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Gebiet der
Erfindung
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Die
Erfindung betrifft ein Nucleinsäuremolekül, das für einen
Typ I-Rezeptor der TGF-β-Oberfamilie
mit modifizierter Wachstumshemmung kodiert, und dessen Verwendung.
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Hintergrund
der Erfindung
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Das
Zellwachstum und die Differenzierung zu einem multizellulären Organismus
werden in kritischer Weise durch Mitglieder der Oberfamilie der
transformierenden Wachstumsfaktoren-β (TGF-β) reguliert, wozu TGF-β, Activin/Inhibin,
morphogenetisches Knochenprotein (BMP), Müllersche Hemmsubstanz und von
glialen Zelllinien abgeleiteter neurotropher Faktor gehören. TGF-β ist ein
Prototyp in dieser Oberfamilie von strukturell verwandten Molekülen und
reguliert die Zellproliferation, die extrazelluläre Matrixbildung, die Wanderung, die
Haftung und zahlreiche andere zelluläre Funktionen, die für die Entwicklung
und Homeostase wichtig sind.
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Bestimmte
Mitglieder der TGF-β-Oberfamilie üben ihre
biologischen Wirkungen über
heteromere Komplexe von zwei Typen (Typ I und Typ II) von Transmembran-Rezeptoren
mit einer Serin/Threonin-kinase-Domäne in ihrer zytoplasmatischen
Region aus. In Säugetieren
wurden sechs verschiedene Typ I-Rezeptoren
identifiziert (ten Dijke et al., Prog. Growth Factor Res., Bd. 5
(1994), S. 55–72),
einschließlich
ein TGF-β-Typ
I-Rezeptor (TβR-I),
zwei Activin-Typ I-Rezeptoren
(ActR-I und ActR-IB), zwei BMP-Typ I-Rezeptoren (BMPR-IA und BMPR-IB)
und ein zusätzlicher
Typ I-Rezeptor mit der Bezeichnung ALK-1. Die Typ I-Rezeptoren weisen ähnliche
Größen (502–532 Aminosäurereste)
und untereinander in ihren Kinase-Domänen eine Identität der Aminosäuresequenz
von 60–90%
auf. Ferner enthalten Typ I-Rezeptoren eine als GS-Domäne (auch
als Typ I-Box bezeichnet) konservierte Sequenz in ihrer zytoplasmatischen
Juxtamembranregion auf (Attisano et al., Biochem. Biophys. Acta,
Bd. 1222 (1994), S. 71–80).
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Typ
I-Rezeptoren sind untereinander ähnlicher
als es bei bekannten Typ II-Rezeptoren,
einschließlich TGF-β-Typ II-Rezeptor
(TβR-II)
und zwei Activin Typ II-Rezeptoren
(ActR-II und ActR-IIB), der Fall ist und bilden somit eine Untergruppe
von Säugetier-Typ
I-Rezeptoren in der Familie der Rezeptor-Serin/Threoninkinasen.
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Untersuchungen über Transmembran-Serin/Threonin-kinasen
haben ergeben, dass bestimmte Mitglieder der TGF-β-Oberfamilie
ihre mehrfachen Wirkungen über
eine Bindung an besondere Sätze
von heteromeren Komplexen zwischen Typ I- und Typ II-Rezeptoren
ausüben.
Im Fall von TGF-β ist
TβR-II eine
konstitutiv wirksame Kinase und zur Bindung von TGF-β in Abwesenheit
von TβR-I
befähigt,
während
TβR-I für die Ligandenbindung
TβR-II benötigt. Die
TβR-I-Kinase scheint durch
Bildung eines heterooligomeren Komplexes aus TGF-β, TβR-II und
TβR-I aktiviert
zu werden. Im Komplex werden mehrere Serin- und Threoninreste in
der GS-Domäne
von TβR-I
durch TβR-II
phosphoryliert und die Phosphorylierung der GS-Domäne ist für die TGF-β-Signalgebung
wesentlich. Jedoch sind die funktionelle Rolle von phosphorylierten
Serin- und Threoninresten in der GS-Domäne sowie der Mechanismus der
Signalgebung nach der Phosphorylierung weitgehend unbekannt. Ferner
muss die funktionelle Bedeutung der zytoplasmatischen TβR-I-Region,
abgesehen von der GS-Domäne,
noch aufgeklärt
werden.
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Mutationsanalysen
unter Veränderung
von Serin- und Threoninresten in der TβR-I-GS-Domäne haben ergeben, dass eine
Phosphorylierung bestimmter Serine und Threonine durch TβR-II für die TGF-β-Signalgebung
wesentlich ist, obgleich dessen Signalgebungsaktivität offensichtlich
nicht von der Phosphorylierung eines bestimmten Serin- oder Threoninrestes
in der TTSGSGSG-Sequenz der GS-Domäne abhängt (Wieser et al., Embo. J.,
Bd. 14 (1995), S. 2199–2208).
Ferner lassen die kürzlich
erfolgte Identifizierung einer konstitutiv aktiven Form von TβR-I, die
kein TβR-II
und TGF-β für die Signalgebung
benötigt,
darauf schließen,
dass TβR-I als
strangabwärtiges
Signalgebungsmolekül
von TβR-II
wirkt (Wieser et al., (1995), a.a.O.).
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Trotz
der funktionellen Bedeutung der GS-Domäne für die Initiation von intrazellulären Signalen
ist wenig darüber
bekannt, wie die Signale nach der Phosphorylierung der GS-Domäne weitergeleitet
werden. Aufgrund der Kenntnis von Rezeptor-Tyrosin-kinasen könnte ein
möglicher
Mechanismus darin bestehen, dass die phosphorylierten Serin- und/oder
Threoninreste in der GS-Domäne
als Bindungsstellen für
das intrazelluläre
Substrat zur Aktivierung durch die TβR-I-Kinase wirken. Diese Hypothese stellt
eine attraktive Möglichkeit zur
Erklärung
des Signalgebungsmechanismus für
bestimmte gemeinsame Effekte dar, die durch die Mitglieder der TGF-β-Oberfamilie
induziert werden, da die GS-Domäne
der bekannten Typ I-Rezeptoren hochgradig konserviert ist. Andererseits
könnten
die Aminosäuresequenzen
der GS-Domäne
der Typ I-Rezeptoren untereinander zu ähnlich sein, um den Signalen,
die eine große
Vielzahl von durch die TGF-β-Oberfamilie induzierten
Reaktionen vermitteln, Spezifität
zu verleihen. Tatsächlich
weist ein chimärer
TβR-I-Rezeptor,
bei dem die TβR-I-GS-Domäne durch
die ActR-I-GS-Domäne
ersetzt ist, immer noch das TGF-β-induzierte,
antiproliferative Signal auf, das durch intaktes ActR-I nicht vermittelt
wird (Wieser et al., (1995), a.a.O.). Somit können eine oder mehrere bestimmte
Regionen, die von der GS-Domäne in Typ
I-Rezeptoren abweichen, für
unterschiedliche Signalgebungsaktivitäten der TGF-β-Oberfamilie
von Bedeutung sein.
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Sowohl
die Wachstumshemmung als auch die Matrixbildung durch TGF-β sind stark
und von physiologischer Bedeutung. Jedoch sind diese Effekte im
Verlauf von Krankheiten beim Menschen nicht immer erstrebenswert.
Beispielsweise wachsen Krebszellen autonom, so dass die wachstumshemmende
Wirkung von TGF-β von
Bedeutung ist. Eine durch TGF-β induzierte
Matrixbildung ist unerwünscht,
da sie eine Fibrose der Gewebe, die in bestimmten Krebsgeweben,
d. h. Magenkrebs und Hepatom, auftreten, induziert. Somit wird die
Matrixbildung durch TGF-β bei
der Krebsbehandlung vorzugsweise gehemmt, während die wachstumshemmende
Wirkung von TGF-β intakt
gehalten wird.
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Zusammenfassende
Darstellung der Erfindung
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Erfindungsgemäß werden
neuartige TGF-β-Rezeptoren
so mutiert, dass ihr Matrixbildungseffekt im wesentlichen erhalten
bleibt und sie eine verringerte (z. B. auf ein Niveau von nicht
mehr als 50% und vorzugsweise von nicht mehr als 25%) Wachstumshemmwirkung
aufweisen. Die Erfindung betrifft ferner beliebige Fragmente derartiger
Materialien, bei denen diese Eigenschaften erhalten geblieben sind,
sowie die entsprechenden Nucleotide.
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Die
neuartigen TβR-I-Mutanten
eignen sich zur Identifizierung von intrazellulären Substraten, die das Wachstumshemmsignal,
jedoch nicht das Matrixbildungssignal transduzieren. Die Mutanten
eignen sich ferner zum Screening von Arzneistoffen, die für diese
Zwecke verwendet werden können.
Die Mutanten eignen sich auch zur Erzeugung von transgenen Säugetieren,
wie Mäusen,
die infolgedessen zur Gewinnung von Erkenntnissen über die
sich in vivo ergebende Wachstumshemmwirkung und Matrixbildungswirkung
durch Vergleich von Wildtyp-TβR-I
und Kinase-Mangelmutanten von Bedeutung sein können.
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Speziell
haben wir die Rolle der zytoplasmatischen Juxtamembranregion, die
sich zwischen der Transmembrandomäne und der GS-Domäne von TβR-I befindet,
durch Mutationsanalysen unter Verwendung von mutanten Nerz-Lungenepithelzellen,
denen endogenes TβR-I
fehlt, untersucht. Bei Transfektion stellte Wildtyp-TβR-I die TGF-β-Signale
für die
Wachstumshemmung und die Induktion des Plasminogenaktivator-Inhibitors
(PAI)-I und von Fibronectin wieder her. Eine Deletionsmutante, TβR-I/I/JD1
(Δ150–181), der
die der GS-Domäne
vorausgehende Juxtamembranregion fehlt, band TGF-β zusammen
mit TβR-II
und transduzierte ein Signal, das zur Induktion von PAI-1 und Fibronectin,
jedoch nicht zur Wachstumshemmung führte. Rekombinante Rezeptoren
mit Mutationen, bei denen Serin 172 in Alanin (S172A) oder Threonin
176 in Valin (T176V) abgeändert
ist, verhielten sich ähnlich
wie Wildtyp TβR-I
bezüglich
ihrer Fähigkeiten
zur Bindung von TGF-β, bildeten
Komplexe mit TβR-II
und transduzierten ein Signal für
PAI-1 und Fibronectin. Ähnlich
wie bei TβR-I/JD1 (Δ150–181) waren
diese mutanten Missense-Rezeptoren bezüglich ihrer Wirkung zur Vermittlung eines
Wachstumshemmsignals beeinträchtigt.
Diese Beobachtungen zeigen, dass Serin 172 und Threonin 176 von
TβR-I für die Erzeugung
von extrazellulärem
Matrixprotein entbehrlich sind, jedoch für die Wachstumshemmung von
TGF-β wesentlich
sind.
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Beschreibung
der Zeichnungen
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1 zeigt
die Sequenzausrichtung der zytoplasmatischen Juxtamembranregion
von verschiedenen Typ I-Rezeptoren (ten Dijke et al., Prog. Growth
Factor Res., Bd. 5 (1994), S. 55–72).
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2 zeigt
die antiproliferative Reaktion in R4-2-Zellen, die mit Wildtyp-TβR-I und Mutantenderivaten transfiziert
sind. Die Ergebnisse sind als prozentuale Hemmung des Einbaus von
[3H]-Thymidin gegen zunehmende Konzentrationen
(ng/ml) von TGF-β1
wiedergegeben.
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3 zeigt
die Hemmung des Einbaus von [3H]-Thymidin
in R4-2-Zellen, die Wildtyp-TβR-I
und mutante Derivate exprimieren.
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Beschreibung
der Erfindung
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Es
werden die folgenden Abkürzungen
verwendet:
TGF-β,
transformierender Wachstumsfaktor-β; BMP, morphogenetisches Knochenprotein;
TβR, TGF-β-Rezeptor;
ActRI, Activin-Rezeptor; BMPR, BMP-Rezeptor; ALK, Activin-Rezeptor-artige
Kinase; PAI, Plasminogen-Aktivator-Inhibitor; PCR, Polymerase-Kettenreaktion;
GST, Glutathion S-transferase; DMEM, Dulbecco-modifiziertes Eagle-Medium;
FBS, fötales
Kälberserum;
PBS, phosphatgepufferte Kochsalzlösung; DSS, Disuccinimidylsuberat;
SDS, Natriumdodecylsulfat; DTT, Dithiothreit; IPTG, Isopropylthiogalactopyranosid.
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Verschiedene
Oligonucleotide (vergl. auch das Sequenzprotokoll; SEQ ID NO: 1–12) wurden
zur Erzeugung von Expressionskonstrukten verwendet. Die Sequenzen
der Oligonucleotid-Primer sind nachstehend in Richtung von 5' nach 3' angegeben. Die Nummerierung
beruht auf der Nucleotidsequenz von TβR-I (Franzen et al., Cell, Bd.
75 (1993), S. 681–692).
In die Primer eingebaute Restriktionsenzymstellen sind unterstrichen.
Der Anschluss des Deletionsprimers RISdel5 ist durch ein "-"-Zeichen angegeben.
RIS1-sma: GTCCCGGGCTGCCACAACCGCACT
(Nucleotide; 441–445)
RISdel2-sma:
GCCCCGGGTTATGATATGACA (Nucleotide; 544–555)
RIS0-hind: GGAAGCTTGACCATGGAGGCG
(Nucleotide; 1–13)
RIAS-not:
AGGCGGCCGCTTACATTTTGATGCC (Nucleotide; 1512–1498)
RIASdel1: GTGGCAGATATAGACCATCAAC
(Nucleotide; 446–425)
RISdel5:
CTATATCTGCCAC-TATGATATGACA (Nucleotide; 433–445, 544–555)
S-1: CCTGCATTAGATCGCCCTTTTAT
(Nucleotide; 492–514)
S-2:
CGCCCTTTTATTGCAGAGGGTACT (Nucleotide; 504–527)
S-3: GAGGGTACTGTGTTGAAAGAC
(Nucleotide; 519–539)
AS-1:
ATAAAAGGGCGATCTAATGCAGG (Nucleotide; 514–492)
AS-2: AGTACCCTCTGCAATAAAAGGGCG
(Nucleotide; 527–504)
AS-3:
GTCTTTCAACACAGTACCCTC (Nucleotide; 539–519)
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cDNA-Konstruktionen – Stabile
Expressionsvektoren von Wildtyp-TβR-I
und mutante Derivate davon wurden durch Subklonieren von PCR-erzeugten
cDNA-Fragmenten in den pMEP4-Vektor, einen durch Zn2+ induzierbaren
Säugetier-Expressionsvektor
(Wrana et al., Cell, Bd. 71 (1992), S. 1003–1014), hergestellt. Zur Konstruktion
von Wildtyp-TβR-I-pMEP4
wurden der Primer RIS0-hind
und der Primer RIAS-not zur Amplifikation der Kodierungsregion von
TβR-I-cDNA verwendet. Die
Reaktionsbedingungen waren: 1 min bei 94°C, 1 min bei 48°C, 2 min
bei 72°C
für 30
Zyklen. Die PCR-Produkte wurden sodann mit HindIII und NotI verdaut und
in den pMEP4-Vektor subkloniert. Zur Konstruktion der Deletionsmutante
TβR-I/JD1
(Δ150–181) wurden die
Primer RIS0-hind und RIASdel1 zur Amplifikation des 5'-Teils des TβR-I-cDNA-Fragments
verwendet und die Primer RISdel5 und RIAS-not wurden für das 3'-Fragment verwendet.
Die beiden primären
PCR-Produkte wurden Gel-gereinigt, vermischt und der Reamplifikation
mit den Primern RIS0-hind und RIAS-not unterworfen. Die sekundären PCR-Produke
wurden mit HindIII und NotI verdaut und in den pMEP4-Vektor subkloniert. Gleichermaßen wurden
für die
Konstruktion der einzelnen Missense-Mutanten TβR-I/JM1 (S165A), TβR-I/JM2 (S172A)
und TβR-I/JM3
(T176V) der Primer RIS0-hind und der mutante Antisense-Primer (AS-1,
AS-2 bzw. AS-3) zur Amplifikation der 5'-Fragmente und der mutante Sense-Primer
(S-1, S-2 bzw. S-3)
und der Primer RIAS-not zur Amplifikation der 3'-Fragmente verwendet. Die PCR-Produkte
wurden in entsprechenden Kombinationen vermischt und mit den Primern
RIS0-hind und RIAS-not reamplifiziert. Für TβR-I/JM123 (S165A/S172A/T176V) wurde die
PCR unter Verwendung von TβR-I/JM1
als Matrize für
das 5'-Fragment
mit den Primern RIS0-hind und AS-2 und von TβR-I/JM3 als Matrize für das 3'-Fragment mit den
Primern S-2 und RIAS-not durchgeführt. Die beiden PCR-Fragmente
wurden vermischt und mit den Primern RIS0-hind und RIAS-not reamplifiziert.
Die SmaI-XbaI-Fragmente der mutanten PCR-Produkte wurden mit der
entsprechenden Region des Wildtyp-TβR-I-Plasmids ausgetauscht.
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Expressionsvektoren
für die
bakterielle Expression von Wildtyp-TβR-I-Glutathione S-transferase (GST)-Fusionsproteinen
(GST-WT), der Deletionsmutante davon GST-JD1 (Δ150–181) und der Missense-Mutanten
davon GST-JM1 (S165A), GSTJM2 (S172A), GST-JM3 (T176V) und GST-JM1 23(S165A/S172A/T176V)
wurden durch Insertion von PCR-erzeugten Fragmenten der entsprechenden
zytoplasmatischen Regionen von TβR-I
in pGEX-4T-1 (Pharmacia) unter Verwendung von deren stabilen Expressionsplasmiden
als Matrizen mit RIS1-sma oder RISdel2-sma als Sense-Primer und
RIAS-not als Antisense-Primer erhalten. Folgende PCR-Bedingungen
wurden eingehalten: 1 min bei 94°C,
1 min bei 54°C
und 1 min bei 72°C
für 25
Zyklen. Die erhaltenen PCR-Produkte für die GST-Fusionsproteinkonstrukte
wurden mit SmaI und NotI verdaut und im Raster in pGEX-4T-1 ligiert.
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Die
Strukturen der PCR-amplifizierten Region der Rekombinanten wurden
alle durch Sequenzierung unter Verwendung eines Sequenase DNA-Sequenzierungskits
(U.S. Biochemical) bestätigt.
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Zellkultur
und Transfektion – Die
Mv1Lu-Nerz-Lungenepithelzellen (CCL-64; American Type Culture Collection)
und die R-mutanten Mv1Lu-Zellen (Klon 4-2; R4-2) (Laiho et al., J. Biol. Chem.,
Bd. 265 (1990), S. 18518–18524)
wurden in DMEM (Nissui), das mit 10% FBS und 100 Einheiten/ml Penicillin
ergänzt
war, gehalten. Zur Erzeugung von stabilen Transfektanten, die die
verschiedenen mutanten Formen von TβR-I exprimieren, wurden R4-2-Zellen
durch das Calciumphosphat-Fällungsverfahren
unter Verwendung eines eukaryontischen Transfektionskits (Promega)
transfiziert. Die Selektion von transfizierten Zellen wurde in Gegenwart von
120 U/ml Hygromycin B (Wako Chemicals) durchgeführt. Resistente Zellkolonien
wurden auf die Expression von TβR-I
und dessen Mutanten durch Rezeptor-Affinitätsmarkierungstests unter Verwendung
von 125I-TGF-β1 nach Induktion
der rekombinanten Proteine durch ZnCl2 geprüft. Mehr
als zwei unabhängige
Klone für
jede der Transfektanten wurden den folgenden Experimenten unterworfen.
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Rezeptorbindungstest
von TβR-I-Mutanten – Rekombinantes,
humanes TGF-β1
(Kirin Brewery Company) wurde unter Anwendung des Chloramin T-Verfahrens gemäß Frolik
et al., J. Biol. Chem., Bd. 259 (1984), S. 10995–11000 iodiert. Affinitäts-Vernetzungsexperimente
wurden mit Zellen durchgeführt,
die 6 Stunden in DMEM mit einem Gehalt an 0,2% FBS mit oder ohne
100 μM ZnCl2 vorbehandelt worden waren, wonach sich die
Bindung von 125-I-TGF-β1 in PBS mit einem Gehalt an
0,1% Rinderserumalbumin für
3 Stunden bei 4°C anschloss.
Nach 3-maligem Waschen der Zellen mit PBS wurden die Liganden-Rezeptor-Komplexe mit 0,27 mM
DSS (Pierce Chemical Co.) vernetzt. Die Zellen wurden 1- mal mit 10 mM Tris-HCl
(pH-Wert 7,4) mit einem Gehalt an 1 mM EDTA und 10% Glycerin gewaschen
und durch Inkubation in TNE Puffer (10 mM Tris-HCl, pH-Wert 7,5, 150 mM
NaCl, 1 mM EDTA, 1% NP-40) mit einem Gehalt an 1,5% Aprotinin für 20 Minuten
bei 4°C
in Lösung
gebracht. Zur Immunopräzipitation
der vernetzten Komplexe wurden sodann Zelllysate mit einem Antiserum
gegen TβR-II
(Franzen et al., Cell, Bd. 75 (1993), S. 681–692) für 60 Minuten bei 4°C inkubiert. Immunkomplexe
wurden an Protein A-Sepharose (Kabi Pharmacia) für 45 Minuten bei 4°C gebunden,
1-mal mit TNE-Puffer gewaschen und durch Sieden in SDS-Probenpuffer (100
mM Tris, pH-Wert 8,8, 0,01% Bromphenolblau, 36% Glycerin, 4% SDS)
in Gegenwart von 10 mM Dithiothreit (DTT) eluiert. Die Proben wurden durch
SDS-8,5% Polyacrylamid-Gelelektrophorese und mit dem Fuji BAS 2000
Bio-Imaging-Analysator (Fuji Photo Film) analysiert.
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Zellproliferationstest – Zellen
wurden in Platten mit 24 Vertiefungen in einer Menge von 5 × 104 Zellen pro Vertiefung in DMEM mit einem
Gehalt an 10% FBS ausgestrichen, über Nacht gezüchtet und
in DMEM mit einem Gehalt an 0,2% FBS in Gegenwart oder Abwesenheit
von 100 μM
ZnCl2 für
5 Stunden platziert. Sodann wurden die Zellen mit TGF-β1 versetzt,
weitere 16 Stunden inkubiert und mit 1 μCi/ml [3H]-Thymidin
(6,7 Ci/mmol, Amersham) für
2 Stunden gepulst. Sodann wurden die Zellen auf Eis mit 12,5% Trichloressigsäure fixiert,
mit 1 N NaOH lysiert, und der [3H]-Thymidin-Einbau
in die DNA wurde mit einem Flüssigszintillationszähler bestimmt.
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PAI-1-Test – PAI-1-Tests
wurden gemäß früheren Angaben
unter geringfügigen
Modifikationen durchgeführt
(Carcamo et al., Mol. Cell. Biol., Bd. 14 (1994), S. 3810–3821).
Kurz zusammengefasst, subkonfluente Zellen in Platten mit 6 Vertiefungen
wurden 5 Stunden mit DMEM, das 0,2% FBS und 100 μM ZnCl2 enthielt, inkubiert.
Die Zellen wurden 1-mal mit PBS gewaschen und 4 Stunden in methionin-
und cysteinfreiem DMEM (ICN Biomedicals Inc.) mit einem Gehalt an
100 μM ZnCl2 mit oder ohne 50 ng/ml TGF-β1 inkubiert.
Während der
letzten 2 Stunden der Inkubation wurden 30 μCi eines Gemisches aus [35S]-Methionin
und [35S]-Cystein (Pro-mix-Zellmarkierungsgemisch,
Amersham) zu den Zellen gegeben. Sodann wurden die Zellen entfernt,
indem sie 1-mal mit PBS, 4-mal in 10 mM Tris-HCl, pH-Wert 8,0, 0.5%
Natriumdesoxycholat, 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid, 2-mal in
2 mM Tris-HCl, pHWert 8,0 und 1-mal in PBS gewaschen wurden. Proteine
wurden von den Kunststoffen durch SDS-Probenpuffer mit einem Gehalt an 10
mM DTT extrahiert und durch SDS-10% Polyacrylamid-Gelelektrophorese
und ein Bio-Imaging-Analysengerät
analysiert.
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Fibronectin-Test – Eine Messung
von Fibronectin wurde gemäß früheren Angaben
unter geringfügigen Modifikationen
durchgeführt
(Wrana et al., (1992), a.a.O.). Zellen wurden über Nacht in Platten mit 6
Vertiefungen 5 Stunden mit DMEM mit einem Gehalt an 0,2% FBS und
100 μM ZnCl2 inkubiert. Sodann wurden die Zellen gegebenenfalls
mit 50 ng/ml TGF-β1
versetzt, 20 Stunden inkubiert und mit 50 μCi/ml eines Gemisches aus [35S]-Methionin und [35S]-Cystein in methionin-
und cysteinfreiem DMEM während
der letzten 4 Stunden markiert. Das markierte Kulturmedium wurde über Nacht
mit 100 μl
Gelatine-Sepharose
(Pharmacia) in Gegenwart von 0.5% Triton X-100 inkubiert. Die Kügelchen
wurden 1-mal in mit Tris-gepufferter Kochsalzlösung (50 mM Tris-HCl, pH-Wert
7,4, 150 mM NaCl), 1-mal in 50 mM Tris-HCl (pH-Wert 7,4), 0,5 M
NaCl und 1-mal in mit Tris gepufferter Kochsalzlösung gewaschen. Das Fibronectin
wurde durch Sieden in SDS-Probenpuffer in Gegenwart von 10 mM DTT
eluiert. Sodann wurden die Proben durch SDS-7% Polyacrylamid-Gelelektrophorese
und mit einem Bio-Imaging Analysengerät analysiert.
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GST-Fusionsproteine – Die GST-Fusionsproteinkonstrukte
wurden in JM109-Bakterien transformiert. Über Nacht gezüchtete Kulturen
wurden in frischem Medium 1:8 verdünnt. Nach 2-stündigem Schütteln wurde Isopropylthiogalactopyranosid
(IPTG, 0,5 mM Endkonzentration) zugegeben. Nach weiterem, 3-stündigem Schütteln bei
30°C wurden
die Zellen in PBS mit einem Gehalt an 1% Triton X-100, 1% Tween-20,
1% Natriumdesoxycholat und 1 mM DTT lysiert, 1 Minute mit Ultraschall
behandelt und 5 Minuten zentrifugiert. Die Überstände wurden mit Glutathion-Sepharose-Kügelchen
(Glutathion-Sepharose 4B; Pharmacia) (5:1 Vol./Vol.) 1 Stunde bei
4°C inkubiert.
Nach gründlichem
Waschen in PBS wurden die Kügelchen
Phosphorylierungstests unterzogen.
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Protein-kinase-Test – 25 μl Glutathion-Sepharose-Kügelchen
mit anhaftenden GST-Fusionsproteinen wurden 1-mal mit Kinase-Puffer
(20 mM Hepes, pH-Wert 7,4, 100 mM NaCl, 10 mM MnCl2,
0,5 mM DTT, 0,05% Triton X100) gewaschen. 25 μl Kinase-Puffer mit einem Gehalt
an 1 μCi
[γ32P]-ATP (Amersham) wurden zugegeben. Die
Kügelchen
wurden 15 Minuten bei 4°C
inkubiert. Proteine wurden an SDS-10% Polyacrylamidgel unter reduzierenden
Bedingungen aufgetrennt und mit einem Bio-Imaging-Analysengerät analysiert.
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Nachstehend
werden erfindungsgemäße Produkte
und ihre Verwendbarkeit erläutert.
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32
Aminosäuren
von TβR-I
in der Juxtamembranregion wurden deletiert, wodurch man TβR-I/JD1 (Δ150–181) erhielt.
Das Wildtyp TβR-I
und mutantes TβR-I/JD1 (Δ150–181) in
pMEP4, einem Zn2+-induzierbaren Vektor,
wurden in stabiler Weise in eine TβR-I-defektive Mv1Lu-Zelllinie
(R4-2) transfiziert. Die Expression der exogenen Rezeptoren und
ihre Komplexbildung mit dem endogenen TβR-II wurden durch Affinitätsvernetzung
der Zellen unter Verwendung von 125ITGF-β1 und anschließende Immunopräzipitation
der Liganden-Rezeptor-Komplexe mit anti-TβR-II-Antiserum getestet. TβR-I/JD1 (Δ150–181) war
wie Wildtyp-TβR-I
zur Bindung von TGF-β in
einer Zn2+-induzierbaren Weise und zur Bildung
eines physiologischen Komplexes mit TβR-II befähigt.
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Die
Signalgebungsaktivitäten
von TβR-I/JD1
(Δ150–181) wurden
bestimmt, indem man dessen Fähigkeit
zur Wiederherstellung von biologischen Reaktionen auf TGF-β in R4-2-Zellen
testete. Die Induktion von PAI-1 und Fibronectin wurde geprüft, da diese
Reaktionen in den Mv1Lu-Ausgangszellen gut charakterisiert sind
und für
die verschiedenen Matrixproteine, die durch TGF-β induziert werden, repräsentativ
sind. In Mv1Lu-Zellen war die Synthese von PAI-1 durch Behandlung
mit TGF-β erhöht, jedoch
nicht in R4-2-Zellen, die mit dem Vektor allein transfiziert waren.
Wenn R4-2-Zellen mit dem Wildtyp TβR-I oder TβR-I/JD1 (Δ150–181) transfiziert wurden,
erzeugten die Zellen PAI-1 bei Behandlung mit TGF-β in Gegenwart
von ZnCl2. Gleichermaßen wurde die Fibronectin-Bildung
durch TGF-β in
R4-2-Zellen, die mit dem Wildtyp TβR-I transfiziert waren, wiederhergestellt
und weniger stark in mit TβR-I/JD1
(Δ150–181) transfizierten
Zellen. Die Bildung von PAI-1 und Fibronectin wurde in Abwesenheit
von ZnCl2 nicht stimuliert, was darauf hinweist,
dass die. Signale für
die Induktion von PAI-1 und Fibronectin durch die exogenen Rezeptoren
gerettet wurden.
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Zur
Feststellung, ob TβR-I/JD1
(Δ150–181) zur
Wiederherstellung des antiproliferativen TGF-β-Effekts befähigt ist, wurde ein DNA-Synthesetest
durch Messen des Einbaus von [3H]-Thymidin
in die DNA durchgeführt
(2). Bei Behandlung mit TGF-β wurde der Einbau von [3H]-Thymidin in die DNA von Mv1Lu-Zellen
in dosisabhängiger
Weise bis zu 97% (ausgefüllte
Quadrate) gehemmt, während
TGF-β keinen
Einfluss auf den Einbau von [3H]-Thymidin
in die mit dem Vektor allein transfizierten R4-2-Zellen (offene
Quadrate) hatte. Wenn mit Wildtyp-TβR-I transfizierte R4-2-Zellen
mit TGF-β in
Gegenwart von ZnCl2 (ausgefüllte Kreise)
behandelt wurden, wurde der Einbau von [3H]-Thymidin
in die DNA um 65–75%
gehemmt, während
nur eine marginale Hemmung in Abwesenheit von ZnCl2 beobachtet
wurde (offene Kreise). Im Gegensatz dazu waren mit TβR-I/JD1 (Δ150–181) transfizierte
R4-2-Zellen gegenüber
einer TGF-β-Wachstumshemmung
in Gegenwart oder Abwesenheit von ZnCl2 (ausgefüllte Dreiecke
bzw. offene Dreiecke) beständig.
Diese Ergebnisse ließen darauf
schließen,
dass die N-terminale Hälfte
der zytoplasmatischen Juxtamembrandomäne von TβR-I für die Signalgebung von extrazellulären Matrixreaktionen
nicht erforderlich war, während
sie für
die Signalgebung der Wachstumshemmwirkung wesentlich war.
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Die
Unfähigkeit
von TβR-I/JD1
(Δ150–181) zur
Vermittlung eines Wachstumshemmsignals eröffnet die Möglichkeit, dass die N-terminale
Hälfte
der zytoplasmatischen Juxtamembrandomäne von TβR-I eine Stelle zur Wechselwirkung
mit einer stromabwärtigen
Komponente enthält,
die ein für
die Wachstumshemmung spezifisches Signal überträgt. Alternativ könnte eine
derartige Deletion die strukturelle Konformation verändern, was
einen Rezeptor ergibt, der zur Übertragung
von Signalen unfähig
ist, selbst wenn die Substrat-Wechselwirkungsstellen
erhalten blieben. Um auf diese Fragen einzugehen, wurden Missense-Mutationen
anstelle einer Deletion in bestimmte Serin- und Threoninreste in
der TβR-I-Juxtamembranregion,
die in TβR-I/JD1 (Δ150–181) deletiert
war, eingeführt.
Als ein erster Versuch wurden Serin 165, Serin 172 und Threonin
176 ausgewählt,
da diese Serin- und Threoninreste unter den Typ I-Rezeptoren für die TGF-β-Oberfamilie
eher konserviert waren, insbesondere in ActR-IB, das Wachstumshemm-
und PAI-1-Signale durch Activin A überträgt. Ser- und Thr-Reste wurden gleichzeitig oder
individuell zu Alanin- bzw. Valinresten mutiert, wodurch vier verschiedene
Expressionskonstrukte unter Einschluss von TβR-I/JM123 (S165A/S172A/T176V),
TβR-I/JM1 (S165A),
TβR-I/JM2
(S172A) und TβR-I/JM3
(T176V) erhalten wurden. Diese Konstrukte wurden in stabiler Weise
in R4-2-Zellen transfiziert und ihre Expression, TGF-β-Bindung
und physikalische Assoziation mit TβR-II wurden durch Affinitätsvernetzung
mit 125I-TGF-β1 und anschließende Immunopräzipitation
unter Verwendung von anti-TβR-II-Antiserum
geprüft.
Sämtliche
verschiedenen Rezeptormutanten wurden an der Zelloberfläche exprimiert
und banden TGF-β im
Komplex mit TβR-II
in einer von Zn2+ abhängigen Weise.
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Zum
Testen der Signalgebungsaktivität
dieser Missense-Mutantenformen von TβR-I wurden die transfizierten
Zellen Analysen auf extrazelluläre
Matrixbildung und Wachstumshemmung durch TGF-β unterzogen. Bei PAI-I und Fibronectin-Tests,
wie bei Wildtyp-TβR-I
und TβR-I-IND1
(Δ150–181), stellten
die analysierten Konstrukte unter Einschluss von TβR-I/JM123
(S165A/S172A/T176V), TβR-I/JM1
(S165A), TβR-I/JM2 (S172A)
und TβR-I/JM3
(T176V) die Reaktionsfähigkeit
auf TGF-β wieder
her. In Bezug auf den antiproliferativen TGF-β-Effekt vermittelte das TβR-I/JM1 (S165A)-Konstrukt
(3F) eine Wachstumshemmwirkung, die mit
der von Wildtyp-TβR-I
(3C) vermittelten Wirkung vergleichbar
war, während
TβR-I/JM123 (S165A/S172A/T176V)
(3E), TβR-I/JM2 (S172A) (3G) und TβR-I/JM3 (T176V) (3H) zur Wiederherstellung dieser Aktivität nicht
befähigt
waren. Der Balken A in 3 gibt die Ergebnisse für Mv1Lu
(keine DNA transfiziert) wieder.
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Die übrigen Balken
geben die Ergebnisse für
R4-2-Zellen wieder, wobei B für
den Vektor und D für TβR-I/JD1 (Δ150–181) stehen.
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Der
Unterschied zwischen TβR-I
und dessen mutanten Derivaten bezüglich ihrer Fähigkeit
zur Wiederherstellung der Reaktivität auf TGF-β kann auf eine veränderte katalytische
Aktivität
ihrer Rezeptor-Kinase zurückzuführen sein.
Diesbezüglich
wurde die Kinase-Aktivität
bestimmt, indem man die zytoplasmatischen Regionen von TβR-I und deren
Mutanten als GST-Fusionsproteine
in E. coli exprimierte und ihre Kinase-Aktivitäten in vitro testete. Die Proteinprodukte
von Wildtyp-TβR-I
(GST-WT) und sämtliche
mutanten Konstrukte, einschließlich
GST-JD1 (Δ150–181), GST-JM123
(S165A/S172A/T176V), GST-JM1 (S165A), GST-JM2 (S172A) und GST-JM3
(T176V) wurden in einem ähnlichen
Ausmaß phosphoryliert.
Diese Beobachtungen zeigen, dass sämtliche mutanten Konstrukte
von TβR-I,
die in diesen Experimenten verwendet wurden, zumindest in vitro
als Kinasen aktiv waren.
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