KR20050052548A - 자궁내막기능 또는 자궁내막기능과 관련된 기능의 개선방법 - Google Patents

자궁내막기능 또는 자궁내막기능과 관련된 기능의 개선방법 Download PDF

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KR20050052548A
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케빈 스미쓰 스테펜
마크 샤키 앤드류
브라이언 히프 로버트
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Abstract

본 발명은 포유동물의 생식기의 적어도 몇몇의 세포에 핵산을 도입시켜 상기 세포의 하나이상의 특성을 변경시키는 방법, 및 그러한 방법에 사용되는 핵산을 함유한 조성물에 관한 것이다.

Description

자궁내막기능 또는 자궁내막기능과 관련된 기능의 개선방법 {IMPROVEMENTS IN OR RELATING TO ENDOMETRIAL FUNCTION}
자궁내막의 생리학적 특성
배아가 포유동물의 자궁에 자리를 잡는데는 두 가지의 주요 요건이 있다: 첫 번째로는, 배반포가 착상될 수 있고, 태반의 형성을 통해 영양을 공급받을 수 있는 배반포가 존재하는 것을 수용하도록 자궁내막이 형성되어야 하며; 두 번째로는, 자궁근층의 활동이 개질되어, 휴지상태가 되어야 하며, 이에 의해 배반포가 만출의 위험없이 자궁공동내에 유지될 수 있어야 한다. 이러한 두가지 요건은 임신 호르몬의 작용으로 조절되며, 이 중에서도 에스트로겐과 프로게스테론이 특히 중요하다. 스테로이드성 호르몬은 표적세포의 핵에 위치하는 호르몬 수용체를 통해 자궁내막 및 자궁근층에 작용한다. 호르몬이 활성화되면, 스테로이드-핵 수용체 복합체는 DNA내의 특정 영역과 상호작용하여, 효소 또는 성장인자와 같이, 단백질 및 폴리펩티드를 코드화하는 유전자를 자극, 억제, 및 탈-억제시킨다.
착상은 생화학적 및 생물리학적 변화의 케스케이드에 의해 개시된다. 유착분자(예를 들어, CAM 105)는 배반포가 자궁벽에 유착되는 초기단계에 작용한다. 그 이후에, 배반포 및 자궁내막은 다양한 방법으로 태아와 모체 사이에 친밀성을 증진시킨다. 유제동물에서는, 배반포의 가장 바깥층을 형성하는 영양아층 세포가 자궁표피내로 이동하여 융합된다. 세포의 이동은 암컷에서 추가의 한단계로 수행되는데, 그 이유는 분리되거나 특정 유형의 세포가 이동할 뿐만 아니라 큰 영역의 영양아층이 자궁표피 세포 사이로 스며들기 때문이다. 이를 위하여, 어떠한 영양아층 세포는 융합되어 융합세포를 형성한다. 이러한 과정은 아주 신속하며, 배아는 자궁표피에서 퇴행되지 않으면서 자궁조직에 착상된다. 어떠한 종에서는, 새끼가 일년중 좋은 시기에 태어나도록 환경의 신호를 기다리거나, 다음 임신이 충분히 이루어지기 이전에 모체가 앞선 새끼의 이유를 종료하도록 수유기간과 같은 생리학적인 인자에 의해 착상과정을 지연시킨다.
착상을 위한 자궁의 준비는 난소 호르몬의 분비에 의해 조절된다. 난관을 통한 수정란의 수송은, 자궁이 수정란을 수용하기에 적합한 조건일 때, 정확한 발달 시점에 있는 자궁에 도달하도록 시기를 정밀하게 조절하여야 한다. 대부분의 상태에서, 자궁은 배아에 대해 부적합한 상태이며, 사실 어떠한 다른 신체 영역 보다도 부적합하다. 자궁의 표피내층은 대부분의 상태에서, 영양아층의 부착 및 침습을 저지하며, 단지 정확한 호르몬성 상태에서만이 이러한 저항이 완화된다.
마우스 및 랫트의 경우 교미하지 않은 동물은 완전한 발정주기를 거치지 않는데, 그 이유는 프로게스테론의 양을 증가시키는 정상적인 분비성 황체를 형성하지 않기 때문이다. 높은 수준의 에스트로겐이 난자가 방출되는 난소난포에 의해 분비되는 시점인 발정시에 교미가 되면, 황체가 파열된 난포에서 형성되고, 프로게스테론의 분비 농도가 상승되며, 착상이 이루어져 임신이 된다(기간, 21일). 불임 교미가 수행되면, 황체는 단지 11일 동안 유지되며 의사(擬似)임신이 생략되는 것을 제외하고는 상기와 유사한 현상이 발생된다.
여성의 경우, 자궁내막에서 발생되는 세포변화 및 생화학적 변화에 대한 정보가 최근 증가하고 있으며, 마우스 및 랫트에서는 거의 완전히 연구되었다. 모든 종의 자궁내막은 세 가지의 주요 조직, 즉, 루미날(luminal) 표피, 샘 표피 및 간질(間質: stroma)로 이루어져 있다. 세가지의 조직은 상이한 시점에 세포 증식된다. 루미날 세포는 난소에서의 난포에 의해 생성된 에스트로겐 수준의 상승 영향으로 발정 직전(발정전기)에 증식한다. 임신 1일(설치동물에서의 교미일)까지, 루미날 세포는 분화를 중지하나, 비록 미비하기는 하지만 3일째에는 부가의 파열 활성을 갖게 된다. 샘 세포는 4일째 가장 큰 활성을 보이며, 이어서 쇠퇴한다. 간질 세포는 4일까지는 증식하지 않지만, 그 이후에는, 프로게스테론의 영향으로 5일까지 높은 수준으로 증식한다. 여성에서, 착상과정을 예측할 수 있는 이러한 변화들이 다소 잘 알려져 있지는 않지만, 마우스 및 랫트에서, 표피세포는 주기 중의 난포 단계 동안, 간질 세포는 황체기 또는 분비단계 동안에 세포의 증식이 절정에 이르는 것으로 나타났다.
자궁내막 세포의 증식의 목적은 완전히 밝혀지지 않았다. 영양 및 분비기능(샘 표피)을 하며 태반형성의 아주 초기단계(탈락막화)에 관여하는 세포의 수를 증가시킴으로써 착상을 위한 자궁내막을 형성하는 것으로 여겨진다. 성공적인 착상의 필수요건으로서, 세포 유사분열은 세포 분화로 진행되어 임신이 확정되는 초기 단계에 중요한 역할을 한다. 이러한 역할을 뒷받침하는 증거는 성장인자(미토겐), 사이토킨 및 핵 종양유발 유전자가 자궁내막에서 생성되는 것이다. 많은 이러한 화합물은 난소 호르몬 수용체를 통해 작용하는 난소 호르몬에 반응하여 증가된 농도로 생성된다.
성장인자 중에서, 현재 표피성장인자(EGF), 헤파린 결합 표피성장인자(HBEGF), 암피레귤린(amphiregulin) 및 인슐린-결합 성장인자(IGF-I 및 IGF-II)에 많은 관심이 집중되고 있다. 하나 이상의 이러한 성장인자, 암피레귤린의 국소(측분비)작용의 중요성에 대한 근거가 마우스에서의 최근의 시험에 의해 입증되고 있다. 암피레귤린에 대한 착상-특이적이고 프로게스테론-조절된 유전자는 항-프로게스틴, 즉, RU486에 의해 억제되며, 그 결과 착상이 억제된다[참조문헌: Das et al., Molecular Endocrinology 9, 691-705, 1995].
사이토킨 중에서, 착상시에 마우스 자궁에서 생성되는 백혈병 억제 인자(LIF) 및 콜로니-자극인자는, 이것의 제거시 착상 및 정상적인 태반형성이 불가능하다는 것이 입증되면서, 유전자 녹아웃 시험에서 필수 인자인 것으로 확인되었다[참조문헌: Stewart et al., Nature 359, 76-79, 1992: Pollard et al., Developmental Biology 148, 273-283, 1991].
핵 종양유발 유전자 중에서, c-jun 및 c-fos(유전자 전사의 초기 지시제)의 수준은 에스트로겐 투여 후에 자궁에서 증가하며, 프로게스테론에 의해 억제된다.
다양한 종들간의 중요한 차이는 착상시의 영양아층 침습 범위에 있다. 여성에서, 초기의 영양아층은 고도로 침습적인 반면, 착상의 비-침습형태를 지니는 피그에서의 자궁 표피는 3개월의 임신기간 동안 결코 침습되지 않는다. 이들 두 종에서의 착상의 실패는 각각 약 60% 및 30%에 달한다. 이렇게 높은 실패율의 이유는 복잡하며 완전히 이해되지 못하고 있다. 여성에 있어서, 실패의 거의 절반은 유전자 이상에 기인하지만, 피그에 있어서는, 실패율이 높은 다른 유제동물에서와 같이, 유전 결함이 전체 실패율 중의 단지 몇 퍼센트에 불과하다.
여성에 있어서 착상 실패후에 프로게스테론 분비가 저하되어 정상적인 월경주기의 결과와 같은 출혈이 초래된다; 이러한 현상은 대부분의 다른 동물에서는 발생되지 않는 현상이다. 월경장애 뿐만 아니라 착상장애는 일반적인 현상이다. 또한, 연속적인 호르몬 치료의 후유증으로서의 월경출혈, 또는 연속적인 혼합 호르몬 대체 치료 또는 프로게스틴만의 지속성-작용 피임과 결부된 월경출혈은 여성의 건강을 해치는 중요한 원인이다. 이러한 출혈의 중요한 원인은 생화학적 요인(예를 들어, 프로스타글란딘, 효소, 폴리펩티드와 단백질, 혈소판-활성화 인자 PAF와 같은 혈관작용성 화합물, 및 혈관 내피성장인자 VEGF) 및 세포 메카니즘(예를 들어, 면역억제 화합물을 생성하는 자궁으로의 귀소성 이동세포)에 있다.
현재 생식과정에 대한 연구는 스테로이드 호르몬의 생성 조절 및 표적 세포에 대한 이들 호르몬의 작용에 초점을 맞추고 있다. 그러나, 파라크린(paracrine) 및 오토크린(autocrine) 인자가 스테로이드와 상호작용함에도 불구하고 생식기능의 결정적인 중재자인 것으로 점점 밝혀지고 있다[참조문헌: Benton, 1991 Current Opinion in Cell Biology 3, 171-175; Rozengurt. 1992 Current Opinion in Cell Biology 4, 161-165; Tartakovsky et al., 1991 Developmental Biology 146, 345-352; Robertson et al., 1992 Current opinion in Immunology 4, 585-590; Smith, 1994, Human Reproduction 9, 936-946; and Tabibzadeh, 1994 Human Reproduction 9, 947-967]. 이것의 가장 명확한 구체예는 난소절제된 마우스에서 밝혀진다. 이러한 모델에서 자궁은 단일 용량의 에스트라디올에 반응하여 현저한 성장을 하게 된다. 이러한 효과는 항 TGFα항체(TGF는 “변환 성장인자“이다) 에 의해 억제될 수 있는데, 이는 조직내의 에스트로겐의 미토겐 효과가 TGFα에 의해 중재되는 것을 시사한다[참조문헌: Nelson et al., 1992, Endocrinology 131, 1657-1664].
따라서, 부인과 의학에서 약물중재는 자궁의 스테로이드/항스테로이드 조절에 주로 근거하고 있다[문헌: Yen & Jaffe, 1991, "Reproductive Endocrinology", Eds. Yen, Jaffe & Benton, Pub., WB Saunders, Philadelphia; Baird, 1993 British Medical Bulletin 49, 73-87]. 의심할 여지 없는 성공적인 이러한 접근에도 불구하고, 피임기술은 20년 동안 진보되지 못하였고, 착상을 증진시키는 어떠한 수단도 확인되지 못하였으며, 태반성장 및 발달을 촉진시키는 진보된 기술이 개발되지 않았고, 양성 부인과 질환(월경장애 및 유섬유종)의 치료에 대한 새로운 접근도 이루어지지 않았다.
포유동물에서 “유전자 전이”를 이용하여 특정의 조직 또는 조직들에서 적어도 몇몇 세포의 유전형을 변경시키는 것에 관한 많은 문헌이 공개되어 있다. 특히, 핵산서열을 수용체에 도입시켜 코드화된 폴리펩티드의 발현에 의해 수용체에서의 유전 결함을 극복시킬 목적으로, 핵산서열을 수용체에 도입시킴으로써 사람을 “유전자 치료법“으로 치료하는 방법이 공지되어 있다. 예를 들어, DNA 서열(바이러스성 벡터내로 혼입됨)을 낭포성 섬유증 환자의 기도내로 도입시키는 유전자 치료 시험이 수행되어, 적어도 몇몇의 표피세포 내층 환자의 호흡기관의 표현형을 변화시켰다. 지금까지, 포유동물의 자궁내막으로 DNA를 도입시키는 것은, 이를 위해 적합한 기술을 이용할 수 있었음에도 불구하고 공개적으로 시도된 바 없다.
본 발명은 포유동물의 생식기 세포, 바람직하게는 자궁내막 세포에 핵산을 도입시킴으로써 상기 세포의 일부 또는 전부의 하나 이상의 특성을 변경시키는 방법, 상기 핵산을 함유하여 생식기 질환의 치료에 사용될 수 있는 약제, 이러한 약제를 제조하는 방법을 제공하기 위한 것이다. 본 발명에 따르면, 유전자가 생체내에서 자궁내막에 전이되어, 다양한 자궁내막 (및 태반) 조건, 예를 들어, 동물 및 사람에서의 착상 증진, 착상 억제(즉, 피임), 자궁내막증 및 월경과다, 과다형성 및 샘암종에 치료적으로 이용될 수 있다.
첫 번째 양태에서, 본 발명은 포유동물 생식기의 일부 또는 전체 세포에 핵산을 도입시켜 이들 세포의 하나 이상의 특성을 변화시키는 방법을 제공한다.
두 번째 양태에서, 본 발명은 포유동물 생식기의 일부 또는 전체 세포의 하나 이상의 특성을 변화시키는데 이용되는, 핵산을 포함하는 조성물을 제공한다.
세 번째 양태에서, 본 발명은 포유동물 생식기의 일부 또는 전체 세포의 하나 이상의 특성을 변화시키는, 핵산을 포함하는 조성물의 용도를 제공한다.
네 번째 양태에서, 본 발명은 포유동물 생식기의 일부 또는 전체 세포의 하나 이상의 특성을 변화시키는 물질을 제조하는데 사용되는, 핵산을 포함하는 조성물의 용도를 제공한다.
다섯 번째 양태에서, 본 발명은 핵산을 생리학적으로 허용되는 담체와 혼합하는 것을 포함하여, 포유동물 생식기의 일부 또는 전체 세포의 하나 이상의 특성을 변화시키는데 사용되는 조성물을 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명은 어느 면으로 보나 낭포성 섬유증 환자의 폐에 적용되는 경우에 적어도 부분적으로 성공적인 것으로 이미 공지된 유전자 치료기술의 명백한 확대 적용인 것으로 사료될 수 있다. 유전된 유전질환은 공지된 자궁내막질환의 원인이 되지 않는 것으로 사료되고, 따라서, 당업자는 유전자 치료기술을 자궁내막에 적용할 필요가 없었다. 또한, 자궁내막의 표피는 폐 표피(층화됨)와 비교하여 상이한 형태(체강형 표피로부터 유도된 입방형)이므로, 유사한 방식으로 작용한다는 것을 예측할 수 없었다. 또한, 적어도 영장류에는, 형질감염된 세포를 제거하는 경향이 있는 자궁내막 표피의 주기적인 박리가 존재한다. 결국, 본 발명의 발명자들은 모체의 기관 또는 배아의 태반내로 도입된 DNA는 전이되지 않는 것을 발견하였고, 이것은 실행적인 어려움을 발생시키거나 실행에의 문제를 유발할 수 있다.
전형적으로, 핵산은 자성의 포유동물(바람직하게는 여성)내로, 및 특히 이들의 자궁내막 세포로 도입된다. 바람직하게는 핵산이 자궁내막의 샘 표피내로 도입된다. 핵산은 핵산이 도입되는 세포에 의해 이미 천연적으로 합성된 폴리펩티드를 암호화하여, 폴리펩티드의 발현수준을 유전자 용량효과를 통해 상승시킨다. 또한, 이러한 방법은 이들 세포에서 이전에 합성되지 않은 폴리펩티드가 발현되도록 세포를 유도하는데도 이용될 수 있다. 폴리펩티드는, 예를 들어, 둘 이상의 상이한 단백질로부터 얻은 전체 또는 부분적인 기능성 도메인을 포함하는 키메라 폴리펩티드와 같이, 본래 존재하지 않는 “합성의” 재조합 폴리펩티드일 수 있다.
핵산은 바람직하게는 DNA 이지만, RNA(센스 가닥 또는 비센스 가닥)를 도입시키는 것을 연구할 수 있다. 안티센스 분자는 핵산이 도입되는 세포에서의 폴리펩티드의 발현을 억제하거나 달리 간섭하는데 사용될 수 있다. 도입된 핵산서열은 안티센스 RNA이거나, 안티센스 RNA의 세포내 합성을 지시하는 DNA 서열일 수 있다. 이러한 억제를 획득하는 또다른 방법은 리보자임 합성을 유도하는 서열을 세포에 도입시키는 것이고, 이는 발현이 억제되는 것으로 보이는 폴리펩티드의 합성에 요구되는 mRNA를 특이적으로 절단할 것이다.
본 발명의 발명자들은 핵산을 투여하는 시기(생식주기의 단계에 관련하여)가 핵산 흡수의 효율에 크게 영향을 미치는 것을 발견하였다. 본 발명자들은 일반적으로 투여된 핵산의 최적 흡수도를 얻기 위하여, 배란 이후부터 혈액 중의 프로게스테론의 수준이 최고가 되는 시점에 핵산의 투여가 이루어져야 한다는 것을 발견하였다. 정상적으로는, 배아가 자궁에 존재하는 경우 대략 배아가 착상될 수 있는 시점과 유사한 시점에서 프로게스테론의 수준은 최대가 된다.
따라서, 예를 들어, 본 발명자들은 마우스 자궁내막에 투여된 DNA의 최대 흡수는 월경주기(질의 분비물이 처음 관찰된 날을 1일로 하여)의 2일 내지 3일째에 발생한다는 것을 밝혀냈다. 사람에게 있어서, 배란은 전형적으로 월경주기의 14일에 발생되며, 착상은 일반적으로 중간-황체기(사람에서의 정확한 시간은 불명확하지만)에서 발생된다.
핵산은 그대로 투여되거나, 그밖의 물질(예를 들어, 리포솜)과 결합하여 또는 그밖의 물질과 함께 투여될 수 있다. 용이하게는, 서열을 바이러스성 벡터내에 도입시킬 필요 없이, 간단한 형질감염(리포솜과 함께 또는 리포솜 없이)에 의해 수용 포유동물의 세포로 핵산을 도입하는 아주 효과적인 방법이 본 발명의 발명자에 의해 밝혀졌다. 그럼에도 불구하고, 바이러스성 벡터는 특히 특정의 세포형(예를 들어, WO 93/20221에 기재된 바와 같은 세포형)을 표적으로 하는 경우에 바람직할 수 있다.
핵산은 통상적으로는 구성물(예를 들어, 플라스미드, 및 코스미드 등)의 일부로서 도입되고, 구성물은 포유동물에서 작용할 수 있는 프로모터를 포함하여 도입된 핵산의 일부 또는 전체를 전사시키는 것이 바람직하다. 프로모터는 도입된 서열의 발현을 보다 잘 조절하도록 구성되거나, 바람직하게는 유도될 수 있다.
본 발명에 따라 수행된 한가지 특정의 방법에 있어서, 핵산 분자를 각각의 포유동물의 자궁내막 세포로 도입하여 개체의 수정률을 상향 또는 하향 조절한다. 본 발명은 원하지 않는 임신을 억제하도록 동물(예를 들어, 고양이 및 개)을 피임시키는 방법을 제공하는데 이용될 수 있다. 또 다른 구체예에서, 본 발명은 피그, 소, 및 양 등과 같은 가축류의 수정률을 증진시키는 방법을 제공한다.
바람직하게는 핵산이 질을 통해 생식기로 도입되므로, 침습성 외과술이 불필요하다. 그러나, 요구되는 경우, 핵산은 외과적 기술에 의해 생식기(자궁)로 직접 도입될 수 있다. 본 발명은 매우 다수의 상이한 핵산 서열을 하나 이상 도입시켜 하나 이상의 특성을 변경시킬 수 있는 가능성을 제공한다.
한가지 구체예에서, 생식기 세포에 도입된 서열은 사이토킨 또는 성장인자의 유효 부분(유효 부분은, 예컨대 특이적 리간드 등과의 전체 결합과 특히 관련된 생물학적 활성을 보유하는 분자의 일부이다)을 발현(바람직하게는 높은 수준으로)시킨다. 도입된 서열에 의해 발현될 수 있는 폴리펩티드의 예는 인터루킨, 백혈병 억제 인자(LIF), 혈관내피 성장인자(VEGF), 표피성장인자(EGF), 헤파린-결합 표피 성장인자(HBEGF), 인슐린-결합성장인자 I 형 및 II 형 (IGF-I 및 IGF-II), 암피레귤린, 콜로니 자극인자(CSF), 및 종양괴사인자(TNF)를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
또 다른 구체예에서, 도입된 서열은 IL-1 수용체의 길항제와 같은, 사이토킨 또는 성장인자의 길항제의 유효부분을 발현시킬 수 있다. 또한, 길항제는 사이토킨 또는 성장인자에 대한 가용성 수용체인 것이 바람직하다. 적합한 예로는 변환성장인자(TGF)α, 섬유아세포 성장인자(FGF), 혈소판-유도된 성장인자(PDGF), 인터루킨-6(IL-6), 및 VEGF에 대한 가용성 수용체가 있다.
또다른 구체예에서, 도입된 서열은 면역학적 효과를 지닌 폴리펩티드의 유효부분을 발현시킬 수 있다. 특히, 폴리펩티드는 면역유전 활성이 있어, 국소면역반응을 자극할 수 있다. 따라서, 본 발명은 신규한 면역화 방법을 제공하는데 이용될 수 있다. 유리하게는, 면역유전자 폴리펩티드는 점막 병원체로부터의 항원일 수 있다. 일반적인 점막 면역 시스템에 의하여, 생식기내 항체 생성을 자극함에 의해 위장관, 호흡기관, 및 눈물샘 등의 말초점막부위에서의 상응하는 항체 생성을 유도할 수 있다. 그러나, 바람직하게는 항원은 생식기를 침입 및/또는 생식기에 군생하는 병원체, 전형적으로 성병을 유발하는 병원체중의 하나이다. 이러한 예에는 HIV와 같은 바이러스, 파필로마 바이러스(예를 들어, 바이러스 형태의 HPV), 클라미디아 및 박테리아(예를 들어, 엔. 고노르호에아: N, gonorrhoea)가 포함된다. 또한, 면역학적 효과를 지닌 폴리펩티드는 면역글로불린 또는 이의 유효 부분(Fab, Fv, 또는 scFv 단편, 또는 단쇄 항체)일 수 있다. 면역글로불린 또는 이의 유효 부분은 병원체(앞서 언급된 것과 같은 병원체)에 대해서 유도되거나, 스테로이드 또는 그밖의 호르몬과 같은 다른 병원체에 대하여 유도될 수 있다. 따라서, 면역글로불린 또는 이의 단편은 국소적으로 발현되어 질환에 대한 보호를 제공하거나, 수정률을 조절할 수 있다.
또다른 구체예에서, 도입된 서열은 월경에 영향을 주는 폴리펩티드 또는 이의 유효 부분을 발현시킬 수 있다.
또 다른 구체예에서, 도입된 핵산 서열은 생식기 세포 표면상의 수용체 분자의 유효 부분을 발현시킬 수 있다. 수용체는 사이토킨, 스테로이드 호르몬, 또는 성장인자에 대한 수용체(예를 들어, EGF 수용체, TGFα수용체, 또는 VEGF 수용체)일 수 있다. "오르판(orphan)" 수용체로서 기재된 다수의 수용체가 공지되어 있으며, 수용체에 결합하는 리간드는 알려져 있지 않다. 이러한 오르판 수용체는 신규한 치료 또는 예방 화합물에 대한 표적을 제공함으로써 제약 산업에서 상당한 주목이 집중되고 있다.
따라서, 또다른 관점으로, 본 발명은 폴리펩티드의 생물학적인 특성을 규명하는 방법으로서, 이 방법은 특성이 규명되는 폴리펩티드를 코드화하는 서열을 포유동물의 생식기 세포에 도입시키고, 발현된 폴리펩티드의 효과를 검정하는 것을 포함한다. 포유동물은 마우스 또는 랫트와 같은 실험용 동물인 것이 바람직하다. 통상적으로, 특성이 규명되는 폴리펩티드는 오르판 수용체일 수 있으며, 전형적으로는, 적어도 특정화의 일부로서 이를 위한 리간드의 동정을 포함할 수 있다. 일반적으로, 이 방법은 실험용 동물로부터 취한 조직학적 부분의 분석을 수반할 것이다(예를 들어, 조직화학적 염색, 동일계내에서 혼성교잡, 면역학적 염색 등).
따라서, 본 발명은 생체내 직접 유전자 전이에 의해 자궁내막 기능(및 생식능 또는 수정률)의 스테로이드성 조절에 대한 새로운 대안을 제공한다. 이것을 달성하기 위해서, 유전적 구성물이 사이토킨 작용을 특이적으로 조절하도록 설계될 것이다. 이는 다양한 방법으로 수행될 수 있다. 예를 들어, 분비된 사이토킨을 생성시키는 세포에서, 프로모터 유도된 안티센스 구성물 또는 리보좀을 이용한 전사 및 번역을 억제함으로써 인자의 합성을 저해할 수 있다. 또한, 분비된 인자의 작용은 수용체 길항제에 의해 억제될 수 있다. 천연의 가용성 수용체는 생활성 리간드를 없애거나 중화시켜, 경쟁적인 수용체 길항제로서 작용한다. 또한 예를 들어 천연의 수용체 길항제, 예컨대, IL1Ra(인터루킨-1 수용체 길항제)가 있다. 이러한 단백질을 복강내 투여하면 마우스에서 배반포 착상이 억제된다(본원에 인용된 시몬(Simon)등의 문헌 참조).
난관 및 자궁 표피에 의해 분비된 가용성 성장 인자가 배아상에 발현된 수용체를 통해 직접적으로 작용함으로써 포유동물 배아의 조기 착상을 조절할 수 있다는 것을 보여주는 명백한 증거가 있다[참조 문헌: Pampfer et al., 1990 In vitro Cellular and Developmental Biology 26, 944-948]. 반면, 배아를 성장시키면 오토크린 양식으로 작용할 수 있거나, 자궁내막상에 작용하여 그의 수용성에 영향을 줄 수 있는 성장인자를 생성한다. 예를 들어, 마우스에서, LIF 발현(모체 조직으로부터)은 4일째에서 착상 직전에 샘 표피에서 급격하게 상향조절된다. LIF는 조기 착상 배반포상에서 작용하여, LIF 수용체(LIF-R)를 발현시킬 수 있다. LIF의 모체 발현은 착상에 필수적인데, 그 이유는 LIF 녹아웃 마우스에서 배아는 착상되지 않지만, 의사(擬似)임신 모체에 전이될 경우 배아는 착상될 것이기 때문이다(본원에 참조된 1992년 스튜어트 등의 문헌 참조).
본 발명자들은 이러한 연구를 사람으로 확대하였고 RT-PCR에 의해, 사람 배아가 LIF-R을 코드화하는 mRNA를 발현하지만, 그 자신이 LIF를 발현시키지는 않는 것을 밝혀냈다. LIF는 저친화성 수용체 LIF-R에 결합함으로써 작용한다. 고친화성 결합은 LIF/LIF-R 복합체가 시그날 형질도입 검정용 단백질 gp130과 상호작용하는 경우에 발생된다. 사람 배아는 또한 이러한 단백질을 코드화하는 mRNA를 함유한다[참조 문헌: Sharkey et al., 1995 Biology of Reproduction 53, 955-962]. 본 발명의 발명자들은 또한 사람 샘 표피에서의 LIF의 분비가 스테로이드에 의해 조절되며, 황체기에 최대가 되는 것을 밝혀냈다(착상이 기대되는 시간 - 1994년 차녹-존(Charnock-Johnes)등의 문헌 참조). 또한, LIF를 시험관내에서 사람의 조기 착상 배아에 투여하면 발달을 증진시키는 것으로 보고되었다. 모든 이러한 증거는 LIF가 마우스에서와 같이 사람의 착상에 중요할 수 있다는 생각을 뒷받침한다. 명백하게는, 사이토킨이 자궁 루멘내 배아와 자궁내막(양쪽방향으로) 사이의 중요한 신호전달을 매개할 수 있다. 본 발명은 유전자 전이를 이용하여 이러한 신호전달을 억제하거나 증진시킴으로써, 신규한 피임법을 유도하거나, 반대로 착상을 증진시킬 수 있다.
생식기능의 파라크린 및 오토크린 조절에 대한 가장 최근의 연구는 국소 사이토킨/수용체 수준을 조절하는 효과적인 방법의 결여에 의해 설명적인 분석으로 제한된다. 본원에 기재된 증거는 시험관내에서 자궁표피의 형질감염이 가능할 수 있다는 것을 나타낸다. 본 발명은 자궁을 실험적으로 조작하여 새로운 치료방법을 제공한다. 이하 기재된 연구는 수용체 유전자를 사용하여, 생체내에서 자궁 유전자 전이의 가능성을 입증하고 있다. 실질적으로, 자궁의 기능을 변경시킬 수 있는 유전자(또는 그밖의 DNA 구성물)가 이용될 것이다. 이러한 예에는 수용체 길항제(예를 들어, IL-1Ra, 가용성 VEGF 수용체 등), 천연 또는 변형된 사이토킨 및 성장인자, 프로테아제 억제제 또는 스테로이드 수용체 및 다양한 리포솜 및 안티센스 구성물이 포함된다. 이러한 연구는, 유전자가 생체내에서 자궁내막에 전이되어, 이러한 전이가 다양한 자궁내막 (및 태반) 조건, 예를 들어, 동물 및 사람에서의 착상 증진, 착상 억제(즉, 피임), 자궁내막증 및 월경과다, 과다형성 및 샘암종에 이용될 수 있다는 것을 나타낸다.
본 발명자들은 상기 프로토콜을 이용하여 하기의 결과를 얻었다. 이러한 결과는 유전자 구성물이 생체내 및 시험관내에서 자궁내막에 전이될 수 있고, 전이된 구성물이 전사적으로 (및 번역적으로) 작용하는 것을 입증한다.
본 발명은 실시예 및 첨부된 도면으로 보다 상세히 설명된다.
실시예 1
마우스
널리파러스(Nulliparous)의 성숙한 BALB/cJ 마우스를 일광(14시간 빛, 10시간 암실, 20.00시 소등) 및 온도(22℃) 조절된 스몰 애니멀 하우스(Small Animal House)에 가두어, 마우스 및 랫트 식이법으로 사육하였다(Labsure; Christopher Hill Group, Poole, Dorset, UK). 이들을 동일한 종의 정관수술된 수컷과 함께 밤새 있게 하여, 다음날 아침 질분비물의 존재를 측정하였다. 교미가 02.00시에 이루어진 것으로 가정하였고, 1일 0시를, 분비물이 처음 검출되는 날로서 기산하였다. 교미된 암컷은 실험전에 별도로 가두었다.
개복시술은 메타펜(Metafene) 마취(methoxyfluorane, C-Vet Ltd., Bury St. Edmunds)하에 무균으로 수행하였다. 자궁나팔관을 중간-복면 또는 양쪽 절개로 노출시켰다. 튜브-자궁 접합부의 나팔관 팁으로 또는 자궁-경부 접합부의 나팔관 기부에서 주입이 이루어졌다. 반복 연구에서는 후자의 기술이 최상의 투여방법이었지만, 생식기의 교란을 최소화하는 것이 필요할 때 특정 목적에 있어서는, 전자의 기술이 바람직하였다.
리포솜/DNA(pcDNA3 구성물, +/- β-갈락토시다제 리포터 유전자), 네이키드 DNA 또는 대조용액(25 내지 100㎕)을, 평평한 스트라타팁(Stratatip)의 팁을 나팔관의 기부에 삽입함에 의해 주입시켰다. 또한 나팔관내로 용액의 느린 주입을 조절하는데 사용되는 트라베스티(Travesty) 도포기에 의해 팁으로 용액을 사전에 주입시켰다.
주입을 완료한 후에, 절개부를 중단된 매트리스 봉합을 이용하여 봉합하고, 마우스를 우리에 다시 넣어, 음식물과 물을 임의로 공급하였다.
플라스미드 구성물
본원에 기재된 플라스미드는 시판되고 있는 벡터 pcDNA3(Catalogue No. V790-20, from Invitrogen, San Diego, California, USA)를 기재로 한다. 리포터 유전자가 없는 플라스미드 pcDNA3을 음성 대조군으로 사용하였다. 실험용 플라스미드 pcDNA3-βgal, pcDNA3-CAT, 및 pcDNA3-Luc는 각각 β-갈락토시다제, 클로르암페니콜 아세틸 전이효소 및 루시페라제 리포터 유전자를 함유하였다. 이러한 플라스미드는 다음의 유전요소를 함유하였다: 암피실린 내성 유전자, ColE1 기원의 복제물, CMV 프로모터, [리포터 유전자], 소의 성장 호르몬 폴리A 첨가 부위, fl 기원의 복제물, SV40 기원의 복제물, 네오마이신 내성 유전자 및 SV40 폴리A 첨가 부위를, 리포터 유전자가 플라스미드의 도입시에 진핵세포에서 발현될 수 있도록 하는 작동적인 관계로 함유한다. 플라스미드 DNA는 알카리 용해에 의해 E. coil로부터 정제되고, 퀴아겐 이온 교환 칼럼을 이용(제조자의 설명에 따라)하여 추가 정제되었다.
리포솜의 제조
사용된 리포솜은 DOPSA(2,3-디올레일옥시-N-[2(스퍼민카르복사미도)에틸]-N-N-디메틸-1-프로판아미늄 트리플루오로아세테이트) 및 DOPE(디올레일포스파티딜 에탄올아민)(LipofectAMINE; Gibco BRL Paisley, Scotland)의 3: 1(w/w) 지질 제형이었다. 표 1에 제시된 바와 같이, 다양한 DNA : 지질의 비 및 상이한 주입 용적을 사용하였다. DNA/리포솜을 각 실험의 직전에 혼합시켰다. 10㎕의 DNA 용액을 10㎕의 지질용액에 가하고, 온화하게 혼합하여 실온에서 15분간 유지시켰다. 80㎕의 PBS을 가하여 표 1에 표시된 DNA와 지질의 최종 농도를 얻었다. 이러한 용액을 의사임신 마우스의 자궁에 주입시켰다 (상기 마우스 및 수술에 대한 상세한 설명 참조).
β-갈락토시다제의 조직화학적 편재화
동물을 이산화탄소 주입으로 치사시키고, 자궁나팔관을 절개하여, 지방과 장간막을 유리시켰다. 각각의 나팔관을 상하 3부분으로 분할하여 액화질소로 신속하게 동결시키고, β-갈락토시다제 함량을 정량하기 전에 -70℃에서 저장하였다. 각 자궁 나팔관의 중간 절편을 PBS중의 1.25% 글루테르알데히드에 15분 동안 고정시키고, 1PBS로 2회 세척하고, X-gal 염색 용액(1mg/ml X-gal, 5mM K3Fe(CN)6, 5mM K4Fe(CN)6, 2mM MgCl2, 0.02% NP4O, 및 0.01% 나트륨 데옥시콜레이트)중에 실온에서 24시간 동안 두었다. 그후, 절편들을 PBS/3% DMSO(2 x 5분), 70% 에탄올(3 x 5분)로 세척하고, 100% 에탄올에 두었다. 조직을 글리콜 메타크릴레이트 수지에 함침시켜, 7㎛ 절편으로 절단하고 현미경 검사전에 중성 레드로 대조염색하였다.
결과
표 1은 사용된 다양한 조건과, DNA/리포솜 복합물의 투여 이후 자궁 절편의 염색 강도를 나타낸 것이다. 표로 제시된 결과는 플라스미드 DNA의 투여 시점의 중요성을 입증하고 있다. 2일째 투여는 최상의 리포터 유전자 발현 수준을 나타내고, 3일째 투여는 양호한 수준을 나타내나, 4일째 투여는 리포터 유전자가 아주 적게 발현되는 것으로 나타나는데, 그 이유는, 명백히 밝혀진 것은 아니지만, 이 시점에 자궁내막 세포가 구성물을 흡수하지 않기 때문인 것으로 추정된다.
[표 1]
투여일 (생검일) DNA(㎍/ml) 지질 (㎍/ml) 주입 용량(㎕) 조직화학적염색 강도
2(5) 2 20 50 ++
3(5) 2 20 50 ++
4(6) 2 20 50 -
2(6) 2 20 50 +++
2(5) 8 20 20 ++
4(6) 8 20 50 -
4(6) 30 20 50 +
4(6) 2 60 50 -
염색 강도 +++ 강함, ++중간, +약함, -무
대조군:
비주입된 6일째의 의사임신 마우스는 β-갈락토시다제 활성에 대한 자궁 염색이 나타나지 않았다.
50㎕의 pcDNA3 마이너스 β-갈락토시다제(2㎍/ml) 및 지질(20㎍/ml)이 주입된 의사임신 마우스(투여 2일:생검 6일)는 β-갈락토시다제 활성에 대한 자궁 염색이 나타나지 않았다.
X-gal로 염색된 후의 조직 시험 결과, 샘 표피가 진하게 염색되고, 루미날 표피도 또한 염색되지만, 덜 진하다. 최적의 염색은 의사임신 2일째 2㎍/ml DNA 및 20㎍/ml 지질을 50㎕로 투여한 동물에서 나타났다. 도 1a는 이러한 동물의 절편을 나타내며, 도 1b는 β-gal 유전자가 결핍된 플라스미드를 주입(동일한 조건하에)시킨 대조동물의 절편을 나타낸다.
실시예 2
사람 자궁내막의 일차 배양물의 형질감염
본 발명은 또한 사람 자궁내막의 표피세포가 시험관내에서 높은 효율로 형질감염될 수 있음을 입증한다.
이미 기재한 동일한 플라스미드(pcDNA3, +/- β-갈락토시다제 리포터 유전자) 및 지질을 사용하였다. 자궁내막 세포를 스미스(Smith)와 켈리(Kelly)의 방법으로 제조하였다[참조 문헌: Smith et al., 1987 Prostaglandins 34, 553-561]. 일단 배양물이 확정되면, 하기의 형질감염 프로토콜을 사용하였다. DNA(2㎍) 및 리포솜(8㎍)을 각각 혈청-비함유 배지(Opti-MEM1 BRL) 100㎕ 중에서 희석하고, 혼합하고, 실온에서 15분 동안 인큐베이션시켰다. 이후 추가의 Opti-MEM1 800㎕를 첨가하였다. 상기 세포(24 웰 플레이트)를 PBS로 세척한 후 Opti-MEM1으로 세척하였다. DNA/리포솜 혼합물(0.5㎖)을 상기 세포에 첨가하고, 3시간 동안 37℃에서 이산화탄소 인큐베이터내에서 인큐베이션하고, 20%의 우태아 혈청을 함유하는 0.5㎖의 배지를 첨가하였다. 세포를 고정시키고(0.1% 글루테르알데히드 사용), 세척 후, 형질감염 24 시간 후에 X-gal로 염색하였다.
이 작업은 유전자가 생체내에서 자궁내막으로 전이될 수 있음을 나타내며, 다수의 자궁내막(및 태반) 상태에 있어서의 유용성(예를 들어, 동물 및 사람 모두에 있어서 착상 증진, 착상 억제(즉, 피임), 자궁내막증 및 월경과다, 과다형성 및 샘암종의 호전)을 밝혀낼 것이다.
정제된 사람 자궁 표피세포의 시험관내 형질감염과 관련하여 추가의 데이타를 얻었다. 이는 생체내 마우스 실험을 보완하여, 배양시 최소 시간 후에 유사한 세포가 생체내에서 사용된 상기와 동일한 리포솜 및 DNA를 이용하여 효율적으로 형질감염될 수 있음을 나타낸다.
실시예 3
시험관내 사람 자궁내막 표피의 형질감염
자궁내막으로부터 사람의 일차 표피 세포를 장(Zhang) 등의 방법에 따라 단리 및 배양하였다[참조 문헌: J Cell Science, 1995, 108:323-331]. 상기 세포를 표준 6웰 조직 배양 플레이트에 평판하여 다음 날 50%의 군생 밀도를 얻었다. 상기 세포를 5일 동안 배양시킨 후, 24웰 플레이트상에 웰당 60,000 세포의 밀도로 재평판하였다. 다음날 상기 세포를 DNA/리포솜 복합체(DNA/LC)로 형질감염시켰다. 이들을 하기와 같이 제조하였다:
형질감염 과정
장치
LipofectAMINE(Gibco Catalogue No. 18324-012), Opti-MEM I(Gibco Catalogue No. 51985-018)
24웰 배양 접시
세포 배지는 장(Zhang) 등(상기에서 인용됨)에 의해 기술된 바와 같다.
상기 배지는 DMEM/HEPES, 10% FCS, 30㎍/㎖의 표피세포 성장 보충물(Sigma Catalogue No. E-2759), 90㎍/㎖의 헤파린(Sigma Catalogue No. H-3149), 5㎍/㎖ 겐타마이신(Sigma Catalogue No. G-1272) 및 1㎍/㎖의 펀자이존(Gibco Catalogue No. 15290-018)으로 이루어진다. 또한, Mg++, Ca++ 유리 PBS 및 2㎖의 에펜도르프 튜브(Eppendorf tube)를 사용하였다.
상이한 리포터 유전자를 함유하는 두개의 상이한 플라스미드 구성물을 사용하였다. pcDNA3CAT를 인비트로겐 코포레이션(Invitrogen Corporaton)사로부터 입수하였으며, 이는 효소 클로로암페니콜 아세틸 전이효소를 코드화하는 리포터 유전자를 함유한다. 제 2 플라스미드 pcDNA3luc는 상기와 동일한 벡터를 함유하나, CAT 유전자를 개똥벌레 루시페라제 효소를 코드화하는 유전자로 교체시켰다. 상기 벡터의 대규모 DNA 제제를 퀴아겐 미디프레프 시스템(Qiagen midiprep system)을 사용하여 제조하였다. 네거티브 대조군으로서, 리포터 유전자를 함유하지 않는 pcDNA3를 사용하였다.
DNA/리포솜 복합체의 제조
1) 용액 A
1㎍의 DNA를 에펜도르프 튜브내에서 100㎕의 Opti-MEM I으로 희석한다. 형질감염 배지에서 1㎍/㎖의 최종 농도로 DNA를 사용한다.
2) 용액 B
4㎍의 LipofectAMINE을 에펜도르프 튜브내에서 100㎕의 Opti-MEM I으로 희석한다. 형질감염 배지에서 8㎍/㎖의 최종 농도로 LipofectAMINE을 사용한다.
3) 상기 두 용액 A 및 B를 새로운 튜브에서 섞어 서서히 혼합한다.
4) 15분 동안 실온에서 인큐베이션시킨다.
세포 헹굼
1) 형질감염에 앞서, 혈청을 함유하지 않는 신선한 PBS 중에 상기의 세포 단층을 대충 3회 헹군다.
2) Opti-MEM I로 상기의 세포 단층을 다시 헹군다.
형질감염
1) 800㎕의 Opti-MEM를 DNA-지질 혼합물을 함유하고 있는 각각의 튜브에 첨가한다(총 1.0㎖).
2) 상기 세포 단층내에서 Opti-MEM I을 제거한다.
3) DNA/LC 혼합물을 서서히 혼합하고, 세척된 세포, 0.5㎖/24 웰상에 희석된 혼합물 용액을 중첩시킨다.
4) 이산화탄소 인큐베이터내에서 37℃로 3시간 동안 상기 세포 단층을 인큐베이션한다.
추가의 세포 배양
1) 3시간 후에, 형질감염 혼합물을 제거하고, 각각의 웰에 2㎖의 장(Zhang)의 배지를 첨가하고, 이후 배양시킨다.
정량적 검정
형질감염시킨 후 24 내지 28시간 후에, 세포를 추출하고, 필요에 따라 CAT 또는 루시페라제 리포터 활성에 대해 검정하였다.
1. PBS에서 세포를 3회 헹군다.
2. 용해 완충액(Promega Catalogue No. E-3871) 300㎕로 세포를 추출하고, 세포를 에펜도르프 튜브에 완전하게 스크랩핑시킨다.
3. -70℃에서 신속하게 추출물을 동결시키고, 검정할 때까지 저장한다.
4. 검정하기 위해서, 추출물을 해동시키고, 5분 동안 13,000g으로 원심분리시킨다.
5. 동결/해빙/스핀 사이클을 1회 더 반복한다.
6. 트로픽스(Tropix)사의 루시페라제 검정 키트(카달로그 번호 제 BC100L 호)를 사용하여 루시페라제 리포터 유전자 활성을 검정한다. 각 튜브당 추출물을 각각 40㎕를 사용한다.
7. 아머샴(Amersham)사의 Quan-t-CAT 키트(Catalogue No. TRK 1012)를 사용하여 CAT 리포터 유전자 활성을 검정하였다.
결과
일차 자궁내막 표피세포를 상기 기술된 바와 같이 24웰내에서 형질감염시켰다. 형질감염은 pcDNA3(대조군), pcDNACAT 및 pcDNA3LUC의 삼중 웰상에서 수행되었다. 48시간 후 세포를 수집하고, 루시페라제 또는 CAT 활성에 대해 검정하였다.
CAT 효소는 아세틸 조효소 A에서 클로르암페니콜로의 아세틸기 전이를 촉매한다. 삼중수소 아세틸 조효소 A의 사용으로 방사성 동위원소가 클로르암페니콜로 전이된다. 샘플 중 CAT 활성은 제조된 삼중수소 클로로암페니콜의 양에 직접적으로 비례한다. 따라서, 결과는 튜브당 cpm으로 표시된다, 공지된 양의 정제된 CAT를 함유하는 용해 완충액을 사용하여 표준 곡선을 도시할 수 있다.
도 3에 상기 결과를 표시하며, 이 도면은 일반적인 실험의 삼중 측정치에 대한 평균 ±sem을 나타내는 막대 챠트이다. 하기 기재된 바와 같은 결과 수치는 pcDNA3CAT로 처리된 세포의 CAT 활성이 대조 샘플보다 약 6 배 높은 것을 나타내며, 이는 자궁내막 세포의 형질감염이 성공적임을 입증하는 것이다.
며, 이는 자궁내막 세포의 형질감염이 성공적임을 입증하는 것이다.
pcDNA3 pcDNA3CAT
710 4480
616 4134
662 3234
평균 662 ± 271 평균 3951 ± 372
루시페라제에 대한 검정에서, 루시페라제를 함유하는 세포 추출물을 그의 기질인 루시페린과 혼합하였고, 그 결과 빛이 방출되었다. 빛의 시그날 강도는 추출물에 존재하는 루시페라제 효소에 비례하며, 광도계로 측정할 수 있다. 초기 결과는 상대적인 광 유닛으로 얻어진다.
도 4에 도시된 결과는 일반적인 실험의 삼중 측정치에 대한 평균 ±sem을 도시한 막대 챠트이다. 결과 수치는 하기에 기재된 바와 같다. pcDNA3LUC로 처리된 세포의 시그날은 대조 샘플의 배경 시그날보다 30배 높았으며, 이것 역시 자궁내막 세포의 형질감염이 성공적임을 입증하는 것이다.
자궁내막 유전자 전이의 적용예
7개 이상의 상이한 형태의 유전자 구성물을 자궁내막에 형질감염시켜 다양한 효과를 달성할 수 있다. 이러한 상이한 형태를 각각 차례로 설명할 것이다.
1) 사이토킨 및 성장 인자의 과발현
이러한 형태는 자궁 표피세포에서 사이토킨 또는 성장 인자를 과발현시키기 위해 고안될 것이라는 점에서 개념상 가장 간단한 구성물 형태이다. 이러한 과발현을 위한 적합한 cDNA의 예로는 LIF, VEGF, EGF, CSF, TNF, 암피레귤린 및 다양한 인터루킨 및 콜로니 자극 인자를 코드화시키는 것들이 포함된다. 이들은 자궁내막에서 자연적으로 발현되는 것으로 나타났으며, 자궁내막의 기능 조절에 중요한 것으로 여겨진다[참조 문헌: Stewart et al, 1992. Nature, 359, 76-79; Charnock-Jones et al, 1994, Journal of reproduction and Fertility, 101, 421-426; Charnock-Jones et al, 1993, Biology of reproduction, 48, 1120-1128; Das et al, 1995, Molecular Endocrinology, 9, 691-; Tabibzadeh(1994, Human Reproduction Update, 9, 947-967)는 이 분야를 광범위하게 검토하여 공개하였다)]. 이러한 제제는 각각 착상, 혈관 발달 및 백혈구 생물학을 포함하는 재생 기능의 관점에 상이하게 영향을 미친다. 따라서, 상기 구성물의 투여는 특히 가축종의 수정률을 개선시키거나, 사람 및 애완 동물의 수태를 방지하고, 또한 사람의 다양한 월경 장애를 치료하고자 하는 경우에 지시될 수 있을 것이다.
가축의 수정률을 개선시키고자 하는 실험예
LIF는 착상 과정에서 필수적인 것으로 나타나 있다[참조 문헌: Stewart et al, 1992 상기 인용]. 상기 인자는 착상 중에 자궁내막에 의해 생성된다. 따라서, 배아 상실율이 높은 종에서, 착상시 자궁내막으로부터 LIF의 발현 수준을 증가시키면 이러한 상실율을 감소시킬 수 있다. 따라서, 착상시, 자궁내막에서 LIF의 합성을 유도하기 위한 유전자 구성물의 형질감염은 상기 종에서 수정률을 개선시킬 수 있을 것이다. 자궁내막으로 형질감염된 구성물은 LIF 단백질이 적당한 시기에 생성되는 것을 보장하도록 적합한 조절 서열을 함유해야 할 것이다. 이는 문제가 되는 상기 종의 LIF 유전자로부터 얻은 프로모터를 사용하여 달성될 수 있으리라 여겨진다.
또한, 자궁내막 유전자 전이를 이용하여 여성의 월경 장애를 완화시키기 위한 치료를 실시할 수 있다. 이러한 예로는, 예를 들어 VEGF와 같은 맥관형성 성장 인자를 코드화하는 유전자를 형질감염시켜 자궁내막에서 혈관 발달을 변경시키는 것이다. VEGF 생성의 국소적 증가는 모세혈관 성장을 증진시킬 것으로 예상되며, 이에 따라 자궁내막의 농후화를 촉진할 수 있다. 동등하게, 증가된 VEGF 농도는 월경기간 후 모세혈관의 회복을 용이하게 할 수 있으며, 이에 따라 이러한 형태의 구성물로 치료된 환자의 출혈 형태를 변경시킬 수 있다.
2) 수용체의 과발현
자궁 표피에 의해 발현되는 수용체의 수와 유형의 증가로부터 중요한 생물학적 결과가 예기될 수 있다. 과발현될 수 있는 수용체의 유형으로는, 예를 들어, EGF, TGFα, VEGF, 및 다양한 콜로니 자극 인자 및 인터루킨에 대한 성장 인자 및 사이토킨 수용체가 포함되나, 이에 한정되지 않는다. 또한, 스테로이드 호르몬 수용체는 표피세포에서의 발현에 적합하다. 이러한 형질감염은 수정률을 개선시키거나, 수태를 막으며, 월경 장애를 치료하고, 오르판 수용체(리간드가 현재 미확인된 수용체)의 기능을 밝혀내고자 하는 경우에 유용할 것으로 기대된다. 리간드를 특정화하는 것이 새로운 약제 제조를 유도할 수 있기 때문에 오르판 수용체는 제약 산업에서 매우 흥미로운 분야이다.
자궁내막의 발달은 많은 사이토킨과 이들 수용체간의 상호 작용에 의해 매개되는 복잡한 과정이며, 난소 스테로이드의 자극 효과가 종종 이들 사이토킨에 의해 매개된다는 사실이 점차 인식되고 있다. 특히, TGFα가 마우스 자궁에서 에스트로겐의 잠재적인 매개체인 것으로 밝혀졌다[참조 문헌: Nelson et al, 1992, Endocrinology, 131, 1657-1644]. 따라서, 상기 인자의 합성을 유도하는 구성물의 형질감염이 자궁내막 성장을 촉진시킬 것으로 기대할 수 있으며, 이에 따라 자궁내막이 적합하게 발달되지 않는 상황에서 수정률을 개선시킬 수 있다. 이와 유사하게, 상기 인자는 월경 기간후 표피 표면의 회복을 촉진시킬 것으로 예상되며, 이에 따라 월경과다의 치료에 유용할 수 있다.
리간드가 현재 미확인된 스테로이드 호르몬 수용체 상과(superfamily)에 속하는 여러 군이 존재한다. 이러한 cDNA를 자궁내막에 형질감염시키는 것이 이들 수용체의 생물학적 기능을 밝혀내는데 큰 잇점이 될 수 있으며, 이에 따라 이들 수용체에 작용하는 신규한 약제 연구에 적용시킬 수 있을 것이다[참조 문헌: Evans 1988, Science 240, 889-895].
3) 사이토킨 성장인자 및 기타 호르몬의 작용을 억제하거나 예방하기 위해 설계된 구성물의 형질감염
사이토킨 및 성장 인자에 대한 천연 길항제를 형질감염시키는 것은 자궁내막 기능의 조절을 가능하게 한다. 이러한 길항제의 예로는 인터루킨 1 수용체 길항제가 있다[참조 문헌: Hannum et al, 1990 Nature 343, 336]. 상기 단백질의 투여가 마우스의 수태를 억제하는 것으로 나타났다[참조 문헌: Simon et al, 1994, Endocrinology 134, 521-528]. 사이토킨 및 성장 인자의 기타 천연 길항제로는 천연 가용성 수용체가 있다. 가용성 수용체는 다양한 성장 인자/사이토킨 시스템으로 기술되어 있다[참조 문헌: 예를 들어, TNF(Engelmann et al, 1990, J. Biol. Chem. 265, 14497-14504), FGF(Givol et al, 1992, FASEB Journal, 6, 3362-3369), PDGF(Tiesman & Hart, 1993, J. Biol. Chem. 268, 9621-9628) 및 IL-6(Novick et al, 1989, J. Exp. Med. 170, 1409-1414)]. 공통 특성은 수용체의 세포외 리간드 결합 도메인이 자유로운 가용성 인자로서 세포로부터 방출된다는 점이다. 이는 투과막 및 세포내 도메인이 결핍된 절단된 단백질 분자를 생성시키는 단백질 분해에 의해 또는 선택적인 스플라이싱에 의해 달성된다. 켄달(Kendall) 및 토마스(Thomas)(1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 10705-10709)는 VEGF 수용체 flt의 가용성 변이체를 기재하였다. 이 단백질은 시험관내 VEGF의 작용을 억제한다. 본 발명은 추가의 가용성 변이체를 코드화하는 세 개의 추가 cDNA를 분리하였다(참조 문헌: PCT/GB 95/01213). 이러한 천연 제제의 사용은 다른 길항제(예를 들어, 항-VEGF 항체)에 비해 몇가지 잇점을 갖는다. 이들은 체내에서 자연적으로 발생한 것이므로, 면역 반응을 유발하지 않을 것이며, 양호하게 내성을 가질 것으로 예상될 수 있다. 또한, 이들은 막 결합 수용체로부터 유도되기 대문에, 결합 특징이 매우 유사하며, 따라서, 리간드에 대해 매우 효과적으로 경쟁할 것이다. 기타 가용성 수용체가 자연적으로 존재할 수 있거나, 시험관내에서 처리될 수 있다. 또한, 스테로이드 호르몬 수용체류의 일원으로부터 리간드 결합 도메인이 발현될 때, 이 리간드 결합 도메인이 충분히 높은 농도로 세포내에서 발현된다면, 리간드와 경쟁할 수 있다는 점에서 우세한 네거티브 수용체로서 작용할 수 있을 것으로 예상된다. 선택적으로, 비-활성의 DNA 결합 “수용체”는 유전자 전사를 억제하는데 사용될 수 있다. 이러한 적용은 오르판 수용체에 대하여 아직 미확인된 리간드를 포함하는 천연 스테로이드에 대한 작용을 상쇄시키기에 유용할 것이다[참조 문헌: Pemrick et al. 1994 Leukemia 8, 1797-1806]. 7개의 투과막 도메인 수용체류의 시그날화 결핍 수용체가 또한 처리될 수 있으며, 형질감염될 수 있다.
가용성 인터루킨-1 수용체 길항제(Eisenberg et al, 1990 Nature 343, 341)는 생체내에서 IL-1의 작용에 대한 길항 작용을 하는 것으로 기재되어 있다[참조 문헌: Simon et al, 1994 Endocrinology 134, 521-528]. 따라서, 길항제를 합성하기 위한 cDNA 구성물을 자궁내막에 형질감염시키는 것이 마우스의 수태를 억제할 것으로 기대된다.
성장 인자 및 사이토킨 작용에 길항 작용을 하는 것으로 여겨지는 기타 인자로는 천연 수용체의 가용성 변이체가 포함되며, 예를 들어, flt에 대한 VEGF 수용체의 가용성 변이체가 켄탈 & 토마스의 문헌(1993, 상기 언급됨) 및 부콕(Boocock)등의 문헌(1995 J. Natl. Cancer Ins. 87, 506-516)에 기재되어 있다. 이러한 인자의 국소적 생성은 VEGF의 작용에 길항작용을 할 것으로 기대되며, 표피 세포가 과다 증식된 상태, 예를 들어, 자궁내막에서 모세혈관 밀도를 감소시키는 것이 바람직한 여러 월경 장애에서 유용한 치료 용도로 쓰일 수 있다. 여기에는 악성 질환이 포함될 수 있다.
4) 특이적 단백질(또는 효소)의 국소적 생성을 방지하기 위한 안티센스 방법의 이용
사이토킨, 성장 인자 및 호르몬 작용의 억제에 대한 또 다른 접근은 적합한 세포내에서 리간드 생성 또는 수용체의 생성을 억제하기 위해 안티센스 또는 리보솜을 사용하는 것이다[참조 문헌: James, 1991 Antiviral Chemistry and Chemotherapy, 2 191-214; Albert & Morris, 1994 Trends in Pharmacological Sciences 15, 250-254].
안티센스 방법은 안티센스 올리고누클레오티드 또는 폴리누클레오티드를 세포 mRNA에 결합시키는 것이다. 이러한 결합은 상기 mRNA의 번역을 억제하며, 이에 따라 상기 세포에 의해 제조되는 고유 단백질의 양을 감소시킨다. 합성 올리고누클레오티드 또는 폴리리보누클레오티드는 모두 이러한 접근을 위해 성공적으로 사용되어 왔다. 올리고누클레오티드의 리포솜 매개 형질감염 또는 보다 긴 안티센스 폴리리보누클레오티드의 합성을 유도하는 DNA 구성물의 리포솜 매개 형질감염은 형질감염된 세포에 의해 특이적으로, 그리고 선택적으로 단백질 재생을 감소시킬 것으로 기대된다. 또한, 리보자임은 문제시 되는 특이적 단백질을 코드화하는 RNA를 선택적으로 절단함으로써 단백질 생성을 억제한다. 이들은 또한 이러한 폴리누클레오티드의 합성을 유도하는 DNA 구성물로서 또는 폴리리보누클레오티드로서 형질감염될 수 있다[참조 문헌: James 1991, and Albert & Morris 1994, 상기에서 인용됨]. 수정을 억제하기 위한 용도를 갖는 안티센스 리보자임의 예는 하기와 같다. LIF는 포유동물의 수태 중 착상 과정에서 필수적인 것으로 이미 기재되었다[참조 문헌: Stewart et al, 1992, 이미 인용됨]. 따라서, 안티센스 폴리리보누클레오티드의 합성을 유도하는 올리고누클레오티드 또는 DNA 구성물, 또는 LIF mRNA에 대해 유도되는 리보자임의 형질감염이 이러한 인자의 합성을 억제할 것으로 기대된다. 이후, 이러한 인자의 결핍은 착상 실패를 유도하여, 수태를 억제시킬 것이다.
유사한 접근법이 맥관형성 성장 인자, 예를 들어 VEGF의 생성을 억제하기 위해 이용될 수 있으며, 이에 의해 종양 성장에 필요한 표피세포의 증식을 억제시킬 것이다. 따라서, 이러한 치료 유형은 악성 질환을 치료하는 경우에 특히 유리할 수 있다.
5) 면역글로불린 및 그의 단편의 국소적 생성
현재의 재조합 DNA 방법을 사용하여, 전체 모노클로날 항체와 결합 특징이 거의 유사하고 이로부터 유래되는 단일 사슬 항체를 생성시킬 수 있다. 이러한 단일 사슬 항체는 박테리아에서 성공적으로 발현되었다[참조 문헌: He et al, 1995 Immunology 84, 662-668]. 이론상 단일 사슬 항체의 발현을 유도하여, 이를 표피 세포내에서 발현시키는 것이 가능하다. 이것이 자궁내막에서 수행되는 경우, 스테로이드 호르몬에 대해 유도된 단일 사슬 항체가 상기 스테로이드와 결합하여, 표피세포내에서 스테로이드의 작용을 억제시킬 것으로 예상된다. 이러한 항체의 예로는 안티프로게스테론 모노클로날 항체 DBS로부터 유도된 단일 사슬 항체가 있다[참조 문헌: He et al, 1995, 상기에서 인용됨]. 상기 항체가 자궁 루멘으로 분비되는 경우, 또한 프로게스테론과 결합하여, 자궁 구획내 다른 곳에서도 작용이 가능할 것이다. 자궁내막에서 활성인 것으로 공지된 성장 인자 및 사이토킨에 대해 유도된 항체가 이와 같은 방식으로 국소적으로 생성되는 경우, 성장 인자 및 사이토킨의 기능을 이와 유사하게 억제할 수 있을 것이다.
국소적으로 생성된 단일 사슬 항체는 추가로 성적 접촉으로 감염된 질병을 예방하거나 치료하는데 적용될 수 있다. 이러한 상황에서 문제시되는 병원체(예를 들어, 유두종 바이러스, HIV, 클라미디아)에 대해 유도된 항체를 자궁 루멘에 분비시켜 문제시되는 제제에 의한 감염을 억제할 것이다. 정자 또는 난모 세포 항원에 대해 유도된 항체가 피임 작용을 할 수 있을 것으로 예상된다.
6) 점막 면역성을 위한 활성 면역화
국소적 면역성을 위해 사용될 수 있는 추가의 방법으로는 항원을 루멘에 분비시키는 구성물을 고안하는 것이다. 이는 국소적 면역 반응을 유도하며, 이에 따라 부위 특이적 점막 면역이 이루어진다. 자궁 루멘이 다수의 백혈구를 함유하는 것이 오랫 동안 공지되어 왔다[참조 문헌: Howe, 1967 Journal of Reproduction and Fertility 13, 563-566]. 형질감염된 자궁내막 세포에 의해 생성된 항원이 상기 백혈구에 흡수되어, 후속적으로 점막 면역 반응을 유도하는 것이 가능하다. 항원이 장의 루멘에 전달됨으로써 이러한 면역성을 초래할 수 있으며, 일부 경우에서는 매우 효과적인 것으로 나타났다(예를 들어, 소아마비에 대한 예방접종).
7) 병원체 부착 부위 차단
점막 표면에의 병원체 부착은 흔히 감염 성립의 필수 요건이다. 따라서, 이러한 부위에 대한 병원체 부착의 차단은 질병, 특히 성적 접촉으로 감염되는 질병으로부터 사람 또는 동물을 보호하는 방법을 제공할 수 있을 것이다. 이 방법은 박테리아 병원체(예를 들어, E. coli 및 N. gonorrhoea의 특정 병원성 균주) 뿐만 아니라 바이러스 병원체에도 적용된다. 세포를 감염시키는 많은 바이러스가 세포 표면의 “수용체”에 의해 부착한다. 가용성 수용체의 국소적 생성은 세포의 표면 분자와 경쟁하며, 이에 따라 바이러스 감염을 억제할 것으로 예상된다. 이와 유사하게, 바이러스성 의사(擬似)체(바이러스성 “리간드”처럼 작용)로 세포 표면의 수용체를 포화시키는 것이, 또한 특이적 면역글로불린 또는 그의 효과적인 결합 부분을 국소적으로 생성시키는 것처럼, 감염을 차단할 수 있다.
포유동물의 생식기 세포, 바람직하게는 자궁내막 세포에 핵산을 도입시킴으로써 상기 세포의 일부 또는 전부의 하나 이상의 특성을 변경시키는 방법, 상기 핵산을 함유하여 생식기 질환의 치료에 사용될 수 있는 약제, 이러한 약제를 제조하는 방법이 제공된다. 본 발명에 따르면, 유전자가 생체내에서 자궁내막에 전이되어, 다양한 자궁내막 (및 태반) 조건, 예를 들어, 동물 및 사람에서의 착상 증진, 착상 억제(즉, 피임), 자궁내막증 및 월경과다, 과다형성 및 샘암종에 치료적으로 이용될 수 있다.
도 1a 및 도 1b는 각각 β-갈락토시다제 리포터 유전자를 발현시키는 플라스미드 구성물(A), 또는 리포터 유전자가 결핍된 유사한 플라스미드(B)로 형질감염된 마우스 자궁내막의 조직부의 현미경 사진이다. 형질감염된 세포는 세포질내에서 매우 짙은 (블루) 염색에 의해 뚜렷이 동정될 수 있고, 이는 B 부분에는 존재하지 않는다.
도 2는 도 1a에서와 같이 동일한 플라스미드로 형질변환된 시험관내 사람 자궁내막 세포의 현미경 사진이다. 리포터 유전자의 발현으로 인한 짙은 (블루) 염색은 잔류하는 샘 구조와 주로 관련된 것이며, 주위의 세포는 보다 약하게 염색된다.
도 3은 클로르암페니콜 아세틸 전이효소(pcDNA3CAT)를 코드화하는 유전자로 성공적으로 형질감염된 자궁내막 세포에 대한 CAT검정(튜브당 계수)의 결과를, 대조 플라스미드(pcDNA3)로 형질감염된 세포와 비교하여 도시한 막대 챠트이다.
도 4는 루시페라제(pcDNA3LUC)를 코드화하는 유전자로 성공적으로 형질감염된 자궁내막 세포에 대한 루시페라제 검정(광 유닛으로 비교)의 결과를, 대조 플라스미드(pcDNA3)로 형질감염된 세포와 비교하여 도시한 막대 챠트이다.

Claims (7)

  1. 자궁내막증, 월경과다, 자궁내막 과다형성, 자궁내막 샘암종 및 미생물 병원체에 의한 감염으로 구성된 군으로부터 선택되는 생식기 질환 치료용 약제로서,
    상기 약제는, 배란 이후부터 혈액 중의 프로게스테론의 수준이 최고가 되는 시점을 포함하는 기간 중에 포유동물의 자궁내막 세포로 도입시, 생식기 질환에 대한 치료적 효과를 나타내는 핵산을 포함하고,
    상기 핵산은 사이토킨 또는 성장 인자, 또는 이의 유효부분을 코드화하는 핵산; 인터루킨, 백혈병 억제 인자(LIF), 혈관내피 성장인자(VEGF), 표피성장인자(EGF), 헤파린-결합 표피 성장인자(HBEGF), 인슐린-결합 성장인자 I 형 및 II형 (IGF-I 및/또는 IGF-II), 암피레귤린, 콜로니 자극인자(CSF), 종양괴사인자(TNF), 간세포성장인자(HGF) 또는 섬유아세포 성장인자(FGF), 또는 이의 유효부분의 발현을 유도하는 핵산; 사이토킨의 길항제 또는 성장 인자의 길항제, 또는 이의 유효부분의 발현을 유도하는 핵산; 변환성장인자(TGF)α수용체, 섬유아세포성장인자(FGF) 수용체, 혈소판-유도된 성장인자(PDGF) 수용체, 인터루킨-6 수용체, 혈관내피성장인자(VEGF) 수용체 및 간세포성장인자 수용체(“Met" 수용체)로부터 선택된 가용성 수용체, 또는 인터루킨-1 수용체 길항제의 발현을 유도하는 핵산; 세포내 및/또는 세포상에서, 성장 인자, 사이토킨 또는 스테로이드 호르몬에 대한 수용체, 또는 이의 유효부분의 발현을 유도하는 핵산; EGF, 변환성장인자(TGF)α, 또는 VEGF에 대한 수용체, 또는 이의 유효부분의 발현을 유도하는 핵산; 국소면역효과를 갖는 폴리펩티드, 또는 이의 유효부분의 발현을 유도하는 핵산; 병원체로부터의 항원, 또는 이의 유효부분의 발현을 유도하는 핵산; HIV, 파필로마 바이러스, 클라미디아 또는 엔. 고노르호에아(N. gonorrhoea)로부터 얻은 폴리펩티드, 또는 이의 면역원성 부분의 발현을 유도하는 핵산; 및 면역글로불린 또는 이의 유효부분의 발현을 유도하는 핵산으로 구성된 군으로부터 선택되는 약제.
  2. 포유동물의 수정률을 상향조절하는 약제로서,
    상기 약제는, 배란 이후부터 혈액 중의 프로게스테론의 수준이 최고가 되는 시점을 포함하는 기간 중에 포유동물의 자궁내막 세포로 도입시, 포유동물의 수정률을 상향조절하는 핵산을 포함하고,
    상기 핵산은 사이토킨 또는 성장 인자, 또는 이의 유효부분을 코드화하는 핵산; 및 인터루킨, 백혈병 억제 인자(LIF), 혈관내피 성장인자(VEGF), 표피성장인자(EGF), 헤파린-결합 표피 성장인자(HBEGF), 인슐린-결합 성장인자 I 형 및/또는 II형 (IGF-II), 암피레귤린, 콜로니 자극인자(CSF), 종양괴사인자(TNF), 간세포성장인자(HGF) 또는 섬유아세포 성장인자(FGF), 또는 이의 유효부분의 발현을 유도하는 핵산으로 구성된 군으로부터 선택되는 약제.
  3. 포유동물의 수정률을 하향조절하는 약제로서,
    상기 약제는, 배란 이후부터 혈액 중의 프로게스테론의 수준이 최고가 되는 시점을 포함하는 기간 중에 포유동물의 자궁내막 세포로 도입시, 포유동물의 수정률을 하향조절하는 핵산을 포함하고,
    상기 핵산은 사이토킨의 길항제 또는 성장 인자의 길항제, 또는 이의 유효부분의 발현을 유도하는 핵산; 및 변환성장인자(TGF)α수용체, 섬유아세포성장인자(FGF) 수용체, 혈소판-유도된 성장인자(PDGF) 수용체, 인터루킨-6 수용체, 혈관내피성장인자(VEGF) 수용체 및 간세포성장인자 수용체(“Met" 수용체)로부터 선택된 가용성 수용체, 또는 인터루킨-1 수용체 길항제의 발현을 유도하는 핵산으로 구성된 군으로부터 선택되는 약제.
  4. 자궁내막증, 월경과다, 자궁내막 과다형성, 자궁내막 샘암종 및 미생물 병원체에 의한 감염으로 구성된 군으로부터 선택되는 생식기 질환 치료용 약제로서,
    상기 약제는, 배란 이후부터 혈액 중의 프로게스테론의 수준이 최고가 되는 시점을 포함하는 기간 중에 포유동물의 자궁내막 세포로 도입시, 생식기 질환에 대한 치료적 효과를 나타내는 핵산을 포함하고,
    상기 핵산은 프로모터에 안티센스 배향으로 작동가능하게 결합된 핵산 서열 부분을 포함하여, 서열이 도입된 세포에서 폴리펩티드의 발현을 억제시키는 약제.
  5. 포유동물의 수태 촉진용 약제로서,
    상기 약제는, 배란 이후부터 혈액 중의 프로게스테론의 수준이 최고가 되는 시점을 포함하는 기간 중에 포유동물의 자궁내막 세포로 도입시, 포유동물의 수정률을 상향조절하는 핵산을 포함하고,
    상기 핵산은 프로모터에 안티센스 배향으로 작동가능하게 결합된 핵산 부분을 포함하여 서열이 도입된 세포에서 사이토킨의 길항제 또는 성장 인자의 길항제, 또는 이의 유효부분; 및 변환성장인자(TGF)α수용체, 섬유아세포성장인자(FGF) 수용체, 혈소판-유도된 성장인자(PDGF) 수용체, 인터루킨-6 수용체, 혈관내피성장인자(VEGF) 수용체 및 간세포성장인자 수용체(“Met" 수용체)로부터 선택된 가용성 수용체, 또는 인터루킨-1 수용체 길항제로 구성된 군으로부터 선택된 폴리펩티드의 발현을 억제시키는 약제.
  6. 포유동물의 피임용 약제로서,
    상기 약제는, 배란 이후부터 혈액 중의 프로게스테론의 수준이 최고가 되는 시점을 포함하는 기간 중에 포유동물의 자궁내막 세포로 도입시, 포유동물의 수정률을 하향조절하는 핵산을 포함하고,
    상기 핵산은 프로모터에 안티센스 배향으로 작동가능하게 결합된 핵산 부분을 포함하여 서열이 도입된 세포에서 사이토킨 또는 성장 인자, 또는 이의 유효부분; 및 인터루킨, 백혈병 억제 인자(LIF), 혈관내피 성장인자(VEGF), 표피성장인자(EGF), 헤파린-결합 표피 성장인자(HBEGF), 인슐린-결합 성장인자 I 형 및/또는 II형 (IGF-II), 암피레귤린, 콜로니 자극인자(CSF), 종양괴사인자(TNF), 간세포성장인자(HGF) 또는 섬유아세포 성장인자(FGF), 또는 이의 유효부분으로 구성된 군으로부터 선택된 폴리펩티드의 발현을 억제시키는 약제.
  7. 제1항 내지 제6항중의 어느 한 항에 정의된 핵산을 생리학적으로 허용되는 담체와 혼합시킴에 의해 제1항 내지 제6항 중의 어느 한 항에 따른 약제를 제조하는 방법.
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