KR100624881B1 - Ngf 치료제 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 치료제로서 및 NGF 모방물의 선별과 추론적 디자인을 위한 Trk 영역의 용도에 관한 것이다.
신경성장인자
Description
본 발명은 치료제 및 선별 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 통증 질환과 같이, NGF와 같은 뉴로트로핀(neurotrophin)의 수준이 증가된 질환의 치료에 있어서 티로신 키나제 TrkA의 Ig2 영역 및 그의 단편의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한 NGF와 같은 뉴로트로핀의 작용을 길항하거나 모방하는 작용을 하는 화합물의 선별을 위한 표적으로서의 상기 TrkAIg2 영역의 용도에 관한 것이다. TrkAIg2를 본 원에서는 프롤린 풍부 부분과 함께 TrkAIg-유사 서브-영역 2를 포함하는 것으로서 정의한다(도 1).
신경 성장 인자(NGF)는 전뇌 콜린성 뉴런에 대한 강력한 신경자극 인자이며 진화하는 동안 교감신경 및 지각 뉴런의 생존과 분화를 증진시킨다. 동물 모델에서, NGF의 투여로 늙거나 상해를 입은 동물의 콜린성 퇴화 효과를 보정할 수 있는 것으로 나타났다. 정제된 마우스 NGF가 알쯔하이머 병의 치료에 사용되어 왔다. 그러나, 이러한 치료는 침투적인 외과적 처치를 필요로 하며, 장기적인 해결책은 NGF의 영양 작용을 모방할 수 있는 소 분자 작용물질을 생산하는 것일 것이다. NGF는 대개 이량체로서 존재하나, 상기 목적을 위해서 NGF의 용어에는 단량체, 이량체, 삼량체 또는 이종이량체 형태가 포함된다.
NFG가 또한 침해 수용성의 1차적인 구심성 신경상의 수용체와 상호작용함으로써 일부 지속적인 통증 상태의 매개체로서도 작용할 수도 있음을 제시하는 증거가 있다(McMahon S.B. Series B-Biological Science(1996), Vol. 351, No. 1338, 431-440). 다양한 실험상 염증 상태에서, NGF 수준은 염증이 발생한 조직에서 급속히 증가한다. 유사하게, 외래 NGF의 전신 또는 국소 적용으로 동물 및 인간 모두에서 빠르고 연장된 양상의 통각과민이 발생한다. 다수의 동물 모델에서, 실험적인 염증과 관련된 많은 통각과민들이, 항체를 포함하여 NGF를 격리시킬 수 있는 분자에 의해 차단된다. 따라서, 말초적으로 작용하는 NFG-격리제 또는 NGF 길항제가 일부 만성적인 통증 상태를 치료하는데 효능있게 사용될 수 있다.
말초적인 염증은 대개 과장된 통증 감각 또는 통각과민을 특징으로 하며, 이는 염증성 매개체인 사이토킨과 성장 인자들의 방출 결과이다. NGF는 척추 근원 신경절(DRG)의 침해 수용성 감각 뉴런들의 소 그룹의 TrkA 수용체상에서 작용함으로써 통증 매개에 중심적인 역할을 하는 것으로 보인다. 성인에서, 상기는 DRG 세포의 대략 40%를 차지한다. 이들 뉴런은 또한 펩티드 물질 P와 칼시토닌-유전자 관련된 펩티드(CGRP)를 발현한다. TrkA 수용체에 대한 NGF의 작용에 의해 이들 감각 뉴런중의 신경펩티드 수준이 증가하며, 또한 나트륨 및 칼슘 채널이 이들 뉴런의 흥분성을 증가시키도록 작용받는다. 이러한 작용의 결과 통증 수준이 증가할 수도 있다. 따라서, TrkA 세포외 영역과 같은 NGF 격리제를 이들 통증 수준을 감소시키는데 효능있게 사용할 수 있다.
계속적인 NGF 상향 조절의 조건하에서, 만성적인 염증은 지속적인 통증 상태 를 도래시킬 수도 있다. NGF의 외래적인 투여 또는 그의 상향 조절을 포함한 만성 염증의 다양한 모델들이 존재한다. 한가지 이러한 모델(Woolf, C.J. et al., British Journal Of Pharmacology, (1997), Vol. 121, No. 3, 417-424)로서 성숙한 래트에서 완전한 프레운드 보조제를 발바닥내에 주입시켜 유발시킨 것이 있다. 이는 TNF β, IL-1β 및 NGF 수준의 상승에 따라 뒷발의 국소적인 염증을 발생시킨다. TNF α의 주입은 항-NGF 항혈청의 선행 투여에 의해 약화된 열적 및 기계적 감각을 증가시키는 것으로 보고되었다. 카라기난의 투여는 NGF mRNA의 수준을 특정하게 증가(500% 까지)시키는 것으로 알려져 있으나, 이는 NT-3 및 BDNF와 같은 다른 뉴로트로핀에 대한 것으로는 보이지 않는다.
만성적인 염증 상태에서, NGF의 수준을 일정하게 상승시킨 결과 통증 상태를 장기적으로 무력화시킬 수 있다. 일례로서 생검법에서 NGF의 수준이 상승된 것으로 밝혀진 일부 형태의 방광염이 있을 수 있다(Lowe, E. M. et al., British Journal Of Urology, (1997), Vol. 79, No. 4, 572-577). 자극성 화학물질의 투여에 의해 유발된 인간의 만성 방광염의 래트 모델을 다시 NGF 격리, TrkA 면역유착제의 투여에 의해 치료할 수 있다(Dmitrieva, N. et al., Neuroscience, (1997), Vol. 78, No. 2, 449-459). NGF-격리 분자에 의한 전신적 치료로는 기정의 염증 변화를 약 30 내지 60% 까지 부분적으로 및 현저하게 역전시킬 수 있었다. 외래 NGF를 정상적인 래트 방광의 루멘에 투여하면 실험적인 염증에서 보았던 것과 유사한 급속하고 현저한 방광 과다반사항진을 생성시키는 것으로 나타났다. 또한 만성적으로 증가된 NGF 수준에 의해 침해 수용체의 말초적인 증감과 척추 말단 뉴런 의 중추적인 증감 모두를 야기시킬 수 있으며, 추정상 심지어 장기적인 감각 뉴런 이상까지도 야기시킬 수 있다(McMahon, S. B. Series B-Biological Sciences, (1996), Vol. 351, No. 1338, 431-440).
관절염 활액 분비액에서, 높은 수준의 NGF가 관찰되었다. 트랜스제닉 관절염 마우스에서도 또한 증가된 수준의 NGF와 증가된 수의 비만 세포를 갖는 것으로 나타났다(Aloe, L. et al., International Journal Of Tissue Reactions-Experimental And Clinical Aspects, (1993), Vol. 15, No. 4, 139-143). 관절염 트랜스제닉 마우스에게 주입된 정제된 NGF 항체는 상기 활액에서 비만 세포의 수를 감소시킬 뿐만 아니라 히스타민과 물질 P의 수준을 감소시킨다(Aloe, L. et al., Rheumatology International. (1995), Vol. 14, No. 6, 249-252).
대상포진 질환과 관련된 포진후 신경통(PHN)이 또한 NGF 단백질의 상향 조절을 수반할 수도 있는 것처럼 보인다. 수두 바이러스(VZV)는 2 가지 인간 질병, 즉 아동기의 수두와 대상포진에 원인이 있는 α 헤르페스 바이러스이다. 상기 바이러스는 척추 근원 신경절에 잠복해 있으며 나중에 다시 나타날 수도 있는데, 나이에 따라 나타나는 면역 기능의 감퇴를 이용한다. 재활성은 흔히 대상포진으로 알려진 헤르페스 대상포진을 야기시킨다. 대상포진의 발병률은 나이가 듦에 따라 증가한다. 통증, 이질통, 및 감염된 피부절의 감각 상실이 상기 질환의 중심적인 징후이다. 심한 통증은 대상 포진에 걸린 환자의 급성 및 만성적인 병리 상태의 주요 원인이다. 상기 만성적이고 종종 쇠약해지는 통증인 PHN이 대상포진의 가장 흔한 합병증이다. 대상 포진에 걸린 나이든 환자의 50% 이하에서 PHN이 나타날 수도 있다. 적합하게 투여되는 바이러스 억제제는 급성 대상포진의 통증을 전신적으로 크게 경감시키며, 우울증 치료제가 또한 유용할 수도 있으나; 통상적인 진통제는, 일부 환자들에서 아편양제제, 특히 메타돈을 사용하여 약간의 완화가 얻어지기도 했으나, 일반적으로 거의 사용되지 않는다. 항-NGF 치료제의 효과를 시험하는데 어려운 점은 대상포진 모델이 래트에서는 가능하지 않으며, 단지 고양이 모델에서만 가능하다는 점이다. 그러나, NGF 수준의 감소 및 관련된 통증의 경감이 가능한 인간 환자에서 이러한 치료를 조사하는 것은 가능할 수도 있다.
만성적인 염증 질환은 만연해 있으며, 기존의 치료법은 심각하게 제한된다. 예를 들어, 미국에서 관절염은 3천 7백 9십만 명이 앓고 있으며, 간질성 방광염은 45 만명이 앓고 있는 것으로 추정된다. 류마티스성 관절염의 연구에서, 환자의 80% 이상이 대다수가 진통제를 사용하고 있다는 사실에도 불구하고 심각한 통증을 앓고 있었다. 유사하게, 고통스러운 방광 징후를 특징으로 하는 간질성 방광염에도 효과적인 치료제가 없다.
NGF는 말초 및 중추 신경계의 성장 및 유지와 관련된 뉴로트로핀 군의 하나이다. NGF를 다양한 공급원으로부터, 가장 특히는 수컷 마우스의 침샘으로부터 단리시킬 수 있다. 상기를 우선 그의 침강 계수에 따라 명명된 75 NGF로서 단리시킬 수 있으며, 이는 β-NGF와 γ-NGF의 복합체이다. 이로부터 2.5S NGF를 수득할 수도 있다. 2.5S NGF는 상기 복합체의 신경 생물학적 활성에 원인이 되는 것으로 알려져 있다. 2.5S NGF는 βNGF이나, 종종 아미노 및 카르복시숙주 세포서 부분적으로 단백질 분해된다. 다른 것들로는 예를 들어 BDNF, NT-3 및 NT-4가 있다. 상기 뉴로트로핀들은 모두 공통의 수용체인 p75NGFR에 결합한다. 각각이 또한 동족 계열의 티로신 키나제 수용체들중 하나에 결합한다. 즉 NGF는 TrkA에 결합하고, BDNF 및 NT-4는 TrkB에, NT-3는 TrkC에 결합한다. NT-3는 또한 감소된 친화성으로 TrkA와 TrkB에 결합한다.
TrkA 세포외 영역의 3 차원 구조가 밝혀지지는 않았지만, 서열에 있어서 명백한 구조 모티브가 특성화되었다(도 1A). Trk 세포외 영역은 2 개의 시스테인 군 부분과 접해있고 2 개의 면역글로불린-유사(Ig-유사) 영역이 이어 있는 3 개의 나란한 류신 풍부 모티브(LRM)를 포함한다. 신경 세포 유착 분자 및 혈소판 유래된 성장 인자(PDGF)와의 서열 상동성을 기본으로, 상기 Ig-유사 영역은 앞서 면역글로불린 상과(IgSF)의 C2 군에 속하는 것으로 분류되었다(Williams, AF and Barclay AN(1988) Ann. Rev. Immunol 6, 381-405). 다수의 연구들이 p75NGFR 및 Trk 수용체와 상호 작용하는 뉴로트로핀 잔기를 밝혔으나, 뉴로트로핀 결합과 관련된 Trk 잔기에 대해서는 거의 밝혀지지 않았다.
최근에, Trk 수용체들의 Ig-유사 영역이 뉴로트로핀 리간드의 결합과 수용체 활성화에 중요한 역할을 하는 것을 밝힌 2 개의 그룹이 있다. 페레즈 피(Perez P.) 등(Molecular and Cellular Neuroscience 6: 97-105(1995))은 Ig-유사 영역들이 모두 NGF의 TrkA에 대한 결합에 중요하다고 결론지었다. 얼퍼 알(Urfer R.) 등(EMBO J. 14 p2795-2805(1995))은 두 번째 Ig-유사 소-영역과 프롤린 풍부 부분인 Ig2(도 1A)가 NGF 결합을 위한 주요 접촉부를 제공한다고 결론지었다.
TrkA의 세포외 영역은 길이가 아미노산 375 개의 길이이다. 본 발명자들은 최근에 2 개의 면역글로불린-유사 영역 및 프롤린-풍부 부분(아미노산 160-375)을 포함하는 단백질이 단독으로 NGF와, 완전한 세포외 영역의 친화성(Holden P. H. et al., (1997) Nature Biotechnology 15: 668-672)과 유사한 친화성으로 결합할 수 있음을 밝혔다. 상기 부분을 본 원에서는 TrkAIg1,2로 정의하였다. 놀랍게도, 본 발명자들은 TrkAIg2(아미노산 253-375)라 칭하는 TrkA의 훨씬 작은 영역이 NGF와, 완전한 세포외 영역 또는 TrkAIg1,2 부위와 유사한 친화성으로 결합할 수 있으며, 따라서 상기 영역이 그의 결합성에 주요 원인이 됨을 밝혔다.
본 발명자들은 재조합체 Ig-유사 영역이 NGF와 같은 뉴로트로핀과 높은 친화성으로 결합할 수 있고 NGF의 생물 활성을 생체외(in vitro) 및 생체내(in vivo)에서 억제할 수 있음을 입증하였다. 특히, 아미노산 253-375에 의해 한정되는 TrkAIg2(도 1A)가 NGF 결합에 대한 주 기여 인자이다. 본 발명자들은 분자 모델링 기법을 사용하여 TrkAIg1 및 TrkAIg2 영역을 모델링하였다. 놀랍게도, 본 발명자들은 TrkIg2-유사 소-영역 2는 Ig-유사 영역들의 C2 군의 것이 아니라 V 세트의 것임을 발견하였다.
상기에 의해 TrkAIg2 및 이로부터 유도된 폴리펩티드의 여러가지 용도가 발생한다. TrkAIg2-NGF의 공-결정으로부터의 구조 데이터는 NGF 결합과 관련되는 TrkA중의 잔기들을 확인시켜 줄 것이다. 이는 뉴로트로핀, 특히 NGF 모방물의 추정적인 디자인을 가능하게 할 것이다. 고정화된 TrkAIg2를 파아지 명시 라이브러리 뿐만 아니라 조합적인 화학적 라이브러리 및 진균 추출물에 대한 표적으로서 사용할 수 있다. 이에 의해 TrkA와 결합할 수 있고 따라서 수용체에서 작용물질 또 는 길항물질로서 작용할 수 있는 분자를 선택할 수 있게 될 것이다. TrkAIg2의 세 번째 용도는 다수의 만성적인 통증 상태의 치료제로서의 용도이다. NGF는 말초 감각 뉴런에 특히 중요하며, 증거는 NGF가 침해 수용성 1 차 구심성 신경상의 수용체와 상호작용함으로써 일부 지속적인 통증 상태의 매개체로서 작용할 수도 있고 말초적으로 작용하는 NGF 길항물질을 류마티스성 관절염, 간질성 방광염 및 대상포진과 같은 일부 만성적인 통증 상태를 치료하는데 사용할 수도 있음을 제안한다.
발명의 요약
본 발명의 첫 번째 태양은 도 4B의 잔기 22 내지 119의 아미노산 서열 또는 도 4B의 아미노산 서열의 일부를 포함하고 뉴로트로핀과 결합하는 폴리펩티드를 제공한다. 바람직하게는 상기 폴리펩티드는 도 4B의 아미노산 22 내지 144의 전체 서열로 이루어진다. 상기 폴리펩티드는 TrkAIg1,2 또는 그의 일부일 수도 있다. 이러한 폴리펩티드를 화학적 또는 생물학적 수단에 의해 제조할 수도 있다.
본 발명에서 천연 TrkA의 전체 암호화 서열은 제외한다.
폴리펩티드를 동물 세포로부터 유도할 수도 있다. 보다 바람직하게는, 폴리펩티드를 포유동물 세포로부터 선택하며, 특히 인간 세포로부터 선택할 수도 있다. 한편으로, 폴리펩티드를 병아리 세포를 포함한 조류 세포 또는 파충류 또는 양서류 또는 어류 또는 곤충으로부터 선택할 수도 있다.
바람직하게는 뉴로트로핀은 NGF, NT-3, 또는 p75 NGFR과 결합하는 뉴로트로 핀이다. 이러한 뉴로트로핀은 단량체, 이량체, 삼량체 또는 이종이량체의 형태로 존재할 수 있으며 인간과 같은 포유동물로부터 유래될 수도 있다.
본 발명의 두 번째 태양은 본 발명의 첫 번째 태양에 따른 폴리펩티드를 암호화하는 DNA 서열; 또는 유전자 암호의 퇴화 또는 그의 삽입 또는 결실 돌연변이에 기인한, 본 발명의 첫 번째 태양에 따른 폴리펩티드를 암호화하는 상기와 같은 DNA 서열의 변형체, 및 이러한 DNA 서열에 하이브리드를 형성하는 DNA 서열들을 제공한다. 상기 DNA 서열을 플라스미드 또는 pET15b와 같은 다른 벡터내에 삽입시킬 수도 있다.
본 발명의 추가의 태양은 본 발명의 첫 번째 태양에 따른 폴리펩티드를 하나 이상의 뉴로트로핀 또는 뉴로트로핀 서브유니트, 예를 들어 NGF 또는 NT-3와 함께 포함하는 복합체를 제공한다.
본 발명의 추가의 태양은 본 발명의 두 번째 태양에 따른 DNA 서열을 적합한 숙주내로 도입시키고 상기 숙주를 배양함으로써 TrkAIg2를 발현시킴을 포함하는 본 발명의 첫 번째 태양에 따른 폴리펩티드의 제조 방법을 제공한다. 적합한 숙주는 동물 세포, 예를 들어 세균 세포, 곤충 세포 및 포유동물 세포, 특히 인간 세포로부터 선택할 수 있다.
더욱이, TrkAIg2를 본 발명의 첫 번째 태양에 따른 폴리펩티드를 사용하여 TrkA 수용체에 결합하는 분자의 고도의 선별 처리를 위한 표적으로서 통상적으로 사용할 수도 있다. 이러한 방법은 파아지 또는 펩티드 명시 라이브러리, 조합적인 화학물질 라이브러리 및 진균 추출물의 사용, 및 ELISA 기법의 사용을 포함할 수도 있다.
본 발명의 추가의 태양은 TrkAIg2의 적어도 일부에 대한 결합과 TrkAIg1의 적어도 일부에 결합하는 추정상 리간드의 경쟁적인 결합을 포함한다. 이러한 방법은 TrkAIg2의 하나 이상의 용매 노출된 루프, 예를 들어 도 1B에 도시된 E 내지 F 루프 또는 C" 내지 D 루프에 결합하는 분자들을 선택함을 수반할 수 있다. 선택된 분자들은 본 발명의 첫 번째 태양에 따른 폴리펩티드 또는 천연 상태의 TrkA의 적어도 일부가 뉴로트로핀에 결합하는 것을 향상시킬 수도 있다.
본 발명의 추가의 태양은 본 발명의 첫 번째 태양에 따른 폴리펩티드에 대한 결합 친화성을 이용하여 화합물을 생산하고 선별함을 포함하는 복합적인 화학적 방법을 제공한다.
본 발명의 추가의 태양은 본 발명의 첫 번째 태양에 따른 폴리펩티드, 특히 TrkAIg2에 대해 발생한 항체를 포함한다.
본 발명의 추가의 태양은 플라스미드 상에 수반된 본 발명의 첫 번째 태양에 따른 폴리펩티드를 함유하는 숙주 세포를 포함한다. 이러한 숙주 세포는 포유동물(인간 포함), 세균, 곤충, 효모, 조류, 양서류, 어류 또는 파충류일 수 있다.
본 발명의 추가의 태양은 본 발명의 첫 번째 태양에 따른 폴리펩티드의 일부를 포함하는 진단 탐침을 포함한다. 상기 탐침을 형광 표지 또는 방사능 표지로 표지할 수도 있다.
본 발명의 추가의 태양은 특히 상승된 뉴로트로핀 수준의 검출에 있어서 본 발명의 첫 번째 태양에 따른 폴리펩티드를 사용하는 진단 시험, 분석 또는 감시 방 법을 포함한다.
본 발명의 추가의 태양은 본 발명의 첫 번째 태양에 따른 폴리펩티드를 발현하도록 조작된 유기체를 포함한다.
본 발명의 추가의 태양은 증가된 뉴로트로핀 폴리펩티드 수준과 관련된 환자를 치료하는 방법을 포함하며, 상기 방법은 상기 환자에게 본 발명의 첫 번째 태양에 따른 폴리펩티드, 또는 상기 개시된 선별 공정에 의해 단리되거나 동정된 NGF 동족체를 포함하는 약학적 조성물을 제공함을 포함한다.
통증은 ISU, 간질성 방광염, 관절염, 대상포진, 말초적 염증, 만성 염증 또는 포진후 신경통의 징후일 수도 있다.
본 발명의 추가의 태양은 알쯔하이머 병 환자에게 본 발명의 첫 번째 태양에 따른 폴리펩티드를 포함하는 약학적 조성물, 또는 본 발명의 첫 번째 태양에 따른 폴리펩티드를 수반하는 선별 공정에 의해 단리되거나 동정된 뉴로트로핀 동족체를 포함하는 조성물을 제공함을 포함하는 상기 질병의 치료 방법을 포함한다.
본 발명의 첫 번째 태양에 따른 폴리펩티드를 포함하는 조성물을 사용하여 환자의 유리 NGF 수준을 감소시킬 수 있다.
뉴로트로핀에 대한 상기 모든 인용들은 NGF 및 NT-3를 포함한다.
본 발명의 추가의 태양은 도 21에 도시된 좌표 데이터를 갖는 상동성 모델, 및 이러한 상동성 모델을 저장하는 기계 판독가능한 데이터 저장 매체, 및 이러한 상동성 모델을 제공하도록 프로그램화되거나 배열된 컴퓨터를 포함한다.
본 발명의 추가의 태양은 TrkAIg2의 결정화를 제공한다.
본 발명의 추가의 태양은 상기 언급된 컴퓨터를 사용하거나, 또는 상기 언급된 기계 판독가능한 데이터 저장 매체를 사용하여 상기 언급된 방법에 의해 수득된 화합물을 제공한다.
본 발명의 추가의 태양은 본 발명의 첫 번째 태양에 따른 폴리펩티드, 특히 TrkAIg2 폴리펩티드를 포함하는 결정을 포함한다.
TrkA의 세포외 영역의 구조 예측 및 Ig-유사 영역의 모델링
예측단백질(PredictProtein)(Rost B. and Sander C.(1993) PNAS 90: 7553-7562; Rost B. and Sander C.(1993) J. Mol. Biol. 232: 584-599; Rost B. and Sander C.(1994) Proteins 19: 55-72)을 사용하는 Ig-유사 부분들의 2 차 구조 분석은 β-스트랜드의 한정된 신장을 나타냈다. 첫 번째 Ig-유사 소-영역인 TrkAIg1은 TrkA의 성숙한 세포외 영역에서 잔기 160 내지 252(도 1A)로 이루어진 반면, 두 번째 Ig-유사 소-영역은 잔기 253 내지 349(도 1A)로 이루어진다. 잔기 349 내지 375(도 1A)에는 또한 프롤린 풍부 영역이 있다.
TrkAIg1에 대해서, 2 개의 공지된 단백질(모 단백질)이 모델을 세울 수 있는 상동물로서 확인되었다. 이들은 2NCM(마우스 NCAM의 영역 1) 및 1VCA(인간 혈관 세포 유착 분자의 영역 1)이다. 이들 두 영역은 I-세트 Ig 영역들이며, 각각 표적 서열과 함께 32% 및 29%의 서열 일치를 갖는다. 2NCM이, 1VAC에서 발견되는 보다 작은 루프가 사용된 β-스트랜드 C를 D에 연결하는 잔기 38 내지 50은 별도로 하고, 모델의 토대가 되기에 가장 적합한 모 단백질로서 동정되었다.
TrkAIg2에 대해서, 2 개의 모 단백질이 모델을 세울 수 있는 상동물로서 동정되었다. 이들은 1TNM(티틴 모듈러스 M5) 및 1HNG(CD2 영역 1)이다. 상기 상동물들은 21% 및 14%의 서열 일치로 매우 거리가 있으며 각각 Ig-세트 I 계 및 V 세트 계에 속한다. 그러나, 상기 Ig 중첩의 몇몇 주요 특징들, 예를 들어 디설파이드 가교 및 C 가닥의 Trp를 포함하는 것으로 동정될 수 있다. 이는 상기 두 상동물 모두가 디설파이드 결합이 부족하기 때문에 놀라운 것이다. 이들 상동물은 상이한 부분에서 보다 높은 서열 일치를 나타내며, 따라서 주요 주형으로서 1TNM을 사용하여 가상의 모델을 세웠으며 1HNG는 잔기 39 내지 59(도 1B)를 모델링하는데 사용하였고 좌표 데이터를 도 21에 나타내었다.
본 발명자들은 서열 정렬에서 약간의 수동 조정에 따라, 한 시이트에 스트랜드(ABDE)를 갖고 다른 한 시이트에 (A'CFG)를 갖는 8 개의 β-스트랜드를 함유하는 모델을 밝혀냈다. 이들은 함께 TrkAIg1에 대해 β-샌드위치를 형성한다. TrkAIg2의 경우, A' 스트랜드가 없으며 2 개의 잉여 스트랜드 C' 및 C"가 β-스트랜드(ABDE) 및 (GFC'C")에 의해 형성된 β-샌드위치를 갖는 것으로 예측된다. 영역 1에 대해서, 2NCM에서 발견되는 위치와 동일한 위치로 β-스트랜드를 가로질러 스트랜드 B와 F사이에 디설파이드를 정렬시키는 지도를 작성하였다. 상기 디설파이드를 또한 잔기 23 내지 71 사이의 1VCA 디설파이드상에 포개놓았다. 역으로, 영역 2에 대해서 디설파이드는 2 개의 인접한 β-스트랜드 B와 E를 가교하는 분자의 표면상에 있는 것으로 예견되며, 두 번째 Cys는 1TNM에서 Ser과 정렬된다. 상기 디설파이드 결합 배열은 1VCA 영역 1을 모델로 한 문헌[Urfer et al.(Urfer, R., Tsoulfas, P., O'Connell, L., Hongo, J.A., Zhao, W. and Presta, L. G.)(1998), J. Biol. Chem. Urfer et al., (상기 문헌) 273: 5829-5840]에 의해 예견된 모델과 유사하지만, 본 발명의 TrkAIg2 모델은 I-세트 배열에서 7 개의 β-시이트를 갖는 모델과 대조적으로, V-세트의 9 개의 β-시이트를 예견한다. 상기 모델링된 구조를 도 1B에 나타내었으며 좌표 데이터는 데이터 1로 나타내었다.
TrkAIg2에 대해 본 발명에서 세운 구조 모델과 관련하여, 모델 제작에 사용된 모형인 티틴 모듈 M5(1 tnm) 및 CD2 영역 1(1 hng)은 분명히 거리가 있는 상동물이며, 이는 민감한 서열 연구 방법(Barton, G.J. (1993) Comput. Appl. Biosci. 9: 729-734; Henikoff, S. and Henikoff, J.G. 1991. Nucleic Acids Research 19: 6565-6572)에 의해 확인할 수 있다. 문헌[Urfer et al.(Urfer, R., Tsoulfas, P., O'Connell, L., Hongo, J.A., Zhao, W. and Presta, L. G.)(1998) JBC 273: 5829-5840]에 의해 TrkAIg2를 모델 제작하는데 사용된 VCAM 영역 1은 서열에 의해 현저하게 관련있지 않으나, Ig-중첩부에 의하면 상동성이 있다. 티틴 및 VCAM(모두 I-세트 영역)에 비해, 상기 TrkAIg2 서열은 스트랜드 C와 D 사이에 중요한 삽입부(∼10 개 잔기)를 갖는다. 상기 삽입부를 포함하는 위치 39 내지 59에 해당하는 부분이 다른 Ig 영역들보다 CD2 영역 1에 더욱 현저한 상동성을 갖는다. 더욱 또한, 상기 부분에서 TrkAIg2의 예견된 2 차 구조(Rost B. and Sander C.(1993) PNAS 90: 7553-7562)는 CD2 구조에 따르면 2 개의 잉여 스트랜드(C' 및 C")의 존재에 상응한다. 이에 의해 문헌[Urfer et al.(Urfer, R., Tsoulfas, P., O'Connell, L., Hongo, J.A., Zhao, W. and Presta, L. G.)(1998) JBC 273: 5829- 5840]에 의해 제안된 I-세트 영역과 상반되게 예견된 V-세트 영역이 생성된다.
NGF 결합에서 주요 잔기들의 중요성은 본 발명의 모델과 문헌[Urfer et al.(Urfer, R., Tsoulfas, P., O'Connell, L., Hongo, J.A., Zhao, W. and Presta, L. G.)(1998) JBC 273: 5829-5840]에 의한 TrkAIg2의 광범위한 돌연변이 분석을 참고로 이해될 수 있다. TrkAIg2에서 가장 중요한 결합 결정인자는 100 배 이상의 결합 감소를 나타내는 단일 돌연변이 T319A, H320A 및 N323A를 갖는 스트랜드 E와 F를 연결하는 루프(EF-루프)에서 발생한다. 본 발명의 구조 모델에 의하면 모든 3 개의 잔기가 상기 EF-루프의 정점 부근의 용매 노출된 위치에 있음을 가리킨다. 결합 친화성의 손실에 대한 부차적인 기여인자가 또한 돌연변이 H258A, V261E, M263A 및 H264A를 갖는 공간적으로 인접한 AB-루프에서 발생한다. 처음 3 개의 잔기 위치는 상기 루프 표면 상의 용매 노출된 위치에 있다. 단지 2 개의 다른 돌연변이(P269E 및 H310A)만이 50 배 이상 감소된 결합 친화성을 나타낸다. 이들 2 개의 잔기는 본 발명의 모델에서 공간적으로 서로 인접해 있으며 스트랜드 B와 E를 연결하는 디설파이드 가교(C267-C312)에 근접해 있다. 이들 잔기가 문헌[Urfer et al.(Urfer, R., Tsoulfas, P., O'Connell, L., Hongo, J.A., Zhao, W. and Presta, L. G.)(1998) JBC 273: 5829-5840]에 의해 제시된 바와 같이 NGF 결합에 직접적인 역할을 할 수 있다. 그러나, 다른 설명은 디설파이드 가교의 구조적 보전성을 유지하는데 있어서 이들이 중요할 수도 있다는 것이다. 인정된 Ig 영역의 보존된 코어 디설파이드 결합과 달리, 용매 노출된 디설파이드 가교는 상기 영역의 구조를 안정화시키는데 중요하지 않을 수도 있지만, 스트랜드 B와 E 사이의 공유 결합은 결합시 AB와 EF 루프의 형태를 유지시키는데 중요할 수 있다. 실제로, 돌연변이체 C267A 또는 C312A에 의한 디설파이드 손실 결과 10 내지 30 배의 결합 감소가 발생하며, 이는 결합 기작에서 디설파이드 가교의 중요성을 강조하는 것이다.
프롤린 풍부 영역에서 6 개의 아미노산 삽입물(아미노산 위치 224 내지 225(도 3))을 함유하는 TrkA의 달리 접목된 형태인 VSFSPV는 NT3에 대해 보다 높은 친화성을 나타내며, 따라서 리간드 결합에 중요할 수 있다(Clary, D. O & Reichardt L. F. (1994) PAISA 91: 11133-11137). 상기 서열은 래트 TrkA 서열에서도 또한 발견되며 유사한 서열이 병아리 TrkA에서 발견된다. 모든 TrkB 서열에 또한 유사한 극성 잔기가 존재한다(Allen S. J. et al. (1994) Neuroscience 60: 825-834). 따라서, 상기 부분은 뉴로트로핀의 결합 또는 수용체의 특이성에 기여할 수 있다.
TrkAIg1,2 부분은 일반적으로 TrkA의 성숙한 세포외 영역의 아미노산 160 내지 375를 포함하는 것으로서 간주되며, TrkAIg1 또는 TrkAIg 유사 소-영역 1은 아미노산 160 내지 252를, TrkAIg-유사 소 영역 2는 아미노산 253 내지 349를 포함하는 것으로 간주된다. 본 발명에서 TrkAIg2는 프롤린 풍부 부위인 아미노산 253 내지 375를 포함한다. 모든 경우에, 상기 개시한 것들과 같은 TrkA의 변형체 및 그의 소 영역들의 용도들이 본 발명에 포함된다.
이제 본 발명을 단지 예로서 첨부된 도면 1 내지 20을 참고로 개시할 것이다. 도면에서:
도 1(A)는 TrkA 구조(채워진 원들은 일치되는 글리코실화 부위를 나타낸다)의 도식도이고;
도 1(B)는 TrkAIg1 및 TrkAIg2의 모델화된 구조를 도시하며; 가장 중요한 결합 결정위치는 추정상 루프 연결 스트랜드 E 및 F(EF 루프)에서 발생하며;
도 2(A)는 플라스미드 pET15b의 제한 지도이고;
도 2(B)는 TrkAIg1,2를 증폭시키는데 사용된 올리고뉴클레오티드의 서열을 도시하며;
도 3은 pET15b-TrkAIg1,2 삽입물의 뉴클레오티드 서열과 이로부터 유도된 아미노산 서열을 도시하고;
도 4(A)는 뉴클레오티드 서열 및 그의 TrkAIg1의 유도된 아미노산 서열을 도시하며;
도 4(B)는 뉴클레오티드 서열 및 그의 TrkAIg2의 유도된 아미노산 서열을 도시하고;
도 4(C)는 NT-3와 결합할 수 있는 프롤린-풍부 부분에 6 개의 아미노산 삽입물을 포함하는 TrkA의 접목 변형체의 TrkAIg2 영역을 도시하며;
도 5는 TrkAIg1,2, TrkAIg1 및 TrkAIg2의 발현을 예시하는 겔이고;
도 6(A)는 TrkAIg2의 정제를 예시하는 겔이며;
도 6(B)는 TrkAIg1의 정제를 예시하는 겔이고;
도 7(A)는 재 중첩후의 포로스(Poros) 20HQ로부터의 TrkAIg1의 용출 프로파일을 도시하며;
도 7(B)는 재 중첩후의 포로스 20HQ로부터의 TrkAIg2의 용출 프로파일을 도시하고;
도 8은 TrkAIg2의 환상 2 색성 스펙트럼을 도시하며, 이때 분자 타원율(θ)은 파장의 함수로서 나타내고;
도 9는 TrkAIg1,2 및 TrkAIg2에 대한 경쟁 결합 분석을 도시하며, 이때 축은 1 x 10-11 내지 1 x 10-5 M의 대수 규모로 나타내고;
도 10은 고정화된 TrkAIg2에 결합하는 NGF의 표면 플라스몬 공명(SPR)을 도시하며;
도 11은 TrkAIg2(2 μM) 및 TrkAIg1(2 μM)를 βNGF(0 내지 1000 pM)의 표준 곡선에 따라 별도로 배양한 결합 실험의 결과를 예시하고;
도 12는 증가하는 농도의 βNGF(1 내지 200 μM)를 2 μM TrkAIg1 또는 2 μM TrkAIg2와 별도로 배양한 결합 실험의 결과를 예시하며;
도 13은 PC12 세포상에서 NGF 의존성 신경돌기 증식에 대한 TrkAIg2의 효과를 도시하고;
도 14A 내지 F는 NGF-유발된 혈장 유출에 대한 동시 주입된 TrkAIg1,2의 효과를 예시하며;
도 15는 NGF-유발된 혈장 유출에 대한 TrkAIg1,2의 5 분 예비 처리 효과를 예시하고;
도 16은 NGF-유발된 혈장 유출에 대한 TrkAIg1,2의 40 분 예비 처리 효과를 예시하며;
도 17은 NGF-유발된 혈장 유출에 대한 동시-주입된 TrkAIg1의 효과를 예시하고;
도 18은 NGF-유발된 혈장 유출에 대한 TrkAIg2의 동시 주입 효과를 예시하며;
도 19는 NGF-유발된 혈장 유출에 대한 TrkAIg2의 5 분 예비 처리 효과를 예시하고;
도 20은 NGF-유발된 혈장 유출에 대한 TrkAIg2의 40 분 예비 처리 효과를 예시하며;
도 21은 도 1(B) 모델에 대한 좌표 데이터를 도시한다.
달리 접목된 변형체로부터의 삽입물을 갖는 TrkAIg2의 제작
달리 접목된 변형체들로부터의 삽입물을 갖는 TrkAIg2를 PCR 돌연변이에 의해 생성시켰다. 상기 돌연변이는 2 단계로 수행되었다. 첫 번째, 5' 및 3' 단편들을 Trk의 달리 접목된 형태의 서열을 중복 암호화하도록 증폭시켰다. 두 번째 단계에서, 상기 5' 및 3' 단편들의 PCR 생성물을 상기 중복 서열과 2 개의 측면 프라이머를 사용하여 함께 접목시켰다. PCR의 첫 번째 순환은 5'-단편을 생성하는 올리고66816(ATCATATGCC GGCCAGTGTG CAGCT) 및 올리고49234(CCACTGGCGA GAAGGAGACA GGGATGGGGT CCTCGGGG)와 3'-단편을 생성하는 올리고49233(GTCTCCTTCT CGCCAGTGGA) 및 T-7 종결자 프라이머(GCTAGTTATTGCTCAGCGG)를 포함한다. 이어서 생성물을 정제시키고 올리고66816 및 T7종결자 프라이머를 사용하는 PCR의 두 번째 순환에 대한 표적으로서 사용하였다. 이어서 PCR의 두 번째 순환으로부터의 PCR 생성물을 pET15b내로 클로닝시키고 동일한 방식으로 TrkAIg2로서 발현시켰다.
TrkAIg1,2의 서브-클로닝:
두 번째 구조 예측 데이터로부터, TrkA의 세포외 영역의 아미노산 160 내지 375(도 1A)를 암호화하는 DNA의 서브클로닝을 결정하였다. TrkAIg1,2 삽입물이 발현 벡터 pET15b(Novagen)의 폴리-히스티딘 표지 및 번역을 중지시키는 2 개의 정지 코돈과 함께 인-프레임되도록 적합한 제한 부위를 제공하는 올리고뉴클레오티드 프라이머(10692 및 10693)를 디자인하였다. pET15b의 지도 및 상기 올리고뉴클레오티드 프라이머의 서열을 도 2에 나타낸다.
이어서 PCR에 의한 증폭을 프라이머로서 올리고10692 및 올리고10693(Cruachem Ltd), 표적으로서 전체 길이의 인간 TrkA cDNA 클론(David Kaplan, Montreal Neurological Institute, Canada)을 사용하여 수행하였다. 이어서 PCR 생성물을 플라스미드 pCRII(Invitrogen)내로 연결시켜 pCRII-TrkAIg1,2를 수득하였다. 이어서 pCRII-TrkAIg1,2를 XhoI으로 절단시키고 삽입물을 페놀 추출에 의해 저 융점 아가로스 겔로부터 정제시키고, 이를 XhoI으로 절단시키고 송아지-장의 알칼리성 포스파타제(CIAP)를 사용하여 탈포스포릴화시킴으로써 미리 제조한 pET15b(Novagen)내로 연결시켰다. 에스케리키아 콜라이 XL1Blue(Stratagene)내로 형질전환시킨 후에, pET15b 및 올리고10693에 어닐링하는 T7 프로모터 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 형질전환체들을 선별하였다. 이러 한 방식으로, 상기 T7 프로모터로부터의 발현을 위해 TrkAIg1,2 삽입물을 정확한 배향으로 갖는 클론들을 동정하였다. 생성된 클론 pET15b-TrkAIg1,2를 상기 삽입물이 XhoI 부위에서 상기 pET15b에 확실히 연결되도록 T7 프로모터 프라이머와 T7 종결자 프라이머로부터 서열화하였다. pET15b-TrkAIg1,2의 삽입물의 DNA 서열 및 이로부터 유도된 아미노산 서열을 도 3에 굵은 선(아미노산 24 내지 239, 뉴클레오티드 71 내지 718)으로 나타내었다. 효소 및 효소 완충액을 베링거(Boerhinger)사로부터 입수하였다.
TrkAIg1의 서브 클로닝
PCR 생성물이 폴리-히스티딘 표지와 함께 pET15b 인-프레임의 XhoI 부위내로 연결될 수 있도록 TrkAIg1,2에 대한 좌측 프라이머를 사용하여 TrkAIg1 영역을 증폭시킬 수 있는 올리고뉴클레오티드 프라이머를 디자인하였다.
(올리고36770 TrkAIg1에 대한 우측 프라이머;)
이어서 표적으로서 pET15b-TrkAIg1,2를 갖는 올리고10692 및 올리고36770을 사용하여 PCR에 의한 증폭을 수행하였다. 이어서 PCR 생성물을 pCRII(Invitrogen)내에 연결시켜 pCRII-TrkAIg1을 수득한 다음, 이를 XhoI로 절단시키고 저 융점 아가로스 겔 전기영동을 가하였다. 이어서 상기 삽입물을 정제시 키고 XhoI으로 미리 절단시키고 CIAP로 처리한 pET15b내로 연결시켰다. 이 콜라 이 XL1Blue내로 형질전환시킨 후에, 올리고10692 및 T7 종결자 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 형질전환체를 선별하였다. 이어서 생성된 클론 pET15b-TrkAIg1을 TrkAIg1의 판독 프레임이 pET15b의 폴리-히스티딘 표지와 함께 인-프레임되도록 서열화하였다. 도 4a는 TrkAIg1의 뉴클레오티드 서열(잔기 71 내지 349) 및 추론된 아미노산 서열(잔기 24 내지 116)을 굵은선으로 나타낸다.
TrkAIg2의 서브 클로닝
pET15b-TrkAIg1,2의 T7 종결자 프라이머를 사용하여 TrkAIg2 영역을 증폭시키는 올리고뉴클레오티드 프라이머를 디자인하였다:
(올리고66816 TrkAIg2에 대한 좌측 프라이머)
이어서 주형 DNA로서 pET15b-TrkAIg1,2와 함께 올리고66816 및 T7 종결자 프라이머를 사용하여 PCR에 의한 증폭을 수행하였다. 이어서 PCR 생성물을 NdeI 및 BamHI으로 절단시키고 동일한 효소로 절단시키고 CIAP로 처리하여 미리 제조한 pET15b내로 연결시켰다. T7 프로모터 프라이머 및 올리고10693을 사용하는 PCR에 의해 형질전환체를 선별하고 양성 클론들을 서열화하였다. 도 4b는 TrkAIg2의 뉴클레오티드 서열(잔기 65 내지 433) 및 유도된 아미노산 서열(잔기 22 내지 144)을 굵은선으로 나타낸다.
TrkA DNA 서열의 하이브리드화
TrkAIg1,2 또는 TrkAIg2를 암호화하는 DNA(도 3 및 4B에 따른 서열)를 하이브리드화 분석에 사용할 수 있다. TrkAIg1,2 또는 TrkAIg2를 암호화하는 DNA 서열 또는 이러한 서열의 부분들을 게놈 DNA의 역 전사효소 PCR에 의해 얻거나 또는 TrkA에 대한 cDNA로부터의 PCR 또는 제한 절단에 의해 직접 얻을 수도 있다. TrkAIg1,2 또는 TrkAIg2를 암호화하는 DNA, 또는 이러한 서열의 일부, 또는 조성은 유사하나 퇴화된 서열을 함유하는 서열에 상보적인 DNA 또는 RNA를 상기 제조된 DNA에 하이브리드를 형성시킬 수 있다. 이러한 서열을 본 원에서는 탐침이라 칭한다. 대개, 상보적인 DNA 또는 RNA를 방사능 또는 비-방사능 물질로 표지한다.
상기에 대한 한가지 예로 방사능 표지된 cDNA 탐침을 사용하는 TrkAIg2의 노던 분석이 있다. cDNA 탐침을 32P-dATP(6000 Ci/밀리몰; Dupont NEN)로 랜덤하게 표시한다. 이어서 상기 탐침을 넉트랩(Nuctrap) 컬럼(Stratagene)을 사용하여 2 x 106 cpm/ng의 비 활성으로 정제시킨다. 이어서 TrkA를 발현하는 중국 햄스터 난소 세포(CHO)를 울트라스펙(Ultraspec)TM(Biotex, Houston Texas)에 균질화시키고 전체 RNA를 추출한다. 상기 RNA를 1% 변성 아가로스 겔상에 부하하고 전기 영동에 의해 분리시킨 후에, 하이본드(Hybond) N(Amersham, Cardiff, UK)상에 밤새 블럿팅시키고 80 ℃에서 2 시간 동안 소성시킨다. 상기 하이본드 N 필터를 하이브 리드화 오븐에서 하이브리드화 완충액(6SSC, 5x Denhardts, 0.5% SDS 및 0.002% 산 절단된 연어 정자 DNA)중에서 회전시킴으로써 65 ℃에서 4 시간 동안 예비-하이브리드화시킨다. 이어서 상기 탐침을 100 ℃에서 5 분간 변성시킨 후에 새로운 하이브리드화 용액에 가한다. 이어서 필터를 고도로 엄격한 상기 조건하에 65 ℃에서 밤새 하이브리드화시킨다. 엄격성은 탐침의 퇴화 또는 표적의 상동성에 따라 가변적일 수 있다. 50 ℃와 같은 보다 낮은 온도 및 20 x 55C와 같은 보다 높은 염 농도가 보다 덜한 엄격성에 허용될 것이다. 포름아미드의 존재는 핵산 결합의 친화성을 감소시키며 엄격성의 가변성을 허용한다. 이러한 전략은 잘 개시되어 있다(예를 들어 헤임스와 히긴스(Hames and Higgins)(IRL 출판사)(1988)에 의해 편집된 실용적인 접근법인 핵산 하이브리드화를 참조하시오). 다음 날, 상기 필터를 2 x SSC/0.5% SDS로 세척하고 2 x SSC/0.5% SDS를 갖는 하이베이드(Hybaid)로 65 ℃에서 30 분간 2회 세척한다. 이어서 상기 필터를 건조시키고 -70 ℃에서 밤새 하이퍼필름(Hyperfilm MP, Amersham)에 노출시키고 다음 날 현상한다. TrkAIg2 서열을 암호화하는 RNA에 결합된 DNA 탐침은 노출 시 자동방사능 필름의 영역에 검은색으로 나타난다.
상기에 대한 추가의 예는 TrkAIg1,2 또는 TrkAIg2의 발현, 또는 발현 라이브러리에서 유사한 서열의 검출이다. λGT10 인간 뇌 cDNA 라이브러리(M Goedert, Cambridge)를 사용하여 이 콜라이 c600 세포를 감염시킨다. 이를 24 ㎝ x 24 ㎝ 한천 플레이트에 도말하여 플레이트 당 10,000 pfu를 얻는다. 이어서 나일론 멤브레인 하이본드 N(Amersham, Cardiff, UK)을 한천 플레이트상에 1 분간 깔아 놓아 플라크 이동을 수행한다. 이어서 필터를 변성 용액(1.5 N NaCl, 0.5 N NaOH)상에 30 분간 DNA 쪽을 위로하여 놓은 후에, 2 분간 침지시킨다. 이어서 필터를 중화 용액(1.5 N NaCl, 0.5 N 트리스-HCl, pH 8.0)에 침지시킨다. 새로운 중화 용액에서 침지를 반복한다. 이어서 필터를 2 x SSC(0.3 N NaCl, 0.03 N Na3시트레이트, pH 7.0)에서 간단히 세정하고 여과지상에 놓아 80 ℃에서 2 시간 동안 소성시킨다. 상기 개시된 바와 같이 하이브리드화를 수행한다. TrkA 서열을 암호화하는 플라크에 결합된 DNA 탐침의 위치가 노출 시 자동방사능 사진 필름의 영역에 검은색으로 가시화된다. 이렇게 노출된 검은색 영역을 상기 플레이트에 재 정렬시켜 TrkAIg1,2 또는 TrkAIg2와 유사한 서열 또는 이러한 DNA 서열의 일부를 발현하는 양성 클론들을 동정할 수 있다.
동일한 PCR 기법을 사용하여 하이브리드화를 또한 수행할 수도 있다. TrkAIg1,2의 서열 부분에 상응하는 특정하거나 퇴화된 올리고뉴클레오티드를 예를 들어 'TrkAIg2의 서브 클로닝' 표제하에 개시된 서열 부분의 증폭에 사용할 수도 있다. 이러한 하이브리드화 분석을 진단 키트에서 TrkAIg1,2 또는 TrkAIg2 서열, 또는 그의 일부의 존재를 검출하는 도구로서 사용할 수도 있다.
TrkAIg1,2, TrkAIg1 및 TrkAIg2의 발현:
컴피턴트 BL21(DE3) 세포를 상기 벡터로 형질전환시키고 어려운 표적 단백질에 대한 pET(Novagen) 안내서에 개시된 방법을 변형시켜 발현을 수행하였다. 간단히, 2YT 브로쓰(200 ㎎/㎖ 카르벤실린 함유) 2 ㎖에 콜로니를 접종하고 37 ℃에 서 중간 대수기로 증식시켰다. 세포를 원심분리 및 2YT(안내서에서와 같이)에 재현탁시키지 않고 2YT 브로쓰(500 ㎍/㎖ 카르벤실린 함유) 50 ㎖을 접종시키는데 직접 사용하여 37 ℃에서 중간 대수기로 증식시켰다. 세포를 원심분리 및 재현탁에 의해 수확하지 않고 2YT(500 ㎍/㎖ 암피실린 함유) 5 ℓ를 감염시키는데 직접 사용하였다. 일단 OD600 값이 1에 도달하면, 세포 배양액을 IPTG를 가하여 최종 농도를 1 mM로 만들고 세포를 37 ℃에서 추가로 2 시간 동안 증식시켰다. 도 5는 다양한 pET15b-TrkAIg 구조물을 함유하는 BL21(DE3) 배양액 추출물의 15% SDS PAGE 겔을 도시한다. 상기 세포 추출물에 대한 추가의 분석으로 상기 모든 구조물에 대해 발현된 TrkAIg 단백질이 불용성인 것으로 밝혀졌다. TrkAIg 단백질의 가용성 분획의 발현을 여러번 시도하였으나, 실패하였다. 그러나, TrkAIg 단백질이 불용성이라는 사실은 그의 정제를 용이하게 하였다.
TrkAIg1,2의 정제 및 재 중첩
수확된 세포를 10% 글리세롤에 재현탁시키고, -70 ℃에서 냉동시키고, 펠렛을 엑스프레스(Xpress)(BioX, 12 톤 psi)에 3 회 통과시켰다. 용균된 세포를 20 mM 트리스-HCl(pH 8.0)로 세척하고 모든 가용성 물질이 제거될 때가지 4 ℃, 10,000 rpm에서 30 분간 원심분리시켜 불용성 단백질을 함유하는 봉입체가 생성되었다. 정제된 봉입체를 6 M 우레아 완충액(20 mM 트리스-HCl pH 8.5, 1 mM β-머캅토에탄올)에 대략 0.1 ㎎/단백질 ㎖의 농도로 용해시키고 1 시간 동안 서서히 진탕시키면서 얼음상에서 배양하였다. 재중첩은 400 배 완충액(20 mM 트리스-HCl, 100 mM NaCl, pH 8.5)에 대해 상기 완충액을 1 회 교환하면서 투석시켜 수행하였다. 재중첩된 TrkAIg1,2 단백질을 1 ㎖ 리소스(Resource) Q(Pharmacia) 컬럼에 걸고 20 mM 트리스-HCl중의 0 내지 1 M NaCl의 선형 구배로 분 당 2 ㎖씩 40 ㎖에 걸쳐 용출시켰다. 280 nm에서 검출된(UV 검출기 사용) 주 피이크를 모으고 His-결합 수지(Novagen)의 2.5 ㎖ 1 회용 컬럼을 사용하여 노바겐 His 컬럼 정제 프로토콜에 따라 친화성 정제시켰다. 마지막으로, 용출된 단백질을 상기 리소스 Q 컬럼에 다시 걸어 이미다졸을 제거하였다. 이를 20 mM 트리스 완충액(pH 8.0)중의 NaCl 0 내지 1 ㎖의 구배로 10 ㎖ 염으로 용출시켰다.
TrkAIg1 및 TrkAIg2의 정제:
수확된 세포를 10% 글리세롤에 재현탁시키고 -70 ℃에서 냉동시키고 펠렛을 엑스프레스(BioX)에 3 회 통과시켰다. 이어서 추출물을 4 ℃, 10,000 rpm에서 30 분간 원심분리시켜 불용성 봉입체를 펠렛화시켰다. 이어서 상기 봉입체를 50 ㎖의 1%(v/v) 트리톤 X-100, 10 mM 트리스 HCl(pH 8.0), 1 mM EDTA에 이어서 50 ㎖의 1 M NaCl, 10 mM 트리스 HCl(pH 8.0), 1 mM EDTA 및 최종적으로 10 mM 트리스 HCl(pH 8.0), 1 mM EDTA로 세척하였다. 이어서 상기 봉입체를 20 mM Na 포스페이트, 30 mM 이미다졸, 8 M 우레아(pH 7.4)에 용해시켰다. 이어서 상기 용해된 봉입체를 원심분리에 의해 등명화시킨 후에, 5 ㎖의 히스트랩(HisTrap) 컬럼(Pharmacia)에 걸었다. 상기 컬럼을 50 ㎖의 20 mM Na포스페이트, 30 mM 이미다졸, 8 M 우레아(pH 7.4)로 세척하고 정제된 TrkAIg1 및 TrkAIg2를 25 ㎖의 20 mM Na포스페이트, 300 mM 이미다졸, 8 M 우레아(pH 7.4)를 사용하여 분 당 2 ㎖로 용출시켰다(도 6A 및 6B).
TrkAIg1 및 TrkAIg2의 재중첩
정제된 TrkAIg 단백질을 1 mM β-머캅토에탄올을 가하여 20 mM Na포스페이트, 30 mM 이미다졸, 8 M 우레아(pH 7.4)중의 0.1 ㎎/㎖의 농도로 조절하고 TrkAIg2에 대해서는 20 mM 트리스HCl, 50 mM NaCl(pH 8.5)에 대해, TrkAIg1에 대해서는 20 mM 트리스HCl, 50 mM NaCl(pH 9.0)에 대해 투석시켰다(2 x 100 부피). 투석된 단백질을 1.6 ㎖의 포로스 20HQ 컬럼에 걸고 20 컬럼 부피에 대해 0.05 내지 1 M NaCl의 선형 구배로 용출시켰다(도 7).
3 개의 피이크가 TrkAIg2에 대해 포로스 20HQ 컬럼으로부터 용출되었으며, 이들은 모두 TrkAIg2에 상응하는 밴드를 나타냈다(데이터 도시 안됨). 따라서, 재중첩 공정은 TrkAIg2의 3 개의 종들들 생성시켜야 하며, 이들은 모두 상이한 형태를 갖는다. 변위 결합 연구는 용출되는 첫 번째 피이크가 NGF와 결합하는 반면 다른 것들은 결합하지 않음을 밝혔다. 따라서 첫 번째 피이크를 수거하고, 글리세롤을 20%(v/v)의 최종 농도로 가하고 액체 질소에서 급속 냉동시킨 후에 -70 ℃에서 보관하였다.
TrkAIg1에 대해서, 단지 2 개의 피이크만이 포로스 20HQ 컬럼으로부터 용출되며, 보다 많은 단백질은 통과된다. 다시 각각의 피이크 및 통과물에 대한 SDS PAGE는 TrkAIg1이 유일하게 존재하는 단백질임을 나타낸다. 상기 2 개의 피이크 에 대한 변위 결합 분석은 이들 TrkAIg1의 종들중 어느 것도 NGF와 결합하지 않음을 나타낸다(데이터는 나타내지 않았음).
TrkAIg2에 대한 환상 2 색성 연구
중첩된 단백질의 2 차 구조 함량을 측정하기 위해서, 파(far)-UV 환상 2 색성(CD) 측정을 수행하였다. 단백질의 CD는 주로 아미드 색원체의 CD이며, 이는 약 220 nm에서 첫 번째 밴드를 갖는 UV 부분내로 멀리 흡수하기 시작한다. 반평행한 β-시이트 구조는 전형적으로 218 nm 부근에서 최소인 음의 코튼 효과를 나타내며 195 nm 부근에서는 최대의 양의 효과를 나타낸다. 가변적인 광 쇄(VL) 및 일정한 광 쇄(CL) 영역과 같은 상이한 면역글로불린의 파-UV 스펙트럼의 진폭은 또한 215 내지 218 nm 부근에서 최소로 나타난다. 따라서 TrkAIg 단백질에 대해서도 유사한 결과가 예상되었다.
CD 스펙트럼을 실온에서 40 μM의 단백질 농도에서 0.5 ㎜ 경로 길이의 큐벳을 사용하여 조빈 이븐(Jobin Yvon) CD6 장비상에서 기록하였다. 10 개의 주사선이 0.5 nm/초의 주사 속도로 축적되었다. 스펙트럼을 평균화하고 완충액으로부터 발생하는 작은 신호는 삭제하였다. 활성 TrkAIg2의 CD는 218 nm에서 최소로 나타났고 200 nm 부근에서 최대로 나타났다(도 8). 이는 반평행한 β-시이트에 대해 전형적인 것이며, 이는 218 nm 부근에서 최소인 음의 코튼 효과와 195 nm 부근에서 최대인 양의 코튼 효과를 나타낸다(Yang, J.T., Wu, C.S.C. and Martinez, H.M. (1986). Methods Enzymol. 130: 208-269). 유사한 결과가 다른 면역글로불린 영 역들(Ikeda, K., Hamaguchi, K. and Migita, S.(1968) J. Biochem. 63: 654-660) 및 TrkAIg1,2(Hodlen, P.H., Asopa, V., Robertson, A.G.S., Clarke, A.R., Tyler, S., Bennett, G.S., Brain, S.D., Wilcock, G.K., Allen, S.J., Smith, S. and Dawbarn, D.(1997) Nat. Biotechnol 15: 668-672)에 대해서 보고되었다. 이들 결과는 도 1B에 도시된 TrkAIg2의 모델과 일치한다.
따라서, 상기 CD 데이터는 포로스 20HQ 컬럼으로부터 처음 용출되는 TrkAIg2가 치밀한 구조로 중첩되고 다른 면역글로불린 영역과 유사한 구조를 갖기 쉬운 것을 가리킨다.
TrkA의 면역글로불린-유사 영역에 대한 NGF의 결합
1. 경쟁 결합
TrkA의 Ig-유사 영역에 대한 125I-NGF의 결합 친화성을 NGF 수용체 p75NGFR를 발현하는 흑색종 세포 주 A875(아메리칸 티슈 컬쳐 콜렉션, ATCC)를 사용하여 경쟁적인 결합 분석에 의해 측정하였다.
정제된 재조합체 인간 NGF를 락토퍼옥시다제 방법을 사용하여 I125로 방사능요오드 표지하고 [125I]-NGF와의 평형 결합을 수행하였다(Treanor et al., 1991; Neuroscience Letters 121 p73-76). 간단히 A875 세포(106/㎖)를 [125I]-NGF(0.14 nM) 및 일련의 희석된 표지되지 않은 인간 NGF(농도 범위: 10-6 M 내지 1 x 10-11
M), TrkAIg1,2(농도 범위: 4 x 10-6 M 내지 1 x 10-11 M) 또는 TrkAIg2(농도 범위: 5 x 10-6 M 내지 1 x 10-11 M)와 함께 배양하였다. 튜브를 실온에서 1 시간 동안 격렬히 진탕시켰다. 이어서 100 ㎕의 분액을 벡크만 튜브에서 200 ㎕의 슈크로즈(결합 완충액중의 0.15 M)상에 도포하였다. 원심분리(20,000 g에서 15 초)시킨 후에, 결합 및 유리 [125I]-NGF를 상기 튜브를 액체 질소에서 냉동시키고 세포 펠렛의 결합된 [125I]-NGF를 측정함으로써 분리시켰다. 결합 반응을 3 회 중복 수행하였다. 백그라운드에 대해서 계수를 보정하였으며 특이적인 결합은 전체 결합의 85 내지 87% 사이였다. 경쟁 결합 분석(도 9)에 의해 재조합체 TrkAIg2 단백질에 대한 [125I]-NGF의 결합 친화성을 평가하였다. 일정 범위 농도의 Ig-유사 영역들을 125I-NGF 및 A875 세포와 함께 배양한다(Vale R. D. & Shooter E. M(1985) Methods in Enzymology 109: 21-39). 상기에 의해, 이용가능한 125I-NGF에 대해서 TrkAIg 영역과 p75NGFR 간에 경쟁이 일어난다. 2 개의 경쟁 평형은 하기와 같다:
상기에서, N은 NGF를 나타내고; R은 p75NGFR 세포 수용체를 나타내며; T는 TrkAIg2 영역을 나타낸다.
데이터는 가변적인 TrkAIg2 농도에서 세포에 결합된 NGF를 TrkAIg2 부재하에서 결합된 NGF의 분율로서 나타낸다. p75NGFR 세포 수용체에 대한 NGF의 높은 친화성으로 인해, 상기 곡선에 대한 분석 해법은 복잡하며, 따라서 데이터를 수치 시뮬레이션(FACSIMILE, U.K.A.E.A)을 사용하여 조정하였다.
TrkAIg1,2/NGF 상호작용에 대한 해리 상수(Kd2)의 조정 값은 3.3 nM 이었다(Holden et al., 1997; Nature Biotechnology 15 p668-672). 이는 포유동물 세포에서 정규 장소 외적으로 발현된 TrkA에 결합하는 NGF에 대한 0.1 내지 1.0 nM의 Kd와 잘 일치한다. 표지되지 않은(냉) NGF에 대한 IC50(125I-NGF를 50% 까지 억제하는데 필요한 냉 NGF의 농도)은 0.2 nM이었다(Holden, P. H et al. (1997) Nature Biotechnology 15: 668-672)(도 4B).
결과는 TrkAIg2가 TrkAIg1,2에 대한 친화성과 유사한 친화성으로 NGF와 결합함을 나타낸다(도 9). TrkAIg2에 대한 IC50은 단지 TrkAIg1,2의 값보다 단지 3 배 크며, 이는 NGF에 대해 매우 유사한 친화성을 나타낸다. 이러한 놀라운 결과는 TrkAIg1,2내 결합에 대한 주요 기여인자가 두 번째 Ig 영역인 TrkAIg2에 있음을 가리킨다.
2. 표면 플라스몬 공명 연구:
TrkAIg2에 대한 NGF의 결합에 대한 역학적 데이터를 비아코어-X(BiaCore-X)를 사용하여 얻었다. 비아코어 기법은 매우 소량의 단백질을 사용하는 속도 상수의 실시간 측정을 허용한다. 간단히, 가변적인 농도의 샘플(분석물)을 목적하는 단백질(리간드)이 결합된 감지 칩을 통해 유동시켰다. 분석물이 리간드에 결합함에 따라, 표면에 의해 흡수된 빛의 강도 및 파장에 영향을 받는 감지 칩 표면상의 전자 밀도가 변한다.
경쟁 결합 분석 데이터는 TrkAIg2가 NGF 결합에 대한 주요 기여인자임을 가리키므로, 상기 영역을 추가로 조사하였다.
TrkAIg2를 비아코어 아민 커플링 키트를 사용하여 상기 TrkAIg2 상의 아민 그룹과 감지 칩 표면상의 카복실 그룹을 커플링시킴으로써 상기 표면에 공유 결합시키고 가변적인 농도의 NGF를 2 분간 20 ㎕/분의 일정한 유속으로 통과시켰다. 1 μM 내지 1 nM 범위의 NGF 농도에 대해 데이터를 모았다. 높은 농도에서 NGF의 응집 및 매우 낮은 농도에서 표면과의 비-특이적인 상호작용으로 인해 상기 높은 농도 및 매우 낮은 농도에서는 데이터를 판독하는 것이 곤란한 것으로 밝혀졌다. 그러나, 40 nM 내지 500 nM 범위에 대해 수집한 데이터는 성공적으로 평가할 수 있었다. 조정 소프트웨어 비아에발(BiaEval) 3.0을 사용하여, 11.8 nM의 Kd를 얻었다. 얻어진 11.8 nM의 Kd 값은 경쟁 결합 분석에서 측정된 바와 같이 NGF에 대한 TrkAIg1,2 결합의 Kd가 3.3 nM이었으므로, TrkAIg2에 대한 IC50이 TrkAIg1,2의 값보다 3 배 크다는 사실과 일치한다.
또한, 20 μM BDNF를 또한 TrkAIg2위로 통과시켰으나, 결합은 무시할 만한 것임이 관찰되었다. TrkAIg2는 TrkA의 NGF 결합 능력에 대한 주요 기여인자일 뿐만 아니라 NGF에 대해서도 또한 특이적인 것이 분명하다.
3. ELISA 기법을 사용하는 TrkAIg-유사 영역들의 결합
방법 1
코트(Coat) I 완충액(50 mM 탄산 나트륨, pH 9.6, NaN3 0.1%)으로 희석시킨 항-βNGF(시그마 다클론성 토끼 항 마우스 NGF, 1:1000)를 96 웰 플레이트상에 도말하고 4 ℃에서 밤새 방치시켰다. 웰들을 비우고 웰 당 100 ㎕의 코트 II 완충액(코트 I + 1% BSA)을 가하였다. 4 ℃에서 2 시간 후에, 플레이트를 세척 완충액(50 mM 트리스 HCl pH 7.2, 200 mM NaCl, 0.1% 트리톤 X-100, 0.1% NaN3, 0.25% 젤라틴)으로 3 회 세척하고 샘플, 및 샘플 완충액(세척 완충액 + 1% BSA)으로 희석시킨 표준 곡선의 NGF(0 내지 1000 pg/㎖)를 가하였다(웰 당 50 ㎕). 샘플을 가변 농도의 TrkAIg-유사 영역과 함께 실온에서 진탕시키면서 10 분간 예비 배양시킨 후에 플레이트에 가했다. 상기 플레이트를 실온에서 1 시간 방치시킨 후에 세척 완충액으로 3 회 세척하였고, 세척 완충액으로 희석(1:40)시킨 항 βNGF 갈락토시다제 공액물(Boerhinger: 분석 당 2.5 내지 20 mU 및 5 내지 10 ng 항체)을 가하였다(웰 당 10 ㎕를 가하였다). 플레이트를 실온에서 2 시간 동안 배양시키고 이어서 세척 완충액으로 3 회 세척한 후에, 기질 완충액(100 mM 인산 나트륨 pH 7.3, 1 mM MgCl2)중의 기질(4-메틸 움벨리페릴 갈락토사이드(4-MUG) 200 mM) 50 ㎕를 가하였다. 이어서 4-MUG로부터의 형광성 생성물(4-메틸유벨리페론)의 생산을 364 nm의 여기 파장 및 448 nm의 방출 파장에서 형광측정계를 사용하여 측정하였다.
방법 2
분석은 TrkAIg1,2 영역을 코트 I 완충액에서 96 웰 플레이트상에 직접 도말하고 4 ℃에서 밤새 방치시킴을 제외하고 방법 1의 분석과 유사하다. 이어서 웰들을 비우고 코트 II 완충액을 4 ℃에서 2 시간 동안 가하였다. 표준 곡선의 βNGF(0 내지 200 nM)를 실온에서 10 분간 2 μM TrkAIg1 또는 2 μM TrkAIg2와 함께 예비 배양시키고 상기 플레이트에 가하였다. 이를 실온에서 1 시간 동안 배양시킨 후에 세척하고 항 βNGF 갈락토시다제 공액물을 가하였다. 이어서 상기 플레이트를 실온에서 2 시간 동안 배양하고 세척 완충액으로 세척한 후에 기질(4-MUG 200 mM)을 가하였다. 이어서 형광성 생성물의 생산을 364 nm의 여기 파장 및 448 nm의 방출 파장에서 형광측정계를 사용하여 측정하였다.
TrkAIg1은 상기 플레이트상에서 항-βNGF 항체에 대한 NGF 결합에 영향을 주지 않았으며, 이는 상기가 예비-배양에서 NGF를 격리시키지 않았음을 가리킨다. 대조적으로, TrkAIg2는 NGF 0.5 nM에서 22% 및 NGF 1 nM에서 38%의 NGF와 결합하였다.
TrkAIg2는 NGF를 격리시킬 수 있었으며 따라서 적은 NGF가 TrkAIg1,2에 대한 결합에 이용가능하였다. 상기 결합을 200 nM NGF에서 40%까지 낮추었다. TrkAIg1은 NGf를 격리시킬 수 없었으며 따라서 TrkAIg1,2에 대한 결합에는 영향을 미치지 않았다(도 12).
이러한 결과는 TrkAIg2가 NGF에 결합하여 96 웰 플레이트에 대한 결합에 이용할 수 있는 NGF의 농도를 강하시킴을 나타낸다. TrkAIg1은 이를 할 수 없다. 선행의 프로토콜들은 방법의 선택을 개시하며, 이에 의해 비-펩티드 또는 펩티드 데이터베이스의 고도의 선별 처리를 96 웰 플레이트 포맷상에서 수행할 수 있다. 도말된 TrkAIg-유사 영역들에의 결합에 대한 NGF와의 알려지지 않은 리간드에 의한 경쟁을 형광성의 감소에 의해 측정할 수 있다.
PC12 세포에 의한 NGF-유발된 신경돌기 증식에 대한 TrkAIg-유사 영역의 생체외 효과
4 ng의 NGF 존재하에서 증식시킨 PC12(이식가능한 래트 부신 파에오크로모사이토마(phaeochromocytoma, ECACC 88022401 번) 세포(도 13A)가 분화하여 72 시간 후에 신경돌기를 발생시킨다. 이는 NGF의 부재하에서는 일어나지 않는다(도 13B). 4 ng의 NGF 존재하에서 2.5 μM(도 13C), 1.25 μM(도 13D) 및 0.625 μM(도 13E)로 PC12 세포에 가해진 TrkAIg2는 신경돌기의 증식을 억제시킨다. TrkAIg2의 농도를 0.312 μM로 감소시킬 때만(도 13F) 신경돌기의 증식이 나타나기 시작한다.
상기 결과는 TrkAIg2 영역이 NGF의 격리에 의해 PC12 세포의 신경돌기 증식을 억제시킬 수 있는 반면(도 13), TrkAIg1은 이를 할 수 없음을 나타낸다.
TrkAIg-유사 영역의 생체내 효과: 혈장 유출의 억제
모든 생체내 실험들은 신경 종말의 마취 하에서 동물(과학적 공정) 행동 1986에 따라 수행하였다. 피내(i.d.) NGF에 의해 유발된 래트 피부의 혈장 단백질 유출을 정맥내(i.v.) 125I-인간 혈청 알부민의 혈관외 축적에 의해 측정하였다(Brain, S A and Williams T. J.(1985) British Journal of Pharmacology 86: 855-860). 수컷 위스타 래트(200 내지 350 g)를, 필요에 따라 지속적인 투여량(15 ㎎/㎖)으로, 60 ㎎/㎏으로 복강내(i.p.) 마취시켰다. 척추 피부를 면도하고 시험 물질의 주입을 위해 균형을 이루고 랜덤화된 계획에 따라 시험 약제 당 2 개의 부위에 표시를 하였다. 래트에 125I-인간 혈청 알부민(100 kBq)과 에반스 블루 염료(염수중의 2.5% w/v, 0.2 내지 0.5 ㎖)를 꼬리 정맥을 통해 축적 기간의 출발 시에 주입하였다. 이어서 NGF 및 다른 시험 약제(타이로드 완충된 염 용액중의)를 피내 주입하고 30 분간 축적을 허용하였다. 혈액 샘플을 심장 천공(혈장을 위해)에 의해 채혈하고 래트를 경부 탈구에 의해 죽였다. 이어서 척추 피부를 제거하고 주입 부위를 천공시켰다(직경 16 ㎜). 혈장 및 피부 부위들을 감마 계수기로 계수 측정하였다. 각 부위에서의 혈장 단백질 유출을 유출된 혈장의 부피로서 나타내었다.
동시-주입 실험을 위해서, 모든 피부 부위에 NGF(8 피코몰) 또는 타이로드(TrkAIg1,2, TrkAIg1 또는 TrkAIg2의 존재 또는 부재하에) 100 ㎕(피내)를 주입하였다. 예비처리 실험을 위해서, 피부 부위에 TrkAIg1,2TrkAIg1 또는 TrkAIg2(24 또는 80 피코몰), 또는 비히클(타이로드 용액) 100 ㎕(피내)를 -5 또는 -40 분째에 주입하였다. 이어서 이들 부위에 NGF(8 피코몰) 또는 타이로드 50 ㎕(피내)를 축적 기간의 출발 시(0 분)에 주입하였다.
NGF-유발된 혈장 유출에 대한 TrkAIg1,2의 효과
NGF-유발된 혈장 유출에 대한 TrkAIg1,2의 동시 주입 효과를 도 14에 나타낸다. 결과는 피내 시험 약제에 응하여 유출된 혈장(㎕/부위)으로서 나타낸다(평균 ± 표준오차 평균, n=6). 7S NGF(2.55(β-NGF)와 γNGF의 복합체이다)(단독 및 TrkAIg1,2와의 동시-주입 모두)에 의해 유발된 반응을 나타낸다(8 피코몰, 채워진 네모). 비교를 위해서, 타이로드의 용액(비히클, 빈 원)(단독 및 TrkAIg1,2와의 동시-주입 모두)에 의해 유발된 반응을 또한 나타낸다. 약제만을 단독 주입한 부위와 현저하게 상이한 약제 + 동시 주입된 TrkAIg1,2를 주입한 부위에서의 혈장 유출을 본페로니(Bonferroni)의 후-시험에 따른 ANOVA에 의한 평가에 따라 **p<0.01로 나타낸다.
TrkAIg1,2는 24 피코몰의 투여량으로 사용될 때, 즉 사용된 NGF의 투여량보다 3 배 높게 사용될 때 NGF의 작용을 길항할 수 있다. 대조적으로, 비히클중의 TrkAIg1,2의 주입은 현저한 혈장 유출을 발생시키지 않는다. 따라서, TrkAIg1,2는 특히 예비 혼합되고 동시 주입될 때 NGF의 작용을 길항할 수 있다. 이는 TrkAIg1,2가 NGF에 결합할 수 있고 따라서 상기를 격리시켜 그의 유출 작용을 억제 할 수 있음을 가리킨다. TrkAIg1,2가 생체내에서 NGF를 길항하는 능력을 조사하기 위해서, 피부 부위를 TrkAIg1,2를 피내 주입함으로써 예비-처리하고 NGF를 5 분 후에 피내 주입하였다. 도 15에 나타낸 결과는 24 피코몰의 TrkAIg1,2가 8 피코몰의 7S NGF에 의해 유발된 혈장 유출을 현저하게 억제시킬 수 있음을 나타낸다. 결과를 피내 시험 약제에 응하여 유출된 혈장(㎕/부위)으로서 나타낸다(평균 ± 표준오차 평균, n=4). 7S NGF(8 피코몰)에 의해 유발된 반응을 단독 및 증가하는 투여량의 TrkAIg1,2(도시됨)로 예비 처리된 부위 모두에 대해 채워진 네모로 나타낸다. 비교를 위해서, TrkAIg1,2(24 피코몰)와 동시-주입된 7S NGF(8 피코몰)에 의해 유발된 반응을 채워진 봉 모양으로 나타낸다. GR 73632(30 피코몰)의 피내 주입에 의해 유발된 혈장 유출을 도시된 TrkAIg1,2의 예비 처리 투여량과 함께, 채워진 삼각형으로 나타내고, 타이로드 용액(비히클)은 빈 원으로 나타낸다. 약제만을 주입한 부위와 현저하게 상이한, 약제 + 동시 주입된 TrkAIg1,2를 주입한 부위의 혈장 유출을 본페로니의 후-시험에 따른 ANOVA에 의한 평가에 따라 **p<0.01로 나타낸다.
24 피코몰의 TrkAIg1,2로 예비 처리한 부위에서 NGF에 의해 나타난 혈장 유출은 24 피코몰의 TrkAIg1,2와 동시 주입된 NGF에 의해 발생한 혈장 유출과 유사하였다. 동시 주입 실험에서와 같이, TrkAIg1,2에 의한 예비 처리는 단독 주입시 현저한 혈장 유출을 발생시키지 않았다. TrkAIg1,2의 작용이 NGF-유발된 반응 또는 일반적인 염증 치료 효과에 대해 특이적인지를 결정하기 위한 시도에서, NK1 작용물질인 GR73632(30 피코몰)를 TrkAIg1,2 예비 처리된 부위에 주입하였다. 5 분 간의 예비 처리는 GR73632에 의해 유발된 혈장 유출을 억제하지 못했다(도 15에 또한 도시됨).
NGF 격리 안정성을 평가하기 위해서, 피부 부위를 보다 긴 기간(40 분) 동안 축적 기간의 출발 시에 주어진(피내) TrkAIg1,2 및 NGF로 예비 처리하였다(도 16에 도시됨). 결과를 피내 시험 약제에 반응하여 유출된 혈장(㎕/부위)으로서 나타낸다(평균 ± s.e. 평균, n=4). 7S NGF(8 피코몰)에 의해 유발된 반응을 단독 및 증가하는 투여량의 TrkAIg1,2(도시됨)로 예비 처리된 부위 모두에 대해 채워진 네모로 나타낸다. 비교를 위해서, TrkAIg1,2(24 피코몰)와 동시-주입된 7S NGF(8 피코몰)에 의해 유발된 반응을 채워진 봉 모양으로 나타낸다. GR 73632(30 피코몰)의 피내 주입에 의해 유발된 혈장 유출을 TrkAIg1,2의 예비 처리 투여량(y 축에 도시됨)과 함께, 채워진 삼각형으로 나타내고, 타이로드 용액(비히클)은 빈 원으로 나타낸다. 약제만을 주입한 부위와 현저하게 상이한, 약제 + 동시 주입된 TrkAIg1,2를 주입한 부위의 혈장 유출을 본페로니의 후-시험에 따른 ANOVA에 의한 평가에 따라 **p<0.05로 나타낸다.
이들 실험에서, NGF-유발된 혈장 유출은 TrkAIg1,2 80 피코몰에 의해서는 현저하게 억제되었으나, 24 피코몰에 의해서는 억제되지 못했다. 비교를 위해 80 피코몰의 TrkAIg1,2와 함께 8 피코몰의 NGF를 동시 주입하여 유발된 혈장 유출을 비교를 위해 나타낸다. 선행 실험의 결과를 유의하여, 사용된 TrkAIg1,2의 투여량은 단독으로 주입되었을 때 현저한 혈장 유출을 발생시키지 않았으며, 또한 GR73632(상기 개시됨)에 의해 유발된 혈장 유출을 억제시키지 못했다.
NGF-유발된 혈장 유출에 대한 TrkAIg1의 효과
선행의 일련의 실험에 따라, 면역글로불린-유사 영역들(TrkAIg1,2) 모두를 사용하여 TrkA의 면역글로불린-유사 영역에 대한 NGF의 결합을 추가로 특성화하고자 하였다. 이를 위해서, 본 발명자들은 첫 번째 면역글로불린-유사 영역인 TrkAIg1 재조합체 샘플을 사용하였다. 도 17에서 알 수 있는 바와 같이, TrkAIg1을 사용한 동시 주입 실험은 80 피코몰/부위 이하의 투여량에서 NGF-유발된 혈장 유출을 현저하게 억제시키지 못했음을 나타내었다.
결과를 피내 시험 약제에 반응하여 유출된 혈장(㎕/부위)으로서 나타낸다(평균 ± 표준오차 평균, n=6). 7S NGF(8 피코몰)에 의해 유발된 반응을 단독 및 TrkAIg1의 동시 주입(도시됨) 모두에 대해 채워진 네모로 나타낸다. 비교를 위해서, 동시 주입된 TrkAIg1의 투여량(도시됨)과 함께 타이로드 용액(비히클)에 의해 유발된 반응을 빈 원으로 나타낸다. 약제만을 주입한 부위와 현저하게 상이한, 약제 + 동시 주입된 TrkAIg1을 주입한 부위의 혈장 유출을 본페로니의 후-시험에 따른 ANOVA에 의한 평가에 따라 ns(현저하지 않음)로 나타낸다.
NGF-유발된 혈장 유출에 대한 TrkAIg2의 효과
(NGF에 결합하고 이를 격리시키는 TrkAIg2의 능력을 평가하였다)
도 18에서 알 수 있는 바와 같이, NGF와 TrkAIg2의 동시 주입은 10 배 과잉으로 제공될 때 NGF-유발된 혈장 유출을 현저하게 억제시킬 수 있었다. 사용된 모든 투여량에서, TrkAIg2는 GR73632에 의해 유발된 혈장 유출을 억제시키지 못했으며, 또한 단독으로 주입되었을 때 현저한 혈장 유출을 발생시키지 않았다. 결과를 피내 시험 약제에 반응하여 유출된 혈장(㎕/부위)으로서 나타낸다(평균 ± 표준오차 평균, n=4 내지 8). 7S NGF(8 피코몰)에 의해 유발된 반응을 단독 및 TrkAIg와의 동시 주입(도시됨) 모두에 대해 채워진 네모로 나타낸다. 비교를 위해서, GR 73632(30 피코몰)의 피내 주입에 의해 유발된 반응을 동시 주입된 TrkAIg2의 투여량(도시됨)과 함께, 채워진 삼각형으로 나타내고, 타이로드 용액(비히클)은 빈 원으로 나타낸다. 약제만을 주입한 부위와 현저하게 상이한, 약제 + 동시 주입된 TrkAIg2를 주입한 부위의 혈장 유출을 본페로니의 후-시험에 따른 ANOVA에 의한 평가에 따라 **p<0.001로 나타낸다.
NGF와 함께 80 피코몰의 TrkAIg2로 피부 부위를 예비 처리하여 8 피코몰의 NGF(5 분 후에 제공됨)에 의해 유발된 혈장 유출을 억제시킬 수 있었다(도 19). 결과를 피내 시험 약제에 반응하여 유출된 혈장(㎕/부위)으로서 나타낸다(평균 ± 표준오차 평균, n=4). 7S NGF(8 피코몰)에 의해 유발된 반응을 단독 및 증가하는 투여량의 TrkAIg2(도시됨)로 예비 처리된 부위 모두에 대해 채워진 네모로 나타낸다. GR 73632(30 피코몰)의 피내 주입에 의해 유발된 혈장 유출을 TrkAIg2의 예비 처리 투여량(도시됨)과 함께, 채워진 삼각형으로 나타내고, 타이로드 용액(비히클)은 빈 원으로 나타낸다. 약제만을 주입한 부위와 현저하게 상이한, 약제 + 동시 주입된 TrkAIg2를 주입한 부위의 혈장 유출을 본페로니의 후-시험에 따른 ANOVA에 의한 평가에 따라 **p<0.001로 나타낸다. 다시, 상기 예비 처리는 GR73632-유 발된 혈장 유출에 대해 효과가 없었으며 단독 주입 시 현저한 혈장 유출을 발생시키지 않았다(도 19).
TrkAIg를 40 분 예비 처리로서 사용했을 때 유사한 결과가 나타났다(도 20). 결과를 피내 시험 약제에 반응하여 유출된 혈장(㎕/부위)으로서 나타낸다(평균 ± 표준오차 평균, n=3). 7S NGF(8 피코몰)에 의해 유발된 반응을 단독 및 증가하는 투여량의 TrkAIg2의 증가하는 투여량(도시됨)으로 예비 처리된 부위 모두에 대해 채워진 네모로 나타낸다. GR 73632(30 피코몰)의 피내 주입에 의해 유발된 혈장 유출을 TrkAIg2의 예비 처리 투여량(도시됨)과 함께, 채워진 삼각형으로 나타내고, 타이로드 용액(비히클)은 빈 원으로 나타낸다. 약제만을 주입한 부위와 현저하게 상이한, 약제 + 동시 주입된 TrkAIg2를 주입한 부위의 혈장 유출을 스튜던트-뉴만-코일스(Student-Newman-Keuls) 후-시험에 따른 ANOVA에 의한 평가에 따라 **p<0.001로 나타낸다. NGF에 의해 유발된 혈장 유출은 80 피코몰의 TrkAIg2에 의해 현저하게 억제되었다. 비교를 위해서, 80 피코몰의 TrkAIg2와 동시 주입된 8 피코몰의 7S NGF에 의해 유발된 혈장 유출을 채워진 기둥으로 나타낸다. TrkAIg2의 예비 처리는 단독으로 혈장 유출을 유발시키지 않았으며 GR73632에 의해 유발된 혈장 유출에 영향을 미치지 못했다.
상기 결과들은 TrkAIg2 영역이 생체내에서 NGF와 결합할 수 있으며 그의 생물 활성을 차단할 수 있음을 입증한다.
TrkAIg2의 결정화
재조합체 TrkAIg2의 결정을 다양한 조건들, 즉 14 내지 20%의 MPD, pH 5.0(100 mM Na-시트레이트), 300 내지 500 mM NaCl, pH 5.0(100 mM Na-시트레이트), 가장 유리하게는 500 mM NaCl, pH 5.0의 조건하에서 수득하였다. 상기 결정은 0.2 x 0.2 x 0.2 ㎜의 대략적인 치수로 재현 가능하게 성장한다. 이어서 결정을 저온 보존시킨다. 가정용 공급원(회전 양극, 거울, 화상 플레이트) 및 싱크로트론 공급원(Hamburg)을 사용시, 이들 결정은 약 2.8 Å으로 회절한다. 50%의 용매를 가정하여, 4 개(또는 가능하게는 3 개) 분자가 비대칭 단위로 존재하는 것으로 평가된다. 상기 단백질의 셀레노멧(selenoMet) 형태의 결정을 MAD 위상화에 사용되고 무거운 원자 유도체로서 사용된 셀레노멧 영양요구체(구조중에 4 개의 메티오닌이 존재함)를 사용하여 제조하였다. 천연 및 셀레노멧 TrkAIg2 모두의 재조합체 형태를 본 명세서에 정의된 바와 같은 기존의 공정들을 사용하여 제조하고, 정제하고 재중첩시켰다.
TrkAIg2의 치료학적 태양
몇몇 통증 상태는 NGF의 과발현에 의해 야기되기 때문에, 항체 또는 재조합체 TrkAIg2 결합 영역과 같은 NGF 길항물질의 적용으로 생성된 통증 상태를 경감시킬 수도 있을 것이 예상되며 입증되었다(McMaoh, S. B. Series B-Biological Sciences(1996), 351, No. 1338, 431-440; Woolf, C. J. et al., British Journal Of Pharmacology, (1997), 121, No. 3, 417-424; Lowe, E. M. et al. British Journal Of Urology, (1997), 79, No. 4, 572-577; Dmitrieva, N. et al. Neuroscience, (1997), 78, No. 2, 449-459; Aloe, L. et al. International Journal Of Tissue Reactions-Experimental And Clinical Aspects, (1993), 15, No. 4, 139-143; Aloe, L. et al. Rheumatology International, (1995), 14, No. 6, 249-252).
따라서, 요약하자면, 본 발명자들은 TrkAIg1이라 칭하는 부분이 NGF와 결합할 수 없음을 입증하였다. TrkAIg2 분자의 소형성 및 상기 단백질이 예를 들어 이 콜라이에서 풍부하게 생산될 수 있고 정제되고 정확한 형태로 재중첩될 수 있다는 점은 부득이 포유동물 또는 곤충 세포에서 수행되어야 하는 완전한 세포외 영역에 대해 특정한 이점들을 부여한다.
다양한 통증 상태로 종종 NGF 단백질 수준의 증가와 관련있는 만성 염증 질환들이 알려져 있다. 여기에는 특발성 감각상 절박 및 간질성 방광염, 관절염 및 대상포진이 포함된다. 이러한 만성 질환들은 말초 뉴런들을 예민하게 만들 수 있으며 추정상 심지어는 장기적인 감각 신경 이상을 발생시킬 수도 있다. 이러한 증가된 NGF의 격리에 의해, TrkAIg2의 사용에 의해 상기와 같은 질환들 및 NGF가 상승된 다른 질환들에서 통증을 경감시키는 것이 가능할 것이다.
명세서 전체를 통해, 하기의 약어들을 사용하였다:
아미노산 | 3 자 약어 | 1 자 기호 |
알라닌 아르기닌 아스파라진 아스파르트산 아스파라진 또는 아스파르트 산 시스테인 글루타민 글루탐산 글루타민 또는 글루탐산 글리신 히스티딘 이소류신 류신 라이신 메티오닌 페닐알라닌 프롤린 세린 쓰레오닌 트립토판 티로신 발린 | Ala Arg Asn Asp Asx Cys Gln Glu Glx Gly His Ile Leu Lys Met Phe Pro Ser Thr Trp Tyr Val | A R N D B C Q E Z G H I L K M F P S T W Y V |
뉴클레오티드에 대한 약어:
A 아데닌
G 구아닌
C 시토신
T 티민
U 우라실
돌연변이에 대한 약어:
X1NNNX2
X1 및 X2는 상기 정의된 바와 같은 아미노산 1 자 기호이다.
NNN은 아미노산 서열내의 돌연변이 위치를 지시하는 아라비아 숫자이다.
<110> University of Bristol
<120> Therapeutic agent for NGF
<150> GB 9807781.1
<151> 1999-04-09
<160> 10
<170> KopatentIn 1.71
<210> 1
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligo 10692
<400> 1
ccgatctcga gggtgtgccc acgctg 26
<210> 2
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligo 10693
<400> 2
ccgatctcga gttatcattc gtccttcttc tccaccgggt c 41
<210> 3
<211> 734
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(717)
<400> 3
atg ggc agc agc cat cat cat cat cat cac agc agc ggc ctg gtg ccg 48
Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro
1 5 10 15
cgc ggc agc cat atg ctc gag ggt gtg ccc acg ctg aag gtc cag gtg 96
Arg Gly Ser His Met Leu Glu Gly Val Pro Thr Leu Lys Val Gln Val
20 25 30
ccc aat gcc tcg gtg gat gtg ggg gac gac gtg ctg ctg cgg tgc cag 144
Pro Asn Ala Ser Val Asp Val Gly Asp Asp Val Leu Leu Arg Cys Gln
35 40 45
gtg gag ggg cgg ggc ctg gag cag gcc ggc tgg atc ctc aca gag ctg 192
Val Glu Gly Arg Gly Leu Glu Gln Ala Gly Trp Ile Leu Thr Glu Leu
50 55 60
gag cag tca gcc acg gtg atg aaa tct ggg ggt ctg cca tcc ctg ggg 240
Glu Gln Ser Ala Thr Val Met Lys Ser Gly Gly Leu Pro Ser Leu Gly
65 70 75 80
ctg acc ctg gcc aat gtc acc agt gac ctc aac agg aag aac ttg acg 288
Leu Thr Leu Ala Asn Val Thr Ser Asp Leu Asn Arg Lys Asn Leu Thr
85 90 95
tgc tgg gca gag aac gat gtg ggc cgg gca gag gtc tct gtt cag gtc 336
Cys Trp Ala Glu Asn Asp Val Gly Arg Ala Glu Val Ser Val Gln Val
100 105 110
aac gtc tcc ttc ccg gcc agt gtg cag ctg cac acg gcg gtg gag atg 384
Asn Val Ser Phe Pro Ala Ser Val Gln Leu His Thr Ala Val Glu Met
115 120 125
cac cac tgg tgc atc ccc ttc tct gtg gat ggg cag ccg gca ccg tct 432
His His Trp Cys Ile Pro Phe Ser Val Asp Gly Gln Pro Ala Pro Ser
130 135 140
ctg cgc tgg ctc ttc aat ggc tcc gtg ctc aat gag acc agc ttc atc 480
Leu Arg Trp Leu Phe Asn Gly Ser Val Leu Asn Glu Thr Ser Phe Ile
145 150 155 160
ttc act gag ttc ctg gag ccg gca gcc aat gag acc gtg cgg cac ggg 528
Phe Thr Glu Phe Leu Glu Pro Ala Ala Asn Glu Thr Val Arg His Gly
165 170 175
tgt ctg cgc ctc aac cag ccc acc cac gtc aac aac ggc aac tac acg 576
Cys Leu Arg Leu Asn Gln Pro Thr His Val Asn Asn Gly Asn Tyr Thr
180 185 190
ctg ctg gct gcc aac ccc ttc ggc cag gcc tcc gcc tcc atc atg gct 624
Leu Leu Ala Ala Asn Pro Phe Gly Gln Ala Ser Ala Ser Ile Met Ala
195 200 205
gcc ttc atg gac aac cct ttc gag ttc aac ccc gag gac ccc atc cct 672
Ala Phe Met Asp Asn Pro Phe Glu Phe Asn Pro Glu Asp Pro Ile Pro
210 215 220
gac act aac agc aca tct gga gac ccg gtg gag aag aag gac gaa tga 720
Asp Thr Asn Ser Thr Ser Gly Asp Pro Val Glu Lys Lys Asp Glu
225 230 235
taactcgaga tcgg 734
<210> 4
<211> 239
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 4
Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro
1 5 10 15
Arg Gly Ser His Met Leu Glu Gly Val Pro Thr Leu Lys Val Gln Val
20 25 30
Pro Asn Ala Ser Val Asp Val Gly Asp Asp Val Leu Leu Arg Cys Gln
35 40 45
Val Glu Gly Arg Gly Leu Glu Gln Ala Gly Trp Ile Leu Thr Glu Leu
50 55 60
Glu Gln Ser Ala Thr Val Met Lys Ser Gly Gly Leu Pro Ser Leu Gly
65 70 75 80
Leu Thr Leu Ala Asn Val Thr Ser Asp Leu Asn Arg Lys Asn Leu Thr
85 90 95
Cys Trp Ala Glu Asn Asp Val Gly Arg Ala Glu Val Ser Val Gln Val
100 105 110
Asn Val Ser Phe Pro Ala Ser Val Gln Leu His Thr Ala Val Glu Met
115 120 125
His His Trp Cys Ile Pro Phe Ser Val Asp Gly Gln Pro Ala Pro Ser
130 135 140
Leu Arg Trp Leu Phe Asn Gly Ser Val Leu Asn Glu Thr Ser Phe Ile
145 150 155 160
Phe Thr Glu Phe Leu Glu Pro Ala Ala Asn Glu Thr Val Arg His Gly
165 170 175
Cys Leu Arg Leu Asn Gln Pro Thr His Val Asn Asn Gly Asn Tyr Thr
180 185 190
Leu Leu Ala Ala Asn Pro Phe Gly Gln Ala Ser Ala Ser Ile Met Ala
195 200 205
Ala Phe Met Asp Asn Pro Phe Glu Phe Asn Pro Glu Asp Pro Ile Pro
210 215 220
Asp Thr Asn Ser Thr Ser Gly Asp Pro Val Glu Lys Lys Asp Glu
225 230 235
<210> 5
<211> 362
<212> DNA
<213> homo sapiens
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(348)
<400> 5
atg ggc agc agc cat cat cat cat cat cac agc agc ggc ctg gtg ccg 48
Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro
1 5 10 15
cgc ggc agc cat atg ctc gag ggt gtg ccc acg ctg aag gtc cag gtg 96
Arg Gly Ser His Met Leu Glu Gly Val Pro Thr Leu Lys Val Gln Val
20 25 30
ccc aat gcc tcg gtg gat gtg ggg gac gac gtg ctg ctg cgg tgc cag 144
Pro Asn Ala Ser Val Asp Val Gly Asp Asp Val Leu Leu Arg Cys Gln
35 40 45
gtg gag ggg cgg ggc ctg gag cag gcc ggc tgg atc ctc aca gag ctg 192
Val Glu Gly Arg Gly Leu Glu Gln Ala Gly Trp Ile Leu Thr Glu Leu
50 55 60
gag cag tca gcc acg gtg atg aaa tct ggg ggt ctg cca tcc ctg ggg 240
Glu Gln Ser Ala Thr Val Met Lys Ser Gly Gly Leu Pro Ser Leu Gly
65 70 75 80
ctg acc ctg gcc aat gtc acc agt gac ctc aac agg aag aac ttg acg 288
Leu Thr Leu Ala Asn Val Thr Ser Asp Leu Asn Arg Lys Asn Leu Thr
85 90 95
tgc tgg gca gag aac gat gtg ggc cgg gca gag gtc tct gtt cag gtc 336
Cys Trp Ala Glu Asn Asp Val Gly Arg Ala Glu Val Ser Val Gln Val
100 105 110
aac gtc tcc ttc tg ataactcgag cg 362
Asn Val Ser Phe
115
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<213> homo sapiens
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20 25 30
Pro Asn Ala Ser Val Asp Val Gly Asp Asp Val Leu Leu Arg Cys Gln
35 40 45
Val Glu Gly Arg Gly Leu Glu Gln Ala Gly Trp Ile Leu Thr Glu Leu
50 55 60
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Leu Thr Leu Ala Asn Val Thr Ser Asp Leu Asn Arg Lys Asn Leu Thr
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cgc ggc agc cat atg ccg gcc agt gtg cag ctg cac acg gcg gtg gag 96
Arg Gly Ser His Met Pro Ala Ser Val Gln Leu His Thr Ala Val Glu
20 25 30
atg cac cac tgg tgc atc ccc ttc tct gtg gat ggg cag ccg gca ccg 144
Met His His Trp Cys Ile Pro Phe Ser Val Asp Gly Gln Pro Ala Pro
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tct ctg cgc tgg ctc ttc aat ggc tcc gtg ctc aat gag acc agc ttc 192
Ser Leu Arg Trp Leu Phe Asn Gly Ser Val Leu Asn Glu Thr Ser Phe
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atc ttc act gag ttc ctg gag ccg gca gcc aat gag acc gtg cgg cac 240
Ile Phe Thr Glu Phe Leu Glu Pro Ala Ala Asn Glu Thr Val Arg His
65 70 75 80
ggg tgt ctg cgc ctc aac cag ccc acc cac gtc aac aac ggc aac tac 288
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85 90 95
acg ctg ctg gct gcc aac ccc ttc ggc cag gcc tcc gcc tcc atc atg 336
Thr Leu Leu Ala Ala Asn Pro Phe Gly Gln Ala Ser Ala Ser Ile Met
100 105 110
gct gcc ttc atg gac aac cct ttc gag ttc aac ccc gag gac ccc atc 384
Ala Ala Phe Met Asp Asn Pro Phe Glu Phe Asn Pro Glu Asp Pro Ile
115 120 125
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<213> homo sapiens
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130 135 140
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<212> DNA
<213> homo sapiens
<220>
<221> CDS
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atg ggc agc agc cat cat cat cat cat cac agc agc ggc ctg gtg ccg 48
Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro
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cgc ggc agc cat atg ccg gcc agt gtg cag ctg cac acg gcg gtg gag 96
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Gly Cys Leu Arg Leu Asn Gln Pro Thr His Val Asn Asn Gly Asn Tyr
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Ala Ala Phe Met Asp Asn Pro Phe Glu Phe Asn Pro Glu Asp Pro Ile
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cct gtc tcc ttc tcg cca gtg gac act aac agc aca tct gga gac ccg 432
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130 135 140
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145 150
Claims (67)
- 뉴로트로핀 (neurotrophin)과 결합할 수 있는 서열 번호 8의 잔기 22 내지 119의 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드.
- 뉴로트로핀과 결합할 수 있는 서열 번호 8의 잔기 22 내지 144의 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드.
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 제 1 항에 있어서, 동물 세포로부터 단리된 폴리펩티드.
- 제 6 항에 있어서, 동물 세포가 포유동물 세포인 폴리펩티드.
- 제 7 항에 있어서, 포유동물 세포가 인간 세포인 폴리펩티드.
- 제 6 항에 있어서, 동물 세포가 곤충 세포, 파충류 세포, 어류 세포, 조류 세포 또는 양서류 세포인 폴리펩티드.
- 제 1 항에 있어서, 뉴로트로핀이 NGF, NT-3 또는 p75NGFR과 결합하는 뉴로트로핀인 폴리펩티드.
- 제 1 항에 있어서, 뉴로트로핀이 단량체, 이량체, 삼량체 또는 뉴로트로핀 이종이량체로서 존재하는 폴리펩티드.
- 제 1 항에 있어서, 뉴로트로핀이 포유동물, 곤충, 파충류, 어류, 조류 또는 양서류로부터 유래되는 폴리펩티드.
- 제 12 항에 있어서, 포유동물 뉴로트로핀이 인간 뉴로트로핀인 폴리펩티드.
- 제 1 항에 따른 폴리펩티드를 암호화하는 DNA 서열.
- 삭제
- 제 14 항에 따른 DNA 서열을 포함하는 플라스미드 또는 다른 벡터.
- 제 16 항에 있어서, 발현 벡터인 플라스미드.
- 제 16 항에 있어서, pET-15b인 플라스미드.
- 삭제
- 제 14 항에 따른 DNA 서열을 적합한 숙주 내로 도입시키고, 이에 의해 상기 DNA 서열을 발현시키는 것을 포함하는 제 1 항에 따른 폴리펩티드의 제조 방법.
- 제 20 항에 있어서, 숙주가 동물 세포인 방법.
- 제 20 항에 있어서, 숙주가 세균 세포인 방법.
- 제 21 항에 있어서, 숙주가 포유동물 세포인 방법.
- 제 23 항에 있어서, 숙주가 인간 세포인 방법.
- 제 1 항에 따른 폴리펩티드를 사용하여 TrkA 수용체에 결합하는 분자를 선별하는 방법.
- 제 25 항에 있어서, TrkAIg1에 대한 추정 리간드의 결합을 TrkAIg2에 대한 동일한 추정 리간드의 결합과 비교하는 것을 포함하는 방법.
- 제 25 항에 있어서, TrkAIg2의 하나 이상의 용매-노출된 루프에 결합하는 분자들을 선택하는 것을 포함하고, 상기 용매-노출된 루프가 도 1B에 도시된 루프 E 내지 F 또는 루프 C" 내지 D인 방법.
- 삭제
- 삭제
- 제 27 항에 있어서, 10 nM ~ 200 nM의 친화성을 갖는 분자를 선택하는 방법.
- 제 25 항에 있어서, 제 1 항에 따른 폴리펩티드 또는 TrkA가 천연 상태로 뉴로트로핀에 결합하는 것을 향상시키는 분자들을 선택하는 것을 포함하는 방법.
- 1. 화합물 제조 단계2. 단계 1에서 제조된 화합물과 제 1 항에 따른 폴리펩티드와의 결합을 수반하는 화합물 선별 단계를 포함하는 조합 화학의 방법.
- 제 1 항에 따른 폴리펩티드에 대해 발생한 항체.
- 제 33 항에 있어서, 폴리펩티드가 TrkAIg2인 항체.
- 제 14 항에 따른 DNA 서열을 함유하는 숙주 세포.
- 제 35 항에 있어서, 포유동물, 세균, 곤충 또는 효모 세포인 숙주 세포.
- 제 36 항에 있어서, 포유동물 세포가 인간 세포인 숙주 세포.
- 제 1 항에 따른 폴리펩티드를 포함하는 진단 탐침.
- 제 38 항에 있어서, 표지된 진단 탐침.
- 제 39 항에 있어서, 표지가 형광 표지 또는 방사능 표지인 진단 탐침.
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 화학적 또는 생물학적 수단에 의해 제 1 항에 따른 폴리펩티드를 제조하는 방법.
- 제 1 항에 따른 폴리펩티드 또는 제 14 항에 따른 DNA 서열을 함유하거나, 발현하거나 또는 과발현하도록 조작된 유기체.
- 제 46 항에 있어서, 동물, 세균, 효모 또는 곤충인 유기체.
- 제 46 항에 있어서, 포유동물, 세균, 효모 또는 곤충인 유기체.
- 제 1 항에 따른 폴리펩티드를 포함하는, 뉴로트로핀 수준의 증가와 관련된 통증인 특발성 감각 절박(ISU), 간질성 방광염, 관절염, 대상포진, 말초적 염증, 만성 염증 및 포진후 신경통에서 선택된 질병의 증상의 치료용 조성물.
- 삭제
- 삭제
- 제 1 항에 따른 폴리펩티드를 수반하는 선별 공정에 의해 단리되거나 동정된 뉴로트로핀 유사체를 포함하는, 증가된 뉴로트로핀 수준과 관련된 통증인 특발성 감각 절박(ISU), 간질성 방광염, 관절염, 대상포진, 말초적 염증, 만성 염증 및 포진후 신경통에서 선택된 질병의 증상의 치료용 약학적 조성물.
- 삭제
- 제 1 항에 따른 폴리펩티드를 포함하는 알쯔하이머 병의 치료용 약학적 조성물.
- 제 1 항에 따른 폴리펩티드를 수반하는 선별 공정에 의해 단리되거나 동정된 뉴로트로핀 유사체를 포함하는, 알쯔하이머 병의 치료용 약학적 조성물.
- 제 52 항, 제 54 항 및 제 55 항 중 어느 한 항에 있어서, 뉴로트로핀이 NGF인 약학적 조성물.
- 제 1 항에 따른 폴리펩티드를 약학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제와 함께 포함하는, 증가된 뉴로트로핀 수준과 관련된 통증인 특발성 감각 절박(ISU), 간질성 방광염, 관절염, 대상포진, 말초적 염증, 만성 염증 및 포진후 신경통에서 선택된 질병의 증상, 또는 알쯔하이머 병의 치료용 약학적 조성물.
- 제 57 항에 있어서, 하나 이상의 뉴로트로핀을 포함하고, 증가된 뉴로트로핀 수준과 관련된 통증인 특발성 감각 절박(ISU), 간질성 방광염, 관절염, 대상포진, 말초적 염증, 만성 염증 및 포진후 신경통에서 선택된 질병의 증상, 또는 알쯔하이머 병의 치료용 약학적 조성물.
- 데이터 이용 지시에 따라 프로그램화된 기계를 사용할 때, 제 1 항에 따른 폴리펩티드의 3 차원 그래픽 표현을 나타낼 수 있는 기계 판독가능한 데이터에 의해 암호화된 데이터 저장 자료를 포함하는, 기계 판독가능한 데이터 저장 매체.
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 결정성 TrkAIg2.
- 제 1 항에 따른 폴리펩티드를 포함하는 결정.
- 제 66 항에 있어서, 폴리펩티드가 TrkAIg2인 결정.
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