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Gebiet der
Erfindung
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Diese Erfindung betrifft u. a. ein
Verfahren zur Veränderung
eines oder mehrerer kennzeichnender Merkmale des Endometrialgewebes
von Säugetieren.
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Hintergrund der Erfindung
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Endometrialphysiologie
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Zwei Hauptereignisse sind erforderlich,
damit sich der Embryo im Säugetier-Uterus etabliert;
erstens, die Vorbereitung des Endometriums, so dass es aufnahmefähig ist
für das
Vorhandensein eines Keimbläschens,
welches sich dann implantieren kann und durch die Bildung der Plazenta
die ernährende
Stütze
findet; und zweitens die Abänderung
der myometrialen Aktivität,
die ruhig werden muss und dadurch dem Keimbläschen die Möglichkeit bietet, sich in dem
Uterushohlraum sesshaft zu werden ohne die Gefahr der Ausstoßung. Diese
beiden Ereignisse werden durch die Wirkung der Schwangerschaftshormone
gesteuert, von denen die Oestrogene und das Progesteron besonders
wichtig sind. Diese Steroidhormone wirken auf das Endometrium und
das Myometrium durch ihre Rezeptoren, die sich im Kern von Zielzellen
befinden. Sobald der steroid-nukleare Rezeptorenkomplex aktiviert
ist, tritt er mit spezifischen Bereichen innerhalb der DNA in Wechselwirkung,
um Gene, welche Proteine und Polypeptide als Enzyme oder Wachstumsfaktoren
kodieren, zu stimulieren, umzuprägen
oder rückzuprägen.
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Die Initiierung der Implantation
kommt durch eine Kaskade biochemischer und biophysikalischer Veränderungen
zustande. Adhäsionsmoleküle (z. B.
CAM 105) sind in den frühen
Stadien der Anlagerung des Keimbläschens an die Wand des Uterus
beteiligt. Danach wenden das Keimbläschen und das Endometrium verschiedene
Tricks an, um die Intimität
zwischen dem fötalen
und dem maternen Gewebe zu verbessern. Bei Huftieren wandern Trophoblastzellen,
welche die äußerste Schicht
des Keimbläschens
bilden, in das Epithelium des Uterus, mit welchem sie anschließend verschmelzen.
Die Zellwanderung ist bei Frauen einen Schritt weiter geführt, weil
es hier nicht nur isolierte oder spezifische Zelltypen sind, die
wandern, sondern große
Bereiche an Trophoblast, die sich unter die Epithelialzellen des
Uterus mischen. Damit dies geschieht, schmelzen einige der Trophoblastzellen
zusammen, um ein Synzytium zu bilden. Der Vorgang läuft sehr
schnell ab, und der Embryo wird ohne größere deutliche Degenerierung
am Uterusepitheliumin in den Uterusgeweben etabliert. Bei einigen
Spezies ist der Vorgang der Implantation verzögert, entweder um Anregungen
aus der Umwelt abzuwarten, die gewährleisten, dass die Jungen
zu günstigen
Zeiten des Jahres geboren werden, oder durch physiologische Faktoren
wie beispielsweise die Laktation, so dass die Mutter mit dem Absetzen
des vorherigen Wurfs aufgehört
hat, bevor die nächste
Schwangerschaft voll einsetzt.
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Die Vorbereitung des Uterus zur Implantation
wird durch die Sekretion von Ovarialhormonen reguliert. Der Transport
des befruchteten Eies durch den Eileiter muss zeitlich so genau
abgestimmt sein, dass es im Uterus zum richtigen Entwicklungszeitpunkt
ankommt und wenn sich der Uterus in einem zur Aufnahme des Eies
bereiten Zustand befindet. Unter den meisten Bedingungen ist der
Uterus gegenüber
dem Embryo feindlich, in der Tat sogar feindlicher als manche anderen
Bereiche des Körpers.
Die epitheliale Auskleidung des Uterus ist unter den meisten Bedingungen
gegenüber
der Anlagerung und dem Eindringen durch den Trophoblast resistent,
und es passiert nur unter sehr genauen hormonellen Zuständen, dass
dieser Widerstand gelockert wird.
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Bei Mäusen und Ratten haben die unbegatteten
Tiere keinen vollen Östruszyklus,
weil sie keinen normalen sekretorischen Gelbkörper bilden, der ansteigende
Mengen von Progesteron erzeugt. Wenn die Paarung im Brunststadium
erfolgt, also zu einer Zeit, in der hohe Konzentrationen an Östrogenen
durch den ovariellen Follikel abgesondert werden, vor denen das
Ei geschützt
ist, so bildet sich ein Gelbkörper
an der Stelle des gesprungenen Follikels, ansteigende Konzentrationen
an Progesteron werden dann abgesondert, die Implantation erfolgt
und die Schwangerschaft schreitet voran (Länge 21 Tage). Wenn eine unfruchtbare
Paarung erfolgt, passieren ähnliche
Ereignisse, außer
dass der Gelbkörper
nur ungefähr
11 Tage andauert und Scheinträchtigkeit
verkürzt
ist.
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Die zellularen und biochemischen
Veränderungen,
die im Endometrium stattfinden, sind am gründlichsten bei der Maus und
bei der Ratte untersucht worden, obgleich die Informationen über diese
Aspekte bei Frauen in den letzten Jahren wesentlich zugenommen haben.
Das Endometrium besteht in allen Spezies aus drei Hauptgeweben – dem luminalen
Epithelium, dem glandularen Epithelium und der Stroma. Die Zellproliferation
erfolgt in den drei Geweben zu unterschiedlichen Zeiten. Die Luminalzellen
proliferieren genau vor dem Brunststadium (Proestrus) unter dem
Einfluss der ansteigenden Konzentration an Östrogenen, die durch die Follikel
im Ovarium erzeugt werden. Zum Tag 1 der Trächtigkeit (Tag des Paarungspfropfs
bei den Nagetieren) haben sie die Teilung beendet, gehen dann aber
einen zweiten, wenn auch kleineren Aktivitätssprung am Tag 3 ein. Die
Glandularzellen zeigen die stärkste
Aktivität
am Tag 4, die dann abnimmt. Die Stromazellen proliferieren bis zum
Tag 4 nicht, aber danach, und zwar unter dem Einfluss des Progesterons
erreichen sie hohe Werte der Proliferation bis zum Tag 5. Bei Frauen
ist weniger über
diese Veränderungen
bekannt, die den Vorgang der Implantation ankündigen, aber es scheint, dass
es einen Spitzenwert der Proliferation bei den Epithelzellen während der
Follikelphase des Zyklus und bei den Stromazellen während der
lutealen Phase oder sekretorischen Phase wie bei der Maus und der
Ratte gibt.
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Es ist nicht völlig geklärt, was der Zweck der endometrialen
Zellproliferation ist. Man nimmt an, dass sich das Endometrium auf
die Implantation durch die Erhöhung
der Anzahl derjenigen Zellen vorbereitet, die eine ernährende und
sekretorische Funktion erfüllen
(Glandularepithelium) und die in den ganz frühen Stadien der Plazentation
(Dezidualisierung) beteiligt sind. Als Voraussetzung einer erfolgreichen
Implantation kann die Zellmitose in Richtung auf eine Zelldifferenzierung
fortschreiten und spielt daher eine entscheidende Rolle bei den
frühen
Ereignissen der Etablierung der Trächtigkeit. Ein Beweis zur Stützung dieser
Rolle ist die endometriale Produktion von Wachstumsfaktoren (Mitogenen),
Cytokinen und nuklearen Onkogenen. Viele dieser Verbindungen werden
in erhöhten Konzentrationen
als Reaktion auf ovarielle Hormone, die durch ihre Rezeptoren wirken,
erzeugt.
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Was die Wachstumsfaktoren betrifft,
wird gegenwärtig
große
Aufmerksamkeit auf den epidermalen Wachstumsfaktor (EGF), den Heparin
bindenden epidermalen Wachstumsfaktor (HBEGF) und auf die Amphiregulin
und Insulin bindenden Wachstumsfaktoren (IGF-I und IGF-II) gelegt.
Ein Beweis für
die Wichtigkeit der lokalen (parakrinen) Wirkung von mindestens
einem dieser Wachstumsfaktoren, dem Amphiregulin, ist durch jüngste Experimente
an Mäusen
erbracht worden. Die Inhibition der implantationsspezifischen und
progesteronregulierten Gene für
Amphiregulin wurde durch das Anti-Progestin RU486 erzielt, und dies
führte
zur Verhinderung der Implantation (Das et al., Molecular Endocrinology
9, 691–705,
1995).
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Unter den Cytokinen hat man aus Gen-Knockout-Studien
herausgefunden, dass der Leukämie-inhibierende
Faktor (LIF) und der Colonie-stimulierende Faktor (CSF), die auch
vom Uterus der Maus zur Zeit der Implantation erzeugt werden, unerlässlich sind,
was zeigt, dass ihr Entfernen mit der Implantation und der normalen
Plazentation inkompatibel ist (Stewart et al., Nature 359, 76–79, 1992;
Pollard et al., Developmental Biology 148, 273–283, 1991).
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Unter den nuklearen Onkogenen, nehmen
die Konzentrationen von c-jun und c-fos (welche frühe Indikatoren der Gentranskription
sind) im Uterus nach der Östrogenverabreichung
zu und werden durch Progesteron inhibiert.
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Wichtige Unterschiede bestehen zwischen
verschiedenen Spezies im Umfang der Trophoblast-Invasion zum Zeitpunkt
der Implantation. Bei Frauen ist der frühe Trophoblast stark invasiv,
während
bei Schweinen, die eine nicht-invasive Form der Implantation aufweisen,
das endometriale Epithelium über
den dreimonatigen Trächtigkeitszeitraum
niemals unterbrochen wird. Fälle
ausbleibender Implantation sind bei beiden Spezies hoch und erreichen
60 bzw. 30%. Die Gründe
für diese
hohe Fehlerrate sind komplex und sind nicht völlig erklärbar. Bei Frauen ist ungefähr die Hälfte der
Verlustfälle
genetischen Abnormitäten
zuzuschreiben, aber bei Schweinen, wie auch bei anderen Huftieren,
wo die Verlustrate auch hoch ist, belaufen sich die genetischen
Defekte nur auf einige Prozente der Gesamtanzahl.
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Nach der Fehlimplantation verursacht
bei Frauen eine Abnahme der Progesteronsekretion Blutung wie am
Ende des normalen Menstruationszyklus; dies tritt jedoch bei den
meisten anderen Tieren nicht auf. Unregelmäßigkeiten bei der Menstruation
als auch bei der Implantation sind üblich. Außerdem ist die Menstruationsblutung,
entweder als Folge einer sequentiellen Hormontherapie oder in Verbindung
mit einer kontinuierlichen kombinierten Hormonersatztherapie oder
langzeitwirkenden Nur-Progestin-Antizeptiva eine signifikante Ursache
der Unpässlichkeit
bei Frauen. Die dieser Blutung zu Grunde liegenden Gründe sind
der Kernpunkt vieler derzeit laufender Untersuchungen im Hinblick
auf biochemische Mechanismen (z. B. Prostaglandine, Enzyme, Polypeptide
und Proteine, vasoaktive Verbindungen wie beispielsweise der plättchenaktivierende Faktor
PAF und der Vaskular-Endothelial-Faktor VEGF) und auf zellulare
Mechanismen (z. B. am Uterus ansässige
wandernde Zellen, die immunosuppressive Verbindungen erzeugen).
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Das gegenwärtige Verständnis der reproduktiven Prozesse
kreist weitgehend um die Steuerung der Steroidhormonproduktion und
die Wirkungen dieser Hormone auf ihre Zielgewebe. Jedoch werden
in zunehmendem Maße
die parakrinen und autokrinen Faktoren als Mediatoren mit Schlüsselwirkung
für die
reproduktive Funktion ungeachtet ihrer Wechselwirkung mit den Steroiden
angesehen (Benton, 1991, Current Opinion in Cell Biology 3, 171–175; Rozengurt,
1992, Current Opinion in Cell Biology 4, 161–165; Tartakovsky et al., 1991,
Developmental Biology 146, 345–352;
Robertson et al., 1992, Current Opinion in Immunology 4, 585–590; Smith,
1994, Human Reproduction 9, 936–946;
und Tabibzadeh, 1994, Human Reproduction 9, 947–967). Das deutlichste Beispiel
hierfür
sieht man bei der ovarektomisierten Maus. Bei diesem Modell vollzieht
der Uterus ein markiertes Wachstum als Reaktion auf eine Einzeldosis
Estradiol. Diese Wirkung kann durch Anti-TGFα-Antikörper (TGF ist der „transformierende
Wachstumsfaktor) abgeblockt werden, indem man annimmt, dass die
mitogenen Wirkungen des Östrogens
in diesem Gewebe durch TGFα vermittelt
werden (Nelson et al., 1992, Endocrinology 131, 1657–1664).
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Folglich beruht die medizinische
Intervention in der Gynäkologie
weitgehend auf der steroidalen/antisteroidalen Regulierung des Uterus
(Yen & Jaffe,
1991, in „Reproductive
Endocrinology" Eds.
Yen, Jaffe & Benton,
Pub. WB Saunders, Philadelphia; Baird, 1993, British Medical Bulletin
49, 73–78).
Trotz des außer
Zweifel stehenden Erfolgs dieser Herangehensweise sind 20 Jahre
lang keine begrifflichen Fortschritte bei der Technologie der Kontrazeptiva
gemacht worden, kein Mittel ist identifiziert worden, um die Implantation
zu verbessern, keine Fortschritte sind in der Förderung des Wachstums und der
Entwicklung der Plazenta erzielt worden, und es sind keine neuen
Herangehensweisen gefunden worden, um gutartige gynäkologische
Erkrankungen (menstruale Dysfunktion und Fasergeschwulste) zu behandeln.
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In Bezug auf den Einsatz von „Genübertragung" bei Säugetieren
zur Änderung
des Gentyps von zumindest einigen Zellen in einem bestimmten Gewebe
oder in bestimmten Geweben sind eine Anzahl von Veröffentlichungen
erschienen. Insbesondere ist bekannt, dass man eine „Gentherapie" von Menschen durch
die Einführung
von Nukleinsäuresequenzen
in Empfänger
versucht mit dem Ziel, eine genetische Mangelerscheinung beim Empfänger durch
die Expression von Polypeptiden, die durch die eingeführten Nukleinsäuresequenzen
kodiert sind, zu überwinden.
Es sind beispielsweise Gentherapieversuche durchgeführt worden,
bei denen DNA-Sequenzen (innerhalb viraler Vektoren inkorporiert)
in die Luftwege von Patienten mit zystischer Fibrose eingeführt worden,
um den Phänotyp
von mindesten einigen der Epithelialzellen, welche den Atemtrakt
der Patienten auskleiden, zu verändern.
Bis jetzt hat es also noch keine veröffentlichten Versuche gegeben,
DNA in das Endometrium von Säugetieren
einzuführen
trotz der dafür
vorhandenen geeigneten Technik.
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Zusammenfassung der Erfindung
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In einem Aspekt bietet die Erfindung
ein Verfahren zur Änderung
von einem oder mehreren charakteristischen Merkmalen von wenigstens
einigen der Zellen des reproduktiven Trakts eines Säugetier-Individuums
durch die Einführung
einer Nukleinsäure
in die besagten Zellen.
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In einem zweiten Aspekt liefert die
Erfindung eine Substanz, welche Nukleinsäure für die Verwendung zur Veränderung
von einem oder mehreren charakteristischen Merkmalen von wenigstens
einigen der Zellen des reproduktiven Trakts eines Säugetier-Individuums
enthält.
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In einem dritten Aspekt betrifft
Erfindung die Verwendung einer Substanz, welche Nukleinsäure enthält, zur Änderung
von einem oder mehreren charakteristischen Merkmalen von wenigstens
einigen der Zellen des reproduktiven Trakts eines Säugetier-Individuums.
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In einem vierten Aspekt betrifft
Erfindung die Verwendung einer Substanz, welche Nukleinsäure enthält, bei
der Darstellung einer Substanz zur Änderung von einem oder mehreren
charakteristischen Merkmalen von wenigstens einigen der Zellen des
reproduktiven Trakts eines Säugetier-Individuums
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In einem fünften Aspekt liefert die Erfindung
ein Verfahren zur Herstellung einer Substanz für die Verwendung zur Änderung
von einem oder mehreren charakteristischen Merkmalen von wenigstens
einigen der Zellen des reproduktiven Trakts eines Säugetier-Individuums,
wobei dieses Verfahren das Mischen einer Nukleinsäure mit
einer physiologisch verträglichen
Trägersubstanz
umfasst.
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Die vorliegende Erfindung kann in
keiner Weise als eine offensichtliche Erweiterung der Techniken
der Gentherapie betrachtet werden, von denen bereits bekannt ist,
dass sie zumindest teilweise erfolgreich sind, wenn sie auf die
Lungen von Patienten mit zystischer Fibrose angewendet werden. Vererbte
genetische Störungen
werden nicht für
irgendwelche der bekannten Erkrankungen des Endometriums für verantwortlich
erachtet, so dass es für
die Sachkundigen auf diesem Gebiet keinen Anreiz gegeben hätte, Techniken
der Gentherapie auf das Endometrium anzuwenden. Außerdem ist
das Epithelium des Endometriums von einem ganz anderen Typ (würfelähnlich,
abgeleitet vom Cölomepithel)
im Vergleich mit dem Lungenepithelium (das schichtförmig aufgebaut
ist), und daher konnte nicht vorausgesagt werden, dass es sich auf
eine analoge Art verhält.
Darüber
hinaus gibt es zumindest bei den Primaten ein zyklisches Abstoßen des
endometrialen Epitheliums, was darauf hinauslaufen würde, dass
dies den Verlust von irgendwelchen transfektierten Zellen verursachen
würde.
Schließlich
haben die Erfinder herausgefunden, dass es weder die Übertragung
der eingeführten
DNA in die Organe der Mutter noch in die Plazenta des Embryos gab;
beide könnten
vorgelegen und praktische Schwierigkeit verursacht haben.
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Typischerweise wird die Nukleinsäure in ein
weibliches Säugetier
(vorzugsweise eine Frau) eingeführt, und
insbesondere in dessen Endometrialzellen. Es ist wünschenswert,
dass die Nukleinsäure
in das glandulare Epithelium des Endometriums eingeführt wird.
Die Nukleinsäure
kann ein Polypeptid kodieren, welches bereits von Natur aus durch
die Zellen, in welche die Nukleinsäure eingeführt wird, dergestalt synthetisiert
worden ist, dass der Konzentrationswert der Expression jenes Polypeptids
mittels eines Gendosiereffekts erhöht wird. Andererseits kann
das Verfahren dazu benutzt werden, die Zellen zu induzieren, um
ein Polypeptid auszuprägen,
welches von jenen Zellen vorher nicht synthetisiert worden ist.
Das Polypeptid könnte
beispielsweise ein „künstliches" rekombinantes Polypeptid
sein, welches in der Natur nicht existiert wie beispielsweise ein schimärisches
Polypeptid, welches, gänzlich
oder teilweise, funktionelle Bereiche aus zwei oder mehr unterschiedlichen
Proteinen aufweist.
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Die Nukleinsäure ist vorzugsweise DNA, aber
man könnte
versuchen, RNA (entweder Sense-Strands oder Non-Sense-Strands) einzuführen. Ein
Antisense-Molekül könnte benutzt
werden, um die Expression eines Polypeptids in den Zellen, in welche
die Nukleinsäure
eingeführt
wird, zu hemmen oder sonstwie auf diese einzuwirken. Die eingeführte Nukleinsäuresequenz
kann eine Antisense-RNA oder kann auch eine die Synthese intrazellular
steuernde DNA-Sequenz der Antisense-RNA sein. Ein anderer Weg, eine
solche Inhibition zu erreichen, besteht darin, dass man in die Zellen
eine die Synthese steuernde Sequenz eines Ribozyms einführt, welches
dann spezifisch die mRNA spaltet, die zur Synthese desjenigen Polypeptids
benötigt
wird, dessen Expression man zu hemmen sucht.
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Die Erfinder haben herausgefunden,
dass die Zeit der Verabreichung der Nukleinsäure (relativ zum Stadium des
reproduktiven Zyklus) die Effizienz der Aufnahme der Nukleinsäure stark
beeinflusst. Die Erfinder haben herausgefunden, dass, um den optimalen
Grad der Aufnahme der verabreichten Nukleinsäure zu erreichen, es im Allgemeinen
für die
Verabreichung erforderlich ist, dass sie in dem der Ovulation folgenden
Zeitraum bis zu dem Tag und einschließlich des Tages, an welchem
ein Spitzenwert der Progesteronkonzentration im Blut vorhanden ist,
erfolgt. Die Progesteronkonzentration hat normalerweise einen Spitzenwert
um einen Zeitpunkt ähnlich
demjenigen, zu welchem ein Embryo, wenn er im Uterus vorhanden ist,
implantiert werden könnte.
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So haben beispielsweise die Erfinder
herausgefunden, dass die maximale Aufnahme des verabreichten DNA
durch das Endometrium der Maus am Tag 2–3 im Zyklus auftritt (wobei
als Tag 1 der Tag genommen wird, an welchem ein Vaginalpfropf zuerst
festgestellt wird). Bei Menschen erfolgt typischerweise die Ovulation am
Tag 14 des Zyklus, und man rechnet im Allgemeinen damit, dass die
Implantation in der Mitte der Lutealphase auftritt (auch wenn die
exakte Zeit bei Menschen kaum festgelegt ist).
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Die Nukleinsäure kann in reiner Form verabreicht
werden oder kann an andere Substanzen (z. B. Liposome) gebunden
oder mit diesen verbunden sein. Zweckmäßigerweise wird die Nukleinsäure in die
Zellen des Aufnahme-Säugetiers
durch einfache Transfektion (mit oder ohne Liposome) eingeführt, was
von den Erfindern als überraschend
wirkungsvoll herausgefunden worden ist, ohne dass es erforderlich
ist, dass die Sequenz in einen viralen Vektor eingeführt wird.
Dennoch können
Viralvektoren wünschenswert
sein, insbesondere diejenigen, die auf bestimmte Zelltypen gerichtet
werden können
(z. B. wie das in WO 93/20221 offenbart wird).
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Die Nukleinsäure wird zweckdienlicherweise
als Teil eines Konstrukts (z. B. Plasmid, Kosmid oder dergl.) eingeführt werden,
wobei dieses Konstrukt vorteilhafterweise einen Promotor aufweist
der in ein Säugetier operabel
ist, um die Transkription von mindestens einem Teil der eingeführten Nukleinsäure zu bewirken.
Der Promotor kann konstitutiv sein, oder was stärker vorzuziehen ist, induzierbar,
so dass eine stärkere
Steuerung der Expression der eingeführten Sequenz ermöglicht wird.
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In einem besonderen erfindungsgemäßen Verfahren
ermöglicht
die Einführung
eines Nukleinsäuremoleküls in die
endometrialen Zellen eines weiblichen Säugetier-Individuums die Hoch- oder Herunterregelung der
Fruchtbarkeit dieses Individuums. Die Erfindung kann insbesondere
dafür benutzt
werden, ein Verfahren der Kontrazeption für Begleittiere (z. B. Katzen
und Hunde) zu liefern, um unerwünschte
Würfe zu
vermeiden. In weiteren Ausführungsformen
liefert die Erfindung ein Verfahren zur Erhöhung der Fruchtbarkeit von
Herdenspezies wie Schweinen, Rindern, Schafen und dergl.
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Vorzugsweise wird die Nukleinsäure in den
reproduktiven Trakt über
die Vagina eingeführt,
was die Notwendigkeit einer invasiven chirurgischen Technik vermeidet.
Erforderlichenfalls könnte
jedoch die Nukleinsäure
mittels chirurgischer Methoden direkt in den reproduktiven Trakt
(z. B. in den Uterus) eingeführt
werden. Die Erfindung bietet die Möglichkeit der Änderung
von einem oder mehreren charakteristischen Merkmalen durch die Einführung von
einer oder mehreren Nukleinsäuresequenzen
aus einer sehr großen
Zahl davon.
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In einer Ausführungsform steuert die Sequenz
der in den reproduktiven Trakt eingeführten Zellen die Expression
(vorzugsweise bei hohen Konzentrationen) eines effektiven Anteils
eines Cytokins oder eines Wachstumsfaktors (ein effektiver Anteil
ist derjenige Anteil des Moleküles,
welcher die biologische Aktivität
behält,
die insbesondere mit dem Ganzen verbunden ist wie z. B. die Bindung
an einen spezifischen Liganden). Beispiele für solche Polypeptide, die durch
die eingeführte Sequenz
ausgeprägt
werden könnten,
enthalten, ohne darauf beschränkt
zu sein, folgendes: Interleukine, den Leukämie-inhibierenden Faktor (LIF),
den vaskularendothelialen Wachstumsfaktor (VEGF), den epidermalen
Wachstumsfaktor (EGF), den Heparin bindenden epidermalen Wachstumsfaktor
(HBEGF), die Insulin bindenden Wachstumsfaktoren I und II (IGF-I
und IGF-II), Amphiregulin, den Colonie-stimulierenden Faktor (CSF)
und den Tumor-Nekrose-Faktor (TNF).
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In einer weiteren Ausführungsform
kann die eingeführte
Sequenz die Expression eines effektiven Anteils eines Antagonisten
eines Cytokins oder Wachstumsfaktor wie beispielsweise den Rezeptorantagonisten IL-1
lenken. Vorteilhafterweise kann der Antagonist ein löslicher
Antagonist eines Cytokins oder Wachstumsfaktor sein. Geeignete Beispiele
umfassen lösliche
Rezeptoren für
die folgenden: transformierender Wachstumsfaktor (TGF)α, Fibroplast-Wachstumsfaktor
(FGF), Thrombozytenabgeleiteter Wachstumsfaktor (PDGF), Interleukin-6
(IL-6) und VEGF.
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In einer weiteren Ausführungsform
kann die eingeführte
Sequenz die Expression eines effektiven Anteils eines Polypeptids
steuern, welches eine immunologische Wirkung aufweist. Insbesondere
kann das Polypeptid immunogene Aktivität aufweisen, wodurch es dazu
dienen kann, eine lokale immune Reaktion zu stimulieren; somit kann
die Erfindung dazu benutzt werden, ein neuartiges Verfahren zur
Immunisierung bereitzustellen. Vorteilhafterweise wird das immunogene
Polypeptid ein Antigen aus einem Mukosa-Pathogen sein. Dank des üblichen
mukosalen Immunsystems kann die Stimulation der Antikörperbildung
im reproduktiven Trakt zur Produktion der entsprechenden Antikörper an
distalen mukosalen Stellen wie beispielsweise dem gastro-intestinalen
Trakt, dem Atemtrakt, den Tränendrüsen und
dergl. führen.
Vorzugsweise wird jedoch das Antigen eines aus einem Pathogen sein,
welches in den reproduktiven Trakt eindringt und/oder diesen kolonisiert,
typischerweise ein Pathogen, welches eine durch den Sexuelverkehr übertragene
Krankheit verursacht. Beispiele umfassen Viren wie beispielsweise
HIV, Papillomaviren (z. B. HPV verschiedener Arten), Chlamydia und
Bakterien (z. B. N gonorrhoea). Andererseits kann das Polypeptid,
welches einen immunologischen Effekt aufweist, ein Immunoglobulin
oder ein effektiver Anteil davon sein (wie beispielsweise ein Fab-,
Fv- oder scFv-Fragment oder ein Einzelketten-Antikörper). Das
Immunoglobulin oder der effektive Anteil davon können gegen ein Pathogen (wie
beispielsweise die weiter oben erwähnten) gerichtet werden, oder
sie können
auch gegen andere Antigene wie beispielsweise Steroid- oder andere
Hormone gerichtet werden. Derartige Immunoglobuline oder Fragmente
davon könnten
lokal ausgeprägt
werden, um einen Schutz von Krankheiten zu liefern oder um die Fruchtbarkeit
zu regulieren.
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In einer weiteren Ausführungsform
kann die eingeführte
Folge die Expression eines die Menstruation beeinflussenden Polypeptids
oder eines effektiven Anteils αdavon
steuern.
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In einer weiteren Ausführungsform
kann die eingeführte
Nukleinsäure
die Expression eines effektiven Anteils eines Rezeptormoleküls auf der
Oberfläche
der Zellen des reproduktiven Trakts steuern. Der Rezeptor könnte ein
Rezeptor für
ein Cytokin, ein Steroidhormon oder einen Wachstumsfaktor (wie beispielsweise
der EGF-Rezeptor, TGFα-Rezeptor
oder der VEGF-Rezeptor) sein. Es ist eine ganze Anzahl von Rezeptoren
bekannt, die als „Waisen"-Rezeptoren dahingehend
beschrieben werden, dass der Ligand, der an den Rezeptor bindet,
nicht bekannt ist. Derartige Waisenrezeptoren sind von beträchtlicher
Bedeutung in der pharmazeutischen Industrie, da sie ja die Zielgebiete
für neuartige
therapeutische oder prophylaktische Verbindungen liefern können.
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Dementsprechend liefert in einem
weiteren Aspekt die Erfindung ein Verfahren zur Kennzeichnung der biologischen
Eigenschaften eines Polypeptids, wobei dieses Verfahren die Einführung der
Sequenz, welche das zu kennzeichnende Polypeptid kodiert, in die
Zellen des reproduktiven Trakts eines Säugetieres und die Bewertung
der Wirkungen dieses ausgeprägten
Polypeptids umfasst. Vorzugsweise ist das Säugetier ein Labortier wie beispielsweise
eine Maus oder Ratte. Zweckdienlicherweise wird das zu kennzeichnende
Polypeptid ein Waisenrezeptor sein, und typischerweise wird zumindest
ein Teil von dessen Kennzeichnung die Identifizierung des Liganden
hierfür
umfassen. Im Allgemeinen wird das Verfahren die Analyse von histologischen Schnitten
beinhalten, die dem Labortier entnommen wurden, und deren Verarbeitung
nach einem der unterschiedlichen Standardtechniken (z. B. histochemisches
Anfärben,
Hybridisierung in situ, immunologisches Anfärben usw.).
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Die vorliegende Erfindung bietet
somit eine neuartige Andererseitse zur steroidalen Regulierung der endometrialen
Funktion (und daher der Reproduktionsfähigkeit oder Fruchtbarkeit)
durch direkten Gentransfer in vivo. Um dies zu erreichen, hat man
genetische Konstrukte entworfen, um auf spezifische Art und Weise
die zytokine Wirkung zu modulieren. Dies kann über eine Vielfalt von Wegen
erreicht werden. Zum Beispiel könnten
die Zellen, die ein abgesondertes Cytokin erzeugen, daran gehindert
werden, den Faktor zu synthetisieren, indem man die Transkription
und die Translation unter Verwendung von promotorgetriebenen Antisense-Konstrukts
oder Ribozymen blockiert. Andererseits kann die Wirkung des abgesonderten
Faktors durch Rezeptorantagonisten blockiert werden. Natürlich auftretende
lösliche
Rezeptoren können
bioaktive Liganden beseitigen und neutralisieren, wodurch sie als
konkurrierende Rezeptorantagonisten wirken. Andererseits gibt es
natürliche
Rezeptorantagonisten wie beispielsweise IL1Ra (Rezeptorantagonist
Interleukin-1). Eine intraperitoneale Verabreichung dieses Proteins
blockiert die Blastozyst-Implantation bei der Maus (Simon et al.,
1994 zitiert a. a. O.).
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Es gibt beträchtlichen Grund zu zeigen,
dass lösliche
Wachstumsfaktoren, die von dem Epithel des Eileiters und des Uterus
abgesondert werden, die Prä-Implantationsentwicklung
des Säugetier-Embryos
steuern können,
indem sie direkt durch Rezeptoren, die am Embryo ausgeprägt sind,
wirken (Pampfer et al. 1990, In Vitro Cellular and Developmental
Biology 26, 944–948).
Dagegen erzeugen sich entwickelnde Embryonen Wachstumsfaktoren,
die auf eine autokrine Art und Weise oder auf das Endometrium wirken
können,
um seine Empfänglichkeit
zu beeinflussen. Beispielsweise bei Mäusen ist die LIF-Expression
(aus Muttergeweben) im Glandularepithelium am Tag 4 genau vor der
Implantation dramatisch hochgeregelt.
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LIF ist imstande, auf die Prä-Implantations-Blastozysten
zu wirken, welche den LIF-Rezeptor
(LIF-R) ausprägen.
Diese materne Espression ist für
die Implantation von vitaler Bedeutung, da bei LIF-Knockout-Mäusen die
Embryos nicht implantiert werden, auch wenn dies auf dem Transfer
zu Scheinträchtiglceitsdämmen geschieht
(Stewart et al., 1992, zitiert a. a. O.).
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Die Erfinder haben nunmehr diese
Arbeiten auf Menschen ausgedehnt und mit RT-PCR gezeigt, dass menschliche
Embryonen die mRNA ausprägen,
die den LIF-R kodiert, aber selbst den LIF nicht ausprägen. Der
LIF wirkt durch die Bindung an einen Rezeptor LIF-R geringer Affinität. Eine
Bindung hoher Affinität
entsteht, wenn der LIF/LIF-R-Komplex mit dem signalübertragenden
Begleitprotein gp 130 in Wechselwirkung tritt. Menschliche Embryonen
enthalten auch mRNA, welches dieses Protein kodiert (Sharkey et
al., 1995, Biology of Reproduction 53, 955–962). Die Erfinder haben auch
aufgezeigt, dass die LIF-Sekretion im menschlichen Glandularepithelium
durch Steroide geregelt wird, die in der. Lutealphase maximal sind
(um die erwartete Zeit der Implantation – Charnock-Jones et al., 1994,
zitiert a. a. O.). Außerdem
ist berichtet worden, dass die Verabreichung von LIF an menschliche
Präimplantationsembryonen
in vitro die Entwicklung verbessert. All diese Beweise stützen den
Gedanken, dass der LIF bei der menschlichen Implantation genau so
wichtig ist wie auch bei der Maus. Offensichtlich können Cytokine
eine wichtige Kommunikation zwischen dem Embryo im Uteruslumen und
dem Endometrium (in beiden Richtungen) vermitteln. Die vorliegende
Erfindung ermöglicht
den Einsatz des Gentransfers, um diese Kommunikation zu unterbrechen
oder zu fördern,
was zu neuartigen Methoden der Kontrazeption oder umgekehrt zur
verbesserten Implantation führt.
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Die meisten laufenden Untersuchungen über die
parakrine und autokrine Regulierung der reproduktiven Funktion sind
durch das Fehlen wirksamer Methoden zur Modulierung der lokalen
Cytokin/Rezeptor-Konzentrationen auf eine beschreibende Analyse
beschränkt.
Der bei dieser Anwendung vorgelegte Beweis zeigt, dass die Transfektion
des Uterusepithelium in vitro machbar ist. Dies ermöglicht,
dass das Endometrium experimentell manipuliert werden kann, und
bietet neue therapeutische Strategien. Die weiter unten aufgezeigte Arbeit
beschreibt die Verwendung eines Reportergens, um die Praktizierbarkeit
des uterinen Gentransfers in vivo zu demonstrieren. In der Praxis
verwendet man ein Gen (oder ein anderes DNA-Konstukt), das in der Lage ist, die
Uterusfunktion zu ändern.
Beispiele für
diese enthalten Rezeptorantagonisten (z. B. IL-1Ra, lösliche VEGF-Rezeptoren
usw.), natürliche
oder modifizierte Cytokine und Wachstumsfaktoren, Protease-Inhibitoren oder
Steroidrezeptoren und eine Vielzahl von Ribozym- und Antisense-Konstruktens.
Diese Arbeit zeigt, dass Gene auf das Endometrium in vivo transferiert
werden können,
und dies wird eine nützliche
Anwendung bei vielen endometrialen (und plazentalen) Zuständen finden
wie zum Beispiel zur Verbesserung der Implantation sowohl bei Tiere
als auch beim Menschen, zur Unterbrechung der Implantation (d. h.
Kontrazeption), Endometriose und Menorrhagie, Hyperplasie und Adenokarzinom.
-
Unter Verwendung der von uns entwickelten
Protokolle wurden die weiter unten beschriebenen Ergebnisse erhalten.
Sie zeigen, dass die Genkonstrukte auf das Endometrium in vivo (bei
Mäusen)
und in vitro übertragen
werden können
und dass diese Konstrukte transkriptionell (und translationell)
aktiv sind.
-
Die Erfindung soll nun anhand von
veranschaulichenden Beispielen und unter Bezugnahme auf die beigefügten Zeichnungen
näher beschrieben
werden. Bei den Zeichnungen handelt es sich um:
-
1A und 1B zeigen Mikrofotografien
von histologischen Schnitten des Maus-Endometriums, welches mit
(A) einem
Plasmid-Konstrukt, welches die Expression eines ß-Galaktosidase-Reportergens steuert,
oder
(B) einem ähnliches
Plasmid, dem das Reportergen fehlt, transfektiert worden ist. Die
transfektierten Zellen können
deutlich durch die stark dunkle (blaue) Färbung innerhalb des Zytoplasmas
erkannt werden, was im Schnitt B fehlt;
-
2 ist
eine Mikrofotografie von menschlichen Endometrialzellen in vitro,
die mit demselben Plasmid wie in 1A transformiert
worden sind – die
dunkle (blaue) Färbung,
die auf die Expression des Reportergens zurückzuführen ist, ist hauptsächlich mit
der verbleibenden Glandularstruktur verbunden, während die umgebenden Zellen
nur schwach gefärbt
sind.
-
3 ist
ein Balkendiagramm, welches die Ergebnisse einer CAT-Auswertung (in Impulsen
pro Zählrohr)
für Endometrialzellen,
die mit einem die Chloramphenicol-Azetyltransferase (pcDNA3CAT)
kodierenden Gen erfolgreich transfektiert worden sind, im Vergleich
mit Zellen, die mit einem Kontroll-Plasmid (pcDNA3) transfektiert
worden sind.
-
4 ist
ein Balkendiagramm, welches die Ergebnisse einer Luciferaseprobe
(in relativen Lichteinheiten) für
endometriale Zellen, die erfolgreich mit einem die Luciferase (pcDNA3LUC)
kodierenden Gen transfektiert worden sind, im Vergleich mit Zellen,
die mit einem Kontroll-Plasmid (pcDNA3) transfektiert worden sind.
-
Beispiele
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Mäuse
-
Reife Nullipara-Mäuse BALB/cJ wurden in einem
lichtgesteuerten (14 Std. Licht, 10 Std. Dunkelheit; Licht aus um
22 Uhr) und temperaturgesteuerten (22°C) Kleintiergehäuse gehalten
und mit einer Maus-und-Ratten-Diät
(Labsure; Christopher Hill Group, Poole, Dorset, Vereinigtes Königreich)
gefüttert.
Sie wurden mit vasektomisierten Männchen derselben Gruppe über Nacht
zusammen gebracht und am nächsten Morgen
auf das Vorhandensein eines Vaginalpfropfs untersucht. Man nimmt
an, dass die Paarung um 02.00 Uhr stattgefunden hat als Zeitpunkt
0, und als Tag 1 wurde der Tag gerechnet, an welchem der Pfropf
das erste Mal entdeckt worden ist. Die begatteten Weibchen wurden
vor den Experimenten einzeln gehalten.
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Unter Anwendung aseptischer Verfahren
unter Metafan-Anaesthesie (Methoxyfluoran, C-Vet Ltd., Bury St.
Edmunds) wurde die Laparotomie durchgeführt. Die Gebärmutterzipfel
wurden entweder durch mittig-ventrale oder beidseitige Schnitte
freigelegt. Injektionen erfolgten entweder in die Spitze des Zipfels
an der tubouterinen Verbindung oder an der Basis des Zipfels an
der uterocervicalen Verbindung. Wiederholte Untersuchungen haben
gezeigt, dass die letztere Technik die beste Methode der Verabreichung
war, aber für
manche Zwecke die erstere vorzuziehen war, wenn es erforderlich
war, die Störungen
am reproduktiven Trakt zu minimieren.
-
Injektionen von Liposom-DNA (pcDNA3-Konstrukt,
+/- ß-Galaktosidase-Reportergene), nackte
DNA oder Kontrolllösungen
(25–100 μl) wurden
durch Einsetzen der Spitze eines flachen Stratatips in die Basis
des Zipfels vorgenommen. Die Lösungen
wurde vorher in die Spitze mittels eines Travesty-Applikators aufgezogen,
der auch für
die Kontrolle der langsamen Injektion der Lösungen in den Zipfel benutzt
wurde.
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Nach der Injektion wurde der Schnitt
unter Anwendung der unterbrochenen Matratzennaht geschlossen, und
die Mäuse
konnten sich in ihren Käfigen
mit Futter und Wasser ad libitum erholen.
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Plasmid-Konstrukte
-
Die in dieser Anmeldung (als Beispiel)
beschriebenen Plasmide beruhen auf dem kommerziell verfügbaren Vektor
pcDNA3 (Katalog-Nr. V790-20 von Invitrogen, San Diego, Kalifornien,
USA). Das Plasmid pcDNA3 ohne jegliches Reportergen wurde als Negativkontrolle
benutzt. Die experimentellen Plasmide pcDNA3-ßgal, pcDNA3-CAT und pcDNA3-Luc
enthielten die ß-Galaktosidase-,
die Chloramphenicol-Azetyltransferase- bzw. die Luciferase-Reportergene.
Diese Plasmide enthielten die folgenden genetischen Elemente: Ampicillin-Widerstandsgen,
Co1E1 Origin der Replikation, CMV-Promotor [Reportergen], Rinderwachstumshormon
polyA-Zusatz, fl Origin der Replikation, SV40 Origin der Replikation,
Neomycin-Widerstandsgen und ein SV40-polyA-Zusatz in operabler Beziehung
dergestalt, dass das Reportergen in eukatyotischen Zellen nach Einführung des
Plasmids ausprägbar
würde.
Plasmid-DNA wurde aus E. coli durch alkaline Lysis rein dargestellt
und darüber
hinaus unter Verwendung einer Quiagen-Ionenaustauschersäule (nach den Anweisungen des
Herstellers) gereinigt.
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Liposomdarstellung
-
Das benutzte Liposom war eine 3 :
1-(w/w)-Lipidformulierung aus DOPSA (2,3-dioleyloxy-N[2(sperminecarboxamido)ethyl]-N-N-Dimethyl-1-Propanaminium-Trifluorazetat) und
DOPE (Dioleoylphosphatidyl-Ethanoamin) (LipofectAMINE); Gibco BRL
Paisley, Schottland). Eine Anzahl von DNA : Lipid-Verhältnissen
und unterschiedlichen Injektionsvolumina wurden benutzt, wie das
in Tabelle 1 dargestellt ist. Die DNA-Liposome wurden unmittelbar
vor jedem Experiment gemischt. 10 μl DNA-Lösung wurden zu 10 μl Lipidlösung gegeben, sanft
gemischt und 15 Minuten bei Raumtemperatur belassen. 80 μl PBS wurden
dann zugefügt,
um die endgültige
Konzentration von DNA und Lipid zu ergeben, wie dies in Tabelle
1 gezeigt wird. Diese wurde dann in den Uterus der scheinträchtigen
Mäuse injiziert
(siehe obigen Abschnitt über
Mäuse und
Chirurgie).
-
Histochemische
Lokalisierung der ß-Galaktosidase
-
Die Tiere wurden durch Kohlendioxid-Inhalation
getötet,
und die Gebärmutterzipfel
wurden frei von Fett und Mesenterium herausseziert. Jeder Zipfel
wurde in 3 Abschnitte geteilt, wobei der obere und der untere Bereich
in flüssigem
Stickstoff schockgefroren und bei –70°C bis zur quantitativen Bestimmung
des ß-Galaktosidasegehalts
gelagert wurden. Der mittlere Bereich eines jeden Gebärmutterzipfels
wurde in 1,25% Gluteraldehyd in PBS 1 Minuten lang gelöst, zwei
mal in PBS gespült
und in eine X-gal Färbelösung (1
mg/ml X-gal, 5 mM K3Fe(CN)6,
5 mM K4Fe(CN)6,
2 mM MgCl2, 0,02% NP40 und 0,01% Natriumdesoxycholat)
für 24
Stunden bei Raumtemperatur gebracht. Die Abschnitte wurden dann
in PBS / 3% DMSO (2 × 5
Minuten), 70% Ethanol (3 × 5
Minuten) gespült
und in 100% Ethanol gebracht. Die Gewebe wurden in Glykolmethacrylatharz
eingebettet, und 7-μm-Schnitte
wurden angefertigt und mit neutralem Rot vor der mikroskopischen
Untersuchung gegengefärbt.
-
Ergebnisse
-
Die nachfolgende Tabelle zeigt die
verschiedenen Bedingungen, die angewendet wurden, und die sich ergebende
Farbintensität
der Uterusschnitte nach der Verabreichung der DNA/Liposom-Komplexe.
Die in der Tabelle angeführten
Ergebnisse zeigen, wie kritisch der Zeitpunkt für die Verabreichung der Plasmid-DNA
ist, wobei die Verabreichung am Tag 2 die besten Konzentration der
Expression liefert, die Verabreichung am Tag 3 zufriedenstellende
Konzentration ergibt, aber die Verabreichung am Tag 4 zu einer sehr
geringen Expression des Reportergens führte, vermutlich deswegen,
weil die Endometrialzellen zu diesem Zeitpunkt aus Gründen, die
nicht völlig
klar sind, das Konstrukt nicht aufnehmen.
-
-
Kontrollen:
-
Eine nicht injizierte, 6 Tage lang
scheinträchtige
Maus ergab keine Uterusfärbung
für ß-Galaktosidaseaktivität.
-
Eine scheinträchtige Maus (Verabreichungstag
2; Autopsietag 6), injiziert mit 50 μl pDNA3 minus ß-Galaktosidase
(2 μg/ml)
und Lipid (20 μg/ml)
ergaben keine Uterusverfärbung
für ß-Galaktosidaseaktivität.
-
Die Untersuchung der histologischen
Schnitte nach dem Anfärben
mit X-gal zeigten, dass das Glandularepithelium stark angefärbt war
und das Luminalepithelium auch, aber weniger stark, angefärbt war.
Die optimale Färbung
wurde bei Tieren beobachtet, die mit 2 μg/ml DNA und 20 μg/ml Lipid
in 50 ml transfektiert waren, die am Tag 2 der Scheinträchtigkeit
verabreicht wurden. 1a zeigt
einen Schnitt von solch einem Tier, und 1b einen Schnitt von einem Kontrolltier,
welches (unter identischen Bedingungen) ein Plasmid erhielt, welchen
das ß-gal
nicht aufwies.
-
Beispiel 2
-
Transfektion
primärer
Kulturen des menschlichen Endometriums
-
Die Erfinder haben auch aufgezeigt,
dass menschliche endometriale Epithelialzellen in vitro mit hoher Effizienz
transfektiert werden können.
-
Es wurden dasselbe Plasmid (pcDNA3,
+/- ß-Galaktosidase-Reportergen)
und Lipide, wie bereits beschrieben, verwendet. Die Endometrialzellen
wurden nach der Methode von Smith und Kelly (Smith et al., 1987,
Prostaglandins 34, 553–561)
präpariert.
Sobald sich die Kultur etabliert hatte, wurde das folgende Transfektionsprotokoll
benutzt. DNA (2 μg)
und Liposom (8 μg)
wurden jeweils in 100 μl
eines serumfreien Mediums (Opti-MEM1 BRL) verdünnt, gemischt und bei Raumtemperatur
15 Minuten lang inkubiert. Anschließend wurden weitere 800 μg Opti-MEM1
zugegeben. Die Zellen (in 24-Loch-Zellkulturschalen) wurden mit
PBS gewaschen, worauf ein Waschen mit Opti-MEM1 folgte. Das DNA-Liposom-Gemisch
(0,5 ml) wurde dann den Zellen zugegeben und bei 37°C drei Stunden
lang in einem CO2-Inkubaror inkubiert, wonach
0,5 ml des Kulturmediums, das 20% fötales Kalbsserum enthielt,
zugegeben wurden. Die Zellen wurden fixiert (0,1% Gluteraldehyd), gespült und 24
Stunden nach der Transfektion mit X-gal angefärbt.
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Diese Arbeit zeigt, dass die Gene
auf das Endometrium in vivo transferiert werden können, und
dies wird unter vielen endometrialen (und plazentalen) Bedingungen
Nutzanwendung finden wie zum Beispiel zur Verbesserung der Implantation
sowohl beim Tier als auch beim Menschen, zur Unterbrechung von Implantation
(d. h. Kontrazeption), Endometriose und Menorrhagie, Hyperplasie
und Adenokarzinom.
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Weitere Daten wurden bezüglich der
Transfektion von gereinigten menschlichen Uterus-Epithelialzellen
in vitro erhalten. Dies ergänzt
die Arbeit an der Maus in vivo und zeigt, dass ähnliche Zellen nach einer minimalen
Zeit in der Kultur effizient mit demselben Liposom und mit den in
vivo benutzten DNA transfektiert werden können.
-
Beispiel 3
-
Transfektion vom menschlichen
endometrialen Epithelium in vitro
-
Menschliche primäre Epithelialzellen vom Endometrium
wurden isoliert und nach der Methode von Zhang et al. (J. Cell Science,
1995; 108, 323–331)
kultiviert. Die Zellen wurden in standardisierte 6-Zellkulturschalen
gesetzt, um eine Dichte von 50% Zuwachs am nächsten Tag zu erhalten. Die
Zellen wurden 5 Tage lang kultiviert, dann in 24-Loch-Zellkulturschalen
umgesetzt, und zwar mit einer Dichte von 60.000 Zellen pro Loch.
Am nächsten
Tag wurden die Zellen mit dem DNA-Liposom-Komplex (DNA-LC) transfektiert. Diese
wurden wie folgt präpariert:
-
Transfektionsverfahren
-
Apparatur
-
LipofectAMINE (Gibco-Katalog Nr.
18324-012), OptimMEM1 (Gibco-Katalog-Nr.
51985-018) 24-Loch-Zellkulturschale. Das Medium der Zellkultur wurde
von Zhang et al. (zitiert a. a. O.) beschrieben. Dieses besteht
aus DMEM-HEPES, 10% FCS, Wachstumsergänzungmittel für Endothelialzellen
(Sigma-Katalog-Nr. E-2759) bei 30 μg/ml, Heparin (Sigma-Katalog-Nr. H-3149) bei 90 μg/ml, Gentamycin
(Sigma-Katalog-Nr. G-1272) bei 5 μg/ml
und Fungizon (Gibco-Katalog-Nr. 15290-018) bei 1 μg/ml. Es
wurden ferner Mg++-, Ca++freie
PBS und ein 2-ml-Eppendorf-Gefäß benutzt.
-
Es wurden zwei unterschiedliche Plasmid-Konstrukte
benutzt, welche die unterschiedlichen Reportergene enthielten. Das
Material pcDNA3CAT wurde von der Invitrogen Corporation bezogen
und enthält
ein Reportergen, welches die Enzym-Chloramphenicol-Azetyltransferase kodiert.
Das zweite Plasmid, pcDNA31uc enthält denselben Vektor, aber das
CAT-Gen wurde durch dasjenige Gen ersetzt, welches das Leuchtkäfer-Luciferase-Enzym
kodiert. Unter Verwendung des Qiagen-Midiprep-Systems wurden groß angelegte DNA-Präparationen
der Vektoren durchgeführt.
Als Negativkontrolle wurde pcDNA3, welches kein Reportergen enthielt, verwendet.
-
Präparation der DNA-/Liposom-Komplexe
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1) Lösung A
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Man verdünne 1 μg DNA in 100 μl Opti-MEM-1
in einer m Eppendorf-Gefäß. Eine
Endkonzentration der DNA im Transfektionsmedium ist zu verwenden.
-
2) Lösung B
-
Man verdünne 4 μl LipofectAMINE in 100 μl Opti-MEM-1
in einem Eppendorf-Gefäß. Im Transfektionsmedium
ist LipofectAMINE mit einer Endkonzentration von 8 μg/ml zu verwenden.
-
- 3) Man vereinige die beiden Lösungen A
und B in einer neuen Sonde und mische sanft.
- 4) Man inkubiere bei Raumtemperatur 15 Minuten lang.
-
Zellspülung
-
- 1) Vor der Transfektion spüle man die Zell-Monoschicht
dreimal grob in FRISCHER PBS ohne Serum
- 2) Man spüle
die Zell-Monoschicht zweimal mit Opti-MEM-1 nach
-
Transfektion
-
- 1) Man gebe 800 μl (insgesamt 1,0 ml) Opti-MEM
in jede Sonde, welche die DNA-Lipid-Mischung
enthält. Die
endgültige
DNA-Konzentration beträgt
1 μg/ml
und die LipofectAMINE-Konzentration 8 μg/ml.
- 2) Man entferne Opti-MEM-1 in der Zell-Monoschicht.
- 3) Man mische das DNA-LC-Gemisch sanft und überlagere die verdünnte Komplexlösung den
gewaschenen Zellen, 0,5 ml/24 Löcher.
- 4) Man inkubiere die Zell-Monoschicht 3 Stunden lang bei 37°C in einem
CO-2 Inkubator.
-
Weitere Zellkulturen
-
- 1) 3 Stunden später entferne man die Transfektionsmischung
und gebe 2 ml des Zhang-Mediums in jedes Loch und setze die Kultivierung
fort.
-
Quantitative
Untersuchung
-
24 bis 48 Stunden nach der Transfektion
wurden die Zellen extrahiert und auf CAT- oder Luciferase-Reportergen-Aktivität untersucht,
je nachdem, was zutreffend ist.
-
- 1. Man spüle
die Zellen dreimal in PBS.
- 2. Man extrahiere die Zellen mit 300 Mikroliter Lysis-Pufferlösung (Promega-Katalog Nr. E-3871),
kratze die Zellen ab in ein Eppendorf-Gefäß.
- 3. Man friere den Extrakt schnell auf –70°C und lagere ihn bis zur Untersuchung.
- 4. Für
die Untersuchung taue man die Extrakte auf und zentrifugiere sie
bei 13.000 g 5 Minuten lang.
- 5. Man wiederhole den Zyklus des Einfrierens, Auftauens und
Zentrifugierens einmal.
- 6. Unter Verwendung des Luciferase-Bestimmungssatzes von Tropix
(Katalog-Nr. BC 100L) untersuche man die Luziferase-Reportergen-Aktivität.
- 7. Die Aktivität
des CAT-Reportergens wurde unter Verwendung des Quan-t-CAT-Satzes von Amersham (Katalog-Nr.
TRK 1012) untersucht.
-
Ergebnisse
-
Primäre endometriale Epithelialzellen
wurden in 24-Loch-Zellkulturschalen transfektiert, wie das weiter oben
beschrieben wurde. Die Transfektionen wurden auf Dreifach-Löchern mit
pcaDNA3 (zur Kontrolle), pcDNACAT und pcDNA3LUC durchgeführt. Nach
48 Stunden wurden die Zellen geerntet und auf Luciferase- oder CAT-Aktivität untersucht.
-
Das CAT-Enzym katalysiert den Transfer
von Azetylgruppen vom Azetyl-Coenzym
A zum Chloramphenicol. Die Verwendung von tritiumbehandeltem AzetylcoA
führt zum
Transfer der radioaktiven Markierung auf das Chloramphenicol. Die
CAT-Aktivität
in einer Probe ist direkt proportional der Menge an erzeugtem tritiumbehandeltem
Chloramphenicol. Die Ergebnisse werden daher in Impulsen pro Minute
pro Zählrohr
ausgedrückt.
Eine Standardkurve kann dadurch erhalten werden, dass man Lysispuffer
verwendet, die bekannte Mengen an gereinigtem CAT enthalten.
-
Die Ergebnisse sind in 3 dargestellt, die ein Balkendiagramm
ist, welches den Mittelwert ± Streuung
für Dreifach-Bestimmungen
für ein
typisches Experiment zeigt. Die Ergebnisse in numerischer Form waren
diejenigen, die weiter unter gezeigt werden, nämlich mit einer CAT-Aktivität in den
mit pcDNA3CAT behandelten Zellen, die 6 mal höher war als in den Kontrollproben,
was die erfolgreiche Transfektion der Endometrialzellen zeigt.
-
-
In der Auswertung auf Luciferase
wird der Zellextrakt, welcher die Luciferase enthält, mit
seinem Substrat Luciferin gemischt, was zur Emission von Licht führt. Die
Intensität
des Lichtsignals ist proportional dem im Extrakt enthaltenen Luciferase-Enzym und kann mit
einem Luminometer gemessen werden. Die Anfangsergebnisse werden
in relativen Lichteinheiten angegeben.
-
Die Ergebnisse sind in 4 dargestellt, die ein Balkendiagramm
ist, welches den Mittelwert ± Streuung
für Dreifach-Bestimmungen
für ein
typisches Experiment zeigt. Die Ergebnisse in numerischer Form waren
diejenigen, die weiter unter gezeigt werden, Das Signal von den
mit pcDNA3LUC behandelten Zellen war mehr als 30 man höher als
das Untergrundsignal der Kontrollproben, was abermals die erfolgreiche
Transfektion der Endometrialzellen zeigt.
-
Beispiele
für mögliche Anwendungen
des Transfers von Endometrialgenen
-
Mindestens sieben verschiedene Typen
von Genkonstrukten konnten in das Endometrium transfektiert werden,
um eine Vielfalt von verschiedenen Wirkungen zu erzielen. Jeder
dieser unterschiedlichen Typen soll nun der Reihe nach beschrieben
werden.
-
1) Über-Expression der Cytokine
und Wachstumsfaktoren
-
Diese sind begrifflich die einfachsten
Typen von Konstrukten dahingehend, dass sie dazu bestimmt sind,
entweder ein Cytokin oder einen Wachstumsfaktor in den Epithelialzellen
des Uterus zu überprägen. Beispiele
für geeignete
cDNA für
derartige Über-Expressionen
enthalten diejenigen, die LIF, VEGF, EGF, CSF, TNF Amphiregulin
kodieren sowie eine Vielfalt von Interleukinen und coloniestimulierenden
Faktoren. Es ist gezeigt worden, dass diese auf natürliche Weise
im Endometrium ausgeprägt
werden, und man ist der Ansicht, dass diese wichtig bei der Regulierung
der Endometrialfunktion sind (Stewart et al, 1992, Nature, 359,
76–79; Chamock-Jones
et al, 1994, Journal of Reproduction and Fertility, 101, 421–426; Chamock-Jones
et al, 1993, Biology of Reproduction, 48, 1120–1128; Das et al, 1995, Molecular
Endocrinology 9, 691-; Tabibzadeh (1994, Human Reproduction Update,
9, 947–967)
hat eine umfangreiche Übersicht über diese
Gebiet veröffentlicht). Jedes
dieser Agentien beeinflusst unterschiedliche Aspekte der Reproduktionsfunktion
einschließlich
der Implantation, der Blutgefäßentwicklung
und der Leukozytenbiologie. Daher gäbe es mögliche Indikationen für die Verabreichung
solcher Konstrukte über
all dort, wo gewünscht
wird, die Fruchtbarkeit, insbesondere des Viehbestandes, zu erhöhen oder
die Konzeption von Menschen und ihrer Begleittiere zu verhindern
und auch, um eine Vielfalt von Menstruationsstörungen beim Menschen zu behandeln.
-
Ein Beispiel
für ein
Experiment zur Erhöhung
der Fruchtbarkeit des Viehbestandes
-
Es ist gezeigt worden, dass der LIF
für den
Vorgang der Implantation ganz wesentlich ist (Stewart t al, 1992,
zitiert weiter oben) Dieser Faktor wird durch das Endometrium zum
Zeitpunkt der Implantation erzeugt. Es ist daher möglich, dass
bei Spezies, wo die Raten des Embryoverlustes hoch sind, eine Erhöhung der
Konzentrationswerte der LIF-Expression aus dem Endometrium zum Zeitpunkt
der Implantation diese Verlustraten senken könnte. Daher könnte die
Transfektion eines Genkonstrukts, das dazu bestimmt ist, die Synthese
von LIF aus dem Endometrium zum Zeitpunkt der Implantation zu steuern,
die Fruchtbarkeitsraten derartiger Spezies erhöhen. Konstrukte, die in das
Endometrium transfektiert sind, müssten geeignete regulatorische
Sequenzen aufweisen, um zu gewährleisten,
dass das LIF-Protein zum richtigen Zeitpunkt produziert wird. Es
ist wahrscheinlich, dass dies dadurch erreicht werden könnte, indem
man den Promotor aus dem LIF-Gen von der in Frage kommenden Spezies
verwendet.
-
Behandlungen zur Milderung von menstrualen
Dysfunktionen bei Frauen können
auch durch die Anwendung des Transfers von Endometriumgenen ins
Auge gefasst werden. Ein Beispiel hierfür bestünde darin, die Blutgefäßentwicklung
innerhalb des Endometriums durch Transfektion von genkodierenden
angiogenen Wachstumsfaktoren wie beispielsweise VEGF zu verändern. Von
einer örtlichen
Erhöhung
der VEGF-Produktion könnte
man erwarten, dass diese das Kapillarenwachstum steigert und daher
eine endometriale Verdickung fördern
kann. Gleichermaßen
können
erhöhte
Konzentration von VEGF die Reparatur von Kapillaren nach der Menstruation
erleichtern und daher die Blutungsschemata der mit diesem Typ von
Konstrukt behandelten Patientinnen verändern.
-
2. Über-Expression
von Rezeptoren
-
Man könnte erwarten, dass eine Erhöhung der
Anzahl und des Typs von Rezeptoren, die durch das Uterusepithelium
ausgeprägt
werden, signifikante biologische Folgen hat. Die Typen von Rezeptoren,
die man sich für
die Über-Expression wünschen mag,
umfassen, ohne darauf beschränkt
zu sein, die Wachstumsfaktor- und die Cytokin-Rezeptoren für beispielsweise
EGF, TGFα,
VEGF und eine Vielfalt von colonie-stimulierenden Faktoren und Interleulanen.
Steroidhormonrezeptoren sind auch für die Expression in den Epithelialzellen
geeignet. Man könnte
erwarten, dass eine solche Transfektion überall dort nützlich ist,
wo man wünscht, die
Fruchtbarkeit zu erhöhten,
die Konzeption zu verhüten,
Menstruationsstörunen
zu behandeln und auch die Funktion von Waisenrezeptoren zu erleuchten
(Waisenrezeptoren sind solche Rezeptoren, wo der Ligand zur Zeit
nicht identifiziert ist). Waisenrezeptoren stellen ein Gebiet von
großem
Interesse in der pharmazeutischen Industrie dar, da die Kennzeichnung
des Liganden wohl zur Generierung neuer Arzneimittel führen kann.
-
In zunehmendem Maße wird erkannt, dass die Entwicklung
des Endometriums ein komplexer Vorgang ist, der durch die Wechselwirkung
von vielen Cytokinen und ihren Rezeptoren vermittelt wird, und dass
die stimulatorischen Effekte der ovariellen Steroide häufig durch
diese Cytokine vermittelt werden. Insbesondere ist gezeigt worden
(Nelson et al, 1992, Endocrinology, 131, 1657–1644), dass TGFα ein potentieller
Mediator der Östrogenwirkung
im Uterus der Maus ist. Daher könnte
man erwarten, dass die Transfektion von Konstrukten, welche die
Synthese dieses Faktors steuern, das Endometrialwachstum fördern und
folglich die Fruchtbarkeit in solchen Situationen steigern könnten, wo
das Endometrium sich nicht ausreichend entwickelt hatte. Auf ähnliche
Weise könnte
man erwarten, dass dieser Faktor die Reparatur der Epithelialfläche nach
der Menstruation fördert
und daher bei der Behandlung von Menorrhagie nützlich sein könnte.
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Es gibt mehrere Mitglieder der Superfamilie
der Steroidhormonrezeptoren, für
die der Ligand zur Zeit nicht bekannt ist. Transfektionen derartiger
cDNA in das Endometrium könnte
von großem
Nutzen zur Erhellung der biologischen Funktion dieser Rezeptoren
sein und daher Anwendung finden bei der Suche nach neuen pharmazeutischen
Wirkstoffen, die auf diese Rezeptoren wirken (Evans 1988, Science
240, 889–895).
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3) Transfektion von Konstrukten
zur Blockierung oder Verhinderung der Wirkung der Cytokin-Wachstumsfaktoren
und anderer Hormone
-
Die Transfektion von natürlichen
Antagonisten in Cytokin und in Wachstumsfaktoren eröffnet die
Möglichkeit
der Modulierung der Endometrialfunktion. Ein Beispiel für solche
Antagonisten wäre
der Rezeptorantagonist Interleukin 1 (Hannum et al, 1990, Nature
343, 336). Es ist gezeigt worden, dass die Verabreichung dieses
Proteins die Trächtigkeit
bei Mäusen
blockiert (Simon et al, 1994, Endocrinology 134, 521–528). Zu
weiteren natürlichen
Antagonisten von Cytokinen und Wachstumsfaktoren gehören die
natürlichen
löslichen
Rezeptoren. Lösliche
Rezeptoren sind in einer Vielfalt von Wachstumsfaktor-Cytokin-Systemen
beschrieben worden. Zum Beispiel TNF (Engelmann et al, 1990, J.
Biol. Chem. 265, 14497–14504),
FGF (Givol et al, 1992, FASEB Journal 6, 3362–3369), PDGF (Tiesman & Hart, 1993, J.
Biol. Chem 268, 9621–9628)
und IL-6 (Novick et al. 1989, J. Exp. Med. 170, 1409–1414).
Das gemeinsame Merkmal besteht darin, dass die extrazellulare Ligandenbindungsdomäne des Rezeptors
von der Zelle als ein frei löslicher
Faktor freigegeben wird. Dies wird erreicht entweder durch Proteolyse
oder durch Andererseitses Spleißen,
was ein gestutztes Proteinmolekül
erzeugt, dem die Transmembrane und die Intrazellulardomänen fehlen.
Kendall und Thomas (1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 10705–1709) beschrieben
eine lösliche
Variante des VEGF-Rezeptor-Fit. Dieses Protein war imstande, die
Wirkung von VEGF in vitro zu blockieren. Wir haben drei weitere
cDNA isoliert, welche zusätzliche
lösliche
Varianten kodieren (siehe PCT/GB95/01213). Die Verwendung dieser
natürlichen
Wirkstoffe hat mehrere Vorteile gegenüber anderen Antagonisten (z.
B. Anti-VEGF-Antikörper).
Da sie auf natürliche
Weise im Körper
auftreten, könnte
man erwarten, dass sie eine Immunantwort nicht hervorrufen und daher
wohl toleriert sein dürften.
Da sie von dem membrangebundenen Rezeptor abgeleitet sind, sind
auch die Bindungskenndaten sehr ähnlich
und würden
daher sehr effektiv für
den Liganden eignen. Es ist möglich,
dass andere lösliche
Rezeptoren auf natürliche
Weise existieren oder dass sie in vitro verfahrensmäßig hergestellt
werden könnten.
Es ist auch wahrscheinlich, dass, wenn die Ligandenbindungsdomäne von einem
Mitglied der Familie der Steroidhormonrezeptoren ausgeprägt wurde,
dieses als ein dominanter negativer Rezeptor dahingehend wirken
könnte,
dass er sich als Ligand eignen würde,
wenn er innerhalb der Zelle mit ausreichend hohen Konzentrationen
ausgeprägt
ist. Andererseits könnte
ein nicht-aktivierender, aber DNA-bindender „Rezeptor" dazu verwendet werden, die Gentranskription
zu blockieren. Diese Anwendung wäre
nützlich
für die
Antagonisierung der Wirkung auf natürliche Steroide einschließlich derjenigen,
welche bislang nicht identifizierte Liganden für Waisenrezeptoren sind (Pemrick
et al, 1994, Leukemia 8, 1797–1806).
Die Signalierung von Defektrezeptoren aus der Familie der sieben
Transmembrandomänerezeptoren
könnte
auch verfahrensmäßig bewerkstelligt
und transfektiert werden.
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Es ist gezeigt worden (Eisenberg
et al, 1990, Nature 343, 341), dass der lösliche Rezeptorantagonist Interleukin-1
die Wirkungen von IL-1 in vivo antagonisiert (Simon et al, 1994,
Endocrinology 134, 521–528). Daher
wäre zu
erwarten, dass die Transfektion des Endometriums mit einem DNA-Konstukt
zur Steuerung der Synthese von Antagonisten die Trächtigkeit
bei Mäusen
blockiert.
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Weitere Faktoren, die wahrscheinlich
die Wirkung des Wachstumsfaktors oder Cytokins antagonisieren, enthalten
lösliche
Varianten von natürlichen
Rezeptoren, beispielsweise ist die lösliche Variante des „for fit"-VEGF-Rezeptors von
Kendall & Thomas
(1993, zitiert weiter oben) und auch von Boocock (1995, J. Natl. Cancer
Ins. 87, 506–516)
beschrieben worden. Man würde
erwarten, dass die örtliche
Produktion von derartigen Faktoren die Wirkungen der VEGF antagonisiert
und zu einem nützlichen
therapeutischen Einsatz in Situationen führen könnte, wo eine Hyperproliferation
von endothelialen Zellen vorliegt wie beispielsweise bei einer Vielfalt
von Menstruationsstörungen,
wo es wünschenswert
ist, die Kapillardichte im Endometrium zu reduzieren. Dies würde bösartige
Erkrankungen einschließen.
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4) Einsatz von Antisense-Methoden
zur Verhütung
der lokalen Produktion eines spezifischen Proteins oder Enzyms
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Eine Andererseitse Herangehensweise
zur Blockierung der Wirkung von Cytokinen, Wachstumsfaktoren und
Hormonen würde
darin bestehen, die Antisense- oder
Ribozym-Technologie einzusetzen, um entweder die Produktion der
Liganden oder die Produktion der Rezeptoren in den jeweiligen Zellen
zu blockieren (James, 1991, Antiviral Chemistry and Chemotherapy
2, 191–214;
Albert & Morris,
1994, Trends in Pharmocological Sciences 15, 250–254).
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Die Antisense-Technologie beruht
auf der Bindung eines sogenannten Antisense-Oligonukleotids oder -Polynukleotids
an eine zellulare mRNA. Diese Bindung verhindert die Translation
dieser mRNA und reduziert die Menge des jeweiligen, von der Zelle
produzierten Proteins. Synthetische Oligonukleotide oder Polyribonukleotide
sind beide gemeinsam für
dieses Vorgehen eingesetzt worden. Es wäre zu erwarten, dass durch
Liposom medierte Transfektion von Olikonukleotiden oder durch Liposom
medierte Transfektion von DNA-Kunstrukten, welche die Synthese von
längeren
Antisense-Polyribonukleotiden steuern, spezifisch und selektiv die
Proteinreduktion durch die transfektierten Zellen vermindern. Ribozyme
verhindern auch die Proteinproduktion durch selektives Spalten der
RNA, welche das spezifische, zur Debatte stehende Protein kodiert.
Diese beiden können
transfektiert werden als Polyribonukleotide oder als DNA-Konstrukte,
welche die Synthese solcher Polynukleotide steuern (was Übersichten
betrifft, siehe James 1991 und Albert & Morris, 1994, beide weiter oben
zitiert). Ein Beispiel für
eine derartige Verwendung eines Antisense-Ribozyms zur Verhinderung
der Fruchtbarkeit wäre
wie folgt. Es ist bereits gezeigt worden, dass der LIF für den Vorgang
der Implantation bei der Trächtigkeit
von Säugetieren
wichtig ist (Stewart et al, 1992, weiter vorn zitiert). Daher wäre zu erwarten,
dass die Transfektion von entweder Oligonukleotiden oder DNA-Konstrukten,
welche die Synthese von Antisense-Polyribonukleotiden steuern, oder
Ribozymen, die gegen die LIF mRA gesteuert sind, die Synthese dieses
Faktors verhindern. Das Fehlen dieses Faktors würde dann zu einem Misslingen
der Implantation führen,
und folglich wäre
die Konzeption blockiert.
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Eine ähnliche Herangehensweise könnte benutzt
werden, um die Produktion von angiogenen Wachstumsfaktoren, beispielsweise
VEGF, zu blockieren, welche die Proliferation von Endothelialzellen,
die für
das Tumorwachstum erforderlich sind, verhindert. Daher könnte dieser
Typ von Therapie von besonderem Vorteil überall dort sein, wo bösartige
Erkrankungen behandelt werden.
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5) Lokale Produktion von
Immunoglobulinen und Fragmenten davon
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Es ist möglich, die moderne Rekombinanten-DNA-Technologie
einzusetzen, um Einzelketten-Antikörper zu erzeugen, die nahezu
identische Bindungskenndaten an dem ganzen monoklonalen Antikörper haben, von
dem sie abgeleitet sind. Derartige Einzelketten-Antikörper sind
erfolgreich an Bakterien ausgeprägt
worden (He et al, 1995, Immunology 84, 662–668). Im Prinzip ist es möglich, ein
Konstrukt verfahrensmäßig herzustellen,
welches die Expression eines Einzelketten-Antikörpers steuert, und diesen in
Epithelialzellen auszuprägen.
Wenn dies im Endometrium in vivo ausgeführt würde, könnte man erwarten, dass Einzelketten-Antikörper, die
gegen ein Steroidhormon gesteuert sind, sich an das Steroid binden
und dessen Wirkung in den Epithelialzellen verhindern. Ein Beispiel
eines derartigen Antikörpers
wäre derjenige
Einzelketten-Antikörper, der
von dem monoklonalen Antikörper
Antiprogesteron DB3 abgeleitet ist (He et al, 1995, zitiert weiter
oben). Wenn dieser Antikörper
in das Uteruslumen sekretiert würde,
dann würde
er auch Progesteron binden und kann Wirkungen sonstwo im Uteruslumen
zeigen. Ein Antikörper,
der gegen Wachstumsfaktoren und Cytokine gerichtet ist, von denen
man weiß,
dass sie im Endometrium aktiv sind, könnte auf ähnliche Weise ihre Funktion
blockieren, wenn er lokal auf diese Weise produziert würde.
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Eine zusätzliche Anwendung für lokal
produzierte Einzelketten- Antikörper
läge in
der Verhütung
oder Behandlung von Krankheiten, die beim Geschlechtsverkehr übertragen
werden. In diesem Fall würden
Antikörper,
die gegen den zur Debatte stehenden Wirkstoff (zum Beispiels das
Papillomavirus, HIV, Chlamydia) in das Uteruslumen sekretiert und
die Infektion durch den zur Debatte stehenden Wirkstoff verhindern.
Antikörper,
die gegen Sperma gesteuert sind, oder Oozyt-Antigene könnten dahingehend
ins Auge gefasst werden, dass sie eine Rolle bei der Kontrazeption
spielen könnten.
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6) Aktive Immunisierung
zur Erzielung einer mukosalen Immunität
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Ein zusätzliches Verfahren, welches
benutzt werden könnte,
um eine lokale Immunität
zu errichen, bestünde
darin, Konstrukte zu entwickeln, welche die Sekretion eines Antigens
in das Lumen steuern. Dies würde eine
lokale Immunantwort auslösen,
und somit würde
eine spezifische mukosale Immunität an Ort und Stelle erreicht
werden. Seit vielen Jahren ist bekannt (Howe, 1967, Journal of Reproduction
and Fertility 13, 563–566),
dass das Uteruslumen viele Leukozyten enthält. Es ist möglich, dass
Antigene, die durch transfektierte Endometrialzellen produziert
werden, von diesen Leukozyten aufgenommen und anschließend präsentiert
werden, um eine mukosale Immunantwort auszulösen. Die Abgabe von Antigenen
in das intestinale Lumen hat zu einer derartigen Immunität geführt, und
in einigen Fallen ist gezeigt worden, dass dies sehr effektiv ist
(zum Beispiel bei der Impfung gegen Poliomyelitis).
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7) Blockierung von Anlagerungsstellen
für Pathogene
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Die Anlagerung von Pathogenen an
mukosale Flächen
ist häufig
eine wesentliche Voraussetzung für die
Etablierung einer Infektion. Das Blockieren einer Anlagerung von
Pathogenen an diesen Stellen kann somit ein Verfahren zum Schutz
von Menschen und Tieren vor Krankheiten darstellen, insbesondere
solchen Krankheiten, die auf dem Wege des Sexualverkehrs übertragen
werden. Dies trifft nicht nur auf bakterielle Pathogene (wie beispielsweise
bestimmte pathogene Stämme
von E. coli und N. gonnorrhoea) zu, sondern auch auf virale Pathogene
zu. Viele Viren lagern sich durch einen Zelloberflächen-„Rezeptor" an, wenn sie infizieren.
Es kann erwartet werden, dass die lokale Produktion von löslichen
Rezeptoren mit den Molekülen
der Zelloberfläche
konkurrieren und somit eine virale Infektion verhindern kann. In
gleicher Weise könnte
die Sättigung
der Zelloberflächenrezeptoren
mit viralen Imitationen (die wie die viralen „Liganden" wirken) auch die Infektion blockieren,
wie dies die lokale Produktion von spezifischen Immunoglobulinen
oder von deren effektiven Bindungsbereichen könnte.
