CN112210019A - 一种含单跨膜区的膜蛋白其跨膜区的纯化方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种含单跨膜区的膜蛋白其跨膜区的纯化方。它是在含单跨膜区的膜蛋白的N或C端加入多聚组氨酸标签，然后将此含组氨酸标签的含单跨膜区的膜蛋白的编码基因转入到表达质粒中，再将表达质粒转入表达菌中，培养表达菌并诱导含单跨膜区的膜蛋白的表达，将表达菌破碎，并用含尿素和变性剂的缓冲液将含单跨膜区的膜蛋白溶解，在有尿素的情况下利用组氨酸标签对单跨膜区的膜蛋白进行纯化，并同时用再折叠剂使单跨膜区的膜蛋白再折叠并去除尿素，获得折叠的单跨膜区的膜蛋白。采用直接加入尿素法溶解目标蛋白，不需要收集细胞包涵体，既节约时间，也提高目标蛋白的产量。

Description

一种含单跨膜区的膜蛋白其跨膜区的纯化方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种含单跨膜区的膜蛋白其跨膜区的纯化方法。
背景技术：
膜蛋白指的是位于细胞膜上的一类蛋白质，在信号传导过程中起重要作用。根据膜蛋白跨膜区的二级结构不同，膜蛋白的跨膜区分为α螺旋和β折叠的结构。而含有α螺旋的膜蛋白常含有一个或多个由α-螺旋组成的跨膜区。在这类蛋白中具有一个α螺旋组成的单个跨膜区的膜蛋白，此单个跨膜区对蛋白的功能起着非常重要的作用。跨膜区在一定条件下可形成多聚体，从而实现信号的跨膜传导。跨膜区中一些氨基酸的突变，可引起蛋白质功能的变化，从而引起一定的疾病。而有的跨膜区还可与其它的膜蛋白发生相互作用，以形成有酶活性的复合物，会对生物体行使其相应的功能起着重要作用。因此，研究跨膜区的结构对了解膜蛋白的功能有重要的意义。
在体外研究蛋白的结构与功能，需要对目标蛋白进行纯化，而由于膜蛋白的跨膜区位于细胞膜中，其组成的氨基酸多为疏水性的，在体外不含有变性剂的条件下，这类蛋白质是不可溶的，因此，这类蛋白的纯化需要膜系统的存在。单跨膜区的结构相对简单，其α螺旋结构不易受到膜系统的影响。因而，可采用变性法纯化并联合体外重新折叠的方法以获得折叠的纯化蛋白质，应用于结构和功能的研究中。另外，利用大肠杆菌纯化蛋白质是一种快速有效的方法获得大量的目标蛋白，并通过构建重组蛋白质的方法在目标蛋白的N或C端加入多聚组氨酸标签，便于利用亲合层析的方法对目标蛋白进行快速纯化。这类传统的纯化方法首先需要将目标蛋白表达至大肠杆菌的包涵体中，然后通过分离包涵体，再将所分离的包涵体进行溶解并纯化目标蛋白的方法。但是此方法并不适用于所有的蛋白，例如有些膜蛋白的跨膜区经表达后，仍然具有可溶性，不易被表达在包涵体中，致使目标蛋白的产量极低。
发明内容：
本发明的目的在于提供一种含单跨膜区的膜蛋白其跨膜区的纯化方法，其是一种全新的纯化方法和全新的纯化过程，用于纯化含有单个跨膜区的膜蛋白的跨膜区。
本发明通过重组蛋白的方法，在目标蛋白N或C端加入多聚组氨酸标签，并在表达菌，例如大肠杆菌中表达。细胞经破碎后，不需要经过包涵体纯化，而是直接加入所设计的缓冲液(含有6M尿素和2％变性剂)的方法将目标蛋白溶解，然后在有尿素存在的条件下对重组蛋白进行纯化，并在Ni-NTA纯化介质上通过采用去尿素和变性剂置换的方法将目标蛋白进行再折叠，从而得到折叠的蛋白以用于结构和功能的研究。
本发明的含单跨膜区的膜蛋白其跨膜区的纯化方法，其包括以下步骤：在含单跨膜区的膜蛋白的N或C端加入多聚组氨酸标签，然后将此含组氨酸标签的含单跨膜区的膜蛋白的编码基因转入到表达质粒中，再将表达质粒转入表达菌中，培养表达菌并诱导含单跨膜区的膜蛋白的表达，将表达菌破碎，并用含尿素和变性剂的缓冲液将含单跨膜区的膜蛋白溶解，在有尿素的情况下利用组氨酸标签对单跨膜区的膜蛋白进行纯化，并同时用再折叠剂使单跨膜区的膜蛋白再折叠并去除尿素，获得折叠的单跨膜区的膜蛋白。
优选，去除尿素后的折叠的单跨膜区的膜蛋白再利用分子筛层析法将蛋白进一步纯化并去除蛋白缓冲液中的咪唑。进一步优选，是将去除尿素后的折叠的单跨膜区的膜蛋白上样分子筛层析柱，然后用洗脱缓冲液洗脱，所述的洗脱缓冲液是20mM磷酸钠、100mM氯化钠、质量分数0.2％十二烷基磺酸钠，pH6.5。
优选，所述的表达菌是大肠杆菌。
优选，所述的含尿素和变性剂的缓冲液，其尿素浓度为6M，变性剂为十二烷基磺酸钠，浓度为质量分数2％，所述的在有尿素的情况下利用组氨酸标签对单跨膜区的膜蛋白进行纯化，其尿素浓度为6M。
优选，在含单跨膜区的膜蛋白的N或C端加入多聚组氨酸标签，然后将此含组氨酸标签的含单跨膜区的膜蛋白的编码基因转入到表达质粒中，再将表达质粒转入大肠杆菌中，培养大肠杆菌并诱导含单跨膜区的膜蛋白的表达，收集大肠杆菌，悬浮于缓冲液1中，冰浴下用超声波破碎，然后加入尿素至6M，直至蛋白溶解，细胞破碎液离心，收集上清液，所述的缓冲液1为：20mM磷酸钠，500mM氯化钠和质量分数2％十二烷基磺酸钠，pH7.8；
取平衡后的Ni-NTA纯化介质与上清液混合吸附，装柱，待液体流出后，用缓冲液2清洗纯化介质，然后再用折叠缓冲液3冲洗，去除尿素并使蛋白折叠，最后利用洗脱液洗脱将含单跨膜区的膜蛋白与纯化介质分离；
所述的缓冲液2为20mM磷酸钠,100mM氯化钠，6M尿素，质量分数0.2％十二烷基磺酸钠和10mM咪唑，pH7.8；
所述的折叠缓冲液3为20mM磷酸钠,100mM氯化钠和质量分数0.2％十二烷基磺酸钠，pH6.5；
所述的洗脱缓冲液为20mM磷酸钠,100mM氯化钠和质量分数0.2％十二烷基磺酸钠， pH6.5。
所述的再用折叠缓冲液3冲洗，去除尿素并使蛋白折叠可以为用折叠缓冲液3冲洗，去除尿素，然后转换变性剂，用折叠缓冲液4冲洗，所述的折叠缓冲液4为20mM磷酸钠,100 mM氯化钠和质量分数0.2％十二烷基磷酰胆碱，pH6.5。纯化的含单跨膜区的膜蛋白可以被纯化至不同的膜系统中，如DPC可以是用于膜蛋白折叠的膜系统。
与现有的技术相比，本发明具有以下有效效果：
1、采用直接加入尿素法溶解目标蛋白，不需要收集细胞包涵体，既节约时间，也提高目标蛋白的产量。
2、提供了用于膜蛋白纯化的多种缓冲液系统和纯化方法，可以快速有效地将目标蛋白纯化至不同的膜系统中。
3、本方法能够快速获得高纯度的溶于不同膜系统中的膜蛋白，以便应用于其结构和功能的研究。
附图说明：
图1是目标蛋白(红细胞生成素跨膜区)纯化于十二烷基磺酸钠的SDS-PAGE电泳分析图。 M，分子量标准。1，细胞破碎液；2，含有重组蛋白的上清液；3，与层析胶结合后的上清液 (流出液)；4，从Ni-NTA中洗脱的纯化的红细胞生成素跨膜区；5，经分子筛层析纯化的样品(红细胞生成素跨膜区)。
具体实施方式：
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
本实施例中，各缓冲液的配制方法是将各组分按其含量混合均匀，溶剂为水，灭菌备用。
实施例1，红细胞生成素跨膜区纯化至十二烷基磺酸钠中。
一种红细胞生成素跨膜区的纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：
1.目标蛋白的诱导：将编码人类红细胞生成素的跨膜区基因克隆至大肠杆菌表达载体pET29b上，所产生的质粒能够编码一个在C端含有6个组氨酸标签的重组蛋白。质粒转化入大肠杆菌(BL21DE3)中，在含有30μg/ml的卡那霉素的LB平板上培养，挑取单菌落接种于4毫升的含30μg/ml的卡那霉素LB液体培养基中，37℃摇床上过夜培养后，转至1升含 30μg/ml的卡那霉素LB液体培养基中培养，当在600nm处的吸光度达到1.0时，加入IPTG 至1mM诱导重组蛋白的表达，菌体细胞继续在37℃摇床上培养12小时后，离心收集菌体。
2.目标蛋白的溶解：每4g菌体细胞悬浮于40ml缓冲液1中(20mM磷酸钠，pH7.8,500mM氯化钠和质量分数2％十二烷基磺酸钠)中，置于冰浴中用超声波破碎仪破碎15min，然后加入尿素至6M。于25摄氏度放置2小时使所有蛋白溶解，得细胞破碎液(图1中的泳道1)。将细胞破碎液于16000×g以及20摄氏度条件下离心后，收集上清液(图1中的泳道 2)备用。取2毫升Ni-NTA纯化介质，先用10毫升缓冲液(20mM磷酸钠，pH7.8,500mM 氯化钠)平衡后，将纯化介质与含有重组蛋白的上清液混合，并置于180rpm摇床上2小时，再将纯化介质转移至层析柱中，通过重力作用让液体自然流出，自然流出的上清液进行电泳分析，图1中的泳道3。
3.目标蛋白亲合层析准备：利用50毫升缓冲液2(20mM磷酸钠，pH7.8,100mM氯化钠，6M尿素，质量分数0.2％十二烷基磺酸钠和10mM咪唑)清洗纯化介质。
4.目标蛋白的折叠与洗脱：利用50毫缓冲液3(20mM磷酸钠，pH6.5,100mM氯化钠和质量分数0.2％十二烷基磺酸钠)去除尿素并使目标蛋白在十二烷基磺酸钠中折叠。最后利用洗脱液(20mM磷酸钠，pH6.5,100mM氯化钠，质量分数0.2％十二烷基磺酸钠和 300mM咪唑)将目标蛋白与纯化介质分离，得到从Ni-NTA中洗脱的成分(红细胞生成素跨膜区)，图1中的泳道4。
5.目标蛋白的纯化：所收集的目标蛋白(从Ni-NTA中洗脱的成分)再用分子筛层析柱进一步纯化，一是可以去除杂蛋白，二是还可以去除洗脱缓冲液中的咪唑。此处用于分子筛层析的缓冲液为20mM磷酸钠，pH6.5,100mM氯化钠，质量分数0.2％十二烷基磺酸钠，分子筛纯化后的样品-红细胞生成素跨膜区，其电泳分析如图1中的泳道5。
各阶段的蛋白溶液的SDS-PAGE电泳分析图如图1所示，从图1可以看出，利用本实施例的红细胞生成素跨膜区的纯化方法，可以获得了高纯度的目标蛋白-红细胞生成素跨膜区。
实施例2，红细胞生成素跨膜区纯化至十二烷基磷酰胆碱(DPC)中。
一种红细胞生成素跨膜区纯化至另外一种变性剂系统中的方法，其特征在于包括以下步骤：
1.目标蛋白的诱导：将编码人类红细胞生成素的跨膜区基因克隆至大肠杆菌表达载体 pET29b上，所产生的质粒能够编码一个在C端含有6个组氨酸标签的重组蛋白。质粒转化入大肠杆菌(BL21DE3)中，在含有30μg/ml的卡那霉素的LB平板上培养，挑取单菌落接种于4毫升的含30μg/ml的卡那霉素LB液体培养基中，于37℃摇床上过夜培养后，转至1升含30μg/ml的卡那霉素LB液体培养基中培养，当在600nm处的吸光度达到1.0时，加入IPTG 至1mM诱导重组蛋白的表达，菌体细胞继续在37℃摇床上培养12小时后，离心收集菌体。
2.目标蛋白的溶解：每4g菌体细胞悬浮于40ml缓冲液1中(20mM磷酸钠，pH7.8,500mM氯化钠和质量分数2％十二烷基磺酸钠)中，置于冰浴中用超声波破碎仪破碎15min，然后加入尿素至6M。于25摄氏度放置2小时使所有蛋白溶解。将细胞破碎液于16000×g以及20摄氏度条件下离心后，收集上清液备用。取2毫升Ni-NTA纯化介质，先用10毫升缓冲液(20mM磷酸钠，pH7.8,500mM氯化钠)平衡后，将介质与含有重组蛋白的上清液混合，并置于180rpm摇床上2小时，再将介质转移至层析柱中，通过重力作用让液体自然流出。
3.目标蛋白亲合层析准备：利用50毫升缓冲液2(20mM磷酸钠，pH7.8,100mM氯化钠，6M尿素，质量分数0.2％十二烷基磺酸钠和10mM咪唑)清洗纯化介质。
4.目标蛋白的折叠：利用50毫升缓冲液3(20mM磷酸钠，pH6.5,100mM氯化钠和质量分数0.2％十二烷基磺酸钠)去除尿素并使目标蛋白在十二烷基磺酸钠中折叠。
5.变性剂的转换：利用50毫升缓冲液4(20mM磷酸钠，pH6.5,100mM氯化钠和质量分数0.2％十二烷基磷酰胆碱(DPC)置换蛋白中的十二烷基磺酸钠。
6.最后利用洗脱液(20mM磷酸钠，pH6.5,100mM氯化钠，质量分数0.2％DPC和300mM咪唑)将目标蛋白与纯化介质分离，获得从Ni-NTA中洗脱的成分。
7.目标蛋白的纯化：所收集的目标蛋白(从Ni-NTA中洗脱的成分)再利用分子筛层析柱进一步纯化，一是可以去除杂蛋白，二是还可以去除洗脱缓冲液中的咪唑。此处用于分子筛层析的缓冲液为20mM磷酸钠，pH6.5,100mM氯化钠，质量分数0.2％DPC，由此获得纯化的膜蛋白-红细胞生成素跨膜区。
由此可见，纯化的蛋白-红细胞生成素跨膜区可以被纯化至不同的膜系统中，本实施例中的DPC可以是其它用于膜蛋白折叠的膜系统。

Claims (7)

1.一种含单跨膜区的膜蛋白其跨膜区的纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：在含单跨膜区的膜蛋白的N或C端加入多聚组氨酸标签，然后将此含组氨酸标签的含单跨膜区的膜蛋白的编码基因转入到表达质粒中，再将表达质粒转入表达菌中，培养表达菌并诱导含单跨膜区的膜蛋白的表达，将表达菌破碎，并用含尿素和变性剂的缓冲液将含单跨膜区的膜蛋白溶解，在有尿素的情况下利用组氨酸标签对单跨膜区的膜蛋白进行纯化，并同时用再折叠剂使单跨膜区的膜蛋白再折叠并去除尿素，获得折叠的单跨膜区的膜蛋白。
2.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，去除尿素后的折叠的单跨膜区的膜蛋白再利用分子筛层析法将蛋白进一步纯化并去除蛋白缓冲液中的咪唑。
3.根据权利要求2所述的纯化方法，其特征在于，是将去除尿素后的折叠的单跨膜区的膜蛋白上样分子筛层析柱，然后用洗脱缓冲液洗脱，所述的洗脱缓冲液是20mM磷酸钠、100mM氯化钠、质量分数0.2％十二烷基磺酸钠，pH 6.5。
4.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，所述的表达菌是大肠杆菌。
5.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，所述的含尿素和变性剂的缓冲液，其尿素浓度为6M，变性剂为十二烷基磺酸钠，浓度为质量分数2％，所述的在有尿素的情况下利用组氨酸标签对单跨膜区的膜蛋白进行纯化，其尿素浓度为6M。
6.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，在含单跨膜区的膜蛋白的N或C端加入多聚组氨酸标签，然后将此含组氨酸标签的含单跨膜区的膜蛋白的编码基因转入到表达质粒中，再将表达质粒转入大肠杆菌中，培养大肠杆菌并诱导含单跨膜区的膜蛋白的表达，收集大肠杆菌，悬浮于缓冲液1中，冰浴下用超声波破碎，然后加入尿素至6M，直至蛋白溶解，细胞破碎液离心，收集上清液，所述的缓冲液1为：20mM磷酸钠，500mM氯化钠和质量分数2％十二烷基磺酸钠，pH 7.8；
取平衡后的Ni-NTA纯化介质与上清液混合吸附，装柱，待液体流出后，用缓冲液2清洗纯化介质，然后再用折叠缓冲液3冲洗，去除尿素并使蛋白折叠，最后利用洗脱液洗脱将含单跨膜区的膜蛋白与纯化介质分离；
所述的缓冲液2为20mM磷酸钠,100mM氯化钠，6M尿素，质量分数0.2％十二烷基磺酸钠和10mM咪唑，pH 7.8；
所述的折叠缓冲液3为20mM磷酸钠,100mM氯化钠和质量分数0.2％十二烷基磺酸钠，pH6.5；
所述的洗脱缓冲液为20mM磷酸钠,100mM氯化钠和质量分数0.2％十二烷基磺酸钠，pH6.5。
7.根据权利要求6所述的纯化方法，其特征在于，所述的再用折叠缓冲液3冲洗，去除尿素并使蛋白折叠为用折叠缓冲液3冲洗，去除尿素，然后转换变性剂，用折叠缓冲液4冲洗，所述的折叠缓冲液4为20mM磷酸钠,100mM氯化钠和质量分数0.2％十二烷基磷酰胆碱，pH6.5。
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