS Polyacrylamid-Plattengel nach Laemmli unterzogen (56), wobei ein Minigel-Gerät (Bio-Rad, Richmond, CA) zum Einsatz kam. Die getrockneten Gele wurden bei –70°C Röntgenfilmen für die Autoradiographie ausgesetzt.
Wie in 12 zu erkennen ist, ergab die autoradiographische Analyse, dass eine größere vernetzte Bande mit einem Molekulargewicht von 190–195 kDa vorhanden war. Die Hauptbande entspräche einem Molekulargewicht für den nicht gebundenen Rezeptor von etwa 110 kDa. Die Intensität der vernetzten Hauptbande nahm in denjenigen Spuren ab, in denen die Bindung in Gegenwart von überschüssigem kaltem GP88 erfolgte. Eine vernetzte Bande konnte nicht nachgewiesen werden, wenn Experiment und Gelelektrophorese in Abwesenheit von DSS durchgeführt wurden. Weitere Experimente, bei denen Proben verwendet wurden, die vor Durchführung der Elektrophorese entweder mit b-Mercaptoethanol behandelt worden waren oder auch nicht, zeigten, dass die Zelloberflächenrezeptoren für den Epithelin-/Granulin-Vorläufer monomer sind.
Mittels derselben Methode wurde eine Vernetzung von ¹²⁵I-GP88 mit Zelloberflächenrezeptoren auch mit 3T3, PC-Zellen und den Brustgewebeepithelzellen C57MG durchgeführt. Die Ergebnisse dieser Experimente zeigten ein ähnliches Vernetzungsverhalten für GP88 in allen getesteten Zelllinien, was auf das Vorhandensein von Zelloberflächenbindungsstellen in ähnlicher Größe in Fibroblast- und Epithelzellen hindeutet (13).
Durch GP88 vermittelte Signaltransduktion in der Mamma-Epithelzelllinie C57MG
Experimente zur Bestimmung der Eigenschaften des Signaltransduktionsweges, der von GP88 nach der Bindung an die Zelloberflächenrezeptoren aktiviert wird, wurden mit GP88 in der Brustgewebeepithelzelllinie C57MG durchgeführt. Wir haben gezeigt, dass der anti-K19T-Antikörper den von GP88 gebildeten Komplex und seine Zelloberflächenrezeptoren durch Immunpräzipitation auf verschiedenen Zelltypen und insbesondere in den Brustgewebeepithelzellen C57MG abscheiden kann. Dieses Merkmal hat es uns ermöglicht, biochemische Eigenschaften des GP88-Rezeptors und die von ihm vermittelte Signaltransduktion, die zur Wachstumsstimulation führt, genauer zu charakterisieren. Wir haben gezeigt, dass GP88-Rezeptoren zur Tyrosinkinase-Rezeptorfamilie gehören. Durch die Bindung von GP88 an die Zelloberfläche wird der GP88-Rezeptor durch Phosphorylierung auf Tyrosinresten aktiviert, was die Phosphorylierung verschiedener Signalmoleküle, einschließlich IRS-1, SHC, Grb2 zum Ergebnis hat und zur Aktivierung der MAP-Kinase ERK-2 führt.
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Claims

Pharmazeutische Zusammensetzung, die ein GP88 antagonisierendes Agens und einen pharmazeutisch verträglichen Träger umfasst.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, wobei das Agens ein anti-GP88-Antikörper ist.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 2, wobei der Antikörper ein neutralisierender Antikörper ist.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 3, wobei der Antikörper gegen eine GP88-Sequenz zwischen Aminosäure 334 und 362 gerichtet ist.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 2, wobei der Antikörper aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus anti-K19T-, anti-S14R-, anti-E19V- und anti-A14R-Antikörpern besteht.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, bei das Agens ein antisense-Oligonukleotid ist.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 6, wobei das antisense-Oligonukleotid eine antisense-RNA-Sequenz ist, die eine Komplementarität zur GP88-mRNA aufweist, die ausreicht, um eine Hybridisierung zwischen der antisense-RNA und der GP88-mRNA sowie eine Hemmung der Translation der GP88-mRNA zu verursachen.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 6, wobei das antisense-Oligonukleotid eine antisense-DNA-Sequenz ist, die eine Komplementarität zur GP88-mRNA aufweist, die ausreicht, um eine Expression des GP88 zu hemmen.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, wobei das Agens ein Vektor ist, der für die Expression einer antisense-Nukleotidsequenz geeignet ist, die eine Komplementarität zur GP88-mRNA aufweist, die ausreicht, um eine Expression von GP88 in Zellen zu hemmen.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, wobei das Agens ein Reagens ist, das die Expression von GP88-mRNA oder -Protein verhindert.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, wobei das Agens ein Reagens ist, das die Sekretion von GP88-Protein hemmt.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, wobei das Agens ein Antagonist ist, der die Bindung von GP88 an seinen Rezeptor hemmt.
Verwendung eines GP88 antagonisierenden Agens, wobei das Agens die Produktion oder biologische Aktivität von GP88 hemmt, zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Krankheiten, die mit einer erhöhten Expression von GP88 einhergehen.
Verwendung gemäß Anspruch 13, wobei es sich bei der Krankheit um Krebs handelt.
Verwendung gemäß Anspruch 13, wobei das Agens ein antisense-Oligonukleotid mit einer Mindestlänge von 20 Nukleotiden ist, dessen Komplementarität zur GP88-DNA ausreicht, um eine Expression von GP88 zu hemmen.
Verwendung gemäß Anspruch 13, wobei das Agens antisense-RNA ist.
Verwendung gemäß Anspruch 13, wobei das Agens ein anti-GP88-Antikörper ist.
Methode zur Unterstützung der invitro-Diagnose der Tumorgenität, umfassend die Schritte: Messung der Höhe der GP88-Expression in Gewebsextrakten oder biologischen Flüssigkeiten; Messung der Höhe der GP88-Expression in entsprechendem normalen oder peripheren Gewebe; und Bestimmung, ob die gemessene Höhe der GP88-Expression in Gewebsextrakten oder biologischen Flüssigkeiten über der Höhe in entsprechendem normalen oder umgebenden Gewebe liegt.
Methode gemäß Anspruch 18, wobei der Messschritt die Messung der Expression von GP88-mRNA umfasst.
Methode gemäß Anspruch 18, wobei der Messschritt die Messung der Expression von GP-Protein umfasst.
Methode zur Unterstützung der Diagnose der Tumorgenität, umfassend die Schritte: Messung der Bindung von GP88 an seine Rezeptoren auf der Zelloberfläche oder die Messung der Expression von GP88-Rezeptoren.
Verwendung eines GP88 antagonisierenden Agens, wobei das Agens die biologische Aktivität von GP88 hemmt, bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Krankheiten, die mit einer Veränderung der biologischen Aktivität von GP88 einhergehen.
Verwendung gemäß Anspruch 22, wobei das Agens ein neutralisierender anti-GP88-Antikörper ist.
Verwendung eines GP88 antagonisierenden Agens bei der Herstellung eines Agens zur Diagnose der Tumorgenität, wobei die Diagnose die Schritte Messung der Höhe der GP88-Expression in Gewebsextrakten oder biologischen Flüssigkeiten; Messung der Höhe der GP88-Expression in entsprechendem normalen oder umgebenden Gewebe; und Bestimmung, ob die gemessene Höhe der GP88-Expression in Gewebsextrakten oder biologischen Flüssigkeiten über der Höhe in entsprechendem normalen oder umgebenden Gewebe liegt, beinhaltet.
Verwendung eines GP88 antagonisierenden Agens bei der Herstellung eines Agens zur Diagnose von Krankheiten, die mit einer Veränderung der biologischen Wirkung von GP88 einhergehen, wobei die Diagnose die Schritte Messung der Bindung von GP88 an seine Rezeptoren auf der Zelloberfläche oder Messung der Expression von GP88-Rezeptoren beinhaltet.