DE69212671T2

DE69212671T2 - Rekombinante Antikörper spezifisch für einen Wachstumsfaktor-Rezeptor

Info

Publication number: DE69212671T2
Application number: DE69212671T
Authority: DE
Inventors: Bernd Dr Groner; Norman Dr Hardman; Ina-Maria Harwerth; Nancy E Dr Hynes; Winfried Stephan Dr Wels; Markus Zwickl
Original assignee: Ciba Geigy AG
Current assignee: Novartis AG
Priority date: 1991-02-05
Filing date: 1992-01-27
Publication date: 1997-03-13
Anticipated expiration: 2012-01-28
Also published as: JP3415171B2; DK0502812T3; AU662311B2; AU1042192A; ES2091438T3; CA2060544C; IE72959B1; GR3020809T3; IE920361A1; JPH05192183A; EP0502812A1; DE69212671D1; ATE141329T1; EP0502812B1; CA2060544A1

Description

Hintergrund der Erfindung

Wachstumsfaktoren und deren Rezeptoren sind an der Regulierung der Zellproliferation beteiligt und sie scheinen zudem eine Rolle beim Tumorwachstum zu spielen. Das c-erbB-2-Wachstumsfaktor-Rezeptor-Protein, ein Protein der Membranrezeptorprotein-Thyrosinkinase-Familie (A. Ullrich und J. Schlessinger, Cell 61 (1990), 203-212), wird in humanen Brusttumoren und humanen Ovarialkarzinomen gefunden. Die Amplifizierung des c-erbB-2-Gens und die Überexpression des Proteins scheint mit den schlechten Aussichten für Tumorpatienten einher zu gehen. Das c-erbB-2-Protein ist daher sowohl als diagnostische Sonde als auch als Ziel für die Krebstherapie verwendbar. Die Sequenzanalyse zeigt, daß c-erbB-2, auch HER2 genannt, ein Glycoprotein mit 185 KDa (gp185), mit dem humanen Analogon des neu-Oncogens identisch oder eng damit verwandt ist (A.L. Schechter et al., Science 229 (1985), 976-978), und eine erhebliche Sequenzhomologie zu dem humanen Epidermis-Wachstumsfaktor-(EGF)-Rezeptor aufweist.
Bei der Tumordiagnose und Therapie sind insbesondere Antikörper von Interesse, die gegen Tumormarker gerichtet sind. Polyklonale Antikörper können aus dem Serum von Säugetieren erhalten werden, die mit dem Antigen, das heißt dem Tumormarker, immunisiert wurden. Die Entwicklung der Hybridom- Technologie ermöglichte die Herstellung kontinuierlicher Zelllinien, insbesondere Maushybridome, welche monoklonale Antikörper der gewünschten Spezifizität herstellen. Monoklonale Maus- Antikörper, die gegen c-erbB-2 gerichtet sind, sind bekannt und beschrieben, beispielsweise von S.J. Mckenzie et al., Oncogene 4 (1989), 543-548; R.M. Hudziak et al., Molecuiar and Cellular Biology 9 (1989), 1165-1172; PCT WO 89/06692 (Genentech), und JP (Kokai) 02-150 293 (Ajinomoto KK).
Ein Haupthindernis bei der Verwendung von von der Maus abgeleiteten monoklonalen Antikörpern als in vivo diagnostische und therapeutische Mittel stellt deren Immunisierungsfähigkeit als Fremdproteine, deren ziemlich lange Anwesenheit im Kreislauf und die Bildung von schädigenden Immunkomplexen dar. Andererseits ist die Behandlung mit humanen monoklonalen Antikörpern ebenfalls eingeschränkt, da humane Hybridom-Zellinien schwer herzustellen sind, im allgemeinen instabil sind und monoklonale Antikörper geeigneter Spezifität nicht in ausreichenden Mengen und bei vernünftigen Kosten produzieren. Im Prinzip ist die in vitro Verwendung von monoklonalen Maus- Antikörpern nicht eingeschränkt. Die Produktionskosten monoklonaler Antikörper und, je nach dem verwendeten Immunassay-Typ, das Erfordernis eine nachweisbare Sonde an den Antikörper anzubringen, machen es jedoch wünschenswert ökonomisch günstigere Alternativen zu herkömmlichen monoklonalen Maus- Antikörpern zu finden.
Eine vielversprechende Alternative ist die Modifizierung von Immunglobulingenen, um Antikörper für bestimmte diagnostische und therapeutische Aufgaben anzufertigen. Aufgrund der Tatsache, daß der variable Bereich und jede Dömäne des konstanten Bereichs von Immunglobulin-Molekülen in getrennten Exons mit ihren eigenen Spleisstellen codiert werden, können rekombinante DNA-Techniken verwendet werden, um unterschiedliche Teile klonierter Immunglobulingene zu isolieren und diese an Teile anderer Immunglobuline oder Effektormoleküle zu ligieren. Die so hergestellten Gene werden durch geeignete, transformierte, kontinuierliche Zellinien exprimiert. Maus-Antikörper können beispielsweise in "humanisierte" Antikörper umgewandelt werden, indem die Exons konstanter Domänen der Maus gegen Exons konstanter Domänen humaner Immunglobuline ausgetauscht werden, wobei chimäre Antikörper mit Antikörper-Bindungsstellen der Maus und humanen konstanten Domänen gebildet werden. Die chimären Antikörper behalten die Antigspezifität, die durch die variablen Domänen der Maus bestimmt sind, zeigen jedoch auch humane Effektorfunktionen (wie beispielsweise Komplement-Bindung, Stimulierung von Phagozytose, Auslösen von Vesikel-Freisetzung durch Mastzellen), die durch die Carboxy-terminalen Segmente der konstanten Domäne der Polypeptide der schweren Kette bestimmt werden. Eine überdies noch anspruchsvollere Technik zur Anpassung von Antikörpern, die in EP-A-0 239 400 beschrieben ist, wechselt darüber hinaus andere, verhältnismäßig konservierte Domänen, die sogenannten Gerüst-Bereiche (FRs), in den variablen Domänen der Maus gegen die entsprechenden Gerüst-Bereiche humaner Antikörper oder gegen andere humane Proteinsequenzen aus. Ein derartiger Antikörper sollte im Menschen sogar weniger immunogen sein, da die einzigen, von einem Maus-Antikörper abgeleiteten Teile jene hypervariablen Bereiche sind, die eine bestimmte Spezifität für ein Antigen definieren, die sogenannten Komplementarität bestimmenden Bereiche (CRDs).
Darüber hinaus können Fusionsproteine hergestellt werden, die sich von Immunglobulinen unterscheiden, beispielsweise Einketten-Antikörper, die die Spezifität und die Bindungseigenschaften des ursprünglichen monoklonalen Maus-Antikörpers behalten, die jedoch anderweitig neue Eigenschaften aufweisen, welche von dem nicht-Immunoglobulinteil des Fusionsproteins abgeleitet sind. Die kleinste Domäne eines monoklonalen Antikörpers, die an das Antigen binden kann, ist das sogenannte Fv- Fragment, das aus den variablen Domänen der schweren und leichten Ketten besteht. Die Herstellung von Fv-Fragmenten durch proteolytische Techniken ist schwierig, da die entsprechenden variablen Domänen bei Verdünnung zur Dissoziation neigen. Fv- Moleküle, die durch Verbinden der variablen Domänen der schweren und leichten Kette über einen kurzen Peptid-Linker gebildet wurden, welche auch Einketten-Antigen-Bindungsproteine genannt werden, binden an ein Antigen mit ähnlichen Eigenschaften, wie der ursprüngliche monoklonale Antikörper (R.E. Bird et al., Science 242 (1988), 423-426; J.S.Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (1988), 5879-5883; und PCT WO 89/09825 (Celltech)).
Fv codierende Gene können mittels rekombinanter Gentechnologie im Prinzip mit Genen verbunden werden, die Effektor-Moleküle codieren. Es ist beispielsweise bekannt, daß Fv codierende Gensequenzen mit einem Gen verbunden werden können, das einen Teil des Exotoxin A-Gens von Pseudomonas codiert (V.K. Chaudhary et al., Nature 339 (1989) 394-397; und PCT WO 89/11533 (I. Pastan et al.)).

Aufgabe der Erfindung

Eine Aufgabe dieser Erfindung ist es rekombinante Antikörper zur Verfügung zu stellen, die gegen die extrazelluläre Domäne des humanen Wachstumsfaktor-Rezeptors c-erbB-2 gerichtet sind und eine variable Domäne einer leichten Kette und eine variable Domäne einer schweren Kette eines monoklonalen Antikörpers umfassen, monoklonale Antikörper, die gegen c-erbB-2 selbst gerichtet sind, ein Verfahren zur Herstellung der rekombinanten Antikörper und der monoklonalen Antikörper, Hybridomzellen, die die monoklonalen Antikörper sezernieren, ein Verfahren zur Herstellung der Hybridomzellen, DNA, die die variable Domäne der schweren Kette, die variable Domäne der leichten Kette, und den rekombinanten Antikörper codiert, ein Verfahren zur Herstellung der DNA, Hybridvektoren, die zur Expression der DNA geeignet sind, Wirtszellen, die mit der DNA transformiert sind, und die Verwendung der rekombinanten Antikörper und der monoklonalen Antikörper bei der Diagnose und Behandlung von Tumoren.

Ausführliche Beschreibung der Erfindung

Die Erfindung betrifft einen rekombinanten Antikörper, der gegen die extrazelluläre Domäne des Wachstumsfaktor-Rezeptors c-erbß-2, ein humanes Glycoprotein mit 185 kD (gp185), gerichtet ist, welcher eine variable Domäne einer schweren Kette und eine variable Domäne einer leichten Kette eines monoklonalen Antikörpers umfaßt.
Ein derartiger rekombinanter Antikörper kann ein chimärer Antikörper sein, der beispielsweise aus einer variablen Domäne einer schweren Kette der Maus, mit der Spezifität für c-erbB-2, und der konstanten Domäne einer humanen schweren Kette, α, γ, δ, &epsi;, oder µ, vorzugsweise γ, wie γ1 oder γ4 und aus einer variablen Domäne einer leichten Kette der Maus, mit der Spezifität für c-erbB-2, und der konstanten Domäne einer humanen leichten Kette, Kappa oder Lambda, vorzugsweise Kappa, besteht, die alle, vereinigt, einen funktionalen Antikörper ergeben.
Der bevorzugte, erfindungsgemäße, rekombinante Antikörper ist ein Einketten-Antikörper, bei dem die variable Domäne der schweren Kette und die variable Domäne der leichten Kette mittels einer zwischen ihnen angeordneten Gruppe, vorzugsweise einem Peptid, verbunden sind. Am meisten bevorzugt ist ein Einketten-Antikörper, bei dem die variable Domäne der schweren Kette an dem N-Terminus des rekombinanten Antikörpers angeordnet ist. Der rekombinante Einketten-Antikörper kann darüber hinaus ein Effektormolekül und/oder Signalsequenzen umfassen, welche die Verarbeitung des Antikörpers durch die Wirtszelle, in der er hergestellt wird, erleichtert. In Betracht gezogene Effektormoleküle sind solche, die für diagnostische oder therapeutische Zwecke verwendbar sind, beispielsweise Enzyme, die eine nachweisbare Reaktion bewirken, beispielsweise Phosphatase, wie alkalische Phosphatase aus E.coli oder alkalische Säuger-Phosphatase, beispielsweise alkalische Rinder-Phosphatase, Meerrettich-Peroxidase, β-D-Galactosidase, Glucose-Oxidase, Glucoamylase, Carbonsäure-Anhydrase, Acetylcholin-Esterase, Lysozym, Malat-Dehydrogenase, oder Glucose-6-Phosphat, ein Peptid mit bestimmten Bindungseigenschaften, beispielsweise Streptavidin aus Streptomyces Avidinii, das Biotin stark bindet, oder Enzyme, Toxine oder andere, die Zellen angreifende Stoffe, an die der Antikörper gebunden ist, beispielsweise eine Protease, ein Zytolysin oder ein Exotoxin, beispielsweise Rhizin A, Diphterietoxin A oder Pseudomonas Exotoxin. Im Folgenden wird ein rekombinanter Einketten-Antikörper, der zusätzlich ein Effektormolekül aufweist, als Fusionsprotein bezeichnet, oder, wenn zweckmäßig, innerhalb der Bedeutung der Ausdrücke "(rekombinanter) Einketten-Antikörper" oder "rekombinanter Antikörper" liegend angesehen.
Der Ausdruck Effektormolkül beinhaltet darüber hinaus biologisch aktive Varianten der vorstehend aufgeführten Proteine, beispielsweise Varianten, die von einer DNA hergestellt wurden, die einer in vitro Mutagenese unterzogen wurden, mit der Maßgabe, daß das durch die DNA codierte Protein die biologische Aktivität des nativen Proteins behält. Derartige Modifikationen können in einer Addition, einem Austausch oder einer Entfernung von Aminosäuren bestehen, wobei das zuletzt Genannte verkürzte Varianten ergibt. Ein Enzym, wie Phosphatase, kann beispielsweise aus einer DNA hergestellt werden, die zur Erleichterung der Klonierung des codierenden Gens modifiziert wurde, oder ein Exotoxin, wie Pseudomonas Exotoxin, kann aus einer DNA hergestellt werden, die unter Entfernung der Zellbindungs-Domäne verändert wurde.
Die erfindungsgemäßen, rekombinanten Antikörper werden auf ihre spezifität für die extrazelluläre Domäne von c-erbß-2 untersucht, beispielsweise durch Immunfluoreszenzfärbung von Zellen, die große Mengen an c-erbB-2 exprimieren, entweder direkt durch Immunblotten oder durch Immunpräzipitation und Proteinblotten der Immunkomplexe, oder durch einen anderen Immunassay, wie Bindungs-, Kreuzinhibierungs- oder Verdrängungs-Radio- oder Enzym-Immunassays.
Die variable Domäne einer schweren oder leichten Kette eines Antikörpers besteht aus den sogenannten Gerüstbereichen (FRs), die in Antikörpern unterschiedlicher Spezifitäten verhältnismäßig konserviert sind, und aus hypervariablen Bereichen, die auch Komplementarität bestimmende Bereiche (CDRs) genannt werden, die für eine bestimmte Spezifität typisch sind.
Bevorzugte erfindungsgemäße, rekombinante Antikörper sind solche, worin die variable Domäne der schweren Kette ein Polypeptid der Formel
FR&sub1;-CDR1H-FR&sub2;-CDR2H-FR&sub3;-CDR3H-FR&sub4; (I)
umfaßt, worin FR&sub1; ein Polypeptidrest ist, der mindestens 25-29, vorzugsweise 25-33 natürlich vorkommende Aminosäuren umfaßt, FR&sub2; ein Polypeptidrest ist, der 12-16 natürlich vorkommende Aminosäuren umfaßt, FR&sub3; ein Polypeptidrest ist, der 30-34 natürlich vorkommende Aminosäuren umfaßt, FR&sub4; ein Polypepeptidrest ist, der mindestens 6-10, vorzugsweise 6-13 natürlich vorkommende Aminosäuren umfaßt, CDR1H ein Polypeptidrest der Aminosäuresequenz 32-36 der SEQ ID Nr.4 ist, CDR2H ein Polypeptidrest der Aminosäuresequenz 51-67 der SEQ ID Nr.4 ist, und CDR3H ein Polypeptidrest der Aminosäuresequenz 100-109 der SEQ ID Nr.4 ist, oder CDR1H ein Polypeptidrest der Aminosäuresequenz 32-36 der SEQ ID Nr.8 ist, CDR2H ein Polypeptidrest der Aminosäuresequenz 51-67 der SEQ ID Nr.8 ist und CDR3H ein Polypeptidrest der Aminosäuresequenz 100-110 der SEQ ID Nr.8 ist, und worin die Aminosäure Cys in dem oxidierten Zustand unter Bildung von S-S-Brücken vorliegen kann. Diese besonderen Komplementarität bestimmenden Bereiche sind Asn-Tyr-Gly-Met-Asn (CDR1H), Trp-Ile-Asn-Thr-Ser-Thr-Gly-Glu-Ser-Thr-Phe-Ala-Asp- Asp-Phe-Lys-Gly(CDR2H), und Trp-Glu-Val-Tyr-His-Gly-Tyr-Val- Pro-Tyr(CDR3H) gemäß SEQ ID Nr.4, oder Ser-Tyr-Trp-Met-Asn (CDR1H), Met-Ile-Asp-Pro-Ser-Asp-Ser-Glu-Thr-Gln-Tyr-Asn-Gln- Met-Phe-Lys-Asp (CDR2H) und Gly-Gly-Ala-Ser-Gly-Asp-Trp-Tyr-Phe- Asp-Val (CDR3H) gemäß SEQ ID Nr.8.
Besonders bevorzugt sind rekombinante Antikörper, welche eine variable Domäne einer schweren Kette der Formel I umfassen, worin die Polypeptidreste der Gerüstbereiche FR&sub1;, FR&sub2;, FR&sub3; und FR&sub4; solche sind, die vorzugsweise in Säuger-, insbesondere Maus- oder Mensch-Antikörpern vorkommen.
In einer ersten Ausführungsform der Erfindung sind rekombinante Antikörper mit einer variablen Domäne einer schweren Kette am meisten bevorzugt, welche ein Polypeptid der Aminosäuresequenz 2-120 der SEQ ID Nr.4 umfassen, worin gegebenenfalls eine oder mehrere, beispielsweise 1, 2, 3 oder 4 einzelne Aminosäuren in den Aminosäuresequenzen 2-31 (FR&sub1;), 37-50 (FR&sub2;), 68-99 (FR&sub3;), und/oder 110-120 (FR&sub4;), durch andere Aminosäuren ersetzt sind oder entfernt wurden, und worin die Aminosäure Cys in dem oxidierten Zustand unter Bildung von S-S-Brücken vorliegen kann, insbesondere die rekombinanten Antikörper mit einer variablen Domäne einer schweren Kette, welche ein Polypeptid der Aminosäuresequenz 2-120 der SEQ ID Nr.4 umfaßt, worin die Aminosäure Cys in dem oxidierten Zustand unter Bildung von S-S- Brücken vorliegen kann.
In einer zweiten Ausführungsform der Erfindung sind rekombinante Antikörper am meisten bevorzugt, worin die variable Domäne einer schweren Kette ein Polypeptid der Aminosäuresequenz 2-121 der SEQ ID Nr.8 umfaßt, worin gegebenenfalls eine oder mehrere, beispielsweise 1, 2, 3 oder 4 einzelne Aminosäuren in den Aminosäuresequenzen 2-31 (FR&sub1;), 37-50 (FR&sub2;), 68- 99 (FR&sub3;) und/oder 111-121 (FR&sub4;) durch andere Aminosäuren ersetzt sind oder entfernt wurden und worin die Aminosäure Cys in dem oxidierten Zustand unter Bildung von S-S-Brücken vorliegen kann, insbesondere die rekombinanten Antikörper mit einer variablen Domäne einer schweren Kette, welche ein Polypeptid der Aminosäuresequenz 2-121 der SEQ ID Nr.8 umfaßt, worin die Aminosäure Cys in dem oxidierten Zustand unter Bildung von S-S- Brücken vorliegen kann.
Beispielsweise kann eine hydrophobe Aminosäure in den Gerüstbereichen durch eine andere Aminosäure ersetzt werden, vorzugsweise ebenfalls durch eine hydrophobe Aminosäure, beispielsweise eine homologe Aminosäure, durch zwei Aminosäuren ersetzt werden, oder entfernt worden sein. In ähnlicher Art und Weise kann eine hydrophile Aminosäure in dem Gerüstbereich durch eine andere Aminosäure ersetzt werden, durch zwei Aminosäuren ersetzt werden, oder entfernt worden sein, wobei das Ersetzen von Aminosäuren die Wasserstoffbrücken-Struktur des entsprechenden Gerüstbereichs vorzugsweise aufrecht erhält.
In ähnlicher Art und Weise sind bevorzugte erfindungsgemäße rekombinante Antikörper solche, worin die variable Domäne der leichten Kette ein Polypeptid der Formel
FR&sub6;-CDR1L-FR&sub7;-CDR2L-FR&sub8;-CDR3L-FR&sub9; (II)
umfaßt, worin FR&sub6; ein Polypeptidrest ist, der natürlich vorkommende Aminosäuren umfaßt, vorzugsweise 19-25, insbesondere 19-23 natürlich vorkommende Aminosäuren, FR&sub7; ein Polypeptidrest ist, der 13-17 natürlich vorkommende Aminosäuren umfaßt, FR&sub8; ein Polypeptidrest ist, der 30-34 natürlich vorkommende Aminosäuren umfaßt, FR&sub9; ein Polypeptidrest ist, der natürlich vorkommende Aminosäuren, insbesondere 7-11 natürlich vorkommende Aminosäuren umfaßt, und CDR1L ein Polypeptidrest der Aminosäuresequenz 159-169 der SEQ ID Nr.4 ist, CDR2L ein Polypeptidrest der Aminosäuresequenz 185-191 der SEQ ID Nr.4 ist und CDR3L ein Polypeptid der Aminosäuresequenz 224-232 der SEQ ID Nr.4 ist, oder CDR1L ein Polypeptidrest der Aminosäuresequenz 160-170 der SEQ ID Nr.8 ist, CDR2L ein Polypeptidrest der Aminosäuresequenz 186-192 der SEQ ID Nr.8 ist und CDR3L ein Polypeptidrest der Aminosäuresequenz 225-232 der SEQ ID Nr.8 ist, und worin die Aminosäure Cys in dem oxidierten Zustand unter Bildung von S-S-Brücken vorliegen kann. Diese besonderen Komplementarität bestimmenden Bereiche sind Lys-Ala-Ser-Gln- Asp-Val-Tyr-Asn-Ala-Val-Ala(CDR1L), Ser-Ala-Ser-Ser-Arg-Tyr-Thr (CDR2L), und Gln-Gln-His-Phe-Arg-Thr-Pro-Phe-Thr(CDR3L) gemäß SEQ ID Nr.4, oder Lys-Ala-Ser-Gln-Asp-Ile-Lys-Lys-Tyr-Ile-Ala (CDR1L), Tyr-Thr-Ser-Val-Leu-Gln-Pro(CDR2L) und Leu-His-Tyr-Asp- Tyr-Leu-Tyr-Thr(CDR3L) gemäß SEQ ID Nr.8.
Besonders bevorzugt sind rekombinante Antikörper, die eine variable Domäne einer leichten Kette der Formel (II) umfassen, worin die Polypeptidreste der Gerüstbereiche FR&sub5;, FR&sub6;, FR&sub7; und FR&sub8; solche sind, die vorzugsweise in Säuger-, insbesondere Maus- oder Mensch-Antikörpern vorkommen.
In einer Ausführungsform der Erfindung sind rekombinante Antikörper am meisten bevorzugt, worin die variable Domäne der leichten Kette ein Polypeptid der Aminosäuresequenz 136-241 der SEQ ID Nr.4 umfaßt, worin gegebenenfalls eine oder mehrere, beispielsweise 1, 2, 3 oder 4 einzelne Aminosäuren in den Aminosäuresequenzen 136-158 (FR&sub6;), 170-184 (FR&sub7;), 192-223 (FR&sub8;), und/oder 233-241 (FR&sub9;) durch andere Aminosäuren ersetzt sind, oder entfernt wurden, und worin die Aminosäure Cys in dem oxidierten Zustand unter Bildung von S-S-Brücken vorliegen kann, insbesondere die rekombinanten Antikörper mit einer variablen Domäne einer leichten Kette, welche ein Polypeptid der Aminosäuresequenz 136-241 der SEQ ID Nr.4 umfaßt, worin die Aminosäure Cys in dem oxidierten Zustand unter Bildung von S-S- Brücken vorliegen kann.
In einer zweiten Ausführungsform der Erfindung sind rekombinante Antikörper am meisten bevorzugt, worin die variable Domäne der leichten Kette ein Polypeptid der Aminosäuresequenz 137-241 der SEQ ID Nr.8 umfaßt, worin gegebenenfalls eine oder mehrere, beispielsweise 1, 2, 3, oder 4 einzelne Aminosäuren in den Aminosäuresequenzen 137-159 (FR&sub6;), 171-185 (FR&sub7;), 193-224 (FR&sub8;) und/oder 233-241 (FR&sub9;) durch andere Aminosäuren ersetzt sind oder entfernt wurden, und worin die Aminosäure Cys in dem oxidierten Zustand unter Bildung von S-S-Brücken vorliegen kann, insbesondere der rekombinante Antikörper, worin die variable Domäne der leichten Kette ein Polypeptid der Aminosäuresequenz 137-241 der SEQ ID Nr.8 umfaßt, worin die Aminosäure Cys in dem oxidierten Zustand unter Bildung von S-S-Brücken vorliegen kann.
Beispielsweise können Aminosäuren in den Gerüstbereichen durch andere Aminosäuren ersetzt sein oder entfernt werden, wie vorstehend für die schwere Kette erläutert wurde.
Besonders bevorzugt ist ein rekombinanter Einketten-Antikörper, worin die variable Domäne der schweren Kette und die variable Domäne der leichten Kette über eine zwischen diesen angeordnete Gruppe, die aus 10-30 beispielsweise etwa 15 Aminosäuren, besteht, verbunden sind, insbesondere ein rekombinanter Einketten-Antikörper, der ein Polypeptid der Formel
FR&sub1;-CDR1H-FR&sub2;-CDR2H-FR&sub3;-CDR3H-FR&sub4;-Sp-FR&sub6;-CDR1L-FR&sub7;-CDR2L-FR&sub8;&submin;&submin; CDR3L-FR&sub9; (III)
umfaßt, worin FR&sub1;, CDR1H, FR&sub2;, CDR2H, FR&sub3;, CDR3H, FR&sub4;, FR&sub6;, CDR1L, FR&sub7;, CDR2L, FR&sub8;, CDR3L und FR&sub9; die vorstehend aufgeführten Bedeutungen besitzen und Sp eine Peptid-Abstandshaltergruppe (Spacer) ist, die aus etwa 10-30, beispielsweise etwa 15, Aminosäuren besteht, und worin die variable Domäne der schweren Kette oder der leichten Kette weiterhin an ein Effektormolekül gebunden ist, beispielsweise ein Enzym, wie Phosphatase, insbesondere alkalische Phosphatase, oder ein Toxin, wie Pseudomonas Exotoxin, oder eine Variante davon. Das Effektormolekül ist vorzugsweise an die variable Domäne der leichten Kette gebunden, gegebenenfalls über einen Peptid- Spacer, der aus einer oder mehreren, beispielsweise 1-10 Aminosäuren, besteht.
Diese Fusionsproteine, die einen rekombinanten Einketten- Antikörper und ein Effektormolekül umfassen, enthalten gegebenenfalls ein anderes Peptid, beispielsweise ein Peptid, das die Reinigung erleichtert, insbesondere ein Peptid, das ein Epitop darstellt, gegen das ein Antikörper verfügbar ist, wie das FLAG-Peptid. Die Reinigung eines Fusionsproteins, das ein derartiges Peptid enthält, beispielsweise durch Affinitätschromatographie, ist vorteilhaft, da es beispielsweise schneller, spezifischer und/oder einfacher sein kann. Das Peptid kann an den N-Terminus des Fusionsproteins gebunden sein, zwischen dem rekombinanten Antikörper und dem Effektormolekül, oder an den C-Terminus des Fusionsproteins. Es ist vorzugsweise an dem N- Terminus oder an dem C-Terminus, insbesondere an dem N-Terminus angeordnet. Diese Konstrukte enthalten vorzugsweise zusätzlich eine Spaltstelle, so daß das Fusionsprotein davon entweder durch enzymatisches Spalten, beispielsweise mittels Enterokinase oder mittels Faktor Xa, oder durch die im Stand der Technik bekannten chemischen Methoden freigesetzt werden kann. Darüber hinaus können diese Konstrukte einen Peptid-Spacer enthalten, der aus einer oder mehreren, beispielsweise 1-10, insbesondere etwa 2 Aminosäuren besteht, wobei der Spacer die Verbindung des vorstehend aufgeführten Peptids und/oder der Spaltstelle zu dem rekombinanten Antikörper erleichtert. Die Spaltstelle ist in einer solchen Art und Weise angeordnet, daß das Fusionsprotein, das den rekombinanten Antikörper und das Effektormolekül umfaßt, auf Wunsch einfach freigesetzt werden kann, vorzugsweise in vitro. In dem Proteinkonstrukt beispielsweise, das das als Fv(FRP5)-ETA (siehe SEQ ID Nr.10) bezeichnete Fusionsprotein umfaßt, sind das FLAG-Peptid und eine Enterokinase-Spaltstelle an einen Spacer gebunden und vor dem aus der variablen Domäne der Fv schweren Kette/leichten Kette und dem Exotoxin A bestehenden Fusionsprotein angeordnet. Wenn gewünscht kann das FLAG- Peptid mittels Enterokinase abgespalten werden, vorzugsweise nach Affinitäts-Reinigung des Proteins, was ein Fusionsprotein ergibt, das den Einketten-Antikörper Fv(FRP5) und Exotoxin A umfaßt.
Am meisten bevorzugt ist ein rekombinanter Einketten- Antikörper, bei dem die variable Domäne der schweren Kette und die variable Domäne der leichten Kette von einem monoklonalen Maus-Antikörper abgeleitet sind, der gegen die extrazelluläre Domäne des Wachstumsfaktor-Rezeptors c-erbB-2 gerichtet ist, beispielsweise abgeleitet von den monoklonalen Maus-Antikörpern FRP5, FSP16, FWP51 oder FSP77, insbesondere von den monoklonalen Maus-Antikörpern FRP5 oder FWP51. Gleichermaßen bevorzugt ist ein rekombinanter Einketten-Antikörper, worin die Spacer- Gruppe, die die variablen Domänen der leichten Kette und der schweren Kette verbindet, ein Polypeptid ist, das etwa 15 Aminosäuren umfaßt, die unter Glycin und Serin ausgewählt sind, insbesondere worin die Spacer-Gruppe das 15 Aminosäuren lange Polypeptid ist, das aus drei wiederkehrenden Untereinheiten von Gly-Gly-Gly-Gly-Ser besteht.
Besonders bevorzugt ist ein Einketten-Antikörper, der die variable Domäne der schweren Kette eines monoklonalen Maus- Antikörpers enthält, welcher aus der Gruppe, bestehend aus FRP5 FSP16, FWP51 und FSP77 ausgewählt ist, wobei die 15 Aminosäuren-Spacer-Gruppe aus drei wiederkehrenden Untereinheiten von Gly-Gly-Gly-Gly-Ser besteht, wobei die variable Domäne der leichten Kette des monoklonalen Maus-Antikörpers aus der Gruppe bestehend aus FRP5, FSP16, FWP51 und FSP77 ausgewählt ist, und ein Enzym, beispielsweise eine Phosphatase, wie alkalische Phosphatase phoA, oder ein Exotoxin, wie Pseudomonas Exotoxin, oder eine Variante davon.
Insbesondere bevorzugt ist der als Fv(FRP5)-phoA bezeichnete, bestimmte rekombinante Einketten-Antikörper, der ein Polypeptid der Aminosäuresequenz 2-690 der SEQ ID Nr.5 umfaßt.
Gleichermaßen bevorzugt ist ein rekombinanter Einketten- Antikörper, der ein Peptid umfaßt, das die Reinigung erleichtert, eine Spaltstelle und einen bestimmten rekombinanten Einketten-Antikörper, der aus der Gruppe, bestehend aus Fv(FRP5)- ETA und Fv(FWP51)-ETA, ausgewählt ist, insbesondere einen rekombinanten Einketten-Antikörper, der ein Polypeptid umfaßt, das aus der Gruppe, bestehend aus einem Polypeptid der Aminosäuresequenz -10-606 der SEQ ID Nr.10 und einem Polypeptid der Aminosäuresequenz -10-606 der SEQ ID Nr.11 ausgewählt ist, wobei das Protein, wenn gewünscht, einer in vitro Spaltung durch Enterokinase unterworfen wird.
Insbesondere bevorzugt ist ein rekombinanter Einketten- Antikörper, der ein Protein umfaßt, das ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus einem Polypeptid der Aminosäuresequenz 2-606 der SEQ ID Nr.10 und einem Polypeptid der Aminosäuresequenz 2-606 der SEQ ID Nr.11.
Die Erfindung betrifft weiterhin die monoklonalen Maus- Antikörper, die gegen die extrazelluläre Domäne des Wachstumsfaktor-Rezeptors c-erbB-2 gerichtet sind und als FRP5, FSP16, FSP77 und FWP51 bezeichnet werden, und von den Hybridomzelllinien FRP5, FSP16, FSP77 bzw. FWP51 sezerniert werden. Am meisten bevorzugt sind die monoklonalen Maus-Antikörper, die als FRP5 und FWP51 bezeichnet werden.
Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen rekombinanten Antikörper und der erfindungsgemäßen monoklonalen Maus-Antikörper. Die Antikörper werden durch an sich bekannte Verfahren hergestellt, und sind dadurch gekennzeichnet, daß die Wirtszellen oder Hybridomzellen, wie nachstehend definiert, die derartige Antikörper herstellen, in vitro oder in vivo vermehrt werden, und, wenn erforderlich, die erhaltenen Antikörper isoliert werden. Die erfindungsgemäßen rekombinanten Antikörper können beispielsweise mittels rekombinanter DNA-Techniken hergestellt werden, welche Züchten eines transformierten Wirts unter Bedingungen, die deren Expression erlauben, und Isolieren der Antikörper umfassen.
Die vorliegende Erfindung betrifft insbesondere auch ein Verfahren zur Herstellung eines erfindungsgemäßen Proteins, das aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus einer variablen Domäne einer Maus-schweren Kette, einer variablen Domäne einer Maus-leichten Kette, einer variablen Domäne einer Maus-schweren Kette und einer variablen Domäne einer Maus-leichten Kette, einem rekombinanten Einketten-Antikörper, einem Fusionsprotein, und einem Fusionsprotein, das gegebenenfalls ein Peptid, das die Reinigung erleichtert, eine Spaltstelle und einen Peptid- Spacer enthält, welches Züchten eines Wirts, beispielsweise E.coli, der mit einem Hybridvektor transformiert wurde, der eine Expressionskasette enthält, die einen Promotor und eine DNA, die das Protein codiert, umfaßt, wobei die DNA durch den Promotor kontrolliert wird und Isolieren der Proteins umfaßt.
Die vorliegende Erfindung betrifft insbesondere ein Verfahren zur Herstellung eines erfindungsgemäßen Proteins, das ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus einer variablen Domäne der Maus-schweren Kette, einer variablen Domäne einer Maus-leichten Kette, einer variablen Domäne einer Maus-schweren Kette und einer variablen Domäne einer Maus-leichten Kette, einem rekombinanten Einketten-Antikörper, und einem Fusionsprotein, das gegebenenfalls ein Peptid, das die Reinigung erleichtert, eine Spaltstelle und einen Peptid-Spacer enthält, welches Züchten eines Wirts, beispielsweise E.coli, der mit einem Hybridvektor transformiert wurde, der eine Expressionskasette enthält, die einen Promotor umfaßt, der mit einer ersten DNA-Sequenz verbunden ist, die ein Signalpeptid codiert, das in dein richtigen Leseraster mit einer zweiten DNA- Sequenz, die das Protein codiert, verbunden ist, und Isolieren des Proteins umfaßt.
Die Vermehrung der Hybridomzellen oder Säuger-Wirtszellen in vitro wird in geeigneten Kulturmedien durchgeführt, welche die herkömmlichen Standard-Kulturmedien sind, beispielsweise Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) oder RPMI 1640-Medium, das gegebenenfalls mit einem Säuger-Serum, beispielsweise fötalem Kälberserum, ergänzt wurde oder Spurenelementen und Wachstum-erhaltenden Zusätzen, beispielsweise Nährzellen, wie normale peritoneale Maus-Exudat-Zellen, Milzzellen, Knochenmarks-Makrophagen, 2-Aminoethanol, Insulin, Transferrin, Lipoprotein mit niedriger Dichte, Ölsäure oder dergleichen. Die Vermehrung von Wirtszellen, die Bakterienzellen oder Hefezellen sind, wird gleichermaßen in geeigneten, im Stand der Technik bekannten Kulturmedien durchgeführt, beispielsweise für Bakterien im Medium LB, NZCYM, NZYM, NZM, Terrific-Kulturlösung, SOB, SOC, 2xYT oder M9-Minimalmedium, und für Hefe in Medium YPD, YEPD, Minimalmedium, oder vollständigem Minimal-Dropout- Medium.
Die in vitro Herstellung liefert relativ reine Antikörper- Zubereitungen und ermöglicht eine Maßstabsvergrößerung, wobei große Mengen der gewünschten Antikörper erhalten werden. Techniken zum Züchten von Bakterienzellen, Hefe- oder Säugerzellen, sind im Stand der Technik bekannt und umfassen homogene Suspensionskultur, beispielsweise in einem Druckluftbehälter oder in einem Behälter mit kontinuierlichem Rühren, oder immobilisierte oder eingeschlossene Zellkultur, beispielswelse in hohlen Fasern, Mikrokapseln, auf Agarose-Mikrokügelchen oder keramischen Kapseln.
Große Mengen der gewünschten Antikörper können ebenfalls durch Vermehrung von Säugerzellen in vivo erhalten werden. Zu diesem Zweck werden Hybridomzellen, die die gewünschten Antikörper herstellen, in gewebeverträgliche Säugetiere injiziert, um das Wachstum der Antikörper produzierenden Tumore zu bewirken. Die Tiere werden gegebenenfalls vor der Injektion mit einem Kohlenwasserstoff, insbesondere Mineralölen, wie Pristan (Tetramethylpentadecan) aktiviert. Nach ein bis drei Wochen werden die Antikörper aus den Körperflüssigkeiten dieser Säugetiere isoliert. Beispielsweise werden Hybridomzellen, die durch Fusion geeigneter Myelomzellen mit Antikörper produzierenden Milzzellen aus Balb/c Mäusen erhalten wurden, oder transfizierte Zellen, die von der Hybridomzellinie Sp2/0 abgeleitet sind und die gewünschten Antikörper produzieren, in Balb/c Mäuse, die gegebenenfalls mit Pristan vorbehandelt wurden, intraperitoneal injiziert, und nach ein bis zwei Wochen wird den Tieren Aszites-Flüssigkeit entnommen.
Die Zellkultur-Überstände werden auf die gewünschten Antikörper getestet, vorzugsweise durch Immunofluoreszenz-Färbung der Zellen, die c-erbB-2 exprimieren, durch Immunblotten, durch einen Enzym-Immunassay, beispielsweise einen Sandwich-Assay oder einen Dot-Assay oder einen Radioimmun-Assay.
Zur Isolierung der Antikörper können die Immunglobuline in den Kulturüberständen oder in der Aszites Flüssigkeit konzentriert werden, beispielsweise durch Präzipitation mit Ammoniumsulfat, Dialyse gegen hygroskopisches Material, wie Polyethylenglycol, Filtration durch selektive Membranen oder dergleichen. Wenn erforderlich und/oder gewünscht, werden die Antikörper durch herkömmliche Chromatographie-Verfahren gereinigt, beispielsweise Gelfiltration, Ionenaustausch-Chromatographie, Chromatographie über DEAE-Zellulose und/oder (Immun-) Affinitäts-Chromatographie, beispielsweise Affinitäts-Chromatographie mit c-erbB-2-Protein oder mit Protein A.
Die Erfindung betrifft weiterhin Hybridomzellen, die die erfindungsgemäßen, monoklonalen Antikörper sezernieren, insbesondere die Hybridomzellinien, FRP5, FSP16, FSP77 und FWP51, die gemäß dem Budapester Vertrag am 21. November 1990 bei der European Collection of Animal Cell Cultures (ECACC) in Porton Down, Salibury, GB, unter den Hinterlegungsnummern 90112115, 90112116, 90112117 bzw. 90112118 hinterlegt wurden. Am meisten bevorzugt ist die als FRP5 bezeichnete Hybridomzellinie, ECACC- Nr. 90112115, oder die als FWP51 bezeichnete Hybridomzellinie, ECACC-Nr. 90112118. Die erfindungsgemäßen bevorzugten Hybridomzellen sind genetisch stabil, sezernieren erfindungsgemäße monoklonale Antikörper der gewünschten Spezifität, und können aus tiefgefrorenen Kulturen durch Auftauen und erneutes Klonieren aktiviert werden.
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung einer Hybridomzellinie, die monoklonale Antikörper, die gegen die extrazelluläre Domäne des Wachstumsfaktor-Rezeptor c-erbB-2 gerichtet sind, sezerniert, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß ein geeignetes Säugetier, beispielsweise eine Balb/c-Maus mit gereinigtem c-erbB-2-Protein, einem antigenem Träger, der gereinigtes c-erbB-2 enthält, oder mit Zellen, die den Wachstumsfaktor-Rezeptor c-erbB-2 tragen, immunisiert wird, Antikörper produzierende Zellen des immunisierten Säugers mit Zellen einer geeigneten Myelomzellinie fusioniert werden, die bei der Fusion erhaltenen Hybridzellen kloniert werden, und die Zellklone, die die gewünschten Antikörper sezernieren, ausgewählt werden. Beispielsweise werden Milzzellen von Balb/c-Mäusen, die mit Zellen, die c-erbB-2 aufweisen, immunisiert wurden, mit Zellen der Myelomzellinie PAI oder mit Zellen der Myelomzellinie Sp2/0-Agl4 fusioniert, die erhaltenen Hybridzellen werden auf Sekretion der gewünschten Antikörper untersucht und positive Hybridomzellen werden kloniert.
Ein Verfahren zur Herstellung einer Hybridomzellinie ist bevorzugt, das dadurch gekennzeichnet ist, daß Balb/c-Mäuse immunisiert werden, indem zwischen 10&sup7; und 10&sup8; Zellen der humanen Brusttumorzellinie SKBR3 mit einem geeigneten Adjuvans mehrere Male, beispielsweise 4-6 Mal, über mehrere Monate hinweg, beispielsweise zwischen 2 und 4 Monate, subkutan und/oder intraperitoneal injiziert werden, und den immunisierten Mäusen zwei bis vier Tage nach der letzten Injektion Milzzellen entnommen werden und mit Zellen der Myelomzellinie PAI in Anwesenheit eines die Fusion fördernden Mittels, vorzugsweise Polyethylenglycol, fusioniert werden. Die Myelomzellen werden vorzugsweise mit einem 3-20 fachen Überschuß an Milzzellen der immunisierten Mäuse in einer Lösung fusioniert, die etwa 30 bis etwa 50 % Polyethylenglycol mit einem Molekulargewicht von etwa 4000 enthält. Nach der Fusion werden die Zellen in einem geeigneten, wie vorstehend beschriebenen Kulturmedium, das mit einem Selektionsmedium ergänzt wurde, beispielsweise HAT- Medium, in regelmäßigen Abständen expandiert, um zu verhindern, daß die Myelomzellen die gewünschten Hybridomzellen überwuchern
Die Erfindung betrifft zudem rekombinante DNAs, welche ein Insert umfassen, das einie variable Domäne einer Maus-schweren Kette und/oder eine variable Domäne einer Maus-leichten Kette der Antikörper codiert, die gegen die extrazelluläre Domäne des Wachstumsfaktor-Rezeptors c-erbB-2, wie vorstehend beschrieben, gerichtet sind. Derartige DNAs umfassen definitionsgemäß codierende einzelsträngige DNAs, doppelsträngige DNAs, die aus den codierenden DNAs und dazu komplementären DNAs bestehen, oder diese komplementären (einzelsträngigen) DNAs selbst.
Darüber hinaus kann DNA, die eine variable Domäne einer Maus-schweren Kette und/oder eine variable Domäne einer Mausleichten Kette von Antikörpern codiert, die gegen die extrazelluläre Domäne des Wachstumsfaktor-Rezeptors c-erbB-2 gerichtet sind, enzymatisch oder chemisch synthethisierte DNA sein, die die authentische DNA-Sequenz aufweist, die eine variable Domäne einer Maus-schweren Kette und/oder eine variable Domäne der Maus-leichten Kette codiert, oder ein Mutant davon. Ein Mutant der authentischen DNA ist eine DNA, die eine variable Domäne einer Maus-schweren Kette und/oder eine variable Domäne einer Maus-leichten Kette der vorstehend aufgeführten Antikörper codiert, worin eine oder mehrere Aminosäuren entfernt oder durch eine oder mehrere anderen Aminosäuren ausgetauscht sind. Diese Modifizierungen befinden sich vorzugsweise außerhalb der CDRs der variablen Domäne der Maus-schweren Kette und/oder der variablen Domäne der Maus-leichten Kette des Antikörpers. Eine derartige mutierte DNA soll darüber hinaus ein stummer Mutant sein, worin ein oder mehrere Nucleotide durch andere Nucleotide ersetzt ist/sind, wobei die neuen Codons die gleichen Aminosäure(n) codieren. Eine derartige mutierte Sequenz ist auch eine degenerierte Sequenz. Degenerierte Sequenzen sind in der Bedeutung des genetischen Codes dahingehend degeneriert, daß eine unbegrenzte Anzahl an Nucleotiden durch andere Nucleotide ersetzt sind, ohne eine Änderung der ursprünglich codierten Aminosäuresequenz zu bewirken. Derartige degenerierte Sequenzen können aufgrund ihrer unterschiedlichen Restriktionsschnittstellen und/oder Häufigkeit bestimmter Codons, die von dem spezifischen Wirt, insbesondere E.coli, bevorzugt sind, nützlich sein, um eine optimale Expression der variablen Domäne der Maus-schweren Kette und/oder der variablen Domäne der Mausleichten Kette zu erhalten.
Der Ausdruck Mutant soll eine mutierte DNA beinhalten, die durch in vitro Mutagenese der authentischen DNA gemäß im Stand der Technik bekannter Verfahren erhalten wurde.
Die Erfindung betrifft eine rekombinante DNA, welche ein Insert enthält, das eine variable Domäne einer Maus-schweren Kette eines monoklonalen Antikörpers codiert, der ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus den Antikörpern FRP5, FSP16, FSP77, und FWP51, oder eine Aminosäuresequenz codiert, die zu der variablen Domäne der schweren Kette homolog ist.
Die Erfindung betrifft insbesondere eine rekombinante DNA, welche ein Insert enthält, das eine variable Domäne einer Mausschweren Kette codiert, die von der genomischen DNA oder mRNA der Hybridomzellinien FRP5, FSP16, FSP77 oder FWP51 abstammt, oder welche zu der genomischen DNA diese Zellinien homolog ist, und eine Aminosäuresequenz codiert, die zu der variablen Domäne der schweren Kette der monoklonalen Antikörper FRP5, FSP16, FSP77 oder FWP51 homolog ist. Insbesondere bevorzugt ist eine rekombinante DNA, welche ein Insert enthält, das eine variable Domäne einer Maus-schweren Kette codiert, die von der genomischen DNA oder mRNA der Hybridomzellinie FRP5 abstammt, oder welche zu der genomischen DNA der Zellinie homolog ist und eine Aminosäuresequenz codiert, die zu der variablen Domäne der schweren Kette des monoklonalen Antikörpers FRP5 homolog ist, oder eine rekombinante DNA, welche ein Insert umfaßt, das eine variable Domäne einer Maus-schweren Kette codiert, die von der genomischen DNA oder mRNA der Hybridomzellinie FWP51 abstammt, oder welche zu der genomischen DNA der Zellinie homolog ist, und eine Aminosäuresequenz codiert, die zu der variablen Domäne der schweren Kette des Antikörpers FWP51 homolog ist.
Bevorzugt ist eine rekombinante DNA, welche ein Insert enthält, das das Polypeptid der Formel I codiert, worin FR&sub1;, FR&sub2;, FR&sub3;, FR&sub4;, CDR1H, CDR2H und CDR3H die vorstehend aufgeführten Bedeutungen besitzen, und gegebenenfalls weiter Introns enthält. Besonders bevorzugt ist eine rekombinante DNA, die das Polypeptid der Formel I codiert, welche Inserts enthalten, die die Maus- oder humanen Gerüstbereiche FR&sub1;, FR&sub2;, FR&sub3; und FR&sub4; codieren, und Inserts enthält, die Komplementarität bestimmende Bereiche der DNA-Sequenz 99-113 (CDR1H), der DNA-Sequenz 156- 206 (CDR2H) und der DNA-Sequenz 303-332 (CDR3H) der SEQ ID Nr.4, oder Komplementarität bestimmende Bereiche der DNA-Sequenz 99-113 (CDR1H), der DNA-Sequenz 156-206 (CDR2H) und der DNA-Sequenz 303-332 (CDR3H) der SEQ ID Nr.8 codieren. Am meisten bevorzugt ist eine DNA, welche ein Insert der DNA- Sequenz 9-365 der SEQ ID Nr.4 enthält, worin gegebenenfalls ein oder mehrere, beispielsweise 1-10, Nucleotid(e) durch andere Nucleotide ersetzt sind, insbesondere eine DNA, welche ein Insert der DNA-Sequenz 9-365 der SEQ ID Nr.4 enthält. Gleichermaßen bevorzugt ist eine DNA, welche ein Insert der DNA-Sequenz 9-368 der SEQ ID Nr.8 umfaßt, worin gegebenenfalls ein oder mehrere, beispielsweise 1-10, Nucleotid(e) durch andere Nucleotide ersetzt sind, insbesondere eine DNA, welche ein Insert der DNA-Sequenz 9-368 der SEQ ID Nr.8 enthält.
In einer DNA, worin Nucleotide der in SEQ ID Nr.4 aufgeführten Sequenz, oder in einer DNA, worin Nucleotide der in SEQ ID Nr.8 aufgeführten Sequenz durch andere Nucleotide ersetzt sind, ist ein derartiger Ersatz bevorzugt, der die Aminosäuresequenz der Komplementaritäts bestimmenden Bereiche (CDRs), die sie codiert, nicht verändern. Dies bedeutet, daß ein derartiger Ersatz von Nucleotiden in den Inserts, die die Gerüstbereiche (Frs) codieren, oder in einer Position vorkommen kann, in der die codierte Aminosäuresequenz aufgrund der Degeneration der Tripplett-Codons nicht verändert wird.
Die Erfindung betrifft gleichermaßen eine rekombinante DNA, die ein Insert enthält, das eine variable Domäne einer Maus-leichten Kette eines monoklonalen Antikörpers codiert, der ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus den Antikörpern FRP5, FSP16, FSP77 und FWP51, oder das eine Aminosäuresequenz codiert, die zu der variable Domäne der leichten Kette homolog ist.
Die Erfindung betrifft insbesondere eine rekombinante DNA, welche ein Insert enthält, das eine variable Domäne einer Maus-leichten Kette codiert, die von genomischer DNA oder mRNA der Hybridomzellinien FRP5, FSP16, FSP77 oder FWP51 abstammt, oder die zu der genomischen DNA der Zellinien homolog ist und eine Aminosäuresequenz codiert, die zu der variablen Domäne der leichten Kette der monoklonalen Antikörper FRP5, FSP16, FSP77 oder FWP51 homolog ist. Besonders bevorzugt ist eine rekombinante DNA, welche ein Insert enthält, das eine variable Domäne einer Maus-leichten Kette codiert, die von genomischer DNA oder mRNA der Hybridomzellinie FRP5 abstammt, oder die zu der genomischen DNA der Zellinie homolog ist und eine Aminosäuresequenz codiert, die zu der variablen Domäne der leichten Kette des monoklonalen Antikörpers FRP5 homolog ist, oder eine rekombinante DNA, welche ein Insert enthält, das eine variable Domäne einer Maus-leichten Kette codiert, die von genomischer DNA oder mRNA der Hybridom-Zellinie FWP51 abstammt, oder die zu der genomischen DNA der Zellinie homolog ist und eine Aminosäuresequenz codiert, die zu der genomischen DNA der variablen Domäne der leichten Kette des monoklonalen Antikörpers FWP51 homolog ist.
Bevorzugt ist eine rekombinante DNA, welche ein Insert enthält, das das Polypeptid der Formel II codiert, worin FR&sub5;, FR&sub6;, FR&sub7;, FR&sub8;, CDR1L, CDR2L und CDR3L die vorstehend aufgeführten Bedeutungen besitzen und gegebenenfalls weiter Introns enthält. Besonders bevorzugt ist eine rekombinante DNA, die das Polypeptid der Formel II codiert, welche Inserts enthält, die die Maus- oder Mensch-Gerüstbereiche FR&sub5;, FR&sub6;, FR&sub7;, und FR&sub8; codieren und Inserts, die die Komplementaritäts bestimmenden Bereiche der DNA-Sequenz 480-512 (CDR1L), der DNA-Sequenz 558- 578 (CDR2L) und der DNA-Sequenz 675-701 (CDR3L) der SEQ ID Nr.4 codieren, oder Komplementarität bestimmende Bereiche der DNA- Sequenz 483-515 (CDR1L) der DNA-Sequenz 561-581 (CDR2L) und der DNA-Sequenz 678-701 (CDR3L) der SEQ ID Nr.8 codieren.
Am meisten bevorzugt ist eine DNA, welche ein Insert der DNA-Sequenz 411-728 der SEQ ID Nr.4 enthält, worin gegebenenfalls ein oder mehrere, beispielsweise 1-10 Nucleotid(e), durch andere Nucleotide ersetzt sind, insbesondere eine DNA, die ein Insert der DNA-Sequenz 411-728 der SEQ ID Nr.4 enthält. Gleichermaßen bevorzugt ist eine DNA, welche ein Insert der DNA-Sequenz 414-728 der SEQ ID Nr.8 enthält, worin gegebenenfalls ein oder mehrere, beispielsweise 1-10, Nucleotid(e) durch andere Nucleotide ersetzt sind, insbesondere eine DNA, die ein Insert der DNA-Sequenz 414-728 der SEQ ID Nr.8 enthält. In einer DNA, worin Nucleotide der in SEQ ID Nr.4 gezeigten Sequenz, oder in einer DNA, worin Nucleotide der in SEQ ID Nr.8 gezeigten Sequenz durch andere Nucleotide ersetzt sind, ist ein derartiger Ersatz bevorzugt, der die codierte Aminosäuresequenz der Komplementarität bestimmenden Bereiche (CDRs) nicht verändert, wie vorstehend für DNA beschrieben ist, die die variable Domäne der schweren Kette codiert.
Zur Aggregation des vollständigen tetrameren Immunglobulin-Moleküls und Expression chimärer Antikörper werden die rekombinanten DNA-Inserts, die die variablen Domänen der schweren und leichten Kette codieren mit den entsprechenden DNAs fusioniert, die die konstanten Domänen der schweren und leichten Kette codieren, und dann in geeignete Wirtszellen, beispielsweise nach Einbau in Hybridvektoren, transferiert.
Die Erfindung betrifft daher auch rekombinante DNAs, die ein Insert enthalten, das eine variable Domäne einer Mausleichten Kette eines Antikörper, der gegen die extrazelluläre Domäne von c-erbB-2 gerichtet ist, codiert, die mit einer humanen konstanten Domäne γ, beispielsweise γ1, γ2, γ3 oder γ4, vorzugsweise γ1 oder γ4, fusioniert ist. Die Erfindung betrifft gleichermaßen rekombinante DNAs, die ein Insert enthalten, das eine variable Domäne einer Maus-leichten Kette eines Antikörpers, der gegen die extrazelluläre Domäne von c-erbB-2 gerichtet ist, codiert, die mit einer humanen konstanten Domäne κ oder λ, vorzugsweise K fusioniert ist.
Die Erfindung betrifft insbesondere rekombinante DNAs, die einen vorstehend beschriebenen, rekombinanten Einketten-Antikörper codieren, beispielsweise rekombinante DNA, worin die variable Domäne der schweren Kette und die variable Domäne der leichten Kette mittels eines DNA-Inserts, das eine Spacergruppe codiert, verbunden sind, insbesondere eine rekombinante DNA, die ein Protein der Formel III codiert, worin FR&sub1;, FR&sub2;, FP&sub3;, FR&sub4;, FR&sub6;, FR&sub7;, FR&sub8;, FR&sub9;, SP, CDR1H, CDR2H, CDR3H, CDR1L, CDR2L und CDR3L die vorstehend aufgeführten Bedeutungen besitzen, welche gegebenenfalls weiter DNA umfaßt, die ein Effektormolekül und/oder Signalsequenzen codiert, welche das Verarbeiten des Antikörpers in der Wirtszelle erleichtert. Die Erfindung betrifft insbesondere eine DNA, welche ein Insert der DNA- Sequenz 9-728 der SEQ ID Nr.4 enthält, worin gegebenenfalls ein oder mehrere, beispielsweise 1-10, Nucleotid(e) durch andere Nucleotide ersetzt sind, insbesondere eine DNA, welche ein Insert der DNA-Sequenz 9-728 der SEQ ID Nr.4 umfaßt. Darüber hinaus betrifft die Erfindung eine DNA, die ein Insert der DNA- Sequenz 9-728 der SEQ ID Nr.8 enthält, worin gegebenenfalls ein oder mehrere, beispielsweise 1-10, Nucleotid(e) durch andere Nucleotide ersetzt sind, insbesondere eine DNA, welche ein Insert der DNA-Sequenz 9-728 der SEQ ID Nr.8 enthält.
In einer anderen Ausführungsform betrifft die Erfindung rekombinante DNAs, die eine rekombinante DNA codieren, worin die variable Domäne der schweren Kette und die variable Domäne der leichten Kette über ein DNA-Insert, das eine Spacergruppe codiert, verbunden sind, und gegebenenfalls eine Signalsequenz umfaßt, die das Verarbeiten des Antikörpers in der Wirtszelle erleichtert, und/oder eine DNA, die ein Peptid codiert, das die Reinigung des Antikörpers erleichtert und/oder eine DNA, die eine Spaltstelle codiert, und/oder eine DNA, die einen Peptidspacer codiert und/oder eine DNA, die ein Effektor-Molekül codiert.
Die DNA, die ein Effektormolekül codiert, soll eine DNA sein, die die vorstehend aufgeführten Effektormoleküle codiert, insbesondere eine DNA, die alkalische Phosphatase oder Pseudomonas Exotoxin A codiert. Die DNA, die ein derartlges Effektormolekül codiert, besitzt die Sequenz einer ein natürlich vorkommendes Enzym oder Toxin codierenden DNA, oder elner Mutante davon, und kann durch im Stand der Technik bekannte Verfahren hergestellt werden. Ein Mutant der natürlich vorkommenden DNA, die beispielsweise alkalische Phosphatase oder Pseudomonas Exotoxin A codiert, oder eine Variante davon, kann beispielsweise in zu den vorstehend beschriebenen Methoden analoger Art und Weise erhalten werden.
Am meisten bevorzugt ist eine DNA, die ein Insert der DNA- Sequenz 23-814 der SEQ ID Nr.5, der DNA-Sequenz 86-2155 der SEQ ID Nr.5 oder der DNA-Sequenz 23-2155 der SEQ ID Nr.5 enthält, worin gegebenenfalls ein oder mehrere, beispielsweise 1-10, Nucleotid(e) durch andere Nucleotide ersetzt sind, insbesondere eine DNA, die ein Insert der DNA-Sequenz 23-2155 der SEQ ID Nr.5 enthält.
Gleichermaßen bevorzugt ist eine DNA, welche ein Insert der DNA-Sequenz 1-1911 der SEQ ID Nr.10, der DNA-Sequenz 64- 1911 der SEQ ID Nr.10 oder der DNA-Sequenz 97-1911 der SEQ ID Nr.10 enthält, worin gegebenenfalls ein oder mehrere, beispielsweise 1-10, Nucleotid(e) durch andere Nucleotide ersetzt sind, insbesondere eine DNA, welche ein Insert der DNA-Sequenz 1-1911 der SEQ ID Nr.10 enthält, oder eine DNA, welche ein Insert der DNA-Sequenz 1-1911 der SEQ ID Nr.11, der DNA-Sequenz 64-1911 der SEQ ID Nr.11, der DNA-Sequenz 96-1911 der SEQ ID Nr.11 oder der DNA-Sequenz 97-1911 der SEQ ID Nr.11 enthält, worin gegebenenfalls ein oder mehrere, beispielsweise 1-10 Nucleotid(e) durch andere Nucleotide ersetzt sind, insbesondere eine DNA, die ein Insert der DNA-Sequenz 1-1911 der SEQ ID Nr.11 enthält.
Darüber hinaus betrifft die Erfindung eine rekombinante DNA, welche ein Hybridvektor ist, der ein Insert enthält, das die variable Domäne einer Maus-schweren Kette, wie vorstehend beschrieben, codiert und/oder ein Insert, das die variable Domäne einer Maus-leichten Kette, wie vorstehend beschrieben, codiert, einen Ursprung der Replikation oder eine autonom replizierende Sequenz, ein oder mehrere dominante Marker-Sequenzen und gegebenenfalls Expressionskontrollsequenzen, Signalsequenzen und zusätzliche Restriktionsschnittstellen.
In einer ersten Ausführungsform umfaßt der erfindungsgemäße Hybridvektor eine Expressionskasette, die einen Promotor und eine DNA enthält, die ein erfindungsgemäßes Protein codiert, das ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus einer variablen Domäne einer Maus-schweren Kette, einer variablen Domäne einer Maus-leichten Kette, einer variablen Domäne einer Maus-schweren Kette und einer variablen Domäne einer Mausleichten Kette, einem rekombinanten Einketten-Antikörper, einem Fusionsprotein und einem Fusionsprotein, das gegebenenfalls ein Peptid, das die Reinigung erleichtert, eine Schnittstelle und einen Peptidspacer enthält, wobei die DNA durch den Promotor kontrolliert wird, und Isolieren des Proteins.
In einer zweiten Ausführungsform umfaßt der erfindungsgemäße Hybridvektor eine Expressionskassette, die einen Promotor enthält, der mit einer ersten, ein Signalpeptid codierenden DNA-Sequenz funktionell verknüpft ist, die mit einer zweiten DNA-Sequenz in dem richtigen Leseraster verbunden ist, das ein erfindungsgemäßes Protein codiert, das aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus einer variablen Domäne einer Maus-schweren Kette, einer variablen Domäne einer Maus-leichten Kette, einer variablen Domäne einer Maus-schweren Kette und einer variablen Domäne einer Maus-leichten Kette, einem rekombinanten Einketten-Antikörper, und einem Fusionsprotein, das gegebenenfalls ein Peptid, das die Reinigung erleichtert, eine Schnittstelle und einen Peptidspacer enthält.
Vektoren besitzen im allgemeinen im Zusammenwirken mit kompatiblen Wirtszellen zwei Funktionen. Eine Funktion besteht darin, das Klonieren der Nucleinsäuren zu erleichtern, die die variablen Domänen des Immunglobulins codieren, d.h. verwendbare Mengen der Nucleinsäuren herzustellen (Klonierungsvektoren). Die andere Funktion besteht darin, die Replikation und Expression des rekombinanten Genkonstrukts in einem geeigneten Wirt, entweder durch Vorliegen als ein extrachromosomales Element, oder durch Integration in das Wirts-Chromosom sicherzustellen (Expressionsvektoren). Ein Klonierungsvektor enthält die rekombinanten Genkonstrukte, wie vorstehend beschrieben, einen Ursprung der Replikation oder eine autonom replizierende Sequenz, dominante Markersequenzen und, gegebenenfalls, Signalsequenzen und zusätzliche Restriktionsschnittstellen. Ein Expressionsvektor enthält darüber hinaus Expressionskontrollsequenzen, die für die Transkription und Translation des rekombinanten Gens erforderlich sind.
Ein Ursprung der Replikation oder eine autonom replizierende Sequenz wird entweder durch eine derartige Konstruktion des Vektors zur Verfügung gestellt, daß dieser einen exogenen Ursprung enthält, wie vom Affen-Virus 40 (SV40) oder einer anderen viralen Quelle abgeleitet, oder durch den chromosomalen Mechanismus der Wirtszelle.
Die Marker ermöglichen die Selektion von Wirtszellen, die den Vektor enthalten. Selektionsmarker beinhalten Gene, die gegen Schwermetalle, wie Kupfer, oder gegen Antibiotika, wie Geneticin (G-418) oder Hygromycin, Resistenz verleihen, oder Gene, die einen genetischen Defekt der Wirtszelle, wie das Fehlen von Thymidinkinase, Hypoxanthin-Phosphoryltransferase, Dihydrofolatreductase oder dergleichen, ausgleichen.
Signalsequenzen können beispielsweise Prä-Sequenzen oder sekretorische Leadersequenzen, die die Sekretion des rekombinanten Antikörpers steuern, Spleiß-Signale oder dergleichen sein. Beispiele für Signalsequenzen, die die Sekretion des rekombinanten Antikörpers steuern, sind Sequenzen, die von dem ompA-Gen, dem pelB-Gen (Pectatlyase), oder dem phoA-Gen abgeleitet sind.
Als Expressionskontrollsequenzen umfaßt die Vektor-DNA einen Promotor, Sequenzen, die zum Start und zur Beendigung der Transkription und für die Stabilisierung der mRNA erforderlich sind, und gegebenenfalls Verstärker und weitere regulatorische Sequenzen.
Eine große Vielzahl von Promotor-Sequenzen kann verwendet werden, je nach der Natur der Wirtszelle. Promotoren, die stark und gleichzeitig gut reguliert sind, sind am besten. Sequenzen für den Start der Translation sind beispielsweise Shine-Dalgarno-Sequenzen. Sequenzen, die für den Start und die Beendigung der Transkription und für die Stabilisierung der mRNA erforderlich sind, sind gewöhnlich aus den nicht-codierenden 5'-Bereichen bzw. 3'-Bereichen viraler oder eukaryotischer cDNAs, beispielsweise von dem Expressionswirt, erhältlich. Verstärker sind Transkription stimulierende DNA-Sequenzen viralen Ursprungs, beispielsweise solche, die vom Affenvirus, Polyoma-Virus, Rinder-Papillomavirus oder Moloney-Sarkomvirus abgeleitet sind, oder genomischen, insbesondere Maus- oder humanen Ursprungs.
Die verschiedenen DNA-Segemente der Vektor-DNA sind funktionell verknüpft, d.h. sie sind fortlaufend und in funktioneller Beziehung zueinander angeordnet. Beispiele für Vektoren, die zur Replikation und Expression in einem E.coli- Stamm geeignet sind, sind Bakteriophagen, beispielsweise Derivate des Bakteriophagen λ, oder Plasmide, wie insbesondere das Plasmid Cole1 und dessen Derivate, beispielsweise pMB9, pSF2124, pBR317 oder pBR322, und Plasmide, die von pbR322 abgeleitet sind, wie pUC9, pUCK0, pHRi148 und pLc24. Geeignete Vektoren enthalten ein vollständiges Replikon, ein Markergen, Erkennungssequenzen für Restriktionsendonucleasen, so daß die fremde DNA und, wenn geeignet, die Expressionskontrollsequenzen in diese Stellen inseriert werden können, und gegebenenfalls Signalsequenzen und Verstärker.
Mikrobielle Promotoren sind beispielsweise der stark nach links wirkende Promotor PL des Bakteriophagen λ, der durch einen temperatursensitiven Repressor kontrolliert wird. Ebenfalls geeignet sind Promotoren von E.coli, wie der lac (Lactose)-Promotor, der durch den lac-Repressor reguliert und durch Isopropyl-β-D-thiogalactosid induziert wird, der trp (Tryptophan)-Promotor, der durch den trp-Repressor reguliert und durch beispielsweise Tryptophanentzug induziert wird, und der tac (Hybrid trp-lac)-Promotor, der durch den lac-Repressor reguliert wird.
Vektoren, die zur Replikation und Expression in Hefe geeignet sind, enthalten einen Hefe-Replikationsstart und einen selektiven genetischen Marker für Hefe. Eine Gruppe derartiger Vektoren beinhaltet als Ursprung der Replikation sogenannte ars-Sequenzen (autonom replizierende Sequenzen) . Diese Vektoren werden nach der Transformation in der Hefezelle extrachromosomal beibehalten und werden autonom repliziert. Darüber hinaus können Vektoren verwendet werden, die die gesamte oder einen Teil der 2 µ (2 Mikron)-Plasmid-DNA von Saccharomyces cerevisiae enthalten. Derartige Vektoren werden durch Rekombination in 2 µ Plasmide, die bereits in der Hefezelle existiert, integriert, oder replizieren autonom. 2 µ-Sequenzen sind insbesondere dann geeignet, wenn eine hohe Transformationsfrequenz und eine hohe Kopienzahl erreicht werden sollen.
Expressionskontrollsequenzen, die zur Expression in Hefe geeignet sind, sind beispielsweise solche von stark exprimierten Hefegenen. Die Promotoren des TRP1-Gens, des ADHI- oder ADHII-Gens, des saure Phosphatase (PHO3 oder PHO5)-Gens, des Isocytochrom-Gens oder eines Promotors, der an der Glycolyse beteiligt ist, wie der Promotor des Enolase-, Glyceraldehyd-3- phosphatkinase- (PGK), Hexokinase-, Pyruvatdecarboxylase-, Phosphofructokinase-, Glucose-6-phosphatisomerase-, 3-Phosphoglyceratmutase-, Pyruvatkinase-, Triosephosphatisomerase-, Phosphoglucoseisomerase- und Glucokinase-Gens kann verwendet werden.
Vektoren, die zur Replikation und Expression in Säugerzellen geeignet sind, werden vorzugsweise mit Promotor-Sequenzen ausgestattet, die von DNA viralen Ursprungs, beispielsweise vom Affen-Virus 40 (SV40), Rous-Sarcomvirus (RSV), Adenovirus-2, Rinder-Papillomavirus (BPV), der Papovavirus BK-Mutante (BKV) oder dem Maus- oder humanem Cytomegalovirus (CMV) abgeleitet sind. Alternativ können die Vektoren Promotoren von Säuger-Expressionsprodukten enthalten, wie Actin, Collagen, Myosin usw., oder den nativen Promotor und Kontrollsequenzen, die normalerweise mit den gewünschten Gensequenzen verknüpft sind, d.h. dem Promotor der Immunglobulin H-Kette oder L-Kette.
Bevorzugte Vektoren sind sowohl bei prokaryotischen als auch eukaryotischen Wirten verwendbar und gehen auf virale Replikationssysteme zurück. Besonders bevorzugt sind Vektoren, die Affen-Virus-Promotoren enthalten, beispielsweise pSVgpt oder pSVneo, die weiter einen Verstärker enthalten, beispielsweise einen Verstärker, der normalerweise mit den Immunglobulin-Gensequenzen assoziiert ist, insbesondere den Maus IgH- oder L-Ketten-Verstärker.
Die rekombinante DNA, die einen erfindungsgemäßen rekombinanten Antikörper codiert, kann beispielsweise durch Züchten einer transformierten Wirtszelle und gegebenenfalls Isolieren der hergestellten DNA hergestellt werden.
Eine derartige DNA kann insbesondere durch ein Verfahren hergestellt werden, welches umfaßt:
a) Herstellen von Maus-DNA, die die variablen Domänen der schweren und/oder leichten Kette des Antikörpers mit der gewünschten Spezifität codiert, beispielsweise durch Isolieren der DNA aus dem Genom einer geeigneten Hybridomzellinie und Auswählen der gewünschten DNA unter Verwendung von DNA-Sonden, oder durch Isolieren von mRNA aus einer geeigneten Hybridomzellinie und Herstellen von cDNA, die die variablen Domänen der schweren und/oder leichten Kette des Antikörpers mit der gewünschten Spezifität codiert, unter Verwendung von Oligonucleotid-Primern,
b) Herstellen von DNA, die die gewünschte Signalsequenz codiert und/oder Herstellen von DNA, die ein Effektormolekül codiert, beispielsweise durch Isolieren der gewünschten DNA(s) aus einer geeigneten Quelle, beispielsweise einer genomischen Bank oder einer cDNA-Bank unter Verwendung von DNA-Sonden,
c) Synthetisieren von DNA, die die gewünschte Spacergruppe codiert, mittels chemischer Methoden,
d) Bilden rekombinanter Genen, die die rekombinanten Antikörper codieren, indem die DNA aus Schritt a) und gegebenenfalls b) und/oder c) in geeignete Hybridvektoren eingebaut werden,
e) Transferieren der erhaltenen Hybridvektoren in eine aufnehmende Wirtszelle oder Wiedergewinnen der DNA, die die rekombinanten Gene codiert und Transferieren der freien DNA in eine aufnehmende Wirtszelle,
f) Auswählen und Züchten der transformierten Wirtszelle, und
g) gegebenenfalls Isolieren der gewünschten DNA.
Die DNA gemäß Schritt a) des vorstehend beschriebenen Verfahrens kann durch Isolieren genomischer DNA oder durch Herstellen von cDNA aus isolierter mRNA erhalten werden. Genomische DNA aus Hybridomzellen wird durch im Stand der Technik bekannte Verfahren isoliert, welche Schritte für das Zerstören der Zellen, beispielsweise durch Lyse in Anwesenheit von Detergenzien wie Triton , Extrahieren der DNA, beispielsweise durch Behandeln mit Phenol und CHCl&sub3;/Isoamylalkohol, und Ausfällen der DNA beinhalten. Die DNA wird zerkleinert, zweckmäßigerweise durch 1 oder mehrere Restriktionsendonucleasen, wobei die so erhaltenen Fragmente auf einen geeigneten Träger überführt werden, beispielsweise Nitrocellulosemembranen, und mit einer DNA-Sonde auf die Anwesenheit der DNA-Sequenzen, die die betreffende Polypeptidsequenz codieren, untersucht werden, insbesondere auf die Anwesenheit umgelagerter H- und L-Ketten Ig-Gen-Orte. Mit diesem Verfahren werden DNA-Fragmente gefunden, die Inserts mit V-, D- und J-Bereichen der schweren Kette bzw. V- und J-Bereichen der leichten Kette zusammen mit einer Leadersequenz und gegebenenfalls Introns, beinhalten. cDNA von Hybridomzellen wird gleichermaßen durch im Stand der Technik bekannte Verfahren hergestellt, beispielsweise durch Extrahieren von zellulärer Gesamt-RNA, Isolieren von mRNA mit einer geeigneten chromatographischen Methode, beispielsweise Chromatographie an Oligo(dT)-Cellulose, Synthetisieren von cDNA mit einem Gemisch von Desoxynucleotidtriphosphaten und reverser Transkriptase in Anwesenheit von Oligonucleotidprimern, die zu geeigneten Bereichen in den Genen der konstanten Domäne der schweren und leichten Kette des Maus-Immunglobulins komplementär sind, und Isolieren der cDNA. Als Mittel zur Vereinfachung der DNA-Isolierung kann die gewünschte genomische DNA oder cDNA unter Verwendung der Polymerase-Ketten-Reaktions-(PCR)-Technologie amplifiziert werden. PCR beinhaltet wiederholte Runden der Verlängerung von 2 Primern ausgehend, die für DNA-Bereiche am jeweiligen Ende des Gens spezifisch sind. Vorzugsweise werden cDNA-Transkripte von gesamten mRNA aus der geeigneten Hybridomzellinie in einem Aufheiz-/Abkühlungs-Zyklus mit Taq- DNA-Polymerase in Anwesenheit von Primern behandelt, die zur Hybridisierung mit variablen Domänen von Ig H- bzw. L-Ketten angepaßt wurden.
Genomische DNA bzw. cDNA gemäß Schritt b) des vorstehend beschriebenen Verfahrens wird aus geeigneten Bakterien- oder Säugerzellen gemäß Methoden des Standes der Technik isoliert. Die unter a) beschriebenen Methoden werden vorzugsweise verwendet, wobei die entsprechenden Zellen der Ausgangsquelle durch die Maus-Hybridomzellen ersetzt werden und DNA-Sonden verwendet werden, die zur Hybridisierung mit den gewünschten Signalsequenzen oder den Genen, die die gewünschten Effektormoleküle codieren, angepaßt wurden. In Bakterien, bei denen eine Trennung von mRNA von Gesamt-RNA mit Oligo(dT)-Cellulose nicht möglich ist, wird cDNA aus Gesamt-RNA unter Verwendung entsprechender Oligonucleotid-Primer hergestellt. Die DNA-Isolierung wird durch die PCR-Technologie erheblich vereinfacht.
DNA gemäß Schritt c) wird durch herkömmliche chemische und enzymatische Methoden hergestellt, beispielsweise durch chemische Synthese von Oligonucleotiden zwischen 30 und 60 Basen mit überlappenden komplementären Sequenzen, Hybridisierung derartiger Oligonucleotide, und enzymatische Ligierung, gegebenenfalls nach Auffüllen fehlender Basen mit geeigneten Enzymen in Anwesenheit der entsprechenden Desoxynucleotidtriphosphate.
Die DNA-Sonde für die variablen Domänen der Mausketten kann eine synthetische DNA sein, eine cDNA, die von mRNA abgeleitet ist, die das gewünschte Immunglobulin codiert, oder eine genomische DNA oder ein DNA-Fragment mit bekannter Nucleotidsequenz. Als Sonden zum Nachweis und/oder zur Amplifizierung der umgelagerten Ig-Gen-Orte der variablen Domänen der L-/H-Ketten, werden DNA-Fragmente mit bekannter Nucleotidsequenz von benachbarten, konservierten, variablen oder konstanten Domänen gewählt, die die Ig-Orte der L-/H-Kette im Säuger, von dem die DNA abgeleitet ist, beispielsweise Balb/c-Mäuse, darstellen. Die DNA-Sonde wird mittels chemischer Methoden synthetisiert oder aus einem geeigneten Gewebe eines geeigneten Säugers, beispielsweise der Leber der Balb/c-Maus, isoliert, und mittels Standard-Methoden gereinigt. Wenn gewünscht kann die Sonden-DNA markiert werden, beispielsweise mit der wohlbekannten Nick-Translationstechnik radioaktiv markiert werden, und anschließend mit der DNA-Bank in Puffer und Salzlösungen, die Zusätze enthalten, beispielsweise Calciumchelatoren, Viskositäts-regulierende Verbindungen, Proteine, nicht-spezifische DNA und dergleichen, bei Temperaturen hybridisiert werden, die eine selektive Hybridisierung förden.
Sobald ein Fragment identifiziert wurde, das die gewünschte DNA-Sequenz enthält, kann dieses Fragment zur Entfernung nicht erforderlicher DNA weiter verarbeitet werden, an einem oder beiden Enden modifiziert werden, und zur Entfernung aller oder eines Teils der dazwischen liegenden Sequenzen behandelt werden, oder dergleichen.
Das Verbinden der verschiedenen DNA-Fragmente zur Herstellung rekombinanter Gene, die rekombinante Antikörper codieren, wird gemäß herkömmlicher Techniken durchgeführt, beispielsweise durch Ligierung glatter oder überhängender Enden, Spaltung mit Restriktionsenzymen, um die geeigneten, köhäsiven Enden zu liefern, Auffüllen der köhäsiven Enden, wie gewünscht, Behandlung mit alkalischer Phosphatase, um unerwünschtes Verbinden zu vermeiden, und Ligieren mit geeigneten Ligasen.
Der Transfer rekombinanter DNA, beispielsweise der Transfer von Hybridvektoren und die Wahl transformierter Zellen wird nachstehend beschrieben.
Darüber hinaus betrifft die Erfindung Wirtszellen, die mit den vorstehend aufgeführten rekombinanten DNAs transformiert sind, d.h. Wirtszellen, die mit einer DNA transformiert sind, die die schwere Kette codiert und/oder einer DNA, die die leichte Kette des gewünschten, rekombinanten Antikörpers codiert, insbesondere Wirtszellen, die mit einer DNA transformiert sind, die den bevorzugten rekombinanten Einketten-Antikörper codiert.
Die Erfindung betrifft insbesondere eine Wirtszelle, die mit einem Hybridvektor transformiert ist, der eine Expressionskassette umfaßt, die einen Promotor und eine DNA enthält, die ein erfindungsgemäßes Protein codiert, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einer variablen Domäne einer Mausschweren Kette, einer variablen Domäne einer Maus-leichten Kette, einer variablen Domäne einer schweren Kette und einer variablen Domäne einer leichten Kette, einem rekombinanten Einketten-Antikörper, einem Fusionsprotein, und einem Fusionsprotein, das weiter ein Peptid enthält, das die Reinigung erleichtert, eine Spaltstelle und einen Peptidspacer, wobei die DNA durch den Promotor kontrolliert wird.
Die Erfindung betrifft weiterhin eine Wirtszelle, die mit einem Hybridvektor transformiert wurde, der eine Expressionskassette umfaßt, die einen Promotor enthält, der mit einer ersten DNA-Sequenz funktionell verbunden ist, die ein Signalpeptid codiert und die in dem richtigen Leseraster mit einer zweiten DNA-Sequenz verbunden ist, die ein erfindungsgemäßes Protein codiert, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einer variablen Domäne einer Maus-schweren Kette, einer variablen Domäne einer Maus-leichten Kette, einer variablen Domäne einer Maus-schweren Kette und einer variablen Domäne einer Maus-leichten Kette, einem rekombinanten Einketten-Antikörper, einem Fusionsprotein, und einem Fusionsprotein, das weiter ein Peptid enthält, das die Reinigung erleichtert, eine Spaltstelle und einen Peptidspacer.
Die vorliegende Erfindung betrifft insbesondere ein Verfahren zur Herstellung eines erfindungsgemäßen Proteins, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einer variablen Domäne einer Maus-schweren Kette, einer variablen Domäne einer Maus-leichten Kette, einer variablen Domäne einer Maus-schweren Kette und einer variablen Domäne einer Maus-leichten Kette, einem rekombinanten Einketten-Antikörper, einem Fusionsprotein und einem Fusionsprotein, das weiter ein Peptid umfaßt, das die Reinigung erleichtert, eine Spaltstelle und einen Peptidspacer, welches umfaßt, Züchten eines Wirts, beispielsweise E.coli, der mit einem Hybridvektor transformiert wurde, der eine Expressionskassette umfaßt, die einen Promotor enthält, der mit einer ersten DNA-Sequenz funktionell verbunden ist, die ein Signalpeptid codiert und in dem richtigen Leseraster mit einer zweiten DNA-Sequenz verbunden ist, die das Protein codiert, und Isolieren des Proteins. Die erfindungsgemäßen Wirtszellen müssen in vitro gezüchtet werden können. Geeignete Wirtszellen sind prokaryontischen und eukaryontischen Ursprungs und sind beispielsweise Bakterienzellen, beispielsweise E.coli, Hefen, beispielsweise Saccharomyces cerevisiae, oder Säugerzellen. Zur Herstellung funktioneller chimärer humaner/Maus-Antikörper müssen die Wirtszellen höheren eukaryontischen Ursprungs sein, um eine geeignete Umgebung zur Herstellung aktiver Antikörper zu liefern, da die Biosynthese funktioneller tetramerer Antikörpermoleküle ein korrektes ursprüngliches Falten der Polypeptidkette, Glycosylierung und Aggregation erfordert.
Beispiele geeigneter Wirte sind Mikroorganismen, die keine oder wenige Restriktionsenzyme oder Modifizierungs-Enzyme aufweisen, wie Bakterien, insbesondere Escherichia coli Stämme, beispielsweise die Stämme E.coli X1776, E.coli Y1090, E.coli HB101, E.coli W3110, E.coli HB101/LM1035, E.coli JA221, E.coli DH5α, E.coli K12 oder E.coli CC118, Bacillus subtilis, Bacillus stearothermophilus, Pseudomonas, Haemophilus, Streptococcus und andere, und Hefen, beispielsweise Saccharomyces cerevisiae, wie S.cerevisiae GRF18. Weitere geeignete Wirtszellen sind Zellen höherer Organismen, insbesondere etablierte, kontinuierliche humane oder tierische Zellinien, beispielsweise humane embryonale Lungenfibroblasten L132, humane maligne Melanom-Bowes- Zellen, HeLa-Zellen, mit SV40-Virus transformierte Nierenzellen der afrikanischen grünen Meerkatze COS-7 oder Chinesen-Hamster- Ovarialzellen (CHO), oder Zellen lymphoiden Ursprungs, wie Lymphom-, Myelom-, Hybridom-, Triom- oder Quadrom-Zellen, beispielsweise PAI, Sp2/0 oder X63-Ag8.653-Zellen.
Die vorstehend aufgeführten E.coli-Stämme, insbesondere E.coli CC118 sind als Wirt bevorzugt.
Die Erfindung betrifft zudem Verfahren zur Herstellung transformierter Wirtszellen, wobei geeignete aufnehmende Wlrtszellen, wie vorstehend beschrieben, mit einem erfindungsgemäßen Hybridvektor transformiert werden und die transformierten Zellen ausgewählt werden.
Die Transformation von Mikroorganismen wird wie in der Literatur beschrieben durchgeführt, beispielsweise für S.cerevisiae (A. Hinnen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75 (1978), 1929), für Bacillus subtilis (Anagnostopoulos et al., J. Bacteriol. 81 (1961), 741) und für E.coli (M. Mandel et al., J. Mol. Biol. 53 (1970), 159).
Das Transformationsverfahren von E.coli-Zellen beinhaltet daher beispielsweise Ca²&spplus;-Vorbehandlung der Zellen, um elne Aufnahme von DNA zu ermöglichen, und Inkubieren mit dem Hybridvektor. Die nachfolgende Selektion der transformierten Zellen kann beispielsweise dadurch erreicht werden, daß die Zellen in ein selektives Wachstumsmedium überführt werden, das die Separation der transformierten Zellen von den Ausgangszellen, je nach der Natur der Markersequenz der Vektor-DNA ermöglicht. Bevorzugt wird ein Wachstumsmedium verwendet, das Wachstum von Zellen nicht erlaubt, die den Vektor nicht enthalten. Die Transformation von Hefe beinhaltet beispielsweise Schritte der enzymatischen Entfernung der Hefe-Zellwand mittels Glucosidasen, Behandlung der erhaltenen Sphäroblasten mit dem Vektor in Anwesenheit von Polyethylengycol und Ca²&spplus;-Ionen und Regeneration der Zellwand durch Einbetten der Sphäroblasten in Agar. Der Regenerationsagar wird vorzugsweise in einer Art und Weise hergestellt, daß gleichzeitig Regeneration und Selektion der transformierten Zellen, wie vorstehend beschrieben, ermöglicht wird.
Die Transformation von Zellen höheren eukaryotischen Ursprungs, wie Säuger-Zellinien, wird vorzugsweise durch Transfektion erreicht. Die Transfektion wird mit herkömmlichen Techniken, wie Calciumphosphat-Präzipitation, Mikroinjektion, Protoblasten-Fusion, Elektroporation, d.h. Einbringen von DNA durch einen kurzen elektrischen Puls, der vorübergehend die Permeabilität der Zellmembran erhöht, oder in Anwesenheit von Helfer-Verbindungen, wie Diethylaminoethyldextran, Dimethylsulfoxid, Glycerin oder Polyethylenglycol und dergleichen, durchgeführt. Nach dem Transfektions-Verfahren werden transfizierte Zellen identifiziert und selektiert, beispielsweise durch Züchten in einem Selektionsmedium, das abhängig von der Natur des Selektionsmarkers gewählt wird, beispielsweise Standard- Kulturmedien, wie Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium (DMEM), Minimal-Essential-Medium, RPMI164O-Medium und dergleichen, das beispielsweise entsprechende Antibiotika enthält.
Die Wirtszellen werden mit dem rekombinanten L-Ketten-Genkonstrukt allein, mit dem rekombinanten H-Ketten-Genkonstrukt allein, mit beiden, entweder nacheinander oder gleichzeitig, oder unter Verwendung eines Vektorkonstrukts, das sowohl die L- Ketten- als auch die H-Ketten-Gene enthält, beispielsweise ein rekombinantes Einketten-Antikörper-Genkonstrukt, wie vorstehend aufgeführt, transformiert.
Wirtszellen sind bevorzugt, die mit einem rekombinanten Einketten-Antikörper-Genkonstrukt transformiert sind, das DNA enthält, die die variable Domäne der schweren Kette eines anti- c-erbB-2-Antikörpers codiert, DNA, die eine Spacergruppe codiert, DNA, die die variable Domäne der leichten Kette eines anti-c-erbB-2-Antikörpers codiert, und DNA, die ein Effektormolekül codiert, insbesondere solche, die mit dem bevorzugten, vorstehend aufgeführten, rekombinanten Einketten-Antikörper- Genkonstrukt transfiziert sind. Weitere Beispiele für erfindungsgemäße Wirtszellen sind Zellen, die mit ähnlichen rekombinanten Plasmiden transfektiert sind, die alternative Orientierungen der H- und L-Ketten-Genkonstrukte enthalten, und solche, die zusätzliche DNA-Elemente beinhalten, die eine hohe Expression der rekombinanten Antikörper erleichtern.
Die erfindungsgemäßen Wirtszellen sind genetisch stabil, sezernieren erfindungsgemäße rekombinante Antikörper konstanter Spezifität und können aus tiefgefrorenen Kulturen durch Auftauen und erneutes Klonieren aktiviert werden.
Die transformierten Wirtszellen werden durch im Stand der Technik bekannte Verfahren in einem flüssigen Medium gezüchtet, das assimilierbare Quellen von Kohlenstoff, beispielsweise Kohlenhydrate, wie Glucose oder Lactose, von Stickstoff, beispielsweise Aminosäuren, Peptide, Proteine oder deren Abbauprodukte, wie Peptone, Ammoniumsalze oder dergleichen und anorganische Salze, beispielsweise Sulfate, Phosphate und/oder Natrium-, Kalium-, Magnesium- und Calcium-Carbonat, enthält. Das Medium enthält darüber hinaus beispielsweise wachstumsfördernde Substanzen, wie Spurenelemente, beispielsweise Eisen, Zink, Mangan und dergleichen.
Das Medium wird vorzugsweise so gewählt, daß ein Selektionsdruck ausgeübt wird und das Wachstum von Zellen verhindert wird, die nicht transformiert wurden oder den Hybridvektor verloren haben. Daher wird dem Medium beispielsweise ein Antibiotikum zugesetzt, wenn der Hybridvektor als Marker ein Antibiotikum- Resistenzgen enthält. Wenn beispielsweise eine Wirtszelle verwendet wird, die hinsichtlich einer essentiellen Aminosäure auxotroph ist, während der Hybridvektor ein Gen enthält, das ein Enzym codiert, das den Defekt des Wirts ausgleicht, wird ein Minimalmedium, dem diese Aminosäure fehlt, dazu verwendet, die transformierten Zellen zu züchten.
Zellen höheren eukaryontischen Ursprungs, wie Säugerzellen, werden unter Gewebekulturbedingungen gezüchtet, wobei im Handel erhältliche Medien verwendet werden, beispielsweise Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium (DMEM), Minimal-Essential- Medium, RPMI164O-Medium und dergleichen, wie vorstehend aufgeführt, die gegebenenfalls mit wachtsumsfördernden Substanzen und/oder Säugerseren ergänzt sind. Techniken zum Züchten von Zellen unter Gewebekulturbedingungen sind im Stand der Technik wohlbekannt und beinhalten homogene Suspensionskultur, beispielsweise in einem Druckluftbehälter, oder in einem Behälter mit kontinuierlichem Rühren, oder immobilisierte oder eingeschlossene Zellkultur, beispielsweise in Hohlfasern, Mikrokapseln, auf Agarose-Mikrokügelchen, porösen Glaskügelchen, keramischen Hülsen, oder anderen Mikroträgern.
Das Züchten wird durch im Stand der Technik bekannte Verfahren durchgeführt. Die Kulturbedingungen, wie Temperatur, der pH-Wert des Mediums und Fermentationszeit, werden so gewählt, daß ein maximaler Titer des erfindungsgemäßen Polypeptids oder Derivats erhalten wird. Ein E.coli- oder Hefe-Stamm wird daher vorzugsweise unter aeroben Bedingungen in Kultur in Lösung unter Schütteln oder Rühren bei einer Temperatur von etwa 20º bis 40ºC, vorzugsweise bei etwa 30ºC und einem pH-Wert von 4-8, vorzugsweise etwa 7, für etwa 4 bis 30 Stunden, vorzugsweise bis maximale Ausbeuten des erfindungsgemäßen Polypeptids oder Derivats erreicht werden, gezüchtet.
Wenn die Zelldichte einen ausreichenden Wert erreicht hat, wird die Kultur unterbrochen und das Polypeptid oder das Derivat kann isoliert werden. Wenn der Hybridvektor eine geeignete Signalsequenz zur Sekretion enthält, wird das Polypeptid oder das Derivat durch die transformierten Zellen direkt in das Kulturmedium sezerniert. Andernfalls müssen die Zellen zerstört werden, beispielsweise durch Behandlung mit einem Detergenz, wie SDS, NP-40 , Triton oder Desoxycholsäure, mit Lysozym oder einem ähnlich wirkenden Enzym lysiert oder durch einen osmotischen Schock oder Ultraschall aufgebrochen werden. Das Aufbrechen der Zellen ist ebenfalls erforderlich, wenn die Signalsequenz die Sekretion des gewünschten Proteins in das Periplasma der Zelle leitet. Bei Verwendung von Hefe als Wirts- Mikroorganismus, kann die Zellwand durch enzymatisches Spalten mit einer Glucosidase entfernt werden. Alternativ oder zusätzlich können mechanische Kräfte, wie Scherkräfte (beispielsweise eine stehende Presse, eine Dynomühle und dergleichen), oder Schütteln mit Glaskügelchen oder Aluminiumoxid, oder abwechselndem Einfrieren, beispielsweise in flüssigem Stickstoff, und Auftauen, beispielsweise bei 30º - 40ºC, sowie Ultraschall zum Aufbrechen der Zellen verwendet werden.
Der Zellüberstand oder die Lösung, der/die erhalten wurde nach Zentrifugation des Gemisches, das nach Aufbrechen der Zelle erhalten wurde und das Proteine, Nucleinsäuren und andere Zellbestandteile enthält, ist an Proteinen, einschließlich der erfindungsgemäßen Polypeptide in einer an sich bekannten Art und Weise angereichert. So werden beispielsweise die meisten der nicht-Protein-Bestandteile durch Behandlung mit Polyethylenimin entfernt und die Proteine, einschließlich der erfindungsgemäßen Polypeptide und Derivate, werden ausgefällt, beispielsweise durch Sättigung der Lösung mit Ammoniumsulfat oder mit anderen Salzen. Andernfalls wird der Zellüberstand oder das Lysat durch Filtrieren durch geeignete Membranen und/oder mit chromatographischen Methoden, beispielsweise Affinitätschromatographie, direkt vorgereinigt.
Die erfindungsgemäßen rekombinanten Antikörper und monoklonalen Antikörper können zur qualitativen und quantitativen Bestimmung der extrazellulären Domäne des Wachstumsfaktor- Rezeptors c-erbB-2 verwendet werden. Dies ist insbesondere bei der Überwachung des Tumor-Wachstums, zur Entscheidung, ob ein Tumor einer Behandlung mit den erfindungsgemäßen rekombinanten oder monoklonalen Antikörper zugänglich ist, und zur Überwachung der Behandlung des Tumors mittels Chemotherapie nützlich. Die in Betracht gezogenen Tumoren sind solche, die erbB-2 überexprimieren, beispielsweise Brust- oder Ovarial- Tumore.
Im allgemeinen können die erfindungsgemäßen, monoklonalen und rekombinanten Antikörper in jedem der bekannten Immunassays verwendet werden, der auf die Bindungs-Wechselwirkung zwischen Antikörper und dem Antigen, d.h. der extrazellulären Domäne des c-erbB-2-Proteins, zurückgeht. Beispiele derartiger Assays sind Radio-, Enzym-, Fluoreszenz-, Chemilumineszenz- Immunpräzipitation-, Latex-Agglutinierungs- und Hemagglutinierungs-Immunassays, und insbesondere Immunfärbemethoden.
Die erfindungsgemäßen Antikörper können als solche verwendet werden, oder in Form von mit Enzym verbundenen Derivaten in einem Enzym-Immunassay. Jede der bekannten Modifizierungen eines Enzym-Immunassays kann verwendet werden, beispielsweise Enzym-Immunassay in löslicher Phase (homogen), Fest-Phasen- Enzym-Immunassay (heterogen), Einzel-Enzym-Immunassay oder Doppel-Enzym-Immunassay (Sandwich) mit direkter oder indirekter (kompetitiver) Bestimmung des c-erbB-2-Proteins.
Ein Beispiel für einen derartigen Enzym-Immunassay ist ein Sandwich-Immunassay, bei dem ein geeigneter Träger, beispielsweise die Kunststoffoberfläche einer Mikrotiterplatte oder eines Teströhrchens, beispielsweise Polystyrol, Polypropylen oder Polyvinylchlorid, Glas oder Kunststoffkügelchen, Filterpapier, Dextran usw., Celluloseacetat- oder Nitrocelluloseblätter, magnetische Teilchen oder dergleichen, mit einem erfindungsgemäßen, monoklonalen Antikörper durch einfache Adsorption, oder gegebenenfalls nach Aktivierung des Trägers, beispielsweise mit Glutaraldehyd oder Cyanbromid, beschichtet wird. Anschließend werden die Testlösungen, die das lösliche c- erbB-2-Protein enthalten, und schließlich die erfindungsgemäßen rekombinanten Einketten-Antikörper, die ein nachweisbares Enzym umfassen, beispielsweise alkalische Phosphatase, zugesetzt. Die Menge an löslichem c-erbB-2-Protein in der Testlösung ist direkt proportional zu der Menge an gebundenem, rekombinantem Antikörper und wird durch Zugabe einer Enzym-Substratlösung bestimmt. Die Enzym-Substrat-Reaktion führt beispielsweise zu einer Farbänderung, die mit dem Auge oder mit optischen Meßvorrichtungen beobachtet werden kann.
Die erfindungsgemäßen Antikörper können als solche oder in Form radioaktiv markierter Derivate in einem Radioimmunassay (RIA) verwendet werden. Wie vorstehend für Enzym-Immunassays beschrieben, kann jede der bekannten Modifikationen eines Radioimmunassays verwendet werden.
Die Tests werden in zu den vorstehend beschriebenen Enzym- Immunassays analoger Art und Weise unter Verwendung eines radioaktiven Markers, beispielsweise ¹²&sup5;I, anstelle eines Enzym-Markers durchgeführt. Die Menge des gebildeten Immunkomplexes, die der Menge des in der Testlösung vorhandenen c- erbB-2-Proteins entspricht, wird durch Messen der Radioaktivität des Immunkomplexes bestimmt.
Zur Immunfärbung werden Cryosektionen von tiefgefrorenem Biopsie-Material, oder in Paraffin eingebettete Gewebeteile mit einer Lösung behandelt, die einen erfindungsgemäßen rekombinanten Antikörper, der ein nachweisbares Enzym umfaßt, enthält. Der gebundene rekombinante Antikörper wird durch Behandlung mit einem geeigneten Enzym-Substrat nachgewiesen, vorzugsweise mit einem Enzym-Substrat, das zu einer festen Ablagerung (Farbe) an der Stelle des erfindungsgemäßen rekombinanten Antikörpers führt. Anstelle von rekombinanten Antikörpern mit einem Enzym, kann ein rekombinanter Antikörper mit Strepatvidin und eine Lösung eines Biotin-Enzym-Konjugats verwendet werden, die zu einer höheren Enzym-Konzentration an der Stelle des Antikörpers führt und daher die Sensitivität der Immunfärbemethode erhöht. Die feste Ablagerung des Enzym-Substrats wird durch Untersuchung mit einem Mikroskop, beispielsweise einem Fluoreszenz-Mikroskop, oder durch Abtasten der optischen Dichte bei der Wellenlänge der Farbe nachgewiesen.
Die erfindungsgemäße Verwendung von rekombinanten und/oder monoklonalen Antikörpern, wie vorstehend beschrieben, zur Bestimmung des c-erbB-2-Proteins, beinhaltet ebenso andere per se bekannte Immunassays, beispielsweise Immunfluoreszenz-Assays, Latex-Agglutination mit Latex-Teilchen, die mit Antikörpern oder Antigen beschichtet sind, Hemagglutination mit roten Blutkörperchen, die mit Antikörpern oder mit Antigen beschichtet sind, Assays mit nicht-sichtbarem Licht unter Verwendung einer Antikörper-beschichteten optischen Faser und anderen, dlrekt wirkenden Immunsensoren, die die Bindung in ein elektrisches oder optisches Signal umwandeln, oder dergleichen.
Die Erfindung betrifft zudem Test-Kits zur qualitativen und quantitativen Bestimmung des c-erbB-2-Proteins, welche erfindungsgemäße rekombinante Antikörper und/oder erfindungsgemäße monoklonale Antikörper, und gegebenenfalls Zusätze, umfassen.
Erfindungsgemäße Test-Kits für einen Enzym-Immunassay enthalten beispielsweise einen geeigneten Träger, gegebenenfalls gefriergetrocknete Lösungen eines monoklonalen Antikörpers, gegebenenfalls gefriergetrocknete oder konzentrierte Lösungen eines rekombinanten Antikörpers, der ein Enzym oder Streptavidin umfaßt, Lösungen eines Enzym-Biotin-Konjugats, wenn ein rekombinanter, Streptavidin umfassender Antikörper verwendet wird, Enzym-Substrat in fester oder gelöster Form, Standardlösungen des c-erbB-2-Proteins, Pufferlösungen, und gegebenenfalls Polypeptide oder Detergenzien zur Verhinderung nicht- spezifischer Adsorption und Aggregat-Bildung, Pipetten, Reaktionsgefäße, Kalibrierungs-Kurven, Instruktions-Handbücher und dergleichen.
Erfindungsgemäße Test-Kits zur Immunfärbung enthalten beispielsweise gegebenenfalls gefriergetrocknete oder konzentrierte Lösungen eines rekombinanten Antikörpers, der ein Enzym oder Streptavidin umfaßt, Lösungen eines Enzym-Biotin-Konjugats, wenn ein rekombinanter, Streptavidin umfassender Antikörper verwendet wird, Enzym-Substrat in fester oder gelöster Form, Pufferlösungen und gegebenenfalls Pipetten, Reaktionsgefäße, Kalibrierungskurven, Instruktions-Handbücher und dergleichen.
Die erfindungsgemäßen, rekombinanten und monoklonalen Antikörper können zur qualitativen und quantitativen Bestimmung des c-erbB-2-Proteins verwendet werden. Aufgrund der Tatsache, daß der Wachstumsfaktor-Rezeptor c-erbB-2 in bestimmten Tumor- Typen, beispielsweise Brust- und Ovarial-Tumoren, überexprimiert wird, sind die Antikörper zum Nachweis und Beobachten der erwähnten Tumore gut geeignet. Darüber hinaus können radioaktiv markierte Derivate der erfindungsgemäßen Antikörper für die in vivo Lokalisierung von Tumoren in einem Patienten unter Verwendung von Radioabtastungs-Techniken verwendet werden. Dazu werden radioaktiv markierte Derivate der erfindungsgemäßen Antikörper in den Patienten injiziert, und der Patient wird mit einem Gamma-Bildwiedergabegerät in regelmäßigen Abständen untersucht. Zellen, die den Wachstumsfaktor-Rezeptor c-erbB-2 überexprimieren, nehmen mehr radioaktive Antikörper auf, als anderes Gewebe und werden durch die Gamma-Bildwiedergabe-Kamera klar erkannt. Erfindungsgemäße, rekombinante und monoklonale Antikörper, die mit ¹³¹I oder mit 99mTc markiert sind, werden bevorzugt zur Radioabtastung in Mengen von 3 - 8 µg, was 15 - 30 µCi entspricht, pro kg Körpergewicht verwendet.
Die erfindungsgemäßen Antikörper können weiter zur Isolierung und Reinigung des c-erbB-2-Proteins aus natürlichen Quellen oder aus transformierten Wirtszellen durch Immunaffinitätschromatographie verwendet werden.
Weiterhin sind die erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper und rekombinanten Antikörper, insbesondere die rekombinanten Antikörper, die ein Effektormolekül, insbesondere ein Toxin, insbesondere Pseudomonas Exotoxin, umfassen, zur Behandlung von Patienten mit Tumoren verwendbar, die den Wachstumsfaktor-Rezeptor c-erbB-2 überexprimieren, beispielsweise Brust- oder Ovarial-Tumore. Wenn gewünscht, kann die Tumortherapie Verabreichen von mehr als einem, beispielsweise zwei unterschiedlichen, erfindungsgemäßen Antikörpern beinhalten, beispielsweise Verabreichen von FRP5 und FWP51. Die rekombinanten Antikörper, die eine Phosphatase umfassen, können in Verbindung mit einem phosphorylierten, inaktiven Stoff, wie Mitomycinphosphat oder Etoposidphosphat, verwendet werden, wobei die Umwandlung des inaktiven Stoffes in das aktive Arzneimittel an der Tumorstelle ermöglicht wird.
Die Erfindung betrifft daher pharmazeutische Zusammensetzungen zur Behandlung von Tumoren, die den Wachstumsfaktor- Rezeptor c-erbB-2 überexprimieren, welche eine therapeutisch wirksame Menge eines erfindungsgemäßen rekombinanten Antikörpers oder monoklonalen Antikörpers und einen pharmazeutisch verträglichen Träger umfaßt. Pharmazeutische Zusammensetzungen zur parenteralen Behandlung sind bevorzugt. Zusammensetzungen für intramuskuläre, subkutane oder intravenöse Anwendung sind beispielsweise isotonische, wäßrige Lösungen oder Suspensionen, die gegebenenfalls kurz vor Verwendung aus lyophilisierten oder konzentrierten Zubereitungen hergestellt werden. Suspensionen in Öl enthalten als ölige Komponente für Injektionen gebräuchliche Gemüse-, synthetische- oder halbsynthetische Öle. Die pharmazeutischen Zusammensetzungen können sterilisiert werden und enthalten Zusätze, beispielsweise zum Konservieren, Stabilisieren, Benetzen, Emulgieren oder Solubilisieren der Inhaltsstoffe, Salze für die Regulierung des osmotischen Drucks, Puffer und/oder Verbindungen, die die Viskosität regeln, beispielsweise Natriumcarboxycellulose, Carboxymethylcellulose, Natriumcarboxymethylcellulose, Dextran, Polyvinylpyrrolidin oder Gelatine.
Die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen enthalten etwa 0,01 % bis zu etwa 50 % aktive Inhaltsstoffe. Sie können in Dosis-Einheitsform vorliegen, wie als sofort verwendbare Ampullen oder Arzneifläschchen, oder auch in lyophilisierter, fester Form.
Im allgemeinen liegt die therapeutisch wirksame Dosis für Säuger zwischen etwa 5 bis 20 µg eines erfindungsgemäßen rekombinanten oder monoklonalen Antikörpers pro Kg Körpergewicht, je nach dem Antikörpertyp, dem Zustand des Patienten und der Verabreichungsart. Die spezifische Darreichungsform und die geeignete Dosis wird durch den behandelnden Arzt unter Berücksichtigung der Besonderheiten des Patienten, dem Stadium der Erkrankung, dem Typ des zu behandelnden Tumors und dergleichen gewählt. Die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen werden durch im Stand der Technik bekannte Verfahren hergestellt, beispielsweise durch herkömmliches Mischen, Auflösen, Konfektionierungs- oder Lyophilisierungs-Verfahren. Pharmazeutische Zusammensetzungen zur Injektion werden verarbeitet, in Ampullen oder Arzneimittelfläschchen gefüllt, und unter aseptischen Bedingungen nach im Stand der Technik bekannten Verfahren versiegelt.
Die Erfindung betrifft insbesondere die monoklonalen Antikörper, Hybridomzellinien, die rekombinanten Einketten-Antikörper, die rekombinanten DNAs, die transformierten Wirtszellen und die Verfahren zur Herstellung davon, wie in den Beispielen beschrieben ist. Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung, begrenzen sie jedoch in keiner Weise.

Abkürzungen

ATP Adenosintriphosphat
BSS Earles ausgeglichene Salzlösung
BSA Rinderserumalbumin
DEAE Diethylaminoethyl
DMEM Dulbeccos modifiziertes Eagles Methode
dNTP Desoxynucleotidtriphosphat
DTT Dithiothreitol
EDTA Dinatriumethylendiamintetraacetat
EGF Epidermis-wachstumsfaktor
EGTA Ethylenglycol-bis-(β-aminoethylether)-N,N,N' ,N'- tetraessigsäure
FCS Fötales Kälberserum
HAT-Medium Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin-Medium
HEPES N-2-Hydroxyethylpiperazin-N'-2-ethansulfonsäure
HT-Medium Hypoxanthin und Thymidin-Medium
Ig Immunglobulin
IPTG Isopropyl-β-thiogalactosid
mAk Monoklonaler Antikörper
PBS Phosphat-gepufferte Salzlösung
PCR Polymerase-Kettenreaktion
PMSF Phenylmethylsulfonylfluorid
SDS-PAGE Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelelektrophorese
TRIS Tris-(hydroxymethyl)aminomethan
U Einheit
VL Variable Domäne der leichten Kette
VH Variable Domäne der schweren Kette
XP 5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphat-p-toluidinsalz

Beispiele

Beispiel 1. Herstellung der Hybridomzellinien FRP5, FSP16, FWP51 und FSP77 1.1 Antigen-Quelle und Immunisierung von Balb/c-Mäusen:

Die humane Brusttumor-Zellinie SKBR3 (ATCC HTB 30), die 1970 aus einem Pleuraerguß einer Brustkrebs-Patientin isoliert wurde, exprimiert etwa 1x10&sup6; Moleküle des c-erbB-2- Rezeptorproteins pro Zelle. 20x10&sup6; SKBR3-Zellen in PBS werden subkutan und/oder intraperitoneal in Balb/c-Mäuse injiziert. Die Zellen werden mit Freunds vollständigem Adjuvans 1:1 (Vol./Vol.) gemischt. Die Injektionen werden insgesamt 5 mal über einen Zeitraum von etwa 3 Monaten wiederholt, wobei Freunds vollständiges Adjuvans durch unvollständiges Adjuvans ersetzt wird. Die letzte Injektion von Zellen wird 3 Tage vor der Fusion verabreicht.

1.2 Zellfusion

Immunisierte Mäuse werden getötet und ihre Milzzellen gemäß herkömmlichen Methoden (Koehler & Milstein, Nature 256 (1976), 495) fusioniert. Milzzellen werden mit dem Fusionspartner, der Maus-Myelomzellinie PAI (Stoker et al., Research Disclosure Nr.21713, 1982), in Anwesenheit von 41 % Polyethylenglyol 4000 (Merck) in einem Verhältnis von 5:1 bis 10:1 vermischt. Die fusionierten Zellen werden in einer Dichte von 1x10&sup6; Zellen pro Vertiefung in Mikrotiterplatten mit 24 Vertiefungen auf peritoneale Makrophagen ausplattiert und 3 mal pro Woche mit Standard HAT-Selektionsmedium für 2 Wochen, gefolgt von HT-Medium für 2 Wochen, versorgt. Wenn das Wachstum von Hybridomzellen sichtbar wird, werden die Überstände wie in Beispiel 1.3 untersucht. Positive Hybridome werden kloniert und gelagert.

1.3 Antikörper-Nachweis in Hybridom-Überständen

Kulturflüssigkeiten von expandierenden Hybridomen werden auf die Anwesenheit von anti-c-erbB-2-Antikörper unter Verwendung eines Protokolls getestet, das zwei Schritte beinhaltet, Immunfluoreszenz und Immunpräzipitation.

1.3.1 Immunfluoreszenz

In dem ersten Schritt werden Hybridom-Überstände auf deren Immunfluoreszenzfärbung von Mauszellen untersucht, die große Mengen des humanen c-erbB-2-Proteins exprimieren. Zur Isolierung dieser Zellen wird die Maus-Brust-Epithelzellinie HC11 (Ball et al., EMBO J. 7 (1988), 2089) gemäß herkömmlicher, vorstehend beschriebener, Methoden (Graham & van der Eb, Virology 52 (1973), 456) mit einem Plasmid transfiziert, das das humane c-erbB-2-Protein exprimiert (Masuko et al., Jpn. Cancer Res. 80 (1989), 10), und mit dem Plasmid pSV2neo (Southern & Berg, J. Mol. Appl. Genet. 1 (1982), 327), das das Resistenzgen gegen den Stoff G418 codiert. Transfizierte Zellen werden 2 Wochen in einem Medium selektiert, das 200 µg/ml G418 (Geneticin, Gibco- BRL) enthält. Einzelne Klone werden selektiert und auf Expression des humanen c-erbB-2-Proteins unter Verwendung herkömmlicher Protein-Blot-Techniken analysiert (Towbin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76 (1979), 4350). Ein Klon, der große Mengen des c-erbB-2-Proteins codiert (Klon R1#11), wird gewählt und in dem Immunfluoreszenz-Assay verwendet. Nichttransfizierte HC11-Zellen dienen als Kontrollzellen.
Der Assay wird in der folgenden Art und Weise durchgeführt. Die Zellen (R1#11 oder HC11) werden in RPMI-Medium, das 8 % Hitze-inaktiviertes FCS (Amimed), 10 ng/ml EGF (Inotech) und 5 µg/ml Insulin (Sigma) enthält, für 1-2 Tage auf mit Fibronectin (Boehringer Mannheim) beschichteten Deckplättchen gezüchtet. Die mit Fibronectin beschichteten Deckplättchen werden hergestellt und bei Raumtemperatur gelagert, und sie werden routinemäßig zum Screenen verwendet. Die Deckplättchen werden mit PBS gewaschen, das Calcium und Magnesium enthält, und durch 10 minütige Behandlung mit 3,7 % Formaldehyd (Vol./Vol. in PBS) fixiert. Zur Reduktion von nicht-spezifischem Binden, werden die Deckplättchen 20 Minuten in PBS inkubiert, das 3 % BSA (Sigma) enthält. Die Deckplättchen werden in PBS und in Wasser gewaschen, dann bei Raumtemperatur trocknen gelassen. 20-30 µl der Hybridom-Überstände werden zu abgegrenzten Bereichen auf einem Deckplättchen gegeben, das 1-2 Stunden bei Raumtemperatur in einer feuchten Atmosphäre inkubiert wird. Die Deckplättchen werden dann 3 mal mit PBS gewaschen, das 0,05 % Triton-X-100 (Fluka) enthält, und eine weitere Stunde mit anti-Maus Ig, mit Fluorescein verknüpften ganzen Antikörpern vom Schaf (Amersham) inkubiert. Nach dreimaligem Waschen mit PBS und einmaligem Waschen mit Wasser werden die Zellen auf Fluoreszenz unter Verwendung eines Fluoreszenzmikroskops und einer Wasser-Immersionslinse untersucht. Die Hybridom-Überstände, die positiv sind, werden in dem in Beispiel 1.3.2 beschriebenen zweiten Schritt untersucht.

1.3.2 Immunpräzipitation und Protein-Blot-Analyse

Die humanen Brusttumor-Zellen SKBR3 exprimieren ungefähr 1x10&sup6; Moleküle des c-erbB-2-Proteins pro Zelle. Ein Zellysat wird durch Extrahieren von etwa 4x10&sup6; Zellen in 1 ml Puffer, der 1 % Triton-X100 (Fluka), 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 5 mM EGTA, 0,15 M NaCl, 1 mM PMSF (Boehringer Mannheim), 80 µg/ml Aprotinin (Boehringer Mannheim), 50 µg/ml Leupeptin (Boehringer Mannheim), und 4 µg/ml Pepstatin (Boehringer Mannheim) enthält, hergestellt. 200-500 µl des Überstandes der Hybridome, die in dem in Beispiel 1.3.1 beschriebenen Immunfluoreszenz-Assay positiv sind, werden mit 100 µl des SKBR3-Extrakts (2,5-4,0 mg/ml) inkubiert. Diese Extraktmenge enthält ungefähr 50-100 ng des c-erbB-2-Proteins. Die Hybridom-Überstände und der SKBP3- Extrakt werden über Nacht auf Eis inkubiert, worauf 1 µl der IgG-Fraktion des Schaf-anti-Maus Ig (ICN Immunobiologicals) zugesetzt wird. Die Komplexe werden durch Zugabe von Protein-A- Sepharose (Pharmacia) gewonnen, mit TNET (140 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 5 mM EDTA, 1 % Triton X-100 ) und Wasser gewaschen, in Probenpuffer (80 mM Tris-HCl, pH 6,8, 0,2 % SDS, 10 % Glycerin) gekocht, und die Überstände werden auf 8 % SDS- PAGE aufgetragen. Die Proteine werden elektrophoretisch aufgetrennt und auf PVDF-Membranen (Millipore), unter Verwendung einer Technik, die ursprünglich von Towbin et al. beschrieben wurde (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76 (1979), 4350), mit einigen Abänderungen, überführt. Die Proteine werden unter Verwendung einer halbtrocken-Blot-Vorrichtung (G.Frobel, Model 1004.01) gemäß den Hersteller-Instruktionen überführt. Die Membranen werden in PBS, das 0,5 % Gelatine (Merck) enthält, für 1 Stunde bei 37ºC blockiert. Die Membranen werden 2 mal für 5 Minuten bei 37ºC in PTG (PBS, das 0,02 % Gelatine (Merck) und 0,25 % Triton-X100 (Fluka) enthält, gewaschen. Das c-erbB-2-Protein wird durch Inkubieren der Membran für 45 Minuten bei 37ºC in PTG, das ein gegen die 13 Carboxy-terminalen Aminosäuren des c- erbB-2-Proteins hergestelltes Antiserum enthält (Gullick et al., Int. J. Cancer 40 (1987), 246, Antiserum 21N), nachgewiesen. Die Membranen werden 3 mal für 5 Minuten bei 37ºC in PTG gewaschen. Das an der Membran gebundene 21N-Antiserum wird durch Inkubieren der Membran in PTG, das 0,1 µCi/ml ¹²&sup5;I-markiertes Protein-A (Amersham) enthält, nachgewiesen. Die Membranen werden 4 mal für 5 Minuten bei 37ºC in PTG gewaschen und einem Röntgenfilm ausgesetzt. Die Hybridome, deren Überstände das c-erbB-2-Protein spezifisch immunpräzipitieren können, werden zur Klonierung einzelner Zellen gezüchtet und wie nachstehend beschrieben weiter charakterisiert.

Beispiel 2. Charakterisierung von c-erbB-2-spezifischen mAk 2.1 Lagerung und Verarbeitung der Hybridome

Die Hybridome FRP5, FSP16, FWP51 und FSP77, die die anti- c-erbB-2-mAk FRP5, FSP16, FWP51 bzw. FSP77 sezernieren, können in Kultur gezüchtet, bei -80ºC oder in flüssigem Stickstoff eingefroren und wieder gezüchtet werden. Die Zellen werden durch das Verfahren der limitierenden Verdünnung kloniert und wurden bei der Buropean Collection of Animal Cell Lines in England hinterlegt. Die Hybridom-Zellinien besitzen die folgenden Hinterlegungsnummern: FRP5: 90112115, FSP16: 90112116, FSP77:90112117, FWP51:90112118. Die Zellen werden vermehrt, indem in Balb/c Mäusen, die mit Pristan vorbehandelt wurden, Asictes gebildet werden. Die Antikörper werden aus dem Ascites durch Ammoniumsulfatausfällung und Ionenaustauschchromatographie auf DE 52 DEAE-Zellulosesäulen (Whatman) gereinigt. Gereinigte mAk werden in PBS bei -80ºC gelagert.

2.2 Isotypisierung der mAk

Der Isotyp der mAk FRP5, FSP16, FWP51 und FSP77 wird durch ELISA-Analyse mit Kaninchen-Antiseren gegen Maus Ig-Klassen und Subklassen (Biorad Maus Typer TMSub Isotypisierungs-Kit ) gemäß dem vom Hersteller vorgeschlagenen Verfahren bestimmt. Die mAk FRP5, FWP51 und FSP77 sind vom Isotyp IgG1, während FSP16 vom Isotyp IgG2b ist. Die leichten Ketten aller mAk sind vom Typ Kappa.

2.3 Strömungszytometrie

Eine FACS-Analyse unter Verwendung der c-erbB-2-spezifischen mAk wird wie folgt durchgeführt: humane SKBR3 Brust- Tumorzellen werden mit Trypsin behandelt, in FACS-Medium gewaschen (BSS, das 10 µM Natriumazid, 4 % FCS und 25 mM EDTA enthält), und 1x10&sup6; Zellen werden in 100 µl FACS Medium resuspendiert. Nicht spezifische Bindungsstellen werden durch Inkubieren der Zellen für 10 Minuten bei Raumtemperatur mit 5 µl Ziegenserum blockiert. Die SKBR3-Zellen werden durch Zentrifugation gewonnen, in 50 µl einer 1:2 Verdünnung des Überstandes in FACS-Medium resuspendiert und 45 Minuten auf Eis inkubiert. Die Zellen werden mit 4 ml FACS-Medium gewaschen, durch Zentrifugation gewonnen, in 50 µl FACS-Medium, das eine 1:20 Verdünnung eines mit Fluorescein verknüpften, gesamten, anti- Maus-Ig Schaf-Antikörpers enthält, resuspendiert und für 30 Minuten auf Eis inkubiert. 4 ml des FACS-Mediums werden zugesetzt, die Zellen werden durch Zentrifugation gewonnen, in 100 µl FACS-Medium resuspendiert und ohne Fixierung auf deren Fluoreszenz in einem Becton-Dickinson FACScan analysiert. Als Kontrolle werden SKBR3-Zellen mit einem nicht-reagierenden IgG1 mAk (1236S31-3) inkubiert. Die FACS-Analyse zeigte, daß die mit den mAk FRP5, FSP16, FWP51 und FSP77 behandelten SKBR3-Zellen eine höhere Fluoreszenz aufweisen, als Zellen, die mit dem Kontroll-mAk behandelt wurden. Diese Ergebnisse zeigen, daß die mAk an die extrazelluläre Domäne des c-erbB-2-Proteins binden.

2.4 Bindungsdomäne der c-erbB-2-spezifischen mAk

Die mAk FRP5 und FSP77 werden kovalent ¹²&sup5;I (als Träger freies Natrium¹²&sup5;iodid, Amersham) bis zu einer spezifischen Aktivität von 1 µCi/µg unter Verwendung von Iodogen (1,3,4,6- Tetrachlor-3a,6a-diphenylglycouril, Sigma) gemäß einem Standardprotokoll verknüpft (Antikörper: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988, 330). Verdrängungsexperimente werden durch Inkubieren von SKBR3-Zellen (0,5-1x10&sup5; Zellen/15 mm Vertiefung, Nunclon 4-Vertiefungs-Mehrfachplatte) in 250 µl RIA-Puffer (120 mM NaCl, 50 mM HEPES, pH 7,8, mM EDTA, 2 % BSA), der markiertes FRP5 oder FSP77 enthielt, und unterschiedlichen Mengen nicht-markierter mak FRP5, FSP16, FWP51 und FSP77 für 2 Stunden bei 4ºC durchgeführt. Die Zellen werden 5 mal mit dem RIA-Puffer gewaschen, in 0,5 ml 1% Triton X-100 , 10 % Glycerin, 20 mM HEPES, pH 7,4 für 30 Minuten bei Raumtemperatur solubilisiert, und die gebundene Radioaktivität wird in einer Gamma-Zählvorrichtung gemessen. Die Ergebnisse zeigen, daß die mAk FRP5 und FSP16 miteinander um die Bindung an SKBR3-Zellen konkurrieren, was nahelegt, daß diese 2 mAk an die gleiche Domäne auf dem c-erbB-2-Protein binden. Die mAk FWP51 und FSP77 konkurrieren weder miteinander, noch mit FRP5 oder FSP16 um die Bindung an das c-erbB-2-Protein. Als Folgerung binden die 4 mAk an 3 unterschiedliche Domänen des extrazellulären Bereichs des c-erbB-2-Membranrezeptors Tyrosinkinase.

Beispiel 3. Isolierung von RNA aus der Hybridom-Zellinie FRP5, 3.1 Züchten von FRP5-Zellen

FRP5 Hybridomzellen (1x10&sup8;) werden in Suspensionskultur bei 37ºC in DMEM (Seromed), das weiter 10 % FCS (Amimed), 1 mM Natriumpyruvat (Seromed), 2 mM Glutamin (Seromed), 50 µM 2-Mercaptoethanol und 100 µg/ml Gentamycin (Seromed) enthält, in feuchter Atmosphäre von Luft und 7,5 % CO&sub2; in 175 cm Gewebekulturbehältern (Falcon 3028) gezüchtet. Die Zellen werden durch Zentrifugation geerntet, einmal in PBS gewaschen, in flüssigen Stickstoff schnell eingefroren und als Pellet bei -80&sup0;c, in einem sauberen, sterilen, verschließbaren Kunststoffbehälter eingefroren, aufbewahrt.

3.2 Extraktion von zellulärer Gesamt RNA aus FRP5-Zellen

Gesamt-RNA wird unter Verwendung der von Chomczynski & Sacchi (Anal. Biochem. 162 (1987), 156) beschriebenen sauren Guanidiniumthiocyanat-Phenol-Chloroform-Methode extrahiert. Zellpellets von FRP5-Zellen (1x10&sup8;) werden direkt in dem Behälter in Anwesenheit von 10 ml denaturierender Lösung (4M Guanidiniumthiocyanat (Fluka), 25 mM Natriumcitrat, pH 7,0, 0,5 % N- Lauroylsarcosin (Sigma), 0,1 M 2-Mercaptoethanol) aufgetaut. Die Lösung wird bei Raumtemperatur homogenisiert. Nacheinander werden dem Homogenat 1 ml 2M Natriumacetat, pH 4, 10 ml Phenol (mit Wasser gesättigt) und 2 ml Chloroform-Isoamylalkohol- Gemisch (49:1) zugesetzt. Die schlußendliche Suspension wird für 10 Sekunden heftig geschüttelt und für 15 Minuten auf Eis gekühlt. Die Proben werden bei 10000xg für 20 Minuten bei 4ºC zentrifugiert. Nach Zentrifugation wird die RNA, die in der wäßrigen Phase vorhanden ist, mit 10 ml Isopropanol gemischt und für 1 Stunde bei -20ºC gehalten. Die RNA-Ausfällung wird durch Zentrifugation gewonnen, das Pellet wird in 3 ml Wasser aufgelöst und die RNA wird durch Zugabe von 1 Volumen Isopropanol bei -20ºC erneut ausgefällt. Nach Zentrifugation und Waschen des Pellets in Ethanol, wird das erhaltene RNA-Pellet in Wasser gelöst. Die Methode ergibt etwa 300 µg zelluläre Gesamt-RNA. Das schließlich gereinigte Material wird bei -20ºC gefroren gelagert.

3.3 Isolierung von poly(A)-enthaltender RNA

Poly(A) enthaltende RNA wird durch Chromatographie an Oligo(dT)-Cellulose (Boehringer Mannheim) von Gesamt-RNA, wie ursprünglich von Edmonds et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 68 (1971), 1336) und modifiziert von Maniatis et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982, 197) beschrieben, getrennt. Die poly(A) enthaltende RNA wird, wie in dem veröffentlichten Verfahren beschrieben, hergestellt, mit der Ausnahme, daß die RNA von der Oligo(dT)-Cellulose mit Wasser anstelle SDS-enthaltendem Puffer eluiert wird. Die poly(A) enthaltende RNA wird mit Ethanol ausgefällt und durch Zentrifugation gewonnen. Die Ausbeute der poly(A) enthaltenden RNA beträgt ungefähr 30 µg aus 300 µg zellulärer Gesamt- RNA. Das gereinigte Endmaterial wird gefroren bei -20ºC gelagert.

Beispiel 4. Klonieren funktionaler schwerer und leichter Ketten-Umlagerungen aus der Hybridom-Zellinie FRP5

Poly(A) enthaltende RNA wird aus FRP5 Hybridom-Zellen wie in Beispiel 3.3 beschrieben isoliert und liefert die Quelle für die cDNA-Synthese und nachfolgende Amplifizierung von Minigenen aus V-Bereichen. Die Amplifizierungsprodukte erwarteter Größe werden aus Agarosegelen gereinigt und in geeignete Vektoren kloniert. Funktionelle Umlagerungen werden durch Sequenzieren identifiziert.

4.1 Oligonucleotide:

MCK2 ist so gestaltet, daß es zu einem Bereich in dem konstanten Maus-Immunoglobulin κ (Kappa)-Minigen komplementär ist.
5'-TCACTGGATGGTGGGAAGATGGA-3'
MCHC2 ist so gestaltet, daß es zu einem Bereich in dem konstanten Maus-Immunoglobulin γ1 Minigen komplementär ist.
5'-AGATCCAGGGGCCAGTGGATAGA-3'
Die Oligonucleotide VH1FOR, VH1BACK, VK1FOR und VK1BACK sind gemäß Orlandi et al. (Proc. Natl. Acad. Sci USA 86 (1989), 3833) hergestellt, um zu Konsensus-Sequenzen zu passen.
VH1FOR: 5'-TGAGGAGACGGTGACCGTGGTCCCTTGGCCCCAG-3'
VH1BACK: 5'-AGGT(C/G)(C/A)A(G/A)CTGCAG(G/C)AGTC(T/A)GG-3'
VK1FOR: 5'-GTTAGATCTCCAGCTTGGT(C/G)C(C/G)-3'
VK1BACK: 5'-GACATTCAGCTGACCCAGTCTCCA-3'

4.2 cDNA-Synthese

55 ng Poly(A) enthaltende RNA wird in einem Puffer gelöst, der 50 mM Tris-HCl, pH 8,3, 3 mM Magnesiumchlorid, 10 mM DTT, 75 mM KCl, 400 µM dNTPs (N = G, A, T und C), 100 µg BSA (Molecular Biology Grade, Boehringer Mannheim), 100 U RNAse- Inhibitor (Boehringer Mannheim), 25 pMol MCK2 und 25 pmol MCHC2 enthält. Die RNA wird bei 70ºC für 5 Minuten denaturiert und dann auf Eis für 2 Minuten gekühlt. Nach Zugabe von 200 U MMLV reverse Transkriptase (Gibco, BRL), wird die cDNA-Synthese durch Inkubieren bei 37ºC fur 1 Stunde erreicht.

4.3 Polymerase-Kettenreaktion

1/10 der cDNA-Reaktion wird für die DNA-Amplifizierung in einem Puffer verwendet, der 10 mM Tris-HCl, pH 8,3, 1,5 mM MgCl&sub2;, 50 mM KCl, 10 mM β-Mercaptoethanol, 200 µM dNTPs (N = G, A, T und C), 0,05 % Tween-20 (Merck), 0,05 % NP-40 (Merck), 10 % DMSO (Merck), 25 pmol Oligonucleotid 1 (siehe nachstehend), 25 pMol Oligonucleotid 2 (siehe nachstehend) und 2,5 U Amplitaq DNA-Polymerase (Perkin Elmer Cetus) enthielt. Die Tag-Polymerase wird nach anfänglicher Denaturierung bei 93ºC für 1 Minute und nachfolgendem Annealen bei 37ºC zugesetzt. In den ersten 4 Zyklen wird die Verlängerung der Primer bei 71ºC für 0,2 Minuten, Denaturierung bei 93ºC für 0,01 Minuten und Annealen bei 37ºC für 0,2 Minuten bewirkt. Für die letzten 25 Zyklen wird die Annealing-Temperatur auf 62ºC erhöht. Schließlich wird die Amplifizierung durch einen 3-minütigen Primerverlängerungsschritt bei 71ºC vervollständigt.

4.4 Modifizierung und Reinigung

Amplifiziertes Material wird mit CHCl&sub3; extrahiert und mit Ethanol in Anwesenheit von 200 mM LiCl ausgefällt. Zur Erleichterung des Klonierens werden durch eine 3-minütige Behandlung mit 1 U T4 DNA-Polymerase (Boehringer Mannheim) in 66 mM Tris-Acetat, pH 7,9, 132 mM Kaliumacetat, 20 mM Magnesiumacetat, 1 mM DTT, 200 µg/ml BSA (Molecular Biology Grade, Boehringer Mannheim) und 400 µM dNTPs (N G, A, T und C) glatte Enden gebildet. Die Polymerase wird vor Phosphorylierung der DNA mit 10 U T4-Polynucleotid-Kinase (Pharmacia) bei 37ºC für 1 Stunde, durch Erhitzen für 15 Minuten auf 65ºC inaktiviert. Zu diesem Zweck wird der Puffer auf 50 mM EDTA und 1 mM ATP eingestellt. Die modifizierten Amplifizierungsprodukte werden auf einem 1,2 %igen (Gew./Vol.) Agarosegel (hochreine DNA-Grade Agarose, Biorad) aufgetrennt und DNA der erwarteten Größe wird mittels DEAE NA 45 Membranen (Schleicher & Schull) eluiert.

4.5 Ligierung

Bluescript KS+ (70 ng), der mit XbaI linearisiert, mit Klenow-DNA-Polymerase (Boehringer Mannheim) zur Herstellung glatter Enden, und mit Kälberdarm-Phosphatase dephosphoryliert wurde, und 30 ng des gereinigten Amplifizierungsprodukts werden unter Verwendung von 0,5 U T4-DNA-Ligase (New England Biolabs) in 50 mM Tris-HCl, pH 7,8, 10 mM Magnesiumchlorid, 10 mM DTT und 0,8 mM ATP über Nacht bei 16ºC ligiert. Eine Hälfte des Ligierungsgemisches wird zur Transformation von E.coli K803 verwendet, um gegen Ampicillin resistente Kolonien zu erhalten. Diese werden auf die gewünschten Ligierungsprodukte untersucht, wobei eine auf NaOH gründende Plasmid-"Miniprep"-Methode verwendet wird (Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982). Die folgenden Plasmide werden erhalten:

4.6 Sequenzierung

Die Sequenzierung wird unter Verwendung von Sequenase - Kits (United States Biochemicals) mit T3- und T7-Oligonucleotid-Primern gemäß den vom Hersteller gelieferten Verfahren durchgeführt.
Das Plasmid pMZ17/1 enthält eine nicht funktionelle Umlagerung. Das Plasmid pMZ17/2 enthält eine mit Ig nicht verwandte Sequenz. Die Plasmide pMZ18/1 (SEQ ID Nr.2) und pMZ18/2 enthalten identische, funktionelle FRP5-Inserts der variablen Domäne der leichten Kette kappa. Die Plasmide pMZ16/1 (SEQ ID Nr.1) und pMZ16/2 enthalten identische, funktionelle FRP5-Inserts der variable Domäne der schweren Kette. Die Plasmide pMZ15/1 und pMZ15/2 enthalten ebenfalls FRP5-Inserts der variablen Domäne der schweren Kette zusammen mit DNA von Teilen von konstanten Bereichen. Die Plasmide pMZ16/1 und pMZ18/1 werden als Quelle für weitere Subklonierungsschritte verwendet.

Beispiel 5. Konstruktion des mAk FRP5-Einketten Fv-Gens 5.1 Konstruktion und Seguenz eines Klonierungslinkers für cDNAs der variablen Domäne der schweren Kette und leichten Kette

Unter Verwendung von Oligonucleotiden wird eine Linkersequenz hergestellt, die das Klonieren von mit PCR amplifizierter cDNA der variablen Domäne der Maus-schweren Kette als ein PstI/BstEII-Fragment und von mit PCR amplifizierter cDNA der variablen Domäne der Maus-leichten Kette kappa als ein PvuII/BglII-Fragment ermöglicht. Dies erzeugt einen offenen Leseraster, bei dem die variablen Domänen der schweren und leichten Kette durch eine Sequenz verbunden sind, die die Folge von 15 Aminosäuren Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly- Gly-Gly-Gly-Ser codiert. Es wurde gezeigt, daß dieser Aminosäure-Linker in einem Einketten-Fv die korrekte Faltung der in den variablen Domänen der schweren Kette und leichten Kette vorhandenen Antigen-Bindungsdomäne ermöglicht (Houston et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 85 (1988), 5879).
Zur Herstellung des Klonierungs-Linkers werden die folgenden 6 komplementären Oligonucleotide 1A, 1B, 2A, 2B, 3A, 3B verwendet.
1A: 5'-CAAGCTTCTCAGGTACAACTGCAGGAGGTCACCGTTTCCTCTGGCGG-3'
1B: 5'-GAAACGGTGACCTCCTGCAGTTGTACCTGAGAAGCTTGCATG-3'
2A: 5'-TGGCGGTTCTGGTGGCGGTGGCTCCGGCGGTGGCGGTTCTGAC-3'
2B: 5'-GCCACCGCCGGAGCCACCGCCACCAGAACCGCCACCGCCAGAG-3'
3A: 5'-ATCCAGCTGGAGATCTAGCTGATCAAAGCT-3'
3A: 5'-CTAGAGCTTTGATCAGCTAGATCTCCAGCTGGATGTCAGAACC-3'
40 pM der Oligonucleotide 1B, 2A, 2B, 3A werden am 5'-Ende unter Verwendung von T4-Polynucleotid-Kinase (Boehringer Mannheim) in 4 getrennten Reaktionen, in einem Gesamtvolumen von 20 µl, gemäß dem von Maniatis et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982) beschriebenen Verfahren phosphoryliert. Die Oligonucleotide 1A und 3B sind nicht phosphoryliert, um eine Selbst-Ligierung der Linker in der abschließenden Ligierungsreaktion zu verhindern. Nach der Kinase-Reaktion wird das Enzym durch Inkubieren bei 70ºC für 30 Minuten inaktiviert. In 3 getrennten Reaktionen mit jeweils 40 pM der 2 Oligonucleotide in einem Gesamtvolumen von 40 µl werden nicht-phosphoryliertes 1A und phosphoryliertes 1B, phosphoryliertes 2A und phosphoryliertes 2B, und phosphoryliertes 3A und nicht-phosphoryliertes 38 gemischt. Die Hybridisierung der Oligonucleotide in den 3 Reaktionen wird durch Erhitzen auf 95ºC für 5 Minuten, Inkubieren bei 65ºC für 5 Minuten und langsames Abkühlen auf Raumtemperatur durchgeführt. 10 µl aus jeder der 3 Reaktionen werden vermischt, 4 µl 10x Ligierungspuffer (Boehringer) und 4 Einheiten T4-DNA-Ligase (Boehringer) werden zugesetzt, und das Gesamtvolumen wird mit sterilem Wasser auf 40 µl eingestellt. Die annealten 0ligonucleotidpaare werden für 16 Stunden bei 14ºC in eine Linkersequenz ligiert. Das Reaktionsgemisch wird mit einem gleichen Volumen Phenol/Chloroform (1:1) gefolgt von erneuter Extraktion der wäßrigen Phase mit einem gleichen Volumen Chloroform/Isoamylalkohol (24:1) extrahiert. Die wäßrige Phase wird gewonnen, 0,1 Volumen 3 M Natriumacetat pH 4,8 und 2 Volumen Ethanol werden zugesetzt und die DNA wird bei -70ºC für 4 Stunden ausgefällt und durch Zentrifugation gewonnen. Die so erhaltene Linkersequenz besitzt ein SphI- und ein XbaI-Adaptor-Ende. Diese wird an mit SphI und XbaI gespaltenen pUC19 in einer Reaktion ligiert, die 100 ng ligierten Linker und 200 ug mit SphI/XbaI gespaltenen pUC19 enthält. Nach Transformation in E.coli XL1Blue (Stratagene), wird aus 4 einzelnen Kolonien Plasmid-DNA durch die alkalische Lyse Minipreparations-Methode (Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboatory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982) isoliert. Die DNA-Sequenz des in pUC19 klonierten Linkers wird durch Sequenzieren doppelsträngiger DNA in beide Richtungen mit Sequenase II (United States Biochemicals) und universal- und revers-pUC-Primern (Boehringer Mannheim) gemäß dem Hersteller-Protokoll bestimmt. 3 von 4 sequenzierten, rekombinanten pUC19-Isolaten enthalten die richtige Linker-Sequenz. Einer von Ihnen wird pWW19 bezeichnet und in weiteren Experimenten verwendet. Die Sequenz ist in SEQ ID Nr.3 gezeigt.

5.2 Plasmid-Herstellung zum Subklonieren variabler Domänen

Die Fv-Klonierungs-Linker-Sequenz wird von pWW19 als ein 144 bp HindIII/SacI-Fragment erhalten und wird in mit HindIII/SacI gespaltenen Bluescript KS+(ex PvuII) (Stratagene), der keine PvuII-Restriktionsschnittstellen besitzt, inseriert. Das so erhaltene Plasmid, pWW15, ermöglicht das Klonieren von variablen Domänen der schweren und leichten Kette als PstI/BstEII bzw. PvuII/BglII-Fragment.

5.2.1 Subklonieren der variablen Domäne der schweren Kette von FRP5

Das Plasmid pMZ16/1 wird mit PstI und BstEII gespalten und das 338 bp Fragment der variablen Domäne der schweren Kette von FRP5 wird Isoliert. Es wird in mit PstI/BstEII gespaltenen pWW19 kloniert, wobei das Plasmid pWW31 erhalten wird.

5.2.2 Mutation der FRP5 variablen Domäne der leichten Kette und Aggregation des Fv-Fusionsgens

Um das Subklonieren der variablen Domäne der leichten Kette in den Fv-Klonierungs-Linker zu erleichtern, werden am 5'- bzw. 3'-Ende des codierenden Bereichs eine PvuII-Restriktionsschnittstelle und eine BglII-Restriktionsschnittstelle eingeführt. Der die variable Domäne der leichten Kette von FRP5 codierende Bereich wird aus pMZ18/1 als ein SacI/BamHI-Fragment isoliert. SacI und BamHI sind Restriktionsschnittstellen des Bluescript Polylinkers, der in pMZ18/1 vorhanden ist. Das Fragment enthält das gesamte 392 bp Fragment der variablen Domäne der leichten Kette, das durch PCR unter Verwendung des Oligonucleotids MCK2 (siehe vorstehend) amplifiziert wurde. Dieses Fragment wird mutiert und durch PCR amplifiziert, wobei zur Einführung einer PvuII-Restriktionsschnittstelle am 5'-Ende (VL5') und einer BglII-Restriktionsschnittstelle am 3'-Ende (VL3') der DNA der variablen Domäne der leichten Kette kappa die Oligonucleotide
VL 5'-GACATTCAGCTGACCCAG-3' und
VL 5'-GCCCGTTAGATCTCCAATTTTGTCCCCGAG-3'
verwendet wurden. 20 ng des SacI/BamHI-Fragments der variablen, leichten Kette von FRP5 werden als Template in einer 100 µl Reaktion verwendet, wobei die in Beispiel 4.3 beschriebenen PCR-Bedingungen angewandt werden. Das amplifizierte und mutierte Fragment wird nach PvuII/BglII-Spaltung als ein 309 bp Fragment aus einem 1,5 %igen Agarosegel isoliert und in mit PvuII/BglII gespaltenen pWW15 kloniert, was das Plasmid pWW41 ergibt. Die variable Domäne der leichten Kette kappa von FRP5 wird aus pWW41 als ein BstEII/XbaI-Fragment isoliert und in mit BstEII/XbaI gespaltenen pWW31 inseriert. Die variable Domäne der schweren Kette von FRP5 in pWW31 und die variable Domäne der leichten Kette kappa von FRP5 werden daher zu einem offenen Leseraster verbunden. Doppelsträngige DNA aus 3 unabhängigen Klonen wird mit SequenaseII -Kit (United Biochemicals) in beiden Orientierungen unter Verwendung von universal- und reverspUC-Primern (Boehringer) gemäß dem Hersteller-Protokoll sequenziert. Eines der Plasmide, das die variable Domäne der schweren Kette von FRP5, das mit der mutierten, variablen Domäne der leichten Kette von FRP5 verbunden ist, beinhaltet, wird ausgewählt und als pWW52 bezeichnet. Die Sequenz des HindIII/XbaI- Inserts im Plasmid pWW52 ist in SEQ ID Nr.4 gezeigt.

Beispiel 6. Konstruktion eines Einketten Fv-Phosphatase- Fusionsgen-Expressionsplasmids

Das mAk-FRP5-Einketten-Fv-Gen wird mit der bakteriellen alkalischen Phosphatase fusioniert. Dieses chimäre Gen codiert ein bifunktionelles Molekül, das die Bindungsaktivität des c-erbB-2-Proteins aufrecht erhält und enzymatische Aktivität besitzt.

6.1 Mutation des Einketten Fv(FRP5)-Gens

Um eine Genfusion zwischen dem das Einketten-Fv(FRP5) codierenden Gen aus pWW52 und dem Gen der alkalischen Phosphatase phoA zu ermöglichen, wurde das Stopcodon an Position 729- 731 der Sequenz in pWW52 (siehe Beispiel 5.2.3) wie folgt entfernt. Die pWW52-Plasmid-DNA wird mit BstEII und Bg1II gespalten und die Linkersequenz und das Fragment, das die variable Domäne der leichten Kette von FRP5 codiert, wird isoliert. In einer anderen Spaltung, wird pWW52 mit BstEII und BglII gespalten. Das große Fragment, das Vektorsequenzen und die Sequenz, die die variable Domäne der schweren Kette von FRP5 codiert, wird daher isoliert. Das BstEII/BglII-VL-Fragment wird nun in mit BstEII/BclI gespaltenen pWW52, der VH enthält, inseriert. In dem so erhaltenen Plasmid, pWW53, wird die BglII/BclI-Verbindung durch Sequenzieren doppelsträngiger DNA, wie vorstehend beschrieben, bestimmt.
Die Sequenz der BglII/BclI-Verbindung in pWW53 (die Positionsnummern entsprechen den Positionsnummern des HindIII/XbaI- Inserts in Plasmid pWW52, SEQ ID Nr.4)

BglII/BclI

ACA AAA TTG GAG ATC AAA GCT CTA GA

714-728 738-748

6.2 Mutation des alkalischen Phosphatase-Gens phoA aus E.coli

Zu Bildung des Fv(FRP5)-phoA-Fusionsgens, wird das alkalische Phosphatase-Gen phoA von E.coli unter Bildung einer XbaI-Spaltstelle im codierenden Bereich von phoA nahe dem N- Terminus des reifen Proteins, und einer SacI-Spaltstelle in dem 3'-nicht-translatierten Bereich von phoA, mutiert. Dieser Schritt erleichtert das Klonieren des mutierten Fragments. Ein pBR322-Derivat, das das rekombinante Transposon TnPhoA enthält (Manoll & Beckwith, Proc. Natl. Acad. Scl. USA 82 (1985), 8129), wird mittels Spaltung mit BglII linearisiert. 20 ng der linearisierten Template-DNA wird für eine 100 µl PCR-Reaktion verwendet, die, wie vorstehend beschrieben, unter Verwendung der Oligonucleotide PhoA5' und PhoA3' als Primer 1 und 2 durchgeführt wird.
PhoA5' : 5'-CCCTCTAGAGCCTGTTCTGGAAAAC-3'
PhoA3' : 5'-CCCGAGCTCTGCCATTAAG-3'
Nach der XbaI/Saci-Spaltung des PCR-Produkts wird ein 1419 bp-Fragment aus einem 1,5 %igen Agarosegel isoliert und in mit XbaI/SacI gespaltenes pUC19-Plasmid inseriert. Die Ligierung wird wie vorstehend beschrieben durchgeführt. Die ligierte DNA wird in E.coli XL1Blue (Stratagene) transformiert. Das offene Leseraster des mutierten phoA-Gens wird daher im Leseraster mit dem offenen Leseraster von lacZ von pUC19 fusioniert. Um zu zeigen, daß das mutierte phoA-Gen funktionelle alkalische Phosphatase exprimiert, werden rekombinante Klone auf LB-Agarplatten ausplattiert, die 100 µg/ml Ampicillin, 0,5 mM IPTG (Sigma) und 40 µg/ml XP (Boehringer) enthalten. Nach Induktion des lac-Promotors von pUC19 wird ein lacZ-phoA-Fusionsprotein exprimiert. Die Phosphataseaktivltät dieses Fusionsproteins wandelt den Indikator XP in einen blauen Farbstoff um. Eine der blauen Kolonien wird isoliert und die Anwesenheit der eingeführten Restriktionsschnittstellen wird durch Spalten einer Miniprep-DNA mit XbaI und SacI bestätigt. Teile der 5' und 3'- DNA-Sequenzen des mutierten phoA-Gens werden durch Sequenzieren von Doppelstrang-DNA, wie vorstehend beschrieben, erhalten. Die DNA-Sequenzen sind in der endgültigen Fv(FRP5)-phoA-Fusionsgen-Sequenz, die in SEQ ID Nr.5 gezeigt ist, enthalten. Das isolierte Plasmid wird als pWW61 bezeichnet und für weitere Subklonierungsschritte verwendet.

6.3 Konstruktion eines FRP5 Fv-phoA-Expressionsplasmids

Aus dem Plasmid pWW19 (siehe Beispiel 5.1.2) wird die Klonierungslinker-Sequenz als HindIII/EcoRI-Fragment isoliert und in das mit HindIII/EcoRI gespaltene Plasmid pINIII-ompA-Hind (Rentier-Delrue et al., Nucl. Acids Res. 16 (1988), 8726) inseriert, was das Plasmid pWW16 ergibt.
Aus pWW61 (siehe Beispiel 6.2) wird das mutierte phoA-Gen als XbaI/SacI-Fragment isoliert und in mit XbaI/SacI gespaltenen pWW53 inseriert. Das so erhaltene Plasmld, pWW615, enthält das Fv(FRP5)-Gen, das im Leseraster mit dem mutierten Gen der alkalischen Phosphatase fusioniert ist. Das Fv(FRP5)-phoA-Gen wird aus pWW615 als HindIII/SacI-Fragment isoliert und in das mit HindIII/SacI gespaltene Plasmid pWW16 inseriert. Dies führt zur Produktion des Fv(FRP5)-phoA-Epressionsplasmids pWW616 (siehe nachstehend). Alle Ligierungen werden wie vorstehend beschrieben durchgeführt. Die rekombinanten Plasmide werden in E.coli XL1Blue (Stratagene) transformiert. Die Konstrukte werden durch Restriktionsenzym-Analyse der Plasmid-DNA, die gemäß der alkalischen-Miniprep-Methode (Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982) isoliert werden, bestätigt.
In diesem Konstrukt kann der Fv Einketten-Antikörper von FRP5, der mit der alkalischen Phosphatase phoA genetisch fusioniert ist, in E.coli, nach Induktion mit IPTG, exprimiert werden. Das rekombinante Protein enthält am N-Terminus die Signalsequenz des äußeren Membranproteins A (ompA) von E.coli (durch den pINIII-ompA-Hind-Vektor codiert), um die Sekretion des Proteins in den periplasmatischen Raum der E.coli- Expressionszellen zu erleichtern.
Die Sequenz des Fv(FRP5)-phoA-Fusionsgens des Expressionsplasmids pWW616 ist in SEQ ID Nr.5 gezeigt. Ein Teil der phoA- Sequenz ist aus Chang et al., Gene 44 (1986), 121 zusammengetragen.

Beispiel 7. Expression von Fv(FRP5)-phoA in E.coli

Das Plasmid pWW616 wird in den phoA-negativen E.coli-Stamm CC118 (Manoil & Beckwith, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 (1985), 8129) transformiert. Eine einzelne rekombinante Kolonie wird über Nacht in 50 ml LB-Medium, das 70 µg/ml Ampicillin enthält, gezüchtet. Die über Nacht-Kultur wird in 500 ml frischem LB- Medium, das 70 µg/ml Ampicillin enthält, 1:10 verdünnt und bei 37ºC bis zu einer OD&sub5;&sub5;&sub0; von 0,1 gezüchtet. IPTG wird bis zu einer Endkonzentration von 2 mM zugesetzt und die Expression wird für 1,5 Stunden bei 37ºC induziert. Die Zellen werden bei 4ºC durch Zentrifugation bei 4000 Upm für 25 Minuten in einer Beckman GPKR-Zentrifuge geerntet. Der Überstand von CC118/pWW616 wird zur Herstellung von Fv(FRP5)-pho (siehe Beispiel 7.2) beiseite auf Eis gestellt.

7.1 Isolierung von Fv(FRP5)-phoA aus den periplasmatischen Proteinen von CC118/pWW616

Das bakterielle Pellet wird in 10 ml TES-Puffer (0,2 M Tris-HCl, pH 8,0, 0,5 mM EDTA, 0,5 M Saccharose) suspendiert und für 10 Minuten auf Eis gestellt. Nach Zentrifugation bei 4ºC für 10 Minuten bei 5000 Upm in einer Heraeus-Minifuge wird der Überstand verworfen und das gewaschene Pellet wird in 15 ml eiskaltem, mit Wasser verdünntem (1:4), TES suspendiert. Die Zellen werden für 30 Minuten auf Eis gehalten und erneut, wie vorstehend, zentrifugiert. Der Überstand, der die periplasmatischen Proteine enthält, wird erneut bei 45000xg für 15 Minuten in einer Beckman TL100 Ultrazentrifuge zentrifugiert Der periplasmatische Extrakt wird in einer Amersham Ultrafiltrations-Einheit durch eine YM10-Membran auf ein Endvolumen von 2 ml konzentriert. Nach fünffacher Verdünnung mit PBS und fünfmaliger erneuter Konzentration durch die YM10-Membran wird der 1:4 verdünnte TES-Puffer des periplasmatischen Extrakts gegen PBS ausgetauscht. NaN&sub3; und Protease-Inhibitoren werden den periplasmatischen Proteinen (2 ml in PBS) bis zu einer Endkonzentration von 0,02 % NaN&sub3;, 0,1 mM PMSF, 2 µg/ml Aprotinin, 1 µg/ml Leupeptin und 1 µg/ml Pepstatin, zugesetzt. Der periplasmatische Extrakt wird bei 4ºC gelagert.

7.2 Isolierung von Fv(FRP5)-phoA aus dem konzentrierten Überstand von E.coli-CC118/pWW616-Kulturen

Der Überstand (500 ml) der induzierten E.coli-Kultur CC118/pWW616 wird durch eine 0,45 µm Membran filtriert. Das Filtrat wird in einer Amicon Ultrafiltrations-Einheit durch eine YM10-Membran zu einem Endvolumen von 10 ml in PBS, wie vorstehend beschrieben, konzentriert. NaN&sub3; und Protease-Inhibitoren werden dem konzentrierten Überstand zu den vorstehend aufgeführten Endkonzentrationen zugesetzt. Die Konzentration von Fv(FRP5)-phoA in den Extrakten wird durch Densitometrie im Vergleich zu BSA-Standards von mit Coomassie gefärbten, 9 %igen SDS-PAGE-Gelen bestimmt.

Beispiel 8. Aktivität von Fv(FRP5)-phoA 8.1 Nachweis von c-erbB-2 in SKBR3-Brusttumorzellen durch Immunfärbung unter Verwendung von Fv(FRP5)-phoA

Die Fv-Domäne von Fv(FRP5)-phoA ermöglicht dem Molekül die Bindung an die extrazelluläre Domäne des c-erbB-2-Proteins. Gebundenes Fv(FRP5)-phoA kann durch Färbeverfahren unter Verwendung von Farbsubstraten zum Nachweis alkalischer Phosphatase- Aktivität sichtbar gemacht werden.

8.1.1 Fixierung von Zellen

Humane SKBR3-Brusttumorzellen, die etwa 1 x 10&sub6; c-erbB-2- Rezeptoren pro Zelle aufweisen, werden auf mit Fibronectin beschichteten Glasplättchen gezüchtet. Die Zellen werden zweimal mit PBS gewaschen und dann mit PBS/3,7 % Formaldehyd bei Raumtemperatur für 30 Minuten fixiert. Die fixierten Zellen werden mit PBS dreimal bei Raumtemperatur gewaschen. Unspezifische Bindungsstellen werden durch Inkubieren der Zellen für 1 Stunde mit PBS/3 % BSA bei 37ºC in einem Feucht-Inkubator blockiert. Die Zellen werden dann zweimal mit PBS gewaschen.

8.1.2 Vorbehandlung von Fv(FRP5)-phoA

Um enzymatisch aktiv zu sein, muß die alkalische Phosphatase phoA aus E.coli als Dimer vorliegen. In dem Periplasma von E.coli liegt natürliches phoA als Dimer vor, d.h. zwei Moleküle phoA werden durch 2 Zn²&spplus;-Ionen zusammengehalten. Das Fv(FRP5)- phoA wird in E.coli ebenfalls als Dimer hergestellt. Um die Bindung von Fv(FRP5)-phoA an das Antigen zu erhöhen, werden die Dimere durch Zugabe von EGTA zur Lösung monomerisiert. Dieser Schritt entfernt Zn²&spplus; aus der Lösung. Monomerisierte Phosphatase kann durch Zugabe von Zn²&spplus; wieder dimerisiert werden. EGTA wird zu 200 µl des 40 x konzentrierten Überstandes oder der periplasmatischen Proteine aus CC118/pWW616 (siehe vorstehend) bis zu einer Endkonzentration von 5 mM zugesetzt. Die Lösung wird unmittelbar vor Verwendung in dem Immunassay für 1 Stunde bei 37ºC inkubiert.

8.1.3 Färben der Zellen

Nach Blockieren mit PBS/3 % BSA (siehe vorstehend) werden die fixierten Zellen für 1 Stunde mit vorbehandeltem Fv(FRP5)- phoA bei einer Konzentration von 1 µg/ml bei 37ºC in einem Feucht-Inkubator inkubiert. Die Zellen werden bei Raumtemperatur dreimal mit PBS gewaschen. Die Färbelösung besteht aus 300 µl Naphtol AS-MX Phosphat (Sigma, 13 µg/ml in Dimethylformamid), 8 mg Levamisol (Sigma) und 10 mg Fast Red TR -Salz (Sigma), das zu 9,7 ml 100 mM Tris-HCl, pH 8,2, 1 mM ZnCl&sub2; gegeben wurde. Dieses Gemisch wird hergestellt und unmittelbar vor Verwendung durch einen 0,45 µm Filter filtriert. Der Färbelösung wird ZnCl&sub2; zugesetzt, um eine erneute Dimerisierung von gebundenem Fv(FRP5)-phoA zu ermöglichen und dabei die alkalische Phosphatase zu aktivieren. Die Zellen werden in der Fast Red Färbelösung für 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die Phosphatase-Aktivität wird nach Färben durch zweimaliges Waschen der Zellen mit PBS, und einmal mit 1 M KH&sub2;P0&sub4;, blockiert. Die Glas-Deckplättchen werden mit Gel (Biomeda) beladen. Die Zellen werden unter einem Fluoreszenz-Mikroskop unter Verwendung von grünem Licht zur Anregung untersucht. Gefärbte SKBR3-Zellen zeigen intensive rote Zelloberflächenfluoreszenz.

8.2 Nachweis einer Überexpression des c-erbB-2-Proteins in Immunblots unter Verwendung von Fv(FRP5)-phoA

Proteine aus Gesamt-Zellysaten von SKBR3-Zellen, die das c-erbB-2-Protein überexprimieren, werden durch SDS-PAGE aufgetrennt und auf PVDF-Membran (Millipore) geblottet. Zur Herstellung von Extrakten und Immunblot-Techniken siehe Beispiel 1.3.2. Freie Bindungsstellen der Membran werden durch Inkubieren für 1 Stunde bei Raumtemperatur in einer Lösung, die 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 0,9 % NaCl, 0,05 % Tween 20 (Biorad) und 3 % BSA enthält, blockiert. Vorbehandeltes Fv(FRP5)-phoA (siehe Beispiel 7.2) wird in einer Blockierungslösung auf eine Endkonzentration von 0,1 µg/ml verdünnt. Die Membran wird in der Fv(FRP5)-phoA-Lösung für 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert und dann dreimal für 5 Minuten bei Raumtemperatur in 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 0,9 % NaCl, 0,05 % Tween 20 und einmal in 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 0,9 % NaCl, gewaschen. Zum Nachweis von gebundenem Fv(FRP5)-phoA wird die Membran für 20 Minuten bei 37ºC in der in Beispiel 7.3 beschriebenen Fast Red -Substratlösung ohne Levamisol inkubiert. Die Reaktion wird durch zweimaliges Waschen der Membran in Wasser gestoppt. Fv(FRP5)- phoA weist spezifisch das 185 KD c-erbB-2-Protein nach.

Beispiel 9. Expression und Isolierung von Fv(FRP5)-phoA aus E.coli 9.1. Herstellung des periplasmatischen Extrakts

Das Plasmid pWW616 wird gemäß Standardverfahren (Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982) in den phoA-negativen E.coli-Stamm CC118 transformiert. Eine einzelne Kolonie wird herausgenommen und über Nacht in LB-Medium gezüchtet, das 70 µg/ml Ampicillin enthält. Die über Nacht-Kultur wird in frischem LB-Medium, das Ampicillin enthält, 1:10 verdünnt und bei 37ºC bis zu einem OD&sub5;&sub5;&sub0; von 0,1 gezüchtet. An diesem Punkt wird die Expression des Fv(FRP5)-phoA-Gen durch Zugabe von IPTG in einer Endkonzentration von 2 mM induziert, und die Zellen werden für weitere 1,5 bis 2 Stunden gezüchtet. Die Zellen werden durch Zentrifugation geerntet und mit einem milden osmotischen Schock behandelt, der die periplasmatischen Proteine in den Überstand freisetzt. Die Proteine werden in einer Amersham Ultrafiltrationseinheit durch eine YM10-Memebran konzentriert.

9.2 Herstellung einer Antigen-Affinitätssäule

Das c-erbB-2-Protein wird aus Insektenzellen, die mit einem Baculovirusvektor infiziert sind, der die extrazelluläre Domäne von c-erbB-2 exprimiert, gemäß Standardmethoden isoliert (V.A. Luckow & MD. Summers, Biotechnology 6 (1988), 47-55). Der mAk FSP77 wird gemäß den Hersteller-Instruktionen an mit CNBr-aktivierte Sepharose 4B gekoppelt (Pharmacia). Die Insektenzellysate werden mit dem gekoppelten mAk FSP77 in einem Puffer, der 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 5 mM EGTA, 0,5 % Triton X- 1OO , 150 mM NaCl enthält, für 2 Stunden bei 4ºC auf einer Schüttel-Plattform inkubiert. Die Kügelchen werden in eine Säule gepackt und mit Vor-Elutionspuffer gewaschen, der 10 mM Phosphat, pH 6,8 und 100 mM NaCl enthält, um nicht spezifisch gebundene Proteine zu entfernen. Das c-erbB-2-Protein wlrd von der Säule durch Behandlung mit einem Elutionspuffer mit niedrigem pH-Wert, der 100 mM Glycin, pH 3,0, und 100 mM NaCl enthält, gewonnen. Die Fraktionen von der Säule werden in Phosphatpuffer, pH 8,0, gesammelt, um den pH-Wert zu erhöhen. Die extrazelluläre Domäne von c-erbB-2 wird durch Laufenlassen eines Teils jeder Fraktion auf einem 8 %igen SDS-PAGE-Gel, Blotten auf PVDF-Membran (Millipore) und Behandeln des Filters mit dem mAk FSP77 gefolgt von Schaf anti-Maus IgG, nachgewiesen. Gebundenes IgG wird durch ¹²&sup5;I-Protein-A-Behandlung nachgewiesen. Die Fraktionen, die die extrazelluläre Domäne enthalten, werden vereinigt und das Protein wird gemäß den Hersteller-Instruktionen an mit CNBR-aktivierte Sepharose 4B (Pharmacia) gekoppelt.

9.3 Fv(FRP5-phoA-Isolierung durch Affinitätschromatographie

Die an das c-erbB-2-Protein gekoppelte Sepharose (Beispiel 9.2) wird für 2-4 Stunden bei 4ºC auf einer Schüttelplattform mit dem periplasmatischen Extrakt, der wie in Beispiel 9.1 beschrieben isoliert wurde, inkubiert. Die Kügelchen werden in eine Säule gepackt und, wie in Beispiel 9.2, mit Vor- Elutionspuffer gewaschen. Das Fv(FRP5)-phoA-Protein wird durch Elution mit dem Elutionspuffer mit niedrigem pH-Wert aus Beispiel 9.2 gewonnen. Die Fraktionen werden auf Anwesenheit des Fv(FRP5)-phoA durch Testen auf enzymatische phoA-Aktivität unter Verwendung eines Standard-Protokolls untersucht.

Beispiel 10. Immunässay für das c-erbB-2-Protein in Tumoren 10.1 Herstellung von Tumor-Sektionen

Um die c-erbB-2-Protein-Menge in Tumoren zu bestimmen, wird Tumorgewebe vorbehandelt, um entweder gefrorene Tumor- Sektionen oder in Paraffin eingebettete Tumor-Sektionen zu ergeben. Die Tumor-Stückchen werden schnell eingefroren, dann mit einem Kryostat geschnitten, auf mit 1 % Gelatine beschichteten Glas-Deckplättchen gesammelt, und mit 4 % Paraformaldehyd fixiert. Nach mehreren Waschschritten mit PBS sind die Tumorgewebe-Sektionen zum Färben fertig. Alternativ werden Tumorstückchen zum Fixieren in 4 % Paraformaldehyd überführt, in Paraffin eingebettet, dann werden die Sektionen geschnitten und auf mit Polylysin-beschichteten Glas-Deckplättchen gewonnen. Um die Sektionen zum Färben vorzubereiten, werden diese über Nacht auf 56ºC erhitzt, das Wachs wird in Xylol entfernt, und sie werden schrittweise durch Waschen in 95 %, 70 % und 35 % Ethanol und Wasser rehydratisiert und in PBS gewaschen.

10.2 Vorbehandlung von Fv(FRP5)-phoA

Da das Fv(FRP5)-phoA-Dimer, wie es aus dem Periplasma von E.coli erhalten wurde, nicht optimal an das c-erbB-2-Antigen bindet, wird es zuerst monomerisiert. Dies wird dadurch erreicht, daß die Fv(FRP5)-phoA-Lösung für 1 Stunde mit EGTA in einer Endkonzentration von 5 mM auf 37ºC erwärmt wird. Diese Behandlung chelatisiert die Zn²&spplus;-Ionen, die zur Aufrechterhaltung der dimeren Fv(FRP5)-phoA-Struktur erforderlich sind.

10.3 Färben der Tumor-Sektionen

Nicht-spezifisches Färben der Tumor-Sektionen, die gemäß Beispiel 10.1 hergestellt wurden, wird durch Inkubieren der Sektionen in PBS, das 3 % BSA enthält, blockiert. Die blockierten Sektionen werden für 1-2 Stunden mit vorbehandeltem Fv(FRP5)-phoA (Beispiel 10.2) bei einer Konzentration von 1 µg/ml in einem Feucht-Inkubator bei Raumtemperatur inkubiert. Die Sektionen werden mit PBS dreimal bei Raumtemperatur gewaschen. Das gebundene Fv(FRP5)-phoA-Protein wird unter Verwendung von Fast RedTR als Substrat für die alkalische Phosphatase nachgewiesen. Die Färbungslösung besteht aus 300 µl Naphthol AS-MX Phosphat (Sigma, 13 mg/ml in Dimethylformamid), 8 mg Levamisol (ein Inhibitor von endogener alkalischer Phosphatase, Sigma) und 10 mg Fast Red -Salz (Sigma), das zu 9,7 ml 100 mM Tris-HCl, pH 8,2 und 1 mM ZnCl&sub2; gegeben wurde. Dieses Gemisch wird unmittelbar vor Verwendung hergestellt und durch einen 0,45 µm Filter filtriert. Der Färbelösung wird ZnCl&sub2; zugesetzt, um eine erneute Dimersierung des gebundenen Fv(FRP5)-phoA- Proteins und Aktivierung der alkalischen Phosphatase zu ermöglichen. Die Tumor-Sektionen, die mit Fv(FRP5)-phoA behandelt wurden, werden in der Fast Red -Färbelösung für 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Nach Färben wird die Aktivität der Phosphatase durch zweimaliges Waschen der Zellen mit PBS und einmal mit 1 M KH&sub2;PO&sub4; blockiert. Die Glas-Deckplättchen werden mit Gel überzogen. Die Zellen werden unter einem Fluoreszenz- Mikroskop unter Verwendung von grünem Licht zur Anregung untersucht. Positiv gefärbte Zellen zeigen eine intensive, rote Fluoreszenz auf der Zelloberfläche.
Alternativ können die mit dem Fv(FRP5)-phoA-Protein behandelten Tumor-Sektionen mit Naphthol AS-BI-Phosphat (Sigma) und New Fuchsin (Sigma), oder mit 5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphat (BCIP, Sigma) und Nitro Blue Tetrazolium (Sigma) gefärbt werden. Die gefärbten Sektionen können dann mit einem normalen Lichtmikroskop sichtbar gemacht werden.

Beispiel 11. Klonieren funktioneller Umlagerungen schwerer und leichter Ketten der Hybridomzellinie FWP51

Poly(A)-enthaltende RNA, die aus Hybridomzellen FWP51, wie in Beispiel 3.3 beschrieben, isoliert wurde, liefert die Quelle für die cDNA-Synthese und die nachfolgende Amplifizierung von V-Bereich-Minigenen. Die cDNA-Synthese und Amplifizierung der cDNA der FWP51 variablen Domäne der schweren und leichten Kette mittels der Polymerase-Ketten-Reaktion wird, wie in Beispiel 4 beschrieben, durchgeführt. Die Amplifizierungsprodukte der erwarteten Größe werden aus Agarosegelen gereinigt und in geeignete Vektoren kloniert. Funktionelle Umlagerungen werden durch Sequenzieren ermittelt.

11.1 Subklonieren der cDNA der variablen Domäne der schweren und leichten Kette von FWP51

Material, das gemäß Beispiel 4.3 amplifiziert wurde, wird mit CHCl&sub3; extrahiert und in Anwesenheit von 200 mM LiCl ausgefällt. Um das Klonieren zu erleichtern, wird die cDNA der variablen Domäne der schweren Kette von FWP51 mit den Re- striktionsenzymen PstI und BstEII gespalten, das Fragment wird durch Agarosegelelektrophorese gereinigt und mit mit PstI und BstEII gespaltener pWW15-DNA ligiert. Die cDNA der variablen Domäne der leichten Kette von FWP51 wird mit den Restriktionsenzymen PvuII und BglII gespalten, das Fragment wird durch Agarosegelelektrophorese gereinigt und mit mit PvuII und BglII gespaltener pWW15-DNA (siehe Beispiel 5) ligiert. Die Ligierung, Transformation und das Screenen nach den gewünschten Ligierungsprodukten wird wie in Beispiel 4.5 beschrieben durchgeführt. Die folgenden Plasmide werden erhalten:
PCR-Produkt Plasmid-Klone
H pWW15-VH51-1
pWW15-VH51-2
pWW15-VH51-3
L PWW15-VL51-1
pWW15-VL51-2
pWW15-VL51-3

11.2 Sequenzieren

Das Sequenzieren wird wie in Beispiel 4.6 beschrieben durchgeführt.
Die Plasmide pWW15-VH51-1 (SEQ ID Nr.6), pWW15-VH51-2, pWW15-VH51-3 enthalten identische funktionelle FWP51-Inserts der variablen Domäne der schweren Kette. Die Plasmide pWW15- VL51-1 (SEQ ID Nr.7), pWW15-VL51-2, pWW15-VL51-3 enthalten identische, funktionelle variable Domänen der leichten Kette kappa von FWP51. Die Plasmide pWW15-VH51-1 und pWW15-VL51-1 werden als Quelle für weitere Subklonierungsschritte verwendet.

Beispiel 12 Konstruktion des mAk FWP51-Einketten-Gens 12.1 Verbinden des Fv-Fusionsgens

Das Plasmid pWW15-VH51-1 wird mit PstI und BstEII gespalten und das 342 bp Fragment der variablen Domäne der schweren Kette von FWP51 wird isoliert. Dies wird in mit PstI/BstEII gespaltenen pWW15-VL51-1 kloniert, was das Plasmid pWW15-Fv51 (SEQ ID Nr.8) ergibt.

12.2 Mutation des Fv(FWP51-Einketten-Gens

Um die Genfusion zwischen dem das Einketten-Fv(FWP51) codierenden Gens aus pWW15-Fv51 und Effektorgenen zu ermöglichen, wird das Stopcodon an Position 729-731 der Sequenz in pWW15-Fv51 (SEQ ID Nr.8) wie folgt entfernt (siehe auch Beispiel 6.1): die Plasmid-DNA von pWW15-Fv51 wird mit BstEII und BglII gespalten und die Linkersequenz und das die variable Domäne der leichten Kette von FWP51 codierende Fragment wird isoliert. In einer anderen Spaltung wird pWW15-Fv51 mit BstEII und BclI gespalten. Das große Fragment, das Vektorsequenzen und die variable Domäne der schweren Kette von FWP51 codierende Sequenzen enthält, wird daher isoliert. Das BstEII/BglII VL- Fragment wird nun in mit BstEII/BclI gespaltenem pWW15-Fv51, der VH enthält, inseriert. Das so erhaltene Plasmid pWW15-Fv51- ORF wird als Quelle zur Konstruktion von Fv(FWP51)-Effektor- Fusionsgenen verwendet.

Beispiel 13 Konstruktion von Einketten-Fv-Exotoxin A- Fusionsgen-Expressionsplasmiden

Die mAk FRP5- und mAk-FWP51-Einketten-Fv-Gene werden an ein verkürztes bakterielles Toxin, Exotoxin A (ETA) von Pseudomonas aeruginosa, fusioniert. Diese chimären Gene codieren rekombinante Immuntoxine, die selektiv die Proteinsynthese in c-erbB-2-exprimierenden Zellen inhibieren.

13.1 Mutation des Exotoxin A-Gens von Pseudomonas aeruginosa PAK

Zur Konstruktion der Fv-Exotoxin A (Fv-ETA)-Fusiongene wird das ETA-Gen aus Pseudomonas aeruginosa PAK derart mutiert, daß die ursprüngliche Zellbindungsdomäne I am N-Terminus des Toxins entfernt wird und eine XbaI-Spaltstelle an der früheren Grenze Domäne I/Domäne II des das ETA codierenden Bereichs gebildet wird. Das Plasmid pMS150A (Lory et al., J Bacteriol. 170 (1988), 714) wird durch EcoRI-Spaltung linearisiert. 20 ng der linearisierten Template-DNA werden für eine 100 µl PCR- Reaktion verwendet, welche wie vorstehend unter Verwendung der folgenden Oligonucleotid-Primer 1 und 2 durchgeführt wurde:
1: 5'-CACGGAAGCTTAAGGAGATCTGCATGCTTCTAGAGGGCGGCA- GCCTGGCCGCGCTG-3'
2: 5'-GCGGATCGCTTCGCCCAGGT-3'
Nach Spaltung der PCR-Produkte mit HindIIIl/SalI wird ein 201 bp-Fragment aus einem 1,5 %igen Agarosegel isoliert und in mit HindIII/SalI gespaltenen pUC 18 inseriert. Die Ligierung wird wie vorstehend beschrieben durchgeführt. Die ligierte DNA wird in E.coli XL1 Blue (Stratagene) transformiert. 2 rekombinante Plasmide werden isoliert und die Insert-DNA wird wie vorstehend beschrieben unter Verwendung von universal- und reverspUC-Primer (Boehringer) sequenziert. Ein Plasmid, das das erwartete Produkt enthält, wird als pWW22 (SEQ ID Nr.9) bezeichnet und als Quelle für weitere Subklonierungsschritte verwendet. Das Plasmid pWW22 wird mit HindIII und SalI gespalten, das mutierte ETA-Genfragment wird isoliert und in das große Fragment des mit HindIII/SalI gespaltenen Plasmids pMS150A inseriert, das pUC9-Vektorsequenzen und einen Teil des ETA- Gens, das die C-terminale Hälfte des Toxins codiert, enthält. In dem so erhaltenen Plasmid pWW20 wird daher eine verkürztes ETA-Gen gebildet, das die Domänen II und III des Toxins codiert

13.2 Vereinigung der Einketten-Fv-ETA-Fusionsgene

HindIII/XbaI/-Einketten-Fv-Genfragmente, die zur Konstruktion von Fv-ETA-Fusionsgenen geeignet sind, werden aus dem Plasmid pWW53 (Einketten-Fv FRP5), und dem Plasmid pWW15-Fv51- ORF (Einketten-Fv FWP51) isoliert, und in mit HindIII/XbaI gespaltenem pWW20 inseriert. Die Ligierung und Transformation in E.coli XL1 Blue (Stratagene) wird wie vorstehend beschrieben durchgeführt. Die so erhaltenen Plasmide pWW20-Fv5 (Fv(FRP5)-ETA) und pWW20-Fv51 (Fv(FWP51)-ETA) werden als Ausgangspunkt für weitere Subklonierungsschritte verwendet.

13.3 Konstruktion von Einketten Fv-Exotoxin A Fusionsgen- Expressionsplasmiden

Zur Expression von Einketten Fv-Exotoxin A Fusionsgenen in E.coli wird das Expressionsplasmid pFLAG-1 (IBI Biochemicals) verwendet. Die Fusionsgene werden im Leseraster mit der von pFLAG-1 codierten Signalsequenz des äußeren Membranproteins A (omp A) verknüpft. Die Plasmid-DNA von pWW20-Fv5 und pWW20-Fv51 wird mit HindIII gespalten und durch Auffüllen mit Klenow werden wie in Beispiel 4.5 glatte Enden gebildet. Die DNA mit glatten Enden wird wird mit EcoRI gespalten und die Einketten Fv-ETA-Genfragmente werden isoliert (Fv(FRP5)-ETA: 1916 bp, Fv(FWP51)-ETA: 1916 bp). Die Plasmid-DNA pFLAG-1 wird mit HindIII gespalten, und glatte Enden werden wie vorstehend beschrieben gebildet. Das so erhaltene DNA-Fragment wird isoliert und mit EcoRI gespalten. Die Fv-ETA Fusionsgen-Fragmente mit glattem/EcoRI-Ende werden in die modifizierte pFLAG-1 Plasmid-DNA inseriert. Die Fv-ETA-Fragmente werden dabei im Leseraster mit der ompA-Signalsequenz von pFLAG-1 fusioniert, wobei die Plasmide pWW215-5 zur Expression von Fv(FRP5)-ETA (SEQ ID Nr.10) und pWW215-51 zur Expression von Fv(FWP51)-ETA (SEQ ID Nr.11) gebildet werden.

Beispiel 14. Expression und Isolierung von Fv(FRP5)-ETA und Fv(FWP51)-ETA aus E.coli 14.1 Herstellung von Gesamt-Lysaten

Die Plasmide pWW215-5 und pWW215-51 werden gemäß Standardverfahren in den E.coli-Stamm CC118 transformiert (siehe Beispiel 9.1). Einzelne Kolonien werden gewählt und über Nacht in LB-Medium gezüchtet, das 100 µg/ml Ampicillin und 0,4 % Glucose enthält. Die über Nacht-Kulturen werden in frischem LB- Medium, das Ampicillin und Glucose enthält, 1:30 verdünnt und bei 37ºC bis zu einer OD&sub5;&sub5;&sub0; von 0,5 gezüchtet. An diesem Punkt wird die Expression der Fv(FRP5)-ETA- und Fv(FWP51)-ETA-Gene durch Zusatz von IPTG in einer Endkonzentration von 0,5 mM induziert und die Zellen werden für weitere 30 Minuten gezüchtet. Die Zellen werden durch Zentrifugation geerntet und durch Ultraschall in PBS/1 mM CaCl&sub2; lysiert. Die Lysate werden durch Ultrazentrifugation bei 25000 g für 45 Minuten bei 4ºC geklärt. Die Überstände werden gewonnen.

14.2 Isolierung von Fv(FRP5)-ETA und Fv(FWP51)-ETA

Die geklärten E.coli-Lysate, die das 66,4 KDA Fv(FRP5)- ETA- oder das 66,3 KDA Fv(FWP51)-ETA-Protein enthalten, werden durch eine Affinitätssäule mit dem monoklonalen Antikörper M1 (IBI Biochemicals) geleitet. Die Säule wird dreimal mit PBS/1 mM CaCl&sub2; gewaschen. Die gebundenen Fv(FRP5)-ETA- und Fv(FWP51)- ETA-Proteine werden mit PBS/2 mM EDTA eluiert. Die Fraktionen werden durch SDS-PAGE und Immunblotten (siehe Beispiel 1.3.2) auf Anwesenheit der Fv-ETA-Proteine untersucht, wobei ein in Kaninchen entwickeltes anti-Exotoxin A Antiserum verwendet wird.

Beispiel 15. Selektive Inhibierung der Proteinsynthese in c- erbB-2-exprimierenden Zellen mit Fv(FRP5)-ETA und Fv(FWP51)-ETA

Die rekombinanten Immuntoxine Fv(FRP5)-ETA und Fv(FWP51)- ETA inhibieren in vitro selektiv die Proteinsynthese und das Wachstum von Zellen, die große Mengen des humanen c-erbB-2- Proteins exprimieren. Die Immuntoxine beeinträchtigen Zeilen nicht, die kein oder geringe Mengen des humanen c-erbB-2-Proteins exprimieren.

15.1 Behandlung von Zellinien mit Immuntoxin

Die humanen Brust- und Ovarial-Tumorzellinien SK-8R3, MDAMB-231, MDA-MB-453, HTB77, die Maus Mammaepithel-Zellinie HC11 und HC11-Zellen, die mit humaner c-erbB-2-cDNA transfiziert wurden, werden auf Gewebekulturplatten mit 48 Vertiefungen (Costar) bei einer Dichte von 10&sup5; Zellen/Vertiefung ausplattiert. Nach 4 Stunden wird das Medium entfernt und gegen normales Wachstumsmedium ausgetauscht, das Fv(FRP5)-ETA oder Fv(FWP51)-ETA in unterschiedlichen Konzentrationen im Bereich von 1 bis 1000 ng/ml enthält. Die Zellen werden für 16 Stunden mit den Toxin-Fusionsproteinen inkubiert.

15.2 ³H-Leucin-Markierung der Zellen

Die mit Immuntoxin behandelten Zellen werden zweimal gewaschen und für 4 Stunden in normalem Wachstumsmedium, das 4 µCi 3H-Leucin/ml enthält, inkubiert. Die markierten Zellen werden zweimal gewaschen und die mit ³H-Leucin markierten Gesamt-Proteine werden durch TCA-Fällung auf Whatman GFC-Filter geerntet. Das Ausmaß der Proteinsynthese in mit Immuntoxin behandelten Zellen wird im Vergleich zu unbehandelten Kontrollzellen bestimmt.

Beispiel 16. Fv(FRP5)-ETA und die mAk FWP51 und FSP77 inhibieren das Wachstum von c-erbB-2 exprimierenden Zellen in "nude" Mäusen

Die Verabreichung von Fv(FRP5)-ETA und der mAk FWP51 und FSP77 an Tiere, denen c-erbB-2 exprimierende Zellen injiziert wurden, inhibiert das Tumorwachstum dieser Zellen.

16.1 Das Tumor-Modell "nude" Maus

Die Maus-Fibroblasten-Zellinie NIH/3T3 wird gemäß herkömmlicher, zuvor beschriebener Verfahren (Graham & van der Eb, Virology 52 (1973),456) mit einem Plasmid, das das Punktmutierte, aktivierte c-erbB-2-Protein (Masuko et al., Jpn. Cancer Res. 80 (1989), 10) exprimiert, und mit dem Plasmid pSV2neo (Southern & Berg, J. Mol. Appl. Genet. 1 (1982), 327), das das Resistenzgen gegen den Stoff G418 codiert, transfiziert. Die transfizierten Zellen werden 2 Wochen in einem Medium selektiert, das 500 µg/ml G418 (Geneticin, Gibco-BRL) enthält. Einzelne Klone werden gewählt und unter Verwendung herkömmlicher Protein-Blot-Techniken (Towbin et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 76 (1979), 4350) auf Expression des humanen c-erbB-2-Proteins untersucht. Ein Klon, der geringe Mengen des Punkt-mutierten, aktivierten, humanen c-erbB-2-Proteins (Klon 3.7) exprimiert, wird gewählt und auf Wachstum in "nude" Mäusen untersucht. 2-5x10&sup6; Zellen des Klons 3.7 (pro Tier) werden in 0,2 ml PBS suspendiert und in die Schenkel weiblicher, "nude' Balb/c-Mäuse subkutan injiziert. Die 3.7-Zellen, die in einer Dosis von 2x10&sup6; Zellen injiziert wurden, bilden in "nude" Mäusen schnell Tumore (Kontrolltiere, siehe Beispiel 16.2).

16.2 Immuntoxin-Behandlung von Tieren

2x10&sup6; Zellen des Klons 3.7 werden in "nudet" Mäuse subkutan injiziert. Die Tiere werden für insgesamt 7 Tage kontinuierlich mit Fv(FRP5)-ETA behandelt. 200 µl Fv(FRP5)-ETA (Konzentration 35 µg/ml in PBS) werden in eine osmotische Pumpe (Alzet mini osmotische Pumpe, Modell 2001, Alza, Pab Alto, CA, #94303- 0802) überführt, die den Tieren zur gleichen Zeit, als die 3.7- Zellen injiziert werden, subkutan eingepflanzt wird. Die Pumpe setzt Fv(FRP5)-ETA kontinuierlich frei und gibt für 7 Tage 1 µg/Tag an jedes Tier ab. Im Vergleich zu den Kontrolltieren (siehe Beispiel 16.1), verzögert die Verabreichung von Fv(FRP5)-ETA den Beginn der Tumorbildung.

16.3 Behandlung von Tieren mit mAk

5x10&sup6; Zellen des Klons 3.7 werden "nude" Mäusen subkutan injiziert. Beginnend am Tag der ersten Injektionen von Klon 3.7-Zellen, werden die Tiere, täglich, für insgesamt 10 Tage, ebenfalls mit dem monoklonalen Antikörper FWP51 oder dem monoklonalen Antikörper FSP77 (die Dosis der mAk beträgt 50 µg/200 µl BSS/Tag) behandelt. Der mAk wird in die Schwanzvene der Maus intravenös injiziert. Beide Antikörper verzögern den Beginn des Tumorwachstums. Im Vergleich dazu wird bei der Inhibierung des Tumorwachstums durch gleichzeitige Verabreichung beider Antikörper, dem mAk FWP51 und dem mAk FSP77, ein synergistischer Effekt beobachtet.

Sequenzlisten

SEQ ID Nr.1

Sequenztyp : Nucleotid
Sequenzlänge : 361 bp
Molekültyp : Plasmid-DNA
Ursprünglicher Ausgangs-Organismus : Maus
Unmittelbare experimentelle Quelle : E.coli
Name des Zellklons : pMZ16/1
Merkmale: 6 - 27 bp VH1BACK-Primerregion
95 - 109 bp CDR1H
152 - 202 bp CDR2H
299 - 328 bp CDR3H
329 - 361 bp VH1FOR-Primerregion
Eigenschatten : codiert die variable Domäne der schweren Kette des monoklonalen Antikörper FRP5

SEQ ID Nr.2

Sequenztyp : Nucleotid
Sequenzlänge : 407 bp
Molekültyp : Plasmid-DNA
Ursprünglicher Ausgangs-Organismus : Maus
Unmittelbare experimentelle Quelle : E.coli
Name des Zellklons : pMZ18/1
Merkmale: 6 - 28 bp MCK2-Primerregion
98 - 130 bp CDR1L
176 - 196 bp CDR2L
293 - 319 bp CDR3L
374 - 404 bp MCK2-Primerregion
Eigenschatten : codiert die variable Domäne der leichten Kette des Kappa des monoklonalen Antikörper FRP5

SEQ ID Nr.3

Sequenztyp : Nucleotid
Sequenzlänge : 175 bp
Molekültyp : Plasmid-DNA
Ursprünglicher Ausgangs-Organismus : vollsynthetisch
Unmittelbare experimentelle Quelle : E.coli
Name des Zellklons : pWW19
Merkmale: 30 - 35 bp PstI-Schnittstelle
38 - 44 bp BstEII-Schnittstelle zum Subklonieren der variablen Domäne der schweren Kette
54 - 98 bp codierende Sequenz des (GlyGlyGlyGlySer)&sub3; Linkers
105 - 110 bp PvuII-Schnittstelle
112 - 117 bp BglII-Schnittstelle
120 - 125 bp BclI-Schnittstelle zum Subkionieren der variablen Domäne der leichten Kette

SEQ ID Nr.4

Sequenztyp : Nucleotid mit entsprechendem Protein
Sequenzlänge : 748 bp
Molekültyp : Plasmid-DNA
Ursprünglicher Ausgangs-Organismus : Maus
Unmittelbare experimentelle Quelle : E.coli
Name des Zellklons : pWW52
Merkmale: 1 - 8 bp synthetischer Spacer
9 - 365 bp FRP5 variable Domäne der schweren Kette
99 - 113 bp CDR1H
156 - 206 bp CDR2H
303 - 332 bp CDR3H
366 - 410 bp 15 Aminosäuren-Linkersequenz
411 - 720 bp FRP5 variable Domäne der leichten Kette
480 - 512 bp CDR1L
558 - 578 bp CDR2L
675 - 701 bp CDR3L
Eigenschaften: Fusionsprotein der Fv-variablen Domäne der schweren Kette/leichten Kette, das an die extrazelluläre Domäne des Wachstumsfaktor-Rezeptors c-erbB-2 bindet

SEQ ID Nr.5

Sequenztyp : Nucleotid mit entsprechendem Protein
Sequenzlänge : 2233 bp
Molekültyp : Plasmid-DNA
Ursprünglicher Ausgangs-Organismus : Maus und E.coli
Unmittelbare experimentelle Quelle : E.coli
Name des Zellklons : pWW616
Merkmale: 1 - 22 bp ompA 5'-nicht-codierender Bereich
23 - 85 bp ompA-Signalpeptid
89 - 445 bp FRP5 variable Domäne der schweren Kette
446 - 490 bp 15 Aminosäuren-Linkersequenz
491 - 814 bp FRP5 variable Domäne der leichten Kette
815 - 2155 bp phoA-codierender Bereich
2156 - 2233 bp 3'-nicht-codierender Bereich von phoA
Eigenschaften: Fusionsprotein Ev(FRP5)-phoA der Fv-schweren Kette/leichten Kette und alkalischer Phosphatase, das an den Wachstumsfaktor-Rezeptor c-erbB-2 bindet

SEQ ID Nr.6

Sequenztyp : Nucleotid
Sequenzlänge : 342 bp
Molekültyp : Plasmid-DNA
Ursprünglicher Ausgangs-Organismus : Maus
Unmittelbare experimentelle Quelle : E.coli
Name des Zellklons : pWW15-VH51-1
Merkmale: 1 - 14 bp Teilsequenz der VH1BACK-Primerregion
82 - 96 bp CDR1H
139 - 189 bp CDR2H
286 - 318 bp CDR3H
317 - 342 bp Teilsequenz der VH1FOR-Primerregion Eigenschaften: codiert die variable Domäne der schweren Kette des monoklonalen Antikörpers FWP51

SEQ ID Nr.7

Sequenztyp : Nucleotid
Sequenzlänge : 310 bp
Molekültyp : Plasmid-DNA
Ursprünglicher Ausgangs-Organismus : Maus
Unmittelbare experimentelle Quelle : E.coli
Name des Zellklons : pWW15-VL51-1
Merkmale: 1 - 18 bp Teilsequenz der VK1BACK-Primerregion
64 - 96 bp CDR1L
142 - 162 bp CDR2L
259 - 282 bp CDR3L
292 - 310 bp Teilsequenz der VK1FOR-Primerregion
Eigenschaften: codiert die variable Domäne der leichten Kette des monoklonalen Antikörpers FWP51

SEQ ID Nr.8

Sequenztyp : Nucleotid mit entsprechendem Protein
Sequenzlänge : 748 bp
Molekültyp : Plasmid-DNA Original
Ursprünglicher Ausgangs-Organismus : Maus
Unmittelbare experimentelle Quelle : E.coli
Name des Zellklons : pWW15-Fv51
Merkmale: 1 - 8 bp synthetischer Spacer
9 - 368 bp FWP51 variable Domäne der schweren Kette
99 - 113 bp CDR1H
156 - 206 bp CDR2H
303 - 335 bp CDR3H
369 - 413 bp synthetischer Spacer
414 - 728 bp FWP51 variable Domäne der leichten Kette
483 - 515 bp CDR1L
561 - 581 bp R2L
678 - 701 bp CDR3L
729 - 748 bp synthetischer Spacer
Eigenschaften: codiert das Einketten Fv-Fusionsgen, das die cDNA der variablen Domäne der schweren Kette und kappa-leichten Kette des monoklonalen Antikörpers FWP51 umfaßt

SEQ ID Nr.9

Sequenztyp : Nucleotid
Sequenzlänge : 201 bp
Molekültyp : Plasmid-DNA
Ursprünglicher Ausgangs-Organismus : Pseudomonas aeruginosa PAK
Unmittelbare experimentelle Quelle : E.coli
Name des Zellklons : pWW22
Merkmale: 1 - 27 bp synthetischer Spacer
29 - 201 bp Teilsequenz von Exotoxin A, die den
Nucleotid-Positionen 1574 - 1747 der Exotoxin A- Sequenz entspricht (Cray et al Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 (1984), 2645)
Eigenschaften: codiert einen Teil des mutierten Exotoxin A-Gens von Pseudomonas aeruginosa PAK

SEQ ID Nr.10

Sequenztyp : Nucleotid mit entsprechendem Protein
Sequenzlänge : 2012 bp
Molekültyp : Plasmid-DNA
Ursprünglicher Ausgangs-Organismus : Maus/P. aeruginosa
Unmittelbare experimentelle Quelle : E.coli
Name des Zellklons : pWW215-5
Merkmale: 1 - 63 bp ompA-Signalpeptid
64 - 87 bp FLAG-Peptid und Enterokinase-Spaltstelle
97 - 453 bp FRP5 variable Domäne der schweren Kette
454 - 498 bp 15 Aminosäuren-Linkersequenz
499 - 822 bp FRP5 variable Domäne der leichten Kette
826 - 1911 bp Exotoxin A codierender Bereich (codiert Aminosäure 252-613 des reifen Exotoxin A)
1912 - 2012 bp 3'-nicht-codierender Bereich des Exotoxin A-Gens
Eigenschaften: Fusionsprotein Fv(FRP5)-ETA der Fv-variablen Domäne der schweren Kette/leichten Kette und Exotoxin A, das an das c- erbB-2-Protein bindet

SEQ ID Nr.11

Sequenztyp : Nucleotid mit entsprechendem Protein
Sequenzlänge : 2012 bp
Molekültyp : Plasmid-DNA
Ursprünglicher Ausgangs-Organismus : Maus/P. aeruginosa
Unmittelbare experimentelle Quelle : E.coli
Name des Zellklons : pww215-51
Merkmale: 1 - 63 bp ompA-Signalpeptid
64 - 87 bp FLAG-Peptid und Enterokinase-Spaltstelle
97 - 456 bp FWP51 variable Domäne der schweren Kette
457 - 501 bp 15 Aminosäuren-Linkersequenz
502 - 822 bp FWP51 variable Domäne der leichten Kette
826 - 1911 bp Exotoxin A codierender Bereich (codiert Aminosäuren 252-613 des reifen Exotoxin A)
1912 - 2012 bp 3'-nicht-codierender Bereich des Exotoxin A-Gens
Eigenschaften: Fusionsprotein Fv(FWP51)-ETA der Fv-variablen Domäne der schweren Kette/leichten Kette und Exotoxin A, das an das c- erbB-2-Protein bindet

Claims

1. Fusionsprotein, das einen rekombinanten Einketten-Antikörper umfaßt, der gegen die extrazelluläre Domäne des Wachstumsfaktor-Rezeptors c-erbB-2 gerichtet ist, welcher eine variable Domäne einer schweren Kette und eine variable Domäne einer leichten Kette eines monoklonalen Antikörpers, wobei die Domänen durch eine Polypeptid-Spacergruppe verbunden sind, und ein Effektormolekül umfaßt, und gegebenenfalls ein Peptid, das die Reinigung erleichtert, eine Spaltstelle und einen Peptidspacer umfaßt.

2. Fusionsprotein nach Anspruch 1, worin die variable Domäne der schweren Kette ein Polypeptid der Aminosäuresequenz 2-120 der SEQ ID Nr.4 umfaßt, worin gegebenenfalls 1, 2, 3 oder 4 einzelne Aminosäuren in den Aminosäuresequenzen 2-31 (FR&sub1;), 37- 50 (FR&sub2;), 68-99 (FR&sub3;) und/oder 110-120 (FR&sub4;), durch andere Aminosäuren ersetzt sind oder entfernt wurden, und worin die Aminosäure Cys in dem oxidierten Zustand unter Bildung von S-S- Brücken vorliegen kann.

3. Fusionsprotein nach Anspruch 1, worin die variable Domäne der schweren Kette ein Polypeptid der Aminosäuresequenz 2-120 der SEQ ID Nr.4 umfaßt, worin die Aminosäure Cys in dem oxidierten Zustand unter Bildung von S-S-Brücken vorliegen kann.

4. Fusionsprotein nach Anspruch 1, worin die variable Domäne der leichten Kette ein Polypeptid der Aminosäuresequenz 136-241 der SEQ ID Nr.4 umfaßt, worin gegebenenfalls 1, 2, 3 oder 4 einzelne Aminosäuren in den Aminosäuresequenzen 136-158 (FR&sub6;), 170-184 (FR&sub7;), 192-223 (FR&sub8;), und/oder 233-241 (FR&sub9;) durch andere Aminosäuren ersetzt sind, oder entfernt wurden, und worin die Aminosäure Cys in dem oxidierten Zustand unter Bildung von S-S-Brücken vorliegen kann.

5. Fusionsprotein nach Anspruch 4, worin die variable Domäne der leichten Kette ein Polypeptid der Aminosäuresequenz 136-241 der SEQ ID Nr.4 umfaßt, worin die Aminosäure Cys in dem oxidierten Zustand unter Bildung von S-S-Brücken vorliegen kann.

6. Fusionsprotein nach Anspruch 1, worin die variable Domäne der schweren Kette ein Polypeptid der Aminosäuresequenz 2-121 der SEQ ID Nr.8 umfaßt, worin gegebenenfalls 1, 2, 3 oder 4 einzelne Aminosäuren in den Aminosäuresequenzen 2-31 (FR&sub1;), 37- 50 (FR&sub2;), 68-99 (FR&sub3;) und/oder 111-121 (FR&sub4;) durch andere Aminosäuren ersetzt sind oder entfernt wurden, und worin die Aminosäure Cys in dem oxidierten Zustand unter Bildung von S-S- Brücken vorliegen kann.

7. Fusionsprotein nach Anspruch 6, worin die variable Domäne der schweren Kette ein Polypeptid der Aminosäuresequenz 2-121 der SEQ ID Nr.8 umfaßt, worin die Aminosäure Cys in dem oxidierten Zustand unter Bildung von S-S- Brücken vorliegen kann

8. Fusionsprotein nach Anspruch 6, worin die variable Domäne der leichten Kette ein Polypeptid der Aminosäuresequenz 137-241 der SEQ ID Nr.8 umfaßt, worin gegebenenfalls eine oder mehrere einzelne Aminosäuren in den Aminosäuresequenzen 137-159 (FR&sub6;), 171-185 (FR&sub7;), 193-224 (FR&sub8;) und/oder 233-241 (FR&sub9;) durch andere Aminosäure ersetzt sind oder entfernt wurden, und worin die Aminosäure Cys in dem oxidierten Zustand unter Bildung von S-S-Brücken vorliegen kann.

9. Fusionsprotein nach Anspruch 8, worin die variable Domäne der leichten Kette ein Polypeptid der Aminosäuresequenz 137-241 der SEQ ID Nr.8 umfaßt, worin die Aminosäure Cys in dem oxidierten Zustand unter Bildung von S-S-Brücken vorliegen kann

10. Fusionsprotein nach einem der Ansprüche 1 bis 9, worin das Effektormolekül ein Enzym oder eine biologisch aktive Variante davon ist.

11. Fusionsprotein nach Anspruch 10, worin das Enzym alkalische Phosphatase oder eine biologisch aktive Variante davon ist.

12. Fusionsprotein nach einem der Ansprüche 1 bis 9, worin das Effektormolekül ein Toxin oder eine biologisch aktive Variante davon ist.

13. Fusionsprotein nach Anspruch 12, worin das Effektormolekül Pseudomonas Exotoxin oder eine biologisch aktive Variante davon ist.

14. Fusionsprotein nach Anspruch 1, worin die variable Domäne der schweren Kette und die variable Domäne der leichten Kette von einem monoklonalen Maus-Antikörper abgeleitet ist, der ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus FRP5, FSP16, FWP51 und FSP77, die die gemäß dem Budapester Vertrag am 21. November 1990 bei der European Collection of Animal Cell Cultures (ECACC) in Porton Down, Salisbury, GB, unter den Hinterlegungsnummern 90112115, 90112116, 90112117 bzw. 90112118 hinterlegt wurden.

15. Fusionsprotein nach Anspruch 1, worin die variable Domäne der schweren Kette und die variable Domäne der leichten Kette von dem monoklonalen Maus-Antikörper FRP5 abgeleitet sind.

16. Fusionsprotein nach Anspruch 1, worin die variable Domäne der schweren Kette und die variable Domäne der leichten Kette von dem monoklonalen Maus-Antikörper FWP51 abgeleitet sind.

17. Fusionsprotein, das als Fv(FRP5)-phoA bezeichnet wird, nach Anspruch 1, welches ein Polypeptid der Aminosäuresequenz 2-690 der SEQ ID Nr.5 umfaßt.

18. Fusionsprotein, das als Fv(FRP5)-ETA bezeichnet wird, nach Anspruch 1, welches ein Polypeptid der Aminosäuresequenz 2-606 der SEQ ID Nr.10 umfaßt.

19. Fusionsprotein, das als Fv(FWP5L)-ETA bezeichnet wird, nach Anspruch 1, welches ein Polypeptid der Aminosäuresequenz 2-606 der SEQ ID Nr.11 umfaßt.

20. Rekombinante DNA, welche ein Insert umfaßt, das ein Fusionsprotein nach einem der Ansprüche 1 bis 19 codiert.

21. Rekombinante DNA nach Anspruch 20, die ein Insert umfaßt, das eine variable Domäne einer schweren Kette der Maus eines monoklonalen Antikörpers codiert, der ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus den Antikörpern FRP5, FSP16, FSP77 und FWP51, die gemäß dem Budapester Vertrag am 21. November 1990 bei der European Collection of Animal Cell Cultures (ECACC) in Porton Down, Salisbury, GB, unter den Hinterlegungsnummern 90112115, 90112116, 90112117 bzw. 90112118 hinterlegt wurden, oder eine Aminosäuresequenz codiert, die zu der variablen Domäne der schweren Kette homolog ist.

22. Rekombinante DNA nach Anspruch 21, die ein Insert umfaßt, das eine variable Domäne einer leichten Kette der Maus eines monoklonalen Antikörpers codiert, der ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus den Antikörpern FRP5, FSP16, FSP77 und FWP51, die gemäß dem Budapester Vertrag am 21. November 1990 bei der European Collection of Animal Cell Cultures (ECACC) in Porton Down, Salisbury, GB, unter den Hinterlegungsnummern 90112115, 90112116, 90112117 bzw. 90112118 hinterlegt wurden, oder eine Aminosäuresequenz codiert, die zu der variablen Domäne der leichten Kette homolog ist.

23. Rekombinante DNA nach Anspruch 20, die ein Hybridvektor ist, der weiter einen Ursprung der Replikation oder eine autonom replizierende Sequenz, einen oder mehrere dominante Markersequenzen, und gegebenenfalls Expressionskontrollsequenzen, Signalsequenzen und zusätzliche Restriktionschnittstellen enthält.

24. Hybridvektor nach Anspruch 23, der einen Affen-Virus- Promotor und den Enhancer der Maus Ig H- oder L-Kette umfaßt.

25. Verfahren zur Herstellung einer DNA nach Anspruch 20, welches die folgenden Schritte umfaßt:

a) Herstellen von Maus-DNA aus dem Genom einer geeigneten Hybridomzellinie und Auswählen der gewünschten DNA, die die variablen Domänen der schweren und/oder leichten Kette des Antikörpers mit der gewünschten Spezifität codiert,

b) Herstellen von DNA, die die gewünschte Signalsequenz codiert und Herstellen von DNA, die ein Effektormolekül codiert,

c) Synthetisieren von DNA mittels chemischer Methoden, die die gewünschte Spacergruppe codiert,

d) Bilden rekombinanter Gene, die die Fusionsproteine codieren, indem die DNA aus Schritt a) und c) und gegebenenfalls b) in geeignete Hybridvektoren eingebaut werden,

e) Transferieren der erhaltenen Hybridvektoren in eine aufnehmende Wirtszelle oder Wiedergewinnen der DNA, die die rekombinanten Gene codiert und Transferieren der nicht-verknüpften DNA in eine aufnehmende Wirtszelle,

f) Auswählen und Züchten der transformierten Wirtszelle, und

g) gegebenenfalls Isolieren der gewünschten DNA.

26. Wirtszelle, die mit einer rekombinanten DNA nach Anspruch 25 transformiert ist.

27. Wirtszelle nach Anspruch 26, die eine Zelle eines E.coli- Stamms ist.

28. Verfahren zur Herstellung einer transformierten Wirtszelle nach Anspruch 26, wobei geeignete aufnehmende Zellen mit einem Hybridvektor transformiert werden, der ein DNA-Insert nach Anspruch 20, einen Ursprung der Replikation oder eine autonom replizierende Sequenz, einen oder mehrere dominante Markersequenzen und gegebenenfalls Expressionskontrollsequenzen, Signalsequenzen und zusätzlich Restriktionsschnittstellen umfaßt, und die transformierten Zellen ausgewählt werden.

29. Verwendung eines Fusionsproteins nach Anspruch 1 zur qualitativen und quantitativen Bestimmung des Wachstumsfaktor-Rezeptors c-erbB-2.

30. Verwendung nach Anspruch 29, welches Immunfärben von Gewebeschnitten mit einer Lösung umfaßt, die das Fusionsprotein, welches ein nachweisbares Enzym umfaßt, enthält.

31. Test-Kit zur qualitativen und quantitativen Bestimmung des c-erbB-2-Proteins, welcher ein Fusionsprotein nach Anspruch 1 umfaßt.

32. Fusionsprotein nach Anspruch 1 zur Verwendung bei der Behandlung des menschlichen oder tierischen Körpers.

33. Pharmazeutische Zusammensetzung zur Behandlung von Tumoren, die den Wachstumsfaktor-Rezeptor c-erbB-2 überexprimieren, welche eine therapeutisch wirksame Menge eines Fusionsproteins nach Anspruch 1 und einen pharmazeutisch verträglichen Träger umfaßt.

34. Verwendung eines Fusionsproteins nach Anspruch 1 zur Herstellung einer pharmazeutischen Zubereitung.