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GEBIET DER ERFINDUNG
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Die vorliegende Erfindung betrifft
die Verwendung von Follistatin, um die Aktivität eines Wachstums- und Differenzierungsfaktors
[GDF], bekannt als GDF-8, zu modulieren. Genauer gesagt betrifft
die Erfindung die Verwendung von Follistatin zur Behandlung von
muskulären
Erkrankungen, welche im Zusammenhang mit der Modulation der Spiegel
oder der Aktivität
von GDF-8 oder nahe verwandten Faktoren stehen, einschließlich des
Knochenmorphogenetischen Proteins-11 [BMP-11], auch bekannt als
GDF-11.
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HINTERGRUND DER ERFINDUNG
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Knochen-morphogenetische-Proteine
(BMPs) und Wachstums-/Differenzierungsfaktoren (GDFs) sind Teil
einer Familie von Proteinen, bei denen die Fähigkeit festgestellt wurde,
das Wachstum, die Entstehung, die Differenzierung und den Erhalt
von verschiedenen Geweben, einschließlich Knochen, Knorpel, Sehnen/Bänder, Muskel,
Neuralgewebe und verschiedener Organe, zu induzieren. BMPs und GDFs
sind Unterfamilien innerhalb der TGF-β-Überfamilie.
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Es wurde gezeigt, dass die TGF-β-Überfamilie
von Proteinen an Serin-/Threonin-Kinaserezeptoren bindet.
Massague, Cell, 69: 1067–1070
(1992); Attisano et al., Cell 68: 97– 108 (1992); Lin et al., Cell
68: 775–785
(1992); Wang et al., Cell 67: 797–805 (1991). In ähnlicher
Weise wurden Aktivinrezeptoren isoliert und als eine vorhergesagte
Transmembran-Serinkinase
charakterisiert. Mathews et al., Cell 65: 973–982 (1991); Nakamura et al.,
J. Biol. Chem. 267: 18924–18928
(1992). Ebner et al., Science, 260: 1344–1348 (1993) beschreiben die
Existenz von Typ-I- und Typ-II-TGF-β-Rezeptoren und die Wirkungen
des Typ-I-Rezeptors
auf die Bindung von TGF-β an
den Typ-II-Rezeptor.
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Follistatin ist ein Protein, das
als ein Molekül,
das in der Lage ist, an Aktivin, ein anderes Mitglied der TGF-β-Überfamilie,
zu binden und als möglicher
Antagonist von Aktivin identifiziert wurde [Patent 5.545.616 der
Vereinigten Staaten]. Entsprechend wurde Follistatin für eine mögliche Verwendung
zur Vorhersage und/oder zur Verhinderung von vorzeitigen Wehen und
zur Unterdrückung
der FSH-Sekretion aus der Hypophyse [US-Patent 5.545.616], für den Besitz
einer Inhibin-ähnlichen
Aktivität
[Vereinigte Staaten Patent 5.041.538], für die Verwendung bei rheumatoider
Arthritis [AU9675056, Kaneka Corp] sowie bei neurogenerativen und
neuromuskulären
Erkrankungen [WO95/10611] vorgeschlagen.
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ZUSAMMENFASSUNG
DER ERFINDUNG
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Die vorliegende Erfindung betrifft
die Verwendung einer wirksamen Menge von Follistatin oder eines funktionellen
Fragments davon für
die Herstellung einer therapeutischen Zusammensetzung zur Behandlung einer
den Muskel betreffenden Erkrankung.
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Den Muskel betreffende Erkrankungen
umfassen, jedoch nicht ausschließlich, Muskeldystrophien (wie schwere
und gutartige X-verknüpfte
Muskeldystrophie, Gliedergürtel-Dystrophie,
facioscapulohumerale Dystrophie, myotonische Dystrophie, distale
Muskeldystrophie, progressive dystrophe Ophthalmoplegie, okulopharyngeale
Dystrophie und kongenitale Muskeldystrophie Typ Fukuyama), kongenitale
Myopathie, kongenitale Myotonie, familiäre periodische Paralyse, paroxysmale
Myoglobinurie, Myastenia gravis, Eaton-Lambert Syndrom, sekundäre Myastenia,
Denervationsatrophie.
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GENAUE BESCHREIBUNG
DER ERFINDUNG
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TGF-β-Proteine so wie BMPs und GDFs
werden durch ihre Fähigkeit
charakterisiert, das Wachstum, die Entstehung, die Differenzierung
und den Erhalt von verschiedenen Geweben, einschließlich Knochen, Knorpel,
Sehnen/Bänder,
Muskel, Neuralgewebe und verschiedener Organe, zu fördern, anzuregen
oder anderweitig zu induzieren. Für GDF-8 wurde gezeigt, dass
er eine besondere Aktivität
auf Muskel-, Fett- und Neuralgewebe ausübt. Für BMP-11 wurde gezeigt, dass
es Aktivität
auf Neuralzellen, insbesondere auf neuronale Zellen ausübt.
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Zwei Formen von Follistatin (FS)
werden als Ergebnis des alternativen Spleißens hergestellt. Diese Formen
sind FS-288 und FS-315. Für
die FS-315-Form wurde auch gezeigt, dass sie proteolytisch prozessiert wird,
so dass FS-303 entsteht (Sugino et al., J. Biol. Chem. 268: 15579
(1993)). Es ist zu erwarten, dass rekombinante Formen jedes dieser
Moleküle
unterschiedliche Eigenschaften hat (Sumitomo et al., Biochem. Biophys.
Acta 208: 1 (1995)), und man stellt sie sich als nützlich für die Inhibierung
der Wirkung von GDF-8 und BMP-11 vor.
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Angesichts der vorliegenden Darstellung
umfassen die voraussichtlichen Eigenschaften von Follistatin die
differenzielle Fähigkeit,
mit Zelloberflächen
zu wechselwirken und Heparin und Heparansulfat-Proteoglycane zu
binden (Nakamura et al., J. Biol. Chem. 266: 19432 (1991); Sumitomo
et al., Biochem. Biophys. Acta 208: 1 (1995)). Diese Eigenschaften
können
bei zur therapeutischen Anwendung verwendetem FS suboptimal sein.
Folglich kann ortsgerichtete Mutagenese angewendet werden, um diese
Eigenschaft zu ändern.
Spezifisch kann dies die Veränderung
oder Deletion der basischen Reste, die verantwortlich für die Heparinbindung sind,
an den Resten 72–86
beinhalten (Inouye et al., Mol. Cell. Endocrinol. 90: 1 (1992)).
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Follistatin ist neben anderen Verwendungen
nützlich
für die
Identifizierung von BMPs, die Identifizierung von weiteren BMP-Rezeptoren
und die Identifizierung von Liganden oder Molekülen, einschließlich Antikörpern, welche
in der Lage sind, die Bindungseigenschaften von BMPs nachzuahmen.
Diese Liganden können,
abhängig
vom individuellen Liganden, als Agonisten oder Antagonisten wirken.
Die Fähigkeit
von Follistatin, die Aktivität
von GDF-8 und BMP-11 zu blockieren oder zu modulieren, kann in einem
Test auf BMP-Aktivität,
wie dem untenstehend im Beispiel 2 beschriebenen animalen Hemisphären-Test
("animal cap assay"), charakterisiert
werden. Die Follistatinmoleküle
sind auch nützlich
für die
Hemmung der Wirkungen von GDF-8 und BMP-11, wo eine solche Hemmung
erwünscht
ist.
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Wegen der bekannten Aktivitäten von
GDF-8 und BMP-11 wird die vorliegende Erfindung bei der Behandlung
von den Muskel betreffenden Erkrankungen Verwendung finden. Den
Muskel betreffende Erkrankungen zur Behandlung beinhalten, ohne
darauf beschränkt
zu sein, Muskeldystrophien (wie schwere und gutartige X-verknüpfte Muskeldystrophie,
Gliedergürteldystrophie,
facioscapulohumerale Dystrophie, myotonische Dystrophie, distale
Muskeldystrophie, progressive dystrophe Ophthalmoplegie, okulopharyngeale
Dystrophie und kongenitale Muskeldystrophie Typ Fukuyama), kongenitale
Myopathie, kongenitale Myotonie, familiäre periodische Paralyse, paroxysmale
Myoglobinurie, Myastenia gravis, Eaton-Lambert Syndrom, sekundäre Myastenia,
Denervationsatrophie.
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Follistatinproteine, die nützlich für die vorliegende
Erfindung sind, schließen
menschliches Follistatin, offengelegt in Shimasaki et al., PNAS:
USA 85: 4218–4222
(1988), Follistatin des Schweins, offengelegt in Ueno et al., PNAS:
USA 84: 8282–8286
(1987) und Follistatin des Rinds, offengelegt in Robertson et al.,
Biochem. Biophys. Res. Commun. 149: 744–749 (1987) ein. Zusätzlich können verkürzte Polypeptide,
die Teilfragmente der vollständigen
Follistatin-Polypeptide umfassen und welche die Fähigkeit,
GDF-8 und BMP-11 zu
binden, beibehalten haben, auch nützlich für die vorliegende Erfindung
sein. Insbesondere sind funktionelle Fragmente der Follistatinsequenzen,
welche die Fähigkeit
beibehalten haben, die Aktivität
von GDF-8- und/oder BMP-11 zu modulieren, zu blockieren oder anderweitig
zu beeinflussen, nützlich
für die
vorliegende Erfindung. Die Identifizierung eines Follistatin-Teilpolypeptids
als funktionelles Fragment von Follistatin kann einfach bestimmt
werden, zum Beispiel unter Verwendung des in Beispiel 2 beschriebenen
Tests.
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Die vorliegende Erfindung schließt auch
Fusionen von Follistatin mit anderen Molekülen ein. Dies beinhaltet die
Fusion der Sequenzen FS-288, FS-315 oder FS-303 mit den Gelenk-,
CH2- und CH3-Domänen eines
menschlichen Immunglobulin-gamma-Isotyps, z. B. gamma 1 oder 4.
Es ist zu erwarten, dass ein solches Fusionsprotein ein dimeres
Molekül
mit der verbesserten Pharmakokinetik, wie für eine Immunglobulin-Fc-Fusion
erwartet, bildet. Zusätzlich
können
die konstanten Domänen
oder sekretorische Schwanzstücke der
schweren alpha- oder mü-Ketten
von Immunglobulinen an FS fusioniert werden, um polymere Formen
von FS zu erzeugen.
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Der Anteil von FS, der für die Wechselwirkung
mit GDF-8 und BMP-11 verantwortlich ist, kann für die Herstellung von funktionellen
Fragmenten von FS und Fusionsproteinen oder als Basis für andere
therapeutische Verwendungen identifiziert und verwendet werden.
Das menschliche FS-Gen enthält
vier Domänen,
von denen jede auf einem getrennten Exon codiert ist, zusätzlich zu
einem Exon, das die N-terminale Signalsequenz codiert, und einem
Exon, das die C-terminale Verlängerung
codiert, die zu FS-315 führt
(Shimasaki et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 4218 (1995)).
Die Regionen, die verantwortlich für die Bindung an GDF-8 und/oder
BMP-11 sind, können
bestimmt und durch die in Beispiel 3 beschriebenen Verfahren hergestellt
werden.
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Für
die Verwendung in den Verfahren der vorliegenden Erfindung können die
gereinigten Follistatinproteine und funktionelle Fragmente davon
durch Reinigung aus natürlichen
Geweben oder rekombinant durch Kultivierung einer Wirtszelle, die
mit einer DNA-Sequenz transformiert wurde, die eine DNA umfasst,
die in einer beliebigen der vorstehenden Veröffentlichungen beschrieben
wird, hergestellt werden. Zusätzlich
zu den natürlichen
codierenden DNA-Sequenzen beinhalten codierende Sequenzen, die verwendet
werden können, Sequenzen,
die das Vorstehende codieren, sich jedoch in der Codon-Sequenz durch
die Degeneriertheit des genetischen Codes oder Allel-Variationen
(natürlich
vorkommende Basenveränderungen
in der Population einer Art, welche zu einer Aminosäureveränderung
führen
können
oder auch nicht) unterscheiden, sowie DNA-Sequenzen, die unter stringenten
Hybridisierungsbedingungen [vgl. T. Maniatis et al., Molecular Cloning (A
Laboratory Manual), Cold Spring Harbor Laboratory (1982), Seiten
387 bis 389] mit denjenigen DNA-Sequenzen
hybridisieren, die in den vorstehenden Veröffentlichungen beschrieben
werden und ein Protein codieren, das die Fähigkeit hat, an GDF-8 oder
BMP-11 zu binden. In den vorstehenden Veröffentlichungen offengelegte
Variationen in den DNA-Sequenzen, die durch Punktmutationen oder
durch induzierte Modifikationen (einschließlich Insertion, Deletion und
Substitution) verursacht werden, um die Aktivität, die Halbwertszeit oder die
Herstellung der durch sie codierten Follistatin-Polypeptide zu verbessern,
sind ebenfalls nützlich
für die
vorliegende Erfindung.
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Die vorliegende Erfindung kann Gentherapie
einschließen,
bei der eine Transfektion von Zellen mit DNA-Molekülen, die
Follistatin, oder funktionelle Fragmente davon, codieren, durchgeführt wird,
um die Bindung des Follistatins an in den transfizierten Zellen
oder in der Umgebung der transfizierten Zellen vorhandenes GDF-8
und/oder BMP-11 zu erreichen und dadurch die Wirkung von GDF-8 und/oder
BMP-11 auf jene Zellen zu modulieren oder zu blockieren. Zum Beispiel
können
Zellen, die Follistatinproteine exprimieren, die Auswirkungen eines Überschusses
an GDF-8 oder BMP-11 in einem Organismus oder einer Zelle verringern
oder eliminieren. Das erhöhte
Follistatin kann wünschenswert
sein, um die negativen Wirkungen von GDF-8 oder BMP-11 zu minimieren,
oder es kann in einem Komplex mit GDF-8 oder BMP-11 wirken, um die
Aktivität
zu verstärken
oder zu erhöhen.
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Follistatinproteine oder funktionelle
Fragmente davon können
auch in einem Verfahren zur Isolierung von GDF-8 oder BMP-11 in
einem Reinigungsverfahren nützlich
sein. In einem solchen Verfahren kann Follistatin in eine Säule oder
ein Harz eingearbeitet werden, welche/welches für die kommerzielle Herstellung
von GDF-8 oder BMP-11 aus Gewebeproben oder über rekombinante Verfahren
verwendet werden kann. Das Follistatin oder funktionelle Fragmente
davon werden verwendet, um GDF-8 oder BMP-11 zu binden, und später werden
Bedingungen angewendet, die zu einer Freisetzung der gebundenen
Proteine führen.
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Die vorliegende Erfindung umfasst
therapeutische Möglichkeiten,
bei denen eine Follistatin enthaltende Zusammensetzung topisch,
systemisch oder lokal als Implantat oder über eine Vorrichtung verabreicht
werden kann. Wenn es verabreicht wird, liegt die therapeutische
Zusammensetzung zur Verwendung in dieser Erfindung vorzugsweise
in einer pyrogenfreien, physiologisch verträglichen Form vor. Weiterhin
kann die Zusammensetzung wie gewünscht
zur Verabreichung an den gewünschten
Ort eingekapselt oder in einer viskösen Form injiziert werden.
Therapeutisch nützliche
Agenzien wie Wachstumsfaktoren (z. B. BMPs, TGF-β, FGF, IGF), Cytokine (z. B.
Interleukine und CSFs) und Antibiotika können auch wahlweise bei den
Verwendungen der Erfindung in der Follistatin-Zusammensetzung enthalten sein oder
gleichzeitig damit oder sequenziell verabreicht werden.
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Es gibt ein breites Spektrum von
Mitteln, die angewendet werden können,
um die Follistatinprotein exprimierenden Zellen an einen Ort zur
Verwendung zur Modulation einer GDF-8- oder BMP-11-Antwort zu verabreichen.
In einer Ausführungsform
der Erfindung können
die Follistatinprotein exprimierenden Zellen durch direkte Applikation
verabreicht werden, zum Beispiel durch direkte Injektion einer Probe
solcher Zellen an die Stelle der Gewebsschädigung. In einer besonderen
Ausführungsform
können
diese Zellen gereinigt sein. In einer bevorzugten Ausführungsform
können
die Follistatinprotein exprimierenden Zellen in einem Medium oder einer
Matrix verabreicht werden, die teilweise ihre Mobilität einschränkt, so
dass die Zellen an der Stelle der Verletzung lokalisiert sind. Ein
solches Medium oder eine solche Matrix könnte halbfest wie eine Paste
oder wie ein Gel einschließlich
eines gelartigen Polymers sein. Alternativ könnte das Medium oder die Matrix
in Form eines Feststoffs, vorzugsweise eines porösen Feststoffs sein, welcher
die Wanderung der Zellen in die feste Matrix zulässt und sie dort zurückhält, wobei
die Vermehrung der Zellen ermöglicht
wird.
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In einer Ausführungsform der vorliegenden
Erfindung werden die Follistatinprotein exprimierenden Zellen, wie
vorstehend beschrieben, an den gewünschten Ort verabreicht, und
GDF-8 oder BMP-11 wird verabreicht. Der Faktor kann gleichzeitig
oder unmittelbar auf die Verabreichung der Follistatinprotein exprimierenden
Zellen folgend verabreicht werden. Das BMP kann mit auf dem Fachgebiet
bekannten Verfahren, wie in den vorstehenden Patenten sowie im Patent
5.171.579 der Vereinigten Staaten beschrieben, verabreicht werden.
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Expression des Follistatinproteins
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Um das Follistatinprotein herzustellen,
wird die das gewünschte
Protein codierende DNA in einen geeigneten Expressionsvektor überführt und
in Säugerzellen
oder andere bevorzugte eukaryontische oder prokaryontische Wirte
durch konventionelle Genmanipulationsverfahren eingeführt. Das
derzeit bevorzugte Expressionssystem für biologisch aktives rekombinantes
Follistatinprotein sind stabil transfizierte Säugerzellen.
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Die folgenden Beispiele liefern Einzelheiten
zu den derzeit bevorzugten Ausführungsformen
der vorliegenden Erfindung. Man kann absehen, dass dem Fachmann
eine Vielzahl von Modifikationen und Variationen bei der praktischen
Anwendung davon bei der Betrachtung dieser Beschreibungen in den
Sinn kommen werden. Es wird angenommen, dass jene Modifikationen
und Variationen innerhalb der hier im Anhang angefügten Ansprüche eingeschlossen
sind. Die Beispiele schränken
die Erfindung in keiner Weise ein.
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BEISPIELE
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BEISPIEL 1. BIAcore-Bindungstest:
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Gereinigtes Follistatin wurde an
eine Schicht Carboxymethyldextran eines CM5-Forschungschips auf einem Biacore 2000-Instrument
unter Verwendung von Standard-Amin-Kopplungsverfahren gemäß der Anweisungen
des Herstellers gekoppelt. Der zur Immobilisierung verwendete Puffer
war 10 mM Natriumacetat pH 4. Typischerweise wurden etwa 7.000 Antworteinheiten
("response units" RU) Follistatin
durch dieses Verfahren immobilisiert. Gereinigte BMP- und GDF-Proteine
wurden jeweils über
das immobilisierte Follistatin für 10
Minuten bei 2 μl/min
injiziert. Der für
die Durchmusterung verwendete Laufpuffer war 10 mM Natriumphosphat
pH 7,4, 300 mM Natriumchlorid, 3,4 mM Ethylendiamintetraessigsäure, 0,005%
(Vol/.Vol.) Tween 20 und die Temperatur wurde bei 22°C gehalten.
Die Bindung wurde als Erhöhung
der RU 60 Sekunden nach dem Ende der Injektion im Vergleich zur
Basislinie, die 20 Sek. vor der Injektion aufgenommen wurde, quantifiziert. Spezifische
Bindung wurde durch gemeinsame Injektion löslichen Follistatins und der
BMP-11- und GDF-8-Proteine gezeigt.
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Ergebnisse:
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Ergebnisse der Biacore-Durchmusterung
zeigten, dass sowohl GDF-8 als auch BMP-11 an Follistatin gebunden
hatte. Diese Bindung war vergleichbar zur Positivkontrolle Activin.
Die Bindung war spezifisch, wie durch die Tatsache demonstriert
wurde, dass keine Bindung beobachtet wurde, wenn man GDF-8 oder BMP-11
vorab inkubierte und mit einem Überschuss
an löslichem
Follistatin gemeinsam injizierte.
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BEISPIEL 2: Animale Hemisphären-Testverfahren
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Der animale Hemisphärentest
von Xenopus wurde verwendet, um die biologische Aktivität der BMP-Proteine
zu bestimmen. Xenopus-Eier wurden in vitro befruchtet, und man ließ sie bis
zum Blastulastadium entwickeln. Das Ectoderm oder die animale Hemisphäre des Embryos
wurde herausgeschnitten und in Medien, die das interessierende Protein
enthielten, für
5–6 Stunden
gezüchtet.
Die Explantate wurden dann in frisches Medium ohne Protein überführt. Die
animalen Hemisphären
wurden über
Nacht gezüchtet
und die Aktivität
des Proteins wurde am nächsten
Tag mittels Morphologie, Histologie und RT PCR unter Verwendung molekularer
Marker für
Mesoderm, Neuralgewebe und Endoderm beurteilt.
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Ergebnisse des animalen
Hemisphärentests
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Sowohl GDF-8 als auch BMP-11 bewirkten,
dass die animalen Hemisphären
sich ausdehnten, und sie induzierten dorsales mesodermales (Muskel)
und neurales Gewebe bei Dosen (50 ng/ml), die vergleichbar zu denen
für Faktoren
waren, für
die zuvor gezeigt wurde, dass sie diese Gewebe induzieren (z. B.
Activin). Follistatin war in der Lage, die Fähigkeit von sowohl GDF-8 als
auch BMP-11, die Ausdehnung der animalen Hemisphären und mesodermales Gewebe
darin zu induzieren, zu inhibieren. GDF-8 wurde durch einen 5-fachen Überschuss
an Follistatin (100 ng/ml GDF-8 und 500 ng/ml Follistatin) blockiert,
während
BMP-11 durch einen 10-fachen Überschuss
an Follistatin (BMP-11 50 ng/ml und 500 ng/ml Follistatin) blockiert
wurde. Zusammengenommen zeigen die Ergebnisse der Biacore-Bindung und die Hemmung
bei dem animalen Hemisphärentest von
Xenopus, dass Follistatin ein Antagonist von GDF-8 und BMP-11 ist
und in der Lage ist, die Aktivität
dieser beiden Faktoren zu modulieren.
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BEISPIEL 3: Bestimmung
der funktionellen Fragmente von Follistatin
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Funktionelle Fragmente von Follistatin
und die Komponenten von Follistatin, die notwendig für die Herstellung
desselben sind, werden durch die Herstellung einer Serie von FS-Mutanten,
jedes mit einem zusätzlich
am 3'-Ende deletierten
Exon, definiert. Die sechs Exons von FS werden von 1 bis 6 nummeriert.
Die Mutanten werden aus den Exons 1–5, 1–4, 1–3 und 1–2 bestehen, und die Bindung
jeder Form wird mit dem Wildtyp-FS (1–6) verglichen. Dies wird die
Domäne
oder die Domänen
identifizieren, die für
die Ligandenbindung verantwortlich sind. Spezifische Reste, die
kritisch für
die Bindung an den Liganden sind, werden dann unter Verwendung der
ortsgerichteten Mutagenese identifiziert.
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Die Formen 1–5, 1–4, 1–3 und 1–2 werden unter Verwendung
von Oligonucleotidprimern und der Polymerasekettenreaktion (PCR)
hergestellt. Die Matrize für
diese Amplifizierung wird die FS-cDNA sein, entweder aus einem Plasmidclon
oder als Ergebnis einer mit hexameren Zufallsprimern initiierten
Erststrang-cDNA-Synthese ausgehend von polyA+-RNA
aus Primärgewebe
(z. B. von Ovar-RNA). Ein (5')-Vorwärts-Primer, basierend
auf dem Startcodon von FS, wird bei jeder Amplifizierung verwendet
und mit einem (3')-Rückwärts-Primer, der an die
codierende 3'-Sequenz
des letzten Exons (z. B. Exon 5 bei der Form 1–5) bindet und ein Stoppcodon
unmittelbar nach dem letzten Exon einführt, kombiniert. Erkennungssequenzen
von Restriktionsendonucleasen werden ebenfalls an das 5'-Ende eines jeden
Primers angefügt,
um die molekulare Clonierung des PCR-Produkts in einen Expressionsvektor
zu erleichtern. PCR-Bedingungen und Komponenten werden so ausgewählt, dass
die Einführung
von Punktmutationen minimiert wird, und die entstehenden Clone werden
durch Nucleotidsequenzierung analysiert, um sicherzustellen, dass
die korrekte FS-Sequenz in jedem Konstrukt vorhanden ist.
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Der Vorwärts-Primer wird FS-vorwärts genannt.
Der Rückwärts-Primer
zur Herstellung von 1–5
wird FS-rückwärts 5 genannt;
für 1–4 wird
er FS-rückwärts 4 genannt,
für 1–3 wird
er FS-rückwärts 3 genannt
und für
1–2 wird
er FS-rückwärts 2 genannt.
Potenzielle Sequenzen für
diese Primer werden untenstehend gezeigt. Die FS-Sequenzen, die
für die
Wechselwirkung mit GDF-8, BMP-11 und Activin verantwortlich sind,
können identisch
sein. Wenn die Bindestellen diskret oder überlappend sind, kann Mutagenese
angewendet werden, um die Bindung an spezifische FS-Liganden zu
eliminieren. Dies kann durch Alanin-Scanning-Mutagenese und Prüfung jeder
Mutante auf Bindung an jeden der drei Liganden erreicht werden.
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Unter Verwendung von Verfahren und
Primern, die ähnlich
den vorstehend beschriebenen sind, wird eine Serie von FS-Mutanten
mit je einem zusätzlich
am 5'-Ende deletierten
Exon hergestellt, um zu bestimmen, ob der N-terminale Anteil des
Follistatinproteins für
funktionelle Fragmente von Follistatin benötigt wird. Diese Mutanten werden
aus den Exons 3–6,
4–6, 5–6 und 6
bestehen, und die Bindung jeder dieser Formen wird auch mit dem
Wildtyp-FS (1–6)
verglichen. Das erste Exon, einschließlich der Signalsequenz, wird
in jedes Konstrukt eingebaut, um die richtige Sekretion jedes Moleküls zu erleichtern.
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