PL192784B1 - Zastosowanie kwasu nukleinowego - Google Patents

Abstract

1. Zastosowanie kwasu nukleinowego kierujacego ekspresja przynajmniej czesci funkcyjnej jednego z nastepujacych bialek: interleukiny, bialaczkowego czynnika hamujacego (LIF), naczy- niowo-sródblonkowego czynnika wzrostu (VEGF), naskórkowego czynnika wzrostu (EGF), naskór- kowego czynnika wzrostu wiazacego heparyne (HBEGF), czynnika wzrostu wiazacego insuline l i II (IGF-I i IGF-II), amfireguliny, czynnika stymulujacego kolonie (CSF), czynnika martwicy nowotworu (TNF), czynnika wzrostu hepatocytów (HGF) i czynnika wzrostu fibroblastów (FGF) albo polipepty- dów HIV, wirusa brodawczaków, Chlamydia lub N. gonorrhoea albo antagonisty dla cytokiny lub antagonisty dla czynnika wzrostu, receptora dla czynnika wzrostu, cytokiny lub hormonu steroido- wego, polipeptydu wykazujacego miejscowe dzialanie immunologiczne, do wytwarzania leku do transfekowania komórek dróg rozrodczych kobiety. PL PL PL PL PL PL PL

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie kwasu nukleinowego i zmieniania w ten sposób jednej lub wielu cech charakterystycznych tkanki endometrium ssaków.

Fizjologia endometrium

Dwoma podstawowymi zjawiskami wymaganymi do implantacji zarodka w macicy ssaków są; po pierwsze: przygotowanie endometrium, tak by było podatne na obecność blastocysty, która może się wtedy zagnieździć i zdobywać substancje odżywcze poprzez łożysko, po drugie: modyfikacja aktywności myometrium, które musi stać się nieruchome i przez to pozwolić blastocyście na zagnieżdżenie wewnątrz jamy macicy bez niebezpieczeństwa wydalenia. Oba te zjawiska są kontrolowane przez wpływ hormonów ciążowych, z których szczególnie ważne są estrogeny i progesteron. Te hormony steroidowe wpływają na endometrium i myometrium poprzez swoiste receptory, które są zlokalizowane w jądrach komórek docelowych. Aktywowany kompleks hormon steroidowy - jądrowe białko receptorowe ma możliwość interakcji ze specyficznymi regionami wewnątrz DNA, powodując stymulację, represję lub derepresję genów kodujących białka i polipeptydy, takie jak enzymy lub czynniki wzrostu.

Rozpoczęcie implantacji jest wywołane kaskadą zmian biochemicznych i biofizycznych. Cząsteczki adhezyjne (np. CAM 105) są włączone we wczesne stadium wiązania blastocysty ze ścianą macicy. Następnie blastocysta i endometrium znajdują różne sposoby dla poprawy wzajemnych ścisłych zależności między tkankami płodowymi i matczynymi. U kopytnych, komórki trofoblastu, które formują się z zewnętrznie położonej warstwy blastocysty, wędrują do wewnątrz nabłonka macicy, z którym się następnie zlewają. U kobiet migracja komórkowa jest doprowadzona o etap dalej, ponieważ nie tylko izolowane specyficzne typy komórek migrują, ale całe obszary trofoblastu wnikają między komórki nabłonkowe macicy. Proces ten jest możliwy, ponieważ część komórek trofoblastu zlewa się razem tworząc syncytium. Proces ten jest bardzo szybki i zarodek zagnieżdża się wtkankach macicy bez bardzo widocznej degeneracji nabłonka macicy. U niektórych gatunków, proces implantacji jest opóźniony, albo przez hamujące sygnały środowiskowe, które zapewniają rodzenie się młodych w korzystnym okresie roku, lub przez czynniki fizjologiczne, takie jak np. laktacja, tak więc matka może zakończyć odstawianie od piersi poprzedniego dziecka zanim następna ciąża będzie w pełni rozwinięta.

Przygotowanie macicy na implantację jest regulowane przez wydzielanie hormonów jajnikowych. Transport zapłodnionego jaja przez jajowód jest precyzyjnie kontrolowany pod względem czasu, więc dostaje się ono do macicy w odpowiednim czasie dla swego rozwoju i gdy macica jest w najlepszym okresie do przyjęcia zapłodnionego jaja. Pod wieloma względami macica jest przyjazna dla zarodka, w rzeczywistości bardziej przyjazna niż inne obszary ciała. Wyściełająca tkanka nabłonkowa macicy jest pod wieloma względami oporna na wiązanie i inwazję trofoblastu i tylko w bardzo precyzyjnie określonym stanie hormonalnym ten opór jest rozluźniony.

U szczurów i myszy, które nie miały kontaktów płciowych, nie występuje pełny cykl miesiączkowy, ponieważ nie powstaje normalne wydzielnicze ciałko żółte produkujące zwiększoną ilość progesteronu. Jeśli kopulacja odbędzie się w trakcie rui, w czasie gdy wysoki poziom estrogenów jest osiągany przez wydzielanie przez pęcherzyki jajnika skąd zostało uwolnione jajo, ciałko żółte tworzy się wmiejscu pękniętego pęcherzyka, rośnie poziom stężenia wydzielanego progesteronu, dochodzi do implantacji i rozpoczyna się ciąża (czas trwania 21 dni). Jeśli dochodzi do bezpłodnej kopulacji, występują podobne wydarzeniaza wyjątkiem tego, że ciałko żółte utrzymuje się tylko przez 11 dni i ciąża rzekoma jest skrócona.

Komórkowe i biochemiczne zmiany, które zachodzą w endometrium, są bardzo dokładnie zbadane u szczurów i u myszy i dzięki tym informacjom wiedza o tych zjawiskach zachodzących u kobiet bardzo wzrosła w ostatnich latach. Endometrium u wszystkich gatunków jest zbudowane z trzech głównych tkanek: nabłonka wyściełającego, nabłonka gruczołowego i zrębu. Proliferacja komórek pojawia się w tych trzech tkankach w różnym okresie. Komórki wyściełające proliferują dokładnie przed fazą płodną (proestrus) pod wpływem rosnącego poziomu estrogenów produkowanych przez pęcherzyki jajnika. Pierwszego dnia ciąży (dzień kopulacji u gryzoni) komórki przestają się dzielić, następnie przechodzą 3-go dnia drugi, aczkolwiek słabszy, okres wzmożonej aktywności. Komórki gruczołowe wykazują największą aktywność 4-go dnia, a następnie aktywność ta zmniejsza się. Komórki zrębu nie proliferują do 4-go dnia, a następnie pod wpływem progesteronu osiągają wysoki stopień proliferacji 5-go dnia. U kobiet mniej są poznane zmiany, które poprzedzają proces implantacji,

PL 192 784 B1 ale wydaje się, że szczyt proliferacji komórek nabłonkowych występuje podczas fazy folikularnej, a komórek zrębu podczas fazy sekrecyjnej, tak jak u myszy i szczurów.

Przyczyna proliferacji komórek endometrium nie jest w pełni poznana. Uważa się, że endometrium przygotowuje się do implantacji przez zwiększenie liczby komórek, które mają funkcje odżywczą i wydzielniczą (nabłonek gruczołowy), które biorą udział w bardzo wczesnym etapie powstawanie łożyska (tworzenie doczesnej). Warunkiem wymaganym do udanej implantacji jest mitoza komórek, która może powodować następnie różnicowanie komórek i stąd może odgrywać istotną rolę we wczesnych wydarzeniach zagnieżdżonej ciąży. Dowodem wspierającym tę rolę jest endometrialna produkcja czynników wzrostu (mitogenów), cytokin i onkogenów jądrowych. Wiele z tych związków jest produkowanych w zwiększonym stężeniu w odpowiedzi na hormony jajnikowe działające przez ich receptory.

Spośród czynników wzrostowych, ostatnio najwięcej uwagi poświęca się nabłonkowemu czynnikowi wzrostowemu (EGF), wiążącemu heparynę nabłonkowemu czynnikowi wzrostowemu (HBEGF), amfiregulinie i wiążącym insulinę czynnikom wzrostowym (IGF-I i IGF-II). Niedawne eksperymenty na myszach udowodniły, jak ważny jest wpływ lokalny (parakrynny) przynajmniej jednego z tych czynników wzrostu, amfireguliny. Zahamowanie specyficznego w stosunku do implantacji i regulowanego przez progesteron genu amfireguliny osiągnięto przez anty-progestin RU486, co spowodowało zabezpieczenie przed implantacją (Das i wsp., Molecular Endocrinology, 9, 691-705, 1995).

W badaniach nad knock-out'em genu okazało się, że wśród cytokin, białaczkowy czynnik hamujący (LIF) i czynnik stymulujący kolonie (CSF), produkowane także przez mysią macicę w czasie implantacji, są niezastąpione i wykazano, że usunięcie ich powoduje niemożność implantacji i brak rozwoju łożyska, (Steward i wsp., Nature 359, 76-79,1992: Pollard i wsp., Developmental Biology 148, 273-283, 1991). Wśród onkogenów jądrowych, poziom c-jun i c-fos, (które są wczesnymi wskaźnikami transkrypcji genu) wzrasta w macicy po podaniu estrogenu i jest hamowany przez progesteron.

Zasadnicze różnice między gatunkami występują w wydłużeniu w czasie inwazji trofoblastu podczas implantacji. U kobiet wczesny trofoblast jest wysoce inwazyjny, natomiast u świń, u których występuje nieinwazyjna forma implantacji, nabłonek endometrium nigdy nie zostaje naruszony przez czas trwania trzymiesięcznej ciąży. Możliwość wystąpienia nieudanej implantacji u tych dwóch gatunków jest częsta, osiąga odpowiednio około 60 i 30%. Przyczyny tak wysokiego stopnia niepowodzeń są złożone i niedokładnie poznane. U kobiet, około połowa niepowodzeń jest związana z nieprawidłowościami genetycznymi, ale u świń, jak i u innych kopytnych gdzie częstość niepowodzeń jest również wysoka, defekty genetyczne zdarzają się tylko u kilku procent ogółu.

Po nieudanej implantacji u kobiet spadek progesteronu powoduje krwawienie, tak jak na koniec normalnego cyklu miesiączkowego; nie występuje to u większości innych zwierząt. Zaburzenia cyklu miesiączkowego, tak jak i implantacji są częste. Dodatkowo krwawienie miesięczne, czy to jako konsekwencja sekwencyjnej terapii hormonalnej, czy w połączeniu z ciągłą kombinowaną hormonalną terapią zastępczą, lub ciągła antykoncepcja jedynie progestinowa, jest przyczyną zdrowia lub choroby u kobiet. Celem wielu prowadzonych badań są przyczyny tych krwawień: mechanizmy biochemiczne (tj. prostaglandyny, enzymy, polipeptydy i białka, związki wazoaktywne, takie jak czynnik aktywujący płytki PAF, i naczyniowo-śródbłonkowy czynnik wzrostu VEGF) i komórkowe (tj. migracja komórek produkujących związki immunosupresyjne do macicy).

Obecna wiedza o procesach rozrodczych skupia się na kontrolowanej produkcji hormonów steroidowych i działaniu tych hormonów na tkanki docelowe. Czynniki parakrynne i autokrynne coraz bardziej wydają się być kluczowym mediatorem funkcji rozrodczych, chociaż współdziałają ze steroidami (Benton, 1991, Current Opinion in Cell Biology 3,171-175: Rozengurt. 1992 Current Opinion in Cell Biology 4, 161-165: Tartakovsky i wsp., 1991 Developmental Biology 146, 345-352: Robertson i wsp.,1992 Current Opinion in Immunology 4, 585-590; Smith, 1994 Human Reproduction 9, 936-946; i Tabibzadeh, 1994 Human Reproduction 9, 947-967). Najbardziej oczywiste przykłady można zaobserwować u myszy po owariektomii. W tym modelu macica wykazuje znaczący wzrost odpowiedzi na pojedynczą dawkę estradiolu. Efekt ten można zablokować przez przeciwciała anty TGFa (TGF transformujący czynnik wzrostu), co sugeruje, że mediatorem tego mitogennego efektu estrogenu jest w tej tkance TGFa (Nelson i wsp., 1992 Endocrinology 131, 1657-1664).

Konsekwentnie medyczne interwencje w ginekologii są w większości przypadków oparte na steroidowo/antysteroidowej regulacji mechanizmów macicy. (Yen i Jaffe,1991 w Reproductive Endocrinology, wyd. Yen, Jaffe i Benton, Pub. WB Saunders, Philadelphia; Baird, 1993 British Medical Bulletin 49, 73-87). Pomimo niewątpliwych sukcesów tego podejścia, nie zostało osiągnięte od 20 lat nowe

PL 192 784 B1 pojęciowe podejście do technik antykoncepcyjnych, nie zostały zidentyfikowane nowe sposoby ułatwiające implantację, nie ma żadnych postępów w ułatwianiu wzrostu i rozwoju łożyska, nie znaleziono nowego podejścia leczenia łagodnych schorzeń ginekologicznych (zaburzeń miesiączkowych i włókniaków).

Ogłoszono wiele publikacji dotyczących stosowania u ssaków „transferów genu” do poprawy genotypu przynajmniej niektórych komórek danej tkanki lub tkanek. W szczególności znana jest próba „terapii genowej” u ludzi przez wprowadzenie do organizmu biorcy sekwencji kwasów nukleinowych, wcelu przezwyciężenia niedoborów genetycznych biorcy przez ekspresję polipeptydów kodowanych przez wprowadzone sekwencje kwasów nukleinowych. Próby terapii genowej były prowadzone, na przykład, z sekwencjami DNA (włączonymi w wektory wirusowe) wprowadzonymi do dróg oddechowych pacjentów z mukowiscydozą, co poprawiło fenotyp przynajmniej części komórek nabłonkowych wyściełających drogi oddechowe tych pacjentów. Jak dotąd, nie opublikowano prób wprowadzenia DNA do endometrium ssaków, pomimo istnienia odpowiednich możliwości technicznych.

Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie kwasu nukleinowego kierującego ekspresją przynajmniej części funkcyjnej jednego z następujących białek: interleukiny, białaczkowego czynnika hamującego (LIF), naczyniowo-śródbłonkowego czynnika wzrostu (VEGF), naskórkowego czynnika wzrostu (EGF), naskórkowego czynnika wzrostu wiążącego heparynę (HBEGF), czynnika wzrostu wiążącego insulinę l i II (IGF-I i IGF-II), amfireguliny, czynnika stymulującego kolonie (CSF), czynnika martwicy nowotworu (TNF), czynnika wzrostu hepatocytów (HGF) i czynnika wzrostu fibroblastów (FGF) albo polipeptydów HIV, wirusa brodawczaków, Chlamydia lub N. gonorrhoea albo antagonisty dla cytokiny lub antagonisty dla czynnika wzrostu, receptora dla czynnika wzrostu, cytokiny lub hormonu steroidowego, polipeptydu wykazującego miejscowe działanie immunologiczne, do wytwarzania leku do transfekowania komórek dróg rozrodczych kobiety.

Niniejszy wynalazek bez wątpienia nie może być rozpatrywany jako proste rozszerzenie znanych technik terapii genowej, która jest przynajmniej częściowo skuteczna przy podawaniu do płuc u pacjentów z mukowiscydozą. Wrodzone zaburzenia genetyczne nie są odpowiedzialne za żadne znane choroby endometrium, tak więc bodźcem do stosowania technik terapii genowej w endometrium nie była żadna znana w stanie techniki metoda. Dalej, nabłonek endometrium jest odmiennego typu (sześcienny, pochodzący z nabłonka jam ciała) w porównaniu z nabłonkiem płuc, (który jest warstwowy) i dlatego nie można oczekiwać, że będą one miały jakiekolwiek analogiczne właściwości. Poza tym, przynajmniej u naczelnych, występuje cykliczne złuszczanie nabłonka endometrium, które prowadzi do utraty transfekowanych komórek. W końcu, wynalazcy stwierdzili, że nie dochodzi do przechodzenia wprowadzonego DNA ani do narządów matki, ani do łożyska zarodka, które mogłoby wystąpić i spowodować problemy w praktyce.

Zwykle, kwas nukleinowy jest wprowadzany do organizmów kobiet, dokładnie do komórek ich endometrium. Pożądane jest wprowadzenie kwasu nukleinowego do komórek gruczołowych endometrium. Kwas nukleinowy może kodować polipeptyd, który jest już naturalnie syntetyzowany przez komórki, do których został wprowadzony kwas nukleinowy, tak że poziom ekspresji danego polipeptydu jest zwiększony przez efekt dawki genu. Równocześnie ta metoda może być użyta do indukcji komórek do produkcji polipeptydu, który nie był wcześniej syntetyzowany przez te komórki. Polipeptyd może być, na przykład sztucznie rekombinowanym polipeptydem, który nie występuje w naturze, tak jak chimeryczne polipeptydy zawierające całą lub część domen funkcyjnych jednego lub dwóch różnych białek.

Kwasem nukleinowym jest korzystnie DNA, lecz niektórzy mogą potrzebować wprowadzenia RNA (łańcuch sensowny lub nonsensowny). Cząsteczki antysensu mogą być użyte do hamowania lub w innym przypadku do zakłócania ekspresji polipeptydu w komórkach, do których był wprowadzony kwas nukleinowy. Sekwencja wprowadzonego kwasu nukleinowego może być antysensownym RNA, lub może być sekwencją DNA kierującą syntezą, wewnątrzkomórkową, antysensownego RNA. Inną drogą uzyskania takiego hamowania jest wprowadzenie do komórek sekwencji kierującej syntezą rybozymu, który specyficznie rozszczepia mRNA potrzebny do syntezy polipeptydu, którego ekspresję chciano zahamować.

Twórcy niniejszego wynalazku stwierdzili, że czas podawania leku wytworzonego zgodnie z zastosowaniem według wynalazku (zależny od etapu cyklu rozrodczego) znacząco wpływa na skuteczność wychwytu kwasu nukleinowego. Wynalazcy stwierdzili, że korzystnie w celu uzyskania optymalnego stopnia wychwytu podawanego kwasu nukleinowego, podanie powinno być przeprowadzone w okresie następującym po owulacji, włącznie do dnia, w którym występuje maksymalny poziom proPL 192 784 B1 gesteronu we krwi. Poziom progesteronu zwykle jest najwyższy w tym samym czasie, w którym zarodek, jeśli jest obecny w macicy, może się implantować.

W ten sposób, na przykład, wynalazcy stwierdzili, że maksymalny wychwyt podawanego do endometrium myszy DNA występuje w 2-3 dniu cyklu (za dzień 1 jest uznany dzień, w którym po raz pierwszy jest odkryty w pochwie czop spermy po stosunku). U ludzi owulacja występuje zwykle 14 dnia cyklu i czas implantacji jest tak zwykle wyliczany, że przypada na połowę fazy lutealnej (aczkolwiek dokładny czas jest u ludzi słabo zdefiniowany).

Kwas nukleinowy może być podawany w formie nagiej, lub może być podawany w nośniku, którym są liposomy, wirusy lub inne cząstki. Zwykle kwas nukleinowy jest wprowadzany do komórek ssaka - biorcy przez zwykłą transfekcję (z lub bez liposomów), która w niniejszym wynalazku okazała się być zaskakująco skuteczna, bez potrzeby wprowadzania sekwencji do wektora wirusowego. Mimo to, wektory wirusowe mogą być użyteczne, szczególnie te, które mogą osiągać konkretne komórki docelowe (jak zostało ujawnione w WO 93/20221).

Kwasy nukleinowe dogodnie wprowadza się jako część konstruktu (np. plazmidu, kosmidu lub podobnych), który to konstrukt korzystnie zawiera promotor, funkcjonalny u ssaków, który powoduje transkrypcję przynajmniej części wprowadzonego kwasu nukleinowego. Promotor może być konstytutywny, lub korzystniej indukowalny, co pozwala na większą kontrolę ekspresji wprowadzonej sekwencji.

Wprowadzenie cząsteczki kwasu nukleinowego do komórek endometrium samic ssaków pozwala na regulację, pobudzanie i hamowanie, płodności u tych osobników. Lek wytworzony zgodnie z wynalazkiem można stosować w antykoncepcji u zwierząt domowych (tj. psów i kotów) celem zapobiegania niechcianym miotom. Wynalazek można też wykorzystać do poprawienia płodności zwierząt hodowlanych, takich jak świnie, bydło, owce i tym podobne.

Korzystne jest wprowadzenie leku zawierającego kwas nukleinowy do dróg rodnych przez pochwę, co pozwala na uniknięcie inwazyjnych technik chirurgicznych. Jednak, jeśli potrzeba, kwas nukleinowy może być wprowadzony przy użyciu technik chirurgicznych bezpośrednio do dróg rodnych (tj. do macicy). Wynalazek oferuje możliwość zmiany jednej lub więcej charakterystyk przez wprowadzenie jednej lub więcej, spośród różnych wskazanych sekwencji kwasów nukleinowych.

Sekwencja wprowadzona do komórek dróg rodnych kieruje ekspresją (korzystnie na wysokim poziomie) funkcyjnej części cytokin lub czynników wzrostu (funkcyjna część jest częścią cząsteczki, która zachowuje aktywność biologiczną, szczególnie związaną z całością np. wiązanie ze swoistymi ligandami). Przykłady takich polipeptydów, które mogą być wyrażane przez wprowadzoną sekwencję, obejmują interleukinę, białaczkowy czynnik hamujący (LIF), naczyniowo-śródbłonkowy czynnik wzrostu (VEGF), naskórkowy czynnik wzrostu (EGF), wiążący heparynę naskórkowy czynnik wzrostu (HBEGF), czynnik wzrostu wiążący insulinę l i II (IGF-I i IGF-II), amfiregulinę, czynnik stymulujący kolonie (CSF) i czynnik martwicy nowotworu (TNF).

W innym wykonaniu wprowadzone sekwencje mogą kierować ekspresją funkcyjnej części antagonisty cytokiny lub czynnika wzrostowego, takiego jak antagonista receptora dla IL-1. Korzystnie, antagoniści mogą być rozpuszczalnymi receptorami cytokiny lub czynnika wzrostu, a ich odpowiednie przykłady obejmują rozpuszczalne receptory transformującego czynnika wzrostu (TGF)a, czynnika wzrostu fibroblastów (FGF), płytkowego czynnika wzrostu (PDGF), interleukiny-6 (IL-6) i naczyniowośródbłonkowego czynnika wzrostu (VEGF) oraz czynnika wzrostu hepatocytów (receptora „Met'').

W innym wykonaniu wprowadzona sekwencja może kierować ekspresją funkcyjnej części polipeptydu wykazującego miejscowe działanie immunologiczne. W szczególności, polipeptyd może mieć aktywność immunogenną i służyć dzięki temu do stymulowania lokalnej odpowiedzi odpornościowej. Tak więc wynalazek umożliwia wprowadzenie nowej metody immunizacji. Korzystnie immunogenny polipeptyd może być antygenem patogenu śluzówkowego. Stosownie do ogólnych właściwości śluzówkowego układu odpornościowego, stymulacja produkcji przeciwciał w drogach rodnych może powodować produkcję odpowiednich przeciwciał w śluzówkach odległych obszarów, takich jak przewód pokarmowy, drogi oddechowe, gruczoły łzowe i tym podobne. Korzystnie jednak antygenem będzie jeden z patogenów, które zakażają lub kolonizują drogi rozrodcze, zwykle patogen powodujący chorobę przenoszoną drogą płciową. Przykłady obejmują wirusy takie jak HIV, wirusy brodawczaków (tj. HPV, różnych typów), chlamydie i bakterie (np. N. gonorrhoea). Alternatywnie polipeptydy wykazujące działanie immunologiczne mogą być immunoglobulinami lub ich funkcjonalnymi fragmentami (takimi jak Fab, Fv lub fragment scFv, lub przeciwciało jednołańcuchowe). Immunoglobulina lub jej czynny fragment mogą być kierowane przeciwko patogenowi (jednemu z wymienionych powyżej), lub mogą być kierowane przeciwko innym antygenom, takim jak hormony steroidowe lub inne hormony. Tak więc

PL 192 784 B1 immunoglobuliny lub ich fragmenty mogą być wyrażane miejscowo celem zapewnienia ochrony przeciwko chorobie lub celem regulacji płodności.

W innym wykonaniu, wprowadzona sekwencja może kierować ekspresją polipeptydu lub jego aktywnego fragmentu, kierującego menstruacją.

W innym wykonaniu wprowadzony kwas nukleinowy może kierować ekspresją czynnych fragmentów cząsteczek receptora na powierzchni komórek dróg rozrodczych. Receptor może być receptorem dla cytokin, hormonów steroidowych lub czynników wzrostu (takich jak receptor dla EGF, receptor dla TGFa lub receptor dla VEGF). Znanych jest wiele receptorów, które są opisane jako receptory „sieroce, dla których nie są znane wiążące ligandy. Takie receptory sieroce stanowią źródło zainteresowania przemysłu farmaceutycznego, ponieważ mogą stanowić cel nowych związków terapeutycznych i profilaktycznych.

Wynalazek umożliwia też przeprowadzenie sposobu charakteryzowania własności biologicznych polipeptydów, obejmującego wprowadzenie sekwencji kodującej charakteryzowany polipeptyd do komórek dróg rozrodczych ssaków i ocenę efektów wyrażanego polipeptydu. Korzystnie, ssakiem jest zwierzę laboratoryjne, takie jak mysz, czy szczur. Dogodnie, charakteryzowany polipeptyd jest receptorem sierocym i zwykle ostatnia część badania jego charakterystyki będzie obejmowała identyfikację jego liganda. Ogólnie sposób będzie obejmował analizę histologiczną skrawków pobranych ze zwierząt laboratoryjnych i opracowanie ichjedną z wielu znanych technik (tj. barwienie histochemiczne, hybrydyzacja in situ, barwienie immunologiczne itd.).

Niniejszy wynalazek w ten sposób oferuje nowy, alternatywny do podlegającego kontroli steroidowej, sposób regulacji funkcji endometrium (tak więc zdolności reprodukcyjnej i płodności) przez bezpośredni transfer genu in vivo. Aby to osiągnąć, konstrukty genetyczne powinny być konstruowane do specyficznej modulacji funkcji cytokin, co można uzyskać różnymi sposobami. Na przykład, komórki produkujące wydzielaną cytokinę mogą być zabezpieczone przed syntezą czynnika przez blokowanie transkrypcji i translacji przy użyciu antysensownych konstruktów pod kontrolą promotora lub rybozymów. Alternatywnie, działanie wydzielanego czynnika może być blokowane przez antagonistów receptora. Naturalnie występujące, rozpuszczalne receptory mogą wychwytywać i neutralizować bioaktywne ligandy i przez to grać rolę kompetycyjnych antagonistów receptora. Alternatywnie, występują naturalni antagoniści receptora, na przykład IL1Ra (antagonista receptora dla interleukiny-1). Dootrzewnowe podanie tych białek blokuje implantację blastocysty u myszy. (Simon i wsp., 1994 cyt.)

Są poważne dowody wykazujące, że rozpuszczalne czynniki wzrostowe wydzielane przez jajowody i nabłonek macicy kontrolują przedimplantacyjny rozwój zarodka ssaków, przez bezpośredni wpływ na receptory wyrażane na powierzchni zarodka (Pampfer i wsp.,1990 w Vitro Cellular and Developmental Bilogy 26, 944-948). l odwrotnie, rozwijający się zarodek produkuje czynniki wzrostowe, które mogą grać rolę autokrynną lub wpływać na podatność endometrium. Na przykład, u myszy ekspresja LIF (z tkanek matczynych) w nabłonku gruczołowym jest znacząco regulowana w górę w 4 dniu, dokładnie przed implantacją. Ta matczyna ekspresja LIF jest niezbędna do implantacji, od kiedy wiadomo, że u myszy z knock'out-em LIF nie dochodzi do implantacji zarodka, chyba że zostaną przeniesione do matek w stanie pseudociąży. (Steward i wsp., 1992 cyt.).

Wynalazcy rozszerzyli te wyniki na ludzi i wykazali przez RT-PCR, że w ludzkich zarodkach wyrażany jest mRNA kodujący LIF-R, ale nie jest wyrażany LIF. LIF odgrywa rolę w wiązaniu receptora LIF-R o niskim powinowactwie. Wiązanie o wysokim powinowactwie rośnie, gdy kompleks LIF/LIF-R współgra z dodatkowym białkiem gp130, przekazującym sygnał. Zarodki ludzkie również zawierają mRNA kodujący to białko (Sharkey i wsp., 1993, Biology of Reproduction 53, 955-962). Wynalazcy wykazali również, że sekrecja LIF w ludzkim nabłonku wydzielniczym jest regulowana przez hormony steroidowe i osiąga maksimum w fazie lutealnej (około spodziewanego czasu implantacji - Charnock-Jones i wsp., 1994, cyt). Następnie, podanie in vitro LIF ludzkim zarodkom przed implantacją, jak to opisano, poprawia ich rozwój. Wszystkie te przykłady wspierają tezę, że LIF może u ludzi, tak samo, jak u myszy, być istotny w procesie implantacji. Jest jasne, że cytokiny mogą być ważnymi mediatorami wzajemnych związków zachodzących pomiędzy zarodkiem w świetle macicy a endometrium (w obu kierunkach). Niniejszy wynalazek pozwala na użycie transferu genu do zakłócenia lub poprawy tych wzajemnych powiązań, prowadząc do nowych metod antykoncepcji lub, odwrotnie, poprawiającimplantację.

Najnowsze badania nad regulacją parakrynną i autokrynną funkcji rozrodczych są ograniczone do opisowych analiz z powodu braku efektywnych metod modulujących poziom cytokina/receptor. Dowody wykazane w tym zgłoszeniu wskazują, że transfekcja nabłonka macicy in vitro jest możliwa

PL 192 784 B1 do przeprowadzenia. Pozwala to na eksperymentalny wpływ na endometrium i oferuje nowe metody terapeutyczne. Praca poniższa opisuje użycie genu reporterowego do wykazania możliwości wykonania transferu genu in vivow macicy. W praktyce użyty może być gen (lub inny konstrukt DNA) zdolny do zmiany funkcji macicy. Przykłady obejmują antagonistów receptora (np. IL-1Ra, rozpuszczalne receptory dla VEGF), naturalne lub modyfikowane cytokiny i czynniki wzrostowe, inhibitory proteazy lub receptorów steroidowych i różne konstrukty rybozymu i antysensu. Ta praca pokazuje, że geny mogą być przenoszone do endometrium in vivo i mogą znaleźć zastosowanie w różnych chorobach endometrium (i łożyska), na przykład, w poprawie implantacji zarówno u ludzi, jak i zwierząt, zakłóceniu implantacji (tj. antykoncepcji), endometriozie i krwotoku miesiączkowym, hiperplazji (przeroście) i gruczolakoraku.

Rezultaty opisane poniżej zostały uzyskane przy użyciu protokołów opracowanych przez wynalazców. Pokazują one, że konstrukty genowe mogą być przenoszone do endometrium zarówno in vivo, jak i in vitro i te konstrukty podlegają aktywnej transkrypcji (i translacji).

Wynalazek będzie dalej opisany poprzez ilustrujące przykłady i odniesienia do towarzyszących rysunków, w których:

Figury 1A i 1B przedstawiają mikrofotografie skrawków histologicznych endometrium mysiego transfekowanego (A), konstruktem plazmidowym kierującym ekspresją genu reporterowego dla β-galaktozydazy, lub (B) podobnym plazmidem nie posiadającym genu reporterowego. Transfekowane komórki mogą być łatwo zidentyfikowane przez intensywnie ciemne (niebieskie) barwienie cytoplazmy, które jest nieobecne w części B.

Figura 2 jest mikrofotografią komórek ludzkiego endometrium in vitro, które są transformowane tym samym plazmidem co na Figurze 1A - ciemne (niebieskie) barwienie zależne od ekspresji genu reporterowego, jest przede wszystkim związane z pozostałą strukturą pęcherzykową, podczas gdy otaczające komórki wybarwiająsię znacznie słabiej.

Figura 3 jest wykresem słupkowym pokazującym wyniki testu CAT (w zliczeniach na probówkę) dla komórek endometrium skutecznie transfekowanych genem kodującym acetylotransferazę chloramfenikolu (pcDNA3CAT) w porównaniu z komórkami transfekowanymi kontrolnym plazmidem (pcDNA3); i

Figura 4 jest wykresem słupkowym pokazującym wyniki testu lucyferazy (we względnych jednostkach światła) dla komórek endometrium skutecznie transfekowanych genem kodującym lucyferazę (pcDNA3LUC) w porównaniu z komórkami transfekowanymi kontrolnym plazmidem (pcDNA3).

Przykład 1

Myszy

Nierodzące, dojrzałe myszy BALB/cJ były hodowane w świetle (14 godz. jasno: 10 godz. ciemno; światło gasło o 22.00) i przy kontrolowanej temperaturze(22°C) w SmallAnimal House i karmione dietą dla myszy i szczurów (Labsure; Christopher Hill Group, Poole, Dorset, UK). Były one umieszczane na noc z samcami tej samej rasy, które miały podwiązane nasieniowody i były sprawdzane następnego dnia rano w kierunku obecności czopu spermy w pochwie po stosunku. Czas kopulacji był określany na godz. 2.00, czas 0 i 1-y dzień były liczone od dnia, w którym czop spermy był zauważony. Samice po kopulacji były trzymane oddzielnie przed eksperymentem.

Laparotomia była przeprowadzana z użyciem procedur aseptycznych w znieczuleniu Metafanem (metoksyfluoran, C-Vet Ltd., Bury St. Edmunds). Rogi macicy były wyłonione przez cięcie w linii pośrodkowej lub przez nacięcia dwustronne. Iniekcje były wykonane zarówno w koniuszek rogu wpołączeniu jajowodowo-macicznym, jak i w podstawę rogu w połączeniu maciczno-pochwowym. Powtarzane badania wykazały, że ta druga technika zapewnia lepszą metodę podawania, lecz z pewnych względów pierwsza jest preferowana, gdy jest konieczne zminimalizowanie zaburzeń w drogach rozrodczych.

Iniekcje liposomów/DNA (konstrukt pcDNA3, +/- gen reporterowy β-galaktozydazy), nagiego DNA lub roztworu kontrolnego (25-100μΓ) były przeprowadzone przez wprowadzenie koniuszka płaskiego Stratatip'u w podstawę rogu. Roztwór był wcześniej wciągnięty do koniuszka za pomocą aplikatora Travesty'ego, który był również użyty do kontroli powolnej iniekcji roztworu do rogu.

Po iniekcji, nacięcie było zamknięte przy użyciu ciągłego szwu materacowego i myszy pozostawiono do wyzdrowienia w klatkach, dostarczając im wody i pożywienia ad libitum.

PL 192 784 B1

Konstrukty plazmidu

Plazmid opisany w tym zgłoszeniu (na zasadzie przykładu) jest oparty na komercyjnie dostępnym wektorze pcDNA3 (Katalog nr V790-20, lnvitrogen, San Diego, Kalifornia, USA). Plazmid pcDNA3 bez żadnego genu reporterowego był użyty jako kontrola negatywna. Eksperymentalne plazmidy pcDNA3-egal, pcDNA3-CAT i pcDNA-Luc zawierały odpowiednio geny reporterowe β-galaktozydazy, acetylotransferazy chloramfenikolu i lucyferazy. Te plazmidy zawierały następujące elementy genetyczne: gen oporności na ampicylinę, oryginały replikacji ColE1, promotor CMV, (gen reporterowy), bydlęcy hormon wzrostu z dodatkiem miejsca poliA, początek replikacji fl, początek replikacji SV40, gen oporności na neomycynę i SV40 z dodatkiem miejsca poliA w funkcjonalnym związku, takim że gen reporterowy może być ekspresjonowany w komórkach eukariotycznych po wprowadzeniu plazmidu. Plazmid DNA był oczyszczany z E. coli przez lizę zasadową i dalej oczyszczany przy użyciu kolumny jonowymiennej Qiagen (zgodnie z instrukcją producenta).

Wytwarzanie liposomów

Stosowane liposomy były formulacją lipidową DOPSA (trifluorooctan 2,3-dioleiloksy-N-[2(sperminokarboksyamido)etylo]-N-N-dimetylo-1-propanoaminiowy) i DOPE (dioleoilfosfatydyloetanoloamina) (LipofectAMINE; Gibco BRL Paisley, Szkocja) w stosunku wagowym 3:1. Stosowano różne stosunki ilość DNA:liposomy i różne objętości, jak wskazano w tabeli 1. DNA/liposomy mieszano bezpośrednio przed każdym eksperymentem. 10 μl roztworu DNA dodano do 10 μl roztworu lipidów, łagodnie wymieszano i pozostawiono na 15 min. w temperaturze pokojowej. Następnie dodano 80 μl PBS i uzyskano końcowe stężenie DNA i lipidów takie jak podano w tabeli 1. Wytworzony produkt następnie wstrzyknięto do macicy pseudociężarnej myszy (patrz fragment powyżej dla szczegółów dotyczących myszy i chirurgii).

Histochemiczna lokalizacja β-galaktozydazy

Zwierzęta zabijano przy użyciu inhalacji z dwutlenku węgla, wycinano rogi macicy, uwalniano z tłuszczu i krezki. Każdy róg dzielono na trzy skrawki histologiczne, skrawek koniuszkowy i podstawny, po czym szybko zamrażano w ciekłym azocie, i trzymano w temperaturze -70°C przed określeniem ilości zawartej β-galaktozydazy. Środkowy skrawek każdego rogu utrwalano w 1,25% glutaraldehydzie w PBS przez 15 minut, płukano w PBS dwukrotnie i umieszczano w roztworze do barwienia X-gal (1 mg/ml X-gal, 5 mM K3Fe(CN)6, 5 mM K4Fe(CN)6, 2 mM MgCI2, 0,02% NP40 i 0,01% deoksycholanu sodu) na 24 godziny w temperaturze pokojowej. Skrawki przemywano w PBS/3% DMSO (2x5 min.), w 70% etanolu (3 x 5min.) i umieszczano w 100% etanolu. Skrawki zatapiano w żywicy polimetakrylanu glikolu i cięto na 7 μm skrawki i następnie barwiono kontrastowo czerwienią obojętną przed badaniem mikroskopowym.

Wyniki

W poniższej tabeli 1 przedstawiono różne stosowane warunki i wyniki intensywności barwienia skrawków macicy po podaniu kompleksów DNA/liposomy. Wyniki podane w Tabeli 1 wskazują jak istotny jest czas podawania plazmidu DNA. Podanie drugiego dnia daje najlepszy poziom ekspresji, podanie trzeciego dnia daje poziom możliwy do przyjęcia, natomiast podanie czwartego dnia daje wynik bardzo małej ekspresji genu reporterowego, przypuszczalnie, ponieważ komórki endometrium nie wyłapują konstruktu w tym czasie, z przyczyn, które nie są do końca jasne.

PL 192 784 B1

T A BEL A 1

Dzień podania (dzień autopsji)	DNA (Mg/ml)	lipidy (Mg/ml)	objętość iniekcji (Ml)	intensywność barwienia histochemicznego
2(5)	2	20	50	++
3(5)	2	20	50	++
4(6)	2	20	50	-
2(6)	2	20	50	+++
2(5)	8	20	20	++
4(6)	8	20	50	-
4(6)	30	20	50	+
4(6)	2	60	50	-

intensywność barwienia: +++ silna; ++ umiarkowana; + słaba, - brak

Kontrola:

U 6 pseudociężarnych myszy bez iniekcji nie stwierdzono barwienia macicy na aktywność β-galaktozydazy.

U pseudociężarnej myszy (dzień podania 2-gi, dzień autopsji 6-ty), której podano iniekcję z 50 μl pcDNA3 bez β-galaktozydazy (2 μg/ml) i lipidu (20 μg/ml) nie stwierdzono barwienia macicy na aktywność β-galaktozydazy.

Badanie skrawków histologicznych po barwieniu X-gal wykazało, że nabłonek gruczołowy jest silnie wybarwiony, a nabłonek wyściełający jest wybarwiony znacznie mniej silnie. Optymalne barwienie obserwowano u zwierząt transfekowanych 2 μg/ml DNA i 20 μg/ml lipidu podanych w 50 μl drugiego dnia pseudociąży. Na Figurze 1a przedstawiono skrawek histologiczny od takiego zwierzęcia, a na Figurze 1b skrawek kontrolnego zwierzęcia, które otrzymało (w identycznych warunkach) plazmid bez genu β-gal.

P r z y k ł a d 2

Transfekcja pierwotnych hodowli ludzkiego endometrium

Twórcy wynalazku wykazali również, że komórki nabłonkowe ludzkiego endometrium mogą być transfekowane in vitro z wysoką skutecznością. Użyto tego samego plazmidu (pcDNA +/- gen reporterowy β-galaktozydazy) i lipidów jak opisane. Komórki endometrium były przygotowane metodą Smitha i Kelly'ego (Smith i wsp.,1987 Prostaglandins 34, 553-561). Gdy hodowla została założona, zastosowano następujący protokół transfekcji. Każdy ze składników: DNA (2 μg) i liposomy (8 μg) rozpuszczono w 100 iil pożywki bez surowicy (Opti-MEM1 BRL), mieszano i inkubowano w temperaturze pokojowej przez 15 min. Następnie dodano dalsze 800 μl Opti-MEM1. Komórki (w 24-studzienkowych płytkach) przemywano w PBS, a następnie przemywano w Opti-MEM1. Mieszaninę DNA/liposom (0,5 ml) dodano do komórek i inkubowano w 37°C przez 3 godz. w inkubatorze z CO2, a następnie dodano 0,5 ml pożywki hodowlanej zawierającej 20% cielęcej surowicy płodowej. Komórki utrwalono (0,1% aldehydem glutarowym), przemyto i barwiono X-gal w 24 godzinie po transfekcji.

Badanie to wykazuje, że geny mogą być przenoszone do endometrium in vivoi może to znaleźć zastosowanie w wielu zjawiskach zachodzących w endometrium (i w łożysku), np. do poprawy implantacji zarówno u zwierząt, jak i ludzi, do zakłócenia implantacji (tj. antykoncepcji), w endometriozie i krwotokach miesiączkowych, w przeroście i gruczolakoraku.

Uzyskano dodatkowe dane dotyczące transfekcji in vitro oczyszczonych ludzkich komórek nabłonkowych macicy. Są to dane komplementarne do pracy in vivo na myszach i pokazują, że podobne komórki po minimalnym czasie hodowli mogą być skutecznie transfekowane liposomami i DNA używanymi in vivo.

P r z y k ł a d 3

Transfekcja ludzkiego nabłonka in vitro

Ludzkie pierwotne komórki nabłonkowe były izolowane z endometrium i hodowane sposobem według Zhanga i wsp.,(J. Cell Science, 1995; 108; 323-331). Komórki wysiewano na standardowe 6studzienkowe płytki hodowlane do osiągnięcia następnego dnia 50%-owego wzrostu zlewnego. Ko10

PL 192 784 B1 mórki hodowano przez 5 dni, a następnie przesiewano na 24-studzienkowe płytki, do gęstości 60000 komórek na studzienkę. Następnego dnia komórki transfekowano kompleksem DNA/liposom (DNA/LC). Przeprowadzono to w następujący sposób:

Procedura transfekcji

Aparat

LipofectAMINE (Gibco Katalog nr 18324 - 012), Opti-MEM l (Gibco Katalog nr 15985-018)

Płytki hodowlane 24-studzienkowe

Stosowano pożywkę do hodowli komórek opisaną przez Zhanga i wsp. (cyt. powyżej).

Pożywka składała się z DMEM/HEPES, 10% FCS, 30 μg/ml Nabłonkowo-Komórkowego Dodatku Wzrostowego (Sigma Katalog nr E-2759), 90 μg/ml heparyny (Sigma Katalog nr H-3149), 5 μg/ml gentamycyny (Sigma Katalog nr G-1272) i 1 μg/ml fungizonu (Gibco Katalog nr 15290-018). Stosowano również PBS pozbawioną Mg⁺⁺ i Ca⁺⁺ oraz stosowano 2 ml probówki Eppendorfa.

Stosowano dwa różne konstrukty plazmidowe zawierające różne geny reporterowe. pcDNA3CAT uzyskany z lnvitrogen Corporation, zawierał gen reporterowy kodujący enzym acetylotransferazę chloramfenikolu. Drugi plazmid pcD-NA3Iuc zawierał ten sam wektor, ale gen CAT był zastąpiony genem kodującym enzym lucyferazę robaczka świętojańskiego. Wykonanie na dużą skalę wektorów DNA przeprowadza się przy użyciu metody Qiagen midiprep. Jako kontrolę negatywną użyto pcDNA3 niezawierającego genu reporterowego.

Przygotowanie kompleksów DNA/liposom

1) Roztwór A

W probówce Eppendorfa rozcieńczono 1 μg DNA w 100 μl Opti-MEM l. Użyto DNA w końcowym rozcieńczeniu 1 μg/ml w pożywce do transfekcji.

2) Roztwór B

W probówce Eppendorfa rozcieńczono 4 μl LipofectAMINE w 100 μl Opti-MEM. Użyto LipofectAMINE w końcowym rozcieńczeniu 8 μg/ml w pożywce do transfekcji.

3) Połączono dwa roztwory A i B w nowej probówcei łagodnie wymieszano.

4) Inkubowano w temperaturze pokojowej przez 15 min.

Przemywanie komórek

1) Przed transfekcją przemyto warstwę komórek na powierzchni pożywki trzykrotnie w FRESH PBS bez surowicy.

2) Ponownie przemyto warstwę komórek dwukrotnie Opti-MEM l.

Transfekcja

1) Dodano 800 μl (ogółem 1,0 ml) Opti-MEM do każdej probówki zawierającej mieszaninę DNAlipid. Końcowe stężenie DNA wynosiło 1 μg/ml, a lipofectAMINE 8 μg/ml.

2) Pobrano Opti-MEM l znad warstwy komórek.

3) Łagodnie wymieszano mieszaninę DNA/LC i wysiano rozcieńczony roztwór kompleksu do przemytych studzienek, 0,5 ml/24 studzienki.

4) Inkubowano warstwę komórek przez 3 godziny w 37°C w inkubatorze z CO2.

Dalsza hodowla komórkowa

1) 3 godziny później, usunięto transfekowaną mieszaninę i dodano 2 ml pożywki Zhanga do każdej studzienki i dalej hodowano.

Testy ilościowe do 48 godzin po transfekcji komórki były ekstrahowane i stosownie oceniane w kierunku aktywności reporterowej CAT lub lucyferazy.

1. Przemyto komórki trzykrotnie w PBS.

2. Ekstrahowano komórki 300 mikrolitrami buforu Lysis (Promega Katalog nr E - 3871), resztki komórkowe przeniesiono dokładnie do probówki Eppendorfa.

3. Ekstrakt szybko zamrożono w -70°C i przechowywano aż do testu.

4. Celem przeprowadzenia testu, rozmrożono ekstrakt i wirowano przy 13000 g przez 5 minut.

5. Powtórzono cykl mrożenie/rozmrożenie/wirowanie raz jeszcze.

6. Do oceny aktywności genu reporterowego lucyferazy użyto zestawu testowego dla lucyferazy z Tropix (Katalog nr BC100L). Użyto 40 μl każdego ekstraktu na probówkę.

7. Do oceny aktywności genu reporterowego CAT użyto zestawu testowego Quan-t-CAT z Amersham (Katalog nr TRK 1012).

PL 192 784 B1

Wyniki

Pierwotne komórki nabłonkowe endometrium były transfekowane w 24-studzienkowych płytkach, tak jak opisano powyżej. Transfekcję przeprowadzono w potrójnych studzienkach z pcDNA3 (jako kontrola), pcDNACAT i pcDNA3LUC. Po 48 godzinach komórki zbierano i oceniano w kierunku aktywności lucyferazy lub CAT. Enzym CAT katalizuje transfer grupy acetylowej z acetylokoenzymu A na chloramfenikol. Użycie acetylokoenzymu A zawierającego atom trytu doprowadziło do przeniesienia radioaktywności na chloramfenikol. Aktywność CAT w próbce jest wprost proporcjonalna do ilości wyprodukowanego chloramfenikolu znakowanego trytem. Wyniki wyrażono w cpm na probówkę. Standardową krzywą można uzyskać stosując bufor do lizy zawierający znane ilości czystego CAT.

Wyniki przedstawiono na Figurze 3, która jest wykresem słupkowym przedstawiającym średnią ± SEM z potrójnych oznaczeń dla typowego doświadczenia. Dane są przedstawione w formie liczbowej, jak zostało pokazane poniżej, z aktywnością CAT w komórkach traktowanych pcDNA3CAT prawie 6 razy wyższą niż w próbkach kontrolnych, co wskazuje na skuteczną transfekcję komórek endometrium.

pcDNA3 pcDNA3CAT

710 4480

616 4134

662 3234 średnia 662±271 3951±372

W teście dla lucyferazy, ekstrakt komórkowy zawierający lucyferazę miesza się z substratem, lucyferyną, co wywołuje emisję światła. Intensywność sygnału świetlnego jest proporcjonalna do obecności w ekstrakcie enzymu lucyferazy i może być zmierzona luminometrem. Wstępne wyniki zostały podane we względnych jednostkach światła.

Wyniki przedstawiono na Figurze 4, która jest wykresem słupkowym przedstawiającym średnią ±SEM z potrójnych oznaczeń dla typowego doświadczenia. Dane są przedstawione w formie liczbowej, jak zostało pokazane poniżej. Sygnał z komórek traktowanych pcDNA3LUC był ponad 30 razy silniejszy niż sygnał tła próbek kontrolnych, co wskazuje na skuteczną transfekcję komórek endometrium.

Przykłady możliwych zastosowań transferu genu do endometrium

Co najmniej siedem różnych typów konstruktów genetycznych może być transfekowanych do endometrium w celu osiągnięcia wielu różnych efektów.

1) Nadmierna ekspresja cytokin i czynników wzrostu

Są to pojęciowo najprostsze typy konstruktów projektowane dla uzyskania nadmiernej ekspresji w komórkach nabłonkowych macicy cytokin lub czynników wzrostu. Przykładami cDNA właściwych do uzyskania nadmiernej ekspresji są te, które kodują LIF, VEGF, EGF, CSF, TNF, amfiregulinę, różne interleukiny i czynniki stymulujące kolonie. Wykazano, że są one naturalnie ekspresjonowane w endometrium i wydaje się, że są istotne w regulacji funkcji endometrium. (Stewart i wsp., nature, 359. 7679; Charnock-Jones i wsp., 1994, Journal of Reproduction and Fertility, 101, 421-426; CharnockJones i wsp., 1993, Biology of Reproduction, 48,1120-1128; Das i wsp., 1995, Molecular Endocrinology, 9, 691-; Tabibzadeh (1994, Human Reproduction Update, 9, 947-967) był publikowany w obszernym przeglądzie na ten temat. Każdy z tych czynników wpływa na inny aspekt funkcji rozrodczej, wtym na implantację, rozwój naczyń krwionośnych i biologię leukocytów. Stąd też możliwe wskazania do podawania takich konstruktów obejmują potrzebę poprawy płodności, zwłaszcza gatunków zwierząt domowych, lub antykoncepcji u ludzi i zwierząt domowych, jak również leczenie różnorodnych zaburzeń miesiączkowania u ludzi.

Przykład doświadczenia zaplanowanego w celu poprawy płodności inwentarza

Wykazano, że LIF jest niezbędny do przebiegu zjawiska implantacji (Stewrt i wsp., 1992, cyt. powyżej). Czynnik ten jest produkowany przez endometrium w trakcie implantacji. Jest możliwe, że ugatunków, u których częstość występowania utraty zarodków jest wysoka, zwiększenie poziomu ekspresji LIF przez endometrium w trakcie implantacji może zmniejszyć częstość strat zarodków. Tak więc transfekcja w czasie implantacji konstruktu genetycznego zaprojektowanego do kierowania syntezą LIF przez endometrium może poprawić współczynnik płodności u tych gatunków. Transfekowany do endometrium konstrukt powinien zawierać odpowiednie sekwencje regulatorowe zapewniające produkcję białka LIF w korzystnym momencie. Należy się spodziewać, że będzie to osiągnięte przez użycie promotora z genu LIFgatunków, o których mowa.

PL 192 784 B1

W terapiach planowanych do złagodzenia zaburzeń miesiączkowych u kobiet, również można wykorzystywać transfer genu do endometrium. Przykładem może być zmiana rozwoju naczyń krwionośnych w endometrium przez transfekcję genu kodującego naczyniowy czynnik wzrostu, na przykład VEGF. Lokalny wzrost produkcji VEGF jak można się spodziewać, zwiększy rozwój naczyń włosowatych i przez to spowoduje rozcieńczenie endometrium. Jednocześnie, większy poziom VEGF może ułatwiać naprawę naczyń włosowatych po miesiączce i przez to zmieniać schemat krwawień u pacjentek leczonych tym typem konstruktu.

2) Nadmierna ekspresja receptorów

Rosnąca ilość i różnorodność receptorów wyrażanych przez nabłonek endometrium, jak można przewidywać, będzie mieć znaczące biologiczne konsekwencje. Rodzaje receptorów, które mogą podlegać nadmiernej ekspresji, obejmują, ale bez ograniczeń, receptory dla cytokin i dla czynników wzrostowych, na przykład: EGF, TGFa, VEGF, różnorodne czynniki stymulujące kolonie i interleukiny. Receptory dla hormonów steroidowych są również odpowiednie do ekspresji w komórkach nabłonkowych. Można oczekiwać, że taka transfekcja będzie użyteczna, gdy zachodzi potrzeba poprawienia płodności, zapobieżenia zapłodnieniu, leczenia zaburzeń miesiączkowania, jak również wyjaśnienia funkcji receptorów sierocych (receptory sieroce to takie receptory, których ligandy są obecnie niezidentyfikowane). Receptory sieroce reprezentują obszar znacznego zainteresowania ze strony przemysłu farmaceutycznego, ponieważ scharakteryzowanie liganda może prowadzić do generacji nowych leków.

Coraz powszechniej przyjmuje się, że rozwój endometrium jest złożonym procesem, w którym pośredniczą interakcje między wieloma cytokinami i ich receptorami, i że w stymulującym działaniu steroidów jajnikowych często pośredniczą te cytokiny. Szczególnie, zostało wykazane (Nelson i wsp., 1992, Endocrinology, 131,1657-1644), że TGFa jest potencjalnym mediatorem działania estrogenu w macicy myszy. Tak więc można się spodziewać, że transfekcja konstruktu kierującego syntezą tego czynnika będzie pobudzała wzrost endometrium i przez to zwiększała płodność w sytuacjach, gdzie endometrium nie rozwijało się właściwie. Podobnie, czynnik ten może brać udział w pobudzaniu naprawy powierzchni nabłonkapo miesiączce i przez to może być użyteczny w leczeniu krwotoków miesiączkowych.

Jest wiele receptorów w nadrodzinie receptorów hormonów steroidowych, dla których nie są znane obecnie ligandy. Transfekcja takich cDNA do endometrium może przynieść znaczną korzyść w wyjaśnieniu biologicznej funkcji tych receptorów, może znaleźć zatem zastosowanie w poszukiwaniu nowych środków farmaceutycznych, które działają na te receptory, (Evans, 1988, Science 240, 889-895).

3) Transfekcja konstruktów zaprojektowanych do blokowania lub zabezpieczania przed działaniem cytokinowych czynników wzrostu i innych hormonów

Transfekcja naturalnych antagonistów dla cytokin i czynników wzrostu otwiera możliwość modulowania funkcji endometrium. Przykładem takich antagonistów może być antagonista receptora dla interleukiny 1 (Hannum i wsp. 1990, Nature 343, 336). Jak wykazano, przez podawanie tego białka można zahamować ciążę u myszy (Simon i wsp., 1994, Endocrinology 134, 521-528). Inni naturalni antagoniści cytokin i czynników wzrostowych obejmują naturalne rozpuszczalne receptory. Rozpuszczalne receptory zostały opisane w różnorodnych systemach czynnik wzrostu/cytokina. Na przykład, TNF (Engelmann i wsp., 1990, J. Biol Chem. 265, 14497-14504), FGF (Givol i wsp., 1992, FASEB Journal, 6, 3362-3369), PDGF (Tiesman&Hart, 1993, J. Biol. Chem. 268, 9621-9628) i IL-6 (Novick iwsp., 1989, J. Exp. Med. 170, 1409-1414). Częstą cechą jest to, że wewnątrzkomórkowa domena receptora wiążąca ligandy jest uwalniana z komórki jako wolny rozpuszczalny czynnik. Uzyskuje się to albo przez proteolizę, albo przez alternatywne połączenia, które generują cząsteczkę białkową skróconą pozbawioną śródbłonowych i wewnątrzkomórkowych domen. Kendall i Thomas (1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90,10705-10709) opisali rozpuszczalny wariant receptora flt dla VEGF. To białko jest zdolne do blokowania działania VEGF in vitro. Wyizolowaliśmy trzy dalsze cDNA kodujące dodatkowe rozpuszczalne warianty (patrz PCT/Gb95/01213). Stosowanie tych naturalnych czynników ma wiele korzyści w porównaniu z innymi antagonistami (np. przeciwciałami anty-VEGF). Gdy występują one naturalnie w organizmie, można oczekiwać, że nie będą wywoływały odpowiedzi immunologicznej i będą dobrze tolerowane. Również gdy pochodzą od receptorów błonowych, charakterystyka ich wiązania będzie bardzo podobna, a zatem mogą bardzo skutecznie konkurować o ligand. Jest możliwe, że naturalnie występują inne receptory rozpuszczalne lub można je konstruować in vitro.

PL 192 784 B1

Jest również prawdopodobne, że jeżeli była wyrażana domena wiążąca ligand, jednego z receptorów z rodziny receptorów dla hormonów steroidowych, może ona działać jako główny receptor negatywny i może konkurować o ligand, jeżeli była wyrażana wewnątrz komórki na odpowiednio wysokim poziomie. Ewentualnie, do blokowania transkrypcji genu można stosować nie-aktywny, lecz wiążący DNA „receptor.

To zastosowanie może być użyteczne do antagonizowania działania naturalnych steroidów włącznie z tymi, które są jeszcze nie zidentyfikowanymi ligandami receptorów sierocych (Pemrick iwsp., 1994, Leukemia, 8, 1797-1806). Mogą być również skonstruowane i transfekowane receptory pozbawione zdolności przekazywania sygnału z rodziny receptorów o siedmiu domenach śródbłonowych.

Rozpuszczalny antagonista receptora dla interlukiny-1 (Eisenberg i wsp., 1990, Nature 343, 341), jak wykazano, antagonizuje działanie IL-1 in vivo (Simon i wsp., Endocrinology 134, 521-528). Oczekuje się więc, że taka transfekcja endometrium konstruktem cDNA zaprojektowanym do kierowania syntezą antagonisty zablokuje ciążę u myszy.

Inne czynniki, które prawdopodobnie hamują czynność czynników wzrostu lub cytokin, obejmują rozpuszczalne odmiany naturalnych receptorów, na przykład rozpuszczalna odmiana receptora VEGF dla flt została opisana przez Kendalla&Thomasa (1993, cyt. powyżej), jak również przez Boocock'a i wsp. (1995, J. Natl. Cancer Ins. 87, 506-516). Można się spodziewać, że miejscowa produkcja takich czynników antagonizuje czynność VEGF i może prowadzić do pożytecznego terapeutycznego zastosowania w sytuacjach, gdzie dochodzi do hiperproliferacji komórek śródbłonka, na przykład, w rozmaitych zaburzeniach miesiączkowych, gdzie jest korzystna redukcja gęstości naczyń włośniczkowych w endometrium. Może to obejmować nowotwory złośliwe.

4) Zastosowanie metod antysensowych w zapobieganiu miejscowej produkcji specyficznych białek (lub enzymów)

Alternatywnym podejściem do blokowania działania cytokin, czynników wzrostowych i hormonów może być zastosowanie technologii antysensu lub rybozymu do blokowania zarówno produkcji ligandów, jak i produkcji receptorów w odpowiednich komórkach (James, 1991 Antiviral Chemistry and Chemotherapy, 2, 191-214; Albert & morris, 1994 Trends in Pharmacological Sciences 15, 250 -254).

Technologia antysensu polega na przyłączeniu tzw. nukleotydów lub polinukleotydów antysensownych do komórkowego mRNA. Łączenie to zapobiega translacji tego mRNA i przez to zmniejsza ilość odpowiednich białek produkowanych przez komórkę. W tym sposobie mogą być korzystnie zastosowane zarówno syntetyczne oligonukleotydy jak i polirybonukleotydy. Należy oczekiwać, że liposomy pośredniczące w transfekcji oligonukleotydów lub liposomy pośredniczące w transfekcji konstruktów DNA będą specyficznie i selektywnie zmniejszać redukcję białka w transfekowanych komórkach. Rybozymy również zabezpieczają przed produkcją białka przez selektywne rozszczepianie RNA kodującego specyficzne białko, o którym mowa. Mogą być również transfekowane jako polirybonukleotydy lub jako konstrukty DNA, które kierują syntezą tych polinukleotydów (patrz James 1991, i Albert & Morris 1994, oba powyżej cytowane). Można wskazać następujący przykład takiego zastosowania rybozymu antysensowego do zapobiegania płodności. Wykazano, że LIF jest niezbędny do procesu implantacji w ciąży ssaków (Stewart i wsp. 1992, uprzednio cytowane). Tak więc należy oczekiwać, że transfekcja zarówno oligonukleotydów, jak i konstruktu DNA kierującego syntezą antysensowych polirybonukleotydów, a także rybozymu skierowanego przeciwko LIF mRNA, zapobiegnie syntezie tego czynnika. Brak więc tego czynnika może prowadzić do niepowodzenia implantacji, a tym samym do blokowania zapłodnienia.

Podobnym zastosowaniem może być użycie do blokowania naczyniowego czynnika wzrostu, na przykład VEGF, co może zapobiegać proliferacji komórek śródbłonka koniecznych do wzrostu guza. Tak więc ten typ terapii może być szczególnie korzystny w leczeniu nowotworów złośliwych.

5) Miejscowa produkcja immunoglobulin i ich fragmentów

Możliwe jest stosowanie nowoczesnej technologii rekombinowanego DNA do wyprodukowania przeciwciał jednołańcuchowych, które mogą mieć identyczną charakterystykę wiązania jak całe przeciwciało monoklonalne, z którego pochodzą. Takie przeciwciała jednołańcuchowe mogą być korzystnie wyrażane w bakteriach (Hei wsp., 1995, Immunology 84, 662-668). Jest możliwe w zasadzie zbudowanie konstruktu, który może kierować ekspresją przeciwciała jednołańcuchowego i wyrażać je w komórkach nabłonkowych. Jeśli zachodzi to in vivow endometrium, można oczekiwać, że przeciwciało jednołańcuchowe kierowane przeciwko hormonom steroidowym może łączyć się ze steroidami ihamować ich działanie w komórkach nabłonkowych. Przykładem takiego przeciwciała może być po14

PL 192 784 B1 jedynczy łańcuch przeciwciała pochodzący z antyprogesteronowego monoklonalnego przeciwciała DB3 (He i wsp.,1995, cytowane powyżej). Jeśli to przeciwciało jest wydzielane do światła macicy, również może wiązać progesteron i może działać w każdym z kompartmentów macicy. Przeciwciało kierowane przeciwko czynnikom wzrostowym i cytokinom, znane jako aktywne w endometrium, może blokować ich funkcję, jeśli jest produkowane miejscowo w taki sposób.

Dodatkowym zastosowaniem miejscowej produkcji pojedynczych łańcuchów przeciwciał może być zapobieganie lub leczenie chorób przenoszonych drogą płciową. W tej sytuacji przeciwciała kierowane w ten sposób przeciwko czynnikom wywołującym (na przykład: wirus brodawczaków, HIV, chlamydia) mogą być wydzielane do światła macicy i w ten sposób mogą zapobiegać infekcjom wywoływanym przez dany czynnik. Uważa się, że przeciwciała kierowane przeciwko spermie lub komórkom jajowym mogą mieć znaczenie dla antykoncepcji.

6) Immunizacja czynna w celu osiągnięcia odporności śluzówkowej

Dodatkowym sposobem, który można stosować w celu osiągnięcia miejscowej odporności, może być zaprojektowanie konstruktu, który może kierować wydzielaniem antygenu do światła. Może to wywołać miejscową odpowiedź immunologiczną i w tym miejscu może być osiągnięta specyficzna odporność śluzówkowa. Od wielu lat wiadomo (Howe, 1967 Journal of Reproduction and Fertility 13, 563-566), że światło macicy zawiera wiele leukocytów. Antygen produkowany przez transfekcję komórek endometrium może być wychwytywany przez te leukocyty, a następnie prezentowany celem wywołania miejscowej odpowiedzi odpornościowej. Podanie antygenów do światła jelita powoduje taką odporność, która w niektórych przypadkach jest bardzo skuteczna (na przykład szczepienie przeciwko poliomyelitis).

7) Blokowanie miejsca przyczepu patogenu

Przyczepienie patogenu do powierzchni błony śluzowej jest często koniecznym warunkiem rozpoczęcia zakażenia. Blokowanie przyczepienia patogenu do tych miejsc może reprezentować sposób zabezpieczenia ludzi i zwierząt przed chorobami, szczególnie chorobami przenoszonymi drogą płciową. Dotyczy to nie tylko patogenów bakteryjnych (takie jak niektóre szczepy patogenne E. coli i N. gonorrhoea), ale również wirusowych. Wiele wirusów podczas infekcji komórki przyczepia się do powierzchni komórki poprzez „receptor”. Należy się spodziewać, że miejscowa produkcja rozpuszczalnych receptorów będzie konkurować z cząsteczkami powierzchniowymi komórki i w ten sposób zapobiegać infekcji. Jednocześnie nasycenie miejsc powierzchniowych komórki naśladowcami wirusów, (które działają jako „ligandy” wirusowe) może również blokować infekcję, tak jak miejscowa produkcja specyficznych immunoglobulin lub skuteczne wiązanie ich części.

Claims (13)

1. Zastosowanie kwasu nukleinowego kierującego ekspresją przynajmniej części funkcyjnej jednego z następujących białek: interleukiny, białaczkowego czynnika hamującego (LIF), naczyniowo-śródbłonkowego czynnika wzrostu (VEGF), naskórkowego czynnika wzrostu (EGF), naskórkowego czynnika wzrostu wiążącego heparynę (HBEGF), czynnika wzrostu wiążącego insulinę l i II (IGF-I i IGF-II), amfireguliny, czynnika stymulującego kolonie (CSF), czynnika martwicy nowotworu (TNF), czynnika wzrostu hepatocytów (HGF) i czynnika wzrostu fibroblastów (FGF) albo polipeptydów HIV, wirusa brodawczaków, Chlamydia lub N. gonorrhoea albo antagonisty dla cytokiny lub antagonisty dla czynnika wzrostu, receptora dla czynnika wzrostu, cytokiny lub hormonu steroidowego, polipeptydu wykazującego miejscowe działanie immunologiczne, do wytwarzania leku do transfekowania komórek dróg rozrodczych kobiety.

2. Zastosowanie według zastrz.1, do wytwarzania leku przeznaczonego do wprowadzania do nabłonka gruczołowego endometrium.

3. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że kwasem nukleinowym jest DNA.

4. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że lek jest przeznaczony do stosowania w okresie następującym po owulacji, do i włącznie z momentem, kiedy jest osiągnięty maksymalny poziom progesteronu we krwi.

5. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że nośnikiem kwasu nukleinowego są liposomy, wirusy lub inne cząstki stanowiące nośnik.

6. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że kwas nukleinowy jest w postaci plazmidu lub innego konstruktu.

PL 192 784 B1

7. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że kwas nukleinowy zawiera promotor połączony funkcjonalnie z sekwencją, która ulega transkrypcji w komórkach eukariotycznych.

8. Zastosowanie według zastrz. 7, znamienne tym, że promotor jest indukowalny.

9. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że sekwencja kwasu nukleinowego zawiera część połączoną funkcjonalnie w orientacji antysensowej z promotorem.

10. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że kwas nukleinowy kieruje ekspresją antagonisty receptora dla interleukiny-1 lub antagonisty rozpuszczalnego receptora dla transformującego czynnika wzrostu (TGF)a, czynnika wzrostu fibroblastów (FGF), płytkowego czynnika wzrostu (PDGF), interleukiny-6, naczyniowo-śródbłonkowego czynnika wzrostu (VEGF) lub czynnika wzrostu hepatocytów (receptora „Met).

11. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że kwas nukleinowy kieruje ekspresją przynajmniej części funkcyjnej receptora: EGF, transformującego czynnik wzrostu (TGF)a lub VEGF.

12. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że kwas nukleinowy kieruje ekspresją przynajmniej części funkcyjnej antygenu patogenu.

13. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że kwas nukleinowy kieruje ekspresją immunoglobuliny lub jej funkcjonalnej części.