JPH05504134A - オンコスタチンｍ活性を有する新規なタンパク質及びそれらの調製方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

オンコスタチンＭ活性を存する新規なタンパク質及びそれらの本発明は、欠失変 異体、置換変異体、挿入変異体及びプロセッシング変異体を含む、オンコスタチ ンＭ生物活性を有するオンコスタチン間変異体並びに類縁体に関する。本発明の オンコスタチン間変異体は天然オンコスタチンＭよりも大きいか、または小さい 程度にオンコスタチンＭて誘発される生物応答を惹起するのに有益であり得る。 本発明は、種々のオンコスタチン間変異体か調製され、そして性格づけされる実 施例により説明される。 ２、発明の背景 ヒト腫瘍細胞系に関するその阻止効果について最初に同定されたオンコスタチン Ｍは、フォルボール テート（ＰＭＡ）誘発ヒト細網肉腫細胞（Ｚａｒｌｉｎｇら、１９８６．　Ｐｒ ｏｃ．　Ｎａ　ｔ　ｌ。 Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ８３：９７３９−９７４３）及び活性Ｔリンパ球 （Ｂｒｏｗｎら、１９８７。 Ｊ．　Ｉｍｍｕｎｏｌ．　１３９：２９７７−２９８３）から最初に単離された 。その分子は、−重鎖ポリベブチドＭ　、　＝２８，０００を含む熱と酸に安定 なタンパク質である。その他の天然産成長調節因子と同様に、オンコスタチンＭ は種々の生物活性を示す。増殖阻止は、全部ではないか一部のヒト腫瘍細胞系で 観察される。対照的に、ヒト包皮繊維芽細胞または［−３８細胞の如き幾つかの 正常な繊維芽細胞の増殖はオンコスタチンＭへの暴露により刺激される（Ｚａｒ ｌｉｎｇら、１９８６．　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８ ３：９７３９−９７４３）。 オンコスタチンＭの遺伝子かクローン化され、配列決定され、そして組換えオン コスタチンＭの活性形態が最近哺乳類細胞で発現された（１９８８年１月１５日 に出願された共同未決米国特許出願第１４４、　５７４号明細書、これは参考と して本明細書にそのまま含まれる）。オンコスタチンＭの成熟形態は２２８のア ミノ酸を含む糖タンパク質てあり、そのアミノ酸の５個はシスティン残基である 。 そのタンパク質は極めて親水性のカルボキン末端領域を有する。 オンコスタチンＭはその他の既知のサイトカインに構造上関係しないか、そのｍ ＲＮＡはその３゛非翻訳末端でＡＵに富む領域を含む。オンコスタチンＭメツセ ージ中のこの領域は多くのサイトカイン、リンフ才力イン及びその他の成長調節 分子の領域に相同であり、遺伝子発現を調節する共通のモードを示唆する。オン コスタチンＭの細胞受容体か種々の哺乳類細胞で見られた。主なオンコスタチン 間受容体分子はＭ　、　＝１５０，０００−１６０，０００の特定のタンパク質 である（Ｌｉｎｓｌｅｙら、１９８９．　Ｊ．　Ｂｊｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２６ ４　：６５２８−６５３２）。 ３、発明の要約 本発明は、オンコスタチンＭの欠失変異体、プロセッシング変異体、挿入変異体 及び／または置換変異体、並びにその誘導体及びフラグメントを含む新規な組成 物に関する。また、本発明は組換え系中のオンコスタチン間変異体の発現に関す る。また、オンコスタチン間受容体に特異的に結合し得るオンコスタチンＭ結合 領域の二次構造を有する組成物か提供される。オンコスタチン間変異体は、宿主 細胞を所望のオンコスタチン間変異体ポリペプチドを暗号化するＤＮＡ配列を含 む発現ベクターで形質転換し、形質転換した宿主細胞を増殖させて外来性ＤＮＡ 配列を発現し、そして細胞溶解産物またはならし増殖培地から得られるオンコス タチン間変異体ポリペプチドを回収することにより調製し得る。オンコスタチン 間変異体ポリペプチドは天然のオンコスタチンＭに較へて変性された生物活性、 特に増殖阻止活性を有することかできる。 本発明の組成物は、とりわけ、新生細胞増殖を変調するのに有益であり得る。 ４、

【図面の簡単な説明】

図１、オンコスタチンＭのアミノ酸配列及び機能領域の略図。 アミノ酸は通常の１文字コードにより表される。 図２．Ｃー末端欠失オンコスタチンＭ変異体の増殖阻止活性。 図３．システィンからセリンへのオンコスタチン間変異体の増殖阻止活性。 ５、発明の詳細な説明 本発明はオンコスタチンＭ生物活性を保持するオンコスタチン間変異体に関する 。本発明は、一部、必須のオンコスタチンＭ機能領域の解明及び成る突然変異か 生物活性を保存するだけでなく、成る場合に、生物活性をかなり高めるという発 見に基いている。 本発明は、種々の欠失変異体、プロセッシング変異体、挿入変異体及び置換変異 体オンコスタチンＭポリペプチドか組換えＤＮＡ突然変異誘発技術及び発現技術 を使用して調製され、そして性格つけされる実施例により説明される。 特別な実施態様では、天然オンコスタチンのカルボキシ末端の４２のアミノ酸の 一部または全部が除去されたオンコスタチン間欠失変異体が調製される。オンコ スタチンＭの構造（図１）中の位置＋８６の残基から位置２２７のカルボキシ末 端残基までのアミノ酸のいずれかが欠失されて生物活性オンコスタチンＭ変異体 を生じることかできる。これらのオンコスタチン間欠失変異体は生物活性を保持 するだけでなく、幾つかか天然オンコスタチンＭ種よりもかなり活性である。 別の実施態様では、天然オンコスタチンＭのシスティン残基の少なくとも一つか システィン以外のアミノ酸、好ましくはセリンにより置換されているオンコスタ チン間置換変異体が調製される。 本件出願人の置換突然変異誘発の研究は、天然オンコスタチンＭ二次構造中に存 在する二つのジスルフィド結合のうち、システィン残基４９と１６７の間の結合 のみかオンコスタチンＭ生物活性に必要とされることを明らかにした。それ故、 残基の位置６及び１２７にあるシスティンの間のジスルフィド結合を排除するこ とは機能上の能力をそこなわないので、そのジスルフィド結合を形成し得ないオ ンコスタチン間変異体はそれにもかかわらず生物活性で、機能的な増殖変調ポリ ペプチドである。以下の実施例に更に詳しく説明されるように、このような生物 活性オンコスタチンＭ置換変異体は、この“必須でない“ジスルフィド結合に関 与するシスティン残基のいずれか、またはその両方を置換することにより調製し 得る。更に、位置８０のシスティン残基は生物活性を犠牲にしないで置換し得る 。本発明のオンコスタチン間置換変異体は、それらの調製、製薬組成物への製剤 化、及び／または所望の生物応答に作用する能力に関して天然オンコスタチンＭ よりも利点を有することができる。例えば、このようなオンコスタチン間置換変 異体は、ジスルフィド結合スクランプリング（ｓｃｒａｍｂｌｉｎｇ）及び得ら れる二次構造の歪みを最小にし、または実際に排除するように操作し得る。 本発明の上記の実施態様及びその他の実施態様は、本発明のオンコスタチン間変 異体の調製及びその使用に関する本件出願人の研究及び発見を代表する以下の実 施例により説明される。これらの研究及び発見の結果として、機能上の保全性を 保存するように維持される必要があり、またそのようにすべきであるオンコスタ チンＭ樽造の種々の特徴か、同定され、そして本発明のオンコスタチン間変異体 を調製する場合にこれらの特徴か考慮されるへきである。これに関して、機能上 重要な配列かオンコスタチンＭポリペプチド中に存在し、そして単一領域に制限 されない。例えば、スキャンニング欠失及び挿入突然変異誘発は、アミノ酸残基 ２２−３６及び４４−７７か生物活性に必須であることを同定する。また、Ｃ− 末端残基から位置１８６までの欠失は生物活性を損なわないが、アミノ酸１８５ −１８２を欠く変異体は活性を有しない。オンコスタチンＭの増殖阻止活性及び 受容体結合活性に重要なその他の配列は残基１１８−１２１及び１７８−１８１ を含み、これらの配列はオンコスタチンＭ及びオンコスタチン間変異体の正確な プロセッシング及び／または哺乳類による分泌に必須であり得る。何となれば、 これらの配列を欠くオンコスタチン間変異体は検出できなかったからである。 同様に、位置７１のアスパラギン残基を維持することは、充分な生物活性及び／ または哺乳類細胞からの分泌に必要であり得る。 強い両親媒性の領域はＣ１６７とＲ１９６のペプチド開裂部位の間のオンコスタ チンＭ０）Ｃ−末端で生じる。位置】７６及び１８４てフェニルアラニンをグリ シンに置換することは活性を損なうか、位置１７１．１７４及び１７８でヒスチ ジンをグリシンに置換することは生物機能に影響しない。 カルボキシ末端とアミン末端の緊密な物理的会合か、全部ではないか一部のカル ボキシ末端欠失変異体中のアミノ末端エピトープの遮断により示唆されるように 存在し得る。 本発明のオンフスタチンＭ変異体及びその類縁体は、天然オンコスタチンＭポリ ペプチドそれ自体を組換えＤＮＡ技術により修飾することにより、そして固相ペ プチド合成の如き化学合成技術により調製し得る。 本発明によれば、少なくとも一つのオンコスタチン間活性を有する新規なりＮＡ 槽構造び新規なポリペプチド組成物か提供される。 活性の絶対量は天然オンコスタチンＭの活性よりも高いか、またはそれより低い ものてあり得る。オンコスタチン間活性を有するポリペプチドは、Ｃ−末端領域 の少なくとも実質的に全部か欠失されたオンコスタチンＭの欠失変異体タンパク 質を含むたけてなく、天然オンコスタチンＭの結合部位と同じ二次構造を有する 変異体タンパク質を含む。オンコスタチン間活性を有する所望のポリペプチドを 暗号化するＤＮＡ配列を含むプラスミド構成物が、宿主細胞を形質転換するのに 使用され、この宿主細胞か培養されて所望のポリペプチドを発現する。次に、形 質転換した宿主細胞か増殖されて挿入ＤＮＡ配列を発現する。宿主細胞は真核細 胞または原咳細胞であってもよい。 ヒトオンコスタチンＭは下記のアミノ酸配列を有する。 アミノ酸に関して１文字略号が使用され、下記の意味を有する。 Ａ＝アラニン１Ｒ：アルギニン、Ｎ＝アスパラギン、Ｄ＝アスパラギン酸：Ｃ・ システィン：Ａ・グルタミン、Ｅ＝グルタミン酸＋Ｇ＝グリシン：Ｈ＝ヒスチジ ン、Ｆ＝イソロイシン；Ｌ＝ロイシン、に＝　リシン、Ｍ＝メチオニン、Ｆ＝フ ェニルアラニン、Ｐ＝ニブロリンＳ：セリン；Ｔ：スレ才ニン、Ｗ＝ニトリブト ファンＹ＝チロシン：そしてＶ＝バリン。 オンコスタチンＭは、還元条件または非還元条件下でポリアクリルアミドゲル電 気泳動により測定して約３２−３６ｋＤの分子量を育すると更に性格づけされる 。単離されたオンコスタチンＭの活性製剤は、多量のマンノースと複合体冶連鎖 オリゴ糖の混合物を含む。しかしなから、オンコスタチンＭの非グリコジル化製 剤は細胞増殖変調活性を保持する。 また、オンコスタチンＭは成る種の細胞株に対するその活性により性格づけされ る。オンコスタチンＭは、Ｗ＋３８細胞及びＷ［２６細胞により例示されるよう な正常なヒト繊維芽細胞の増殖を刺激し、そしてＡ３７５、ＨＢＴＩＯ、Ａ３４ ９及びＳＫ−！１ｌＥＬ２８の如き腫瘍細胞の増殖を阻止し、正常な骨髄からの コロニー形成細胞の増殖を増大し得る。 しかしなから、それはＷＩ２６及びＷＩ３８ヒト繊維芽細胞、及びマウス上９２ ９細胞（これらは腫瘍壊死因子に感受性である）、並びにγ−インターフェロン 感受性ヒト腫瘍細胞系に対する細胞毒性活性を欠いている。オンコスタチンＭは 正常なヒトＴ−リンパ球の増殖を阻止しないし、そして１００ＧＩＡ単位／ｍｌ までの濃度で骨髄細胞からの顆粒球／骨髄法のコロニー形成を阻止しない。更に 、それは５００　ＣＩＡ単位／ｍｌの濃度で混合白血球培養反応（ＭＬＣ）に於 いてヒトの増殖性または細胞毒性のＴ細胞応答を抑制しない。オンコスタチンＭ は適度の酸及び塩基に対して安定であり、そして５６°Ｃの熱処理に対して安定 である。 本発明のポリペプチドは、夫々共通の特徴を有する種々の群のポリペプチドを含 み、そのポリペプチドはオンコスタチンＭの少なくとも一つの特徴を有するもの として性格づけされる。これらの群は、オンコスタチンＭの欠失変異体、プロセ ッシング変異体、もしくは置換変異体または天然オンコスタチンＭの結合領域と 同じ二次構造を有するポリペプチドであるという共通の特徴を含む。 また、ポリペプチドは、複数の置換突然変異、欠失突然変異、プロセッシング突 然変異及び／または挿入突然変異が移入される組み合わせ突然変異を含んでもよ い。本発明は、このようなオンコスタチンＭの類縁体、変異体、及びこれらの機 能部分を含む。本発明のポリペプチドは、例えば免疫反応性であり、または受容 体を結合し得る少なくとも一つの生物活性配列を有し、この場合、このような配 列は生物学的性質に関して天然オンコスタチンＭと競合し得る。 以下の定義が使用される。 “欠失変異体″はオンコスタチンＭのＣ−末端領域の全部または一部を欠いてい る。 “置換変異体”は、一つのアミノ酸が他のアミノ酸により置換されたオンコスタ チン間変異体である。生物活性に不必要なスルフヒドリル基の置換か特に重要で ある。このような突然変異は、システィンの電荷特性及び空間充填特性と同様の 電荷特性及び空間充填特性を育する、他の未荷電のアミノ酸、例えば、セリン、 グリシン、スレオニン等、特にセリンによるシスティン残基の置換を含んでもよ い。 “プロセッシング変異体”は、成熟ポリペプチドのプロセッシングか阻止される ように、オンコスタチンＭポリペプチド中のタンパク質分解による開裂部位か突 然変異された変異体である。この変化は変性された生物活性を有する分子を生じ 得る。このようなプロセッシング部位の例はアミノ酸残基１９５及び１９６を含 む。 “挿入変異体”は、アミノ酸配列グリシン−アラニン−グリシンを暗号化するコ ドンが、機能上重要なアミノ酸を暗号化すると考えられるＤＮＡ配列の領域に配 置されている変異体である。例はアミノ酸位置５と６．７６と７７．１０３と１ ０４、及び１３９と１４０の間に配置された挿入を含む。 また、本発明のポリペプチドは、ポリペプチドの結合領域の二次構造が天然オン コスタチンＭの結合領域の二次構造と少なくとも実質的に同じであるポリペプチ ドを含む。“結合領域“は、天然オンコスタチンＭのＣ−末端の領域及びＮ−末 端の領域（これらはジスルフィド結合Ｃ４９−Ｃ１６７（図１を参照のこと）に より接近させられる）を意味し、その分子のその部分は高い親和性によりオンコ スタチン間受容体分子に特異的に結合し得る。その結合領域は、Ｃ−末端の領域 、特にアミノ酸１６８−１９５を含む領域中で両親媒性のらせんを有するものと して性格づけされる。“両親媒性のらせん“は、一つの側に疎水性アミノ酸残基 を有し、そして他の側に親水性の残基を育する領域を意味する。一般に、らせん は、約３０％〜５０％、一般に約４０％の疎水性アミノ酸、例えば、バリン、フ ェニルアラニン、メチオニン、ロイシン等、約３０％〜５０％、一般に約４０％ の親水性アミノ酸、例えば、チロシン、リシン、アルギニン、ヒスチジン、等； 及び約ｌＯ％〜４０％、一般に２０％の、少なくとも疎水性または親水性を実質 的に有しないアミノ酸、例えば、セリン、グリシン等を含む。Ｃ−末端領域中の ポリペプチドの一次構造が、水溶液、特に生理塩溶液等中で二次構造を維持し得 るポリペプチドか含まれ、この場合、その二次構造は同様の条件下の天然オンコ スタチンＭの二次構造と少なくとも実質的に同様である。 ポリペプチドのアミノ酸配列は天然オンコスタチンＭのアミノ酸配列と同じであ ってもよく、また異なっていてもよく、通常は同様である。その構造か異なる場 合、置換は、二次構造及びオンコスタチン間受容体特異的結合能力を少なくとも 実質的に維持するように、その他のアミノ酸を一つの疎水性アミノ酸に置換し、 且つ／またはその他のアミノ酸、特に同様の電荷特性及び空間充填特性を有する アミノ酸を一つの親水性アミノ酸に置換することにより行うことができる。オン コスタチンＭ受容体に結合されたポリペプチドの活性は天然オンコスタチンＭの 活性と同しである必要はなく、全体として、または一部で、オンコスタチンＮ４ の作用物質または拮抗物質の活性であってもよい。 “生物活性”は、細胞増殖変調活性、天然産ヒトオンコスタチンＭとの免疫交差 反応性、または高アフィニティーオンコスタチンＭ受容体結合を含むことを意味 する。“細胞増殖変調活性”は天然産オンコスタチンＭの生物活性を意味し、こ れは新生物細胞の増殖の阻止及び正常な細胞（造血系の細胞を含む）の増殖の刺 激を含む。細胞増殖変調活性は天然産オンコスタチンＭと異なっていてもよく、 通常、低下される。“生物活性配列”は、ポリペプチドの全長までを構成するア ミノ酸配列を意味する。“免疫交差反応性”は、本発明の新規ポリペプチドによ り誘導された抗体か無傷のオンコスタチンＭ（少なくともオンコスタチンＭが自 然な状態にある場合）に特異的に結合すること、及びオンコスタチンＭ及び新規 ペプチドが共通のエピトープ部位を有する場合にオンコスタチンＭの抗体が新規 ペプチドに特異的に結合することを意味する。 “オンコスタチンＭ受容体”は、高親和性でオンコスタチンＭを特異的に結合す る細胞の表面の結合部位を意味し、その結合は飽和性であり、構造上関係しない ポリペプチドにより阻止されない。“類縁体”は、オンコスタチンＭの生物活性 に相当する少なくとも一つの生物活性を育し、そしてオンコスタチンＭのアミノ 酸配列の少なくとも一部に実質的に等しいアミノ酸配列を含む化合物を意味する 。類縁体は天然オンコスタチンＭと比較して更に多いか、または少ないアミノ酸 を含んでもよい。 種々のオンコスタチンＭの変異体及び類縁体は、出発物質として天然産オンコス タチンＭまたは組み換えオンコスタチンＭを使用して調製し得る。オンコスタチ ンＭは、天然源、特に、インゲノールまたはフォルボールの如き適当なインデュ ーサーか補給され、そしてヒト細網肉腫から誘導された細胞系（［９３７）（Ｓ ｕｎｄｓｔｒｏｍ及びＮｉ　１ｓｓｏｎ、　１９７６、　ｔｎｔ、　Ｊ、　Ｃａ ｎｃｅｒ　１７：５６５−５７７）により状態調節された増殖培地またはフィト ヘマグルチニン（ＰＨＡ）の如きマイトジェンか補給され、そして末梢血リンパ 球（ＰＢＬ）により状態調節された増殖培地から得ることかできる。オンコスタ チンＭの変異体及び類縁体は、当業界で公知の種々の精製技術（溶剤抽出、ゲル 透過クロマトグラフィー、逆相ＨＰＬＣ１電気泳動等を含むか、これらに限定さ れない）を使用することにより細胞成分を少なくとも実質的に含まないように精 製し得る。オンコスタチンＭのＣ−末端の欠失変異体は、全長のオンコスタチン Ｍのタンパク質分解による開裂、続いて一度に少な（とも一つのアミノ酸のカル ボキシ末端のトランケーションにより得ることかできる。その分子のＣ−末端部 分の全部までが全長のオンコスタチンＭから欠失し得る。 “Ｃ−末端部分″はアミノ酸１８６〜２２７（図１を参照のこと）を意味する。 また、オンコスタチンＭの欠失変異体、プロセッシング変異体及び置換変異体は 、組換えＤＮＡ技術により調製し得る。オンコスタチンＭ遺伝子を単離するのに 使用される技術は当業界で公知であり、合成、ゲノムＤＮＡからの単離、ｃＤＮ Ａからの調製、またはこれらの組み合わせを含む。ＤＮＡの操作の種々の技術は 公知であり、制限、消化、切除、連結、試験管内の突然変異誘発、プライマー修 復、及びポリリンカー並びにアダプター、等を含む。ＭａｎｉａｔｉＳら、Ｍｏ １ｅｃｕｌａｒ　ＣＩｏｎｉｎｇ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌ ａｂｏｒａｔｏｒｙ、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ （１９８２）を参照のこと。一般に、その方法は、オンコスタチンＭを合成する 細胞、例えば、細網肉腫細胞（（Ｊ９３７）またはＰＢＬからｃＤＮＡライブラ リーをつくり、スクリーニングすることを含む。プローブを使用してオンコスタ チンＭをｍＲＮＡ暗号化するアッセイ、またはオンコスタチンＭの発現について 分析し、次にオンコスタチンＭの抗体てスクリーニングして交差反応性ペプチド フラグメントを検出するアッセイ等が使用し得る。 オンコスタチンＭをコードする配列を含むｃＤＮＡが一旦同定されると、構造遺 伝子中の所望の修飾か幾つかの方法て行うことかてきる。修飾は、上記の欠失、 挿入、これらの組み合わせ、並びに置換を伴い得る。欠失の如き変化は、Ｃ−末 端領域、特にアミノ酸１８６〜Ｃ−末端を暗号化する領域を伴い得る。 欠失は、当業者に知られている幾つかの方法で行うことかでき、これらの方法は 全長のオンコスタチンＭのｃＤＮＡの酵素的切断、続いて精製フラグメントの修 飾及び連結、または部位特異的突然変異誘発、特にＫｒａｍｅｒら、Ｎｕｃｌ、 Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、（１９８４）　１２：９４４１−９４５６に記載されたよ うなルーブーアウト（ｌｏｏｐ−Ｏｕｔ）突然変異誘発を含む。 本発明の目的のために、種々のアミノ酸は幾つかのサブクラスに分けることかで きる。下記の表はサブクラスを示す。 脂肪族 中性 無極性　ＧＡＰＶＬ　１ 極性　ＳＴＣＭＮＱ 酸性　ＤＥ 塩基性　ＫＲ 芳香族　ＦＨＹＷ “保存的置換”は、同じサブクラス（即ち、中性脂肪族、酸性脂肪族、塩基性脂 肪族または芳香族）、更に特別には同し極性からのアミノ酸か互いに置換される ことを意味する。望ましくは、２〜４個の炭素原子または５〜６個の炭素原子の アミノ酸が脂肪族サブクラスのモノマー群を形成する。 高分子量ポリペプチドは、一つのポリペプチドフラグメントを大きな免疫原性ポ リペプチドキャリヤーに連結して免疫原性を与えることにより調製し得る。この ようなタンパク質キャリヤーの例は、ウシ血清アルブミン、キーホールリンペッ トヘモシアニン（ＫＬＨ）等である。これらの複合ポリペプチドは適当な宿主生 物中に抗体を誘導するのに有益である。抗体は体液中のすンコスタチンＭの存在 及び／または濃度を測定するのに使用でき、その存在は更に腫瘍細胞の存在を検 出するための手段として使用でき、オンコスタチンＭに結合し、こうしてその活 性を変調するのに使用でき、そしてオンコスタチンＭをアフィニティーカラム中 の使用によるように精製するのに使用できる。次に、こうして得られた遺伝子は 当業界で公知の種々の方法で操作されて発現を与えることができる。原核生物宿 主及び真核生物宿主の両方か使用でき、これらはバクテリア、酵母、昆虫細胞及 び哺乳類細胞、例えば、Ｅ、ｃｏｌｉ、　ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、サル腎臓細 胞、及び蚕細胞（ｓｆ９）を含んでもよい。それ故、遺伝子がオンコスタチンＭ の野生型の転写及び翻訳の調節領域を認識する宿主中で発現される場合、その野 生型の５−及び３′−調節領域を有する全遺伝子か適当な発現ベクターに導入し 得る。哺乳類ウィルス、例えば、シミアンウィルス４０、アデノウィルス、ウソ 乳頭腫ウィルス、ワクシニアウィルス、昆虫ハキュａウィルス、等からの複製系 を使用する種々の発現ベクターか存在する。これらの複製系は、移入体の選択を 可能にするマーカーを与えるだけでなく、遺伝子か挿入し得る都合のよい制限部 位を与えるために開発された。 遺伝子か天然産の野生型の転写及び翻訳の調節領域を認識しない宿主中で発現さ れる場合、更に別の操作か必要とされる。都合のよいことに、種々の３゛−転写 調節領域か知られており、終止フトンから下流に挿入し得る。構造遺伝子から上 流の暗号とならない５゛−領域は、エンドヌクレアーゼ制限、Ｂａ１３１制限、 等により除去し得る。また、都合のよい制限部位か構造遺伝子の５−末端付近に 存在する場合、構造遺伝子かＭ限でき、アダプターか構造遺伝子をプロモーター 領域に連鎖するのに使用でき、この場合、アダプターは構造遺伝子の損失ヌクレ オチドを与える。 種々の戦略か発現カセットを与えるのに使用でき、これは転写の５’−３’一方 向に転写調節領域及び翻訳開始領域を育し、これはまた調節の誘導を可能にする 調節配列：開始領域の転写及び翻訳の調節下の構造遺伝子；並びに転写及び翻訳 の終止領域を含んでもよい。発現カセットは、発現生産物の安定性を与えるバク テリオファージまたはバクテリア遺伝子からのリーダー配列、及び発現生産物の 分泌を与える分泌リーダー配列、並びにマーカー遺伝子を更に含んでもよい。 開始領域及び終止領域は宿主細胞中で機能性であり、同種ＤＮＡ配列（もとの宿 主から誘導）、または異種１１ＮＡ配列（外米源から誘導）または合成りＮＡ配 列であってもよい。こうして、発現カセットは天然源から全部または一部誘導さ れてもよく、源から全部または一部誘導されてもよく、宿主と同種の源、もしく は宿主と異種の源から全部または一部誘導されてもよい。本発明の種々のＤＮＡ 構成物（ＤＮＡ配列、ベクター、プラスミド、発現カセット）は単離及び／また は精製され、または合成され、こうして“天然産”ではない。 最適の遺伝子発現のため、翻訳開始コドンＡＴＧを包囲するヌクレオチド配列か 動物細胞で重要であることがわかった。例えば、Ｋｏｚａｋ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏ ｌ、Ｒｅｖｉｅｗｓ（１９８３）　４７：１−４５は、ＣＯ３細胞中のインシュ リンの如きポリペプチドの発現に関するこれらの領域の効果を徹底的に研究して いた。こうして、開始コドンを包囲するヌクレオチド配列を修飾することが必要 であり得る。これは、部位特異的突然変異誘発により、または外来遺伝子を高度 に発現された遺伝子の開始領域に融合することにより行うことができる。 例示の転写調節領域またはプロモーターは、バクテリアに関して、β−ｇａ？プ ロモーター、ラムダの左右のプロモーター、ｔｒｐ及びＩａｃプロモーター、ｔ ｒｐ−１ａＣ融合プロモーター、等：酵母に関して、解糖酵素プロモーター、例 えば、ＡＤ）Ｉ−１及び−ＴＩプロモーター、ＧＰＫプロモーター、及びＰＣＩ プロモーター、ＴＲＰプロモーター、等；哺乳類細胞に関して、ＳＶ４０初期及 び後期プロモーター、アデノウィルス主後期プロモーター、等を含む。 転写調節領域か、例えば、増殖培地中の栄養素または発現生産物の存在または不 在、温度、等により構造遺伝子の発現が変調されることを可能にする調節配列を 更に含む場合、その調節領域は例えばバクテリオファージラムダＯ，オペレータ ー及びＣｌ８５７温度感受性リプレッサーと一緒にバクテリオファージラムダＰ Ｌプロモーターを含んでもよく、構造遺伝子の温度感受性発現を与えることかで きる。プロモーターの調節はリプレッサーとオペレーターの相互作用により得ら れる。 真核細胞中では、調節配列は、例えば、サイトメガロウィルスエンハンサ−配列 を含むことができ、これはＳＶ４０プロモーターの如きプロモーター配列に融合 されてキメラプロモーターを形成でき、または、発現カセットのいずれかの場所 （好ましくはプロモーター配列に接近した場所）に挿入し得る。また、構造遺伝 子の発現は、例えば、優性な増幅可能な遺伝マーカー５゛または３°の遺伝子を 構造遺伝子にタンデムにつなぎ、そして宿主細胞を選択条件下で増殖させること により増幅し得る。増幅可能な遺伝子の例はジヒドロ葉酸レダクターゼ（ｄｈｆ ｒ）の遺伝子であり、その発現は葉酸拮抗物質であるメトトレキセー）　（ｍｔ ｘ）に対して抵抗性にされた細胞中で増大し得る。 ｌａｃオペレーター−プロモーター、ｔａｃプロモーター、またはラムダＰＬプ ロモーターー〇、オペレーター、および温度感受性リプレッサーを、特にλ−Ｃ ｒｏ、　ｌａｃまたはＮ−遺伝子リポソーム結合部位と共に使用するオンコスタ チンＭを発現し得る発現カセットは特に興味かもてるものである。構造遺伝子は 、転写調節領域と翻訳調節領域の調節支配下に置かれるように、リポソーム結合 部位の下流に連結する。これは１９８８年ｌＯ月２８日付けのＵＳＳＮ　２６４ ，０９８に記載されており、その開示内容を参照によりここに引用するものとす る。 発現産物の安定性は、例えばバクテリオファージラムダのＮ−遺伝子またはＣｒ ｏ遺伝子、あるいは細菌のアルカリ性ホスファターゼ遺伝子由来の、Ｎ−末端ア ミノ酸を含む融合タンパク質の合成を導くことにより達成される。リーダー配列 は構造遺伝子の上流に同じリーディングフレームで供給される。対象となるリー ダー配列は原核生物遺伝子、例えばバクテリオファージラムダのＮ−遺伝子また はＣｒｏ遺伝子、あるいは細菌のアルカリ性ホスファターゼ遺伝子由来の、約８ −３５個、好ましくは約１５−２５個のＮ−末端アミノ酸を含む。例えば、１９ ８８年１０月２８日付はノＵＳＳＮ　２６４．０９８を参照すれたい。 さらに、融合遺伝子は分泌リーダーおよびプロセッシングシグナルをコードする ５′−配列を構造遺伝子に供給することにより作製される。分泌リーダーの例に はペニシリナーゼ、α−因子、免疫グロブリン、Ｔ−細胞受容体、外層膜タンパ ク質、血清アルブミン、インシュリン、消化酵素、β−トランスフォーミング成 成長壬子との分泌リーダーが含まれる。分泌リーダーと構造遺伝子を適切なリー ディングフレームで融合させると、成熟オンコスタチンＭまたは類縁体が培地に 分泌される。例えば、１９８８年１月１５日付けのＵＳＳＮ　１４４．５７４を 参照されたい。 構造遺伝子とリーダー配列間に少なくとも１個の追加のアミノ酸を挿入すること かでき、この介在アミノ酸は例えば融合タンパク質を切断するための酵素的また は化学的切断部位を提供する。 また、リーダー配列と構造遺伝子産物からなる融合タンパク質は成熟ポリペプチ ドの切断なしに使用することもできる。 発現カセットは適当な細胞宿主内でのエビソーム維持のために複製系に挿入され るか、または複製系なして供給され、その場合は宿主ゲノム内に組み込まれる。 ＤＮＡは既知の技法、例えば形質転換、リン酸カルシウム沈降ＤＮＡを用いるト ランスフェクション、ニレクトロボレーション、組み換えウィルスによるトラン スフェクション、細胞へのＤＮＡの顧微注入などを使って、宿主に導入すること ができる。 ひとたび構造遺伝子か適切な宿主に導入されたら、その構造遺伝子を発現させる ために宿主を増殖させる。宿主細胞は適当な培地て高密度へ増殖させる。原核細 胞系のように、プロモーターか誘導可能である場合は、その後温度変化、枯渇、 または過剰の代謝産物や栄養分なとの許容できる条件か採用されるだろう。哺乳 動物細胞系では、増幅可能な遺伝子を構造遺伝子と直列配置で使用する場合に、 相応の増幅手段か採用されるだろう。 融合または非融合発現産物は、分泌される場合、慣用手段によって増殖培地から 単離することかできる。分泌されない場合は、宿主細胞を回収して、通常の条件 に従って細胞を溶解する。その後、目的とする産物をクロマトグラフィー、電気 泳動、溶剤抽出などの既知の技法により単離・精製する。 組み換え産物はグリコジル化されないか、またはグリコジル化されて、野生塁も しくは他のグリコジル化を有する。一般に、グリコジル化は野生型グリコジル化 と約５０％以上、通常は約２０％以上相違しないだろう。グリコジル化の量は伺 々のペプチドの配列とそれを生産する生物に幾分か左右される。かくして、大腸 菌細胞での生産物の発現は非グリコジル化産物をもたらし、そして昆虫細胞での 生産物の発現は哺乳動物細胞での生産物の発現よりも少ないグリコジル化をもた らすだろう。 ５．１６　オンコスタチンＭ変異体および類縁体の使用オンコスタチンＭ変異体 および類縁体ポリペプチド並びにその組成物は、ｉｎ　ｖｉｖｏまたはｉｎ　ｖ ｉｔｒｏで用いる抗体をつくるために使用される。抗体は、免疫原として本ポリ ペプチドを使用し、そのポリペプチドを哺乳動物（例えば、マウス、ウシ、ヤギ 、ヒツジ、ウサギ）に、特にアジュバント　（例えば、完全ツウインドアジュバ ント、水酸化アルミニウムゲルなと）と共に注射することにより、通常の方法で つくることができる。その後、宿主から採血し、その血液をポリクローナル抗体 の単離のために使用するか、または、マウスの場合は、本化合物に対し特異的な 抗体のモノクローナル発現のために染色体を不死化する適当なミエローマ細胞と 融合させるべく、末梢血リンパ球または膵臓リンパ球（Ｂ−細胞）を使用する。 ポリクローナル抗体あるいはモノクローナル抗体かつくられる。 オンコスタチンＭ変異体、類縁体およびその組成物はオンコスタチンＭ受容体の 存在を検出するためのリガンドとして使用される。この方法では、オンコスタチ ンＭ受容体の存在および密度により細胞を識別することかてき、かかる受容体の 存在に対する各種化合物の作用を監視し、かつ特定のオンコスタチンＭ変異体ま たは類縁体の作用に対する所定の細胞の感受性を調べる。さらに、オンコスタチ ンソ一様生物学的活性をもっと考えられるペプチドは、オンコスタチンＭ受容体 に結合するその能力を、天然に存在するオンコスタチンＭのその能力と比較する ことにより評価する二とができる。一般に、被検ペプチドを障識オンコスタチン Ｍまたは他の標識ペプチド（オンコスタチン間受容体に高親和結合しうるもの） およびオンコスタチン間受容体を含む調製物と共にインキュベ−１−Ｌ、、以下 の実施例で述べるように、標識オンコスタチンＭの結合阻止の程度を観測するこ とにより、そのペプチドを評価することかできる。その後、以下の実施例に記載 するように、オンコスタチンＭと関連した生物学的作用（例えば、腫瘍細胞の増 殖抑制）に対するそのペプチドの作用を観察することにより、受容体に結合する 被検ペプチドかオンコスタチンＭアゴニストであるのかアンタゴニストであるの か評価を下すことかできる。 オンコスタチン部変異体、類縁体およびその組成物は、血液、肺、乳房器官、前 立腺、腸、肝臓、心臓、皮膚、膵臓、脳なとのいろいろな器官に影響を及ぼす多 種多様の新生物疾患、例えばガン、肉腫、黒色腫、リンパ腫、白血病なとの治療 に使用される。 それらは病変部内、腹腔内、皮下に注射されるか、または他の適当な投与経路に よりｉｖ　ｖｉｖｏ投与される。滅菌水、リン酸緩衝溶液、食塩水、水性エタノ ールのような生理学的に許容される担体と共に投与してもよい。本化合物は自己 骨髄移植のために骨髄から悪性細胞を取り除くために、あるいは再注入の前に他 の組織（例えば血液）中の悪性細胞の増殖を抑制または排除するために１ｎｖｉ 　ｔｒｏて使用される。また、組成物はカポジ肉腫の増殖刺激活性を誘導したオ ンコスタチンＭのアンタゴニストとして、あるいはＩＣ３細胞内のＤＮＡ複製を 刺激してそれらを化学療法剤に対しより感受性にするために使用することかてき る。 オンコスタチン部変異体、類縁体およびその組成物は、さらに造血系の疾患の治 療において、特に骨髄機能か低下した患者、例えば再生不良性貧血、先天性また は後天性免疫不全症にかかつている患者、あるいは放射線療法や化学療法を受け る患者において造血を刺激する手段として使用される。 オンコスタチン部変異体、類縁体およびその組成物はまた、実質的に全ての皮膚 損傷、角膜損傷および上皮細胞の内層を有する中空器官の損傷を含めて、広範な 損傷の治療に使用される。この種の治療か適する損傷には火傷、擦過傷、切り傷 なとの外傷、および切開や皮膚移植のような外科手術から生じるものか含まれる 。本発明組成物による治療が適する他の疾患には慢性潰瘍、糖尿病性潰瘍、他の 非−治癒（栄養）疾患のような慢性疾患か含まれる。本化合物は患部への適用の ために生理学的に許容される担体と混和することかできる。担体の性質は広範に 変化し、意図する適用部位に左右されるだろう。皮膚へ適用する場合、通常クリ ームや軟膏の基剤が好適であり、適当な基剤としてはラノリン、シルバデン（Ｓ ｉｌｖａｄｅｎｅ；　Ｍａｒｉｏｎ）　（特に火傷治療用）、アクアフォア（Ａ ｑｕａｐｈＯｒ　；　コネチカット州すウスノルつ才−り、　Ｄｕｋｅ　Ｌａｂ ｏｒａｔｏｒｉｅｓ）などがある。所望により、損傷部へのペプチドの連続暴露 を与えるために、オンコスタチンＭ類縁体または変異体組成物を包帯や他の傷用 包帯にしみ込ませることか可能であるだろう。 エーロゾル適用も使用できる。 治療用組成物中のポリペプチドの濃度は限定的でない。ポリペプチドは上皮細胞 増殖誘導量で存在するだろう。本組成物は患部へ局所的に適用され、典型的には 点眼薬として眼に、クリーム、軟膏またはローションとして皮膚へ適用されるだ ろう。眼の場合は頻繁な治療か望ましく、通常４時間以内の間隔で投与される。 皮膚では、治療の間中治療用組成物を患部に保持することか望ましく、治療用組 成物を１日に２−４回またはそれより頻繁に塗布する。 本組成物はいろいろな方法で処方することかでき、特にリポソームか特定の腫瘍 性細胞を標的とするホーミング（ｈｏｍｉ　ｎｇ）分子、例えば抗体、非分解性 粒子マトリックスなどに結合される場合は、組成物をリポソームの内腔へ保持さ せる。緩衝剤、安定剤、界面活性剤、殺菌剤のような他の成分を含めることもで きる。これらの成分は文献に豊富な実例か載っており、ここで詳細に説明する必 要はない。 以下の実施例で得られた結果は、いくつかの変異体オンコスタチンＭポリペプチ ドか生物学的活性を保持し、ある場合には増強された生物学的活性を保有するこ とを証明している。かかる変異体を含む組成物は、ｉｎ　ｖｉｖｏとｉｎ　ｖｉ ｔｒｏの両方で、例えば培養下に、白血球搬出、予防および治療のｉｎ　ｖｉｖ ｏ用途などにおいて、細胞増殖の調節に使用される。一つの特定の用途は、生物 学的活性オンコスタチン間変異体ポリペプチドを使用して、骨髄中の腫瘍細胞の 増殖を抑制しかつコロニー細胞形成を刺激することにより、自己骨髄移植のため に細胞を処置することに関する。別の特定の用途は、オンコスタチン部変異体を 使用して上皮細胞の増殖を刺激し、それにより損傷治癒を促進することに関する 。さらに、変異体ポリペプチドは抗体形成を誘導するための免疫原としても使用 される。誘導された抗体は体液中に存在するオンコスタチンＭの量を測定し、か つ／またそれに結合することによりその因子の活性を調節するのに使用される。 本発明は例示によって詳細に説明されるか、当分針て通常の知識を育する者は、 添付した請求の範囲の精神から逸脱することなく、いくつかの変更および修飾か 可能であることを容易に理解するであろう。以下の実施例は例示するためのもの であって、制限するためのものではない。 Ａ３７５黒色腫、Ｈ２９８１およびＣＯＳ細胞はｌＯ％ウシ胎児血清（ＦＢＳ） を補給したダルベツコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）で培養した。 ６．１．２．　増殖阻止検定 増殖阻止活性（ＣＩＡ）は染料結合検定により測定した。９６−ウェルのマイク ロタイタープレート中のｌＯ％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含むＤＭＥＭ　Ｏ，１ ｍｌにＡ３７５黒色腫細胞（３−４ｘ　１０りをまいた。種々の濃度のオンコス タチンＭを０．１ｍｌの容量で加え、３７°Ｃで７２時間インキュベートした。 培地を除き、細胞をクリスタルバイオレ・ノドで染色し、マイクロタイタープレ ート読取機（ワシントン州シアトル、　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｓｙｓｔｅｍｓ　Ｃｏ ｒｐ、）を使って５９０　ｎｍでの吸光度で結合染料を測定して相対的な細胞増 殖を定量した。オンコスタチンＭの存在下での細胞増殖は未処理試料での増殖と 比較し、最大増殖阻止パーセントとして表した。試料は二通りまたは三通りずつ 検定した。オンコスタチンＭのＣＩＡ単位は阻止曲線から決定され、標準検定で Ａ３７５細胞の増殖を５０％阻止するのに必要なタンノくり質の量として定義さ れる。Ｇ４Ａ単位をタンパク質濃度について規格化した場合、規格化した値の変 動係数は一般に〈２０％であった。 ６、１．３．　ラジオレセプターアッセイオンコスタチンＭ処理の１６−２４時 間前に、４８−ウェルのプラスチック皿に１−３　Ｘ　１０’／ｃｍ’の密度で ８２９８１細胞をまいた。次第に増大する量のオンコスタチンＭまたは変異体オ ンコスタチンＭを含む結合緩衝液（Ｌｉｎｓｌｅｙ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８６ ．　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ旦２９７８−２９８６）　０．１ｍｌ中で、単層 を１２Ｓ７−オンコスタチンＭ　（２０ｎｇ／ｍｌ。 ０．７ｎＭ）とインキュベートした。結合反応は２３でて２−４時間実施した。 ５０−１００倍過剰の未標識オンコスタチンＭの存在下で非特異的結合を測定し た。特異的結合は全結合から過剰の未標識オンコスタチンＭの存在下で結合した 放射能を差し引くことにより算出し、通常全結合の７０−９５％の範囲であった 。二通りの測定値間の変動は一般に１０％未満であった。ラジオレセプターアッ セイ単位（ＲＲＡ　ｕｎｌｔ）は次第に増大する量の未標識オンコスタチンＭの 存在下で得られた阻止曲線から決定した。Ｉ　ＲＲＡ単位は標準検定で１２ｓＩ −オンコスタチンＭの結合を５０％阻止するのに必要なオンコスタチンＭの量と して定義される。 ＣＩＡまたはＲＲＡとして計算した比活性値（単位／ｍｇ）は実験間で２倍も変 動した。１つの実験内では、比活性の変動は、主として培地中の免疫反応性タン パク質を定量する際の変動のために、１５−３０％の範囲であった。相対比活性 値は、組み換え“野生型”オンコスタチンＭの比活性に対する変異体の比活性パ ーセントを示す。 相対比活性の誘導された変動係数は、平均２乗根として計算して、２２−４５％ の範囲であった。組み換え“野生型”オンコスタチンＶの１０％未満の相対比活 性をもたらす突然変異は生物学的活性を失ったとみなされる。 ６、１．４．　ラジオイムノアッセイ 無血清培地をＤＭＥＭで希釈し、ジチオトレイトールを１０　ｍＭの濃度で加え 、そしてタンパク質を煮沸して変性させた。この処理はその後のオンコスタチン Ｍの免疫反応性を高める。次いて処理培地の段階的希釈物をスロットプロット装 置（Ｍｉ　１ｌｉｐｏｒｅ）を通してニトロセルロース膜に塗布した。膜は、検 出のために抗−６−１９抗血清（以下のセクション６、１．５．　）と１２５１ −プロティンＡを使って、記載される通りに（Ｌｉｎｓｌｅｙ　ｅｔ　ａｌ、、 　１９８５．　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ。 Ｓｃｉ、　（ＵＳＡ）旦３５６−３６０）イムノブロッティング分析にかけた。 標準曲線は擬似トランスフェクトした細胞からの無血清培地で希釈した精製オン コスタチンＭを使って作成した。オートラジオグラフ上のバンド強度は走査デン シトメーターで測定し、トランスフェクトした細胞由来の培地中に存在するオン コスタチンＭの量は標準曲線との比較により定量した。大抵の場合、いくつかの 培地希釈率で測定して標準曲線の直線部分からのバンド強度を与えるオンコスタ チンＭの量を平均した：これらの測定値の変動係数は一般に〈１０％であった。 ６、１．５．　抗血清 オンコスタチンＭのアミノ酸６−１９および２０６−２１８　（図１）に対応す るペプチドを固相法で合成した。ペプチドはウシ免疫グロブリン（ペプチド６− １９）またはキーホールリンベットヘモシアニン（ペプチド２０６−２１８）に 結合させ、記載される通りに（Ｇｅｎｔｒｙ　ｅｔａｌ、、　１９８７．　Ｍｏ １．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、　７：　３４１８−３４２７；　Ｌｉｎ５ｌｅｙ 　ｅｔ　ａｌ、。 １９８５、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　（ＵＳＡ）　８ ２：　３５６−３６０）ウサギを免疫した。抗−６−Ｉ９については、免疫した ２匹のウサギに由来する血清の１．１混合物を使用した。 ６．１．６．　ＣＯＳ細胞トランスフェクションＣＯ５細胞は記載される通りに （Ｖａｌｉｋ　ｅｔ　ａｌ、、　＋９８９．　Ｍｏ１．　Ｃｅ１１、　Ｂｉｏｌ 、　９：　２８４７−２８５３）オンコスタチン間変異体コート化プラスミドで トランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後、無血清培地を加え 、細胞を３７°Ｃてさらに４８時間インキュベートした。ならし培地（ｃｏｎｄ ｉｔｉｏｎｅｄ　ｍｅｄｉｕｍ）を集め、検定した。 ６．２．　発現プラスミドの構築 オンコスタチンＭ　ｃＤＮＡ発現プラスミドｐｓＰＯＭはＭａｌｉｋ　ｅｔ　ａ ｌ、。 １９８９、　Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、　９：　２８４７−２８５３に 記載されている。オンコスタチン間シグナル配列をコードする配列がシミアンＴ ＧＦ−β１シグナルペプチドをコードする配列と置き換わった発現プラスミド（ ここではｐβ−０Ｍと呼ぶ）はＬｉｎ５ｌｅｙ　ｅｔ　ａｔ、、　１９８９．　 Ｊ、　Ｂｉ。 １、　Ｃｈｅｍ、　２６４：　４２８２−８９に記載されている。 ６．２．１．　欠失変異体構築物 オンコスタチンＭ欠失変異体（停止コドン挿入変異体）Δ１８２−２２７　、　 Δ１８３−２２７　、　Δ１８４−２２７　、　Δ１８６−２２７　、　△１８ ７−２２７　、　△１８８−２２７　、Δ１８９−２２７、Δ１９０−２２７　 、Δ１９５−２２７およびΔ１９６−２２７は、停止コドンとクローニング部位 をコードする３′オリゴヌクレオチドプライマーを用いたＰＣＲ増幅により構築 した。変異体Δ１９１　とΔ１８５は、オンコスタチンＭコード領域の３′末端 からの制限されたエキソヌクレアーゼ消化（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ、　１９８４　Ｇ ｅｎｅ　２８：３５１−３５９）により構築した。簡単に説明すると、オンコス タチンＭｃＤＮＡをプラスミドｐＳｐ６４　（Ｐｒｏｒｎｅｇａ）にサブクロー ニングし、ｃＤＮＡの３′末端近傍で線状化し、そしてエキソヌクレアーゼＩＴ ｌて制限消化に付した。その後、消化したｃＤＮＡの３′末端をＤＮＡポリメラ ーゼエのＫｌｅｎｏｗ断片て平滑末端とした。最後に、末端切断型ｃＤＮＡを翻 訳開始部位の５′側から３７塩基の遺伝子操作したＨｉｎｄｌＪ［部位てｐＳＰ ６４から切り出し、合成オリゴヌクレオチドリンカーＴＡＧＧＴＧＡＡＴＧＡＴ ＣＡＣおよびＴＣＧＡＧＴＧＡＴＣＡＴＴＣＡＣＣＴＡ　（それぞれのリーディ ングフレームで停止コドンをコードし、Ｘｈｏｌ制限部位に相補的な突出末端を 有する）を使って、ＨｉｎｄｌｌＩ−Ｘｈｏｌ切断πＨ３ＭＰＹ　（Ｓｔａｍｅ ｎｋｏｖｉｃ、　１９８９．　ＥＭＢＯＪ、）にクローニングした。１８３位と １９０位に導入した停止コドンを育する個々のクローン（Δ１８３−２２７およ び△１９０−２２７）はＤＮＡ配列解析により同定した。他の欠失変異体も同様 に構築した。 いくつかの別のオンコスタチン層欠失変異体（Δ４４−４７　、△８７−９０、 Δ１１８−１２１　、Δ１５２−１５５および６１７ｇ−１８１）はループアウ ト欠失法（Ｋｒａｍｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、前掲）を使って構築した。変異体構築 物はｐＨ３ＭＰＹのＨｉｎｄＩ［Ｉ−Ｘｈｏ１部位にサブクローニングし、制限 分析によりスクリーニングし、そして全コード領域の配列を決定することにより 同定した。 ６、２．２．　プロセッシング変異体構築物変異体クローンＧ１９５およびＧ１ ９６は商業キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を使ってオリゴヌクレオチド特異的突然 変異誘発により構築した。 １９５位または１９６位のアルギニン残基のグリシンへの変換を指令する誤対合 オリゴヌクレオチドを合成し、供給者の指示通りに使用して変異体クローンを構 築した。クローンＧ１９５およびＧ１９６の変異領域の配列はＤＮＡ配列解析に より確認した。 変異体クローンＧ１９５はオリゴヌクレオチド突然変異誘発法の変法により構築 した。ギャップのあるＭ１３ファージＤＮＡの再重合および連結後に、オンコス タチンＭ　ｃＤＮＡは、Ｔａｃボリメラーセチェインリアクション（Ｐｅｒｋｉ ｎ　Ｅｌｍｅｒ　Ｃｅｔｕｓ）により、Ｍ１３１：バーサル前および逆プライマ ーを使って増幅した。その後、増幅ｃＤＮＡをＨｉｎｄｌＩＩ−Ｘｈｏ［切断ｐ Ｈ３ＭＰＹにサブクローニングし、変異体クローンを制限分析および／またはＤ ＮＡ配列解析により同定した。 変異コード領域は配列解析により確認した。Ｇ１９５の配列解析は、オンコスタ チンＭの２番目のアミノ酸（アラニン）か突然変異誘発中に導入された第２変異 の結果としてバリンに交換されたことを明らかにした。６１９６は最初の逆相ク ロマトグラフィーと、その後のサイズ分画化から成る二段階法を２サイクル行っ て精製した。 ６、２．３．　置換変異体構築物 変異体クローンＳ５　、Ｓ４９　、Ｓ８０．５１２７．５１６７およびＳ６／５ １６７はセクション６、２．２に上述したようにオリゴヌクレオチド突然変異誘 発により構築した。６位、４９位、８０位、１２７位、１６７位、および６　＋ 　１６７位のシスティンの変換を指令する誤対合オリゴヌクレオチドを合成し、 これを使用して変異体クローンを構築した。 変異体構築物はｐＨ３ＭＰＹのＨｉｎｄｌＩＩ−Ｘｈｏ［部位にサブクローニン グした。得られたクローンの変異コード領域はＤＮＡ配列解析により確認した。 ６、２．４．　挿入変異体構築物 変異体クローンＧＡＧ６　、ＧＡＧ７７　、　ＧＡＧ１４およびＧＡＧ１４０は セクション６、２．２に上述したようにオリゴヌクレオチド特異的ｉｎ　ｖｉｔ ｒ。 突然変異誘発により構築した。変異体構築物はｐＨ３ＭＰＹのＨｉｎｄ［ＩＦ− Ｘｈｏ１部位にサブクローニングした。変異コード領域はＤＮＡ配列解析により 確認した。 プロセッシング変異体Ｇ１９５およびＧ１９６　（上記のセクション６゜２、２ ．　’）と欠失変異体Δ１９５およびΔ１９０（上記のセクション６、２．１． 　）をコードするプラスミドを用いてトランスフェクトしたＣＯ８細胞からの無 血清培地はイムノブロッティング分析により調へた。 これらの変異体コード化構築物でトランスフェクトした細胞は抗−６−１９血清 と反応するタンパク質を産生した。Ｇ１９５およびＧ１９６により産生された免 疫反応性タンパク質はｐｓＰＯＭ　トランスフェクト細胞（下記のセクション７ ）からのＭ、　３６，０００タンパク質と共泳動したが、Δ１９５およびΔ１９ ０はＭ、　３２．０００タンパク質に一層接近して泳動するタンパク質を産生し た。分析用に抗−２０８−２１９血清を使用したときは、Ｇ１９５およびＧ１９ ６トランスフエクト細胞からのＭ、３６．０００形態が観察されたが、Δ！９５ およびΔ１９０は反応しないタンパク質を産生じた。かくして、推定プロセッシ ング部位ての点突然変異の導入はＭ、　３２．０００形態の蓄積を妨げ、一方こ の部位のすぐ上流の欠失突然変異はオンコスタチンＭのＭ、　３６，０００形態 の蓄積を妨げた。これらの結果は、オンコスタチンＭのＭ７３６、０００形態と Ｍ、　３２，０００形態との差異が１９３位で開始するトリブチツク様部位また はその近傍での加水分解プロセッシングによることを示唆している。 オンコスタチンＭのプロセッシング抵抗性変異体（Ｇ１９５およびＧ１９６）と オンコスタチンＭのＭ、　３２，０００形態に大きさか一致する変異体タンパク 質（Δ１９０およびΔ１８２）の生物学的活性を比較した。この実験では、セク ション６．１．２．と６．１．３．にそれぞれ記載した通りに、トランスフェク ト細胞からの未処理の無血清ならし培地かＣＩＡおよびＲＲＡ活性について試験 された。オンコスタチンＭの濃度はセクション６、１．４．に記載したラジオイ ムノアッセイて測定した。表■に示すように、Δ１９０とΔ１９５のＧＩＡ対Ｒ Ｒ，Ａ活性の比は、Ｇ１９５とＧ１９６よりも１０−２０倍高かった。変異体Δ １８２てトランスフェクトした細胞からの培地はいずれのアッセイでも有意な活 性を与えず、残基１８２−１９０のＣ−末端領域か増殖阻止と結合活性の両方に 不可欠であることを示している。ｐｓＰＯＭ（下記のセクション７）トランスフ ェクト細胞からの培地は中間の活性比を与え、この試料中に異なる活性を有する ２つの形態のオンコスタチンＭか存在することと一致する。これらの観察は、オ ンコスタチンＭの変異体非プロセッシング形態（ＧＩ９５およびＧ１９６）か末 端切断されたＭ、　３２，０００形態（Δ１８２およびΔ１９０）よりもＧＬＡ 活性か劣ることを示している。 （本頁以下余白） 表■ オンコスタチンＭの変異体は異なる ｐｓＰＯＭ　１１．７　（２７，２）　２．６　（６，１）　４．５Δ１９５− ２２７　６１．７　（７４，３）　３．２　（３，８）　１９．５Δ１９０−２ ２７　２０．０　（２１，７）　０．９　（１，０）　２２．５Δ１８２−２２ ７　０．０２　（０，０６）　＜０．０２（＜０．０６）　Ｎ／ＡＧ１９６　６ ．６　（８，０）　１１．２（１３，５）　０．６Ｇ１９５　５．０　（８，８ ）　５．３　（９，３）　０．９表示したプラスミドでトランスフェクトしたＣ Ｏ８細胞からの未処理の無血清培地は、実施例１に記載したように増殖阻止（Ｃ ＩＡ）およびラジオレセプター（ＲＲＡ）活性について調へた。オンコスタチン Ｍの濃度は実施例１に記載したようにラジオイムノアッセイて測定した。濃度は ０．４−１μｇ／ｍｌであった。Ｎ／Ａ　、適用不能。 １単位／ｍｌ　（Ｘ　１０’）；かっこ内の数字は比活性を表す。 ’　Ｇ［Ａ活性対ＲＲＡ活性の比。 Ｇ１９６変異体のＣＩＡ活性の低下を確かめるために、このタンパク質を均一に 精製し、ｐｓＰＯＭ　［−ランスフエクト細胞（Ｊ）、下のセクション７）から のオンコスタチンＭのＭ、　３２．０００形態と比較した。 オンコスタチンＭの精製したＭ、　３２．０００形態は０１９６よりも大きいＣ ＩＡ活性を有していた（それぞれ６および１３０　ｐ）Ｊで半一最大活性）３つ の別々の実験において、これらの精製したタンパク質問の増殖阻止活性の差は９ 倍、２２倍および５倍（平均上標準偏差（１２±９倍））であった。これと対照 的に、２種の精製タンパク質のＲＲＡ活性は区別できなかった（約１００　ｐＭ で半一最大活性）。ＲＲＡては、３つの別々の実験により、６１９６かオンコス タチンＭのＭ、　３２，０００形態よりも約１．１Ｓ１．１および２倍大きい（ １，３±０．３倍）　ＲＲＡ活性をもつことかわかった。従って、精製したＧ１ ９６（Ｍ、　３６，０００形態）はＭ、　３２，０００形態と同程度にオンコス タチンＭ受容体に結合するが、ＣＩＡ活性はより劣っている。 オンコスタチンＭ欠失変異体の増殖阻止活性の比較は図２に示しである。Δ１８ １１Δ１８２およびΔ１８３は最小の増殖阻止活性を育する（〈１単位／ｎｇ） 。天然オンコスタチンＭと比へて増強された増殖阻止活性はΔ１９５−２２７　 、Δ１９０−２２７　、Δ１８８−２２７およびΔ１８７−２２７オンコスタチ ンＭ変異体の場合に観察された。変異体Δ１８７−２２７は天然オンコスタチン Ｍ（約８単位／ｎｇ）と比へて最大活性（＞１４単位／ｎｇ）を示した。かくし て、大部分のＣ−末端領域を除くと、オンコスタチンＭの増殖阻止活性か高まる 。 表ＩＩは、数種のオンコスタチンＭ欠失変異体の増殖阻止および受容体結合の相 対的比活性を示す。このデータから、大部分のＣ−末端領域の除去がオンコスタ チンＭの増殖阻止活性を強めることか明らかである。 表Ｉ■ Ｃ−末端の突然変異から生じる 相対的増殖阻止および受容体結合活性 Δ１９６−２２７　１７１　７３ Δ１９１−２２７　９０±３０２６±】３３Δ１９０−２２７　９９　６８ Δ１８９−２２７　１９７±５７４２±１２Δ１８８−２２７　１３５　５４ Δ１８７−２２７　６６±３１２１±５２Δ１８６−２２７　６０±３０　２０ ±４２Δ１８５−２２７　１７　２ Δ１８４−２２７　２　＜　１ Δ１８３−２２７　＜　２　＜　１　２Δ１８２−２２７　＜　３　＜　１　２ 表示したオンコスタチンＭ変異体でトランスフェクトしたｃｏｓ細胞からの無血 清培地は増殖阻止（ＣＩＡ）およびラジオレセプター（ＲＲＡ）活性について調 べた。オンコスタチンＭの濃度は定量イムノブロッティングにより測定し、０． ２−１．０μｇ／ｍｌであった。値は同一実験で試験した野生型組み換えオンコ スタチンＭに対する変異体の比活性パーセントを示し、変異体の比活性／野生型 オンコスタチンＭの比活性Ｘ１００として算出した。実験数を“ｎ”で示す。 ６、３．２．　置換変異体 上記のセクション６、２．３．に記載したように作製した変異体クローンは増殖 阻止活性について試験した。図３に示した結果は、４９はそれ以上の生物学的活 性を有し、これらの結果は６位、８０位および１２７位のシスティンかオンコス タチンＭＧＩＡに不可欠のものではないことを示す。事実、８０位のシスティン をセリンに変えると、生物活性のわずかではあるが有意な増加が生じた。 ６、３．３．　アミノ酸の欠失および挿入を含むオンコスタチンＭ突然変異 走査欠失および挿入変異体はセクション６．２．１．および６．２．４．にそれ ぞれ記載したように作製し、増殖阻止およびラジオレセプター活性について試験 した（表ＩＮ）。欠失変異体Δ２２−３６とΔ４４−４７は全てのＧＩＡおよび ＲＲＡ活性を消失したが、変異体Δ８７−９０はを挿入しても、生物学的活性の 有意な低下か起こらなかった。相対ＣＩＡおよびＲＲＡ比活性は、アミノ酸位置 ７６と７７の間にＧｌ　ｙ−Ａｌａ−ＧＩＹ配列を挿入したとき顕著に低下し、 アミノ酸位置７５から推定Ｎ−結合グリコシル化認識配列か開始する。 走査欠失および挿入突然変異から生じる相対的増殖阻止および受容体結合活性 相対的比活性（％） ＧＡＧＩ４０　７９　４０ ０表示たオンコスタチン間変異体構築物（番号を付けたものを含む残基の欠失は “Δ”で示され、記載した位置でのＧｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ残基の挿入は“ＧＡ Ｇ”で示される）でトランスフェクトしたＣＯ３ｗＩ胞からの無血清培地は増殖 阻止（ＣＩＡ）およびラジオレセブタ−（ＲＲＡ）活性について調へた。オンコ スタチンＭの濃度は定量イムノブロッティングにより測定し、０．１４−１．８ μｇ／ｍｌであった。 値は同一実験で試験した野生型組み換えオンコスタチンＭに対する変異体の比活 性パーセントを示し、変異体の比活性／野生型オンコスタチンＭの比活性ｘ　１ ００として算出した。 ７、　実施例・ＣＯ８細胞でのオンコスタチンＭの発現はＣＯＳ細胞は記載され る通りに（ＭａＨｋ　ｅｔ　ａｌ、、＋９８９．　Ｍｏ１．　Ｃｅ１ｌＢｉｏ１ ．　９：　２８４７−２８５３）　ｐｓＰＯＭまたは９３０Ｍを用いてトランス フェクトした。トランスフェクションの２４時間後、無血清培地を加え、細胞を ３７°Ｃでさらに４８時間インキュベートした。ならし培地を集め、直ちに検定 するか、またはＩＮへ酢酸を加えて酸性化し、精製のために濃縮した。ｐｓＰＯ Ｍでトランスフェクトした細胞からの培地は、Ｕ９３７細胞により生産された天 然オンコスタチンＭと免疫学的に関係があるか大きさの異なる２種類のタンパク 質（Ｍ、３６．０００およびＭ、３２．０００）を含んでいた。これらと同じタ ンパク質はまた、シグナル配列かシミアンＴＧＦ−β１由来のシグナルペプチド で置換されたオンコスタチンＭをコードする構築物（９３０Ｍ）を用いてＣＯ３ 細胞をトランスフェクトしたときにも観察された。Ｍ、　３６．０００七Ｍ、　 ３２．０００タンパク質の両方のＮ−末端アミノ酸配列解析は天然オンコスタチ ンＭと同じＮ−末端配列を示し、これらのタンパク質の相違はＮ−末端配列の不 均一性によるものでないことかわかる。 オンコスタチンＭのＭ、　３２，０００形態は、ｐｓＰＯＭでトランスフェクト したＣＯ８細胞からの無血清培地を酸性化しかつ濃縮したものから、本質的に記 載される通りに（Ｌｉｎｓｌｅｙ、　ｅｔ　ａｌ、、　ａｎｄ　Ｍａｌｉｋ。 ｅｔ　ａｌ、、前掲）精製した。サイズ分画化培地がらの増殖阻止活性のピーク 画分を集め、逆相クロマトグラフィーによる最終精製にかけた。得られた調製物 は主にオンコスタチンＭのＭ、　３２，０００形態を含んでいた。いくつかの実 験では、１！″Ｉで標識するためにまたはラジオイムノアッセイでの標準曲線を 作成するために、組み換えオンコスタチンＭ（ワシントン州シアトル、Ｏｎｃｏ ｇｅｎ）を過剰生産するＣＨＯ細胞の無血清培地から同じ方法でオンコスタチン Ｍを精製した。この精製源からのオンコスタチンＭは抗２０６−２１８抗血清と の免疫反応性を示さず、ｃｏｓ細胞由来のオンコスタチンＭのＭ、　３２．００ ０形態と同じ性質を有する。 ７．３．　Ｍ、３６，０００形態 １）ＳＰＯＭ　トランスフェクト細胞からのオンコスタチンＭのＭ、３６．００ ０形態は三段階法で部分的に精製した。無血清培地を酸性化し、４０％アセトニ トリル、０．１％トリフルオロ酢酸中でＴＳＫ　３０００ＳＷカラムを使ってサ イズ分画化した。主にオンコスタチンＭのＭ、３６，０００形態を含む画分を抗 −６−９血清によるイムノブロッティングにより同定し、プールし、濃縮し、再 度同じカラムにがけた。免疫化学的に純粋なＭ、　３６，０００形態を含む画分 （すなわち、検出可能なＭ、　３２．０００形態を含まない）をプールし、後続 の実験に使用した。 精製したタンパク質の濃度はＧａｒｙ　Ｈａｔｈａｗａｙ博士（リバーサイド、 カリフォルニア大学、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔ ｉｏｎ　Ｃｅｎｔｅｒ）か行ったアミノ酸分析により測定した。 ７．４．　電気泳動 ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ ）はＬａｅｍｍｌ　ｉシステム（Ｌａｅｍｍｌｉ、　Ｕ、に、、　Ｎａｔｕｒｅ 　（１９７０）２２７：　６８０−６８５）を使って行った。５％アクリルアミ ドのスタッキングゲルと共に直線状アクリルアミド勾配ゲルを使用した。試料は 還元条件下で泳動させた。ゲルを銀試薬（ＢｉｏＲａｄ）やクーマシーブルーで 染色し、写真を撮る前に乾燥した。オンコスタチンＭの個々の形態の見掛は分子 量は記載される通りに（Ｍａｌｉｋ、　ｅｔ　ａｌ、。 前掲）標準と比較してめた。 ７．５．　Ｍ、３６，０００オンコスタチンＭのトリプシン処理オンコスタチン ＭのＭ、　３６．０００形態はサイズ分画化により部分精製し、逆相クロマトグ ラフィーでさらに精製した。得られた調製物は５ＤＳ−ＰＡＧＥで判定して約８ ０％の純度であった。約１５０　ｎｇのオンコスタチンＭ（ＲＲＡから概算）を 含むアリコートは、３０μＩの５０ｍＭ　トリス酢酸（ｐＨ７，９）中、３７° Ｃで６ｎｇのＴＰＣＫ−処理トリプシン（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ）を用いて処 理した。試料を３７°Ｃでさらにインキュベートし、濃縮電気泳動試料緩衝液を 加えて反応を停止させ、その後異なる形態のオンコスタチンＭを抗−６−１９血 清とのイムノブロッティングにより同定した。 ７．６．　オリゴ糖の除去 予測されたオンコスタチンＭ前駆体配列は２つの可能なＮ−結合グリコシル化部 位を含む。これらの部位での異なるグリコジル化かオンコスタチンＭのＭ、　３ ６．０００形態とＭ、　３２．０００形態の相違の原因であるのかを検討するた めに、ｐｓＰＯＭでトランスフェクトしたＣＯ８細胞からの無血清ならし培地中 に存在するタンパク質を酵素Ｎ−グリカナーゼ（Ｎ−結合オリゴ糖を除去する） で処理し、オンコスタチン■に対する部位特異的抗血清（抗−６−１９）との免 疫反応性について分析した。オンコスタチンＭのＭ、３６．０００とＭ、３２． 。 ００の両形懇の移動度はこの処理により増加し、Ｍ、約３４．０００およびＭ、 　３０，０００の新しい種か生じた。両断片の移動度の増加はオンコスタチンＭ の各形態からの１つのＮ−結合オリゴ糖成分（Ｍ約２、０００）の除去と一致す る。両形態の移動度は平行して増加したので、異なるＮ−結合グリコシル化か原 因でこれらの断片間にサイズの相違か生じたとは思えない。 ７．７　部位特異的抗血清はオンコスタチンＭのＭ、　３６，０００とＭ、　３ ２，０００形態の異なるＣ−末端を明らかにするバイトロバシー（ｈｙｄｒｏｐ ａｔｈｙ）分析（Ｋｅｓｋｉ−Ｏｊｉ、　Ｊ、　ｅｔ　ａＬ、。 Ｊ、　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　５ｕｐｐ１．　（１９８７）　ＩＩＡ： 　６０）はオンコスタチンＭのＣ−末端（アミノ酸約１９０−２２７）か非常に 親水性であることを明らかにした。塩基性アミノ酸（Ｒ，ＫまたはＨ）がこの領 域の３８残基のうち２４残基（６３％）を占め、潜在的な加水分解切断部位を表 す５つの対合した二塩基性残基が存在する。Ｃ−末端の不均一性が原因てＭ、３ ６．０００形態とＭ、３２．０００形態の違いか生じるのかを検討するために、 成熟オンコスタチンＭ　（Ｍａｌｉｋ、　ｅｔ　ａｌ、、前掲、およびＺａｒｌ ｉｎｇ、　Ｊ、Ｍ、　ｅｔ　ａｔ、、　１９８６．　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　 Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　８３：　９７３９−９７４３）のＮ−末端およびｃＤＮ Ａ配列から予測されるＣ−末端に由来する領域に相応するペプチドに対して抗血 清を誘起させた。その後これらの抗血清はｐｓＰＯＭ　トランスフェクト細胞か らの無血清ならし培地とＵ９３７細胞から誘導された天然オンコスタチンＭとの イムノブロッティング実験に使用した。抗−６−１９血清はｌ）ＳＰＯＭ　）ラ ンスフェクト細胞からのＭ、　３６，０００形態とＭ、　３２．０００形態の両 方と、さらにＵ９３７細胞からのＭ、　２８．０００天然オンコスタチンＭと反 応したか、抗−２０６−２１８血清はオンコスタチンＭ　Ｏ）　Ｍ、　３６，０ ００形態とだけ反応した。両方の抗血清の特異性はそれらの反応性を阻害する同 族ペプチドの能力により示された。これらの結果は、オンコスタチンＭのＭ、　 ３６．０００形態とＭ、　３２，０００形態の違いが、少なくとも幾分かは、親 水性Ｃ−末端ドメイン内の加水分解プロセッシングから生じるＣ−末端の不均一 性によるものてありうる、ことを示している。 ７．８．　制限されたタンパク質加水分解によるオンコスタチンＭのＭ、　３６ ，０００形態のＭ、　３２，０００形態への変換オンコスタチンＭのＭ、　３６ ．０００形態の加水分解プロセッシングかＭ、　３２，０００形態をもたらすこ とを確認するために、Ｍ、　３６．０００形態の部分精製調製物を制限タンパク 質加水分解に付した。反応生成物は抗−６−１９血清で検出した。トリプシン処 理を続けるにつれて、オンコスタチンＭのＭ、　３６，０００形態の量か次第に 減少し、同時にＭ、　３２．０００形態の量か増してきた。最長の試験時間では 、Ｍ、３２．０００形態の量が減少し、より低分子量の別の免疫反応性生成物か 観察された。Ｍ、　３２，０００生成物はＮ−末端特異的抗血清と反応するので 、それはＣ−末端でプロセッシングされたオンコスタチンＭを表す。このことは 、オンコスタチンＭのＭ、　３６．０００形態のＣ−末端近傍での加水分解が、 ｐｓＰＯＭ　トランスフェクト細胞により生産されたＭ、　３２．０００形態に 大きさか類似した形態のオンコスタチンＭをもたらし得ることを示している。 ７．９．　オンコスタチンＭ　（３２におよび３６に形態）の増殖阻止活性０８ ０Ｍトランスフェクト細胞からの無血清ならし培地をＢｉｏＧｅＩＰ６０でクロ マトグラフィーにかけて分画化した。その後、個々の画分はＡ３７５黒色腫細胞 に対するＧ４Ａ活性について試験し、さらに抗−６−１９との免疫反応性につい ても試験した。ＣＩＡ活性のピーク画分は、Ａ２１Ｇ吸収物質の大半のあとで、 画分３５と４０の間に溶離された。ＣＩＡ活性の正確なピーク画分は、そのピー ク画分か試験した希釈率で正確に測定しつる以上の活性を含んでいたので、この 実験では決定できなかった。 イムノブロッティング分析により、オンコスタチンＭのＭ、３２．０００形態は ＣＩＡ活性の大半を含む画分に溶離されることが分かった。対照的に、Ｍ、　３ ６．０００形態はＧｒＡ活性の主ピーク（画分３３かピーク）の前のいくつかの 画分に溶離された。Ｍ、　３６．０００形態を含む画分はより強く染色されるが 、Ｍ、３２．０００形態よりも劣ったＣＩＡ活性を育するノテ、Ｍ、３６．００ ０形態ノＧＩＡ比活性はＭ、３２，０００形態よりも低いと思われる。 Ｍ、　３２，０００形態とＭ、　３６，０００形態の生物学的活性の定量比較を 行うために、主に一方または他方の形態を含むサイズ分画化画分をプールし、Ｃ ＩＡとＲＲＡ活性の両方を比較した。この分析のために、ＢｉｏＧｅｌ　Ｐ２Ｏ と定性的に類似した結果を与えるが、Ｍ、３６．０００とＭ、　３２．０００形 態のより良好な分離を可能にする別のカラム（ＴＳＫ　３０００ＳＷ）を使用し た。プールした画分は、オンコスタチンＭの他の形態が混じっていないことを確 かめるために、イムノブロッティングにより分析した。５ＤＳ−ＰＡＧＥ後の染 色ゲルの分析により、オンコスタチンＭの各形態の純度はＭ、　３６，０００形 態か約２０％で、Ｍ、３２．０００形態か８０％であることか分がった。表ＪＶ に示すように、部分精製したＭ、３６．０００形態はＭ、　３２，０００形態よ り低イＧ［Ａ　活性をもつが、ＲＲＡ活性はより高かった。この相違はＭ、３２ ．０００形態のこれらの活性の比かＭ、　３６．０００形態よりも約１０倍大き い二とから明らかである。 試料　ＣＩＡ活性’　ＲＲＡ活性１　ル２３６に形！！！　１０４　４３．５　 ２．４３２に形態　３４５　１７．９　１９．２Ｍ、　３６，０００またはＭ、 　３２．０００形態を含む画分をプールし、増殖阻止（ＧｒＡ）およびラジオレ セプター（ＲＲＡ）活性についてアリコートを試験した。 ｆ単位／ｍｌ　（ｘ　１０−リ ’　ＧｒＡ活性対ＲＲＡ活性の比 八 矢 口 、＼ 骨 国際調査報告

Claims (12)

【特許請求の範囲】
1. １．１８６位のアミノ酸残基（この残基も含む）から２２７位のカルボキシ末端 残基（この残基も含む）までのアミノ酸のいずれかが欠失されている、実質的に 図１に示したアミノ酸配列からなるオンコスタチンＭ変異体。
2. ２．アミノ酸１８６から２２７までが欠失されている、請求項１記載のオンコス タチンＭ変異体。
3. ３．アミノ酸１９６から２２７までが欠失されている、請求項１記載のオンコス タチンＭ変異体。
4. ４．アミノ酸１８９から２２７までが欠失されている、請求項１記載のオンコス タチンＭ変異体。
5. ５．アミノ酸１８８から２２７までが欠失されている、請求項１記載のオンコス タチンＭ変異体。
6. ６．６位、８０位、および１２７位のアミノ酸のいずれかがシステイン以外のア ミノ酸で置換されている、実質的に図１に示したアミノ酸配列からなるオンコス タチンＭ変異体。
7. ７．置換アミノ酸がセリンである、請求項６記載のオンコスタチンＭ変異体。
8. ８．アミノ酸８７から９０までが欠失されている、実質的に図１に示したアミノ 酸配列からなるオンコスタチンＭ変異体。
9. ９．アミノ酸１５２から１５５までが欠失されている、実質的に図１に示したア ミノ酸配列からなるオンコスタチンＭ変異体。
10. １０．１９５位と１９６位のアミノ酸のいずれかがアルギニン以外のアミノ酸で 置換されている、実質的に図１に示したアミノ酸配列からなるオンコスタチンＭ 変異体。
11. １１．置換アミノ酸がグリシンである、請求項１０記載のオンコスタチンＭ変異 体。
12. １２．アミノ酸配列ＧＡＧがアミノ酸１０３と１０４の間に挿入されている、実 質的に図１に示したアミノ酸配列からなるオンコスタチンＭ変異体。