PT96134B - Processo de obtencao de mutantes da oncostatina m - Google Patents

Description

MEMóRIA DESCRITIVA

- Introdução □ presente inventa dirige-se aos mutantes e análogos da oncostatina M possuindo bioactividade da oncostatina M, incluindo mutantes por delecção, substituição, inserção e processamento. Os mutantes da oncostatina M do invento podem ser úteis na indução de respostas biológicas induzidas pela oncostatina M, numa extensão maior ou menor do que a oncostatina 1*1 nativa. 0 invento é descrito por meio de exemplos nos quais se preparam e caracterizam vários mutantes da oncostatina M.

- Antecedentes do Invento

A oncostatina M, originalmente identificada pelos seus efeitos inibidores sobre as linhas de células tumorais humanas, foi isolada pela primeira vez a partir de células do linfoma histiocítico humano, induzidas pelo 13-acetato 12-miristato de forbol (PMA) (Zarling e col., 1986, Proc Natl. Acad. Sei. USA 83: 9739-9743) e dos linfócitos T activados (Brown e col., 1987, J. Immunol. 139: 2977-2983). A molécula é uma proteína estável aos ácidos e ao calor, consistindo numa única cadeia polipeptídica de I*l_r = 28 000. Tal como outros reguladores do crescimento de ocorrência natural, a oncostatina 1*1 exibe várias actividades biológicas. A inibição do crescimento é observada em algumas, mas não em todas, as linhas de células tumorais humanas. Em contraste, o crescimento de alguns fibroblastos normais, tais como os fibroblastos do prepúcio humano ou células WI-38, é estimulado por exposição à oncostatina 1*1 (Zarling e col., 1986, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 83: 9739-9743).

gene da oncostatina 1*1 já foi isolado e sequenciado e, recentemente, foi expressa em células de mamífero uma forma activa da oncostatina M recombinante (pedido dos Estados Unidos copendente nS de série 144 574, depositado em 15 de Janeiro de 1988, que é aqui incorporado como referência na sua globalidade).

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A forma madura da oncostatina IM é uma gl icoproteína contenda 228 aminoácidos, cinco dos quais são resíduos cisteína. A proteína tem um domínio do terminal carboxi extremamente hidrofílico. Embora a oncostatina IM não esteja estruturalmente relacionada com outras citoquinas conhecidas, o seu ARNm contém uma região rica em AU na sua extremidade 3' não traduzida. Esta região na mensagem da oncostatina IM é homóloga à de muitas citoquinas, linfoquinas e outras moléculas reguladoras do crescimento, sugerindo um funcionamento comum da expressão do gene de regulação. Encontrou-se um receptor celular da oncostatina IM em várias linhas de células de mamíferos. A molécula major do receptor da oncostatina IM é uma proteína específica com IM_r = 150 000-160 000 (Linsley e col. 1989, J. Biol. Chem. 264: 6528-6532) .

- Sumário do Invento presente invento dirige-se a novas composições compreendendo mutantes por delecção, processamento, inserção e/ou substituição da oncostatina IM, bem como aos seus derivados e fragmentos. 0 invento também se refere à expressão dos mutantes da oncostatina IM em sistemas recombinantes. Também são fornecidas composições possuindo a estrutura secundária da região de ligação da oncostatina IM, que são capazes de se ligar, especif icamente, ao receptor da oncostatina IM. Os mutantes da oncostatina IM podem ser preparados por transformação de uma célula hospedeira com um vector de expressão compreendendo a sequência de ADN que codifica o polipéptido mutante da oncostatina IM desejado, o crescimento da célula hospedeira transformada, para expressar a sequência de ADN exógena, e a recuperação do polipéptido mutante da oncostatina IM, resultante do lisado celular ou do meio de crescimento condicionado. 0s polipéptidos mutantes da oncostatina IM podem possuir actividade biológica alterada, comparados com a oncostatina IM natural, particularmente actividade inibidora do crescimento. As composições do invento podem ser úteis, inter alia, na modulação da proliferação de células neoplásicas.

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-44 - Breve Descrição das Figuras

Fig. 1 - Representação esquemática da sequência de aminoácidos e das regiSes -funcionais da oncostatina M. Os aminoácidos são designados pelo código de uma letra padrão.

Fig. 2 - Actividade inibidora do crescimento de mutantes da oncostatina M por delecção do terminal C.

Fig. 3 - Actividade inibidora do crescimento da cisteína em relação a mutantes serina da oncostatina M.

- Descrição Detalhada do Invento presente inventa dirige-se aos mutantes da oncostatina M que retêm a bioactividade da oncostatina ΙΊ. 0 invento baseia-se, em parte, na elucidação dos domínios -funcionais da oncostatina M, essenciais, e na verificação de que certas mutaçães podiam não só conservar, mas também, nalguns casos, melhorar significativamente, a actividade biológica. 0 invento é ilustrado por meio de exemplos nos quais se preparam e caracterizam vários

polipéptidos	mutantes	da	oncostat i na	M	por delecção,
processamento,	inserção	e	substituição,	usando técnicas	de
expressão e de	mutagénese	de	ADN recombinante.

Numa concretização específica, preparam-se os mutantes por delecção, da oncostatina M, dos quais todo ou parte dos 42 aminoácidos do terminal carboxi da oncostatina nativa foram removidas. Qualquer dos aminoácidos, desde o resíduo na posição 186 inclusivé, até ao resíduo do terminal carboxi, na posição 227, inclusivé, na estrutura da oncostatina M (Fig. 1), pode ser deleccionado para dar mutantes biologicamente activos da oncostatina M. Estes mutantes por delecção da oncostatina M, não retêm apenas actividade biológica, mas muitos deles são significativamente mais activos do que as espécies nativas da oncostatina ΙΊ.

Noutra concretização, preparam-se mutantes por substituição, da oncostatina M, nos quais pelo menos um dos resíduos cisteína da oncostatina M nativa foi substituído por um aminoácido diferente da cisteína, preferivelmente pela serina. Os estudos de

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mutagénese de substituição realizados pelos requerentes revelaram que, das duas ligações dissul-feto presentes na estrutura secundária da oncostatina 1*1 nativa, apenas a que se situa entre os resíduos de cisteína 49 e 167 é necessária para a bioactividade da oncostatina 1*1. Em consequência, uma vez que a eliminação da ligação dissul-feto entre as cisteínas nas posições de resíduos 6 e 127 não é incapacitante -funcionalmente, os mutantes da oncostatina 1*1 incapazes de -formar aquela ligação dissul-feto são ainda polipéptidos biologicamente activos e moduladores -funcionais do crescimento. Tal como se descreve mais completamente nos exemplos que se seguem, tais mutantes por substituição, da oncostatina 1*1, bioactivos, podem ser preparados substituindo um ou ambos os resíduos de cisteína que participam nesta ligação dissul-feto não essencial. Adicionalmente, o resíduo cisteína na posição 80 pode ser substituído, sem sacri-ficar a actividade biológica. Os mutantes por substituição, da oncostatina 1*1, do invento, podem possuir vantagens em relação à oncostatina 1*1 nativa, em relação à sua preparação, -formulação em composições -farmacêuticas e/ou capacidade de realizar a resposta biológica desejada. Por exemplo, tais mutantes por substituição, da oncostatina 1*1, podem ser concebidos por engenharia de modo a minimizar, ou mesmo eliminar, a possibilidade de mistura da ligação dissul-feto e quaisquer distorções estruturais secundárias resultantes.

As concretizações acima mencionadas, e outras, do presente invento são descritas por meio dos exemplos seguintes que são representativos das investigações e constatações da requerente no que se re-fere à preparação e uso dos mutantes de oncostatina M do invento. Como consequência destas investigações e constatações vários aspectos da estrutura da oncostatina 1*1 que têm de ser ou devem ser mantidos, de modo a preservar a integridade -funcional •foram já identificados e devem ser considerados quando se preparam os mutantes da oncostatina 1*1 do invento. A este respeita, existem ao longo do polipéptido da oncostatina 1*1, sequências -funcionalmente importantes, e estas não estão

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c. - _? //// Γ*2Τ , -3 isasrssesíjefe —6— confinadas a um sá domínio. Por exemplo, a delecção por varrimento (scanning) e a mutagénese de inserção identificam os resíduos de aminoácidos 22-36 e 44-77 como sendo essenciais para a actividade biológica. Igualmente, a delecção dos resíduos do terminal C até á posição 186, não destrói a actividade biológica, mas os mutantes sem os aminoácidos 185 a 18S não apresentam actividade. Outras sequências importantes para as actividades de ligação ao receptor e inibição do crescimento, da oncostatina 1*1, incluem os resíduos 118-121 e 178-181, podendo estas sequências ser essenciais para o processamento e/ou secreção, correctas, da oncostatina 1*1 e dos mutantes da oncostatina 1*1, visto que os mutantes da oncostatina 1*1 a quem faltam estas sequências não puderam ser detectados. De modo semelhante, a manutenção de um resíduo asparagina na posição 71, pode ser necessária para se ter uma bioactividade e/ou secreção completas em células de mamíferos A inserção de dois resíduos glicina em três domínios alfahelicoidais preditas, parece não influenciar significativamente a actividade biológica. Prevê-se que os resíduos glicina acorram com baixa frequência em hélices alfa, o que sugere que as glicinas adicionais não quebram a conformação bioactiva ou que qualquer destas quebras é tolerada ao nível funcional.

Ocorre uma região fortemente anfifílica no terminal C da oncostatina 1*1, entre C167 e o local de clivagem do péptido em R196. Substituindo as glicinas por fenilalaninas, nas posições 176 e 184, destrói-se a actividade, mas substituindo as glicinas por histidinas, nas posições 171, 174 e 178, não se afecta a função biológica. A perda de actividade resultante da substituição da glicina por fenilalanina não pode ser explicada como resultando somente das alterações do carácter anfifílico desta região. Se este domínio tiver uma conformação em hélice, a substituição da própria glicina poderia, possivelmente, quebrar a estrutura da hélice naquelas posições.

Pode existir uma associação física estreita dos terminais amino e carboxi, como sugerido pelo bloqueamento dos epítopos do

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-7terminal amino em alguns dos mutantes por delecção carboxi, mas não em todos.

□s mutantes da oncostatina M do invento e os seus análogos podem ser preparados, portanto, por modificação do próprio polípéptido da oncostatina M nativa, por meio de técnicas de ADN recombinante, e por técnicas de síntese química, tal como síntese peptídica em -fase sólida.

De acardo com o invento em questão, proporcionam-se novas construçães de ADN e novas composiçães polipeptídicas possuindo pelo menos uma das actividades da oncostatina Μ. A quantidade absoluta de actividade pode ser superior ou inferior à da oncostatina oncostatina oncostatina act ividade delecção, da da do

M nativa. Os polipéptidos possuindo M incluem proteínas mutantes por M, nos quais substancialmente toda a região terminal C foi deleccionada, bem como proteínas mutantes que têm a mesma estrutura secundária do local de ligação da oncostatina M nativa. As construçães plasmídicas compreendendo sequências de ADN codificando os polipéptidos desejados, que têm actividade da oncostatina Μ, podem ser usados para transformar uma célula hospedeira, a qual é cultivada de modo a expressar o polípéptido desejado. A célula hospedeira transformada é, em seguida, cultivada, de modo a exprimir a sequência de ADN inserida. A célula hospedeira pode ser uma célula eucariótica ou uma procar iót ica.

A oncostatina humana tem a seguinte sequência de aminoácidos:

20 30

A-A-I-G-S-C-S-K-E-Y-R-V-L-L-G-Q-L-Q-K-Q-T-D-L-M-Q-D-T-S-R-L40 50 60

L-D-P-Y-I-R-I-Q-G-L-D-V-P-K-L-R-E-H-C-R-E-R-P-G-A-F-P-S-E-E70 80 90

T-L-R-G-L-G-R-R-G-F-L-Q-T-L-N-A-T-L-G-C-V-L-H-R-L-A-D-L-E-Q71 944

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100 110 120

R-L-P-K-A-B-D-L-E-R-S-G-L-N-I-E-D-L-E-K-L-B-M-A-R-P-N-I-L-G130 140 150

L-R-N-N-I-Y-C-M-A-B-L-L-D-N-S-D-T-A-E-P-T-K-A-G-R-G-A-S-B-P160 170 180

P-T-P-T-P-A-S-D-A-P-Q-R-K-L-E-G-C-R-F-L-H-G-Y-H-R-F-H-H-S-V190 200 210

G-R-V-F-S-K-W-G-E-S-P-N-R-S-R-R-H-S-P-H-Q-A-L-R-K-G-V-R-R-T220 227

R-P-S-R-K-G-K-R-L-M-T-R-G-B-L-P-R

Usam-se as abreviaturas de uma letra para os aminoácidos e estas têm os seguintes signif içados :

A = alanina; R = arginina; N = asparagina; D = ácido aspártico; C = cisteína; Q = glutamina; E = ácido glutãmico; G = glicina; H=histidina; I = isoleucina; L = leucina; K = lisina;

M = metionina; F = -feni lalanina; P = prolina; S = serina;

T = treonina; W = tripto-fano; Y = tirosina; e V = valina.

A oncostatina M é ainda caracterizada por possuir um peso molecular de cerca de 32-36 KD, tal como determinado por electro-forese em gel de poliacrilamida, sob condições redutoras ou não redutoras. As preparações aetivas de oncostatina M isolada, contêm uma mistura de manose elevada e de oligossacãrido ligados por N, complexo. Contudo, as preparações não glicosadas de oncostatina M retêm actividade moduladora do crescimento celular.

A oncostatina M é também caracterizada pela sua actividade em relação a várias estirpes celulares. A oncostatina M estimula a proliferação dos fibroblastos humanos normais, como exemplificado pelas células WI38 e WI26, e inibe a proliferação

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de células tumorais como a A375 , HBT1O, A549 e SK-MEL28, e pode aumentar □ crescimento das células -formadoras de colónias da medula óssea normal. Tem, contudo, -falta de actividade citotóxica contra os fibroblastos humanos WI26 e WI38, e as células L929 de ratinho, que são sensíveis ao -factor de necrose tumoral, e contra uma linha de células de tumor humano sensível ao $-interferão. A oncostatina M não inibe a proliferação dos linfócitos T humanos normais e não inibe a formação de colónias granulocíticas/mielocíticas a partir de células da medula óssea em concentraçães de até 100 unidades GIA/ml. Mais ainda, não suprime as respostas citotóxica ou proliferativa de células T humanas, em reacçães de cultura de leucócitos mistos (MLC) a concentraçães de 500 unidades GIA/ml. A oncostatina M é estável aos ácidos e bases, moderados, e ao tratamento térmico a 56°C.

□s polipéptidos deste invento incluem vários grupos de polipéptidos tendo, cada um, uma característica comum, sendo os polipéptidos caracterizados por terem pelo menos uma característica da oncostatina M. Os grupos têm as características comuns de serem mutantes por delecção, mutantes por processamento ou mutantes por substituição, da oncostatina M, ou polipéptidos que têm a mesma estrutura secundária da região de ligação da oncostatina M nativa. Os polipéptidos podem também compreender mutantes por combinação, nos quais são incorporadas várias mutaçães por substituição, delecção, processamento e/ou inserção. 0 invento cobre tais análogos da oncostatina M, mutantes e suas porçães funcionais. Os polipéptidos. do invento terão pelo menos uma sequência biologicamente activa, a qual é, por exemplo, imuno-reactiva ou capaz de ligação ao receptor, podendo tal sequência competir com a oncostatina M nativa em relação à adequação biológica.

Usam-se as seguintes definiçães:

Mutantes por delecção a quem falta toda ou uma porção da região do terminal C da oncostatina M.

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-10Mutantes por substituição são os mutantes da oncostatina M nos quais um aminoácido -foi substituído por outro aminoácido. Têm interesse particular as substituições dos grupos sul-fidrilo, que não são necessárias para a actividade biológica. Tais mutações podem incluir a substituição de um resíduo cisteína por outro aminoácido não carregado, tal como a serina, glicina, treonina e semelhantes,possuindo propriedades de carga e caracetrísticas de ocupação espacial semelhantes às da cisteína, em particular a serina.

Mutantes por processamento são os mutantes nos quais um local de clivagem proteolítica, no polipéptido da oncostatina M, foi mutado de modo que o processamento do polipéptido maduro seja bloqueado. Esta alteração pode resultar numa molécula possuindo actividade biológica alterada. Exemplos de tais locais de processamento incluem os resíduos de aminoácido 195 e 196.

O s

Mutantes por inserção são os mutantes nos quais/codões que codificam a sequência de aminoácidos glicina-alanina-glicina são colocados em regiões da sequência de ADN que se crê codificarem aminoácidos de importante significado funcional. Os exemplos incluem inserções colocadas entre as posições de aminoácido 5 e 6, 76 e 77, 103 e 104, e 139 e 140.

invento também incluem secundária da região de

Os polipéptidos polipéptidos nos quais do presente a estrutura ligação do polipéptido é, pelo menos substancialmente, a mesma do que a da região de ligação da oncostatina M nativa. Por região de ligação pretende-se significar a região no terminal C e a região no terminal N da oncostatina M nativa, que são aproximadas pela ligação dissulfeto C49-C167 (ver Fig. 1), cuja porção da molécula é capaz de se ligar especificamente a uma molécula receptora de oncostatina M, com elevada afinidade. A região de ligação caracteriza-se por ter uma hélice anfifática na região do terminal C, particularmente na região que inclui os aminoácidos 168-195. Por hélice anfifática entende-se uma região tendo resíduos de aminoácidos hidrofóbicos num lado e resíduos

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h idro-f ί 1 icos no outro. A hélice compreende, geralmente, cerca de 30% a 50*/., geralmente cerca de 40’/., de aminoácidos hidro-fóbicos, por exempla valina, -feni lalani na, metionina, leucina e semelhantes; cerca de 30*/. a 50*/., geralmente cerca de 407., de aminoácidos hidro-fóbicos, por exemplo tirosina, lisina, arginina, histidina e semelhantes; e cerca de 10% a 40*/., geralmente cerca de 20*/., de aminoácidos não possuindo, pelo substancialmente, carácter hidro-f ί l ico ou hidro-fóbico, exemplo serina, glicina e semelhantes. Incluem-se polipéptidos nos quais a estrutura primária do polipéptido na região do terminal C é capaz de manter uma estrutura secundária numa solução aquosa, particularmente numa solução de sal, fisiológica, ou semelhante, em que a estrutura secundária é, pelo menos substancialmente, semelhante à da oncostatina M nativa sob condições similares.

menos por também

A sequência de aminoácidos do polipéptido pode ser igual ou di-ferente da da oncostatina M nativa, sendo usualmente similar. Quando a estrutura é di-ferente podem-se -fazer substituições, por substituição de um aminoácido hidro-fóbico por outro e/ou de um aminoácido hidro-fílico por outro, particularmente por um. aminoácido com propriedades de carga e características de ocupação espacial similares, de modo que se mantenha, pelo menos substancialmente, a estrutura secundária e a capacidade de ligação especí-fica ao receptor da oncostatina ΙΊ. A actividade do polipéptido ligado ao receptor da oncostatina M não precisa de ser igual à da oncostatina M nativa, e pode ser a de um agonista ou antagonista da oncostatina M, no todo ou em parte.

Na actividade biológica pretende-se incluir a actividade moduladora do crescimento celular, a reactividade cruzada imunológica com a oncostatina M humana de ocorrência natural, ou ligação com elevada a-finidade ao receptor da oncostatina M. Por actividade moduladora do crescimento celular entende-se a actividade biológica da oncostatina M de ocorrência natural, que

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inclui a inibição do crescimento de células neoplásicas e a estimulação do crescimento das células normais, incluindo células do sistema hematopoiético. A actividade moduladora do crescimento celular pode ser diferente da da oncostatina 1*1 de ocorrência natural, e está normalmente reduzida. Por sequência biologicamente activa entende-se uma sequência de aminoácidos constituindo, no máximo, o comprimento total do polipéptido. Por reactividade cruzada imunológica entende-se que um anticorpo induzida por um novo polipéptido deste invento se ligará especificamente à oncostatina 1*1 intacta, pelo menos quando a oncostatina M está num estado nativo, e que um anticorpo da oncostatina 1*1 se ligará especificamente ao novo polipéptido quando a oncostatina 1*1 e o novo polipéptido tiverem um local epitópico comum.

Por receptor da oncostatina M entende-se um local de ligação na superfície de uma célula, que se liga especificamente à oncostatina 1*1 com elevada afinidade, sendo a ligação saturável e não inibida por polipéptidos estruturalmente não relacionados. Por análogo entende-se compostos que têm pelo menos uma actividade biológica correspondente à da oncostatina 1*1 e que incluem uma sequência de aminoácidos substancialmente equivalente a, pelo menos, parte da sequência de aminoácidos da oncostatina 1*1. Os análogos podem incluir mais ou menos aminoácidos, quando comparados com a oncostatina 1*1 nativa.

Os vários mutantes e análogos da oncostatina 1*1 podem ser preparados usando como material de partida oncostatina 1*1 recombinante ou de ocorrência natural. A oncostatina t*l pode ser obtida de fontes naturais, particularmente de meio de crescimento suplementado com um indutor apropriado, tal como um ingenol ou forbol, e condicionado por uma linha celular (U937) derivada de um linfoma histiocítico humano (Sundstrom e Nilsson, 1976, Int. J. Câncer 17: 565-577) ou de um mitogéneo tal como fito-hemoglutineno (PHA) e condicionado com linfócitos do sangue periférico humano, normais, (PBL). Os mutantes e análogos da

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oncostatina M podem ser purificados de modo que fiquem substancialmente isentos de componentes celulares, empregando várias técnicas de purificação bem conhecidas na arte, incluindo a extracção com solvente, cromatografia de permeação em gel, HPLC de fase inversa, electroforese e semelhantes, não ficando contudo a estas limitadas. Os mutantes por delecção do terminal C, da oncostatina M, podem ser obtidos por clivagem proteolítica da oncostatina M de comprimento total, seguida de truncagem do terminal carboxi em pelo menos um aminoácido de cada vez. Toda a porção do terminal C da molécula pode ser deleccionada da oncostatina M de comprimento total. Por porção do terminal C entende-se os aminoácidos 186 a 827 (Fig. 1).

Os mutantes por delecção, os mutantes por processamento e os mutantes por substituição da oncostatina M, também podem ser preparados por técnicas de ADN recombinante. As técnicas usadas no isolamento do gene da oncostatina M são conhecidas na arte e incluem síntese, isolamento a partir do ADN genómico, preparação a partir de ADNc ou suas combinações. As várias técnicas de manipulação do ADN são bem conhecidas e incluem restrição, digestão, ressecção, ligação, mutagénese in vitro. reparação do iniciador, e poli-ligadores e adaptadores e semelhantes. Ver Maniatis e col., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1988). Geralmente, o processo compreende a construção e rastreio de uma biblioteca de ADNc de células que sintetizam oncostatina M, tais como células do linfoma histiocítico (U937) au PBL. Pode-se usar um ensaio /‘WARNm que codifica a oncostatina M, usando uma sonda, quer para avaliar a expressão da oncostatina M, seguido de rastreio com anticorpos da oncostatina M, de modo a detectar um fragmento peptídico reactivo cruzadamente ou semelhante.

Uma vez identificado o ADNc que contém a sequência de codifcação da oncostatina M, podem ser feitas, de várias maneiras, modificações desejadas no gene estrutural. As modificações podem envolver delecções, inserções, suas

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combinaçSes, bem como susbt i tuiçSes, tal como anteriormente descrito. As alterações, tais como as delecçSes, podem envolver a região do terminal C, particularmente a região que codi-fica os aminoácidos 186 até ao término C.

As delecçSes podem ser -feitas de vários modos conhecidos dos peritos na arte, incluindo o corte enzimático do ADNc da oncostatina M de comprimento completo, seguido por modificação e ligação dos fragmentos purificados, ou por mutagénese dirigida ao local, especialmente mutagénese do tipo loop-out tal como descrito por Kramer e col., Nucl. Acids. Res. (1984) IS: 941-9456

Para fins do presente invento os vários aminoácidos podem ser divididos em várias subclasses. A tabela seguinte indica as subclasses.

alifát ico neutral não-polar polar ácido básico aromát ico

G A Ρ V L I

S T C ΙΊ N Q

D E K R

F Η Y W

Por substituição conservativa quei—se significar que os aminoácidos da mesma subclasse (i.e. quer alifáticos neutros, alifáticos ácidos, alifáticos básicos ou aromáticos), mais particularmente com a mesma polaridade, podem ser susbtituídos uns pelos outros. Desjavelmente, os aminoácidos com dois a quatro átomos de carbono ou cinco a seis átomos de carbono definirão agrupamentos monoméricos na subclasse alifática.

Os polipéptidos com peso molecular mais elevado podem ser preparados unindo um fragmento de polipéptido a um portador imunogénico polipeptídico maior, de modo a fornecer imunogenicidade. São exemplos de tais portadores proteicos a albumina de soro bovino, a hemocianina de lapa (do género Fissurela) (KLH) e semelhantes. Os polipéptidos conjugados serão

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hospedeiro úteis na indução de anticorpos num organismo apropriado. Os anticorpos podem ser usados para determinar a presença e/ou concentração de oncostatina M num -Fluído corporal, podendo a sua presença ser ainda usada para determinar a presença de uma célula tumoral, para ligar a oncostatina M e assim para modular a sua actividade, e para purificar a oncostatina M, tal como por meio de uso numa coluna de a-finidade. 0 gene assim obtido pode ser então manipulado de vários modos, bem conhecidos na arte para fornecer a expressão. Podem ser empregues tanto hospedeiros procarióticos como eucarióticos, os quais podem incluir bactérias, leveduras, células de insecto e células de mamífero, p.e. E .coli , células COS, células CHO, células de rim de macaco e células do bicho da seda (sf9). Consequentemente, quando o gene deve ser expresso num hospedeiro que reconhece as regiões reguladoras da transcrição e da tradução do tipo selvagem, da oncostatina Μ, o gene inteiro, com as suas regiões reguladoras 5' e 3' do tipo selvagem, pode ser introduzido num vector de expressão adequado. Existem várias vectores de expressão que empregam os sistemas de replicação dos vírus dos mamíferos, tais como o vírus símio 40, os adenovírus, os vírus do papiloma bovino, vírus vacinia, baculovírus de insecto, etc. Estes sistemas de replicação foram desenvolvidos para proporcionar marcadores, que permitem a selecção de tranfectantes, bem como para fornecer locais de restrição convenientes nos quais o gene pode ser inserido.

Quando o gene deve ser expressa num hospedeiro que não reconhece as regiões reguladoras da transcrição e da tradução do tipo selvagem, de ocorrência natural, é necessária manipulação adicional. Convenientemente, conhecem-se e podem-se inserir a jusante dos codões de paragem, várias regiões reguladoras da transcrição era 3'. A região 5', não codificante, a montante do gene estrutural pode ser removida por endonuclease de restrição, ressecção com Bàl31 ou semelhante. Alternativamente, quando está presente um local de restrição conveniente, próximo do terminal 5' do gene estrutural, o gene estrutural pode ser restringido e em71 944

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pregue um promotor, adaptador para ligar o gene estrutural à região do •fornecendo o adaptador os nucleótidos do gene estrutural que se perderam.

Podem ser empregues várias estratégias para se proporcionar uma cassete de expressão, a qual na direcção de transcrição 5^Z-3', possui uma região reguladora da transcrição e uma região de iniciação da transcrição, a qual também pode incluir sequências reguladoras que permitem a indução da regulação; o gene estrutural sob controlo de transcrição e tradução da região de iniciação; e as regiões de terminação da transcrição e da tradução. A cassete de expressão pode, adicionalmente, incluir sequências de comando de genes de bacterió-fago ou bacterianos que proporcionam a estabilidade do produto de expressão, e sequências de comando de secreção que proporcionam a expressão do produto, bem como genes marcadores.

As regiões de iniciação e de terminação são funcionais na célula hospedeira e podem ser homólogas (derivadas do hospedeiro original) ou heterólogas (derivadas de uma fonte estranha) ou serem sequências de ADN sintéticas. Assim, a cassete de expressão pode ser total ou parcialmente derivada de fontes naturais, e total ou parcialmente derivada de fontes homólogas à célula hospedeira ou heterólogas à célula hospedeira. As várias construções de ADN (sequências de ADN, vectores, plasmídeos, cassetes de expressão) do invento são isoladas e/ou purificadas, ou são sintetizadas e deste modo não ocorrem naturalmente.

Para uma expressão óptima do gene, verificou-se que as sequências de nucleótidos que rodeiam o codão ATG de iniciação da tradução, são importantes nas células animais. Por exemplo, Kozak, Microbiol. Reviews (1983) 47: 1-45, estudou exaustivamente o efeito destas regiões sobre a expressão de polipéptidos, tais como a insulina, em células COS. Deste modo, pode ser necessário modificar as sequências de nucleótidos que rodeiam o codão de iniciação. Isto pode ser conseguido por mutagénese dirigida ao local ou por fusão do gene exógeno com a região de iniciação de

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um gene altamente expresso.

As regiões ou promotores, reguladores da transcrição, ilustrativos incluem, para bactérias, o promotor β-gal, os promotores lambda direito e esquerdo, os promotores trp e lac, o promotor de -fusão trp-lac, etc; para as leveduras, os promotores da enzima glicolítica, tais como promotores da ADH I e II, promotor GPK, promotor PGI, promotor TRP, etc; para células de mamíferos, os promotores precoce e tardio de SV40, os promotores tardios major dos adenovírus, etc.

Quando a região reguladora da transcrição adicionalmente inclui sequências reguladoras que permitem que seja modulada a expressão do gene estrutural, p.e. pela presença ou ausência de nutrientes ou de produtos de expressão no meio de crescimento, temperatura, etc, a sequência reguladora pode compreender o promotor P|_ do bacteriófago lambda juntamente com o operador 0[_ do bacteriófago lambda e o repressor CI857, sensível à temperatura, para, por exemplo, proporcionar uma expressão sensível à temperatura do gene estrutural . A regulação do promotor é conseguida por meio da interacção entre o repressor e o operador.

Nas células eucarióticas, as sequências reguladoras podem incluir, por exemplo, a sequência melhoradora do citomegalovírus, que pode ser -fundida com uma sequência promotora tal como o promotor SV40, -formando um promotor quimérica, ou inseridas em qualquer outro lugar da cassete de expressão, preferivelmente muito próximo da sequência promotora. A expressão do gene estrutural também pode ser amplificada, por exemplo, por ligação em tandém de um gene de um marcador genético, 5' ou 3', amplificável, dominante, com o gene estrutural e crescimento das células hospedeiras sob condições selectivas. Um exemplo de um gene amplificável é o gene da di-hidrofolato-redutase (dhfr) , cuja expressão pode ser aumentada em células tornadas resistentes ao metotrexato (mtx), um antagonista do folato.

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São de particular interesse as cassetes de expressão, capazes de expressar a oncostatina M, que empregam o operador-promotor lac, o promotor tac ou o promotor Pi_-operador 0|_ lambda, e um repressor sensível à temperatura, particularmente em conjunção com o local de ligação ao ribossoma, do gene N, lac ou ^.-Cro. 0 gene estrutural é unido a jusante do local de ligação ao ribossoma, de modo a -ficar sob controlo regulador da região reguladora da transcrição e da região reguladora da tradução. Isto está descrito no USSN 264 098, depositado em 28 de Outubro de 1988, sendo a sua especificação aqui incorporada como referência.

Pode conseguir-se a estabilidade do produto de expressão, proporcionando uma síntese de uma proteína fundida compreendendo os aminoácidos do teminal N de, por exemplo, um gene Cro ou gene N do bacteriófago lambda, ou um gene da fosfatase alcalina de bactérias. A sequência de comando é proporcionada a montante e em estrutura de leitura com o gene estrutural. As sequências de comando com interesse incluem de cerca de 8 a cerca de 35, preferivelmente de cerca de 15 a cerca de 25 aminoácidos do terminal N de um gene procariótico, por exemplo um gene Cro ou um gene N do bacteriófago lambda ou um gene da fosfatase alcalina bacteriana. Ver por exemplo o USSN 264 098 depositado em 28 de Outubro de 1988.

Adicionalmente, pode-se preparar um gene fundido, dispondo de uma sequência 5' do gene estrutural que codifica o comando da secreção e o sinal de processamento. Os comandos de secreção ilustrativos incluem os comandos de secreção da penici1inase, factor <x, imunoglobulinas, receptores das células T, proteínas da membrana exterior, albumina sérica, insulina, enzimas do tracto digestivo, factor de crescimento transformante (3 e semelhantes. Por fusão do comando de secreção com o gene estrutural, na estrutura de leitura adequada, a oncostatina M madura ou análogo podem ser segregados para o meio. Ver, por exemplo, a USSN 144 574 depositada em 15 de Janeiro de 1988, cuja especificação é

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aqui incorporada com referência.

Pode ser inserido pelo menos um outro aminoácido entre o gene estrutural e a sequência de comanda, proporcionando o(s) aminoácido(s) adicional(is) interveniente(s) , por exemplo, um local de clivagem química ou enzimática para clivagem da proteína de fusão. Alternativamente, a proteína de fusão compreendendo a sequência de comando e o produto do gene estrutural pode ter utilidade sem clivagem do polipéptido maduro.

A cassete de expressão pode ser incluída num sistema de replicação para a manutenção epissómica num hospedeiro celular adequado ou pode ser fornecida sem sistema de replicação, pelo que fica integrada no genoma do hospedeiro. 0 ADN pode ser introduzido no hospedeiro de acordo com técnicas conhecidas, tais como transformação, transfecção usando ADN precipitado com fosfato de cálcio, electroporação, transfecção com um vírus recombinante, micro-injecção do ADN nas células e similares.

Uma vez o gene estrutural introduzido no hospedeiro apropriado, o hospedeiro pode ser cultivado para expressar o gene estrutural. A célula hospedeira pode ser cultivada até elevada densidade num meio apropriado. Quando o promotor é induzível, tal como num sistema procariótico, então serão empregues condições permissivas, por exemplo, alteração da temperatura, exaustão, ou excesso de um produto metabólico ou nutriente, ou semelhante. Num sistema mamífero, quando se usa um gene amplificável em tandém com o gene estrutural, serão empregues os meios adequados à amplificação.

Quando se verifica secreção, o produto de expressão, quer fundido, quer não fundido, pode ser isolado do meio de crescimento por meios convencionais. Quando não se verifica secreção, as células hospedeiras podem ser colhidas e lisadas de acordo com condições convencionais. 0 produto desejado é, em seguida, isolado e purificado de acordo com técnicas conhecidas tais como cromatografia, electroforese, extracção com solvente,

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ou semelhante.

Os produtos recombinantes podem estar glicosados ou não glicosados, possuindo glicosação do tipo selvagem ou outra. De um modo geral, a glicosação não diferirá em mais do que cerca de 50%, usualmente não mais do que cerca de 20%, da glicosação do tipo selvagem. A quantidade de glicosação dependerá em parte da sequência do péptido particular, bem como do organismo no qual é produzido. Assim, a expressão do produto em células E.coli resultará num produto não glicosado e a expressão do produto em células de insecto resultará, geralmente, numa glicosação inferior à da expressão do produto em células de mamífero.

5.1 - UTILIZAÇÕES DOS MUTANTES E ANALDGOS DA ONCOSTATINA ΙΊ

Os polipéptidos análogos e mutantes da oncostatina M, e suas composições, podem ser usados para fazer anticorpos, os quais podem encontrar aplicações in vitro ou in vivo. Os anticorpos podem ser preparados de maneiras convencionais, usando o polipéptido em questão como imunogénio, injectando o polipéptido num hospedeiro mamífero, p.e. ratinho, vaca, cabra, carneiro, coelho, etc., particularmente com um adjuvante, p.e. adjuvante de Freund completo, gel de hidróxido de alumínio, ou semelhante. 0 hospedeiro pode ser então sangrado e o sangue empregue no isolamento de anticorpos policlonais, ou no caso de um ratinho, os linfócitos do sangue periférico ou linfócitos esplénicos (células B) podem ser empregues para fusão com uma célula de mieloma adequada, para imortalizar os cromossomas para expressão de anticorpos monoclonais específicos para os presentes compostos. Podem-se preparar anticorpos policlonais ou anticorpos monoclonais.

Os mutante e análogos da oncostatina M e suas composições podem ser utilizados como ligandos para detectar a presença de receptores da oncostatina M. Deste modo, as células podem ser distinguidas de acordo com a presença e a densidade dos receptores da oncostatina M, por controlo do efeito dos vários

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compostos em presença de tais receptores, bem como por determinação da sensibilidade de uma dada célula aos e-feitos de um análogo ou mutante da oncostatina 1*1, particular. Adicionalmente podem-se avaliar os péptidos que se crê terem actividade biológica semelhante à da oncostatina M, por comparação da sua capacidade de se ligar ao receptor da oncostatina M, com a da oncostatina 1*1 de ocorrência natural. Beralmente, os péptidos em teste podem ser avaliados incubando o péptido em teste juntamente com oncostatina 1*1 marcada ou outro péptido que se liga com elevada afinidade ao receptor da oncostatina M, com uma preparação contendo receptores da oncostatina 1*1 e observando a quantidade de inibição da ligação da oncostatina 1*1 marcada, tal como se descreve nos exemplos que se seguem. Pode-se avaliar se os péptidos em teste, que se ligam ao receptor da oncostatina 1*1, são agonistas ou antagonistas da oncostatina 1*1, observando o seu efeito sobre uma função biológica associada à oncostatina M como, por exemplo, inibição do crescimento de células tumorais, como descrito nos exemplas que se seguem.

□s mutantes e análogos da oncostatina 1*1, e suas composiçães, podem ser utilizados no tratamento de uma grande variedade de situaçães neoplásicas tais como carcinomas, sarcomas, melanoma, linfomas, leucemias, que podem afectar uma grande variedade de orgãos como o sangue, pulmães, orgãos mamários, próstata, intestino, fígado, coração, pele, pâncreas, cérebro, etc. Podem ser administrados i n vivo por injecçâo, intra-lesâo, peritonealmente, subcutaneamente ou por qualquer outra via de administração adequada. A administração pode ser num veículo fisiologicamente aceitável, tal como água esterilizada, solução salina tamponada com fosfato, solução salina, etanol aquoso, etc. 0 composto em questão pode ser usado in vitro, para eliminar células malignas da medula para transplantes autólogos de medula ou para inibir ou eliminar a proliferação de células malignas de outros tecidos, p.e. o sangue, antes da re-infusão. As composiçães podem, também, ser usadas como antagonistas da

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actividade estimuladora do crescimento, induzida pela oncostatina M, do sarcoma de Kaposi, ou para estimular a replicação de ADN de células ICS, tornando-as mais sensíveis às dragas quimioterapêuticas.

□s mutantes e análogos da oncostatina M e suas composições também podem ser usados no tratamento de perturbações do sistema hematopoiético, especialmente, como meio para estimular a hematopoiése em pacientes com a função da medula óssea deprimida como, por exemplo, pacientes que sofrem de anemia aplástica, imunodeficiência hereditária ou adquirida ou pacientes submetidos a radioterapia ou quimioterapia.

Os mutantes e análogos da oncostatina M, e suas composições também encontram utilização no tratamento de uma grande variedade de feridas incluindo, substancialmente todas as feridas cutâneas, feridas da córnea e lesões dos orgãos Scos do organismo revestidos de epitélio. As feridas adequadas ao tratamento incluem as que resultam de traumatismo, tais como queimaduras, abrasão, golpes e semelhantes, bem coma as de procedimentos cirúrgicos, como as incisões cirúrgicas e os enxertos de pele. Outras situações adequadas ao tratamento com composições do presente invento incluem situações crónicas tais como úlceras crónicas, úlceras diabéticas e outras doenças não curáveis (tróficas). Os presentes compostos podem ser incorporados em veículos fisíologicamente aceitáveis, para aplicação à área afectada. A natureza dos veículos pode variar grandemente, e dependerá da localização de aplicação pretendida. Usualmente, para aplicação á pele, prefere-se uma base de creme ou de unguento, incluindo, as bases adequadas a lanolina, Silvadene (particularmente para o tratamento de queimaduras), (Duke Laboratories, South Norwalk, Connecticut) e semelhantes. Se se desejar, é possível incorporar as composições de análogos e mutantes da oncostatina M em ligaduras e outros feridas, de modo a proporcionar uma exposição ferida ao péptido. Também podem ter utilidade as (Marion) Aquaphor pensas para contínua da

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aplicações em aerosol.

tratamento quant idade composição

A concentração do polipéptido na composição de não é crítica. 0 polipéptido estará presente numa indutora da proliferação de células epiteliais. A será aplicada topicamente à área afectada, tipicamente como gotas oftálmicas, para o olho, ou como cremes, unguentos ou loções, para a pele. No caso dos olhos, é desejável o tratamento frequente, sendo habitualmente aplicado a intervalos de 4 horas ou menores. Na pele é desejável manter a composição de tratamento continuamente sobre a área afectada durante a cicatrização, com aplicações da composição de tratamento duas a quatro vezes por dia, ou mais frequentemente.

As composições presentes podem ser formuladas de vários modos, incluindo no lúmen de lipossomas, particularmente quando os lipossomas se podem ligar a moléculas residentes dirigidas a células neoplásicas particulares, p.e. anticorpos, matrizes de partículas não degradáveis ou semelhantes. Podem ser incluídas, na formulação, outros componentes tais como tampões, estabilizantes, surfactantes, biocidas, etc. Estes componentes estão extensamente exemplificados na literatura e aqui não necessitam de ser descritos em particular.

Os resultados obtidos nos exemplos que se seguem demonstram que alguns polipéptidos da oncostatina M, mutantes, retêm bioactividade e, nalguns casos, possuem bioactividade melhorada. As composições compreendendo tais mutantes podem ser usadas na regulação da proliferação celular, tanto in vivo como in vitro. tal como em cultura, leucoferese, aplicações profiláticas e terapêuticas in vivo, etc. Uma aplicação particular refere-se ao uso de polipéptidos mutantes da oncostatina M, biologicamente activos, no tratamento de células para transplantes autólogos de medula óssea, por inibição do crescimento de células tumorais na medula e por estimulação da formação de colónias de células. Outra aplicação específica refere-se ao uso de mutantes da oncostatina M na estimulação do crescimento de células epiteliais, promovendo assim a cicatrização das feridas. Adicionalmente os z

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polipéptidos mutantes podem ser usados como imunogénios para induzir a -formação de anticorpos. Os anticorpos induzidos podem ser usados na titulação dos níveis de oncostatina M presente nos -fluídos corporais e/ou para modular a actividade do -factor de ligação à mesma.

o invento seja descrito com algum pormenor, como é prontamente evidente, para os que têm uma vulgar na arte, que se podem -fazer alterações e sem que com isso haja afastamento do espírito ou reivindicações anexas. Os exemplos que se seguem são a título ilustrativo e não como limitação.

Embora explicação, experiência modificações âmbito das apresentados

- EXEMPLO: EXPRESSftQ E CARACTERIZAÇÃO DOS MUTANTES

DA ONCOSTATINA M

6.1 - MATERIAIS E MÉTODOS

6.1.1 “ CULTURA DE CÉLULAS

Cultivaram-se células de melanoma A375, H29S1 e COS em meio de Eagle modificado com Dulbecco (DMEM) suplementado com soro bovino fetal a 10% (FBS) .

6.1.2 - ENSAIO DE INIBIÇÃO DQ CRESCIMENTO

Mediu-se a actividade inibidora do crescimento (GIA) por meio de um ensaio de ligação a corante. As células de melanoma A375 (3-4 x 10³) foram semeadas num volume de 0,1 ml de DMEM contenda soro de bovina fetal a 10% (FBS), em placas de microtitulação de 96 poços. Adicionaram-se várias concentrações de oncostatina M, num volume de 0,1 ml, e continuou-se a incubação a 37°C, durante 72 horas. Removeu-se o meio de cultura, as células foram coradas com violeta de cristal e quantificou-se a proliferação celular relativa, por medição do corante ligado, num leitor de placas de microtitulação (Genetic Systems Corp . , Seattle, WA) , pela absorvância a 590 nm. Comparou-se a

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proliferação celular, na presença de oncostatina M, com a proliferação de amostras não tratadas e exprimiu-se como percentagem de inibição do crescimento máximo. As amostras foram ensaiadas em duplicado ou em triplicado. Determinaram-se as unidades GIA da oncostatina M a partir das curvas de inibição e definem-se como a quantidade de proteína necessária para inibir em 507, o crescimento de células A375, num ensaio Standard. Quando se normalizaram as unidades GIA relativamente à concentração proteica, os coeficientes de variação dos valores normalizados foram de um modo geral <207,.

6.1.3 - ENSAIO RADIO-RECEPTQR

Semearam-se células H2981 com uma densidade de 1-3 x 10⁵/cm^ em pratas de plástica com 48 poços, 16-24 horas antes do tratamento com oncostatina M. Incubaram-se as monocamadas com 125i__oncOstatina M <20 ng/ml, 0,7 nM) num volume de 0,1 ml de tampão de ligação (Linsley e col . , 1986, Biochemistry 25.: 2978-2986) contendo quantidades crescentes de oncostatina M ou de oncostatina M mutante. As reacçííes de ligação realizaram-se durante 2-4 horas a 23°C. Mediu-se a ligação não específica na presença de um excesso 50 a 100 vezes, de oncostatina M não marcada. A ligação específica foi calculada subtraindo radioactividade ligada na presença do excesso de oncostatina M não marcada, da ligação total e, de modo geral, variou entre 707,- 957, da ligação total. A variação entre as determinaçães das réplicas foi, geralmente, inferior a 107,. As unidades de ensaio de radio-receptor (unidades RRA) foram determinadas a partir das curvas de inibição obtidas na presença de quantidades crescentes de oncostatina M não marcada. Uma unidade RRA é definida como a quantidade de oncostatina M necessária para inibir 507, da ligação de ^25 j__onc:osj. £_na |vj , num ensaio Standard.

Os valores da actividade específica, avaliados como GIA ou

RRA (unidade/mg) variaram, entre experiências, no máximo em duas vezes. Na mesma experiência, as variaçães da actividade

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-86específica variaram de 15% a 30% devido, em grande parte, â variação na quantificação da quantidade de proteína imuno-reactiva no meio de cultura. Os valores da actividade específica relativa indicam a percentagem de actividade específica do mutante em relação à da oncostatina M de Tipo selvagem recombinante. 0 coeficiente de variação derivado, da actividade específica relativa variou entre 88% e 45%, calculada coma raiz quadrada média. As mutaçães que resultaram em valores da actividade específica relativa inferiores a 10% da oncostatina M de Tipo selvagem recombinante, são consideradas como tendo perdido actividade biológica.

6.1.4 - DOSEAMENTO RADIQ-IMUNDLóGICD

Diluiu-se meio de cultura isento de soro em DMEM, adicionou-se ditiotreitol até à concentração de 10 mM e desnaturaram-se as proteínas por fervura. Este tratamento aumenta a subsequente imuno-reactividade da oncostatina M. Em seguida, aplicaram-se a uma membrana de nitrocelulose diluiçães seriadas de meio tratado, através de um dispositivo de slot-blot (Millipore). As membranas foram então, submetidas a análise de imuno-mancha como está descrito (Linsley e col., 1985, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88: 356-360) usando anti-soro anti-6-19 (Secção 6.1.5, infra) e ^^I-proteína A, para a detecção. Construíram-se curvas Standard usando oncostatina M purificada, diluída em meio isento de soro, de células falsamente transfectadas. Mediram-se as intensidades da banda dos auto-radiogramas por densiometria de varrimento e quantificou-se a quantidade de oncostatina M, presente no meio proveniente das células transfectadas, por comparação com as curvas Standard. Na maior parte dos casos, fez-se a média das quantidades de oncostatina M medida em várias diluiçães de meio que deram intensidades da banda na porção linear da curva Standard; os coeficientes de variação destas mediçães foram, geralmente, < 10%.

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6.1.5 - ANTI-SORO

Sintetizaram-se, por técnicas de fase sólida, os péptidos correspondendo aos aminoácidos 6-19 e 206-218 da oncostatina M (Fig.l). Os péptidos foram conjugados com imunoglobulina de bovino (péptido 6-19) ou com hemocianina de lapa (gén. Fissurela) (péptido 206-218) e imunizaram-se coelhos, como descrito (Gentry e col., 1987, Mol. Cell. Biol. 7: 3418-3427; Linsley e col., 1985 Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82,: 356-360) . Para o anti-6-19 usou-se uma mistura 1:1 de soro de dois coelhos imunizadas.

6.1.6

TRANSFECgftO DE CÉLULAS COS

Transfectaram-se células COS com plasmídeos codificando oncostatina M mutante como está descrito (Malik e col., 1989, Biol. 9: 2847-2853). Vinte e quatro horas após a adicionou-se meio isento de soro e incubaram-se as células a 37°C, durante mais 48 horas. Recolheu-se e testou-se o meio condicionado.

Mol. Cell. transfecção

6.2 “ CONSTRUgSQ DE PLASMÍDEOS DE EXPRESSÃO

Em Malik e col., 1989 Mol. Cell. Biol. 9: 2847-2853 descreve-se um plasmídeo de expressão de ADNc de oncostatina Μ, o pSPOM. Em Linsley e col., 1989 J. Biol. Chem. 264: 4282-89, é descrito um plasmídeo de expressão no qual a sequência que codifica a sequência de sinal da oncostatina M é substituída pela sequência que codifica o péptido de sinal de TGF-βΙ de símio (aqui referido como ρβ-ΟΜ) .

6.2.1 - CQNSTRUgSES MUTANTES POR DELECgAO

Construiram-se mutantes por delecção, da oncostatina M (mutantes de inserção de codão de paragem) (Δ 182-227, Δ 183-227, Δ184-227, Δ 136-227, Δ 187-227, Δ 188-227, Δ 189-227, Δ 190-227, Δ 195-227 e Δ196-227), por amplificação PCR com iniciadores oligonucleótídicos de 3', que codificam um codão de paragem e um

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U.U» local de clonação. Os mutantes A 191 e A 185 foram construídos por digestão com exonuclease, limitada, (Henikoff, 1984, Gene 58i 351-359) a partir da extremidade 3' da região de codificação da oncostatina M. Resumidamente, subclonou-se ADNc de oncostatina M no plasmídeo pSP64 (Promega), linearizada próximo da extremidade 3' do ADNc e submeteu-se a digestão limitada com exonuclease III. As extremidades 3' dos ADNc digeridas, foram então tornadas rombas com o fragmenta de Klenow da ADN polimerase I. Finalmente, os ADNc truncados foram excisados do pSP64 num local HindiII. produzido por engenharia a 37 bases, no sentido de 5' do local de início da tradução e clonados no nH3MPY clivado com Hindlll-Xhol (Stamenkovic, 1989, EMBO J.), usando os ligadores oligonucleotídicos sintéticos TAGGTGAATGATCAC e

TCGAGTGATCATTCACCTA, que codificam os codões de paragem em cada estrutura de leitura e possuem uma extremidade sobreposta, complementar ao local de restrição Xhol. Identificaram-se os clones individuais possuindo codões de paragem introduzidos nas posições 183 e 190 (Δ183-227 e -Δ 190-227) , por análise da sequência de ADN. De modo semelhante, prepararam-se outros mutantes por delecção.

Construíram-se vários outros mutantes por delecção da oncostatina M (21 44-47 , A 87-90 , 118-121 , Δ 152-155 e Δ 178-181) usando o método de delecção loop out (Kramer e col., supra). As construções mutantes foram subclonadas no local Hindlll-Xhol do pH3MPY, pesquisado por análise de restrição e verificado por sequenciação de toda a região de codificação.

6.2.2 - CONSTRUÇÕES MUTANTES POR PROCESSAMENTO

Os clones mutantes G195 e G196 foram construídos por mutagénese dirigida ao oligonucleótido usando um conjunta (Kit) comercializado (Amercham). Os oligonucleótidos mal emparelhados que dirigem a conversão dos resíduos arginina, nas posições 195 ou 196, em glicinas, foram sintetizados e usados, de acordo com as instruções do fornecedor, para construir clones mutantes. A

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-29sequência da região mutada dos clones por análise da sequência de ADN.

GÍ95 e G196 foi

Construíu-se o clone mutante G195 por modificação do procedimento de mutagénese do oligonucleótido. Após repolimerização e ligação do ADN do fago M13 fendido, amplificou-se o ADNc da oncostatina M usando a reacção em cadeia de Tac polimerase (Perkin Elmer Cetus), utilizando iniciadores de avanço e de reversão universais, de M13. 0 ADNc amplificado foi, em seguida, subclonado em pH3NPY clivado com HindlII-Xhol e identificaram-se os clones mutantes por análise de restrição e/ou sequenciação de ADN. As regiões de codificação mutadas foram depois confirmadas por análise da sequência. A análise da sequência de G195, revelou que o segundo aminoácido da oncostatina M (alanina) tinha sido trocado por valina, em resultado de uma mutação secundária introduzida durante a mutagénese. 0 G196 foi purificado por dois ciclos de um procedimento em dois passos, consistindo num passo inicial de cromatografia de fase inversa, seguido por fraccionamento por tamanhos.

6.2.3 - CONSTRUÇÕES MUTANTES PDR SUBSTITUIÇSO

S80,

Os clones mutantes S5, S49,/S127, S167 e SC/S167 foram construídas por mutagénese de oligonucleótidos tal como descrito na secção 6.2., supra. Os oligonucleótidos mal emparelhados que dirigem a conversão das cisteínas nas posições 6, 49, 80, 127,

167 e 6+167 foram sintetizados e usados para construir clones mutantes. As construções mutantes foram subclonadas no local HindiII-Xhol do pH3MPY. As regiões de codificação mutadas dos clones resultantes foram confirmadas por análise da sequência de ADN.

6.2.4 - CONSTRUÇÕES MUTANTES POR INSERÇSO

Os clones mutantes GAG6, GAG77, GAG14 e GAG140 foram construídos por mutagénese dirigida, in vitro. de

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scçgB oligonucleótidos, tal como descrito na secção 6.5.2., supra. As construções mutantes -foram subclonadas no local Hindl I I-Xhol do pH3MPY. As regiões de codificação mutadas foram confirmadas por análise da sequência de ADN.

6.3 - BIOACTIVIDADE DOS MUTANTES DA ONCOSTATINA M

6.3.1 - MUTANTES POR DELECgftO E POR PROCESSAMENTO

Analisou-se por análise de imuno-mancha o meio isento de soro, de células COS transfectadas com plasmídeos codificando os clones mutantes por processamento G195 e G196 (secção 6.2.2, supra) e os mutantes por delecção Λ 195 e 2Ϊ190 (secção 6.S.1, supra).

As células transfectadas com estas construções codificando mutantes, produziam proteínas que reagiram com soro anti-6-19. As proteínas imuno-reactivas produzidas por G195 e G196, comigraram com a proteína M_r 36 000, proveniente de células transfectadas com pSPOM (secção 7, infra), ao passo que ο Δ195 e zs190 produziram proteínas que migraram mais próximas da proteína M_r 32 000. Quando se usou soro anti-208-219 na análise, observou-se a forma M_r 36 000 das células transfectadas com G195 e G196, mas as proteínas produzidas por G195 e G196 não conseguiram reagir. Assim, a introdução de mutações pontuais num local de processamento putativo evitou a acumulação da forma Μ_Γ 32 000, enquanto que mutações por delecção logo a montante deste local evitaram a acumulação da forma M_r 36 000 de oncostatina M. Estes resultados sugerem que a diferença entre as formas M_r 36 000 e M_r 32 000 da oncostatina M é devida ao processamento prateaiítico no ou próximo do local semelhante a triptico que começa na posição 193.

Comparou-se a actividade biológica das formas mutantes, resistentes ao processamento, de oncostatina M (G195 e G196) com a das proteínas mutantes correspondendo estreitamente, em tamanho, à forma M_r 32 000, da oncostatina Μ (Δ190 e Δ 182) .

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Ref: 5624-154-118

Para esta experiência testou-se quanto às actividades GIA e RRA meio condicionado, isento de soro, não tratado, proveniente de células transfectadas, tal como descrito na secção 6.1.2 e 6.1.3, respectivamente. Determinaram-se as concentrações de oncostatina 1*1 por doseamento radio-imunológico, tal como descrito na secção 6.1.4. Como se mostra na Tabela I as razões das actividades GIA para RRA do Δ 190 e do Δ 195, foram 10-20 vezes superiores às do G195 e do G196. □ meio proveniente de células transfectadas com o mutante Δ182 não deu actividade significativa em qualquer dos ensaias, indicando que a região do terminal C do resíduo 182-190 era essencial para as actividades inibidoras do crescimento e de ligação. 0 meio de células transfectadas com pSPOM (secção 7, infra) deu razões de actividade intermédia, consistente com a presença, nesta amostra, de duas formas de oncostatina 1*1 tendo actividades diferentes. Estas observações indicam que as formas mutantes não processadas da oncostatina M (G195 e G196) possuem menor actividade GIA do que as formas l*l_r 32 000 truncadas ( Δ182 e A190) .

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Re-f: 5624-154-118

TABELA I

AS FORMAS MUTANTES DA ONCOSTATINA M TêM DIFERENTES ACTIVIDADES RELATIVAS DE INIBIÇ80 DO CRESCIMENTO E DE LIGAÇSSO

AMOSTRA	ACTIVIDADE GIA1 2
pSPOM	11 ,7	(27,2)
Δ195-227	61 ,7	(74,3)
Δ190-227	20,0	(21,7)
Δ 182-227	0,02	(0,06)
G196	6,6	(8,0)
G195	5,0	(8,8)
Os meios	isentos de soro
células COS	transfectadas com

ACTIVIDADE RRA¹ RAZftO⁵

2,6	(6,1)	4,5
3,2	(3,8)	19,5
0,9	(1,0)	22,5
<0,02	((0,06)	N/A
11,2	(13,5)	0,6
5,3	(9,3)	0,9

testadas quanto às actividades radio-receptora (RRA) como concentrações de oncostatina M não testados, provenientes de os plasmídeos indicados -foram inibidora do crescimento (GIA) e descrito no exemplo 1; as ariaram enre 0,4-1 J^g/ml/N/A, não aplicável.

unidades/ml (x 10^); os números entre parêntesis representam actividades específicas.

Razão entre a actividade GIA e a actividade RRA

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Re-f: 5624-154-118

Para confirmar a actividade GIA reduzida do mutante G196, esta proteína foi purificada até à homogeneidade e comparada com a forma I*l_r 32 000 da oncostatina 1*1, proveniente de células transfectadas com pSPOM (secção 7, infra). A forma M_r 32 000 da oncostatina 1*1 tinha actividade GIA maior do que a G196 (actividades semi-máximas a 6 e 130 pM, respectivamente). Em três experiências separadas a diferença entre as actividades inibidoras do crescimento destas proteínas purificadas eram 9, 22 e 5 vezes (média ± desvio padrão (12 ± 9 vezes). Em constrate as actividades RRA das duas proteínas purificadas eram indistinguíveis (actividades semi-máximas de, aproximadamente, 100 pl*l) . Na RRA, as três experiências separadas mostraram que o G196 tinha actividade RRA de aproximadamente 1,1, 1,1 e 2 vezes maior (1,3 ± 0,3 vezes) do que a da forma l*l_r 32 000 da oncostatina 1*1. Assim, o G196 purificado (forma M_r 36 000) liga-se ao receptor da oncostatina 1*1 igualmente bem á forma M_r 32 000, mas tem uma actividade GIA menor.

Na Fig. 2 é mostrada uma comparação entre as actividades inibidoras do crescimento dos mutantes por delecção, da oncostatina M. 0 Δ181, Δ182 e Δ183 têm actividade inibidora do crescimento mínima (< 1 unidade/mg) . A actividade inibidora do crescimento melhorada, em relação à da oncostatina 1*1 nativa, foi observada nos mutantes da oncostatina 1*1 Δ 195-227, Δ.190-227, Δ 188-227 e Δ187-227. 0 mutante Δ187-227 foi o que exibiu a actividade maior O 14 unidades/ng) em comparação com a da oncostatina 1*1 nativa <~8 unidades/ng). Deste modo, a remoção de porçães substanciais da região do terminal C, aumenta a actividade inibidora do crescimento da oncostatina 1*1.

A Tabela II apresenta as actividades de ligação ao receptor e de inibição do crescimento, específica, relativas, de vários mutantes por delecção, da oncostatina 1*1. Estes dados confirmam que a remoção de porçães substanciais da região do terminal C aumenta a actividade inibidora do crescimento da oncostatina 1*1.

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Re-f: 5624-154-118 ,/7

TABELA II

ACTIVIDADES INIBIDORA DO CRESCIMENTO E DE LIGAÇBO AO RECEPTOR RELATIVAS, RESULTANTES DE MUTAÇÕES NO TERMINAL C

ACTIVIDADE ESPECÍFICA RELATIVA (%)

MUTANTE	GIA		RRA		n
A196-227	171		73
A 191-227	90 ±	30	26 ±	13	3
Δ190-227	99		68
Δ189-227	197 ±	57	42 ±	1	2
Δ188-227	135		54
A187-227	66 ±	31	21 ±	5	2
Δ186-227	60 ±	30	20 ±	4	2
Δ185-227	17		2
Δ184-227	2		<1
Δ183-227	<2		<1		2
Δ182-227	<3		<1		2
Os meios	isentos de	soro	provenientes de	células

transfectadas com os mutantes da oncostatina M indicados, -foram testados quanto às actividades inibidora do crescimento (GIA) e radio-receptora (RRA). As concentrações de oncostatina M foram determinadas por imuno-mancha quantitativa e variaram de 0,2-1,0 Mg/ml. Os valores indicam a percentagem de actividade específica dos mutantes em relação à oncostatina M recombinante, do tipo selvagem, testada na mesma experiência, e calculada como actividade específica do mutante/actividade específica da oncostatina M do tipo selvagem x 100. 0 número de experiência é i nd içado por n .

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Re-f: 5624-154-118

•sSS*

-35<í

6.3.2 - MUTANTES POR SUBSTITUIÇÃO

Testaram-se quanto à actividade inibidora do crescimento, os clones mutantes preparados como descrito na secção 6.2.3, supra. Os resultados, apresentados na Fig. 3, demostram que as cisteínas nas posições 49 e 167 são essenciais para a actividade biológica, uma vez que todos os mutantes a quem -faltavam estes resíduos (S49, S167 e S6/S167) tinham actividade biológica mínima ou nula. Os mutantes por substituição S6, S80 e S127, tinham actividades biológicas equivalentes ou superiores à actividade da oncostatina M, resultados estes que indicam que as cisteínas nas posições 6, 80 e 127 não são essenciais para a GIA da oncostatina M. De •facto, alterando a cisteína na posição 80 para ser ina, teve como resultado um ligeira, mas signi-f icante, aumento na bioact ividade.

6.3.3 - MUTAÇÕES DA ONCOSTATINA M ENVOLVENDO DELECÇÕES

E INSERÇÕES DE AMINOÁCIDOS

Prepararam-se mutantes, por delecção, por inserção de varrimento, como descrito nas secções 6.2.1 e 6.2.4, respectivamente, e testaram-se quanto às actividades inibidora de crescimento e radio-receptora (Tabela III). Os mutantes por delecção Λ22-36 e Δ44-47 perderam todas as actividades, GIA e RRA, enquanto que o mutante Δ 87-90 tinha uma actividade específica relativa maior do que a oncostatina M do tipo selvagem. 0 mutante por delecção Z)>152-155 tinha uma actividade específica relativa intermédia. A inserção de Gly-Ala-Gly entre as posições de aminoácidos 5 e 6, 103 e 104 e 139 e 140 não perda significativa de actividade biológica. As resultou em actividades,

GIA

RRA, específicas, relativas.

foram significativamente reduzidas quando a inserção da sequência Gly-Ala-Gly se deu entre as posições de aminoácidos 76 e 77, iniciando-se, na posição de aminoácido 75, a sequência de reconhecimento de glicosação ligada a N, putativa.

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Re-f: 5624-154-113

-36λ' a

TABELA III

ACTIVIDADESINIBIDORA DO CRESCIMENTO E DE LIGAÇSO AO RECEPTOR ESPECÍFICAS, RELATIVAS, RESULTANTES DE MUTAÇÕES POR INSERÇSO E POR DELECÇSO, DE VARRIMENTO

ACTIVIDADE ESPECÍFICA RELATIVA (7.)

MUTANTE	GIA	RRA
A 22-36	<1	<5
A44-47	<1	<3
Δ87-90	320	260
Δ152-155	39	48
GAG6	58	37
GAG77	8	24
GAG104	125	196
GAG140	79	40

Os meios isentos de soro, provenientes de células COS trans-fectadas com as construções mutantes da oncostatina M indicadas (delecção de resíduos, incluindo os enumerados com a indicação Δ, e a inserção dos resíduos Gly-Ala-Gly, nas posições apontadas, são indicados por GAG) -foram testados quanto às actividades inibidora do crescimento (GIA) e radio-receptora (RRA) . As concentrações de oncostatina M -foram determinadas por imuno-mancha quantitativa e variaram entre 0,14 e 1,8 Ag/ml . Os valores indicam a percentagem de actividade específica do mutante em relação à oncostatina M recombinante, do tipo selvagem, testada na mesma experiência, e calculada como actividade específica do mutante/actividade específica da oncostatina M do tipo selvagem X 100.

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Re-f: 5624-154-118

7. - EXEMPLO; A EXPRES5SQ DA ONCOSTATINA M EM CÉLULAS

COS BERA DUAS FQRMAS MOLECULARES

As células COS -foram trans-fectadas com pSPOM e pfSOM, como está descrito (Malik, e col., 1989 Mol. Cell. Biol. 9: 2847-2853). Vinte e quatro horas após a transfecção, adicionou-se meio isento de soro e as células -foram incubadas a 37°C por mais 48 horas. Os meios condicionados -foram recolhidos e ensaiados imediatamente ou acidi-fiçados por adição de ácido acético, até 1 N, e concentrados, para purificação. 0 meio das células trans-fectadas com pSPOM continha duas proteínas (M_r 36 000 e M_r 32 000) que eram, imunologicamente relacionadas mas não idênticas em tamanho á oncostatina M nativa produzida por células U937. Estas mesmas proteínas -foram, também, observadas quando as células COS eram trans-fectadas com uma construção, codificando oncostatina M, que tinha a sua sequência de sinal substituída pelo péptido de sinal (p(SOM) de TGF-(S1 de símio. A sequenciação dos aminoácidos N-terminais de ambas as proteínas M_r 36 000 e M_r 32 000 revelou a mesma sequência do terminal N da oncostatina M natural, indicando que a diferença entre estas proteínas não é consequência da heterogeneidade da sequência do terminal N.

7.2 - PURIFICADO DA FORMA Mv 32 000 DA ONCOSTATINA M

A forma M_r 32 000 da oncostatina M foi purificada, essencialmente como está descrito (Linsley e col., e Malik e col., supra) a partir de meio isento de soro, acidificado e concentrado, proveniente de células COS transfectadas com pSPOM. As fracçães de pico da actividade inibidora de crescimento do meio de cultura fraccionado por tamanhos, foram recolhidas e submetidas a uma purificação final por cromatografia de fase inversa. As preparaçães resultantes continham, predominantemente, a forma M_r 32 000 da oncostatina M. Em algumas experiências, a oncostatina M, usada para radio-marcação com 1^5j _ou p_ara curvas Standard no doseamento radio-imunológica, fai preparada de forma idêntica a partir de meio isento de soro proveniente de células

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Re-f: 5624-154-118

CHO que sobre-produziam oncostatina M recombinante (Oncogen; Seattle, WA) . A oncostatina M proveniente desta -fonte puri-ficada não apresenta imuno-reactividade com os anti-soros anti-206-218 e tem propriedades equivalentes à -forma M_r 32 000 da oncostatina M, proveniente de células COS.

7.3 - FORMAS M_r 36 000

A -forma M_r 36 000 de oncostatina M proveniente de células trans-fectadas com pSPOM -foi parcialmente puri-ficada num procedimento em três passos. 0 meio de cultura isento de soro -foi acidificado e fraccionado por tamanhos numa coluna 3000 SW TSK processada em acetonitrilo 40’/., ácido trifluoroacético 0,1%. As fracções contendo predominantemente a forma M_r 36 000 da oncostatina M foram identificadas, por análise de imuno-mancha usando soro anti-6-9, reunidas, concentradas e reprocessadas na mesma coluna. As fracções contendo a forma M_r 36 000 imuno-quimicamente pura (i.e. não tendo forma M_r 32 000 detectável) foram reunidas e usadas em experiências subsequentes. Determinaram-se as concentrações das proteínas purificadas por análise dos aminoácidos realizada pelo Dr. Bary Hathaway (Biotechnology Instrumention Center, Universidade da Califórnia, Riverside).

7.4 - ELECTROFORESE

Realizou-se uma electroforese em gel de poliacrilamida-dodeciIsulfato de sódio (SDS-PAGE) usando o sistema de Laemmli (Laemmli, Reino Unido, Nature (1970)227: 680-685). Usaram-se geles de gradiente linear de acrilamida com geles compactados de acrilamida a 5%. As amostras foram processadas sob condições redutoras. Os geles foram corados com reagente de prata (BioRad) ou azul de Coomassie, descorados e secos antes de serem fotografados. Calcularam-se os pesos moleculares aparentes das diferentes formas de oncostatina M por comparação com padrões, tal como se encontra descrito (Malik e col., supra).

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Ref: 5624-154-118

7.5 - TRATAMENTO COM TRIPSINA DA ONCOSTATINA IM IMr- 36 OOP

A forma M_r 36 OOO foi parcialmente purificada por fraccionamento por tamanhos e submetida a purificação adicional por cromatografia de fase inversa. A preparação resultante era ~80‘/. pura, como julgado por SDS-PAGE. As alíquotas contendo ~150 ng de oncostatina M (avaliada por RRA) foram tratadas a 37°C com 6 ng de tripsina tratada com TPCK (Worthington) em 30 Pl de acetato tris 50 mM, pH 7,9. As amostras foram incubadas a 37°C por períodos de tempo crescente, sendo as reacções terminadas por adição de tampão de amostra da electroforese, concentrado, e as diferentes formas de oncostatina M foram identificadas por imuno-mancha com soro anti-6-19.

7.6 - REMQÇaO DE 0LIG055ACARID05

A sequência do precursor da oncostatina M, predita, contém dois locais de glicosação ligados a N, potenciais. Para determinar se a glicosação diferencial =nestes locais poderia contribuir para a diferença entre as formas M_r 36 000 e M_r 32 000 da oncostatina M, as proteínas presentes no meio condicionado, isento de soro, proveniente de células COS transfectadas com pSPOM, foram tratadas com a enzima N-glicanase, a qual remove oligossacáridos ligados a N, e analisadas quanto à imuno-reactividade com um anti-soro específico do local, da oncostatina M (anti-6-19). Por meio deste tratamento, aumentaram-se as mobilidades de ambas as formas M_r 36 000 e M_r 32 000 da oncostatina M, resultando em novas espécies de M_r ~34 000 e M_r 30 000. □ aumento na mobilidade de ambos os fragmentos ê consistente com a remoção de uma porção oligossacárida ligada a N (M_r ~ 2000) de cada forma de oncostatina IM. Uma vez que as mobilidades de ambas as formas foram aumentadas em paralelo, é improvável que a glicosação, ligada a N, diferencial pudesse contribuir para a diferença de tamanhas entre estes fragmentos.

944

Re-f: 5624-154-118

7.7 - □ ANTI-SQRQ ESPECÍFICO DO LOCAL REVELA TERMINAIS C

DIFERENTES PARA AS FORMAS IV 36 OOP e Mr- 32 OOP DA ONCOSTATINA M

A análise por hidropatia (keski-Oji, J. e col., J. Cell. Biochem. Suppl. (1987) 11A: 60) revelou que o terminal C da oncostatina M (aminoácidos ~190-227) é -fortemente h idro-f ί l ico . Os aminoácidos básicos (R, K ou H) compreendem 24 de 38 (63%) dos resíduas desta região e há 5 resíduos dibásicos emparelhados que poderiam representar os locais de clivagem proteolítica potenciais. Para investigar se a heterogeneidade do terminal C contribui para a diferença entre as -formas M_r 36 000 e M_r 32 000, os anti-soros -foram desenvolvidas para péptidos correspondendo às regiões do terminal N da oncostatina M madura (Malik, e col., supra e Zarling, J.M. e col., 1986, Proc. Natl. Acad. Sei. 83:

9739-9743) e o terminal C foi predito a partir da sequência de

ADNc. Estes anti-soros foram então usados em experiências de imuno-mancha com meio condicionado, isento de soro, proveniente de células transfectadas com pSPOM e com oncostatina M derivada de células U937, natural. Enquanto que o soro anti-6-19 reagiu com ambas as formas M_r 36 000 e M_r 32 000 provenientes de células transfectadas com pSPOM, e com a oncostatina M natural de M_r 28 000, proveniente de células U937, o soro anti-206-218 apenas reagiu com a forma M_r 36 000 da oncostatina Μ. A especificidade de ambos os anti-soros foi indicada pela capacidade dos péptidos cognatos inibirem as suas actividades. Estes resultados indicam que as diferenças entre as formas M_r 36 000 e M_r 32 000 da oncostatina M podem ser resultado, pelo menos em parte, da heterogeneidade do terminal C, o qual, presumivelmente, resulta do processamento proteolítico no domínio do terminal C hidrofílico.

7.8 - CONVERSaO DA FORMA M,- 36 000 DA ONCOSTATINA M

NA FORMA Mv 32 000 PDR PRQTEáLISE LIMITADA

Para confirmar que o processamento proteolítico da forma M_r

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Ref: 5624-154-118

proteólise limitada uma preparação parcialmente purificada da forma M_r 36 000. Os produtos da reacção foram detectados com soro anti-6-19. Com um aumento do tempo de tripsinação, viu-se uma diminuição gradual da quantidade da forma M_r 36 000, concomitante com um aumento na quantidade de forma l*l_r 32 000. No ponto de tempo mais tardio testado, a quantidade de forma M_r 32 000 estava diminuída e observavam-se outros produtos imuno-reactivos de baixo peso molecular. Uma vez que o produto M_r 32 000 reage com o anti-soro específico do terminal N, representa oncostatina 1*1 que foi processada no terminal C. Isto indica que a proteólise, próxima do terminal C, da forma M_r 36 000 da oncostatina 1*1 pode originar uma forma de oncostatina 1*1 semelhante, em tamanho, à forma !*l_r 32 000 produzida pelas células transf ectadas com pSPOM.

7.9 - ACTIVIDADE INIBIDORA DQ CRESCIMENTO DA ONCOSTATINA 1*1 (FORMAS 32K e 36K) meio condicionado isento de soro proveniente de células transf ectadas com piSOM foi fraccionado por cromatografia em BioBel P60. As fracções individuais foram em seguida testadas quanto à actividade GIA em células de melanoma A375 e testadas quanta à imuno-reactividade com anti-6-19. As fracções de pico da actividade GIA eluiram entre as fracções 35 e 40, muito antes do grasso de material absorvente em AggQ. A fracção de pico da actividade GIA, precisa, não pôde ser determinada nesta experiência, porque as fracções de pico tinham mais actividade do que a que poderia ser rigorosamente medida às diluições testadas.

A análise de imuno-mancha indicou que a forma M_r 32 000 da oncostatina M eluiu com fracções contenda o grosso da actividade GIA. Em contraste, a forma M_r 36 000 eluiu várias fracções adiante (pico na fracção 33) do pico principal da actividade GIA. Dado que as fracções contendo a forma M_r 36 000 coraram mais intensamente, mas tinham actividade GIA menor do que a forma M_r

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Re-f! 5624-154-118

000, a actividade GIA específica da forma M_r 36 000 parece ser menor do que a da forma M_r 32 000.

Para fazer comparações quantitativas das actividades biológicas das formas M_r 32 000 e M_r 36 000, as fraeções, fraccionadas por tamanhos, contendo predominantemente uma ou outra forma, foram reunidas e comparadas quanto às actividades GIA e RRA. Para esta análise, usou-se uma coluna diferente (TSK 3000SW) que deu resultados qualitativamente semelhantes ao BioGel P60, mas proporcionou melhor separação entre as formas M_r 36 000 e M_r 32 000. as fraeções reunidas foram analisadas por imuno-mancha para confirmar a ausência de contaminação cruzada com a outra forma de oncostatina Μ. A análise dos geles corados, seguida por SDS-PAGE, indicou que a pureza de cada forma de oncostatina M era de aproximadamente 20% para a forma M_r 36 000 e de 80% para a forma M_r 32 000. Como se mostra na Tabela IV, a M_r 36 000 parcialmente purificada tinha menor actividade GIA, mas maior actividade RRA, do que a forma M_r 32 000. Esta diferença é aparente na razão aproximadamente 10 vezes maior, entre estas actividades da forma M_r 32 000 em relação à forma M_r 36 000.

TABELA IV

AMOSTRA ACTIVIDADE GIA ¹

ACTIVIDADE RRA¹ RAZÃO^{* 5}

Forma 36K 104

Forma 32K 345

43,5 2,4

17,9 19,2

As fraeções contendo as formas M_r 36 000 ou M_r 32 000 foram reunidas, e testaram-se alíquotas quanto às actividades inibidora do crescimento (GIA) e radio-receptora (RRA) .

Unidades/ml (xlO ³).

⁵ Razão entre actividade GIA e actividade RRA.

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Re-f: 5624-154-118

Claims (12)

1. REIVINDICAÇÕES

   1 - Processo de obtenção de um mutante da oncostatina M que compreende substancialmente a sequência de aminoácidos seguinte;

   caracterizado por se proceder à delecção de quaisquer aminoácidos desde o resídua na posição 186, inclusivé, até ao resíduo, do terminal carboxilo, na posição 227, inclusivé.
2. 2 - Processo de acorda com a reivindicação 1, caracterizado por se proceder à delecção dos aminoácidos 186 até 227.
3. 3 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se proceder à delecção dos aminoácidos 196 até 227.
4. 4 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se proceder à delecção dos aminoácidos 189 até 227.

   71 944

   Ref: 5624-154-118
5. 5 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se proceder à delecção dos aminoácidos 188 até 227.
6. 6 - Processo de obtenção de um mutante da oncostatina M que compreende substancialmente a sequência de aminoácidos apresentada na reivindicação 1, caracterizada por se proceder à substituição de qualquer um dos aminoácidos nas posições 6, 80 e 1S7, por um aminoácido diferente da cisteína.
7. 7 - Processo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por o aminoácido substituído ser a serina.
8. 8 - Processo de obtenção de um mutante da oncostatina M, que compreende substancialmente a sequência de aminoácidos representada na reivindicação 1, caracterizado por se proceder à delecção dos aminoácidos 87 até 90.
9. 9 - Processo de obtenção de um mutante da oncostatina ΙΊ que compreende substancialmente a sequência de aminoácidos representada na reivindicação 1, caracterizado por se proceder à delecção dos aminoácidos 158 a 155.
10. 10 - Processo de obtenção de um mutante da oncostatina M compreendendo substancialmente a sequência de aminoácidos representada na reivindicação 1, caracterizado por se proceder à substituição de qualquer um dos aminoácidos nas posições 195 e 196 por um aminoácido diferente da arginina.
11. 11 - Processo de acordo com a reivindicação 10, caracteriza do por o aminoácido substituído ser a glicina.
12. 12 - Processo de obtenção de um mutante da oncostatina M que compreende substancialmente a sequência de aminoácidos

    71 944

    Re-f: 56S4-154-118

    -45representada na reivindicação 1, caracterizado por se inserção da sequência de aminoácidos GAG, entre os 103 e 104.

    proceder à aminoácidos