DE3910323A1

DE3910323A1 - Biologisch aktive proteine

Info

Publication number: DE3910323A1
Application number: DE3910323A
Authority: DE
Inventors: Jean-Michel Dayer; Philippe Lucien Seckinger
Original assignee: Glaxo Group Ltd
Current assignee: Glaxo Group Ltd
Priority date: 1988-03-31
Filing date: 1989-03-30
Publication date: 1989-10-19
Also published as: IT8947794A0; GB8807803D0; GB8907148D0; SE8901115L; FR2629345A1; IL89804A0; GB2218101A; DK156589A; DK156589D0; SE8901115D0; KR890014125A; AU3228789A; BE1001845A4; NL8900779A; IT1232827B; JPH02117700A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues Protein mit einem inhibitorischen Effekt gegen Tumor Necrose Faktor α- vermittelte Aktivität, die Isolierung und Reinigung eines solchen Proteins aus natürlichen Quellen, seine Her stellung durch DNA-Manipulation und die Verwendung eines solchen Proteins bei der Behandlung von Zuständen, die mit übermäßiger oder unregelmäßiger TNFα-Produktion zusammen hängen.

Tumor Necrose Faktor (TNF) ist eine Aktivität, die durch eine Familie von mindestens zwei Proteinen, α und β, ver körpert wird, welche cytotoxisch für Tumorzellen sind und ihr Wachstum in Kulturen inhibieren [E. Carswell et. al. "An endotoxin-induced serum factor that causes necrosis of tumours", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 72, Seite 3666 (1975)]. Der Tumor Necrose Faktor α (TNFα ), der auch als "Cachectin" bezeichnet wird, wird hauptsächlich durch Zellen der monocytären/makrophagen-Zellinie produziert, als Reak tion auf "Streß"-Signale, welche invasive Stimulantien wie Bakterien, Viren, Tumoren und andere Toxine begleiten, TNFβ, gewöhnlich als "Lymphotoxin" bezeichnet, wird hauptsächlich durch Lyphoidzellen produziert. TNFβ hat viele Aktivitäten, ähnlich denjenigen von TNFα, jedoch scheint es weniger wirksam zu sein, obzwar dies das Ergebnis von Schwierig keiten bei der Herstellung von reinem TNFβ sein kann.

TNFα vermittelt und nimmt teil in einem weiten Bereich von bio logischen Aktivitäten [B. Beutler et. al., "Identity of tumour necrosis factor and the macrophage-secreted factor cachectin", Nature, 316, Seite 552 (1985)], wobei einige von ihnen mit Interleukin 1 (IL-1) [J. Le et. al., "Tumour necrosis factor and interleukin 1: cytokines with multiple overlapping biological activities", Laboratory Invest., 56, Seite 234 (1987)] gemeinsam sind. Erhöhte Spiegel von TNFα, die beispielsweise durch Tumorzellen induziert sind, können zu Gewichtsverlust und Kachexie führen und TNFα wurde auch als hauptsächlicher Faktor von endotoxischem Schock (septischer Schock) angesehen, was tödlich sein kann. Andere biologische Wirkungen von TNFα umfassen Hypotension, Fieber (induziert durch Stimulierung von hypothalamischer Prostaglandin E₂ (PGE₂)-Synthese, Koagulopathie (induziert durch Stimulierung der vaskulären Endothelialzellen, welche beispielsweise den Gewebefaktor freisetzen) und Gewebezer störung (induziert beispielsweise durch Stimulierung einer Reihe von Proteinasen, einschließlich Collagenaseproduktion durch Dermalfibroblaste und Synovialzellen) [C. Dinarello et. al., "Tumour necrosis factor (cachectin) is an endogenous pyrogen and induces production of interleukin 1", J. Exp. Med., 163, Seite 1433 (1986); J. Dayer et. al., "Cachectin/ tumour necrosis factor stimulate collagenase and prosta glandin E₂ production by human dermal filbroblasts and synovial cells", J. Exp. Med., 162, Seite 2163 (1985)].

Es besteht daher ein Bedürfnis zur Entwicklung eines Cachec tin/TNFα-Inhibitors, der dem endotoxischen Schock, Kachexie und den anderen oben beschriebenen schädlichen Wirkungen vorbeugt bzw. sie verhindert. Es wurde gezeigt, daß die passive Immunisierung von Tieren gegen Cachectin dem Endotoxin-induzierten Tod, vermittelt durch die TNFα- Antikörper [B. Beutler et. al., Nature, 316, supra] vorbeugen bzw. ihn verhindern kann.

Es wurde nun ein neues Protein identifiziert, das einen wirksamen inhibitorischen Effekt gegen TNFα-vermittelte Aktivitäten ohne signifikante gleichzeitige Inhibierung der IL-1-vermittelten-Aktivität besitzt. Das Protein wird im folgenden als Tumor Necrose Faktor α-Inhibitor (TNFa-INH) identifiziert.

So wird gemäß einem Aspekt der Erfindung ein Protein ge schaffen, das Tumor Necrose Faktor α-vermittelte Aktivität selektiv inhibiert.

Wie hier verwendet, wird die selektive Inhibierung, wie durch den erfindungsgemäßen Inhibitor gezeigt, identifiziert als die Fähigkeit, TNF-vermittelte Aktivität zu blockieren, während die Fähigkeit fehlt, andere Proteine, welche mit dem TNF bestimmte, jedoch nicht alle der biologischen Akti vitäten des TNF wie IL-1 gemeinsam haben, zu blockieren.

Vorzugsweise ist der Tumor Necrose Faktor α-Inhibitor gemäß der Erfindung in im wesentlichen homogener Form, im wesent lichen frei von größeren Verunreinigungen und/oder im wesent lichen frei von anderem Proteinmaterial.

Von dem Tumor Necrose Faktor α-Inhibitor gemäß der Erfin dung wurde gefunden, daß er eine oder mehrere der folgenden Eigenschaften hat:

(a) ein Molekulargewicht im Bereich von 40 bis 60 kDa, be stimmt durch Molekularsiebchromatographie;
(b) einen isoelektrischen Punkt (pI) im Bereich von 5,5 bis 6,1, bestimmt durch Chromatofokussierung;
(c) Hemmung der Standard-TNF-Bestimmung verschiedener Cyto toxidzität für Murin L929-Zellen, die mit Actinomycin D behandelt sind, wiebeschrieben von G. Nedwin et. al., "Effects of interleukin 2, interferon γ and mitogens on the production of tumour necrosis factors and β", J. Immunol., 135, Seite 2492 (1985). Diese Hemmung kann durch weitere Zugabe von TNFa überwunden werden, was anzeigt, daß die Hemmung kompetitiv ist. Der Inhibitor ist auch ein Inhibitor der TNFβ-Aktivität, obzwar die Hemmung von TNFα bei dieser Bestimmung wirksamer ist als diejenige von TNFβ.
(d) Hemmung der TNF-induzierten PGE₂-Freisetzung aus mensch lichen Fibroblasten und Synovialzellen;
(e) Der Inhibitor beeinflußt störend die Bindung von TNFa an U937-Zellen (eine monocytische Tumorlinie), wie ge zeigt wird durch Hemmung der Bindung von radioaktiv markier tem TNFα(¹²⁵I-TNFα );
(f) die Spaltung von vorgeformtem TNFα : U937-Zellkom plex wird angeregt durch den Inhibitor in einer tempe raturabhängigen Weise;
(g) der Inhibitor baut TNF durch proteolytische Spaltung nicht ab;
(h) der Inhibitor hemmt nicht die IL-1 Rezeptor-Bindungs aktivität, z. B. die Bindung von radioaktiv markierter IL-1 (¹²⁵I-IL-1α ) an die Murin Thymoma-Subzellinie EL4-6.1.

Es wurde gefunden, daß das erfindungsgemäße Protein, wenn es wetier gereinigt wird, ein Molekulargewicht von etwa 33 000 Daltons hat, wie bestimmt durch Natriumdodecysulfat polyacrylamidgel-Elektrophorese (SDS-PAGE).

Als weiterer oder alternativer Aspekt wird daher ein Pro tein geschaffen, das TNFα-vermittelte Aktivität selektiv inhibiert, das eine oder mehrere der folgenden Eigenschaften hat:

(a) Ein Molekulargewicht von etwa 33 kDa, bestimmt durch SDS-PAGE;
(b) einen isoelektrischen Punkt (pI) im Bereich von 5.5 bis 6.1, bestimmt durch Chromatofokussierung;
(c) Hemmung der Standard-TNF-Bestimmung von verschiedener Toxizität von Murin L929-Zellen, behandelt mit Actino mycin D, wie beschrieben von G. Nedwin et. al. "Effects of interleukin 2, interferon-γ and mitogens on the production of tumour necrosis factors α and β", J. Immunol., 135, Seite 2492 (1985). Diese Hemmung kann durch weitere Zugabe von TNFα überwunden werden, was anzeigt, daß die Hemmung konkurrierend ist. Der Inhibitor ist auch ein Inhibitor der TNFβ-Aktivität, ob zwar die Hemmung von TNFα bei dieser Prüfung wirksamer ist als diejenige von TNFβ;
(d) Hemmung von TNF-induzierter PGE₂-Feisetzung aus mensch lichen Fibroblasten und Synovialzellen;
(e) der Inhibitor beeinflußt störend die Bindung von TNFα an U937-Zellen (eine monocytische Tumorzellinie, wie gezeigt durch die Hemmung der Bindung von radioaktiv markiertem TNFα (¹²⁵I-TNFα );
(f) die Spaltung eines vorgeformten TNFα : U937-Zellkomplexes wird durch den Inhibitor in temperaturabhängiger Weise gefördert;
(g) der Inhibitor baut TNF durch proteolytische Spaltung nicht ab;
(h) der Inhibitor hemmt nicht die IL-1-Rezeptor-Bindungs aktivität, z. B. die Bindung von radioaktiv markierter IL-1 (¹²⁵I-IL-1a ) zu der Murin Thymoma-Subzellinie EL4-6.1.

Vorzugsweise hat der TNFα-INH gemäß vorliegender Erfindung beide Eigenschaften (a) und (b) und eine oder mehrere der Eigenschaften (c) bis (h).

Insbesondere hat der TNFα-INH der vorliegenden Erfindung alle Eigenschaften (a) bis (h).

Das erfindungsgemäße Protein hat eine aminoterminale Aminosäuresequenz folgendermaßen:

Asp-Ser-Val-Cys-Pro-Gln-Gly-Lys-Tyr-Ile-His- Pro-Gln-Cys-Asn-Ser-Ile

Es wird ferner angenommen, daß die nächsten drei Amino säuren eine Glycoxylierungsstelle schaffen und daß die Sequenz sich so fortsetzt:

Asn-Ser-Thr-Lys.

Es sei erwähnt, daß ein TNFα-Inhibitor gemäß der Erfindung eine Aminosäuresequenz umfaßt, im wesentlichen entsprechend der Sequenz von nativem TNFα-INH und enthaltend eine amino terminale Sequenz, die im wesentlichen mit derjenigen wie oben beschrieben identisch ist. Die Sequenz eines TNFα- Inhibitors gemäß der Erfindung wird demnach identisch sein mit der Sequenz von nativem TNFα-INH oder eine oder mehrere Deletionen, Substitutionen, Insertionen, Inversionen oder Additionen allelen Ursprungs oder anderweitig ent halten, wobei die sich ergebende Sequenz wenigstens 80% und vorzugsweise 90% Homologie mit der Sequenz von nativem TNFα-INH haben wird und im wesentlichen die gleichen bio logischen Eigenschaften des Proteins behalten wird.

Der TNFα-Inhibitor gemäß der Erfindung hat gezeigt, daß er proteinartig ist, indem er durch Erhitzen in Zeit- und Tempe ratur-abhängiger Weise inaktiviert und durch Behandlung mit Trypsin oder Pronase zerstört wird.

Der TNFα-INH gemäß der Erfindung hat auch gezeigt, daß er ein Glycoprotein ist, da die Behandlung mit dem Enzym Endo glycosidase F das Molekulargewicht um 7 bis 8 kDa vermindert.

Gemäß einem weiteren oder alternativen Aspekt der Erfindung wird somit ein TNFα-Inhibitor, wie hier definiert, geschaf fen, der jedoch in im wesentlichen unglycolisiertem Zustand ist.

Dei Inhibitoren gemäß der Erfundung sind von Interesse bei der Behandlung von Zuständen, wo es erwünscht ist, die TNFα- Aktivität zu hemmen, beispielsweise solche Zustände, welche von den Wirkungnen der TNF kommen, wie Gewichtsverlust, Schock, Kachexie und chronische lokale Entzündungen, rheuma toide Arthritis, disseminierte (gestreute) intravaskuläre Koagulation und Nephritis.

Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung wird ein TNFα-In hibitor, wie hier definiert, oder ein pharmazeutisch annehm bares Derivat davon geschaffen, zur Verwendung als aktives therapeutisches Mittel, insbesondere bei der Behandlung von Zuständen, die mit übermäßiger oder unregelmäßiger TNFα- Produktion verbunden sind.

Nach einem weiteren oder alternativen Aspekt der Erfindung wird eine Methode zur Behandlung von Zuständen, die mit übermäßiger oder nicht regulierter TNFα-Produktion in einem Säugetier einschließlich des Menschen verbunden sind, ge schaffen, umfassend die Verabreichung einer wirksamen Menge eines TNFα-Inhibitors, wie hier beschrieben, oder eines pharmazeutisch annehmbaren Derivats davon.

Gemäß einem weiteren oder alternativen Aspekt der Erfindung wird auch die Verwendung eines TNFα-Inhibitors, wie hier beschrieben, oder eines pharmazeutisch annehmbaren Derivats davon zur Erzeugung eines Arzneimittel zur Behandlung von Zuständen, die mit übermäßiger oder nicht regulierter TNFα- Produktion verbunden sind, vorgesehen.

Für den Fachmann ist ersichtlich, daß die hier angegebene Bezugnahme auf die Behandlung sich auch auf die Prophylaxe erstreckt sowie auf die Behandlung von bestehenden Zustän den oder Symptomen.

Es sei ferner erwähnt, daß die Menge an TNFα-Inhibitor ge mäß der Erfindung, die zur Verwendung bei der Behandlung erforderlich ist, nicht nur mit dem Verabreichungsweg variieren wird, sondern auch mit der Natur des zu behandeln den Zustandes und dem Alter und der Kondition des Patienten und letzten Endes ins Ermessen des behandelnden Arztes oder Veterinärs gestellt ist. Im allgemeinen wird jedoch eine geeignete Dosis im Bereich von etwa 5,0 bis 500 µg per Kilogramm Körpergewicht pro Tag liegen, beispielsweise im Be reich von 30 bis 300 µg/kg/Tag, vorzugsweise im Bereich von 50 bis 150 µg/kg/Tag.

Eine gewünschte Dosis kann zweckmäßig in einer einzigen Dosis gegeben werden oder als verteilte Dosierungen in ge eigneten Intervallen verabreicht werden, beispielsweise in zwei, drei, vier oder mehr Unterdosierungen pro Tag.

Während es sein kann, daß zur Verwendung in der Therapie ein TNFα-Inhibitor gemäß der Erfindung als Rohprotein ver abreicht werden kann, ist es vorzuziehen, das aktive Protein als pharmazeutische Formulierung darzubieten.

Die Erfindung betrifft ferner eine pharmazeutische Formulie rung, die einen TNFα-Inhibitor, wie hier definiert, oder ein pharmazeutisch annehmbares Derivat davon umfaßt, zusam men mit einem oder mehreren pharmazeutisch annehmbaren Trä gern dafür und gegebenenfalls anderen therapeutischen und/ oder prophylaktischen Bestandteilen. Der Träger oder die Träger müssen "annehmbar" sein in dem Sinne, daß sie mit den Bestandteilen der Formulierung verträglich sind und für den Empfänger nicht schädlich sind.

Die erfindungsgemäßen Inhibitoren können daher zur paren teralen Verabreichung (z. B. durch Injektion, zum Beispiel Bolusinjektion oder kontinuierliche Infusion) formuliert sein und können in Einheitsdosisform in Ampullen, vorge fertigten Spritzen, kleinvolumigen Infusionen oder in Multi dosisbehältern mit zugesetztem Konservierungsmittel darge boten werden. Die Zusammensetzungen können solche Formen als Suspensionen oder Lösungen in wäßrigen Trägern annehmen und können Formulierungsmittel enthalten, wie Suspendier-, Stabilisier- und/oder Dispergiermittel. Alternativ kann der aktive Bestandteil in Pulverform sein, erhalten durch asep tische Isolierung von sterilem Feststoff oder durch Lyo philisierung aus Lösung zur Zubereitung mit einem geeigneten Träger, z. B. sterilem pyrogenfreiem Wasser vor der Verwen dung.

Der TNFα-Inhibitor gemäß der Erfindung kann auch in Kombi nation mit anderen therapeutischen Mitteln, bespielsweise anderen Cytokinen oder Inhibitoren davon, verwendet werden.

Die Erfindung schafft somit gemäß einem weiteren Aspekt eine Kombination, umfassend einen TNFα-Inhibitor, wie hier definiert, oder ein pharmazeutisch annehmbares Derivat da von, zusammen mit einem anderen therapeutisch aktiven Mittel, beispielsweise anderen Cytokinen oder Inhibitoren davon.

Die erfindungsgemäßen Proteine können hergestellt werden durch Reinigung aus natürlichen Quellen und, falls geeignet, anschließende chemische Modifizierung, oder sie können her gestellt werden durch bekannte übliche Methoden zur Her stellung von Proteinen, beispielsweise durch rekombinante DNA-Techniken.

Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung des Tumor Necrose Faktor α-Inhibitors ge mäß der Erfindung durch Reinigung aus natürlichen Quellen, besonders Urin von menschlichen Fieberpatienten, geschaffen. Eine solche Reinigung umfaßt beispielsweise Schritte des Konzentrierens des rohen Urins von menschlichen Fieberpa tienten, Ausfällen des rohen TNFα-INH aus dem Urin und Frak tionieren des TNFα-INH aus den anderen Proteinen dieses Nieder schlags durch eine oder mehrere Maßnahmen, beispielsweise Ionen austauschsäulenchromatographie, Gelfiltrationchromatographie, Hydrophobizitätschromatographie, Immunoabsorptions- und Affinitätschromatographie auf immobilisiertem TNFα.

Der Tumor Necrose Faktorα-Inhibitor gemäß der Erfindung ist auch erhältlich aus menschhlichem makrophagenhaltigem Gewebe, beispielsweise Lungenspülungen und Extrakten von menschlicher Leber, woraus er durch Standardreinigungsstech niken wie die oben beschriebenen, erhalten werden kann.

Natürlicher und rekombinanter TNFα-INH, hergestellt gemäß den hier beschriebenen Verfahren, kann durch eine Reihe von Schritten, wie oben erwähnt, gereinigt werden. Nach jedem der Reinigungsschritte kann die Anwesenheit und Reinheit des TNFα-INH in einem Test auf Cytotoxizität in Anwesenheit von Actinomycin D (Acti D) unter Verwendung einer TNF-empfind lichen Zellinie L929 gemessen werden, wie von G. Nedwin et. al., J. Immunol., 135, loc. cit., beschrieben.

Bei einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens wird der TNFα-INH zunächst aus unbehandeltem Urin isoliert wer den, der von menschlichen Fieberpatienten (<38,5°C), frei von Urininfektionen unter Verwendung einer Standardkonzen trationstechnik, beispielsweise Ultrafiltration, gesammelt wird. Eine rohe Faktion kann dann aus dem rohen Urin unter Verwendung von Ammoniumsulfat, beispielsweise durch Zugabe von Ammoniumsulfat, bis zu einer Konzentration von 80% (Gew./Vol.) bei 4°C unter Rühren ausgefällt werden. Vorzugs weise kann das Ammoniumsulfat schrittweise zugesetzt werden und das bei niedrigeren Konzentrationen gefällte Material, z. B. bei 40% (Gew./Vol.), wird verworfen. Das Ammoniumsulfat kann durch Dialyse entfernt und die ent standene Fraktion gereinigt werden, um den TNFα-INH von anderen Proteinen durch eine Vielzahl von chromatographischen Methoden abzutrennen.

So kann das TNFα-INH-Konzentrat durch Ionenaustauschchroma tographie gereinigt werden, wobei Proteine, je nach ihrer Differenz in der elektrischen Ladung, abgetrennt werden, was ein Spiegelbild der Säuren-Baseneigenschaften der Pro teine ist. Geeignete Materialien für die Ionenaustausch chromatographie umfassen Aminoethylcellulosederivate, bei spielsweise quaternäre Aminoeethylcellulose (QAE-Cellulose) oder Diethylaminoethylcellulose (DEAE-Cellulose), welche in weitem Maße im Handel erhältlich sind. Die Anionenaustausch säule sollte vor der Anwendung des Konzentrats unter Ver wendung eines geeigneten Puffers wie Tris-HCl, gegebenen falls enthaltend ein Chelatmittel wie EDTA, equilibriert werden: Gebundenes Material kann aus der Säule unter Ver wendung einer Salzlösung (beispielsweise 0,8 M Natriumclo rid, aufgebracht mit dem Equilibrierungspuffer) eluiert werden.

Die aktiven Fraktionen von der Ionenaustauschchromatographie werden vereinigt. Geeignete Materialien zur Kationenaus tauschchromatographie umfassen Derivate der Cellulose wie Carboxymethyl-(CM)-Cellulose oder Sulfopropyl Sepharose (Pharmacia, Uppsala, Schweden). Die Säule sollte mit einem geeigneten Puffer wie Natriumacetat equilibriert sein und gebundenes Material kann mit dem Equilibrierungspuffer, der beispielsweise 0,5 M Natriumchlorid enthält, eluiert werden.

Die vereinigten aktiven Fraktionen werden weiter gereinigt durch Affinitätschromatographie auf gebundenem rekombinan tem TNFα (rhTNFα ), gekuppelt an eine geeignete Matrix, bei spielsweise Mini-Leak Agarose (Kem En Tec, Biotechnology Corp., Dänemark). Die Säule sollte gepuffert sein, unter Ver wendung von beispielsweise einem Phosphatpuffer (z. B. 0,8 M Kaliumphosphat pH 8,6). Aktive Gruppen, die nicht an rh TNFα gebunden sind, sollten blockiert werden unter Verwendung von Ethanolamin-HCl pH 8,5 Puffer. Die Säule sollte mit einem geeigneten Puffer, beispielsweise Tris-HCl, gegebenenfalls enthaltend Natriumchlorid, equilibriert werden und der TNFα- INH wird mit einem sauren (pH 3,5) Glycinpuffer eluiert. Die eluierten Fraktionen sollten sofort auf pH 7,0 durch Zugabe von beispielsweise Tris-Base eingestellt werden.

Die aktiven vereinigten Fraktionen werden vorzugsweise vor dem endgültigen Reinigungsschritt der Umkehrphasen-FPLC (Fast-protein-liquid-Chromatographie) lyophilisiert werden. Vor deren Aufbringung auf die FPLC-Säule sollte die lyophi lisierte TNFα-INH-Fraktion mit einem geeigneten Puffer wie Trifluoressigsäure (TFA) (Fulka, Buchs, Schweiz), Heptafluor buttersäure (HFBA) oder Essigsäure gepuffert werden. Die Elution des TNFα-INH aus der FPLC-Säule kann unter Verwen dung üblicher Techniken durchgeführt werden, beispielsweise mit einem geeigneten Puffer, wie vorstehend beschrieben, gegebenenfalls enthaltend einen Alkohol, beispielsweise N-Propanol.

Die eluierte Fraktion sollte sofort gepuffert werden, bei spielsweise mit Ammoniumbicarbonat und lyophilisiert werden. Der TNFα-INH ist dann in im wesentlichen homogener Form, geeignet zur weiteren Prüfung auf biologische Aktivität und zur Herstellung in einer geeigneten Form zur therapeutischen Verwendung.

Es wird demnach als weiterer oder alternativer Aspekt der Erfindung ein Protein geschaffen, das TNFα-vermittelte Akti vität selektiv hemmt, die im wesentlichen identisch ist mit derjenigen, die nach dem obigen Verfahren erhalten wurde.

Die Fähigkeit, den TNFα-INH der vorliegenden Erfindung bis zur Homogenität zu reinigen, hat die Sequenzierung des N-ter minalen Teils dieses Proteinmoleküls ermöglicht. Diese Sequenz nimmt teil beim Klonen eines Gens, das TNFα-INH kodiert, und ermöglicht so die Produktion von großen Mengen von TNFα-INH in reiner Form zur weiteren biologischen Unter suchung und gegebenenfalls zum therapeutischen Testen und zur Verwendung.

Proben von homogenem TNFα-INH gemäß der Erfindung können durch übliche Techniken sequenziert werden, beispielsweise unter Verwendung eines handelsüblichen automatischen Sequen zers, unter Verwendung von entweder Ninhydrin- oder Gaspha senermittlung. Die ersten 17 Reste des aminoterminalen Teils des menschlichen TNFα-INH, wie hier definiert, umfas sen die folgende Sequenz:

Asp-Ser-Val-Cys-Pro-Gln-Gly-Lys-Tyr-Ile-His-Pro-Gln-Cys- Asn-Ser-Ile

(identifiziert unter Verwendung eines automatischen Sequen zers, Modell 477A von Applied Biosystems).

Es wird ferner angenommen, daß die nächsten drei Aminosäuren eine Glycoxylierungsstelle schaffen und daß die Sequenz so fortfährt:

Asn-Ser-Thr-Lys.

Es sei erwähnt, daß eine gute Methode zur Schaffung großer Mengen von TNFα-INH in reiner Form durch rekombinante DNA- Techniken besteht, welche in der Fachwelt gut bekannt sind. Jedoch erfordert die erfolgreiche Anwendung solcher Techni ken nicht nur, daß der natürliche und rekombinante TNFα-INH oder seine Aktivität genau gemessen werden, sondern auch daß sowohl das natürliche als auch das rekombinante Produkt bis zur Homogenität gereinigt werden kann.

Gemäß einem noch weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Erzeugung eines Tumor Necrose Faktor- Inhibitors gemäß der Erfindung oder eines Derivats davon ge schaffen, durch Expression einer DNA-Sequenz, die einen solchen Inhibitor in einem geeigneten transformierten Wirt kodiert.

Ein solches Verfahren umfaßt das Züchten eines mit Molekülen von rekombinanter DNA transformierten Wirts, umfassend DNA-Sequenzen, die den Inhibitor kodieren, welche in einen geeigneten Vektor eingeschoben worden sind.

Geeignete eukaryotische und prokaryotische Wirte können bei spielsweise sein Stämme von Bakterien, Hefen, andere Pilze und tierische Zellen (einschließlich Insektenzellen) und Pflanzenzellen im Gewebe. Besonders bevorzugte Wirtszellen sind Hefezellen, E. coli-Zellen und tierische Zellen.

Die Expression eines Proteins mit Tumor Necrose Faktor-In hibitor-Aktivität wird erreicht durch Züchten der trans formierten Wirtzellen in einem geeigneten Wachstumsmedium. Normalerweise wird ein solches Medium enthalten eine Quelle für Stickstoff wie Ammoniumsulfat, eine Quelle für Kohlen stoff und Energie wie Glucose oder Glycerin, Spurenelemente und Faktoren, die für das Wachstum der besonderen Wirtszellen wesentlich sind. Die genauen Züchtungsbedingungen werden von dem gewählten Wert abhängen; so wird beispielsweise im Falle von E. coli submerse aerobe Fermentation bevorzugt, vor zugsweise bei etwa 37°C.

Zusätzlich kann die Expression induziert werden, beispiels weise durch Zugabe eines Induziermittels oder Verwendung von induzierenden Bedingungen für das Promotorsystem, das in dem Expressionsvektor verwendet wird.

In Abhängigkeit von dem Wirt kann der TNFα-Inhibitor als gra nulare Inklusionskörper produziert werden, welche nach der Zellyse durch Differentialzentrifugieren gewonnen werden können; diese können durch übliche Methoden solubilisiert und durch hier beschriebene Methoden zur Reinigung des Urin- TNFα-INH gereinigt werden. Alternativ kann der TNFα-Inhibi tor in Lösung in dem Cytosol sein, das in den periplasmischen Raum abgegeben oder zweckmäßig in das Kulturmedium abgege ben wird.

Die Wirtszellen werden durch rekombinante DNA-Moleküle transfor miert, welche eine DNA-Sequenz enthalten, die einen TNFα- Inhibitor kodieren, der in einen Expressionsvektor einge schoben wurde.

Solche Expressionsvektoren können bestehen aus Segmenten von chromosomalen, nicht-chromosomalen und synthetischen DNA- Sequenzen wie verschiedene bekannte Derivate von SV-40 und bekannte bakterielle Plasmide, beispielsweise "natürliche" Plasmide wie ColE1, pSCIOI oder pRSF2124 und Phagen-DNAs oder "künstliche" Plasmide (in vitro konstruiert) wie pBR322, pMB9 oder pAT153. Die Phagen-DNAs umfassen bei spielsweise die verschiedenen Derivate von Phagen-λ und andere DNA-Phagen, beispielsweise M13, und andere faden förmige einsträngige DNA-Phagen. Vektoren, die in Hefen ver wendbar sind, umfassen das 2 µ-Plasmid, und solche, die in eukaryotischen Zellen wie tierischen Zellen verwendbar sind, umfassen solche, enthaltend SV-40 Adenovirus und Retrovirus.

Solche Expressionsvektoren können auch durch wenigstens eine Expressionskontrollsequenz charakterisiert werden, welche wirksam an die TNF-Inhibitor-DNA-Sequenz geknüpft werden kann, so daß sie die Expression der geklonten DNA-Sequenz steuert und reguliert. Beispiele von brauchbaren Expressions- Kontrollsequenzen umfassen die lac-, trp-, tac- und trc- Systeme, die hauptsächlichen Arbeits- und Promotorregionen des Phagenλ (wie der P_L-Promotor unter der Steuerung des thermolabilen ts cI857-Repressors), die Kontrollregion des fd Mantel-Proteins, die glycolytischen Promotoren von Hefe (z. B. der Promotor für 3-Phosphoglyceratkinase), die Promo toren von Hefe, Säurephosphatase (z. B. Pho 5), die Promotoren von Hefeα-mating-Faktoren und Promotoren, stammend von Polyoma, Adenovirus, Retrovirus und Affenvirus.

Zusätzlich können solche Expressionsvektoren verschiedene Stellen für die Insertion von TNFα-Inhibitor-DNA-Sequenzen ge mäß der Erfindung besitzen. Diese Stellen sind durch die spe zifische Restriktionsendonuclease charakterisiert, welche sie spaltet. Solche Spaltungsstellen werden vom Fachmann gut er kannt. Der Expressionsvektor und besonders die darin gewählte Stelle zur Insertion eines ausgewählten DNA-Fragments und seine wirksame Verknüpfung an eine Expressionskontrollsequenz wird durch eine Vielzahl von Faktoren bestimmt, einschließ lich der Zahl der Stellen, die für ein gegebenes Restriktions enzym empfindlich sind, die Größe des Proteins, das der Ex pression unterworfen wird, Verunreinigung oder Bindung des der Expres sion unterworfenen Proteins durch Wirtszellenproteine, was während der Reinigung schwierig zu entfernen sein kann, der Ort der Start/Stop-Codone und andere Faktoren, die der Fachmann weiß. So ist die Wahl eines Vektors und der Insertionsstelle für eine DNA-Sequenz durch ein Gleichgewicht dieser Faktoren bestimmt, wobei nicht alle Auswahlkriterien für einen bestimmten Fall gleich wirksam sind.

In gleicher Weise werden nicht alle Wirt/Vektor-Kombinatio nen mit gleicher Stärke bei der Expression der DNA-Sequenzen gemäß der Erfindung funktionieren. Die Auswahl wird getroffen in Ab hängigkeit von einer Vielzahl von Faktoren, einschließlich Verträglichkeit des Wirts und Vektors, Leichtigkeit der Ge winnung des gewünschten Proteins, der Expressionscharakte ristika der DNA-Sequenzen und der Expressionskontrollsequenzen, die damit wirksam verknüpft sind, oder irgendwelche notwen dige Nach-Expressionsmodifikationen des gewünschten Proteins.

Die DNA-Sequenzen der Erfindung, welche bei Expression Proteine mit TNFα-Inhhibitor-Aktivität kodieren, können iso liert werden, indem verschiedene DNA-Kartierungen für solche DNA-Sequenzen unter Verwendung einer Reihe von DNA-Proben gescreent werden. Die DNA-Proben können aus dem gereinigten natürlichen Protein hergestellt werden, das als Quelle der Aminosäuresequenzdaten verwendet wird. Das gereinigte natür liche Protein kann beispielsweise aus menschlichem Urin von Fieberpatienten, wie oben beschrieben, hergestellt werden. Degenerierte DNA-Sequenzen, die verschiedene Teile und Fragmente der Aminosäureseqenz kodieren, z. B. in Kombina tion mit Lathe-Proben, werden verwendet, um die DNA-Proben zu bestimmen.

So werden verschiedene DNA-Kartierungen auf DNA-Sequenzen, welche die TNFα-Inhibitoren der Erfindung kodieren, aus gewählt. Solche Kartierungen umfassen chromosomale Genban ken und cDNA- oder DNA-Kartierungen, hergestellt aus Zell linien oder Gewebe, welche nachweislich TNFα-Inhibitoren produzieren, wie alveolare Makrophagen oder Lebergewebe. Das Screening kann durch direkte Immunexpression, beispielsweise in λgtll oder ähnlichen Systemen, oder, im Falle daß eine TNFα-INH-produzierende Zelle identifiziert wird, durch Iden tifizieren der TNFα-INH-spezifischen mRNA durch direkte Ex pression in Xenopus oocytes, erfolgen.

Eine Vielzahl von üblichen Cloning- und Selektionstechniken können verwendet werden, um DNA-Sequenzen zu lokalisieren und zu identi fizieren, welche bei Expression in einem geeigneten eukaryo tischen oder prokaryotischen Wirt die TNFα-Inhibitoren gemäß der Erfindung kodieren. Diese ausgewählten DNA-Sequenzen können selbst als Proben verwendet werden, um andere DNA-Sequenzen, die TNFα-Inhibitoren kodieren, auszuwählen, oder können in geeigneten rekombinanten DNA-Molekülen verwendet werden, um geeignete eukaryotische oder prokaryotische Wirte zur Produktion von TNFα-INH, der durch sie kodiert wird, zu transformieren.

Die Erfindung umfaßt in ihrem Bereich ein- oder doppel strangige DNA-Sequenzen, welche TNFα-Inhibitoren kodieren, solche Sequenzen enthaltende Vektoren, die zur Transforma tion eines Wirtsorganismus geeignet sind, und Wirtszellen, die mit solchen DNA-Sequenzen transformiert sind.

Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Protein mit selektiver TNFα-Inhibitor-Aktivität geschaf fen, das durch Expression eines Wirts, transformiert mit einer DNA-Sequenz, die ein solches TNFα-Inhibitor-Pro tein kodiert, erzeugt wird. Die TNF-Inhibitoren der Erfin dung, welche durch Expression einer DNA-Sequenz, die solche Inhibitoren in einem transformierten Wirt kodieren, werden demnach identisch mit der Sequenz von nativem TNFα-INH sein oder eine oder mehrere Deletionen, Substitutionen, In sertionen, Inversionen oder Additionen allelen Ursprungs oder anderweitig enthalten, die entstandene Sequenz wird mindestens 80% und vorzugsweise 90% Homolo gie mit der Sequenz von nativem TNFα-INH haben und im we sentlichen die gleichen biologischen Eigenschaften behalten. Insbesondere kann ein TNF-Inhibitor gemäß der Erfindung ein N-terminales Methionin umfassen. Auch kann beispiels weise die DNA-Sequenz gemäß der Erfindung, die TNFα-INH kodiert, in einem Expressionsvektor mit einem Teil einer DNA-Sequenz verschmolzen (integriert) werden, die ein eukaryotisches oder prokaryotisches Polypeptid kodiert, um die Expression von TNFα-INH, welcher die DNA-Sequenz kodiert, zu unter stützen oder die Sekretion, Reifung oder Reinigung des TNFα- INH von dem Wirt zu fördern; das verschmolzene (integrierte) Polypeptid kann intra- oder extra-cellular durch bekannte Techniken entfernt werden oder der TNFα-INH kann zusammen mit dem integrierten Polypeptid verwendet werden.

Die TNFα-Inhibitoren, die durch Züchten der eukaryotischen und prokaryotischen Wirte, transformiert mit DNA-Sequenzen, die TNFa-Inhibitoren kodieren, erzeugt werden, können dann nach Reinigung in den pharmazeutischen Zusammensetzun gen gemäß der Erfindung verwendet werden.

Es sei erwähnt, daß, falls der TNFα-Inhibitor gemäß der Er findung durch tierische Zellen erzeugt wurde, dieser ein Glycoprotein ist. Prokaryotische Expressionssysteme werden jedoch das Protein in unglykolisiertem Zustand erzeugen. Außerdem kann das glykolisierte Protein durch bekannte Tech niken im wesentlichen entglykolisiert werden, beispielsweise durch Verwendung von Endoglykosidase-Enzymen.

Die folgenden nicht-beschränkenden Beispiele erläutern die Erfindung. Alle Temperaturen sind in °C und alle Prozent konzentrationen in Gew.-/Vol. angegeben.

TNFα-Hemmtest

Der Prozentsatz an TNFα-INH-Aktivität in den in den Beispie len beschriebenen Fraktionen wurde bestimmt, indem angenom men wurde, daß die Werte für die optische Dichte (OD) von Murin L929-Zellen, die durch Actinomycin D (acti D) stimu liert wurden, einer 100%igen Inhibierung bzw. Hemmung ent sprechen, während das OD aus Zellen, die mit Actinomycin D und TNFα gezüchtet wurden, einer maximalen Zellmortalität von 0% TNFα-Inhibierung entsprach. Die in dem Versuch ver wendete TNFα war rekombinante menschliche TNFα (rhTNFα ), erzeugt in E. coli, wie von A. Marmenout et. al., "Molecular cloning and expression of human tumour necrosis factor and comparison with mouse tumour necrosis factor", Eur. J. Biochem., 152, Seite 515 (1985) beschrieben. Demnach wurde der Prozentsatz an TNFα-Inhibierung in dem Cytotoxizitäts test gemäß der Formel (I) berechnet:

Prozentsatz an TNFα-INH-Aktivität =

Beispiel 1 Reinigung von Urin-TNFα-INH a) Konzentration von Protein aus menschlichem Urin

Menschlicher Urin (15 Liter) wurde frisch erhalten aus einem Pool von 5 Patienten vor irgendeiner Be handlung. Zwei der Patienten litten an kleinzelligem Carcinom, einer an maligner Histocytose, einer an Poly myocitis und einer an Sepsis. Alle waren hoch fiebernd (<38,5°C) und waren frei von Harnweginfekten. Der Urin wurde bei 4° auf einem Amicon Ultrafiltrationshohlfaser apparat konzentriert, mit einem Abschneiden (Abspaltung) der Molekülgröße von etwa 5 kDa.

b) Fällung des Proteins aus menschlichem Urin

Die Ansammlung von konzentriertem Urin wurde mit festem Ammoniumsulfat gesättigt, indem das Sulfat langsam unter gleichmäßigem Rühren bei 4° zugesetzt wurde, bis eine Ammoniumsulfatkonzentration von 40% erreicht war. Der Niederschlag wurde durch Zentrifugieren entfernt, verworfen, und der Überstand wurde durch Zugabe von weiterem Ammonium sulfat auf 80%ige Sättigung eingestellt. Durch Zentrifugie ren wurde ein Pellet erhalten, das in 150 ml 20 mM Natrium phosphat (pH 7,2) und 150 mM Natriumchlorid wieder suspen diert wurde. Das Ammoniumsulfat wurde durch Dialyse bei 4° unter Verwendung von 10 mM Tris-HCL pH 7,4, 2 mM EDTA und 5 mM Benzamidin-HCl entfernt.

c) Identifizierung von TNFα-INH-Aktivität

Die halb-gereinigte Fraktion von Beispiel 1(b) wurde in einem Cytotoxizitätstest mit der TNF-empfindlichen Zel linie L929 in Anwesenheit von Actinomycin D getestet. Bei einer Verdünnung von 1 : 20 der halb-gereinigten Fraktion wurde totale Hemmung des cytotoxischen Effekts, induziert durch rhTNFα, beobachtet, so daß der OD_{570 nm}-Wert identisch war mit demjenigen, der in Anwesenheit von Actinomycin D allein (OD_{570 nm} = 1,5) gemessen wurde.

Weiterhin wurde die inhibitorische Aktivität (Hemmkonzentration) in Ver dünnungen der Fraktion bis zu 1 : 160 an Zellen (OD_{570 nm} = 0,83) beobachtet, während der Kontrollwert von rhTNFα bei einer Endkonzentration von 0,2 ng/ml, gemessen in Anwesenheit von Actinomycin D, niedriger war (OD_{570 nm} = 0,73), so daß 50% Hemmung beobachtet wurde, bei einer Verdünnung von etwa 1 : 100 (OD_{570 nm} = 1,10). Der TNFα-INH hatte keine Wirkung auf die Zellenlebensfähigkeit, wenn ohne Actinomycin D ge testet wurde.

d) Vergleich der Wirkung von TNFα-INH auf TNFα- und -β-induzierte Cytotoxizität

Ein Cytotoxizitätstest wurde durchgeführt unter Verwendung der TNF-empfindlichen Zellinie L929 in Anwesenheit von Actinomycin D, unter Verwendung eines Konzentrationsbereichs von TNFα oder TNFβ, um den cytotoxischen Effekt zu induzie ren. Die halb-gereinigte Fraktion von Beispiel 1(b) wurde bei Verdünnungen von 1 : 20, 1 : 50 und 1 : 80 getestet. Die Kontrolltests wurden in Abwesenheit von TNFα- oder TNFβ- Cytokine und in Abwesenheit des Inhibitors durchgeführt. Die Ergebnisse sind unten in der Tabelle 1 gezeigt und ver anschaulichen, daß der erfindungsgemäße Inhibitor einigen inhibitorischen Effekt (Hemmwirkung) auf die INFβ-vermittelte Cytotoxizität im Bereich von etwa 50% bis hinunter zu 2% der TNFα-Hemmung mit steigender TNFβ-Konzentration hat.

Tabelle 1

Beispiel 2 Gelfiltration von Urin-TNFα-INH

Der halbgereinigte TNFα-INH gemäß Beispiel 1(b) wurde durch Gelfiltrationschromatographie bei 4° auf einer Sephacryl S-200-Säule (0,9 × 60 cm) (Pharmacia, Uppsala, Schweden), die in 50 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,4), ent haltend 100 mM Natriumchlorid, äquilibriert worden war, gereinigt. Eine Probe der Proteinfraktion (20 mg, 0,8 ml) wurde auf die Säule gegeben und mit dem gleichen Puffer bei einer Fließgeschwindigkeit von 5,4 ml/h eluiert. Fraktionen (1,35 ml) wurden gesammelt und auf TNFa-INH- Aktivität getestet. Die TNFα-INH-Aktivität eluierte aus dem Gel in einem einzigen Peak. Die inhibitorische Ak tivität zeigte ein scheinbares Molekulargewicht von 40 bis 60 kDa (vergl. Fig. 1).

Beispiel 3 Chromatofokussierung von Urin-TNFα-INH

Der halbgereinigte TNFα-INH des Beispiels 1(b) wurde bei 4° auf einer Mono-P vorgepackten Säule (HR 5/20), 5 × 200 mm) (Pharmacia, Uppsala, Schweden), die in 25 mM Bis-Tris-Puffer, eingestellt auf pH 7,1 mit Imi dodiessigsäure (Fluka, Buchs, Schweiz), äquilibriert war, chromatographisch fokussiert. Eine Probe der Proteinfraktion von Beispiel 1(b) (30 mg) wurde auf die Säule gebracht und mit einem Polypuffer 74/ Iminodiessigsäure bei pH 4,0 eluiert. Säulenfraktionen (1 ml) wurden bei einer Verdünnung von 1 : 10 auf ihre Wirkung im rhTNFα(0,2 ng/ml)-Cytotoxizitätstest in An wesenheit von Actinomycin D (1 µg/ml) getestet. Das tatsächliche pH jeder Säulenfraktion wurde mit einem pH-Meter bestimmt, wobei die Hauptmasse der TNFα-INH- Aktivität in den eluierten Fraktionen zwischen pH 5,5 und 6,1 (vergl. Fig. 2) enthalten war. Dies ist ein Äquivalent zu dem pI des TNFα-INH-Proteins.

Beispiel 4 Ionenaustauschchromatographie von Urin-TNFa-INH

Der halbgereinigte TNFα-INH von Beispiel 1(b) wurde durch Anionen-Austauschchromatographie bei 4° auf einer DEAE-Sephadexsäule (2,6 × 20 cm) (Pharmacia, Uppsala, Schweden), die in 10 mM Tris-HCl-Puffer pH 8,0, enthal tend 2 mM EDTA, äquilibriert war, gereinigt. Gebundenes Material wurde aus der Säule mit dem Äquilibrierungs puffer, enthaltend 0,8 M Natriumchlorid, eluiert. Frak tionen (8,0 ml) wurden gesammelt, auf TNFα-INH-Aktivi tät getestet und die inhibitorischen Fraktionen wurden vereinigt (160 ml) und gegen 10 mM Natriumacetat-Puffer pH 5,0 (4 × 2 l) dialysiert.

Der TNFα-INH wurde weiter durch Kationen-Austauschchromatogra phie bei 4° an einer Sulfopropyl-Sephadexsäule (0,8 × 15 cm) (Pharmacia, Uppsala, Schweden), äquilibriert in 10 mM Natriumacetat-Puffer pH 5,0, gereinigt. Gebunde nes Material wurde aus der Säule mit dem 0,5 M Natrium chlorid enthaltenden Äquilibrierungspuffer eluiert. Fraktionen (7,5 ml) wurden gesammelt, auf TNFα-INH- Aktivität getestet und die inhibitorischen Fraktionen wurden vereinigt und auf das 20fache auf einem Amicon- Ultrafiltrationsapparat mit einem Molekülgrößenabschnitt von etwa 10 kDa eingeengt.

Beispiel 5 Gelfiltration von Urin-TNFα-INH

Das TNFα-IHN-Konzentrat von Beispiel 4 wurde durch Gel filtrationschromatographie bei 4° auf einer Sephacryl- S-200 Säule (2,6 × 100 cm) (Pharmacia, Uppsala, Schwe den), äquilibriert mit 50 mM Tris-HCl pH 7,4-Puffer, enthaltend 100 mM Natriumchlorid, gereinigt. Eine Probe der Proteinfraktion aus Beispiel 4 (200 mg) wurde auf die Säule aufgebracht und mit dem Äquilibrierungspuffer bei einer Fließgeschwindigkeit von 27 ml/h eluiert. Fraktionen (9,0 ml) wurden gesammelt, auf TNFa-INH- Aktivität getestet und die inhibitorischen Fraktionen wurde vereinigt. Die Säule wurde mit Dextranblau (DB), 2000 KDa; Rinderserumalbumin (BSA), 67 kDa; Ovalbumin (OA), 43 kDa; α-Chymotrypsinogen-A ( αCT), 25 kDa; und Ribonclease A (RNase), 13,5 kDa kalibriert, wie in Fig. 4 gezeigt.

Beispiel 6 Affinitätschromatographie von Urin-TNFα-INH

Eine TNFα-Affinitätssäule wurde hergestellt, indem re kombinante, menschliche TNFα (1,0 mg) auf Mini Leak- Agarose (Kem En Tec, Biotechnology Corp., Dänemark) in 0,8 MKaliumphosphat-Puffer pH 8,6 gekuppelt wurde. Die verbleibenden, aktiven Gruppen wurden durch Bebrütung in 0,1 M Ethanolamin-HCl-Puffer pH 8,5 blockiert. Das Gel wurde mit 50 mM Tris-HCl pH 7,4-Puffer, enthaltend 100 mM Natriumchlorid, gewaschen (3 × 50 ml). Eine Probe der TNFα-INH-Fraktionen aus Beispiel 5 (15 ml) wurde auf die Säule aufgebracht und mit 0,2 M Glycin-HCl pH 3,5- Puffer eluiert. Fraktionen (1,0 ml) wurden gesammelt, sofort durch Zugabe von 1 M Tris (5 bis 40 µl) auf pH 7,0 eingestellt und auf TNFα-INH-Aktivität getestet.

Beispiel 7 Umkehrphasen-FPLC-Chromatographie von Urin-TNFα-INH

Die TNFα-INH-Fraktionen aus Beispiel 6 wurden lyophili siert, in 0,1% Trifluoressigsäure (2,0 ml) gelöst und auf ProRPC-Umkehrphasen-FPLC-Säule (5 × 20 cm) (Phar macia, Uppsala, Schweden), äquilibriert in 0,1% Tri fluoressigsäure, aufgebracht. Gebundenes Material wurde mit einem 0 bis 100% Acetonitril-Gradienten in 0,1% Trifluoressigsäure bei einer Fließgeschwindigkeit von 0,3 ml/min eluiert. Zu jeder Fraktion (0,75 ml) wurde 0,5 M Ammoniumbicarbonat (10 µl) zugesetzt und das elu ierte Material wurde lyophilisiert.

Die Umkehrphasen-FPLC-Chromatographie ergab einen größe ren Peak entsprechend der TNFα-INH-Aktivität. Die lyo philisierten Fraktionen, welche diese Akivität enthiel ten, wurden in 10 mM Tris-HCl pH 7,4-Puffer, enthaltend 2 mM EDTA, gelöst und mittels Natriumdodecylsulfat-Poly acrylamid-Gel-Elektrophorese (SDS PAGE) analysiert, wo bei die von U. Laemmli et. al., Nature, 277, S. 680 (1970), beschriebene Methode angewandt wurde. Es wurde gefunden, daß der TNFα-INH mit einem Molekulargewicht von 33 kDa eluiert (vergl. Fig. 4) wurde. Proben, welche unter nicht- reduzierenden Bedingungen liefen, wurden auf TNFα-INH- Aktivität bei einer Verdünnung von 1: 10 auf L929-Zellen in Anwesenheit von 0,15 mg/ml rhTNFα getestet. Die ge gen rhTNFα gerichtete Aktivität wanderte mit einem scheinbaren Molekulargewicht, das mit der 33-kDa-Bande auf dem Gel, gelaufen unter reduzierenden Bedingungen, identisch war.

Beispiel 8 Protein-Sequenzierung von Urin-TNFα-INH

Die aus der Umkehrphasen-FPLC-Chromatographie isolierte TNFα-INH-Fraktion wurde im Vakuum eingeengt und auf ein hergerichtetes Sequenzierfilter getüpfelt. Das Protein wurde mit einem Applied Biosystems Model 477A-Protein- Sequenzer analysiert. Fraktionen von den sequenzierenden Zyklen wurden zur Trockene eingedampft und in N,N-Di isopropylethylaminacetat und Acetonitril vor der Injek tion in eine HPLC-Säule für Restidentifizierung wieder suspendiert.

Die ersten 17 Aminosäurereste des N-terminalen Endes wurden identi fiziert und haben die Sequenz:

Asp-Ser-Val-Cys-Pro-Cln- Gly-Lys-Tyr-Ile-His-Pro-Gln-Cys-Asn-Ser-Ile.

Es wird weiterhin angenommen, daß die nächsten drei Aminosäuren eine Glykosylierungsstelle darstellen und daß die Sequenz somit sich mit Asn-Ser-Thr-Lys fortsetzt. Diese Sequenz ist nicht deutlich homogen zu irgendeiner Proteinsequenz, die in der NBRF-Proteinsequenzdatenbasis (November 1988) enthalten ist.

Beispiel 9 Veranschaulichung, daß TNFα-INH ein Protein ist (a) Zeit- und Temperaturabhängigkeit

Der Sephacryl S-200-gereinigte TNFα-INH gemäß Beispiel 2, erhalten durch Vereinigen der Röhrchen mit den aktiven Fraktionen, wurde auf 56°, 75° und 95° erhitzt. Die TNFα-INH-Aktivität wurde nach 10, 20 und 60 min gemessen und durch Vergleich mit unbehandelten Proben wurde der Prozentsatz an TNFα-INH-Aktivität gemäß Formel (I) er rechnet. Die in der folgenden Tabelle 2 angegebenen Er gebnisse zeigen, daß die TNFα-INH-Aktivität in zeit- und temperaturabhängiger Weise sinkt.

Hitzeinaktivierung

(b) Empfindlichkeit für Trypsinverdauung (digestiver Abbau)

Trypsin (500 µg) (Sigma, St. Louis, Mo.)in 0,2 M Tris- HCl-Puffer (pH 8,0), enthaltend 1 mM Calciumchlorid, wurde zu den vereinigten Fraktionen des Sephacryl S-200- gereinigten Urin-TNFα-INH von Beispiel 2 gegeben und 4 h bei 37°C bebrütet. Ein anderer Anteil von Trypsin (500 µg) wurde zugesetzt und die Verdauung weitere 20 h fortgesetzt, bei welcher Zeit die Reaktion durch Zugabe von Sojabohnentrypsin-Inhibitor (2 mg) (Sigma, St. Louis, Mo.) beendet wurde. Der Prozentsatz der TNFα-INH-inhi bitorischen Aktivität des Trypsinauszugs und der Kon trollprobe wurde bestimmt bei einer Endverdünnung von 1 : 20 des Pools der vereinigten Fraktionen auf L929- Zellen, stimuliert durch rhTNFα in Anwesenheit von Actinomycin D gemäß Formel (I). Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 3 aufgeführt.

Trypsin-Inaktivierung

(c) Behandlung mit Harnstoff

Der mit Sephacryl S-200 gereinigte TNFα-INH von Beispiel 2 wurde zu 2 M Harnstoff gegeben und ausgiebig bei 4′ gegen Phosphat-gepufferte Salzlösung (PBS), enthal tend 2 M Harnstoff, dialysiert. Die Dialyse gegen PBS wurde vor der Biobestimmung wiederholt. Es wurde gefun den, daß die TNFα-INH-Aktivität nicht angegriffen war, was anzeigt, daß die inhibitorische Aktivität durch ein Molekül mit niedrigem Molekulargewicht, gebunden an ein Protein, nicht vermittelt wurde.

Beispiel 10 Veranschaulichung von konkurrierender (kompetitiver) Hemmung

Der Sephacryl S-200-gereinigte TNFα-INH von Beispiel 2 wurde bei einer Verdünnung von 1 : 10 gegen steigende Men gen von rhTNFα auf L929-Zellen getestet. Eine umgekehr te Wechselbeziehung zwischen der Menge an vorhandenem rhTNFα in dem Test und dem Grad der Hemmung wurde beob achtet (siehe Fig. 3). Demnach wird die Hemm- Aktivität kompetitiv durch steigende Konzentrationen an rhTNFα überwunden.

Beispiel 11 Hemmung der TNFα-vermittelten PGE₂-Produktion durch dermale Fibroblasten

Menschliche dermale Fibroblasten wurden bei einer Kon zentration von 2,0 × 10⁴ Zellen/Vertiefung eingebracht und 48 h gezüchtet. Die Zellen wurden dann mit DMEM-Puffer, ergänzt mit 10% FCS als Kontrolle, stimuliert. Zellen wurden auch mit rhTNFα bei Konzentrationen im Bereich von 0,5 bis 5 mg/ml stimuliert, und der Effekt des TNFα-INH aus Beispiel 5 wurde bei drei Verdünnungen (1 : 20, 1 : 50 und 1 : 80) in dem obigen Puffer beobachtet. Nach 72stündiger Bebrütung wurde die PGE₂-Produktion im Überstehenden durch Radioimmunoassay unter Verwen dung eines PGE₂-Antiserums [siehe J. M. Dayer et. al., J. Clin. Invest., 67, S. 1385 (1979)] gemessen.

Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 4 gezeigt und veranschaulichen, daß die Fähigkeit von rhTNFα, die PGE₂-Produktion durch dermale Fibroblasten zu stimulie ren, durch die Zugabe von TNFα-INH bei allen drei Ver dünnungen gehemmt war. Bei einer Verdünnung von 1 : 80 von TNFα-INH war die inhibitorische Aktivität teilweise durch steigende rhTNFα-Konzentrationen überwunden.

Drei verschiedene Versuche wurden mit dem gleichen Stamm von Fibroblasten durchgeführt. Puffer oder TNFα- INH wurde bei verschiedenen Verdünnungen in Anwesenheit oder Abwesenheit von verschiedenen Konzentrationen an rhTNFα inkubiert. Die PGE₂-Produktion durch gezüchtete, menschliche, dermale Fibroblasten wurde nach 3 Tagen ge messen. Die Werte stellen die dreifachen Mittel der drei Kulturen ± SEM (N = 3) dar.

Beispiel 12 rhTNFα-Bindungshemmtest

Rekombinante, menschliche TNFα wurde unter Verwendung der Jodogen-Methode von Fraker und Speck jr., Biochem. Biophys. Res. Comm., 80, S. 849 (1978), jodiert. Die spezifische Aktivität von [¹²⁵J]-INFα war 2,2 × 10⁴ cpm/ng und erzeugte eine einzige Bande mit einem Mo lekulargewicht von 17 kDa, wenn durch SDS PAGE analy siert wurde. Die menschliche Makrophagen-Zellinie U937 in aliquoten Anteilen von 10⁶ Zellen wurde 2 h bei 4° in einem Kulturmedium (200 µl), umfassend RPMI 1640 (Gibco, Paisley, Schottland), ergänzt mit Streptomycin (100 µg/ml), Penicillin (100 E/ml), 1,0% Glutamin und 10% foetalem Kalbsserum, und zusätzlich enthaltend 0,04% Natriumazid und 0,5 ng [¹²⁵J]-TNFα, gezüchtet. Die Bin dungshemmung wurde durch Zugabe von verschiedenen Ver dünnungen an TNFα-INH (1 : 20, 1 : 200 und 1 : 2000) durch geführt.

Nicht-spezifische Bindung wurde in Anwesenheit eines 100fachen Überschusses von nichtmarkiertem rhTNFα ge messen und die freie Radioaktivität wurde von dem ge bundenen [¹²⁵J]-TNFα durch Zentrifugieren durch ein Öl gemisch abgetrennt, wie von Robb et. al., J. Exp. Med., 154, S. 1455 (1981), beschrieben. Zellgebundenes [¹²⁵J]- TNFα wurde in einem Gamma-Zähler (LKB, Bromma, Schwe den) gemessen und der Prozentsatz der Bindungshemmung wurde nach der Formel (II) bestimmt.

Prozent der Bindungshemmung:

Beispiel 13 Wirkung von TNFα-INH auf [¹²⁵-J]-TNFα-Bindung an U937-Zellen

U937-Zellen wurden 1 h bei 20° in dem Kulturmedium von Beispiel 12 in Anwesenheit von entweder [¹²⁵J]-TNFa al lein oder [¹²⁵J]-TNFα mit 100fachem Überschuß an nicht markiertem rhTNFα vorgezüchtet. Die U937-Zellen wurden dann mit phosphatgepufferter Salzlösung (3 × 50 ml) bei 4° gewaschen. Die in [¹²⁵J]-TNFα allein gezüchteten Zellen wurden in vier Ansätze aufgeteilt und mit TNFα- INH aus Beispiel 5 (1 : 20, 1 : 200 und 1 : 2000 Verdünnun gen) bzw. mit Puffer allein gezüchtet.

Es wurde gefunden, daß die spezifische Bindung von (¹²⁵J]-TNFα an U937-Zellen bei 4° um 100%, 80% und 35% durch die drei Verdünnungen von TNFα-INH, 1 : 20, 1 : 200 bzw. 1 : 2000, gehemmt wurde (vergl. Fig. 5). Der Kon trollansatz, der kein TNFα-INH enthielt, zeigte keine Hemmaktivität. Es wurde festgestellt, daß die Bindungs hemmung der beiden schwächeren Verdünnungen auf 90% bzw. 60% gesteigert wurde, wenn [¹²⁵J]-TNFα mit TNFα-INH bei Verdünnungen von 1 : 200 bzw. 1 : 2000 vor der Zell zugabe vorinkubiert wurde.

Der Versuch wurde wiederholt unter Verwendung von vor inkubierten Zellen in Anwesenheit von [¹²⁵J]-TNFα und einem 100fachen Überschuß an nicht-markiertem TNFα, so daß der Prozentsatz der Bindungshemmung für nicht spezifische Bindung korrigiert werden konnte.

Beispiel 14 Spaltung eines vorgeformten TNFα:U937-Komplexes

U937-Zellen wurden 1 h in Anwesenheit von [¹²⁵J]-TNFα, wie in Beispiel 12 beschrieben, vorgezüchtet. Die Zel len wurden gewaschen und entweder bei 4° oder 37° in An wesenheit oder Abwesenheit von TNFα-INH aus Beispiel 5 bebrütet. Es wurde festgestellt, daß Zelloberflächen gebundenes [¹²⁵J]-TNFα in Anwesenheit von TNFα-INH ra scher spaltet als in dessen Abwesenheit, und es wurde weiterhin festgestellt, daß dies in einer Zeit- und Temperatur-abhängigen Weise (siehe Fig. 6) erfolgt.

Beispiel 15 Darstellung, daß TNFα-INH kein Proteolytikum für hrTNFα ist

[¹²⁵J]-TNFα wurde 1 h bei 20° in Anwesenheit von drei verschiedenen Verdünnungen von TNFα-INH (1 : 20, 1 : 200 und 1 : 2000) und in Anwesenheit von Puffer allein bebrü tet. Bei Analyse durch SDS PAGE und Autoradiographie wurde festgestellt, daß [¹²⁵J]-TNFα als einzige Bande sowohl in Abwesenheit als auch in Anwesenheit von TNFα- INH wandert, was anzeigt, daß der Inhibitor keine prote olytische Wirkung hat.

Beispiel 16 Wirkung von TNFα-INH auf die IL-1-Rezeptor-Bindungsaktivität

Die Aktivität von TNFα-INH aus Beispiel 5 wurde in dem IL-1/LAF (Lymphozyten-aktivierender Faktor)-Versuch ge testet, wenn durch IL-1α oder IL-1β induziert wurde [dieser Versuch ist von P. Seckinger et. al., J. Immunol., 139, S. 1541 (1987) für ein IL-1-Inhibitorprotein be schrieben]. Eine Dosis-Reaktion von [³H]-Thymidin-Ein verleibung (entsprechend der Thymozyten-Vermehrung) wurde in bis zu 200 pg/ml-Konzentrationen sowohl von IL-1α als auch IL-1β beobachtet. Zugabe von TNFα-INH bei Konzentrationen, von denen beobachtet wurde, daß sie rhTNFα hemmen, hatten keinerlei signifikante Wir kung auf die IL-1-induzierte Thymozyten-Vermehrung, was anzeigt, daß die Hemmung nur für TNFα spezifisch ist.

Die erhaltenen Ergebnisse sind unter Bezugsnahme auf die beigefügten Zeichnungen folgendermaßen erläutert: Fig. 1 zeigt das Urin-TNFα-INH-Aktivitätsprofil der Sephacryl S-200-Gelfiltration. Säulenfraktionen (1 ml) wurden bei einer Verdünnung von 1 : 10 auf die Wirkung in dem rhTNFα(1,0 ng/ml)-Cytotoxizitätstest in Anwesenheit von Actinomycin D (1,0 µg/ml) getestet (oo). Die Kurve () bedeutet OD_{280 nm} der Frak tionen. Die Balken bedeuten die Zellyse, gemessen durch Farbstoffaufnahme als Reaktion zu Actinomycin D () und zu Actinomycin D plus hrTNFα () ohne Urin. Die Molekulargewichtsmarker sind Dextranblau (DB), Rinder serumalbumin (BSA), Ovalbumin (OA), α-Chymotrypsinogen ( αCT), Ribonuclease A (RNase) und Phenolrot ( Φ-red).

Fig. 2 zeigt das Urin-TNFα-INH-Aktivitätsprofil der Chromatofokussierung auf einer Mono-P-Säule. Säulen fraktionen (1 ml) wurden bei einer Verdünnung von 1 : 10 auf die Wirkung in dem rhTNFα(0,2 ng/ml)-Cytotoxizi tätstest in Anwesenheit von Actinomycin D (1,0 µg/ml) getestet (o o). Die Linie ( ) bedeutet OD_{280 nm} der Fraktionen und (-----) bedeutet ihr pH. Die Balken sind wie in Fig. 1 beschrieben.

Fig. 3 zeigt die Umkehrbarkeit der TNFα-INH- Aktivität. Die leeren Kreise (o o) bedeuten OD_{570 nm′} gemessen in Anwesenheit von Actinomycin D, rhTNFα mit TNFα-INH; ausgefüllte Kreise (⚫ ⚫) bedeuten OD_{570 nm′} gemessen in Anwesenheit von Actinomycin und nur rhTNFα, und der Balken () bedeutet OD_{570 nm} in Gegenwart von Actinomycin D (1,0 µg/ml) allein.

Fig. 4 zeigt das Elutionsprofil der Sephacryl S-200-Gelfiltration mit gereinigtem TNFα-INH aus Bei spiel 5. Säulenfraktionen (9 ml) wurden sterilisiert und bei einer Verdünnung von 1 : 50 gegen rhTNFα (1,0 mg/ ml) in Anwesenheit von Actinomycin D (1,0 µg/ml), in Anwesenheit von Actinomycin D (1,0 µg/ml) in dem L929- Cytotoxizitätstest getestet (o o). Die Linie ( ) bedeutet OD_{280 nm} der Fraktionen. Die Balken sind wie in Fig. 1 definiert.

Fig. 5 zeigt die SDS PAGE-Analyse von gereinigtem TNFα-INH von Beispiel 7. SDS PAGE wurde wie von U. Laemmli et. al., Nature, 277, loc. cit., beschrieben, durchgeführt. Die Proben wurden auf 15% Polyacrylamid- Gel mit einem 3% Packungsgel geladen, und die Gele wurden mit Silber angefärbt, wie von C. Merril et. al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76, S. 4335 (1979) beschrieben. Pro beläufe unter nicht-reduzierenden Bedingungen wurden auf biologische Aktivität getestet, indem 2 mm-Scheiben von dem Gel abgeschnitten und die Proteine durch Bebrü tung über Nacht in 10 mM Tris-HCl pH 7,4, enthaltend 2 mM EDTA (Gesamtvolumen 200 µl), eluiert wurden. Die Fraktionen wurden bei einer Verdünnung von 1 : 10 auf L929-Zellen in Anwesenheit von rhTNFa (0,15 ng/ml) ge testet.

Fig. 6 zeigt die Wirkung von TNFα-INH auf [¹²⁵J]- TNFα-Bindung an U937-Zellen. TNFα-INH wurde bei drei verschiedenen Verdünnungen in Anwesenheit von [¹²⁵J]- TNFα mit der U937-Zellenlinie, wie in Beispiel 13 be schrieben, bebrütet. Leere Vierecke ( ) bedeu ten Bebrütung in Anwesenheit von TNFα-INH und die leeren Dreiecke (∆ ∆) bedeuten die Kontrollprobe. Ausgefüllte Symbole bedeuten eine 30minütige Vor-Inku bation von TNFα-INH bei 20° mit [¹²⁵J]-TNFα in dem Kulturmedium vor der Zellzugabe.

Fig. 7 zeigt die Spaltung eines vorgeformten TNFα : U937-Komplexes. U937-Zellen wurden mit [¹²⁵J]-TNFα vor-inkubiert, gewaschen und mit TNFα-INH, wie in Beispiel 14 beschrieben, entweder bei 4° ( ) oder 37° (∎ ∎) bebrütet. Bei der angegebenen Zeit wurde die mit der Zelle verbundene Radioaktivität gemessen und der Prozentsatz der spezifischen Bindung bestimmt. Auf dem Diagramm wurde der von der Kontrolle erhaltene Wert ohne den Inhibitor abgezogen von den Werten, die bei den zwei Temperaturen erhalten wurden, so daß 100% dem Wert entsprechen, der ohne Zugabe von TNFα-INH er halten wurde.

Claims

1. Ein Protein, das Tumor Necrose Faktor (TNF)α-vermit telte Aktivität inhibiert (hemmt), jedoch andere Proteine, welche mit TNF gewisse, jedoch nicht alle biologischen Aktivitäten von TNF gemeinsam haben, nicht blockiert.

2. Protein, das Tumor Necrose Faktorα-vermittelte Akti vität selektiv hemmt und ein oder mehrere der folgenden Charakteristika hat:

(a) Ein Molekulargewicht im Bereich von 40 bis 60 kDa, be stimmt durch Molekularsiebchromatographie;
(b) einen isoelektrischen Punkt (pI) im Bereich von 5,5 bis 6,1, bestimmt durch Chromatofokussierung;
(c) Hemmung des Standard-TNF-Tests der Differentialcyto toxizität für Murin L929-Zellen, die mit Actinomycin D behandelt sind;
(d) Hemmung von TNF-induzierter PGE₂-Freisetzung aus mensch lichen Fibroblasten und Synovialzellen;
(e) der Inhibitor stört bzw. überlagert sich mit der Bin dung von TNFα an U937-Zellen (eine monocytische Tumorzel linie), wie durch Inhibierung der Bindung von radioaktiv markierter TNFa (¹²⁵I-TNFα ) ersichtlich wird.
(f) die Spaltung eines vorgebildeten TNFα : U937-Zellkomple xes wird durch den Inhibitor in temperaturabhängiger Weise gefördert;
(g) der Inhibitor baut TNF durch proteolytische Spaltung nicht ab;
(h) der Inhibitor hemmt nicht IL-1-Rezeptor-bindende Aktivi tät, z. B. die Bindung von radioaktiv markiertem IL-1 (¹²⁵I-IL-1a ) an die Murin Thymoma-Subzellinie EL4-6.1.

3. Protein, das selektiv Tumor Necrose Faktorα-vermit telte Aktivität inhibiert (hemmt) und ein oder mehrere der folgenden Charakteristika hat:

(a) Ein Molekulargewicht von etwa 33 kDa, bestimmt durch SDS-PAGE;
(b) einen isoelektrischen Punkt (pI) im Bereich von 5,5 bis 6.1, bestimmt durch Chromatofokussierung;
(c) Inhibierung des Standard-TNF-Tests der Differential-Cyto toxizität für Murin L929-Zellen, die mit Actinomycin D behandelt sind;
(d) Inhibierung von TNF-induzierter PGE₂-Feisetzung aus menschlichen Fibroblasten und Synovialzellen;
(e) der Inhibitor stört (überlagert) die Bindung von TNFα an U937-Zellen (eine monocytische Tumorlinie), wie durch Inhibierung der Bindung von radioaktiv markiertem TNFα (¹²⁵I-TNFα ) ersichtlich;
(f) die Spaltung eines vorgeformten TNFα : U937-Zellkomplexes wird durch den Inhibitor in temperaturabhängiger Weise gefördert bzw. hervorgerufen;
(g) der Inhibitor baut nicht TNF durch proteolytisce Spal tung ab;
(h) der Inhibitor hemmt nicht IL-1-Rezeptor-bindende Aktivi tät, z. B. die Bindung von radioaktiv markiertem IL-1 (¹²⁵I-IL-1a ) an die Murin Thymoma-Subzellinie EL4-6.1.

4. Ein Protein gemäß einem der Ansprüche 2 oder 3 mit den Eigenschaften (a) und (b), zusammen mit einer oder mehreren der Eigenschaften (c) bis (h).

5. Protein gemäß einem der Ansprüche 2 oder 3 mit allen Eigenschaften (a) bis (h).

6. Protein gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, das einem natürlich auftretenden TNFα-Inhibitor entspricht.

7. Protein gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, mit einer aminoterminalen Aminosäuresequenz folgendermaßen: Asp-Ser-Val-Cys-Pro-Gln-Gly-Lys-Tyr-Ile-His-Pro-Gln-Cys-Asn- Ser-Ile.

8. Protein gemäß Anspruch 7, mit einer aminoterminalen Aminosäuresequenz folgendermaßen: Asp-Ser-Val-Cys-Pro-Gln-Gly-Lys-Tyr-Ile-His-Pro-Gln-Cys- Asn-Ser-Ile-Asn-Ser-Thr-Lys.

9. Protein gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Aminosäuresequenz eine oder mehrere Deletionen, Substitutionen, Insertionen, Inversionen oder Additionen allelen Ursprungs oder anderweitig enthält, wo bei die sich ergebende Sequenz mindestens 80% Homologie mit dem Stammprotein hat und im wesentlichen die gleichen biologischen Eigenschaften wie das Stammprotein behält.

10. Protein gemäß Anspruch 9, mit wenigstens 90% Homologie mit dem Stammprotein.

11. Protein gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10 in einer im wesentlichen homogenen Form.

12. Protein gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß es ein rekombinantes Protein ist.

13. Protein gemäß einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß es ein glykosyliertes Protein ist.

14. Protein gemäß einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß es im wesentlichen in unglykolisiertem Zustand ist.

15. Eine exogene DNA, umfassend eine Nucleotidsequenz, welche ein Protein kodiert, wie in einem der Ansprüche 1 bis 11 definiert.

16. Eine cDNA, umfassend eine Nucleotidsequenz, welche ein Protein gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11 kodiert.

17. Rekombinanter Expressionsvector, umfassend DNA gemäß einem der Ansprüche 15 oder 16.

18. Wirtszelle, transformiert mit einem Expressionsvektor gemäß Anspruch 17.

19. Verfahren zur Herstellung eines TNFα-INH-Proteins, dadurch gekennzeichnet, daß eine Zelle gemäß Anspruch 18 gezüchtet und das TNFα-INH-Protein isoliert wird.

20. Rekombinantes Protein, hergestellt nach der Methode von Anspruch 19.

21. Verfahren zur Herstellung eines TNFα-INH-Proteins, umfassend die folgenden Schritte:

(a) Konzentration des Urins von Fieberpatienten;
(b) Ammoniumsulfatfällung;
(c) Anionaustauschchromatographie;
(d) Kationenaustauschchromatographie;
(e) Gelfiltration;
(f) Affinitätschromatographie; und
(g) Umkehrphasen-FPLC.

22. Protein, dadurch gekennzeichnet, daß es im wesentlichen identisch ist mit dem Protein, das nach dem Verfahren von Anspruch 21 erhalten wurde.

23. Pharmazeutische Formulierung, umfassend einen TNFα- Inhibitor, wie in einem der Ansprüche 1 bis 14 oder Anspruch 22 definiert, oder ein pharmazeutisch annehmbares Derivat davon und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger dafür.

24. Protein gemäß einem der Ansprüche 1 bis 14 oder An spruch 22 zur Vewendung in der Therapie.

25. Pharmazeutische Formulierung zur Verwendung bei der Erzeugung eines Arzneimittels zur Behandlugn von Zuständen, die mit übermäßiger oder unregelmäßiger TNFα-Produktion einhergehen, dadurch gekennzeichnet, daß diese Formulierung einen TNFα-Inhibitor, wie in einem der Ansprüche 1 bis 14 oder Anspruch 22 definiert, oder ein pharmazeutisch annehm bares Derivat davon umfaßt.