FI98830C - Menetelmä bifunktionaalisten proteiinien valmistamiseksi - Google Patents

Menetelmä bifunktionaalisten proteiinien valmistamiseksi Download PDF

Info

Publication number
FI98830C
FI98830C FI881743A FI881743A FI98830C FI 98830 C FI98830 C FI 98830C FI 881743 A FI881743 A FI 881743A FI 881743 A FI881743 A FI 881743A FI 98830 C FI98830 C FI 98830C
Authority
FI
Finland
Prior art keywords
ile
thr
csf
asp pro
pro ala
Prior art date
Application number
FI881743A
Other languages
English (en)
Swedish (sv)
Other versions
FI98830B (fi
FI881743A (fi
FI881743A0 (fi
Inventor
Paul Habermann
Original Assignee
Hoechst Ag
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hoechst Ag filed Critical Hoechst Ag
Publication of FI881743A0 publication Critical patent/FI881743A0/fi
Publication of FI881743A publication Critical patent/FI881743A/fi
Publication of FI98830B publication Critical patent/FI98830B/fi
Application granted granted Critical
Publication of FI98830C publication Critical patent/FI98830C/fi

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/53—Colony-stimulating factor [CSF]
    • C07K14/535—Granulocyte CSF; Granulocyte-macrophage CSF
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C07K14/55—IL-2
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
    • C07K2319/74—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor
    • C07K2319/75—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor containing a fusion for activation of a cell surface receptor, e.g. thrombopoeitin, NPY and other peptide hormones

Description

98830
Menetelmä bifunktionaalisten proteiinien valmistamiseksi
Interleukiini-2, jota seuraavassa kutsutaan IL-2*. ksi, toimii T-solukasvutekijänä. IL-2 tehostaa tappa-5 jasolujen, kuten NK-solujen (luontaisten tappajasolujen), sytotoksisten T-solujen ja LAK-solujen (lymfokiinin aktivoimien tappajasolujen) aktiivisuutta.
Granulosyyttimakrofagi-"kolonioita stimuloiva" - tekijä, jota seuraavassa kutsutaan GM-CSF:ksi, puolestaan 10 stimuloi granulosyyttien ja makrofagien muodostumista verta muodostavista esisoluista. Kyseisten kahden biologisen aktiivisuuden yhdistäminen on kiinnostavaa hoidettaessa kasvaimia solun kasvua ehkäisevien aineiden avulla tai niitä ilmankin. IL-2 ja GM-CSF poikkeavat kuitenkin stabiilisuu-15 den osalta toisistaan, mikä saattaa aiheuttaa ongelmia an nettaessa suoraan kumpaakin kyseistä ainetta ja siten johtaa terapeuttisen tuloksen huononemiseen.
Keksinnön mukaan toisistaan poikkeavien stabiili-suuksien aiheuttama ongelma voidaan ratkaista yhdistämällä 20 kyseiset kaksi proteiinia yhdeksi bifunktionaaliseksi pro teiiniksi .
Valinnaisesti modifioidun GM-CSF:n valmistamiseksi geenitekniikan avulla on esitetty fuusioproteiineja, joiden yleinen kaava on ' 25
Met - X - Y - Z tai Met - Z - Y - X
(Ia) (Ib) \ joissa X on edullisesti ihmisperäisen IL-2:n oleellisesti 30 noin sadan ensimmäisen aminohappojäännöksen muodostama aminohapposekvenssi, Y merkitsee suoraa sidosta silloin, « kun halutun proteiinin viereiset aminohappojäännökset tai viereinen aminohapposekvenssi mahdollistavat halutun proteiinin lohkaisun ja merkitsee muulloin yhden tai useamman 35 geneettisesti koodautuvan aminohappojäännöksen muodostamaa 98830 2 kyseisen lohkaisun mahdollistavaa siltasekvenssiä ja Z on geneettisesti koodautuvista aminohappojäännöksistä koostuva sekvenssi, joka vastaa haluttua GM-CSF-proteiinia. Tällöin myös IL-2:ta koodaava DNAsekvenssi voidaan käyttää hyväksi 5 lähes kokonaisuudessaan ja saada täten, mahdollisesti modi fioituna, biologisesti aktiivista IL-2:ta "sivutuotteena" (julkaisematon EP-patenttihakemus nro EP-A 0 228 018 tai eteläafrikkalainen patentti nro 86/9557).
Vastoin kuin edeltävä ehdotus esillä oleva keksintö 10 ei perustu proteiinien käyttöön välituotteena, vaan kyseis ten fuusioproteiinien tai niitä sisältävien tai niistä koostuvien lääkeaineiden käyttöön menetelmässä ihmisruumiin terapeuttiseksi hoitamiseksi. Edelleen tässä kuvataan näiden fuusioproteiinien käyttöä pahanlaatuisten syöpäkasvain-15 ten hoitoon tarkoitetun lääkkeen valmistuksessa.
Tässä kuvattu fuusioproteiini koostuu siis kahdesta biologisesti aktiivisesta osasta ja edelleen toisaalta .IL-2-osasta, jota voidaan modifioida sinänsä tunnetulla tavalla ja toisaalta GM-CSF-osasta, jota myös voidaan modi-20 fioida ja joka voi vastata edellä annetussa kaavassa Y:lle määritellyn mukaista siltasekvenssiä. Kyseiset kaksi osaa ovat järjestäytyneet kaavan (Ia) mukaan. Keksinnön kohteena on siis menetelmä biologisesti aktiivisen inter-leukiini-2-{IL-2)-osan ja granulosyyttimakrofagi-"pesäkkei-25 tä stimuloiva"-tekijä-(GM-CSF)-osan sisältävien bifunktio- naalisten proteiinien valmistamiseksi kyseisten kahden biologisesti aktiivisen proteiiniosan kytkeytyessä toisiinsa sillan välityksellä, jolla on kaava 30 IL-2 (1-126) Ser Ile Ile Ser Thr Leu Asp Pro Met Ile
Thr Thr Tyr Ala Asp Asp Pro Ala Pro Ala GM-CSF (4-127) tai 11-2 (1-126) Ser Ile Ile Ser Thr Leu Asp Pro Met Ile Thr Thr Tyr Leu Glu Glu Leu Thr Ile Asp Asp Pro Ala 35 Pro Ala GM-CSF (4-127),
II
98830 3
Oheinen kuva esittää keksinnön mukaisesti valmistettua bifuntionaalista proteiinia koodaavan plasmidin pB3 0 rakennetta.
Tunnetaan IL-2-molekyylimodifikaatioita, joista täs-5 sä yhteydessä riittää viittaus esimerkiksi EP-patenttihake- muksiin EP-A nrot 0 091 539, 0 109 748, 0 118 617, 0 136 489 ja 0 163 249.
Edelleen julkaisemattomassa patenttihakemuksessa EP-A nro 0 219 839 tuotiin esiin IL-2-johdannainen, jonka 10 N-päädystä seitsemän ensimmäistä aminohappojäännöstä ovat deletoituneet.
Patenttihakemuksessa EP-A nro 0 228 018 esitettiin GM-CSF-molekyylin modifikaatioita.
Kumpaakin aktiivista molekyylin osaa voidaan modifi-15 oida edelleen sinänsä tunnetulla tavalla, joista tässä yh teydessä mainitaan esimerkkinä ainoastaan paikkaohjautuva mutageneesi.
Keksinnön mukaisten bifunktionaalisten proteiinien ilmaisu voi tapahtua sinänsä tunnetulla tavalla.
20 Keksinnön mukaiselle menetelmälle on tunnusomaista, että rakennetaan kyseisiä proteiineja koodaava geeni ja ilmaistaan se bakteereissa.
Bakteeri-ilmaisujärjestelmien kyseessä ollen voidaan valita suorailmaisu. Käytettäviksi soveltuvat kaikki tun-25 netut bakteeri-isäntävektorijärjestelmät, joissa isäntäbak- teeri on esimerkiksi Streptomyces, B. subtilis, Salmonella typhimurium tai Serratia marcescens tai erityisesti E. co-li .
Haluttua proteiinia koodaava DNA-sekvenssi rakenne-30 taan sinänsä tunnetulla tavalla vektoriin, joka valitussa ilmaisujärjestelmässä sallii korkean tason ilmaisun.
Tällöin promoottori ja operaattori valitaan tarkoituksen mukaisesti ryhmästä trp, lac, tae, PL tai PR λ-fagis-ta, hsp ja omp tai valitaan synteettinen promoottori, kuten 35 kuvataan esimerkiksi DE-hakemusjulkaisussa nro 3 430 683 98830 4 tai EP-A-hakemusjulkaisussa nro 0 173 149. Edullisesti käytetään tac-promoottorioperaattorisekvensiä, jota niinikään on kaupallisesti saatavana (esim. ilmaisujärjestelmä pKK223-3, Pharmacia, "Molecular Biologicals, Chemicals and 5 Equipment for Molecular Biology", 1984, s. 63).
Ilmaistaessa mainittuja proteiineja, voi niinikään osoittautua tarkoituksenmukaiseksi muuttaa yksittäisiä ATG-aloituskodonin jälkeisiä ensimmäisten aminohappojäännösten triplettikodoneja mahdollisen mRNA:n tasolla tapah-10 tuvan emäsparien muodostuksen estämiseksi. Kyseiset muutok set, kuten yksittäisten aminohappojäännösten poistaminen tai lisääminen, ovat alan ammattilaiselle tuttuja ja ne kuuluvat samoin kyseisen keksinnön piiriin.
Keksinnön mukaisesti valmistettuja bifunktionaalis-15 ten proteiinien antaminen vastaa kummankin proteiiniosan antamista erikseen. Paremman stabiilisuuden ansiosta on kuitenkin useissa tapauksissa mahdollista käyttää alhaisempaa annostusta kuin mitä alallamme tähän asti esitetty annostus käsittää.
20 Seuraavissa esimerkeissä kuvataan keksintöä yksi tyiskohtaisemmin. Prosenttiluvut ja -osuudet on laskettu painosta ellei toisin ole mainittu.
Esimerkki 1
Plasmidi pl59/6 (EP-A2 0 163 249, kuvio 5; tässä 25 esitetyssä kuviossa (1)) sisältää EcoRI- ja Sall-pilkko- miskohtien välissä synteettisen IL-2:ta koodaavan geenin.
Tämän geenin DNA-sekvenssiin viitataan mainitussa EP-A2:ssa"DNA-sekvenssinä I". Triplettikodonien 127 ja 128 alueella sijaitsee TaqI-pilkkomiskohta. Tästä plasmidista 30 lohkaistaan EcoRI:n ja Taql:n avulla pilkkomalla IL-2:n osasekvenssi (2) ja eristetään se.
GM-CSF:ää koodaava plasmidi pHG23 (3) on tuttu EP-A2 nrosta 0 183 350. Kyseisen EP-A2:n kuviossa 2 on esitetty GM-CSF-cDNA. Plasmidi pHG23 saadaan lisäämällä kyseinen 35 cDNA-sekvenssi plasmidin pBR322 Pstl-kohtaan, jolloin käy- i li 98830 5 tetään hyväksi toisaalta Pstl-kohtaa 5'-päädyssä ja toisaalta GC-"tailing"-menettelyllä insertoitua Pstl-kohtaa 3'-päädyssä. Tästä plasmidista ristetään SfaNI:llä ja Pstl-.llä pilkkomalla DNA-sekvenssi (4), joka sisältää suu-5 rimman osan GM-CSF-geenistä.
Syntetisoidaan fosfiittimenetelmällä seuraava oli-gonukleotidi (5): 128 (133)
Ile Ile Ser Thr Leu Asp Pro Met Ile
10 CG ATC ATC TCT ACC CTG GAC CCG ATG ATC
TAG TAG AGA TGG GAC CTG GGC TAC TAG
(Taql) (5) 1 2
Thr Thr Tyr Ala Asp Asp Pro (Ala) (Pro)
15 ACC ACC TAT GC G GAC GAT CCG GC
TGG TGG ATA CGC CTG CTA GGC CGT GGG
(SfaNI)
Oligonukleotidi (5) täydentää 5'-päädyssä IL-2:n DNA-sek-20 venssiä, jolloin kuitenkin asemassa 133 sijaitsee Thr-jään- nöksen asemesta jäännös Asp. Tämän oligonukleotidin 3 ’-päädyssä sijaitsevat nukleotidit, jotka ovat lohjenneet pois cDNA:sta Sfai-pilkkomisen tuloksena.
Ilmaisuplasmidin pEWlOOO (6) valmistus on esitetty 25 (julkaisemattomassa) EP-A-hakemusjulkaisussa nro 0 227 938 (kuvio 1). Tämä plasmidi on plasmidin ptac 11 johdannainen (Amann et ai., Gene 25 (1983) 167 - 178), jossa EcoRI-tun-nuskohtaan on rakennettu Sali-kohdan sisältävä synteettinen sekvenssi. Näin saadaan ilmaisuplasmidi pKK 177.3. Inser-30 toimalla lac-repressori (Farabaugh, Nature 274 (1978) 765 - 769) saadaan plasmidi pJF118. Tämä katkaistaan yksittäisen Aval-restriktiokeskuksen kohdalta ja lyhennetään sinänsä tunnetulla tavalla eksonukleaasikäsittelyn avulla noin 1 000 bp:n verran sekä ligatoidaan. Saadaan plasmidi 35 pEWlOOO (6). Katkaisemalla tämä plasmidi polyliittäjä- 98830 6 alueelta EcoRI- ja PstI-entsyymien avulla saadaan li-nearisoitu ilmaisuplasmidi (7).
Tämä linearisoitu plasmidi-DNA (7) ligatoidaan sitten IL-2-sekvenssiä koodaavaan DNA-fragmenttiin (2), syn-5 tettiseen oligonukleotidiin (5) ja cDNA-fragmenttiin (4) .
Muodostuu plasmidi pB30 (8), jolla transformoidaan E. coli Mcl061-kantaa. Eristetään yksittäisistä klooneista plasmidi-DNA, jota luonnehditaan restriktioanalyysin avulla.
Esimerkki 2 10 Jos esimerkissä 1 käytetään oligonukleotidin (5) asemesta seuraavaa synteettistä oligonukleotidia 128 (133)
Ile Ile Ser Thr Leu Asp Pro Met Ile Thr Thr Tyr
15 CG ATC ATC TCT ACC CTG GAC CCG ATG ATC ACC ACC TAT
TAG TAG AGA TGG GAC CTG GGC TAC TAG TGG TGG ATA
(Taql) 1 2
Leu Glu Glu Leu Thr Ile Asp Asp Pro (Ala) (Pro)
2o CTA GAA GAG CTC ACG ATC GAC GAT CCG GC
GAT CTT CTC GAG TGC TAG CTG CTA GGC CGT GGG
(SfaNI) saadaan plasmidi pB31.
.. 25 Esimerkki 3
Transformoidaan transformoitumiskelpoisia E. coli W3310-kannan soluja plasmidilla pB30 tai pB31. Laimennetaan kannan yön yli kasvanutta viljelmää 50 /zg/ml ampisilliiniä sisältävällä LB-kasvualustalla (J.H. Miller, Experiments in 30 Molec. Gen., Cold Spring Harbor Lab., 1972) suhteessa noin 1:100 ja seurataan kasvua optisen tiheyden (OD)-mittauksilla. Optisen tiheyden arvolla OD = 0,5 säädetään viljelmä 2 millimolaariseksi isopropyyli-β-D-tiogalaktopyranosidin (IPTG:n) suhteen ja otetaan sitten bakteerisolut 150 - 180 35 minuutin kuluttua sentrifugoimalla talteen. Bakteerisoluja 98830 7 käsitellään noin viiden minuutin ajan puskuriseoksella (7M urea, 0,1 % SDS, O,IM natriumfosfaatti, pH 7,0) ja asetetaan sitten näytteet SDS-geelielektroforeesilevyille. Näin varmistutaan bifunktionaalisen proteiinin ilmaisusta.
5 Annetut olosuhteet sopivat ravistelukasvatuksiin; suuremmissa fermentoinneissa on tarkoituksenmukaista käyttää sopivasti muutettua OD-arvoa, kasvualustaa ja IPTG-pi-toisuutta.
Esimerkki 4 10 Indusoinnin jälkeen otetaan plasmidin pB30 tai pB3l sisältävät E. coli W3110-solut sentrifugoimalla talteen, uudelleensuspendoidaan ne natriumfosfaattipuskuriin (pH 7) ja sentrifugoidaan toistamiseen. Bakteerisolut suspendoi-daan samaan puskuriin ja rikotaan (ranskalainen painekenno, 15 RDyno-Miihle) . Solulysaattisentrifugoidaan. Supernatantti ja sakka analysoidaan SDS-polykryyliamidielektroforeesin avulla, kuten on kuvattu simerkissä 3. Proteiininauhojen värjäys osoittaa bifunktionaalisen proteiinin löytyvän lysaat-tisakasta. Sakka pestään useaan kertaan kaotrooppisella 20 puskurilla ja lopuksi vedellä, jolloin haluttu proteiini rikastuu sakassa edelleen. Sitten vesipohjaisesta pro-teiinisuspensiosta suoritetaan proteiinipitoisuuden määritys. Suspensio tehdään 5 molaariseksi guanidiniumhydroklo-ridin suhteen ja 2 millimolaariseksi ditiotreitolin (DTT) 25 suhteen. Seosta sekoitetaan noin 30 minuutin ajan typpi-il- makehässä ja laimennetaan sitten 50 mM Tris-puskurilla (pH 8,5) siten, että proteiinipitoisuudeksi saadaan 100 μg/ml. Seuraavaksi dialysoidaan samaa Tris-puskuria vastaan ja kahden puskurierän vaihdon jälkeen vettä vastaan. Näin kä-30 sitelty proteiini suodatetaan steriilisti ja varmistutaan sen biologisesta aktiivisuudesta. Se osoittautuu sekä in-terleukiini-2-avusteisessa CTLL-2-solulisääntymiskokeessa että humaaniluuydinkokeessa biologisesti täysin aktiiviseksi. Kokeessa tarkkailtiin granulosyyteistä ja makrof ageista 35 koostuvia sekapopulaatioita.
8 98830
Bifunktionaalista proteiinia voidaan jatkopuhdis-taa interleukiini-2:lie spesifisen affiniteettikromatogra-fia-ajan avulla. Proteiini on myös silloin aktiivinen kummankin kokeen mukaan. Sitä vastoin transformoimattomasta 5 W3110-kannasta saatu E. coli -uute, jota käsiteltiin, kuten edellä on kuvattu, ei omannut lainkaan aktiivisuutta.
Tuotteen valmistus teollisessa mittakaavassa on tarkoituksenmukaista suorittaa käyttäen muita menetelmiä esimerkiksi proteiinin saostuksessa ja sen puhdistuksessa.
10 Sinänsä tunnetuista puhdistusmenettelyistä tulevat kysee seen ioninvaihto- ja adsorptiokromatografia, geelisuodatus sekä preparatiivinen HPLC-kromatografia.
Il

Claims (3)

  1. 98830 Patenttivaatimus Menetelmä biologisesti aktiivisen interleukiini-2-(IL-2)-osan ja granulosyyttimakrofagi-"pesäkkeitä stimu-5 loiva"-tekijä- (GM-CSF) -osan sisältävien bifunktionaalisten proteiinien valmistamiseksi kyseisten kahden biologisesti aktiivisen proteiiniosan kytkeytyessä toisiinsa sillan välityksellä, jolla on kaava
  2. 10 IL-2 (1-126) Ser Ile Ile Ser Thr Leu Asp Pro Met Ile Thr Thr Tyr Ala Asp Asp Pro Ala Pro Ala GM-CSF (4-127) tai 11-2 (1-126) Ser Ile Ile Ser Thr Leu Asp Pro Met Ile Thr Thr Tyr Leu Glu Glu Leu Thr Ile Asp Asp Pro Ala 15 Pro Ala GM-CSF (4-127), tunnettu siitä, että rakennetaan kyseisiä proteiineja koodaava geeni ja ilmaistaan se bakteereissa. 98830 Förfarande för framställning av bifunktionella pro-teiner som innehäller en biologiskt aktiv interleukin-2 5 (IL-2-)-del och granulocyt-makrofag-"kolonistimulerande" - faktor (GM-CSF)-del, varvid ifrägavarande tvä biologiskt aktiva proteindelar är kopplade tili varandra via en brygga med formeln
  3. 10 IL-2 (1-126) Ser Ile Ile Ser Thr Leu Asp Pro Met Ile Thr Thr Tyr Ala Asp Asp Pro Ala Pro Ala GM-CSF (4-127) eller 11-2 (1-126) Ser Ile Ile Ser Thr Leu Asp Pro Met Ile Thr Thr Tyr Leu Glu Glu Leu Thr Ile Asp Asp Pro Ala 15 Pro Ala GM-CSF (4-127), kännetecknat därav, att man konstruerar en gen som kodar ifrägavarande proteiner och uttrycker den i bak-terier.
FI881743A 1987-04-16 1988-04-14 Menetelmä bifunktionaalisten proteiinien valmistamiseksi FI98830C (fi)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE19873712985 DE3712985A1 (de) 1987-04-16 1987-04-16 Bifunktionelle proteine
DE3712985 1987-04-16

Publications (4)

Publication Number Publication Date
FI881743A0 FI881743A0 (fi) 1988-04-14
FI881743A FI881743A (fi) 1988-10-17
FI98830B FI98830B (fi) 1997-05-15
FI98830C true FI98830C (fi) 1997-08-25

Family

ID=6325799

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FI881743A FI98830C (fi) 1987-04-16 1988-04-14 Menetelmä bifunktionaalisten proteiinien valmistamiseksi

Country Status (20)

Country Link
EP (1) EP0288809B1 (fi)
JP (1) JP2667193B2 (fi)
KR (1) KR970000187B1 (fi)
AR (1) AR242991A1 (fi)
AT (1) ATE79135T1 (fi)
AU (1) AU613022B2 (fi)
CA (1) CA1322157C (fi)
DE (2) DE3712985A1 (fi)
DK (1) DK170741B1 (fi)
ES (1) ES2033981T3 (fi)
FI (1) FI98830C (fi)
GR (1) GR3006141T3 (fi)
HU (1) HU204303B (fi)
IE (1) IE61574B1 (fi)
IL (1) IL86086A (fi)
NO (1) NO176922C (fi)
NZ (1) NZ224247A (fi)
PH (1) PH25327A (fi)
PT (1) PT87237B (fi)
ZA (1) ZA882659B (fi)

Families Citing this family (24)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5662896A (en) * 1988-03-21 1997-09-02 Chiron Viagene, Inc. Compositions and methods for cancer immunotherapy
US5225538A (en) * 1989-02-23 1993-07-06 Genentech, Inc. Lymphocyte homing receptor/immunoglobulin fusion proteins
US5116964A (en) * 1989-02-23 1992-05-26 Genentech, Inc. Hybrid immunoglobulins
US6406697B1 (en) 1989-02-23 2002-06-18 Genentech, Inc. Hybrid immunoglobulins
AU5355790A (en) * 1989-04-19 1990-11-16 Cetus Corporation Multifunctional m-csf proteins and genes encoding therefor
US5108910A (en) * 1989-08-22 1992-04-28 Immunex Corporation DNA sequences encoding fusion proteins comprising GM-CSF and IL-3
US5073627A (en) * 1989-08-22 1991-12-17 Immunex Corporation Fusion proteins comprising GM-CSF and IL-3
ATE103932T1 (de) * 1989-08-22 1994-04-15 Immunex Corp Fusionsprotein bestehend aus gm-csf und il-3.
US5376367A (en) * 1991-11-22 1994-12-27 Immunex Corporation Fusion proteins comprising MGF and IL-3
US5723125A (en) * 1995-12-28 1998-03-03 Tanox Biosystems, Inc. Hybrid with interferon-alpha and an immunoglobulin Fc linked through a non-immunogenic peptide
WO1999029732A2 (en) 1997-12-08 1999-06-17 Lexigen Pharmaceuticals Corporation Heterodimeric fusion proteins useful for targeted immune therapy and general immune stimulation
SK782002A3 (en) 1999-07-21 2003-08-05 Lexigen Pharm Corp FC fusion proteins for enhancing the immunogenicity of protein and peptide antigens
MXPA02001417A (es) 1999-08-09 2002-08-12 Lexigen Pharm Corp Complejos multiples de citosina-anticuerpo.
AU1551801A (en) * 1999-11-30 2001-06-12 Shionogi & Co., Ltd. Chemokine slc-il2 fused protein and gene thereof
EP1252192B1 (en) 2000-02-11 2006-08-16 MERCK PATENT GmbH Enhancing the circulating half-life of antibody-based fusion proteins
DK1366067T3 (da) 2001-03-07 2012-10-22 Merck Patent Gmbh Ekspressionsteknologi for proteiner indeholdende en hybrid isotype-antistof-enhed
US6992174B2 (en) 2001-03-30 2006-01-31 Emd Lexigen Research Center Corp. Reducing the immunogenicity of fusion proteins
BR0209177A (pt) 2001-05-03 2004-10-05 Merck Patent Gmbh Anticorpo especìfico a tumor recombinante e uso do mesmo
EP2292271A3 (en) 2001-10-10 2011-09-14 BioGeneriX AG Remodelling and glycoconjugation of an antibody
PT1454138E (pt) 2001-12-04 2012-03-28 Merck Patent Gmbh Imunocitoquinas com seletividade modulada
CA2510180C (en) 2002-12-17 2012-09-11 Merck Patent Gesellschaft Mit Beschraenkter Haftung Humanized antibody (h14.18) of the mouse 14.18 antibody binding to gd2 and its fusion with il-2
ES2359473T3 (es) * 2003-07-21 2011-05-23 Transgene S.A. Citoquinas multifuncionales.
DE602004031341D1 (de) 2003-07-21 2011-03-24 Transgene Sa Multifunktionelle cytokine
WO2010001414A1 (en) * 2008-07-03 2010-01-07 Lupin Limited Expression of heterologous proteins in bacterial system using a gm-csf fusion tag

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1985000817A1 (en) * 1983-08-10 1985-02-28 Amgen Microbial expression of interleukin ii
GB8327880D0 (en) * 1983-10-18 1983-11-16 Ajinomoto Kk Saccharomyces cerevisiae
EP0158198A1 (en) * 1984-03-29 1985-10-16 Takeda Chemical Industries, Ltd. DNA and use thereof
WO1985004673A1 (en) * 1984-04-10 1985-10-24 Takeda Chemical Industries, Ltd. Novel dna and its use
DE3419995A1 (de) * 1984-05-29 1985-12-05 Hoechst Ag, 6230 Frankfurt Gentechnologisches verfahren zur herstellung von human-interleukin-2 und mittel zur durchfuehrung dieses verfahrens
AU588819B2 (en) * 1984-10-29 1989-09-28 Immunex Corporation Cloning of human granulocyte-macrophage colony stimulating factor gene
JPS61128889A (ja) * 1984-11-27 1986-06-16 Green Cross Corp:The 組換えｄｎａ及び該ｄｎａによる形質転換体
JPH0646957B2 (ja) * 1985-03-11 1994-06-22 武田薬品工業株式会社 インタ−ロイキン−２の製造方法
JPS63502795A (ja) * 1985-10-03 1988-10-20 バイオジェン インコーポレイテッド 顆粒球‐マクロファージコロニー刺激因子‐様ポリペプチド、ｄｎａ配列、組換えｄｎａ分子並びに微生物細胞中でヒト顆粒球−マクロファ−ジコロニ−刺激因子−様ポリペプチドを高収量で生産する方法
DE3541856A1 (de) * 1985-11-27 1987-06-04 Hoechst Ag Eukaryotische fusionsproteine, ihre herstellung und verwendung sowie mittel zur durchfuehrung des verfahrens
DE3545568A1 (de) * 1985-12-21 1987-07-16 Hoechst Ag Gm-csf-protein, seine derivate, herstellung solcher proteine und ihre verwendung

Also Published As

Publication number Publication date
FI98830B (fi) 1997-05-15
EP0288809A1 (de) 1988-11-02
ZA882659B (en) 1988-10-14
PT87237B (pt) 1992-07-31
KR970000187B1 (ko) 1997-01-06
EP0288809B1 (de) 1992-08-05
DE3873397D1 (de) 1992-09-10
DE3712985A1 (de) 1988-11-03
NO176922B (no) 1995-03-13
FI881743A (fi) 1988-10-17
FI881743A0 (fi) 1988-04-14
GR3006141T3 (fi) 1993-06-21
HUT47319A (en) 1989-02-28
JP2667193B2 (ja) 1997-10-27
DK170741B1 (da) 1996-01-08
NO881658D0 (no) 1988-04-15
CA1322157C (en) 1993-09-14
AU1466188A (en) 1988-10-20
IE61574B1 (en) 1994-11-16
AR242991A1 (es) 1993-06-30
DK209188A (da) 1988-10-17
NO881658L (no) 1988-10-17
PT87237A (pt) 1988-05-01
NZ224247A (en) 1990-04-26
DK209188D0 (da) 1988-04-15
NO176922C (no) 1995-06-21
HU204303B (en) 1991-12-30
ES2033981T3 (es) 1993-04-01
KR880012760A (ko) 1988-11-29
IL86086A (en) 1995-01-24
IE881146L (en) 1988-10-16
PH25327A (en) 1991-04-30
AU613022B2 (en) 1991-07-25
IL86086A0 (en) 1988-09-30
JPS63301898A (ja) 1988-12-08
ATE79135T1 (de) 1992-08-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
FI98830C (fi) Menetelmä bifunktionaalisten proteiinien valmistamiseksi
US5359035A (en) Bifunctional proteins including interleukin-2 (IL-2) and granuloctyte macrophage colony stimulating factor (GM-CSF)
EP0077670B1 (en) Human immune interferon
EP0211148B1 (en) Mature human leukozyte interferons, process for their bacterial production, intermediates therefor and compositions containing them
AU651152B2 (en) Multidomain hematopoiesis stimulators
KR940000757B1 (ko) 과립구 자극인자(g-csf)의 돌연변이체
WO1987002060A1 (en) Human granulocyte-macrophage colony stimulating factor-like polypeptides and processes for producing them in high yields in microbial cells
JP2967557B2 (ja) ヒトマンガンスーパーオキシドジスムターゼｃＤＮＡ、その細菌中での発現及び酵素活性ヒトマンガンスーパーオキシドジスムターゼの回収方法
EP0256424B1 (en) Homogeneous recombinant immune interferon fragments and pharmaceutical compositions containing same
HU205617B (en) Process for producing neturophyl-activating factor, gene coding this and pharmaceutical composition
EP0594311B1 (en) Process for preparing a metastasis-inhibiting protein and uses thereof.
KR20040020816A (ko) 당쇄화된 인간 과립구 형성인자 동종체
FI94867B (fi) Menetelmä granulosyytti-makrofaagi-pesäkkeitä stimuloivan tekijän puhdistamiseksi
SU1607690A3 (ru) Способ стабилизации рекомбинантного фактора некроза опухоли
JPH02138224A (ja) 血小板減少症治療剤
EP0353516B1 (en) A method for the preparation of recombinant human beta interleukin-1 in the homogeneous form
JP2589094B2 (ja) 抗悪性腫瘍剤
RU2091488C1 (ru) Рекомбинатная плазмидная днк р 280 gm, кодирующая полипептид со свойствами гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора человека. штамм escherichia coli sg20050/р 280 gm - продуцент полипептида со свойствами гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора человека
JP2697725B2 (ja) 悪性腫瘍治療用キット
KR960003376B1 (ko) 혈소판 감소증 치료 약제
JPH08188597A (ja) 変異型ヒト腫瘍壊死因子
JPS63188396A (ja) 新規生理活性ポリペプチド
JPS63313586A (ja) ＴＧＦ−α
JPH0482900A (ja) 新規ｍ―ｃｓｆ及びその製造方法

Legal Events

Date Code Title Description
FG Patent granted

Owner name: HOECHST AKTIENGESELLSCHAFT

BB Publication of examined application
MM Patent lapsed

Owner name: HOECHST AKTIENGESELLSCHAFT