KR20150027743A

KR20150027743A - 재조합 플라스모디움 팔시파룸 포자소체 단백질의 정제 방법

Info

Publication number: KR20150027743A
Application number: KR20147033423A
Authority: KR
Inventors: 제프리 앨렌; 그레그 캔틴; 리안 헤버스톡
Original assignee: 피페넥스 인크.
Priority date: 2012-05-01
Filing date: 2013-04-22
Publication date: 2015-03-12
Also published as: MX352093B; TW201348250A; BR112014027019A2; WO2013165732A1; TWI630213B; AU2013256757A1; KR102087461B1; CN104379596A; JP6238967B2; ZA201407420B; NZ630121A; JP2015517464A; MY166380A; AU2013256757B2; CA2870198C; US20140051841A1; US9169304B2; AR090900A1; BR112014027019B1; EP2844666A1

Abstract

본 발명은 고품질 재조합 플라스모디움 팔시파룸 포자소체 단백질을 고수율로 정제하는 방법에 관한 것이다. 본 방법은 단백질을 변성 및 리폴딩시킬 필요없이 고수율로 rCSP를 제공한다. rCSP의 이량체화, 응집, 및 N 말단 분해를 비롯한, 본 분야에서 이전에 직면하였던 장애들을 본 발명을 통해 극복하게 된다. 본 발명에 의해 제공되는 방법은 규모가변적이고, 대량 발효 배치에 적용될 수 있다. 본 발명은 또한 재조합 P. 팔시파룸 포자소체 단백질의 안정한 액체 제제, 및 안정한 액체 제제 중 rCSP를 안정하게 유지시키는 방법에 관한 것이다.

Description

재조합 플라스모디움 팔시파룸 포자소체 단백질의 정제 방법{PROCESS FOR PURIFYING RECOMBINANT PLASMODIUM FALCIPARUM CIRCUMSPOROZOITE PROTEIN}

관련 출원에 대한 상호 참조

본 출원은 2012년 5월 1일 출원된 미국 가특허 출원 시리얼 번호 제61/641,105호의 이점을 주장하며; 이는 2013년 3월 15일 출원된 미국 특허 출원 시리얼 번호 제13/844,261호의 부분 계속 출원이고, 상기 특허 출원은 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다.

정부 지원

본 발명은 미생물 감염성 질환 분과/미국 국립 알레르기·감염성 질환 연구소에 의해 부여된 계약 번호 AI-N01-054210 하에 정부 지원에 의해 이루어졌다. 정부는 본 발명에 일정 권리를 갖는다.

본 발명의 기술분야

본 발명은 단백질 정제, 특히, 재조합적으로 발현된 플라스모디움 팔시파룸(Plasmodium falciparum) 포자소체 단백질의 정제 분야에 관한 것이다.

말라리아는 플라스모디움(Plasmodium) 속 기생충에 의해 유발된다. 미국 질병 관리 본부에 따르면, 아프리카에서는 말라리아가 HIV/AIDS 다음으로 감염성 질환으로 인한 가장 큰 사망 원인으로서 2위를 차지하였다. 전세계적으로는 호흡기 감염, HIV/AIDS, 설사병, 및 결핵 다음인 5위를 차지한다. 인간을 공격하는 공지된 11종 이상의 플라스모디움 기생충들 중 하나인 플라스모디움 팔시파룸은 그가 면역계를 회피할 수 있는 장소인 생명 유지 기관 및 심부 조직에서의 기생충의 분리를 특징으로 하는 특히 중증의 감염을 유발한다.

이용가능한 효과적인 말라리아 백신은 없다. 최근 전략법은, 기생충의 발병 기전에 중요한 플라스모디움 팔시파룸 포자소체 단백질(CSP)을 표적화한다. 현재, CSP의 일부로 구성된, RTS,S(글락소 스미스클린(Glaxo SmithKline))로 불리는 백신이 III상 임상 시험 단계에 있었다. CSP는 N 말단 영역, 중앙 반복부 영역, 및 C 말단 영역인 3개의 영역으로 광범위하게 기술될 수 있는 단백질 단량체이다. N 및 C 말단 영역은 기생충 침입에 중요한, 중요 보호 영역을 함유하며, 중앙 영역은 고도로 보존되는 면역 우성 테트라펩티드 반복부를 함유한다. 백신 RTS,S는 CSP의 N 말단 영역은 포함하지 않는다. 이는 B형 간염 표면 항원에 연결된, CSP 중앙 반복부의 일부 및 C 말단 영역으로 구성된다. CSP의 N 말단 영역이 면역원성을 띈다고 시사하는 최근 보고는, N 말단 영역을 가지는 CSP 분자를 사용하는 백신 전략법이 우세할 것이라는 것을 제안한다.

백신 연구 및 생산의 요구를 충족시킬 수 있는 양으로 재조합 CSP를 재조하는 제조 규모 정제 공정 개발이 도전 과정을 제시한다. CSP의 N 말단 영역은 분해에 대해 고도로 감수성이다. 추가로, CSP는 단량체의 N 말단 인근에 유리 시스테인을 포함하는 공유 분자간 이황화 결합 형성에 기인하여 이량체를 형성한다. CSP는 또한 더 높은 고분자량의 응집체를 형성한다. 현 정제 방식은 N 말단 영역을 포함하지 않는 재조합 CSP 단량체를 제공하거나, 또는 온전한 CSP를 저수율로 생성한다. 이량체 및 응집체 제거를 위한 변성은 리폴딩을 필요로 하는데, 이는 CSP의 C 말단 영역 중의 4개의 시스테인 잔기가 관여하는 2개의 이황화 결합의 존재로 인해 복작해진다. 상기 이황화 결합은 C 말단 보호 영역의 구조 및 기능에 중요하며; 이를 파괴시키는 것은 CSP가 간 세포에 결합할 수 있는 그의 능력을 파괴시키는 것으로 나타났다. 추가로, 추가의 변성 및 리폴딩 단계는 부담스럽고, 비용이 많이 들며, 수율을 감소시키고, 대량 발효 배치와 함께 사용하기 위해 규모 확장하기 위해서는 도전 과제가 된다. 그러므로, 고품질 재조합 CSP를 고수율로 수득하기 위한 규모가변적 정제 방법이 요구된다.

본 발명의 요약

본 발명은 박테리아 숙주 세포 발현 시스템에서 제조된 재조합 P. 팔시파룸(P. falciparum) 포자소체 단백질(rCSP)을 정제하는 방법에 관한 것이다. 본 방법은 상기 단백질을 변성 및 리폴딩할 필요없이 고수율로 rCSP를 제공한다. rCSP의 이량체화, 응집, 및 N 말단 분해를 비롯한, 본 분야에서 이전에 직면하였던 장애들을 본 발명을 통해 극복하게 된다. 본 발명에 의해 제공되는 방법은 규모가변적이고, 대량 발효 배치에 적용될 수 있다. 본 발명은 또한 재조합 P. 팔시파룸 포자소체 단백질의 안정한 액체 제제, 및 안정한 액체 제제 중 rCSP를 안정하게 유지시키는 방법에 관한 것이다.

실시양태에서, 본 발명은 (a) 재조합 P. 팔시파룸 포자소체 단백질 이량체를 포함하는 박테리아 세포 용해물 조제물(preparation)을 수득하는 단계; (b) 단계 (a) 박테리아 세포 용해물 조제물을, P. 팔시파룸 포자소체 단백질 이량체를 포함하는 가용성 분획, 및 불용성 분획으로 분리시키는 단계; (c) 단계 (b)의 가용성 분획 중의 재조합 P. 팔시파룸 포자소체 단백질 이량체를 가용성 분획 중의 숙주 세포 단백질로부터 분리시키는 단계; 및 (d) 단계 (c)에서 수득된 재조합 P. 팔시파룸 포자소체 단백질 이량체에 우선적 환원 조건을 적용하여 정제된 재조합 P. 팔시파룸 포자소체 단백질을 수득하는 단계를 포함하는, 재조합 P. 팔시파룸 포자소체 단백질을 정제하는 방법을 제공한다.

관련된 실시양태에서, 정제된 재조합 P. 팔시파룸 포자소체 단백질은 약 약 10% 내지 약 75%, 약 10% 내지 약 70%, 약 10% 내지 약 65%, 약 10% 내지 약 60%, 10% 내지 약 55%, 약 10% 내지 약 50%, 약 10% 내지 약 45%, 약 10% 내지 약 40%, 약 10% 내지 약 35%, 약 10% 내지 약 30%, 약 10% 내지 약 25%, 약 10% 내지 약 20%, 약 20% 내지 약 75%, 약 20% 내지 약 70%, 약 20% 내지 약 65%, 약 20% 내지 약 60%, 약 20% 내지 약 55%, 약 20% 내지 약 50%, 약 20% 내지 약 45%, 약 20% 내지 약 40%, 약 20% 내지 약 35%, 약 20% 내지 약 30%, 약 25% 내지 약 75%, 약 25% 내지 약 70%, 약 25% 내지 약 65%, 약 25% 내지 약 60%, 약 25% 내지 약 55%, 약 25% 내지 약 50%, 약 25% 내지 약 45%, 약 25% 내지 약 40%, 약 25% 내지 약 35%, 약 25% 내지 약 30%, 약 30% 내지 약 75%, 약 30% 내지 약 70%, 약 30% 내지 약 65%, 약 30% 내지 약 60%, 약 30% 내지 약 55%, 약 30% 내지 약 50%, 약 30% 내지 약 45%, 또는 약 30% 내지 약 40%의 전체 정제 수율로 수득된다. 실시양태에서, 수득된 정제된 재조합 P. 팔시파룸 포자소체 단백질 중 약 10% 이하는 N 말단에서 분해된 것이다. 실시양태에서, 수득된 정제된 재조합 P. 팔시파룸 포자소체 단백질 중 약 10% 이하는 이량체화된 것이다. 실시양태에서, 수득된 정제된 재조합 P. 팔시파룸 포자소체 단백질 중 약 5% 이하는 고분자량 응집체로서 존재한다. 실시양태에서, 수득된 정제된 재조합 P. 팔시파룸 포자소체 단백질 중 약 10% 이하는 변성된 것이다. 관련된 실시양태에서, 수득된, 정제된 재조합 P. 팔시파룸 포자소체 단백질은 약 90% 이상의 P. 팔시파룸 포자소체 단백질 단량체를 포함한다.

본 발명의 실시양태에서, 박테리아 세포 용해물은 슈도모나드(Pseudomonad) 세포 용해물이다. 관련된 실시양태에서, 슈도모나드 세포가 슈도모나스(Pseudomonas) 세포이고, 다른 관련 실시양태에서, 슈도모나스 세포는 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens)이다.

실시양태에서, 상기 단계 (b)의 분리 단계는 디스크 적층 원심분리 및/또는 심층 여과를 포함한다. 단계 (c)의 분리 단계는 크로마토그래피를 포함할 수 있다. 실시양태에서, 크로마토그래피는 하기: 음이온 교환 크로마토그래피, 양이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 및 혼합 모드 크로마토그래피 중 하나 이상의 것을 포함한다. 혼합 모드 크로마토그래피로서 하이드록시아파타이트를 사용하는 것이 고려된다. 특정 실시양태에서, 단계 (b)의 분리 단계는 디스크 적층 원심분리 및 심층 여과를 포함하고, 단계 (d)의 분리 단계는 음이온 교환 크로마토그래피 및 혼합 모드 크로마토그래피를 포함한다.

본 발명의 실시양태에서, 우선적 환원 조건은 DTT, 시스테인, 글루타티온, 모노티오글리세롤, 티오글리콜레이트, 디티오트레이톨, 디티오에리트리톨, 아세틸시스테인, 2-머캅토에탄올(B-머캅토에탄올), TCEP-HCl(순수, 결정질 트리스(2-카복시에틸)포스핀 하이드로클로라이드), 또는 2-머캅토에틸아민-HCl(2-MEA)을 포함한다. 특정의 관련된 실시양태에서, 우선적 환원 조건은 약 0.010 내지 약 0.030 mM 농도의 DTT를 포함한다. 완충제 교환은 공극 크기가 약 4 kDa 내지 약 8 kDa인 막을 사용하여 수행하는 접선 유동 여과를 포함할 수 있다. 실시양태에서, 우선적 환원 조건은 미국 약전-국립 처방집(USP-NF)에 공개된 미국 약국방(미국 메릴랜드주 로크빌)의 표준, 또는 예컨대, 국제 약전(세계 보건 기구)에 공개된 있는 미국 이외의 타국의 유사 표준을 충족시키는 성분을 포함한다.

청구하는 방법은 약 1 g 내지 약 2,000 g rCSP를 포함하는 박테리아 세포 용해물 조제물으로 규모가변적인 것이다. 관련된 실시양태에서, 박테리아 용해물 조제물 중 rCSP의 양은 약 1 g 내지 약 2,000 g이다.

본 발명은 추가로 (a) 박테리아 숙주 세포의 배양물을 수득하는 단계로서, 여기서, 박테리아 숙주 세포는 P. 팔시파룸 포자소체 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터로 형질전환된 것인 단계; (b) 박테리아 숙주 세포의 배양물을 성장시킴으로써 발현 벡터로부터 P. 팔시파룸 포자소체 단백질을 발현시키는 단계; (c) 단계 (b)에서 성장시킨 박테리아 숙주 세포의 배양물로부터 박테리아 숙주 세포를 파괴시켜 박테리아 세포 용해물 조제물을 생성하는 단계로서, 박테리아 세포 용해물 조제물은 P. 팔시파룸 포자소체 단백질 이량체를 포함하는 것인 단계; (d) 단계 (c)의 박테리아 세포 용해물 조제물을 P. 팔시파룸 포자소체 단백질 이량체를 포함하는 가용성 분획, 및 불용성 분획으로 분리시키는 단계; (e) 단계 (d)의 가용성 분획 중 재조합 P. 팔시파룸 포자소체 단백질 이량체를 숙주 세포 단백질로부터 분리시키는 단계; (f) 단계 (e)에서 수득된 재조합 P. 팔시파룸 포자소체 단백질 이량체에 우선적 환원 조건을 적용하여 P. 팔시파룸 포자소체 단백질 단량체를 수득하는 단계; 및 (g) 단계 (f)의 우선적 환원 조건에서 사용된 환원 시약을 완충제 교환에 의해 제거하여 정제된 재조합 P. 팔시파룸 포자소체 단백질를 수득하는 단계를 포함하는, 재조합 P. 팔시파룸 포자소체 단백질을 정제하는 방법에 관한 것이다.

관련된 실시양태에서, 정제된 재조합 P. 팔시파룸 포자소체 단백질은 약 10% 내지 약 75%, 약 10% 내지 약 70%, 약 10% 내지 약 65%, 약 10% 내지 약 60%, 약 20% 내지 약 75%, 약 20% 내지 약 70%, 약 20% 내지 약 65%, 약 25% 내지 약 75%, 약 25% 내지 약 70%, 약 25% 내지 약 65%, 약 25% 내지 약 60%, 약 30% 내지 약 75%, 약 30% 내지 약 70%, 약 30% 내지 약 65%, 또는 약 30% 내지 약 60%의 전체 정제 수율로 수득된다. 실시양태에서, 수득된 정제된 재조합 P. 팔시파룸 포자소체 단백질 중 약 10% 이하는 N 말단에서 분해된 것이다. 실시양태에서, 수득된 정제된 재조합 P. 팔시파룸 포자소체 단백질 중 약 10% 이하는 이량체화된 것이다. 실시양태에서, 수득된 정제된 재조합 P. 팔시파룸 포자소체 단백질 중 약 5% 이하는 고분자량 응집체로서 존재한다. 실시양태에서, 수득된 정제된 재조합 P. 팔시파룸 포자소체 단백질 중 약 10% 이하는 변성된 것이다. 관련된 실시양태에서, 수득된, 정제된 재조합 P. 팔시파룸 포자소체 단백질은 약 90% 이상의 P. 팔시파룸 포자소체 단백질 단량체를 포함한다.

본 발명의 실시양태에서, 박테리아 세포 용해물은 슈도모나드 세포 용해물이다. 관련된 실시양태에서, 슈도모나드 세포가 슈도모나스 세포이고, 추가의 관련된 실시양태에서, 슈도모나스 세포는 슈도모나스 플루오레센스이다. 특정 실시양태에서, P. 팔시파룸 포자소체 단백질을 코딩하는 핵산 서열은 주변세포질 분비 신호 서열에 융합되어 있다. 주변세포질 분비 신호 서열은 P. 플루오레센스 분비 신호 서열, 예를 들어, LAO, pbp, pbpA20V, 또는 cupA2일 수 있다. 본원에서 추가로 기술되는 바와 같이, 임의의 CSP의 발현이 고려된다. 특정 실시양태에서, rCSP는 서열 번호 3에 기재되어 있는 아미노산 서열, 또는 서열 번호 3에 기재되어 있는 아미노산 서열과 90% 이상 동일한 아미노산 서열을 가지는 핵산 서열에 의해 코딩된다.

실시양태에서, 상기 단계 (d)의 분리 단계는 디스크 적층 원심분리 및/또는 심층 여과를 포함한다. 단계 (e)의 분리 단계는 크로마토그래피를 포함할 수 있다. 실시양태에서, 크로마토그래피는 하기: 음이온 교환 크로마토그래피, 양이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 및 혼합 모드 크로마토그래피 중 하나 이상의 것을 포함한다. 혼합 모드 크로마토그래피로서 하이드록시아파타이트를 사용하는 것이 고려된다. 특정 실시양태에서, 단계 (d)의 분리 단계는 디스크 적층 원심분리 및 심층 여과를 포함하고, 단계 (e)의 분리 단계는 음이온 교환 크로마토그래피 및 혼합 모드 크로마토그래피를 포함한다.

본 발명의 실시양태에서, 우선적 환원 조건은 DTT, 시스테인, 글루타티온, 모노티오글리세롤, 티오글리콜레이트, 디티오트레이톨, 디티오에리트리톨, 아세틸시스테인, 2-머캅토에탄올(B-머캅토에탄올), TCEP-HCl(순수, 결정질 트리스(2-카복시에틸)포스핀 하이드로클로라이드), 또는 2-머캅토에틸아민-HCl(2-MEA)을 포함한다. 특정의 관련된 실시양태에서, 우선적 환원 조건은 약 0.010 내지 약 0.030 mM 농도의 DTT를 포함한다. 완충제 교환은 공극 크기가 약 4 kDa 내지 약 8 kDa인 막을 사용하여 수행하는 접선 유동 여과를 포함할 수 있다.

청구하는 방법은 약 1 g 내지 약 2,000 g rCSP를 포함하는 박테리아 세포 용해물 조제물으로 규모가변적인 것이다. 관련된 실시양태에서, 박테리아 용해물 조제물 중 rCSP의 양은 약 1 g 내지 약 2,000 g이다. 본 발명의 실시양태에서, 단계 (b)에서 성장시킨 박테리아 숙주 세포의 배양물은 약 10 ℓ 내지 약 500 ℓ이다.

본 발명은 하기를 제공한다:

1. (a) 재조합 P. 팔시파룸 포자소체 단백질 이량체를 포함하는 박테리아 세포 용해물 조제물을 수득하는 단계; (b) 단계 (a)의 박테리아 세포 용해물 조제물을, 재조합 P. 팔시파룸 포자소체 단백질 이량체를 포함하는 가용성 분획, 및 불용성 분획으로 분리시키는 단계; (c) 단계 (b)의 가용성 분획 중의 재조합 P. 팔시파룸 포자소체 단백질 이량체를 가용성 분획 중의 숙주 세포 단백질로부터 분리시키는 단계; 및 (d) 단계 (c)에서 수득된 재조합 P. 팔시파룸 포자소체 단백질 이량체에 우선적 환원 조건을 적용하여 재조합 P. 팔시파룸 포자소체 단백질을 수득함으로써 정제된 재조합 P. 팔시파룸 포자소체 단백질을 수득하는 단계를 포함하는, 재조합 P. 팔시파룸 포자소체 단백질을 정제시키는 방법.

2. 제1항에 있어서, 단계 (d)에서 수득된 재조합 P. 팔시파룸 포자소체 단백질을 숙주 세포 단백질, N 말단에서 분해된 rCSP, 및/또는 다른 원치않는 rCSP 종으로부터 분리시키는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.

3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 정제된 재조합 P. 팔시파룸 포자소체 단백질이 약 10% 내지 약 75%의 전체 정제 수율로 수득되는 것인 방법.

4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 P. 팔시파룸 포자소체 단백질이 약 10% 내지 약 75%, 약 10% 내지 약 70%, 약 10% 내지 약 60%, 약 10% 내지 약 50%, 약 10% 내지 약 40%, 약 10% 내지 약 30%, 약 20% 내지 약 75%, 약 20% 내지 약 50%, 약 20% 내지 약 40%, 또는 약 20% 내지 약 30%의 전체 정제 수율로 수득되는 것인 방법.

5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 수득된 정제된 재조합 P. 팔시파룸 포자소체 단백질 중 약 10% 이하가 N 말단에서 분해된 것인 방법.

6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 수득된 정제된 재조합 P. 팔시파룸 포자소체 단백질 중 약 10% 이하가 이량체화된 것인 방법.

7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 수득된 정제된 재조합 P. 팔시파룸 포자소체 단백질 중 약 5% 이하가 고분자량 응집체로서 존재하는 것인 방법.

8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 수득된 정제된 재조합 P. 팔시파룸 포자소체 단백질 중 약 10% 이하가 변성된 것인 방법.

9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 수득된 정제된 재조합 P. 팔시파룸 포자소체 단백질이 약 90% 이상의 P. 팔시파룸 포자소체 단백질 단량체를 포함하는 것인 방법.

10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 박테리아 세포 용해물이 슈도모나드 세포 용해물인 것인 방법.

11. 제10항에 있어서, 슈도모나드 세포가 슈도모나스 세포인 것인 방법.

12. 제11항에 있어서, 슈도모나스 세포가 슈도모나스 플루오레센스인 것인 방법.

13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b)의 분리 단계가 디스크 적층 원심분리를 포함하는 것인 방법.

14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b)의 분리 단계가 심층 여과를 포함하는 것인 방법.

15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (c)의 분리 단계가 크로마토그래피를 포함하고, 여기서, 크로마토그래피는 음이온 교환 크로마토그래피 및 혼합 모드 크로마토그래피를 포함하는 것인 방법.

16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (c)의 분리 단계가 혼합 모드 크로마토그래피를 포함하고, 여기서, 혼합 모드 크로마토그래피는 하이드록시아파타이트 크로마토그래피인 것인 방법.

17. 제2항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (e)의 분리 단계가 소수성 상호작용 크로마토그래피를 포함하는 것인 방법.

18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 우선적 환원 조건이 온화한(mild) 환원제를 포함하는 것인 방법.

19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 온화한 환원제가 DTT, 시스테인, 아세틸시스테인, 글루타티온, 모노티오글리세롤(MTG), 티오글리콜레이트, 디티오트레이톨, 디티오에리트리톨, 아세틸시스테인, 2-머캅토에탄올(B-머캅토에탄올), TCEP-HCl(순수, 결정질 트리스(2-카복시에틸)포스핀 하이드로클로라이드), 또는 2-머캅토에틸아민-HCl(2-MEA)인 것인 방법.

20. 제19항에 있어서, 온화한 환원제가 DTT, MTG, 아세틸시스테인, 글루타티온, 티오글리콜레이트, 또는 시스테인인 것인 방법.

21. 제20항에 있어서, 온화한 환원제가 약 0.01 내지 약 0.03 mM 농도의 DTT, 또는 약 0.5 mM 내지 약 1.5 mM 농도의 MTG인 것인 방법.

22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 우선적 환원 조건이 추가로 탈응집화제(disaggregating agent)를 포함하는 것인 방법.

23. 제22항에 있어서, 우선적 환원 조건이 추가로 우레아, 아르기닌, 구아니딘 HCl, 또는 계면활성제인 탈응집화제를 포함하는 것인 방법.

24. 제23항에 있어서, 탈응집화제가 약 1.5 내지 2.5 M 우레아인 것인 방법.

25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 온화한 환원 조건이 약 0.05 내지 약 1 mM MTG 및 약 2 M 우레아를 포함하는 것인 방법.

26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 약 1 mg/ml 내지 약 50 mg/ml, 약 1 mg/ml 내지 약 25 mg/ml, 약 1 mg/ml 내지 약 10 mg/ml, 약 1 mg/ml 내지 약 5 mg/ml, 약 5 mg/ml 내지 약 50 mg/ml, 약 5 mg/ml 내지 약 25 mg/ml, 또는 약 5 mg/ml 내지 약 10 mg/ml의 재조합 P. 팔시파룸 포자소체 단백질을, 약 0.5 mM 내지 약 1.5 mM MTG 및 약 10% 내지 약 20% 아르기닌을 포함하는 제제 완충제로 정용여과하는 것을 포함하는, 재조합 P. 팔시파룸 포자소체 단백질의 안정한 액체 제제를 제조하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.

27. 제26항에 있어서, 제제 완충제가 0.5X 또는 1X PBS를 포함하는 것인 방법.

28. 제26항 또는 제27항에 있어서, 제제 완충제의 pH가 약 6.0 내지 약 7.5, 약 6.4 내지 약 7.2, 약 6.4 내지 약 7.0, 약 6.6 내지 약 6.8, 또는 약 6.7인 것인 방법.

29. 제26항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 약 4℃ 내지 약 15℃, 약 4℃ 내지 약 10℃, 약 4℃ 내지 약 9℃, 약 4℃ 내지 약 8℃, 약 4℃ 내지 약 7℃, 약 4℃ 내지 약 6℃, 약 4℃ 내지 약 5℃, 약 5℃ 내지 약 10℃, 약 5℃ 내지 약 9℃, 약 5℃ 내지 약 8℃, 약 5℃ 내지 약 7℃, 또는 약 5℃ 내지 약 6℃의 보관 온도를 포함하는 것인 방법.

30. 제26항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 제제 완충제가 약 1.0 mM MTG, 약 10% 내지 약 20% 아르기닌, 1X PBS를 포함하고, pH가 약 6.4 내지 약 7.0이며, 여기서, 보관 온도는 약 4℃ 내지 약 6℃인 것인 방법.

31. 제26항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 P. 팔시파룸 포자소체 단백질의 안정한 액체 제제가 하기: 약 1% 이하, 약 2% 이하, 약 3% 이하, 약 4% 이하, 약 5% 이하, 약 6% 이하, 약 7% 이하, 약 8% 이하, 약 9% 이하, 또는 약 10% 이하의 재조합 P. 팔시파룸 포자소체 단백질 이량체; 약 1% 이하, 약 2% 이하, 약 3% 이하, 약 4% 이하, 약 5% 이하, 약 6% 이하, 약 7% 이하, 약 8% 이하, 약 9% 이하, 또는 약 10% 이하의 재조합 P. 팔시파룸 포자소체 단백질 고분자량 응집체; 약 1% 이하, 약 2% 이하, 약 3% 이하, 약 4% 이하, 약 5% 이하, 약 6% 이하, 약 7% 이하, 약 8% 이하, 약 9% 이하, 또는 약 10% 이하의 변성된 재조합 P. 팔시파룸 포자소체 단백질; 약 1% 이하, 약 2% 이하, 약 3% 이하, 약 4% 이하, 약 5% 이하, 약 6% 이하, 약 7% 이하, 약 8% 이하, 약 9% 이하, 또는 약 10% 이하의 피로글루타메이트 함유 P. 팔시파룸 포자소체 단백질 종; 및 약 1% 이하, 약 2% 이하, 약 3% 이하, 약 4% 이하, 약 5% 이하, 약 6% 이하, 약 7% 이하, 약 8% 이하, 약 9% 이하, 또는 약 10% 이하의 재조합 P. 팔시파룸 포자소체 단백질 분해 생성물 중 1 이상을 함유하는 것인 방법.

32. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 방법인 약 1 g 내지 약 2,000 g rCSP를 포함하는 박테리아 세포 용해물 조제물으로 규모가변적인 것인 것인 방법.

33. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 박테리아 용해물 조제물 중 rCSP의 양이 약 1 g 내지 약 2,000 g인 것인 방법.

34. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 박테리아 세포 용해물이 재조합 P. 팔시파룸 포자소체 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포로부터 제조되는 것인 방법.

35. 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 슈도모나드 세포가 슈도모나스 세포인 것인 방법.

36. 제35항에 있어서, 슈도모나스 세포가 슈도모나스 플루오레센스인 것인 방법.

37. 제34항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산 서열에 의해 코딩된 재조합 P. 팔시파룸 포자소체 단백질이 서열 번호 3에 기재되어 있는 아미노산 서열, 또는 서열 번호 3에 기재되어 있는 아미노산 서열과 90% 이상 동일한 아미노산 서열을 가지는 것인 방법.

38. 제36항 또는 제37항에 있어서, P. 플루오레센스 세포가 유전자형 ΔpyrF, lacIQ, 및 ΔhtpX를 가지는 PyrF 생산 숙주 균주인 것인 방법.

39. 제34항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 P. 팔시파룸 포자소체 단백질을 코딩하는 핵산 서열이 주변세포질 분비 신호 서열에 융합되어 있는 것인 방법.

40. 제39항에 있어서, 주변세포질 분비 신호 서열이 P. 플루오레센스 분비 신호 서열인 것인 방법.

41. 제44항에 있어서, P. 플루오레센스 주변세포질 분비 신호 서열이 LAO, pbp, pbpA20V, 또는 cupA2인 것인 방법.

42. 제41항에 있어서, P. 플루오레센스 주변세포질 분비 신호 서열이 LAO인 것인 방법.

43. 약 0.5 내지 약 1.5 mM MTG 및 약 10% 내지 약 20% 아르기닌을 포함하는 제제 완충제 중 약 1 내지 약 5, 약 1 내지 약 10, 약 1 내지 약 20, 약 1 내지 약 30, 약 1 내지 약 40, 또는 약 1 내지 약 50 mg/ml의 재조합 P. 팔시파룸 포자소체 단백질을 포함하는, 재조합 P. 팔시파룸 포자소체 단백질의 안정한 액체 제제.

44. 제43항에 있어서, 제제 완충제가 0.5X 또는 1X PBS를 포함하는 것인 안정한 액체 제제.

45. 제43항 또는 제44항에 있어서, 제제 완충제의 pH가 약 6.0 내지 약 7.5, 6.4 내지 약 7.2, 약 6.4 내지 약 7.0, 약 6.6 내지 약 6.8, 약 6.4, 약 6.7, 또는 약 7.0인 것인 안정한 액체 제제.

46. 제43항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 약 4℃ 내지 약 15℃, 약 4℃ 내지 약 10℃, 약 4℃ 내지 약 9℃, 약 4℃ 내지 약 8℃, 약 4℃ 내지 약 7℃, 약 4℃ 내지 약 6℃, 약 4℃ 내지 약 5℃, 약 5℃ 내지 약 10℃, 약 5℃ 내지 약 9℃, 약 5℃ 내지 약 8℃, 약 5℃ 내지 약 7℃, 또는 약 5℃ 내지 약 6℃의 보관 온도를 포함하는 것인 안정한 액체 제제.

47. 제43항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 약 1 내지 약 5 mg/ml rCSP, 약 1.0 mM MTG, 약 10% 아르기닌, 1X PBS를 포함하고, pH가 약 6.0 내지 약 7.5이며, 여기서, 보관 온도가 약 4℃ 내지 약 6℃인 것인 안정한 액체 제제.

48. 제43항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 안정한 액체 제제가 하기:약 1% 이하, 약 2% 이하, 약 3% 이하, 약 4% 이하, 약 5% 이하, 약 6% 이하, 약 7% 이하, 약 8% 이하, 약 9% 이하, 또는 약 10% 이하의 재조합 P. 팔시파룸 포자소체 단백질 이량체; 약 1% 이하, 약 2% 이하, 약 3% 이하, 약 4% 이하, 약 5% 이하, 약 6% 이하, 약 7% 이하, 약 8% 이하, 약 9% 이하, 또는 약 10% 이하의 재조합 P. 팔시파룸 포자소체 단백질 고분자량 응집체; 및 약 1% 이하, 약 2% 이하, 약 3% 이하, 약 4% 이하, 약 5% 이하, 약 6% 이하, 약 7% 이하, 약 8% 이하, 약 9% 이하, 또는 약 10% 이하의 재조합 P. 팔시파룸 포자소체 단백질 분해 생성물 중 1 이상을 함유하는 것인 안정한 액체 제제.

49. 0.5X 또는 1X PBS 중 pH 약 6.0 내지 약 7.5에서 약 1 내지 약 5, 약 1 내지 약 10, 약 1 내지 약 20, 약 1 내지 약 30, 약 1 내지 약 40, 또는 약 1 내지 약 50 mg/ml rCSP, 약 0.5 내지 약 1.5 mM MTG 및 약 1% 내지 약 20% 아르기닌을 포함하는 제제를 제공하는 단계를 포함하고, 여기서, rCSP를 약 3℃ 내지 약 25℃의 온도에서 약 7일 이상, 약 8일 이상, 약 9일 이상, 약 10일 이상, 약 11일 이상, 약 12일 이상, 약 13일 이상, 약 14일 이상, 약 15일 이상, 약 16일 이상, 약 17일 이상, 약 18일 이상, 약 19일 이상, 약 20일 이상, 약 21일 이상, 약 22일 이상, 약 23일 이상, 약 24일 이상, 약 25일 이상, 약 30일 이상, 약 60일 이상, 약 70일 이상, 약 80일 이상, 약 90일 이상, 약 6개월 이상, 또는 약 1년 이상 동안 안정하게 유지시키는 것인, 안정한 액체 제제 중에서 rCSP를 안정하게 유지시키는 방법.

50. 1X PBS 중 pH 약 6.4 내지 약 7.2에서 약 1 내지 약 5, 약 1 내지 약 10, 약 1 내지 약 20, 약 1 내지 약 30, 약 1 내지 약 40, 또는 약 1 내지 약 50 mg/ml rCSP, 약 0.5 내지 약 1.5 mM MTG 및 약 10% 내지 약 20% 아르기닌을 포함하는 제제를 제공하는 단계를 포함하고, 여기서, rCSP를 약 3℃ 내지 약 25℃의 온도에서약 7일 이상, 약 8일 이상, 약 9일 이상, 약 10일 이상, 약 11일 이상, 약 12일 이상, 약 13일 이상, 약 14일 이상, 약 15일 이상, 약 16일 이상, 약 17일 이상, 약 18일 이상, 약 19일 이상, 약 20일 이상, 약 21일 이상, 약 22일 이상, 약 23일 이상, 약 24일 이상, 약 25일 이상, 약 30일 이상, 약 60일 이상, 약 70일 이상, 약 80일 이상, 약 90일 이상, 약 6개월 이상, 또는 약 1년 이상 동안 안정하게 유지시키는 것인, 안정한 액체 제제 중에서 rCSP를 안정하게 유지시키는 방법.

51. 1X PBS 중 pH 약 6.4 내지 약 7.0에서 약 1 내지 약 5, 약 1 내지 약 10, 약 1 내지 약 20, 약 1 내지 약 30, 약 1 내지 약 40, 또는 약 1 내지 약 50 mg/ml rCSP, 약 0.5 내지 약 1.5 mM MTG 및 약 10% 내지 약 20% 아르기닌을 포함하는 제제를 제공하는 단계를 포함하고, 여기서, rCSP를 약 3℃ 내지 약 25℃의 온도에서 약 7일 이상, 약 8일 이상, 약 9일 이상, 약 10일 이상, 약 11일 이상, 약 12일 이상, 약 13일 이상, 약 14일 이상, 약 15일 이상, 약 16일 이상, 약 17일 이상, 약 18일 이상, 약 19일 이상, 약 20일 이상, 약 21일 이상, 약 22일 이상, 약 23일 이상, 약 24일 이상, 약 25일 이상, 약 30일 이상, 약 60일 이상, 약 70일 이상, 약 80일 이상, 약 90일 이상, 약 6개월 이상 또는 약 1년 이상 동안 안정하게 유지시키는 것인, 안정한 액체 제제 중에서 rCSP를 안정하게 유지시키는 방법.

52. 제1항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 0.5X 또는 1X PBS 중 pH 약 6.0 내지 약 7.5에서 약 1 내지 약 5, 약 1 내지 약 10, 약 1 내지 약 20, 약 1 내지 약 30, 약 1 내지 약 40, 또는 약 1 내지 약 50 mg/ml rCSP, 약 0.5 내지 약 1.5 mM MTG 및 약 1% 내지 약 20% 아르기닌을 포함하는 제제를 제공하는 단계를 포함하고, 여기서, rCSP는 약 3℃ 내지 약 25℃의 온도에서 약 7일 이상, 약 8일 이상, 약 9일 이상, 약 10일 이상, 약 11일 이상, 약 12일 이상, 약 13일 이상, 약 14일 이상, 약 15일 이상, 약 16일 이상, 약 17일 이상, 약 18일 이상, 약 19일 이상, 약 20일 이상, 약 21일 이상, 약 22일 이상, 약 23일 이상, 약 24일 이상, 약 25일 이상, 약 30일 이상, 약 60일 이상, 약 70일 이상, 약 80일 이상, 약 90일 이상, 약 6개월 이상, 또는 약 1년 이상 동안 안정하게 유지시키는 것인, 안정한 액체 제제 중에서 정제된 재조합 P. 팔시파룸 포자소체 단백질을 안정하게 유지시키는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.

53. 제52항에 있어서, 제제가 1X PBS 중 pH 약 6.4 내지 7.0에서 약 1.0 mM MTG 및 약 10% 아르기닌을 포함하고, 여기서, rCSP를 약 3℃ 내지 5℃의 온도에서 약 7일 이상, 약 8일 이상, 약 9일 이상, 약 10일 이상, 약 11일 이상, 약 12일 이상, 약 13일 이상, 약 14일 이상, 약 15일 이상, 약 16일 이상, 약 17일 이상, 약 18일 이상, 약 19일 이상, 약 20일 이상, 약 21일 이상, 약 22일 이상, 약 23일 이상, 약 24일 이상, 약 25일 이상, 약 30일 이상, 약 60일 이상, 약 70일 이상, 약 80일 이상, 약 90일 이상, 약 6개월 이상, 또는 약 1년 이상 동안 안정하게 유지시키는 것인 방법..

54. 제49항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, rCSP의 안정한 유지도가 rCSP의 총 검출량, 대조군과 비교하였을 때, 전체 rCSP의 상대적인 차이(%), 또는 대조군과 비교하였을 때, rCSP 순도의 상대적인 차이(%)에 의해 표시되는 것인 방법.

55. 제54항에 있어서, rCSP의 안정한 유지도가 rCSP의 총 검출량이 약 70% 내지 약 95%이거나, 대조군과 비교하였을 때, 전체 rCSP의 상대적인 차이(%) 또는 rCSP 순도의 상대적인 차이(%)가 약 -5% 내지 약 5%, 약 -4% 내지 약 4%, 약 -3% 내지 약 3%, 약 -2% 내지 약 2%, 약 -2% 내지 약 1%, 약 -2% 내지 약 0.5%, 약 -2% 내지 약 0%, 또는 약 0% 내지 약 2%인 것에 의해 표시되는 것인 방법.

56. 제54항 또는 제55항에 있어서, 전체 rCSP가 rCSP 단량체의 측정치인 것인 방법.

57. 제54항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 대조군이 시점 0, 또는 -80℃에서 보관된 시료인 것인 방법.

58. 제54항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, rCSP의 총 검출량이 약 70% 내지 약 95%, 약 70% 내지 약 90%, 약 70% 내지 약 85%, 약 70% 내지 약 80%, 약 75% 내지 약 95%, 약 75% 내지 약 90%, 약 75% 내지 약 85%, 약 80% 내지 약 95%, 약 80% 내지 약 90%, 약 85% 내지 약 95%, 약 72% 내지 약 92%, 약 70%, 약 11%, 약 72%, 약 73%, 약 74%, 약 75%, 약 76%, 약 77%, 약 78%, 약 79%, 약 80%, 약 81%, 약 82%, 약 83%, 약 84%, 약 85%, 약 86%, 약 87%, 약 88%, 약 89%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 또는 약 95%인 것인 방법.

59. 제1항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (c)를 수행하기 이전에 용해물을 냉동 및 해동시키는 단계를 포함하는 것인 방법.

참고 인용

본 명세서에서 언급된 모든 공개 문헌, 특허, 및 특허 출원은 마치 각각의 개별 공개 문헌, 특허, 또는 특허 출원이 구체적으로 및 개별적으로 참조로 포함된다고 명시된 것과 같은 정도로 본원에서 참조로 포함된다.

본 발명의 신규한 특징은 특히 첨부된 특허청구범위에 기재되어 있다. 본 발명의 원리가 사용되는 예시적인 실시양태를 기술하는 하기 상세한 설명, 및 첨부된 도면을 참조함으로써 본 발명의 특징 및 이점을 보다 잘 이해할 수 있을 것이다.
도 1. P. 팔시파룸 CSP 단백질 구조. 본 다이어그램은 진뱅크(GenBank) CAB38998로 기재된 단백질 중 도메인, 및 잔기 25, 334, 338, 369 및 374의 시스테인(이는 각각 C로 표시)을 보여주는 것이다.
도 2. P. 팔시파룸 CSP 아미노산 서열. A. 플라스모디움 팔시파룸 3D7 CS 아미노산 서열; 추정 천연 분비 리더 및 GPI 앵커를 포함하는 진뱅크 엔트리 CAB38998(서열 번호 1). B. 비제한적인 일례로서 제시된, N 말단 메티오닌을 포함하고, 천연 리더 및 GPI 앵커를 포함하지 않는 세포질 CSP의 아미노산 서열(서열 번호 2). C. 비제한적인 일례로서 제시된, 천연 리더, N 말단 메티오닌 및 GPI 앵커를 포함하지 않는 주변세포질 CSP의 아미노산 서열(서열 번호 3).
도 3. P. 팔시파룸 CSP 핵산 서열. A. P. 팔시파룸 3D7 CS 뉴클레오티드 서열; 진뱅크 엔트리 XM_001351086.1(서열 번호 4). B. 비제한적인 일례로서 제시된, 주변세포질 분비 리더에 융합된 서열 번호 3의 CSP 아미노산 서열을 코딩하는 최적화된 뉴클레오티드 서열(서열 번호 5). C. 비제한적인 일례로서 제시된, 주변세포질 분비 리더에 융합된 CSP를 코딩하는 최적화된 뉴클레오티드 서열(서열 번호 6).
도 4. 다양한 양의 환원제 첨가 이후의 이량체 rCSP 의 RP - HPLC 분석. A. DTT 농도 0.5 mM, 0.1 mM, 0.03 mM, 및 DTT 무함유. B. DTT 농도 0.01 mM, 0.003 mM, 및 DTT 무함유.
도 5. 탈응집화된 rCSP 의 RP - HPLC 분석. A. 2 M 우레아 및 다양한 양의 DTT(pH 7.2)로 처리. B. 2 M 우레아 및 다양한 양의 DTT(pH 8.0)로 처리.
도 6. 온화한 환원 처리 및 최종 완충제 교환 전후의 rCSP 의 RP - HPLC 분석. A. 온화한 환원 처리 이전의 배치 533-241의 RP-HPLC 분석. B. 온화한 환원 처리 및 최종 TFF 완충제 교환 이후의 배치 533-241의 RP-HPLC 분석. C. 내부 참조 표준 533-191의 RP-HPLC.
도 7. 온화한 환원 처리 및 최종 완충제 교환 이후의 rCSP 의 SE - HPLC 분석. A. 온화한 환원 처리 및 최종 TFF 완충제 교환 이후의 배치 533-241의 SE-HPLC 분석. B. 내부 참조 표준 533-191의 SE-HPLC.
도 8. 이량체 형태의 rCSP 의 공정 중 RP - HPLC 검출. A. 소수성 상호작용 크로마토그래피에 의한 rCSP 단량체 및 이량체 분리. B. 단량체 및 이량체 rCSP 분획의 SDS-CGE 분석(환원된 것). C. 단량체 및 이량체 rCSP 분획의 SDS-CGE 분석(비환원된 것). D. 단량체 및 이량체 rCSP 풀의 RP-HPLC 분석.
도 9. rCSP 에 대한 다중 각도 레이저 광 산란을 이용한 크기 배제 HPLC 방법. A. MALS 검출을 이용한 rCSP 내부 참조 표준(배치 533-191)의 SE-HPLC 크로마토그램. B. MALS 검출을 이용한 우혈청 알부민(BSA) 표준의 SE-HPLC 크로마토그램.
도 10. 응집화된 형태 및 이량체 형태의 rCSP 의 크기 배제 HPLC 분석. A. 원심분리 농축 이후 rCSP 시료의 SE-HPLC 크로마토그램. B. 응집화된 배치 533-128의 SE-HPLC 크로마토그램.
도 11. 헤파린 결합에 대한 rCSP 의 바이오층 간섭법( BLI ) 분석. A. 헤파린 바이오센서 입체배치. B. 다양한 rCSP 조제물에 대한 헤파린 결합의 BLI 분석. C. rCSP 결합률 비교.
도 12. rCSP 의 모세관 등전 포커싱 ( cIEF ) 분석. 시료를 2 M 우레아 및 10 mM DTT의 존재하에서 1 h 동안 인큐베이션시킨 후, ~1.5 mg/mL로 농축시켰다. A. rCSP 533-191 내부 참조의 분석. B. cIEF 정밀도 평가; 배치 533-191의 5회 반복 주입의 전기영동도 오버레이.
도 13. rCSP 의 원 UV 원평광 이색성 분석. 장치: 자스코(Jasco) 815; 온도 = 20℃; 스캔 속도 = 100 nm/min; D.I.T. = 1 sec; 데이터 피치 = 1 nm; 축적 = 5. A. 533-191 내부 참조 표준의 CD 스펙트럼. B. 소프트웨어 분석: 입력 스펙트럼 대 예측 스펙트럼.
도 14. LC - MS 에 의한 조제물 533-191의 온전한 질량 분석(환원된 것(A-C) 및 비환원된 것(D-F)). A. 환원된 시료의 크로마토그램(UV, 상부 패널; 및 MS TIC (질량 스펙트럼 총 이온 전류, 하부 패널)). B. 18.1 min의 표적 피크 영역으로부터 합산된 질량 스펙트럼. C. 18.1 min. 영역의 합산된 질량 스펙트럼으로부터 도출된 데콘볼루션된 스펙트럼. D. 비환원된 시료의 크로마토그램. E. 17.8 min의 표적 피크 영역으로부터 합산된 질량 스펙트럼. F. 17.8 min. 영역의 합산된 질량 스펙트럼으로부터 도출된 데콘볼루션된 스펙트럼. 환원된 시료 및 비환원된 시료에 대한 MW 관측치와 MW 이론치의 차(Δ MW)는 각각 1 및 4 Da이었다.
도 15. LC - MS 에 의한 알킬화된 533 시료의 온전한 질량 분석. 알킬화된 시료에 대한 데콘볼루션된 스펙트럼이 제시되어 있다. A. 알킬화된 비환원된 533-191은 하나의 시스테인 알킬화를 포함하는 533의 MW 이론치와 비교하여 Δ가 6.0 Da인 것으로 관찰되었다. B. 환원되고 알킬화된 533-191은 5개의 시스테인 알킬화를 포함하는 533의 MW 이론치와 비교하여 Δ가 3.9 Da인 것으로 관찰되었다. 4개의 시스테인 알킬화를 포함하는 533과 상관관계가 있고, 총 ~43%의 존재비로 존재하는 추가 종이 존재하였다. 상기 관찰결과는 불완전한 알킬화에 기인할 가능성이 가장 컸다.
도 16. 비환원된 Glu -C 분해 수행 후, LC - MS / MS 에 의한 533-191의 N 말단 시스테인의 분석. A. 방법 섹션에 기술된 바와 같이 생성된 데이터를 바이오파마링크스(BiopharmaLynx)로 프로세싱하였다. 중심이 있는(centroided) MS 크로마토그램 중 줌된 부분은 (가장 N 말단 쪽의, 첫번째 시스테인 C1을 함유하는) Glu-C 펩티드 E2*(서열 번호 110) 확인을 보여주며, 이는 알킬화(* 표시)된 것임을 나타낸다. B. 동일의 중심이 있는 MS 크로마토그램 중 줌된 다른 부분은 Glu-C 생성 이황화 결합된 E1-E2:E1-E2 디펩티드(서열 번호 111로서 개시된 코어 서열)의 확인을 보여주는 것이다. E1-E2는 펩티드내 글루탐산 잔기에서의 결손 절단을 나타낸다.
도 17. 환원 및 알킬화된 533-128의 펩티드 지도화. A. Asp-N 분해물의 바이오파마링크스 분석에 대한 서열 커버율(서열 번호 3)(75.4%. B. 트립신 분해물의 바이오파마링크스 분석에 대한 서열(서열 번호 3) 커버율(56.9%. 보라색 텍스트의 아미노산은 신원을 나타낸다. 회백색 텍스트는 신원을 나타내지 않는다. 청록색으로 강조표시된 시스테인은 시험관내에서 확인된 알킬화된 시스테인 잔기를 나타낸다. 황색으로 강조표시된 N/Q 잔기는 확인된 탈아미드화를 나타낸다. 상기 탈아미드화는 가변적으로 검색되었고, 따라서, 신원만이 단독으로는 상기 잔기들 각각이 어느 수준으로 탈아미드화되었는지를 나타내지는 못한다. 일부는 실제로 오류 신원일 수 있고, 상기 탈아미드 확인을 위해서는 추가 분석이 요구된다. C. Asp-N 분해물에 대해 확인된 펩티드와 관련된 피크를 보여주는 LC-MS 크로마토그램. D. Asp-N 분해물에 대해 확인된 펩티드와 관련된 피크를 보여주는 LC-MS 크로마토그램.
도 18. 바이오파마링크스 소프트웨어에 의해 확인되지 못한 큰 펩티드의 수동식 확인. 각 피크로부터의 MS 스펙트럼을 데콘볼루션을 사용하여 합산하고,데콘볼루션시켰다. A. 29.1 min. 피크로부터의 데콘볼루션된 스펙트럼. 펩티드 179-267(a.a.)의 경우, MW 이론치(8,971.15 Da)로부터의 MW 관측치는 0.9 Da이었다. B. 30.5 min. 피크로부터의 데콘볼루션된 스펙트럼. 펩티드 107-178(aa)의 경우, MW 이론치(7,178.19 Da)로부터의 MW 관측치는 3.8 Da이었다.
도 19. 배치 533-406에 대한 TMAE HiCap 크로마토그래피. A. 크로마토그램 및 칼럼 전개 조건. B. SDS-CGE 겔 유사 영상 분석 분획.
도 20. 배치 533-407에 대한 TMAE HiCap 크로마토그래피. A. 크로마토그램 및 칼럼 전개 조건. B. SDS-CGE 겔 유사 영상 분석 분획.
도 21. 배치 533-406에 대한 세라믹 HA I형 크로마토그래피. A. 크로마토그램 및 칼럼 전개 조건. B. SDS-CGE 겔 유사 영상 분석 분획.
도 22. 배치 533-407에 대한 세라믹 HA I형 크로마토그래피. A. 크로마토그램 및 칼럼 전개 조건. B. SDS-CGE 겔 유사 영상 분석 분획.
도 23. 통합된 정제 런의 SDS - PAGE. 재조합 CSP 배치 533-406 및 533-407을 MOPS 완충제와 함께 10% 비스-트리스를 이용하여 SDS-PAGE에 의해 분석하였다; MW = 분자량 마커; L = 칼럼 로드; Elut = 칼럼 용리 시료; 최종 = 최종 정제된 rCSP.
도 24. 통합된 정제 런의 웨스턴 블롯 분석. 입체형태 특이 4C2 항체를 이용한 웨스턴 블롯에 의해 분석된 재조합 CSP, 배치 533-406, 533-407 및 533-191.
도 25. rCSP 의 크기 배제 HPLC 분석. A. rCSP 배치 533-406의 SE-HPLC 크로마토그램. B. rCSP 배치 533-407의 SE-HPLC 크로마토그램. C. rCSP 참조 533-191의 SE-HPLC 크로마토그램.
도 26. rCSP 의 RP - HPLC 분석. A. rCSP 배치 533-406의 RP-HPLC 크로마토그램. B. rCSP 배치 533-407의 RP-HPLC 크로마토그램. C. rCSP 참조 533-191의 RP-HPLC 크로마토그램.
도 27. rCSP 의 온전한 질량 분석. A. CSP 배치 533-406의 데콘볼루션된 스펙트럼. B. rCSP 배치 533-407의 데콘볼루션된 스펙트럼. C. rCSP 참조 533-191의 데콘볼루션된 스펙트럼.
도 28. rCSP 의 펩티드 지도화 분석. A. rCSP 배치 533-406의 LC/MS GluC 펩티드 지도. B. rCSP 배치 533-407의 LC/MS GluC 펩티드 지도. C. rCSP 참조 533-191의 LC/MS GluC 펩티드 지도.
도 29. rCSP 의 모세관 등전 포커싱 ( cIEF ) 분석. A. rCSP 배치 533-406의 cIEF 분석. B. rCSP 배치 533-407의 cIEF 분석. C. rCSP 참조 533-191의 cIEF 분석.
도 30. rCSP 의 원 UV 원평광 이색성 분석 및 rCSP 의 고유 형광 분석. A. rCSP의 원 UV 원평광 이색성 분석. 장치: 자스코 815; 온도 = 20℃; 스캔 속도 = 100 nm/min; D.I.T. = 1 sec; 데이터 피치 = 0.1 nm; 축적 = 5; 명시된 바와 같은, 533-191(내부 참조), 533-406, 및 533-407의 CD 스펙트럼. B. rCSP의 고유 형광 분석. 측정 모드: Em.스펙트럼; 감도 = 740 V; D.I.T.= 1 sec; 대역폭(Ex)2.00 = nm; 대역폭(Em) = 10 nm; Ex. 파장 = 280 nm; 측정 범위= 295 - 395 nm; 데이터 피치=l nm; 셔터 제어 장치= 오토; CD 검출기= PMT; 축적 = 3; 용매 = PBS; 농도 166 (w/v)%; 온도 증분 20℃. 콘볼루션 폭 25를 이용하여 사비츠키-골레이(Savitzky-Golay) 평활화를 스펙트럼에 적용시켰다. 명시된 바와 같은, 533-191(내부 참조), 533-406, 및 533-407의 형광 스펙트럼.
도 31. rCSP 의 RP - HPLC 분석. 시점 0에서 4℃, pH 7.5에서의 1 mg/ml rCSP의 RP-HPLC는 1-3군 피크를 나타낸다. pE = 피로글루타메이트 함유 숄더.
도 32. 냉동 후 홀드 시간이 고분자량 종에 미치는 효과. 조작 런 1 페이스트 및 공정 유통 페이스트로부터의 냉동 및 해동된 벌크 여액은 냉동 해동 후 홀드 시간(T)의 래더링에 미치는 효과를 보였다. A. 해동 후 유지되지 않은 시료(T = 0). 상단 3개의 화살표로 표시된 고분자량 종 "래더링". 하단 화살표로 표시된 rCSP. B. 해동 후 2.5시간 동안 실온에서 유지된 시료(T = 2.5). C. 해동 후 6시간 동안 실온에서 유지된 시료(T = 6). 모든 패널: 래인 1 = MW 마커; 래인 2 = PRT(-252) 2 ㎛ 여과 이전; 래인 3 = PRT(-445) 2 ㎛ 여과 이후; 래인 3 = ER1(-445) 2 ㎛ 여과 이후.

본 발명의 상세한 설명

본 발명은 재조합 P. 팔시파룸 포자소체 단백질(CSP)을 정제하는, 규모가변적인 신규한 정제 방법을 제공한다. 본 발명의 방법에서, rCSP는 단백질을 변성 및 리폴딩시킬 필요 없이 고수율로 수득된다. 이러한 달성은 적어도 하기 이유: 전장의 CSP는 이량체 및 더 큰 고차 응집체를 형성하는 경향이 있고, CSP 단량체의 N 말단은 빈번하게 분해된다는 이유에서 중요하다. 이량체화는 단량체의 N 말단 인접부의 쌍을 형성하지 않는 시스테인 잔기의 존재와 관련이 있다. 이량체 제거를 위한 종래 시도에서는 이량체를 폐기하거나, 또는 단백질을 변성 및 리폴딩시켜야 했다. 본 발명의 방법을 통해 변성 및 리폴딩시킬 필요 없이 이량체화된 CSP를 이용하는 신규한 방법을 사용함으로써 상기 장애를 극복할 수 있게 된다. 본 방법에서, CSP 이량체를 비변성 조건하에서 정제한 후, 신규한 우선적 환원 조건에 가한다. 상기 우선적 환원 조건은, 각 단량체의 분자내 이황화 결합은 보존시키면서, 분자간 이황화 결합을 환원시켜 단량체로 분리시킨다. 그러므로, 리폴딩될 필요는 없으며, 상기와 같이 수행되지 않았다면 폐기되었을 이량체를 사용하게 됨으로써 생산량은 크게 증가된다. 청구되는 방법의 놀라운 이점은 정제하는 동안 이량체로 유지되었던 rCSP로부터 수득된 CSP 단량체가 N 말단에서 분해되지 않는다는 점이다. 그러므로, 정제된 rCSP의 품질 및 정량, 둘 모두가 본 발명에 의해 크게 개선된다.

실시양태에서, 본 발명의 정제 방법은

1) rCSP 이량체를 포함하는 박테리아 세포 용해물 조제물을 수득하는 단계;

2) rCSP 이량체를 정제하는 단계; 및

3) 정제된 rCSP 이량체에 우선적 환원 조건을 적용하여

고품질 rCSP를 수득하는 단계를 포함한다.

기술된 바와 같이, 우선적 환원 조건은, 각 단량체의 분자내 이황화 결합은 보존시키면서, 분자간 이황화 결합을 환원시켜 단량체로 분리시킨다.

실시양태에서, 정제 방법은 분리된 rCSP 단량체를 추가로 정제하는 단계를 포함한다. 실시양태에서, 숙주 세포 단백질은 크로마토그래피, 예컨대, 소수성 상호작용 크로마토그래피에 의해 rCSP 단량체로부터 제거된다.

실시양태에서, 정제 방법은 완충제 교환에 의하여 우선적 환원 조건에 의해 도입된 환원제를 제거하는 단계를 추가로 포함한다. 본 실시양태에서, 수득된, 분해되지 않은 rCSP 단량체는 응집화된 것이 아니다.

구체적인 실시양태에서, 정제 단계는

a) 세포 용해물 조제물을 가용성 및 불용성 분획으로 분리시키는 단계로서, 여기서, 가용성 분획은 rCSP 이량체를 포함하는 것인 단계; 및

b) 가용성 분획 중의 rCSP 이량체를 숙주 세포 단백질로부터 분리시키는 단계를 포함한다.

실시양태에서, 본 발명은 rCSP HMW 응집체를 형성하지 않고, 우선적 환원 단계 후, 환원제, 탈응집화제 및/또는 다른 원치않는 시약을 제거하는 방법을 추가로 제공한다.

본 발명은 또한 고농도의 rCSP 안정한 액체 제제를 비롯한, rCSP 안정한 액체 제제를 제공한다.

P. 팔시파룸 포자소체 단백질 발현

P. 팔시파룸 포자소체 단백질

P. 팔시파룸 포자소체 단백질(CSP)은 3개의 주요 영역: 헤파린 술페이트 프로테오글리칸에 결합하는 N 말단, 4개의 아미노산으로 된 반복부 영역(NANP), 단백질의 C 말단부의 트롬보스폰딘 유사 I형 반복부 도메인으로 구성된 단량체이다(도 1). 반복부 영역이 길이가 약 21-25 nm이고, 너비가 1.5 nm인, 막대 유사 구조를 형성한다는 것이 구조 연구를 통해 나타났다(문헌 [Plassmeyer, et al., 25 Sept 2009, J. Biol. Chem., vol. 284 no. 39: 26951-26963](상기 문헌은 본원에서 참조로 포함된다)).

CSP 아미노산 및 뉴클레오티드 서열은 본원에서 서열 번호 1-6에, 공개 문헌에, 예컨대, 진뱅크 수탁 번호 CAB38998(단백질) 및 XM_001351086.1(뉴클레오티드)로 개시되어 있다; (문헌 [Hall, N., et al., 2002, Nature 419(6906), 527-531]; 및 미국 특허 번호 제7,722,889호(발명의 명칭: "Plasmodium liver stage antigens")(상기 문헌은 모두 본원에서 참조로 포함된다)). 상기, 및 예컨대, 문헌 [Plassmeyer, et al., 2009]에 기술된 바와 같이, 서열이 매우 유사하고, 구조적 특징이 동일한 다수의 CSP 다형성이 확인되었다.

CSP를 표적화하는 백신 개발은 B 세포 에피토프를 함유하는 중앙 반복부 영역, 및 TSR 도메인, T 세포 에피토프, 및 B 세포 에피토프을 함유하는 C 말단에 주시해 왔다(문헌 [Plassmeyer, et al., 2009], 및 [Rathore and McCutchan, 2000, Proc. Nat. Acad. Sci. vol. 97 no. 15: 8530-35]). 이제, N 말단 영역이 간 세포 부착 및 면역원성에서 중요한 역할을 하고, 헤파린 술페이트를 통해 간 세포와 상호작용하는 에피토프를 함유하는 것으로 밝혀졌다. N 말단 영역 에피토프에 대해 생성된 항체는 스포로조이트 침입 검정에서 억제성인 것으로 밝혀졌다(예컨대, 문헌 [Plassmeyer, et al., 2009]; [Ancsin and Kisilevsky, 2004, J. Biol. Chem. 279: 21824-32]; [Rathore, et al., 2005, J. Biol. Chem. 280: 20524-9]; 및 [Rathore, et al., 2002, J. Biol. Chem. 277: 7092-7098.] 참조). 문헌 [Rathore, et al., 2002]에는 아미노산 잔기 28-33이 수용체 결합에 관여하는 것으로 보고되어 있고, 잠재적으로 T 세포 에피토프를 형성하는 잔기 65-110의 인식은 질환으로부터 보호된다고 문헌 [Bongfen, et al., 2009 (Vaccine 27(2):328-35)]에 보고되어 있다. 그러므로, 백신 연구 및 생산에서 사용하기 위한 N 말단 영역을 포함하는 CSP를 수득하는 것이 우선 순위이다.

CSP는 5개의 시스테인 잔기를 가진다. 한 시스테인 잔기는 도 1 및 2A에 제시되어 있는 바와 같이, (리더를 포함하는) 전장의 아미노산 서열의 25번 위치, N 말단 인접부에 위치한다. 도 2B 및 2C에 제시되어 있는 리더가 없는 서열에서, 상기 시스테인은 각각 25, 6 및 5번 위치에 존재하며, 이는 "C25" 또는 "Cys 25," "C6" 또는 "Cys 6," 또는 "C5" 또는 "Cys 5"로 지칭될 수 있다. 전형적으로, 비변성 CSP 정제 방식으로, 이량체는 상당부의 rCSP를 포함한다. 이량체는 앞서 재조합 박테리아 용해물 중에서 측정된 CSP 중 최대 약 40%로 존재하는 것으로 관찰되었다.

CSP의 N 말단 영역은 2개의 주요 부위를 비롯한, 수개의 특이 부위에서 쉽게 클리핑된다. 사용되는 번호 매김에 따라, 단백질 분해의 한 주요 부위가 C5와 Y6 사이에 존재할 경우, 이를 통해 잔기 1-5가 제거되거나(도 2C의 서열 번호 3에서의 번호 매김 참조), C25와 Y26 사이에 존재할 경우, 이를 통해 잔기 1-25가 제거되거나(도 2A의 서열 번호 1에서의 번호 매김 참조), 또는 C6과 Y7 사이에 존재할 경우, 이를 통해 잔기 1-6이 제거된다(도 2B의 서열 번호 2에서의 번호 매김 참조). 두번째 주요 부위가 V14와 L15 사이에 존재할 경우, 이를 통해 잔기 1-14가 제거되거나(도 2C의 서열 번호 3에서의 번호 매김 참조), 또는 V34와 L35 사이에 존재할 경우, 이를 통해 잔기 1-34가 제거되거나(도 2A의 서열 번호 1에서의 번호 매김 참조), 또는 V15와 L16 사이에 존재할 경우, 이를 통해 잔기 1-15가 제거된다(도 2B의 서열 번호 2에서의 번호 매김 참조). 클리핑이 고수준으로 관찰되는 조제물에서 추가의 클리핑은 잔기 N29/E30 및 S44/L45 사이에서 관찰된다(도 2C의 서열 번호 3에서의 번호 매김 참조).

N 말단에서의 "분해" 또는 "단백질 분해"란 비특이 분해 뿐만 아니라, 특이적인 클리핑도 지칭한다. 분해 및 단백질 분해를 통해 바람직하지 못한 rCSP 종이 생성될 수 있다. N 말단 영역에서 특정 잔기로까지 클리핑되지 않거나, 분해되지 않거나, 또는 단백질 분해되지 않은 CSP는 본원에서 가장 N 말단 쪽에 존재하는 잔기까지는 온전한 것으로 지칭된다. 예를 들어, 클리핑되거나, 비특이적으로 분해되어 잔기 1, 2, 및 3이 제거된 CSP 종은 잔기 4를 포함하며, 이는 잔기 4로 분해된 것으로 및 잔기 4로부터 온전한 것으로 지칭된다. 구체적인 일례로서, 잔기 글루타민 4(Q4)로 분해되고, Q4를 포함하는 종은 잔기 Q4로 분해되고, 잔기 Q4로부터 온전한 것으로 지칭된다. 본 발명의 실시양태에서, 수득된 정제된 rCSP 중 10% 이하는 명시된 잔기 예컨대, 잔기 2-50으로부터 선택되는 잔기로 분해된다. 관련된 실시양태에서, 정제된 rCSP 중 90% 이상이 잔기 1-50으로부터 선택되는 잔기로부터 온전한 것이다. 본 발명의 실시양태에서, 임의의 주어진 정제 단계 이후, 예컨대, HIC 이후 수득된, 또는 최종 rCSP 조제물 중 정제된 rCSP의 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% 이하 또는 잔기 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 및 50으로부터 선택되는 아미노산으로 분해, 클리핑, 또는 단백질 분해되거나, 또는 그러한 것으로 전혀 분해, 클리핑, 또는 단백질 분해되지 않은 것이다. 실시양태에서, 수득된 정제된 rCSP 중 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 이상이 잔기 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 및 50으로부터 선택되는 아미노산으로부터 온전한 것이다.

트롬보스폰딘 유사 I형 반복부(TSR)를 함유하는 C 말단 영역은 4개의 시스테인 잔기를 가진다(예컨대, 도 2A의 CSP 서열의 위치 315, 319, 350, 및 355번, 도 2A의 전장의 서열의 334, 338, 369, 및 374번, 도 2B의 315, 319, 350, 및 355번, 및 도 2C의 314, 318, 349, 및 354번 참조). 도 3C의 번호 매김을 사용한 경우에는 C₃₁₄와 C₃₄₉, 및 C₃₁₈와 C₃₅₄ 사이에서, 또는 도 3B의 번호 매김을 사용한 경우에는 C₃₁₅와 C₃₅₀, 및 C₃₁₉와 C₃₅₅ 사이에서 이황화 결합이 형성된다. C 말단 영역 시스테인 잔기 사이의 이황화 결합 파괴는 CSP의 표적 HepG2 세포에의 결합에 영향을 주는 것으로 보고되었다(문헌 [Rathore, D., and McCutchan, T., 2000, Proc. Nat. Acad. Sci. vol. 97 no. 15: 8530-35]). 전형적으로 수득된 상당부의 이량체화된 또는 응집화된 rCSP를 변성 및 리폴딩시켜야 하는 정제 방식은 C 말단 영역의 적절한 이황화 결합(온전한 이황화 결합)을 회복시켜야 하는 도전 과정에 직면하게 된다.

본 발명의 방법에서, 바람직하지 못한 CSP 이량체는 단백질 변성 없이, 우선적으로 환원됨으로써 CSP 단량체가 생성된다. 본 발명의 실시양태에서, 수득된, 비변성된 정제된 rCSP는 부적절한 이황화 결합을 가지는 CSP를 약 5% 미만으로 포함한다. 부적절한 이황화 결합은, C 말단 영역 중의 두 이황화 결합 중 하나 또는 그 둘 모두가 부적절하게 쌍을 형성하였을 때(예컨대, 시스테인이 잘못된 시스테인과 쌍을 형성하거나, 또는 쌍을 형성하지 않았을 때), 발생한다. 부적절한 이황화 결합은 당업자에게 공지되어 있거나, 또는 본원에 기술되어 있는 임의의 방법을 사용함으로써 평가될 수 있다.

실시양태에서, 임의의 주어진 정제 단계 이후, 예컨대, HIC 이후 수득된, 또는 최종 rCSP 조제물 중 정제된 rCSP는 예컨대, 부적절한 이황화 결합을 가지는 변성된 rCSP를 약 10% 미만, 약 9% 미만, 약 8% 미만, 약 7% 미만, 약 6% 미만, 약 5% 미만, 약 4% 미만, 약 3% 미만, 약 2% 미만, 또는 약 1% 미만으로 포함한다. 부적절한 이황화 결합은 C 말단 영역 중의 두 천연 이황화 결합 중 적어도 하나가 잘못된 쌍을 형성하거나, 또는 쌍을 형성하지 않았을 때에 확인된다. 실시양태에서, 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 이상의 정제된 rCSP가 각각 온전한 이황화 결합을 가진다.

도 2A는 진뱅크 CAB38998로 제공되는 바와 같은, (성숙한 형태의 단백질에는 존재하지 않는) 추정 천연 분비 신호 펩티드, 및 GPI 앵커 영역을 포함하는 전장의 단백질을 보여주는 것이다. 실시양태에서, 본 발명의 방법을 사용하여 수득된, 정제된 rCSP는 GPI 앵커를 포함한다. (Ophorst) 등에 따르면, GPI 앵커 영역 결실은 단백질의 발현 또는 분비를 변경시키지 않으면서, P. 팔시파룸 CSP의 면역원성을 개선시킨다(문헌 [Ophorst, et al., 9 Feb 2007, Vaccine 25(8): 1426-36]). 실시양태에서, GPI 앵커 영역은 포함된다. 실시양태에서, GPI 앵커 영역은 절두되고, 즉, 그의 일부는 존재한다. 본 발명의 방법을 사용하여 정제하는 데 고려되는 CSP의 아미노산 서열의 예는 도 2B 및 도 2C에 제시되어 있다. 도 2B에는 진뱅크 CAB38998의 아미노산 21 내지 382 이외에도 N 말단 메티오닌을 가지는 세포질 종이 도시되어 있다. 도 2C에는 진뱅크 CAB38998의 아미노산 21 내지 382 또한 포함하는, 도 2B의 종에 상응하는 주변세포질 종이 도시되어 있다. 실시양태에서, 분비 리더는 CSP의 주변세포질 분비를 위해 단백질의 N 말단에 융합되어 있다.

도 2A의 CSP는 길이가 397개의 아미노산 길이고, 분자량이 약 42.6 kDa이며, 등전점이 5.37인 단량체이다. 도 2C의 성숙한 형태(즉, 분비 리더가 없는 것, 아미노산 1-20)는 분자량이 약 38.7 kDa이고, 등전점이 5.21인 단백질이다. 분자량은 완전하게 환원되었을 때에는 38725.0 Da이고, 비환원된 경우에는( 2개의 천연 분자내 이황화 결합을 함유하는 경우) 38721.0 Da인 것으로 관찰되었다.

CSP 변이체 및 변형

기술된 바와 같이, 본 발명의 방법을 통해, 단백질의 N 말단 영역에 쌍을 형성하지 않은 시스테인이 존재하는 것에 기인하여 이량체되고, 응집화되는 경향을 비롯한, 앞서 직면해 온 rCSP 정제상의 장애를 극복할 수 있게 된다.

실시양태에서, 본 발명의 방법은 CSP의 임의의 서열 변이체 또는 변형을 정제시키는 데 사용된다. 실시양태에서, 임의의 CSP 변이체 또는 다형체의 정제가 고려되되, 단, 상기 CSP 변이체 또는 다형체는 단백질의 N 말단 영역에 존재하는 쌍을 형성하지 않는 티올 잔기를 포함하는 단량체, 예컨대, 시스테인 사이의 상호작용에 기인하여 이량체화될 경우에 그러하다. CSP 다형성은 상기에서 참조된 예컨대, 문헌 [Rathore, et al., 2005], 및 [Anders, et al., 1989, Polymorphic antigens in Plasmodium falciparum" Blood 74: 1865]에 기술되어 있다. 공개된 문헌에서 개시된 서열로는 예를 들어, 진뱅크 수탁 번호 AAA29555, AAN87594, AAA29554.1, AAA29524.1, AAA63421.1 AC049545.1, 및 AAA63422.1의 단백질 서열을 포함한다.

실시양태에서, 본 발명의 방법을 사용하여 정제될 수 있는 CSP의 이량체화 변이체 또는 변형은 N 말단 영역에, 및 문헌 [Rathore, et al., 2005](레포트에서 사용된 바와 같은 번호 매김)에 기술된 바와 같이, N 말단 영역 에피토프 중 93-113번 위치에 쌍을 형성하지 않은 티올 잔기를 포함한다. 관련된 실시양태에서, CSP의의 이들 이량체화 변이체 또는 변형은 N 말단 영역, 및 N 말단 영역 에피토프 서열 ENDDGNNEDNEKLRKPKHKKL(서열 번호 7) 또는 DKRDGNNEDNEKLRKPKHKKL(서열 번호 8)에 쌍을 형성하지 않는 티올 잔기를 포함한다.

본 발명은 조작된 rCSP 변형 뿐만 아니라, 자연적으로 발생된 다형성의 정제를 고려한다. 변형은 치환, 삽입, 신장, 결실, 및 유도체화를 단독으로, 또는 조합하여 포함한다. 실시양태에서, rCSP는 비필수 아미노산 잔기의 하나 이상의 변형을 포함할 수 있다. 비필수 아미노산 잔기는, 단백질의 활성 또는 기능, 예컨대, 단백질의 면역원성 또는 특이 항체에 결합할 수 있는 그의 능력을 폐지하거나, 또는 실질적으로 감소시키지 않으면서, 신규한 아미노산 서열 중에서 변경될 수 있는, 예컨대, 결실 또는 치환될 수 있는 잔기이다. 실시양태에서, rCSP는 필수 아미노산 잔기의 하나 이상의 변형을 포함할 수 있다. 필수 아미노산 잔기는 신규한 아미노산 서열 중에서 변경, 예컨대, 결실 또는 치환되었을 때, 참조 펩티드의 활성이 실질적으로 감소 또는 폐지되는 잔기이다. 치환, 삽입 및 결실은 rCSP의 임의 영역에 존재할 수 있다. 예를 들어, rCSP는 분자 전역에 걸쳐 연속된 방식으로 또는 이격된 방식으로, 둘 모두로 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 치환을 포함할 수 있다. 단독으로 또는 치환과의 조합으로 rCSP는 다시 펩티드 분자 전역에 걸쳐 연속된 방식으로 또는 이격된 방식으로 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 삽입을 포함할 수 있다. 단독으로 또는 치환 및/또는 삽입과의 조합으로 rCSP는 다시 펩티드 분자 전역에 걸쳐 연속된 방식으로 또는 이격된 방식으로 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 결실을 포함할 수 있다. 단독으로 또는 치환, 삽입 및/또는 결실과의 조합으로 rCSP는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 아미노산 부가를 포함할 수 있다.

치환은 보존적 아미노산 치환을 포함한다. 보존적 아미노산 치환은 아미노산 잔기가, 유사한 측쇄, 또는 유사한 물리화학적 특징(예컨대, 정전기적 특징, 수소 결합, 등전자적 특징, 소수성 특징)을 가지는 아미노산 잔기로 대체되는 치환이다. 아미노산은 자연적으로 또는 비자연적으로 발생된 것일 수 있다. 유사한 측쇄를 가지는 아미노산 잔기의 패밀리는 당업계에 공지되어 있다. 이들 패밀리는 염기성 측쇄(예컨대, 리신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄(예컨대, 아스파르트산, 글루탐산), 비하전된 극성 측쇄(예컨대, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 메티오닌, 시스테인), 비극성 측쇄(예컨대, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 트립토판), 베타 분지형 측쇄(예컨대, 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄(예컨대, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)를 가지는 아미노산을 포함한다. 치환은 또한 비보존적 변이를 포함할 수 있다.

"아미노산" 또는 "아미노산 잔기"라는 용어는 천연 아미노산, 비천연 아미노산, 및 변형된 아미노산을 지칭한다. 달리 언급되지 않는 한, 아미노산이라고 언급되는 것은 그의 구조가 D 및 L 입체이성질체 형태 중 하나를 허용할 경우, D 및 L 입체이성질체, 둘 모두를 지칭하는 것을 포함한다. 천연 아미노산으로는 알라닌(Ala), 아르기닌(Arg), 아스파라긴(Asn), 아스파르트산(Asp), 시스테인(Cys), 글루타민(Gin), 글루탐산(Glu), 글리신(Gly), 히스티딘(His), 이소류신(He), 류신(Leu), 리신(Lys), 메티오닌(Met), 페닐알라닌(Phe), 프롤린(Pro), 세린(Ser), 트레오닌(Thr), 트립토판(Trp), 티로신(Tyr) 및 발린(Val)을 포함한다. 비천연 아미노산으로는 호모리신, 호모아르기닌, 호모세린, 아제티딘카복실산, 2-아미노아디프산, 3-아미노아디프산, 베타 알라닌, 아미노프로피온산, 2-아미노부티르산, 4-아미노부티르산, 6-아미노카프로산, 2-아미노헵탄산, 2-아미노이소부티르산, 3-아미노이소부티르산, 2-아미노피멜산, 3급 부틸글리신, 2,4-디아미노이소부티르산, 데스모신, 2,2'-디아미노피멜산, 2,3-디아미노프로피온산, N-에틸글리신, N-에틸아스파라긴, 호모프롤린, 하이드록시리신, 알로-하이드록시리신, 3-하이드록시프롤린, 4-하이드록시프롤린, 이소데스모신, 알로-이소류신, N-메틸알라닌, N-메틸글리신, N-메틸이소류신, N-메틸펜틸글리신, N-메틸발린, 나프트알라닌, 노르발린, 노르류신, 오르니틴, 펜틸글리신, 피페콜린산, 피로글루타메이트, 및 티오프롤린을 포함한다. 이에 한정되지 않는다. 추가의 비천연 아미노산으로는 예를 들어, N-메틸화된 D 및 L 아미노산과 같이, 그의 N 말단 아미노 기 또는 그의 측쇄 기 상에서 화학적으로 차단, 가역적으로 또는 비가역적으로, 또는 화학적으로 변형된, 변형된 아미노산 잔기 또는 측쇄 작용기가 또 다른 측쇄 작용기로 화학적으로 변형된 잔기를 포함한다. 예를 들어, 변형된 아미노산으로는 메티오닌 술폭시드; 메티오닌 술폰; 아스파르트산의 변형된 아미노산인, 아스파르트산-(베타-메틸 에스테르); 글리신의 변형된 아미노산인 N-에틸글리신; 또는 알라닌의 변형된 아미노산인 알라닌 카복스아미드를 포함한다. 혼입될 수 있는 추가의 잔기는 문헌 [Sandberg et al. (1998) J. Med. Chem. 41:2481-2491]에 기술되어 있다.

당업계에서 이해되는 바와 같이, 서열 동일성은 서열 비교에 의해 측정되는 바와 같은, 둘 이상의 폴리펩티드 서열 또는 둘 이상의 폴리뉴클레오티드 서열 사이의 관계이다. 당업계에서 동일성이란, 이는 또한 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 서열 스트링 사이의 매치에 의해 측정되는 바와 같은, 상기 서열들 간의 서열 관계 정도를 의미할 수 있다. 동일성은 문헌 [Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ed., Oxford University Press, New York (1988)]; [Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, New York, 1993]; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A. M. and Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey (1994)]; [Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press (1987)]; [Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., Stockton Press, New York (1991)]; 및 [Carillo, H., and Lipman, D., SIAM J Applied Math, 48: 1073 (1988)]에 기술되어 있는 것을 포함하나, 이에 한정되지 않는 공지 방법에 의해 계산될 수 있다. 동일성 측정 방법은 테스트되는 서열 사이에 매치가 가장 크도록 디자인된다. 또한, 동일성 측정 방법은 공개적으로 이용가능한 프로그램으로 체계화되어 있다. 두 서열 간의 동일성을 측정하는 사용될 수 있는 컴퓨터 프로그램으로는 GCG (문헌 [Devereux et al. (1984) Nucleic Acids Research 12:387]; 뉴클레오티드 서열 질의용으로 디자인된 3가지(BLASTN, BLASTX, 및 TBLASTX) 및 단백질 서열 질의용으로 디자인된 2가지(BLASTP 및 TBLASTN)로 이루어진 5가지의 BLAST 프로그램 묶음)(문헌 [Coulson (1994) Trends in Biotechnology 12:76-80]; [Birren et al. (1997) Genome Analysis 1 :543-559])를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. BLAST X 프로그램은 NCBI 및 다른 공급처로부터 공개적으로 이용가능하다(문헌 [BLAST Manual, Altschul, S., et al., NCBI NLM NIH, Bethesda, Md. 20894]; [Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410]). 스미스 워터맨(Smith Waterman) 알고리즘 또한 동일성을 측정하는 데 사용될 수 있다.

실시양태에서, 변이체 rCSP는 서열 번호 1(도 2A에 제시), 서열 번호 2(도 2B에 제시), 또는 서열 번호 3(도 2C에 제시)에 기재되어 있는 서열과 약 90% 이상의 이상, 약 91% 이상, 약 92% 이상, 약 93% 이상, 약 94% 이상, 약 95% 이상, 약 96% 이상, 약 97% 이상, 약 98% 이상, 또는 약 99% 이상 동일한 아미노산 서열을 가진다. 실시양태에서, 변이체 rCSP는 서열 번호 4(도 3A에 제시) 또는 서열 번호 5(도 3B에 제시)에 기재되어 있는 서열과 약 85% 이상, 약 86% 이상, 약 87% 이상, 약 88% 이상, 약 89% 이상, 약 90% 이상, 약 91% 이상, 약 92% 이상, 약 93% 이상, 약 94% 이상, 약 95% 이상, 약 96% 이상, 약 97% 이상, 약 98% 이상, 또는 약 99% 이상 동일한 핵산 서열에 의해 코딩된다.

P. 팔시파룸 포자소체 단백질 발현

본 발명의 방법은 박테리아 과다발현 시스템에서 생산된 재조합 P. 팔시파룸 포자소체 단백질의 정제를 고려한다. 재조합 단백질을 코딩하는 유전자를 발현 벡터로 코딩하는 방법, 박테리아 숙주 세포를 상기 발현 벡터로 형질전환시키는 방법, 및 재조합 CSP를 발현하는 데 적합하는 조건하에서 형질전환된 숙주 세포를 성장시키는 방법은 당업자의 지식 범위 내에 포함되어 있다. 적합한 방법은 또한 본원에 기술되어 있고, 문헌에 기술되어 있다.

슈도모나스 숙주 세포 뿐만 아니라, 본 발명의 방법에서 유용한 다른 숙주 세포에서, 유용한 조절 서열(예컨대, 프로모터, 분비 리더, 및 리보솜 결합 부위)을 비롯한, 이종성 단백질을 발현하는 방법은 예컨대, 미국 특허 출원 공개 번호 2008/0269070 및 2010/0137162(둘 모두의 발명의 명칭: "Method for Rapidly Screening Microbial Hosts to Identify Certain Strains with Improved Yield and/or Quality in the Expression of Heterologous Proteins"), 미국 특허 출원 공개 번호 2006/0040352(발명의 명칭: "Expression of Mammalian Proteins in Pseudomonas Fluorescens") 및 미국 특허 출원 공개 번호 2006/0110747(발명의 명칭: "Process for Improved Protein Expression by Strain Engineering")(상기 특허들은 모두 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다)에 기술되어 있다. 상기 공개 문헌들에는 또한, 이종성 단백질 발현을 증가시키기 위해 숙주 균주가 폴딩 조절 인자를 과다발현하도록 조작된, 또는 프로테아제 돌연변이가 도입되어 있는, 본 발명의 방법을 실시하는 데 유용한 박테리아 숙주 균주가 기술되어 있다.

조절 요소

본 발명의 방법을 실시하는 데 유용한 발현 구성체는 단백질 코딩 서열 이외에도, 그에 작동가능하게 연결된 하기 조절 요소들: 프로모터, 리보솜 결합 부위(RBS), 전사 종결 인자, 및 번역 출발 및 정지 신호, 전사 인핸서 서열, 번역 인핸서 서열, 다른 프로모터, 활성 인자, 시스트론성 조절 인자, 폴리시스트론성 조절 인자, 발현된 폴리펩티드의 확인, 분리, 정제 및/또는 단리를 촉진시키는 태그 서열, 예컨대, 뉴클레오티드 서열 "태그들" 및 "태그" 폴리펩티드 코딩 서열 중 임의의 것을 포함할 수 있다.

유용한 RBS는 예컨대, 미국 특허 출원 공개 번호 2008/0269070 및 미국 특허 출원 공개 번호 2010/0137162에 따라 발현 시스템에서 숙주 세포로서 유용한 종들 중 임의의 것으로부터 수득될 수 있다. 다수의 특이적이고, 다양한 컨센서스 RBS, 예컨대, 문헌 [D. Frishman et al., Gene 234(2):257-65 (8 Jul. 1999)]; 및 [B. E. Suzek et al., Bioinformatics 17(12): 1123-30 (December 2001)]에 기술되어 있고, 그를 참조로 포함하는 것이 공지되어 있다. 추가로, 천연 또는 합성 RBS, 예컨대, EP 0207459에 기술되어 있는 것(합성 RBS); 문헌 [O. Ikehata et al., Eur. J. Biochem. 181(3):563-70 (1989)]에 기술되어 있는 것(천연 RBS 서열 AAGGAAG)이 사용될 수 있다. 방법, 벡터, 번역 및 전사 요소, 및 본 발명에서 유용한 다른 욘소에 관한 추가의 예는 예컨대, 미국 특허 번호 제5,055,294호(Gilroy) 및 미국 특허 번호 제5,128,130호(Gilroy 등); 미국 특허 번호 제5,281,532호(Rammler 등); 미국 특허 번호 제4,695,455호 및 제4,861,595호(Barnes 등); 미국 특허 번호 제4,755,465호(Gray 등); 및 미국 특허 번호 제5,169,760호(Wilcox)(상기 특허들은 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다)에 기술되어 있다.

리더

실시양태에서, 분비 리더를 코딩하는 서열은 CSP를 코딩한 서열에 융합되어 있다. 실시양태에서, 분비 리더는 주변세포질 분비 리더이다. 실시양태에서, 분비 리더는 천연 분비 리더이다.

실시양태에서, 가용성 단백질은 생산 동안 세포의 세포질 또는 주변세포질에 존재한다. 이종성 단백질 발현을 최적화시키는 데에서 분비 신호 펩티드 또는 리더를 선별 및 사용하는 방법은 예컨대, 미국 특허 번호 제7,618,799호(발명의 명칭: "Bacterial leader sequences for increased expression") 및 미국 특허 번호 제7,985,564호(발명의 명칭: "Expression systems with Sec-secretion")(상기 두 특허 모두 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다) 뿐만 아니라, 상기에서 참조된 미국 특허 출원 공개 번호 2008/0269070 및 2010/0137162에 상세하게 기술되어 있다. 하기 표 1에는 본 발명의 방법과 관련하여 사용이 고려되는 분비 리더 서열의 비제한적인 예가 제공되어 있다.

실시양태에서, 사용되는 분비 리더는 LAO, pbp, pbpA20V, 또는 cupA2이다. 구체적인 실시양태에서, LAO 분비 리더가 사용된다.

프로모터

본 발명에 따라 정제되는 rCSP를 발현하는 데 사용되는 프로모터는 구성적 프로모터 또는 조절형 프로모터일 수 있다. 이종성 단백질의 발현을 조절하는 데 유용한 프로모터를 선택하는 방법은 당업계에 주지되어 있고, 문헌에 광범위하게 기술되어 있다. 유용한 조절형 프로모터의 일반 예로는 미국 특허 번호 제4,551,433호(DeBoer)에 기술되어 있는 tac 및 trc 프로모터 뿐만 아니라, Ptacl6, Ptacl7, PtacII, PlacUV5, 및 T71ac 프로모터를 비롯한, lac 프로모터로부터 유도된 패밀리의 것(즉, lacZ 프로모터)을 포함한다. 한 실시양태에서, 프로모터는 숙주 세포 유기체로부터 유래된 것이 아니다. 실시양태에서, 프로모터는 E. 콜라이(E. coli) 유기체로부터 유래된 것이다.

본 발명의 방법에 따라 CSP의 발현을 조절하는 데 유도성 프로모터 서열이 사용될 수 있다. 실시양태에서, 본 발명의 방법에 유용한 유도성 프로모터로는 lac 프로모터로부터 유도된 패밀리의 것(즉, lacZ 프로모터), 특히, 미국 특허 번호 제4,551,433호(DeBoer)에 기술되어 있는 tac 및 trc 프로모터 뿐만 아니라, Ptacl6, Ptacl7, PtacII, PlacUV5, 및 T71ac 프로모터를 포함한다. 한 실시양태에서, 프로모터는 숙주 세포 유기체로부터 유래된 것이 아니다. 특정 실시양태에서, 프로모터는 E. 콜라이 유기체로부터 유래된 것이다.

본 발명에 따라 발현 시스템에서 유용한 비lac형 프로모터의 일반 예로는 예컨대, 하기 표 2에 열거되어 있는 것을 포함한다.

예컨대, 문헌 [J. Sanchez-Romero & V. De Lorenzo (1999) Manual of Industrial Microbiology and Biotechnology (A. Demain & J. Davies, eds.) pp. 460-74 (ASM Press, Washington, D.C.)]; [H. Schweizer (2001) Current Opinion in Biotechnology, 12:439-445]; 및 [R. Slater & R. Williams (2000 Molecular Biology and Biotechnology (J. Walker & R. Rapley, eds.) pp. 125-54 (The Royal Society of Chemistry, Cambridge, UK))]를 참조할 수 있다. 선택된 박테리아 숙주 세포에 고유한 프로모터의 뉴클레오티드 서열을 가지는 프로모터, 예컨대, 슈도모나스 안트라닐레이트 또는 벤조에이트 오페론 프로모터 (Pant, Pben), 또한 표적 폴리펩티드를 코딩하는 트랜스진의 발현을 제어하는 데 사용될 수 있다. 서열이 동일하든, 또는 상이하든 상관없이, 1 초과의 프로모터가 서로 공유적으로 부착되어 있는 탠덤 프로모터, 예컨대, Pant-Pben 탠덤 프로모터(프로모터간 하이브리드) 또는 Plac-Plac 탠덤 프로모터, 또는 동일한 유기체로부터 유래되든 또는 상이한 유기체로부터 유래되든 상관없는 것 또한 사용될 수 있다.

조절형 프로모터는 프로모터가 유전자의 일부인 것인 유전자의 전사를 제어하기 위해 프로모터 조절 단백질을 사용한다. 본원에서 조절형 프로모터가 사용되는 경우, 상응하는 프로모터 조절 단백질 또한 본 발명에 따른 발현 시스템의 일부가 될 것이다. 프로모터 조절 단백질의 예로는 활성 인자 단백질, 예컨대, E. 콜라이 이화 대사산물 활성 인자 단백질, MalT 단백질; AraC 패밀리 전사 활성 인자; 억제 인자 단백질, 예컨대, E. 콜라이 LacI 단백질; 및 이중 기능 조절 단백질, 예컨대, E. 콜라이 NagC 단백질을 포함한다. 다수의 조절형 프로모터/프로모터-조절-단백질 쌍은 당업계에 공지되어 있다. 한 실시양태에서, 관심의 대상이 되는 표적 단백질(들) 및 이종성 단백질에 대한 발현 구성체는 동일한 조절 요소의 제어하에 있다.

프로모터 조절 단백질은 효과기 화합물, 즉, 단백질이 프로모터의 제어하에 있는 유전자의 1종 이상의 DNA 전사 조절 영역으로부터 유리되거나, 또는 그에 결합함으로써 유전자의 전사를 개시할 때 트랜스크립타제 효소의 작용을 허용하거나, 차단할 수 있도록 하기 위해 조절 단백질과 가역적으로 또는 비가역적으로 회합하는 화합물과 상호작용한다. 효과기 화합물은 유도 인자 또는 보조 억제 인자로 분류되고, 이들 화합물은 천연 효과기 화합물 및 무상 유도 인자 화합물. 다수의 조절형 프로모터/프로모터-조절-단백질/효과기 화합물 트리오가 당업계에 공지되어 있다. 비록 효과기 화합물이 세포 배양 또는 발효 전역에 걸쳐 사용될 수 있기는 하지만, 조절형 프로모터가 사용되는 바람직한 실시양태에서, 원하는 양 또는 밀도의 숙주 세포 바이오매스 성장 후, 적절한 효과기 화합물을 배양물에 직접 또는 간접적으로 첨가함으로써 관심의 대상이 되는 단백질 또는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자(들)을 발현시킬 수 있다.

lac 패밀리 프로모터가 사용되는 실시양태에서, lacI 유전자 또한 상기 시스템 중에 존재할 수 있다. 보통 구성적으로 발현되는 유전자인 lacI 유전자는 lac 패밀리 프로모터의 lac 오퍼레이터에 결합하는 Lac 억제 인자 단백질 LacI 단백질을 코딩한다. 따라서, lac 패밀리 프로모터가 사용되는 경우, lacI 유전자 또한 발현 시스템에 포함될 수 있고, 발현될 수 있다.

슈도모나스에서 유용한 프로모터 시스템은 문헌, 예컨대, 상기에서 언급된 미국 특허 출원 공개 번호 2008/0269070에 기술되어 있다.

숙주 세포

본 발명의 방법은 슈도모나드 및 E. 콜라이 숙주 세포를 포함하나, 이에 한정되지 않는 임의의 박테리아 숙주 세포 발현 시스템에서 발현된 rCSP를 정제하는 데 사용될 수 있다. 실시양태에서, rCSP는 슈도모나드 또는 밀접한 관계가 있는 박테리아 유기체에서 발현된다. 특정 실시양태에서, 슈도모나드 숙주 세포는 슈도모나스 플루오레센스이다. 실시양태에서, 숙주 세포는 E. 콜라이, 바실러스 섭틸러스(Bacillus subtilus), 또는 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida)이다. 본 발명의 방법을 실시하는 데 유요한 박테리아 숙주 세포 및 구성체는 당업계에 공지되고, 문헌, 예컨대, 미국 특허 출원 공개 번호 2009/0325230(발명의 명칭: "Protein Expression Systems")(상기 특허 출원은 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다)에 기술되어 있는 시약 및 방법을 사용함으로써 확인되거나, 제조될 수 있다. 상기 공개 문헌에는 염색체 lacI 유전자 삽입체를 포함하는 영양요구성 슈도모나스 플루오레센스 숙주 세포 내로 핵산 구성체를 도입함으로써 재조합 폴리펩티드를 제조하는 것이 기술되어 있다. 핵산 구성체는 숙주 세포에서 핵산의 발현을 지시할 수 있는 프로모터에 작동가능하게 연결된, 재조합 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 이는 또한 영양요구성 선별 마커를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 영양요구성 선별 마커는 영양요구성 숙주 세포에 독립영양성을 복원시키는 폴리펩티드이다. 실시양태에서, 세포는 프롤린, 우라실, 또는 그의 조합에 대해 영양요구성이다. 실시양태에서, 숙주 세포는 당업자에게 공지되어 있고, 과학 문헌에 기술되어 있는 방법을 사용하여 MB101(ATCC 기탁 PTA-7841)로부터 유래된 것이다. 예를 들어, 미국 특허 출원 공개 번호 2009/0325230, 및 문헌 [Schneider, et al., 2005, "Auxotrophic markers pyrF and proC can replace antibiotic markers on protein production plasmids in high-cell-density Pseudomonas fluorescens fermentation," Biotechnol. Progress 21(2): 343-8](상기 두 문헌 모두 그 전문이 본원에 참조로 포함된다)에는 균주 MB101에서 pyrF 유전자를 결실시킴으로써 제조된, 우라실에 대해 영양요구성인 생산 숙주 균주가 기술되어 있다. pyrF 유전자가 균주 MB214(ATCC 기탁 PTA-7840)로부터 클로닝되었고, 이로써, pyrF 결실을 보완하여 독립영양성을 복원시킬 수 있는 플라스미드가 생성되었다.

특정 실시양태에서, P. 플루오레센스 숙주 세포에서 이중 PyrF-ProC 이중 영양요구성 선별 마커 시스템이 사용된다. 기술된 바와 같은 PyrF 생산 숙주 균주는 본 발명의 방법을 실시하는 데 유용한 것으로 본원에 기술된 것을 비롯한, 다른 원하는 게놈 변이를 도입하기 위한 배경으로서 사용될 수 있다. 실시양태에서, P. 플루오레센스 숙주 균주는 유전자형 ΔpyrF, lacI^Q, 및 ΔhtpX를 가지는 PyrF 생산 숙주 균주이다. 실시양태에서, lacI^Q는 lvs 유전자에 삽입된다(lvs:lacIQ1).

실시양태에서, 바이오바르(biovar) 1 균주 MB101로부터 유래된 P. 플루오레센스 숙주 균주 DC469(ΔpyrF, lacI^Q, 및 ΔhtpX)는 본 발명의 방법에서 유용한 rCSP를 제조하는 데 사용된다. 균주 DC469에서, lacI^Q는 lvs 유전자에 삽입된다(lvs:lacIQ1). lacI^Q 삽입은 통상 당업자에게 공지되어 있는 바와 같이, 다양한 적절한 위치 주 임의 위치에서 이루어진다.

실시양태에서, 숙주 세포는 슈도모나달레스(Pseudomonadales) 목의 것이다. 숙주 세포가 슈도모나달레스 목의 것인 경우, 슈도모나스 속을 비롯한, 슈도모나다세에(Pseudomonadaceae) 과의 구성원일 수 있다. 감마 프로테오박테리아 숙주로는 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) 종의 구성원, 및 슈도모나스 플루오레센스 종의 구성원을 포함한다.

다른 슈도모나스 유기체 또한 유용할 수 있다. 슈도모나드 및 밀접한 관계가 있는 종으로는 문헌 ["Gram-Negative Aerobic Rods and Cocci" by R. E. Buchanan and N.E. Gibbons (eds.), Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, pp. 217-289 (8th ed., 1974) (The Williams & Wilkins Co., Baltimore, Md., USA)]에 기술되어 있는 과 및/또는 속에 속하는 프로테오박테리아 군을 포함하는, 그람 음성 종의 구성원 서브군 1을 포함한다. 하기 표 3에는 유기체의 상기 과 및 속이 제시되어 있다.

슈도모나스 및 밀접한 관계가 있는 박테리아는 일반적으로 "그람(-) 프로테오박테리아 아군 1" 또는 "그람 음성 호기성 간균 및 구균"(문헌 [Buchanan and Gibbons (eds.) (1974) Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, pp. 217-289])으로 정의되는 군의 일부이다. 슈도모나스 숙주 균주는 문헌, 예컨대, 상기 인용된 미국 특허 출원 공개 번호 2006/0040352에 기술되어 있다.

"그람 음성 프로테오박테리아 아군 1"은 또한 분류에 따라 사용된 기준에 따라 상기 표제에서 분류된 바와 같은 프로테오박테리아를 포함한다. 표제는 또한 이전에 상기 섹션으로 분류되었지만, 더 이상은 그렇지 않은 군, 예컨대, 아시도보락스(Acidovorax), 브레분디모나스(Brevundimonas), 부르크홀데리아(Burkholderia), 하이드로게노파가(Hydrogenophaga), 오세아니모나스(Oceanimonas), 랄스토니아(Ralstonia), 및 스테노트로포모나스(Stenotrophomonas) 속, 크산토모나스(Xanthomonas) 속에 속하는 유기체(및 이전에 지칭된 종)를 재분류함으로써 구성된, 스핀고모나스(Sphingomonas) 속(및 그로부터 유래된 블라스토모나스(Blastomonas) 속), 문헌 [Bergey (1974)]에 정의된 아세토박터 속에 속하는 유기체를 재분류함으로써 구성된 아시도모나스(Acidomonas) 속을 포함한다. 추가로, 슈도모나스 속, 슈도모나스 에날리아(Pseudomonas enalia)(ATCC 14393), 슈도모나스 니그리파시엔스(Pseudomonas nigrifaciens)(ATCC 19375), 및 슈도모나스 푸트레파시엔스(Pseudomonas putrefaciens)(ATCC 8071)(이는 각각 알테로모나스 할로플란크티스(Alteromonas haloplanktis), 알테로모나스 니그리파시엔스(Alteromonas nigrifaciens), 및 알테로모나스 푸트레파시엔스(Alteromonas putrefaciens)로 재분류되었다)로부터의 세포를 포함할 수 있다. 유사하게, 예컨대, 슈도모나스 아시도보란스(Pseudomonas acidovorans)(ATCC 15668) 및 슈도모나스 테스토스테로니(Pseudomonas testosteroni)(ATCC 11996)는 각각 코마모나스 아시도보란스(Comamonas acidovorans) 및 코마모나스 테스토스테로니(Comamonas testosteroni)로 재분류되었고; 슈도모나스 니그리파시엔스(Pseudomonas nigrifaciens)(ATCC 19375) 및 슈도모나스 피스키시다(Pseudomonas piscicida)(ATCC 15057)는 각각 슈도알테로모나스 니그리파시엔스(Pseudoalteromonas nigrifaciens) 및 슈도알테로모나스 피스키시다(Pseudoalteromonas piscicida)로 재분류되었다. "그람 음성 프로테오박테리아 아군 1"은 또한 하기 과 중 임의의 것에 속하는 것으로 분류된 프로테오박테리아를 포함한다: 결과적으로, 상기 속 이외에, 본원에서 달리 기재되지 않는다면, "그람 음성 프로테오박테리아 아군 1" 내에 해당하는 추가의 프로테오박테리아 속은 1) 아조토박터 군 박테리아의 아조르히조필루스(Azorhizophilus) 속; 2) 슈도모나다세아에과 박테리아의 셀비브리오(Cellvibrio), 올리겔라(Oligella), 및 테레디니박터(Teredinibacter) 속; 3) 리조비아세아에 과 박테리아의 셀라토박터(Chelatobacter), 엔시퍼(Ensifer), 리베리박터(Liberibacter)(또한 "칸디다투스 리베리박터(Candidatus Liberibacter)"로도 지칭된다), 및 시노르히조비움(Sinorhizobium) 속; 및 4) 메틸로코카세아에 과 박테리아의 메틸로박터(Methylobacter), 메틸로칼둠(Metlaylocaldum), 메틸로미크로비움(Methylomicrobium), 메틸로사르시나(Methylosarcina), 및 메틸로스파에라(Methylosphaera) 속을 포함한다.

숙주 세포는 "그람 음성 프로테오박테리아 아군 16"으로부터 선택될 수 있다. "그람 음성 프로테오박테리아 아군 16"은 하기 슈도모나스 종(괄호 안에 제시된 것은 예시적인 균주(들)의 ATCC 또는 다른 기탁 번호이다)의 프로테오박테리아 군으로서 정의된다: 슈도모나스 아비에타니필라(Pseudomonas abietaniphila)(ATCC 700689); 슈도모나스 에루기노사(ATCC 10145); 슈도모나스 알칼리게네스(Pseudomonas alcaligenes)(ATCC 14909); 슈도모나스 안구일리세프티카(Pseudomonas anguilliseptica)(ATCC 33660); 슈도모나스 시트로넬롤리스(Pseudomonas citronellolis)(ATCC 13674); 슈도모나스 플라베센스(Pseudomonas flavescens)(ATCC 51555); 슈도모나스 멘도시나(Pseudomonas mendocina)(ATCC 25411); 슈도모나스 니트로레두센스(Pseudomonas nitroreducens)(ATCC 33634); 슈도모나스 올레오보란스(Pseudomonas oleovorans)(ATCC 8062); 슈도모나스 슈도알레알리게네스(Pseudomonas pseudoalealigenes)(ATCC 17440); 슈도모나스 레시노보란스(Pseudomonas resinovorans)(ATCC 14235); 슈도모나스 스트라미네아(Pseudomonas straminea)(ATCC 33636); 슈도모나스 아가리시(Pseudomonas agarici)(ATCC 25941); 슈도모나스 알칼리필라(Pseudomonas alcaliphila); 슈도모나스 알기노보라(Pseudomonas alginovora); 슈도모나스 안데르소니이(Pseudomonas andersonii); 슈도모나스 아스플레니이(Pseudomonas asplenii)(ATCC 23835); 슈도모나스 아젤라이카(Pseudomonas azelaica)(ATCC 27162); 슈도모나스 베이예린키이(Pseudomonas beiyerinckii)(ATCC 19372); 슈도모나스 보레알리스(Pseudomonas borealis); 슈도모나스 보레오폴리스(Pseudomonas boreopolis)(ATCC 33662); 슈도모나스 브라시카세아룸(Pseudomonas brassicacearum); 슈도모나스 부타노보라(Pseudomonas butanovora)(ATCC 43655); 슈도모나스 셀룰로사(Pseudomonas cellulosa)(ATCC 55703); 슈도모나스 아우란티아카(Pseudomonas aurantiaca)(ATCC 33663); 슈도모나스 클로로라피스(Pseudomonas chlororaphis)(ATCC 9446, ATCC 13985, ATCC 17418, ATCC 17461); 슈도모나스 프라기(Pseudomonas fragi)(ATCC 4973); 슈도모나스 룬덴시스(Pseudomonas lundensis)(ATCC 49968); 슈도모나스 테트롤렌스(Pseudomonas taetrolens)(ATCC 4683); 슈도모나스 시시콜라(Pseudomonas cissicola)(ATCC 33616); 슈도모나스 코로나파시엔스(Pseudomonas coronafaciens); 슈도모나스 디테르페니필라(Pseudomonas diterpeniphila); 슈도모나스 엘롱가타(Pseudomonas elongata)(ATCC 10144); 슈도모나스 플렉텐스(Pseudomonas flectens)(ATCC 12775); 슈도모나스 아조토포르만스(Pseudomonas azotoformans); 슈도모나스 브레네리(Pseudomonas brenneri); 슈도모나스 세드렐라(Pseudomonas cedrella); 슈도모나스 코루가타(Pseudomonas corrugata)(ATCC 29736); 슈도모나스 엑스트레모리엔탈리스(Pseudomonas extremorientalis); 슈도모나스 플루오레센스(ATCC 35858); 슈도모나스 게사르디이(Pseudomonas gessardii); 슈도모나스 리바넨시스(Pseudomonas libanensis); 슈도모나스 만델리이(Pseudomonas mandelii)(ATCC 700871); 슈도모나스 마르기날리스(Pseudomonas marginalis)(ATCC 10844); 슈도모나스 미굴라에(Pseudomonas migulae); 슈도모나스 무시돌렌스(Pseudomonas mucidolens)(ATCC 4685); 슈도모나스 오리엔탈리스(Pseudomonas orientalis); 슈도모나스 로데시아에(Pseudomonas rhodesiae); 슈도모나스 신크산타(Pseudomonas synxantha)(ATCC 9890); 슈도모나스 톨라시이(Pseudomonas tolaasii)(ATCC 33618); 슈도모나스 베로니이(Pseudomonas veronii)(ATCC 700474); 슈도모나스 프레데리크스베르겐시스(Pseudomonas frederiksbergensis); 슈도모나스 게니쿨라타(Pseudomonas geniculata)(ATCC 19374); 슈도모나스 깅게리(Pseudomonas gingeri); 슈도모나스 그라미니스(Pseudomonas graminis); 슈도모나스 그리몬티이(Pseudomonas grimontii); 슈도모나스 할로데니트리피칸스(Pseudomonas halodenitrificans); 슈도모나스 할로필라(Pseudomonas halophila); 슈도모나스 히비시콜라(Pseudomonas hibiscicola)(ATCC 19867); 슈도모나스 후티엔시스(Pseudomonas huttiensis)(ATCC 14670); 슈도모나스 히드로게노보라(Pseudomonas hydrogenovora); 슈도모나스 예세니이(Pseudomonas jessenii)(ATCC 700870); 슈도모나스 킬로넨시스(Pseudomonas kilonensis); 슈도모나스 란세올라타(Pseudomonas lanceolata)(ATCC 14669); 슈도모나스 리니(Pseudomonas lini); 슈도모나스 마르기나타(Pseudomonas marginata)(ATCC 25417); 슈도모나스 메피티카(Pseudomonas mephitica)(ATCC 33665); 슈도모나스 데니트리피칸스(Pseudomonas denitrificans)(ATCC 19244); 슈도모나스 페르투시노게나(Pseudomonas pertucinogena)(ATCC 190); 슈도모나스 피크토룸(Pseudomonas pictorum)(ATCC 23328); 슈도모나스 사이로필라(Pseudomonas psychrophila); 슈도모나스 풀바(Pseudomonas fulva)(ATCC 31418); 슈도모나스 몬테일리이(Pseudomonas monteilii)(ATCC 700476); 슈도모나스 모셀리이(Pseudomonas mosselii); 슈도모나스 오리지하비탄스(Pseudomonas oryzihabitans)(ATCC 43272); 슈도모나스 플레코글로시시다(Pseudomonas plecoglossicida)(ATCC 700383); 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida)(ATCC 12633); 슈도모나스 레악탄스(Pseudomonas reactants); 슈도모나스 스피노사(Pseudomonas spinosa)(ATCC 14606); 슈도모나스 발레아리카(Pseudomonas balearica); 슈도모나스 루테올라(Pseudomonas luteola)(ATCC 43273); 슈도모나스 스투체리(Pseudomonas stutzeri)(ATCC 17588); 슈도모나스 아미그달리(Pseudomonas amygdali)(ATCC 33614); 슈도모나스 아벨라나에(Pseudomonas avellanae)(ATCC 700331); 슈도모나스 카리카파파예(Pseudomonas caricapapayae)(ATCC 33615); 슈도모나스 키코리이(Pseudomonas cichorii)(ATCC 10857); 슈도모나스 피쿠세렉타에(Pseudomonas ficuserectae)(ATCC 35104); 슈도모나스 푸스코바기나에(Pseudomonas fuscovaginae); 슈도모나스 멜리아에(Pseudomonas meliae)(ATCC 33050); 슈도모나스 시링게(Pseudomonas syringe)(ATCC 19310); 슈도모나스 비리디플라바(Pseudomonas viridiflava)(ATCC 13223); 슈도모나스 테르모카르복시도보란스(Pseudomonas thermocarboxydovorans)(ATCC 35961); 슈도모나스 테르모톨레란스(Pseudomonas thermotolerans); 슈도모나스 티베르발렌시스(Pseudomonas thivervalensis); 슈도모나스 반코우베렌시스(Pseudomonas vancouverensis)(ATCC 700688); 슈도모나스 비스콘시넨시스(Pseudomonas wisconsinensis); 및 슈도모나스 크시아메넨시스(Pseudomonas xiamenensis). 한 실시양태에서, 숙주 세포는 슈도모나스 플루오레센스이다.

숙주 세포는 "그람 음성 프로테오박테리아 아군 17"로부터 선택될 수 있다. "그람 음성 프로테오박테리아 아군 17"은 예를 들어 하기 슈도모나스 종에 속하는 것들을 비롯한, "플루오레센트 슈도모나드"로서 당업계에 공지된 프로토박테리아 군으로 정의된다: 슈도모나스 아조토포르만스(Pseudomonas azotoformans); 슈도모나스 브레네리(Pseudomonas brenneri); 슈도모나스 세드렐라(Pseudomonas cedrella); 슈도모나스 코루가타(Pseudomonas corrugata); 슈도모나스 엑스트레모리엔탈리스(Pseudomonas extremorientalis); 슈도모나스 플루오레센스; 슈도모나스 게사르디이(Pseudomonas gessardii); 슈도모나스 리바넨시스(Pseudomonas libanensis); 슈도모나스 만델리이(Pseudomonas mandelii); 슈도모나스 마르기날리스(Pseudomonas marginalis); 슈도모나스 미굴라에(Pseudomonas migulae); 슈도모나스 무시돌렌스(Pseudomonas mucidolens); 슈도모나스 오리엔탈리스(Pseudomonas orientalis); 슈도모나스 로데시에(Pseudomonas rhodesiae); 슈도모나스 신크산타(Pseudomonas synxantha); 슈도모나스 톨라시이(Pseudomonas tolaasii); 및 슈도모나스 베로니이(Pseudomonas veronii).

다른 실시양태에서, 슈도모나스 숙주 세포는 DsbA, DsbB, DsbC, 및 DsbD를 과다발현한다. DsbA, B, C, 및 D는 예컨대, 미국 특허 출원 공개 번호 2008/0269070 및 2010/0137162에 기술된 바와 같은 이황화 결합 이소머라제이다.

다른 실시양태에서, 슈도모나스 숙주 세포는 야생형이고, 즉, 프로테아제 발현 결합을 포함하지 않고, 어떤 폴딩 조절 인자도 과다발현하지 않는 것이다.

프로테아제 발현에 있어 결함이 있는 숙주 세포는 야생형 숙주와 비교하여 프로테아제의 정상적인 활성 또는 발현 수준을 감소시키는 임의의 변형을 가질 수 있다. 예를 들어, 미스센스 또는 넌센스 돌연변이는 활성이 아닌 단백질 발현을 유도할 수 있고, 유전자 결실은 단백질을 발현시키지 않을 수 있다. 유전자의 상류 조절 영역의 변화는 단백질 발현을 감소시킬 수 있거나, 또는 단백질을 발현시키지 않을 수 있다. 다른 유전자 결함은 단백질 번역에 영향을 줄 수 있다. 프로테아제 프로세싱에 필요한 단백질 활성에 결함이 있는 경우, 프로테아제 발현 또한 결함이 있을 수 있다.

본 발명의 방법, 및 숙주 세포를 확인하는 방법과 관련하여 유용한 슈도모나드 숙주 세포를 생성하는 데 유용한 프로테아제 및 폴딩 조절 인자의 예는 예컨대, 상기 참조된 미국 특허 출원 공개 번호 2008/0269070 및 2010/0137162에 기술되어 있다.

코돈 최적화

박테리아 숙주에서 이종성 단백질의 발현을 개선시키기 위하여 코돈을 최적화하는 방법은 당업계에 공지되어 있고, 이는 문헌에 기술되어 있다. 예를 들어, 슈도모나스 숙주 균주에서 발현을 위해 코돈을 최적화시키는 것은 예컨대, 미국 특허 출원 공개 번호 2007/0292918(발명의 명칭: "Codon Optimization Method")(상기 특허 출원은 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다)에 기술되어 있다. E. 콜라이에서의 발현을 위한 코돈 최적화는 예컨대, 문헌 [Welch, et al, 2009, PLoS One, "Design Parameters to Control Synthetic Gene Expression in Escherichia coli , 4(9): e7002](본원에서 참조로 포함된다)에 기술되어 있다.

본 발명은 사용된 숙주 세포에서의 발현을 위해 최적화된 임의의 서열을 비롯한, CSP에 대한 임의의 코딩 서열의 용도를 고려한다. 사용을 위해 고려되는 서열은 원하는 바대로 임의 정도로 최적화될 수 있으며, 이는 제거를 통한 최적화, 슈도모나스 숙주 세포에서 5% 미만으로 존재하는 코돈, 슈도모나스 숙주 세포에서 10% 미만으로 존재하는 코돈, 희귀 코돈 유도성 번역 정지, 추정 내부 RBS 서열, G 또는 C 뉴클레오티드의 외부 반복부, 간섭 2차 구조, 제한 부위, 또는 그의 조합을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

추가로, 본 발명의 방법을 수행하는 데 유용한 임의의 분비 리더의 아미노산 서열은 임의의 적절한 핵산 서열에 의해 코딩될 수 있다.

발효 포맷

본 발명의 방법에 따라 정제하기 위한 재조합 단백질의 발현은 임의의 발효 포맷으로 실행될 수 있다. 예를 들어, 배치, 유가식, 반연속식, 및 연속식 발효 모드가 본원에서 사용될 수 있다. 박테리아 발현 시스템에서 재조합 단백질, 예컨대, CSP를 제조하는 발효 조건은 문헌에 기술된 방법을 사용하여 당업자에 의해 적절한 것으로 간주되는 바와 같이 최적화될 수 있다. 예를 들어, 독소 단백질 생산을 최적화하는 방법은 미국 특허 출원 공개 번호 2011/0287443(발명의 명칭: "High Level Expression of Recombinant Toxin Proteins")(상기 특허 출원은 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다)에 기술되어 있다. 실시양태에서, 발효 배지는 농축 배지, 최소 배지 및 무기 염 배지로부터 선택될 수 있다. 다른 실시양태에서, 최소 배지 또는 무기 염 배지가 선택된다. 특정 실시양태에서, 무기 염 배지가 선택된다.

무기 염 배지는 무기 염 및 탄소 공급원, 예컨대, 글루코스, 수크로스 또는 글리세롤로 구성된다. 무기 염 배지의 예로는 예컨대, M9 배지, 슈도모나스 배지 (ATCC 179), 및 데이비스(Davis) 및 민지올리(Mingioli) 배지(문헌 [B D Davis & E S Mingioli (1950) J. Bact. 60: 17-28] 참조)를 포함한다. 무기 염 배지를 제조하는 데 사용되는 무기 염으로는 예컨대, 인산칼륨, 황산암모늄 또는 염화암모늄, 황산마그네슘 또는 염화마그네슘, 및 미량 무기물, 예컨대, 염화칼슘, 철, 구리, 망간, 및 아연의 보레이트, 및 술페이트로부터 선택되는 것을 포함한다. 전형적으로, 어떤 유기 질소 공급원, 예컨대, 펩톤, 트립톤, 아미노산 또는 효모 추출물도 무기 염 배지에는 포함되지 않는다. 대신, 무기 질소 공급원이 사용되며, 이는 예컨대, 암모늄 염, 수성 암모니아, 및 기상 암모니아로부터 선택될 수 있다. 무기 염 배지는 전형적으로 탄소 공급원으로서 글루코스 또는 글리세롤을 함유할 것이다. 무기 염 배지와 비교하여, 최소 배지는 또한 무기 염 및 탄소 공급원을 함유할 수 있지만, 비록 상기 성분들이 매우 최소 수준으로 첨가되더라도, 예컨대, 저수준의 아미노산, 비타민, 펩톤 또는 다른 성분으로 보충될 수 있다. 배지는 당업계에 기술된 바와 같은, 예컨대, 미국 특허 출원 공개 번호 2006/0040352(상기 특허 출원은 상기 참고 문헌에 의해 본원에서 참조되고, 포함된다)에 기술된 바와 같은 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 본 발명의 방법에 유용한 배양 방법 및 무기 염 배지에 관한 상세한 설명은 문헌 [Riesenberg, D et al., 1991, "High cell density cultivation of Escherichia coli at controlled specific growth rate," J. Biotechnol. 20 (1): 17-27]에 기술되어 있다.

발효 규모

본 발명의 정제 방법은 대량의 단백질을 공정처리하기 위해 규모를 확장시킬 수 있기 때문에 특히 유용하다. rCSP 제조 방법을 규모 확장하면 전형적으로 rCSP 응집체가 생성된다. 본 방법은 대규모 프로세싱과 호환가능하고, 출발 물질이 다량의 rCSP를 포함할 때, 사용하기 위한 것으로 고려된다. 본 발명의 정제 방법은 또한 임의의 소규모로 제조된 박테리아 세포 용해물로부터 단백질을 수득할 때 사용하기 위한 것으로 고려된다. 따라서, 예컨대, 마이크로리터 규모, 센티리터 규모, 데시리터 규모의 발효 부피가 사용될 수 있다. 실시양태에서, 1 ℓ 규모 이상의 발효 부피가 사용된다.

실시양태에서, 발효 부피는 약 1 ℓ 내지 약 100 ℓ이다. 특정 실시양태에서, 발효 부피는 약 2 ℓ 이상, 약 3 ℓ 이상, 약 4 ℓ 이상, 약 5 ℓ 이상, 약 6 ℓ 이상, 약 7 ℓ 이상, 약 8 ℓ 이상, 약 9 ℓ 이상, 약 10 ℓ 이상, 약 20 ℓ 이상, 약 25 ℓ 이상, 약 50 ℓ 이상, 약 75 ℓ 이상, 약 100 ℓ 이상, 약 200 ℓ 이상, 약 500 ℓ 이상, 약 1,000 ℓ 이상, 약 2,000 ℓ 이상, 약 5,000 ℓ 이상, 약 10,000 ℓ 이상, 또는 약 50,000 ℓ 이상이다. 실시양태에서, 발효 부피는 약 1 ℓ 내지 약 5 ℓ, 약 1 ℓ 내지 약 10 ℓ, 약 1 ℓ 내지 약 20 ℓ, 약 1 ℓ 내지 약 25 ℓ, 약 1 ℓ 내지 약 50 ℓ, 약 1 ℓ 내지 약 75 ℓ, 약 10 ℓ 내지 약 25 ℓ, 약 25 ℓ 내지 약 50 ℓ, 또는 약 50 ℓ 내지 약 100 ℓ이다.

고처리량 스크린

일부 실시양태에서, rCSP를 발현하는 최적의 조건을 측정하기 위해 고처리량 스크린이 수행될 수 있다. 스크린에서 가변적인 조건으로는 예를 들어, 숙주 세포, 숙주 세포의 유전적 배경 (예컨대, 상이한 프로테아제 유전자의 결실, 또는 폴딩 조절 인자의 과다발현), 발현 구성체에서 프로모터의 유형, 재조합 단백질을 코딩하는 서열에 융합되는 분비 리더 유형, 성장 온도, 유도성 프로모터가 사용될 때, 유도시 OD, 사용되는 유도제의 농도(예컨대, lacZ 프로모터가 사용될 때, IPTG), 단백질 유도 지속 기간, 배양물에의 유도제 첨가 후 성장 온도, 배양물 교반 속도, 플라스미드 유지를 위한 선택 방법, 베쓸 중 배양물 부피 등을 포함한다.

이종성 단백질의 발현에서 수율 및/또는 품질이 개선된 균주를 확인하기 위한 미생물 숙주 스크리닝 방법은 예를 들어, 미국 특허 출원 공개 번호 2008/0269070에 기술되어 있다.

도입

본원 다른 곳에도 기술되어 있는 바와 같이, 유도성 프로모터, 예컨대, lac 프로모터는 재조합 단백질의 발현을 제어하는 데 발현 구성체에서 사용될 수 있다. lac 프로모터 유도체 또는 패밀리 구성원, 예컨대, tac 프로모터의 경우, 효과기 화합물은 유도 인자, 예컨대, 무상 유도 인자, 예컨대, IPTG(이소프로필-β-D-1-티오갈락토피라노시드, 이는 또한 "이소프로필티오갈락토시드"로도 명명된다), 락토스, 또는 알로락토스이다. 실시양태에서, lac 프로모터 유도체가 사용되고, 세포 밀도가 OD₅₇₅ 약 80 내지 약 160인 것으로 확인되는 수준에 도달하였을 때, 재조합 단백질 발현은 IPTG를 최종 농도 약 0.01 mM 내지 약 1.0 mM로 첨가함으로써 유도된다. 실시양태에서, 비lac 유형 프로모터가 사용되는 경우, 본원에 기술된 바와 같이, 및 문헌에 기술되어 있는 바와 같이, 다른 유도 인자 또는 효과기가 사용될 수 있다. 한 실시양태에서, 프로모터는 구성적 프로모터이다. 프로모터를 유도하는 방법은 당업계에, 예컨대, 미국 특허 번호 제7,759,109호(발명의 명칭: "High Density Growth of T7 Expression Strains with Auto-induction Option") 및 미국 특허 출원 공개 번호 2011/0217784(발명의 명칭: "Method for Producing Soluble Recombinant Interferon Protein without Denaturing")(상기 특허 모두 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다)에 기술되어 있다.

구체적인 실시양태에서, rCSP는 슈도모나스 플루오레센스에서 발현되고, 발현은 lac 프로모터에 의해 조절된다. 본 실시양태에서, 발효 배양물은 27 내지 32℃의 온도, pH 6.5 내지 7.2에서 0.1 내지 0.2 mM IPTG를 이용하여 575 nm 유도 세포 밀도에서 100-160 AU(흡광도 단위)로 유도된다.

단백질 정제

본 발명의 방법에서, 재조합 P. 팔시파룸 CSP의 이량체는 rCSP를 발현하는 세포로부터 제조된 박테리아 세포 용해물로부터 정제된다. 실시양태에서, 정제는 숙주 세포 파쇄물 및 단백질 및 다른 불순물로부터 CSP 이량체를 분리하여 CSP 이량체를 함유하는 가용성 분획 및 불용성 분획을 생성하는 것을 포함한다. 가용성 분획 중 CSP 이량체는 숙주 세포 단백질 및 임의의 다른 원치않는 불순물로부터 분리된다. 숙주 세포 파쇄물로부터의 분리, 숙주 세포 단백질로부터의 분리, 예컨대, N 말단에서 클리핑된 종, 고분자량 응집체, 이량체화된 종, 및 변성된 종을 비롯한, 원치않는 rCSP 종으로부터의 분리, 및 임의의 다른 불순물로부터의 분리는 사용되는 분리 방법에 따라 상이한 공정 단계에서 또는 동일한 공정(들)에서 수행될 수 있다. rCSP를 정제하는 본 발명의 방법에 따라 유용한 분리 방법은 문헌, 예컨대, 문헌 [Methods in Enzymology (1990) volume 182. A Guide to Protein Purification. Edited by M. P. Deutscher. Academic Press]; 및 [Ausubel, F.M., Brett, R., Kingston, R. E., Moore, D. D., Seidman, J.G., Smith, J.A., and Struhl, L. 1991. Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1. Wiley. New York](상기 두 문헌 모두 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다)에 기술되어 있다.

규모가변적인 방법

rCSP 제조 방법을 규모 확장하면 전형적으로 단백질 응집이 일어난다. 본 발명의 방법은 규모가변적이고, 이를 사용하여 대량의 rCSP를 포함하는, 출발 물질, 예컨대, 세포 배양물 또는 박테리아 세포 용해물로부터 높은 전체 정제 공정 수율로 rCSP를 정제할 수 있다. 실시양태에서, 방법은 약 100 mg 내지 약 3,000 g rCSP를 포함하는, rCSP의 출발량 또는 초기 로드로까지 규모가 확장될 수 있다. 실시양태에서, rCSP의 출발량은 약 1 g 내지 약 3,000 g, 약 100 g 내지 약 3,000 g, 약 250 g 내지 약 3,000 g, 약 500 g 내지 약 3,000 g, 약 750 g 내지 약 3,000 g, 약 1,000 g 내지 약 3,000 g, 약 100 g 내지 약 2,000 g, 약 250 g 내지 약 2,000 g, 약 500 g 내지 약 2,000 g, 약 750 g 내지 약 2,000 g, 약 1,000 g 내지 약 2,000 g, 약 100 g 내지 약 1,000 g, 약 150 g 내지 약 1,000 g, 약 200 g 내지 약 1,000 g, 약 250 g 내지 약 1,000 g, 약 300 g 내지 약 1,000 g, 약 400 g 내지 약 1,000 g, 약 500 g 내지 약 1,000 g, 또는 약 750 g 내지 약 1,000 g을 포함한다. 실시양태에서, 본 발명의 방법을 사용하여 약 10% 이상, 약 15% 이상, 약 20% 이상, 약 25% 이상, 약 30% 이상, 약 35% 이상, 약 40% 이상, 약 50% 이상, 약 60% 이상, 약 70% 이상, 약 10% 내지 약 75%, 약 10% 내지 약 70%, 약 10% 내지 약 65%, 약 10% 내지 약 60%, 약 20% 내지 약 75%, 약 20% 내지 약 70%, 약 20% 내지 약 65%, 약 25% 내지 약 75%, 약 25% 내지 약 70%, 약 25% 내지 약 65%, 약 25% 내지 약 60%, 약 30% 내지 약 75%, 약 30% 내지 약 70%, 약 30% 내지 약 65%, 또는 약 30% 내지 약 60%의 전체 정제 공정 수율로 rCSP을 상기 출발량 중 임의의 양으로 수득할 수 있다. 실시양태에서, 상기 정제 공정 수율은 10% 이하의 변성된 rCSP, 10% 이하의 분해된 rCSP, 및/또는 10% 이량체화된 rCSP를 포함한다. 실시양태에서, 상기 정제 공정 수율은 5% 이하의 변성된 rCSP, 5% 이하의 분해된 rCSP, 및/또는 5% 이하의 이량체화된 rCSP를 포함한다.

우선적 환원 조건

본 발명의 방법에서, 본 발명의 방법에서 숙주 세포 단백질로부터 분리된 rCSP 이량체는 우선적 환원 조건에 가해진다. 상기 우선적 환원 조건을 통해 특정의 이황화 결합은 선택적으로 환원되고, 동시에 다른 것은 온전하게 그대로 유지된다. rCSP를 우선적 환원 조건에 가하면서, rCSP 이량체의 분자간 이황화 결합은 환원되고, 이로써, 이량체는 2개의 단량체로 분리된다. 예를 들어, C 말단 영역 중의 2개의 분자내 이황화 결합으로 나타나는 구조는 온전한 상태 그대로 유지된다. 그러므로, 우선적 환원 조건은 종래 사용된 방법에 비하여 (이량체 이용에 기인한) 높은 전체 공정 수율, 및 (리폴딩 단계 결여 및 단량체로부터 이량체를 분리하여야 하는 필요성의 결여에 기인한) 복잡성 감소에 중요하다. 본 전략법의 추가의 이점은 온전한 N 말단을 포함하는, 정제 동안 이량체로서 유지되는 rCSP를 더 큰 비율로 수득할 수 있다는 점이다. 그러므로, 회수된 rCSP의 품질 및 정량은 크게 개선된다. 실시양태에서, 우선적 환원 조건은 온화한 환원제를 포함한다. 실시양태에서, 온화한 환원제는 DTT, 시스테인, 아세틸시스테인, 글루타티온, 모노티오글리세롤(MTG), 티오글리콜레이트, 디티오트레이톨, 디티오에리트리톨, 아세틸시스테인, 2-머캅토에탄올(B-머캅토에탄올), TCEP-HCl(순수, 결정질 트리스(2-카복시에틸)포스핀 하이드로클로라이드), 또는 2-머캅토에틸아민-HCl(2-MEA), 또는 당업계에 공지된 임의의 다른 적절한 환원제를 포함한다. 특정 실시양태에서, 온화한 환원제는 최종 농도 약 0.001 내지 약 0.1 mM의 디티오트레이톨(DTT)이다. 실시양태에서, 온화한 환원제는 DTT를 최종 농도 약 0.010 mM 내지 약 0.030 mM, 약 0.010 mM 내지 약 0.020 mM, 약 0.010 mM 내지 약 0.025 mM, 약 0.020 mM 내지 약 0.025 mM, 약 0.020 mM 내지 약 0.030 mM, 또는 약 0.025 mM 내지 약 0.030 mM로 포함한다. 실시양태에서, DTT의 농도는 약 20 μM이다. 실시양태에서, 온화한 환원제는 최종 농도 약 0.5 mM 내지 약 5 mM의 모노티오글리세롤(MTG)이다. 실시양태에서, 온화한 환원제는 MTG 또는 시스테인을 최종 농도 약 0.5 mM 내지 약 4 mM, 약 0.5 mM 내지 약 3 mM, 약 0.5 mM 내지 약 2 mM, 약 0.5 mM 내지 약 1 mM, 약 0.6 mM 내지 약 2 mM, 약 0.6 mM 내지 약 1.5 mM, 약 0.6 mM 내지 약 1.4 mM, 약 0.6 mM 내지 약 1.3 mM, 약 0.6 mM 내지 약 1.2 mM, 약 0.6 mM 내지 약 1.1 mM, 약 0.6 mM 내지 약 1.05 mM, 약 0.6 mM 내지 약 1 mM, 약 0.7 mM 내지 약 2 mM, 약 0.7 mM 내지 약 1.5 mM, 약 0.7 mM 내지 약 1.4 mM, 약 0.7 mM 내지 약 1.3 mM, 약 0.7 mM 내지 약 1.2 mM, 약 0.7 mM 내지 약 1.1 mM, 약 0.7 mM 내지 약 1.05 mM, 약 0.7 mM 내지 약 1 mM, 약 0.8 mM 내지 약 2 mM, 약 0.8 mM 내지 약 1.5 mM, 약 0.8 mM 내지 약 1.4 mM, 약 0.8 mM 내지 약 1.3 mM, 약 0.8 mM 내지 약 1.2 mM, 약 0.8 mM 내지 약 1.1 mM, 약 0.8 mM 내지 약 1.05 mM, 약 0.8 mM 내지 약 1 mM, 약 0.9 mM 내지 약 2 mM, 약 0.9 mM 내지 약 1.5 mM, 약 0.9 mM 내지 약 1.4 mM, 약 0.9 mM 내지 약 1.3 mM, 약 0.9 mM 내지 약 1.2 mM, 약 0.9 mM 내지 약 1.1 mM, 약 0.9 mM 내지 약 1.05 mM, 약 0.9 mM 내지 약 1 mM, 약 1 mM 내지 약 1.5 mM, 약 1 mM 내지 약 1.4 mM, 약 1 mM 내지 약 1.3 mM, 약 1 mM 내지 약 1.2 mM, 약 1 mM 내지 약 1.1 mM, 약 0.5 mM, 약 0.6 mM, 약 0.7 mM, 약 0.8 mM, 약 0.9 mM, 약 1.0 mM, 약 1.1 mM, 약 1.2 mM, 약 1.3 mM, 약 1.4 mM, 약 1.5 mM, 약 1.6 mM, 약 1.7 mM, 약 1.8 mM, 약 1.9 mM, 약 2.0 mM, 약 3.0 mM, 약 4.0 mM, 또는 약 5.0 mM로 포함한다. 실시양태에서, 온화한 환원제는 MTG 또는 시스테인을 최종 농도 약 1 mM로 포함한다.

실시양태에서, 온화한 환원제 및 탈응집화제는 완충제(예컨대, PBS, 트리스(Tris), 또는 Hepes) 중 정제된 이량체화된 CSP, 또는 응집화된 CSP에 첨가되고, 실온(약 21℃)에서 혼합된다. 실시양태에서, 탈응집화제는 아르기닌, 구아니딘 HCl, 계면활성제, 또는 임의의 다른 공지된 탈응집화제이다. 실시양태에서, 온화한 환원제는 MTG이고, 탈응집화제는 우레아이다. 실시양태에서, 우선적 환원 조건은 완충제 중 MTG 및 우레아를 포함한다. 실시양태에서, 완충제는 Hepes, PBS, 트리스, 또는 임의의 다른 적절한 완충제이다. 실시양태에서, 우선적 환원 조건은 Hepes 중 1.0 mM MTG 및 2 M 우레아를 포함한다. 실시양태에서, 본원 다른 곳에서도 기술된 바와 같이, 탈응집화제는 정제 방법 중 조기에, 예컨대, 세포 파괴 이전에 첨가된다. 본 실시양태에서, rCSP 이량체의 우선적 환원을 개시하기 위해 온화한 환원제가 첨가될 때, 탈응집화제는 이미 충분한 농도로 존재한다. 예를 들어, 탈응집화제는 약 0.5 M 내지 약 4 M 농도로 존재하는 우레아이다. 실시양태에서, 우레아의 농도는 약 2.5 M, 약 3 M, 약 1 내지 약 2 M, 약 1 내지 약 2.5 M, 약 1 내지 약 3 M, 약 1.5 내지 약 2 M, 약 1.5 내지 약 2.5 M, 약 1.5 내지 약 3 M, 약 2 내지 약 2.5 M, 약 2 내지 약 3 M, 또는 약 2.5 내지 약 3 M이다.

실시양태에서, 혼합은 약 21℃에서 약 8 내지 약 48시간 동안 수행된다. 실시양태에서, 혼합은 약 12 내지 약 24시간 동안, 또는 약 16 내지 약 18시간 동안 수행된다. 혼합은 예컨대, 자기 교반 막대 및 교반 플레이트, 로킹 플랫폼, 오버헤드 혼합기를 사용하여 신속하게 교반함으로써, 또는 백 중에서 연동식 펌프를 사용하여 이량체화된 CSP 및 환원제를 재순환시킴으로써 수행될 수 있다. 실시양태에서, 우선적 환원 조건은 전체 부피 약 1 mL 내지 약 25 ℓ로 수행된다. 실시양태에서, 부피는 약 100 mL 내지 약 1 ℓ이다. 실시양태에서, 우선적 환원 조건은 약 200-600 mL의 부피로 수행된다.

특정 실시양태에서, 우선적 환원 조건은 부틸 650S 크로마토그래피로부터 정제된 이량체 rCSP를 사용하여 수행된다. 다른 실시양태에서, 우선적 환원 조건은 세라믹 하이드록시아파타이트 크로마토그래피로부터 용리된 rCSP 이량체 분획에 대해 수행된다.

박테리아 세포 용해물

박테리아 세포 용해물 조제물은 물리적 또는 기계적 세포 파괴 방법 및 비기계적 세포 파괴 방법을 비롯한, 임의의 적절한 공지의 세포 파괴 방법을 사용하여 재조합 단백질을 발현하는 박테리아 세포를 파괴시킴으로써 수득된다. 파괴 방법은 파괴 공정의 엄격도, 필요한 장치 및/또는 시약, 및 사용 용이성에 따라 달라질 수 있다. 세포 파괴 방법은 예컨대, 특정 세포 파괴의 난해성 및 공정처리되는 물질의 양에 기초하여 선택된다. 박테리아 세포를 파괴하는 바람직한 방법은 변성되지 않은, 비분해된 재조합 단백질을 수득하기 위하여 하류 정제 단계에서 사용될 수 있는 박테리아 세포 용해물을 제조하는 방법이다.

파괴를 위해 제공된 세포 배양물

본 발명의 실시양태에서, 재조합 단백질을 발현하는 배양물로부터의 박테리아 세포, 예컨대, 전체 세포 브로쓰, 세포 현탁액, 세포 슬러리, 또는 세포 페이스트가 파괴를 위해 제공된다. 실시양태에서, 세포는 CSP 응집체 형성을 막는 데 충분할 정도로 탈응집화제를 포함하는 용액 중에 존재한다. 본 실시양태에서, CSP는 변성되지 않은 것이고, 따라서, CSP의 C 말단 영역 이황화 결합은 온전한 것이다. 실시양태에서, 박테리아 세포를 희석시켜 세포:배지 또는 세포:희석제의 부피를 조정한다.

실시양태에서, 박테리아 숙주 세포의 배양물은 본 발명의 방법에 따른 파괴를 위한 세포 페이스트 제조에 사용된다. 세포 페이스트는 당업계에 공지되고, 문헌에 기술된 방법에 따라 배양물로부터 제조될 수 있다. 예를 들어, 세포 페이스트는 원심분리에 의해 전체 발효 브로쓰를 수거하고, 생성된 세포 펠릿 및 무세포 브로쓰를 분리함으로써 제조될 수 있다. 실시양태에서, 발효물 수거를 위해, 전체 발효 브로쓰를 90 min 동안 10,000 x g로 원심분리하여 수거한다. 세포 페이스트는 -70 내지 -80℃에서 냉동시킬 수 있다. 실시양태에서, 파괴 이전에 세포 페이스트는 CSP를 변성시키지 않으면서, CSP 응집을 막는 데 충분한 정도의 농도로 탈응집화제를 함유하는 용액 중에서 재구성된다. 변성되지 않은 CSP에서, C 말단 영역 이황화 결합은 온전한 상태이다. 실시양태에서, 탈응집화제는 우레아이다. 실시양태에서, 탈응집화제는 예컨대, 아르기닌, 구아니딘 HCl, 계면활성제, 또는 당업계에 공지된 임의의 다른 적절한 탈응집화제이다. 실시양태에서, 탈응집화제는 미국 약전-국립 처방집(USP-NF)에 공개된 미국 약국방(미국 메릴랜드주 로크빌)의 표준, 또는 예컨대, 국제 약전(세계 보건 기구)에 공개된 있는 미국 이외의 타국의 유사 표준을 충족시키는 성분이다. 특정 실시양태에서, 탈응집화제는 2 M 우레아이다. 실시양태에서, 탈응집화제는 우레아를 최종 농도 약 0.5 M 내지 약 4 M으로 포함한다. 실시양태에서, 우레아의 농도는 약 2.5 M, 약 3 M, 약 1 내지 약 2 M, 약 1 내지 약 2.5 M, 약 1 내지 약 3 M, 약 1.5 내지 약 2 M, 약 1.5 내지 약 2.5 M, 약 1.5 내지 약 3 M, 약 2 내지 약 2.5 M, 약 2 내지 약 3 M, 또는 약 2.5 내지 약 3 M이다. 특정 실시양태에서, 2 M 우레아 및 20 mM 트리스 용액(pH 8.1 ± 0.2)이 세포 페이스트 재구성에 사용된다. 실시양태에서, 세포 페이스트는 20% 고체(w/v)로 재구성된다. 실시양태에서, 세포 페이스트는 20% 미만의 고체(w/v)로 재구성된다. 본 발명의 방법 전 과정에 걸쳐 탈응집화제가 사용되는 것이 고려된다.

본원 실시예에 기술된 바와 같이, 세포 페이스트 및 탈응집화제 완충제 용액은 용액이 와동되도록 하지 않으면서, 모든 세포가 해동되고, 용액이 균질성이 될 때까지, 예컨대, 스테인리스강 임펠러(바난트 믹서 시리즈 20(Barnant Mixer Series 20), 바난트 컴퍼니(Barnant Co.: 미국 일리노이주 배링턴), 또는 랩마스터(LabMaster), 0-1800 rpm, 라이트닝(Lightnin: 미국 뉴욕주 로체스터))를 이용하여 교반될 수 있다. 세포 파괴의 원하는 방법을 위한 세포를 적합하게 제조하는 재구성 조건을 확인하는 것은 당업계자의 기술 범위 내에 포함된다. 실시양태에서, 세포를 미세유동화기를 이용하여 기계적으로 파괴하는 경우, 미립자 크기는 미세유동화기 채널이 잠재적으로 막힐 가능성을 방지한다.

실시양태에서, CSP를 발현하는 박테리아 숙주 세포의 배양물은 전체 세포 브로쓰로서 존재한다. 실시양태에서, 브로쓰를 희석시킴으로써 20%(v/v) 혼합물을 수득한다. 실시양태에서, 희석 완충제는 탈응집화제를 포함한다. 특정 실시양태에서, 탈응집화제를 포함하는 희석 완충제는 3.1 M 우레아, 31 mM 트리스(pH 8.1 ± 0.2)이고, 이를 첨가함으로써 20%(v/v) 세포에서 2 M 우레아 및 20 mM 트리스를 수득할 수 있다.

세포 파괴

당업계에 공지된 임의의 적절한 방법을 사용하여 박테리아 세포 용해물 조제물을 제조할 수 있다. 예컨대, 공정 규모, 재현성, 파괴에 기인한 재조합 단백질 손상 잠재성, 및 계획된 분리 단계에 필요한 특정 용해물 특징에 기초하여 당업자는 방법을 확인할 수 있다. 당업자는 최고 품질의 생성물을 수득할 수 있는 최소 힘의 파괴 방법을 확립할 수 있다. 단백질 품질의 측면으로는 단백질 이량체화 또는 더 큰 고차 응집, 단백질 분해, 또는 단백질 변성을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 상기 측면들은 본원에 기술되고, 당업계에 공지된 방법에 의해 평가될 수 있다. 하류의 분리 단계에 필요한 세포 용해물 조제물의 특징은 공개 문헌에 특정 분리 방법에 대해 기술되어 있는 가이던스를 사용함으로써 확인될 수 있다. 실시양태에서, 예컨대, 본원에 기술된 바와 같은, 디스크 적층 원심분리를 비롯한 방법의 경우, 고체는 10% 이하이다. 실시양태에서, 고체는 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19% 또는 20% 이하이다. 분리 단계에서 잠재적으로 중요한 다른 용해물 특징으로는 완충제 조성, 용액 점도, 용해물의 온도(이들은 원심분리기에서의 분리에 영향을 줄 수 있기 때문이다)를 포함한다. 이에 한정되지 않는다.

파괴시키지 전에 배양물을 OD에 대해 정규화시킬 수 있다. 예를 들어, 세포를 약 10, 약 11, 약 12, 약 13, 약 14, 약 15, 약 16, 약 17, 약 18, 약 19, 또는 약 20의 OD₆₀₀으로 정규화시킬 수 있다.

세포를 파괴시키는 방법으로는 물리적 파괴(예컨대, 기계적 세포 용해, 액체 균질화, 초음파 처리, 냉동/해동, 및 수동식 분쇄), 및 투과화(예컨대, 화학적 파괴, 삼투압 충격에 의한 파괴, 효소적 파괴, 및 열 파괴)를 포함한다. 본 발명의 방법에서 유용한 박테리아 세포 용해물은 예컨대, 문헌 [Grabski, A.C., 2009, "Advances in preparation of biological extracts for protein purification," Methods Enzymol. 463:285-303]; [Hopkins, T.R., 1991, "Physical and chemical 세포 파괴 for the recovery of intracellular proteins," Bioprocess technology 12: 57-83]; 및 [Harrison, S.T., 1991, "Bacterial cell disruption: a key unit operation in the recovery of intracellular products," Biotechnology Advances 9 (2): 217-240](상기 문헌은 모두 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다)에 기술된 바와 같은, 세포를 파괴시켜 가용성 분획을 유리시키는 데 적절한 임의의 세포 파괴 방법을 사용함으로써 제조될 수 있다. 세포 및 정제 규모에 기초하여 적절한 방법을 선택하는 것은 당업자의 능력 범위 내에 포함되어 있으며 이들은 이용가능한 방법의 이점 및 단점에 대해서도 알고 있다. 예를 들어, 강한 기계적 처리는 세포 용해물 점도를 감소시키지만, 열 또는 산화에 의해 불안정한 단백질을 불활성화시킬 수 있는 반면, 비기계적 처리, 예컨대, 세포 투과화는 표적 단백질을 세포로부터 유리시키지 않을 수 있고, 점성 세포 용해물을 생성할 수 있다. 재조합 단백질을 발현시키는 데 사용되는 세포 유형에 따라, 세포 추출물은 다양한 양의 핵산, 리보솜 물질, 지질, 분산된 세포벽 다당류, 탄수화물, 키틴, 소분자, 및 원치않는 단백질(예컨대, 숙주 단백질)을 함유할 수 있다. 재조합 단백질의 불활성화 또는 분해 없이 하류 정제 공정에서 효율적으로 조작될 수 있는 박테리아 세포 용해물을 제조하는 것이 중요하다.

기계적 세포 파괴 방법으로는 예컨대, 분쇄기 또는 혼합기 사용, 비드밀링, 또는 비드비팅을 포함한다. 액체 균질화 방법으로는 미세유동화 뿐만 아니라, 예컨대, 콘스탄트 셀 디스트럽터(Constant Cell Disruptor), 니로-소아비(Niro-Soavi) 균질화기, APV-가울린(APV-Gaulin) 균질화기, 다운스 호모게나이저(Dounce Homogenizer), 포터-엘베헴 호모게나이저(Potter-Elvehjem Homogenizer), 또는 프렌치 프레스(French Press)를 사용하는 균질화를 포함한다. 다른 물리적 파괴방법으로는 초음파 처리, 냉동/해동, 및 수동식 분쇄를 포함한다. 물리적 파괴에 유용한 장치는 상업적으로 이용가능하다.

구체적인 실시양태에서, 세포는 예컨대, 본원 실시예에 기술된 바와 같은 방법에 따라, 및 당업계에 공지되고, 문헌에 공개되어 있는 바와 같이 미세유동화기를 사용하여 기계적으로 파괴된다. 본 실시양태에서, 10,000 ± 1,000 psi로 작동하는 마이크로플루이딕스(Micro fluidics) M-110Y 미세유동화기가 세포를 파괴시키는 데 사용될 수 있다. 미세유동화기로부터의 용해물을, 용액을 ≤12℃로 냉각시키는 원통 다관식(shell-and-tube) 열 교환기를 통해 통과시킬 수 있고, 당업계에 공지된 임의 방법에 따라 수집할 수 있다.

실시양태에서, 임의의 적절한 미세유동화기가 사용된다. 실시양태에서, 세포 파괴 과정을 돕기 위해 하나 이상의 작용제가 첨가된다. 예를 들어, 세포는 저장성 완충제 중에 현탁될 수 있다. 예컨대, 200 ㎍/ml로 첨가된 리소자임은 박테리아 세포벽의 다당류 성분을 분해한다. 실시양태에서, 세포를 유리 비드로 처리하여 세포벽의 분쇄를 용이하게 할 수 있다. 실시양태에서, 프로테아제 억제제는 정제 방법 동안 언제든지 첨가될 수 있다. 특정 실시양태에서, 프로테아제 억제제는 용해 이전 또는 그동안에 첨가된다.

삼투압 충격에 의한 주변세포질 방출

실시양태에서, 본원에 기술된 바와 같이, rCSP는 주변세포질 리더를 사용하여 주변세포질로 유도되고, 박테리아 세포 용해물은 세포벽을 투과화시킴으로써 생성된다. 예를 들어, 실시양태에서, 화학적 및/또는 효소적 세포 용해 시약, 예컨대, 세포벽 용해 효소 및 EDTA가 사용될 수 있다. 냉동된 또는 사전 보관된 배양물을 사용하는 것 또한 본 발명의 방법에서 고려된다. 예컨대, 본원 실시예에 기술된 바와 같이, 또는 당업계에 공지되고, 문헌에 보고되어 있는 바와 같이, 삼투압 충격에 의해 세포를 투과화시킬 수 있다.

재조합 CSP 이량체 정제

본 발명의 방법에서, 박테리아 세포 용해물 조제물 중의 rCSP 이량체는 숙주 세포 파쇄물 및 숙주 세포 단백질을 비롯한 불순물로부터 분리된다. 실시양태에서, 정제는 rCSP를 세포 파쇄물 및 숙주 세포 단백질로부터 순차적으로 분리하기 위해 수행된다. 예를 들어, 용해물은 먼저 가용성 및 불용성 분획으로 분리될 수 있고, 이어서, 가용성 분획 중에 존재하는 rCSP 이량체가 숙주 세포 단백질 및 다른 불순물로부터 분리될 수 있다. 다른 실시양태에서, rCSP 이량체는 세포 파쇄물 및 숙주 세포 단백질은 동일한 단계에서 또는 일련의 단계로 분리된다. 실시양태에서, 세포 파쇄물 및 숙주 세포 단백질, 둘 모두를 분리시키는 크로마토그래피 층 상에 용해물을 통과시키는 확장층 크로마토그래피가 사용된다. 확장층 크로마토그래피에 이어서 추가의 정제 단계가 수행될 수 있고, 이로써 남은 오염 물질을 제거할 수 있다.

박테리아 세포 용해물 표준의 가용성 및 불용성 분획으로의 분리

본 발명의 정제 방법에서, 재조합 단백질을 포함하는 박테리아 세포 용해물 조제물은 가용성 및 불용성 분획으로 분리된다. 본 공정에서 파쇄물을 제거함으로써 재조합 단백질을 함유하는 가용성 분획을 정화시킨다. 실시양태에서, 가용성 및 불용성 분획으로 분리시키고자 하는 박테리아 세포 용해물 조제물은 새로 용해된 세포를 포함한다. 다른 실시양태에서, 가용성 및 불용성 분획으로 분리하기 전에 박테리아 세포 용해물 조제물에 대해 하나 이상의 조작 또는 처리를 수행한다. 이러한 조적, 또는 정화 전처리로는 후속되는 조작을 용이하게 하거나, 원하는 대로 재조합 단백질의 회수율 또는 품질을 증진시키는 처리를 포함할 수 있다. 예를 들어, 박테리아 세포 용해물 조제물은 1종 이상의 시약, 예컨대, 응집제 또는 응고제로 희석되거나, 처리될 수 있다. 황산암모늄 및 PEG를 비롯한 응집제는 박테리아 세포 용해물 조제물의 불용성 분획의 침전을 증진시켜 가용성 분획으로부터 불용성 분획의 분리를 증진시킨다. 실시양태에서, 뉴클레아제, 예컨대, DN아제(25-50 ㎍/ml) 및/또는 RN아제(50 ㎍/ml)를 박테리아 세포 용해물 조제물에 첨가하여 그의 점도를 감소시킬 수 있다.

박테리아 세포 용해물을 가용성 단백질을 포함하는 가용성 분획, 및 세포 파쇄물을 포함하는 불용성 분획으로 분리시키는 방법은 당업계에 주지되어 있다. 당업자에 의해 적절한 것으로 간주되는, 임의의 액체 및 고체 분리 방법, 또는 그러한 방법들의 조합이 본 발명의 방법과 관련하여 사용되는 것으로 고려된다. 유용한 방법으로는 원심분리, 여과, 침강, 및 다른 정화 방법, 및 그의 조합을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 특정 실시양태에서, 보다 큰 세포 파쇄물 입자를 재조합 단백질로부터 분리하기 위해 원심분리가 수행되고, 이어서, 보다 작은 파쇄물 입자를 분리시키는 여과 방법이 수행된다. 특정 실시양태에서, 미세여과는 원심분리 또는 다른 방법의 부재하에서 수행된다.

분리 방법 - 가용성 및 불용성 분획

원심분리

하나 이상의 원심분리 방법을 사용하여 박테리아 세포 용해물을 가용성 분획(액체) 및 불용성 분획(고체)로 분리할 수 있다. 박테리아 세포 용해물을 가용성 및 불용성 분획으로 분리시키는 데 유용한 원심분리 방법으로는 예컨대, 고정 각도 원심분리, 디스크 적층 원심분리, 관형 볼 원심분리, 및 바닥 원심분리기를 사용하는 배치 원심분리를 포함한다.

원심분리는 임의의 적절한 장치 및 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 불용성 분획으로부터 가용성 분획을 분리하기 목적으로 세포 배양물 또는 용해물을 원심분리시키는 것은 당업계에 주지되어 있고, 문헌, 예컨대, 문헌 [Methods in Enzymology (1990), edited by M. P. Deutscher], 및 [Ausubel, F.M., et al., 1991]에 광범위하게 기술되어 있다. 예를 들어, 용해된 세포를 (4℃에서) 20분 동안 20,800 x g로 원심분리할 수 있고, 수동식 또는 자동 액체 처리를 사용하여 상청액을 제거할 수 있다. 펠릿(불용성) 분획을 완충처리된 용액, 예컨대, 포스페이트 완충처리된 염수(PBS)(pH 7.4) 중에 재현탁시킬 수 있다. 예컨대, 오버헤드 혼합기에 연결된 임펠러, 자기 교반 반대, 로킹 진탕기와 같은 장치를 이용하여 재현탁을 수행할 수 있다.

본 발명의 실시양태에서, 박테리아 세포 용해물은 일련의 방법, 예컨대, 원심분리 수행 후, 하나 이상의 추가의 원심분리 방법 또는 하나 이상의 여과 또는 침강 방법을 사용하여 가용성 및 불용성 분획으로 분리된다. 각 방법은 추가로 가용성 분획을 정화시킨다.

실시양태에서, 분리는 본원에 기술된 바와 같이, 디스크 적층 원심분리를 사용하여 수행된다. 디스크 적층 원심분리에서, 디스크 적층 원심분리기는 연속 공정으로 서로로부터 고체 및 1 또는 2개의 액체 상을 분리시킨다. 더 조밀한 고체는 원심력에 의해 바깥쪽으로 향하도록 압력을 받게 되는 반면, 덜 조밀한 액체 상은 내부에 동심원 층을 형성한다. 특수 플레이트가 삽입되고, 여기서, 액체 상은 만나게 되고, 이로써 최대 분리율을 달성하게 된다. 고체는 수동식으로, 간헐적으로 또는 연속적으로 제거될 수 있다. 정화된 액체는 볼 상단부 배출구 구역에서 월류된다. 상이한 액체 상은 별개의 챔버로 유도될 수 있고, 상호 오염을 막기 위해 서로 봉쇄될 수 있다. 디스크 적층 원심분리기를 사용하여 최도 밀도차로 상을 분리할 수 있다.

본 발명의 실시양태에서, 박테리아 세포 용해물 조제물을 가용성 및 불용성 분획으로 분리시키는 데 디스크 적층 원심분리가 사용되는 경우, 20%(w/v 또는 v/v) 용해물은 슈퍼 Q(Super Q) 정제수 또는 2 M 우레아, 20 mM 트리스(pH 8.0)으로 희석되고, 연동식 펌프에 의해, 또는 스테인리스강 임펠러로 재순화시켜 철저하게 혼합시킴으로써 균질한 10%(w/v 또는 v/v) 용해물을 수득할 수 있다. 디스크 적층 원심분리기, 예컨대, SC-6 원심분리기(GEA 웨스트팔리아(독일 오엘데))를 15,000 x g로 작동시킨다. 연동식 펌프 및 백금 경화된 실리콘 배관을 사용하여 10% 및 20% 용해물을 15 내지 22℃에서 0.3 내지 1.0 ℓ/min의 유속으로 원심분리기로 공급한다. 농축물 배압은 75 내지 85 psig로 유지된다. 12 내지 30℃에서 열 교환기를 사용하거나, 사용하지 않고, 농축물이 SC-6을 통해 배출될 수 있도록 하고, 이를 폴리프로필렌 베쓸 또는 플렉스보이(Flexboy)® 백 내로 수집할 수 있다. 불용성 분획/입자는 결정된 간격으로 반복 사이클로 간헐적으로 배출된다. AF16 단일 채널 근적외선 (NIR) 흡수 측정기(옵테크-다누라트(미국 위스콘신주 저먼타운))를 통해 농축물(centrate) 상에서 실시간 인라인 탁도를 수집할 수 있고, 보정된 범위의 농도 단위(%)(CU)로 기록할 수 있다. 하취(Hach) 2100p(러브 랜드(콜로라도))를 이용하여 비탁 탁도 단위(NTU) 측정을 위해 농축물의 즉석 및 벌크 시료를 취할 수 있다. 탁도 감소(1 - NTU농축물/NTU피드)는 원심분리가 성능을 평가하는 데 유용하며, 여기서, > 90% 감소는 추가의 최적화를 개시하는 데 있어 우수한 수준인 것이다.

심층 여과

실시양태에서, 심층 여과를 사용하여 박테리아 세포 용해물 조제물을 정화시키거나, 원심분리 후, 추가로 정화시킨다. 실시양태에서, 가용성 및 불용성 분획을 분리시키는 것은 디스크 적층 원심분리 후, 심층 여과에 의해 수행된다. 실시양태에서, 심층 여과가 사용되는 경우, 심층 및 멸균 필터의 조합을 사용함으로써 0.2 ㎛ 미만의 입자는 제거된다. 특정 실시양태에서, 심층 및 막 필터는 상청액 및 농축액을 여과하는 데 있어서 그의 적합성에 대해 평가된다. 실시양태에서, 상청액 및 농축액(예컨대, 10% 세포 페이스트 또는 전체 세포 브로쓰의 용해물)을 50 내지 100 LMH로 18 내지 28℃에서 심층 필터를 통해 펌핑한다. 실시양태에서, 원심분리 방법, 예컨대, 디스크 적층 원심분리를 사용하여 분리된 박테리아 세포 용해물 조제물의 가용성 분획을 10 psig로 막 필터를 통해 펌핑하여 V_최대 값을 확립한다.

심층 여과를 사용하여 박테리아 세포 용해물 조제물을 가용성 및 불용성 분획으로 분리시키는, 본 발명의 방법에서 유용한 심층 필터의 비제한적인 예로는 밀리포어(Millipore) COHC, AIHC, BIHC 및 XOHC 심층 필터, CUNO 60ZA 및 CUNO 90ZA가 있다. 필터는 예컨대, <20 ℓ/㎡의 피드 로드인 압력 한계, 또는 탁도 감소에 기초하여 평가될 수 있다. 실시양태에서, 본 발명의 방법에 따라 심층 여과를 수행하는 데 유용한 심층 필터는 공극이 작고, 전하 밀도가 높은 매트릭스를 가지며, 이는, 대개 막힘을 유발하고, 압력 결함을 유도하는 0.1 ㎛의 공칭 막은 포함하지 않는다. 실시양태에서, 사용되는 필터는 ≤ 30 psi의 압력 강하 및/또는 40 ℓ/㎡의 피드 로드로의 탁도 감소를 보인다. 실시양태에서, 본 발명의 방법에 따라 심층 여과를 수행하는 데 사용되는 심층 필터는 밀리포어 XOHC 필터이다.

미세여과

미세여과(MF)는 1 단위 조작으로 고체를 제거하고, 크로마토그래피에 직접 사용될 수 있는 피드스트림을 제공하는 규모가변적인 공정이다. 실시양태에서, 가용성 및 불용성 분획 분리는 사전 원심분리 없이 미세여과를 사용하여 수행된다. 실시양태에서, 미세여과는 ㎛ 내지 1 ㎛ 이하 범위의 공극을 가지는 막을 사용하는 접선 유동 여과(TFF)를 포함한다. 실시양태에서, 공극은 0.22 내지 0.45 ㎛이다. 이상적으로는, 막 공극 크기보다 큰 입자, 예컨대, 세포 파쇄물은 유지되는 반면(보유액), 막 공극 크기보다 작은 입자는 다른 용질 및 용매와 함께 막을 통해 확산된다(투과액). rCSP 회수를 위해, 보유액 중 세포 파쇄물을 유지시키고, 농축 및 및 완충제 교환을 통해 투과액 중 rCSP를 수집하는 것이 바람직하다.

5 내지 20%(w/v) 고체의 박테리아 세포 용해물 조제물을 접선 유동 여과를 통해 40%(w/v) 고체로 농축시키고, 2 M 우레아, 20 mM 트리스/20 mM MES/20 mM 비스트리스(pH 6-8)를 이용하여 1 내지 3 DV(디아볼륨)에 대해 정용여과시킬 수 있다.

냉동 해동 공정

실시양태에서, 용해물을 추가의 공정 단계, 예컨대, 숙주 세포 단백질을 제거하는 단계 이전에 냉동 및 해동시킨다. 부피에 따라 용해물은 보다 효율적인 냉동을 위해 분취량으로 나뉘어질 수 있다. 실시양태에서, 각 용해물 분취물은 약 19시간 이하 경과 후에도 100% 고체이다. 실시양태에서,각 용해물 분취물은 약 18시간 이하, 약 18.1시간 이하, 약 18.2시간 이하, 약 18.3시간 이하, 약 18.4시간 이하, 약 18.5시간 이하, 약 18.6시간 이하, 약 18.7시간 이하, 약 18.8시간 이하, 또는 약 18.9시간 이하 경과 후에도 100% 고체이다. 실시양태에서, 각 용해물 분취물은 약 7시간 이하, 약 6.9시간 이하, 약 6.8시간 이하, 약 6.7시간 이하, 약 6.6시간 이하, 약 6.5시간 이하, 약 6.4시간 이하, 약 6.3시간 이하, 약 6.2시간 이하, 약 6.1시간 이하, 또는 약 6시간 이하 경과 후에도 약 65% 이상 고체이다. 실시양태에서, 각 용해물 분취물은 약 5시간 이하, 약 4.9시간 이하, 약 4.8시간 이하, 약 4.7시간 이하, 약 4.6시간 이하, 약 4.5시간 이하, 약 4.4시간 이하, 약 4.3시간 이하, 약 4.2시간 이하, 약 4.1시간 이하, 또는 약 4시간 이하 경과 후에도 약 25% 이상 고체이다. 실시양태에서, 용해물 분취물은 약 1 ℓ 내지 약 2 ℓ이다. 실시양태에서, 용해물은 1 ℓ 또는 2 ℓ PETG 병 중에서 냉동된다.

실시양태에서, 냉동 해동 공정은 용해물을 해동시킨 후, 실온에서 유지시키는 것을 포함한다. 실시양태에서, 용해물을 약 4시간 이상 내지 약 7시간 이상, 약 4.5시간 이상 내지 약 7시간 이상, 약 5시간 이상 내지 약 7시간 이상, 또는 약 5.5시간 이상 내지 약 7시간 이상, 또는 약 6시간 이상 내지 약 7시간 이상, 또는 약 6.5시간 이상 내지 약 7시간 이상, 약 4시간 이상 내지 약 6시간 이상, 약 4.5시간 이상 내지 약 6시간 이상, 약 5시간 이상 내지 약 6시간 이상, 또는 약 5.5시간 이상 내지 약 6시간 이상 동안 실온에서 유지시킨다. 실시양태에서, 용해물을 해동 후 약 6시간 실온에서 유지시킨다.

실시양태에서, 냉동 해동 공정은 용해물 중 고분자량 단백질 종, 또는 "래더링"의 존재를 유의적으로 감소시킨다. 래더링의 존재를 통해 후속 크로마토그래피 단계에서의 낮은 rCSP 수율을 예측할 수 있다.

실시양태에서, 냉동 해동 공정 후, 및 추가의 공정 단계 이후에 침전 수준은 크로마토그래피 단계, 예컨대, TMAE 크로마토그래피가 완전하게 완료될 수 있도록 수준으로 침전을 감소시키는 처리에 의해 감소된다. 예를 들어, 침전 수준은 정상 크로마토그래피를 허용할 정도로 충분히 낮아야 한다. 실시양태에서, 침전을 감소시키기 위해 어떤 처리도 사용하지 않은 것과 비교하였을 때, 침전을 허용 수준으로 감소시키는 데 사용되는 방법을 통해서는 N 말단 클리핑이 증가하지 않는다. 실시양태에서, 용해물 침전물 수준은 해동 후, 또는 해동 후 실온 홀드 이후에 막 여과에 의해서 감소된다. 실시양태에서, 사르토브란(Sartobran) P(0.45 ㎛/0.2㎛) 막 필터이 용해물의 막 여과에 사용된다. 실시양태에서, 상기 여과 방법은 정제 방법 동안 임의 단계에서 수행된다. 실시양태에서, 최종 칼럼 이후 및 완충제 교환 단계 이전에 rCSP에 대해 막 여과를 수행한다.

가용성 분획 중 숙주 세포 단백질로부터의 rCSP 분리

숙주 세포 단백질로부터 재조합 단백질을 분리시키는 방법, 및 재조합 단백질의 특징에 기초하여 선택된 하나 이상의 분리 방법의 용도가 당업계에 공지되어 있고, 문헌 [Methods in Enzymology (1990), edited by M. P. Deutscher]에 상세하게 기술되어 있다. 예컨대, 크기, 전하, 결합 특성 및 가용성과 같은, 재조합 단백질 및 오염 물질의 특성의 차이에 기초하여 분리 방법이 선택될 수 있다. 상기 파라미터에 기초한 프로토콜로는 친화성 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 및 혼합 모드 크로마토그래피를 포함할 수 있다. 실시양태에서, 분리 방법은 재조합 단백질을 농축시키는 역할을 한다.

분리 방법의 예는 본원에 기술되어 있지만, 실시양태에서, 숙주 세포 단백질, 원치않는 rCSP 종, 또는 다른 불순물로부터 rCSP를 분리하고/하거나, 재조합 단백질을 농축시키는 임의의 공지된 방법 또는 방법들의 조합이 적절한 것으로 간주되는 경우, 그에 따라 사용된다. 본원에 기술된 바와 같이, rCSP의 우선적 환원 후에 바람직한 분리 방법을 통해 분해되지 않은, 비변성된 CSP 단량체가 정제된다. 실시양태에서, 수득된 rCSP(단량체)는 숙주 세포 단백질을 비롯한, 남은 불순물로부터 추가로 분리된다.

크로마토그래피

실시양태에서, 크로마토그래피는 박테리아 세포 용해물 조제물을 분리함으로써 수득된 가용성 분획 중에 존재하는 숙주 세포 단백질, 원치않는 rCSP 종, 또는 다른 불순물로부터 rCSP 이량체를 분리시키는 데 사용된다. 실시양태에서, (단량체를 결합시키는) 이량체내 분자간 이황화 결합을 감소시키지 않으면서, 및 추가로 CSP의 분자내 이황화 결합을 변성시키지 않으면서 응집이 일어나지 못하도록 하기 위해 크로마토그래피 동안 탈응집화제는 저농도로 존재한다. 실시양태에서, 저농도의 탈응집화제는 약 2 M의 우레아이다. 특정 실시양태에서, 박테리아 세포 용해물 가용성 분획은 20 mM 트리스(pH 8.0), 및 2 M 우레아 중에 존재한다.

많은 크로마토그래피 유형이 당업계에 공지되어 있고, 문헌, 예컨대, 문헌 [Methods in Enzymology (1990), edited by M. P. Deutscher]에 기술되어 있다.

실시양태에서, 이온 교환 크로마토그래피가 사용된다. 이온 교환 크로마토그래피, 예컨대, 음이온 교환 또는 양이온 교환 크로마토그래피에서, 재조합 단백질은 예컨대, 칼럼과 같은 기판 상의 고정된 전하에 결합하게 된다. 재조합 단백질은 고정화되는 반면, 비이동성 오염 물질은 제거된다. 추후 재조합 단백질은 용리되거나, 고정된 전하로부터 치환된다. 본 발명의 방법을 수행하는 데 유용한 기판 또는 이온 교환기는 당업계에 공지되어 있고, 셀룰로스, 덱스트란, 아가로스, 및 폴리스티렌을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 임의 크기의 칼럼, 또는 이온 교환 크로마토그래피, 예컨대, 배치 이온 교환 크로마토그래피에 유용한, 임의의 다른 적절한 공지 시스템이 본 발명의 방법에서 사용하기 위한 것으로 고려된다. 실시양태에서, 음이온 교환 크로마토그래피, 양이온 교환 크로마토그래피, 또는 그 둘 모두 사용된다.

소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC)는 고정상과, 분리하고자 하는 성분 사이의 소수성 상호작용에 기초한다. HIC 방법은 소수성 고정상 및 극성 이동상을 포함한다. 극성 성분은 이동상을 선호하고, 먼저 용리된다. 화합물의 소수성 특징이 증가함에 따라, 더 장시간 동안 체류하게 된다. 일반적으로 이동상의 극성이 낮을수록, 그의 용리제 강도는 더 높다. 흡착 및 탈착은 각각 액체의 염 농도를 증가 또는 감소시키거나, 또는 pH를 변화시켜 흡착/탈착시키고자 하는 리간드 상의 전하 및/또는 물질을 변화시킴으로써 지지를 받는다. HIC 방법은 문헌, 예컨대, WO 96/00735(발명의 명칭: "Hydrophobic Chromatographic Resins with Ionizable Groups"), WO 96/09116 및 미국 특허 번호 제5,652,348호(발명의 명칭: "Chromatographic Resins and Methods for Using Same")(이들 모두 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다)에 기술되어 있다. 소수성 상호작용 분리 방법은 예컨대, 미국 특허 번호 제8,138,306호(발명의 명칭: "Separation Method")(상기 특허는 그 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다)에 기술되어 있는 바와 같이, 친황성 흡착제에 기초할 수 있다. 미국 특허 번호 제8,138,306호에도 또한 사중극자 또는 쌍극자 모멘트를 소지하는 비하전된 리간을 포함하는 분리 매트릭스 사용이 기술되어 있다.

본 발명의 실시양태에서, rCSP 이량체 또는 단량체의 HIC는 임의의 적절한 소수성 기, 예컨대, 헥실, 페닐, 옥틸, 또는 부틸을 사용함으로써 수행된다. 소수성 수지는 상업적으로 이용가능하고, 이는 예컨대, 헥실 650C(토소 USA), 페닐 HP(GE, 17-5195-01), 부틸 HP(GE, 28-4110-01), PPG 600M(토소 USA), 및 MEP HyperCel(팔(Pall))을 포함할 수 있다. 실시양태에서, HIC는 (우선적 환원 조건하의) 온화한 환원 단계를 개시한 후에 수행된다. 실시양태에서, HIC 정제 단계는 성공적으로 숙주 세포 단백질의 수준을 최대 500 ppm, 최대 450 ppm, 최대 400 ppm, 최대 350 ppm, 최대 300 ppm, 최대 250 ppm, 최대 200 ppm, 최대 150 ppm, 최대 100 ppm, 최대 50 ppm, 최대 40 ppm, 최대 30 ppm, 최대 20 ppm, 최대 10 ppm, 최대 5 ppm으로까지, 또는 검출되지 않는 수준으로까지 감소시킨다. 실시양태에서, HIC 정제 단계는 성공적으로는 ELISA에 의해 검출되는 바, 숙주 세포 단백질 수준을 최대 50 ppm, 최대 40 ppm, 최대 30 ppm, 최대 20 ppm, 또는 최대 10 ppm으로까지 감소시킨다. 실시양태에서, HIC 정제 단계 이후 관찰되는 rCSP의 N 말단 클리핑은 최대 5%, 최대 4%, 최대 3%, 최대 2%, 최대 1.5%, 최대 1%, 최대 0.5%이거나, 또는 검출되지 않는다. 실시양태에서, HIC 정제 단계를 통해 98% 이상, 98.5% 이상, 99% 이상 또는 99.5% 이상의 순도의 rCSP를 얻게 된다. 실시양태에서, HIC 정제 단계를 통해 약 0.1 mg/ml 내지 약 2 mg/ml 이상의 rCSP 농도를 얻게 된다. 실시양태에서, HIC 정제 단계를 통해 약 0.15 mg/ml 내지 약 2 mg/ml 이상, 약 0.2 mg/ml 내지 약 2 mg/ml 이상, 약 0.25 mg/ml 내지 약 2 mg/ml 이상, 약 0.3 mg/ml 내지 약 2 mg/ml 이상, 약 0.35 mg/ml 내지 약 2 mg/ml 이상, 약 0.4 mg/ml 내지 약 2 mg/ml 이상, 약 0.45 mg/ml 내지 약 2 mg/ml 이상, 약 0.5 mg/ml 내지 약 2 mg/ml 이상, 약 0.1 mg/ml 내지 약 1 mg/ml 이상, 약 0.15 mg/ml 내지 약 1 mg/ml 이상, 약 0.2 mg/ml 내지 약 1 mg/ml 이상, 약 0.25 mg/ml 내지 약 1 mg/ml 이상, 약 0.3 mg/ml 내지 약 1 mg/ml 이상, 약 0.35 mg/ml 내지 약 1 mg/ml 이상, 약 0.4 mg/ml 내지 약 1 mg/ml 이상, 약 0.45 mg/ml 내지 약 1 mg/ml 이상, 약 0.5 mg/ml 내지 약 1 mg/ml 이상의 rCSP 농도를 얻게 된다. 특정 실시양태에서, HIC 정제 단계는 숙주 세포 단백질의 수준을 최대 50 ppm으로까지 감소시키고, N 말단 클리핑은 최대 1%이다.

실시양태에서, HIC를 사용하여 전장의 종으로부터 원치않는 rCSP 종, 예컨대, N 말단에서 클리핑된 종을 분리할 수 있다. 실시양태에서, 제거되는 원치않는 종으로는 예컨대, 고분자량 응집체, 이량체화된 종, 및 변성된 종을 포함한다. 실시양태에서, HIC는 RP-HPLC에 의해 측정된 바, 전체 rCSP를 약 5 내지 약 15%만큼 증가시킨다. 실시양태에서, 증가는 약 8 내지 약 12%, 약 9 내지 약 11%, 약 8% 이상, 약 9% 이상, 약 10% 이상, 약 1% 이상, 또는 약 12% 이상이다.

실시양태에서, HIC는 구배 용리 또는 단계 용리로 헥실 650C 칼럼을 사용하여 수행된다. 실시양태에서, HIC는 MTG를 이용하는 환원 후, 0.5 내지 0 M, 또는 1.0 내지 0 M, 황산암모늄 구배 용리로 헥실 650C 칼럼을 사용하여 수행된다.

크로마토그래피 방법은 또한 리간드와, 분리시키고자 하는 화합물 사이의 친화성에 기초할 수 있다. 유용한 친화성의 예로는 항체-항원 친화성, 금속 이온 친화성 및 수용체-리간드 친화성이 있다. 단백질은 크기에 기초하여 크기 배제 크로마토그래피에 의해 분리될 수 있다. 크기 배제 방법으로는 예컨대, 겔 여과를 포함한다.

혼합 모드 크로마토그래피 방법은 분리 파라미터의 조합에 기초하여 단백질을 분리한다. 예를 들어, 2가지 이상의 공지된 이온 교환 분리 원리의 조합이 혼합 모드 교환기로 제시되었다. 예를 들어, 혼합 모드 음이온 교환기를 기술하는 WO 97/29825(발명의 명칭: "Process for Chromatographic Separation of Peptides and Nucleic Acid, and New High Affinity Ion Exchange Matrix")를 참조할 수 있다.

예컨대, 미국 특허 번호 제8,138,306에 기술되어 있는 고염 리간드(HSL)는 혼합 모드 양이온 교환 리간드로서 작용할 수 있고, 이는 고염 농도에 대해 내성을 가질 수 있고, 따라서, 시료의 실질적인 희석을 필요로 하지 않는 바, 예컨대, 단백질 정제와 같이, 산업 적용에서 관심의 대상이 되는 것으로 나타났다.

본 발명의 실시양태에서, 혼합 모드 크로마토그래피는 숙주 세포 단백질로부터 rCSP를 분리시키는 데 사용된다. 구체적인 실시양태에서, 하이드록시아파타이트 크로마토그래피가 사용된다. 실시양태에서, CSP의 N 말단의 클리핑을 담당하는 숙주 세포 프로테아제는 하이드록시아파타이트 크로마토그래피에 의해 rCSP로부터 분리된다. 실시양태에서, TMAE 로드는 하이드록시아파타이트 크로마토그래피에서 사용된다.

하이드록시아파타이트 크로마토그래피는 매트릭스 및 리간드, 둘 모두를 형성하는 불용성 하이드록실화된 인산칼슘[Ca₁₀(PO₄)₆(OH)₂]을 이용하는, 단백질 정제 방법이다. 작용기는 양으로 하전된 칼슘 이온 쌍(C 부위) 및 음으로 하전된 포스페이트 기의 클러스터(P 부위)로 구성된다. 하이드록시아파타이트와 단백질 사이의 상호작용은 복잡하고, 다중 모드이다. 상호작용의 한 방법에서, 단백질 상의 양으로 하전된 아미노 기는 음으로 하전된 P 부위와 회합하게 되고, 단백질 카복실 기는 배위 착화합물 형성에 의해 C 부위와 상호작용한다. 산성 및 염기성 단백질은 보통 상이한 기전을 통해 cHA 수지와 상호작용한다: 산성 단백질은 보통 카복실 기에의 배위 결합을 통해 C 부위에 결합하는 반면, 염기성 단백질은 아민 기와의 하전 상호작용을 통해 P 부위에 결합한다. 세라믹 하이드록시아파타이트(cHA) 크로마토그래피를 통해서 예건대, 유속 제한과 같은, 결정질 하이드록시아파타이트와 관련된 몇가지 난관을 극복하게 되었다. 세라믹 하이드록시아파타이트는 내구성이 높고, 단백질 결합능이 우수하며, 결정질 하이드록시아파타이트보다 더 높은 유속 및 압력에서 사용될 수 있다. cHA를 사용하는 크로마토그래피 분리는 수개의 상이한 모드, 예컨대, 결합 모드, 관류식 모드, 또는 결합/관류식 모드의 조합으로 수행될 수 있다. 세라믹 하이드록시아파타이트 크로마토그래피 사용 방법은 예컨대, 미국 특허 번호 제8,058,407호(발명의 명칭: "Purification of acidic proteins using ceramic hydroxyapatite chromatography")(상기 특허는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다)에 기술되어 있다.

완충제 교환

실시양태에서, 우선적 환원 처리 개시 이후에 완충제 교환을 수행한다. 완충제 교환을 통해 특정의 원치않는 시약, 예컨대, 원치않는 환원 시약을 제거할 수 있다. 실시양태에서, 완충제 교환을 통해 염, 우레아, 및/또는 DTT를 제거할 수 있다. rCSP가 더 높은 고분자량의 응집체(예컨대, 사량체, 오량체 및 올리고머)를 쉽게 형성하지 못하도록 하는 임의의 완충제 교환 방법이 본 발명의 방법에서 유용하다. 실시양태에서, 완충제 교환은 정용여과 방법, 예컨대, 겔 여과(탈염) 크로마토그래피, 또는 UF/DF 막을 이용하는 접선 유동 여과(TFF)에 의해 수행된다. 실시양태에서, 완충제 교환은 약 5 내지 약 10 kDa MWCO의 UF/DF 막을 이용하는 TFF를 사용하여 수행된다. 실시양태에서, UF/DF 막은 약 5 내지 약 9 kDa MWCO, 약 5 내지 약 8 kDa MWCO, 약 5 내지 약 7 kDa MWCO, 또는 약 5 내지 약 6 kDa MWCO이다. 특정 실시양태에서, 완충제 교환은 약 5 kDa MWCO의 UF/DF 막을 이용하는 TFF를 사용하여 수행된다. 실시양태에서, 막은 생성물 도입 이전에 1x PBS로 평형화된다. 실시양태에서, rCSP는 그 중에서 rCSP가 안정한 상태인 것인 완충제로 교환된다.

실시양태에서, 온화하게 환원된(단량체화된) rCSP는 약 21℃ 내지 23℃에서 324 LMH(ℓ/㎡/시간) 및 720 LMH로 막을 통과시켜 재순환된다. 실시양태에서, rCSP 안정성을 유지시키는 제제 완충제는 막을 통과시켜 재순환된다. 실시양태에서, 1X PBS, 10% (w/v) 아르기닌-HCl(0.5 M 아르기닌-HCl)(예컨대, J.T. 베이커로부터 이용가능, 부품 번호 2067), 1 mM 모노티오글리세롤(예컨대, MP 바이오메디칼즈(미국 캘리포니아주 산타 아나)로부터 이용가능, 카탈로그 번호 155727, 또는 리서치 오가닉(미국 오하이오주 클리블랜드), 카탈로그 번호 0178M))(pH 6.4)는 실온(21 - 23℃)에서 324 LMH로 막을 통과시켜 재순환된다. 실시양태에서, 5 kDa 막에 걸쳐 있는 동안 보유액(정용여과된 로드)에 TMP 21 - 24 psi를 가한다. 실시양태에서, 5 kDa 막에 걸쳐 있는 동안 보유액에 TMP 10 - 15 psi 및 21 - 24 psi를 가한다. 실시양태에서, 다중, 예컨대, 5 내지 10, 보유액 부피(디아볼륨)에 대해 일정 부피 정용여과를 수행한다. 실시양태에서, 예컨대, 3 내지 10의 여러 디아볼륨 후, 보유액을 2x로 농축시키고, 또 다른 여러 디아볼륨에 대해 정용여과시킨다. 보유액을 농축시키고, 1.0 mg/mL로 희석시킨다. 최종 정제된 rCSP를 -80℃에서 냉동 보관한다.

rCSP 안정한 액체 제제

최종 정제된 rCSP를 액체 제제 완충제로 정용여과하여 rCSP 안정한 액체 제제를 생성할 수 있다. 실시양태에서, rCSP 안정한 액체 제제를 통해 rCSP를 고농도로 안정하게 유지시킬 수 있다. 실시양태에서, 액체 제제 완충제 중 rCSP는 보관하는 동안 그의 물리적 및 화학적 안정성을 유지한다. rCSP 액체 제제의 안정성은 주어진 온도에서 선택된 시간 기간 이후에 평가될 수 있다. rCSP 안정성에 대한 음성 지표(또는 불안전성에 대한 지표)로는 예를 들어, rCSP 단량체의 양 또는 비율(%)(전체 rCSP 비율(%))의 감소, 이량체의 양 또는 비율(%)의 증가, 응집체 증가, 분해 생성물 증가, 변성 증가, 활성인 것으로 측정되는 rCSP의 비율(%) 또는 분율의 감소를 포함한다. 실시양태에서, 안정성이 시간 경과에 따른 품질의 척도로 간주될 수 있는 바, 본원에 기술된 바와 같이, rCSP 품질의 지표가 안정성을 표시하는 데 사용된다. 유사하게, rCSP 안정성의 지표는 또한 rCSP 품질을 표시하는 데에 사용될 수 있다. 실시양태에서, 안정한 액체 제제 중 rCSP 안정성은 최소량의 rCSP 단량체, 예컨대, 전체 단백질의 약 80% 내지 약 100% 이상의 존재 또는 유지에 의해 표시된다. 실시양태에서, rCSP 안정성은 약 7일 이상, 약 8일 이상, 약 9일 이상, 약 10일 이상, 약 11일 이상, 약 12일 이상, 약 13일 이상, 약 14일 이상, 약 15일 이상, 약 16일 이상, 약 17일 이상, 약 18일 이상, 약 19일 이상, 약 20일 이상, 약 21일 이상, 약 22일 이상, 약 23일 이상, 약 24일 이상, 약 25일 이상, 약 30일 이상, 약 60일 이상, 약 70일 이상, 약 80일 이상, 약 90일 이상, 약 6개월 이상, 또는 약 1년 이상 동안 보관하였을 때, 약 81% 내지 약 100%, 약 82% 내지 약 100%, 약 83% 내지 약 100%, 약 84% 내지 약 100%, 약 85% 내지 약 100%, 약 86% 내지 약 100%, 약 87% 내지 약 100%, 약 88% 내지 약 100%, 약 89% 내지 약 100%, 약 90% 내지 약 100%, 약 91% 내지 약 100%, 약 92% 내지 약 100%, 약 93% 내지 약 100%, 약 94% 내지 약 100%, 약 95% 내지 약 100%, 약 96% 내지 약 100%, 약 97% 내지 약 100%, 약 98% 내지 약 100%, 약 99% 내지 약 100%, 약 80% 내지 약 99%, 약 81% 내지 약 99%, 약 82% 내지 약 99%, 약 83% 내지 약 99%, 약 84% 내지 약 99%, 약 85% 내지 약 99%, 약 86% 내지 약 99%, 약 87% 내지 약 99%, 약 88% 내지 약 99%, 약 89% 내지 약 99%, 약 90% 내지 약 99%, 약 91% 내지 약 99%, 약 92% 내지 약 99%, 약 93% 내지 약 99%, 약 94% 내지 약 99%, 약 95% 내지 약 99%, 약 96% 내지 약 99%, 약 97% 내지 약 99%, 약 98% 내지 약 99%, 약 80% 내지 약 98%, 약 81% 내지 약 98%, 약 82% 내지 약 98%, 약 83% 내지 약 98%, 약 84% 내지 약 98%, 약 85% 내지 약 98%, 약 86% 내지 약 98%, 약 87% 내지 약 98%, 약 88% 내지 약 98%, 약 89% 내지 약 98%, 약 90% 내지 약 98%, 약 91% 내지 약 98%, 약 92% 내지 약 98%, 약 93% 내지 약 98%, 약 94% 내지 약 98%, 약 95% 내지 약 98%, 약 96% 내지 약 98%, 약 97% 내지 약 98%,약 80% 내지 약 97%, 약 81% 내지 약 97%, 약 82% 내지 약 97%, 약 83% 내지 약 97%, 약 84% 내지 약 97%, 약 85% 내지 약 97%, 약 86% 내지 약 97%, 약 87% 내지 약 97%, 약 88% 내지 약 97%, 약 89% 내지 약 97%, 약 90% 내지 약 97%, 약 91% 내지 약 97%, 약 92% 내지 약 97%, 약 93% 내지 약 97%, 약 94% 내지 약 97%, 약 95% 내지 약 97%, 약 96% 내지 약 97%, 약 80% 내지 약 96%, 약 81% 내지 약 96%, 약 82% 내지 약 96%, 약 83% 내지 약 96%, 약 84% 내지 약 96%, 약 85% 내지 약 96%, 약 86% 내지 약 96%, 약 87% 내지 약 96%, 약 88% 내지 약 96%, 약 89% 내지 약 96%, 약 90% 내지 약 96%, 약 91% 내지 약 96%, 약 92% 내지 약 96%, 약 93% 내지 약 96%, 약 94% 내지 약 96%, 약 95% 내지 약 96%, 약 80% 내지 약 95%, 약 81% 내지 약 95%, 약 82% 내지 약 95%, 약 83% 내지 약 95%, 약 84% 내지 약 95%, 약 85% 내지 약 95%, 약 86% 내지 약 95%, 약 87% 내지 약 95%, 약 88% 내지 약 95%, 약 89% 내지 약 95%, 약 90% 내지 약 95%, 약 91% 내지 약 95%, 약 92% 내지 약 95%, 약 93% 내지 약 95%, 약 94% 내지 약 95%, 약 80% 내지 약 94%, 약 81% 내지 약 94%, 약 82% 내지 약 94%, 약 83% 내지 약 94%, 약 84% 내지 약 94%, 약 85% 내지 약 94%, 약 86% 내지 약 94%, 약 87% 내지 약 94%, 약 88% 내지 약 94%, 약 89% 내지 약 94%, 약 90% 내지 약 94%, 약 91% 내지 약 94%, 약 92% 내지 약 94%, 약 93% 내지 약 94%, 약 80% 내지 약 93%, 약 81% 내지 약 93%, 약 82% 내지 약 93%, 약 83% 내지 약 93%, 약 84% 내지 약 93%, 약 85% 내지 약 93%, 약 86% 내지 약 93%, 약 87% 내지 약 93%, 약 88% 내지 약 93%, 약 89% 내지 약 93%, 약 90% 내지 약 93%, 약 91% 내지 약 93%, 약 92% 내지 약 93%, 약 80% 내지 약 92%, 약 81% 내지 약 92%, 약 82% 내지 약 92%, 약 83% 내지 약 92%, 약 84% 내지 약 92%, 약 85% 내지 약 92%, 약 86% 내지 약 92%, 약 87% 내지 약 92%, 약 88% 내지 약 92%, 약 89% 내지 약 92%, 약 90% 내지 약 92%, 약 91% 내지 약 92%, 약 80% 내지 약 91%, 약 81% 내지 약 91%, 약 82% 내지 약 91%, 약 83% 내지 약 91%, 약 84% 내지 약 91%, 약 85% 내지 약 91%, 약 86% 내지 약 91%, 약 87% 내지 약 91%, 약 88% 내지 약 91%, 약 89% 내지 약 91%, 약 90% 내지 약 91%, 약 80% 내지 약 90%, 약 81% 내지 약 90%, 약 82% 내지 약 90%, 약 83% 내지 약 90%, 약 84% 내지 약 90%, 약 85% 내지 약 90%, 약 86% 내지 약 90%, 약 87% 내지 약 90%, 약 88% 내지 약 90%, 약 89% 내지 약 90%, 약 80% 내지 약 89%, 약 81% 내지 약 89%, 약 82% 내지 약 89%, 약 83% 내지 약 89%, 약 84% 내지 약 89%, 약 85% 내지 약 89%, 약 86% 내지 약 89%, 약 87% 내지 약 89%, 약 88% 내지 약 89%, 약 80% 내지 약 88%, 약 81% 내지 약 88%, 약 82% 내지 약 88%, 약 83% 내지 약 88%, 약 84% 내지 약 88%, 약 85% 내지 약 88%, 약 86% 내지 약 88%, 약 87% 내지 약 88%, 약 80%, 약 81%, 약 82%, 약 83%, 약 84%, 약 85%, 약 86%, 약 87%, 약 88%, 약 89%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 또는 약 100%의 rCSP 단량체의 존재 또는 유지에 의해 표시된다. rCSP 단량체의 양은 본원에 기술된 바와 같이, 또는 당업계에 공지된 임의의 적절한 방법, 예컨대, SE-HPLC에 의해 측정될 수 있다. 보관하기 전 rCSP 단량체의 양은 비교를 위해 사용될 수 있다.

실시양태에서, 안정한 액체 제제 중의 rCSP 안정성은 rCSP 단량체의 최대 감소율에 의해, 예컨대, 약 9일 내지 1년 동안에 걸쳐 보관하였을 때, 약 10% 이하로 감소되는 것으로 표시된다. 실시양태에서, 안정한 액체 제제 중 rCSP 단량체의 양은 약 7일 이상, 약 8일 이상, 약 9일 이상, 약 10일 이상, 약 11일 이상, 약 12일 이상, 약 13일 이상, 약 14일 이상, 약 15일 이상, 약 16일 이상, 약 17일 이상, 약 18일 이상, 약 19일 이상, 약 20일 이상, 약 21일 이상, 약 22일 이상, 약 23일 이상, 약 24일 이상, 약 25일 이상, 약 30일 이상, 약 60일 이상, 약 70일 이상, 약 80일 이상, 약 90일 이상, 약 6개월 이상, 또는 약 1년 이상 동안 보관되었을 때, 약 0%, 0.5%, 1%, 1.5%, 2%, 2.5%, 3%, 3.5%, 4%, 4.5%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 또는 20% 이하만큼 감소된다. 특정 실시양태에서, rCSP 안정성은 약 9일 내지 약 25일 동안 보관되었을 때, rCSP 단량체의 최대 감소율이 약 1% 내지 약 3% 또는 내지 약 5% 이하인 것으로 표시된다. 특정 실시양태에서, rCSP 안정성은 약 9일 내지 약 25일 동안 보관되었을 때, rCSP 단량체의 최대 감소율이 약 1% 이하인 것으로 표시된다.

실시양태에서, 안정한 액체 제제 중 rCSP 안정성은 예컨대, rCSP 이량체, 응집화된 종, 변성된 종, 또는 분해 생성물 양의 최대 증가량 이하로 표시된다. 실시양태에서, 안정한 액체 제제 중 rCSP 이량체, 응집화된 종, 변성된 종, 및/또는 분해 생성물의 양은 약 7일 이상, 약 8일 이상, 약 9일 이상, 약 10일 이상, 약 11일 이상, 약 12일 이상, 약 13일 이상, 약 14일 이상, 약 15일 이상, 약 16일 이상, 약 17일 이상, 약 18일 이상, 약 19일 이상, 약 20일 이상, 약 21일 이상, 약 22일 이상, 약 23일 이상, 약 24일 이상, 약 25일 이상, 약 30일 이상, 약 60일 이상, 약 70일 이상, 약 80일 이상, 약 90일 이상, 약 6개월 이상, 또는 약 1년 이상 동안 보관되었을 때, 약 0%, 0.5%, 1%, 1.5%, 2%, 2.5%, 3%, 3.5%, 4%, 4.5%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 또는 10% 이하만큼 증가한다. 특정 실시양태에서, rCSP 안정성은 약 20 또는 25일 이상 동안 보관되었을 때, rCSP 이량체, 응집화된 종, 변성된 종, 또는 분해 생성물의 최대 증가율이 약 1% 내지 약 3% 또는 내지 약 5% 이하인 것으로 표시된다. 특정 실시양태에서, rCSP 안정성은 약 20 또는 25일 이상 동안 보관되었을 때, 응집화된 종의 최대 증가율이 약 1% 이하인 것으로 표시된다. 특정 실시양태에서, rCSP 안정성은 약 20 또는 25일 이상 동안 보관되었을 때, 분해 생성물의 최대 증가율이 약 5% 이하인 것으로 표시된다. 실시양태에서, rCSP 안정성은 rCSP 이량체, 응집화된 종, 변성된 종, 또는 분해 생성물이 10% 미만으로 존재하는 것으로 표시된다. 실시양태에서, rCSP 안정성은 rCSP 이량체, 응집화된 종, 변성된 종, 또는 분해 생성물이 전체 단백질, 또는 수득된, 정제된 CSP 중 10% 이하, 9% 이하, 8% 이하, 7% 이하, 6% 이하, 5% 이하, 4% 이하, 3% 이하, 2% 이하 또는 1% 이하로 존재하는 것으로 표시된다. rCSP 이량체, 응집화된 종 또는 분해 생성물의 양은 본원에 기술된 방법, 또는 당업계의 임의의 적절한 방법, 예컨대, SE-HPLC에 의해 측정될 수 있다. 보관 전(예컨대, T=0) 양은 비교를 위해 사용될 수 있다.

실시양태에서, rCSP의 안정한 유지도는 rCSP의 총 검출량, 대조군과 비교하였을 때, 전체 rCSP의 상대적인 차이(%), 또는 대조군과 비교하였을 때, rCSP 순도의 상대적인 차이(%)에 의해 표시된다. 실시양태에서, rCSP의 안정한 유지도는 rCSP의 총 검출량이 약 70% 내지 약 95%이거나, 대조군과 비교하였을 때, 전체 rCSP의 상대적인 차이(%)가 약 -5% 내지 약 5% 이하이거나, 또는 대조군과 비교하였을 때, rCSP 순도의 상대적인 차이(%)가 약 -5% 내지 약 5% 이하인 것으로 표시된다. 실시양태에서, 대조군과 비교하였을 때, 전체 rCSP의 상대적인 차이(%) 또는 rCSP 순도의 상대적인 차이(%)는 약 -5% 내지 약 5%, 약 -4% 내지 약 4%, 약 -3% 내지 약 3%, 약 -2% 내지 약 2%, 약 -2% 내지 약 1%, 약 -2% 내지 약 0.5%, 약 -2% 내지 약 0%, 또는 약 0% 내지 약 2%이다. 실시양태에서, 대조군은 시점 0, 또는 -80℃에서 보관된 시료이다.

실시양태에서, rCSP의 총 검출량은 약 70% 내지 약 95%, 약 70% 내지 약 90%, 약 70% 내지 약 85%, 약 70% 내지 약 80%, 약 75% 내지 약 95%, 약 75% 내지 약 90%, 약 75% 내지 약 85%, 약 80% 내지 약 95%, 약 80% 내지 약 90%, 약 85% 내지 약 95%, 약 72% 내지 약 92%, 약 70%, 약 11%, 약 72%, 약 73%, 약 74%, 약 75%, 약 76%, 약 77%, 약 78%, 약 79%, 약 80%, 약 81%, 약 82%, 약 83%, 약 84%, 약 85%, 약 86%, 약 87%, 약 88%, 약 89%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 또는 약 95%이다.

실시양태에서, rCSP는 약 4℃ 내지 약 25℃ 안정한 액체 제제 중에서 안정하게 유지된다. 실시양태에서, rCSP는 약 4℃ 내지 약 25℃, 약 4℃ 내지 약 24℃, 약 4℃ 내지 약 23℃, 약 4℃ 내지 약 22℃, 약 4℃ 내지 약 21℃, 약 4℃ 내지 약 20℃, 약 4℃ 내지 약 19℃, 약 4℃ 내지 약 18℃, 약 4℃ 내지 약 17℃, 약 4℃ 내지 약 16℃, 약 4℃ 내지 약 15℃, 약 4℃ 내지 약 14℃, 약 4℃ 내지 약 13℃, 약 4℃ 내지 약 12℃, 약 4℃ 내지 약 11℃, 약 4℃ 내지 약 10℃, 약 4℃ 내지 약 9℃, 약 4℃ 내지 약 8℃, 약 4℃ 내지 약 7℃, 약 4℃ 내지 약 6℃, 또는 약 4℃ 내지 약 5℃에서 안정한 액체 제제 중에서 유지된다. 특정 실시양태에서, rCSP는 약 4℃에서 안정한 액체 제제 중에서 안정하게 유지된다.

실시양태에서, rCSP는 안정한 액체 제제 중에서 고농도로, 예컨대, 약 1 mg/ml 내지 약 50 mg/ml 이상의 농도로 유지된다. 실시양태에서, rCSP는 안정한 제제 중에서 약 1 mg/ml 이상, 약 1.5 mg/ml 이상, 약 2 mg/ml 이상, 약 2.5 mg/ml 이상, 약 3 mg/ml 이상, 약 3.5 mg/ml 이상, 약 4 mg/ml 이상, 약 4.5 mg/ml 이상, 약 5 mg/ml 이상, 약 6 mg/ml 이상, 약 7 mg/ml 이상, 약 8 mg/ml 이상, 약 9 mg/ml 이상, 약 10 mg/ml 이상, 약 15 mg/ml 이상, 약 20 mg/ml 이상, 약 25 mg/ml 이상, 약 30 mg/ml 이상, 약 35 mg/ml 이상, 약 40 mg/ml 이상, 약 45 mg/ml 이상, 약 50 mg/ml, 약 2 내지 약 50 mg/ml, 약 3 내지 약 50 mg/ml, 약 4 내지 약 50 mg/ml, 약 5 내지 약 50 mg/ml, 약 10 내지 약 50 mg/ml, 약 15 내지 약 50 mg/ml, 약 20 내지 약 50 mg/ml, 약 30 내지 약 50 mg/ml, 약 40 내지 약 50 mg/ml, 약 2 내지 약 40 mg/ml, 약 3 내지 약 40 mg/ml, 약 4 내지 약 40 mg/ml, 약 5 내지 약 40 mg/ml, 약 10 내지 약 40 mg/ml, 약 15 내지 약 40 mg/ml, 약 20 내지 약 40 mg/ml, 약 30 내지 약 40 mg/ml, 약 2 내지 약 30 mg/ml, 약 3 내지 약 30 mg/ml, 약 4 내지 약 30 mg/ml, 약 5 내지 약 30 mg/ml, 약 10 내지 약 30 mg/ml, 약 15 내지 약 30 mg/ml, 약 20 내지 약 30 mg/ml, 약 2 내지 약 20 mg/ml, 약 3 내지 약 20 mg/ml, 약 4 내지 약 20 mg/ml, 약 5 내지 약 20 mg/ml, 약 10 내지 약 20 mg/ml, 약 15 내지 약 20 mg/ml, 약 2 내지 약 15 mg/ml, 약 3 내지 약 15 mg/ml, 약 4 내지 약 15 mg/ml, 약 5 내지 약 15 mg/ml, 약 10 내지 약 15 mg/ml, 약 2 내지 약 10 mg/ml, 약 3 내지 약 10 mg/ml, 약 4 내지 약 10 mg/ml, 약 5 내지 약 10 mg/ml, 약 6 내지 약 10 mg/ml, 약 7 내지 약 10 mg/ml, 약 8 내지 약 10 mg/ml, 약 9 내지 약 10 mg/ml, 약 1 내지 약 9 mg/ml, 약 2 내지 약 9 mg/ml, 약 3 내지 약 9 mg/ml, 약 4 내지 약 9 mg/ml, 약 5 내지 약 9 mg/ml, 약 6 내지 약 9 mg/ml, 약 7 내지 약 9 mg/ml, 약 8 내지 약 9 mg/ml, 약 1 내지 약 8 mg/ml, 약 2 내지 약 8 mg/ml, 약 3 내지 약 8 mg/ml, 약 4 내지 약 8 mg/ml, 약 5 내지 약 8 mg/ml, 약 6 내지 약 8 mg/ml, 약 7 내지 약 8 mg/ml, 약 1 내지 약 7 mg/ml, 약 2 내지 약 7 mg/ml, 약 3 내지 약 7 mg/ml, 약 4 내지 약 7 mg/ml, 약 5 내지 약 7 mg/ml, 약 6 내지 약 7 mg/ml, 약 1 내지 약 6 mg/ml, 약 2 내지 약 6 mg/ml, 약 3 내지 약 6 mg/ml, 약 4 내지 약 6 mg/ml, 약 5 내지 약 6 mg/ml, 약 1 내지 약 5 mg/ml, 약 2 내지 약 5 mg/ml, 약 3 내지 약 5 mg/ml, 약 4 내지 약 5 mg/ml, 약 1 내지 약 4 mg/ml, 약 2 내지 약 4 mg/ml, 약 3 내지 약 4 mg/ml, 약 1 내지 약 3 mg/ml, 약 2 내지 약 4 mg/ml, 또는 약 1 내지 약 2 mg/ml의 농도로 유지된다.

실시양태에서, rCSP 안정한 액체 제제는 온화한 환원제, 예컨대, DTT, 시스테인, 아세틸시스테인, 글루타티온, 모노티오글리세롤(MTG), 티오글리콜레이트, 디티오트레이톨, 디티오에리트리톨, 아세틸시스테인, 2-머캅토에탄올(B-머캅토에탄올), TCEP-HCl(순수, 결정질 트리스(2-카복시에틸)포스핀 하이드로클로라이드), 또는 2- 머캅토에틸아민-HCl(2-MEA), 또는 당업계에 공지된 임의의 다른 적절한 환원제를 포함한다. 실시양태에서, 온화한 환원제는 DTT, MTG, 아세틸시스테인, 글루타티온, 티오글리콜레이트, 또는 시스테인이다. 실시양태에서, 온화한 환원제는 MTG, 시스테인, 또는 아세틸시스테인이다. 실시양태에서, 온화한 환원제는 최종 농도 약 0.5 mM 내지 약 4 mM, 약 0.5 mM 내지 약 3 mM, 약 0.5 mM 내지 약 2 mM, 약 0.5 mM 내지 약 1 mM, 약 0.6 mM 내지 약 2 mM, 약 0.6 mM 내지 약 1.5 mM, 약 0.6 mM 내지 약 1.4 mM, 약 0.6 mM 내지 약 1.3 mM, 약 0.6 mM 내지 약 1.2 mM, 약 0.6 mM 내지 약 1.1 mM, 약 0.6 mM 내지 약 1.05 mM, 약 0.6 mM 내지 약 1 mM, 약 0.7 mM 내지 약 2 mM, 약 0.7 mM 내지 약 1.5 mM, 약 0.7 mM 내지 약 1.4 mM, 약 0.7 mM 내지 약 1.3 mM, 약 0.7 mM 내지 약 1.2 mM, 약 0.7 mM 내지 약 1.1 mM, 약 0.7 mM 내지 약 1.05 mM, 약 0.7 mM 내지 약 1 mM, 약 0.8 mM 내지 약 2 mM, 약 0.8 mM 내지 약 1.5 mM, 약 0.8 mM 내지 약 1.4 mM, 약 0.8 mM 내지 약 1.3 mM, 약 0.8 mM 내지 약 1.2 mM, 약 0.8 mM 내지 약 1.1 mM, 약 0.8 mM 내지 약 1.05 mM, 약 0.8 mM 내지 약 1 mM, 약 0.9 mM 내지 약 2 mM, 약 0.9 mM 내지 약 1.5 mM, 약 0.9 mM 내지 약 1.4 mM, 약 0.9 mM 내지 약 1.3 mM, 약 0.9 mM 내지 약 1.2 mM, 약 0.9 mM 내지 약 1.1 mM, 약 0.9 mM 내지 약 1.05 mM, 약 0.9 mM 내지 약 1 mM, 약 1 mM 내지 약 1.5 mM, 약 1 mM 내지 약 1.4 mM, 약 1 mM 내지 약 1.3 mM, 약 1 mM 내지 약 1.2 mM, 약 1 mM 내지 약 1.1 mM, 약 0.5 mM, 약 0.6 mM, 약 0.7 mM, 약 0.8 mM, 약 0.9 mM, 약 1.0 mM, 약 1.1 mM, 약 1.2 mM, 약 1.3 mM, 약 1.4 mM, 약 1.5 mM, 약 1.6 mM, 약 1.7 mM, 약 1.8 mM, 약 1.9 mM, 약 2.0 mM, 약 3.0 mM, 약 4.0 mM, 또는 약 5.0 mM의 MTG이다.

실시양태에서, rCSP 안정한 액체 제제는 탈응집화제를 포함한다. 실시양태에서, 탈응집화제는 아르기닌, 구아니딘 HCl, 계면활성제, 우레아, 또는 당업계에 공지되어 있는 임의의 다른 적절한 탈응집화제이다. 실시양태에서, 제제는 약 1% 내지 약 25% w/v 이상의 아르기닌을 포함한다. 실시양태에서, 보관용 또는 제제 완충제는 약 1% 내지 약 24% w/v 아르기닌, 약 1% 내지 약 23% w/v 아르기닌, 약 1% 내지 약 22% w/v 아르기닌, 약 1% 내지 약 21% w/v 아르기닌, 약 1% 내지 약 20% w/v 아르기닌, 약 1% 내지 약 19% w/v 아르기닌, 약 1% 내지 약 18% w/v 아르기닌, 약 1% 내지 약 17% w/v 아르기닌, 약 1% 내지 약 16% w/v 아르기닌, 약 1% 내지 약 15% w/v 아르기닌, 약 1% 내지 약 14% w/v 아르기닌, 약 1% 내지 약 13% w/v 아르기닌, 약 1% 내지 약 12% w/v 아르기닌, 약 1% 내지 약 11% w/v 아르기닌, 약 1% 내지 약 10% w/v 아르기닌, 약 1% 0내지 약 9% w/v 아르기닌, 약 1% 0내지 약 8% w/v 아르기닌, 약 1% 0내지 약 7% w/v 아르기닌, 약 1% 0내지 약 6% w/v 아르기닌, 약 1% 0내지 약 5% w/v 아르기닌, 약 5% 내지 약 24% w/v 아르기닌, 약 5% 내지 약 23% w/v 아르기닌, 약 5% 내지 약 22% w/v 아르기닌, 약 5% 내지 약 21 o w/v 아르기닌, 약 5% 내지 약 20% w/v 아르기닌, 약 5% 내지 약 19% w/v 아르기닌, 약 5% 내지 약 18% w/v 아르기닌, 약 5% 내지 약 17% w/v 아르기닌, 약 5% 내지 약 16% w/v 아르기닌, 약 5% 내지 약 15% w/v 아르기닌, 약 5% 내지 약 14% w/v 아르기닌, 약 5% 내지 약 13% w/v 아르기닌, 약 5% 내지 약 12% w/v 아르기닌, 약 5% 내지 약 11% w/v 아르기닌, 약 5% 내지 약 10% w/v 아르기닌, 약 7% 내지 약 24% w/v 아르기닌, 약 7% 내지 약 23% w/v 아르기닌, 약 7% 내지 약 22% w/v 아르기닌, 약 7% 내지 약 21% w/v 아르기닌, 약 7% 내지 약 20% w/v 아르기닌, 약 7% 내지 약 19% w/v 아르기닌, 약 7% 내지 약 18% w/v 아르기닌, 약 7% 내지 약 17% w/v 아르기닌, 약 7% 내지 약 16% w/v 아르기닌, 약 7% 내지 약 15% w/v 아르기닌, 약 7% 내지 약 14% w/v 아르기닌, 약 7% 내지 약 13% w/v 아르기닌, 약 7% 내지 약 12% w/v 아르기닌, 약 7% 내지 약 11% w/v 아르기닌, 약 7% 내지 약 10% w/v 아르기닌, 약 8% 내지 약 24% w/v 아르기닌, 약 8% 내지 약 23% w/v 아르기닌, 약 8% 내지 약 22% w/v 아르기닌, 약 8% 내지 약 21% w/v 아르기닌, 약 8% 내지 약 20% w/v 아르기닌, 약 8% 내지 약 19% w/v 아르기닌, 약 8% 내지 약 18% w/v 아르기닌, 약 8% 내지 약 17% w/v 아르기닌, 약 8% 내지 약 16% w/v 아르기닌, 약 8% 내지 약 15% w/v 아르기닌, 약 8% 내지 약 14% w/v 아르기닌, 약 8% 내지 약 13% w/v 아르기닌, 약 8% 내지 약 12% w/v 아르기닌, 약 8% 내지 약 11% w/v 아르기닌, 약 8% 내지 약 10% w/v 아르기닌, 약 9% 내지 약 24% w/v 아르기닌, 약 9% 내지 약 23% w/v 아르기닌, 약 9% 내지 약 22% w/v 아르기닌, 약 9% 내지 약 21% w/v 아르기닌, 약 9% 내지 약 20% w/v 아르기닌, 약 9% 내지 약 19% w/v 아르기닌, 약 9% 내지 약 18% w/v 아르기닌, 약 9% 내지 약 17% w/v 아르기닌, 약 9% 내지 약 16% w/v 아르기닌, 약 9% 내지 약 15% w/v 아르기닌, 약 9% 내지 약 14% w/v 아르기닌, 약 9% 내지 약 13% w/v 아르기닌, 약 9% 내지 약 12% w/v 아르기닌, 약 9% 내지 약 11% w/v 아르기닌, 약 9% 내지 약 10% w/v 아르기닌, 약 10% 내지 약 24% w/v 아르기닌, 약 10% 내지 약 23% w/v 아르기닌, 약 10% 내지 약 22% w/v 아르기닌, 약 10% 내지 약 21% w/v 아르기닌, 약 10% 내지 약 20% w/v 아르기닌, 약 10% 내지 약 19% w/v 아르기닌, 약 10% 내지 약 18% w/v 아르기닌, 약 10% 내지 약 17% w/v 아르기닌, 약 10% 내지 약 16% w/v 아르기닌, 약 10% 내지 약 15% w/v 아르기닌, 약 10% 내지 약 14% w/v 아르기닌, 약 10% 내지 약 13% w/v 아르기닌, 약 10% 내지 약 12% w/v 아르기닌, 약 10% 내지 약 11% w/v 아르기닌, 약 11% 내지 약 24% w/v 아르기닌, 약 11% 내지 약 23% w/v 아르기닌, 약 l l o 내지 약 22% w/v 아르기닌, 약 11% 내지 약 21% w/v 아르기닌, 약 11% 내지 약 20% w/v 아르기닌, 약 11% 내지 약 19% w/v 아르기닌, 약 11% 내지 약 18% w/v 아르기닌, 약 1 l% 내지 약 17% w/v 아르기닌, 약 11% 내지 약 16% w/v 아르기닌, 약 11% 내지 약 15% w/v 아르기닌, 약 11% 내지 약 14% w/v 아르기닌, 약 11% 내지 약 13% w/v 아르기닌, 약 11% 내지 약 12% w/v 아르기닌, 약 12% 내지 약 24% w/v 아르기닌, 약 12% 내지 약 23% w/v 아르기닌, 약 12% 내지 약 22% w/v 아르기닌, 약 12% 내지 약 21% w/v 아르기닌, 약 12% 내지 약 20% w/v 아르기닌, 약 12% 내지 약 19% w/v 아르기닌, 약 12% 내지 약 18% w/v 아르기닌, 약 12% 내지 약 17% w/v 아르기닌, 약 12% 내지 약 16% w/v 아르기닌, 약 12% 내지 약 15% w/v 아르기닌, 약 12% 내지 약 14% w/v 아르기닌, 또는 약 12% 내지 약 13% w/v 아르기닌을 포함한다. 특정 실시양태에서, 보관용 완충제는 약 10% 아르기닌을 포함한다.

실시양태에서, rCSP 안정한 액체 제제는 완충제를 포함한다. 실시양태에서, 완충제는 PBS, Hepes, 히스티딘, 또는 트리스 완충제 트리스 완충제이다. 실시양태에서, 완충제는 1X PBS 또는 0.5X PBS이다. 실시양태에서, 안정한 rCSP 제제의 pH는 약 6.0 내지 약 pH 7.5이다. 실시양태에서, 안정한 rCSP 제제의 pH는 약 pH 6.0, 약 pH 6.1, 약 pH 6.2, 약 pH 6.3, 약 pH 6.4, 약 pH 6.5, 약 pH 6.6, 약 pH 6.7, 약 pH 6.8, 약 pH 6.9, 약 pH 7.0, 약 pH 7.1, 약 pH 7.2, 약 pH 7.3, 약 pH 7.4, 또는 약 pH 7.5. 실시양태에서, 안정한 rCSP 제제의 pH는 약 pH 6.0 내지 약 pH 7.4, 약 pH 6.0 내지 약 pH 7.3, 약 pH 6.0 내지 약 pH 7.2, 약 pH 6.0 내지 약 pH 7.1, 약 pH 6.0 내지 약 pH 7.0, 약 pH 6.0 내지 약 pH 7.5, 약 pH 6.0 내지 약 pH 7.4, 약 pH 6.0 내지 약 pH 7.3, 약 pH 6.0 내지 약 pH 7.2, 약 pH 6.0 내지 약 pH 7.1, 약 pH 6.0 내지 약 pH 7.0, 약 pH 6.0 내지 약 pH 6.9, 약 pH 6.0 내지 약 pH 6.8, 약 pH 6.0 내지 약 pH 6.7, 약 pH 6.0 내지 약 pH 6.6, 약 pH 6.0 내지 약 pH 6.5, 약 pH 6.1 내지 약 pH 7.5, 약 pH 6.1 내지 약 pH 7.4, 약 pH 6.1 내지 약 pH 7.3, 약 pH 6.1 내지 약 pH 7.2, 약 pH 6.1 내지 약 pH 7.1, 약 pH 6.1 내지 약 pH 7.0, 약 pH 6.1 내지 약 pH 6.9, 6.1 내지 약 pH 6.8, 약 pH 6.1 내지 약 pH 6.7, 약 pH 6.1 내지 약 pH 6.6, 약 pH 6.1 내지 약 pH 6.5, 약 pH 6.2 내지 약 pH 7.5, 약 pH 6.2 내지 약 pH 7.4, 약 pH 6.2 내지 약 pH 7.3, 약 pH 6.2 내지 약 pH 7.2, 약 pH 6.2 내지 약 pH 7.1, 약 pH 6.2 내지 약 pH 7.0, 6.2 내지 약 pH 6.9, 약 pH 6.2 내지 약 pH 6.8, 약 pH 6.2 내지 약 pH 6.7, 약 pH 6.2 내지 약 pH 6.6, 약 pH 6.0 내지 약 pH 6.5, 약 pH 6.3 내지 약 pH 7.5, 약 pH 6.3 내지 약 pH 7.4, 약 pH 6.3 내지 약 pH 7.3, 약 pH 6.3 내지 약 pH 7.2, 약 pH 6.3 내지 약 pH 7.1, 약 pH 6.3 내지 약 pH 7.0, 6.3 내지 약 pH 6.9, 약 pH 6.3 내지 약 pH 6.8, 약 pH 6.3 내지 약 pH 6.7, 약 pH 6.3 내지 약 pH 6.6, 약 pH 6.3 내지 약 pH 6.5, 약 pH 6.4 내지 약 pH 7.5, 약 pH 6.4 내지 약 pH 7.4, 약 pH 6.4 내지 약 pH 7.3, 약 pH 6.4 내지 약 pH 7.2, 약 pH 6.4 내지 약 pH 7.1, 약 pH 6.4 내지 약 pH 7.0, 6.4 내지 약 pH 6.9, 약 pH 6.4 내지 약 pH 6.8, 약 pH 6.4 내지 약 pH 6.7, 약 pH 6.4 내지 약 pH 6.6, 약 pH 6.4 내지 약 pH 6.5, 약 pH 6.5 내지 약 pH 7.5, 약 pH 6.5 내지 약 pH 7.4, 약 pH 6.5 내지 약 pH 7.3, 약 pH 6.5 내지 약 pH 7.2, 약 pH 6.5 내지 약 pH 7.1, 약 pH 6.5 내지 약 pH 7.0, 6.6 내지 약 pH 6.9, 약 pH 6.6 내지 약 pH 6.8, 약 pH 6.6 내지 약 pH 6.7, 약 pH 6.6 내지 약 pH 6.6, 약 pH 6.6 내지 약 pH 6.5, 약 pH 6.6 내지 약 pH 7.5, 약 pH 6.6 내지 약 pH 7.4, 약 pH 6.6 내지 약 pH 7.3, 약 pH 6.6 내지 약 pH 7.2, 약 pH 6.6 내지 약 pH 7.1, 약 pH 6.6 내지 약 pH 7.0, 6.6 내지 약 pH 6.9, 약 pH 6.6 내지 약 pH 6.8, 약 pH 6.6 내지 약 pH 6.7, 약 pH 6.7 내지 약 pH 7.5, 약 pH 6.7 내지 약 pH 7.4, 약 pH 6.7 내지 약 pH 7.3, 약 pH 6.7 내지 약 pH 7.2, 약 pH 6.7 내지 약 pH 7.1, 약 pH 6.7 내지 약 pH 7.0, 6.7 내지 약 pH 6.9, 약 pH 6.7 내지 약 pH 6.8, 약 pH 6.7 내지 약 pH 6.7, 약 pH 6.7 내지 약 pH 6.6, 약 pH 6.7 내지 약 pH 6.5, 약 pH 6.8 내지 약 pH 7.5, 약 pH 6.8 내지 약 pH 7.4, 약 pH 6.8 내지 약 pH 7.3, 약 pH 6.8 내지 약 pH 7.2, 약 pH 6.8 내지 약 pH 7.1, 약 pH 6.8 내지 약 pH 7.0, 6.8 내지 약 pH 6.9, 약 pH 6.8 내지 약 pH 6.8, 약 pH 6.8 내지 약 pH 6.7, 약 pH 6.9 내지 약 pH 7.5, 약 pH 6.9 내지 약 pH 7.4, 약 pH 6.9 내지 약 pH 7.3, 약 pH 6.9 내지 약 pH 7.2, 약 pH 6.9 내지 약 pH 7.1, pH 6.9 내지 약 pH 7.0, 약 pH 7.0 내지 약 pH 7.5, 약 pH 7.0 내지 약 pH 7.4, 약 pH 7.0 내지 약 pH 7.3, 약 pH 7.0 내지 약 pH 7.2, 또는 약 pH 7.0 내지 약 pH 7.1이다.

실시양태에서, rCSP 안정한 액체 제제는 1X PBS(pH 약 6.4 내지 약 7.2) 중 약 1 내지 약 5, 약 1 내지 약 10, 약 1 내지 약 20, 약 1 내지 약 30, 약 1 내지 약 40, 또는 약 1 내지 약 50 mg/ml rCSP, 약 0.5 내지 약 1.5 mM MTG 및 약 10% 내지 약 20% 아르기닌을 포함한다. 특정 실시양태에서, 안정한 rCSP 제제는 1X PBS(pH 약 6.4 내지 약 7.2) 중 1 mM MTG 및 10% 아르기닌을 포함한다. 실시양태에서, pH는 약 6.4 내지 7.0이다. 특정 실시양태에서, pH는 약 6.7이다. 실시양태에서, rCSP 안정한 액체 제제는 약 4℃의 보관 온도에서 보관된다.

실시양태에서, rCSP 안정한 액체 제제는 약 1 내지 약 5, 약 1 내지 약 10, 약 1 내지 약 20, 약 1 내지 약 30, 약 1 내지 약 40, 또는 약 1 내지 약 50 mg/ml rCSP, 약 0.5 내지 약 1.5 mM MTG, 및 약 1% 내지 약 20% 아르기닌, in 0.5X or 1X PBS(pH 약 6.0 내지 약 7.5) 중 약 1 내지 약 5, 약 1 내지 약 10, 약 1 내지 약 20, 약 1 내지 약 30, 약 1 내지 약 40, 또는 약 1 내지 약 50 mg/ml rCSP, 약 0.5 내지 약 1.5 mM MTG, 및 약 1% 내지 약 20% 아르기닌을 포함한다.

실시양태에서, rCSP 안정한 액체 제제는 0.5X or 1X PBS(pH 약 6.4 내지 약 7.2) 중 약 1 내지 약 5, 약 1 내지 약 10, 약 1 내지 약 20, 약 1 내지 약 30, 약 1 내지 약 40, 또는 약 1 내지 약 50 mg/ml rCSP, 약 0.5 내지 약 1.5 mM MTG, 및 약 10% 내지 약 20% 아르기닌을 포함한다.

실시양태에서, rCSP 안정한 액체 제제는 0.5X or 1X PBS(pH 약 6.4 내지 약 7.0) 중 약 1 내지 약 5, 약 1 내지 약 10, 약 1 내지 약 20, 약 1 내지 약 30, 약 1 내지 약 40, 또는 약 1 내지 약 50 mg/ml rCSP, 약 0.5 내지 약 1.5 mM MTG, 및 약 10% 내지 약 20% 아르기닌을 포함한다.

실시양태에서, rCSP 안정한 액체 제제는 1X PBS(pH 약 6.4 내지 약 7.0) 중 약 1 내지 약 5 또는 약 1 내지 약 10 mg/ml rCSP, 약 0.8 내지 약 1.2 mM MTG, 약 5% 내지 약 15% 아르기닌을 포함한다.

실시양태에서, rCSP 안정한 액체 제제는 1X PBS(pH 약 6.4 내지 약 7.0) 중 약 1 내지 약 5 mg/ml rCSP, 약 1.0 mM MTG, 및 약 10% 아르기닌을 포함한다.

다른 실시양태에서, rCSP 안정한 액체 제제는 10 mM 트리스 염기, 4.2% 만닛톨, 2% 아르기닌-HCl, 100 μM EDTA, 및 1 mM MTG(pH 7.5)를 포함한다. 실시양태에서, 안정한 rCSP 제제는 10 mM 히스티딘, 4.2% 만닛톨, 2% 아르기닌-HCl, 100 μM EDTA, 및 1 mM MTG(pH 7.0)를 포함한다.

실시양태에서, rCSP 안정한 액체 제제는 PBS(약 pH 6.4 내지 약 pH 7.0) 중 약 0.5 mM MTG 내지 약 1.5 mM MTG 및 약 0.3 내지 약 0.7 M 아르기닌을 포함한다. 실시양태에서, rCSP 안정한 액체 제제는 PBS(약 pH 6.4 내지 약 pH 7.0) 중 약 1 mM MTG 및 약 0.2 내지 약 0.7 M 아르기닌을 포함한다. 실시양태에서, rCSP 안정한 액체 제제는 PBS(약 pH 6.4 내지 약 pH 7.0) 중 약 1 mM 글루타티온 또는 1 mM 시스테인, 및 약 1% w/v 아르기닌을 포함한다. 실시양태에서, rCSP 안정한 액체 제제는 PBS(약 pH 7.0) 중 약 1 mM MTG 및 약 1% w/v 아르기닌 또는 약 0.5 M 아르기닌을 포함한다.

추가의 실시양태에서, 본 발명의 안정한 액체 제제는 환자에게 투여되는 제품, 예컨대, 백신 제조를 위한 rCSP의 사용을 용이하게 한다. 이와 관련하여, rCSP 제제에서 사용되는 부형제는 미국 약전-국립 처방집(USP-NF)에 공개된 미국 약국방(미국 메릴랜드주 로크빌)의 표준, 또는 예컨대, 국제 약전(세계 보건 기구)에 공개된 있는 미국 이외의 타국의 유사 표준을 충족시키는 것이 바람직할 수 있다.

본 발명은 추가로 시간 경과에 따라 rCSP 안정한 액체 제제 중 rCSP를 안정하게 유지시키는 방법에 관한 것이다. rCSP 안정한 액체 제제 중의 rCSP의 안정한 유지도는 상기 기술된 안정성에 관한 동일의 지표를 사용함으로써 시간 경과에 따라 평가되며, 예컨대, 안정한 유지도는 전체 rCSP 비율(%)에 의해 양으로 표시되고, 제제 중 주어진 시간 경과 후에 존재하는 rCSP 이량체 비율(%), 응집화된 rCSP 비율(%), 변성된 rCSP 비율(%), 및/또는 분해된 rCSP 비율(%)에 의해 음으로 표시된다. 실시양태에서, 전체 rCSP 비율(%)은 주어진 시간 경과 후에 존재하는 rCSP(rCSP 단량체) 비율(%)이다. 그러므로, 안정한 유지도는 안정한 액체 제제 중 주어진 시간 경과 후에 특정의 최소량의 rCSP의 존재로 표시될 수 있다. 실시양태에서, 전체 rCSP 비율(%)은 제제 중 rCSP의 출발량에 대해 상대적인 제제 중 주어진 시간 경과 후에 존재하는 rCSP 비율(%)이다. 다른 실시양태에서, 전체 rCSP 비율(%)은 주어진 시간 경과 후에 존재하는 rCSP 비율(%)이다. rCSP의 양은 본원 다른 곳에도 기술되어 있는 바와 같이, 공지된 방법에 의해 평가될 수 있다. 전체 rCSP 비율(%)은 예를 들어, RP-HPLC 또는 SE-HPLC에 의해 측정된 바와 같이, 및 본원 실시예에 기술된 바와 같이, rCSP 단량체 비율(%)과 같다. 실시양태에서, 전체 rCSP 비율(%)은 천연 rCSP 및 피로글루타메이트 rCSP 단량체 종을 포함한다.

실시양태에서, rCSP 안정한 액체 제제 중에서 안정하게 유지되는 rCSP는 본원에서 기술되고 청구되는 방법에 따라, 예컨대, (a) 재조합 P. 팔시파룸 포자소체 단백질 이량체를 포함하는 박테리아 세포 용해물 조제물을 수득하는 단계; (b) 단계 (a)의 박테리아 세포 용해물 조제물을 P. 팔시파룸 포자소체 단백질 이량체를 포함하는 가용성 분획, 및 불용성 분획으로 분리시키는 단계; (c) 단계 (b)의 가용성 분획 중의 재조합 P. 팔시파룸 포자소체 단백질 이량체를 가용성 분획 중의 숙주 세포 단백질로부터 분리시키는 단계; 및 (d) 단계 (c)에서 수득된 재조합 P. 팔시파룸 포자소체 단백질 이량체에 우선적 환원 조건을 적용하여 P. 팔시파룸 포자소체 단백질을 수득하는 단계, 및 (e) 단계 (d)로부터 수득된 재조합 P. 팔시파룸 포자소체 단백질을 숙주 세포 단백질로부터 분리하여 정제된 재조합 P. 팔시파룸 포자소체 단백질을 수득하는 단계를 포함하는, 재조합 P. 팔시파룸 포자소체 단백질을 정제시키는 방법에 의해 제조된다. 실시양태에서, 단계 (e)의 분리 단계는 소수성 상호작용 크로마토그래피를 포함한다.

본 방법에서, rCSP는 약 3℃ 내지 약 25℃의 온도에서 약 7일 이상, 약 8일 이상, 약 9일 이상, 약 10일 이상, 약 11일 이상, 약 12일 이상, 약 13일 이상, 약 14일 이상, 약 15일 이상, 약 16일 이상, 약 17일 이상, 약 18일 이상, 약 19일 이상, 약 20일 이상, 약 21일 이상, 약 22일 이상, 약 23일 이상, 약 24일 이상, 약 25일 이상, 약 30일 이상, 약 60일 이상, 약 70일 이상, 약 80일 이상, 약 90일 이상, 약 6개월 이상, 또는 약 1년 이상 동안 안정하게 유지된다.

실시양태에서, 본 발명은 rCSP로 이루어진 안정한 액체 제제를 제공하거나, 또는 제조하는 단계를 포함하며, 여기서, rCSP는 약 3℃ 내지 약 25℃의 온도에서 안정하게 유지되는 것인, 안정한 액체 제제 중에서 rCSP를 안정하게 유지시키는 방법에 관한 것이다.

실시양태에서, 본 발명은 0.5X 또는 1X PBS(pH 약 6.0 내지 약 7.5) 중 약 1 내지 약 5, 약 1 내지 약 10, 약 1 내지 약 20, 약 1 내지 약 30, 약 1 내지 약 40, 또는 약 1 내지 약 50 mg/ml rCSP, 약 0.5 내지 약 1.5 mM MTG 및 약 1% 내지 약 20% 아르기닌을 포함하는 제제를 제공하는 단계를 포함하여, 여기서, rCSP는 약 3℃ 내지 약 25℃의 온도에서 약 7일 이상, 약 8일 이상, 약 9일 이상, 약 10일 이상, 약 11일 이상, 약 12일 이상, 약 13일 이상, 약 14일 이상, 약 15일 이상, 약 16일 이상, 약 17일 이상, 약 18일 이상, 약 19일 이상, 약 20일 이상, 약 21일 이상, 약 22일 이상, 약 23일 이상, 약 24일 이상, 약 25일 이상, 약 30일 이상, 약 60일 이상, 약 70일 이상, 약 80일 이상, 약 90일 이상, 약 6개월 이상, 또는 약 1년 이상 동안 안정하게 유지되는 것인, 안정한 액체 제제 중에서 rCSP를 안정하게 유지시키는 방법에 관한 것이다.

실시양태에서, 본 발명은 1X PBS(pH 약 6.4 내지 약 7.2) 중 약 1 내지 약 5, 약 1 내지 약 10, 약 1 내지 약 20, 약 1 내지 약 30, 약 1 내지 약 40, 또는 약 1 내지 약 50 mg/ml rCSP, 약 0.5 내지 약 1.5 mM MTG 및 약 10% 내지 약 20% 아르기닌을 포함하는 제제를 제공하는 단계를 포함하여, 여기서, rCSP는 약 3℃ 내지 약 25℃의 온도에서 약 7일 이상, 약 8일 이상, 약 9일 이상, 약 10일 이상, 약 11일 이상, 약 12일 이상, 약 13일 이상, 약 14일 이상, 약 15일 이상, 약 16일 이상, 약 17일 이상, 약 18일 이상, 약 19일 이상, 약 20일 이상, 약 21일 이상, 약 22일 이상, 약 23일 이상, 약 24일 이상, 약 25일 이상, 약 30일 이상, 약 60일 이상, 약 70일 이상, 약 80일 이상, 약 90일 이상, 약 6개월 이상, 또는 약 1년 이상 동안 안정하게 유지되는 것인, 액체 제제 중에서 rCSP를 안정하게 유지시키는 방법에 관한 것이다.

실시양태에서, 본 발명은 1X PBS(pH 약 6.4 내지 약 7.0) 중 약 1 내지 약 5, 약 1 내지 약 10, 약 1 내지 약 20, 약 1 내지 약 30, 약 1 내지 약 40, 또는 약 1 내지 약 50 mg/ml rCSP, 약 0.5 내지 약 1.5 mM MTG 및 약 10% 내지 약 20% 아르기닌을 포함하는 제제를 제공하는 단계를 포함하여, 여기서, rCSP는 약 3℃ 내지 약 25℃의 온도에서 약 7일 이상, 약 8일 이상, 약 9일 이상, 약 10일 이상, 약 11일 이상, 약 12일 이상, 약 13일 이상, 약 14일 이상, 약 15일 이상, 약 16일 이상, 약 17일 이상, 약 18일 이상, 약 19일 이상, 약 20일 이상, 약 21일 이상, 약 22일 이상, 약 23일 이상, 약 24일 이상, 약 25일 이상, 약 30일 이상, 약 60일 이상, 약 70일 이상, 약 80일 이상, 약 90일 이상, 약 6개월 이상, 또는 약 1년 이상 동안 안정하게 유지되는 것인, 액체 제제 중에서 rCSP를 안정하게 유지시키는 방법에 관한 것이다.

실시양태에서, 본 발명은 1X PBS(pH 약 6.4 내지 약 7.0) 중 약 1 내지 약 5 또는 약 1 내지 약 10 mg/ml rCSP, 약 0.8 내지 약 1.2 mM MTG, 약 5% 내지 약 15% 아르기닌을 포함하는 제제를 제공하는 단계를 포함하여, 여기서, rCSP는 약 3℃ 내지 약 25℃의 온도에서 약 7일 이상, 약 8일 이상, 약 9일 이상, 약 10일 이상, 약 11일 이상, 약 12일 이상, 약 13일 이상, 약 14일 이상, 약 15일 이상, 약 16일 이상, 약 17일 이상, 약 18일 이상, 약 19일 이상, 약 20일 이상, 약 21일 이상, 약 22일 이상, 약 23일 이상, 약 24일 이상, 약 25일 이상, 약 30일 이상, 약 60일 이상, 약 70일 이상, 약 80일 이상, 약 90일 이상, 약 6개월 이상, 또는 약 1년 이상 동안 안정하게 유지되는 것인, 액체 제제 중에서 rCSP를 안정하게 유지시키는 방법에 관한 것이다.

실시양태에서, 본 발명은 1X PBS(약 6.4 내지 약 7.0) 중 약 1 내지 약 5 mg/ml rCSP, 약 1.0 mM MTG 및 약 10% 아르기닌을 포함하는 제제를 제공하는 단계를 포함하여, 여기서, rCSP는 약 3℃ 내지 약 25℃의 온도에서 약 7일 이상, 약 8일 이상, 약 9일 이상, 약 10일 이상, 약 11일 이상, 약 12일 이상, 약 13일 이상, 약 14일 이상, 약 15일 이상, 약 16일 이상, 약 17일 이상, 약 18일 이상, 약 19일 이상, 약 20일 이상, 약 21일 이상, 약 22일 이상, 약 23일 이상, 약 24일 이상, 약 25일 이상, 약 30일 이상, 약 60일 이상, 약 70일 이상, 약 80일 이상, 약 90일 이상, 약 6개월 이상, 또는 약 1년 이상 동안 안정하게 유지되는 것인, 액체 제제 중에서 rCSP를 안정하게 유지시키는 방법에 관한 것이다.

구체적인 실시양태에서, rCSP 안정한 액체 제제는 1X PBS(pH 약 6.4 내지 약 7.0) 중 약 1 내지 약 5 mg/ml rCSP, 약 1.0 mM MTG, 및 약 10% 또는 0.5 M 아르기닌을 포함한다. 실시양태에서, 2-8℃에서 약 120시간 이상 동안 보관될 때, 상기 제제는 약 85 내지 약 95%의 전체 rCSP를 함유하는 것으로 관찰된다. 실시양태에서, 25℃에서 약 24시간 이상 동안 보관될 때, 상기 제제는 약 85% 내지 약 95% 전체 rCSP, 약 85% 내지 약 90% 전체 rCSP, 약 85% 이상의 전체 rCSP, 약 86% 이상의 전체 rCSP, 약 87% 이상의 전체 rCSP, 약 88% 이상의 전체 rCSP, 약 89% 이상의 전체 rCSP, 약 90% 이상의 전체 rCSP, 약 91% 이상의 전체 rCSP, 약 92% 이상의 전체 rCSP, 약 93% 이상의 전체 rCSP, 약 94% 이상의 전체 rCSP, 또는 약 95% 이상의 전체 rCSP를 함유하는 것으로 관찰된다.

방법

실시양태에서, 정제 방법은 P. 플루오레센스 전체 발효 브로쓰를 사용하여 수행된다. 탈응집화제의 존재하에서 브로쓰를 완충제로 희석시켜 예컨대, 3.1 M 우레아, 31 mM 트리스(pH 8.2) 중 ≤ 20% 고체인 균질화 피드를 수득한다. 희석된 발효 브로쓰를 미세유동화에 의해 용해시켜 세포 용해물을 수득한다. 용해물을 2 M 우레아, 20 mM 트리스(pH 8.2)를 이용하여 1:1로 희석하여 10% 고체 용해물을 수득한다. 용해물 중 P. 플루오레센스 고체를 디스크 적층 원심분리 및 심층 여과에 의해 rCSP 함유 완충제로부터 분리한다. rCSP 함유 완충제를 0.2 ㎛ 필터로 추가로 여과시키고, 냉동시킨다. 실시양태에서, 여과된 rCSP 함유 완충제(용해물)를 1 ℓ 또는 2 ℓ 병, 예컨대, 날진(Nalgene)® PETG 병에 넣어 냉동시킨다. 실시양태에서, 용해물을 1 ℓ PETG 병에 넣어 -72℃에서 7시간 이상 동안 냉동시킨다. 실시양태에서, 용해물을 약 7시간 이상 내지 약 18시간 이상 또는 약 7 내지 18시간 사이에 포함된 약 2 내지 약 6시간의 임의의 범위의 시간 동안 냉동시킨다. 실시양태에서, 용해물을 약 8시간 이상, 약 9시간 이상, 약 10시간 이상, 약 11시간 이상, 약 12시간 이상, 약 13시간 이상, 약 14시간 이상, 약 15시간 이상, 약 16시간 이상, 또는 약 17시간 이상 동안 냉동시킨다. rCSP 정화된 세포 추출물을 해동시킨 후, 음이온 교환 크로마토그래피(AEX)에 의해 정제시킨다. 실시양태에서, 해동된 용해물을 크로마토그래피 하기 전에 실온에서 유지시킨다. 실시양태에서, 해동된 용해물을 해동 후, 및 AEX 이전에 여과시킨다. 실시양태에서, 여과는 막 여과이다. 실시양태에서, 여과는 0.2 내지 0.45 ㎛ 막 여과이다. rCSP 함유 AEX 용리액을 수집하고, 하이드록시아파타이트 크로마토그래피 (HA)에 의해 추가로 정제하고, rCSP 함유 HA 용리액을 수집하고, 2-8℃에서 보관한다. HA 용리액을 다시 주변 온도로 복귀시키고, 0.2 ㎛ 필터로 여과시키고, rCSP를 우선적 환원 조건에 가한다. 완충제 중 이량체화된 CSP를 함유하는 크로마토그래피 용리 분획을 최종 부피 200-600 mL로 풀링한다. 디티오트레이톨 환원제를 최종 농도 20 μM로 첨가하거나, 또는 MTG 환원제를 최종 농도 1 mM로 첨가하여 풀을 우선적 환원시키고, 실온에서 12-24시간 동안 자기 교반 막대 및 교반 플레이트를 이용하여 신속하게 교반시킨다. 별법으로, PBS 중 응집화된 rCSP를, 우선적 환원을 수행하기 전에 먼저 2 M 우레아를 상기 물질에 첨가함으로써 동일 과정을 수행한다. 실시양태에서, 이어서, rCSP를 HIC에 의해 추가로 정제시킨다.

우선적 환원 조건에 가한 후, 및/또는 HIC 정제 이후에, rCSP를 농축시키고, TFF에 의해 제제 완충제로 정용여과시킨다.

별법으로, HA 용리액을 실온에서 우선적 환원 조건에 가하고, 제제 완충제로 정용여과시키거나, 또는 HIC에 로딩하기 이전에 밤새도록 유지시킨 후, 농축시키고, 정용여과시킨다.

실시양태에서, 제제 완충제는 1 mM MTG 및 10% 아르기닌을 포함한다. 제제 완충제 중 정용여과된 rCSP를 최종 0.2 ㎛ 필터를 통해 통과시킴으로써 벌크 약물 물질을 수득한다.

정제된 P. 팔시파룸 포자소체 단백질 분석

생성물 명세

단백질의 수율 및/또는 품질을 평가하는 다수의 검정 방법이 당업계에 공지되어 있다. 재조합 단백질의 특징을 규명하기 위해 임의의 적절한 방법을 사용하는 것이 본원에서 고려된다.

단백질 수율

정제된 rCSP의 전체 정제 수율 또는 전체 공정 수율은, 출발 물질 중에 존재하는 rCSP 측정량에 대해 상대적인, 본 발명의 방법을 사용하여 수득된, 정제된 rCSP의 전체량이다. 이는 일반적으로 수율(%)로 표시된다. 수율(%) 측정은 출발 물질, 예컨대, 세포 배양물, 박테리아 세포 용해물 조제물, 또는 가용성 분획(정화 이전 또는 이후) 중의 단백질 측정량에 의존할 뿐만 아니라, 이는 또한 각 단계에 사용되는 로드에도 의존하는 것을 이해할 것이다. 실시양태에서, 단계, 예컨대, 수거 단계의 전체 수율이 다음 단계, 예컨대, 세포 파괴 단계에서 프로세싱되지 않을 경우, 전체 공정 수율은 로딩 단계 및 수율을 사용하여 계산된다. 모든 단계의 전체 수율을 사용할 경우, 전체 공정 수율은 최종 수율을 출발 물질 중의 rCSP 양으로 나눔으로써 계산될 수 있다. 당업계에 공지되어 있거나, 본원에 기술된 바와 같은, 단백질을 측정하는 임의의 적절한 방법, 예를 들어, SDS-PAGE, 예컨대, SDS-CGE 및 웨스턴 블롯 분석이 사용될 수 있다. SDS-PAGE는 환원 또는 비환원 조건하에서 수행될 수 있다. 비환원 조건하에서 수행된 SDS-PAGE를 통해 단량체, 이량체 및 응집화된 종(HMW 응집체)을 개별적으로 비교할 수 있다. 예를 들어, 상기 비교를 사용하여 출발 물질 중의 rCSP 단량체에 대해 상대적인, 또는 출발 물질 중의 rCSP 이량체, 단량체 및 응집화된 종에 대해 상대적인, 정제된 rCSP 단량체의 수율을 측정할 수 있다. 환원 조건하의 평가는 모든 rCSP 종의 측정량을 제공한다. 본원에 기술된 바와 같은, 및 당업계에 공지된 활성 검정법, 예컨대, 결합 검정법은 또한 단백질 수율과 관련된 정보를 제공할 수 있다.

전형적으로, 출발량 또는 초기 rCSP 로드는 분취량의 세포 배양물, 박테리아 세포 용해물, 가용성 분획 또는 정화된 용해물 분획 중 단백질 농도를 측정함으로써 측정된다. 이어서, 정제 방법에 사용되는 단백질의 전체량은 분취 데이터를 후속 단계에서 프로세싱되는 물질의 부피("로드")로 외삽함으로써 계산된다. 실시양태에서, 초기 로드량은 전체 공정 수율을 측정하는 데 사용된다. 실시양태에서, rCSP의 출발량은 약 1 g 내지 약 3,000 g, 약 100 g 내지 약 3,000 g, 약 250 g 내지 약 3,000 g, 약 500 g 내지 약 3,000 g, 약 750 g 내지 약 3,000 g, 약 1,000 g 내지 약 3,000 g, 약 100 g 내지 약 2,000 g, 약 250 g 내지 약 2,000 g, 약 500 g 내지 약 2,000 g, 약 750 g 내지 약 2,000 g, 약 1,000 g 내지 약 2,000 g, 약 100 g 내지 약 1,000 g, 약 150 g 내지 약 1,000 g, 약 200 g 내지 약 1,000 g, 약 250 g 내지 약 1,000 g, 약 300 g 내지 약 1,000 g, 약 400 g 내지 약 1,000 g, 약 500 g 내지 약 1,000 g, 또는 약 750 g 내지 약 1,000 g을 포함한다.

수득된, 정제된 rCSP의 전체량을 출발 물질 중의 rCSP 측정량과 비교함으로써 전체 정제 공정 수율을 수율(%)(또는 수율 분율)로서 얻을 수 있다. 본 발명의 실시양태에서, 수득된, 정제된 rCSP의 전체 정제 공정 수율(%)은 약 10% 내지 약 75%이다. 실시양태에서, 수득된, 정제된 rCSP의 수율(%)은 약 10% 이상, 약 15% 이상, 약 20% 이상, 약 25% 이상, 약 30% 이상, 약 35% 이상, 약 40% 이상, 약 50% 이상, 약 60% 이상, 약 70% 이상, 약 10% 내지 약 70%, 약 10% 내지 약 65%, 약 10% 내지 약 60%, 약 20% 내지 약 75%, 약 20% 내지 약 70%, 약 20% 내지 약 65%, 약 25% 내지 약 75%, 약 25% 내지 약 70%, 약 25% 내지 약 65%, 약 25% 내지 약 60%, 약 30% 내지 약 75%, 약 30% 내지 약 70%, 약 30% 내지 약 65%, 약 30% 내지 약 60%, 약 30% 내지 약 65%, 또는 약 30% 내지 약 60%이다. 실시양태에서, 상기 공정 수율은 변성된, 분해된, 이량체화된, 또는 응집화된 rCSP를 제한된 양으로 함유하는 rCSP의 수율이다. 실시양태에서, 상기 공정 수율은 10% 이하의 변성된 rCSP, 10% 이하의 분해된 rCSP, 10% 이하의 응집화된 rCSP, 및/또는 10% 이하의 이량체화된 rCSP를 포함한다. 실시양태에서, 상기 공정 수율은 5% 이하의 변성된 rCSP, 5% 이하의 분해된 rCSP, 5% 이하의 응집화된 rCSP, 및/또는 5% 이하의 이량체화된 rCSP를 포함한다.

단백질 수율은 또한 전체 세포 단백질(tcp)의 비율(%) 또는 분율, 단백질/세포의 양, 또는 건식 바이오매스의 비율(%) 또는 비율로서 표시될 수 있다. 실시양태에서, 수율이 배양물 부피로 표시되는 경우, 배양 세포 밀도가 고려될 수 있으며, 특히 상이한 배양물 사이의 수율을 비교하는 경우에 그러하다. 회수율 또한 (전체 정제 수율을 기술하는 것과는 대조적으로) 정제 방법의 각 단계로, 또는 다단계 측정될 수 있다는 것을 이해할 것이다.

단백질 품질

관련된 실시양태에서, rCSP는 정제 방법의 임의의 단계에서 단백질 품질로 기술된다. 실시양태에서, 본원에 기술된 바와 같이, 단백질 품질은 이량체화된 또는 이량체화되지 않은, N 말단에서 분해된 또는 분해되지 않은(또는 클리핑된 또는 클리핑되지 않은), 또는 변성된 또는 변성되지 않은, 즉, C 말단 영역에 온전한 이황화 결합을 가지는 또는 가지지 않는, 또는 그의 임의의 조합 형태를 가지는 rCSP의 양 또는 비율(%)의 함수로서 기술될 수 있다. 품질의 척도로는 또한 예컨대, 결합 검정법에 의해 활성인 것으로 측정된 CSP의 비율(%) 또는 분율을 포함한다. 본 실시양태에서, 활성은 활성인 것으로 측정된 단백질의 양을 검정된 단백질 전체량과 비교함으로써 표시될 수 있다. 정제의 임의 단계에서, 예컨대, 이량체화된 것으로, 이량체화되지 않은 것으로, 응집화된 것으로, 응집화되지 않은 것으로, 분해된 것으로, 분해되지 않은 것으로, 변성된 것으로, 변성되지 않은 것으로, 불활성인 것으로 또는 활성인 것으로 측정된 단백질의 양을 같은 단계에서의 단백질 전체량과 비교할 수 있다. 예를 들어, 수득된, 정제된 단백질 중 이량체화되지 않은, 응집화되지 않은, 분해되지 않은, 변성되지 않은, 또는 활성인 rCSP의 양을 수득된, 정제된 rCSP의 전체량과 비교함으로써 이량체화되지 않은, 응집화되지 않은, 분해되지 않은, 변성되지 않은, 또는 활성인 rCSP 등의 양 또는 분율을 얻을 수 있다. 별법으로, 수득된, 정제된 단백질 중 이량체화되지 않은, 응집화되지 않은, 분해되지 않은, 변성되지 않은, 또는 활성인 rCSP의 양은 출발 물질 중의 이량체화되지 않은, 응집화되지 않은, 분해되지 않은, 변성되지 않은, 또는 활성인 rCSP의 양과 비교함으로써 이량체화되지 않은, 응집화되지 않은, 분해되지 않은, 변성되지 않은, 회수된 rCSP의 양, 또는 활성인 회수된 rCSP의 양의 비율(%) 또는 분율 값 등을 얻을 수 있다.

본원에 기술된 바와 같은, 또는 당업계에 공지된 바와 같은, rCSP 이량체 형성을 평가하는 임의의 방법을 사용하여 rCSP 이량체 형성률(%)을 측정할 수 있다. 방법으로는 예컨대, HPLC(RP-HPLC 및 SE-HPLC 포함)를 포함할 수 있다. HMW 응집체 형성을 평가하는 방법으로는 예컨대, HPLC 및 SDS-PAGE를 포함할 수 있다.

본 발명의 실시양태에서, 수득된, 정제된 rCSP는 약 12% 미만의 이량체를 포함한다. 실시양태에서, 수득된, 정제된 rCSP는 약 11% 미만, 약 10% 미만, 약 9% 미만, 약 8% 미만, 약 7% 미만, 약 6% 미만, 약 5% 미만, 약 4% 미만, 약 3% 미만, 약 2% 미만, 또는 약 1% 미만의 이량체를 포함한다. 관련된 실시양태에서, 수득된, 정제된 rCSP는 88% 이상의 단량체를 포함한다. 실시양태에서, 수득된, 정제된 rCSP는 89% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 100% 이상의 단량체를 포함한다.

분해 본원에 기술된 바와 같은, 또는 당업계에 공지된 바와 같은, rCSP 분해를 평가하는 임의의 방법을 사용하여 rCSP 분해율(%)을 측정할 수 있다. 방법으로는 예컨대, LC-MS/온전한 질량, SDS-PAGE, HPLC(RP-HPLC 및 SE-HPLC), 및 N 말단 서열 분석을 포함할 수 있다.

본 발명의 실시양태에서, 수득된, 정제된 rCSP는 약 10% 미만으로, N 말단에서 분해된 전체 rCSP 종을 포함한다. 실시양태에서, 수득된, 정제된 rCSP를 약 9% 미만, 약 8% 미만, 약 7% 미만, 약 6% 미만, 약 5% 미만, 약 4% 미만, 약 3% 미만, 약 2% 미만, 또는 약 1% 미만으로, N 말단에서 분해된 전체 rCSP 종을 포함한다. 실시양태에서, 수득된, 정제된 rCSP 중 어느 것도 N 말단에서 분해되지 않은 것이다. 실시양태에서, 분해율(%)은 C5/Y6 또는 V14/L15에서 클리핑된 비율(%)이다. 실시양태에서, 분해율(%)은 C5/Y6 및 V14/L15, 둘 모두에서 클리핑된 비율(%)이다. 실시양태에서, 분해율(%)은 C5/Y6, V14/L15, 및/또는 N29/E30에서 클리핑된 비율(%)이다. 다른 실시양태에서, 분해율(%)은 C5/Y6, V14/L15, N29/E30, 및/또는 S44/L45에서 클리핑된 비율(%)이다. 실시양태에서, 분해율(%)은 비특이적으로 분해된, 수득된 rCSP의 비율(%)이다. 실시양태에서, 수득된, 정제된 rCSP는 약 10% 미만, 약 9% 미만, 약 8% 미만, 약 7% 미만, 약 6% 미만, 약 5% 미만, 약 4% 미만, 약 3% 미만, 약 2% 미만, 또는 약 1% 미만으로, N 말단에서 비특이적으로 분해된, rCSP를 포함한다. 실시양태에서, 수득된, 정제된 rCSP 중 어느 것도 N 말단에서 비특이적으로 분해되지 않은 것이다. 실시양태에서, 분해율(%)은 N 말단에서 비특이적으로 분해된 rCSP의 비율(%)과 조합된, C5/Y6, V14/L15, N29/E30, 및/또는 S44/L45에서 클리핑된, 수득된 rCSP의 비율(%)이다. 관련된 실시양태에서, 수득된 rCSP 중 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 100% 이상이 비특이적으로, 또는 C5/Y6, V14/L15, N29/E30, 및/또는 S44/L45에서의 클리핑에 의해 N 말단에서 분해된 것이 아니다.

본 발명의 실시양태에서, 수득된, 정제된 rCSP 중 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% 이하가 잔기 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 및 50(여기서, 잔기 1은 리더를 포함하지 않는 발현된 단백질에서 첫번째 잔기, 예컨대, 도 2C, 서열 번호 3에서 Q, 및 도 2B, 서열 번호 2에서 M)으로부터 선택되는 아미노산으로 분해, 클리핑, 또는 단백질 분해된 것이거나, 또는 수득된, 정제된 rCSP 중 어느 것도 그러한 것으로 분해, 클리핑, 또는 단백질 분해되지 않은 것이다. 실시양태에서, 수득된, 정제된 rCSP 중 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 이상이 잔기 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 및 50으로부터 선택되는 아미노산에 온전한 것이다.

구체적인 실시양태에서, 정제된 rCSP는 약 10% 내지 약 75%의 전체 정제 공정 수율로 수득되며, 여기서, 정제된 rCSP는 약 5%미만의 이량체를 포함하고, 약 10%미만의 전체 C5/Y6 및 V14/L15에서 클리핑된 종을 포함하고, 약 5% 미만의 변성된 rCSP를 포함한다.

본원에 기술된 바와 같은, 또는 당업계에 공지된 바와 같은 rCSP 변성을 평가하는 임의의 방법을 사용하여 변성된 단백질의 비율(%)을 측정할 수 있다. 예를 들어, 2차 구조를 분석하는 방법, 예컨대, CD 및 고유 형광, 및 이황화 결합을 분석하는 방법, 예컨대, 펩티드 지도화 및 알킬화/온전한 질량/Glu-C 분해가 사용될 수 있다.

실시양태에서, 수득된, 정제된 rCSP는 약 10% 미만, 약 9% 미만, 약 8% 미만, 약 7% 미만, 약 6% 미만, 약 5% 미만, 약 4% 미만, 약 3% 미만, 약 2% 미만, 또는 약 1% 미만의 변성된 rCSP, 예컨대, 부적절한 이황화 결합을 가지는 rCSP를 포함한다. 부적절한 이황화 결합은 C 말단 영역의 두 천연 이황화 결합 중 적어도 하나가 잘못된 쌍을 형성하였거나, 또는 쌍을 형성하지 않았을 때 확인된다. 실시양태에서, 정제된 rCSP 중 각각 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 이상이 온전한 이황화 결합을 가진다. 다른 실시양태에서, 변성은 정제된 rCSP의 2차 구조에 관한 하나 이상의 척도를 참조 표준 rCSP와 비교함으로써 측정된다.

클리핑 부위 또는 시스테인 및 이황화 결합을 기술하는 데 사용된 번호 매김은 rCSP 아미노산 서열에 따라 달라질 수 있다는 것을 이해할 것이다.

피로글루타메이트 함유 종

특정 실시양태에서, 피로글루타메이트 함유 rCSP 종, 예컨대, 글루타민이 글루타메이트로 탈아미드화된 후, 이어서, 글루타메이트가 피로글루타메이트로 폐환화된(글루타민→글루탐산→피로글루타메이트) rCSP로 제한되는 것이 바람지갈 수 있다. 본원에 기술된 바와 같이, 피로글루타메이트 함유 종은 시간이 경과함에 따라 증가하기 때문에, 피로글루타메이트를 함유하지 않는 rCSP 종은 시간이 경과함에 따라 감소되는 것으로 관찰되었다. 피로글루타메이트는 당업계에 공지된 임의의 적절한 방법, 예컨대, RP-HPLC에 의해 측정될 수 있다.

실시양태에서, 수득된, 정제된 rCSP는 약 20% 미만, 약 18% 미만, 약 15% 미만, 약 10% 미만, 약 9% 미만, 약 8% 미만, 약 7% 미만, 약 6% 미만, 약 5% 미만, 약 4% 미만, 약 3% 미만, 약 2% 미만, 또는 약 1% 미만의 피로글루타메이트 함유 rCSP를 포함한다.

실시양태에서, 공정 수율은 약 20%, 18%, 15%, 10%, 5%, 또는 1% 이하의 피로글루타메이트 함유 rCSP를 포함한다.

실시양태에서, rCSP로 이루어진 제제 중 피로글루타메이트 함유 종의 양은 약 7일 이상, 약 8일 이상, 약 9일 이상, 약 10일 이상, 약 11일 이상, 약 12일 이상, 약 13일 이상, 약 14일 이상, 약 15일 이상, 약 16일 이상, 약 17일 이상, 약 18일 이상, 약 19일 이상, 약 20일 이상, 약 21일 이상, 약 22일 이상, 약 23일 이상, 약 24일 이상, 약 25일 이상, 약 30일 이상, 약 60일 이상, 약 70일 이상, 약 80일 이상, 약 90일 이상, 약 6개월 이상, 또는 약 1년 이상 동안 보관하였을 때, 약 0%, 0.5%, 1%, 1.5%, 2%, 2.5%, 3%, 3.5%, 4%, 4.5%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 또는 10% 이하만큼 증가한다. 특정 실시양태에서, 피로글루타메이트 함유 종의 최대 증가율은 약 9일 내지 약 25일 동안 보관하였을 때, 약 1% 내지 약 3% 또는 약 5% 이하이다. 보관 전(예컨대, T=0) 양은 비교를 위해 사용될 수 있다.

실시양태에서, rCSP 품질은 약 10% 미만의 rCSP 피로글루타메이트 함유 종의 존재에 의해 표시된다. 실시양태에서, rCSP 품질은 피로글루타메이트 함유 종이 전체 단백질 또는 수득된, 정제된 CSP의 약 10% 이하, 약 9% 이하, 약 8% 이하, 약 7% 이하, 약 6% 이하, 약 5% 이하, 약 4% 이하, 약 3% 이하, 약 2% 이하, 또는 약 1% 이하로 존재하는 것인, 상기 종의 부재에 의해 표시된다.

단백질 순도

실시양태에서, rCSP의 순도는 정제 방법 중 임의의 단계에서의 SDS-CGE 및/또는 SDS-PAGE에 의해 평가되고, 순도 값은 그에 따라 지정된다. 순도는 SDS-CGE 장치 소프트웨어에 의해, 전기영동도에서 표적 단백질(예컨대, rCSP 단량체)의 피크 면적을 다른 피크 면적으로 나눔으로써 계산될 수 있다. 실시양태에서, 본 발명의 방법을 사용하여 수득된, 정제된 rCSP의 순도는 약 85% 내지 100%이다. 실시양태에서, 순도는 약 85% 이상, 약 86% 이상, 약 87% 이상, 약 88% 이상, 약 89% 이상, 약 90% 이상, 약 91% 이상, 약 92% 이상, 약 93% 이상, 약 94% 이상, 약 95% 이상, 약 96% 이상, 약 97% 이상, 약 98% 이상, 약 99% 이상, 약 85% 내지 약 99%, 약 85% 내지 약 98%, 약 85% 내지 약 97%, 약 85% 내지 약 96%, 약 90% 내지 약 99%, 약 90% 내지 약 98%, 약 90% 내지 약 97%, 약 90% 내지 약 96%, 또는 약 90% 내지 약 95%이다.

특정 실시양태에서, 수득된, 정제된 rCSP의 순도 96%이고, 5% 이하의 이량체를 함유하며, 검출가능한 고분자량(HMW) 응집체를 함유하지 않고, 10 EU/mg 미만의 내독소를 함유하고, 검출가능한 단백질 분해성 클리핑을 함유하지 않는다. 실시양태에서 내독소는 약 10 EU/mg 이하, 약 25 EU/mg 이하, 약 50 EU/mg 이하, 약 100 EU/mg 이하, 약 250 EU/mg 이하, 약 400 EU/mg 이하, 또는 약 500 EU/mg 이하로 존재한다.

생성물 분석

본 발명의 실시양태에서, 재조합 CSP는 본 발명의 정제 방법의 임의의 단계에서 본원에 기술된 바와 같고, 문헌에 보고되어 있으며, 당업계에 공지되어 있는 방법을 사용하여 수율, 순도, 품질, 및 안정성에 대해 평가된다. rCSP를 평가하는 검정법은 본원에서 비제한적인 일례로서 제공되어 있다.

단백질 수율 측정

본 발명은 높은 전체 정제 수율로 정제된 rCSP를 수득하는 데 유용한 방법을 제공한다. 적절히 정제 방법의 임의의 단계에서 수율을 측정하고, rCSP 순도를 모니터링하는 데 SDS-PAGE 방법, 예컨대, SDS-CGE 또는 웨스턴 블롯이 사용될 수 있다. 실시양태에서, 수율 측정에 포함되는 단백질로는 단량체 rCSP를 포함하고, 이량체 또는 응집화된 rCSP는 포함하지 않는다. 실시양태에서, 단계 수율 및/또는 전체 수율이 측정된다. 실시양태에서, rCSP를 우선적 환원 조건에 가함으로써 rCSP 이량체의 단량체로의 전환에 기인하여 rCSP 단량체의 단계 수율을 증가시킬 수 있다.

적합한 수율 측정 방법은 당업자에게 공지되어 있고, 예를 들어, 단백질 시료는 HT 프로테인 익스프레스 v2(HT Protein Express v2) 칩 및 상응하는 시약(각각 부품 번호 760499 및 760328, 캘리퍼 라이프사이언시즈(미국 매사추세츠주 홉킨턴))이 장착된 랩칩(LabChip) GXII 장치(캘리퍼 라이프사이언시즈)를 사용하는 HTP 마이크로칩 SDS 모세관 겔 전기영동(SDS-CGE)에 의해 분석될 수 있다. 시료는 제조사의 프로토콜(프로테인 유저 가이드 다큐먼트 번호 450589, Rev. 3)에 따라 제조되고, 폴리아크릴아미드 겔 상에서 전기영동된다. 분리 후, 겔을 염색하고, 탈염색시키고, 디지털 방식으로 영상화시킨다.

정제된 rCSP 시료의 단백질 농도는 에펜도르프 바이오포토미터(에펜도르프: 독일 함부르크)를 사용하여 280 nm(벡터 NTI 인비트로겐에 의해 측정된 바, 1 mg/ml에 대한 A₂₈₀= 0.61 AU)에서의 흡광도에 의해 측정될 수 있다.

수율 또는 순도를 측정하는 웨스턴 블롯 분석은 SDS-PAGE 겔 상에서 분리된 CSP를 니트로셀룰로스 막으로 옮겨 놓고, 상기 막을 단일클론 항Pf CSP 항체와 함께 인큐베이션시킴으로써 당업계에 공지된 임의의 적절한 방법에 따라 수행될 수 있다.

본원에 기술된 임의의 분석 방법에 유용한 CSP 항체는 당업자에게 공지되어 있는 적합한 방법에 의해 생성될 수 있다. 유용한 항체는 또한 문헌에 기술되어 있고, 상업적으로 이용가능하다. 적합한 CSP 입체형태 특이 단일클론 항체가 기술되어 있으며, 예를 들어, 항체 4C2, 4B3, 및 1G12의 특징이 규명되었고, CSP 변성에 감수성인 것으로 문헌 [Plassmeyer, et al., 2009]에 보고되어 있다. 원하는 결합 특징을 가지는 CSP 항체는 문헌, 예컨대, 문헌 [Plassmeyer, et al., 2009]에 기술되어 있는 방법에 따라 생성되고, 스크리닝될 수 있다.

단백질 변성 측정

실시양태에서, 본 발명의 정제 방법을 사용함으로써, 리폴딩할 필요 없이, 변성되지 않은 정제된 rCSP 단량체를 수득할 수 있다. 변성되지 않은 rCSP는 예컨대, 내부 참조 표준과의 비교에 의해 평가될 수 있는 천연 구조를 가진다. 실시양태에서, 변성은 C 말단 영역 내의 적절한 이황화 결합의 존재에 기초하여 분석된다. 단백질 2차 또는 3차 구조, 및 C 말단 영역 내의 적절한 이황화 결합의 존재는 당업계에 공지되어 있거나, 본원에 기술된 방법에 의해 분석될 수 있다.

단백질 2차 구조는 예컨대, 원평광 이색성(CD) 또는 고유 형광을 사용하여 분석될 수 있다. CD는 분광편광계(예컨대, 자스코 J-815, 자스코)를 사용할 수 있다. 185-250 nm로부터의 원 UV-CD 영역을 통해 2차 구조적 차이(즉, a 나선, b 시트, 및 및 랜덤 코일)를 모니터링할 수 있다. 원 UV CD 분광법(240-190 nm)은 0.1 mm 경로 길이 큐벳트를 이용하여 5 x 축적과 함께 1 nm로 설정된 대역폭 및 스캐닝 속도 100 nm/min, 디지털 통합 시간(DIT) = 1 sec를 이용하여 자스코 J-815 분광편광계 상에서 수행될 수 있다. 시료를 20℃에서 x 5 mM 트리스(시그마(Sigma), 카탈로그 번호 T7818-250G)/16.7 mM 황산나트륨(시그마, 카탈로그 번호 S9627-500G)(pH 7.5 완충제) 중에서 분석할 수 있다. 문헌 [Perez-Iratxeta, et al., 2008, "K2D2: estimation of protein secondary structure from circular dichroism spectra," BMC Structural Biology 8:25 (doi: 10.1186/1472-6807-8-25)]에 기술되어 있는, 분석 소프트웨어, 예컨대, K2D2를 사용하여 단백질 중 알파 나선 및 베타 가닥의 비율(%)을 평가할 수 있다. CSP는 5%의 알파 나선 및 27%의 베타 가닥을 함유하는 것으로 보고되어 있다(예컨대, 문헌 [Plassmeyer, et al., 2009]).

고유 형광의 경우, 초기 분광편광계 온도를 20℃로 설정한 후, 단계식으로 40, 45, 55, 65, 및 75℃로 증가시키고, 이어서, 20℃로 복귀시킬 수 있다. 각 온도 설정 환경에서 형광을 판독하며, 형광 판독은 하기와 같이 설정될 수 있다: 280 nm에서 여기; 295 - 395 nm에서 방출; 감도 = 790 V; 데이터 피치 = 1 nm; 디지털 통합 시간(DIT) = 1 sec; 대역폭 방출 = 10 nm; 스펙트럼 축적 = 3; 교반 막대 rpm = 200.

수득된 rCSP의 변성/입체형태는, rCSP의 선택된 표적에의 결합을 측정하는 바이오층 간섭법(BLI)을 사용하여 평가될 수 있다. 실시양태에서, 입체형태 특이 항체(예컨대, 변성된 단백질에 결합하지 않는 항체) 및/또는 헤파린에의 결합이 측정된다. 기능적 결합 검정법이 rCSP 입체형태 차이를 모니터링하는 데 유용하고, 이는 대용 효능 검정법으로서 사용될 수 있다. 상기 방법에서 유용한 입체형태 특이 항체의 예는 본원 및 문헌 [Plassmeyer, et al., 2009]에 기술되어 있다. 헤파린 및 입체형태 특이 항체를 사용하여 바이오센서 입체배치의 예는 본원 실시예에 기술되어 있다.

구형 폴딩된 구조는 크기 배제 HPLC(SE-HPLC)를 사용하여 분석될 수 있다. 크기 배제는 크기에 기초하여 단백질을 분리시키는데, 단백질의 크기가 클수록 더 작은 단백질보다 더 빨리 용리된다. 실시양태에서, 크기 배제(SE) HPLC는 TSK-GEL G3000SWXL 칼럼을 사용하여 수행된다. 특히, 실시예에 기술된 바와 같이, rCSP(~38 kDa)는 예상보다 더 짧은 체류 시간을 가진다.

이황화 결합은 본원 실시예에 기술된 바와 같이, 펩티드 지도화를 사용하여 분석될 수 있다. 먼저 트립신을 이용한 후, 이어서, 엘라스타제를 이용하여 rCSP에 대해 이중으로 프로테아제 분해를 수행할 수 있다. 이중 분해물을 LC-MS/MS에 의해 분석되고, 생성된 데이터는 바이오파마링크스(워터스 코포레이션(미국 매사추세츠주 밀퍼드))를 사용하여 프로세싱함으로써 이황화 결합된 두 디펩티드를 확인할 수 있다. 음성 대조군 방법으로서, 상기 (즉, 부정확한) 이황화 결합, C₃₁₄-C₃₅₄ 및 C₃₁₈-C₃₄₉의 역을 포함하는 방법 파일을 사용하여 같은 데이터를 프로세싱할 수 있다.

단백질 분해 측정

본 발명은 N 말단 영역에서 분해되지 않은, 정제된 rCSP를 수득하는 데 유용한 정제 방법을 제공한다. 실시양태에서, 단백질 분해성 클리핑, 탈아미드화, 산화, 및 단편화를 모니터링하는 데, 및 N 말단 영역 시스테인이 쌍을 형성하지 않는 것을 확인하는 데 LC-MS가 사용된다.

실시양태에서, 유리 N 말단 시스테인은 예컨대, 본원 실시예에 기술된 바와 같이, 알킬화 및 펩티드 지도화에 의해 확인된다.

실시양태에서, RP-HPLC는 단편화, 탈아미드화, 및 산화를 검출하는 데 사용된다.

HPLC는 rCSP의 특징을 규명함으로써 단량체 및 이량체 함량을 비롯한 구조적 정보를 제공하는 데 사용될 수 있다. 실시양태에서, 역상 HPLC(RP-HPLC)는 단량체 및 이량체 함량, 단편화, 탈아미드화, 및 산화를 평가하는 데 사용된다. 환원제, 예컨대, 20 μM DTT 첨가는 관찰되는 이량체를 단량체 쪽으로, 및 응집체를 이량체 또는 단량체로 이동시킴으로써 종을 확인하는 데 도움을 줄 수 있다. 적절한 역상(RP) 칼럼을 비롯한, RP-HPLC 방법은 당업계에 공지되어 있고, 문헌에 기술되어 있다. 특정 실시양태에서, C₄ 쥬피터(Jupiter) 칼럼(페노메넥스(Phenomenex))이 사용된다.

실시양태에서, rCSP의 단량체 및 이량체 형태를 분해하는 데 분취용 소수성 크로마토그래피가 사용된다.

실시양태에서, 단백질 전하 이질성은 예컨대, 모세관 등전 포커싱(cIEF) 또는 영상화된 모세관 등전 포커싱(icIEF)을 사용하여 분석된다. 본 실시양태에서, 표준, 예컨대, rCSP 내부 참조 표준이 비교를 위해 사용될 수 있다. 본원 실시예에 기술된 바와 같이, cIEF를 사용하여 평가되는 rCSP 내부 참조 표준을 통해 pI 5.20 및 pI 5.76에서 주요 피크, 및 pI 4.99, 5.08 및 5.52에서 보다 작은 피크가 나타났다.

실시양태에서, CSP 미세이질성은 펩티드 지도화 질량 분석법을 사용하여 분석된다.

단백질 순도 측정

실시양태에서, 숙주 세포 단백질 및 핵산을 비롯한, 오염 물질은 당업계에 주지되어 있는 방법을 사용하여 평가된다.

수율 측정과 관련하여 기술된 바와 같이, SDS-PAGE 방법은 오염성 이량체 및 HMW 응집화된 종을 확인하는 데 유용하다. 실시양태에서, SE-HPLC는 응집화된 종을 확인하는 데 사용된다.

실시양태에서, ELISA 방법은 숙주 세포 단백질을 측정하는 데 사용된다. 예를 들어, 숙주 세포 단백질(HCP) ELISA는 시그너스 테크놀러지스 인코퍼레이티드(Cygnus Technologies, Inc.) 카탈로그 번호 F450으로부터의 "슈도모나스 플루오레센스 숙주 세포 단백질 측정용 면역효소측정 검정용(Immunoenzymetric Assay for the Measurement of Pseudomonas fluorescens Host 세포 Proteins)" 키트를 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라 수행할 수 있다. 스펙트라맥스 플러스(SPECTRAmax +)(몰레큘라 디바이시즈(Molecular Devices)) 상에서 소프트맥스 프로(Softmax Pro) v3.1.2 소프트웨어를 사용하여 플레이트를 판독할 수 있다.

실시양태에서, 내독소는 리물루스 아메바양세포 용해물(LAL)에 의해 평가된다. LAL 검사는 당업계에 주지되어 있고, 약물, 장치, 및 혈액과 접촉하는 다른 제품 검사용으로 FDA의 승인을 받은 것이다. 실시양태에서, 용리 분획 중 내독소의 양은 엔도세이프-PTS(Endosafe-PTS) 휴대용 내독소 분석기(찰스 리버 라보라토리즈(CHL))를 사용하고, 감도 범위가 1-0.01 EU/mL(CHL, 부품 번호 PTS2001F) 및 10-0.1 EU/mL(CHL, 부품 번호 PTS201F)인 카트리지를 이용함으로써 제조사가 제공하는 작동 방법에 따라 분석한다.

실시양태에서, 숙주 세포 DNA는 Q-PCR을 사용하여 분석된다. 숙주 세포 DNA는 예컨대, DNA 폴리머라제 I 유전자에 특이적인 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 평가될 수 있다.

발현 균주의 발현 플라스미드 골격 서열은 실시간 정량적 PCR에 의해 검출된다. 실시간 PCR은 예컨대, DNA 엔지 옵티콘 시스템 PTC-200 DNA 엔진 사이클러(DNA Engine Opticon System PTC-200 DNA Engine Cycler)(MJ 리서치(MJ Research), CFD-3200 옵티콘(CFD-3200 Opticon))을 이용하여 수행될 수 있다.

rCSP 내부 참조 표준 정제

실시양태에서, rCSP 내부 참조 표준은 본 발명의 방법과 관련하여 수행되는 분석에서 사용된다. 참조 표준은 당업계에 공지되어 있거나, 본원에 기술된 바와 같은 방법에 따라 제조될 수 있다. 예를 들어, rCSP를 발현하는 숙주 세포로부터의 세포 페이스트를 미세유동화시키고, 분리시켜 고체 세포 파쇄물을 제거할 수 있고, 분리시켜 숙주 세포 단백질을 제거할 수 있다. 최종 정제된 rCSP를 겔 여과에 의해 PBS(pH 7.2)로 완충제 교환시키고, 여과 멸균시키고, -80℃에서 보관할 수 있다. 내부 참조 표준의 순도는 예컨대, SDS-PAGE에 의해 분석될 수 있다. 실시양태에서, rCSP 내부 참조 표준의 순도는 SDS-PAGE에 의해 >90%로 측정된다. 실시양태에서, 표준은 이량체를 10% 미만으로 함유한다. rCSP의 아이덴티티를 확인하고, 단편화된 종의 존재를 밝혀내는 데 웨스턴 블롯 분석이 사용될 수 있다. 입체형태 특이 항체 검정법은 두 rCSP이 온전하고, 적절하게 쌍을 형성하는 C 말단 도메인에 감수성인 항체를 이용함으로써 수행될 수 있다. 적절한 항체는 예컨대, 문헌 [Plassmeyer, et al., 2009]에 기술되어 있다. 환원 및 알킬화된 시료는 정제된 rCSP 표준이 정확한 이황화 구조를 가지는지를 나타내는 신호 손실에 대해 분석될 수 있다. 실시양태에서, rCSP 표준의 농도는 280 nm에서의 흡광도에 의해 측정된다. 실시양태에서, 참조 물질이 동물 연구에서의 효능을 입증하였다.

본 발명의 실시양태에서, 1차 회수 공정은 2가지 옵션을 가진다. 세포를 원심분리에 의해 수거하고, 세포 페이스트를 냉동시킬 수 있다. 이어서, 세포 페이스트를 해동시키고, 미세유동화시켜 세포 균질액을 제조할 수 있다. 별법으로, 세포 브로쓰를 희석시키고, 유지 단계 없이 바로 미세유동화시켜 세포 균질액을 제조할 수 있다.

특정 실시양태에서, 세포 페이스팅 옵션이 사용된다. 이어서, 균질액을 디스크 적층 원심분리기를 사용한 후, 이어서, 0.2 ㎛ 여과와 함께 X0HC 막을 이용하여 심층 여과함으로써 정화시킬 수 있다. 이어서, 물질을 유지 단계로서 냉동 상태 그대로 유지시킨 후, 해동시키고, TMAE HiCap 포획 칼럼에 로딩시킨다. 용리된 물질을 0.2 ㎛ 필터를 통해 여과시키고, 세라믹 하이드록시아파타이트 I형(CHT) 칼럼에 직접 로딩시킨다. 이어서, CHT 칼럼 용리액을 주변 온도에서 유지시키면서, 0.2 ㎛ 여과시키고, 온화하게 환원 처리한다. 이어서, 온화한 환원 처리 후 물질을 TFF에 의해 완충제 교환시키고, 0.2 ㎛ 필터를 통해 여과시키고, -80℃에서 냉동 보관한다.

실시양태에서, 본 발명의 방법을 사용하여 수득된, 정제된 rCSP는 SDS-PAGE(SDS-CGE)에 의해 측정된 바, 90% 초과의 순도를 가지고, SE-HPLC에 의해 측정된 바, 10% 미만의 이량체를 가지며, SE-HPLC에 의해 측정된 바, 검출가능한 더 높은 고분자량의(HMW) 응집체는 함유하지 않고, LC/MS에 의해 검출가능한 단편은 5% 미만으로 함유하며, 100 EU/mg 미만의 내독소를 가진다. 본원에서 본 발명의 바람직한 실시양태가 제시되고 기술되었지만, 상기 실시양태는 단지 일례로 제공되었다는 것은 당업자에게 명백할 것이다. 이에, 다수의 변형, 변이, 및 치환이 본 발명으로부터 벗어남 없이 이루어질 수 있다는 것을 당업자는 이해할 것이다. 본원에 기술된 본 발명의 실시양태에 대한 다양한 대안이 본 발명을 실시하는 데 사용될 수 있음을 이해하여야 한다. 하기 특허청구범위가 본 발명의 범주를 정의하고, 이들 특허청구범위 범주 내에 포함된 방법 및 구조, 및 그의 등가물이 그에 포함되는 것으로 한다.

실시예

본 발명의 방법에서 사용하기 위한 정제 공정 단계를 확인하고, 테스트하였다. SDS-CGE 분석을 사용하여 단백질 수율 및 순도를 평가하였다. 단백질 시료는 HT 프로테인 익스프레스 v2 칩 및 상응하는 시약(각각 부품 번호 760499 및 760328, 캘리퍼 라이프사이언시즈(미국 매사추세츠주 홉킨턴)이 장착된 랩칩 GXII 장치(캘리퍼 라이프사이언시즈)를 사용하는 HTP 마이크로칩 SDS 모세관 겔 전기영동에 의해 분석하였다. 시료를 제조사의 프로토콜(프로테인 유저 가이드 다큐먼트 번호 450589, Rev. 3)에 따라 제조하였다.

정제된 rCSP 시료의 단백질 농도는 에펜도르프 바이오포토미터(에펜도르프: 독일 함부르크)를 사용하여 280 nm(벡터 NTI 인비트로겐에 의해 측정된 바, 1 mg/ml에 대한 A₂₈₀= 0.61 AU)에서의 흡광도에 의해 통상적으로 측정하였다.

본원에 기술된 방법을 사용하여 CSP를 재조합적으로 발현하도록 조작된 박테리아 숙주 세포로부터 공정 개발 및 검정법 개발에 사용된 세포 페이스트 배치를 제조하였다. 세포 페이스트 배치를 제조하는 데 사용된 P. 플루오레센스 균주에 의해 발현된 CSP 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 5에 기재되어 있는 최적화된 뉴클레오티드 서열(서열 번호 3에 기재되어 있는 상응하는 아미노산 서열)을 포함하였다. 균주 CS533-129는 LAO 분비 리더에 융합된 CSP(서열 번호 3)를 코딩하는 발현 벡터를 함유하는 P. 플루오레센스 DC469(ΔpyrF, lacI^Q, ΔhtpX)이다. 균주 CS533-211은 CupA2 리더에 융합된 CSP(서열 번호 3)를 코딩하는 발현 벡터를 함유하는 P. 플루오레센스 DC488(degP2 결실)이다.

실시예

실시예 1: 재조합적으로 제조된 플라스모디움 팔시파룸 포자소체 단백질의 우선적 환원

rCSP 이량체의 단량체로의 전환

본 실시예는 C 말단 영역의 분자내 이황화 결합 및 CSP 면역원성에 필요한 천연 구조 상태를 보존시키면서, 이량체화된 rCSP의 분자간 이황화 결합을 선택적으로 환원시키는 데 유용한 우선적 환원 조건을 확인하기 위해 수행된 실험을 기술한다.

논의된 바와 같이, rCSP는 분자간 이황화 결합을 형성하는 데 이용가능한 N 말단 영역의 유리 시스테인에 기인하여, 정제하는 동안 쉽게 이량체화된다. 이어서, 이량체는 시간, 농도, 및 온도에 따라 더 높은 고분자량의 응집체를 형성할 수 있다. 재조합 CSP는 CSP 효능에 중요한 것으로 여겨지는, 2개의 이황화 결합을 그의 C 말단 영역에 추가로 함유한다. 단량체 rCSP의 회수를 증가시키기 위해, 본 발명자들은 분자간 이황화 결합을 감소시키고, 이량체를 단량체로 전환시키는 조건에 대해 조사하였다. C 말단 영역 분자내 이황화를 감소시키지 않은 조건이 바람직하였다.

디티오트레이톨(DTT)을 환원제로서 테스트하였고, 농도를 달리하면서 부틸 650S 크로마토그래피 분획으로부터의 이량체화된 rCSP 시료 1 mL에 첨가하였다. 시료를 주변 온도에서 밤새도록 자기 교반 플레이트 상에서 교반하였다. 이어서, 시료를 RP-HPLC에 의해 단량체 및 이량체 함량에 대하여 분석하였다(도 4). 패널 A는 DTT 농도 0.5 mM(최저 단량체 피크 및 두번째로 높은 이량체 피크로 나타남), 0.1 mM(0.03 피크와 중첩되는 두번째로 높은 단량체 피크, 두번째로 낮은 이량체 피크), 0.03 mM(0.03 피크와 중첩되는 두번째로 높은 단량체 피크, 최저 이량체 피크), 및 DTT 무함유(최고 단량체 피크, 최고 이량체 피크)에 상응하는 결과를 보여주는 것이다. 패널 B는 DTT 농도 0.01 mM(최고 단량체 피크, 최저 이량체 피크) 0.003 mM(중간 단량체 피크, 중간 이량체 피크), 및 및 DTT 무함유(최저 단량체 피크, 최고 이량체 피크)에 상응하는 결과를 보여주는 것이다.

rCSP를 분석하였을 때 통상 관찰되는 RP-HPLC 크로마토그램에 대해 3가지 특징이 존재한다: 단량체 형태의 주요 rCSP, 주요 rCSP 피크에서 벗어난, 트레일링(trailing) 숄더 피크, 및 rCSP의 이량체 형태인 것인, 주요 피크보다 1.4분 늦게 용리되는 피크. 도 4에 제시되어 있는 바와 같이, DTT 첨가는 일반적으로 이량체의 농도를 감소시켰고, 단량체 피크의 농도를 증가시켰지만; DTT 농도가 너무 높거나(도 4A에서, 0.5 mM), 너무 낮은 경우(도 4B에서, 0.003 mM), 이량체의 단량체로의 전환은 아주 적었다. 전환을 위해 최상인 DTT의 우선적 환원 농도 범위는 0.010 내지 0.030 mM DTT인 것으로 측정되었다.

이량체 및 이량체의 HMW 응집체를 함유하는 rCSP 배치(533-128)를 사용하여 상기 실험을 반복하였다. 소규모 정제 방법을 이용하여 다중 사이클로 대략 3 g의 배치 533-128을 SDS-PAGE에 의해 측정된 바 > 90% 순도로 제조하였다. 배치 533-128은 추후 응집화되는 것으로 측정되었다. 2 M 우레아를 첨가하자, HMW 응집체는 파괴되는 것으로 관찰되었고, 이로써 상기 응집체는 이량체 형태로 분해되었다(데이터 나타내지 않음). DTT를 pH 7.2 및 pH 8.0에서 DTT의 농도를 달리하면서 2 M 우레아를 함유하는 533-128 시료 1 mL에 첨가하고, 주변 온도에서 6 h 동안 인큐베이션시켰다. 시료를 주변 온도에서 6 h 동안 자기 교반 플레이트 상에서 교반하였다. 시료의 RP-HPLC 분석은 도 5에 제시되어 있다. 도 5A 및 도 5B의 실험을 위해 사용된 DTT 농도는 각각 하기 표 5 및 표 6에 제시되어 있다.

pH 7.2에서, 전환을 위해 최상인 DTT 농도는 12 μM 내지 25 μM인 것으로 측정되었고, pH 8.0인 경우에 최상인 농도는 25 μM이었다. 최고 농도의 DTT(10 mM)는 pH 7.2 및 pH 8.0 시료, 둘 모두에 대해 이량체 피크를 완전하게 감소시켰고, 체류 시간을 좌측으로 이동시켰는데(체류 시간 단축), 이는 가능하게는, 완전하게 환원된 형태의 rCSP일 수 있다.

수행된 실험에 기초하여, 온화한 환원 공정에 사용되는 최적의 DTT 농도는 20 μM인 것으로 측정되었다. 밤새도록(16-18 h) 환원 공정을 수행하였을 때, rCSP의 품질에는 어떤 부정적인 영향도 없었으며, 따라서, 상기 단계를, 최종 UF/DF 완충제 교환 개시 이전의 홀드 점으로서 사용하였다.

도 6에는 부틸 650S 크로마토그래피로부터의, ~120 mg의 이량체 rCSP(rCSP 배치 533-241)를 16 h 동안 20 μM DTT로 처리하고 혼합함으로써 수행된 일례가 제시되어 있다. 처리 이전의 배치는 RP-HPLC 분석에 의하면, 92.1%의 이량체를 함유하였고(도 6A), TFF에 의해 최종 완충제 교환으로 처리한 후에는 94.2% 단량체를 함유하였다(도 6B). 최종 완충제 교환 물질을 SE-HPLC에 의해 분석하였고, 어떤 HMW 응집체도 관찰되지 않았다(도 7). 온화화 환원 방법은 매우 강력한 것으로 보였고, 염기성 완충제 조성에 있어서 작은 차이에는 영향을 받지 않는 것으로 나타났다. 세라믹 하이드록시아파타이트 크로마토그래피로부터 용리된 재조합 CSP 이량체 분획에 대해서도 또한 하기 논의되는 바와 같이, 온화한 환원 처리를 성공적으로 수행할 수 있었다.

본원에서 상세하게 기술된 바와 같이, 온화하게 환원 처리된 rCSP 배치를 LC/MS 및 펩티드 지도화에 의해 분석함으로써 N 말단 시스테인이 유리 상태이고, C 말단 이황화는 온전하다는 것이 입증되었다.

실시예 2: 우선적 환원된 재조합 플라스모디움 팔시파룸 포자소체 단백질을 분석하기 위한 검정법 개발

재조합 플라스모디움 팔시파룸 포자소체 단백질 평가를 위해 공정 중 및 최종 생성물 분석 방법을 개발하였다. 상기 방법은 실시예 1에 기술된 우선적 환원 조건을 사용하여, 또는 임의의 다른 방법에 의해 수득된 rCSP를 평가하는 데 사용하기 위한 것으로 고려된다.

1. rCSP 내부 참조 표준 정제

내부 참조로서 사용하기 위한 rCSP(배치 533-191)의 정제를 하기와 같이 수행하였다.

정제용 용해물 제조

배양된 CS533-129 세포로부터의 냉동된 세포 페이스트(~70 g)를 해동시키고, 프로테아제를 함유하지 않는 20 mM 트리스(pH 8.0) 완충제(1 M 트리스(TRIS) 스톡을 사용하여 제조된 밀리-Q(Milli-Q) 물로 50배 희석된 1 M 스톡 용액(pH 8.0), 카탈로그 번호 T1080, 테크노바(미국 캘리포니아주 홀리스터)) 중에 재현탁시키고, 15,000 psi로 마이크로플루이딕스 마이크로플루다이저(Microfluidics Micro fluidizer) M-110Y을 통해 1회 통과시킴으로써 균질화시켰다. 용해물을 60 min 동안 12,000 g로 원심분리시키고, 사르토리우스 사르토브란(Sartorius Sartobran) P 0.45/0.2 ㎛ 필터 캡슐(카탈로그 번호 5235307H8-0-A, 사르토리우스-스테딤(미국 뉴욕주 보헤미아))을 통해 통과시킴으로써 여과시켰다. 8.0 M 우레아 스톡 용액(카탈로그 번호 4203-08, JT 베이커(미국 뉴저지주 필립스버그))을 사용하여 여과된 용해물을 2.0 M 우레아로 조정하였다.

크로마토그래피

프랙-950(Frac-950) 분획 수집기가 장착된 AKTA익스플로러(AKTAexplorer) 100 크로마토그래피 시스템(GE 헬쓰케어(GE Healthcare))을 사용하여 고속 단백질 액체 크로마토그래피(FPLC) 작동을 수행하였다. 30 mg의 정제된 CSP의 제조에서 사용된 정제 런에 대한 조건은 하기 표 7에 요약되어 있다. 사용된 물질: Q-세파로스 FF(Q-SepharoseFF)(카탈로그 번호 17-0510-01, GE 헬쓰케어: 미국 뉴저지주 피츠카타웨이); AK26/20 칼럼(부품 번호 28-9889-48, GE 헬쓰케어); 부틸-650S(카탈로그 번호 14701, 토소 USA(TosohUSA: 미국 뉴저지주 플레밍턴); NaCl(카탈로그 번호 13423, 시그마/리에델 데 하엔(Riedel de Haen: 미국 미주리주 세인트루이스)); NaOH(카탈로그 번호 5674-03, JT 베이커: 미국 뉴저지주 필립스버그); 황산암모늄(카탈로그 번호 BDH9001 , VWR, West Ch에스테르, PA); 및 우레아(카탈로그 번호 4203-08, JT 베이커(미국 뉴저지주 필립스버그)).

rCSP 이량체의 단량체로의 전환

완충제[용리 완충제: 2 M 우레아, 200-600 mM 황산암모늄, 및 20 mM 트리스(pH 8.0)] 중의 이량체화된 CSP를 함유하는 소수성 상호작용 크로마토그래피 용리 분획을 최종 부피 200-600 mL로 풀링시켰다. 디티오트레이톨 환원제(JT 베이커, 부품 번호 JT-F780-2, 미국 뉴저지주 필립스버그)를 최종 농도 20 μM 로 첨가하여 풀을 선택적으로 환원시키고, 실온에서 12-24시간 동안 자기 교반 막대 및 교반 플레이트를 이용하여 신속하게 교반하였다. 별법으로, 선택적 환원을 수행하기 전에 먼저 2 M 우레아를 물질에 첨가함으로써 PBS 중 응집화된 rCSP(예컨대, 배치 533-128)에 대해서 동일한 공정을 수행하였다.

최종 완충제 교환

크로마토그래피(PD-10 칼럼, 카탈로그 번호 17-0851-01, GE 헬쓰케어)로 탈염시킴으로써 온화하게 환원된 rCSP 풀을 1X PBS 완충제로 교환하였다. 더 많은 조제물의 경우, 우선적 환원된 rCSP 풀을 접선 유동 여과를 통해 1x PBS(테크노바, P0191, 20x 농축액)로 정용여과시켰다. 펠리콘(Pellicon) XL(10 kDa, 50 ㎠) 및 펠리콘 2(5 kDa, 0.1 ㎡ 및 10 kDa, 50 ㎠ 및 0.1 ㎡) 재생 셀룰로스 막(EMD 밀리포어(미국 매사추세츠주 빌러리카)을 사용하여 완충제 교환 동안 CSP를 유지시켰다. 필터테크(FilterTec) 및 사이프레스(SciPres)(사이로그 인코퍼레이티드(미국 위스콘신주 매디슨)) 유니트를 사용하여 막투과 압력(TMP) 및 저울로부터의 투과액 질량 데이터를 수집하였다. 보유액 재순환을 위해 필터테크 또는 마스터플렉스(Masterflex) L/S(콜 파머(미국 일리노이주 버논 힐즈)) 연동식 펌프를 사용하였다. 폴리프로필렌 및 PETG 용기는 혼합 및 재순환용 베쓸로서 사용하였다. 유체 스트림을 유도하는 데(direct) 타이곤(Tygon)(콜 파머) 및 백금 경화된 실리콘(콜 파머; 어드반타퓨어(미국 펜실베이니아주 사우샘프턴))을 사용하였다. 로드(온화하게 환원된 CSP) 및 보유액(정용여과된 로드)를 밀리팩 듀라포어(Millipak Durapore)®(EMD 밀리포어) 또는 사르토브란® P(프랑스 오반뉴) 멸균 0.22 ㎛ 막을 이용하여 여과시켰다.

생성물을 도입시키기 이전에 1x PBS로 막을 평형화시켰다. 실온(21-23℃)에서 우선적 환원된 CSP를 시간당 1 ㎡당 324 ℓ로(LMH) 및 648 LMH로 막을 통과시켜 재순환시켰다. 각각 10 kDa 및 5 kDa 막에 걸쳐 있는 동안 보유액에 TMP 10-15 psi 및 21-24 psi를 가하였다. 6 보유액 부피 (디아볼륨)에 대해 일정 부피 정용여과를 수행하였다. 질량 로드 비(표적/막 면적)는 2.6-14.6 g/㎡였다. 한 실험에서, 3 디아볼륨 후, 보유액을 2x로 농축시키고, 또 다른 3 디아볼륨에 대해 정용여과시켰다. 자기 교반 막대 및 교반 플레이트를 이용하여 보유액을 혼합하였다. 실온에서 ≥ 60분 동안 0.1 N NaOH를 재순환시킴으로써 막을 세정하였다. 막 재생은 정규화된 투수성 측정에 의해 확인하였다.

방법 개발에 따라 상기 물질의 다양한 재생 배치를 분석하였고, 이는 하기 다수의 섹션에서 논의되어 있다.

2. HPLC

역상 HPLC(RP-HPLC)

rCSP 단량체 및 이량체 함량, 단편화, 탈아미드화, 및 산화를 평가하기 위한 역상 HPLC(RP-HPLC) 방법이 개발되었다.

자동 시료채취기, 4원(quaternary) 펌프, 및 다중 파장(UV-vis) 검출 모듈이 장착된 애질런트 1100 시리즈(Agilent 1100 Series) 액체 크로마토그래피 시스템(애질런트 테크놀러지즈, 인코퍼레이티드(미국 캘리포니아주 팔로알토)) 상에서 분리를 수행하였다. 이동상 시약은 분석 등급의 것이거나, 또는 최적 가용 시약이었다. 사용된 아세토니트릴은 HPLC 등급(J.T. 베이커, '베이커 애널라이즈드(Baker Analyzed)'® HPLC 용매, ≥99.9%, 카탈로그 번호 9017-33))이었다. TFA(트리플루오로아세트산)은 피어스(Pierce)(카탈로그 번호 28904)로부터 입수하였다. 탈이온수는 밀리-Q 시스템(Milli-Q system)(밀리포어: 미국 베드포드)을 사용하여 수득하고, 사용 전 PES 필터 유니트(Filter Unit), 1,000 ml, 90 mm, 0.2 ㎛ 필터 멸균 장치(날진, 카탈로그 번호 567-0020)로 여과시켰다. 이동상 A는 물 중 0.1%(v/v)% TFA를 함유하였고; 용매 B는 아세토니트릴 중 0.1%(v/v) TFA를 함유하였다. 시료를 PBS(pH 7.2)(카탈로그 번호 14200, 기브코(GIBCO: 미국 캘리포니아주 칼즈배드))로 희석시키고, 가드 카트리지(시큐리티 가드(Security Guard), 4 x 3 mm, 카탈로그 번호 KJO-4282)가 장착된 쥬피터 C₄(페노메넥스, 부품 번호 00G-4167-E0) 칼럼(300 Å 공극, 5 ㎛ 입자 크기, 4.6 x 250 mm) 상에 30-60 ㎕를 주입하였다. 구배 조건은 20 min 동안 22%-32% 이동상 B였다. 칼럼 온도는 50℃였다. 유속은 1 ml/min이었다. 검출은 214 nm 및 280 nm에서 수행되었다.

rCSP의 이량체 및 단량체 형태 측정을 위한 공정 중 시료 분석에 대해서는 도 8에 제시되어 있다. 환원 및 비환원 SDS-CGE 분석에 의해 측정된 바, 분취용 소수성 크로마토그래피를 통해 rCSP의 단량체 및 이량체 형태가 분리되었다(도 8A-C). RP-HPLC에 의한 단리된 형태의 분석 결과, 상기 기술된 단량체 및 이량체의 혼합물에 대한 체류 시간과 일치하는, 상이한 체류 시간을 가지는 단일 피크들이 나타났다(도 8D).

크기 배제 HPLC ( SE - HPLC )

응집화된 종을 확인하고, rCSP의 구형 구조를 분석하는 SE-HPLC 방법이 개발되었다.

애질런트 1100 시리즈 액체 크로마토그래피 시스템(애질런트 테크놀러지즈, 인코퍼레이티드)에 장착된 가드 TSK겔 SW_XL(가드 TSKgel SW_XL)(토소, 카탈로그 번호 8543)과 함께 TSK겔 G3000SW_XL, 7.8 mm ID x 300 mm, 5 ㎛(토소, 카탈로그 번호 8541) 상에서 크기 배제 크로마토그래피를 수행하였다. 이동상은 밀리-Q 물로 10X 희석된 포스페이트 완충처리된 염수(PBS)(pH 7.4)(미디어테크(Mediatech), 카탈로그 번호 46-013-CM)였고, 사용 전 PES 필터 유니트, 1,000 ml, 90 mm, 0.2 ㎛ 필터 멸균 장치(날진, 카탈로그 번호 567-0020)로 여과시켰다. 유속은 0.5 mlmin^-1이고; 주입 부피는 50-100 ㎕이고; 흡광도는 280 nm에서 모니터링하였다.

도 9A에는 최상의 성능을 제공한 TSK-GEL G3000SWXL 칼럼이 사용된 rCSP(533-191)의 SE 크로마토그램이 제시되어 있다. 크기 배제는 크기에 기초하여 단백질을 분리시키는데, 단백질의 크기가 클수록 더 작은 단백질보다 더 빨리 용리된다. rCSP의 분자량(~38 kDa)에 기초하여, 체류 시간은 관찰된 것보다 더 길어야 한다. 예를 들어, 크로마토그래프를 작성하였을 때, 같은 칼럼 상의 보정 표준, 예컨대, 분자량이 ~67 kDa(rCSP보다 크기가 ~1.8x 더 크다)인 BSA는 체류 시간 1.66 min으로 rCSP보다 더 늦게 용리된다(도 11B). 이에 대한 해명으로는 CSP의 고도로 확장된 비구형 구조를 들 수 있는데, 이는 SE-HPLC에 의한 크기 분류를 혼동케 할 수 있다. SE-HPLC에 커플링된 다중 각도 레이저 광 산란(MALS)에 의해 rCSP의 분자량을 측정한 결과, 이는 42-46 kDa인 것으로 측정되었는데, 이는 그의 실제 분자량(제시하지 않음)에 가까운 값이었다. MALS에 의해 측정된 BSA의 크기는 70.5 kDa이었고, 이 또한 그의 분자량에 가까운 값이었다.

다른 방법에 의해서 품질이 손상된 것으로 측정된 시료와 함께, SE-HPLC에 의해 rCSP의 강제식 분해 연구를 분석하였다. rCSP의 응집화된 형태는 도 10에 제시되어 있는 바와 같이 분석되었다. 도 10A에는 원심분리 농축 장치를 사용하여 농축된 시료에 대한 것으로서, rCSP인 경우에는 이량체 및 고분자량(HMW) 응집체를 제조하는 것인 시료에 대해 제시되어 있다. 도 10B에는 고도로 응집화된 것으로 관찰된 rCSP 배치 533-128의 SE-HPLC 분석이 제시되어 있다.

3. SDS - PAGE

rCSP 순도, 및 분해 단편을 분석하는 SDS-PAGE 방법이 개발되었다. 시료를 레멜리 샘플 버퍼(바이오-래드(Bio-Rad), 카탈로그 번호 161-0737)를 이용하여 1:1로 희석시킨 후, 써모사이클러에서 95℃에서 5분 동안 가열하였다. 시료가 실온에 도달하게 한 후, 18 웰 바이오-래드 10% 비스-트리스 겔(바이오-래드, 카탈로그 번호 345-0112)에 로딩하고, 1X MOPS 전개 완충제(바이오-래드, 카탈로그 번호 161-0788) 중 100 V에서 20분 동안, 이어서, 200 V에서 60분 동안 전기영동시켰다. 전개 완충제를 PAGE 분리 동안 10℃로 냉각시켰다. 분리 후, 겔을 겔코드 블루 스테인(피어스, 카탈로그 번호 24592)로 염색시키고, 탈염색시키고, 디지털 영상화 장치를 이용하여 영상화하였다.

4. 웨스턴 블롯

rCSP 순도 분해 단편을 모니터링하는 웨스턴 블롯팅 방법이 개발되었다.

20% 메탄올과 함께 1X NuPAGE 트랜스퍼 버퍼(인비트로겐, 카탈로그 번호 NP0006-1)를 사용하여 단백질을 100 V에서 60분 동안 SDS-PAGE 겔로부터 0.2 ㎛ 니트로셀룰로스 막(바이오-래드, 카탈로그 번호 162-0232) 상으로 옮겨 놓았다. SDS-PAGE 전에 일부 시료를 알킬화시켰다. 상기 분석을 위해, 요오도아세트아미드(시그마, p/n 16125)를 환원된 시료에 과량으로 최종 농도 5 mM까지 첨가하고, 암실에서 실온에서 30 min 동안 인큐베이션시켰다. 막을 실온에서 1시간 동안 PBS 중 블로커™ 카제인(Blocker™ Casein)(피어스, 37528)에서 차단시켰다. 검출을 위해, 희석제를 붓고, 단일클론 항Pf CSP의 1:2,000 희석액을 함유하는 추가물을 첨가하였다. 블롯을 밤새도록 4℃에서 로킹시키면서 인큐베이션시켰다. 블롯을 3회에 걸쳐 매회 5분 동안 PBS-트윈을 이용하여 세척한 후, 염소에서 유래된, 항마우스 IgG(γ 쇄 특이) 퍼옥시다제(써던 바이오테크(Southern Biotech), 1030-05)의 1:5,000 희석액을 함유하는 추가의 희석제 중에서 실온에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 블롯을 3회에 걸쳐 매회 5분 동안 PBS-트윈(시그마, P3563)을 이용하여 세척한 후, 실온에서 1분 동안 이뮤노퓨어 메탈 인핸스드 DAB(Immunopure Metal Enhanced DAB) 기질(피어스, 34065)을 사용하여 발색시켰다. 알파 이노테크 플루오르이미저(Alpha Innotech FluorImager)를 이용하여 영상화를 수행하였다.

5. 바이오층 간섭법( BLI )

검출 방법으로서 바이오층 간섭법(BLI)을 사용하는 rCSP에 대한 결합 검정법이 개발되었다. BLI를 사용하여 입체형태 특이 항체 및/또는 헤파린에 결합할 수 있는 rCSP의 능력에 의하여 폴딩 및 기능성을 모니터링할 수 있었다. 따라서, 기능성 결합 검정법은 rCSP 입체형태 차이를 검출하는 데 유용하고, 이는 활성 검정법으로서 사용될 수 있다. 3가지 전략법이 개발되었는데: 한 전략법은 헤라핀을 포함하는 것으로서, 여기서, CSP는 간세포 헤파린 술페이트 프로테오글리칸에 결합하는 그의 기능의 일부로서 헤파린에 결합하고, 나머지 두 전략법은 입체형태 특이 단일클론 항체를 포함한다.

방법: 포르테바이오(ForteBio: 미국 캘리포니아주 멘로 파크) 기술 노트: "Biotinylation of Protein for Immobilization onto Streptavidin Sensors"에 기술된 방법을 이용하고, NHS-LC-LC-비오틴(피어스, 카탈로그 번호 21343)을 사용함으로써 항체에 대한 몰비 2.5:1로 (CSP를 인식하는 항체를 단리시키는 방법에 대해서도 기술되어 있는 것인, 상기 참조된 문헌 [Plassmeyer, et al., 2009]에 기술된) 단일클론 항CSP 항체 IG12 또는 4C2를 비오티닐화하였다. 칼바이오켐(Calbiochem)으로부터 입수한 헤파린(카탈로그 번호 375095, 칼바이오켐은 EMD 케미칼즈(미국 뉴저지주 깁스타운)의 부서이다)을 상기와 같이 비오티닐화하였다. 바이오센서(스트렙트아비딘 바이오센서스, 포르테바이오, 카탈로그 번호 18-0009)를 10분 이상 1 x 동역학적 완충제(PBS로의 10 x 키네틱스 버퍼(포르테바이오, 카탈로그 번호 18-5032)의 10배 희석액)의 중에서 수화시켰다. 사이드킥(Sidekick)™ (포르테바이오) 진탕기/혼합기 상에서 실온에서 90분 동안 1,000 rpm으로, 또는 4℃에서 밤새도록 혼합시키지 않으면서, 시료 희석제(포르테바이오, 카탈로그 번호 18-5028)로 희석된 10 ㎍/ml 비오티닐화된 기질을 센서에 로딩하였다.

시료를 시료 희석제로, 또는 1 x 동역학적 완충제로 희석하였다. 시료 및 표준을 ½ 면적 플레이트(E&K 사이언티픽(E&K Scientific), 카탈로그 번호 EK-78076)로 100 ㎕의 부피로 로딩하거나, 표준 크기 96 웰 플레이트(E&K 사이언티픽, 카탈로그 번호 EK-25209)로 200 ㎕의 부피로 로딩하였다.

센서를 ~5분 동안 1 x 동역학적 완충제 중에 침지시킨 후, 테스트 시료를 대략 전체 단백질 농도로 가용성 분획이 없는 희석액 중 사이드킥™ 진탕기/혼합기 상에서 1,000 rpm으로 40분 동안 미리 평형화시켰다. 검정을 개시하기 전에 10분 동안 옥테트(Octet) BLI 장치 중 30℃에서 시료 플레이트를 미리 평형화시켰다. 30℃에서 180 sec 동안 1,000 rpm으로 시료를 판독하고, 기질의 표준 곡선으로부터 64, 32, 16, 8, 4, 2, 1, 및 0.5 ㎍/ml에서 정량를 계산하였다.

결과: rCSP 결합에 대한 헤파린을 이용한 바이오센서 입체배치가 도 11A에 제시되어 있다. 각각 서열 번호 3에 기재된 rCSP를 발현하는 세포로부터 제조된 것인 rCSP의 3가지 표준을 헤파린 결합에 대해 검정하였다:배치 533-036; 내부 참조 표준으로서 정제된 배치 533-191; 및 배치 533-128. 다양한 농도에서의 상기 조제물에 대한 결합률의 결과가 도 11B에 제시되어 있다. 각 시료 농도의 비율은 서로 매우 달랐다(도 11B 및 C).

6. 모세관 등전 포커싱 ( cIEF )

rCSP 전하 이질성을 모니터링하기 위한 모세관 등전 포커싱 분석 방법이 개발되었다.

시료 제조: 2 h 동안 2 M 우레아(JT 베이커, 카탈로그 번호 4203-08) 및 10 mM DTT 중에서 인큐베이션시킴으로써 시료를 환원시킨 후, 10 kDa 밀리포어 마이크로콘(Millipore Microcon) 원심분리 농축기(카탈로그 번호 42407)를 이용하여 >1.5 mg/mL로 농축시켰다. 이어서, 30 ㎕의 시료를 5 ㎕의 40% 파마라이츠(Pharmalytes)(pH 2.5-5)(GE 헬쓰케어, 카탈로그 번호 17-0451-01), 5 ㎕의 40% 파마라이츠(pH 5-8)(GE 헬쓰케어, 카탈로그 번호 17-0453-01), 35 ㎕의 1% 메틸셀룰로스(프로테인심플(ProteinSimple), 카탈로그 번호 101876), 25 ㎕의 8M 우레아, 및 pI 마커 4.22 및 6.14(프로테인심플, 각각 카탈로그 번호 102350 및 102220)와 혼합하였다.

방법: CFR 소프트웨어 버전 2.3.6, cIEF 카트리지-Fc 코팅(커버젠트 바이오사이언스(캐나다 토론토), 카탈로그 번호 101700), 및 프린스 마이크로인젝터(PrinCE MicroInjector)(커버젠트 바이오사이언스, s/n 54-20-07-4-048)가 장착된, iCE280 애널라이저(Analyzer)(커버젠트 바이오사이언스, S/N 1348) 상에서 획득 및 분석을 수행하였다. 하기 분석기 설정 환경을 사용하였다: 포커스 기간 1 = 1.0 min 동안 1,500 V; 포커스 기간 2 = 7.0 min 동안 3,000 V; 시료 이동 시간 = 135 sec; 세척 기간 = 0 sec; 평균 스캔 = 16; 노출 시간 = 73 msec; 탈염 전류 = 101 μAMP; 이동 시간 지연 = 0.0 min; 검출 = 280 nm.

iCE 소프트웨어에 이어서, 크롬퍼펙트(ChromPerfect) 버전 5.5.6에 의해 데이터를 변환시키고, 프로세싱함으로써 pI 마커 보정을 수행하였다. 전해 탱크 시약은 0.1% 메틸셀룰로스 중 0.08% 인산, 및 0.1% 메틸셀룰로스 중 0.1 M 수산화나트륨을 포함하였다(상기 두 시약 모두 심플프로테인 키트(SimpleProtein Kit)의 부품이다, 부품 번호 102506).

cIEF를 사용하여 rCSP의 전하 이질성을 분석하는 방법이 개발되었고, 그 결과는 도 12에 제시되어 있다. 내부 참조 rCSP 배치 533-191은 pI 5.20 및 pI 5.76에서 주요 피크를, 및 pI 4.99, 5.08 및 5.52에서 그보다 작은 피크를 나타내었다(도 12A). 1차 아미노산 서열에 기초한 pI의 계산치는 pI 5.21이었다. pI 피크가 더 낮은 것은 음전하를 생성하고, pI를 저하시킨 rCSP 중 아스파라긴 잔기의 탈아미드화 때문일 가능성이 존재하였다.

7. 원평광 이색성 및 고유 형광

rCSP에 대한 원평광 이색성(CD) 방법이 개발되었다. 185-250 nm로부터의 원 UV-CD 영역은 2차 구조적 차이(즉, α 나선, β 시트 및 랜덤 코일)를 모니터링한다. 3차 구조적 차이를 모니터링하기 위해 고유 형광을 평가하였다.

방법: 0.1 mm 경로 길이 큐벳트를 사용하고, 대역폭을 1 nm로 설정하고, 스캐닝 속도 100 nm/min, 디지털 통합 시간(DIT) = 1 sec, 폭 5 x 축적으로 하여 자스코 J-815 분광편광계(자스코) 상에서 원 UV CD 분광법(240-190 nm)을 수행하였다. 20℃에서 x 5 mM 트리스(시그마, 카탈로그 번호 T7818-250G)/16.7mM 황산나트륨(시그마, 카탈로그 번호 S9627-500G), pH 7.5 완충제 중에서 시료를 분석하였다.

결과: 도 13A에는 포스페이트 완충처리된 염수 중 0.37 mg/mL의 rCSP 참조 물질에 대한 CD 선 스펙트럼이 제시되어 있다. CD 스펙트럼은 어떤 다른 특징적인 최소치 또는 최대치 없이 200 nm에서 최소치를 보였다. 이러한 특징은 알파 나선의 비율(%)이 낮다는 것을 제안한다. K2D2 소프트웨어를 사용하여 분석을 수행함으로써 알파 나선 8% 및 베타 가닥 29%인 결과를 얻었다(도 16B). 최대 오차는 0.23이었다. 상기 값은 문헌에 보고된 값(5% 알파 나선 및 27% 베타 가닥, 예컨대, 문헌 [Plassmeyer, M.L. et al., 2009, Structure of the Plasmodium falciparum Circumsporozoite Protein, a Leading Malaria Vaccine Candidate, JBC 284 (39): 26951-26963])과 일치하는 것이었다.

참조 표준 533-191에 대한 rCSP의 형광 스펙트럼을 측정하였다. 분석을 위해 초기 온도를 20℃로 설정한 후, 40 내지 75℃로 단계적으로 증가시킨 후, 20℃로 복귀시켰다. 각 온도 설정 환경에서 형광을 판독하였다. 방출 최대치는 340 nm였고, 온도 증가에 따른 유의적인 이동은 없었다. 그러나, 기준선은 증가하였는데, 그 이유에 대해서는 불명확하다. 변성시 최대치의 방출 강도는 75℃에서 유의적으로 감소하였다. 20℃로의 복귀시, 방출 강도는 초기 판독치보다 더 높은 수준으로 복귀되었고; 이는 기준선이 상향 이동하였기 때문일 수 있다.

8. 질량 분석법 분석

LC - MS 에 의한 온전한 질량 분석

방법: 조제물 533-191에 대해 온전한 질량 분석을 수행하였다. 온전한 질량 분석은 단백질 분해성 클리핑, 예컨대, N 말단에서의 탈아미드화, 산화, 및 단편화를 모니터링하는 데 유용하다. 본 시료를 비환원된 및 환원된 조건하에서 LC-MS에 의해 분석하였다.

결과: 환원된 조건하에서 분석하는 경우, 정제된 533 시료를 동량의 UTD 완충제(7.2 M 우레아, 100 mM 트리스(pH 7), 100 mM DTT)와 혼합하였다. 이어서, 분석하기 전에 환원된 시료를 30 min 동안 37℃에서 가열하였다. 비환원된 조건하에서 분석하는 경우, 시료를 혼합하지 않고 그대로(neat) 전개시켰다. 알킬화된 시료의 경우, 하기를 참조할 수 있다. 전기 분무 경계면이 있는 Q-토프(Q-Tof) 질량 분석계(워터스(Waters))에 커플링된 상호연결된 시료 채취기, 칼럼 가열기, UV 검출기, 및 HPLC(애질런트 1100)를 이용하여 시료(10 ㎍)에 대해 LC-MS 분석을 수행하였다. 런에 앞서, NaCsI를 이용하여 질량 분석계를 600-2,600 m/z로 보정하였다. 가드 칼럼(조르박스 5 ㎛, 300SB-CN, 4.6 x 12.5 mm, 애질런트, P/N 820950-923)이 장착된 CN 칼럼(조르박스(Zorbax) 5 ㎛, 300SB-CN, 2.1 x 150 mm, 애질런트, P/N 883750-905)을 이용하여 50℃에서 분리하였다. 사용된 HPLC 완충제는 완충제 A(0.1% 포름산) 및 완충제 B(90% 아세토니트릴 0.1% 포름산)였다. 개발된 새 방법에서, 5% B로 시료 주입 후, 칼럼을 바로 5% 내지 30% B인 구배로 17 min 동안, 이어서, 5 min 동안 100% 100% B에 이르게 한 후, 5 min 동안 5% B로 종료되는 것으로 전개시켰다. 유속은 0.3 ml/min이었고, 시료 탈염을 위해 처음 10 min 동안 MS 전환 밸브를 이용하여 유동을 폐기물 쪽으로 전환시켰다. 533 표적 단백질(CSP)은 ~17.9 min에서 용리된다.

MS에 앞서, 180-500 nm으로부터 UV 흡광도를 수집하였다. 2.5 kV에서 양의 모드로 ESI-MS 전원을 사용하였다. 1초단 2 스캔으로 600-2,600 m/z 범위를 이용하여 MS 스캔을 수행하였다. MS 및 UV 데이터를 분석하였다. 매스링크스(MassLynx) 소프트웨어(워터스)를 사용하여 데이터를 분석하였다. UV 크로마토그램 및 MS 총 이온 전류(TIC) 크로마토그램을 작성하였다. 표적 피크에 대한 MS 스펙트럼을 합산하였다. 합산된 스펙트럼을 해상도 1 Da/채널, 및 가우시안(Gaussian) 폭 0.25 Da으로 분자량 범위 10,000-80,000에 대해 스캐닝하는 맥스Ent 1(MaxEnt 1)을 사용하여 데콘볼루션을 수행하였다. 전체 프로세싱된 533의 MW 이론치는 환원된 것 및 비환원된 것에 대해 각각 38,725.0 Da 및 38,721.0 Da인 것으로 측정되었다.

환원된 시료 및 비환원된 시료에 대한 MW 관측치와 이론치 사이의 차이(Δ MW)는 각각 1 및 4 Da이었다. 이는 해상도 5,000의 장치를 이용하여 상기 크기의 단백질을 분석하는 경우의 예상 질량 정확도 4 Da ± 4 Da 범위 내의 것이었다. 장치의 질량 정확도 한계에 기인하여, 온전한 질량 분석만으로는 이황화 결합 형성 상태를 측정할 수 없었다. 본 분석의 결과는 도 14에 제시되어 있다.

시스테인 알킬화에 이은 온전한 질량 분석

이황화 결합 형성 상태를 조사하기 위해, 조제물 533-191에 대해 시스테인 알킬화 실험을 수행하였다.

방법: 천연 단백질 중 유리 시스테인(들)의 분석을 위해 정제된 533-191 시료에 대해 알킬화를 수행하였다. 본 분석을 위해, 요오도아세트아미드(시그마, p/n 16125)를 천연 비환원된 533 시료에 최종 농도 5 mM까지 첨가하고, 암실에서 R.T.에서 30 min 동안 인큐베이션시켰다. 이어서, 온전한 질량 분석을 위해 반응물을 PBS로 탈염시키거나, 크기 배제 스핀 칼럼(0.7 ml, 피어스, p/n 89849)을 사용하는 분해를 위해 25 mM NH₄HCO₃으로 탈염시켰다

모든 이황화 결합의 변성 및 완전한 환원 후, 정제된 533-191 시료에 대하여 또한 모든 시스테인의 알킬화를 수행하였다. 변성 및 환원된 시료의 알킬화를 위해, 우레아를 2 M 최종 농도로 첨가하고, DTT를 10 mM 최종 농도로 첨가하고, 시료를 37℃에서 30 min 동안 인큐베이션시켰다. 이어서, 요오도아세트아미드를 30 mM 최종 농도로 첨가하고, 암실에서 실온에서 30 min 동안 인큐베이션시켰다. 이어서, 온전한 질량 분석 또는 분해를 위해 시료를 상기와 같이 탈염시켰다.

결과: 상기 기술된 바와 같이, 요오도아세트아미드를 비환원된 및 환원된 시료, 둘 모두에 첨가하였다. 상기 시료에 대해 LC-MS에 의한 온전한 질량 분석을 수행하였고, 결과는 도 15에 제시되어 있다. 비환원된 및 환원된 시료에 대한 질량 관측치는 하나의 시스테인 알킬화을 포함하는 533-191과 일치하였다(도 15A). 비록 본 실험을 통해 어떤 시스테인이 실제로 알킬화되었는지 여부를 확인하지는 못했지만, N 말단 시스테인인 알킬화된 것으로 가정하였다. 환원 및 알킬화된 시료 분석 결과, 533-191이 완전하게 환원되었을 때, 5개의 시스테인 모두 알킬화된 것으로 나타났다(도 15B).

알킬화되고, 비환원된 533-191은 하나의 시스테인 알킬화를 가지는 533의 MW 이론치와 비교하였을 때, Δ는 6.0 Da인 것으로 관찰되었다. 환원 및 알킬화된 533-191은 5개의 시스테인 알킬화를 가지는 533의 MW 이론치와 비교하였을 때, Δ는 3.9 Da인 것으로 관찰되었다. 4개의 시스테인 알킬화를 가지는 533과 관련이 있고, 전체 존재비가 ~43%인 추가의 종이 존재하였다. 본 관찰 결과는 불완전한 알킬화에 기인하는 것일 가능성이 가장 컸다.

알킬화 및 펩티드 지도화에 의한 유리 N 말단 시스테인 확인

rCSP 미세이질성을 평가하고, rCSP의 N 말단 영역 중의 이용가능한 시스테인을 확인하기 위한 펩티드 지도화 분석 방법이 개발되었다.

방법: 천연, 비환원된-알킬화된, 및 환원된-알킬화된 533 시료를 상기 기술된 바와 같이, 25 mM NH₄HCO₃으로 탈염시켰다. 개별 분해물에 대해, 5-20 ㎍의 탈염된 시료를 상이한 프로테아제로 분해시켰다. 트립신(시그마, 프로테오믹스 등급, p/n T6567) 및 Glu-C(로슈(Roche), 서열 분석 등급, p/n 11420399001) 분해물의 경우, 각각의 프로테아제를 1:50(wt:wt)의 효소:기질로 첨가하고, 37℃에서 밤새도록 인큐베이션시켰다. 트립신 및 엘라스타제의 이중 분해 또한 수행하였다. 먼저, 시료를 상기와 같이 트립신으로 분해하였다. 트립신 분해 후, 엘라스타제(시그마, IV형, p/n E0258)를 상이한 비, 1:20, 1:100, 및 1:500으로 첨가하고, 37℃에서 7 hr 동안 인큐베이션시켰다. 포름산을 최종 1-5%(vol:vol)로 첨가함으로써 상기 분해 모두를 정지시켰다.

하기 기술되는 바와 같이, 2 ㎍의 각 분해물에 대해 LC-MS/MS를 수행하였다. 런에 앞서, NaCsI를 이용하여 질량 분석계를 200-2,000 m/z로 보정하였다. 분해물 분석을 위해 상기 LC-MS 환경 설정을 사용하였는데, 단, 예외적으로, 분리를 위해 C₁₈ 칼럼(조르박스 300SB C₁₈, 2.1 x 250 mm, 5 ㎛, 애질런트, 부품 번호 881750-902)을 사용하였다. 하기 LC 세그먼트를 이용하는 칼럼이 개발되었다: 5% B에서 10 min, 50 min에 걸쳐 5-40% B 구배, 20 min에 걸쳐 40-60% B 구배, 5 min 동안 100%, 및 5 min 동안 5% B; 0.3 mlmin^-1 및 50℃로 전개). MS에 앞서 180-500 nm로부터 UV 흡광도를 수집하였다. 2.5 kV에서 양의 모드로 MS 전원을 사용하였다. 측량 MS 스캔에 이어서, 데이터 독립 MS/MS 스캔을 포함하는 MS/MS 스캔 전략법을 사용하였다. 100-2,000 m/z 범위 및 스캔 시간 0.5 sec를 사용하여 스캔을 수행하였다; 측량 스캔은 충돌 에너지 6 V에서 이루어졌고, 데이터 독립 MS/MS 스캔은 28 V에서 이루어졌다. 획득 후, 각 열의 파일은 특정 체류 시간에, 앞서 관찰된 특정 펩티드를 이용하여 록 질량(lock-mass) 방식으로 보정하였다.

바이오파마링크스(워터스)를 사용하여 LC-MS/MS 결과를 분석하였다. 개별 트립신 Asp-N, 및 Glu-C 분해물에 대해 하기 파라미터를 사용하였다: 60 ppm 질량 허용 오차(tolerance), 결손 절단 2회 허용, 및 반특이성(펩티드 중 한쪽 단부는 비특이성일 수 있다); Asp-N 및 Glu-C는 (특이성에 의해) Asp 및 Glu, 둘 모두에서 절단될 수 있도록 하였다. 서열 커버율 측정을 위해, 2% 강도의 필터를 이용하였다(즉, 신원 확인으로서 계수하기 위해, 펩티드 이온은 가장 강도가 큰, 확인된 펩티드 이온의 강도인 2%보다 더 큰 값을 가져야 했다); 추가로, N 및 Q에서의 탈아미드화를 가변적으로 검색하였다. 비환원된 분해물의 경우, 단량체 조제물의 검색을 위해 533의 예상된 이황화 결합(C₃₁₄-C₃₄₉ 및 C₃₁₈-C₃₅₄)을 사용하였고; 이량체화를 검색하기 위한 경우에는 533 서열에 대한 2개의 카피를 첨가하고, 상기 이황화 결합을 사용하고, 그와 함께 C₅-C₅ 분자간 이황화 결합을 방법 파일에 부가하였다. 환원 및 알킬화된 분해물의 경우, 단백질 서열 중 임의의 이황화 결합 없이, 검색을 위해 Cys에서의 고정된 변형(카바미도메틸-Cys)을 사용하였다. 비환원 및 알킬화된 시료의 경우, 단백질 서열 중 임의의 이황화 결합 없이, 검색을 위해 Cys에서의 다양한 알킬화를 사용하였다. 이중 분해(트립신 및 엘라스타제) 시료의 경우, 검색을 위해 100 ppm을 사용하고, 효소 특이성은 사용하지 않았다. 2개의 이황화 결합을 포함하는 전체 단백질 서열에 대한 비특이적인 검색은 종료하는 데 상당한 시간이 소요되는 바, 이로 인해 실행불가능하였다. 따라서, 2개의 이황화 결합을 구성하는 4개의 시스테인을 함유하는 533 서열의 단 3개의 짧은 세그먼트만이 사용되었다. 상기 서열은 아미노산 303-325, 348-350, 및 354-362로 구성되었고, 이는 트립신에 의해 분해된 이황화 결합 트리펩티드를 구성하는 펩티드 서열이었다. 이들 서열은 방법 파일에 개별 단백질 서열로서 부가되었고, 상기 언급된 정확한 이황화 결합이 사용되었다.

결과: 펩티드 지도화를 수행하여 상기 언급된 알킬화되고, 비환원된 533-191 시료에서 어느 시스테인이 알킬화되었는지를 측정하였다. Glu-C는 적절한 크기의 N 말단에 인접한 펩티드(E2)를 제조하는 바, 이에 사용되는 프로테아제였다. 상기 펩티드는 예상 유리 시스테인인 첫번째 시스테인(C₅)을 함유하는 것이다. 분해된 시료에 대해 LC-MS/MS 분석을 수행하였다. 도 16A의 방법 섹션에 기술되어 있는 바와 같이, 바이오파마링크스 소프트웨어를 사용하여 알킬화된 E2 펩티드를 확인하였다. 상기 펩티드는 가장 강도가 강한 것으로 확인된 펩티드들 중 하나이고, 확인된 22개의 b- 및 y-이온을 가졌다(데이터 나타내지 않음). Glu-C 분해물은 또한 2번째 및 3번째 시스테인(C₃₁₄ 및 C₃₁₈)을 함유하는 E18 및 5번째 시스테인(C₃₅₄)을 함유하는 E23인, 매우 뚜렷한 2개의 다른 펩티드를 제조할 수 있었다. 상기 두 펩티드는 완전하게 환원 및 알킬화된 시료 중 고강도에서 관찰할 수 있었다(데이터 나타내지 않음). 그러나, 상기 펩티드는 비환원된, 알킬화된 시료 533-191의 상기 언급된 분석에서 유의적인 수준으로 확인되지는 않았다. 이는 상기 펩티드 내의 시스테인은 주로 이황화 결합에 관여한다는 것을 제안한다. 마지막으로, 본 발명자들은 같은 시료 중 C₅와 C₅ 사이의 분자간 이황화 결합을 확인하기 위해 시도하였다. 바이오파마링크스를 사용하여 같은 데이터를 검색하되, 단, 533의 두 카피 사이의 이황화 결합은 C1을 통해 이루어질 수 있도록 허용하였다. 상기 이황화 결합된 디펩티드, E1-E2:E1-E2가 본 검색에서 확인되었다(도 16B). E1-E2는 펩티드 내 글루탐산 잔기에서의 결손 절단을 나타낸다. 이러한 경우, 결손 절단은 인접한 이황화 결합에 의해 유발된 프로테아제에 대한 접근 제한이 원인이 될 수 있다. 이는 낮은 강도의 이온이며, 상기 조제물 중의 이량체는 단량체와 비교하여 소량의 성분이라는 다른 데이터(예컨대 RP-HPLC, SE-HPLC)와 일치하였다. 종합해 보면, 비환원되고, 알킬화된 533-191의 Glu-C 분석은 N 말단에 인접한 시스테인(C₅)이 유일한 유리 시스테인이며, 533-191의 1차 형태라는 것을 제안하였다. 따라서, 선택적 환원 방법은 분자내 이황화 결합이 아닌, 오직 C₅-C₅ 분자간 이황화 결합만을 환원시키는 것으로 나타났다.

펩티드 지도화에 의한 이황화 결합 분석

P페넥스(Pfenex) 제조된 533 중의 이황화 결합의 성질을 펩티드 지도화에 의해 분석하였다. 533-128을 먼저 트립신으로, 이어서, 엘라스타제를 이용하여 순차적으로 이중 분해시켰다. 엘라스타제 분해는 3가지 다른 효소: 기질 비로 테스ㅌ하였다. 이중 분해물 모두 LC-MS/MS에 의해 분석하고, 생성된 데이터는 바이오파마링크스로 프로세싱하였다. 먼저, 예상되는 이황화 결합(C₃₁₄-C₃₄₉ 및 C₃₁₈-C₃₅₄)을 검색 파라미터에 포함시켰다. 그 결과, 3개의 이중 분해물 모두에서 다중 이황화 결합 디펩티드가 확인되었다. 두 이황화 결합 모두를 구성하는 상기 디펩티드 중 2개는 하기 표 8에 제시되어 있다. 음성 대조군 방법으로서, 상기(또는 부정확한) 이황화 결합의 역, C₃₁₄-C₃₅₄ 및 C₃₁₈-C₃₄₉를 함유하는 방법 파일을 이용하여 같은 데이터를 통한 프로세싱하였다. 상기 검색으로부터 일부 이황화 결합 디펩티드가 확인되었다. 그러나, 이러한 확인은 정확한 이황화 결합(데이터 나타내지 않음)을 사용한 이전 검색과 비교하였을 때, 관찰된 이온 강도, Δ 질량, 및 b/y 단편 이온에 있어서 유의적으로 더 불량한 품질의 것이었다. 종합해 보면, 이중 분해물로부터 얻은 데이터는 533-128의 대부분의 형태, 또는 가능하게는 오직 단 한가지 형태가 예상되는 이황화 결합 C₃₁₄ _- _C349 및 C₃₁₈ _- _C354를 함유하는 것으로 제안된다.

전장의 아미노산 서열 커버율

펩티드 지도화에 의한 전장의 아미노산 서열 커버율을 위해, 환원 및 알킬화된 시료(533-128)에 대하여 다중 프로테아제를 테스트하였다. 각 분해물에 대해 LC-MS/MS를 수행하고, 바이오파마링크스에 의해 분석하였다. Asp-N 및 트립신(또는 Lys-C) 분해물로부터의 데이터를 조합하여 최적의 결과를 얻었다. 도 17A에 제시된 바와 같이, Asp-N으로 달성된 서열 커버율은 75.4%였다. 트립신의 경우, 도 17B에 제시된 바와 같이, 서열 커버율은 56.9%였다. 상기 각각의 분석에서 확인된 펩티드는 하기 표 9 및 10에 각각 제시되어 있다. Asp-N 및 트립신 분해물에 대한 관련된 LC-MS 크로마토그램은 각각 도 17C 및 17D에 제시되어 있다. Lys-C에 대한 서열 커버율은 66.9%였다(데이터 나타내지 않음). Asp-N 및 트립신/Lys-C 분해물로부터의 결과를 조합함으로써 달성된 서열 커버율은 100%보다 작았다. 이는 바이오파마링크스가 큰 펩티드를 확인할 수 없기 때문이었다. 533의 큰 반복부 영역에 기인하여, Asp-N으로부터 예상되는 2개의 펩티드는 a.a. 107-178 및 179-267이었다. 두 펩티드에 대한 분자량 이론치는 각각 7,178.2 Da 및 8,971.2 Da이었다. 본 발명자들은 원시 데이터를 수동으로 조사함으로써 Asp-N 분해물의 크로마토그램에서 두 펩티드 모두를 관찰할 수 있었다. 이들 펩티드는 (맥스Ent 1을 사용하여) 질량에 의해 확인하였고, 이는 각각 30.5 및 29.1 min에서 용리되었다. 각 피크로부터의 데콘볼루션된 스펙트럼은 도 18에 제시되어 있다. 종합해 보면, 바이오파마링크스를 사용하는 자동 프로세싱과 수동식 프로세싱을 조합한 결과, Asp-N + 트립신/Lys-C 단백질 분해물의 서열 커버율 100%를 달성할 수 있었다.

표 9에는 출현 순서대로 각각 서열 번호 29-34, 34-48, 47-50, 50-59, 59-66 및 66-76가 개시되어 있다.

표 10에는 출현 순서대로 각각 서열 번호 77-78, 78, 78-79, 78, 80-81, 81-86, 86-94, 94-101, 101-102, 102-103, 103-105 및 104-109가 개시되어 있다.

9. 숙주 세포 분석

숙주 세포 단백질( HCP ) 검정법

숙주 세포 단백질(HCP) ELISA는 시그너스 테크놀러지스 인코퍼레이티드 카탈로그 번호 F450으로부터의 "슈도모나스 플루오레센스 숙주 세포 단백질 측정용 면역효소측정 검정용" 키트를 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라 수행하였다.

Q- PCR 숙주 세포 DNA 검정법

숙주 세포 DNA를 분석하기 위해 실시간 정량적 PEC에 의한 P. 플루오레센스 DNA 검출용으로 DNA 폴리머라제 I 유전자에 대한 올리고뉴클레오티드 프라이머 및 발현 플라스미드 골격 서열을 디자인하였다. 프라이머는 인터그레이티드 DNA 테크놀러지즈, 인코퍼레이티드(Integrated DNA Technologies, Inc.)에 의해 합성되었다. 실시간 PCR은 DNA 엔지 옵티콘 시스템 PTC-200 DNA 엔진 사이클러(MJ 리서치, CFD-3200 옵티콘)을 이용하여 수행되었다.

10. 내독소 검정법

용리 분획 중 내독소는 엔도세이프-PTS 휴대용 내독소 분석기(찰스 리버 라보라토리즈(CHL)를 사용하고, 감도 범위가 1-0.01 EU/mL(CHL, 부품 번호 PTS2001F) 및 10-0.1 EU/mL(CHL, 부품 번호 PTS201F)인 카트리지를 이용함으로써 제조사가 제공하는 작동 방법에 따라 분석하였다.

실시예 3: rCSP 정제 및 rCSP 이량체의 우선적 환원

정제된 rCSP 이량체를 우선적 환원 조건에 가하고, 단량체로 분리시킨, 실시예 2에 기술된 결과에 기초하여 확인된 방법을 사용하여 정제된 재조합 CSP를 수득하였다. 모든 실험에 대해 수득된 전체 공정 수율은 36%였고, LC-MS에 의해 관찰된 분해된 종은 0%였다.

개요:

슈도모나스 플루오레센스 전체 발효 브로쓰(10 ℓ)를 1차 회수를 위해 수거용 베쓸로 옮겨 놓았다. 먼저, 전체 발효 브로쓰를 3.1 M 우레아, 31 mM 트리스(pH 8.2)로 희석시켜 ≤ 20% 고체인 균질화 피드를 수득하였다. 희석된 발효 브로쓰를 미세유동화에 의해 용해시켜 세포 용해물을 수득하였다. 용해물을 2 M 우레아, 20 mM 트리스(pH 8.2)를 이용하여 1:1로 희석하여 10% 고체 용해물을 수득하였다. 용해물 중 P. 플루오레센스 고체를 디스크 적층 원심분리 및 심층 여과에 의해 rCSP 함유 완충제로부터 분리하였다. 이어서, rCSP 함유 완충제를 0.2 ㎛ 필터로 추가로 여과시키고, 냉동시켰다. 일단 해동시킨, rCSP 정화된 세포 추출물 중 일부를 음이온 교환 크로마토그래피(AEX)에 의해 정제하였다. rCSP 함유 AEX 용리액을 수집하고, 하이드록시아파타이트 크로마토그래피(HA)에 의해 추가로 정제하였다. rCSP 함유 HA 용리액을 수집하고, 2-8℃에서 보관하였다. 일단 HA 용리액을 다시 주변 온도로 복귀시키고, 0.2 ㎛ 필터로 여과시키고 나면, rCSP를 우선적 환원 조건에 가하였다. 완충제 중 이량체화된 CSP를 함유하는 크로마토그래피 용리 분획을 최종 부피 200-600 mL로 풀링하였다. 디티오트레이톨 환원제(JT 베이커, 부품 번호 JT-F780-2, 미국 뉴저지주 필립스버그)를 최종 농도 20 μM로 첨가하여 풀을 우선적 환원시키고, 실온에서 12-24시간 동안 자기 교반 막대 및 교반 플레이트를 이용하여 신속하게 교반하였다. 별법으로, PBS 중 응집화된 rCSP(예컨대, 배치 533-128)를, 우선적 환원을 수행하기 전에 먼저 2 M 우레아를 상기 물질에 첨가함으로써 동일 과정을 수행하였다.

우선적 환원 조건에 가한 후, rCSP를 농축시키고, TFF에 의해 제제 완충제로 정용여과시켰다. 이어서, 정용여과된 rCSP를 최종 0.2 ㎛ 필터를 통해 통과시킴으로써 벌크 약물 물질을 수득하였다.

두 통합된 정제에 대한 정제 개요는 하기 표 11에 제시되어 있다. 500 g의 냉동된 세포 페이스트에 대해 1차 회수 단계를 수행하고, 심층 여과를 통해 공정 처리함으로써 대략 85%의 회수 수율, 및 8%의 순도를 얻었다. 이어서, 상기 물질을 TMAE 칼럼(런 533-402 및 런 533-404) 상에서 크로마토그래피하여 평균 회수율 83% 및 순도 78%를 얻었다(도 19 및 20). 이어서, TMAE 풀을 세라믹 하이드록시아파타이트 I형(런 533-403 및 런 533-405)을 통해 통과시킴으로써 SDS-CGE에 의하면 평균 회수율 69% 및 순도 96%를 얻었다(도 21 및 22). 이어서, CHT 물질을 온화화 환원 공정으로 처리하고, TFF에 의해 PBS로 완충제 교환함으로써 SDS-CGE에 의하면 수율 ~75% 및 최종 순도 96%를 얻었다. 280 nm에서의 흡광도에 의해 측정된, 배치 533-406 및 533-407에 대한 rCSP 농도는 각각 1.0 mg/ml 및 1.2 mg/ml인 것으로 나타났다(하기 표 11). 이어서, 정제된 rCSP(배치 533-406 및 533-407)를 분취하고, 추가 분석을 위해 -80℃에서 부관하고, 하기 논의되는 바와 같이, 특징을 규명하였다. 두 통합된 런 모두에 대한 전체 정제 수율은 대략 36%였으며, 이는 이전 단계 정제 공정에 비하여 대략 10배 개선되었음을 나타낸다. 예를 들어, 음이온 교환에 이어서, 소수성 상호작용 크로마토그래피를 포함하고, 소규모(출발 물질 중 0.5 g 미만의 rCSP)로 수행된 조기 단계 공정을 통해 CS533-129(pbp 리더에 융합된 서열 번호 3의 rCSP 발현)에 대해서는 3.2%의 전체 공정 수율, CS533-211에 대해서는 6.5%의 전체 공정 수율, 및 CS533-249에 대해서는 3.1%의 전체 공정 수율을 얻었다.

도 23에 제시되어 있는 바와 같이, 정제된 물질을 SDS-PAGE에 의해 분석하였고, 순도는 SDS-CGE에 의한 것과 일치하는 것으로 측정되었다(>95% 순도). 웨스턴 블롯 분석을 통해 아이덴티티를 확인하였고, 이는 낮은 단편화를 보였다(도 24). 두 이황화를 함유하는 C 말단 도메인에 감수성인 입체형태 특이 항체(4C2)는 강력한 신호(2)를 보였다. 환원 및 알킬화된 시료에서는 신호 상실이 나타났는데, 이는 정제된 rCSP가 정확한 이황화 구조를 가진다는 것을 제안하는 것이다(도 24). 내독소는 두 배치 모두 < 10 EU/mg이었다(하기 표 11). HCP-ELISA 측정 결과, 두 정제 모두에 대해 숙주 세포 단백질은 ~4,000 ppm이었고(표 11), 이는 SDS-CGE에 의해 측정된 96% 순도와 일치하는 것이었다. 숙주 DNA(게놈)는 Q-PCR에 의하면 78-98 pg/mg인 것으로 측정되었다. SE-HPLC에 의한 분석 결과, 두 조제물 모두 이량체는 <5%이고, HMW 응집체는 없는 것으로 나타났다(도 25 및 표 11). RP-HPLC 결과, 두 조제물 모두 이량체는 11%이고(표 11), 피크 프로파일은 533-191 참조와 일치하는 것으로 나타났다(도 26). 온전한 질량은 533-406 및 533-407, 둘 모두에 대한 분자량 이론치와 일치하였고, N 말단에서 검출가능한 클리핑은 없었다(도 27). 두 조제물 모두에 대해 Glu-C 단백질 분해를 사용하여 수행된 펩티드 지도화 분석을 533-191 참조와 비교하였다(도 28). N 말단에 인접한 시스테인은 유리 상태이고, 이황화 결합은 온전하다는 본 분석을 통해 입증되었다(제시되지 않음). 조제물에 대한 전하 이질성은 533-191 내부 참조 프로파일과 매칭되었다(도 29). 시료 농도차에 기인하여 pI 피크 강도에 있어 미세한 차이가 있는 것이 관찰되었다. 두 조제물 모두에 대한 원 UV-CD 분석은 참조 물질과 유사하였다(도 30A). K2D2 소프트웨어를 사용하여 분석 결과, 배치 533-406의 경우, α 나선은 10.45%, 및 베타 가닥은 29.09%인 것으로 계산되었고, 배치 533-407의 경우, α 나선은 10.45%, 및 베타 가닥은 29.09%인 것으로 계산되었고, 533-191 참조의 경우, α 나선은 10.04%, 및 베타 가닥은 29.65%인 것으로 계산되었다. 두 조제물 모두에 대한 고유 형광 스펙트럼은 참조 물질과 매칭되었다(도 30B).

요약하면, 통합된 정제 런으로부터의 배치 533-406 및 533-407은 고품질 및 고순도의 것이고, 프로젝트의 상기 단계에 대한 분석 명세들 모두를 충족시켰다. 비교 분석 결과, 조제물들 사이 뿐만 아니라, 533-191 참조 표준과 최소의 차이를 보였다.

실시예 4: 5 ℓ 발효로부터의 rCSP 정제

실시예 43에 기술된 바와 같이, 본 발명의 정제 방법을 사용하여 서열 번호 5를 포함하는 발현 벡터를 가지는 P. 플루오레센스 발현 균주의 5 ℓ 발효 배양물로부터 정제된 rCSP를 수득하였다. N 말단 분해는 5.1%인 것으로 측정되었다. 전체 공정 수율은 60%였다.

실시예 5: 서열 번호 6에 의해 코딩된 rCSP 정제

실시예 3에서 사용된 바와 같이, 본 발명의 정제 방법을 사용하여 서열 번호 6을 포함하는 발현 벡터를 가지는 P. 플루오레센스 발현 균주의 배양물로부터 정제된 rCSP를 수득하였다. 서열 번호 6은 서열 번호 3에 기재된 rCSP를 코딩하는 최적화된 CSP 뉴클레오티드 서열이다. CSP 유전자를 pbp 분비 리더 코딩 서열에 융합시켰다.

실시예 6: 우선적 환원 완충제 중에서 사용하기 위한 환원제 농도의 최적화

실시예 1에 기술된 일반 전략법에 따라, DTT에 대해 수행된 바와 같이 다른 환원제를 테스트하여, 단백질을 변성화시키지 않고, rCSP 이량체를 단량체로 우선적 환원시키는 데 최적인 농도를 확인하였다. 테스트된 다른 환원제로는 DTT, 시스테인, 글루타티온, 모노티오글리세롤, 티오글리콜레이트, 디티오트레이톨, 디티오에리트리톨, 아세틸시스테인, 2-머캅토에탄올(B-머캅토에탄올), TCEP-HCl(순수, 결정질 트리스(2-카복시에틸)포스핀 하이드로클로라이드), 또는 2-머캅토에틸아민-HCl(2-MEA)를 포함하였다.

실시예 7: 환원제로서의 모노티오글리세롤 평가

rCSP 단량체 제조를 최적화시키기 위해 다른 환원제/조건을 평가하였다. 이는 액체 형태의 rCSP의 안정성을 추가로 증진시키는 완충제 제제 및 방법에 대해 테스트하는 것을 포함하였다. 시약을 rCSP의 분해, 이량체화, 및 응집에 미치는 그의 효과에 기초하여 활성 단량체로서 rCSP를 보존시킬 수 있는 그의 능력에 대해 평가하였다. rCSP는 모노티오글리세롤 및 아르기닌을 함유하는 PBS 완충제 중에서 최대 23일째까지 4℃에서 > 85% 단량체 함량으로 유지될 수 있다는 것이 본 연구를 통해 입증되었다.

아르기닌 단독으로, 및 환원제 모노티오글리세롤과 함께 아르기닌을 rCSP 시료(PBS(pH 7.2))(PBS(pH 7.2))로 스파이킹시킨 실험에서 아르기닌의 안정화 효과가 입증되었다. 추가 연구에서는 모노티오글리세롤 및 아르기닌을 함유하는 PBS로 한외여과/정용여과함으로써 완충제 교환 수행 후, rCSP 단량체 함량이 80%인 것으로 측정되었다. 이러한 안정성 수준은 rCSP 농도가 1 mg/mL 내지 > 5 mg/mL인 경우에 입증되었다. 한편, 만닛톨, 모노티오글리세롤, 및 아르기닌을 함유하는 트리스 및 히스티딘 완충제는 전체 rCSP 중 대략 11%의 응집체 형성을 보였다.

역상 HPLC 용리 분획을 액체 크로마토그래피/질량 분광법(LC/MS:liquid chromatography/mass spectroscopy) 및 SDS-PAGE에 의해 분석하여 분자량 및 화학 구조상의 차이를 측정하였다. 본 연구에서는 RP-HPLC 용리액의 분획이 피로글루타메이트 모이어티를 가지는 rCSP를 함유한 것으로 나타났다. 3가지 수준의 pH에서 1 mM 모노티오글리세롤 및 10% w/v 아르기닌을 함유하는 PBS 중에서의 재조합 CSP 안정성을 비교하는 연구를 통해 피로글루타메이트를 함유하지 않는 천연 rCSP 분획이 감소됨에 따라, 시간 경과에 따른 피로글루타메이트 함유 분획은 증가하는 것으로 나타났다. 4℃ 및 pH 6.4에서 21일 및 23일 경과 후, 전체 rCSP에 대한 안정성 수준은 pH 7.0에서의 안정성에 필적하였고; 25℃에서 안정성은 같은 기간 동안에 걸쳐 유의적으로 감소되었다.

실시예 2에 기술된 내부 참조 표준 제조에 대하여 기술된 방법을 사용하여 균주 CS533-129로부터 제조된 rCSP를 사용하여 본 연구를 수행하였다. 달리 언급하지 않는 한, 모든 방법은 실시예 2에 기술되어 있는 바와 같았다.

스파이킹 연구

활성 단량체로서 rCSP를 안정화시키기 위하여, 다수의 제제 완충제 부형제를 rCSP의 이량체화, 응집, 및 전체 분해를 감소시키거나, 또는 그를 억제시킬 수 있는 능력에 대해 다수의 제제 완충제 부형제를 평가하였다.

스파이킹 실험 1: 환원제 및 아르기닌이 rCSP 안정성에 미치는 효과

rCSP 이량체 형성을 억제시키는 효과에 대해 환원제 패널을 테스트하였다. 테스트된 환원제는 모노티오글리세롤(MTG), L-시스테인, 아세틸시스테인, 글루타티온, 및 티오글리콜레이트였다. 아르기닌을, rCSP 응집률을 감소시키기 위한 수단으로서 각 환원제와 함께 테스트하였다. rCSP의 개별 시료(PBS(pH 7.2) 중 1 mg/mL)각각을 1% 아르기닌의 존재 및 부재하에서 6개의 환원제 중 하나로 스파이킹하는 소규모 안정성 실험에서 시약을 사용하였다.

시료를 실온(25℃)에서 3, 6, 또는 14일 동안 유지시킨 후, SE-HPLC에 의해 분석하였다. 실시예 2에 기술된 바와 같이 HPLC를 수행하였다. 뚜렷이 구별되는 4개의 피크 영역이 관찰되었다: 첫번째 영역은 고분자량(HMW) rCSP 응집체를 함유하였고; 두번째 피크 영역은 rCSP 이량체를 함유하였고; 세번째 피크 영역은 rCSP 단량체를 함유하였고; 마지막에 용리된 피크 영역은 저분자량 분해 생성물을 함유하였다.

모노티오글리세롤(MTG), 시스테인, 또는 아세틸시스테인으로 스파이킹된 PBS 중에 유지된 rCSP 시료는 다른 부형제에서 같은 기간 동안 저장된 시료와 비교하였을 때, 6 및 14일째 주요(단량체) 피크에서 단백질을 최고 비율(%)로 및 고분자량(응집체) 및 저분자량(분해 생성물) 피크에서 최저 비율(%)로 가졌다(하기 표 12A-C). "주요 피크" 칼럼은 rCSP 단량체의 비율(%)을 나타낸다.

오직 1% 아르기닌으로만 스파이킹된 시료는 3일에서 14일까지 단량체 피크 크기 감소와 함께, 이량체 피크 및 고분자량 응집체 피크 크기 증가를 보였다. 다른 부형제와의 아르기닌의 조합을 평가하였다.

아르기닌 첨가가 3 및 6일째에는 단량체 비율에 대하여 작은 영향을 미쳤지만, 14일째 환원제 + 아르기닌을 첨가하였을 때에는 환원제만을 단독으로 첨가한 경우보다 9% 내지 23%로 더 많은 양의 단량체를 얻을 수 있었다. 모노티오글리세롤 + 아르기닌은 시스테인 + 아르기닌보다 주요 피크 중 물질의 양을 2% 더 많은 양으로 유지시켰고, 아세틸시스테인 + 아르기닌보다는 5% 더 많은 양으로 유지시켰다.

스파이킹 실험 2: 모노티오글리세롤 및 아르기닌이 rCSP 안정성에 미치는 효과

MTG 및 더 광범위한 범위의 농도의 아르기닌으로 스파이킹된 PBS(pH 7.2) 중에서의 rCSP 안정성을 평가하기 위한 실험 세트를 수행하였다. 시료를 3 또는 12일 동안 PBS 단독, 1 mM MTG 단독, 또는 1 mM MTG + 1, 5, 10, 또는 20% 아르기닌 중에 유지시켰다. SE-HPLC에 의해 단백질 안정성을 분석하였다. MTG 단독일 때, 3일째부터 12일째까지 저분자량 피크의 상대적인 크기가 증가함에 따라, 주요 단량체 피크의 상대적인 크기는 감소하였다. 아르기닌의 농도를 증가시켰을 ?, 주요 (단량체) 피크의 전체 단백질의 비율(%)은 증가하였다. 아르기닌 농도 증가에 따라서 또한 저분자량(MW) 피크 중 각 시료의 비율(%)은 점진적으로 더 높아졌고, 고 MW 피크 중 비율(%)은 점진적으로 더 낮아졌으며, 이는 아르기닌의 응집체 형성에 대한 억제 효과를 나타내는 것이다. MTG 중의 모든 시료는 이량체 피크 중에는 어떤 물질도 보지이 낳았고, PBS 단독인 것에서 유지된 시료만 오직 이량체화를 나타내었다(표 13A 및 B).

후속 농도 및 pH 안정성 실험에서 사용하기 위한 것으로 10% 아르기닌과 함께 모노티오글리세롤을 선택하였다. 20% 아르기닌을 함유하는 제제가 약간 더 우수한 안정성 결과를 제공하였다. 테스트된 부형제 제제에 대한 SE-HPLC 데이터는 표 13에 요약되어 있다. 스파이킹 실험 1 및 2로부터의 시료 중 어느 것도 SDS-CGE에서 유의적인 단편화를 나타내지 않았고, 이들 모두 rCSP에 대한 예상 MW에서 주요 대역을 나타내었다.

농축 연구

1 mM MTG + 10% 아르기닌 중에서 5 mg/mL로 농축된 rCSP의 안정성을 평가하였다. 1 mM MTG 및 10% 아르기닌을 포함하는 PBS 중, 또는 PBS 단독인 것에서 rCSP 시료를 원심분리 농축기 상에서 8배로 농축시켰다. 4℃에서 16시간의 유지 단계를 수행하면서, 또는 수행하지 않으면서, 0.8 mg/mL의 출발 농도에서 및 6.4 mg/mL에서 시료에 대해 SE-HPLC를 수행하였다. PBS 단독인 것에서, 8배 농축 후, 단량체는 86%에서 50%로 감소하였고; 농축 후 16시간 동안의 홀드 부가시, 단량체 피크는 29%까지 감소하였다. 10% 아르기닌과 함께 1 mM MTG 중의 rCSP 시료는 훨씬 더 안정한 것으로 나타났다. 8배 농축시 주요 단량체 피크는 86%에서 80%로 감소하였고, 16시간 동안의 홀드시에는 전혀 감소되지 않았다. 상대적인 피크 크기 데이터는 하기 표 14에 요약되어 있다. 본 데이터를 통해 스파이킹 연구의 결과를 확인할 수 있었고, 5 mg/mL로 농축시키는 것이 rCSP 단량체를 현저하게 감소시키지 않으면서 달성될 수 있는 것으로 나타났다.

비PBS 완충제를 이용하여 완충제 교환

4.2% 만닛톨, 2% 아르기닌, 1 mM MTG, 및 10 μM 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)을 함유하는 제제를 트리스 및 히스티딘 완충제 중에서 테스트하였다(하기 표 15). 본 실험을 수행하여 완충제 시스템이 rCSP에 미치는 안정화 효과를 테스트하였다. 한외여과/정용여과(UF/DF)에 의한 완충제 교환 후에 안정성을 평가하였다.

실험 A 및 B, 두 실험 모두에서, 세라믹 하이드록시아파타이트(CHT) 칼럼으로부터의 용리액을 온화하게 환원시킨 후, UF/DF에 의해 테스트 부형제 완충제로 교환하였다. UF/DF 공정을 위해, 온화하게 환원된 CHT 용리액을 한외여과에 의해 1.0 mg/mL로 농축시키고, 6 디아볼륨의 언급된 제제에 대해 정용여과시켰다. 시스템으로부터 회수하기 전에 보유액을 ~5.0 mg/mL로 추가로 농축시키고, 0.22 ㎛ 여과시켰다. SE-HPLC에 의한 분석 결과, 두 부형제 제제 모두 2일 이상 동안 유지시킨 시료는 11%의 응집체 형성을 보인 것으로 나타났다. 10 mM 트리스 염기, 4.2% 만닛톨, 2% 아르기닌-HCl, 100 μM EDTA, 1 mM 모노티오글리세롤(pH 7.5)로 교환된, 온화하게 환원된 CHT 용리액 중에서 단백질에 대해 수행된 SE-HPLC 데이터는 하기 표 16에 요약되어 있다(UF 1 = 0.0시간부터 -1.0시간; DF = 1.0시간부터 4.5시간; UF 2 = 4.5시간부터 5.0시간).

10 mM 히스티딘, 4.2% 만닛톨, 2% 아르기닌-HCl, 100 μM EDTA, 1 mM 모노티오글리세롤(pH 7.0)로 교환된, 온화하게 환원된 CHT 용리액 중에서 단백질에 대해 수행된 SE-HPLC 데이터는 하기 표 17에 요약되어 있다(UF 1 = 0.0시간부터 -1.0시간; DF = 1.0시간부터 4.5시간; UF 2 = 4.5시간부터 5.0시간).

pH 안정성 연구

1X PBS, 0.5 M 아르기닌, 및 1 mM 모노티오글리세롤을 함유하는 제제 완충제를 2-8℃ 및 주변 온도에서 21일 동안 3가지 상이한 pH 수준에서 테스트하였다. -70℃에서 냉동된 대조군 또한 각 시점에서 분석하였다. 시료를 접선 유동 여과에 의해 완충제 교환하였다. 이어서, rCSP를 UF/DF에 의해 1 내지 5 mg/mL로 농축시키고, pH를 6 N HCl을 이용하여 pH 6.44로 조정하고, 1 ℓ로 충분히 조정하거나(배치 1, 533-551), 10 N NaOH를 이용하여 pH 7.0으로 조정하고, 1 ℓ로 충분히 조정하고(배치 2, 533-550), 또는 10 N NaOH를 이용하여 pH 7.5로 조정하고, 1 ℓ로 충분히 조정하였다(배치 3, 533-549). 214 nm에서 RP-HPLC에 의해, 및 280 nm에서 SE-HPLC에 의해 시점을 분석하였다. 종료 시점에 바로 SE-HPLC 시료를 분석하였다. RP-HPLC 시료를 그의 종료 시점에 -80℃에서 냉동시킨 후, 해동시키고 분석하였다. pH 7.0, 25℃, 21일에 대한 데이터는 이용불가능하였다.

3가지 pH 수준: 6.4, 7.0, 및 7.5에서 rCSP pH 안정성 연구 시료에 대한 RP-HPLC를 수행하였다. 본 실험에서 분석된 시료는 천연 rCSP를 함유하는 주요 피크를 나타내었고, 상기 논의된 바와 같이, 피로글루타메이트 모이어티를 포함하는 rCSP로 구성된 것인 숄더는 약간 늦게 용리된 것으로 나타났다. 종합해 보면, 천연 CSP 피크 및 피로글루타메이트 함유 숄더 면적이 전체 rCSP를 나타내는 크로마토그램 면적을 구성하였다. 3가지 다른 피크 군이 관찰되었다: 대략 10분째에 1군, 주요 피크 바로 앞에서 2군, 및 피로글루타메이트 함유 숄더 바로 뒤에서 3군. 도 31에는 4℃, pH 7.5에서 보관된 1 mg/ml rCSP의 T0 대조군 안정성 시료에서 관찰된 1-3군 피크의 상대적인 위치가 제시되어 있다.

pH 7.5에서, 1 mg/mL 또는 5 mg/mL로 rCSP를 함유하는 시료(배치 3)을 T=0에서 RP-HPLC에 의해 분석하거나, 4℃ 또는 25℃에서 보관하고, 5일, 14일, 또는 21일째에 분석하였다. pH 7.0(배치 2) 및 pH 6.4(배치 1)에서 시료에 대하여 같은 방식으로 시간 경과에 따른 분석을 수행하였다. 3가지 pH 수준 모두에서, 천연 CSP 분획 중의 물질은 시간 경과에 따라 감소한 반면, 피로글루타메이트 함유 분획 중의 물질은 시간 경과에 따라 증가하였고; 이는 4℃에서 유지시킨 것보다 25℃에서 유지시킨 시료 중에서 현저하게 더 큰 정도로 관찰되었다.

전체 CSP 분획, 또는 피로글루타메이트 함유 숄더를 제외한, 천연(주요) RP-HPLC 피크에서만 오직 용리되는 물질을 사용하여 4℃ 및 25℃에서 1 및 5 mg/mL로 시간 경과에 따른 3가지 pH 수준에 대해 안정성 데이터 맞(side-by-side) 비교를 수행하였다(표 18-20). 4℃에서의 1 mg/mL 및 5 mg/mL 시료의 경우, pH 6.4 및 pH 7.0의 완충제는 pH 7.5의 완충제보다 14/15일 및 21/23일째에 더 높은 수준의 안정성을 제공하였다. RP-HPLC 분석 결과, 1 mg/mL의 천연 rCSP의 경우, 21/23일째에 pH 6.4와 pH 7.0 사이에는 대략 2% 정도의 안정성 차이가 나타났고, 5 mg/mL의 경우에는 1.6%인 것으로 나타났다. 25℃에서 두 농도 모두의 천연 및 전체 CSP 시료의 경우, pH 6.4 및 7.0은 5/6일째에 pH 7.5보다 더 높은 수준의 안정성을 제공하였고, 14/15일 및 21/23일째에는 필적하는 수준의 안정성을 제공하였다. pH 7.5에서 유지된 5 mg/mL의 시료는 pH 6.4 및 pH 7.0 완충제 중에서 유지된 시료보다 21일째에 1군 피크 중 더욱 큰 물질 증가를 보였다.

5 mg/mL 또는 1 mg/mL rCSP를 함유하는 시료를 4℃ 또는 25℃에서 pH 6.4, 7.0, 또는 7.5의 완충제 중에서 유지시키고, 1/3일, 5/6일, 14/15일 및 21/23일?에 SE-HPLC에 의해 분석하였다(하기 표 21 및 22). 피크 테일링 증가가 관찰되었는데, 이는 25℃에서 같은 시간 동안 유지시킨 시료에서 더욱 현저하였다. 4℃ 및 25℃에서 유지시킨 1 mg/mL 시료에 대한 경향도 유사하였다.

1/3일, 5/6일, 14/15일 및 21/23일째에 1 mg/mL 및 5 mg/mL의 시료를 사용하여 4℃ 및 25℃에서의 3가지 pH 수준에 대한 데이터 맞비교를 수행하였다. 가장 안정한 시료는 4℃ 및 25℃, 둘 모두에서 및 1 mg/mL 및 5 mg/mL, 둘 모두에서 pH 7.0의 완충제 중의 것이었다. RP-HPLC와 유사하게, SE-HPLC는 1, 5, 및 14일째에 pH 7.0의 것보다 pH 6.4의 완충제의 경우에 25℃에서 5 mg/mL 시료의 안정성은 약간 더 높은 것으로 나타났다. 21일 종점에서는 pH 6.4에서보다는 pH 7.0에서 안정성이 다소 더 높은 것으로 측정되었다.

표 18에 열거된 RP-HPLC 시료를 모두 분석할 때까지 -80℃에서 냉동시켰다. 천연 rCSP는 피로글루타메이트를 함유하지 않았다. pE-CSP는 피로글루타메이트 종이었다.

표 19에 열거된 RP-HPLC 시료를 모두 분석할 때까지 -80℃에서 냉동시켰다.

표 20에 열거된 RP-HPLC 시료를 모두 분석할 때까지 -80℃에서 냉동시켰다.

표 21에서 이탤릭체로 표시 열거된 시료를 0일째 -80℃에서 냉동시켰다. 다른 시료들은 모두 분석할 때까지 액체 상태로(냉동시키지 않고) 유지시켰다.

표 22에서 이탤릭체로 표시 열거된 시료를 0일째 -80℃에서 냉동시켰다. 다른 시료들은 모두 분석할 때까지 액체 상태로(냉동시키지 않고) 유지시켰다.

(예컨대, 본원 실시예 9에 기술된 바와 같이) 추가의 소수성 상호작용 크로마토그래피 단계를 사용함으로써 rCSP 조제물 중 숙주 세포 단백질의 수준을 감소시킨 안정성 연구를 수행하였다. 안정화 제제 완충제 중 2-8℃에서 120시간 경과 후 RP-HPLC에 의해 검출된 전체 rCSP는 91.4% 정도로 높게 관찰되었고(표 23 및 24 참조), 이는 0.2% RDP를 나타내었다. 본 연구에서는, PBS(pH 6.7) 중 1 mM MTG 및 0.5 M 아르기닌에서 2개의 rCSP 배치(배치 533-616 및 533-618)를 -80, 2-8, 25, 및 40℃에서 3, 6, 16, 24, 48, 72, 96, 및 120시간째에 평가하였다.

본원에 기술된 바와 같이 역상 HPLC를 수행하였다. 시료를 분석하기 전에, 1 mL/분의 속도로 30 mL 이동상 A를 유동시킴으로써 칼럼을 조절하였다. 반복가능성 및 체료 시간을 평가하기 위해 시료와 동일한 농도 및 주입 부피로 (PBS, 0.5 M 아르기닌-HCL, 1 mM 모노티오글리세롤(pH 7.0) 중) 30 ㎍ rCSP 참조 표준 주입을 분석하였다. 시스템 적합성 평가를 위해 오직 희석제 완충제(PBS, 0.5 M 아르기닌-HCL, 1 mM 모노티오글리세롤(pH 7.0))만을 함유하는 블랭크 주입을 수행하였다. 벌크 약물 물질 시료를 3중을 주입하였다. 이동상 B에 대한 구배는 20분 동안 22% 내지 32%였다. 시료 표준, 및 블랭크를 214 nm 및 280 nm에서 모니터링하고, 면적 보고서를 작성하였다. 피크 면적을 사용하여 rCSP의 품질 및 순도를 측정하였다. RP 분석을 통해 CSP(천연-CSP & 피로글루타메이트-CSP) 및 3개의 피크 군인 1-3군의 함량을 추적하였다. 각 데이터 점(시간/보관 조건)에 대한 반복 실험의 평균값은 하기 표 23 및 24에 제시되어 있다. 시료 배치를 대조군 및 그의 상응하는 강조된 시료의 개별, 시점 특이 런으로 분석하였다. 크로마토그래피 면적 및 순도(면적-%)에 의해 대조군과 시료 사이의 RPD(상대적인 차이(%))에 의해 생성물 변화/분해를 추적하였다.

크로마토그래피 순도(대 시간/보관 조건) 및 분해율 선형성(아레니우스(Arrhenius) 플롯)을 기술하는 배치 특이 차트를 작성하였다. 두 배치에서의 상대적인 변화(순도의 상대적인 차이(%) 또는 rCSP의 전체 비율(%))에 준하여, 생성물은 4℃에서 5일 동안 안정한 것으로 관찰되었다(순도 손실 <2%). 순도 손실은 25℃에서 같은 기간 동안 최대 6%까지 발생하였다. 24시간까지의 분해 곡선 내삽에 의하면, 40℃에서 생성물의 상당한 분해(5%)이 발생한 것으로 예측되었다. 3개의 처리 조건(온도) 사이의 분해 동역학적 속도에 대한 아레니우스 플롯(r = -0.996)은 단일의 속도 제한 공정을 제안한다. 각 배치에 대한 플롯은 일치하였고, 이를 통해 배치들 사이의 분해는 유사하다는 것이 입증되었다.

결론

안정성 연구 결과, 본원에 기술된 바와 같이 제조된 재조합 CSP 조제물은 1 mM 모노티오글리세롤 및 0.5 M 아르기닌을 함유하는 PBS 부형제 완충제 중 pH 6.4 내지 7.0 에서 보관되었을 때, 4℃에서 최대 23일까지 단량체 함량을 >85% 유지시키는 것으로 나타났다. PBS, 1 mM MTG, 10% 아르기닌 완충제에서, 80% 단량체로 구성된 rCSP는 5 mg/mL로의 농축 후 4℃에서 16시간 동안 유지된 반면, 농축된 시료는 PBS 단독의 것 중에서는 4℃에서 16시간 경과 후 29% 단량체를 함유하였다. RP-HPLC 및 SE-HPLC 분석에 의하면, pH 7.5의 완충제 중의 rCSP가 거의 모든 시점에서 pH 6.4 또는 7.0의 완충제 중의 rCSP보다 덜 안정한 것으로 입증되었다.

상기 결과를 확인하고, 그보다 개선된 결과를 이끈 추가의 안정성 연구는 전체 rCSP 약 10%의 증가를 보였다. 본 연구에서 사용된 rCSP 조제물 중 숙주 세포 단백질은 소수성 상호작용 크로마토그래피 사용으로 감소되었다.

실시예 8: 조작 런

실시예 3에 기술된 공정을 보다 큰 용량으로 규모를 확장하는 것에 대해 테스트하기 위해 4개의 조작 런을 수행하였다.

효모 추출물 및 글리세롤로 보충된 화학적으로 정의된 배지 600 mL를 함유하는 진탕 플라스크에 선택된 균주의 냉동 배양 스톡을 접종함으로써 발효기 배양을 위한 접종물을 생성하였다. 32℃에서 진탕시키면서 대략 21시간 동안 인큐베이션시킨 후, 진탕 플라스크 배양물을, 다량의 바이오매스를 지원하도록 디자인된 화학적으로 정의된 배지를 함유하는 20 ℓ 생물반응기(뉴 브룬스위크 사이언티픽(New Brunswick Scientific, IF-20L)으로 살균 처리 방식으로 옮겨 놓았다. 압축 대기 공기의 분사식 흐름(sparged flow) 뿐만 아니라, 교반 속도를 조절함으로써 액체 배양물 중 용존 산소량을 양의 수준으로 유지시켰다. 수성 암모니아를 첨가함으로써 원하는 설정 지점으로 pH를 조절하였다. 유가식 고밀도 세포 발효 공정은 초기 성장 단계에 이어서, (유도시 부피가 8 ℓ인 것으로 추정되는 것에 기초하여 브로쓰 중 농도가 0.2 mM인 경우) 0.38 g의 IPTG를 첨가하여 재조합 유전자 발현을 개시하는 유전자 발현(유도) 단계로 나뉘어졌다. pH 6.85 내지 7.2, 27-32℃에서 세포를 성장시켰다. 이어서, 발효 유도 단계를 24시간 동안 진행시켰다. 상기 단계 동안 각 시점에서 발효기에서 시료를 채취하여 세포 밀도를 측정한 후, 추후 표적 유전자 발현을 측정하기 위해 100 ㎕의 분취물을 -20℃에서 냉동시켰다. 24시간째인 최종 시점에 각 20 ℓ 생물반응기에 대해 대략 10 ℓ의 전체 발효 브로쓰를 90 min 동안 15,900 x g으로 원심분리(베크만 쿨터(Beckman Coulter), 아반티(Avanti) J-20))하여 1 ℓ의 분취량으로 수거하였다. 세포 페이스트를 -80℃에서 냉동시켰다. 4개의 런 모두, 사전에 냉동시킨 세포 페이스트를 2 M 우레아, 20 mM 트리스(pH 8.0) 중에 20% 농도로 해동시키고(세포 페이스트/용액 1 ℓ), 균질액으로 재현탁시키고, 미세유동화시켰다.

조작 런 1: 본 런에서는 신선한(사전에 냉동시킨 것인 아닌) 용해물에 대해 TMAE를 수행하였다. 수거, 미세유동화, 디스크 적층 원심분리, 및 0.2 ㎛ 여과를 수행한 후, 9.9 g의 조 rCSP를 회수하고, 20% 세포 용해물로부터의 전체 수율은 81%였다. 10 g의 CSP를 0.31 mg/mL의 농도로 TMAE 칼럼 상에 로딩하였고, SDS-CGE에 측정한 바, 순도는 7%였다. 3 g의 CSP 단백질을 0.05 mg/mL의 농도로 용리시켰고, 순도는 40%였다.

TMAE 용리액에 대하여 세라믹 하이드록시아파타이트(CHT) 상에서 연마 크로마토그래피를 수행하였다. CHT 칼럼 상에 로딩된 TMAE 용리액의 순도는 45%였고, CHT 용리액의 순도는 SDS-CGE에 의하면 75%였다. CHT 용리액의 농도는 0.04 mg/ml였다(0.05 ng/ml TMAE 용리액으로부터의 것). 모든 용리에서 수율은 81%였다. 계산된 CSP 잔여분은 96%였다(용리에서 수집되지 않은 CSP 나머지는 용리액 이외의 다른 분획 중에서 설명될 수 있다).

조작 런 1 TMAE 칼럼으로부터의 회수율은 SDS-PAGE에 의하면 27%였다. 상기 실시예 3에 기술된 (10 ℓ) 런과 비교하여 상기 런에서 수득된 물질의 수율 및 순도가 낮은 것에 대한 이유를 확인하기 위한 연구에 착수하였다.

수지(조절된 것 대 새 수지), 수지 로딩, 용해물 페이스트(성공적인 유통으로부터의 입증된 페이스트 대 조작 런 1 페이스트), 전도성, 수지 로딩, 및 조합된 선형 유속(체류 시간), 및 성공적인 런으로부터의 모든 조건의 반복(냉동된 용해물 사용 포함).

신선한 용해물 및 냉동/해동된 용해물 시료의 SDS-CGE를 통해 모든 신선한 용해물 시료에서의 주요 rCSP 대역 위의 고분자량 대역의 "래더링"이 나타났다. 래더링을 보인 모든 용해물 시료는 TMAE 상에서 허용되지 않는 수율 및 순도를 제공하였다. 해동되고, 즉시 전기영동에 의해 분석된 냉동된 시료 또한 래더링을 보였지만, 해동되고, 분석하기 전 6시간 동안 RT에서 유지된 냉동된 시료는 래더링을 보이지 않았다. 래더링에 미치는 효과에 데해 냉동 후 여과 및 홀드 시간을 평가하였다. 여과는 래더링에 대해 유의적인 영향을 미치지 않는 것으로 나타난 반면, 냉동 후 6시간의 홀드 시간은 래더링을 유의적으로 감소시켰다(도 32). 냉동/해동 후 1 h, 3h, 6 h, 7.5 h, 및 14 h의 홀드 시간을 평가하였다. 4 M 우레아 중에 용해된 시료는 동일한 홀드 시간에 2 M 우레아 중의 시료보다 유의적으로 더 적은 래더링을 보이는 것으로 나타났다. 추가로, 홀드 시간을 최대 6시간까지 연장시켰을 때, 2 M 및 4 M 우레아 시료, 둘 모두에서 래더링은 직접적으로 감소된 것으로 나타났다; 홀드 시간이 6시간을 초과하였을 때, 4 M 우레아 시료에서는 래더링에 대하 어떤 식별가능한 효과도 나타나지 않은 반면, 2 M 우레아 시료에서는 래더링이 감소되었다.

요약하면, SDS-CGE에 의한 높은 MW 대역의 "래더링"에 의해 입증되는 TMAE 칼럼 상에 로딩된 시료 중 응집체의 존재와, 부진한 음이온 교환 크로마토그래피 결과 사이에는 강력한 연관성이 존재하는 것으로 확인되었다. 다수의 가능한 공정 변수를 제거하였을 때, 냉동 및 해동 후 홀드 시간이 용해물 시료 중 응집체의 검출에 영향을 미치는 1차 파라미터인 것으로 확인되었다. 본 결과를 통해 냉동 및 해동 후 6시간의 홀드 시간이 응집체 형성을 현저하게 감소시킬 것이라고 제안되었다. 평가된 다른 인자인 전도성, 수지 로딩, 선형 유속, 조작 런과 공정 유통로부터의 것 사이의 세포 페이스트의 차이, 및 수지가 새것인지 또는 조절된 것인지 여부는 부진한 음이온 교환 크로마토그래피 결과의 원인으로서는 배제되었다.

조작 런 2: 본 런에서는 심층 여과와 TMAE 크로마토그래피 사이에 6시간의 용해물 홀드 시간을 가지는 냉동/해동 사이클을 수행하고, 우수한 결과를 얻었다. 심층 여과 후, Q-PAGE에 의해 측정된 1차 회수는 12.8 g rCSP이고; 20% 세포 용해물로부터의 전체 수율 91%였다. 음이온 교환 포획 칼럼에 용해물을 0.30 mg/mL 농도로 로딩하고, SDS-CGE에 의해 측정된 바, 순도는 5%였다. rCSP를 0.58 mg/mL 농도로 용리시키고, 순도는 78%였다. TMAE 칼럼에서는 일부 오염 흔적이 있었지만, 성능에는 어떤 영향도 미치지 않았다. 로딩된 용해물 중 여과되지 않은 침전이 검출되었다. TMAE 용리액을 0.2 ㎛에 여과시키고, 여액을 CHT에 의해 연마 크로마토그래피시켰다. TMAE 용리액의 0.2 ㎛ 여과 후 HA (CHT) 로드의 순도는 82%였다. SDS-CGE에 의해 측정된 바, CHT 용리액 순도는 97%이고, 농도는 0.75 mg/ml이고, 수율은 113%였다.

CHT 용리액(533-511)의 0.2 ㎛ 여과 및 12 hr의 RT 홀드 후, DTT에 의한 온화한 환원을 수행하였다(533-512). 최종 농도 20 μM이 되도록 10 mM DTT를 여과된 용리액에 스파이킹시켰다. 이어서, 용리액을 19시간 동안 1.5-2.5 L/min으로 연동식 펌프를 이용하여 20 ℓ 백에서 재순환시켰다(백 중 16.6 ℓ CHT 용리액 @ 0.72 g/CSP ℓ). 본 단계로부터의 회수율은 102%였다. CHT 용리액 환원 전후의 크기 배제-HPLC 크로마토그래피 분석 결과, 단량체 함량이 85%에서 100%로 명확하게 증가한 것으로 나타났다.

온화하게 환원된 물질에 대하여 접선 유동 여과(TFF)에 의한 완충제 교환을 수행함으로써 염, 우레아, 및 DTT를 제거하였다. CSP 단량체를 1x PBS로 정용여과시켰다. 5 kDa 분자량 컷오프, 0.1 ㎡의 재생 셀룰로스 막을 사용하여 CSP를 유지시켰다. 완충제 교환 단계로부터의 회수율은 86.2%이고, 투과액 중 CSP는 7.3%이고, 본 시스템 내 홀드 업(hold-up) 부피는 0.4%였다. 분석 최종 생성물은 A₂₈₀에서 0.66 g/L이고, 내독소 수준은 10.3 EU/mL이고, HCP-ELISA에 의하면 숙주 세포 단백질은 4,700 ppm이고, SDS-CGE에 의하면 순도는 97%였다. LC/MS 결과, rCSP 중 5.1%가 N 말단 클리핑된 것으로 나타났다. RP-HPLC 체류 시간은 CSP 표준과 일치하였다. UF/DF 후 10.6 g의 CSP가 회수되었고, 이를 -80℃에서 냉동시켰다. UF/DF 후의 벌크 약물 물질(533-513)을 크기 배제 크로마토그래피한 결과, 대조군(533-407)과 비교하였을 때, 상기 단계 동안 이량체화 수준은 낮고, rCSP 응집도 낮았으며, 이로써 90% 단량체, 7% 이량체, 및 3% 응집체인 함량을 얻게 되었다.

상기 런을 통해 표적화된 수준의 순도, 수율, 농도, 단량체 함량, 클리핑, 및 내독소에 따른 정제된 rCSP를 기술된 발효 및 통합된 정제 공정을 사용하여 일정 규모로 제조할 수 있다는 것을 확인할 수 있었다.

조작 런 3: 본 런에서는 조작 런 2와 동일한 프로토콜에 따라 용해물의 수거, 세포 파괴 및 정화를 수행하였다. 용해물을 6시간 동안 -80℃에서 유지시키고, TMAE 칼럼 상에 로딩시키기 전에 6시간 동안 실온에서 유지시켰지만, 용해물이 완전하게 해동된 것으로 관찰되지는 않았다. 심층 여과 후, Q-PAGE에 의해 측정된 바, 1차 회수는 14.8g CSP였고, 및 전체 수율은 20% 세포 용해물로부터 98%였다. 해동된 용해물 중에서 많은 침전이 관찰되었고, 로딩 과정에서 조기에 많은 칼럼 오염이 관찰되었으며, 런이 진행됨에 따라 오염은 점점 더 악화되는 것으로 나타났다. 조작 런 3에 대한 순도 및 수율은 조작 런 2와 비교하였을 때 현저히 감소되었다. SDS-CGE에 의하면, ER3에 대한 rCSP 잔여분은 41%이고, 용리액에서는 23%, 세액 중에서는 4%이고, 통과액 중에서는 13%였다. 연마 크로마토그래피 및 완충제 교환을 수행하지 않았다.

조작 런 4: 본 런에서는 조작 런 2와 동일한 프로토콜에 따라 용해물의 수거, 세포 파괴 및 정화를 수행하되, 단, TMAE 크로마토그래피를 위해 저온 완충제를 사용하였다.

심층 여과 후, 정량적 SDS-PAGE(Q-PAGE)에 의해 측정된 바, 1차 회수는 13.7g CSP였고, 및 전체 수율은 20% 세포 용해물로부터 81%였다. 해동 후, 침전이 관찰되었고, TMAE 칼럼 상에 로딩하기 전에 0.45 ㎛ 여과에 의해 용해물을 여과하였다. 칼럼 오염은 관찰되지 않았다. 본 칼럼 런에서 사용된 완충제는 사용시 6-12℃였다. SDS-CGE에 의하면 순도는 65%였고, 로딩된 용해물의 농도는 용리액의 경우, 0.34 ng/mL 및 0.24 ng/mL였다. 수율은 용리액에서는 54%, 세액 중에서는 4%이고, 통과액 중에서는 1%, 및 스트립 중에서는 3%였다. CSP 질량 잔여부는 62%였다. 본 결과는 조작 런 2에 대한 것보다 유의적으로 더 낮았고, 이는 저온 완충제 사용에 따른 결과인 것으로 여겨졌다.

CHT 상에서의 연마 크로마토그래피를 수행하였다. 로딩된 TMAE 용리액은 SDS-CGE에 따르면 65%로 순수하였고, CHT 용리 순도는 94%였다. 로딩된 물질의 농도는 0.25 mg/mL였고; 용리액은 0.27 mg/mL였다. SDS-CGE에 의하면 수율은 112%였고, 용리액에서 모든 단백질이 분리되었다. 7.2 g의 CHT 용리액이 회수되었고, 이를 -80℃에서 보관하였다. ER2보다 순도가 약간 더 낮은 이유는 잠재적으로는 TMAE 용리액 농도 및 순도가 더 낮은 것이 될 가능성이 가장 컸다.

결론

발효 및 정제 공정을 통해 순도, 수율, 단량체 함량, N 말단 클리핑, 및 내독소에 대한 표적 값을 충족시키거나, 그를 초과하는 mg 양으로 rCSP를 성공적으로 제조할 수 있었다. 조작 런 2를 통해 10.6 g의 정제된 CSP 벌크 약물 물질이 제조되었다. 조작 런 4를 통해 7.2 g의 CHT 용리액이 제조되었다. 상기 두 조작 런 모두, 그에 의해 제조된 물질의 순도는 HPLC-SEC 및 RP-HPLC에 의하면, 표적화된 값을 충족시켰다. 더 큰 런에서 관찰된 침전은 잠재적으로는 보다 큰 용량의 용해물을 냉동시키는 데 소요되는 추가 시간 때문일 수 있었고, 이로 인해 용해물 중 일부 소량은 냉동되지 않거나, 탈응집화에 소요되는 냉동 시간이 단축되었다.

실시예 9: 숙주 세포 단백질 제거 방법

숙주 세포 단백질을 추가로 제거하는 방법이 개발되었다. 벌크 약물 물질 중 숙주 세포 단백질의 양을 감소시키기 위해 제3 크로마토그래피 단계에서 사용하기 위한 것으로 2개의 크기 배제 및 5개의 소수성 상호작용 수지를 평가하였다. 토요 헥실 650C를 사용하는 소수성 상호작용 크로마토그래피는 탁월한 rCSP 순도, 농도, 수율 및 온전한 질량과 함께, 숙주 세포 단백질을 100 ppm 미만으로 감소시키는 것으로 나타났다. 온화한 환원 조건하에서 MTG를 사용함에 따라 결과는 추가로 개선되었다.

4.56 ℓ 헥실 650C 제3 크로마토그래피 단계를 비롯한, 개선된 공정 방법을 사용하는 실규모 조작 런을 수행하였다. 상기 런을 통해 단량체 함량이 96.3%이고, 숙주 세포 단백질이 152 ppm인, 실시예 7에 기술된 최종 부형제 완충제 제제 중 7.6 g의 벌크 약물 물질이 제조되었다.

숙주 세포 단백질을 제거하는 방법 평가

HCP를 감소시키는 분석적 분리 방법을 평가하였다. SE-HPLC를 사용하여 HCP로부터 rCSP를 분리 제거하고, SDS-PAGE 및 HCP-ELISA에 의한 분석을 위해 수집하였다(미세분획화하였다). 533-407(실시예 2에 기술된 방법을 사용하여 균주 533-129로부터 제조된 내부 rCSP 참조 표준)의 SE-HPLC 분석 결과, ELISA에 의해 주요 SE-HPLC 분획 중 HCP의 수준은 현저히 감소된 것으로 나타났다: SE-HPLC 피크의 경우, 350 ppm 대 SE-HPLC 이전, 4,100 ppm. SDS-PAGE에 의해 분석하였을 때, SE-HPLC 이후 533-407로부터의 주요 rCSP 피크 시료 중에서는 어떤 HCP 밴드도 외관으로 나타나지 않았다.

HCP 감소를 위한 분취용 소수성 상호작용 크로마토그래피 평가

소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC)에 의한 제3 칼럼 정제를 위한 것으로 헥실 650C, 페닐 HP, 부틸 HP, 및 PPG 600M을 평가하였다. 테스트되는 소수성 상호작용 수지의 상대적인 결합 강도 및 체류 시간은 가장 강한 것(체류 시간이 가장 긴 것)에서부터 가장 약한 것(체류 시간이 가장 짧은 것)으로의 순서는 헥실 650 C > 부틸 HP > 페닐 HP > PPG 600M이다. 테스트되는 모든 수지에 대하여 5.13 mL 칼럼을 사용하여 벤치 규모 런을 수행하였다. 1.0 M 내지 0 M 황산암모늄으로 20 CV 용리 구배를 사용하여 MTG(533-565 및 533-563) 및 DTT(533-523)로 환원된 CHT 용리액 시료를 비교하였다. 프랙-950 분획 수집기가 장착된 AEKTA익스플로러 100 크로마토그래피 시스템(GE 헬쓰케어)을 사용하여 고속 단백질 액체 크로마토그래피(FPLC) 작동을 수행하였다. 사용된 물질: 토소 수지 헥실 650C(로트 번호 65HECB501N0); HEPES 산(카탈로그 번호 4018-06, JT 베이커: 미국 뉴저지주 필립스버그); Hepes Na 염(카탈로그 번호 4153-05, JT 베이커: 미국 뉴저지주 필립스버그); NaCl(카탈로그 번호 13423, 시그마/리에델 데 하엔: 미국 미주리주 세인트루이스); 황산암모늄(카탈로그 번호 BDH8001-12Kg, BDH); 우레아(카탈로그 번호 4203-60, JT 베이커: 미국 뉴저지주 필립스버그); 모노티오글리세롤(MP 바이오메디칼즈, 카탈로그 번호 155727); 헥실 650C 및 PPG 600M(카탈로그 번호 21399, 토소 USA: 미국 뉴저지주 플레밍턴, GE 헬쓰케어: 미국 뉴저지주 피츠카타웨이); 페닐 HP(GE, 17-5195-01); 부틸 HP(GE, 28-4110-01).

제3 칼럼을 위해 테스트된 칼럼 수지 중 헥실 650C에 의해 낮은 N 말단 클리핑, 및 높은 수준의 순도, 수율, 및 이량체로부터의 단량체의 분리와 함께 최저 수준의 HCP(< 100 ppm)가 제조되었다. 훨씬 더 큰 제조 규모에서의 성능에 관한 충분한 예측 가능성을 제공하기 위해 헥실 650C를 112.5 mL 칼럼을 사용하여 중간 규모로 최적화시켰다. 크로마토그래피 파라미터는 하기 표 25에 제시되어 있다.

벤치 규모 헥실 650C 런

1. 벤치 규모 헥실 650C 런: MTG와 함께 1.0 M 내지 0 M 황산암모늄 구배(533-597 & 533-594)

토요-헥실 650C 칼럼(0.66 cm 직경 x 15 cm 높이)을 1 mM MTG로 환원된 CHT 용리액(533-565)으로 전개시키고, 1 mM MTG와 함께 1 M 내지 0 M 황산암모늄의 15 칼럼 부피(CV:column volume) 구배로, 이어서, 1 mM MTG와 함께 0 M 황산암모늄의 3 CV로 용리시켰다. 칼럼 용리액을 533-597로 지정하였다. 용리된 분획에 대해 SDS-CGE를 수행하고, HCP-ELISA에 의해 HCP 수준을 측정하였다. 용리 피크의 조기 분획이 후속 분획보다 더 높은 수준의 HCP를 보였고, 모든 분획은 100 ppm보다 훨씬 아래였다. 일부 rCSP 단량체 및 거의 모든 이량체가 칼럼 수 스트립에서 용리되었다. 533-597에 대해 사용된 동일 시료 물질(CHT 용리액 533-565)을 로딩하여 용리액 533-594를 수득하고, 동일 조건하에서 용리시켰다. 533-594에 대한 SDS-CGE 분석 결과, 피크 rCSP 분획 바로 앞에서 용리된 분획은 이중 대역을 나타내었는데, 이는 HCP가 존재하는 것을 나타내는 것이며, 이에 반해 피크 rCSP 용리 분획은 SDS-CGE 상에서 이중 대역을 나타내지 않는 것으로 밝혀졌다. ELISA에 의해 측정된 바, 피크 분획 중 HCP의 양이 50 ppm이라는 것이 가장 유의적이었다. 선택된 분획의 전기영동도는 용리 범위의 중앙부 가까이에서 상기 분획 중 단일 피크를 나타내었다. RP-HPLC에 의해 533-594를 분석한 결과, SDS-CGE에서 2개의 대역을 보인 F2 분획에는 주요 CSP 피크 앞에서 용리된 2군 불순물이 풍부하게 존재하였다. "분획 #2"로 지정된(실시예 7 참조), 주요 CSP 피크의 테일링 숄더는 N 말단 피로글루타메이트와 일치하는 온전한 측정치를 가지는 rCSP 종을 함유하였다. 용리 피크의 중앙부에 가깝게 위치하는 용리 분획 7은 피로글루타메이트-CSP를 거의 보이지 않은 반면; 이 또한 피크의 중앙부에 가깝게 위치하는 분획 F12는 F7보다 더 많은 피로글루타메이트-CSP를 보이고, 2군 불순물을 더 적게 나타내었다. 칼럼 스트립은 용리 구배의 다른 부분보다 더 많은 양의 pE-CSP 및 3군 이량체를 함유하였다. 하기 26에서는 헥실 650C 용리 피크 533-594 분획의 RP-HPLC 런을 비교함으로써 분획들 중 3개의 RP 피크 군의 상대적인 풍부화도를 나타내었다. 분석된 분획은 시료 열에 제시되어 있다. 1, 2, 및 3군 피크는 실시예 7에 기술되어 있는 바와 같다. LC/MS에 의한 온전한 질량 분석 결과, 환원된 헥실 G2 분획 중 2%가 클리핑된 것으로 측정되었다.

2. 벤치 규모 헥실 650C 런: MTG 및 단계식 용리와 함께 0.5 M 내지 0 M 황산암모늄 구배

추가의 구배 용리된 헥실 650C 칼럼 런 3-6은 0.5 M 내지 0 M 황산암모늄 용리 구배를 사용하였다. 구배 범위가 더 좁을수록 rCSP 용리 범위 내에서 더욱 잘 분리될 수 있었다. 런 3 & 4는 0.5 M 내지 0 M 황산암모늄의 구배로 용리되는 칼럼 상에서 1 mM MTG(533-606)로 환원된 CHT 용리액을 100 mM DTT(533-610)로 환원된 것과 비교하였다. 533-610으로부터의 분획 풀 및 개별 용리액 분획의 HCP 수준 비교 결과, 용리 피크 부근에서 HCP 농도는 더 높게 나타났지만, 로딩된 물질(533-523)의 7,000 ppm과 비교하였을 때, 대략 900 ppm으로 훨씬 더 낮은 HCP 수준을 나타내었다. 로딩된 물질 중의 클리핑은 15%인 반면, 헥실 용리액(분획 E2-F2)의 주요 피크 분획에 대한 클리핑은 6.2%였다. 런 5 & 6은 각각 MTG로 환원된 CHT 용리액(533-607 및 533-611)과 함께 0.1 M 황산암모늄의 3 CV 단계식 용리를 사용하였다. SDS-CGE 분석 결과, 구배 용리가 단계식 용리보다는 유의적으로 더욱 잘 이량체 및 HCP로부터 단량체를 분리시키는 것으로 나타났다. 하기 표 27에는 상기 칼럼 런으로부터의 분석 데이터가 제시되어 있다. 533-606에서 낮은 클리핑 및 고순도와 함께 HCP 최저 수준이 달성되었고; 따라서, 후속되는 중간 내지 실규모 런에 대해 1 mM MTG 환원에 이어서, 0.5 내지 0 M 황산암모늄 구배로 헥실 650C 크로마토그래피하는 것이 선택되었다.

중간 규모 헥실 650C 런(533-615) 및 벌크 약물 물질(533-616)

벤치 규모 헥실 구배 칼럼으로부터 수득된 결과에 기초하여, 칼럼 부피 112.6 mL로 대규모 헥실 650C 분취용 칼럼에 MTG로 환원된 CHT 용리액(533-563)을 로딩하고, 0.5 M 내지 0 M 황산암모늄 구배로 용리시켰다.; 용리액을 533-615(런 7)로 지정하였다. 533-606, -610, -607, 및 -611과 함께 533-615에 대한 ELISA에 의한 533-615로부터의 HCP는 152 ppm이고, rCSP의 순도는 99.2%였다. SDS-CGE에 의한 순도, 280 nm에서의 흡광도에 의한 전체 단백질 농도, LC/MS에 의한 아미노산 클리핑, 및 ELISA에 의한 숙주 세포 단백질 수준은 하기 표 27에 요약되어 있다. 역상 HPLC에 의해 측정된 바, 전체 rCSP(천연 + 피로글루타메이트 형태)는 CHT 후 82.4%로부터 헥실 650C 후 91.5%로 증가하였다.

UF/DF 완충제 교환(533-616)

533-616 헥실 용리 풀을 접선 유동 여과에 의해 농축시키고, 1x PBS, 0.5 M 아르기닌-HCl, 1 mM 모노티오글리세롤(pH 6.7)로 구성된 최종 부형제 완충제로 정용여과시켰다.

생성물을 도입시키기 이전에 1x PBS로 막을 평형화시켰다. 실온(21-23℃)에서 1X PBS, 10%(w/v) 아르기닌-HCl(533-616의 경우, 0.5 M 아르기닌-HCl)(J.T. 베이커, 부품 번호 2067), 1 mM 모노티오글리세롤(MP 바이오메디칼즈(MP BIOMEDICALS) 카탈로그 번호 155727)(pH 6.4)을 324 LMH로 막을 통과시켜 재순환시켰다. 5 kDa 막에 걸쳐 있는 동안 보유액에 TMP 10-15 psi 및 21-24 psi를 가하였다. 60.2 mL 완충제로 홀드 업 부피를 계산하였다. 533-616의 경우, 용리액의 농도는 원 부피 1,532 mL에서 0.173 mg/ml 내지 부피 189.3 mL에서 1.4 mg/mL였다. 농축 후, 8 보유액 부피에 대해 일정 부피 정용여과를 수행하였다: 189.3 mL x 8 = 1,514.4 mL. 이어서, 163.4 mL 부피로 농축시키고, 최종 부피 221.9 mL(533-616의 경우, 209.5 mL)로 1.0 mg/mL로 희석시켰다. 막을 52.3 mL의 완충제로 플러싱시키고, 실온에서 ≥60분 동안 0.1 N NaOH를 재순환시켜 세정하였다. 막 재생은 정규화된 투수성 측정에 의해 확인하였다. 최종 정제된 CSP를 -80℃에서 냉동 보관하였다.

완충제 교환 단계로부터의 회수율은 87.6%였고; SDS-CGE에 의한 순도는 99.8%였다. SDS-PAGE 결과, 최종 완충제로의 교환 후, 이량체의 양은 감소한 것으로 나타났고; 단량체는 SEC-HPLC에 의하면 97.6%였다. 환원 후 N 말단 클리핑은 LC/MS에 의하면, 2.7%였고, rCSP는 RP-HPLC에 의하면, 90.3%였다. 최종 생성물의 분석 결과, A₂₈₀에서 1.05 mg/mL인 것으로 나타났고, 내독소 수준은 4 EU/mg이고, HCP-ELISA에 의하면, 숙주 세포 단백질 수준은 216 ppm이었다. 분석 데이터는 하기 표 28에 요약되어 있다.

20 cm 헥실 650C 제3 칼럼(533-618)을 사용하여 수행된 규모로의 제조

벤치 규모 및 112 mL 규모로 헥실 650C를 사용함으로써 만족할 만한 HCP 및 이량체 감소 결과를 달성함에 따라, 20 cm, 4.56 ℓ 헥실 650C 칼럼을 사용하여 실규모 기술 이전 제조 런을 시도하였다. -80℃에서 냉동시킨 농축물 물질을 14일 후에 해동시키고, TMAE 및 CHT에 의해 정제시켰다. TMAE 및 CHT 정제 환원과 같은 날 1 mM MTG를 이용한 환원을 시작하였다. 헥실 650C 정제는 다음날 시작하였다(헥실 용리액: 533-617). 다음날, 533-617 헥실 650C 용리액을, UF/DF에 의해 1 mM MTG, 0.5 M 아르기닌과 함께 1X PBS(pH 6.7)로 구성된 벌크 완충제로 옮겨 놓고, 533-618로 지정하였다. 533-617의 A₂₈₀ 크로마토그램은 통과액에서 분리된 소분자 피크가 나타났다. 20 cm 칼럼으로부터의 533-618 BDS 분석 결과, 중요한 성능 기준이 밝혀졌으며, 이는 모두 본 명세서 범위 내에 포함된다(표 29).

결론: 질량 분석법 펩티드 데이터베이스 분석에 의해 숙주 세포 단백질을 확인하였다. 확인된 숙주 세포 단백질 중 어느 것도 독성인 것으로 확인된 것은 없었다. '다량'(2 칼럼 정제) 및 '소량'(3 칼럼 정제)의 HCP 함유 rCSP 배치를 비교하는 면역원성 연구 결과, rCSP 조제물 중 HCP 수준 차이로부터 발생되는 rCSP 면역원성 차이를 보이지 않았다.

제3 크로마토그래피 단계에 의해 벌크 약물 물질 중 HCP의 수준을 감소시켰다. 1 mM MTG를 포함하는 온화화 환원 조건을 사용한 후, 이어서, 0.5 내지 0 M 황산암모늄 구배로 헥실 650C 크로마토그래피를 수행한 결과, 저 클리핑 및 고순도와 함께 최저 수준의 HCP를 얻을 수 있었다.

실시예 11: 용해물 중 침전을 감소시키는 방법

음이온 교환 크로마토그래피 수행 전 용해물 중 침전을 감소시키는 방법을 그가 rCSP 수율 및 순도에 미치는 효과에 대해 평가하였다.

기술된 바와 같이, TMAE 음이온 교환 칼럼 상에 로딩시키니 이전에 용해물을 냉동 및 해동시킴으로써 rCSP 순도, 농도, 및 수율을 증진시킬 수 있다. 그의 표면적 대 부피의 비가 더 높은 것에 기인하여 더 큰 용기에 대한 대안으로서 2 ℓ 병 중 용해물의 냉동을 평가하였다. 조작 런에 대해 기술된 공정에 의해 10% 용해물을 제조하였다. 10% 용해물 상청액(533-555, 세포 페이스트 533-446으로부터 제조)을 함유하는 1개의 2 ℓ PETG 병 및 탈이온수를 함유하는 5 x 2 ℓ PETG 병을 레브코(Revco) -80℃ 냉동기에 배치시켰다. 하기 표 30에는 시간 경과에 따른 냉동 진행 과정이 개략적으로 설명되어 있다.

해동에 대한 예상 시간을 확립하기 위해, DI 수를 함유하는 6 x 2 ℓ PETG 병, 및 ≤-76℃에서 냉동된 액체 (총 24 ℓ의 냉동된 액체)를 함유하는 다양한 1 ℓ 및 500 mL PETG 병과 함께, 10% 냉동된 용해물(533-555)을 함유하는 2 ℓ PETG 병을 25℃로 설정된 프리시즌(Precision) 270(써모사이언티픽(Thermo Scientific)) 수조에 배치시키고, 수조 온도를 절대 22℃ 아래로 떨어뜨리지 않았다. 3.25시간 경과 후, 병을 수회에 걸쳐 온화하게 혼합하면서, 10% 냉동된 용해물을 22-23℃에서 완전하게 해동시켰다.

침전을 추가로 감소시키기 위해, 완전히 냉동시켰던 해동된 용해물의 여과를 평가하였다. 조작 런 3에 대한 용해물(533-485) 제조에 사용된 동일의 세포 페이스트로부터 제조된 10% 용해물을 기술된 공정에 의해 제조하고, 2 ℓ PETG 병 중에서 냉동시키고, 상기 기술된 바와 같이, 2시간 35분 동안 해동시켰다. 원심분리를 위해 요구되는 추가의 시간 동안 N 말단 클리핑이 증가할 가능성이 있다는 점을 고려해 보면, 침전물의 양이 적절하게 감소된 것으로 나타났다면, 원심분리 없이 여과하는 것이 바람직할 수 있다고 간주되었다. 원심분리에 요구되는 기간 및 힘을 측정하기 위해, 해동된 용해물의 사르토브란 P (0.45 ㎛/0.2 ㎛) 막 필터를 통한 여과를 하기 3가지 상이한 조건하에서 평가하였다: 원심분리 수행하지 않음, 15분 동안 15,000 x g, 및 30분 동안 30,000 x g로 원심분리. 필터 용량을 측정하기 위해 V_최대 방법을 따랐다. 75% 플러깅시 유속은 초기 유속의 대략 25%였기 때문에 V₇₅ 값이 타당한 용량 한계인 것으로 간주되었다. 원심분리 없이 수행된 막 여과를 통해 제조에 적절한 V₇₅ 값을 얻을 수 있는 것으로 나타났다(표 31). 원심분리 없이 수행되었을 때 타당한 것으로 측정된 0.45 ㎛(TMAE 수지의 오염을 막는 데 충분히 작은 크기)로 여과하는 경우, 냉동/해동된 용해물을 원심분리하지 않고, 여과하여 TMAE 크로마토그래피를 수행하였다. 단백질 분해성 클리핑 증가에 대한 잠재성에 대하여 비교 검토하였을 때, 원심분리된 용해물에 비하여 원심분리되지 않은 용해물에 대해 요구되는 여과 면적이 더 큰 것은 타당한 것이었다. 원심분리되지 않은 시료에 대해 요구되는 필터 투과량에서 뚜렷한 rCSP 농도 감소는 관찰되지 않았다.

TMAE 칼럼이 오염되지 못하게 하기 위해 적절하게 미립자를 제거하는 것으로 알려져 있는 크기 조합을 가지는 0.65 ㎛/0.45 ㎛ 막 필터를 사용하였다. 원심분리되지 않은 용해물이 25 L/㎡로 투과되었고, 어떤 TMAE 칼럼 오염도 발생하지 않았다.

본 결과는 2 ℓ 병 중 용해물을 냉동 해동시킨 후, 원심분리 없이 0.2/0.45 ㎛ 또는 0.65 ㎛/0.45 ㎛ 막 여과를 사용하는 것을 나타낸다. 이러한 추가의 단계를 통해 침전은 감소하였으며, 이를 통해 성공적인 크로마토그래피를 수행할 수 있게 되었고, 프로세싱 시간 단축과 관련된 rCSP의 N 말단 클리핑 수준은 저하되었다.

SEQUENCE LISTING <110> PFENEX INC. <120> PROCESS FOR PURIFYING RECOMBINANT PLASMODIUM FALCIPARUM CIRCUMSPOROZOITE PROTEIN <130> 38194-739.601 <140> <141> <150> 13/844,261 <151> 2013-03-15 <150> 61/641,105 <151> 2012-05-01 <160> 111 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 397 <212> PRT <213> Plasmodium falciparum <400> 1 Met Met Arg Lys Leu Ala Ile Leu Ser Val Ser Ser Phe Leu Phe Val 1 5 10 15 Glu Ala Leu Phe Gln Glu Tyr Gln Cys Tyr Gly Ser Ser Ser Asn Thr 20 25 30 Arg Val Leu Asn Glu Leu Asn Tyr Asp Asn Ala Gly Thr Asn Leu Tyr 35 40 45 Asn Glu Leu Glu Met Asn Tyr Tyr Gly Lys Gln Glu Asn Trp Tyr Ser 50 55 60 Leu Lys Lys Asn Ser Arg Ser Leu Gly Glu Asn Asp Asp Gly Asn Asn 65 70 75 80 Glu Asp Asn Glu Lys Leu Arg Lys Pro Lys His Lys Lys Leu Lys Gln 85 90 95 Pro Ala Asp Gly Asn Pro Asp Pro Asn Ala Asn Pro Asn Val Asp Pro 100 105 110 Asn Ala Asn Pro Asn Val Asp Pro Asn Ala Asn Pro Asn Val Asp Pro 115 120 125 Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro 130 135 140 Asn Ala 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Synthetic peptide <400> 70 Asp Lys His Ile Lys Glu Tyr Leu Asn Lys Ile Gln Asn Ser Leu Ser 1 5 10 15 Thr Glu Trp Ser Pro Cys Ser Val Thr Cys Gly 20 25 <210> 71 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 71 Asp Lys His Ile Lys Glu Tyr Leu Asn Lys Ile Gln Asn Ser Leu Ser 1 5 10 15 <210> 72 <211> 43 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 72 Asp Lys His Ile Lys Glu Tyr Leu Asn Lys Ile Gln Asn Ser Leu Ser 1 5 10 15 Thr Glu Trp Ser Pro Cys Ser Val Thr Cys Gly Asn Gly Ile Gln Val 20 25 30 Arg Ile Lys Pro Gly Ser Ala Asn Lys Pro Lys 35 40 <210> 73 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 73 Asp Lys His Ile Lys Glu Tyr Leu Asn Lys Ile Gln Asn Ser Leu Ser 1 5 10 15 Thr Glu Trp Ser Pro Cys Ser Val Thr Cys Gly Asn 20 25 <210> 74 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 74 Lys His Ile Lys Glu Tyr Leu Asn Lys Ile Gln Asn Ser Leu Ser Thr 1 5 10 15 Glu Trp Ser Pro Cys Ser Val Thr Cys Gly Asn Gly Ile Gln Val Arg 20 25 30 Ile Lys Pro Gly Ser Ala Asn Lys Pro Lys 35 40 <210> 75 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 75 Lys His Ile Lys Glu Tyr Leu Asn Lys Ile Gln Asn Ser Leu Ser Thr 1 5 10 15 <210> 76 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 76 Glu Tyr Leu Asn Lys Ile Gln Asn Ser Leu Ser Thr Glu Trp Ser Pro 1 5 10 15 Cys Ser Val Thr Cys Gly Asn Gly Ile Gln Val Arg Ile Lys Pro Gly 20 25 30 Ser Ala Asn Lys Pro Lys 35 <210> 77 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 77 Gln Glu Tyr Gln Cys Tyr Gly Ser Ser Ser Asn Thr Arg 1 5 10 <210> 78 <211> 25 <212> PRT <213> 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Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 82 Tyr Asp Asn Ala Gly Thr Asn Leu Tyr Asn Glu Leu Glu Met Asn Tyr 1 5 10 15 Tyr Gly Lys Gln Glu Asn Trp Tyr Ser Leu Lys 20 25 <210> 83 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 83 Thr Asn Leu Tyr Asn Glu Leu Glu Met Asn Tyr Tyr Gly Lys Gln Glu 1 5 10 15 Asn Trp Tyr Ser Leu Lys 20 <210> 84 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 84 Tyr Asn Glu Leu Glu Met Asn Tyr Tyr Gly Lys Gln Glu Asn Trp Tyr 1 5 10 15 Ser Leu Lys Lys 20 <210> 85 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 85 Gln Glu Asn Trp Tyr Ser Leu Lys 1 5 <210> 86 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 86 Gln Glu Asn Trp Tyr Ser Leu Lys Lys 1 5 <210> 87 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 87 Ser Leu Gly Glu Asn Asp Asp Gly Asn Asn Glu Asp Asn Glu Lys Leu 1 5 10 15 Arg <210> 88 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 88 Ser Leu Gly Glu Asn Asp Asp Gly Asn Asn Glu Asp Asn Glu Lys 1 5 10 15 <210> 89 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 89 Leu Gly Glu Asn Asp Asp Gly Asn Asn Glu Asp Asn Glu Lys 1 5 10 <210> 90 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 90 Asp Asn Glu Lys Leu Arg Lys Pro Lys 1 5 <210> 91 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 91 Leu Lys Gln Pro Ala Asp Gly Asn Pro Asp Pro Asn Ala Asn Pro Asn 1 5 10 15 Val Asp Pro Asn Ala Asn Pro Asn Val Asp 20 25 <210> 92 <211> 28 <212> PRT 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11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 106 Asp Glu Leu Asp Tyr Ala Asn Asp Ile Glu Lys 1 5 10 <210> 107 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 107 Asp Glu Leu Asp Tyr Ala Asn Asp Ile Glu Lys Lys 1 5 10 <210> 108 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 108 Cys Ser Ser Val Phe Asn Val Val Asn 1 5 <210> 109 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 109 Cys Ser Ser Val Phe Asn Val Val 1 5 <210> 110 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(3) <223> Alkylated-Cys <400> 110 Tyr Gln Cys Tyr Gly Ser Ser Ser Asn Thr Arg Val Leu Asn Glu 1 5 10 15 <210> 111 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 111 Gln Glu Tyr Gln Cys Tyr Gly Ser Ser Ser Asn Thr Arg Val Leu Asn 1 5 10 15 Glu

Claims

재조합 P. 팔시파룸(P. falciparum) 포자소체 단백질을 정제하는 방법으로서,
(a) 재조합 P. 팔시파룸 포자소체 단백질 이량체를 포함하는 박테리아 세포 용해물 조제물(preparation)을 수득하는 단계;
(b) 단계 (a)의 박테리아 세포 용해물 조제물을, 재조합 P. 팔시파룸 포자소체 단백질 이량체를 포함하는 가용성 분획, 및 불용성 분획으로 분리시키는 단계;
(c) 단계 (b)의 가용성 분획 중의 재조합 P. 팔시파룸 포자소체 단백질 이량체를 가용성 분획 중의 숙주 세포 단백질로부터 분리시키는 단계; 및
(d) 단계 (c)에서 수득된 재조합 P. 팔시파룸 포자소체 단백질 이량체에 우선적 환원 조건을 적용하여 재조합 P. 팔시파룸 포자소체 단백질을 수득함으로써;
정제된 재조합 P. 팔시파룸 포자소체 단백질을 수득하는 단계를 포함하는 방법.
제1항에 있어서, (e) 단계 (d)에서 수득된 재조합 P. 팔시파룸 포자소체 단백질을 숙주 세포 단백질, N 말단에서 분해된 rCSP, 및/또는 다른 원치않는 rCSP 종으로부터 분리시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제1항에 있어서, 정제된 재조합 P. 팔시파룸 포자소체 단백질이 약 10% 내지 약 75%의 전체 정제 수율로 수득되는 것인 방법.
제1항에 있어서, 수득된, 정제된 재조합 P. 팔시파룸 포자소체 단백질이 약 90% 이상의 재조합 P. 팔시파룸 포자소체 단백질 단량체를 포함하는 것인 방법.
제1항에 있어서, 단계 (c)의 분리가 크로마토그래피를 포함하고, 상기 크로마토그래피는 음이온 교환 크로마토그래피 및 혼합 모드 크로마토그래피를 포함하는 것인 방법.
제5항에 있어서, 혼합 모드 크로마토그래피가 하이드록시아파타이트 크로마토그래피인 방법.
제2항에 있어서, 단계 (e)의 분리가 소수성 상호작용 크로마토그래피를 포함하는 것인 방법.
제1항에 있어서, 우선적 환원 조건이 온화한(mild) 환원제를 포함하는 것인 방법.
제8항에 있어서, 온화한 환원제가 DTT, 시스테인, 아세틸시스테인, 글루타티온, 모노티오글리세롤(MTG), 티오글리콜레이트, 디티오트레이톨, 디티오에리트리톨, 아세틸시스테인, 2-머캅토에탄올(B-머캅토에탄올), TCEP-HCl(순수, 결정질 트리스(2-카복시에틸)포스핀 하이드로클로라이드), 또는 2-머캅토에틸아민-HCl(2-MEA)인 방법.
제9항에 있어서, 온화한 환원제가 약 0.01 내지 약 0.03 mM 농도의 DTT, 또는 약 0.5 mM 내지 약 1.5 mM 농도의 MTG인 방법.
제8항에 있어서, 우선적 환원 조건이 탈응집화제(disaggregating agent)를 추가로 포함하는 것인 방법.
제11항에 있어서, 탈응집화제가 우레아, 아르기닌, 구아니딘 HCl, 또는 계면활성제인 방법.
제1항에 있어서, 약 1 mg/ml 내지 약 50 mg/ml, 약 1 mg/ml 내지 약 25 mg/ml, 약 1 mg/ml 내지 약 10 mg/ml, 약 1 mg/ml 내지 약 5 mg/ml, 약 5 mg/ml 내지 약 50 mg/ml, 약 5 mg/ml 내지 약 25 mg/ml, 또는 약 5 mg/ml 내지 약 10 mg/ml의 재조합 P. 팔시파룸 포자소체 단백질을, 약 0.5 mM 내지 약 1.5 mM MTG 및 약 10% 내지 약 20% 아르기닌을 포함하는 제제 완충제로 정용여과시키고, 안정한 단백질 제제를 보관하는 것을 포함하는, 재조합 P. 팔시파룸 포자소체 단백질의 안정한 액체 제제를 제조하는 단계를 추가로 포함하고, 이때 보관 온도는 약 3℃ 내지 약 25℃인 방법.
제2항에 있어서, 약 1 mg/ml 내지 약 50 mg/ml, 약 1 mg/ml 내지 약 25 mg/ml, 약 1 mg/ml 내지 약 10 mg/ml, 약 1 mg/ml 내지 약 5 mg/ml, 약 5 mg/ml 내지 약 50 mg/ml, 약 5 mg/ml 내지 약 25 mg/ml, 또는 약 5 mg/ml 내지 약 10 mg/ml의 재조합 P. 팔시파룸 포자소체 단백질을, 약 0.5 mM 내지 약 1.5 mM MTG 및 약 10% 내지 약 20% 아르기닌을 포함하는 제제 완충제로 정용여과시키고, 안정한 단백질 제제를 보관하는 것을 포함하는, 재조합 P. 팔시파룸 포자소체 단백질의 안정한 액체 제제를 제조하는 단계를 추가로 포함하고, 이때 보관 온도는 약 3℃ 내지 약 25℃인 방법.
제13항에 있어서, 제제 완충제가 0.5X 또는 1X PBS를 포함하는 것인 방법.
제15항에 있어서, 제제 완충제의 pH가 약 6.0 내지 약 7.5, 약 6.4 내지 약 7.2, 약 6.4 내지 약 7.0, 약 6.6 내지 약 6.8, 또는 약 6.7인 방법.
제16항에 있어서, 제제 완충제가 약 1.0 mM MTG, 약 10% 내지 약 20% 아르기닌, 1X PBS를 포함하고, pH가 약 6.4 내지 약 7.5이며, 이때 보관 온도는 약 4℃ 내지 약 6℃인 방법.
제13항에 있어서, 재조합 P. 팔시파룸 포자소체 단백질의 안정한 액체 제제가 약 1% 이하, 약 2% 이하, 약 3% 이하, 약 4% 이하, 약 5% 이하, 약 6% 이하, 약 7% 이하, 약 8% 이하, 약 9% 이하, 또는 약 10% 이하의 재조합 P. 팔시파룸 포자소체 단백질 이량체; 약 1% 이하, 약 2% 이하, 약 3% 이하, 약 4% 이하, 약 5% 이하, 약 6% 이하, 약 7% 이하, 약 8% 이하, 약 9% 이하, 또는 약 10% 이하의 재조합 P. 팔시파룸 포자소체 단백질 고분자량 응집체; 약 1% 이하, 약 2% 이하, 약 3% 이하, 약 4% 이하, 약 5% 이하, 약 6% 이하, 약 7% 이하, 약 8% 이하, 약 9% 이하, 또는 약 10% 이하의 변성된 재조합 P. 팔시파룸 포자소체 단백질; 및 약 1% 이하, 약 2% 이하, 약 3% 이하, 약 4% 이하, 약 5% 이하, 약 6% 이하, 약 7% 이하, 약 8% 이하, 약 9% 이하, 또는 약 10% 이하의 재조합 P. 팔시파룸 포자소체 단백질 분해 생성물 중 하나 이상을 함유하는 것인 방법.
제1항에 있어서, 박테리아 세포 용해물이, 재조합 P. 팔시파룸 포자소체 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포로부터 제조된 것인 방법.
제19항에 있어서, 숙주 세포가 슈도모나드(Pseudomonad) 세포인 방법.
제20항에 있어서, 숙주 세포가 슈도모나스(Pseudomonas) 세포인 방법.
제19항에 있어서, 핵산 서열에 의해 코딩된 재조합 P. 팔시파룸 포자소체 단백질이 서열 번호 3에 기재되어 있는 아미노산 서열, 또는 서열 번호 3에 기재되어 있는 아미노산 서열과 90% 이상 동일한 아미노산 서열을 가지는 것인 방법.
제21항에 있어서, 재조합 P. 팔시파룸 포자소체 단백질을 코딩하는 핵산 서열이 주변세포질 분비 신호 서열에 융합되는 것인 방법.
재조합 P. 팔시파룸 포자소체 단백질의 안정한 액체 제제로서,
약 0.5 내지 약 1.5 mM MTG 및 약 10% 내지 약 20% 아르기닌을 포함하는 제제 완충제 중 약 1 내지 약 5, 약 1 내지 약 10, 약 1 내지 약 20, 약 1 내지 약 30, 약 1 내지 약 40, 또는 약 1 내지 약 50 mg/ml의 재조합 P. 팔시파룸 포자소체 단백질을 포함하고, 이때 보관 온도는 약 3℃ 내지 약 25℃인 안정한 액체 제제.
제24항에 있어서, 제제 완충제가 0.5X 또는 1X PBS를 포함하는 것인 안정한 액체 제제.
제25항에 있어서, 제제 완충제의 pH가 약 6.0 내지 약 7.5, 6.4 내지 약 7.2, 약 6.4 내지 약 7.0, 약 6.6 내지 약 6.8, 약 6.4, 약 6.7, 또는 약 7.0인 안정한 액체 제제.
제26항에 있어서, 안정한 액체 제제가 약 1 내지 약 5 mg/ml rCSP, 약 1.0 mM MTG, 약 10% 아르기닌, 1X PBS를 포함하고, pH가 약 6.0 내지 약 7.5이며, 이때 보관 온도는 약 4℃ 내지 약 6℃인 안정한 액체 제제.
제24항에 있어서, 재조합 P. 팔시파룸 포자소체 단백질의 안정한 액체 제제가 약 1% 이하, 약 2% 이하, 약 3% 이하, 약 4% 이하, 약 5% 이하, 약 6% 이하, 약 7% 이하, 약 8% 이하, 약 9% 이하, 또는 약 10% 이하의 재조합 P. 팔시파룸 포자소체 단백질 이량체; 약 1% 이하, 약 2% 이하, 약 3% 이하, 약 4% 이하, 약 5% 이하, 약 6% 이하, 약 7% 이하, 약 8% 이하, 약 9% 이하, 또는 약 10% 재조합 P. 팔시파룸 포자소체 단백질 고분자량 응집체; 및 약 1% 이하, 약 2% 이하, 약 3% 이하, 약 4% 이하, 약 5% 이하, 약 6% 이하, 약 7% 이하, 약 8% 이하, 약 9% 이하, 또는 약 10% 이하의 재조합 P. 팔시파룸 포자소체 단백질 분해 생성물 중 하나 이상을 함유하는 것인 안정한 액체 제제.
안정한 액체 제제 중에서 rCSP를 안정하게 유지시키는 방법으로서, pH 약 6.0 내지 약 7.5의 0.5X 또는 1X PBS 중 약 1 내지 약 5, 약 1 내지 약 10, 약 1 내지 약 20, 약 1 내지 약 30, 약 1 내지 약 40, 또는 약 1 내지 약 50 mg/ml rCSP, 약 0.5 내지 약 1.5 mM MTG 및 약 1% 내지 약 20% 아르기닌을 포함하는 안정한 액체 제제를 제공하는 단계를 포함하고, 상기 rCSP는 약 3℃ 내지 약 25℃의 온도에서 약 7일 이상, 약 8일 이상, 약 9일 이상, 약 10일 이상, 약 11일 이상, 약 12일 이상, 약 13일 이상, 약 14일 이상, 약 15일 이상, 약 16일 이상, 약 17일 이상, 약 18일 이상, 약 19일 이상, 약 20일 이상, 약 21일 이상, 약 22일 이상, 약 23일 이상, 약 24일 이상, 약 25일 이상, 약 30일 이상, 약 60일 이상, 약 70일 이상, 약 80일 이상, 약 90일 이상, 약 6개월 이상, 또는 약 1년 이상 동안 안정하게 유지되는 것인 방법.
제1항에 있어서, 안정한 액체 제제 중에서 정제된 재조합 P. 팔시파룸 포자소체 단백질을 안정하게 유지시키는 단계를 추가로 포함하고, 이 방법은 pH 약 6.0 내지 약 7.5의 0.5X 또는 1X PBS 중 약 1 내지 약 5, 약 1 내지 약 10, 약 1 내지 약 20, 약 1 내지 약 30, 약 1 내지 약 40, 또는 약 1 내지 약 50 mg/ml rCSP, 약 0.5 내지 약 1.5 mM MTG 및 약 1% 내지 약 20% 아르기닌을 포함하는 제제를 제공하는 단계를 포함하고, 상기 rCSP는 약 3℃ 내지 약 25℃의 온도에서 약 7일 이상, 약 8일 이상, 약 9일 이상, 약 10일 이상, 약 11일 이상, 약 12일 이상, 약 13일 이상, 약 14일 이상, 약 15일 이상, 약 16일 이상, 약 17일 이상, 약 18일 이상, 약 19일 이상, 약 20일 이상, 약 21일 이상, 약 22일 이상, 약 23일 이상, 약 24일 이상, 약 25일 이상, 약 30일 이상, 약 60일 이상, 약 70일 이상, 약 80일 이상, 약 90일 이상, 약 6개월 이상, 또는 약 1년 이상 동안 안정하게 유지되는 것인 방법.
제2항에 있어서, 안정한 액체 제제 중에서 정제된 재조합 P. 팔시파룸 포자소체 단백질을 안정하게 유지시키는 단계를 추가로 포함하고, 이 방법은 pH 약 6.4 내지 약 7.2의 1X PBS 중 약 1 내지 약 5, 약 1 내지 약 10, 약 1 내지 약 20, 약 1 내지 약 30, 약 1 내지 약 40, 또는 약 1 내지 약 50 mg/ml rCSP, 약 0.5 내지 약 1.5 mM MTG 및 약 10% 내지 약 20% 아르기닌을 포함하는 제제를 제공하는 단계를 포함하고, 상기 rCSP는 약 3℃ 내지 약 25℃의 온도에서 약 7일 이상, 약 8일 이상, 약 9일 이상, 약 10일 이상, 약 11일 이상, 약 12일 이상, 약 13일 이상, 약 14일 이상, 약 15일 이상, 약 16일 이상, 약 17일 이상, 약 18일 이상, 약 19일 이상, 약 20일 이상, 약 21일 이상, 약 22일 이상, 약 23일 이상, 약 24일 이상, 약 25일 이상, 약 30일 이상, 약 60일 이상, 약 70일 이상, 약 80일 이상, 약 90일 이상, 약 6개월 이상, 또는 약 1년 이상 동안 안정하게 유지되는 것인 방법.
제31항에 있어서, 안정한 액체 제제가 pH 약 6.4 내지 7.0의 1X PBS 중 약 1.0 mM MTG 및 약 10% 아르기닌을 포함하고, rCSP는 약 3℃ 내지 5℃의 온도에서 약 7일 이상, 약 8일 이상, 약 9일 이상, 약 10일 이상, 약 11일 이상, 약 12일 이상, 약 13일 이상, 약 14일 이상, 약 15일 이상, 약 16일 이상, 약 17일 이상, 약 18일 이상, 약 19일 이상, 약 20일 이상, 약 21일 이상, 약 22일 이상, 약 23일 이상, 약 24일 이상, 약 25일 이상, 약 30일 이상, 약 60일 이상, 약 70일 이상, 약 80일 이상, 약 90일 이상, 약 6개월 이상, 또는 약 1년 이상 동안 안정하게 유지되는 것인 방법.
제31항에 있어서, rCSP의 안정한 유지도가 제제 중 전체 rCSP의 양, 대조군과 비교하였을 때, 제제 중 전체 rCSP의 상대적인 차이(%), 또는 대조군과 비교하였을 때, rCSP 순도의 상대적인 차이(%)에 의해 표시되는 것인 방법.
제31항에 있어서, rCSP의 안정한 유지도가 약 70% 내지 약 95%의 제제 중 전체 rCSP의 양에 의해, 또는 대조군과 비교하였을 때, 약 -5% 내지 약 5%, 약 -4% 내지 약 4%, 약 -3% 내지 약 3%, 약 -2% 내지 약 2%, 약 -2% 내지 약 1%, 약 -2% 내지 약 0.5%, 약 -2% 내지 약 0%, 또는 약 0% 내지 약 2%의 제제 중 전체 rCSP의 상대적인 차이(%) 또는 rCSP 순도의 상대적인 차이(%)에 의해 표시되는 것인 방법.