PT87237B - Processo para a preparacao de proteinas bi-funcionais e de composicoes farmaceuticas que as contem - Google Patents

Processo para a preparacao de proteinas bi-funcionais e de composicoes farmaceuticas que as contem Download PDF

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Description

MEMÓRIA BESCRITIVA
A interleuquina-2, seguidamente designada abreviadamente por IL-2, possui actividade de factor de crescimento das células T. A IL-2 reforça a actividade das células destruidoras (Killer), como as células destruidoras naturais NK (natural Killer), as células T citotóxicas e as células destruidoras activadas pela linfoquina LAK (Lymphokine Activa ted Killer).
factor de estimulação de colónias (Colony stimulating) de granulócitos e macrófitos, seguidamente designado abreviadamente por GM-CSF, pelo contrário, estimula a formação de granulócitos e de macrófagos a partir de células precursoras hematopoiéticas. A combinação das duas actividades biológicas tem interesse para o tratamento de tumores com e sem administração de citostáticos. A IL-2 e o GM-CSF possuem, no entanto, estabilidades diferentes, o que pode provocar pro. blemas na utilização directa dos dois componentes e, em conse. quência, pode contribuir para a redução dos resultados tera- 1 pêuticos.
problema das diferentes estabilidades pode ser resolvido de acordo com o processo da presente invenção mediante o acoplamento das duas proteínas numa única proteína bifuncional.
Já foram descritas proteínas de fusão geral
Met - X - Y - Z ou Met - Z - Y - X í (Ia) (Ib) | i
I para a preparação por manipulação genética de GM-CSP eventualmente modificado, nas quais X essencialmente significa os primeiros cerca de 100 ácidos aminados da 11-2 humana, de preferência, Y significa uma ligação directa no caso de o ácido aminado ou a série de ácidos aminados adjacentes à proteína pretendida possibilitarem hidrólise da proteína pretendida, ou, por outro lado, um elo de ligação de um de vários ácidos aminados geneticamente codificáveis que permitam a hidrólise, e Z significa uma sequência de ácidos aminados geneticamente codificáveis que representa a proteína pretendida GM-CSF. Pode-se utilizar também a sequência de ADN que codifica para a IL-2 - mais ou menos - até à extremidade e deste modo obter como produto secundário 11-2 biologicamente activa - eventualmente modificada - (pedido de Patente Europeia não pré-publicada com o número de publicação (EP-A) 0 228 018 ou Patente Sul-Africana 86/9557).
Ao contrário das descriç-ães anteriores, a presente invenção não se refere à utilização das proteínas como intermediários mas sim ao seu uso em processos de tratamento terapêutico do corpo humano ou como medicamentos que contém as referidas proteínas de fusão ou que são constituídos pelas referidas proteínas de fusão. Um outro aspecto da presente invenção refere-se à utilização destas proteínas de fusão para a preparação de um medicamento para o tratamento de neoformaçães malignas.
As proteínas de fusão preparadas de acordo
com a presente invenção são portanto constituídas por dois componentes biológicos activos:
por um lado uma fracção de IL-2, a qual pode ser modificada de modo conhecido, e por outro lado uma fracção de G-M-CSF, a qual pode igualmente ser modificada, e eventualmente um elo de ligação correspondente à definição de Y na fórmula apresentada anteriormente. De preferência a ordem dos componentes cor responde à fórmula Ia. 0 princípio da presente invenção pode também servir para a preparação de outras novas proteínas de fusão bifuncionais.
À figura mostra a construção do plasmideo pB3O que codifica para uma proteína bifuncional.
São conhecidas modificações na molécula da IL-2 das quais apenas aqui se faz referência, a título exemplificativo, às descritas em EP-A 0 091 539, 0 118 617, 0 136 489 e 0 163 249. Para além disso descreve-se no pedido de Patente Europeia não objecto de pré-publicação EP-A 0 219 839 um derivado da IL-2 no qual os primeiros sete ácidos aminados na extremidade N-terminal foram suprimidos.
Na EP-A 0 228 são descritas modificações da molécula do Grivl-CSP.
Podem ser introduzidos outras variações em ambas as fracções activas moleculares de modos conhecidos, dos quais aqui se refere, a título exemplificativo, a mutagénese específica.
elo de ligação Y tem, de modo vantajoso, a fórmula II
- Asp - (As)x - Pro (II) em que x significa um número inteiro até 20 e As significa um qualquer ácido aminado codificável geneticamente com excepção de cisteína.
É vantajoso que o elo da fórmula II se encontre situado na extremidade esquerda da fracção da IL-2 e
De um modo especialmente, Y apresenta as sequências de ácidos aminados.
- Asp - Pro - Met - Ile - Thr - Thr - Tyr - Ala - Asp -
- Asp - Pro - ou
- Asp - Pro - Met - Ile - Thr - Thr - Tyr - Leu - Glu -
- Glu - Leu - Thr - Ile - Asp - Asp - Pro -,
Estando igualmente de preferência a fracção da IL-2 ordenada na extremidade esquerda e a fracção do GM-CSP na extremidade direita.
A expressão das proteínas bifuncionais da presente invenção pode ser levada a efeito de acordo com técni cas conhecidas em si. Em sistemas de expressão bacteriana pode ser seguida a via da expressão directa. Para esse fim são ade. quados todos os sistemas vector-hospedeiro, podendo os hospedeiros ser, por exemplo, bactérias dos géneros Streptomyces,
B. subtilis, Salmonella typhimurium ou Serratia marcescens, e especialmente E. coli.
A sequência de ADN que codifica para a pro teína pretendida é integrada de acordo com técnicas conhecidas num vector, que garante uma boa expressão no sistema de express são seleccionado.
Para este fim pode ser escolhido, de acordo com o fim em vista, o promotor e operador a partir do grupo trp, lac, tac, Pr ou Pr do fago^ , hsp, omp ou um promotor sintético, como os que são descritos por exemplo na publicação de pedido de Patente Alemã 34 30 683 ou na EP-A 0 173 149. Ê vantajosa a sequência tac-promotor-operador, que pode ser obtida comercialmente (p. ex. o vector de expressão pKK223-3, Pharmacia, Molecular Biologicals, Chemicals and Equipment for Molecular Biology, 1984, pág. 63).
Na expressão das proteínas de acordo com a presente invenção pode verificar-se vantajoso para o fim em vista modificar alguns tripletos dos primeiros ácidos aminados
Ν') a seguir ao codão de início ATG a fim de evitar um eventual emparelhamento de bases sobre o plano do ARNm. Estas modificações, tais como supressões ou adições de alguns ácidos aminados, sideram-se são familiares abrangidas no cia em S. um sistema através do dos especialistas na matéria e con· âmbito da presente invenção.
i expressão em leveduras - de preferên j é vantajoso para o fim em vista usar i de secreção, por exemplo a expressão heteróloga sistema do factor , descrito várias vezes.
Para a cerevisiae Para a expressão da molécula bifuncional em leveduras é vantajoso, quando existem, destruir na proteína; bifuncional as sequências peptídicas dibásicas bem como os locais de glicosilação por meio de permuta de alguns ácidos aminados. Para esse fim ocorrem numerosas possibilidades de combinação, as quais também biológica, partir de 0 188 350.
A expressão da
EP-A 0 142 268 modo de podem influenciar a actividade IL-2 em leveduras é conhecida a e a do Gií-CSF da EP-A administração das proteínas bidé acordo com a presente invenção corresponde às funcionais dos dois componentes. Em virtude da maior estabilidade é, no entanto, em muitos casos possível uma dosagem mais reduzida, que se situa na parte inferior da gama de dosagem até agora usadas.
Nos exemplos que se seguem elucida-se a presente invenção mais em pormenor ferem-se
Os dados em a peso, sempre que nada em contrário percentagem refor indicado.
Exemplo plasmideo pl59/6 (EP-A2 0 163 249, Figura 5; (1) na figura anexa) contém entre um local de corte
EcoRI e um Sall um gene sintético para a IL-2. A sequência de ADN deste gene é dada na referida EP-A2 sob designação Sequência de ADN I. No domínio dos tripletos 127 e 128 encontra-se situado um local de corte Taql. A partir deste plasmideo separa-se por corte com EcoRI e Taql e isola-se
a sequência (2) parcial da IL-2.
A partir da EP-A2 0 183 350 é conhecido o plasmideo pHG23 (3) que codifica para GM-CSF. 0 ÀDNc do GM-CSP é apresentado na Fig. 2 desta EP-A2. Quando se integra a sequência de ADNc no local de corte PstI do plasmideo pBR322 obtém-se o plasmideo pHG23 utilizando, por um lado, o local de corte PstI na extremidade 5’ e, por outro lado, um local PstI introduzido por ”trailing” GC na extremidade 3’. A partir deste plasmideo isola-se por corte com SfaNI e PstI, a sequência de ADN (4) que contém a maior parte do gene do Giá-CSF.
seguinte oligonucleótido (5) é sintetizado pelo método do fosfito:
128 (133)
Ile Ile Ser Thr Leu Asp Pro Líet Ile
CG ATC ATC TCT ACC CTG GAC CCG ATG ATC
TAG TAG AGA TGG GAC CTG GGC TAC TAG (Taql)
2
Thr Thr Tyr Ala Asp Asp Pro (Ala) (Pro)
ÀCC ACC TAT GCG GAC GAT CCG GC
TGG TGG ATA CGC CTG CTA GGC CGT GGG (SfaNI) oligonucleótido (5) completa a sequência de ADN da IL-2 na extremidade 5', situando-se na posição 133 uma Asp em vez duma Thr. Na extremidade 3’ deste oligonucleótico estão situados os nucleótidos que foram suprimidos a partir do
ÀDNc por corte com SfaNI.
A preparação do plasmideo de expressão pEWlOOO (6) é descrita na EP-A 0 227 938 (não publicada) (Fig.
1). Este plasmideo é um derivado do plasmideo ptac 11 (Amann et al.Gene 25 (1983) 167-178), no qual no local de reconhecimento para EcoRI foi integrada uma sequência sintética que con tém um local de corte Sall. Obtém-se o plasmideo de expressão pKK 177.3. Por inserção do repressor lao (Farabaugh) Nature 274 (1987) 765-769) obtém-se 0 plasmideo pJF 118. Este é aberto no local de corte por restrição singular para Aval e é encurta do de cerca de 1000 pb por tratamento com exonuclease e é li- 6 -
gado de modo conhecido. Obtém-se o plasmideo pEWlOOO (6) . Por abertura do plasmideo no poliadaptador com as enzimas EcoRI e PstI obtém-se o plasmideo de expressão linearizado (7).
ADN deste plasmideo linearizado (7) é entãc ligado com o fragmento de ADN (2), que codifica para a sequência da 11-2, com o oligonucleótido sintético (5) e com o fragmento de ADNc (4). Resulta o plasmideo pB30 (8) que é utilizado para transformação da estirpe de E.coli Mc 1061. 0 ADN plasmídeo de alguns clones é isolado e é caracterizado por meio de análise de restrição.
Exemplo 2
Quando no procedimento de Exemplo 1 se utili za, em vez do oligonucleótido (5), o seguinte oligonucleótido sintético
128 (133)
Ile Ile Ser Thr Leu Asp Pro Met Ile Thr Thr Tyr
CG ÀTC ATC TCT ACC CTG GAC CCG ATG ATC ACC ACC TAT
TAG TAG AGA TGG GAC CTG GGC TAC TAG TGG TGG ATA
(Taql)
1 2
Leu Glu Glu Leu Thr Ile Asp Asp Pro (Ala) (Pro)
CTA GAA GAG CTC ACG ATC GAC GAT CCG GC
GAT CTT CTC GAG TGC TAG CTG CTA GGC CGT GGG
(SfaNl) obtém-se o plasmideo pB31
Exemplo 3
Transformam-se células competentes da estirpe de E.coli W3110 com o plasmideo pB30 ou pB31. Dilui-se uma cul tura dessa estirpe, deixa-se em crescimento dum dia para o outro, com meio 1B (J.H.Miller. Experiments in Molec. Gen,, Cold Spring Harbor hab., 1972) contendo 50jug/ml de ampicílina numa proporção de 1:100 e segue-se o crescimento pela determinação , l da DO. A uma DO = 0,5 adiciona-se isopropil-tí-D-tiogalactopira nosido (IPTG) até uma concentração de 2 mM e,após 150 a 180 mi nutos, separam-se as bactérias por centrifugação. As bactérias são tratadas durante cerca de 5 minutos numa mistura tampão (ureia 7 M, SDS a 0,1%, fosfato de sódio O,1M a pH 7,0) e depositam-se amostras em placas de electroforese em gel de SDS.
Deste modo confirma-se a expressão da proteína bifuncional.
As condições referidas são válidas para culturas agitadas em agitadores orbitais·, em fermentações de maior volume é vantajoso alterar de modo adequado o valor da OD, os meios nutrientes e variar a concentração de IPTG Exemplo 4
Após indução, separam-se as células de E. coli W3110 que contém o plasmídeo pB3O ou pB31, ressuspendem-se em tampão de fosfato de sódio (pH 7) e separam-se novamente por centrifugação. As bactérias são retomadas no mesmo tampão f R j e em seguida são desintegradas (prensa francesa, moinho v 1 Dyno). Os resíduos celulares são separados por centrifugação. Analisam-se o sobrenadante e o sedimento por meio de electroforese em gel de SDS-poliacrilamida, conforme descrito no Exem pio 3. Após revelação das bandas proteicas, verifica-se que a proteína bifuncional se encontra no sedimento dos resíduos celulares. 0 sedimento é lavado várias vezes com tampão caótropo e por fim com água, aumentando deste modo a concentração da pro teína pretendida.
Em seguida determina-se a concentração de pro teína na suspensão proteica aquosa. Adiciona-se então cloridra to de guanidínio até uma concentração de 5 M e ditiotreitol (DTT) até 2 mM. Agita-se a mistura durante cerca de 30 minutos sob atmosfera de azoto e em seguida dilui-se com tampão de tris 50 mM (pH 8,5) até uma concentração de protéína de lOO^bg/ml. Em seguida purifica-se por diálise contra o mesmo tampão e, após duas mudanças de tampão, contra água. A proteína obtida desse modo é esterilizada por filtração e analisada para compra vação da respectiva actividade.
Verifica-se aue apresenta uma actividade biológica integral tanto por meio do ensaio de proliferação de células CTLI 2 dependente de interleuquina-2 como também no ensaio da medula humana. Neste ensaio observam-se colónias mistas de granulócitos e de macrófagos.
A proteína bifuncional pode ainda ser purifi• cada por meio de cromatografia de afinidade específica para interleuquina-2. A proteína é também, após purificação, activa em
ambos os ensaios. Em comparação extractos de E. coli da estirpe W3110 não transformada tratados do mesmo modo não apresentam qualquer actividade.
Para a preparação do produto em escala indus trial tomam-se vantajosas outras condições, por exemplo para o isolamento e purificação. Podem ser utilizados como métodos de purificação - conhecidos em si - permuta iónica, adsorção, filtração por gel e cromatografia HPLC preparativa.

Claims (1)

  1. - 1& Processo para a preparação de proteínas bifun cionais, constituídas por uma fracção de interleuquina-2 (IL-2) biologicamente activa e uma fracção de factor estimulador de colónias (Colony Stimulating) de granulócitos macrófagos (GM-CSF), em que as duas fracções proteínas biologicamente activas estão ligadas através de uma ponte de 1 a cerca de 20 ácidos aminados codificáveis geneticamente, caracterizado por se construir um gene que codifioue para as referidas proteínas e por se expressar este gene numa célula hospedeira.
    Processo de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por a ponte referida corresponder à fórmula
    - Asp - (As)x - Pro na qual x significa um número inteiro de 1 a 18 e As é ácido aminado codificável geneticamente com excepção de Cys.
    Processo de acordo com a reivindicação 2 caracterizado por o elo (As)x da ponte referida significar a sequência de ácidos aminados
    - Pro-Me t-IIe-Thr-Thr-Tyr-AIa-Asp-Asp ou
    - Pro-Me t-IIe-Thr-Thr-Tyr-Leu-Glu-Glu-Leu-Thr-II e-Asp-Asp-.
    - 9 - 4* Processo de acordo com uma ou várias das rei vindicações 2 a 4 caracterizado por a proteína preparada estar ordenada com a fracção de 11-2 situada na extremidade N-termi nal e a fracção de CM-CSF na extremidade C-terminal.
    _ 5a _
    Processo para a preparação de composições farmacêuticas caracterizado por se incorporar como ingrediente activo uma proteína quando preparada de acordo com as reivindicações anteriores.
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