JP6108261B2 - 疼痛の予防および/または治療剤のスクリーニング方法並びにこれに用いるためのキット - Google Patents
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Description
(I)BDNF遺伝子および/またはCGRP遺伝子を発現可能な細胞と、被験物質とを接触させる工程、
(II)前記被験物質を接触させた前記細胞における、BDNF遺伝子および/またはCGRP遺伝子の発現量を測定する工程、および、
(III)前記発現量を前記被験物質に接触させない対照細胞における発現量と比較して、BDNF遺伝子および/またはCGRP遺伝子の発現量を減少させる被験物質を候補物質として選択する工程、
を含むことが好ましい。より好ましくは、前記疼痛が神経成長因子(NGF)惹起性の疼痛である場合に、前記工程(I)を神経成長因子(NGF)の存在下で行う。
(I)BDNFタンパク質および/またはCGRPタンパク質を発現可能な細胞または前記細胞から調製した細胞画分と、被験物質とを接触させる工程、
(II)前記被験物質を接触させた前記細胞または前記細胞画分における、BDNFタンパク質および/またはCGRPタンパク質の発現量を測定する工程、および、
(III)前記発現量を前記被験物質に接触させない対照細胞または前記対照細胞から調製した対照細胞画分における発現量と比較して、BDNFタンパク質および/またはCGRPタンパク質の発現量を減少させる被験物質を候補物質として選択する工程、
を含むことが好ましい。より好ましくは、前記疼痛が神経成長因子(NGF)惹起性の疼痛であり、前記工程(I)を神経成長因子(NGF)の存在下で行う。
(A)配列番号:1に記載の塩基配列からなる遺伝子
(B)前記(A)の塩基配列において、1個〜30個、好ましくは1個〜10個、より好ましくは1個〜5個の塩基が欠失、置換または付加された塩基配列からなり、かつ、NGFによって発現が誘導されるBDNFタンパク質をコードする遺伝子
(C)前記(A)の塩基配列において1個〜30個、好ましくは1個〜10個、より好ましくは1個〜5個の塩基が欠失、置換または付加された塩基配列からなり、前記(A)のDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする遺伝子
(D)前記(A)の塩基配列において1個〜30個、好ましくは1個〜10個、より好ましくは1個〜5個の塩基が欠失、置換または付加された塩基配列からなり、配列番号:1に記載の塩基配列との相同性が少なくとも60%以上、好ましくは80%以上、より好ましくは95%以上である遺伝子。
(E)前記(A)〜(D)のいずれかの遺伝子と相補的な塩基配列からなる遺伝子
同様に、「CGRP遺伝子」には、以下のような遺伝子が含まれる。
(A)配列番号:3に記載の塩基配列からなる遺伝子
(B)前記(A)の塩基配列において、1個〜30個、好ましくは1個〜10個、より好ましくは1個〜5個の塩基が欠失、置換または付加された塩基配列からなり、かつ、NGFによって発現が誘導されるCGRPタンパク質をコードする遺伝子
(C)前記(A)の塩基配列において1個〜30個、好ましくは1個〜10個、より好ましくは1個〜5個の塩基が欠失、置換または付加された塩基配列からなり、前記(A)のDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする遺伝子
(D)前記(A)の塩基配列において1個〜30個、好ましくは1個〜10個、より好ましくは1個〜5個の塩基が欠失、置換または付加された塩基配列からなり、配列番号:1に記載の塩基配列との相同性が少なくとも60%以上、好ましくは80%以上、より好ましくは95%以上である遺伝子。
(E)前記(A)〜(D)のいずれかの遺伝子と相補的な塩基配列からなる遺伝子
上述の(C)において、ハイブリダイズのストリンジェントな条件としては、当該技術分野における標準の条件が挙げられるが、例えば、温度条件は、配列番号:1で示された塩基配列のTm値の±5℃、好ましくは±2℃、より好ましくは±1℃である。条件の具体例として、5×SSC溶液、10×Denhardt溶液、100μg/mlサケ精子DNAおよび1%SDS中、65℃でのハイブリダイゼーション、0.2×SSCおよび1%SDS中、65℃、30分の洗浄(2回)、続いて、0.2×SSCおよび0.1%SDS中、65℃、30分の洗浄(2回)が挙げられる。
(A)配列番号:2に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質
(B)前記(A)のアミノ酸配列において、1個〜30個、好ましくは1個〜10個、より好ましくは1個〜5個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、NGFによって発現が誘導されるタンパク質
(C)前記(A)のアミノ酸配列において1個〜30個、好ましくは1個〜10個、より好ましくは1個〜5個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、配列番号:2に記載のアミノ酸配列との相同性が少なくとも60%以上、好ましくは80%以上、より好ましくは95%以上であるタンパク質。
(A)配列番号:4に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質
(B)前記(A)のアミノ酸配列において、1個〜30個、好ましくは1個〜10個、より好ましくは1個〜5個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、NGFによって発現が誘導されるタンパク質
(C)前記(A)のアミノ酸配列において1個〜30個、好ましくは1個〜10個、より好ましくは1個〜5個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、配列番号:4に記載のアミノ酸配列との相同性が少なくとも60%以上、好ましくは80%以上、より好ましくは95%以上であるタンパク質。
まず、本発明の第1のスクリーニング方法について詳細に説明する。第1のスクリーニング方法は、上述のように、BDNF遺伝子および/またはCGRP遺伝子の発現を抑制する物質を探索する工程を含む、疼痛の予防および/または治療剤のスクリーニング方法である。
(I)BDNF遺伝子および/またはCGRP遺伝子を発現可能な細胞と、被験物質とを接触させる工程、
(II)前記被験物質を接触させた前記細胞における、BDNF遺伝子および/またはCGRP遺伝子の発現量を測定する工程、および、
(III)前記発現量を前記被験物質に接触させない対照細胞における発現量と比較して、BDNF遺伝子および/またはCGRP遺伝子の発現量を減少させる被験物質を候補物質として選択する工程、
を含むことが好ましい。
次に、本発明の第2のスクリーニング方法について説明する。第2のスクリーニング方法は、上述のように、BDNFタンパク質および/またはCGRPタンパク質の発現を抑制する物質を探索する工程を含む、疼痛の予防および/または治療剤のスクリーニング方法である。
(I)BDNFタンパク質および/またはCGRPタンパク質を発現可能な細胞または前記細胞から調製した細胞画分と、被験物質とを接触させる工程、
(II)前記被験物質を接触させた前記細胞または前記細胞画分における、BDNFタンパク質および/またはCGRPタンパク質の発現量を測定する工程、および、
(III)前記発現量を前記被験物質に接触させない対照細胞または前記対照細胞から調製した対照細胞画分における発現量と比較して、BDNFタンパク質および/またはCGRPタンパク質の発現量を減少させる被験物質を候補物質として選択する工程、
を含むことが好ましい。
C57/BL6マウス成体(8〜12週齢)より後根神経節(DRG)を分離し、コラゲナーゼタイプIV(500U/mL)(Worthington Biochemicals、cat #CLS3)およびDNAse I(0.12μg/mL、タカラバイオ株式会社、cat #P75454)を含むDMEM培地(Dulbecco's Modified Eagle's Medium)(和光純薬工業株式会社、cat #043-30085)で2時間(37℃)培養した(文献:Komagiri Y, Kitamura N: Effect of intracellular dialysis of ATP on the hyperpolarization-activated cation current in rat dorsal root ganglion neurons. J Neurophysiol (2003) 90:2115-2122を参照)。その後、トリプシン(0.25%wt/vol)(ライフテクノロジーズジャパン株式会社、cat #15400054)を加えたDMEM培地で15分間(37℃)培養し、1mLのピペットチューブ(greiner bio-one Co., Ltd、cat #741045)で撹拌し、1500回転にて3分間遠心分離して上清を取り除いた。分離した細胞は、B27添加物(ライフテクノロジーズジャパン株式会社、cat #17504-044)、ペニシリン(100U/mL)、およびストレプトマイシン(100μg/mL)(ライフテクノロジーズジャパン株式会社、cat #15070-063)を加えたDMEM培地で、ポリ−L−リジン(Sigma-Aldrich Co.、cat #P-1524)でコーティングした24穴細胞皿(greiner bio-one Co., Ltd.、cat #662160)を用いて、37℃ 5%CO2培養器(ASTEC、cat #SCA-165D)の中で3日間培養し、実験に用いた。
上述した手法により培養した後根神経節の初代培養細胞に、200ng/mLの濃度のNGF(Nerve Growth Factor)(Sigma-Aldrich Co.、cat #N6009)を投与し、投与後0、3、6、9、および12時間後にサンプルを回収して、解析に用いた。なお、コントロールとしては、NGFを投与しなかったこと以外は同様に培養・回収した細胞を用いた。
上述した手法により回収した初代培養後根神経節の細胞から、TRIZOL(ライフテクノロジーズジャパン株式会社、cat #15596-026)を用いてRNAを抽出し、cDNA合成キット(ABI High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit、ライフテクノロジーズジャパン株式会社、cat #4368814)により、First strand cDNAを合成した。これを鋳型としてTHUNDERBIRD(商標)SYBR(登録商標)qPCR Mix(東洋紡績株式会社、cat #QPK-201)を用いて、7300 Real-Time PCR System (ライフテクノロジーズジャパン株式会社)によりリアルタイムPCRを施行し、6種の疼痛関連遺伝子(ASCI3、BDNF、CGRP、NaV.1.8、Substance P、TRPV1)の発現誘導を解析した。リアルタイムPCRの反応条件は、50℃×2分間(1サイクル)、95℃×10分間(1サイクル)、95℃×20秒間→60℃×1分間(40サイクル)を用いた。
上述した発現誘導実験において、NGF(200ng/mL)投与の30分前に、NGF中和抗体(Sigma-Aldrich Co.、cat #N6655)(1,000倍希釈)を投与し、NGF投与後0、6、9時間の時点でサンプルを回収して、リアルタイムPCRを施行した。コントロール(Mock)としては、Rabbit serum(Sigma-Aldrich Co.、cat #R9133)を同濃度投与した。
NGF(Sigma-Aldrich Co.、cat #N6009)を、0.1%アルブミン(Sigma-Aldrich Co.、cat #A7906)とともに生理食塩水に溶解し(0.1μg/μL濃度)、10μLをマウス(C57/BL6、6〜8週齢オス)の後肢の肉球に投与した。文献(Journal of Neuroscience Research 86:3566-3574 (2008))によれば、NGFが投与されたマウスは、投与後1〜24時間以内は有意に熱刺激に対する感受性が増加する。NGF投与後、3時間後および6時間後に、第3、4、5腰椎の後根神経節を取り出した(各時間、それぞれ計4匹のマウスより)。一方、コントロール群として、0.1%アルブミンのみを生理食塩水に溶解した溶液10μLを同様に後肢の肉球に投与したマウス(C57/BL6, 6-8週齢♂)を用いた。
BDNF遺伝子(アクセッション番号:M37762.1)の塩基配列を表す。
〔配列番号:2〕
BDNF遺伝子によってコードされるBDNFタンパク質(アクセッション番号:AAA51820.1)のアミノ酸配列を表す。
〔配列番号:3〕
CGRP遺伝子(アクセッション番号:NM_001033953.2)の塩基配列を表す。
〔配列番号:4〕
CGRP遺伝子によってコードされるCGRPタンパク質(アクセッション番号:NP_001029125.1)のアミノ酸配列を表す。
Claims (1)
- BDNF遺伝子および/またはCGRP遺伝子の発現を抑制する物質を探索する工程を含み、
前記物質を探索する工程が、以下の工程(I)〜(III):
(I)マウス後根神経節由来の初代培養細胞の培地に神経成長因子(NGF)を投与することにより、前記細胞におけるBDNF遺伝子および/またはCGRP遺伝子の発現を誘導する工程、
(II)前記誘導の前またはこれと同時に、前記培地に被験物質を投与する工程、および、
(III)前記誘導の6〜9時間後に、前記被験物質を接触させた前記細胞におけるBDNF遺伝子および/またはCGRP遺伝子の発現量を測定し、
前記誘導をしない対照細胞におけるBDNF遺伝子および/またはCGRP遺伝子の発現量と比較して2〜3倍の発現量である発現誘導を指標として、前記測定した発現量と前記発現誘導とを比較することにより、前記発現誘導を抑制する被験物質を候補物質として選択する工程、
を含む、神経成長因子(NGF)惹起性の疼痛の予防および/または治療剤のスクリーニング方法。
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