NO320436B1 - Metode for endring av sjansene for embryoimplantasjon i livmorslimhinnen. - Google Patents

Description

Denne oppfinnelsen dreier seg om en metode for å endre sjansene for embryoimplantasjon i livmorslimhinnen ved transfeksjon av endometrievev.

Endometriefysiologi

To hoved hendelser er nødvendige for at embryoet skal bli etablert i pattedyr-livmoren; for det første at endometriet prepareres slik at det er mottagelig for tilstedeværelsen av en blastocyst som deretter implanteres og oppnå ernæringsstøtte gjennom dannelsen av livmorkaken, og for det andre modifikasjon av livmormuskelens (myometriets) aktivitet som først må dempes og derved tillate blastocysten å lokaliseres inne i livmorhulen uten risiko for å bli sendt ut. Begge disse hendelser er kontrollert av effekter fremkalt av graviditetshormoner, hvorav østrogener og progesteron er spesielt viktige. Disse steroidhormoner virker på endometriet og myometriet gjennom deres reseptorer som er lokalisert i målcellenes kjerner. Når de er aktivert interagerer steroid-kjernereseptorkomplekset med spesielle regioner innen DNA slik at de stimulerer, hemmer eller fjerner hemming av gener som koder for proteiner og polypeptider slik som enzymer eller vekstfaktorer.

Initiering av implantasjon blir frembragt ved hjelp av en kaskade av biokjemiske og biofysiske endringer. Adhesjonsmolekyler, foreksempel CAM 105,

har blitt implisert i de tidlige stadier av blastocystbindingen til veggen i livmoren. Etter dette benytter blastocysten og endometriet ulike strategier for å forbedre nærkontakt mellom føtale og maternelle vev. Hos klovdyr vandrer trofoblastceller som danner det ytre laget av blastocysten, inn i det urine epitel, hvoretter det smelter sammen med

dette. Cellevandring blir ført et skritt videre hos kvinner siden det ikke bare er isolerte eller spesifikke celletyper som vandrer, men store områder av trofoblast som presser seg mellom livmorens epitelceller. For å gjøre dette vil noen av trofoblastcellene smelte sammen til å danne et syncytium. Denne prosess er meget rask og embryoet blir etablert i livmorvevene uten særlig tydelig degenerering av livmorepitelet. Hos noen arter er implantasjonsprosessen forsinket, enten i påvente av signaler fra omgivelsene som sikrer at fødsel av de unge dyr foregår på fordelaktige årstider, eller ved fysiologiske faktorer slik som laktasjon slik at moren har fullført avvenning av det tidligere kull før den neste graviditet blir fullt etablert.

Preparering av livmoren for implantasjon blir regulert ved hjelp av sekresjon av eggstokkhormoner. Transport av det fertiliserte egg gjennom egglederen må tidsreguleres nøyaktig slik at egget kommer til livmoren på den korrekte utviklingstid og når livmoren er passende i tilstand slik at den kan motta egget. Under de fleste betingelser vil livmoren ikke ta imot embryoet, og er faktisk mer fiendtlig innstillet enn en del andre områder i kroppen. Epiteloverflaten i livmoren er under de fleste forhold motstandsdyktig mot binding og invasjon av trofoblast, og det er bare under meget presise hormonelle tilstander at denne motstand blir senket.

Hos mus og rotter har ikke-parrede dyr ikke en full østrus-syklus, siden de ikke danner et normalt sekretorisk corpus luteum (gult legeme) som produserer økende mengder av progesteron. Dersom parring foregår ved østerus, et tidspunkt der høye nivåer av østrogener blir frigjort fra eggstokk-follikkelen som er utgangspunkt for egget, vil et corpus luteum dannes i den sprukne follikkel, økende konsentrasjoner av progestron blir deretter skilt ut, implantasjon forekommer og graviditeten går videre (lengde 21 dager). Dersom en ikke-fertiliserende parring forekommer, vil lignende hendelser oppstå med unntak av at corpus luteum bare varer omrent 11 dager og pseduograviditet blir forkortet.

De cellulære og biokjemiske endringer som foregår i endometriet har blitt studert mest grundig hos mus og rotte, selv om informasjon om disse aspekter hos kvinner også har øket betydelig i de senere år. Endometriet i alle arter består av tre hovedvev - hulromsepitel, kjertelepitel og stroma. Celleproliferering oppstår ved ulike tidspunkter i de tre vev. Hulromsceller prolifererer like før østrus (pro-østrus) under påvirkning av de økende mengder av østrogener som produseres av folliklene i eggstokken. Ved dag 1 i graviditeten (dag med kopulasjonsplugg hos gnagere) har de sluttet å dele seg, men gjennomgår en annen, men mindre, aktivitetsøkning på dag 3. Kjertelceller viser høyest aktivitet på dag 4 og noe som deretter synker. Stromaceller proliferer ikke før dag 4, men deretter, under påvirkning av progesteron oppnår de høye nivåer av proliferering på dag 5. Hos kvinner er mindre kjent om disse endringer som går forut for implantasjonsprosessen, men det synes å være maksimal proliferasjon i epitelceller under den follikulære fase av menstruasjonssyklus, og i stromaceller under den luteale eller sekretoriske fase, som hos mus og rotte.

Formålet av celleproliferasjon i endometriet er ikke fullt klarlagt. Det antas at den forbereder endometriet for implantasjon ved å øke antall celler som vil fungere i en ernærende og sekretorisk funksjon (kjertelepitel) og som deltar i meget tidlige stadier av livmorkakedannelse (decidualisering). Som et nødvendig forstadium for vellykket implantasjon kan cellemitose utvikle seg mot celledifferensiering, og spiller derfor en essensiell rolle i de tidligere stadier av etablering av graviditet. Funn som støtter denne rolle er endometriets produksjon av vekstfaktorer (mitogener), cytokiner og nukleære onkogener. Mange av disse forbindelser blir produsert i økende konsentrasjoner som respons på eggstokkhormoner som virker gjennom sine reseptorer.

Blant vekstfaktorer er det for øyeblikket stor interesse for epidermal vekstfaktor( EGF), heparin-bindende epidermal vekstfaktor (HBEGF), amfiregulin og insulin-bindende vekstfaktorer (IGF-I og IGF-II). Data som indikerer betydning av de lokale (parakrine) effekter av minst én av disse vekstfaktorer, amfiregulin, har blitt presentert fra nylige eksperimenter hos mus. Hemming av det implantasjons-spesifikke og progesteronregulerte amfiregulingen ble oppnådd ved bruk av antiprogestinet, RU486, og dette førte til at implantasjon ble forhindret (Das et al., Molecular Endocrinology, 9, 691-705,1995).

Blant cytokinene har leukemi-inhibitorisk faktor (LIF) og kolonistimulerende faktor (CSF), som også blir produsert av muselivmoren ved implantasjontidspunktet, blitt funnet fra gen knockout studier å være absolutt nødvendige, idet det ble vist at fjernelse av disse ikke er kompatibelt med implantasjon og normal morkakedannelse (Stewart et al. Nature, 359, 76-79,1992; Pollard et al., Developmental Biology 148, 273-282, 1991).

Blant de nukleære onkogener øker nivåer av c-jun og c-fos (som er tidlige indikatorer på gentranskripsjon) i livmoren etter østrogentilførsel, og de blir hemmet av progesteron.

Viktige forskjeller eksisterer mellom ulike arter i graden av trofoblastinvasjon ved implantasjonstidspunktet. Hos kvinner er den tidlige trofoblast meget invasiv, mens hos griser som har en ikke-invasiv form for implantasjon, blir endometriets epitel aldri penetrert under den 3 måneder lange graviditetsperiode. Implantasjonssvikt i begge disse arter er vanlig, og når verdier på henholdsvis omtrent 60 og 30%. Årsakene til denne høye frekvens av svikt er kompliserte og ikke fullstendig forstått. Hos kvinner er omtrent halvparten av tapet forårsaket av genetiske abnormaliteter, men hos griser som hos andre klovdyr hvor tapet også er stort, vil genetiske defekter bare forklare noen få prosent av totalen.

Etter implantasjonssvikt hos kvinner fører et fall i progesteronsekresjon til blødning, som ved slutten av den normale menstruasjonssyklus, dette forekommer ikke hos de fleste andre dyr. Menstruasjonsforstyrrelser som også implantasjons-forstyrrelser er vanlige. I tillegg er menstruasjonsblødning, enten som en konsekvens av sekvensiell hormonterapi eller i samband med kontinuerlig kombinert hormon-substitusjonsterapi eller progesteron-inneholdende langtvirkende prevensjonsmidler en viktig årsak til helsesvikt hos kvinner. Årsakene som ligger til grunn for denne blødning er fokus for mange pågående studier vedrørende biokjemiske (for eksempel prostaglandiner, enzymer, polypeptider og proteiner, vasoaktive forbindelser slik som blodplateaktiverende faktor PAF, og vaskulær endotel-vekstfaktor (VEGF) og cellulære mekanismer (for eksempel vandrende celler rettet mot livmoren som produserer immunosuppressive forbindelser).

Nåværende forståelse av reproduksjonsprosesser sentrerer hovedsakelig på kontroll av steroidhormonproduksjon og effekter av disse hormoner på deres målvev. Imidlertid blir parakrine og autokrine faktorer i økende grad sett på som nøkkel-mediatorer av reproduksjonsfunksjon, selv om de interagerer med steroider (Benton, 1991 Current Opinion in Cell Biology 3,171-175; Rozengurt, 1992 Current Opinion in Cell Biology, 4,161-165; Tartakovsky et al., 1991 Developmental Biology 146, 345-352; Robertson et al., Current Opinion in Immunology 4, 585-590; Smith, 1994 Human Reproduction 9, 936-946; og Tabibzadeh, 1994, Human Reproduction 9, 947-967). Det klareste eksempel på dette sees hos ovarie-ektomerte mus (mus med fjernet eggstokk). I denne modell gjennomgår livmoren en markert vekst som respons til en enkel dose av østradiol. Denne effekt kan blokkes ved hjelp av et anti-TGFa-antistoff (TGF er "transformerende vekstfaktor"), noe som antyder at de mitogene effekter av østrogen i dette vev blir mediert av TGFa (Nelson et al., 1992, Endocrinology 131, 1657-1664).

Som en konsekvens er medisinsk intervensjon i gynekologi hovedsakelig basert på steroid/antisteroid regulering av livmoren (Yen & Jaffe, 1991 i "Reproductive Endocrinology", Eds. Yen, Jaffe & Benton, Pub. WB Saunders, Philadelphia; Baird, 1993 British Medical Bulletin, 49, 73-87). Til tross for den klare suksess som denne tilnærming har hatt, har ingen konseptuelle fremskritt i prevensjonsteknologi oppstått de siste 20 år, ingen metoder blitt identifisert som kan forbedre implantasjon, ingen fremskritt har blitt gjort i å fremme morkakevekst og utvikling og ingen nye tilnærminger har blitt funnet for å behandle godartede gynekologiske sykdommer (menstruasjonsdysfunksjon og fibroider).

Et antall publikasjoner har blitt presentert i relasjon til bruk av "genoverføring" i pattedyr for å endre genotypen av i det minste noen celler i ett eller flere vev. Spesielt er forsøk kjent på å prøve "genterapi" hos mennesker ved å introdusere nukleinsyresekvenser inn i mottagere, med ønske om å overvinne en genetisk svikt hos mottageren ved ekspresjon av polypeptidet som kodes for av de introduserte nukleinsyresekvenser. Genterapiforsøk har blitt utført, for eksempel der DNA-sekvenser (inkorporert innen virusvektorer) ble introdusert inn i luftveiene hos pasienter med cystisk fibrose, for å endre fenotypen av i det minste noen av epitelcellene som dekker overflaten av pasientenes luftveier. Foreløpig har ingen publiserte forsøk på å introdusere DNA inn i pattedyrs endometrium blitt publisert, til tross for passende teknikker for å gjøre dette.

Foreliggende oppfinnelse frembringer en metode for endring av sjansene for embryoimplantasjon i livmorslimhinnen, kjennetegnet ved at endometrium transfekteres mellom eggløsning og det tidspunkt i den samme menstruasjonssyklus hvor det er en topp i nivået av progesteron i blodet.

I en foretrukket utførelsesform kjennetegnes metoden ifølge foreliggende oppfinnelse av at nukleinsyren administreres til individet i perioden som følger eggløsning, opptil og inkluderende det tidspunkt i den samme menstruasjonssyklus der det er en topp i nivået av progesteron i blodet.

Den foreliggende oppfinnelse kan ikke på noen måte bli oppfattet som en nærliggende forlengelse av genterapiteknikker som allerede er kjent å være i det minste delvis vellykkede når de appliseres til lungene hos pasienter med cystisk fibrose. Arvelige genetiske forstyrrelser antas ikke å være ansvarlig for noen av de kjente endometrie-sykdommer, slik at det ikke ville ha vært noe incentiv for de som er trenet i faget til å applisere genterapiteknikker til endometriet. Videre er endometriets epitel av en ulik type (kuboidal, utviklet fra coelom-epitelet) sammenlignet med lungeepitelet (som er plateformet) og kunne derfor ikke ha blitt forutsett å oppføre seg på en lignende måte. Videre er det i det minste hos primater en cyklisk avstøtning av endometrie-epitelet som ville føre til tap av alle transfekterte celler. Til sist har oppfinnerne funnet at det ikke var overføring av det introduserte DNA inn i morens organer, heller ikke inn i fosterets morkake, begge disse kunne ha forekommet og kunne ha ført til praktiske problemer.

I den typiske utførelse blir nukleinsyren introdusert inn i en pattedyrhunn, fortrinnsvis en kvinne, og spesielt inn i endometriecellene hos denne. Det er ønskelig at nukleinsyren blir introdusert inn i kjertelepitelet i endometriet. Nukleinsyren kan kode for et polypeptid som allerede blir naturlig syntetisert av cellene som har fått nukleinsyre introdusert, slik at nivået av ekspresjon av dette polypeptid blir øket via en gendose effekt. Som alternativ kan metoden bli benyttet for å indusere cellene til å uttrykke et polypeptid som ikke tidligere blir syntetisert i disse celler. Polypeptidet kunne for eksempel være et "kunstig" rekombinant polypeptid som ikke eksisterer i naturen, slik som et kimære polypeptid som omfatter delvis eller helt funksjonelle domener og to eller flere ulike proteiner.

Nukleinsyren er fortrinnsvis DNA, men man kunne prøve å introdusere RNA (enten sens eller ikke-sens tråder). Et antisensmolekyl kunne bli benyttet for å hemme eller på annen måte interferere med ekspresjonen av et polypeptid i cellene der nukleinsyren har blitt introdusert. Nukleinsyresekvensen introdusert kan være antisens RNA, eller kan være en DNA-sekvens som dirigerer syntese, intracellulært, av et antisens RNA. En annen måte for å oppnå slik inhibisjon er å introdusere inn i cellene en sekvens som dirigerer syntese av et ribozym, som deretter spesifikt vil kløve mRNA som er nødvendig for å syntetisere polypeptidet hvis ekspresjon man prøver å hemme.

De herværende oppfinnere har funnet at tidspunktet for tilførsel av nukleinsyren, relativt til stadium av den reproduktive syklus, har stor effekt på opptakseffektiviteten av nukleinsyren. Oppfinnerne har funnet at det generelt for å oppnå optimal grad av opptak av den tilførte nukleinsyre, er det nødvendig å tilføre nukleinsyren i perioden som følger etter eggløsning, frem til og inkluderende dagen der progesteron-nivået i blod når en topp. Progesteron-nivået når vanligvis en topp omtrent på samme tidspunkt der et embryo, dersom det er tilstede i livmoren, kunne bli implantert.

Således har oppfinnerne funnet for eksempel at maksimalt opptak av tilført DNA i muse-endometriet forekommer på dag 2-3 i syklus (med dag 1 definert som den dag der en vaginal plugg først blir observert). Hos mennesker opptrer eggløsning typisk på dag 14 i syklus, og implantasjon blir vanligvis antatt å forekomme i midt-lutealfasen selv om det eksakte tidspunkt er dårlig definert hos mennesker. Nukleinsyren kan tilføres i en naken form, eller kan være bundet eller assosiert med andre substanser, for eksempel liposomer. Nukleinsyren blir med fordel introdusert inn i cellene hos det mottagende pattedyr ved en enkel transfeksjon (med eller uten liposomer), som har blitt funnet av de herværende oppfinnere å være forbløffende effektiv, uten behov for at sekvensen blir introdusert innen en virusvektor. Til tross for dette kan virusvektorer være ønskelige, spesielt de som kan bli målrettet mot spesielle celletyper (for eksempel som beskrevet i WO93/20221).

Nukleinsyren vil fortrinnsvis bli introdusert som del av en konstruksjon (for eksempel et plasmid, cosmid eller lignende), der denne konstruksjon vil med fordel omfatte en promoter, som kan fungere i et pattedyr, for å fremkalle transkripsjon av i det minste del av den introduserte nukleinsyre. Promoteren kan være konstitutiv eller, mere fordelaktig, induserbar, noe som tillater større kontroll av ekspresjon av den introduserte sekvens.

I en spesiell metode utført i overensstemmelse med oppfinnelsen, tillater introduksjon av et nukleinsyremolekyl inn i endometriecellene hos et individuelt kvinnelig pattedyr, en opp- eller ned-regulering av fruktbarheten hos individet. Oppfinnelsen kan spesielt bli benyttet for å gi en metode for prevensjon for kjæledyr, for eksempel katter og hunder, for å forebygge uønskede kull. I andre utførelser av oppfinnelsen fremskaffes en metode for å forbedre fertilitet hos husdyr, slik som griser, kuer, sauer og lignende.

Fortrinnsvis blir nukleinsyren introdusert inn i reproduksjonstraktus via skjeden, noe som unngår behovet for invasive kirurgiske teknikker. Dersom det imidlertid er nødvendig, kunne nukleinsyren bli introdusert ved hjelp av kirurgiske teknikker rett inn i reproduksjonstraktus, for eksempel inn i livmoren. Oppfinnelsen tilbyr muligheten av å endre ett eller flere karakteristika ved introduksjon av ett eller flere av et meget stort antall av ulike nukleinsyresekvenser.

I en utførelse dirigerer sekvensen som er introdusert inn i reproduksjons-tractus, ekspresjonen, fortrinnsvis på høye nivåer, av en effektiv del av et cytokin eller en vekstfaktor (en effektiv del er den delen av molekylet som beholder den biologiske aktivitet som spesielt er assosiert med hele, for eksempel binding til en spesifikk ligand, etc). Eksempler på slike polypeptider som kan bli uttrykt av den introduserte sekvens inkluderer, men er ikke begrenset til de følgende: interleukiner, leukemi-inhibitorisk faktor (LIF), vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF), epidermal vekstfaktor (EGF), heparin-bindende epidermal vekstfaktor (HBEGF), insulin-bindende vekstfaktorer I og II (IGF-I og IGF-II), amfiregulin, kolonistimulerende faktor (CSF) og tumor-nekrosefaktor (TN F).

I en annen utførelse kan den introduserte sekvens dirigere ekspresjon av en effektiv del av en antagonist av et cytokin eller en vekstfaktor, slik som IL-1 reseptorantagonisten. Med fordel kan antagonisten være en løselig reseptor for cytokinet eller vekstfaktoren. Passende eksempler inkluderer løselige reseptorer for de følgende: transformerende vekstfaktor (TFG)a, fibroblast-vekstfaktor (FGF), blodplatederivert vekstfaktor (PDGF), interleukin-6 (IL-6) og VEGF.

I en utførelse kan den introduserte sekvens dirigere ekspresjon av en effektiv del av et polypeptid som har en immunologisk effekt. Spesielt kan polypeptidet ha immunogen aktivitet, noe som fører til at det stimuleres en lokal immunrespons. Således kan oppfinnelsen blir benyttet for å frembringe en ny metode for immunisering. Med fordel vil det immunogene polypeptid være et antigen fra et patogen fra slimhinnen. På grunn av det felles slimhinne-immunsystem kan stimulering av antistoffproduksjon i reproduksjonstraktus, resultere i produksjon av tilsvarende antistoff i fjerne slimhinne-lokaliteter, slik som mave/tarmtractus, respirasjonstraktus, tårekjertler og lignende. Imidlertid vil antigenet fortrinnsvis være et fra et patogen som invaderer og/eller koloniserer reproduksjonstraktus, typisk et patogen som forårsaker en seksuelt overførbar sykdom. Eksempler inkluderer virus, slik som HIV, papillomvirus, for eksempel HPV av ulike typer, chlamydia og bakterier, for eksempel N. gonorrhoea. Alternativt kan polypeptidet som har en immunologisk effekt være et immunglobulin eller en effektiv del av dette slik som et Fab, Fv, eller scFv-fragmenter, eller et enkeltkjede-antistoff. Immunglobulinet eller den effektive del av dette, kan være rettet mot et patogen slik som de som er beskrevet over, eller kan være rettet mot noe annet antigen, slik som et steroid eller et annet hormon. Således kunne immunglobuliner eller fragmenter av disse, bli uttrykt lokalt for å gi beskyttelse mot sykdom eller for å regulere fertilitet. I en annen utførelse kan den introduserte sekvens dirigere ekspresjon av et polypeptid, eller en effektiv del av dette som har en effekt på menstruasjon.

I en annen utførelse kan den introduserte nukleinsyre dirigere ekspresjonen på overflaten av reproduksjonstraktuscellene av en effektiv del av et reseptor-molekyl. Reseptoren kunne være en reseptor for et cytokin, et steroid-hormon eller en vekstfaktor (slik som EGF-reseptoren, TGFa-reseptoren eller VEGF-reseptoren). En rekke reseptorer er kjent som er beskrevet som "foreldreløse" reseptorer, siden liganden som binder til reseptoren ikke er kjent. Slike foreldreløse reseptorer er av betydelig interesse for den farmasøytiske industri, siden de kan gi mål for nye terapeutiske eller profylaktiske forbindelser.

Således beskrives en metode for å karakterisere de biologiske egenskaper hos et polypeptid, som omfatter å introdusere sekvensen som koder for polypeptidet som skal karakteriseres, inn i cellene hos et pattedyrs reproduksjonstraktus, og deretter estimere effekten av det uttrykte polypeptid. Fortrinnsvis er pattedyret et forsøksdyr, slik som en mus eller rotte. For letthets skyld vil polypeptidet som skal karakteriseres være en foreldreløs reseptor, og typisk vil i det minste en del av karakteirseringen av denne omfatte identifikasjon av liganden som skal bindes. Generelt vil metoden inkludere analyse av histologiske snitt tatt fra forsøksdyret, og behandling av disse snitt via enhver av flere ulike standardmetoder, for eksempel histokjemisk farging, in situ hybridisering, immunologisk farging, etc.

Den herværende oppfinnelse tilbyr således et nytt alternativ til regulering av endometriefunksjon og således den reproduktive kapasitet eller fertilitet av steroider ved hjelp av direkte genoverføring in vivo. For å oppnå dette må genetiske konstruksjoner bli konstruert for spesifikt å modulere cytokineffekter. Dette kan oppnås på en rekke ulike måter. For eksempel kunne cellene som produserer et frisatt cytokin, bli hindret fra å syntetisere faktoren ved hjelp av transkripsjons-blokade og transtasjonsblokade, under bruk av promoterdrevet antisens-konstruksjoner eller ribozymer. Alternativt kan effekten av den utskilte faktor bli blokkert av reseptorantagonister. Naturlig forekommende løselige reseptorer kan suge opp og nøytralisere bioaktive ligander, og derved fungere som kompetitive reseptorantagonister. Alternativt er det naturlige reseptorantagonister, for eksempel IL-1Ra (interleukin-1 reseptorantagonist). Intraperitoneal tilførsel avdette protein blokkerer blastocystimplantasjon hos mus (Simon et al., 1994 sitert på annet sted).

Det er betydelig funn som viser at løselige vekstfaktorer frisatt av eggleder og livmorepitel kan kontrollere pre-implantasjonsutvikling av pattedyrembryoer, ved å virke direkte gjennom reseptorer som uttrykkes på embryoet (Pampfer et al., 1990 In vitro Cellular and Developmental Biology, 26,944-948). Omvendt produserer utviklende embryoer vekstfaktorer som kan fungere på en autokrin måte, eller på endometriet for å influere dets evne til å motta embryo. For eksempel er LIF-ekspresjon fra maternelle vev hos mus, dramatisk oppregulert i kjertelepitel på dag 4, like før implantasjon. LIF har evne til å virke på pre-implantasjonsblastocyster, som uttrykker LIF-reseptoren (LIF-R). Denne maternelle ekspresjon av LIF er vital for implantasjon siden embryoer ikke vil implanteres i LiF-"knock ouf-mus, selv om de vil gjøre dette når de overføres til pseudogravide hunndyr (Stewart et al., 1992, sitert på annet sted).

Oppfinnerne har nå utviklet dette arbeid ut til å inkludere mennesker, og vist ved hjelp av RT-PCR at humane embryoer uttrykker mRNA som koder for LIF-R, men uttrykker ikke selv LIF. LIF fungerer ved binding tii en lav-affinitetsreseptor LIF-R. Høy-affinitetsbinding oppstår når LIF/LIF-R-komplekset interagerer med det signaloverførende aksessoriske protein gp130. Humane embryoer inneholder også mRNA som koder for dette protein (Sharkey et al., 1995 Biology of Reproduction 53, 955-962). Oppfinnerne har også vist at LIF-sekresjon i humant kjertelepitel er regulert av steroider, og er maksimal i lutealfasen (rundt den forventede tid for implantasjon - Chamock-Jones et al., 1994, sitert annet sted). Videre har tilførsel av LIF til humane pre-implantasjonsembryoer in v/fro blitt rapportert å forbedre utvikling. Atle disse funn støtter ideen at LIF kan være viktig for implantasjon hos mennesker som det er hos mus. Tydeligvis kan cytokiner mediere viktig kommunikasjon mellom embryo i livmorhulrommet og endometriet i begge retninger. Den nærværende oppfinnelse tillater bruk av genoverføring for å ødelegge eller forsterke denne kommunikasjon, noe som fører til nye metoder for prevensjon, eller motsatt, til forbedret implantasjon.

De fleste nåværende studier av den parakrine og autokrine regulering av reproduksjonsfunksjon er begrenset til en deskriptiv analyse på grunn av mangel på effektive metoder for å modulere lokale cytokin/reseptor-nivåer. Resultatene som presenteres i denne søknad indikerer at transfeksjon av livmorepitel in vitro er mulig. Dette tillater endometriet å bli manipulert eksperimentelt, og tilbyr nye terapeutiske strategier. Arbeider skissert nedenfor beskriver bruk av et reportergen for å demonstrere den praktiske mulighet av in vivo livmor-genoverføring. I virkeligheten ville et gen eller en annen DNA-konstruksjon som hadde evne til å endre livmorfunksjon, bli benyttet. Eksempler på disse inkluderer reseptorantagonister for eksempel IL-1Ra, løselige VGEF-reseptorer, etc, naturlige eller modifiserte cytokiner og vekstfaktorer, protease-inhibitorer eller steroidreseptorer og en rekke av ribozymer og antisens-konstruksjoner. Dette arbeid viser at gener kan bli overført endometriet in vivo og dette vil bli benyttet i mange endometrielle og placentære tilstander, for eksempel for å forbedre implantasjon både hos dyr og hos mennesker, avbryte implantasjon, for eksempel prevensjon, endometriose og menorrhagi (forøket menstruasjonsblødning), hyperplasi og adenokarsinom.

Resultatene beskrevet under, ble oppnådd ved å bruke de protokoller som vi har utviklet. De demonstrerer at genkonstruksjonene kan bli overført til endometriet både in vivo (hos mus) og in vitro og at disse konstruksjoner er transkripsjonelt og translasjonelt aktive.

Oppfinnelsen vil nå bli videre beskrevet ved hjelp av et illustrerende eksempel og med referanse til de vedlagte tegninger, der: Figur 1A og 1B viser fotomikrografer av histologiske snitt av muse-endometriet transfektert med (A) en plasmidkonstruksjon som dirigerer ekspresjon av et B-galaktosidase-reportergen, eller (B) et lignende plasmid som mangler reportergenet. Transfekterte celler kan tydelig bli identifisert ved hjelp av den intenst mørke (blå) fargingen inne i cytoplasma, som er fraværende i snitt (B); Figur 2 er et fotomikrograf av in vitro humane endometrieceller som har blitt transformert med det samme plasmidet som vist i Figur 1A - den mørke (blå) fargingen fremkalt av ekspresjon av reportergenet er hovedsakelig assosiert med den gjenværende kjertelstruktur, mens de omgivende celler farger svakere; Figur 3 er et søylediagram som viser resultatene av en CAT-analyse (vist i tellinger per reagensrør), utført på en endometrieceller som har blitt effektivt transfektert med et gen som koder for kloramfenikol-acetyltransferase (pcDNA3CAT) sammenlignet med celler transfektert med et kontrollplasmid (pcDNA3); og Figur 4 er et søylediagram som viser resultatet av en luciferase-analyse (i relative lysen heter), utført på endometrieceller som har blitt transfektert vellykket med et gen som koder for luciferase (pcDNA3LUC) sammenlignet med celler transfektert med et kontrollplasmid (pcDNA3).

Eksempler

Eksempel 1

Mus

Modne BALB/cJ mus som ikke hadde født, ble oppbevart i et lite forsøksdyr-hus hvor lyset (14 timer lys, 10 timer mørke, lys slått av klokken 20.00) og temperatur (22°C) var kontrollert og gitt en muse- og rottediett (Labsure; Christopher Hill Group, Poole, Dorset, UK). De ble plassert sammen med mus som hadde fått fjernet sædleder fra den samme stamme, over natten og undersøkt neste morgen med henblikk på nærvær en vaginal plugg. Parring ble antatt å ha forekommet klokken 02.00, tid 0 og dag 1 ble tellet som den dagen der pluggen først ble observert. Parrede hunnmus ble oppbevart individuelt før eksperimentering.

Laparotomi ble foretatt under aseptiske betingelser under Metafan-anestesi (metoksyfluoran, C-Vet Ltd., Bury St. Edmunds). Livmorhornene ble blottlagt enten via midtventrale eller bilaterale incisjoner. Injeksjoner ble gjort enten inn i hornenes spisser sammensmeltning mellom eggleder og livmor eller ved basis av hornene ved sammensmeltning av livmor og livmorhals. Gjentatte studier viste at den siste teknikken ga den beste metoden for tilførsel, men for noen formål var den første teknikken fordelaktige når det var nødvendig å minimalisere forstyrrelse av reproduksjonstraktus.

Injeksjoner av liposom/DNA (pcDNA3-konstruksjon, +/- B-galaktosidase-reportergen), nakent DNA eller kontroll-løsninger (25-100 \ iL ble utført ved innførsel av spissen av en flat "Stratatip" inn i livmorhornets basis. Løsningene var tidligere blitt trukket opp i spissen ved hjelp av en Travesty-applikator som også ble benyttet for å kontrollere den langsomme injeksjon av løsningene inn i hornene.

Etter injeksjon ble incisjonen lukket ved hjelp av kontinuerlige madrass-suturer, og musene fikk våkne opp igjen i deres bur og gitt tilgang til mat og vann ad libitum.

Plasmid-konstruksjoner

Plasmidene som beskrives i denne søknad (som eksempler) er basert på den kommersielt tilgjengelige vektor pcDNA3 (Katalog nr. V790-20, fra Invitrogen, San Diego, California, USA). Plasmid pcDNA3, uten noe reportergen, ble benyttet som en negativ kontroll. Eksperimentelle plasmider pcDNA3-pgal, pcDNA3-CAT, og pcDNA3-Luc inneholdt henholdsvis genene for B-galaktosidase, kloramfenikol-acetyltransferase og luciferase som reportergen. Disse plasmider inneholdt de følgende genetiske elementer: ampicillin-resistensgen, Co1E1 replikasjons-påbegynning, CMV-promoter, [reportergen], bovint veksthormon polyA addisjonssete, fl replikasjonspåbegynning, SV40 replikasjons-påbegynning, neomycin resistensgenet og et SV40 polyA addisjonssete, i en operabel relasjon slik at reportergenet kan bli uttrykt i eukaryote celler etter introduksjon av plasmidet. Plasmid DNA ble renset fra £. co// ved alkalisk lyse og videre renset ved hjelp av en Qiagen ionebyttersøyle (ifølge produsentens instruksjoner).

Liposompreparering

Liposomer som ble benyttet var en 3:1 (vekt/vekt) lipidformulering av DOPSA (2,3-dioleyloksy-N-[2(sperminkarboksamido)etyl]-N-N-dimetyl-1-propanaminium-trifluoroacetat) og DOPE (dioleoylfosfatidyi-etanolamin) (LipofectAMINE; Gibco BRL Paisley, Skottland). En rekke DNA:lipid-ratioer og ulike injeksjonsvolumer ble benyttet som vist i Tabell 1. DNA/liposomene ble blandet umiddelbart før hvert eksperiment. 10 uL av DNA-løsning ble tilsatt til 10 uL av lipidløsning, forsiktig blandet og latt i fred i 15 minutter ved romtemperatur. 80 uL av PBS ble deretter tilsatt for å gi sluttkonsentrasjoner av DNA og lipid som vist i Tabell 1. Dette ble deretter injisert inn i livmoren hos de pseudogravide mus. (Se seksjon over for detaljene hva angår mus og kirurgisk teknikk).

Histokjemisk lokalisasjon av B-galaktosidase

Dyr ble avlivet ved karbondioksyd-inhalasjon og livmorshornene ble dissekert ut, renset for fett og bukhinne. Hvert horn ble delt i tre deler med toppen og bunnseksjonen raskt frosset i flytende nitrogen, og lagret ved -70°C før kvantifikasjon av p-galaktosidaseinnhold. Midtdelen av hvert livmorshorn ble fiksert i 1,25% glutataraldehyd i PBS i 15 minutter, renset to ganger i PBS og plassert i X-gal fargeløsning (1 mg/mL X-gal, 5 mM K3Fe(CN)6, 5 mM K4Fe(CN)6,2 mM MgCI2, 0,02% NP40, og 0,01% natriumdeoksycholat) i 24 timer ved romtemperatur. Snitt ble deretter renset i PBS/3% DMSO (2x5 minutter), 70% etanol (3x5 minutter) og plassert i 100% etanol. Vev ble deretter innstøpt i glykol-metakrylat-resin og 7 \ xm snitt ble kuttet og motfarget med nøytralrødt før mikroskopisk undersøkelse.

Resultater

Tabell 1 nedenfor viser de ulike betingelser som ble benyttet og den resulterende fargeintensitet av uterinsnitt etter tilførsel av DNA/liposomkomplekser. Resultatene som vist i Tabellen demonstrerer hvor kritisk tidspunktet for tilførsel av plasmid DNA er, med tilførsel på dag 2 resulterende i de beste ekspresjonsnivåer, tilførsel på dag 3 resulterende i akseptable nivåer, mens tilførsel på dag 4 resulterte i meget liten ekspresjon av reportergenet, sannsynligvis fordi endometriecellene ikke ville ta opp konstruksjonen på dette tidspunkt, av årsaker som ikke er helt klare.

Kontroller:

En ikke-injisert 6-dagers pseudogravid mus ga ingen uterin farging for p-galaktosidaseaktivitet.

En pseudogravid mus (tilførselsdag 2; autopsidag 6) injisert med 50 uL av pcDNA3 minus B-galaktosidase (2 ug/mL) og lipid (20 ug/mL) ga ingen B-galaktosidaseaktivitetsfarging i livmoren.

Undersøkelse av histologiske snitt etter farging med X-gal viste at kjertelepitelet var sterkt farget og at hulromsepitelet også var farget, men ikke så sterkt. Den optimale farging ble sett hos dyr transfektert med 2 ng/ml_ DNA og 20 ug/mL lipid i 50 pi. tilført på dag 2 av pseudograviditeten. Figur 1A viser et snitt fra slikt et dyr og Figur 1B viser et snitt fra et kontrolldyr som mottok (under identiske betingelser) et plasmid som manglet p-gal-genet.

Eksempel 2

Transfeksjon av primære kulturer av humant endometrium

Oppfinnerne har også demonstrert at humane epitelceller fra endometriet kan bli transfektert in vitro med høy effektivitet.

Det samme plasmid (pcDNA3, +/- B-galaktosidase-reportergenet) og lipider som allerede er beskrevet, ble benyttet. Endometrieceller ble preparert ved metoden til Smith and Kelly (Smith et al., 1987 Prostaglandins 34,553-561). Så fort kulturen var etablert ble den følgende transfeksjonsprotokoll benyttet. DNA (2 fig) og liposom (8 \ ig) ble hver fortynnet i 100 nl_ av serumfritt medium (Opti-MEM1 BRL), blandet og inkubert ved romtemperatur i 15 minutter. Etter dette ble ytterligere 800 \ jL av Opti-MEM1 tilført. Cellene (i 24 brønns plater) ble vasket med PBS etterfulgt av vasking med Opti-MEM1. DNA/liposomblandingen (0,5 ml_) ble deretter tilsatt cellene og inkubert ved 37°C i 3 timer i en C02 inkubator, etterfulgt av 0,5 ml_ av kulturmedium inneholdt 20% føtalt kalveserum. Cellene ble fiksert (0,1% glutaraldehyd), renset og farget med X-gal 24 timer etter transfeksjon.

Dette arbeid viser at gener kan bli overført til endometeriet in vivo og dette vil kunne benyttes i mange endometerie- og livmorkake-tilstander, for eksempel forbedring av implantasjon hos både dyr og mennesker, forhindring av implantasjon dvs. prevensjon, endometriose og menstruasjonsblødningsforstyrrelse, hyperplasi og adenokarsinom.

Ytterligere data ble fremskaffet som relaterer til transfeksjon in vitro av renset humant livmorepitelceller. Dette komplementerer in vivo arbeidet gjort på mus og viser at lignende celler, etter minimal tid dyrket i kultur, kan effektivt bli transfektert med det samme liposom og DNA som benyttet in vivo.

Eksempel 3

Transfeksjon av humant endometrie-epitelium in vitro

Humane primære epitelceller fra endometeriet ble isolert og dyrket ifølge metoden til Zhang et at., (J. Cell Science, 1995; 108-323-331). Cellene ble platet i standard 6-brønns vevsdyrkningsptater for å oppnå en tetthet på 50% sammenflyting den neste dag. Cellene ble dyrket i 5 dager, deretter ble de platet på nytt i 24-brønns plater med en tetthet på 60.000 celler per brønn. Neste dag ble cellene transfaktert med DNA/liposom-komplekser (DNA/LC). Disse ble preparert som følger:

Transfeksjonsprosedyre

Apparat

LipofectAMINE (Gibco Katalog nr. 18324-012), Opti-MEM I (Gibco Katalog nr. 51985-018)

24 brønns dyrkningsplate

Celledyrkningsmedium som beskrevet av Zhang et al., (sitert over).

Dette består av DMEM/HEPES, 10% FCS, endotelialt cellevekst-supplement (Sigma Katalog nr. E-2759), ved 30 ug/mL heparin (Sigma Katalog nr. H-3149), 90 ug/mL, gentamycin (Sigma Katalog nr. G-1271), ved 5 |ig/mL, og fungizone (Gibco Katalog nr. 15290-018) ved 1 ug/mL). Mg++, Ca++ fri PBS og et 2 ml_ Eppendorf reagensrør ble også benyttet.

To ulike plasmidkonstruksjoner ble benyttet som inneholdt ulike rapportør-gener. pcDNA3CAT ble skaffet fra Invitrogen Corporation, og inneholder et rapportørgen som koder for enzymet kloramfenikol-acetyltransferase. Det andre plasmid pcDNA3luc inneholdt den samme vektor, men CAT-genet var byttet ut med genet som koder for luciferase-enzymet fra ildflue. Storskala DNA-preparater av vektorene ble utført ved hjelp av Qiagen midiprep-systemet. Som en negativ kontroll ble pcDNA3 som ikke inneholdt noe reportergen benyttet.

Preparering av DNA/liposom-komplekser

1) Løsning A

Fortynn 1 ug av DNA i 100 p.L Opti-MEM I i et Eppendorf-rør. Bruk DNA med

sluttkonsentrasjon på 1 ug/mL i transfeksjonsmediet.

2) Løsning B

Fortynn 4 \ iL av LipofectAMINE i 100 \ iL Opti-MEM I i et Eppendorf-rør. Bruk

LipofectAMINE med sluttkonsentrasjon på 8 ug/mL i transfeksjonsmediet.

3) Slå sammen to løsninger A og B i et nytt rør og bland forsiktig.

4) Inkuber ved romtemperatur i 15 minutter.

Cellerensing

1) Rens cellenes monolag raskt tre ganger i fersk PBS uten serum før transfeksjon.

2) Rens cellenes monolag om igjen to ganger med Opti-MEM I.

Transfeksjon

1) Tilsett 800 jiL (totalt 1,0 ml_) av Opti-MEM til hvert rør som inneholder DNA-lipidblandingen. Sluttkonsentrasjon av DNA 1 ug/mL, og lipofectAMINE-konsentrasjon 8 ug/mL

2) Fjern Opti-MEM I i cellenes monolag.

3) Bland DNA/LC-blandingen forsiktig og overfør forsiktig den fortynnede kompleksløsning på topp av de vaskede celler, 0,5 mL/24 brønn.

4) Inkuber cellemonolaget i 3 timer ved 37°C i en C02-inkubator.

Videre cellekultur

1) 3 timer senere fjernes transfeksjonsblandingen og 2 ml_ av Zhang-mediet tilsettes tit hver brønn og videre dyrking foretas.

Kvantitativ analyse

24 til 48 timer etter transfeksjon ble cellene ekstrahert og analysert med henblikk på CAT eller luciferasereporteraktivitet, som det passet.

1. Rens cellene tre ganger i PBS.

2. Ekstraher cellene med 300 mikroliter av Lysis-buffer (Promega Katalog nr.

E-3871), hvorved cellene blir grundig skrapet av inn i et Eppendorf-rør.

3. Frys ekstraktet raskt ved -70°C og lagre det til analyse.

4. For å analysere blir ekstraktene tint og sentrifugert ved 13.000g i 5 minutter.

5. Gjenta frysing/tining/sentrifugerings-syklus en gang til.

6. Analyser luciferase-reportergenakttvitet ved hjelp av Luciferase-analysesett fra

Tropix (Katalog nr. BC100L). Bruk 40 uL av hvert ekstrakt per rør.

7. CAT-reportergenaktivitet ble analysert ved hjelp av Quan-t-CAT-reagenssettet fra Amersham (Katalog nr. TRK 1012).

Resultater

Primære endometrie-epitelceller ble transfektert i 24-brønns plater som beskrevet over. Transfeksjoner ble utført i tre parallelle brønner med pcDNA3 (som kontroll), pcDNACAT, og pcDNA3LUC. Etter 48 timer ble cellene høstet og analysert med henblikk på luciferase eller CAT-aktivitet.

CAT-enzymet katalyserer overføring av acetylgrupper fra acetyl-koenzym A til kloramfenikol. Bruk av tritiert acetyl coA resulterer i overføring av radioaktiv merking til kloramfenikol. CAT-aktiviteten i en prøve er direkte proporsjonal med mengde av tritiert kloramfenikol som blir produsert. Resultatene blir derfor uttrykt som tellinger per minutt (cpm) per reagensrør. En standardkurve kan produseres ved hjelp av Lysis-buffer som inneholder kjente mengder av renset CAT.

Resultatene blir vist i Figur 3, som er et søylediagram som viser gjennomsnitt ± standardfeil av gjennomsnitt for triplikate bestemmelser i et typisk eksperiment. Resultatene i nummerisk form var som vist nedenfor, med CAT-aktivitet i cellene behandlet med pcDNA3CAT ca. 6 ganger høyere enn kontrollprøvene, noe som viser vellykket transfeksjon av endometriecellene.

I luciferaceanalysen blir celle-ekstraktet som inneholder luciferase blandet med dets substrat luciferin, noe som fører til frigjørelse av lys. Lyssignalets intensitet er proporsjonalt med mengde luciferase-enzym som er tilstede i ekstraktet, og kan måles med et luminometer. Initiale resultater blir gitt i relative lysenheter.

Resultatene blir vist i Figur 4, som er et søylediagram som viser gjennomsnitt ±standardfeil av gjennomsnitt for triplikate bestemmelser i et typisk eksperiment. Resultatene i nummerisk form, var som vist nedenfor. Signalene fra cellene behandlet med pcDNA3LUC var over 30 ganger høyere enn bakgrunnssignalet hos kontrollprøvene, noe som igjen demonstrerte vellykket transfeksjon av endometriecellene.

Eksempler på ulike applikasjoner av endometriell genoverføring

Minst syv ulike typer av genkonstruksjoner kunne bli transfektert inn i endometeriet for å oppnå en rekke ulike effekter. Hver av disse ulike typene vil nå bli beskrevet etter hverandre.

1) Overekspresjon av cytokiner og vekstfaktorer.

Disse er prinsipielt de enkleste typer av konstruksjoner, i og med at de vil bli bygget opp for å over-uttrykke enten et cytokin eller en vekstfaktor i livmorens epitelceller. Eksempler på passende cDNA for slik over-ekspresjon inkluderer de som koder for LIF, VEGF, EGF, CSF, TNF, og amfiregulin, samt en rekke av ulike interleukiner og kolonistimulerende faktorer. Disse har blitt vist å naturlig bli uttrykt i endometriet og antas å være viktige i regulering av endometriefunksjon (Stewart et al., 1992, Nature, 359, 76-79; Charnock-Jones et al., 1994, Journal of Reproduction and Fertility, 101, 421-426; Charnock-Jones et al., 1993, Biology of Reproductiom 48,1120-1128; Das et al., 1995, Molecular Endocrinology, 9, 691-; Tabibzadeh (1994, Human Reproduction Update, 9, 947-967) har publisert en grundig oversikt av dette feltet). Disse midler affiserer hver ulike aspekter av reproduksjonsfunksjoner, inkluderende implantasjon, blodåreutvikling og hvite blodlegemers biologi. Derfor ville mulige indikasjoner for tilførsel av slike konstruksjoner være der man ønsket å forbedre fertilitet, spesielt i husdyrarter, eller å forhindre forplantning av mennesker og deres kjæledyr, og også å behandle en rekke ulike menstruasjonsforstyrrelser hos mennesker.

Et eksempel på et eksperiment planlagt for å forbedre fertilitet hos husdyr

Det har blitt påvist at LIF er nødvendig for implantasjonsprosessen (Stewart et al., 1992, sitert over). Denne faktor blir produsert av endometeriet ved implantasjonstidspunktet. Det er derfor mulig at det hos arter der hyppighet av fostertap er høy, ville være mulig å redusere disse tapsfrekvenser ved å øke nivåene av LIF-ekspresjon fra endometeriet ved implantasjonstidspunktet. Transfeksjon av en genkonstruksjon som var strukturert for å dirigere syntese av LIF fra endometeriet ved implantasjontidspunktet kunne derfor forbedre fertilitetsfrekvens hos slike arter. Konstruksjoner som ble transfektert inn i endometriet ville måtte inneholde passende regulatoriske sekvenser for å sikre at LIF-proteinet ble produsert ved det passende tidspunkt. Det er sannsynlig at dette kunne oppnås ved bruk av promoteren fra LIF-genet fra den relevante art.

Behandlinger planlagt å forbedre eller lindre menstruasjonssvikt hos kvinner kan også tenkes utført ved hjelp av endometriell genoverføring. Et eksempel på dette ville være å endre blodåreutvikling innen endometriet ved hjelp av transfeksjon av et gen som koder for angiogene vekstfaktorer, for eksempel VEGF. En lokal økning i VEGF-produksjon kan bli forventet å øke kapillærvekst og derfor fremme fortykkelse av endometriet. På samme måte kan økede nivåer av VEGF fasilitere kapillær-reparasjon etter menstruasjon og således endre blødningsmønsteret hos pasienter som har blitt behandlet med denne type konstruksjoner.

2) Overekspresjon av reseptorer

En økning av antall og type reseptorer som uttrykkes av livmorens epitel ville bli forventet å ha signifikante biologiske konsekvenser. Typene av reseptorer som man kunne ønske å over-uttrykke inkluderer, men er ikke begrenset til, vekstfaktor og cytokinreseptorer, for eksempel reseptorer for EGF, TGFa, VEGF og en rekke av kolonistimulerende faktorer og interleukiner. Steroidhormonreseptorer er også passende for ekspresjon i de epiteliale celler. Slik transfeksjon ville bli forventet å være hensiktsmessig der man ønsker å forbedre fertilitet, hindre forplantning, behandle menstruasjonsforstyrrelser og også å studere funksjonen av foreldreløse ("orphan") reseptorer "orphan"-reseptorer er reseptorer der liganden for øyeblikket ikke er identifisert. "Orphan"-reseptorene representerer et område med stor interesse for den farmasøytiske industri, siden karakterisering av liganden kan tenkes å føre til dannelse av nye medikamenter.

Det blir i økende grad forstått at utvikling av endometriet er en kompleks prosess som medieres ved hjelp av en interaksjon av mange cytokiner og deres reseptorer, og at de stimulatoriske effekter av eggstokk-steroidene ofte blir mediert gjennom disse cytokiner. Det har spesielt blitt vist (Nelson et al., 1992, Endocrinology, 131,1657-1644) at TGFa er en mulig mediator av østrogen-virkninger i muse-livmor. Derfor kan transfeksjon av konstruksjoner som dirigerer syntese av denne faktor, bli forventet å fremme endometrievekst, og derved ha potensiale å øke fertilitet i situasjoner der endometriet ikke har utviklet seg adekvat. På samme måte kan denne faktor bli forventet å fremme epiteloverflatereparasjon etter menstruasjon, og derfor være hensiktsmessig i behandling av forøkede menstruasjonsblødninger.

Det er ulike typer av steroidhormonreseptor-supeframilien der liganden for øyeblikket ikke er kjent. Transfeksjon av slike cDNA inn i endometriet kunne være til stor hjelp i å identifisere de biologiske effekter til disse reseptorer, og kunne derfor bli benyttet i leting etter nye farmasøytiske midler som virker på disse reseptorer (Evans 1988, Science 240, 889-895). 3) Transfeksjon av konstruksjoner produsert for å blokke eller hindre effekt av cytokin, vekstfaktorer og andre hormoner.

Transfeksjon av naturlige antagonister til cytokiner og vekstfaktorer åpner opp muligheter for å modulere endometriefunksjon. Et eksempel på slike antagonister ville være interleukin 1 reseptorantagonisten (Hannum et al., 1990, Nature, 343, 336). Tilførsel av dette proteinet har blitt vist å blokkere graviditet hos mus (Simon et al., 1994 Endocrinology, 134, 521-528). Andre naturlige antagonister til cytokiner og vekstfaktorer inkluderer de naturlige løselige reseptorer. Løselige reseptorer har blitt beskrevet i en rekke av vekstfaktor/cytokin-systemer. For eksempel TNF (Engelmann et al., 1990, J. Biol. Chem., 265, 14497-14505), FGF (Givol, et al., 1992, FASEB Journal, 6, 3362-3369). PDGF (Tiesman & Hart, 1993, J. Biol. Chem. 268, 9621-9628) og IL-6 (Novick et al., 1989, J. Exp. Med. 170,1409-1414). Den felles egenskap er at det ekstracellulære ligand-bindende domenet av reseptoren blir frigjort fra cellene som en fritt løselig faktor. Dette oppnås enten ved proteolyse eller ved alternativ spleising, noe som genererer et forkortet proteinmolekyl som mangler transmembrane og intracellulære domener. Kendall and Thomas (1993, Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 90,10705-10709) beskrev en løselig variant av VEGF-reseptoren fit. Dette protein hadde evne til å blokkere virkningen av VEGF in vitro. Vi har isolert tre videre cDNA som koder for ytterligere løselige varianter (se PCT/GB95/01213). Bruk av disse naturlige forbindelser har en rekke fordeler fremfor andre antagonister (for eksempel anti-VEGF-antistoff). Siden de forekommer naturlig i kroppen ville man anta at de ikke ville fremkalle en immunrespons og skulle bli tolerert godt. Siden de også blir derivert fra den membran-bundne reseptor, vil bindingskarakteristika være meget like og de vil derfor konkurrere meget effektiv for liganden. Det er mulig at andre løselige reseptorer eksisterer naturlig eller at de kunne bli produsert in vitro. Det er også sannsynlig at dersom ligandbindingsdomenet fra et medlem av steroidhormonreseptorfamilien ble uttrykt kunne det fungere som en dominant negativ reseptor på den måte at domenet ville konkurrere for liganden dersom det ble uttrykt innen cellen på et tilstrekkelig høyt nivå. Som alternativ kunne en ikke-aktiverende men DNA-bindende "reseptor" bli benyttet for å blokkere gentranskripsjon. Denne applikasjon ville være hensiktsmessig for å antagonisere effekten på naturlige steroider, inkluderende de som representerer de foreløpig ikke-identifiserte ligander for "orphan"-reseptorene (Pemrick et al., 1994 Leukemia, 8, 1797-1806). Reseptorer fra reseptorfamilien med syv transmembrandomener som hadde defekter i signaloverføring, kunne også bli produsert og transfektert.

Den løselig interleukin-1 reseptorantagonist (Eisenberg et al., 1990, Nature 343, 341) har blitt funnet å antagonisere virkningene av IL-1 in vivo (Simon et al., 1994 Endocrinology, 134, 521-528). Således ville transfeksjon av endometriet med en cDNA-konstruksjon som er laget for å dirigere syntesen av antagonist, forventes å blokkere graviditet hos mus.

Andre faktorer som ville forventes å motvirke vekstfaktor eller cytokineffekter inkluderer løselige varianter av naturlige reseptorer, for eksempel den løselige variant av VEGF-reseptoren for fit har blitt beskrevet av Kandall & Thomas (1993, sitert over) og også av Boocock et al.,(1995 J. Nati. Cancer Ins., 87, 506-516). Lokal produksjon av slike faktorer ville bli forventet å antagonisere effektene av VEGF og kan føre til hensiktsmessig terapeutisk bruk i situasjoner der det er hyperproliferasjon av endotelceller, for eksempel i en rekke av menstruasjons-blødningssykdommer hvor det er ønskelige å redusere kapillærtettheten i endometriet. Dette ville inkludere ordartet sykdom.

4) Bruk av antisensmetoder for å forhindre lokal produksjon av et spesifikt protein (eller enzym)

En alternativ tilnærming til å blokkere effekt av cytokiner, vekstfaktorer og hormoner ville være å bruke antisens eller ribozym teknologien for å blokkere enten produksjonen av ligandene eller produksjonen av reseptorene i de relevante celler (James, 1991 Antiviral Chemistry and Chemotherapy, 2,191-214; Albert & Morris, 1994, Trends in Pharmacological Sciences, 15, 250-254).

Antisensteknologi baserer seg på binding av et såkalt antisensoligonukleotid eller polynukleotid til et cellulært mRNA. Denne binding hindrer translasjon av dette mRNA, og reduserer derfor mengden av det relevante protein som produseres av cellen. Syntetiske oligonukleotider eller polyribonukleotider har begge blitt benyttet med hell i denne tilnærming. Liposom-mediert transfeksjon av oligonukleotider eller liposom-mediert transfeksjon av DNA-konstruksjoner som dirigerer syntese av lengre antisens-polyribonukleotider, ville forventes spesifikt og selektivt å redusere proteinproduksjon av de transfekterte celler. Ribozymer også hindrer proteinproduksjon ved selektivt å kløve det RNA som koder for det spesifikke protein under studium. Disse kan også bli transfektert som polyribonukleotider eller som DNA-konstruksjoner som dirigerer syntesen av slike polynukleotider (for oversikter se James, 1991 og Albert & Morris, 1994, begge sitert over). Et eksempel på slik bruk av et antisens ribozym for å hindre fertilitet ville være som følger. Det har allerede blitt vist at LIF er essensielt for implantasjonsprosessen i pattedyrs graviditet (Stewart et al., 1992, sitert tidligere). Derfor ville transfeksjon av enten oligonukleotider eller DNA-konstruksjoner som dirigerer syntese av antisens-polyribonukleotider, eller ribozymer rettet mot LIF mRNA, forventes å hindre syntesen av denne faktor. Mangel på denne faktor burde deretter føre til en svikt i implantasjon og derfor til at befruktning ville bli blokkert.

En lignende tilnærming kunne benyttes for å blokkere produksjon av angiogene vekstfaktorer, for eksempel VEGF, som ville hindre proliferasjon av endotelceller som er nødvendig for tumorvekst. Denne type av behandling kunne derfor være spesielt fordelaktig der ondartet sykdom er under behandling.

5) Lokal produksjon av immunoglobuliner og fragmenter av disse

Det er mulig ved bruk av moderne rekombinant DNA-teknologi å produsere enkeltkjede-antistoff som har nesten identiske bindingskarakteristika til det hele monoklonale antistoff som var utgangspunktet for dem. Slike enkeltkjede-antistoff har blitt uttrykt hos bakterier med hell (He et al., 1995 Immunology, 84, 662-668). Det er i prinsipp mulig å lage en konstruksjon som vil dirigere ekspresjon av et enkeltkjede-antistoff og uttrykke dette i epitelceller. Dersom dette ble utført i endometriet in vivo ville man forvente at enkeltkjede-antistoff rettet mot et steroidhormon ville binde til steroidet og hindre dets effekt i epitelcellene. Et eksempel på slikt antistoff ville være enkeltkjede-antistoffet hentet fra det antiprogesterone monoklonale antistoff DB3 (He et al., 1995, sitert over). Dersom dette antistoff ble frigjort inn i uterinhulen ville det også binde progesteron og kunne ha effekter andre steder i livmorens områder. Antistoff rettet mot vekstfaktorer og cytokiner som man vet er aktive i endometriet, kunne på samme måte blokkere deres funksjon dersom de ble produsert lokalt på denne måte.

En ytterligere applikasjon for lokalt produsert enkeltkjede-antistoff ville være i å hindre eller behandle seksuelt overførte sykdommer. I denne situasjon ville antistoff rettet mot det relevante middel (for eksempel papillomvirus, HIV, Chlamydia) bli frigjort inn i livmorhulen og hindre infeksjon med midlet som beskrevet. Antistoff rettet mot sædceller eller antigener på eggcelle kunne tenkes å spille en rolle i prevensjonen.

6) Aktiv immunisering for å oppnå slimhinne-immunitet

En ytterligere metode som kunne bli benyttet for å oppnå lokal immunitet villle være å produsere konstruksjoner som ville dirigere sekresjon av et antigen inn i hulrommet. Dette ville fremkalle en lokal immunrespons og setespesifikk slimhinne-immunitet ville således bli oppnådd. Det har vært kjent i mange år (Howe, 1967, Journal of Reproduction and Fertility, 13, 563-566) at livmorhulen inneholder mange hvite blodlegemer. Det er mulig at antigen produsert av transfekterte endometrieceller kunne bli tatt opp av disse hvite blodlegemer og deretter presentert for å fremkalle en slimhinne-immunrespons. Innføring av antigener til tarmhulrommet har resultert i slik immunitet og har i noen tilfeller blitt vist å være meget effektivt for eksempel vaksinasjon mot poliomyelitt.

7) Blokade av bindingsseter for patogener

Binding av patogener tii slimhinneoverflater er ofte en absolutt nødvendig forutsetning før infeksjon kan etableres. Blokade av binding av patogener til disse steder kan således gi en metode hvorved man kan beskytte mennesker eller dyr mot sykdom, spesielt seksuelt overførte sykdommer. Dette dreier seg ikke bare om bakterielle patogener slik som visse patogene stammer av E. coli og N. gonorrhoea, men også om viruspatogener. Mange virus infiserer en celle ved å binde seg til en celles overflate "reseptor". Lokal produksjon av løselige reseptorer kan forventes å konkurrere med celleoverflatemolekylene og derved å kunne hindre virusinfeksjon. På samme måte kan metning av celleoverflatereseptorene med virusetteriignere (som virker som den virale "ligand") også blokkere infeksjon, som også lokal produksjon av spesifikke immunglobuliner eller effektive bindingsdeler av disse, kan gjøre.

Claims (21)

1. Metode for endring av sjansene for embryoimplantasjon i livmorslimhinnen, karakterisert ved at endometrium transfekteres mellom eggløsning og det tidspunkt i den samme menstruasjonssyklus hvor det er en topp i nivået av progesteron i blodet.

2. Metode ifølge krav 1, karakterisert ved at nukleinsyren administreres til individet i perioden som følger eggløsning, opptil og inkluderende det tidspunkt i den samme menstruasjonssyklus der det er en topp i nivået av progesteron i blodet.

3. Metode ifølge krav 1 og 2, karakterisert ved introduksjon av en nukleinsyre inn i cellene av endometrium hos et pattedyrindivid.

4. Metode ifølge ethvert av de foregående kravene, der nukleinsyren er introdusert inn i kjertelepitelet i endometriet.

5. Metode ifølge ethvert av de foregående krav, der den introduserte nukleinsyre er DNA.

6. Metode ifølge ethvert av de foregående krav, der nukleinsyren er introdusert i et liposom, virus eller en annen bærerpartikkel.

7. Metode ifølge ethvert av de foregående krav, der nukleinsyren blir introdusert som et plasmid eller en annen konstruksjon.

8. Metode ifølge ethvert av de foregående krav, der den introduserte nukleinsyre omfatter en promoter som er operativt koblet til en sekvens som skal transkriberes i en eukaryot celle.

9. Metode ifølge krav 8, der promoteren er induserbar.

10. Metode ifølge ethvert av de foregående krav, der den introduserte nukleinsyresekvens omfatter en del som er operativt koblet i antisensorientering til en promoter, slik at ekspresjon av et polypeptid i cellene der sekvensen blir introdusert blir hemmet.

11. Metode ifølge ethvert av de foregående krav, der introduksjon av nukleinsyresekvensen resulterer i en endring i fertiliteten hos individet.

12. Metode ifølge ethvert av de foregående krav, der den introduserte nukleinsyre dirigerer ekspresjon av minst en effektiv del av et cytokin eller en vekstfaktor.

13. Metode ifølge ethvert av de foregående krav, der den introduserte nukleinsyre dirigerer ekspresjon av minst en effektiv del av en av de følgende: et interleukin; leukemi-inhibitorisk faktor (LIF), vaskulært endotel vekstfaktor (VEGF), epidermal vekstfaktor (EGF), heparin-bindende epidermal vekstfaktor (HBEGF), insulin-bindende vekstfaktorer I og II (IGF-I og IGF-II), amfiregulin, kolonistimulerende faktor (CSF); tumor-nekrosefaktor (TNF); hepatocytt vekstfaktor (HGF) og fibroblast vekstfaktor (FGF).

14. Metode ifølge ethvert av kravene 1 til 11, der den introduserte nukleinsyre dirigerer ekspresjon av minst en effektiv del av en antagonist til et cytokin eller en antagonist til en vekstfaktor.

15. Metode ifølge krav 14, der den introduserte nukleinsyre dirigerer ekspresjon av interleukin-1-reseptorantagonist eller en løselig reseptor for en av de følgende: transformerende vekstfaktor (TGF)a; fibroblast vekstfaktor (FGF); blodplate-derivert vekstfaktor (PDGF); interleukin-6; vaskulært endotel vekstfaktor (VEGF); eller hepatocytt vekstfaktor ("Met" reseptor).

16. Metode ifølge ethvert av kravene 1 til 11, der den introduserte nukleinsyre dirigerer ekspresjon i og/eller cellen av i det minste en effektiv del av en reseptor for en vekstfaktor, et cytokin eller et steroidhormon.

17. Metode ifølge krav 16, der den introduserte nukleinsyresekvens dirigerer ekspresjon av minst en effektiv del av en reseptor for en av de følgende: EGF, transformerende vekstfaktor (TGF)cc, eller VEGF.

18. Metode ifølge ethvert av kravene 1 til 11, der den introduserte nukleinsyre dirigerer ekspresjon av minst en effektiv del av et polypeptid som har en lokal immunologisk effekt.

19. Metode ifølge krav 18, der den introduserte nukleinsyre dirigerer ekspresjon av minst en effektiv del av et antigen fra et patogen.

20. Metode ifølge krav 18 eller 19, der den introduserte nukleinsyre dirigerer ekspresjon av minst en immunogen del av et polypeptid fra en av de følgende: HIV, papillomavirus, Chlamydia eller N. gonorrhoea.

21. Metode ifølge krav 18, der den introduserte nukleinsyre dirigerer ekspresjon av et immunglobulin eller en effektiv del dette.