JP2002511262A - Ｎｇｆに関する治療薬 - Google Patents

Ｎｇｆに関する治療薬

Info

Publication number
JP2002511262A
JP2002511262A JP2000543603A JP2000543603A JP2002511262A JP 2002511262 A JP2002511262 A JP 2002511262A JP 2000543603 A JP2000543603 A JP 2000543603A JP 2000543603 A JP2000543603 A JP 2000543603A JP 2002511262 A JP2002511262 A JP 2002511262A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
polypeptide
ngf
neurotrophin
trkaig2
cell
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
JP2000543603A
Other languages
English (en)
Other versions
JP2002511262A5 (ja
Inventor
ロバートソン，アラン，ジョージ，シンプソン
アレン，シェリー，ジェーン
ダウバーン，デビッド
Original Assignee
ザ ユニバーシティ オブ ブリストル
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by ザ ユニバーシティ オブ ブリストル filed Critical ザ ユニバーシティ オブ ブリストル
Publication of JP2002511262A publication Critical patent/JP2002511262A/ja
Publication of JP2002511262A5 publication Critical patent/JP2002511262A5/ja
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70571—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for neuromediators, e.g. serotonin receptor, dopamine receptor
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/04—Centrally acting analgesics, e.g. opioids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C07K14/48—Nerve growth factor [NGF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/71—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for growth factors; for growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1205—Phosphotransferases with an alcohol group as acceptor (2.7.1), e.g. protein kinases
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/48—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving transferase
    • C12Q1/485—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving transferase involving kinase
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/74—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving hormones or other non-cytokine intercellular protein regulatory factors such as growth factors, including receptors to hormones and growth factors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/0068—Means for controlling the apparatus of the process
    • B01J2219/00686—Automatic
    • B01J2219/00689—Automatic using computers
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/0068—Means for controlling the apparatus of the process
    • B01J2219/007—Simulation or vitual synthesis
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)

Abstract

(57)【要約】 本発明は、治療薬としての、そしてＮＧＦ模倣物のスクリーニング目的および合理的設計のためのＴｒｋのドメインの使用に関する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 本発明は、治療薬およびスクリーニング方法に関する。特に、本発明は、疼痛
性疾患のような、ニューロトロフィン、例えばＮＧＦのレベルが上がる疾患の治
療におけるチロシンキナーゼＴｒｋＡのＩｇ２ドメインおよびその断片の使用に
関する。本発明は、ニューロトロフィン、例えばＮＧＦの作用を相殺するかまた
は模倣するよう作用する化合物をスクリーニングするための標的としてのＴｒｋ
ＡＩｇ２ドメインの使用にも関する。ＴｒｋＡＩｇ２は、ここでは、ＴｒｋＡＩ
ｇ様サブドメイン２をプロリンリッチ領域とともに含むと定義される（図１Ａ）
。
【０００２】 神経成長因子（ＮＧＦ）は、前脳コリン作動性ニューロンに関する有力な神経
栄養因子であり、発生中の交感および感覚ニューロンの生存および分化を促す。
動物モデルにおいて、ＮＧＦの投与は老化または傷害動物におけるコリン作動性
萎縮の作用を矯正し得ることが示されている。精製マウスＮＧＦは、アルツハイ
マー病の治療に用いられてきた。しかしながら、この治療は、侵襲性手術を要し
、長期解決法は、ＮＧＦの栄養作用を模倣し得る小分子作動薬の生成であろう。
ＮＧＦは、通常は二量体として存在するけれども、これらの目的では、ＮＧＦと
いう用語は単量体、二量体、三量体またはヘテロ二量体形態を包含する。
【０００３】 侵害受容性主要求心神経上の受容体との相互作用により、ＮＧＦはいくつかの
持続性疼痛状態の媒介物質としても作用し得る、ということを証拠は示唆する（
McMahon S.B. Series B-Biological Sciences,（1996）, Vol.351, No.1338, 43
1-440）。種々の実験的炎症症状では、ＮＧＦレベルは炎症組織中で急速に増大
する。同様に、外因性ＮＧＦの全身または局所適用は、動物およびヒトの両方で
、急速且つ長期の行動性(behavioural)痛覚過敏を生じる。多数の動物モデルに
おいて、実験的炎症に関連した痛覚過敏の多くは、抗体などの、ＮＧＦを隔絶(s
equester)し得る分子により遮断される。したがって、末梢的作用性ＮＧＦ−隔
絶剤またはＮＧＦ拮抗薬は、おそらくは、いくつかの慢性疼痛状態の治療に用い
られ得る。
【０００４】 末梢性炎症は、通常は、炎症媒介物質、サイトカインおよび成長因子の放出の
結果である疼痛感受性増大または痛覚過敏を特徴とする。ＮＧＦは、後根神経節
（ＤＲＧ）の侵害受容性感覚ニューロンのサブグループのＴｒｋＡ受容体に及ぼ
すその作用を通して疼痛媒介における中枢的役割を演じると思われる。成人では
、これはＤＲＧ細胞の約40％を構成する。これらのニューロンは、ペプチドサブ
スタンスＰおよびカルシトニン遺伝子関連ペプチド（ＣＧＲＰ）も発現する。Ｔ
ｒｋＡ受容体に及ぼすＮＧＦの作用により、これらの感覚ニューロン中の神経ペ
プチドレベルの増大が生じる。さらに、これらのニューロンが興奮性において増
大されるように、ナトリウムおよびカルシウムチャンネルが影響される。これら
の作用は疼痛レベルの上昇を生じ得る。したがって、ＮＧＦ隔絶剤、例えばＴｒ
ｋＡ細胞外ドメインは、可能性として、これらの疼痛レベルを低減するために用
いられ得る。
【０００５】 連続的ＮＧＦ上向き調節(upregulation)の条件下では、慢性炎症は持続性疼痛
状態を導き得る。ＮＧＦの外因性投与またはその上向き調節を包含する慢性炎症
の種々のモデルがある。このようなモデルの一つ（Woolf, C.J. et al., Britis
h Journal Of Pharmacology,（1997）, Vol. 121, No.3, 417-424）は、成体ラ
ットにおける完全フロイントアジュバントの足底内注入により誘導されるもので
ある。これは、ＴＮＦβ、ＩＬ−１βおよびＮＧＦのレベル増大を伴う後足の限
局性炎症を生じる。ＴＮＦα注入は、抗ＮＧＦ抗血清の前投与により減衰される
熱および機械的感受性の増大を生じると報告されている。カラゲナン投与は、他
のニューロトロフィン、例えばＮＴ−３およびＢＤＮＦに関しては観察されない
ＮＧＦｍＲＮＡレベルの特異的増大（500％までの）を引き起こすことが知られ
ている。
【０００６】 慢性炎症状態では、一貫して増大したレベルのＮＧＦの作用は長期能力障害性
疼痛状態を生じ得る。この例は、ＮＧＦレベルの増大が生検で見出された膀胱炎
のいくつかの形態であり得る（Lowe, E.M., et al., British Journal Of Urolo
gy, （1997）, Vol. 79, No.4, 572-577）。刺激性化学物質の投与により誘導さ
れるヒト慢性膀胱炎のラットモデルは、これもＮＧＦ隔絶により、すなわちＴｒ
ｋＡ免疫付着因子(immunoadhesin)の投与により治療され得る（Drnitrieva, N.
et al., Neuroscience, （1997）, Vol.78, No.2, 449-459）。ＮＧＦ隔絶分子
による全身治療は、確立された炎症変化を、約30〜60％だけ、部分的に及び有意
に逆転し得た。正常ラットの膀胱の管腔中への外因性ＮＧＦの投与も、実験的炎
症で観察されたのと同様の急速且つ顕著な膀胱反射亢進を生じることが示されて
いる。ＮＧＦレベルの慢性的増大は、侵害受容器の末梢性感作および後角ニュー
ロンの中枢性感作、ならびに長期感覚ニューロン異常をさえ引き起こし得るとい
うことも考えられる（McMahon, S.B., Series B-Biological Sciences, （1996
）, Vol.351, No.1338, 431-440）。
【０００７】 関節炎滑液中では、高レベルのＮＧＦが観察されている。トランスジェニック
関節炎マウスもＮＧＦのレベル上昇およびマスト細胞数の増大を有することが示
されている（Aloe, L. et al. International Journal Of Tissue Reactions-Ex
perimental And Clinical Aspects,（1993）, Vol.15, No.4, 139-143）。関節
炎トランスジェニックマウスに注入された精製ＮＧＦ抗体は、マスト細胞数の低
減、および滑膜内のヒスタミンおよびサブスタンスＰレベルの低減を引き起こす
（Aloe, L. et al. Rheumatology International,（1995）, Vol.14, No.6, 249
-252）。
【０００８】 帯状ヘルペス疾患に関連したヘルペス後神経痛（ＰＨＮ）は、ＮＧＦタンパク
質の上向き調節が関与し得る、ということも考えられる。水痘−帯状疱疹ウイル
ス（ＶＺＶ）は、２つのヒト疾患、即ち小児期の水疱瘡（水痘）および帯状ヘル
ペスに関与するαヘルペスウイルスである。ウイルスは後根神経節中に潜伏的に
残存し、後年、加齢に伴って起こる免疫機能の低下を利用して、再出し得る。再
活性化は、帯状ヘルペスとして一般に知られている帯状疱疹を引き起こす。帯状
疱疹の発生数は、年齢とともに増大する。罹患皮膚知覚帯の疼痛、異痛および感
覚喪失は、疾患の中心的症状発現である。重度の疼痛は、帯状疱疹患者の急性お
よび慢性病的状態の主因である。慢性のそしてしばしば消耗性の疼痛ＰＨＮは、
帯状疱疹の最も一般的な合併症である。帯状ヘルペスを罹ったことのある高齢患
者の50％までが、ＰＨＮを発症し得る。全身に適切に投与された抗ウイルス薬は
、急性帯状ヘルペスの疼痛を大いに軽減し、抗うつ薬も有用であり得る。しかし
ながら、従来の鎮痛薬は、２〜３の患者においては、オピオイド、特にメタドン
を用いて、多少の軽減が観察されたが、一般にほとんど有用でない。抗ＮＧＦ治
療の効力の検査に伴う困難は、帯状ヘルペスに関するモデルがラットでは得られ
ず、ネコモデルが存在するだけであることである。しかしながら、ＮＧＦレベル
の低減能および関連疼痛の軽減能を用いて、ヒト患者でこのような治療を調べる
ことができるかもしれない。
【０００９】 慢性炎症症状は広範囲に及んでいるが、現在の療法は厳しく限定される。例え
ば、米国内では、関節炎には3790万人、間質性膀胱炎には450,000人の人々が罹
患していると推算される。慢性関節リウマチの研究では、大多数が鎮痛剤を服用
していたという事実にもかかわらず、患者の80％以上が重度疼痛を有した。同様
に、疼痛性膀胱症状を特徴とする間質性膀胱炎のための有効な療法はない。
【００１０】 ＮＧＦは、末梢および中枢神経系の発生および維持に関与するニューロトロフ
ィンファミリーの１つである。ＮＧＦは、種々の供給源から、特に雄マウス唾液
腺から単離され得る。それは、先ず、β−ＮＧＦとγ−ＮＧＦの複合体であり、
その沈降係数で命名された７５ＮＧＦとして単離され得る。2.5Ｓ ＮＧＦはこれ
から得られる。2.5Ｓ ＮＧＦは、複合体の神経栄養的生物学的活性に関与するこ
とが知られている。2.5Ｓ ＮＧＦはβＮＧＦであるが、しかししばしば、アミノ
およびカルボキシ末端で部分的にタンパク質分解される。他のメンバーとしては
、例えばＢＤＮＦ、ＮＴ−３およびＮＴ−４が挙げられる。ニューロトロフィン
はすべて、共通の受容体p75NGFRと結合する。各々は、同ファミリーのチロシン
キナーゼ受容体の１つとも結合する。ＮＧＦはＴｒｋＡと結合し、そしてＢＤＮ
ＦおよびＮＴ−４はＴｒｋＢと結合し、そしてＮＴ−３はＴｒｋＣと結合する。
ＮＴ−３は、低親和性でＴｒｋＡおよびＴｒｋＢとも結合し得る。
【００１１】 ＴｒｋＡ細胞外ドメインの三次元構造は明らかでないが、しかし配列の異なる
構造モチーフが特性評価されている（図１Ａ）。Ｔｒｋ細胞外ドメインは、３つ
のタンデムロイシンリッチモチーフ（ＬＲＭ）を包含し、それらは２つのシステ
インクラスター領域、続いて２つの免疫グロブリン様（Ｉｇ様）ドメインと側面
を接する。神経細胞付着分子および血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）受容体との
配列相同性を基礎にして、Ｉｇ様ドメインは従来、免疫グロブリンスーパーファ
ミリー（ＩｇＳＦ）のＣ２クラスに属すると分類されてきた（Williams, AF, an
d Barclay AN（1998） Ann Rev Immunol 6, 381-405）。多数の研究が、ｐ７５
ＮＧＦＲおよびＴｒｋ受容体と相互作用するニューロトロフィン残基を明らかに
してきたが、しかし、ニューロトロフィンの結合に関与するＴｒｋ残基について
はほとんど知られていない。
【００１２】 近年、二つのグループが、Ｔｒｋ受容体のＩｇ様ドメインがニューロトロフィ
ンリガンドの結合および受容体活性化に重要な役割を演じることを示した。Pere
z P.等（Molecular and Cellular Neuroscience 6:97-105（1995））は、両方の
Ｉｇ様ドメインがＮＧＦのＴｒｋＡとの結合に重要である、と結論づけた。Urfe
r, R.等（EMBO J. 14 p2795-2805（1995））は、第２のＩｇ様サブドメインおよ
びプロリンリッチ領域、Ｉｇ２（図１Ａ）がＮＧＦ結合のための主要接点を提供
する、と結論した。
【００１３】 ＴｒｋＡの細胞外ドメインは375アミノ酸長である。本発明者らは、２つの免
疫グロブリン様ドメインおよびプロリンリッチ領域（アミノ酸160-375）のみを
含むタンパク質が完全細胞外ドメインの場合と同様の親和性でＮＧＦに結合し得
ることを最近示した（Holden P. H et al（1997） Nature Biotechnology 15:66
8-672）。この領域は、ここではＴｒｋＡＩｇ１，２と定義されている。意外な
ことに、ＴｒｋＡＩｇ２（アミノ酸253-375）と呼ばれるＴｒｋＡのより小さい
ドメインでさえ、完全細胞外ドメインまたはＴｒｋＡＩｇ１，２領域と同様の親
和性でＮＧＦに結合し得、したがってその結合特性に主に関与する、ということ
を本発明者らは見出した。
【００１４】 本発明者らは、組換えＩｇ様ドメインが高親和性でＮＧＦのようなニューロト
ロフィンと結合し、そしてin vitroおよびin vivoでＮＧＦの生物学的活性を阻
害し得る、ということを実証した。特に、アミノ酸253-375（図１Ａ）により定
義されるようなＴｒｋＡＩｇ２は、ＮＧＦ結合の主関与体である。本発明者らは
、分子モデリング技法を用いて、ＴｒｋＡＩｇ１およびＴｒｋＡＩｇ２ドメイン
をモデル化した。意外にも、ＴｒｋＩｇ２様サブドメイン２はＣ２クラスのもの
ではなく、ＶセットのＩｇ様ドメインのものであることが見出されている（図１
Ｂ）。
【００１５】 これにより、ＴｒｋＡＩｇ２およびそれから得られるポリペプチドに関するい
くつかの用途が生じる。ＴｒｋＡＩｇ２−ＮＧＦの共結晶からの構造データによ
り、ＮＧＦの結合に関与するＴｒｋＡ中の残基が同定される。これは、ニューロ
トロフィン、特にＮＧＦの模倣物の合理的設計(rational design)を可能にする
。固定化ＴｒｋＡＩｇ２は、ファージディスプレイライブラリー、ならびにコン
ビナトリアルケミストリーライブラリーおよび真菌抽出物のための標的として用
いられ得る。これは、ＴｒｋＡに結合し得る、したがって受容体において作動薬
または拮抗薬として作用し得る分子の選択を可能にする。ＴｒｋＡＩｇ２の第三
の用途は、多数の慢性疼痛状態の治療薬としてのものである。ＮＧＦは、末梢感
覚ニューロンに特に重要であり、証拠は、ＮＧＦが、傷害受容性主要求心神経上
の受容体との相互作用によりいくつかの持続性疼痛状態の媒介物質として作用し
得ること、そして末梢的作用ＮＧＦ拮抗薬はいくつかの慢性疼痛状態、例えば、
慢性関節リウマチ、間質性膀胱炎および帯状ヘルペスを治療する場合に用途を有
し得ることを示唆する。
【００１６】 本発明の第一の要旨は、図４（Ｂ）の残基２２〜１１９のアミノ酸配列、また
は図４（Ｂ）のアミノ酸配列の一部を含み、ニューロトロフィンに結合するポリ
ペプチドである。好ましくは、ポリペプチドは、図４（Ｂ）の残基２２〜１４４
の全配列から成る。ポリペプチドは、ＴｒｋＡＩｇ１，２またはその一部であり
得る。このようなポリペプチドは、化学的または生物学的手段により生成され得
る。
【００１７】 天然ＴｒｋＡの全コード配列は除外される。
【００１８】 ポリペプチドは、動物細胞に由来してもよい。さらに好ましくは、ポリペプチ
ドは、哺乳類細胞から選択され、特に、ヒト細胞から選択され得る。あるいは、
ポリペプチドは、鳥類細胞、例えばニワトリ細胞、または爬虫類または両生類ま
たは魚類または昆虫から選択され得る。
【００１９】 好ましくは、ニューロトロフィンはＮＧＦ、ＮＴ−３、または、ｐ７５ＮＧＦ
Ｒと結合するニューロトロフィンである。このようなニューロトロフィンは、単
量体、二量体、三量体またはヘテロ二量体形態で存在し、そして哺乳類、例えば
ヒト由来のものであり得る。
【００２０】 本発明の第二の要旨は、本発明の第一の要旨のポリペプチドをコードするＤＮ
Ａ配列、または遺伝暗号の縮重によるこのようなＤＮＡ配列の変異体、または本
発明の第一の要旨のポリペプチドをコードするその挿入または欠失突然変異体、
および、このようなＤＮＡ配列とハイブリダイズするＤＮＡ配列である。このＤ
ＮＡ配列は、プラスミドまたはその他のベクター、例えばpET15bに挿入され得る
。
【００２１】 本発明の別の要旨は、本発明の第一の要旨のポリペプチドを、少なくとも１つ
のニューロトロフィンまたはニューロトロフィンサブユニット、例えばＮＧＦま
たはＮＴ−３と組合せて含む複合体である。
【００２２】 本発明のさらに別の要旨は、本発明の第一の要旨のポリペプチドの製造方法で
あって、本発明の第二の要旨のＤＮＡ配列を適切な宿主中に導入して、その宿主
を培養し、それによりＴｒｋＡＩｇ２が発現されることを含む方法である。適切
な宿主は、動物細胞、例えば細菌細胞、昆虫細胞および哺乳類細胞、特にヒト細
胞から選択され得る。
【００２３】 さらに、ＴｒｋＡＩｇ２は、本発明の第一の要旨のポリペプチドを用いる、Ｔ
ｒｋＡ受容体と結合する分子に関する高スループットスクリーンのための標的と
して便利に用いられ得る。このような方法は、ファージまたはペプチドディスプ
レイライブラリー、コンビナトリアルケミストリーライブラリーおよび真菌抽出
物、ならびにＥＬＩＳＡ技法の使用を包含し得る。
【００２４】 本発明のさらに別の要旨は、ＴｒｋＡＩｇ１の少なくとも一部との推定リガン
ドの結合と、ＴｒｋＡＩｇ２の少なくとも一部とのそれの結合との比較を包含す
る。このような方法は、ＴｒｋＡＩｇ２の少なくとも１つの溶媒曝露ループ、例
えば図１（Ｂ）に示されているようなＥ〜ＦループまたはＣ”〜Ｄループと結合
する分子を選択することを包含し得る。選択される分子は、その天然状態で本発
明の第一の要旨のポリペプチドまたはＴｒｋＡの少なくとも一部の、ニューロト
ロフィンとの結合を増強し得る
【００２５】 本発明のさらに別の要旨は、本発明の第一の要旨のポリペプチドとのそれらの
結合親和性を用いる、化合物を生成しそして化合物をスクリーニングすることを
含むコンビナトリアルケミストリー法である。
【００２６】 本発明のさらに別の要旨は、本発明の第一の要旨のポリペプチド、特にＴｒＫ
ＡＩｇ２に対する抗体を包含する。
【００２７】 本発明のさらに別の要旨は、プラスミド上に保有される本発明の第一の要旨の
ポリペプチドを含有する宿主細胞を包含する。このような宿主細胞は、哺乳類（
ヒトを含む）、細菌、昆虫、酵母、鳥類、両生類、魚類または爬虫類であり得る
。
【００２８】 本発明のさらに別の要旨は、本発明の第一の要旨のポリペプチドの一部を含有
する診断プローブを包含する。プローブは、蛍光タッグまたは放射能標識で標識
され得る。
【００２９】 本発明のさらに別の要旨は、特にニューロトロフィンレベルの増大の検出に際
して本発明の第一の要旨のポリペプチドを用いる診断試験、検定またはモニタリ
ング方法を包含する。
【００３０】 本発明のさらに別の要旨は、本発明の第一の要旨のポリペプチドを発現するよ
う操作されている生物を包含する。
【００３１】 本発明のさらに別の要旨は、ニューロトロフィンポリペプチドレベルの増大に
関連した疼痛を有する患者の治療方法であって、本発明の第一の要旨のポリペプ
チド、または前記のようなスクリーニング手法により単離または同定されるＮＧ
Ｆ類似体を含む医薬組成物を患者に供給することを含む方法を包含する。
【００３２】 疼痛は、ＩＳＵ、間質性膀胱炎、関節炎、帯状ヘルペス、末梢性炎症、慢性炎
症またはヘルペス後神経痛の徴候であり得る。
【００３３】 本発明のさらに別の要旨は、アルツハイマー病の患者の治療方法であって、本
発明の第一の要旨のポリペプチドを含有する医薬組成物、または本発明の第一の
要旨のポリペプチドを用いるスクリーニング手法により単離または同定されたニ
ューロトロフィン類似体を含有する組成物を患者に供給することを含む方法を包
含する。
【００３４】 本発明の第一の要旨のポリペプチドを含有する組成物は、患者の遊離ＮＧＦレ
ベルを低減するために用いられ得る。
【００３５】 ニューロトロフィンに対する前記の言及はすべて、ＮＧＦおよびＮＴ−３を包
含する。
【００３６】 本発明のさらに別の要旨は、図２１に示した座標を有する相同モデル、このよ
うな相同モデルが保存された機械読み取り可能データ保存媒体、およびこのよう
な相同モデルを用いてプログラムされ、それを提供するよう準備されたコンピュ
ーターを含む。
【００３７】 本発明のさらに別の要旨は、結晶ＴｒｋＡＩｇ２である。
【００３８】 本発明のさらに別の要旨は、前記のようなコンピューターを用いる、または前
記のような機械読み取り可能データ保存媒体を用いる、前記のような方法により
得られる化合物である。
【００３９】 本発明のさらに別の要旨は、本発明の第一の要旨のポリペプチド、特にＴｒｋ
ＡＩｇ２ポリペプチドを包含する結晶を含む。
【実施例】
【００４０】 ＴｒｋＡの細胞外ドメインの構造予測およびＩｇ様ドメインのモデリング： プレディクトプロテイン(PredictProtein)を用いたＩｇ様領域の二次構造分析
（Rost B. and Sander C.（1993）PNAS 90:7553-7562; Rost B. and Sander C.
（1993）J. Mol. Biol. 232:584-599; Rost B. and Sander C.（1994）Proteins
19:55-72）は、β鎖の定義される範囲を示した。第一Ｉｇ様ドメインＴｒｋＡ
Ｉｇ１は、ＴｒｋＡの成熟細胞外ドメイン中の残基１６０〜２５２（図１Ａ）か
ら成り、一方第二Ｉｇ様サブドメインは残基２５３〜３４９（図１Ａ）から成る
。残基３４９〜３７５のプロリンリッチ領域も存在する（図１Ａ）。
【００４１】 ＴｒｋＡＩｇ１に関しては、モデルが築造され得る２つの既知のタンパク質（
親）は相同体であると同定された。これらは、２ＮＣＭ（マウスＮＣＡＭのドメ
イン１）および１ＶＣＡ（ヒト脈管細胞接着分子のドメイン１）である。両ドメ
インは、ＩセットＩｇドメインであり、標的配列とそれぞれ32％および29％の配
列同一性を有する。２ＮＣＭは、１ＶＣＡ中に見出されるより小さいループが用
いられる場合の残基３８〜５０連結β鎖Ｃ〜Ｄの他に、モデルの基礎となるのに
最も適切な親として同定された（図１Ｂ）。
【００４２】 ＴｒｋＡＩｇ２に関しては、モデルが築造され得る２つの親は相同体であると
同定された。これらは、１ＴＮＭ（タイチンモジュールＭ５）および１ＨＮＧ（
ＣＤ２ドメイン１）である。相同体は、21％および14％の配列同一性でかなり遠
く関連し、それぞれＩｇセットＩファミリーおよびＶセットファミリーに属する
。しかしながら、Ｉｇ折り畳みのある種の重要な特徴、例えばジスルフィド架橋
およびＣ鎖中のTrpを含むことが同定され得る。これは、両相同体がジスルフィ
ド結合を欠くため、意外である。これらの相同体は、異なる領域でより高い配列
同一性を示し、それゆえ、主鋳型として１ＴＮＭを用いてキメラモデルが築造さ
れ、１ＨＮＧは残基３９〜５９（図１Ｂ）を作るために用いられた。座標データ
は図２１に示されている。
【００４３】 配列アラインメント中のわずかな手動介入後に、本発明者らは、あるシート中
の鎖（ＡＢＤＥ）および別のシートの鎖（Ａ'ＣＦＧ）を有する８つのβ鎖を含
有するモデルを説明した。ともにそれらはＴｒｋＡＩｇ１に関するβサンドイッ
チを形成する。ＴｒｋＡＩｇ２に関しては、Ａ'鎖は存在せず、β鎖（ＡＢＤＥ
）および（ＧＦＣ'Ｃ煤jにより構成されるβサンドイッチを有する２つの特別の
鎖Ｃ'およびＣ狽ェ予測される。ドメイン１に関しては、配列は、２ＮＣＭに見出
されるのと同一位置にβサンドイッチを隔てたＢおよびＦ鎖間のジスルフィドを
写した。このジスルフィドは残基２３〜７１間の１ＶＣＡジスルフィド上にも重
なった。逆に、ドメイン２に関しては、ジスルフィドは、２つの隣接β鎖、Ｂお
よびＥを架橋する分子の表面で予測され、第二Ｃｙｓは１ＴＮＭ中にＳｅｒとと
もに整列する。このジスルフィド結合配列は、Urfer等（Urfer, R., Tsoulfas,
P., O'Connell, L., Hongo, J.A., Zhao, W. and Presta, L.G.（1998）, J. Bi
ol. Chem. ; Urfer et al.（上記）273:5829-5840）が予測した、１ＶＣＡドメ
イン１に関してモデル化したモデルと類似するが、しかし我々のＴｒｋＡＩｇ２
モデルはＶセットの９つのβシートを予測し、Ｉセット配列中の７つのβシート
を有するモデルと対照を成す。モデル化構造は図１Ｂに示されており、座標デー
タはデータ１に示されている。
【００４４】 ＴｒｋＡＩｇ２に関してここに築造された構造モデルに関しては、モデル構築
に用いられた親である、タイチンモジュールＭ５（１ｔｎｍ）およびＣＤ２ドメ
イン１（１ｈｎｇ）は、遠い相同性がある高感度配列探索法により同定された（
Barton, G.J.（1993）Comput. Appl. Biosci. 9:729-734; Henikoff, S. and He
nikoff, J.G. 1991, Nucleic Acids Research 19:6565-6572）。Urfer等（Urfer
, R., Tsoulfas, P., O'Connell, L., Hongo, J.A., Zhao, W. and Presta, L.G
.（1998）, J. B. C. 273:5829-5840）によりＴｒｋＡＩｇ２をモデル築造する
ために用いられたＶＣＡＭドメイン１は、配列では有意に関連しないが、しかし
ながら、Ｉｇ折り畳みであるという点では同種である。タイチンおよびＶＣＡＭ
（ともにＩセットドメイン）に関しては、ＴｒｋＡＩｇ２配列は、ＣおよびＤ鎖
間に有意の挿入物（〜１０残基）を有する。この挿入物を含む位置３９〜５９に
対応する領域は、他のＩｇドメインより有意のＣＤ２ドメインとの相同を有する
。さらに、この領域中のＴｒｋＡＩｇ２の予測二次構造（Rost B. and Sander C
.（1993）PNAS 90:7553-7562）は、ＣＤ２構造と合致して、２つの特別の鎖（Ｃ
‘およびＣ“）の存在に対応する。これは、 Urfer等（Urfer, R., Tsoulfas, P
., O'Connell, L., Hongo, J.A., Zhao, W. and Presta, L.G.（1998）, J. B.
C. 273:5829-5840）により提唱されたＩセットドメインと対照したものとして予
測Ｖセットドメインを予想する。
【００４５】 ＮＧＦを結合する場合の鍵となる残基の重要性は、我々のモデルを、そしてUr
fer等（Urfer, R., Tsoulfas, P., O'Connell, L., Hongo, J.A., Zhao, W. and
Presta, L.G.（1998）, J. Biol. Chem. 273:5829-5840）による広範な突然変
異分析を参照することにより理解され得る。ＴｒｋＡＩｇ中の最も重要な結合決
定因子は、単一突然変異Ｔ３１９Ａ、Ｈ３２０ＡおよびＮ３２３Ａにより結合の
100倍以上の低減を示すループ連結鎖ＥおよびＦ（ＥＦループ）に生じる。我々
の構造モデルを参照すると、３つの残基はすべて、ＥＦループの先端付近の溶媒
曝露位置にある、ということが示される。結合親和性の損失の重要でない関与物
も、突然変異Ｈ２５８Ａ、Ｖ２６１Ｅ、Ｍ２６３ＡおよびＨ２６４Ａにより、Ａ
Ｂ−ループに空間的に隣接して生じる。最初の３つの残基位置は、このループの
表面の溶媒曝露位置にある。他の２つの突然変異のみが結合親和性の50倍以上の
低減を示し、これらはＰ２６９ＥおよびＨ３１０Ａである。これら２つの残基は
、我々のモデルでは互いに空間的に隣接し、ＢおよびＥ鎖を連結するジスルフィ
ド架橋（Ｃ２６７〜Ｃ３１２）に極めて近接する。 Urfer等（Urfer, R., Tsoul
fas, P., O'Connell, L., Hongo, J.A., Zhao, W. and Presta, L.G.（1998）,
J. Biol. Chem. 273:5829-5840）により示唆されているように、これらの残基が
ＮＧＦを結合する場合に直接的役割を演じる、ということはあり得る。しかしな
がら、それに代わる説明は、ジスルフィド架橋の構造的完全性を保持する場合の
それらの重要性であり得る。基準Ｉｇドメインの保存コアジスルフィド結合とは
異なり、溶媒曝露ジスルフィド架橋はドメインの構造の安定化には重要ではない
が、しかしながら、ＢおよびＥ鎖間の共有結合は、結合に際してＡＢおよびＥＦ
ループの立体配座を保持するのに重要であり得る。実際、突然変異Ｃ２６７Ａま
たはＣ３１２Ａによるジスルフィドの損失は、結合の10〜30倍の低減を生じ、結
合メカニズムにおけるジスルフィド架橋の重要性を強調する。
【００４６】 プロリンリッチドメイン中に６つのアミノ酸挿入物（アミノ酸位置２２４〜２
２５（図３））ＶＳＦＳＰＶを含有するＴｒｋＡの代替的スプライス化形態はＮ
Ｔ３に対する高親和性を示し、したがって、リガンド結合に重要であり得る（Cl
ary, D.O. & Reichardt L.F.（1994）PAISA 91:11133-11137）。この配列はラッ
トＴｒｋＡ配列中にも見出され、同様の配列はニワトリＴｒｋＡに見出される。
ＴｒｋＢ配列のすべてにも極性残基の類似物が存在する（Allen S.J.et al.（19
94）Neuroscience 60:825-834）。したがって、この領域はニューロトロフィン
の結合に、または受容体の特異性に関与し得ると思われる。
【００４７】 ＴｒｋＡＩｇ１，２領域は一般に、アミノ酸１６０〜２５２を含有するＴｒｋ
ＡＩｇ１またはＴｒｋＡＩｇ様サブドメイン１と、そしてアミノ酸２５３〜３４
９としてＴｒｋＡＩｇ様サブドメイン２と、アミノ酸１６０〜３７５を包含する
ＴｒｋＡの成熟細胞外ドメイン（図１Ａ）であると考えられる。ＴｒｋＡＩｇ２
は、ここでは、アミノ酸２５３〜３７５プロリンリッチ領域を包含する。すべて
の場合に、ＴｒｋＡの変異体および前記のようなそのサブドメインの使用は、本
発明に包含される。
【００４８】 代替的スプライス化変異体からの挿入物を有するＴｒｋＡＩｇ２の構築： 代替的スプライス化変異体からの挿入物を有するＴｒｋＡＩｇ２を、ＰＣＲ突
然変異誘発により作製した。変異誘発は２段階により行われた。代替的スプライ
ス化形態のＴｒｋＡの配列をコードする重複が存在しないように、先ず、５‘お
よび３’断片を増幅した。第二段階では、重複配列および２つのフランキングプ
ライマーを用いて、５‘および３’断片のＰＣＲ生成物を一緒にスプライスした
。第１回目のＰＣＲは、５‘−断片を生成するためのオリゴ66816（ATCATATGCC
GGCCAGTGTG CAGCT）およびオリゴ49234（CCACTGGCGA GAAGGAGACA GGGATGGGGT CC
TCGGGG）、ならびに３’−断片を生成するためのオリゴ49233（GTCTCCTTCT CGCC
AGTGGA CACTAACAGC ACATCTGG）およびＴ７ターミネータープライマー（GCTAGTTA
TTGCTCAGCGG）を包含した。次に生成物を精製し、オリゴ66816およびＴ７ターミ
ネータープライマーを用いる第２回目のＰＣＲのための標的として用いた。第２
回ＰＣＲからのＰＣＲ生成物を次にｐＥＴ１５ｂ中にクローン化し、ＴｒｋＡＩ
ｇ２と同じ方法で発現させた。
【００４９】 ＴｒｋＡＩｇ１，２のサブクローニング 二次構造予測データから、ＴｒｋＡの細胞外ドメインのアミノ酸１６０〜３７
５（図１Ａ）をコードするＤＮＡをサブクローニングすることが決定された。Ｔ
ｒｋＡＩｇ１，２挿入物が発現ベクターｐＥＴ１５ｂ（Novagen）のポリヒスチ
ジンタッグおよび翻訳を終結するための２つの終止コドンとともにインフレーム
となるために適切な制限部位を提供し得るオリゴヌクレオチドプライマー（1069
2および10693）を設計した。ｐＥＴ１５ｂのマップ、およびオリゴヌクレオチド
プライマーの配列を図２に示す。
【００５０】 次にＰＣＲによる増幅を、プライマーオリゴ10692およびオリゴ10693（Cruach
em Ltd）ならびに標的として全長ヒトＴｒｋＡ ｃＤＮＡクローン（David Kapl
an氏（Monteal Neurological Institute, Canada）の寄贈による）を用いて実行
した。次にＰＣＲ生成物をプラスミドｐＣＲＩＩ（Invitrogen）に連結して、ｐ
ＣＲＩＩ−ＴｒｋＡＩｇ１，２を得た。次にｐＣＲＩＩ−ＴｒｋＡＩｇ１，２を
ＸｈｏＩで消化して、フェノール抽出により低融点アガロースゲルから挿入物を
精製し、ＸｈｏＩで消化し、ウシ腸アルカリ性ホスファターゼ（ＣＩＡＰ）を用
いて脱リン酸化することにより予め調製しておいたｐＥＴ１５ｂ（Novagen）に
連結した。大腸菌ＸＬ１Blue（Stratagene）中で形質転換後、ｐＥＴ１５ｂおよ
びオリゴ10693とアニーリングするＴ７プロモータープライマーを用いてＰＣＲ
により形質転換株をスクリーニングした。この方法で、Ｔ７プロモーターからの
発現のための正しい配向のＴｒｋＡＩｇ１，２挿入物を有するクローンを同定し
た。その結果生じたクローンｐＥＴ１５ｂ−ＴｒｋＡＩｇ１，２を、Ｔ７プロモ
ータープライマーおよびＴ７ターミネータープライマーからシーケンシングして
、挿入物がＸｈｏＩ部位でｐＥＴ１５ｂと連結していたことを確認した。ｐＥＴ
１５ｂ−ＴｒｋＡＩｇ１，２の挿入物のＤＮＡ配列ならびにそれより導きだされ
たアミノ酸配列を、図３に太字で示す（アミノ酸２４〜２３９、ヌクレオチド７
１〜７１８）。酵素および酵素緩衝液は、Boerhingerから入手した。
【００５１】 ＴｒｋＡＩｇ１のサブクローニング： ＰＣＲ生成物がポリヒスチジンタッグを有するｐＥＴ１５ｂインフレームのＸ
ｈｏＩ部位に連結され得るよう、ＴｒｋＡＩｇ１，２のための左プライマーを用
いてＴｒｋＡＩｇ１ドメインの増幅を可能にするオリゴヌクレオチドプライマー
を設計した。
【００５２】 オリゴ36770 ＴｒｋＡＩｇ１のための右プライマー； cgctcgag tta tca GAAGGAGACGTTGACC ＸｈｏＩ 終止コドン 終止コドン
【００５３】 次にＰＣＲによる増幅を、オリゴ10692およびオリゴ36770を、標的としてのｐ
ＥＴ１５ｂ−ＴｒｋＡＩｇ１，２とともに用いて実行した。次にＰＣＲ生成物を
ｐＣＲＩＩ（Invitrogen）に連結して、ｐＣＲＩＩ−ＴｒｋＡＩｇ１を生じ、こ
れを次にＸｈｏＩで消化し、低融点アガロースゲル電気泳動処理を施した。次に
、挿入物を精製し、予めＸｈｏＩで消化し、ＣＩＡＰで処理しておいたｐＥＴ１
５ｂに連結した。大腸菌ＸＬ１中で形質転換後、オリゴ10692およびＴ７ターミ
ネータープライマーを用いてＰＣＲにより形質転換株をスクリーニングした。そ
の結果生じたクローンｐＥＴ１５ｂ−ＴｒｋＡＩｇ１を次にシーケンシングして
、ｐＥＴ１５ｂのポリヒスチジンタッグを有するＴｒｋＡＩｇ１の読み取り枠が
インフレームであることを確認した。図４ａは、ＴｒｋＡＩｇ１のヌクレオチド
配列（残基７１〜３４９）および推定アミノ酸配列（残基２４〜１１６）を、太
字で示す。
【００５４】 ＴｒｋＡＩｇ２のサブクローニング： ｐＥＴ１５ｂ−ＴｒｋＡＩｇ１，２のＴ７ターミネータープライマーを用いて
ＴｒｋＡＩｇ２ドメインの増幅を可能にするオリゴヌクレオチドプライマーを設
計した。
【００５５】 オリゴ66816 ＴｒｋＡＩｇ２のための左プライマー； atcatatgCC GGCCAGTGTG CAGCT ＮｄｅＩ
【００５６】 次にＰＣＲによる増幅を、オリゴ66816およびＴ７ターミネータープライマー
を、鋳型ＤＮＡとしてのｐＥＴ１５ｂ−ＴｒｋＡＩｇ１，２とともに用いて実行
した。次にＰＣＲ生成物をＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩで消化し、予め同一酵素で
消化し、ＣＩＡＰで処理して調製しておいたｐＥＴ１５ｂに連結した。Ｔ７プロ
モータープライマーおよびオリゴ10693を用いてＰＣＲにより形質転換株をスク
リーニングし、陽性クローンをシーケンシングした。図４ｂは、ＴｒｋＡＩｇ２
のヌクレオチド配列（残基６５〜４３３）およびそれより導きだされたアミノ酸
配列（残基２２〜１４４）を、太字で示す。
【００５７】 ＴｒｋＡＤＮＡ配列とのハイブリダイゼーション ＴｒｋＡＩｇ１，２またはＴｒｋＡＩｇ２をコードするＤＮＡ（図３および４
Ｂの配列）は、ハイブリダイゼーション検定のために用いられ得る。 ＴｒｋＡ
Ｉｇ１，２またはＴｒｋＡＩｇ２をコードするＤＮＡ配列、あるいはこのような
配列の一部は、ゲノムＤＮＡの逆転写酵素ＰＣＲにより、または直接的にＴｒｋ
Ａに関するｃＤＮＡからのＰＣＲまたは制限酵素消化により得られ得る。Ｔｒｋ
ＡＩｇ１，２またはＴｒｋＡＩｇ２をコードするＤＮＡまたはこのような配列の
一部と相補的なＤＮＡまたはＲＮＡ、あるいは、組成は類似しているがしかし配
列の縮重を含有する配列は、前記で調製されたＤＮＡとハイブリダイゼーション
し得る。このような配列は、本明細書中ではプローブと呼ばれる。通常は、相補
的ＤＮＡまたはＲＮＡは放射性または非放射性物質により標識される。
【００５８】 この一例は、放射能標識化ｃＤＮＡプローブを用いたＴｒｋＡＩｇ２のノーザ
ン分析である。ｃＤＮＡプローブは、32Ｐ−ｄＡＴＰ（6000Ci/mmol; Dupont NE
N）で無作為プライム化される（Stratagene, CA）。次に、プローブはNuctrapカ
ラム（Stratagene）を用いて精製されて、2 x 106 cpm/ngの領域の特異的活性を
生じる。ＴｒｋＡを発現するチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）を次に
ウルトラスペック（Ultraspec（商品名））（Biotecx, Houston Texas）中で均
質化し、総ＲＮＡを抽出した。ＲＮＡを１％変性アガロースゲル上に載せ、電気
泳動により分離した後、ハイボンドＮ（Hybond N）（Amersham, Cardiff, UK）
上で一晩ブロッティングさせて、80℃で２時間焼き固めた。ハイブリダイゼーシ
ョンオーブン中で、ハイブリダイゼーション緩衝液（６ＳＳＣ、５ｘDenhardts
、0.5％ＳＤＳおよび0.002％酸切断サケ精子ＤＮＡ）中で回転させることにより
、これらのハイボンドＮフィルターを、65℃で４時間、予備ハイブリダイズした
。次に、プローブを100℃で５分間変性させた後、新鮮なハイブリダイゼーショ
ン溶液に付加した。次に、高ストリジェントのこれらの条件下で、65℃で一晩、
フィルターをハイブリダイズさせた。は、プローブの縮重または標的の相同性に
より変わり得る。低温、例えば50℃、および高塩濃度、例えば20 x 55Ｃは、よ
り低ストリジェントを可能にする。ホルムアミドの存在は核酸結合の親和性を低
減し、ストリジェントの変化を可能にする。このような方策は、詳しく説明され
ている（例えば、Nucleic acid hybridisation, a practical approach edited
by Hames and Higgins, IRL Press 1988 ）。翌日、フィルターを2ｘＳＳＣ／0.
5％ＳＤＳ中で洗浄し、２ｘＳＳＣ／0.5％ＳＤＳを含有するHybaid中で65℃で30
分間、２回洗浄する。次にフィルターを乾燥させて、-70℃で一晩、ハイパーフ
ィルムHyperfilm（Hyperfilm MP, Amersham）に露出させ、翌日現像する。Ｔｒ
ｋＡＩｇ２配列をコードするＲＮＡと結合していたＤＮＡプローブは、オートラ
ジオグラフフィルムの露出黒色域として可視化される。
【００５９】 これのさらに別の例は、ＴｒｋＡＩｇ１，２またはＴｒｋＡＩｇ２、あるいは
発現ライブラリー中の同様の配列の発現の検出である。λＧＴ１０ヒト脳ｃＤＮ
Ａライブラリー（M Goedert, Cambridge）を用いて、大腸菌c600細胞を感染させ
る。これらを24cm x 24cm寒天プレート上でプレート化し、10,000pfu／プレート
を得る。次に、寒天プレート上にナイロン膜ハイボンドＮ（Amersham, Cardiff,
UK）を１分間載せることにより、プラークリフトを実行する。次にフィルター
を変性溶液（1.5N ＮａＣｌ、0.5N ＮａＯＨ）上に30秒間、ＤＮＡ側を上に、
置いた後、２分間浸漬させる。次にフィルターを中和液（1.5NＮａＣｌ、0.5N
トリス−ＨＣｌ、ｐＨ8.0）中に５分間浸漬させる。新鮮な中和溶液中で浸漬を
反復させる。次に、２ｘＳＳＣ（0.3NＮａＣｌ、0.03NＮａ3クエン酸塩、ｐＨ7.
0）中でフィルターを手短に濯ぎ、濾紙上に載せて、これを80℃で２時間焼き固
める。前記と同様にハイブリダイゼーションを実行する。ＴｒｋＡ配列をコード
するプラークと結合していたＤＮＡプローブの位置は、オートラジオグラフフィ
ルムの露出黒色域として可視化される。これらの露出黒色域をプレートに再整列
させて、ＴｒｋＡＩｇ１，２またはＴｒｋＡＩｇ２と同様の配列あるいはこのよ
うなＤＮＡ配列の一部を発現する陽性クローンを同定し得る。
【００６０】 ハイブリダイゼーションは、相同的ＰＣＲ法を用いても起こり得る。ＴｒｋＡ
Ｉｇ１，２に関する配列のある領域に対応する特定のまたは縮重オリゴヌクレオ
チドを用いて、例えば、「ＴｒｋＡＩｇ２のサブクローニング」の項に記載した
ように、配列の一部を増幅し得る。このようなハイブリダイゼーション検定は、
診断キット中のＴｒｋＡＩｇ１，２またはＴｒｋＡＩｇ２配列、あるいはそれら
の一部の存在を検出するための道具として用いられ得る。
【００６１】 ＴｒｋＡＩｇ１，２、ＴｒｋＡＩｇ１およびＴｒｋＡＩｇ２の発現： コンピテントＢＬ２１細胞（ＤＥ３）を前記のベクターで形質転換し、難しい
標的タンパク質に関するｐＥＴ（Novagen）マニュアルに記載された方法の変法
を用いて、発現を実行した。要するに、2 mlの２ＹＴブロス（200 mg/mlカルベ
ネシリン含有）にコロニーを接種して、37℃で増殖させて中間対数相にした。細
胞は遠心分離により集菌および２ＹＴに再懸濁せず（マニュアル通り）、５０ｍ
ｌの２ＹＴ（500mg/ml カルベマイシン含有）に直接接種され、37℃で増殖させ
て中間対数相にした。細胞は遠心分離により集菌および２ＹＴに再懸濁せず、５
リットルの２ＹＴ（500μg/mlアンピシリン含有）を感染させるために直接使用
した。ＯＤ600が１に達したときに、最終濃度を１mMとなるようにＩＰＴＧを付
加して細胞培養を誘導し、細胞を37℃で２時間増殖させた。図５は、種々のｐＥ
Ｔ１５ｂ−ＴｒｋＡＩｇ構築物を含有するＢＬ２１（ＤＥ３）の培養の抽出物の
15％ＳＤＳ ＰＡＧＥゲルを示す。細胞抽出物のさらなる分析は、全構築物に関
して、発現ＴｒｋＡＩｇタンパク質が不溶性であることを明示した。可溶性分画
中でＴｒｋＡＩｇタンパク質を発現させる、いくつかの試みを実行したが、うま
く行かなかった。しかしながら、ＴｒｋＡＩｇタンパク質が不溶性であるという
事実は、それらの精製を容易にした。
【００６２】 ＴｒｋＡＩｇ１，２の精製および再フォールディング： 収穫細胞を10％グリセロール中に再懸濁し、-70℃で凍結させて、ペレットをX
press（BioX, 12 ton psi）に３回通した。溶解細胞を20 mMトリス−ＨＣｌ（ｐ
Ｈ8.0）で洗浄し、すべての可溶性物質が除去されるまで、10,000 rpmで4℃で30
分間遠心分離して、不溶性タンパク質を含有する含有体を残留させた。精製含有
体を、約0.1 mg/mlタンパク質となるよう6 M尿素緩衝液（20 mMトリス−ＨＣｌ
、ｐＨ8.5、1 mMβ−メルカプトエタノール）中に溶解させ、１時間静かに振盪
しながら、氷上でインキュベートした。１回緩衝液を交換しながら、4℃で24時
間、400ｘ緩衝液（20 mMトリス−ＨＣｌ、100 mM ＮａＣｌ、ｐＨ8.5）に対して
透析することにより、再フォールディングを実行した。再フォールディング化Ｔ
ｒｋＡＩｇ１，２タンパク質を１ml Resource Q（Pharmacia）カラムに投入し、
20 mMトリス−ＨＣｌ中の０〜1 MＮａＣｌの直線勾配で、2mls/分で40 mlsに関
して溶離した。280 nm（ＵＶ検出器使用）で検出されたような主ピークを収集し
、His-bind樹脂（Novagen）の2.5 ml使い捨てカラムを用いて、Novagen Hisカラ
ム精製プロトコールにより、親和精製した。最後に、溶離タンパク質をResource
Qカラムに再添加して、イミダゾールを除去した。これを、20 mMトリス緩衝液
、ｐＨ8.0中の０〜１MＮａＣｌの10 ml塩勾配で溶離した。
【００６３】 ＴｒｋＡＩｇ１およびＴｒｋＡＩｇ２の精製： 収穫細胞を10％グリセロール中に再懸濁し、-70℃で凍結させて、ペレットをXpr
ess（BioX, 12 ton psi）に３回通した。次に抽出物を、10,000 rpmで4℃で30分
間遠心分離して、不溶性含有体をペレット化した。次に含有体を、50 mlの１％
（v/v）トリトンＸ−100、10 mMトリス−ＨＣｌ、ｐＨ8.0、1 mMＥＤＴＡ、その
後、50 mlの1 MＮａＣｌ、10 mMトリスＨＣｌ、ｐＨ8.0、1 mMＥＤＴＡ、最後に
10 mMトリス−ＨＣｌ、ｐＨ8.0、1 mMＥＤＴＡ中で洗浄した。次に含有体を、20
mMリン酸ナトリウム、30 mMイミダゾール、8 M尿素、ｐＨ7.4中に溶解させた。
次に、遠心分離により溶解含有体を透明にした後、5 ml HisTrapカラム（Pharma
cia）に投入した。５０ｍｌの20 mMリン酸ナトリウム、30 mMイミダゾール、8 M
尿素、ｐＨ7.4でカラムを洗浄し、精製ＴｒｋＡＩｇ１およびＴｒｋＡＩｇ２を2
5 mlの20 mMリン酸ナトリウム、300 mMイミダゾール、8 M尿素、ｐＨ7.4を用い
て2 mls／分で溶離した（図６（Ａ）および６（Ｂ））。
【００６４】 ＴｒｋＡＩｇ１およびＴｒｋＡＩｇ２の再フォールディング： 精製ＴｒｋＡタンパク質を、1 mMβ−メルカプトエタノールの付加により、20 m
Mリン酸ナトリウム、30 mMイミダゾール、8 M尿素、ｐＨ7.4中に0.1 mg/mlの濃
度に調整し、ＴｒｋＡＩｇ２に関しては20 mMトリスＨＣｌ、50 mMＮａＣｌ、ｐ
Ｈ8.5、ＴｒｋＡＩｇ１に関しては20 mMトリスＨＣｌ、50 mMＮａＣｌ、ｐＨ9.0
に対して透析した（2 x 100容積）。透析タンパク質を1.6 mlのPoros 20HQカラ
ムに投入し、20カラム容積全体で0.05〜1 MＮａＣｌの直線勾配で溶離した（図
７）。
【００６５】 ３つのピークはＴｒｋＡＩｇ２に関するPoros 20HQカラムから溶離されており
、これらはすべて、ＴｒｋＡＩｇ２に対応するバンドを生じた（データは示され
ていない）。したがって、再フォールディング工程は、すべてが異なる立体配座
を有する３種のＴｒｋＡＩｇ２を生じなければならない。置換結合試験は、溶離
液に対する最初のピークはＮＧＦを結合するが、一方その他は結合しないという
ことを明示した。したがって、最初のピークを収集し、グリセロールを付加して
最終濃度を20％（v/v）として、液体窒素中にスナップ凍結させた後、-70℃で保
存した。
【００６６】 ＴｒｋＡＩｇ１に関しては、２つのピークだけがPoros 20HQカラムから溶離し
、フロースルー中により多くのタンパク質を含有した。各ピークおよびフロース
ルーのＳＤＳページも、ＴｒｋＡＩｇ１が存在する唯一のタンパク質であること
を示す。２つのピークの置換結合検定は、これらの種のＴｒｋＡＩｇ１はどれも
、ＮＧＦと結合しないことを示す（データは示されていない）。
【００６７】 ＴｒｋＡＩｇ２に関する円二色性試験 折り畳まれたタンパク質の二次構造内容物を確定するために、遠ＵＶ円二色性
（ＣＤ）測定をおこなった。タンパク質のＣＤは、主としてアミド発色団のＣＤ
であり、これは、遠ＵＶ領域で吸収し始め、約220 nmで最初のバンドを有する。
反平行β−シート構造は、典型的には、218 nm付近で最小値を有する負のコット
ン効果および195 nmで最大値を有する正の効果を示す。Ｌ鎖変数（ＶＬ）および
定数（ＣＬ）ドメインのような異なる免疫グロブリンの遠ＵＶスペクトルの振幅
も、215〜218 nm当たりで最小を示す。したがって同様の結果は、ＴｒｋＡＩｇ
タンパク質で予測された。
【００６８】 40μMのタンパク質濃度で、0.5 mm径長のキュベットを用いて、Jobin YvonＣＤ
６計器で、室温でＣＤスペクトルを記録した。0.5 nm／秒の走査速度で走査を蓄
積した。スペクトルを平均化し、バッファーから生じる小信号を差し引いた。活
性ＴｒｋＡＩｇ２のＣＤは、218 nmで最小値を、200 nm付近で最大値を示す（図
８）。これは、反平行βシートに典型的であり、218 nm付近で最小値を有する負
のコットン効果および約195 nmで最大値を有する正のコットン効果を示す（Yang
, J.T., Wu, C.S.C. and Martinez, H.M.（1986）, Methods Enzymol. 130:208-
269）。同様の結果は、他の免疫グロブリンドメインに関して（Ikeda, K., Hama
guchi, K. and Migita, S.（1968）J. Biochem. 63:654-660）、そしてＴｒｋＡ
Ｉｇ１，２に関して（Holden, P.H., Asopa, V., Robertson, A.G.S., Clarke,
A.R., Tyler, S., Bennett, G.S., Brain, S.D., Wilcock, G.K., Allen, S.J.,
Smith, S. and Dawbarn, D.（1997）Nat. Biotechnol. 15:668-672）報告され
ている。これらの結果は、図１Ｂに示したＴｒｋＡＩｇ２のモデルと一致する。
【００６９】 したがって、ＣＤデータは、Poros 20HQカラムから最初に溶離するＴｒｋＡＩ
ｇ２がコンパクト構造に折り畳まれることを示し、他の免疫グロブリンドメイン
と同様の構造を有すると思われる。
【００７０】 ＴｒｋＡの免疫グロブリン様ドメインとのＮＧＦの結合 １．競合的結合 ＮＧＦ受容体ｐ７５NGFRを発現するアメリカ培養細胞コレクション（ＡＴＣＣ
）番号Ａ８７５黒色腫細胞株を用いた競合的結合検定により、ＴｒｋＡのＩｇ様
ドメインとの125Ｉ−ＮＧＦの結合親和性を確定した。
【００７１】 精製組換えヒトＮＧＦをラクトペルオキシダーゼ法を用いてＩ125で放射性ヨ
ウ素標識し、［125Ｉ］−ＮＧＦを用いた平衡結合を実行した（Treanor et al.,
1991; Neuroscience Letters 121 p73-76）。要するに、Ａ８７５細胞（106/ml
）を［125Ｉ］−ＮＧＦ（0.14 nM）および非標識化ヒトＮＧＦの連続稀釈液（濃
度範囲：10-6 M〜1 x 10-11M）、ＴｒｋＡＩｇ１，２（濃度範囲：4 x 10-6 M〜
1 x 10-11M ）またはＴｒｋＡＩｇ２（濃度範囲：5 x 10-6 M〜1 x 10-11M ）を
用いてインキュベートした。室温で１時間、試験管を激しく振盪した。次に100
μlアリコートを、ベックマン管中の200μlスクロース（結合緩衝液中0.15 M）
上に層化した。遠心分離（20,000 gで15秒間）後、液体窒素中で試験管を凍結さ
せることにより、結合および遊離［125Ｉ］−ＮＧＦを分離して、細胞ペレット
の結合［125Ｉ］−ＮＧＦを確定した。結合反応は３回実行した。バックグラウ
ンドに対して計数を修正した。特異的結合は総結合の85〜87％であった。競合的
結合検定（図９）は、組換えＴｒｋＡＩｇ２タンパク質との［125Ｉ］−ＮＧＦ
の結合親和性の概算を可能にした。一連の濃度のＩｇ様ドメインを、125Ｉ−Ｎ
ＧＦおよびＡ８７５細胞とともにインキュベートした（Vale R.D. & Shooter E.
M（1985）Methods in Enzymology 109:21-39）。これは、利用可能125Ｉ−ＮＧ
Ｆに関してＴｒｋＡＩｇドメインとｐ７５NGFRとの間に競合を生じる。２つの競
合的平衡状態は：
【００７２】 Ｋｄ１ Ｋｄ２ Ｎ＋Ｒ⇔Ｎ：ＲおよびＮ＋Ｔ⇔Ｎ：Ｔ （式中、ＮはＮＧＦを表し、Ｒはｐ７５NGFR細胞受容体、およびＴはＴｒｋＡＩ
ｇ２ドメインである）。
【００７３】 データは、ＴｒｋＡＩｇ２の非存在下で結合されるものの一分画と同様に、種
々のＴｒｋＡＩｇ２濃度での細胞に結合するＮＧＦを表す。Ｐ７５NGFR細胞受容
体に対するＮＧＦの高親和性のために、曲線に対する分析的解明は複雑であり、
したがって数値シミュレーションを用いてデータを適合させた（FACSIMILE, U.K
.A.E.A）。
【００７４】 ＴｒｋＡＩｇ１，２／ＮＧＦ相互作用に関する解離定数（Ｋd２）に関する適
合値は、3.3 nMであった（Holden et al., 1997; Nature Biotechnology 15 P66
8-672）。これは、哺乳類細胞中の異所性発現ＴｒｋＡとのＮＧＦ結合に関する0
.1〜1.0 nMのＫdとよく一致する。非標識化（冷）ＮＧＦに関するＩＣ50（125Ｉ
−ＮＧＦを50％阻害するのに必要な冷ＮＧＦの濃度）は、0.2 nMであった（Hold
en et al., 1997; Nature Biotechnology 15 P668-672）（図４Ｂ）。
【００７５】 結果は、ＴｒｋＡＩｇ２が、ＴｒｋＡＩｇ１，２と同様の親和性でＮＧＦと結
合することを示す（図９）。ＴｒｋＡＩｇ２に関するＩＣ50はＴｒｋＡＩｇ１，
２より３倍高いだけで、このことは、ＮＧＦに関する非常によく似た親和性を示
している。この意外な結果は、ＴｒｋＡＩｇ１，２内の結合への関与の大部分が
２番目のＩｇドメイン、ＴｒｋＡＩｇ２に見出されることを示す。
【００７６】 ２．表面プラスモン共鳴試験： BiaCore-Xを用いて、ＴｒｋＡＩｇ２とのＮＧＦの結合のカイネティックデー
タを得た。Biacore技法は、極少量のタンパク質を用いる速度定数の実時間測定
を可能にする。要するに、種々の濃度の試料（分析物）を、当該タンパク質（リ
ガンド）が結合されたセンサーチップに流す。分析物がリガンドと結合した場合
、表面に吸収される光の強度および波長に影響を及ぼすセンサーチップの表面の
電子密度に変化が認められる。
【００７７】 競合的結合検定からのデータは、ＴｒｋＡＩｇ２がＮＧＦ結合の主要関与物で
あることを示したため、このドメインをさらに調べた。
【００７８】 BiaCoreアミンカップリングキット、ならびに20μl／分の一定流速で２分間通
過させた種々の濃度のＮＧＦを用いて、ＴｒｋＡＩｇ２上のアミン基を表面上の
カルボキシル基にカップリングさせることにより、センサーチップの表面にＴｒ
ｋＡＩｇ２を共有結合させた。1μM〜1 nMの一連のＮＧＦ濃度に関して、データ
を収集した。高濃度および極低濃度では、高濃度でのＮＧＦの凝集ならびに極低
濃度での表面との非特異的相互作用のために、データは解釈するのが難しくなる
、ということが判明した。しかしながら、40 nM〜500 nMの範囲に関して収集さ
れたデータは、首尾よく評価できた。適合ソフトウェアBiaEval 3.0を用いて、1
1.8 nMのＫdを得た。得られた11.8 nMのＫd値は、 ＴｒｋＡＩｇ２に関するＩＣ 50 が、ＮＧＦと結合するＴｒｋＡＩｇ１，２に関するＫdが競合的結合検定によ
り確定した場合に3.3 nMであることを示したＴｒｋＡＩｇ１，２の値の３倍であ
るという事実と一致しする。
【００７９】 さらに、20μM ＢＤＮＦもＴｒｋＡＩｇ２上を通過させ、観察された結合は無
視してよい値であった。ＴｒｋＡのＮＧＦ結合能力の主要関与物であると同様に
、ＴｒｋＡＩｇ２はＮＧＦに関しても特異的である、ということは明らかである
。
【００８０】 ３．ＥＬＩＳＡ技法を用いたＴｒｋＡＩｇ様ドメインの結合 方法１ Coat I緩衝液（50 mM炭酸ナトリウム、ｐＨ9.6、ＮａＮ３ 0.1％）中に稀釈
した抗−βＮＧＦ（Sigmaポリクローナルウサギ抗マウスＮＧＦ、１：1000）を9
6ウエルプレート上にプレート化（50μl／ウエル）し、4℃で一晩放置した。ウ
エルを空にして、100μl／ウエルのCoat II緩衝液（Coat I＋１％ＢＳＡ）を付
加した。４℃で２時間後、洗浄緩衝液（50 mMトリスＨＣｌ、ｐＨ7.2、200 mMＮ
ａＣｌ、0.1％トリトンＸ−100、0.1％ＮａＮ3、0.25％ゼラチン）を用いてプレ
ートを３回洗浄し、試料と、試料緩衝液（洗浄緩衝液＋１％ＢＳＡ）中に稀釈し
た標準曲線のＮＧＦ（０〜1000 pg/ml）を付加した（50μl／ウエル）。試料を
、種々の濃度のＴｒｋＡＩｇ様ドメインとともに室温で振盪しながら10分間予備
インキュベートした後、プレートに付加した。プレートを室温で一時間放置した
後、洗浄緩衝液で３回洗浄し、抗βＮＧＦガラクトシダーゼ接合体（Boerhinger
:2.5〜20 mUおよび5〜10 ng抗体／検定）を洗浄緩衝液（50μl／ウエルを付加）
中に稀釈した（1:40）。プレートを室温で２時間インキュベートし、次に洗浄緩
衝液で３回洗浄後、基質緩衝液（100 mMリン酸ナトリウム、ｐＨ7.3、1 mMＭｇ
Ｃｌ2）中の50μlの基質（200 mMの４−メチルウンベリフェリルガラクトシド（
４−ＭＵＧ））を付加した。次に、励起波長364 nmで、448 nmでの発光の蛍光計
を用いて、４−ＭＵＧからの蛍光生成物（４−メチルウベリフェロン）の生成を
測定した。
【００８１】 方法２ ＴｒｋＡＩｇ１，２ドメインをCoat I緩衝液中で96ウエルプレート上で直接プレ
ート化して、４℃で一晩放置した以外は、方法１と同様の検定である。次に、ウ
エルを空にし、４℃で２時間、Coat II緩衝液を付加した。標準曲線のβＮＧＦ
（０〜200 nM）を２μMのＴｒｋＡＩｇ１または２μMのＴｒｋＡＩｇ２とともに
室温で10分間予備インキュベートし、プレートに付加した。これを室温で１時間
インキュベート後、洗浄し、抗βＮＧＦガラクトシダーゼ接合体を付加した。次
にプレートを室温で２時間インキュベートし、洗浄緩衝液で洗浄後、基質（200
mMの４−ＭＵＧ）を付加した。次に、励起波長364 nmで、448 nmでの発光の蛍光
計を用いて、蛍光生成物の生成を測定した。
【００８２】 ＴｒｋＡＩｇ１はプレート上での抗βＮＧＦ抗体とのＮＧＦ結合に全く影響を
及ぼさなかった。このことは、それらが予備インキュベーションにおいてＮＧＦ
を隔絶していなかったことを示す。対照してみると、ＴｒｋＡＩｇ２は、0.5 nM
でＮＧＦの22％と、1 nMＮＧＦで38％と結合した（図１１）。
【００８３】 ＴｒｋＡＩｇ２はＮＧＦを隔絶できた。したがって、ＴｒｋＡＩｇ１，２との
結合に利用可能なＮＧＦはほとんどなかった。結合は、200 nMＮＧＦで40％低下
した。ＴｒｋＡＩｇ１はＮＧＦを隔絶できなかった。したがって、ＴｒｋＡＩｇ
１，２との結合は影響を及ぼさなかった（図１２）。
【００８４】 これらの結果は、ＴｒｋＡＩｇ２がＮＧＦと結合して、96ウエルプレートとの
結合に利用可能なＮＧＦ濃度の低下を引き起こす、ということを示す。ＴｒｋＡ
Ｉｇ１はこれができない。前記のプロトコールは、非ペプチドまたはペプチドデ
ータベースの高スループットスクリーニングが96ウエルプレートフォーマットで
実行され得る方法の選択を説明する。プレート化ＴｒｋＡＩｇ様ドメインとの結
合のためのＮＧＦとの未知のリガンドによる競合は、蛍光の減少により測定され
得る。
【００８５】 ＰＣ１２細胞によるＮＧＦ誘導化神経突起伸展に及ぼすＴｒｋＡＩｇ様ドメイ
ンのin vitro作用 ４ ngのＮＧＦの存在下での（図１３Ａ）ＰＣ１２（移植可能ラット副腎クロ
ム親和性細胞腫ＥＣＡＣＣ第88022401号から得られる）細胞増殖は、72時間後に
神経突起を分化し、産生する。これは、ＮＧＦの非存在下（図１３Ｂ）では起こ
らない。2.5μM（図１３Ｃ）、1.25μM（図１３Ｄ）および0.625μM（図１３Ｅ
）での4 ngのＮＧＦの存在下でＰＣ１２細胞に付加されたＴｒｋＡＩｇ２は、神
経突起伸展を阻害する。ＴｒｋＡＩｇ２濃度が0.312μM（図１３Ｆ）に低減され
た場合のみ、神経突起伸展が出現し始める。
【００８６】 結果は、ＴｒｋＡＩｇ２ドメインがＮＧＦの隔絶によりＰＣ１２細胞の神経突
起伸展を阻害し得る（図１３）が、一方ＴｒｋＡＩｇ１はこれができない、とい
うことを示す。
【００８７】 ＴｒｋＡＩｇ様ドメインのin vivo作用：血漿溢出の抑制 in vivoＮＧＦ活性抑制 in vivo実験はすべて、Animals（Scientific Procedures）Act 1986にしたが
って、末期麻酔下で実行した。皮内（i.d.）ＮＧＦにより誘導されるラット皮膚
における血漿タンパク質溢出を、静脈内（i.v.）125Ｉ−ヒト血清アルブミンの
脈管外蓄積により測定した（Brain, S A and Williams T.J.（1985） British J
ournal of Pharmacology 86:855-860）。雄ウィスター系ラット（200〜350g）を
、60 mg/kgの腹腔内（i.p.）で、必要な場合には保持用量（15 mg/ml）で、麻酔
した。２部位／被験剤での平衡無作為化計画にしたがって、背中皮膚を剃って、
被験物質の注射用の印を付けた。ラットは、125Ｉ−ヒト血清アルブミン（100 k
Bq）およびエバンスブルー染料（0.2〜0.5mlの生理食塩水中2.5％w/v）i.v.を、
尾静脈を介して蓄積期間の開始時に施された。次に、ＮＧＦおよびその他の被験
剤（Tyrodes緩衝化塩溶液中）をi.d.注射して、30分間に亘って蓄積させた。心
臓穿刺により血液試料を採取し（血漿用）、頸部脱臼によりラットを屠殺した。
次に、背中皮膚を除去し、注射部位を打ち抜いた（直径16 mm）。血漿および皮
膚部位を、ガンマ計数器で計数した。各部位の血漿タンパク質溢出は、溢出した
血漿の容積として表された。
【００８８】 同時注射実験に関しては、全皮膚部位は、100μl（i.d.）のＮＧＦ（8 pmol）
またはタイロード液（ＴｒｋＡＩｇ１，２、ＴｒｋＡＩｇ１またはＴｒｋＡＩｇ
２を用いた場合と用いない場合）を摂取した。前処理実験に関しては、皮膚部位
は、100μl（i.d.）のＴｒｋＡＩｇ１，２、ＴｒｋＡＩｇ１またはＴｒｋＡＩｇ
２（24または80 pmol）あるいはビヒクル（タイロード液）を〜５または〜40分
間摂取した。次にこれらの部位は、50μl（i.d.）のＮＧＦ（8 pmol）またはタ
イロードを蓄積期間の開始時（０分）に摂取した。
【００８９】 ＮＧＦ誘導性血漿溢出に及ぼすＴｒｋＡＩｇ１，２の作用 ＮＧＦ誘導性血漿溢出に及ぼすＴｒｋＡＩｇ１，２の同時注射の作用を、図１
４に示す。結果は、皮内被験剤に応答して溢出された血漿（μl／部位）、平均
±ｓ．ｅ．平均（ｎ＝６）として表される。７Ｓ ＮＧＦ（７Ｓ ＮＧＦは2.55
（β−ＮＧＦ）およびγＮＧＦの複合体である）単独により、またはＴｒｋＡＩ
ｇ１，２の同時注射により誘導される応答の両方が示されている（8 pmol、中黒
四角）。比較のために、タイロード溶液（ビヒクル、中白丸）単独またはＴｒｋ
ＡＩｇ１，２との同時注射により誘導される応答も示されている。薬剤単独に加
え、同時注射ＴｒｋＡＩｇ１，２を摂取している部位で薬剤単独を摂取している
部位とは有意に異なる部位における血漿溢出は、＊＊として示されており、Bonf
erroniの後検定によるANOVAで査定した場合、ｐ＜0.01である。
【００９０】 ＴｒｋＡＩｇ１，２は、24 pmol、即ち用いられたＮＧＦの用量より高い閾値
である用量で用いた場合、ＮＧＦの作用を相殺し得る。これに対比して、ビヒク
ル中のＴｒｋＡＩｇ１，２の注射は、有意の血漿溢出を生じなかった。したがっ
て、ＴｒｋＡＩｇ１，２は、特に予備混合および同時注射された場合には、ＮＧ
Ｆの作用を相殺し得る。これは、ＴｒｋＡＩｇ１，２がＮＧＦと結合し、したが
って隔絶し、したがって溢出のその作用を抑制し得る、ということを示す。in v
ivoでＮＧＦを中和するＴｒｋＡＩｇ１，２の能力を調べるために、皮膚部位を
ＴｒｋＡＩｇ１，２の皮内注射により前処理し、ＮＧＦを５分後に投与した（i.
d.）。図１５に示した結果は、24 pmolＴｒｋＡＩｇ１，２が8 pmol７Ｓ ＮＧ
Ｆにより誘導された血漿溢出を有意に抑制し得る、ということを示す。結果は、
皮内被験剤に応答して溢出された血漿（μl／部位）、平均±ｓ．ｅ．平均（ｎ
＝４）として表される。７Ｓ ＮＧＦ（8 pmol）により誘導される応答は、単独
、または図示されたＴｒｋＡＩｇ１，２の増加した用量で前処理した部位での両
方が、中黒四角で示されている。比較のために、ＴｒｋＡＩｇ１，２（24 pmol
）を同時注射された応答誘導性７Ｓ ＮＧＦ（8 pmol）は、中黒棒で示されてい
る。ＧＲ73632（30 pmol）の皮内注射により誘導された血漿溢出は、中黒三角で
、そしてタイロード溶液（ビヒクル）は中白丸で示され、ＴｒｋＡＩｇ１，２の
前処理容量も示されている。薬剤単独に加え、同時注射ＴｒｋＡＩｇ１，２を摂
取している部位で薬剤単独を摂取している部位とは有意に異なる部位における血
漿溢出は、＊＊として示されており、Bonferroniの後検定によるANOVAで査定し
た場合、ｐ＜0.01である。
【００９１】 24 pmolのＴｒｋＡＩｇ１，２で前処理された部位においてＮＧＦを用いて観
察された血漿溢出は、24 pmolのＴｒｋＡＩｇ１，２を同時注射したＮＧＦによ
り生じた血漿溢出と同様であった。同時注射実験の場合と同様に、ＴｒｋＡＩｇ
１，２による前処理は、単独で注射した場合には、有意の血漿溢出を生じなかっ
た。ＴｒｋＡＩｇ１，２の作用がＮＧＦ誘導性応答に特異的であるかまたは一般
的抗炎症作用であるかを確定するための試みにおいて、ＮＫ１作動薬ＧＲ73632
（30 pmol）をＴｒｋＡＩｇ１，２前処理部位に注射した。５分前処理は、図１
５にも示されているように、ＧＲ73632により誘導された血漿溢出を抑制できな
かった。
【００９２】 ＮＧＦ隔絶の安定性を評価するために、図１６に示されているように、蓄積期
間の開始時に投与（i.d.）されたＴｒｋＡＩｇ１，２およびＮＧＦを用いて皮膚
部位を長時間（40分間）前処理した。結果は、皮内被験剤に応答して溢出された
血漿（μl／部位）、平均±ｓ．ｅ．平均（ｎ＝４）として表される。７Ｓ Ｎ
ＧＦ（8 pmol）により誘導される応答は、単独、または図示されたＴｒｋＡＩｇ
１，２の漸増用量で前処理した部位での両方が、中黒四角で示されている。比較
のために、ＴｒｋＡＩｇ１，２（24 pmol）を同時注射された応答誘導性７Ｓ
ＮＧＦ（8 pmol）は、中黒棒で示されている。ＧＲ73632（30 pmol）の皮内注射
により誘導された血漿溢出は中黒三角で、そしてタイロード溶液（ビヒクル）は
中白丸で示され、ＴｒｋＡＩｇ１，２の前処理容量もｙ軸上に示されている。薬
剤単独を摂取している部位とは有意に異なる薬剤＋同時注射ＴｒｋＡＩｇ１，２
を摂取している部位における血漿溢出は、＊として示されており、Bonferroniの
後検定によるANOVAで査定した場合、ｐ＜0.05である。
【００９３】 これらの実験では、ＮＧＦ誘導性血漿溢出は、24 pmolではなく80 pmolのＴｒ
ｋＡＩｇ１，２により有意に抑制された。80 pmolのＴｒｋＡＩｇ１，２との8 p
molのＮＧＦの同時注射により誘導される血漿溢出が、比較のために示されてい
る。前記の実験の結果に続くには、ＴｒｋＡＩｇ１，２の用量は、単独で注射し
た場合には有意の血漿溢出を生じることができず、ＧＲ73632により誘導された
血漿溢出を抑制することもできなかった（前と同様）。
【００９４】 ＮＧ誘導性血漿溢出に及ぼすＴｒｋＡＩｇ１の作用 前記一連の実験後、両免疫グロブリン様ドメイン（ＴｒｋＡＩｇ１，２）を用
いて、ＴｒｋＡの免疫グロブリン様ドメインとのＮＧＦの結合を、我々はさらに
特性化することを試みた。これを実行するために、一次免疫グロブリン様ドメイ
ンである組換えＴｒｋＡＩｇ１の試料を我々は用いた。図１７に示されてように
、ＴｒｋＡＩｇ１を用いた同時注射実験は、80 pmol／部位までの用量では、Ｎ
ＧＦ誘導性血漿溢出の有意の抑制を示さなかった。
【００９５】 結果は、皮内被験剤に応答して溢出された血漿（μl／部位）、平均±ｓ．ｅ
．平均（ｎ＝６）として表される。７Ｓ ＮＧＦ（8 pmol ）の、単独により、
およびＴｒｋＡＩｇ１との同時注射により誘導される応答が中黒四角で示されて
いる。比較のために、タイロード溶液（ビヒクル）により誘導される応答が中白
丸で示され、ＴｒｋＡＩｇ１との同時注射の用量も示されている。薬剤単独を摂
取している部位とは有意に異なる薬剤＋同時注射ＴｒｋＡＩｇ１を摂取している
部位における血漿溢出は、ｎｓとして示されており、Bonferroniの後検定による
ANOVAで査定した場合、有意でなかった。
【００９６】 ＮＧＦ誘導性血漿溢出に及ぼすＴｒｋＡＩｇ２の作用 ＮＧＦと結合し、それを隔絶するＴｒｋＡＩｇ２の能力を評価した。 図１８に示されているように、ＴｒｋＡＩｇ２のＮＧＦとの同時注射は、10倍
余分量で投与された場合、ＮＧＦ誘導性血漿溢出の有意の抑制を生じ得る。用い
られた全用量で、ＴｒｋＡＩｇ２はＧＲ73632により誘導された血漿溢出の抑制
を生じなかったし、単独で注射した場合にも有意の血漿溢出を生じなかった。結
果は、皮内被験剤に応答して溢出された血漿（μl／部位）、平均±ｓ．ｅ．平
均（ｎ＝４〜８）として表される。７Ｓ ＮＧＦ（8 pmol ）の、単独により、
およびＴｒｋＡＩｇ２との同時注射により誘導される応答が中黒四角で示されて
いる。比較のために、ＧＲ73632（30 pmol）により誘導された応答が中黒三角で
示され、タイロード溶液（ビヒクル）により誘導されたものが中白丸で示され、
同時投与されたＴｒｋＡＩｇ２の用量も示されている。薬剤単独を摂取している
部位とは有意に異なる薬剤＋同時注射ＴｒｋＡＩｇ２を摂取している部位におけ
る血漿溢出は、＊＊＊として示されており、Bonferroniの後検定によるANOVAで
査定した場合、ｐ＜0.001であった。
【００９７】 80 pmolＴｒｋＡＩｇ２＋ＮＧＦによる皮膚部位の前処理も、５分後に投与さ
れた8 pmolＮＧＦにより誘導された血漿溢出を抑制できた（図１９）。結果は、
皮内被験剤に応答して溢出された血漿（μl／部位）、平均±ｓ．ｅ．平均（ｎ
＝４）として表される。７Ｓ ＮＧＦ（8 pmol ）の、単独による、および漸増
用量のＴｒｋＡＩｇ２で前処理された部位での誘導された応答が中黒四角で示さ
れている。ＧＲ73632（30 pmol）の皮内注射により誘導された血漿溢出が中黒三
角で示され、タイロード溶液（ビヒクル）が中白丸で示され、ＴｒｋＡＩｇ２の
前処理用量も示されている。薬剤単独を摂取している部位とは有意に異なる薬剤
＋同時注射ＴｒｋＡＩｇ２を摂取している部位における血漿溢出は、＊＊＊とし
て示されており、Bonferroniの後検定によるANOVAで査定した場合、ｐ＜0.001で
あった。さらに、この前処理はＧＲ73632誘導性血漿溢出に影響を及ぼさず、単
独で注射した場合も有意の血漿溢出を生じなかった（図１９）。
【００９８】 同様の結果は、図２０に示されているように、ＴｒｋＡＩｇ２が40分前処理と
して用いられた場合に観察された。結果は、皮内被験剤に応答して溢出された血
漿（μl／部位）、平均±ｓ．ｅ．平均（ｎ＝３）として表される。７Ｓ ＮＧ
Ｆ（8 pmol ）の、単独による、および漸増用量のＴｒｋＡＩｇ２で前処理され
た部位での誘導された応答が中黒四角で示されている。ＧＲ73632（30 pmol）の
皮内注射により誘導された血漿溢出が中黒三角で示され、タイロード溶液（ビヒ
クル）が中白丸で示され、ＴｒｋＡＩｇ２の前処理用量も示されている。薬剤単
独を摂取している部位とは有意に異なる薬剤＋同時注射ＴｒｋＡＩｇ２を摂取し
ている部位における血漿溢出は、＊＊＊として示されており、Bonferroniの後検
定によるANOVAで査定した場合、ｐ＜0.0001であった。ＮＧＦにより誘導された
血漿溢出は、80 pmolのＴｒｋＡＩｇ２により有意に抑制された。比較のために
、80 pmolのＴｒｋＡＩｇ２と同時注射した8 pmolの７Ｓ ＮＧＦにより誘導さ
れた血漿溢出は、中黒カラムで示されている。ＴｒｋＡＩｇによる前処理は、単
独では血漿溢出を誘導せず、ＧＲ73632により誘導された血漿溢出に影響を及ぼ
さなかった。
【００９９】 結果は、ＴｒｋＡＩｇ２ドメインがin vivoでＮＧＦと結合し、そしてその生
物学的活性を遮断し得る、ということを明らかに実証する。
【０１００】 ＴｒｋＡＩｇ２の結晶化 組換え体ＴｒｋＡＩｇ２の結晶は、14〜20％ＭＰＤ、ｐＨ5.0（100 mMＮａク
エン酸塩）、300〜500 mMＮａＣｌ、ｐＨ5.0（100 mMＮａクエン酸塩）、最も好
ましくは、500 mMＮａＣｌ、ｐＨ5.0の種々の条件下で得られた。結晶は、約0.2
x 0.2 x 0.2 mmの寸法に、再現可能的に成長する。次に、結晶を低温保存した
。国産供給源（回転アノード、鏡、映像プレート）およびハンブルグのシンクロ
トロン供給源を用いた場合、これらの結晶は約2.8Åに回析する。50％溶媒を想
定すると、不斉単位中には４（またはおそらくは３）分子が存在する、と概算さ
れる。タンパク質のセレノＭｅｔ形態の結晶は、ＭＡＤ位相調整のために、そし
て重原子誘導体として用いられてきたセレノＭｅｔ栄養要求体（構築物中に４つ
のメチオニンが存在する）を用いて調製された。本説明の他の箇所に記載したよ
うな確立された手法を用いて、ネイティブおよびセレノＭｅｔＴｒｋＡＩｇ２の
両方の組換え形態を調製し、精製し、再フォールディングした。
【０１０１】 ＴｒｋＡＩｇ２の療法的局面 ある種の疼痛状態は、ＮＧＦの過剰発現により引き起こされるため、抗体また
は組換えＴｒｋＡＩｇ２結合ドメインのようなＮＧＦ拮抗薬の適用は、結果的に
生じた疼痛状態を軽減し得る（ McMahon S.B. Series B-Biological Sciences,
（1996）, Vol.351, No.1338, 431-440; Woolf, C.J. et al. British Journal
Of Pharmacology,（1997）, 121, No.3, 417-424; Lowe, E.M. et al. British
Journal Of Urology,（1997）, 79, No.4, 572-577; Dmitrieva, N. et al. Neu
roscience,（1997）, 78, No.2, 449-459; Aloe, L. et al. International Jou
rnal Of Tissue Reactions-Experimental And Clinical Aspects,（1993）, 15,
No.4, 139-143; Aloe, L. et al. Rheumatology International, （1995）, 14
, No.6, 249-252）。
【０１０２】 本発明者らは、ＮＧＦと結合するＴｒｋＡＩｇ１と呼ばれる領域の不能力を実証
した。ＴｒｋＡＩｇ２分子の小ささ、およびこのタンパク質が、例えば大腸菌中
で産生され、そしてその正しい形成物に精製され、再フォールディング化され得
る豊富さは、必要性により、哺乳類または昆虫細胞中に作製されねばならない完
全細胞外ドメイン全体にある種の利点を付与する。
【０１０３】 ＮＧＦタンパク質レベルの増大に関連した、しばしば慢性炎症症状である、種
々の疼痛状態が存在することが知られている。これらの例としては、特発性神経
性尿意促迫および間質性膀胱炎、関節炎および帯状ヘルペスが挙げられる。この
ような慢性症状は、末梢神経の感作、そしておそらくは長期間ということさえあ
る感覚ニューロン異常を生じ得る、ということも示唆されている。ＴｒｋＡＩｇ
２の使用によるこのＮＧＦ増大の隔絶により、このような症状における、そして
ＮＧＦが増大されるその他の症状における疼痛を軽減することができる。
【０１０４】 本明細書を通して、以下の略語を用いた：
【０１０５】
【表１】 アミノ酸の略号 アミノ酸 ３文字略語 １文字記号 アラニン Ala A アルギニン Arg R アスパラギン Asn N アスパラギン酸 Asp D アスパラギンまたはアスパラギン酸 Asx B システイン Cys C グルタミン Gln Q グルタミン酸 Glu E グルタミンまたはグルタミン酸 Glx Z グリシン Gly G ヒスチジン His H イソロイシン Ile I ロイシン Leu L リシン Lys K メチオニン Met M フェニルアラニン Phe F プロリン Pro P セリン Ser S トレオニン Thr T トリプトファン Trp W チロシン Tyr Y バリン Val V 核酸に関する略号： Ａ アデニン Ｇ グアニン Ｃ シトシン Ｔ チミン Ｕ ウラシル 突然変異に関する略号： Ｘ1ＮＮＮＸ2 Ｘ1およびＸ2＝前記のアミノ酸１文字略号 ＮＮＮ＝アミノ酸配列内の突然変異の位置を示す数値数字
【図面の簡単な説明】
【図１】 Ａは、ＴｒｋＡ構造の模式図である（中黒丸はコンセンサスグリコシル化部位
を表す）。 Ｂは、ＴｒｋＡ１およびＴｒｋＡ２のモデル構造を示す。最も重要な結合決定
因子はおそらく、ループ連結鎖ＥおよびＦ（ＥＦループ）に生じる。
【図２】 Ａは、ラスミドｐＥＴ１５ｂの制限酵素地図である。 Ｂは、ＴｒｋＡＩｇ１，２を増幅するために用いられるオリゴヌクレオチドの
配列を示す。
【図３】 ｐＥＴ１５ｂ−ＴｒｋＡＩｇ１，２の挿入物のヌクレオチド配列およびそれよ
り導きだされたアミノ酸配列を示す。
【図４】 Ａは、hisＴｒｋＡＩｇ１のヌクレオチド配列およびそれより導きだされたア
ミノ酸配列を示す。 Ｂは、hisＴｒｋＡＩｇ２のヌクレオチド配列およびそれより導きだされたア
ミノ酸配列を示す。 Ｃは、ＮＴ−３と結合し得るプロリンリッチ領域中の６つのアミノ酸挿入物を
含めたＴｒｋＡのスプライス変異体のＴｒｋＡＩｇ２ドメインを示す。
【図５】 ＴｒｋＡＩｇ１，２、ＴｒｋＡＩｇ１およびＴｒｋＡＩｇ２の発現を説明する
ゲルである。
【図６】 Ａは、ＴｒｋＡＩｇ２の精製を説明するゲルである。 Ｂは、ＴｒｋＡＩｇ１の精製を説明するゲルである。
【図７】 Ａは、再フォールディング後のポロス２０ＨＱからのＴｒｋＡＩｇ１の溶離プ
ロファイルを示す。 Ｂは、再フォールディング後のポロス２０ＨＱからのＴｒｋＡＩｇ２の溶離プ
ロファイルを示す。
【図８】 ＴｒｋＡＩｇ２の円二色性スペクトルを示す。分子楕円率（θ）は波長の一関
数として示される。
【図９】 ＴｒｋＡＩｇ１，２およびＴｒｋＡＩｇ２に関する競合的結合検定を示す。軸
は、1 x 10-11〜1 x 10-5Mとして対数尺度で示される。
【図１０】 固定化ＴｒｋＡＩｇ２と結合するＮＧＦの表面プラスモン共鳴（ＳＰＲ）を示
す。
【図１１】 ＴｒｋＡＩｇ２（２μM）およびＴｒｋＡＩｇ１（２μM）が標準曲線のβＮＧ
Ｆ（0〜1000 pM）で別々にインキュベートされた結合実験の結果を説明する。
【図１２】 増加した濃度のβＮＧＦ（１〜200nM）を２μMのＴｒｋＡＩｇ１または２μM
のＴｒｋＡＩｇ２が別々にインキュベートされた結合実験の結果を説明する。
【図１３】 ＰＣ１２細胞上でのＮＧＦ依存性神経突起伸展に及ぼすＴｒｋＡＩｇ２の作用
を示す。
【図１４】 Ａ〜Ｆは、ＮＧＦ誘導性血漿溢出に及ぼす同時注入ＴｒｋＡＩｇ１，２の作用
を説明する。
【図１５】 ＮＧＦ誘導性血漿溢出に及ぼすＴｒｋＡＩｇ１，２による５分前処理の作用を
説明する。
【図１６】 ＮＧＦ誘導性血漿溢出に及ぼすＴｒｋＡＩｇ１，２による40分前処理の作用を
説明する。
【図１７】 ＮＧＦ誘導性血漿溢出に及ぼす同時注入ＴｒｋＡＩｇ１の作用を説明する。
【図１８】 ＮＧＦ誘導性血漿溢出に及ぼす同時注入ＴｒｋＡＩｇ２の作用を説明する。
【図１９】 ＮＧＦ誘導性血漿溢出に及ぼすＴｒｋＡＩｇ２による５分前処理の作用を説明
する。
【図２０】 ＮＧＦ誘導性血漿溢出に及ぼすＴｒｋＡＩｇ２による40分前処理の作用を説明
する。
【図２１】 図１（Ｂ）のモデルに関する座標データを示す。
【図２２】 図２１の続き。
【図２３】 図２１の続き。
【図２４】 図２１の続き。
【図２５】 図２１の続き。
【図２６】 図２１の続き。
【図２７】 図２１の続き。
【図２８】 図２１の続き。
【図２９】 図２１の続き。
【図３０】 図２１の続き。
【図３１】 図２１の続き。
【図３２】 図２１の続き。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 25/28 Ａ６１Ｐ 43/00 １１１ 29/00 Ｃ０７Ｋ 16/40 43/00 １１１ Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ０７Ｋ 16/40 1/21 Ｃ１２Ｎ 1/19 9/12 1/21 Ｃ１２Ｑ 1/48 ＺＣＣＺ 5/10 1/68 Ａ 9/12 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ Ｃ１２Ｑ 1/48 ＺＣＣ 33/50 Ｚ 1/68 33/566 Ｇ０１Ｎ 33/15 37/00 １０３ 33/50 Ｇ０６Ｆ 17/30 １７０Ｆ 33/566 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 37/00 １０３ Ａ６１Ｋ 37/02 // Ｇ０６Ｆ 17/30 １７０ Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，Ｇ Ｈ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ， ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，Ｍ Ｗ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ， ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 アレン，シェリー，ジェーン イギリス ブリストル ビーエス２ ８エ イチダブリュ ブリストル ローヤル イ ンファーマリー エルダーリー内 ディビ ジョン オブ メディスン (72)発明者 ダウバーン，デビッド イギリス ブリストル ビーエス２ ８エ イチダブリュ ブリストル ローヤル イ ンファーマリー エルダーリー内 ディビ ジョン オブ メディスン

Claims (67)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 図４Ｂの残基２２〜１１９のアミノ酸配列または図４Ｂのア
    ミノ酸配列の一部から成るかまたはそれを含むポリペプチドであって、アミノ酸
    配列がニューロトロフィンを結合し得るポリペプチド。
  2. 【請求項２】 図４Ｂの残基２２〜１４４を含む請求項１記載のポリペプチ
    ド。
  3. 【請求項３】 ＴｒｋＡＩｇ１，２またはその一部である請求項１または２
    記載のポリペプチド。
  4. 【請求項４】 ニューロトロフィンと高親和性で結合する請求項１〜３のい
    ずれか１項記載のポリペプチド。
  5. 【請求項５】 10 nM未満の解離定数でニューロトロフィンと結合する請求
    項４記載のポリペプチド。
  6. 【請求項６】 動物細胞から単離される請求項１〜５のいずれか１項記載の
    ポリペプチド。
  7. 【請求項７】 動物細胞が哺乳類細胞である請求項６記載のポリペプチド。
  8. 【請求項８】 哺乳類細胞がヒト細胞である請求項７記載のポリペプチド。
  9. 【請求項９】 動物細胞が、昆虫細胞、爬虫類細胞、魚類細胞、鳥類細胞ま
    たは両生類細胞である請求項６記載のポリペプチド。
  10. 【請求項１０】 ニューロトロフィンが、ＮＧＦ、ＮＴ−３、または、ｐ７
    ５ＮＧＦＲと結合するニューロトロフィンである請求項１〜９のいずれか１項記
    載のポリペプチド。
  11. 【請求項１１】 ニューロトロフィンが、単量体、二量体、三量体またはニ
    ューロトロフィンヘテロ二量体として存在する請求項１〜１０のいずれか１項記
    載のポリペプチド。
  12. 【請求項１２】 ニューロトロフィンが、哺乳類、昆虫、爬虫類、魚類、鳥
    類または両生類由来である請求項１〜１１のいずれか１項記載のポリペプチド。
  13. 【請求項１３】 哺乳類ニューロトロフィンがヒトニューロトロフィンであ
    る請求項１２記載のポリペプチド。
  14. 【請求項１４】 請求項１〜１３のいずれか１項記載のポリペプチドをコー
    ドするＤＮＡ配列もしくは遺伝暗号の縮重によるこのようなＤＮＡ配列の変異体
    、または請求項１〜１３のいずれか１項記載のポリペプチドをコードするその挿
    入または欠失突然変異体、および、50℃、６ｘＳＳＣ塩濃度で、このようなＤＮ
    Ａ配列とハイブリダイズするＤＮＡ配列。
  15. 【請求項１５】 請求項１〜１３のいずれか１項記載のポリペプチドをコー
    ドするＤＮＡ配列もしくは遺伝暗号の縮重によるこのようなＤＮＡ配列の変異体
    、または請求項１〜１３のいずれか１項記載のポリペプチドをコードするその挿
    入または欠失突然変異体、および、65℃、２ｘＳＳＣ塩濃度で、このようなＤＮ
    Ａ配列とハイブリダイズするＤＮＡ配列。
  16. 【請求項１６】 請求項１４または１５記載のＤＮＡ配列を含むプラスミド
    またはその他のベクター。
  17. 【請求項１７】 発現ベクターである請求項１６記載のプラスミド。
  18. 【請求項１８】 ｐＥＴ−１５ｂである請求項１６または１７記載のプラス
    ミド。
  19. 【請求項１９】 請求項１〜１３のいずれか１項記載の少なくとも１つのポ
    リペプチドおよび少なくとも１つのニューロトロフィンまたはニューロトロフィ
    ンサブユニット、モノマーまたはその生物学的活性部分を含む複合体。
  20. 【請求項２０】 請求項１〜１３のいずれか１項記載のポリペプチドの製造
    方法であって、請求項１４記載のＤＮＡ配列または請求項１５〜１７のいずれか
    １項記載のプラスミドを適切な宿主中に、ＤＮＡ配列が発現されるように導入す
    ることを含む方法。
  21. 【請求項２１】 宿主が動物細胞である請求項２０記載の方法。
  22. 【請求項２２】 宿主が細菌細胞である請求項２１記載の方法。
  23. 【請求項２３】 宿主が哺乳類細胞である請求項２２記載の方法。
  24. 【請求項２４】 宿主がヒト細胞である請求項２３記載の方法。
  25. 【請求項２５】 請求項１〜１３のいずれか１項記載のポリペプチドを用い
    る、ＴｒｋＡ受容体と結合する分子に関するスクリーニング方法。
  26. 【請求項２６】 推定リガンドの、ＴｒｋＡＩｇ１またはその一部との結合
    を、 同推定リガンドの、ＴｒｋＡＩｇ２またはその一部との結合と比較するこ
    とを含む請求項２５記載の方法。
  27. 【請求項２７】 ＴｒｋＡＩｇ２の少なくとも１つの溶媒曝露ループと結合
    する分子を選択することを含む請求項２５または２６記載の方法。
  28. 【請求項２８】 溶媒曝露ループが図１（Ｂ）に示されているようなループ
    Ｅ〜Ｆである請求項２７記載の方法。
  29. 【請求項２９】 溶媒曝露ループが図１（Ｂ）に示されているようなループ
    Ｃ”〜Ｄである請求項２７または２８記載の方法。
  30. 【請求項３０】 少なくとも10 nMの親和性を有する分子が選択される請求
    項２８または２９記載の方法。
  31. 【請求項３１】 その天然状態で請求項１〜１３のいずれか１項記載のポリ
    ペプチドまたはＴｒｋＡまたはそれらの一部の、ニューロトロフィンとの結合を
    増強する分子を選択することを含む請求項２５〜３０のいずれか１項記載の方法
    。
  32. 【請求項３２】 １．化合物生成工程と ２．工程１の間に生成された化合物の、請求項１〜１３のいずれか１項記載の
    ポリペプチドまたはポリペプチドの一部との結合を用いる化合物スクリーニング
    工程と を含むコンビナトリアルケミストリー法。
  33. 【請求項３３】 請求項１〜１３のいずれか１項記載のポリペプチドに対す
    る抗体。
  34. 【請求項３４】 ポリペプチドがＴｒｋＡＩｇ２である請求項３３記載の抗
    体。
  35. 【請求項３５】 請求項１４記載のＤＮＡ配列、または請求項１６〜１８の
    いずれか１項記載のプラスミドまたはその他のベクターを含有する宿主細胞。
  36. 【請求項３６】 哺乳類、細菌、昆虫または酵母細胞である請求項３５記載
    の宿主細胞。
  37. 【請求項３７】 哺乳類細胞がヒト細胞である請求項３２記載の宿主細胞。
  38. 【請求項３８】 請求項１〜１３のいずれか１項記載のポリペプチドのいず
    れかの部分を含む診断プローブ。
  39. 【請求項３９】 標識されている請求項３８記載の診断プローブ。
  40. 【請求項４０】 標識が蛍光タッグまたは放射能標識を含む請求項３９記載
    の診断プローブ。
  41. 【請求項４１】 請求項１〜１３のいずれか１項記載のポリペプチドまたは
    ポリペプチドのいずれかの断片、または請求項３３または３４記載の抗体を用い
    る診断試験、検定またはモニタリング方法。
  42. 【請求項４２】 請求項１４記載のＤＮＡ配列の少なくとも一部を含むプロ
    ーブ、または請求項３８〜４０のいずれか１項記載のプローブを用いる診断試験
    、検定またはモニタリング方法。
  43. 【請求項４３】 微生物、動物細胞または生物診断試験、検定またはモニタ
    リング方法を含む請求項４１または請求項４２記載の診断試験、検定またはモニ
    タリング方法。
  44. 【請求項４４】 末梢性炎症、慢性炎症、ヘルペス後神経痛、間質性膀胱炎
    、関節炎または帯状ヘルペスに関連したニューロトロフィンレベルの上昇を検出
    する請求項４１〜４３のいずれか１項記載の診断試験、検定またはモニタリング
    方法。
  45. 【請求項４５】 化学的または生物学的手段による請求項１〜１３のいずれ
    か１項記載のポリペプチドの製造方法。
  46. 【請求項４６】 請求項１〜１３のいずれか１項記載のポリペプチド、また
    は請求項１４または１５記載のＤＮＡ配列を含有、発現または過剰発現するよう
    に操作された生物。
  47. 【請求項４７】 動物、細菌、酵母または昆虫である請求項４６記載の生物
    。
  48. 【請求項４８】 動物が哺乳類、細菌、酵母または昆虫である請求項４７記
    載の生物。
  49. 【請求項４９】 請求項１〜１３のいずれか１項記載のポリペプチドを含む
    、ニューロトロフィンレベルの増大に関連した疼痛の制御のための組成物。
  50. 【請求項５０】 ニューロトロフィンレベルの増大に関連した疼痛を有する
    患者の治療方法であって、請求項１〜１３のいずれか１項記載のポリペプチド、
    または請求項１〜１３のいずれか１項記載のポリペプチドを用いるスクリーニン
    グ手法により単離または同定されるニューロトロフィン類似体を患者に供給する
    ことを含む方法。
  51. 【請求項５１】 疼痛が、特発性神経性尿意促迫（ＩＳＵ）、間質性膀胱炎
    、関節炎、帯状ヘルペス、末梢性炎症、慢性炎症またはヘルペス後神経痛から選
    択される症状の徴候である請求項５０記載の方法。
  52. 【請求項５２】 アルツハイマー病を有する患者の治療方法であって、請求
    項１〜１３のいずれか１項記載のポリペプチドを含む医薬組成物を患者に供給す
    ることを含む方法。
  53. 【請求項５３】 アルツハイマー病を有する患者の治療方法であって、請求
    項１〜１３のいずれか１項記載のポリペプチドを用いるスクリーニング手法によ
    り単離または同定されるニューロトロフィン類似体を含む医薬組成物を患者に供
    給することを含む方法。
  54. 【請求項５４】 患者の遊離ＮＧＦレベルの低減方法であって、請求項１〜
    １３のいずれか１項記載のポリペプチドを患者に供給することを含む方法。
  55. 【請求項５５】 請求項１〜１３のいずれか１項記載のポリペプチドを患者
    に供給することを含む血漿溢出の低減方法。
  56. 【請求項５６】 ニューロトロフィンがＮＧＦである請求項５０〜５５のい
    ずれか１項記載の方法。
  57. 【請求項５７】 請求項１〜１３のいずれか１項記載のポリペプチドを医薬
    上許容可能な担体または稀釈剤と一緒に含む医薬組成物。
  58. 【請求項５８】 少なくとも１つのニューロトロフィンを含有する請求項５
    ７記載の医薬組成物。
  59. 【請求項５９】 データを用いるための命令でプログラムされた機械を用い
    る場合に、請求項１〜１３のいずれか１項記載のポリペプチドのグラフィカル三
    次元表示を表示可能な機械読み取り可能データをコードしたデータ保存材料を含
    む機械読み取り可能データ保存媒体。
  60. 【請求項６０】 図２１に示される座標を有する相同モデル。
  61. 【請求項６１】 請求項１〜１３のいずれか１項記載のポリペプチドの少な
    くとも一部、またはこのようなポリペプチドの、別の分子との複合体に関する相
    同モデルでプログラムされた、またはそれを提供するために準備されたコンピュ
    ーター。
  62. 【請求項６２】 請求項１〜１３のいずれか１項記載のポリペプチドの少な
    くとも一部、またはこのようなポリペプチドの、別の分子との複合体の相同モデ
    ルが機械読み取り可能形態で保存された機械読み取り可能データ保存媒体。
  63. 【請求項６３】 モデルが図２１に示された座標から得られる請求項６１記
    載のコンピューターまたは請求項６２記載の機械読み取り可能データ保存媒体。
  64. 【請求項６４】 請求項２５〜３２のいずれか１項記載の方法により、また
    は請求項６１または６３記載のコンピューターを用いて、または請求項６２また
    は６３記載の機械読み取りデータ保存媒体を用いて得られる化合物。
  65. 【請求項６５】 結晶ＴｒｋＡＩｇ２。
  66. 【請求項６６】 請求項１〜１１のいずれか１項記載のポリペプチドの少な
    くとも一部を含む結晶。
  67. 【請求項６７】 ポリペプチドがＴｒｋＡＩｇ２である請求項６３記載の結
    晶。
JP2000543603A 1998-04-09 1999-04-09 Ｎｇｆに関する治療薬 Withdrawn JP2002511262A (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GB9807781.1 1998-04-09
GBGB9807781.1A GB9807781D0 (en) 1998-04-09 1998-04-09 Therapeutic agent
PCT/GB1999/001108 WO1999053055A2 (en) 1998-04-09 1999-04-09 Therapeutic agent for ngf

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JP2002511262A true JP2002511262A (ja) 2002-04-16
JP2002511262A5 JP2002511262A5 (ja) 2006-06-15

Family

ID=10830230

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2000543603A Withdrawn JP2002511262A (ja) 1998-04-09 1999-04-09 Ｎｇｆに関する治療薬

Country Status (12)

Country Link
US (2) US20030097667A1 (ja)
EP (2) EP1068315B1 (ja)
JP (1) JP2002511262A (ja)
KR (1) KR100624881B1 (ja)
AT (1) ATE320490T1 (ja)
AU (1) AU769317B2 (ja)
CA (1) CA2325332A1 (ja)
DE (1) DE69930378T2 (ja)
GB (1) GB9807781D0 (ja)
ID (1) ID29596A (ja)
WO (1) WO1999053055A2 (ja)
ZA (1) ZA200005821B (ja)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2006505255A (ja) * 2002-09-19 2006-02-16 アムジエン・インコーポレーテツド 神経増殖因子の活性を調節するペプチド及び関連分子
JP2012143200A (ja) * 2011-01-13 2012-08-02 Chiba Univ 疼痛の予防および／または治療剤のスクリーニング方法並びにこれに用いるためのキット

Families Citing this family (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030096753A1 (en) * 1998-04-09 2003-05-22 Robertson Alan George Simpson Therapeutic agent
GB9807781D0 (en) * 1998-04-09 1998-06-10 Univ Bristol Therapeutic agent
GB0020504D0 (en) * 2000-08-18 2000-10-11 Univ Bristol Therapeutic method
GB0122400D0 (en) * 2001-09-17 2001-11-07 Univ Bristol Polypeptide purification method
SI2263692T1 (sl) 2002-12-24 2020-10-30 Rinat Neuroscience Corp. Anti-NGF protitelesa in postopki, v katerih se le-ta uporabljajo
US9498530B2 (en) 2002-12-24 2016-11-22 Rinat Neuroscience Corp. Methods for treating osteoarthritis pain by administering a nerve growth factor antagonist and compositions containing the same
GB0303362D0 (en) * 2003-02-13 2003-03-19 Enact Pharma Plc Tissue regeneration
EP1857146A1 (en) * 2006-05-16 2007-11-21 Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V. Treatment of respiratory disorders
DE102006052504A1 (de) 2006-11-06 2008-05-08 Temper, Rupert Verfahren zum Herstellen eines Mittels gegen eine Infektionskrankheit
AU2011291462A1 (en) 2010-08-19 2013-03-14 Zoetis Belgium S.A. Anti-NGF antibodies and their use
US9067988B2 (en) 2010-12-01 2015-06-30 Alderbio Holdings Llc Methods of preventing or treating pain using anti-NGF antibodies
US9078878B2 (en) 2010-12-01 2015-07-14 Alderbio Holdings Llc Anti-NGF antibodies that selectively inhibit the association of NGF with TrkA, without affecting the association of NGF with p75
US11214610B2 (en) 2010-12-01 2022-01-04 H. Lundbeck A/S High-purity production of multi-subunit proteins such as antibodies in transformed microbes such as Pichia pastoris
US9884909B2 (en) 2010-12-01 2018-02-06 Alderbio Holdings Llc Anti-NGF compositions and use thereof
US9539324B2 (en) 2010-12-01 2017-01-10 Alderbio Holdings, Llc Methods of preventing inflammation and treating pain using anti-NGF compositions
MX359070B (es) 2010-12-01 2018-09-13 Alderbio Holdings Llc Composiciones anti-ngf y uso de las mismas.
US9617334B2 (en) 2012-06-06 2017-04-11 Zoetis Services Llc Caninized anti-NGF antibodies and methods thereof
IT201600086689A1 (it) * 2016-08-23 2018-02-23 Neuheart S R L PEPTIDI AVENTI ATTIVITÀ AGONISTA NEI CONFRONTI DEL RECETTORE TrkA E/O PEPTIDI AVENTI ATTIVITÀ ANTAGONISTA DI NGF
BR112020017701A2 (pt) 2018-03-12 2020-12-29 Zoetis Services Llc Anticorpos anti-ngf e métodos dos mesmos
US20220169740A1 (en) * 2019-03-20 2022-06-02 Kindred Biosciences, Inc. NGF Antagonists for Medical Use

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK166763C (da) * 1983-03-16 1993-07-12 Immuno Ag Immunoglobulin-g-holdig fraktion
IL101661A (en) * 1991-04-23 1998-02-08 Regeneron Pharma Method for detecting, identifying or measuring agents having neurotrophin activity
US5844092A (en) * 1994-03-18 1998-12-01 Genentech, Inc. Human TRK receptors and neurotrophic factor inhibitors
US5877016A (en) * 1994-03-18 1999-03-02 Genentech, Inc. Human trk receptors and neurotrophic factor inhibitors
GB9525180D0 (en) * 1995-12-08 1996-02-07 Univ Mcgill Design of hormone-like antibodies with agonistic and antagonistic fuctions
GB9616105D0 (en) * 1996-07-31 1996-09-11 Univ Kingston TrkA binding site of NGF
ATE382637T1 (de) * 1996-11-22 2008-01-15 Sugen Inc Rezeptor-tyrosine-kinase gene
FR2776661B1 (fr) * 1998-03-26 2002-04-05 Centre Nat Rech Scient Polypeptide immunoreactif du recepteur trka du ngf et utilisations
US20030096753A1 (en) * 1998-04-09 2003-05-22 Robertson Alan George Simpson Therapeutic agent
GB9807781D0 (en) * 1998-04-09 1998-06-10 Univ Bristol Therapeutic agent
GB0020504D0 (en) * 2000-08-18 2000-10-11 Univ Bristol Therapeutic method
GB0122400D0 (en) * 2001-09-17 2001-11-07 Univ Bristol Polypeptide purification method

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2006505255A (ja) * 2002-09-19 2006-02-16 アムジエン・インコーポレーテツド 神経増殖因子の活性を調節するペプチド及び関連分子
JP2010142236A (ja) * 2002-09-19 2010-07-01 Amgen 神経増殖因子の活性を調節するペプチド及び関連分子
JP2012236829A (ja) * 2002-09-19 2012-12-06 Amgen 神経増殖因子の活性を調節するペプチド及び関連分子
JP2012143200A (ja) * 2011-01-13 2012-08-02 Chiba Univ 疼痛の予防および／または治療剤のスクリーニング方法並びにこれに用いるためのキット

Also Published As

Publication number Publication date
DE69930378T2 (de) 2007-01-11
ZA200005821B (en) 2001-12-03
EP1068315A2 (en) 2001-01-17
WO1999053055A2 (en) 1999-10-21
ATE320490T1 (de) 2006-04-15
AU3433699A (en) 1999-11-01
EP1661994A1 (en) 2006-05-31
ID29596A (id) 2001-09-06
US20070067856A1 (en) 2007-03-22
AU769317B2 (en) 2004-01-22
US20030097667A1 (en) 2003-05-22
KR20010042565A (ko) 2001-05-25
EP1068315B1 (en) 2006-03-15
KR100624881B1 (ko) 2006-09-15
DE69930378D1 (de) 2006-05-11
GB9807781D0 (en) 1998-06-10
CA2325332A1 (en) 1999-10-21
WO1999053055A3 (en) 2000-03-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP2002511262A (ja) Ｎｇｆに関する治療薬
US20070067857A1 (en) Therapeutic agent for NGF
JPH10513049A (ja) Ｅｐｈ様受容体リガンド
JPH09510612A (ja) ヒトｔｒｋ受容体および神経栄養因子インヒビター
MXPA01003244A (es) Artemina, un nuevo factor neurotrofico.
AU3654799A (en) Fizz proteins
US20030199042A1 (en) Novel morphogenic protein
US20100160225A1 (en) Lefty, lefty derivatives and uses thereof
EP1015474A1 (en) Don-1 gene and polypeptides and uses therefor
AU758011B2 (en) Persephin and related growth factors
WO1998007736A9 (en) Don-1 gene and polypeptides and uses therefor
CA2339968A1 (en) Dcr5, a bmp-binding protein, and applications thereof
AU2003261561B9 (en) Therapeutic agent
MXPA00009879A (en) Therapeutic agent for ngf
US20020127594A1 (en) Don-1 gene and polypeptides and uses therefor
CA2319208A1 (en) Orphan receptors
US20030228653A1 (en) Novel orphan cytokine receptor polypeptides
MXPA00002779A (en) Persephin and related growth factors

Legal Events

Date Code Title Description
A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20060407

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20060407

A761 Written withdrawal of application

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A761

Effective date: 20080821

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20081014