BR112014027019B1

BR112014027019B1 - Processo para purificar proteína circunsporozoíta p. falciparum recombinante; formulação líquida estável de proteína circunsporozoíta p. falciparum recombinante; e processo para manter de forma estável rcsp em uma formulação líquida estável

Info

Publication number: BR112014027019B1
Application number: BR112014027019-8A
Authority: BR
Inventors: Jeffrey Allen; Greg Cantin; Ryan Haverstock
Original assignee: Pfenex Inc.
Priority date: 2012-05-01
Filing date: 2013-04-22
Publication date: 2022-09-06
Also published as: US9169304B2; JP6238967B2; SG11201407108TA; NZ630121A; ZA201407420B; CA2870198C; CN104379596A; WO2013165732A1; CN104379596B; JP2015517464A; MX352093B; MX2014013124A; US20140051841A1; EP2844666A1; CA2870198A1; MY166380A; EP2844666A4; AU2013256757A1; KR102087461B1; EP2844666B1

Abstract

PROCESSO PARA PURIFICAR PROTEÍNA CIRCUNSPOROZOÍTA P. FALCIPARUM RECOMBINANTE; FORMULAÇÃO LÍQUIDA ESTÁVEL DE PROTEÍNA CIRCUNSPOROZOÍTA P. FALCIPARUM RECOMBINANTE; E PROCESSO PARA MANTER DE FORMA ESTÁVEL rCSP EM UMA FORMULAÇÃO LÍQUIDA ESTÁVEL Trata-se de processos para purificar proteína circunsporozoíta plasmodium faloiparum recombinante de alta qualidade em alto rendimento. Esse processo fornece rCSP em alto rendimento sem a necessidade de desnaturar e redobrar a proteína. A presente invenção supera obstáculos previamente encontrados no campo, incluindo dimerização agregação e degradação de terminal N de rCSP. O processo fornecido pela invenção é escalável e pode ser aplicado a grandes lotes de fermentação. A invenção também refere-se a formulações líquidas estáveis de proteína circunporozoita P. faloiparum recombinante, e processos para manter de modo estável rCSP em uma formulação líquida estável.

Description

REFERÊNCIA CRUZADA AO PEDIDO RELACIONADO

[0001] Este pedido reivindica o benefício do pedido de patente provisório dos Estados Unidos no de série 61/641.105, depositado em 1 de maio de 2012; e é uma continuação-em-parte do pedido de patente dos Estados Unidos no de série 13/844.261, depositado em 15 de março de 2013, cada um dos quais está incorporado ao presente documento a título de referência, em sua totalidade.

APOIO GOVERNAMENTAL

[0002] Esta invenção foi feita com apoio governamental sob o contrato no AI-N01-054210 outorgado pela (Divisão de Microbiologia e Doenças Infecciosas/Instituto Nacional de Alergia e Doenças Infecciosas). O governo tem determinados direitos sobre a invenção.

CAMPO DA INVENÇÃO

[0003] A invenção se encontra no campo de purificação de proteína, em particular, purificação de proteína circunsporozoíta de Plasmodium falciparum expressada de forma recombinante.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

[0004] A malária é causada por parasitas do gênero Plasmodium. De acordo com os centros de controle de doença, a malária ocupa o segundo lugar na África como a maior causa de morte de doenças infecciosas, depois de HIV/AIDS. A mesma ocupa o quinto lugar em todo o mundo, depois de infecções respiratórias, HIV/AIDS, doenças diarreicas e tuberculose. Plasmodium falciparum, um dentre pelo menos onze parasitas Plasmodium conhecidos que atacam os seres humanos, causa uma infecção particularmente severa caracterizada pelo sequestro do parasita em órgãos vitais e tecidos profundos, onde o mesmo pode esquivar-se ao sistema imunológico.

[0005] Não há vacina contra malária eficaz disponível. As recentes estratégias estão dirigidas para a proteína circunsporozoíta de Plasmodium falciparum (CSP), a que é crítica para a patogênese do parasita. Atualmente, uma vacina chamada RTS,S (GlaxoSmithKline), composta de uma parte de CSP, está na Fase III de testes clínicos. A CSP é um monômero de proteína que pode ser amplamente descrito como tendo três regiões - a região N-terminal, a região de repetição central e a região C-terminal. As regiões N e C- terminais contêm regiões protetoras cruciais importantes para a invasão de parasita, e a região central contém repetições de tetrapeptídeo imunodominante altamente conservado. A vacina RTS,S não inclui a região N-terminal de CSP. É composta de uma parte da repetição central de CSP e da região C-terminal, ligada ao antígeno de superfície de hepatite B. Os relatos recentes que indicam que a região N- terminal de CSP é imunogênica sugerem que uma estratégia de vacina que utiliza uma molécula de CSP que tem a região N- terminal seria superior.

[0006] O desenvolvimento de um processo de purificação em escala de produção para fazer CSP recombinante em quantidades que atendem as necessidades para a pesquisa e produção de vacina apresenta desafios. A região N-terminal de CSP é altamente suscetível à degradação. Adicionalmente, CSP dimeriza devido à formação de ligações de dissulfeto intermoleculares covalentes que envolvem uma cisteína livre próxima à terminação N do monômero. CSP também forma agregados de peso molecular maior. Os presentes esquemas de purificação fornecem monômero de CSP recombinante desprovido da região N- terminal, ou geram baixos rendimentos de CSP intata. A desnaturação para eliminar dímeros e agregados tem exigido reenovelamento, o qual é complicado pela presença de duas ligações de dissulfeto que envolvem quatro resíduos de cisteína na região C-terminal de CSP. Essas ligações de dissulfeto são críticas para a estrutura e função da região protetora C-terminal; a ruptura das mesmas tem sido mostrada como destruindo a capacidade da CSP de ligar-se a células hepáticas. Adicionalmente, as etapas adicionais de desnaturação e reenovelamento são fatigantes, dispendiosas, reduzem o rendimento e são desafiadoras para o aumento gradual para o uso com grandes lotes de fermentação. Portanto, são necessários métodos de purificação escaláveis para obtenção de CSP recombinante de alta qualidade em altos rendimentos.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0007] A invenção refere-se a um processo para a purificação de proteína circunsporozoíta de P. falciparum recombinante (rCSP) feita em um sistema de expressão de célula hospedeira bacteriana. Esse processo fornece rCSP em altos rendimentos sem a necessidade pela desnaturação e reenovelamento da proteína. A presente invenção supera os obstáculos encontrados anteriormente no campo, que incluem dimerização, agregação e degradação de N-terminal de rCSP. O processo fornecido pela invenção é escalonável, e pode ser aplicado a grandes lotes de fermentação. A invenção também se refere a formulações líquidas estáveis de proteína circunsporozoíta de P. falciparum recombinante, e processos para manter estavelmente a rCSP em uma formulação líquida estável.

[0008] Nas modalidades, a presente invenção fornece um processo para a purificação de proteína circunsporozoíta de P. falciparum recombinante, em que o dito processo compreende (a) obter uma preparação de lisado de célula bacteriana que compreende dímeros de proteína circunsporozoíta de P. falciparum recombinante; (b) separar a preparação de lisado de célula bacteriana da etapa (a) em uma fração solúvel que compreende os dímeros de proteína circunsporozoíta de P. falciparum, e uma fração insolúvel; (c) separar os dímeros de proteína circunsporozoíta de P. falciparum recombinante na fração solúvel da etapa (b) a partir de proteínas de célula hospedeira na fração solúvel; e (d) submeter os dímeros de proteína circunsporozoíta de P. falciparum recombinante obtidos na etapa (c) a condições de redução preferencial; obtendo, assim, proteína circunsporozoíta de P. falciparum recombinante purificada.

[0009] Nas modalidades relacionadas, a proteína circunsporozoíta de P. falciparum recombinante purificada é obtida em um rendimento de purificação total de cerca de 10% a cerca de 75%, cerca de 10% a cerca de 70%, cerca de 10% a cerca de 65%, cerca de 10% a cerca de 60%, 10% a cerca de 55%, cerca de 10% a cerca de 50%, cerca de10%acercade45%,cercade10%acercade40%,cerca de10%acercade35%,cercade10%acercade30%,cerca de10%acercade25%,cercade10%acercade20%,cerca de20%acercade75%,cercade20%acercade70%,cerca de20%acercade65%,cercade20%acercade60%,cerca de20%acercade55%,cercade20%acercade50%,cerca de20%acercade45%,cercade20%acercade40%,cerca de20%acercade35%,cercade20%acercade30%,cerca de25%acercade75%,cercade25%acercade70%,cerca de25%acercade65%,cercade25%acercade60%,cerca de25%acercade55%,cercade25%acercade50%,cerca de25%acercade45%,cercade25%acercade40%,cerca de25%acercade35%,cercade25%acercade30%,cerca de30%acercade75%,cercade30%acercade70%,cerca de30%acercade65%,cercade30%acercade60%,cerca de30%acercade55%,cercade30%acercade50%,cerca de30%acercade45%oucercade30%acercade40%.Nas modalidades, não mais que cerca de 10% da proteína circunsporozoíta de P. falciparum recombinante purificada obtida são degradados na terminação N. Nas modalidades, não mais que cerca de 10% da proteína circunsporozoíta de P. falciparum recombinante purificada obtida são dimerizadas. Nas modalidades, não mais que cerca de 5% da proteína circunsporozoíta de P. falciparum recombinante purificada obtida estão presentes como agregados de alto peso molecular. Nas modalidades, não mais que cerca de 10% da proteína circunsporozoíta de P. falciparum recombinante purificada obtida são desnaturadas. Nas modalidades relacionadas, a proteína circunsporozoíta de P. falciparum recombinante purificada obtida compreende pelo menos cerca de 90% de monômero de proteína circunsporozoíta de P. falciparum.

[0010] Nas modalidades da invenção, o lisado de célula bacteriana é um lisado de célula de Pseudomonad. Nas modalidades relacionadas, as células de Pseudomonad são células de Pseudomonas, e em outras modalidades relacionadas, as células de Pseudomonas são Pseudomonas fluorescens.

[0011] Nas modalidades, a separação da etapa (b) acima compreende centrifugação de pilha de discos e/ou filtração profunda. A separação da etapa (c) pode compreender cromatografia. Nas modalidades, a cromatografia compreende uma ou mais dentre as seguintes: cromatografia de troca aniônica, cromatografia de troca catiônica, cromatografia de interação hidrofóbica, cromatografia de exclusão de tamanho, cromatografia de afinidade e cromatografia de modo misto. O uso de cromatografia de hidroxiapatita como cromatografia de modo misto é observado. Em determinadas modalidades, a separação da etapa (b) compreende centrifugação de pilha de discos e filtração profunda, e a separação da etapa (d) compreende cromatografia de troca aniônica e cromatografia de modo misto.

[0012] Nas modalidades da invenção, as condições de redução preferencial compreendem DTT, cisteína, glutationa, monotioglicerol, tioglicolato, ditotiotreitol, ditioerititol, acetilcisteína, 2- Mercaptoetanol (B-mercaptoetanol), TCEP-HCl (cloridrato de tris(2-carboxietil)fosfina cristalino puro) ou 2- Mercaptoetilamina-HCl (2-MEA). Em determinadas modalidades relacionadas, as condições de redução preferencial compreendem DTT em uma concentração de cerca de 0,010 a cerca de 0, 030 mM. A troca de tampão pode compreender filtração de fluxo tangencial realizada com o uso de uma membrana que tem um tamanho de poro de cerca de 4 kDa a cerca de 8 kDa. Nas modalidades, as condições de redução preferencial compreendem um ingrediente que atende os padrões da United States Pharmacopeial Convention (Rockville, MD) , conforme publicado na United States Pharmacopeia - National Formulary (USP-NF), ou padrões análogos em países fora dos Estados Unidos, por exemplo, conforme publicado na International Pharmacopeia (Organização Mundial da Saúde).

[0013] O processo, conforme reivindicado, é escalonável para uma preparação de lisado de célula bacteriana que compreende cerca de 1 grama a cerca de 2.000 gramas de rCSP. Nas modalidades relacionadas, a quantidade de rCSP na preparação de lisado bacteriano é de cerca de 1 grama a cerca de 2.000 gramas.

[0014] A invenção refere-se, adicionalmente, a um processo para a purificação de proteína circunsporozoíta de P. falciparum recombinante, sendo que o processo compreende: (a) obter uma cultura de células hospedeiras bacterianas, em que as células hospedeiras bacterianas são transformadas com um vetor de expressão que compreende uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína circunsporozoíta de P. falciparum; (b) cultivar a cultura de células hospedeiras bacterianas, expressando, assim, a proteína circunsporozoíta de P. falciparum a partir do vetor de expressão; (c) romper as células hospedeiras bacterianas a partir da cultura de células hospedeiras bacterianas cultivadas na etapa (b) para gerar uma preparação de lisado de célula bacteriana, em que a preparação de lisado de célula bacteriana compreende dímeros de proteína circunsporozoíta de P. falciparum; (d) separar a preparação de lisado de célula bacteriana da etapa (c) em uma fração solúvel que compreende os dímeros de proteína circunsporozoíta de P. falciparum e uma fração insolúvel; (e) separar os dímeros de proteína circunsporozoíta de P. falciparum recombinante na fração solúvel da etapa (d) a partir de proteínas de célula hospedeira; (f) submeter os dímeros de proteína circunsporozoíta de P. falciparum recombinante obtidos na etapa (e) a condições de redução preferencial, obtendo, assim, monômero de proteína circunsporozoíta de P. falciparum; e (g) remover reagentes redutores usados nas condições de redução preferencial da etapa (f) pela troca de tampão; obtendo, assim, a proteína circunsporozoíta de P. falciparum recombinante purificada.

[0015] Nas modalidades relacionadas, a proteína circunsporozoíta de P. falciparum recombinante purificada é obtida em um rendimento de purificação total de cerca de 10% a cerca de 75%, cerca de 10% a cerca de 70%,cercade10%acercade65%,cercade10%acercade 60%,cercade20%acercade75%,cercade20%acercade 70%,cercade20%acercade65%,cercade25%acercade 75%,cercade25%acercade70%,cercade25%acercade 65%,cercade25%acercade60%,cercade30%acercade 75%,cercade30%acercade70%,cercade30%acercade 65% ou cerca de 30% a cerca de 60%. Nas modalidades, não mais que cerca de 10% da proteína circunsporozoíta de P. falciparum recombinante purificada obtida é degradada na terminação N. Nas modalidades, não mais que cerca de 10% da proteína circunsporozoíta de P. falciparum recombinante purificada obtida são dimerizadas. Nas modalidades, não mais que cerca de 5% da proteína circunsporozoíta de P. falciparum recombinante purificada obtida estão presentes como agregados de alto peso molecular. Nas modalidades, não mais que cerca de 10% da proteína circunsporozoíta de P. falciparum recombinante purificada obtida são desnaturadas. Nas modalidades relacionadas, a proteína circunsporozoíta de P. falciparum recombinante purificada obtida compreende pelo menos cerca de 90% de monômero de proteína circunsporozoíta de P. falciparum.

[0016] Nas modalidades da invenção, o lisado de célula bacteriana é um lisado de célula de Pseudomonad. Nas modalidades relacionadas, as células de Pseudomonad são células de Pseudomonas e, em modalidades relacionadas adicionais, as células de Pseudomonas são Pseudomonas fluorescens. Em determinadas modalidades, a sequência de ácido nucleico que codifica a proteína circunsporozoíta de P. falciparum é fundida a uma sequência de sinal de secreção periplasmática. A sequência de sinal de secreção periplasmática pode ser uma sequência de sinal de secreção de P. fluorescens, por exemplo, LAO, pbp, pbpA20V ou cupA2. A expressão de qualquer CSP é contemplada, conforme descrito adicionalmente no presente documento. Em determinadas modalidades, a rCSP é codificada por uma sequência de ácido nucleico que tem uma sequência de aminoácidos conforme apresentado em SEQ ID NO: 3, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade com a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 3.

[0017] Nas modalidades, a separação da etapa (d) acima compreende centrifugação de pilha de discos e/ou filtração profunda. A separação da etapa (e) pode compreender cromatografia. Nas modalidades, a cromatografia compreende uma ou mais dentre as seguintes: cromatografia de troca aniônica, cromatografia de troca catiônica, cromatografia de interação hidrofóbica, cromatografia de exclusão de tamanho, cromatografia de afinidade e cromatografia de modo misto. O uso de cromatografia de hidroxiapatita como cromatografia de modo misto é contemplada. Em determinadas modalidades, a separação da etapa (d) compreende centrifugação de pilha de discos e filtração profunda, e a separação da etapa (e) compreende cromatografia de troca aniônica e cromatografia de modo misto.

[0018] Nas modalidades da invenção, as condições de redução preferencial compreendem DTT, cisteína, glutationa, monotioglicerol, tioglicolato, ditotiotreitol, ditioerititol, acetilcisteína, 2- Mercaptoetanol (B-mercaptoetanol), TCEP-HCl (cloridrato de tris(2-carboxietil)fosfina cristalino puro) ou 2- Mercaptoetilamina-HCl (2-MEA). Em determinadas modalidades relacionadas, as condições de redução preferencial compreendem DTT em uma concentração de cerca de 0,010 a cerca de 0, 030 mM. A troca de tampão pode compreender filtração de fluxo tangencial realizada com o uso de uma membrana que tem um tamanho de poro de cerca de 4 kDa a cerca de 8 kDa.

[0019] O processo, conforme reivindicado, é escalonável para uma preparação de lisado de célula bacteriana que compreende cerca de 1 grama a cerca de 2.000 gramas de rCSP. Nas modalidades relacionadas, a quantidade de rCSP na preparação de lisado bacteriano é de cerca de 1 grama a cerca de 2.000 gramas. Nas modalidades da invenção, a cultura de células hospedeiras bacterianas cultivadas na etapa (b) é de cerca de 10 litros a cerca de 500 litros.

[0020] A invenção fornece o seguinte:

[0021] 1. Um processo para a purificação de proteína circunsporozoíta de P. falciparum recombinante, sendo que o dito processo compreende: (a) obter uma preparação de lisado de célula bacteriana que compreende dímero de proteína circunsporozoíta de P. falciparum recombinante; (b) separar a preparação de lisado de célula bacteriana da etapa (a) em uma fração solúvel que compreende o dímero de proteína circunsporozoíta de P. falciparum recombinante e uma fração insolúvel; (c) separar o dímero de proteína circunsporozoíta de P. falciparum recombinante na fração solúvel da etapa (b) a partir de proteínas de célula hospedeira na fração solúvel; e (d) submeter o dímero de proteína circunsporozoíta de P. falciparum recombinante obtido na etapa (c) a condições de redução preferencial para obter a proteína circunsporozoíta de P. falciparum recombinante; obtendo, assim, a proteína circunsporozoíta de P. falciparum recombinante purificada.

[0022] 2. O processo, de acordo com 1, que compreende, adicionalmente: (e) separar a proteína circunsporozoíta de P. falciparum recombinante obtida na etapa (d) a partir de proteínas de célula hospedeira, rCSP N-terminalmente degradada e/ou outras espécies de rCSP indesej adas.

[0023] 3. O processo, de acordo com 1 ou 2, em que a proteína circunsporozoíta de P. falciparum recombinante purificada é obtida em um rendimento de purificação total de cerca de 10% a cerca de 75%.

[0024] 4. O processo, de acordo com qualquer um dentre 1 a 3, em que a proteína circunsporozoíta de P. falciparum recombinante é obtida em um rendimento de purificaçãototalde:cercade10%acercade75%,cercade 10%acercade70%,cercade10%acercade60%,cercade 10%acercade50%,cercade10%acercade40%,cercade 10%acercade30%,cercade20%acercade75%,cercade 20%acercade50%,cercade20%acercade40%oucercade 20%acercade30%.

[0025] 5. O processo, de acordo com qualquer um dentre 1 a 4, em que não mais que cerca de 10% da proteína circunsporozoíta de P. falciparum recombinante purificada obtida são degradadas na N-terminação.

[0026] 6. O processo, de acordo com qualquer um dentre 1 a 5, em que não mais que cerca de 10% da proteína circunsporozoíta de P. falciparum recombinante purificada obtida são dimerizadas.

[0027] 7. O processo, de acordo com qualquer um dentre 1 a 6, em que não mais que cerca de 5% da proteína circunsporozoíta de P. falciparum recombinante purificada obtida estão presentes como agregados de alto peso molecular.

[0028] 8. O processo, de acordo com qualquer um dentre 1 a 7, em que não mais que cerca de 10% da proteína circunsporozoíta de P. falciparum recombinante purificada obtida são desnaturadas.

[0029] 9. O processo, de acordo com qualquer um dentre 1 a 8, em que a proteína circunsporozoíta de P. falciparum recombinante purificada obtida compreende pelo menos cerca de 90% de monômero de proteína circunsporozoíta de P. falciparum.

[0030] 10. O processo, de acordo com qualquer um dentre 1 a 9, em que o lisado de célula bacteriana é um lisado de célula de Pseudomonad.

[0031] 11. O processo, de acordo com 10, em que as células de Pseudomonad são células de Pseudomonas.

[0032] 12. O processo, de acordo com 11, em que as células de Pseudomonas são Pseudomonas fluorescens.

[0033] 13. O processo, de acordo com qualquer um dentre 1 a 12, em que a separação da etapa (b) compreende centrifugação de pilha de discos.

[0034] 14. O processo, de acordo com qualquer um dentre 1 a 13, em que a separação da etapa (b) compreende filtração profunda.

[0035] 15. O processo, de acordo com qualquer um dentre 1 a 14, em que a separação da etapa (c) compreende cromatografia, e em que a cromatografia compreende cromatografia de troca aniônica e cromatografia de modo misto.

[0036] 16. O processo, de acordo com qualquer um dentre 1 a 15, em que a separação da etapa (c) compreende cromatografia de modo misto, e em que a cromatografia de modo misto é cromatografia de hidroxiapatita.

[0037] 17. O processo, de acordo com qualquer um dentre 2 a 16, em que a separação da etapa (e) compreende cromatografia de interação hidrofóbica.

[0038] 18. O processo, de acordo com qualquer um dentre 1 a 17, em que as condições de redução preferencial compreendem um agente redutor brando.

[0039] 19. O processo, de acordo com qualquer um dentre 1 a 18, em que o agente redutor brando é DTT, cisteína, acetilcisteína, glutationa, monotioglicerol (MTG), tioglicolato, ditotiotreitol, ditioerititol, acetilcisteína, 2-Mercaptoetanol (B-mercaptoetanol), TCEP- HCl (cloridrato de tris(2-carboxietil)fosfina cristalino puro) ou 2-Mercaptoetilamina-HCl (2-MEA).

[0040] 20. O processo, de acordo com 19, em que o agente redutor brando é DTT, MTG, acetilcisteína, glutationa, tioglicolato ou cisteína.

[0041] 21. O processo, de acordo com 20, em que o agente redutor brando é DTT em uma concentração de cerca de 0,01 a cerca de 0,03 mM ou MTG em uma concentração de cerca de 0,5 mM a cerca de 1,5 mM.

[0042] 22. O processo, de acordo com qualquer um dentre 1 a 21, em que as condições de redução preferencial compreendem, adicionalmente, um agente desagregante.

[0043] 23. O processo, de acordo com 22, em que as condições de redução preferencial compreendem, adicionalmente, um agente desagregante é ureia, arginina, cloridrato de guanidina ou um detergente.

[0044] 24. O processo, de acordo com 23, em que o agente desagregante tem cerca de 1,5 a 2,5 M de ureia.

[0045] 25. O processo, de acordo com qualquer um dentre 1 a 24, em que as condições de redução branda compreendem cerca de 0,05 a cerca de 1 mM de MTG e cerca de 2 M de ureia.

[0046] 26. O processo, de acordo com qualquer um dentre 1 a 25, que compreende, adicionalmente, preparar uma formulação de proteína circunsporozoíta de P. falciparum recombinante líquida estável, que compreende diafiltração de cerca de 1 mg/ml a cerca de 50 mg/ml, cerca de 1 mg/ml a cerca de 25 mg/ml, cerca de 1 mg/ml a cerca de 10 mg/ml, cerca de 1 mg/ml a cerca de 5 mg/ml, cerca de 5 mg/ml a cerca de 50 mg/ml, cerca de 5 mg/ml a cerca de 25 mg/ml ou cerca de 5 mg/ml a cerca de 10 mg/ml de proteína circunsporozoíta de P. falciparum recombinante em um tampão de formulação que compreende cerca de 0,5 mM a cerca de 1,5 mM de MTG e cerca de 10% a cerca de 20% de arginina.

[0047] 27. O processo, de acordo com 26, em que o tampão de formulação compreende 0,5 X ou 1 X PBS.

[0048] 28. O processo, de acordo com 26 ou 27, em que o tampão de formulação tem um pH de cerca de 6,0 a cerca de 7,5, cerca de 6,4 a cerca de 7,2, cerca de 6,4 a cerca de 7,0, cerca de 6,6 a cerca de 6,8 ou cerca de 6,7.

[0049] 29. O processo, de acordo com qualquer um dentre 2 6 a 28, que compreende uma temperatura de armazenamento de cerca de 4 °C a cerca de 15 °C, cerca de 4 °C a cerca de 10 °C, cerca de 4 °C a cerca de 9 °C, cerca de 4 °C a cerca de 8 °C, cerca de 4 °C a cerca de 7 °C, cerca de 4 °C a cerca de 6 °C, cerca de 4 °C a cerca de 5 °C, cerca de 5 °C a cerca de 10 °C, cerca de 5 °C a cerca de 9 °C, cerca de 5 °C a cerca de 8 °C, cerca de 5 °C a cerca de 7 °C ou cerca de 5 °C a cerca de 6 °C.

[0050] 30. O processo, de acordo com qualquer um dentre 26 a 29, em que o tampão de formulação compreende cerca de 1,0 mM de MTG, cerca de 10% a cerca de 20% de arginina, 1 X PBS, tem um pH de cerca de 6,4 a cerca de 7,0 e em que a temperatura de armazenamento é de cerca de 4 °C a cerca de 6 °C.

[0051] 31. O processo, de acordo com qualquer um dentre 26 a 30, em que a formulação de proteína circunsporozoíta de P. falciparum recombinante líquida estável contém pelo menos um dentre os seguintes: não mais que cerca de 1%, não mais que cerca de 2%, não mais que cerca de 3%, não mais que cerca de 4%, não mais que cerca de 5%, não mais que cerca de 6%, não mais que cerca de 7%, não mais que cerca de 8%, não mais que cerca de 9% ou não mais que cerca de 10% de dímero de proteína circunsporozoíta de P. falciparum recombinante; não mais que cerca de 1%, não mais que cerca de 2%, não mais que cerca de 3%, não mais que cerca de 4%, não mais que cerca de 5%, não mais que cerca de 6%, não mais que cerca de 7%, não mais que cerca de 8%, não mais que cerca de 9% ou não mais que cerca de 10% de agregados de alto peso molecular de proteína circunsporozoíta de P. falciparum recombinante; não mais que cerca de 1%, não mais que cerca de 2%, não mais que cerca de 3%, não mais que cerca de 4%, não mais que cerca de 5%, não mais que cerca de 6%, não mais que cerca de 7%, não mais que cerca de 8%, não mais que cerca de 9% ou não mais que cerca de 10% de proteína circunsporozoíta de P. falciparum recombinante desnaturada; não mais que cerca de 1%, não mais que cerca de 2%, não mais que cerca de 3%, não mais que cerca de 4%, não mais que cerca de 5%, não mais que cerca de 6%, não mais que cerca de 7%, não mais que cerca de 8%, não mais que cerca de 9% ou não mais que cerca de 10% de espécie de proteína circunsporozoíta de P. falciparum contendo piroglutamato, e; não mais que cerca de 1%, não mais que cerca de 2%, não mais que cerca de 3%, não mais que cerca de 4%, não mais que cerca de 5%, não mais que cerca de 6%, não mais que cerca de 7%, não mais que cerca de 8%, não mais que cerca de 9% ou não mais que cerca de 10% de produtos de degradação de proteína circunsporozoíta de P. falciparum recombinante.

[0052] 32. O processo, de acordo com qualquer um dentre 1 a 31, em que o processo é escalonável para uma preparação de lisado de célula bacteriana que compreende cerca de 1 grama a cerca de 2.000 gramas de rCSP.

[0053] 33. O processo, de acordo com qualquer um dentre 1 a 32, em que a quantidade de rCSP na preparação de lisado bacteriano é de cerca de 1 grama a cerca de 2.000 gramas.

[0054] 34. O processo, de acordo com qualquer um dentre 1 a 33, em que o lisado de célula bacteriana é preparado a partir de células hospedeiras transformadas com um vetor de expressão que compreende uma sequência de ácido nucleico que codifica a proteína circunsporozoíta de P. falciparum recombinante.

[0055] 35. O processo, de acordo com qualquer um dentre 1 a 34, em que as células de Pseudomonad são células de Pseudomonas.

[0056] 36. O processo, de acordo com 35, em que as células de Pseudomonas são Pseudomonas fluorescens.

[0057] 37. O processo, de acordo com qualquer um dentre 34 a 36, em que a proteína circunsporozoíta de P. falciparum recombinante codificada pela sequência de ácido nucleico tem uma sequência de aminoácidos conforme apresentado em SEQ ID NO: 3, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade com a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 3.

[0058] 38. O processo, de acordo com 36 ou 37, em que as célula de P. fluorescens são uma cepa hospedeira de produção de PyrF que tem o genótipo ΔpyrF, lacIQ e ΔhtpX.

[0059] 39. O processo, de acordo com qualquer um dentre 34 a 38, em que a sequência de ácido nucleico que codifica a proteína circunsporozoíta de P. falciparum recombinante é fundida a uma sequência de sinal de secreção periplasmática.

[0060] 40. O processo, de acordo com 39, em que a sequência de sinal de secreção periplasmática é uma sequência de sinal de secreção de P. fluorescens.

[0061] 41. O processo, de acordo com 44, em que a sequência de sinal de secreção periplasmática de P. fluorescens é LAO, pbp, pbpA20V ou cupA2.

[0062] 42. O processo, de acordo com 41, em que a sequência de sinal de secreção periplasmática de P. fluorescens é LAO.

[0063] 43. Uma formulação líquida estável de proteína circunsporozoíta de P. falciparum recombinante, que compreende cerca de 1 a cerca de 5, cerca de 1 a cerca de 10, cerca de 1 a cerca de 20, cerca de 1 a cerca de 30, cerca de 1 a cerca de 40 ou cerca de 1 a cerca de 50 mg/ml de proteína circunsporozoíta de P. falciparum recombinante em uma tampão de formulação que compreende cerca de 0,5 a cerca de 1,5 mM de MTG e cerca de 10% a cerca de 20% de arginina.

[0064] 44. A formulação líquida estável, de acordo com 43, em que o tampão de formulação compreende 0,5 X ou 1 X PBS.

[0065] 45. A formulação líquida estável, de acordo com 43 ou 44, em que a tampão de formulação tem um pH de cerca de 6,0 a cerca de 7,5, 6,4 a cerca de 7,2, cerca de 6,4 a cerca de 7,0, cerca de 6,6 a cerca de 6,8, cerca de 6,4, cerca de 6,7 ou cerca de 7,0.

[0066] 46. A formulação líquida estável, de acordo com qualquer um dentre 43 a 45, que compreende uma temperatura de armazenamento de cerca de 4 °C a cerca de 15 °C, cerca de 4 °C a cerca de 10 °C, cerca de 4 °C a cerca de 9 °C, cerca de 4 °C a cerca de 8 °C, cerca de 4 °C a cerca de 7 °C, cerca de 4 °C a cerca de 6 °C, cerca de 4 °C a cerca de 5 °C, cerca de 5 °C a cerca de 10 °C, cerca de 5 °C a cerca de 9 °C, cerca de 5 °C a cerca de 8 °C, cerca de 5 °C a cerca de 7 °C ou cerca de 5 °C a cerca de 6 °C.

[0067] 47. A formulação líquida estável, de acordo com qualquer um dentre 43 a 46, que compreende cerca de 1 a cerca de 5 mg/ml de rCSP, cerca de 1,0 mM de MTG, cerca de 10% de arginina, 1 X PBS, tem um pH de cerca de 6,0 a cerca de 7,5, e em que a temperatura de armazenamento é de cerca de 4 °C a cerca de 6 °C.

[0068] 48. A formulação líquida estável, de acordo com qualquer um dentre 43 a 47, em que a formulação líquida estável contém pelo menos um dentre os seguintes: não mais que cerca de 1%, não mais que cerca de 2%, não mais que cerca de 3%, não mais que cerca de 4%, não mais que cerca de 5%, não mais que cerca de 6%, não mais que cerca de 7%, não mais que cerca de 8%, não mais que cerca de 9% ou não mais que cerca de 10% de dímero de proteína circunsporozoíta de P. falciparum recombinante; não mais que cerca de 1%, não mais que cerca de 2%, não mais que cerca de 3%, não mais que cerca de 4%, não mais que cerca de 5%, não mais que cerca de 6%, não mais que cerca de 7%, não mais que cerca de 8%, não mais que cerca de 9% ou não mais que cerca de 10% de agregados de alto peso molecular de proteína circunsporozoíta de P. falciparum recombinante, e; não mais que cerca de 1%, não mais que cerca de 2%, não mais que cerca de 3%, não mais que cerca de 4%, não mais que cerca de 5%, não mais que cerca de 6%, não mais que cerca de 7%, não mais que cerca de 8%, não mais que cerca de 9% ou não mais que cerca de 10% de produtos de degradação de proteína circunsporozoíta de P. falciparum recombinante.

[0069] 49. Um processo para manter estavelmente rCSP em uma formulação líquida estável, sendo que o processo compreende fornecer uma formulação que compreende cerca de 1 a cerca de 5, cerca de 1 a cerca de 10, cerca de 1 a cerca de 20, cerca de 1 a cerca de 30, cerca de 1 a cerca de 40 ou cerca de 1 a cerca de 50 mg/ml de rCSP, cerca de 0,5 a cerca de 1,5 mM de MTG e cerca de 1% a cerca de 20% de arginina em 0,5 X ou 1 X PBS em um pH de cerca de 6,0 a cerca de 7,5, em que a rCSP é estavelmente mantida em uma temperatura de cerca de 3 °C a cerca de 25 °C, durante pelo menos cerca de 7 dias, pelo menos cerca de 8 dias, pelo menos cerca de 9 dias, pelo menoscercade10dias,pelomenoscercade11dias,pelo menoscercade12dias,pelomenoscercade13dias,pelo menoscercade14dias,pelomenoscercade15dias,pelo menoscercade16dias,pelomenoscercade17dias,pelo menoscercade18dias,pelomenoscercade19dias,pelo menoscercade20dias,pelomenoscercade21dias,pelo menoscercade22dias,pelomenoscercade23dias,pelo menoscercade24dias,pelomenoscercade25dias,pelo menoscercade30dias,pelomenoscercade60dias,pelo menoscercade70dias,pelomenoscercade80dias,pelo menoscercade90dias,pelomenoscercade6mesesoupelo menoscercade1ano.

[0070] 50. Um processo para manter estavelmente rCSP em uma formulação líquida estável, sendo que o processo compreende fornecer uma formulação que compreende cerca de 1 a cerca de 5, cerca de 1 a cerca de 10, cerca de 1 a cerca de 20, cerca de 1 a cerca de 30, cerca de 1 a cerca de 40 ou cerca de 1 a cerca de 50 mg/ml de rCSP, cerca de 0,5 a cerca de 1,5 mM de MTG e cerca de 10% a cerca de 20% de arginina em 1 X PBS em um pH de cerca de 6,4 a cerca de 7,2, em que a rCSP é estavelmente mantida em uma temperatura de cerca de 3 °C a cerca de 25 °C, durante pelo menos cerca de 7 dias, pelo menos cerca de 8 dias dias, pelo menos cerca de 9 dias, pelo menos cerca de 10 dias,pelomenoscercade11dias,pelomenoscercade12 dias,pelomenoscercade13dias,pelomenoscercade14 dias,pelomenoscercade15dias,pelomenoscercade16 dias,pelomenoscercade17dias,pelomenoscercade18 dias,pelomenoscercade19dias,pelomenoscercade20 dias,pelomenoscercade21dias,pelomenoscercade22 dias,pelomenoscercade23dias,pelomenoscercade24 dias,pelomenoscercade25dias,pelomenoscercade30 dias,pelomenoscercade60dias,pelomenoscercade70 dias,pelomenoscercade80dias,pelomenoscercade90 dias,pelomenoscercade6mesesoupelomenoscercade1 ano.

[0071] 51. Um processo para manter estavelmente a rCSP em uma formulação líquida estável, sendo que o processo compreende fornecer uma formulação que compreende cerca de 1 a cerca de 5, cerca de 1 a cerca de 10, cerca de 1 a cerca de 20, cerca de 1 a cerca de 30, cerca de 1 a cerca de 40 ou cerca de 1 a cerca de 50 mg/ml de rCSP, cerca de 0,5 a cerca de 1,5 mM de MTG e cerca de 10% a cerca de 20% de arginina em 1 X PBS em um pH de cerca de 6,4 a cerca de 7,0, em que a rCSP é estavelmente mantida em uma temperatura de cerca de 3 °C a cerca de 25 °C, durante pelo menos cerca de 7 dias, pelo menos cerca de 8 durantepelomenoscercade7dias,pelomenoscercade8 dias, pelo menos cerca de 9 dias, pelo menos cerca de 10 dias,pelomenoscercade11dias,pelomenoscercade12 dias,pelomenoscercade13dias,pelomenoscercade14 dias,pelomenoscercade15dias,pelomenoscercade16 dias,pelomenoscercade17dias,pelomenoscercade18 dias,pelomenoscercade19dias,pelomenoscercade20 dias,pelomenoscercade21dias,pelomenoscercade22 dias,pelomenoscercade23dias,pelomenoscercade24 dias,pelomenoscercade25dias,pelomenoscercade30dias,pelomenoscercade60dias,pelomenoscercade70 dias,pelomenoscercade80dias,pelomenoscercade90 dias,pelomenoscercade6mesesoupelomenoscercade1 ano.

[0072] 52. O processo, de acordo com qualquer um dentre 1 a 42, que compreende, adicionalmente, manter estavelmente a proteína circunsporozoíta de P. falciparum recombinante purificada em uma formulação líquida estável, sendo que o processo compreende fornecer uma formulação que compreende cerca de 1 a cerca de 5, cerca de 1 a cerca de 10, cerca de 1 a cerca de 20, cerca de 1 a cerca de 30, cerca de 1 a cerca de 40 ou cerca de 1 a cerca de 50 mg/ml de rCSP, cerca de 0,5 a cerca de 1,5 mM de MTG e cerca de 1% a cerca de 20% de arginina em 0,5 X ou 1 X PBS em um pH de cerca de 6,0 a cerca de 7,5, em que a rCSP é estavelmente mantida em uma temperatura de cerca de 3 °C a cerca de 25 °C, durante pelo menos cerca de 7 dias, pelo menos cerca de 8 dias, pelo menos cerca de 9 dias, pelo menoscercade10dias,pelomenoscercade11dias,pelo menoscercade12dias,pelomenoscercade13dias,pelo menoscercade14dias,pelomenoscercade15dias,pelo menoscercade16dias,pelomenoscercade17dias,pelo menoscercade18dias,pelomenoscercade19dias,pelo menoscercade20dias,pelomenoscercade21dias,pelo menoscercade22dias,pelomenoscercade23dias,pelo menoscercade24dias,pelomenoscercade25dias,pelo menoscercade30dias,pelomenoscercade60dias,pelo menoscercade70dias,pelomenoscercade80dias,pelo menoscercade90dias,pelomenoscercade6mesesoupelo menoscercade1ano.

[0073] 53. O processo, de acordo com 52, em que a formulação compreende cerca de 1,0 mM de MTG e cerca de 10% de arginina em 1 X PBS em um pH de cerca de 6,4 a 7,0, em que a rCSP é estavelmente mantida em uma temperatura de cerca de 7 dias, pelo menos cerca de 8 dias, pelo menos cerca de 9 dias, pelo menos cerca de 10 dias, pelo menos cercade11dias,pelomenoscercade12dias,pelomenos cercade13dias,pelomenoscercade14dias,pelomenos cercade15dias,pelomenoscercade16dias,pelomenos cercade17dias,pelomenoscercade18dias,pelomenos cercade19dias,pelomenoscercade20dias,pelomenos cercade21dias,pelomenoscercade22dias,pelomenos cercade23dias,pelomenoscercade24dias,pelomenos cercade25dias,pelomenoscercade30dias,pelomenos cercade60dias,pelomenoscercade70dias,pelomenos cercade80dias,pelomenoscercade90dias,pelomenos cercade6mesesoupelomenoscercade1ano.

[0074] 54. O processo, de acordo com qualquer um dentre 49 a 53, em que a manutenção estável da rCSP é indicada pela quantidade de rCSP total detectada, pela diferença percentual relativa em rCSP total quando comparado com um controle ou pela diferença percentual relativa em pureza de rCSP quando comparado com um controle.

[0075] 55. O processo, de acordo com 54, em que a manutenção estável da rCSP é indicada por uma quantidade de rCSP total detectada de cerca de 70% a cerca de 95%, por uma diferença percentual relativa em rCSP total ou uma diferença percentual relativa em pureza de rCSP de cerca de 15% a cerca de 5%, cerca de 14% a cerca de 4%, cerca de 13% a cerca de 3%, cerca de 12% a cerca de 2%, cercade12%acercade1%,cercade12%acercade0,5%, cercade12%acercade0%oucercade0%acercade2%, quandocomparadocomumcontrole.

[0076] 56. O processo, de acordo com 54 ou 55, em que a rCSP total é uma medição de monômero de rCSP.

[0077] 57. O processo, de acordo com qualquer um dentre 54 a 56, em que o controle é um ponto no tempo zero ou uma amostra armazenada a -80 °C.

[0078] 58. O processo, de acordo com qualquer um dentre 54 a 57, em que a quantidade de rCSP total

[0079] 59. O processo, de acordo com qualquer um dentre 1 a 42, que compreende congelar e descongelar o lisado antes da etapa (c).

INCORPORAÇÃO A TÍTULO DE REFERÊNCIA

[0080] Todas as publicações, patentes e pedidos de patente mencionados nesse relatório descritivo estão incorporados ao presente documento a título de referência com a mesma abrangência como se cada publicação, patente ou pedido de patente individual fosse indicado de forma específica e individual como incorporado a título de referência.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0081] Os recursos inovadores da invenção são apresentados com particularidade nas reivindicações anexadas. Um melhor entendimento dos recursos de vantagens da presente invenção será obtido com referência à seguinte descrição detalhada que apresenta modalidades ilustradas, nas quais os princípios da invenção são utilizados, e aos desenhos anexos.

[0082] Figura 1. Estrutura da proteína CSP de P. falciparum. O diagrama mostra os domínios na proteína apresentada em GenBank CAB38998, e as cisteínas (cada uma designada por C) nos resíduos 25, 334, 338, 369 e 374.

[0083] Figura 2. Sequências de aminoácidos de CSP de P. falciparum. A. Sequência de aminoácidos de Plasmodium falciparum 3D7 CS; entrada GenBank CAB38998 (SEQ ID NO: 1) com âncora GPI e suposto líder de secreção nativo. B. Sequência de aminoácidos de CSP citoplasmática (SEQ ID NO: 2) com a metionina N-terminal, e sem o líder nativo e âncora GPI, mostrado como um exemplo não limitador. C. Sequência de aminoácidos de CSP periplasmático (SEQ ID NO: 3) sem o líder nativo, metionina N-terminal e âncora GPI, mostrado como um exemplo não limitador.

[0084] Figura 3. Sequências de ácidos nucleicos de CSP de P. falciparum. A. A sequência de nucleotídeos de P. falciparum 3D7 CS; GenBank entrada XM_001351086.1 (SEQ ID NO: 4). B. Uma sequência de nucleotídeos otimizada (SEQ ID NO: 5) que codifica a sequência de aminoácidos de CSP de SEQ ID NO: 3 fundida a um líder de secreção periplasmático, mostrado como um exemplo não limitador. C. Uma sequência de nucleotídeos otimizada (SEQ ID NO: 6) que codifica CSP fundida a um líder de secreção periplasmático, mostrado como um exemplo não limitador.

[0085] Figura 4. Análise de RP-HPLC de dímero rCSP após a adição de Quantidades variadas de Redutor. A. Concentração de DTT de 0,5 mM, 0,1 mM, 0,03 mM e nenhum DTT. B. Concentração de DTT de 0,01 mM, 0, 003 mM e nenhum DTT .

[0086] Figura 5. Análise de RP-HPLC de rCSP desagregada. A. Tratamento com 2 M de ureia e quantidades variadas de DTT em pH 7,2. B. Tratamento com 2 M de ureia e quantidades variadas de DTT em pH 8,0.

[0087] Figura 6. Análise de RP-HPLC de rCSP Pré e Pós-Tratamento de redução branda e Troca de tampão final. A. Análise de RP-HPLC de lote 533-241 antes do tratamento de redução branda. B. Análise de RP-HPLC de lote 533-241 após o tratamento de redução branda e troca de tampão TFF final. C. RP-HPLC de padrão de referência interna 533-191.

[0088] Figura 7. Análise de SE-HPLC de rCSP Pós Tratamento de redução branda e Troca de tampão final. A. Análise de SE-HPLC de lote 533-241 após o tratamento de redução branda e troca de tampão TFF final. B. SE-HPLC de padrão de referência interna 533-191.

[0089] Figura 8. No Processo de detecção de RP-HPLC de forma dimérica de rCSP. A. Separação de dímero e monômero de rCSP por cromatografia de interação hidrofóbica. B. Análise de SDS-CGE (reduzida) de frações de rCSP de monômero e dímero. C. Análise de SDS-CGE (não reduzida) de frações de rCSP de monômero e dímero. D. Análise de RP-HPLC de agrupamentos de rCSP de monômero e dímero.

[0090] Figura 9. Método de HPLC de exclusão de tamanho com espalhamento de luz laser de ângulo múltiplo para rCSP. A. Cromatograma de SE-HPLC de padrão de referência interna rCSP (lote 533-191) com detecção de MALS. B. Cromatograma de SE-HPLC de padrão de albumina de soro bovino (BSA) com detecção de MALS.

[0091] Figura 10. Análise de HPLC de exclusão de tamanho de formas de dímero e agregadas de rCSP. A. Cromatograma de SE-HPLC de amostra de rCSP após a concentração centrífuga. B. Cromatograma de SE-HPLC de lote agregado 533-128.

[0092] Figura 11. Análise de interferometria de biocamada (BLI) de rCSP para ligação de heparina. A. Configuração de biossensor de heparina. B. Análise de BLI de ligação de heparina para diversas preparações de rCSP. C. Comparação de taxas de ligação de rCSP.

[0093] Figura 12. Análise de focalização isoelétrica capilar (cIEF) de rCSP. Amostras foram incubadas por 1 h na presença de 2 M de ureia e 10 mM de DTT e, então, concentração a ~1,5 mg/ml. A. Análise de referência interna de rCSP 533-191. B. Avaliação de precisão de cIEF; sobreposições de eletroferograma de cinco injeções repetidas de lote 533-191.

[0094] Figura 13. Análise de dicroísmo circular de UV distante de rCSP. Instrumente: JASCO 815; Temperatura = 20 °C; Velocidade de varredura = 100 nm/min.; D.I.T. = 1 s; Distância entre dados = 1 nm; Acumulações = 5. A. Espectro CD de padrão de referência interna 533-191. B. Análise de software: Espectro de entrada versus espectro previsto.

[0095] Figura 14. Análise de massa intata da preparação 533-191 por LC-MS, reduzida (A-C) e não reduzida (D-F) . A. Cromatogramas (UV, painel superior; e MS TIC (corrente iônica total de espectros de massa, painel inferior)) da amostra reduzida. B. Os espectros de massa somados a partir da região pico alvo de 18,1 min. C. Espectro desconvolucionado derivado a partir dos espectros de massa somados da região de 18,1 min. D. Cromatogramas da amostra não reduzida. E. Os espectros de massa somados a partir da região de pico alvo de 17,8 min. F. Espectro desconvolucionado derivado a partir dos espectros de massa somados da região de 17,8 min. A diferença entre o MW observado e teórico (MW delta) foi de 1 e 4 Da para as amostras reduzidas e não reduzidas, respectivamente.

[0096] Figura 15. Análise de massa intata de Amostras 533 alquiladas por LC-MS. Espectros desconvolucionados para amostras alquiladas são mostrados. A. 533-191 não reduzida alquilada foi observada tendo um delta de 6, 0 Da comparado com o MW teórico de 533 com uma alquilação de cisteína. B. 533-191 alquilada e reduzida foi observada tendo um delta de 3,9 Da comparado com o MW teórico de 533 com cinco alquilações de cisteína. Houve uma espécie adicional que se correlaciona com 533 contendo quatro alquilações de cisteína e estava presente em ~43% de abundância total. Essa observação foi provavelmente devido à alquilação incompleta.

[0097] Figura 16. Análise da Cisteína N- terminal de 533-191 por digestão de Glu-C não reduzida seguida de LC-MS/MS. A. Os dados resultantes foram processados com BiopharmaLynx, conforme descrito na seção de métodos. Uma ampliação em parte de um cromatograma de MS centroide mostra a identificação do peptídeo de Glu-C E2* (contendo a primeira cisteína mais N-terminal N-terminal C1) (SEQ ID NO: 110) e que é alquilado (denotado por *). B. Uma ampliação em parte diferente do cromatograma de MS centroide mostra a identificação do dipeptídeo E1-E2:E1-E2 ligado por dissulfeto gerado por Glu-C (sequência de núcleo revelada como SEQ ID NO: 111). E1-E2 significa uma clivagem perdida em um resíduo de ácido glutâmico dentro do peptídeo.

[0098] Figura 17. Mapeamento de peptídeo de 533-128 alquilada e reduzida. A. Cobertura de sequência (SEQ ID NO: 3) (75,4%) para a análise de BiopharmaLynx do digesto de Asp-N. B. Cobertura de sequência (SEQ ID NO: 3) (56,9%) para a análise de BiopharmaLynx do digesto de tripsina. Os aminoácidos em texto roxo indicam a identificação. O texto cinza claro indica nenhuma identificação. As cisteínas realçadas com turquesa indicam resíduos alquilados de cisteína in vitro identificados. Resíduos N/Q realçados com amarelo indicam desamidações identificadas. Essas desamidações foram pesquisadas de maneira variável, desse modo, a identificação sozinha não indica em qual nível cada um desses resíduos é desamidado. Algumas podem ser, na realidade, identificações falsas e a análise adicional é exigida para confirmar essas desamidações. C. Cromatograma de LC-MS que mostra os picos associados aos peptídeos identificados para o digesto de Asp-N. D. Cromatograma de LC-MS que mostra os picos associados aos peptídeos identificados para o digesto de Asp-N.

[0099] Figura 18. Identificação Manual de Peptídeos grandes não identificados pelo Software BiopharmaLynx. Os espectros de MS a partir dos respectivos picos foram somados e desconvolucionado com o uso de MaxEnt1. A. Os espectros desconvolucionados a partir do pico de 29,1 min. Para o peptídeo 179-267 (a.a.), o MW observado foi de 0,9 Da a partir do MW teórico (8.971,15 Da). B. Os espectros desconvolucionados a partir do pico de 30,5 min. Para o peptídeo 107-178 (aa), o MW observado foi de 3,8 Da a partir do MW teórico (7.178,19 Da).

[0100] Figura 19. Cromatografia TMAE HiCap para lote 533-406. A. Cromatograma e condições de execução de coluna. B. Análise de imagem semelhante a gel de SDS-CGE de frações.

[0101] Figura 20. Cromatografia TMAE HiCap para lote 533-407. A. Cromatograma e condições de execução de coluna. B. Análise de imagem semelhante a gel de SDS-CGE de frações.

[0102] Figura 21. Cromatografia de HA cerâmica Tipo I para lote 533-406. A. Cromatograma e condições de execução de coluna. B. Análise de imagem semelhante a gel de SDS-CGE de frações.

[0103] Figura 22. Cromatografia de HA cerâmica Tipo I para lote 533-407. A. Cromatograma e condições de execução de coluna. B. Análise de imagem semelhante a gel de SDS-CGE de frações.

[0104] Figura 23. SDS-PAGE de Execuções de Purificação integradas. Os lotes de CSP recombinante 533-406 e 533-407 foram analisados por SDS-PAGE com o uso de um gel de Bis-Tris a 10% com tampão MOPS; MW = marcadores de peso molecular; L = carga de coluna; Elut = amostra de eluição de coluna; Final = rCSP purificada final.

[0105] Figura 24. Análise de Western Blot de Execuções de Purificação integradas. CSP recombinante, lote 533-406, 533-407 e 533-191 analisados por Western blot com o uso de anticorpo 4C2 específico de conformação.

[0106] Figura 25. Análise de HPLC de exclusão de tamanho de rCSP. A. Cromatograma de SE-HPLC de lote de rCSP 533-406. B. Cromatograma de SE-HPLC de lote de rCSP 533-407. C. Cromatograma de SE-HPLC de referência de rCSP 533-191.

[0107] Figura 26. Análise de RP-HPLC de rCSP. A. Cromatograma de RP-HPLC de lote de rCSP 533-406. B. Cromatograma de RP-HPLC de lote de rCSP 533-407. C. Cromatograma de RP-HPLC de referência de rCSP 533-191.

[0108] Figura 27. Análise de massa inata de rCSP. A. Espectro desconvolucionado de lote de rCSP 533-406. B. Espectro desconvolucionado de lote de rCSP 533-407. C. Espectro desconvolucionado de referência de rCSP 533191.

[0109] Figura 28. Análise de mapeamento de Peptídeo de rCSP. A. Mapa de peptídeo de LC/MS GluC de lote de rCSP 533-406. B. Mapa de peptídeo de LC/MS GluC de lote de rCSP 533-407. C. Mapa de peptídeo de LC/MS GluC de referência de rCSP 533-191.

[0110] Figura 29. Análise de focalização isoelétrica capilar (cIEF) de rCSP. A. Análise de cIEF de lote de rCSP 533-406. B. Análise de cIEF de lote de rCSP 533-407. C. Análise de cIEF de referência de rCSP 533-191.

[0111] Figura 30. Análise de dicroísmo circular de UV distante de rCSP e Análise de fluorescência intrínseca de rCSP. A. Análise de dicroísmo circular de UV distante de rCSP. Instrumento: JASCO 815; Temperatura = 20 °C; Velocidade de varredura = 100 nm/min.; D.I.T. = 1 s; Distância entre dados =0,1 nm; Acumulações = 5; espectros de CD de 533-191 (referência interna), 533-406, e 533-407 conforme indicado. B. Análise de fluorescência intrínseca de rCSP. Modo de medição: Em.Spectrum; Sensibilidade = 740 V; D.I.T.= 1 s; Largura de banda (Ex)= 2,00 nm; Largura de banda (Em)= 10 nm; Ex. Comprimento de onda = 280 nm; Faixa de medição = 295 a 395 nm; Distância entre dados = 1 nm; Controle de obturador = Auto; Detector de CD = PMT; Acumulações = 3; Solvente = PBS; Concentração 166 (peso por volume)%; Aumento de temperatura 20 °C. Suavização de Savitzky-Golay com uma largura de convolução de 25 foi aplicada aos espectros. Espectros de fluorescência de 533191 (referência interna), 533-406 e 533-407 conforme indicado.

[0112] Figura 31. Análise de RP-HPLC de rCSP. RP-HPLC de 1 mg/ml de rCSP a 4 °C, pH 7,5, no Tempo 0 indicando picos do Grupo 1 a 3. pE = ombro contendo piroglutamato.

[0113] Figura 32. Efeito de tempo de retenção pós-congelamento sobre espécies de alto peso molecular. Os filtrados de volume congelados e descongelados a partir da pasta da execução de engenharia 1 e pasta do ensaio ininterrupto do processo estavam mostrando efeito sobre encadeamento de tempo de retenção pós-congelamento- descongelmento (T). A. Amostras não retidas pós- descongelamento (T = 0). "Encadeamento" de espécies de alto peso molecular indicada por três setas superiores. rCSP indicada pela seta inferior. B. Amostras retidas em temperatura ambiente por 2,5 horas pós-congelamento (T = 2,5). C. Amostras retidas em temperatura ambiente por 6 horas pós-descongelamento (T = 6). Todos os painéis: Via 1 = marcadores de MW; Via 2 = PRT (-252) filtração pré-2 μm; Via 3 = PRT (-445) filtração pós-2 μm; Via 3 = ER1 (-445) filtração pós 2-μm.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0114] A presente invenção fornece um processo inovador escalonável para a purificação de proteína circunsporozoíta de P. falciparum recombinante (CSP) . Nos métodos da presente invenção, rCSP é obtida em altos rendimentos sem a necessidade pela desnaturação e reenovelamento da proteína. Essa realização é significativa por pelo menos as razões seguintes: a CSP de comprimento total tende a formar dímeros e agregados maiores, e a N- terminação de monômero de CSP é frequentemente degradada. A dimerização está associada à presença de um resíduo de cisteína não pareado próximo à N-terminação do monômero. As tentativas anteriores para eliminar o dímero exigiram o mesmo ou desnaturação e reenovelamento da proteína. Os métodos da presente invenção superam os obstáculos acima com o uso de um processo inovador que faz uso de CSP dimerizada, sem a necessidade por desnaturação e reenovelamento. Nos presentes métodos, o dímero de CSP é purificado sob condições de não desnaturação, então, submetido a condições de redução preferencial inovadoras. Essas condições de redução preferencial reduzem as ligações de dissulfeto intermoleculares para separar os monômeros, enquanto que conserva as ligações de dissulfeto intramoleculares de cada monômero. Portanto, o reenovelamento não é necessário e o resultado é vastamente aumentado devido ao dímero que de outro modo seria descartado. Uma vantagem notável do método reivindicado é que o monômero de CSP obtido a partir da rCSP que foi mantida como um dímero durante a purificação não é degradado na N-terminação. Portanto, tanto a qualidade como a quantidade da rCSP purificada é vastamente aperfeiçoada pela presente invenção.

[0115] Nas modalidades, o processo de purificação da presente invenção compreende:

[0116] 1) Obter uma preparação de lisado de célula bacteriana, em que a preparação de lisado de célula bacteriana compreende dímeros de rCSP;

[0117] 2) Purificar os dímeros de rCSP; e

[0118] 3) Submeter os dímeros de rCSP purificados a condições de redução preferencial,

[0119] obtendo, assim, a rCSP de alta qualidade.

[0120] Conforme descrito, as condições de redução preferencial reduzem as ligações de dissulfeto intramoleculares para separar os monômeros, enquanto que conserva as ligações de dissulfeto intramoleculares de cada monômero.

[0121] Nas modalidades, o processo de purificação compreende a purificação adicional dos monômeros de rCSP separados. Nas modalidades, as proteínas de célula hospedeira são removidas a partir dos monômeros de rCSP por cromatografia, por exemplo, cromatografia de interação hidrofóbica.

[0122] Nas modalidades, o processo de purificação compreende, adicionalmente, remover agentes redutores introduzidos pelas condições de redução preferencial por troca de tampão. Nessas modalidades, o monômero de rCSP não degradado obtido não é agregado.

[0123] Em modalidades específicas, a etapa de purificação compreende:

[0124] a) Separação da preparação de lisado de célula em uma fração solúvel e insolúvel, em que a fração solúvel compreende dímeros de rCSP; e

[0125] b) Separação dos dímeros de rCSP na fração solúvel a partir de proteínas de célula hospedeira.

[0126] Nas modalidades, a invenção fornece, adicionalmente, métodos para remover agentes redutores, agentes desagregantes e/ou outros reagentes indesejados após a etapa de redução preferencial, sem resultar na formação de agregados de HMW de rCSP.

[0127] A presente invenção também fornece formulações líquidas estáveis de rCSP, que incluem formulações líquidas estáveis de rCSP de alta concentração.

EXPRESSÃO DE PROTEÍNA CIRCUNSPOROZOÍTA DE P. FALCIPARUM PROTEÍNA CIRCUNSPOROZOÍTA DE P. FALCIPARUM

[0128] A proteína circunsporozoíta de P. falciparum (CSP) é um monômero composto de três regiões principais: uma terminação N que liga proteoglicanos de sulfato de heparina, uma região de repetição de quatro aminoácidos (NANP) e um domínio de repetição do tipo I semelhante à trombospondina na parte C-terminal da proteína (Figura 1). Os estudos estruturais indicam que a região de repetição forma uma estrutura semelhante à haste de cerca de 21 a 25 nm de comprimento e 1,5 nm de largura (Plassmeyer, et al., 25 de setembro de 2009, J. Biol. Chem., volume 284, no 39: 26951 a 26963, incorporado ao presente documento a título de referência).

[0129] As sequências de nucleotídeos e aminoácidos de CSP são apresentadas no presente documento em SEQ ID NOS: 1 a 6, e na literatura publicada, por exemplo, nos números de acesso GenBank CAB38998 (proteína) e XM_001351086.1 (nucleotídeo); por Hall, N., et al., 2002, Nature 419(6906), 527 a 531; e na patente no U.S. 7.722.889, “Plasmodium liver stage antigens”, todos incorporados ao presente documento a título de referência. Uma série de polimorfismos de CSP que têm sequências muito similares e os mesmos recursos estruturais, conforme descrito acima, e, por exemplo, por Plassmeyer, et al., 2009, tem sido identificada.

[0130] A CSP direcionada ao desenvolvimento de vacina tem se concentrado na região de repetição central que contém epítopos de célula B e na C-terminação que contém o domínio TSR, epítopos de célula T e epítopos de célula B (Plassmeyer, et al., 2009, e Rathore e McCutchan, 2000, Proc. Nat. Acad. Sci. volume 97, no 15: 8530 a 8535). A região N-terminal tem sido agora mostrada desempenhar um papel na imunogenicidade e fixação de célula hepática, e conter um epítopo que interage com as células hepáticas através de sulfato de heparina. Descobriu-se que os anticorpos elevados ao epítopo de região N-terminal são inibitórios em um ensaio de invasão de esporozoíta. (Consulte, por exemplo: Plassmeyer, et al., 2009; Ancsin e Kisilevsky, 2004, J. Biol. Chem. 279: 21824 a 21832; Rathore, et al., 2005, J. Biol. Chem. 280: 20524 a 20529; e Rathore, et al., 2002, J. Biol. Chem. 277: 7092 a 7098.) Rathore, et al., 2002 relatou o envolvimento de resíduos de aminoácido 28 a 33 na ligação de receptor, e o reconhecimento de resíduos 65 a 110, os quais formam potencialmente um epítopo de célula T, foi relatado por Bongfen, et al., 2009 (Vaccine 27(2):328 a 335) como protetor contra doença. Portanto, é uma prioridade obter CSP que tem a região N-terminal para uso em pesquisa e produção de vacina.

[0131] A CSP tem cinco resíduos de cisteína. Um resíduo de cisteína fica localizado próximo à N- terminação, na posição 25 da sequência de aminoácidos de comprimento total (a qual inclui o líder), conforme mostrado nas Figuras 1 e 2A. Nas sequências sem o líder mostrada nas Figuras 2B e 2C, essa cisteína fica nas posições 25, 6 e 5, respectivamente, as quais podem ser mencionadas como "C25" ou "Cys 25”, "C6" ou "Cys 6”, ou "C5" ou "Cys 5”. A Cys 25 está envolvida na ligação de dissulfeto entre monômeros de CSP que produz dímeros de CSP. Tipicamente, em esquemas de purificação de CSP sem desnaturação, os dímeros compreendem uma grande parte da rCSP. Os dímeros têm sido anteriormente observados como presentes em até cerca de 40 por cento da CSP medida em lisado bacteriano recombinante.

[0132] A região N-terminal de CSP é suscetível ao corte em vários sítios específicos, que incluem dois sítios principais. Dependendo da numeração usada, um sítio principal de proteólise ocorre entre C5 e Y6, resultando na remoção de resíduos 1 a 5 (com referência à numeração em SEQ ID NO: 3 na Figura 2C), entre C25 e Y26 resultando na remoção de resíduos 1 a 25 (com referência à numeração em SEQ ID NO: 1 na Figura 2A) ou entre C6 e Y7 resultando na remoção de resíduos 1 a 6 (com referência à numeração em SEQ ID NO: 2 na Figura 2B). O segundo sítio principal está entre V14 e L15, resultando na remoção de resíduos 1 a 14 (com referência à numeração em SEQ ID NO: 3 na Figura 2C), entre V34 e L35 resultando na remoção de resíduos 1 a 34 (com referência à numeração em SEQ ID NO: 1 na Figura 2A) ou entre V15 e L16 resultando na remoção de resíduos 1 a 15 (com referência à numeração em SEQ ID NO: 2 na Figura 2B). Em preparações em que um alto nível de corte é observado, o corte adicional é indicado entre os resíduos N29/E30 e S44/L45 (com referência à numeração em SEQ ID NO: 3 na Figura 2C).

[0133] "Degradação" ou "proteólise" na N- terminação se refere à degradação não específica, assim como corte específico. A degradação e proteólise podem produzir espécies indesejáveis de rCSP. A CSP que é não cortada, não degradada ou não proteolizada na região N- terminal até um determinado resíduo é mencionada no presente documento como sento intata para o resíduo mais N- terminal presente. Por exemplo, uma espécie de CSP que é cortada ou degradada de maneira não específica para remover os resíduos 1, 2 e 3, e inclui o resíduo 4, é mencionada como sendo degradada para resíduo 4 e intata para o resíduo 4. Como um exemplo específico, acredita-se que uma espécie que é degradada para o resíduo Glutamina 4 (Q4) e inclui o resíduo Q4 seja degradada para o resíduo Q4 e intata a partir do resíduo Q4. Nas modalidades da presente invenção, não mais que 10% da rCSP purificada obtida é degradada para um resíduo especificado, por exemplo, um resíduo selecionado a partir dos resíduos 2 a 50. Nas modalidades relacionadas, pelo menos 90% da rCSP purificada é intata para um resíduo selecionado a partir dos resíduos 1 a 50. Nas modalidades da presente invenção, não mais que 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% ou nada da rCSP purificada obtida após qualquer determinada etapa de purificação, por exemplo, após HIC, ou na preparação de rCSP final, é degradada, cortada ou proteolizada a um aminoácido selecionado a partir dos resíduos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 e 50. Nas modalidades, pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% da rCSP purificada obtida é intata para um aminoácido selecionado a partir de resíduos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 e 50.

[0134] A região C-terminal, a qual contém a repetição do tipo I semelhante à trombospondina (TSR), tem quatro resíduos de cisteína. (Consulte, por exemplo, números de posição 315, 319, 350 e 355 da sequência de CSP da Figura 2A, posições 334, 338, 369 e 374 da sequência completa da Figura 2A, posições 315, 319, 350 e 355 da Figura 2B e posições 314, 318, 349 e 354 da Figura 2C). As ligações de dissulfeto se formam entre C314 e C349, e C318 e C354 com o uso da numeração na Figura 3C, ou entre C315 e C350, e C319 e C355 com o uso da numeração na Figura 3B. A ruptura da ligação de dissulfeto entre os resíduos de cisteína da região C-terminal foi relatada como afetando a ligação de CSP a células HepG2 alvo (Rathore, D., e McCutchan, T., 2000, Proc. Nat. Acad. Sci. volume 97, no 15: 8530 a 8535) . Os esquemas de purificação que exigem a desnaturação e reenovelamento da proporção substancial de rCSP dimerizada ou agregada tipicamente obtida enfrentam o desafio de restaurar a ligação de dissulfeto adequada na região C-terminal (ligações de dissulfeto intatas).

[0135] Nos métodos da presente invenção, o dímero de CSP indesejável é reduzido de forma preferencial para gerar monômero de CSP, sem a desnaturação da proteína. Nas modalidades da presente invenção, a rCSP purificada não desnaturada obtida compreende menos que cerca de 5% de CSP com ligação de dissulfeto inadequada. A ligação de dissulfeto inadequada ocorre quando uma ou ambas as duras ligações de dissulfeto na região C-terminal é adequadamente pareada (por exemplo, uma cisteína é pareada com a cisteína inadequada pode ser avaliada com o uso de qualquer método conhecido por aqueles elementos versados na técnica ou descrito no presente documento.

[0136] Nas modalidades, a rCSP purificada obtida após qualquer determinada etapa de purificação, por exemplo, após HIC, ou na preparação de rCSP final, compreende menos que cerca de 10%, menos que cerca de 9%, menos que cerca de 8%, menos que cerca de 7%, menos que cerca de 6%, menos que cerca de 5%, menos que cerca de 4%, menos que cerca de 3%, menos que cerca de 2% ou menos que cerca de 1% de rCSP desnaturada, por exemplo, com ligação de dissulfeto inadequada. A ligação de dissulfeto inadequada é identificada quando pelo menos uma dentre as duas ligações de dissulfeto nativas na região C-terminal é pareada de modo errado ou não pareada. Nas modalidades, pelo menos cerca de 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%, respectivamente, da rCSP purificada tem ligações de dissulfeto inatas.

[0137] A Figura 2A mostra a proteína de comprimento total conforme fornecido em GenBank CAB38998, que compreende o suposto peptídeo de sinal secretório nativo (não presente na forma madura da proteína) e a região de âncora GPI. Nas modalidades, a rCSP purificada obtida com o uso dos métodos da presente invenção não compreende a âncora GPI. De acordo com Ophorst, et al., a deleção da região de âncora GPI aperfeiçoa a imunogenicidade de CSP de P. falciparum sem alterar a expressão ou secreção da proteína (Ophorst, et al., 9 de fevereiro de 2007, Vaccine 25(8): 1426 a 1436). Nas modalidades, a região de âncora GPI está incluída. Nas modalidades, a região de âncora GPI é truncada, isto é, parte da mesma está presente. Os exemplos de sequências de aminoácidos de CSP contempladas para a purificação com o uso dos métodos da presente invenção são mostrados na Figura 2B e 2C. A Figura 2B descreve uma espécie citoplasmática que tem a metionina N-terminal em adição aos aminoácidos 21 a 382 de GenBank CAB38998. A Figura 2C descreve a espécie periplasmática que corresponde à espécie na Figura 2B, que também compreende os aminoácidos 21 a 382 de GenBank CAB38998. Nas modalidades, um líder de secreção é fundido à N-terminação da proteína para a secreção periplasmática da CSP.

[0138] A CSP da Figura 2A é um monômero de 397 aminoácidos de comprimento, que tem um peso molecular de cerca de 42,6 kDa e um ponto isoelétrico de 5,37. A forma madura (isto é, sem o líder de secreção, aminoácidos 1 a 20) da Figura 2C é uma proteína que tem um peso molecular de cerca de 38,7 kDa e um ponto isoelétrico de 5,21. O peso molecular foi observado como sendo de 38725,0 Da quando completamente reduzido e 38721,0 Da quando não reduzido (com duas ligações de dissulfeto intramoleculares nativas). MODIFICAÇÕES E VARIANTES DE CSP

[0139] Conforme descrito, os métodos da presente invenção superam os obstáculos para a purificação de rCSP encontrados anteriormente, que incluem a tendência da rCSP dimerizar e agregar devido à presença de uma cisteína não pareada na região N-terminal da proteína.

[0140] Nas modalidades, os métodos da invenção são usados para purificar qualquer modificação ou variante de sequência de CSP. Nas modalidades, a purificação de qualquer polimorfo ou variante de CSP é contemplada, desde que o mesmo dimerize devido às interações entre monômeros que envolvem um resíduo de tiol não pareado, por exemplo, cisteína, na região N-terminal da proteína. Os polimorfismos de CSP têm sido descritos por, por exemplo, Rathore, et al., 2005, mencionado acima, e Anders, et al., 1989, Polymorphic antigens in Plasmodium falciparum", Blood 74: 1865. As sequências reveladas na literatura publicada incluem, por exemplo, as sequências de proteína no no de acesso GenBank AAA29555, AAN87594, AAA29554.1, AAA29524.1, AAA63421.1 ACO49545.1 e AAA63422.1.

[0141] Nas modalidades, as modificações ou variantes de dimerização de CSP que pode ser purificada com o uso dos métodos da presente invenção compreendem um resíduo de tiol não pareado na região N-terminal, e um epítopo de região N-terminal nas posições 93 a 113, conforme descrito por Rathore, et al., 2005 (numeração conforme usado no relatório). Nas modalidades relacionadas, essas modificações ou variantes de dimerização de CSP compreendem um resíduo de tiol não pareado na região N- terminal, e a sequência de epítopo de região N-terminal ENDDGNNEDNEKLRKPKHKKL (SEQ ID NO: 7) ou DKRDGNNEDNEKLRKPKHKKL (SEQ ID NO: 8).

[0142] A invenção contempla a purificação de modificações de rCSP manipuladas por engenharia, assim como os polimorfismos de ocorrência natural. As modificações incluem substituições, inserções, prolongamentos, deleções e derivações, sozinhos ou em combinação. Nas modalidades, a rCSP pode incluir uma ou mais modificações de um resíduo de aminoácido não essencial. Um resíduo de aminoácido não essencial é um resíduo que pode ser alterado, por exemplo, deletado ou substituído, na sequência de aminoácidos inovadora sem abolir ou reduzir substancialmente a atividade ou função da proteína, por exemplo, a imunogenicidade da proteína ou sua capacidade de se ligar a um anticorpo específico. Nas modalidades, a rCSP pode incluir uma ou mais modificações de um resíduo de aminoácido essencial. Um resíduo de aminoácido essencial é um resíduo que quando alterado, por exemplo, deletado ou substituído, na sequência de aminoácidos inovadora, a atividade do peptídeo de referência é substancialmente reduzida ou abolida. As substituições, inserções e deleções podem ser em qualquer região da rCSP. Por exemplo, a rCSP pode incluir 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais substituições, ambas de uma maneira consecutiva ou espaçada por toda a molécula. Sozinha ou em combinação com as substituições, a rCSP pode incluir 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais inserções, novamente de maneira consecutiva ou espaçada por toda a molécula do peptídeo. A rCSP, sozinha ou em combinação com as substituições e/ou inserções, pode incluir 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais deleções, novamente de maneira consecutiva ou espaçada por toda a molécula do peptídeo. A rCSP, sozinha ou em combinação com as substituições, inserções e/ou deleções, pode incluir 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais adições de aminoácido.

[0143] As substituições incluem substituições de aminoácido conservadoras. Uma substituição de aminoácido conservadora é aquela em que o resíduo de aminoácido é substituído por um resíduo de aminoácido que tem uma cadeia lateral similar, ou características fisioquímicas similares (por exemplo, recursos eletrostáticos, ligação de hidrogênio, isostéricos, hidrofóbicos). Os aminoácidos podem ser de ocorrência natural ou não natural. As famílias de resíduos de aminoácido que têm cadeias laterais similares são conhecidas na técnica. Essas famílias incluem aminoácidos com cadeias laterais básicas (por exemplo, lisina, arginina, histidina), cadeias laterais ácidas (por exemplo, ácido aspártico, ácido glutâmico), cadeias laterais polares não carregadas (por exemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, metionina, cisteína), cadeias laterais não polares (por exemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, triptofano), cadeias laterais .beta.- ramificadas (por exemplo, treonina, valina, isoleucina) e cadeias laterais aromáticas (por exemplo, tirosina, fenilalanina, triptofano, histidina). As substituições também podem incluir mudanças não conservativas.

[0144] Os termos "aminoácido" ou “resíduo de aminoácido” se referem a aminoácidos naturais, aminoácidos não naturais e aminoácidos modificados. Exceto onde especificado em contrário, a referência a um aminoácido inclui a referência tanto aos estereoisômeros D e L se sua estrutura permitir tais formas estereoisoméricas. Os aminoácidos naturais incluem alanina (Ala), arginina (Arg), asparagina (Asn), ácido aspártico (Asp), cisteína (Cys), glutamina (Gln), ácido glutâmico (Glu), glicina (Gly), histidina (His), isoleucina (Ile), leucina (Leu), Lisina (Lys), metionina (Met), fenilalanina (Phe), prolina (Pro), serina (Ser), treonina (Thr), triptofano (Trp), tirosina (Tyr) e valina (Val). Os aminoácidos não naturais incluem, porém sem limitação, homolisina, homoarginina, homoserina, ácido azetidinacarboxíico, ácido 2-aminoadípico, ácido 3- aminoadípico, beta-alanina, ácido aminopropiônico, ácido 2- aminobutírico, ácido 4-aminobutírico, ácido 6- aminocaproico, ácido 2-aminoheptanoico, ácido 2- aminoisobutírico, ácido 3-aminoisbutírico, ácido 2- aminopimélico, terciária-butilglicina, ácido 2,4- diaminoisobutírico, desmosina, ácido 2,2'-diaminopimélico, ácido 2,3-diaminopropiônico, N-etilglicina, N- etilasparagina, homoprolina, hidroxilisina, alo- hidroxilisina, 3-hidroxiprolina, 4-hidroxiprolina, isodesmosina, alo-isoleucina, N-metilalanina, N- metilglicina, N-metilisoleucina, N-metilpentilglicina, N- metilvalina, naftalanina, norvalina, norleucina, ornitina, pentilglicina, ácido pipecólico, piroglutamato e tioprolina. Os aminoácidos não naturais adicionais incluem resíduos de aminoácido modificados que são quimicamente bloqueados, de maneira reversível ou irreversível, ou quimicamente modificados em seu grupo amino N-terminal ou seus grupos de cadeia lateral como, por exemplo, resíduos ou aminoácidos D e L N-metilados ou em que os grupos funcionais de cadeia lateral são quimicamente modificados para outro grupo funcional. Por exemplo, os aminoácidos modificados incluem sulfóxido de metionina; sulfona de metionina; ácido aspártico-(beta-metil éster), um aminoácido modificado de ácido aspártico; N-etilglicina, um aminoácido modificado de glicina; ou carboxamida de alanina, um aminoácido modificado de alanina. Os resíduos adicionais que podem ser incorporados são descritos em Sandberg et al. (1998) J. Med. Chem. 41:2481 a 2491.

[0145] A identidade de sequência, conforme é compreendido na técnica, é uma relação entre duas ou mais sequências de polipeptídeos ou duas ou mais sequências de polinucleotídeos, conforme determinado pela comparação das sequências. Na técnica, a identidade também se refere ao grau de relação de sequência entre sequências de polipeptídeos ou polinucleotídeos, conforme determinado pela correspondência entre séries de tais sequências. A identidade pode ser calculada por métodos conhecidos que incluem, porém sem limitação, aqueles descritos em Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ed., Oxford University Press, Nova Iorque (1988); Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, Nova Iorque, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Parte I, Griffin, A. M. e Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey (1994); Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press (1987); Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. e Devereux, J., eds., Stockton Press, Nova Iorque (1991); e Carillo, H., e Lipman, D., SIAM J Applied Math, 48:1073 (1988). Os métodos para determinar a identidade são projetados para gerar a maior correspondência entre as sequências testadas. Além disso, os métodos para determinar a identidade são codificados em programas disponíveis publicamente. Os programas de computador que podem ser usados para determinar a identidade entre duas sequências incluem, porém sem limitação, GCG (Devereux et al. (1984) Nucleic Acids Research 12:387; conjunto de cinco programas BLAST, três projetados para consultas de sequências de nucleotídeos (BLASTN, BLASTX e TBLASTX) e dois projetados para consultas de sequência de proteína (BLASTP e TBLASTN) (Coulson (1994) Trends in Biotechnology 12:76 a 80; Birren et al. (1997) Genome Analysis 1:543 a 559) . O programa BLAST X está disponível publicamente junto a NCBI e outras fontes (BLAST Manual, Altschul, S., et al., NCBI NLM NIH, Bethesda, Md. 20894; Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403 a 410). O algoritmo Smith Waterman também pode ser usado para determinar a identidade.

[0146] Nas modalidades, uma rCSP variante tem uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 91%, pelo menos cerca de 92%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 94%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98% ou pelo menos cerca de 99% idêntica à sequência conforme apresentado em SEQ ID NO: 1 (mostrada na Figura 2A), SEQ ID NO: 2 (mostrada na Figura 2B) ou SEQ ID NO: 3 (mostrada na Figura 2C) . Nas modalidades, a rCSP variante é codificada por uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 86%, pelo menos cerca de 87%, pelo menos cerca de 88%, pelo menos cerca de 89%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 91%, pelo menos cerca de 92%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 94%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98% ou pelo menos cerca de 99% idêntica à sequência conforme apresentado em SEQ ID NO: 4 (mostrada na Figura 3A) ou SEQ ID NO: 5 (mostrada na Figura 3B).

EXPRESSÃO DE PROTEÍNA CIRCUNSPOROZOÍTA DE P. FALCIPARUM

[0147] Os métodos da presente invenção contemplam a purificação de proteína circunsporozoíta de P. falciparum recombinante produzida em um sistema de superexpressão bacteriana. Os métodos para clonar um gene que codifica uma proteína recombinante em um vetor de expressão, transformar uma célula hospedeira bacteriana com o vetor de expressão e cultivar as células hospedeiras transformadas sob condições adequadas para expressar CSP recombinante, são suficientemente abrangidos pelo conhecimento daqueles versados na técnica. Os métodos adequados também são descritos no presente documento e têm sido descritos na literatura.

[0148] Os métodos para a expressão de proteínas heterólogas, que incluem sequências reguladoras úteis (por exemplo, promotores, líderes de secreção e sítios de ligação de ribossoma), em células hospedeiras de Pseudomonas, assim como outras células hospedeiras úteis nos métodos da presente invenção, são descritos, por exemplo, na publicação do pedido de patente no U.S. 2008/0269070 e 2010/0137162, ambos intitulados “Method for Rapidly Screening Microbial Hosts to Identify Certain Strains with Improved Yield and/or Quality in the Expression of Heterologous Proteins”, publicação do pedido de patente no U.S. 2006/0040352, “Expression of Mammalian Proteins in Pseudomonas Fluorescens” e publicação do pedido de patente no U.S. 2006/0110747, “Process for Improved Protein Expression by Strain Engineering”, todas incorporadas ao presente documento a título de referência, em suas totalidades. Essas publicações também descrevem cepas hospedeiras bacterianas úteis na prática dos métodos da invenção, em que as cepas hospedeiras têm sido manipuladas para superexpressar moduladores de enovelamento ou em que as mutações de protease têm sido introduzidos, a fim de aumentar a expressão de proteína heteróloga.

ELEMENTOS REGULADORES

[0149] Um constructo de expressão útil na prática dos métodos da presente invenção pode incluir, em adição à sequência de codificação de proteína, qualquer um dentre os seguintes elementos reguladores ligados de maneira operável à mesma: um promotor, um sítio de ligação de ribossoma (RBS), um terminador de transcrição e sinais de parada e início traducional, sequências intensificadoras transcricionais, sequências intensificadoras traducionais, outros promotores, ativadores, reguladores cistrônicos, reguladores policistrônicos, sequências de etiqueta, tais como sequências de codificação de polipeptídeo de "etiquetas" e "etiqueta" de sequência de nucleotídeos, as quais facilitam a identificação, separação, purificação e/ou isolamento de um polipeptídeo expressado.

[0150] Os RBSs úteis podem ser obtidos a partir de qualquer um dentre as espécies úteis como células hospedeiras em sistemas de expressão de acordo com, por exemplo, a publicação de pedido de patente no U.S. 2008/0269070 e publicação de pedido de patente no U.S. 2010/0137162. Muitos específicos e uma variedade de RBSs consensos são conhecidos, por exemplo, aqueles descritos em e mencionados por D. Frishman et al., Gene 234(2):257 a 265 (8 de julho de 1999); e B. E. Suzek et al., Bioinformatics 17(12):1123 a 1130 (dezembro de 2001). Além disso, os RBSs sintéticos ou nativos podem ser usados, por exemplo, aqueles descritos em: EP 0207459 (RBSs sintéticos); O. Ikehata et al., Eur. J. Biochem. 181(3):563 a 570 (1989) (sequência de RBS nativo AAGGAAG). Os exemplos adicionais de métodos, vetores e elementos de tradução e transcrição, e outros elementos úteis na presente invenção são descritos, por exemplo, em: patente no U.S. 5.055.294 por Gilroy e patente no U.S. 5.128.130 por Gilroy et al.; patente no U.S. 5.281.532 por Rammler et al.; patente nos U.S. 4.695.455 e 4.861.595 por Barnes et al.; patente no U.S. 4.755.465 por Gray et al.; e patente no U.S. 5.169.760 por Wilcox, incorporados ao presente documento a título de referência, em suas totalidades.

LÍDERES

[0151] Nas modalidades, uma sequência que codifica um líder de secreção é fundida à sequência que codifica a CSP. Nas modalidades, o líder de secreção é um líder de secreção periplasmático. Nas modalidades, o líder de secreção é o líder de secreção nativo.

[0152] Nas modalidades, as proteínas solúveis estão presentes no citoplasma ou periplasma da célula durante a produção. Os métodos para selecionar e usar os líderes ou peptídeos de sinal de secreção na otimização da expressão de proteína heteróloga são descritos em detalhes, por exemplo, na patente no U.S. 7.618.799, “Bacterial leader sequences for increased expression” e patente no U.S. 7.985.564, “Expression systems com Sec-secretion”, ambos incorporados ao presente documento a título de referência, em suas totalidades, assim como na publicação do pedido de patente nos U.S. 2008/0269070 e 2010/0137162, mencionadas acima. A Tabela 1 abaixo fornece exemplos não limitadores de sequências de líder de secreção contempladas para o uso em associação aos métodos da presente invenção.

[0153] Nas modalidades, um líder de secreção usado é LAO, pbp, pbpA20V ou cupA2. Em uma modalidade específica, o líder de secreção LAO é usado. TABELA 1. SEQUÊNCIAS DE LÍDER DE SECREÇÃO DE EXEMPLO

PROMOTORES

[0154] Os promotores usados na expressão de rCSP purificada de acordo com a presente invenção podem ser promotores constitutivos ou promotores regulados. Os métodos para seleção de um promotor útil para regular a expressão de uma proteína heteróloga são bem conhecidos na técnica e descritos extensivamente na literatura. Os exemplos comuns de promotores regulados úteis incluem aqueles da família derivada a partir do promotor lac (isto é, o promotor lacZ), que inclui os promotores tac e trc descritos na patente no U.S. 4.551.433 por DeBoer, assim como o promotor Ptac16, Ptac17, PtacII, PlacUV5 e T7lac. Em uma modalidade, o promotor não é derivado a partir do organismo de célula hospedeira. Nas modalidades, o promotor é derivado a partir de um organismo de E. colí.

[0155] As sequências de promotor induzível podem ser usadas para regular a expressão de CSP de acordo com os métodos da invenção. Nas modalidades, os promotores induzíveis úteis nos métodos da presente invenção incluem aqueles da família derivada a partir do promotor lac (isto é, o promotor lacZ), especialmente, os promotores tac e trc descritos na patente no U.S. 4.551.433 por DeBoer, assim como o promotor Ptac16, Ptac17, PtacII, PlacUV5 e T7lac. Em uma modalidade, o promotor não é derivado a partir do organismo de célula hospedeira. Em determinadas modalidades, o promotor é derivado a partir de um organismo de E. colí.

[0156] Os exemplos comuns de promotores do tipo não-lac úteis em sistemas de expressão de acordo com a presente invenção incluem, por exemplo, aqueles relacionados na Tabela 2. TABELA 2. EXEMPLOS DE PROMOTORES NÃO-LAC

[0157] Consulte, por exemplo: J. Sanchez- Romero & V. De Lorenzo (1999) Manual of Microbiology and Biotechnology (A. Demain & J. Davies, eds.) páginas 460 a 474 (ASM Press, Washington, D.C.); H. Schweizer (2001) Current Opinion in Biotechnology, 12:439 a 445; e R. Slater & R. Williams (2000 Molecular Biology and Biotechnology (J. Walker & R. Rapley, eds.) páginas 125 a 154 (The Royal Society of Chemistry, Cambridge, UK) ) . Um promotor que tem a sequência de nucleotídeos de um promotor nativo para a célula hospedeira bacteriana selecionada também pode ser usado para controlar a expressão do transgene que codifica o polipeptídeo alvo, por exemplo, um promotor de operon de benzoato ou antranilato de Pseudomonas (Pant, Pben). Os promotores em conjunto também podem ser usados, nos quais mais do que um promotor é fixado de maneira covalente a outro, se o mesmo ou diferente em sequência, por exemplo, um promotor em conjunto de Pant-Pben (híbrido interpromotor) ou um promotor em conjunto de Plac-Plac ou se derivado a partir do mesmo ou diferente organismo.

[0158] Os promotores regulados utilizam proteínas reguladoras de promotor a fim de controlar a transcrição do gene cujo promotor é uma parte. Onde um promotor regulado é usado no presente documento, uma proteína reguladora de promotor correspondente também será parte de um sistema de expressão de acordo com a presente invenção. Os exemplos de proteína reguladora de promotor incluem: proteínas ativadoras, por exemplo, proteína ativadora de catabólito de E. colú, proteína MalT; ativadores transcricionais da família AraC; proteínas repressoras, por exemplo, proteínas LacI de E. colú; e proteínas reguladoras de função dupla, por exemplo, proteína NagC de E. coll. Muitos pares de promotor regulado/proteína reguladora de promotor são conhecidos na técnica. Em uma modalidade, o constructo de expressão para a(s) proteína(s) alvo e a proteína heteróloga de interesse estão sob controle do mesmo elemento regulador.

[0159] As proteínas reguladoras de promotor interagem com um composto efetor, isto é, um composto que se associa de maneira reversível ou irreversível à proteína reguladora a fim de possibilitar que a proteína se libere ou ligue a pelo menos uma região reguladora de transcrição de DNA do gene que está sob o controle do promotor, permitindo ou bloqueando, assim, a ação de uma enzima transcriptase na iniciação da transcrição do gene. Os compostos efetores são classificados como indutores ou corepressores, e esses compostos incluem compostos efetores nativos e compostos indutores gratuitos. Muitos trios de promotor regulado/proteína reguladora de promotor/composto efetor são conhecidos na técnica. Embora um composto efetor possa ser usado por toda a fermentação ou cultura de célula, em uma modalidade preferida, na qual um promotor regulado é usado, após o crescimento de uma densidade ou quantidade desejada de biomassa de célula hospedeira, um composto efetor adequado é adicionado à cultura para resultar de modo direto ou indireto na expressão do(s) gene(s) desejado(s) que codificam a proteína ou polipeptídeo de interesse.

[0160] Nas modalidades em que um promotor da família lac é utilizado, um gene lacl também pode estar presente no sistema. O gene lacl, o qual é normalmente um gene expressado de maneira constitutiva, codifica a proteína LacI de proteína repressora Lac, a qual se liga ao operador lac dos promotores da família lac. Desse modo, em que um promotor da família lac é utilizado, o gene lacl também pode ser incluído e expressado no sistema de expressão.

[0161] Os sistemas de promotor úteis em Pseudomonas são descritos na literatura, por exemplo, na publicação de pedido de patente no U.S. 2008/0269070, também mencionada acima.

CÉLULAS HOSPEDEIRAS

[0162] Os métodos da presente invenção podem ser usados para purificar a rCSP expressada em qualquer sistema de expressão de célula hospedeira bacteriana, que inclui, porém sem limitação, células hospedeiras de Pseudomonad e E. coli. Nas modalidades, a rCSP é expressada em Pseudomonads ou organismos bacterianos estreitamente relacionados. Em determinadas modalidades, a células hospedeira de Pseudomonad é Pseudomonas fluorescens. Nas modalidades, a célula hospedeira é E. colú, Bacillus subtúlus ou Pseudomonas putída. As células hospedeiras bacterianas e constructos úteis na prática dos métodos da invenção podem ser identificados ou feitos com o uso de reagentes e métodos conhecidos na técnica e descritos na literatura, por exemplo, na publicação do pedido de patente no U.S. 2009/0325230, “Protein Expression Systems”, incorporada ao presente documento a título de referência, em sua totalidade. Essa publicação descreve a produção de um polipeptídeo recombinante pela introdução de um constructo de ácido nucleico em uma célula hospedeira de Pseudomonas fluorescens auxotrófica que compreende uma inserção de gene lacI cromossômica. O constructo de ácido nucleico compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo recombinante ligado de maneira operável a um promotor capaz de direcionar a expressão do ácido nucleico na célula hospedeira e também compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica um marcador de seleção auxotrófico. O marcador de seleção auxotrófico é um polipeptídeo que restaura a prototrofia à célula hospedeira auxotrófica. Nas modalidades, a célula é auxotrófica para a prolina, uracila ou combinações das mesmas. Nas modalidades, a célula hospedeira é derivada a partir de MB101 (depósito ATCC PTA-7841) com o uso de métodos conhecidos por aqueles versados na técnica e descritos na literatura científica. Por exemplo, a publicação de pedido de patente no U.S. 2009/0325230, e Schneider, et al., 2005, “Auxotrophic markers pyrF and proC can replace antibiotic markers on protein production plasmids in high-cell-density Pseudomonas fluorescens fermentation”, Biotechnol. Progress 21(2) : 343 a 348, ambos incorporados ao presente documento a título de referência, em suas totalidades, descrevem uma cepa hospedeira de produção auxotrófica para uracila, que foi feita deletando-se o gene pyrF na cepa MB101. O gene pyrF foi clonado a partir da cepa MB214 (depósito ATCC PTA- 7840) para gerar um plasmídeo que pode complementar a deleção de pyrF para restaurar a prototrofia.

[0163] Em modalidades particulares, é usado um sistema de marcador de seleção auxotrófico de PyrF-ProC duplo em uma célula hospedeira de P. fluorescens. Uma cepa hospedeira de produção de PyrF, conforme descrito, pode ser usada como a base para a introdução de outras mudanças genômicas desejadas, que inclui aquelas descritas no presente documento na prática dos métodos da invenção. Nas modalidades, a cepa hospedeira de P. fluorescens é uma cepa hospedeira de produção de PyrF que tem o genótipo ΔpyrF, lacIQ e ΔhtpX. Nas modalidades, o lacIQ é inserido no gene lvs (lvs:lacIQ1).

[0164] Nas modalidades, a cepa hospedeira DC469 de P. fluorescens (ΔpyrF, lacIQ, ΔhtpX), a qual é derivada a partir da cepa MB101 biovar 1, é usada para a produção de rCSP útil nos métodos da invenção. Na cepa DC469, o lacIQ é inserido no gene lvs (lvs:lacIQ1) . As inserções de LacIQ comumente são feitas em qualquer uma dentre os diversos locais adequados, conforme conhecido por aqueles versados na técnica.

[0165] Nas modalidades, a célula hospedeira é da ordem Pseudomonadales. Onde a célula hospedeira é da ordem Pseudomonadales, a mesma pode ser um membro da família Pseudomonadaceae, que inclui o gênero Pseudomonas. Os hospedeiros proteobacterianos gama incluem os membros da espécie Escherichia coli e membros da espécie Pseudomonas fl uorescens.

[0166] Outros organismos de Pseudomonas também podem ser úteis. Pseudomonads e espécies estreitamente relacionadas incluem subgrupo 1 de proteobactérias gram- negativas, o qual inclui o grupo de proteobactérias que pertencem às famílias e/ou gêneros descritos como "Gram-Negative Aerobic Rods and Cocci” por R. E. Buchanan e N.E. Gibbons (eds.), Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, páginas 217 a 289 (8a edição, 1974) (The Williams & Wilkins Co., Baltimore, Md., EUA) . A Tabela 3 apresenta essas famílias e gêneros de organismos. TABELA 3. FAMÍLIAS E GÊNEROS RELACIONADOS NA PARTE, "GRAM NEGATIVE AEROBIC RODS AND COCCI” (BERGEY, 1974)

[0167] Pseudomonas e bactérias estreitamente relacionadas são geralmente parte do grupo definido como "subgrupo 1 de proteobactérias Gram(-)” ou "Gram-Negative Aerobic Rods and Cocci” (Buchanan e Gibbons (eds.) (1974) Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, páginas 217 a 289) . As cepas hospedeiras de Pseudomonas são descritas na literatura, por exemplo, na publicação de pedido de patente no U.S. 2006/0040352, citada acima.

[0168] "Subgrupo 1 de proteobactérias Gram- negativas” também inclui as proteobactérias que seriam classificadas nesse título de acordo com os critérios usados na classificação. O título também inclui os grupos que foram classificados anteriormente nessa seção, mas não são mais, tais como os gêneros Acídovorax, Brevundímonas, Burkholdería, Hydrogenophaga, Oceanímonas, Ralstonía e Stenotrophomonas, o gênero Sphíngomonas (e o gênero Blastomonas, derivado a partir do mesmo), o qual foi criado pelo reagrupamento de organismos que pertencem (e espécies chamadas anteriormente de) ao gênero Xanthomonas, o gênero Acídomonas, o qual foi criado pelo reagrupamento de organismos que pertencem ao gênero Acetobacter, conforme definido em Bergey (1974). Adicionalmente, os hospedeiros podem incluir células a partir do gênero Pseudomonas, Pseudomonas enalía (ATCC 14393), Pseudomonas nígrífacíensí (ATCC 19375) e Pseudomonas putrefacíens (ATCC 8071), os quais têm sido reclassificados, respectivamente, como Alteromonas haloplanktís, Alteromonas nígrífacíens e Alteromonas putrefacíens. Semelhantemente, por exemplo, Pseudomonas acídovorans (ATCC 15668) e Pseudomonas testosteroní (ATCC 11996) têm sido posteriormente reclassificados como Comamonas acídovorans e Comamonas testosteroní, respectivamente; e Pseudomonas nígrífacíens (ATCC 19375) e Pseudomonas píscícída (ATCC 15057) têm sido reclassificados, respectivamente, como Pseudoalteromonas nígrífacíens e Pseudoalteromonas píscícída. “Subgrupo 1 de proteobactérias Gram-negativas" também inclui proteobactérias classificadas como pertencentes a qualquer uma dentre as famílias: Pseudomonadaceae, Azotobacteraceae (agora muitas vezes chamada pelo sinônimo, o “grupo de Azotobacter" de Pseudomonadaceae) , Rhizobiaceae e Metilomonadaceae (agora muitas vezes chamada pelo sinônimo, “Metilococcaceae"). Consequentemente, adicionalmente àqueles gêneros descritos de outro modo no presente documento, os gêneros proteobacterianos adicionais que se incluem no “Subgrupo 1 de proteobactérias Gram-negativas" incluem: 1) bactérias do grupo de Azotobacter do gênero Azorhizophilus; 2) bactérias da família Pseudomonadaceae dos gêneros Cellvibrio, Oligella e Teredinibacter; 3) bactérias da família Rhizobiaceae dos gêneros Chelatobacter, Ensifer, Liberibacter (também chamado “Candidatus Liberibacter"), e Sinorhizobium; e 4) bactérias da família Metilococcaceae dos gêneros Metilobacter, Metilocaldum, Metilomicrobium, Metilosarcina e Metilosphaera.

[0169] A célula hospedeira pode ser selecionada a partir do “Subgrupo 16 de proteobactérias Gram-negativas". O “subgrupo 16 de proteobactérias Gram- negativas" é definido como o grupo de proteobactérias das seguintes espécies de Pseudomonas (com o ATCC ou outros números de depósito de cepa(s) exemplificadora(s) mostrados em parênteses): Pseudomonas abietaniphila (ATCC 700689); Pseudomonas aeruginosa (ATCC 10145); Pseudomonas alcalúgenes (ATCC 14909); Pseudomonas anguilliseptica (ATCC 33660); Pseudomonas citronellolis (ATCC 13674); Pseudomonas flavescens (ATCC 51555); Pseudomonas mendocina (ATCC 25411); Pseudomonas nitroreducens (ATCC 33634); Pseudomonas oleovorans (ATCC 8062); Pseudomonas pseudoalcalígenes (ATCC 17440); Pseudomonas resinovorans (ATCC 14235); Pseudomonas straminaa (ATCC 33636); Pseudomonas agarici (ATCC 25941); Pseudomonas alcaliphila; Pseudomonas alginovora; Pseudomonas andersonii; Pseudomonas asplenii (ATCC 23835); Pseudomonas azelaica (ATCC 27162); Pseudomonas beyerinckii (ATCC 19372); Pseudomonas borealis; Pseudomonas boreopolis (ATCC 33662); Pseudomonas brassicacearum; Pseudomonas butanovora (ATCC 43655); Pseudomonas cellulosa (ATCC 55703); Pseudomonas aurantiaca (ATCC 33663); Pseudomonas chlororaphis (ATCC 9446, ATCC 13985, ATCC 17418, ATCC 17461); Pseudomonas fragi (ATCC 4973); Pseudomonas lundensis (ATCC 49968); Pseudomonas taetrolens (ATCC 4683); Pseudomonas cissicola (ATCC 33616); Pseudomonas coronafaciens; Pseudomonas diterpeniphila; Pseudomonas elongata (ATCC 10144); Pseudomonasflectens (ATCC 12775); Pseudomonas azotoformans; Pseudomonas brenneri; Pseudomonas cedrella; Pseudomonas corrugata (ATCC 29736); Pseudomonas extremorientalis; Pseudomonas fluorescens (ATCC 35858); Pseudomonas gessardii; Pseudomonas libanensis; Pseudomonas mandelii (ATCC 700871); Pseudomonas marginalis (ATCC 10844); Pseudomonas migulae; Pseudomonas mucidolens (ATCC 4685); Pseudomonas orientalis; Pseudomonas rhodesiae; Pseudomonas synxantha (ATCC 9890); Pseudomonas tolaasii (ATCC 33618); Pseudomonas veronii (ATCC 700474); Pseudomonas frederiksbergensis; Pseudomonas geniculata (ATCC 19374); Pseudomonas gingeri; Pseudomonas graminis; Pseudomonas grimontii; Pseudomonas halodenitrificans; Pseudomonas halophila; Pseudomonas hibiscicola (ATCC 19867); Pseudomonas huttiensis (ATCC 14670); Pseudomonas hydrogenovora; Pseudomonas jessenii (ATCC 700870); Pseudomonas kilonensis; Pseudomonas lanceolata (ATCC 14669); Pseudomonas lini; Pseudomonas marginata (ATCC 25417); Pseudomonas mephitica (ATCC 33665); Pseudomonas denitrificans (ATCC 19244); Pseudomonas pertucinogena (ATCC 190); Pseudomonas pictorum (ATCC 23328); Pseudomonas psychrophila; Pseudomonas filva (ATCC 31418); Pseudomonas monteilii (ATCC 700476); Pseudomonas mosselii; Pseudomonas oryzihabitans (ATCC 43272); Pseudomonas plecoglossicida (ATCC 700383); Pseudomonas putida (ATCC 12633); Pseudomonas reactans; Pseudomonas spinosa (ATCC 14606); Pseudomonas balearica; Pseudomonas luteola (ATCC 43273);. Pseudomonas stutzeri (ATCC 17588); Pseudomonas amygdali (ATCC 33614); Pseudomonas avellanae (ATCC 700331); Pseudomonas caricapapayae (ATCC 33615); Pseudomonas cichorii (ATCC 10857); Pseudomonas ficuserectae (ATCC 35104); Pseudomonas fuscovaginae; Pseudomonas meliae (ATCC 33050); Pseudomonas syringae (ATCC 19310); Pseudomonas viridiflava (ATCC 13223); Pseudomonas thermocarboxydovorans (ATCC 35961); Pseudomonas thermotolerans; Pseudomonas thivervalensis ; Pseudomonas vancouverensis (ATCC 700688); Pseudomonas wisconsinensis; e Pseudomonas xiamenensis. Em uma modalidade, a célula hospedeira é Pseudomonas fluorescens.

[0170] A célula hospedeira também pode ser selecionada a partir do “Subgrupo 17 de proteobactérias Gram-negativas". O “subgrupo 17 de proteobactérias Gram- negativas" é definido como o grupo de proteobactérias conhecido na técnica como os “Pseudomonads fluorescentes", que incluem aqueles pertencentes, por exemplo, às seguintes espécies de Pseudomonas: Pseudomonas azotoformans; Pseudomonas brenneri; Pseudomonas cedrella; Pseudomonas corrugata; Pseudomonas extremorientalis; Pseudomonas fluorescens; Pseudomonas gessardii; Pseudomonas libanensis; Pseudomonas mandelii; Pseudomonas marginalis; Pseudomonas migulae; Pseudomonas mucidolens; Pseudomonas orientalis; Pseudomonas rhodesiae; Pseudomonas synxantha; Pseudomonas tolaasii; e Pseudomonas veronii.

[0171] Em outras modalidades, a célula hospedeira de Pseudomonas superexpressam DsbA, DsbB, DsbC e DsbD. DsbA, B, C e D são isomerases de ligação de dissulfeto, descritas, por exemplo, na publicação de pedido de patente nos U.S. 2008/0269070 e 2010/0137162.

[0172] Em outras modalidades, a célula hospedeira do Pseudomonas é do tipo selvagem, isto é, que não tem defeitos de expressão de protease e não superexpressam qualquer modulador de enovelamento.

[0173] Uma célula hospedeira que é defeituosa na expressão de uma protease pode ter qualquer modificação que resulta em uma diminuição na atividade normal ou nível de expressão dessa protease em relação a um hospedeiro do tipo selvagem. Por exemplo, uma mutação missense ou sem sentido pode conduzir à expressão de proteína que não é ativa e uma deleção de gene pode resultar em absolutamente nenhuma expressão de proteína. Uma mudança na região reguladora a montante do gene pode resultar em nenhuma expressão de proteína ou reduzida. Outros defeitos de gene podem afetar a tradução da proteína. A expressão de uma protease também pode ser defeituosa se a atividade de uma proteína necessária para o processamento da protease fosse defeituosa.

[0174] Os exemplos de proteases e moduladores de enovelamento úteis para a geração de células hospedeiras de Pseudomonad úteis em associação aos métodos da presente invenção, e métodos para a identificação de células hospedeiras, são descritos, por exemplo, na publicação de pedido de patente nos U.S. 2008/0269070 e 2010/0137162, mencionadas acima.

OTIMIZAÇÃO DE CÓDON

[0175] Os métodos para a otimização de códons para aperfeiçoar a expressão de proteína heteróloga em hospedeiros bacterianos são conhecidos na técnica e descritos na literatura. Por exemplo, a otimização de códons para a expressão em uma cepa hospedeira de Pseudomonas é descrita, por exemplo, na publicação de pedido de patente no U.S. 2007/0292918, “Codon Optimization Method”, incorporada ao presente documento a título de referência, em sua totalidade. A otimização de códon para a expressão em E. colí é descrita, por exemplo, por Welch, et al., 2009, PLoS One, “Design Parameters to Control Synthetic Gene Expression in Escherichia coli, 4(9): e7002, incorporado a título de referência no presente documento. TABELA 4. CÓDONS QUE OCORREM EM MENOS QUE 5% EM MB214 DE P. FLUORESCENS

[0176] Apresenteinvençãocontemplaousode qualquer sequência de codificação para a CSP, que inclui qualquer sequência que tem sido otimizada para a expressão na célula hospedeira que é usada. As sequências contempladas para o uso podem ser otimizadas a qualquer grau, conforme desejado, que inclui, porém sem limitação, otimização para eliminar: códons que ocorrem em menos que 5% na célula hospedeira de Pseudomonas, códons que ocorrem em menos que 10% na célula hospedeira de Pseudomonas, uma pausa traducional induzida por códon raro, uma suposta sequência de RBS interno, uma repetição prolongada de nucleotídeos G ou C, uma estrutura secundária interferente, um sítio de restrição, ou combinações dos mesmos.

[0177] Adicionalmente, a sequência de aminoácidos de qualquer líder de secreção útil na prática dos métodos da presente invenção pode ser codificada por qualquer sequência de ácido nucleico adequada.

FORMATO DE FERMENTAÇÃO

[0178] A expressão de proteínas recombinantes para a purificação de acordo com os métodos da presente invenção pode ser suportada em qualquer formato de fermentação. Por exemplo, os modos de fermentação por lote, descontínuo alimentado, semicontínuo e contínuo podem ser empregados no presente documento. As condições de fermentação que resultam na produção de uma proteína recombinante, por exemplo, CSP, em um sistema de expressão bacteriana, podem ser otimizadas conforme considerado adequado por um elemento versado na técnica, com o uso de métodos descritos na literatura. Por exemplo, os métodos para otimização da produção de proteínas de toxina são descritos na publicação de pedido de patente no U.S. 2011/0287443, “High Level Expression of Recombinant Toxin Proteins”, incorporada ao presente documento a título de referência, em sua totalidade. Nas modalidades, o meio de fermentação pode ser selecionado dentre meios ricos, meios mínimos e meios de sais minerais. Em outras modalidades, um meio mínimo ou um meio de sais minerais é selecionado. Em determinadas modalidades, um meio de sais minerais é selecionado.

[0179] Os meios de sais minerais consistem em sais minerais e uma fonte de carbono, tal como, por exemplo, glicose, sacarose ou glicerol. Os exemplos de meios de sais minerais incluem, por exemplo, meio M9, meio de Pseudomonas (ATCC 179) e meio de Davis e Mingioli (consulte, B D Davis & E S Mingioli (1950) J. Bact. 60:17 a 28) . Os sais minerais usados para fazer os meios de sais minerais incluem aqueles selecionados dentre, por exemplo, fosfatos de potássio, cloreto ou sulfato de amônio, cloreto ou sulfato de magnésio e traços de minerais, tais como cloreto de cálcio, borato, e sulfatos de ferro, cobre, manganês e zinco. Tipicamente, nenhuma fonte de nitrogênio orgânico, tal como peptona, triptona, aminoácidos ou um extrato de levedura, está incluída em um meio de sais minerais. Ao contrário, uma fonte de nitrogênio inorgânico é usada e essa pode ser selecionada dentre, por exemplo, sais de amônio, amônia aquosa e amônia gasosa. Um meio de sais minerais irá conter tipicamente glicose ou glicerol como a fonte de carbono. Em comparação com os meios de sais minerais, os meios mínimos também podem conter sais minerais e uma fonte de carbono, mas podem ser suplementados com, por exemplo, baixos níveis de aminoácidos, vitaminas, peptonas ou outros ingredientes, embora esses sejam adicionados em níveis muito mínimos. Os meios podem ser preparados com o uso dos métodos descritos na técnica, por exemplo, na publicação de pedido de patente no U.S. 2006/0040352, mencionada e incorporada a título de referência acima. Os detalhes dos procedimentos de cultivo e meios de sais minerais úteis nos métodos da presente invenção são descritos por Riesenberg, D et al. , 1991, “High cell density cultivation of Escherichia coli at controlled specific growth rate”, J. Biotechnol. 20 (1) :17 a 27.

ESCALA DE FERMENTAÇÃO

[0180] Os métodos de purificação da presente invenção são particularmente úteis devido ao fato de que podem ser escalonadas para processar grandes quantidades de proteína. O escalonamento da produção de rCSP tipicamente resulta em agregados de rCSP. Os presentes métodos são compatíveis com processamento de grande escala e são contemplados para o uso quando o material de partida compreende grandes quantidades de rCSP. Os métodos de purificação da presente invenção também são contemplados para o uso na obtenção de proteína a partir de lisado de célula bacteriana produzido em qualquer escala menor. Desse modo, por exemplo, os volumes de fermentação em escala de microlitro, escala de centilitro e escala de decilitro podem ser usados. Nas modalidades, a escala de 1 litro e volumes de fermentação maiores são usados.

[0181] Nas modalidades, o volume de fermentação é de cerca de 1 litro a cerca de 100 litros. Em determinadas modalidades, o volume de fermentação é de pelo menos cerca de 2 litros, pelo menos cerca de 3 litros, pelo menos cerca de 4 litros, pelo menos cerca de 5 litros, pelo menos cerca de 6 litros, pelo menos cerca de 7 litros, pelo menos cerca de 8 litros, pelo menos cerca de 9 litros, pelo menos cerca de 10 litros, pelo menos cerca de 20 litros, pelo menos cerca de 25 litros, pelo menos cerca de 50 litros, pelo menos cerca de 75 litros, pelo menos cerca de 100 litros, pelo menos cerca de 200 litros, pelo menos cerca de 500 litros, pelo menos cerca de 1.000 litros, pelo menos cerca de 2.000 litros, pelo menos cerca de 5,000 litros, pelo menos cerca de 10.000 litros ou pelo menos cerca de 50.000 litros. Nas modalidades, o volume de fermentação é de cerca de 1 litro a cerca de 5 litros, cerca de 1 litro a cerca de 10 litros, cerca de 1 litro a cerca de 20 litros, cerca de 1 litro a cerca de 25 litros, cerca de 1 litro a cerca de 50 litros, cerca de 1 litro a cerca de 75 litros, cerca de 10 litros a cerca de 25 litros, cerca de 25 litros a cerca de 50 litros ou cerca de 50 litros a cerca de 100 litros.

TRIAGENS DE ALTA TAXA DE RENDIMENTO

[0182] Em algumas modalidades, uma triagem de alta taxa de rendimento pode ser conduzida para determinar condições ideais para a expressão de rCSP. As condições que podem ser variadas na triagem incluem, por exemplo, a célula hospedeira, histórico genético da célula hospedeira (por exemplo, deleções de diferentes genes de protease ou superexpressão de moduladores de enovelamento), tipo de promotor em um constructo de expressão, tipo de líder de secreção fundido à sequência que codifica a proteína recombinante, temperatura de crescimento, OD em indução quando um promotor induzível é usado, concentração de agente indutor usado (por exemplo, IPTG quando um promotor lacZ é usado), duração de indução de proteína, temperatura de crescimento após adição de um agente indutor a uma cultura, taxa de agitação de cultura, método de seleção para manutenção de plasmídeo, volume de cultura em um vaso, etc.

[0183] Os métodos de triagem de hospedeiros microbianos para identificar cepas com rendimento e/ou qualidade aperfeiçoada na expressão de proteínas heterólogas são descritos, por exemplo, na publicação de pedido de patente no U.S. 2008/0269070.

INDUÇÃO

[0184] Conforme descrito em outro lugar no presente documento, os promotores induzíveis podem ser usados no constructo de expressão para controlar a expressão da proteína recombinante, por exemplo, um promotor lac. No caso dos derivados de promotor lac ou membros da família, por exemplo, o promotor tac, o composto efetor é um indutor, tal como um indutor gratuito, por exemplo, IPTG (isopropil-p-D-1-tiogalactopiranosídeo, também chamado "isopropiltiogalactosídeo") , lactose ou alolactose. Nas modalidades, um derivado de promotor lac é usado, e a expressão de proteína recombinante é induzida pela adição de IPTG a uma concentração final de cerca de 0,01 mM a cerca de 1,0 mM, quando a densidade de célula tem alcançado um nível identificado por um OD575 de cerca de 80 a cerca de 160. Nas modalidades em que um promotor do tipo não-lac é usado, conforme descrito no presente documento e na literatura, outros indutores ou efetores podem ser usados. Em uma modalidade, o promotor é um promotor constitutivo. Os métodos para induzir os promotores são descritos na técnica, por exemplo, na patente no U.S. 7.759.109, "High Density Growth of T7 Expression Strains with Auto-induction Option” e publicação de pedido de patente no U.S. 2011/0217784, “Method for Producing Soluble Recombinant Interferon Protein without Denaturing”, ambos incorporados ao presente documento a título de referência, em suas totalidades.

[0185] Em modalidades específicas, a rCSP é expressa em Pseudomonas fluorescens e a expressão é regulada por um promotor lac. Nessas modalidades, a cultura de fermentação é induzida em 100 a 160 AU (unidades de absorvência) em 575 nm de densidade de célula de indução, com 0,1 a 0.2 mM de IPTG, em pH 6,5 a 7,2, em uma temperatura de 27 a 32 °C.

PURIFICAÇÃO DE PROTEÍNA

[0186] Nos métodos da presente invenção, os dímeros de CSP de P. falciparum recombinante são purificados a partir de um lisado de célula bacteriana preparado a partir de células que expressam rCSP. Nas modalidades, a purificação inclui a separação do dímero de CSP a partir de proteínas e detritos de célula hospedeira e outras impurezas para gerar uma fração solúvel que contém o dímero de CSP e uma fração insolúvel. O dímero de CSP na fração solúvel é separado das proteínas de célula hospedeira e quaisquer outras impurezas indesejadas. A separação a partir de detritos de célula hospedeira, separação a partir de proteínas de célula hospedeira, separação a partir de espécies de rCSP indesejadas que incluem, por exemplo, espécies cortadas N-terminalmente, agregados de alto peso molecular, espécies dimerizadas e espécies desnaturadas e separação a partir de quaisquer outras impurezas, podem ser realizadas em etapas distintas do processo ou na(s) mesma(s) etapa(s), dependendo do método de separação usado. Os métodos de separação úteis de acordo com os métodos da invenção para a purificação da rCSP são descritos na literatura, por exemplo, em Methods in Enzymology (1990) volume 182. A Guide to Protein Purification. Editado por M. P. Deutscher. Academic Press; e Ausubel, F.M., Brett, R., Kingston, R. E., Moore, D. D., Seidman, J.G., Smith, J.A., e Struhl, L. 1991. Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1. Wiley. Nova Iorque, ambos incorporados ao presente documento a título de referência, em suas totalidades.

PROCESSO ESCALONÁVEL

[0187] O escalonamento da produção de rCSP resulta tipicamente em agregação de proteína. O processo de purificação da presente invenção é escalonável e pode ser usado para purificar a rCSP em altos rendimentos do processo de purificação total a partir do material de partida, por exemplo, cultura de célula ou lisado de célula bacteriana, que compreende grandes quantidades de rCSP. Nas modalidades, o processo é escalonável até uma quantidade de partida ou carga inicial de rCSP que compreende cerca de 100 mg a cerca de 3.000 gramas de rCSP. Nas modalidades, a quantidade de partida de rCSP compreende cerca de 1 grama a cerca de 3.000 gramas, cerca de 100 gramas a cerca de 3.000 gramas, cerca de 250 gramas a cerca de 3.000 gramas, cerca de 500 gramas a cerca de 3.000 gramas, cerca de 750 gramas a cerca de 3.000 gramas, cerca de 1.000 gramas a cerca de 3.000 gramas, cerca de 100 gramas a cerca de 2.000 gramas, cerca de 250 gramas a cerca de 2.000 gramas, cerca de 500 gramas a cerca de 2.000 gramas, cerca de 750 gramas a cerca de 2.000 gramas, cerca de 1.000 gramas a cerca de 2.000 gramas, cerca de 100 gramas a cerca de 1.000 gramas, cerca de 150 gramas a cerca de 1.000 gramas, cerca de 200 gramas a cerca de 1.000 gramas, cerca de 250 gramas a cerca de 1.000 gramas, cerca de 300 gramas a cerca de 1.000 gramas, cerca de 400 gramas a cerca de 1.000 gramas, cerca de 500 gramas a cerca de 1.000 gramas ou cerca de 750 gramas a cerca de 1.000 gramas. Nas modalidades, os métodos da presente invenção são usados para obter qualquer uma dentre as quantidades de partida acima de rCSP em um rendimento total do processo de purificação de pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 15%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 25%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 35%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, cercade10%acercade75%,cercade10%acercade70%, cercade10%acercade65%,cercade10%acercade60%, cercade20%acercade75%,cercade20%acercade70%, cercade20%acercade65%,cercade25%acercade75%, cercade25%acercade70%,cercade25%acercade65%, cercade25%acercade60%,cercade30%acercade75%, cercade30%acercade70%,cercade30%acercade65%ou cerca de 30% a cerca de 60%. Nas modalidades, os rendimentos do processo de purificação acima compreendem não mais que 10% de rCSP desnaturada, não mais que 10% de rCSP degradada e/ou 10% de rCSP dimerizada. Nas modalidades, os rendimentos do processo de purificação acima compreendem não mais que 5% de rCSP desnaturada, não mais que 5% de rCSP degradada e/ou não mais que 5% de rCSP dimerizada.

CONDIÇÕES DE REDUÇÃO PREFERENCIAL

[0188] Nos métodos da presente invenção, os dímeros de rCSP separados a partir de proteínas de célula hospedeira nos métodos da invenção são submetidos a condições de redução preferencial. Essas condições de redução preferencial reduzem seletivamente determinadas ligações de dissulfeto, enquanto que deixa outras intatas. Quando a rCSP é submetida às condições de redução preferencial, a ligação de dissulfeto intermolecular do dímero de rCSP é reduzida para separar o dímero em dois monômeros. A estrutura, por exemplo, conforme representado pelas duas ligações de dissulfeto intramoleculares na região C-terminal, permanece intata. Portanto, as condições de redução preferencial são críticas para o alto rendimento total do processo (devido à utilização de dímero) e complexidade diminuída (devido à falta de uma etapa de reenovelamento e a necessidade de separar o dímero do monômero) em relação aos métodos usados anteriormente. Uma vantagem adicional dessa estratégia é que uma proporção maior da rCSP mantida como um dímero durante a purificação é obtida com uma N-terminação intata. Portanto, a qualidade quantidade da rCSP recuperada é vastamente aperfeiçoada. Nas modalidades, as condições de redução preferencial compreendem um agente redutor brando. Nas modalidades, o agente redutor brando é DTT, cisteína, acetilcisteína, glutationa, monotioglicerol (MTG), tioglicolato, ditotiotreitol, ditioerititol, acetilcisteína, 2- Mercaptoetanol (B-mercaptoetanol), TCEP-HCl (cloridrato de tris(2-carboxietil)fosfina cristalino puro) ou 2- Mercaptoetilamina-HCl (2-MEA), ou qualquer outro agente redutor adequado conhecido na técnica. Em determinadas modalidades, o agente redutor brando é ditiotreitol (DTT) em uma concentração final de cerca de 0,001 a cerca de 0,1 mM. Nas modalidades, o agente redutor brando compreende DTT em uma concentração final de cerca de 0,010 mM a cerca de 0, 030 mM, cerca de 0,010 mM a cerca de 0, 020 mM, cerca de 0,010 mM a cerca de 0,025 mM, cerca de 0,020 mM a cerca de 0,025 mM, cerca de 0,020 mM a cerca de 0,030 mM ou cerca de 0, 025 mM a cerca de 0, 030 mM. Nas modalidades, a concentração de DTT é de cerca de 20 μM. Nas modalidades, o agente redutor brando é monotioglicerol (MTG) em uma concentração final de cerca de 0,5 mM a cerca de 5 mM. Nas modalidades, o agente redutor brando compreende MTG ou cisteína em uma concentração final de cerca de 0,5 mM a cerca de 4 mM, cerca de 0,5 mM a cerca de 3 mM, cerca de 0,5 mM a cerca de 2 mM, cerca de 0,5 mM a cerca de 1 mM, cerca de 0,6 mM a cerca de 2 mM, cerca de 0,6 mM a cerca de 1,5 mM, cerca de 0,6 mM a cerca de 1,4 mM, cerca de 0,6 mM a cerca de 1,3 mM, cerca de 0,6 mM a cerca de 1,2 mM, cerca de 0,6 mM a cerca de 1,1 mM, cerca de 0,6 mM a cerca de 1,05 mM, cerca de 0,6 mM a cerca de 1 mM, cerca de 0,7 mM a cerca de 2 mM, cerca de 0,7 mM a cerca de 1,5 mM, cerca de 0,7 mM a cerca de 1,4 mM, cerca de 0,7 mM a cerca de 1,3 mM, cerca de 0,7 mM a cerca de 1,2 mM, cerca de 0,7 mM a cerca de 1,1 mM, cerca de 0,7 mM a cerca de 1,05 mM, cerca de 0,7 mM a cerca de 1 mM, cerca de 0,8 mM a cerca de 2 mM, cerca de 0,8 mM a cerca de 1,5 mM, cerca de 0,8 mM a cerca de 1,4 mM, cerca de 0,8 mM a cerca de 1,3 mM, cerca de 0,8 mM a cerca de 1,2 mM, cerca de 0,8 mM a cerca de 1,1 mM, cerca de 0,8 mM a cerca de 1,05 mM, cerca de 0,8 mM a cerca de 1 mM, cerca de 0,9 mM a cerca de 2 mM, cerca de 0,9 mM a cerca de 1,5 mM, cerca de 0,9 mM a cerca de 1,4 mM, cerca de 0,9 mM a cerca de 1,3 mM, cerca de 0,9 mM a cerca de 1,2 mM, cerca de 0,9 mM a cerca de 1,1 mM, cerca de 0,9 mM a cerca de 1,05 mM, cerca de 0,9 mM a cerca de 1 mM, cerca de 1 mM a cerca de 1,5 mM, cerca de 1 mM a cerca de 1,4 mM, cerca de 1 mM a cerca de 1,3 mM, cerca de 1 mM a cerca de 1,2 mM, cerca de 1 mM a cerca de 1,1 mM, cerca de 0,5 mM, cerca de 0,6 mM, cerca de 0,7 mM, cerca de 0,8 mM, cerca de 0,9 mM, cerca de 1,0 mM, cerca de 1,1 mM, cerca de 1,2 mM, cerca de 1,3 mM, cerca de 1,4 mM, cerca de 1,5 mM, cerca de 1,6 mM, cerca de 1,7 mM, cerca de 1,8 mM, cerca de 1,9 mM, cerca de 2,0 mM, cerca de 3,0 mM, cerca de 4,0 mM ou cerca de 5,0 mM. Nas modalidades, o agente redutor brando compreende MTG ou cisteína em uma concentração final de cerca de 1 mM.

[0189] Nas modalidades, o agente redutor brando e um agente desagregante são adicionados à CSP dimerizada purificada, ou CSP agregada, em tampão (por exemplo, PBS, Tris ou Hepes) e misturados em temperatura ambiente (cerca de 21 °C). Nas modalidades, o agente desagregante é arginina, cloridrato de guanidina, um detergente ou qualquer outro agente desagregante conhecido. Nas modalidades, o agente redutor brando é MTG e o agente desagregante é ureia. Nas modalidades, as condições de redução preferencial compreendem MTG e ureia em um tampão. Nas modalidades, o tampão é Hepes, PBS, Tris ou qualquer outro tampão adequado. Nas modalidades, as condições de redução preferencial compreendem 1,0 mM de MTG e 2 M de ureia em Hepes. Nas modalidades, o agente desagregante é adicionado antes no processo de purificação, por exemplo, antes da ruptura de célula, conforme descrito em outro lugar no presente documento. Nessas modalidades, o agente desagregante já está presente em concentração suficiente quando o agente redutor brando é adicionado para iniciar a redução preferencial dos dímeros de rCSP. Por exemplo, o agente desagregante é ureia presente em uma concentração de cerca de 0,5 M a cerca de 4 M. Nas modalidades, a concentração de ureia é de cerca de 2,5 M, cerca de 3 M, cerca de 1 a cerca de 2 M, cerca de 1 a cerca de 2,5 M, cerca de 1 a cerca de 3 M, cerca de 1,5 a cerca de 2 M, cerca de 1,5 a cerca de 2,5 M, cerca de 1,5 a cerca de 3 M, cerca de 2 a cerca de 2,5 M, cerca de 2 a cerca de 3 M ou cerca de 2,5 a cerca de 3 M.

[0190] Nas modalidades, a mistura é realizada a cerca de 21 °C por cerca de 8 a cerca de 48 horas. Nas modalidades, a mistura é realizada por cerca de 12 a cerca de 24 horas, ou por cerca de 16 a cerca de 18 horas. A mistura pode ser realizada, por exemplo, por agitação rápida com uma barra de agitação magnética e placa de agitação, plataforma oscilante, misturador suspenso ou em uma bolsa que recircula a CSP dimerizada e agente redutor com o uso de uma bomba peristáltica. Nas modalidades, as condições de redução preferencial são realizadas em um volume total de cerca de 1 ml a cerca de 25 l. Nas modalidades, o volume é de cerca de 100 ml a cerca de 1 l. Nas modalidades, as condições de redução preferencial são realizadas em um volume de cerca de 200 a 600 ml.

[0191] Em determinadas modalidades, as condições de redução preferencial são realizadas com o uso de rCSP dimérica purificada a partir da cromatografia de Butyl 650S. Em outras modalidades, as condições de redução preferencial são realizadas em frações de dímero de rCSP eluindo a partir de cromatografia de hidroxiapatita cerâmica.

LISADO DE CÉLULA BACTERIANA

[0192] Uma preparação de lisado de célula bacteriana é obtida mediante a ruptura de células bacterianas que expressam proteína recombinante com o uso de qualquer método de ruptura de célula conhecido adequado, que inclui métodos de ruptura de célula física ou mecânica e métodos de ruptura de célula não mecânica. Os métodos de ruptura variam na severidade do processo de ruptura, no equipamento e/ou reagentes necessários, e na facilidade de uso. Os métodos de ruptura de célula são selecionados com base, por exemplo, na dificuldade em romper as células particulares e na quantidade de material que é processado. Os métodos preferidos para romper células bacterianas são métodos que produzem um lisado de célula bacteriana que pode ser usado nas etapas de purificação a jusante para obter proteína recombinante não degradada e não desnaturada.

CULTURA DE CÉLULA FORNECIDA PARA RUPTURA

[0193] Nas modalidades da presente invenção, as células bacterianas a partir de uma cultura que expressam a proteína recombinante são fornecidas para ruptura como, por exemplo, um caldo de célula total, uma suspensão de célula, uma pasta fluida de célula ou uma pasta de célula. Nas modalidades, as células estão desagregante suficiente para evitar a formação de agregado de CSP. Nessas modalidades, a CSP não é desnaturada, portanto, as ligações de dissulfeto da região C-terminal de CSP são intatas. Nas modalidades, as células bacterianas são diluídas para ajustar o volume de células:meio ou células:diluentes.

[0194] Nas modalidades, a cultura de células hospedeiras bacterianas é usada para fazer uma pasta de célula para ruptura de acordo com os métodos da presente invenção. A pasta de célula pode ser preparada a partir da cultura de acordo com métodos conhecidos na técnica e descritos na literatura. Por exemplo, uma pasta de célula pode ser feita pela coleta de um caldo de fermentação total por centrifugação, e separando-se o pélete de célula e o caldo livre de célula. Nas modalidades, para a coleta de fermentação, os caldos de fermentação totais são coletados por centrifugação a 10.000 x g por 90 min. A pasta de célula pode ser congelada a -70 a -80 °C. Nas modalidades, a pasta de célula é reconstituída antes da ruptura em uma solução que contém uma concentração de um agente desagregante suficiente para evitar a agregação de CSP sem a desnaturação da CSP. Em CSP não desnaturada, as ligações de dissulfeto de região C-terminal são intatas. Nas modalidades, o agente desagregante é ureia. Nas modalidades, o agente desagregante é, por exemplo, arginina, cloridrato de guanidina, um detergente ou qualquer outro agente desagregante adequado conhecido na técnica. Nas modalidades, o agente desagregante é um ingrediente que corresponde aos padrões da United States Pharmacopeial Convention (Rockville, MD), conforme publicado na United States Pharmacopeia - National Formulary (USP-NF), ou padrões análogos em países além dos Estados Unidos, por exemplo, conforme publicado na International Pharmacopeia (Organização Mundial da Saúde). Em determinadas modalidades, o agente desagregante é 2 M de ureia. Nas modalidades, o agente desagregante compreende ureia em uma concentração final de cerca de 0,5 M a cerca de 4 M. Nas modalidades, a concentração de ureia é de cerca de 2,5 M, cerca de 3 M, cerca de 1 a cerca de 2 M, cerca de 1 a cerca de 2,5 M, cerca de 1 a cerca de 3 M, cerca de 1,5 a cerca de 2 M, cerca de 1,5 a cerca de 2,5 M, cerca de 1,5 a cerca de 3 M, cerca de 2 a cerca de 2,5 M, cerca de 2 a cerca de 3 M ou cerca de 2,5 a cerca de 3 M. Em determinadas modalidades, uma solução de 2 M de ureia e 20 mM de tris, pH 8,1 ± 0,2, é usada para a reconstituição da pasta de célula. Nas modalidades, a pasta de célula é reconstituída a 20% de sólidos (peso por volume). Nas modalidades, a pasta de célula é reconstituída a menos que 20% de sólidos (peso por volume) . O uso de um agente desagregante por todo o processo da presente invenção é contemplado.

[0195] Conforme descrito no presente documento nos Exemplos, a solução de tampão de agente desagregante e pasta de célula pode ser agitada, por exemplo, com um impulsor de aço inoxidável (Barnant Mixer Series 20, Barnant Co., Barrington, IL ou LabMaster, 0 a 1800 rpm, Lightnin, Rochester, NY) sem deixar que a solução seja submetida a vórtice, até que todas as células sejam descongeladas e a solução fique homogênea. É abrangido pelo conhecimento de um elemento versado na técnica identificar as condições de reconstituição que preparam adequadamente as células para o método desejado de ruptura de célula. Nas modalidades em que as células serão mecanicamente rompidas com o uso de um microfluidificador, o tamanho de particulado é para evitar o entupimento potencial dos canais do microfluidificador.

[0196] Nas modalidades, a cultura de células hospedeiras bacterianas que expressam CSP está presente como caldo de célula total. Nas modalidades, o caldo é diluído para criar uma mistura de 20% (em volume) . Nas modalidades, o tampão de diluição compreende um agente desagregante. Em determinadas modalidades, o tampão de diluição que compreende um agente desagregante é 3,1 M de ureia, 31 mM de tris, pH 8,1 ± 0,2, e é adicionado para render 2 M de ureia e 20 mM de tris em células a 20% (em volume).

RUPTURA DE CÉLULA

[0197] Uma preparação de lisado de célula bacteriana pode ser feita mediante a ruptura de células com o uso de qualquer método adequado conhecido na técnica. A identificação de um método pode ser feita por um elemento versado na técnica, com base, por exemplo, na escala de processamento, reprodutibilidade, dano potencial para a proteína recombinante devido à ruptura e características de lisado particulares exigidas para as etapas de separação planejadas. Um elemento versado na técnica pode estabelecer a força mínima do método de ruptura que irá render o produto de qualidade maior. Os aspectos da qualidade da proteína incluem, porém sem limitação, agregação de ordem maior ou dimerização de proteína, degradação da proteína ou desnaturação da proteína. Esses aspectos podem ser avaliados por métodos descritos no presente documento e conhecidos na técnica. As características da preparação de lisado de célula exigidas para as etapas de separação a jusante podem ser identificadas com o uso de orientação na literatura publicada sobre o método de separação particular. Nas modalidades, para os métodos que incluem centrifugação de pilha de discos, por exemplo, conforme descrito no presente documento, os sólidos são não mais que 10%. Nas modalidades, os sólidos são não mais que 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19% ou 20%. Outras características de lisado potencialmente importantes nas etapas de separação incluem, porém sem limitação, composição de tampão, viscosidade de solução, temperatura do lisado (à medida que afetam a separação na centrífuga).

[0198] As culturas podem ser normalizadas em OD antes da ruptura. Por exemplo, as células podem ser normalizadas para um OD60O de cerca de 10, cerca de 11, cerca de 12, cerca de 13, cerca de 14, cerca de 15, cerca de 16, cerca de 17, cerca de 18, cerca de 19 ou cerca de 20.

[0199] Os métodos para a ruptura de células incluem ruptura física (por exemplo, lise de célula mecânica, homogeneização de líquido, sonicação, congelamento/descongelamento e trituração manual) e permeabilização (por exemplo, ruptura química, ruptura por choque osmótico, ruptura enzimática e ruptura térmica). Um lisado de célula bacteriana útil nos métodos da invenção pode ser feito com o uso de qualquer método adequado para a ruptura de células para liberar a fração solúvel, por exemplo, conforme descrito por: Grabski, A.C., 2009, “Advances in preparation of biological extracts for protein purification”, Methods Enzymol. 463:285 a 303; Hopkins, T.R., 1991, “Physical and chemical cell disruption for the recovery of intracellular proteins”, Bioprocess technology 12: 57 a 83; e Harrison, S.T., 1991, “Bacterial cell disruption: a key unit operation in the recovery of intracellular products”, Biotechnology Advances 9 (2): 217 a 240, todos incorporados ao presente documento a título de referência, em suas totalidades. É abrangido pelas capacidades de um elemento versado na técnica selecionar um método adequado com base nas células e escala de purificação, conhecendo-se as vantagens e desvantagens dos métodos disponíveis. Por exemplo, os tratamentos mecânicos vigorosos reduzem a viscosidade do lisado de célula, mas podem resultar na inativação de proteínas lábeis por calor ou oxidação, enquanto que os tratamentos não mecânicos, por exemplo, permeabilização celular, podem não liberar a proteína alvo a partir das células, e podem produzir lisados de células viscosos. Dependendo do tipo de célula usado para expressar a proteína recombinante, os extratos celulares podem conter quantidades variadas de ácido nucleico, material ribossômico, lipídeos, polissacarídeo de parede celular dispersos, carboidratos, quitina, moléculas pequenas e proteínas indesejadas (por exemplo, proteínas hospedeiras). A produção de um lisado de célula bacteriana que pode ser manipulado de maneira eficaz em processos de purificação a jusante, sem a inativação ou degradação da proteína recombinante, é crítica.

[0200] Os métodos de ruptura mecânica de célula, por exemplo, incluem o uso de um mesclador ou misturador, moinho de esferas ou batedor de esferas. Os métodos homogeneização de líquido incluem microfluidificação, assim como homogeneização com o uso, por exemplo, de um disruptor de célula constante, homogeneizador Niro-Soavi, homogeneizador APV-Gaulin, homogeneizador Dounce, homogeneizador Potter-Elvehjem ou prensa francesa. Outros procedimentos de ruptura física incluem sonicação, congelamento/descongelamento e trituração manual. Os equipamentos úteis para ruptura física estão disponíveis comercialmente.

[0201] Em modalidades específicas, as células são rompidas mecanicamente com o uso de um microfluidificador, por exemplo, de acordo com os métodos descritos no presente documento nos Exemplos e conforme conhecido na técnica e publicado na literatura. Nessas modalidades, um microfluidificador Microfluidics M-110Y que opera a 10.000 ± 1.000 psi pode ser usado para romper as células. O lisado a partir do microfluidificador pode ser passado através de um trocador de calor de casco e tubo, o qual resfria a solução para < 12 °C, e coletado de acordo com qualquer método conhecido na técnica.

[0202] Nas modalidades, qualquer microfluidificador adequado é usado. Nas modalidades, pelo menos um agente é adicionado para auxiliar o processo de ruptura de célula. Por exemplo, as células podem ser suspensas em um tampão hipotônico. Lisozima adicionada em, por exemplo, 200 μg/ml, digere o componente de polissacarídeo de paredes celulares bacterianas. Nas modalidades, as células são tratadas com esferas de vidro para facilitar a trituração de paredes celulares. Nas modalidades, um inibidor de protease é adicionado em qualquer momento durante o processo de purificação. Em determinadas modalidades, um inibidor de protease é adicionado antes ou durante a lise.

LIBERAÇÃO PERIPLASMÁTICA POR CHOQUE OSMÓTICO

[0203] Nas modalidades, a rCSP é direcionada para o periplasma com o uso de um líder periplasmático, conforme descrito no presente documento, e um lisado de célula bacteriana é gerado permeabilizando a parede celular. Por exemplo, nas modalidades, os reagentes de lise química e/ou enzimática, tal como enzima lítica de parede celular e EDTA, podem ser usados. O uso de culturas congeladas ou armazenadas anteriormente também é contemplado nos métodos da invenção. As células podem ser permeabilizadas por choque osmótico, por exemplo, conforme descrito no presente documento nos exemplos ou conforme conhecido na técnica e relatado na literatura.

PURIFICAÇÃO DE DÍMEROS DE CSP RECOMBINANTE

[0204] Nos métodos da invenção, os dímeros de rCSP na preparação de lisado de célula bacteriana são separados das impurezas que incluem detritos de célula hospedeira e proteínas de célula hospedeira. Nas modalidades, a purificação é executada para separar sequencialmente a rCSP dos detritos de célula e das proteínas de célula hospedeira. Por exemplo, o lisado pode ser primeiramente separado em frações solúveis e insolúveis, então, os dímeros de rCSP presentes na fração solúvel podem ser separados das proteínas de célula hospedeira e outras impurezas. Em outras modalidades, os dímeros de rCSP são separados dos detritos de célula e das proteínas de célula hospedeira na mesma etapa ou série de etapas. Nas modalidades, a cromatografia de leito expandido, onde o lisado é passado sobre um leito cromatográfico que remove por separação tanto os detritos de célula como as proteínas de célula hospedeira, é usada. As etapas adicionais de purificação podem seguir a cromatografia de leito expandido para remover contaminantes restantes.

SEPARAÇÃO DA PREPARAÇÃO DE LISADO DE CÉLULA BACTERIANA EM FRAÇÃO SOLÚVEL E INSOLÚVEL

[0205] Nos métodos de purificação da presente invenção, a preparação de lisado de célula bacteriana que compreende proteína recombinante é separada em uma fração solúvel e uma fração insolúvel. Esse processo remove os detritos para clarificar a fração solúvel contendo a proteína recombinante. Nas modalidades, a preparação de lisado de célula bacteriana a ser separada em fração solúvel e insolúvel compreende células recém lisadas. Em outras modalidades, a preparação de lisado de célula bacteriana é submetida a uma ou mais manipulações ou tratamentos antes de ser separada em uma fração solúvel e uma fração insolúvel. Essas manipulações, ou pré- tratamentos de clarificação, podem incluir o tratamento para facilitar manipulações futuras ou otimizar a qualidade ou recuperação de proteína recombinante conforme desejado. Por exemplo, a preparação de lisado de célula bacteriana pode ser diluída ou tratada com pelo menos um reagente, por exemplo, um floculante ou coagulante. Os floculantes, que incluem sulfato de amônio e PEG, otimizam a precipitação da fração insolúvel da preparação de lisado de célula bacteriana, otimizando, assim, a separação da fração insolúvel a partir da fração solúvel. Nas modalidades, uma nuclease, por exemplo, DNase (25 a 50 μg/ml) e/ou RNase (50 μg/ml), é adicionada à preparação de lisado de célula bacteriana para reduzir sua viscosidade.

[0206] Os métodos para a separação de um lisado de célula bacteriana em uma fração solúvel, que compreende proteínas solúveis, e uma fração insolúvel, que compreende detritos de célula, são bem conhecidos na técnica. Qualquer método ou combinação de métodos para a separação de líquidos e sólidos considerados adequados por um elemento versado na técnica é contemplado para o uso em associação aos métodos da presente invenção. Os métodos úteis incluem, porém sem limitação, centrifugação, filtração, sedimentação e outros métodos de clarificação, e combinações dos mesmos. Em determinadas modalidades, a centrifugação é realizada para separar partículas de detritos de célula maiores a partir da proteína recombinante, seguido de um método de filtração que separa partículas de detritos menores. Em determinadas modalidades, a microfiltração é executada na ausência de centrifugação ou outros métodos.

MÉTODOS DE SEPARAÇÃO - FRAÇÃO SOLÚVEL E INSOLÚVEL CENTRIFUGAÇÃO

[0207] Uma ou mais métodos de centrifugação podem ser usados para separar o lisado de célula bacteriana em uma fração solúvel (líquida) e insolúvel (sólida). Os métodos de centrifugação úteis para a separação de um lisado de célula bacteriana em uma fração solúvel e insolúvel incluem, por exemplo, centrifugação de ângulo fixo, centrifugação de pilha de discos, centrifugação de cuba tubular e centrifugação por lote com o uso de uma centrífuga de chão.

[0208] A centrifugação pode ser executada com o uso de qualquer equipamento e método adequado. A centrifugação de cultura ou lisado de célula para os propósitos de separar uma fração solúvel de uma fração insolúvel é bem conhecida na técnica e descrita extensivamente na literatura, por exemplo, em Methods in Enzymology (1990), editado por M. P. Deutscher, e por Ausubel, F.M., et al., 1991. Por exemplo, as células lisadas podem ser centrifugadas em 20.800 x g por 20 minutos (a 4 °C), e os sobrenadantes removidos com o uso de manuseio de líquido manual ou automatizado. A fração de pélete (insolúvel) pode ser ressuspensa em uma solução tamponada, por exemplo, solução salina tamponada com fosfato (PBS), pH 7,4. A ressuspensão pode ser realizada com o uso, por exemplo, de equipamentos como impulsores conectados a um misturador suspenso, barras de agitação magnética, agitadores oscilantes, etc.

[0209] Nas modalidades da presente invenção, o lisado de célula bacteriana é separado em fração solúvel e insolúvel com o uso de uma série de procedimentos, por exemplo, centrifugação seguida de um ou mais procedimentos de centrifugação adicionais ou um ou mais procedimentos de filtração ou sedimentação. Cada procedimento clarifica a fração solúvel.

[0210] Nas modalidades, a separação é realizada com o uso de centrifugação de pilha de discos, conforme descrito no presente documento. Em centrifugação de pilha de discos, uma centrífuga de pilha de discos separa os sólidos e uma ou duas fases líquidas um do outro em um processo contínuo. Os sólidos mais densos são forçados para fora por forças centrífugas, enquanto que as fases líquidas menos densas formam camadas concêntricas internas. Placas especiais são inseridas onde as fases líquidas se encontram para alcançar eficiência de separação máxima. Os sólidos podem ser removidos de maneira manual, intermitente ou contínua. Os líquidos transbordam na área de saída no topo da cuba. Diferentes fases líquidas podem ser direcionadas para câmaras de separação e vedadas uma em relação à outra para evitar contaminação cruzada. As centrífugas de pilha de discos podem ser usadas para separar fases com diferenças de densidade mínimas.

[0211] Nas modalidades da invenção, em que a centrifugação de pilha de discos é usada para separar a preparação de lisado de célula bacteriana em fração solúvel e insolúvel, 20 por cento (peso por volume ou em volume) de lisados são diluídos 1:1 com água purificada Super Q ou 2 M de ureia, 20 mM de Tris, pH 8,0 e misturada cuidadosamente pela recirculação com uma bomba peristáltica ou por um impulsor de aço inoxidável, para criar 10% (peso por volume ou em volume) de lisados homogeneizados. Uma centrífuga de pilha de discos, por exemplo, uma centrífuga SC-6 (GEA Westfalia, Olede, Alemanha) é operada em 15.000 x g. Com o uso de bombas peristálticas e tubagem de silicone curado com platina, 10% e 20% de lisados são alimentados para a centrífuga em taxas de fluxo de 0,3 a 1,0 l/min. em temperaturas de 15 a 22 °C. A contrapressão do concentrado é mantida em 0,5 a 0,6 MPa (75 a 85 psig). Os concentrados são deixados sair da SC-6, com e sem troca de calor, a 12 a 30 °C, e podem ser coletados em vasos de polipropileno ou bolsas Flexboy®. As partículas/frações insolúveis são descarregadas de forma intermitente em intervalos determinados e o ciclo se repete. A turbidez em linha e em tempo real pode ser coletada no concentrado através de um medidor de absorção de infravermelho próximo (NIR) de canal único AF16 (Optek-Danulat, Germantown, WI) e relatada como uma porcentagem de unidade de concentração (CU) de uma faixa calibrada. As amostras de volume e instantâneas do concentrado podem ser tomadas para a medição de unidade de turbidez nefelométrica (NTU) com um Hach 2100p (Loveland, Colorado). A redução de turbidez (1 - NTUconcentrado/NTUalimentação) é útil para avaliar o desempenho da centrífuga, com > 90% de redução sendo um bom nível para iniciar a otimização adicional.

FILTRAÇÃO PROFUNDA

[0212] Nas modalidades, a preparação de lisado de célula bacteriana é clarificada ou adicionalmente clarificada após a centrifugação com o uso de filtração profunda. Nas modalidades, a separação da fração solúvel e insolúvel é realizada por centrifugação de pilha de discos, seguida de filtração profunda. Nas modalidades em que a filtração profunda é usada, as partículas abaixo de 0,2 μm são removidas com o uso de uma combinação de filtros estéreis e profundos. Em determinadas modalidades, os filtros profundos e de membrana são avaliados acerca de sua adequabilidade na filtração de sobrenadantes e concentrados. Nas modalidades, os sobrenadantes e concentrados (por exemplo, lisados de 10% de pastas de célula ou caldo de célula total) são bombeados através de filtros profundos a 18 a 28 °C em 50 a 100 LMH. Nas modalidades, a fração solúvel de uma preparação de lisado de célula bacteriana que tem sido separada com o uso de um método de centrifugação, por exemplo, centrifugação de pilha de discos, é bombeada através de filtros de membrana em 0,07 MPa (10 psig) para estabelecer um valor Vmax.

[0213] Os exemplos não limitadores de filtros profundos úteis nos métodos da invenção, em que a preparação de lisado de célula bacteriana é separada em fração solúvel e insolúvel com o uso de filtração profunda, são: filtros profundos Millipore C0HC, A1HC, B1HC e X0HC, CUNO 60ZA e CUNO 90ZA. Os filtros podem ser avaliados com base, por exemplo, em limitações de pressão em uma carga de alimentação de <20 l/m2 ou redução em turbidez. Nas modalidades, um filtro profundo útil na prática de filtração profunda, de acordo com os métodos da invenção, tem uma matriz que tem poros pequenos e alta densidade de carga, e não tem uma membrana nominal de 0,1 μm, a qual muitas vezes entope e conduz à falha de pressão. Nas modalidades, o filtro usado exibe uma queda de pressão de ^ 30 psi e/ou uma redução de turbidez a uma carga de alimentação de 40 l/m2. Nas modalidades, o filtro profundo usado na prática de filtração profunda, de acordo com os métodos da invenção, é um filtro Millipore X0HC.

MICROFILTRAÇÃO

[0214] A microfiltração (MF) é um processo escalonável que em uma unidade a operação remove sólidos e fornece uma corrente de alimentação que pode ser usada diretamente para cromatografia. Nas modalidades, a separação da fração solúvel e insolúvel é realizada com o uso de microfiltração sem centrifugação anterior. Nas modalidades, a microfiltração inclui filtração de fluxo tangencial (TFF) com o uso de membranas com poros na faixa de mícron a submícron. Nas modalidades, os poros sãos de 0,22 a 0,45 μm. De forma ideal, as partículas maiores que o tamanho de poro da membrana, como os detritos de célula, são retidas (retentado), enquanto que aquelas menores que o tamanho de poro se difundem através da membrana com outros solutos e solventes (permeado). Para a recuperação de rCSP, é desejado reter os detritos de célula no retentado e coletar a rCSP no permeado através de concentração e troca de tampão.

[0215] A preparação de lisado de célula bacterianas de 5 a 20% (peso por volume) de sólidos pode ser concentrada a 40% (peso por volume) de sólidos através da filtração de fluxo tangencial e diafiltrada por 1 a 3 DVs (diavolumes) com 2 M de ureia, 20 mM de Tris/20 mM de MES/20 mM de Bis-Tris, pH 6 a 8.

PROCESSO DE CONGELAMENTO-DESCONGELAMENTO

[0216] Nas modalidades, o lisado é congelado e descongelado antes das etapas de processamento adicionais, por exemplo, as etapas para remover proteínas de células hospedeiras. Dependendo do volume, o lisado pode ser dividido em alíquotas para o congelamento mais eficiente. Nas modalidades, cada alíquota de lisado é 100% sólida em cerca de 19 horas ou menos. Nas modalidades, cada alíquota de lisado é 100% sólida em cerca de 18 horas ou menos, cerca de 18,1 horas ou menos, cerca de 18,2 horas ou menos,cercade18,3horasoumenos,cercade18,4horasoumenos, cercade18,5horasoumenos,cercade18,6horasoumenos, cercade18,7horasoumenos,cercade18,8horasoumenos ou cerca de 18,9 horas ou menos. Nas modalidades, cada alíquota de lisado é pelo menos cerca de 65% sólida em cerca de 7 horas ou menos, cerca de 6,9 horas ou menos, cercade6,8horasoumenos,cercade6,7horasoumenos, cercade6,6horasoumenos,cercade6,5horasoumenos, cercade6,4horasoumenos,cercade6,3horasoumenos, cercade6,2horasoumenos,cercade6,1horasoumenosou cercade6horasoumenos.Nasmodalidades,cadaalíquota de lisado é pelo menos cerca de 25% sólida em cerca de 5 horasoumenos,cercade4,9horasoumenos,cercade4,8 horasoumenos,cercade4,7horasoumenos,cercade4,6 horasoumenos,cercade4,5horasoumenos,cercade4,4 horasoumenos,cercade4,3horasoumenos,cercade4,2 horasoumenos,cercade4,1horasoumenosoucercade4 horasoumenos.Nasmodalidades,asalíquotasdelisadosão de lisado é pelo menos cerca de 25% sólida em cerca de 5 horas ou menos, cerca de 4,9 horas ou menos, cerca de 4,8 horas ou menos, cerca de 4,7 horas ou menos, cerca de 4,6 horas ou menos, cerca de 4,5 horas ou menos, cerca de 4,4 horas ou menos, cerca de 4,3 horas ou menos, cerca de 4,2 horas ou menos, cerca de 4,1 horas ou menos ou cerca de 4 horas ou menos. Nas modalidades, as alíquotas de lisado são de cerca de 1 L a cerca de 2 L. Nas modalidades, o lisado é congelado em garrafas PETG de 1 L ou 2 L.

[0217] Nas modalidades, o processo de congelamento e descongelamento inclui a retenção de temperatura ambiente após o lisado ser descongelado. Nas modalidades, o lisado é mantido à temperatura ambiente por pelo menos cerca de 4 a pelo menos cerca de 7 horas, pelo menos cerca de 4,5 a pelo menos cerca de 7 horas, pelo menos cerca de 5 a pelo menos cerca de 7 horas ou pelo menos cerca de 5.5 a pelo menos cerca de 7 horas ou pelo menos cerca de 6 a pelo menos cerca de 7 horas ou pelo menos cerca de 6,5 a pelo menos cerca de 7 horas, pelo menos cerca de 4 a pelo menos cerca de 6 horas, pelo menos cerca de 4,5 a pelo menos cerca de 6 horas, pelo menos cerca de 5 a pelo menos cerca de 6 horas ou pelo menos cerca de 5,5 a pelo menos cerca de 6 horas. Nas modalidades, o lisado é mantido à temperatura ambiente por cerca de 6 horas após o descongelamento.

[0218] Nas modalidades, o processo de congelamento-descongelamento reduz significativamente a presença de espécies de proteína de alto peso molecular ou "encadeamento", no lisado. A presença de encadeamento pode prever um baixo rendimento de rCSP nas etapas de cromatografia subsequentes.

[0219] Nas modalidades, os níveis de precipitação são reduzidos após o processo de congelamento- descongelamento e antes das etapas de processamento adicionais, através de um tratamento que reduz a precipitação a um nível que permite a conclusão bem sucedida das etapas de cromatografia, por exemplo, cromatografia TMAE. Por exemplo, o nível de precipitação deve ser baixo o bastante para permitir a cromatografia normal. Nas modalidades, o método usado para reduzir a precipitação a um nível aceitável não resulta em corte N- terminal aumentado em comparação ao uso de nenhum tratamento para reduzir a precipitação. Nas modalidades, os níveis de precipitado de lisado são reduzidos pela filtração por membrana após o descongelamento ou após a retenção de temperatura ambiente após o descongelamento. Nas modalidades, Sartobran P (0,45 μm/0,2 μm) . Os filtros de membrana são usados para a filtração por membrana do lisado. Nas modalidades, tal procedimento de filtração é realizado em qualquer etapa durante o processo de purificação. Nas modalidades, a rCSP é submetida à filtração por membrana após a última coluna e antes da etapa de troca de tampão.

SEPARAÇÃO DA RCSP DAS PROTEÍNAS DE CÉLULAS HOSPEDEIRAS NA FRAÇÃO SOLÚVEL

[0220] Os métodos para separar as proteínas recombinantes das proteínas de células hospedeiras, e o uso de um ou mais métodos de separação selecionados com base nas características da proteína recombinante, são conhecidos na técnica e descritos detalhadamente na literatura, por exemplo, em Methods in Enzymology (1990), editado por M. P. Deutscher. Os métodos de separação podem ser selecionados com base nas diferenças nas propriedades da proteína recombinante e dos contaminantes, por exemplo, propriedades de tamanho, carga, ligação e solubilidade. Os protocolos que se baseiam nesses parâmetros podem incluir cromatografia de afinidade, cromatografia de troca iônica, cromatografia de exclusão por tamanho, cromatografia de interação hidrofóbica e cromatografia de modo misto. Nas modalidades, os métodos de separação servem para concentrar a proteína recombinante.

[0221] Os métodos de separação exemplificativos são descritos no presente documento, entretanto, nas modalidades, qualquer método conhecido ou combinação de métodos para separar a rCSP das proteínas de células hospedeiras, espécies de rCSP indesejadas ou outras impurezas e/ou para concentrar a proteína recombinante, é utilizado conforme apropriado. Os métodos de separação desejáveis resultam na purificação do monômero CSP não degradado, não desnaturado após a redução preferencial do dímero de rCSP, conforme descrito no presente documento. Nas modalidades, a rCSP (monômero) obtida é adicionalmente separada das impurezas restantes, incluindo as proteínas de células hospedeiras.

CROMATOGRAFIA

[0222] Nas modalidades, a cromatografia é usada para separar o dímero de rCSP das proteínas de células hospedeiras, espécies de rCSP indesejadas ou outras impurezas presentes na fração solúvel obtida através da separação da preparação de lisado celular bacteriano. Nas modalidades, uma baixa concentração de agente de desagregação está presente durante a cromatografia, para evitar a agregação sem reduzir a ligação de dissulfeto intermolecular no dímero (que une os monômeros) e sem desnaturar adicionalmente as ligações de dissulfeto intramoleculares da CSP. Nas modalidades, a baixa concentração de agente de desagregação é de cerca de 2 M de ureia. Em determinadas modalidades, a fração solúvel de lisado celular bacteriano está presente em 20 mM de Tris, pH 8,0 e 2 M de ureia.

[0223] Muitos tipos de cromatografia são conhecidos na técnica e descritos na literatura, por exemplo, em Methods in Enzymology (1990), editado por M. P. Deutscher.

[0224] Nas modalidades, a cromatografia de troca iônica é usada. Na cromatografia de troca iônica, por exemplo, a cromatografia de troca aniônica ou catiônica, a proteína recombinante é ligada a cargas fixas, por exemplo, em um substrato, tal como, uma coluna. Embora a proteína recombinante seja imobilizada, os contaminantes não mobilizados são eliminados. A proteína recombinante é posteriormente eluída ou deslocadas das cargas fixas. Os substratos ou trocadores de íons úteis na realização dos métodos da presente invenção são conhecidos na técnica e incluem, porém, não se limitam a celulose, dextranos, agarose e poliestireno. Uma coluna de qualquer tamanho ou qualquer outro sistema conhecido apropriado útil para cromatografia de troca iônica, por exemplo, a cromatografia de troca iônica em batelada, é considerada para uso nos métodos da invenção. Nas modalidades, a cromatografia de troca aniônica, cromatografia de troca catiônica, ou ambas, são usadas.

[0225] A cromatografia de interação hidrofóbica (HIC) se baseia em uma interação hidrofóbica entre a fase estacionária e o componente a ser separado. Os métodos HIC incluem uma fase estacionária hidrofóbica e uma fase móvel polar. Os componentes polares preferem a fase móvel e eluem primeiro. À medida que o caráter hidrofóbico de um composto aumenta, a retenção se torna mais longa. Geralmente, quanto mais baixa a polaridade da fase móvel, mais alta é sua força eluente. A adsorção e a dessorção são suportadas pelo aumento ou diminuição, respectivamente, da concentração de sal do líquido ou alteração da carga no ligando e/ou a substância a ser adsorvida/dessorvida alterando-se o pH. Os métodos HIC são descritos na literatura, por exemplo, no documento no WO 96/00735, “Hydrophobic Chromatographic Resins with Ionizable Groups”, documento no WO 96/09116 e patente U.S. no 5.652.348, “Chromatographic Resins and Methods for Using Same”, todos incorporados a título de referência no presente documento em sua totalidade. Um método de separação de interação hidrofóbica pode se basear em adsorventes tiofílicos, conforme descrito, por exemplo, na patente U.S. no 8.138.306, “Separation Method”, incorporada no presente documento a título de referência em sua totalidade. A patente U.S. no 8.138.306 também descreve o uso de uma matriz de separação que inclui ligandos não carregados que possuem um momento quadripolar ou dipolar.

[0226] Nas modalidades da presente invenção, a HIC do dímero ou monômero de rCSP é realizada usando qualquer grupo hidrofóbico apropriado, por exemplo, hexila, fenila, octila ou butila. As resins hidrofóbicas são comercialmente disponíveis e incluem, por exemplo, Hexyl 650C (Tosoh USA), Phenyl HP (GE, 17-5195-01), Butyl HP (GE, 28-4110-01), PPG 600M (Tosoh USA) e MEP HyperCel (Pall). Nas modalidades, a HIC é realizada após iniciar a etapa de redução moderada (sob as condições de redução preferenciais). Nas modalidades, a etapa de purificação HIC reduz de maneira bem sucedida o nível de proteínas de células hospedeiras a no máximo 500 ppm, no máximo 450 ppm, no máximo 400 ppm, no máximo 350 ppm, no máximo 300 ppm, no máximo 250 ppm, no máximo 200 ppm, no máximo 150 ppm, no máximo 100 ppm, no máximo 50 ppm, no máximo 40 ppm, no máximo 3 0 ppm, no máximo 20 ppm, no máximo 10 ppm, no máximo 5 ppm ou a um nível não detectável. Nas modalidades, a etapa de purificação HIC de maneira bem sucedida reduz o nível de proteínas de células hospedeiras a no máximo 50 ppm, no máximo 4 0 ppm, no máximo 3 0 ppm, no máximo 2 0 ppm ou no máximo 10 ppm, conforme detectado por um ELISA. Nas modalidades, o corte N-terminal de rCSP observado após a etapa de purificação HIC é de no máximo 5%, no máximo 4%, no máximo 3%, no máximo 2%, no máximo 1,5%, no máximo 1%, no máximo 0,5% ou não detectável. Nas modalidades, a etapa de purificação HIC resulta em rCSP de pelo menos 98%, pelo menos 98,5%, pelo menos 99% ou pelo menos 99,5% de pureza. Nas modalidades, a etapa de purificação HIC resulta em uma concentração de rCSP de pelo menos cerca de 0, 1 mg/ml a cerca de 2 mg/ml. Nas modalidades, a etapa de purificação HIC resulta em uma concentração de rCSP de pelo menos cerca de 0,15 mg/ml a cerca de 2 mg/ml, pelo menos cerca de 0,2 mg/ml a cerca de 2 mg/ml, pelo menos cerca de 0,25 mg/ml a cerca de 2 mg/ml, pelo menos cerca de 0,3 mg/ml a cerca de 2 mg/ml, pelo menos cerca de 0,35 mg/ml a cerca de 2 mg/ml, pelo menos cerca de 0,4 mg/ml a cerca de 2 mg/ml, pelo menos cerca de 0,45 mg/ml a cerca de 2 mg/ml, pelo menos cerca de 0,5 mg/ml a cerca de 2 mg/ml, pelo menos cerca de 0,1 mg/ml a cerca de 1 mg/ml, pelo menos cerca de 0,15 mg/ml a cerca de 1 mg/ml, pelo menos cerca de 0,2 mg/ml a cerca de 1 mg/ml, pelo menos cerca de 0,25 mg/ml a cerca de 1 mg/ml, pelo menos cerca de 0,3 mg/ml a cerca de 1 mg/ml, pelo menos cerca de 0,35 mg/ml a cerca de 1 mg/ml, pelo menos cerca de 0,4 mg/ml a cerca de 1 mg/ml, pelo menos cerca de 0,45 mg/ml a cerca de 1 mg/ml, pelo menos cerca de 0,5 mg/ml a cerca de 1 mg/ml. Em determinadas modalidades, a etapa de purificação HIC reduz o nível de proteínas de células hospedeiras a no máximo 50 ppm, e o corte N- terminal é de no máximo 1%.

[0227] Nas modalidades, a HIC é usada para separar as espécies de rCSP indesejadas, por exemplo, as espécies N-terminalmente cortadas a partir de espécies de comprimento total. Nas modalidades, as espécies indesejadas removidas incluem, por exemplo, agregados de alto peso molecular, espécies dimerizadas e espécies desnaturadas. Nas modalidades, a HIC aumenta a rCSP total em cerca de 5 a cerca de 15%, conforme medida por RP-HPLC. Nas modalidades, o aumento é de cerca de 8 a cerca de 12%, cerca de 9 a cerca de 11%, pelo menos cerca de 8%, pelo menos cerca de 9%, pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 1% ou pelo menos cerca de 12%.

[0228] Nas modalidades, a HIC é realizada usando uma coluna Hexyl 650C com uma eluição por gradiente ou uma eluição por etapas. Nas modalidades, a HIC é realizada após a redução com MTG, usando uma coluna Hexyl 650C com uma eluição por gradiente de sulfato de amônio de 0,5 a 0 M ou 1,0 a 0M.

[0229] Os métodos de cromatografia também se baseiam na afinidade entre o ligando e o composto a ser separado. Os exemplos de afinidades úteis são afinidade anticorpo-antígeno, afinidade por íons metálicos e afinidade receptor-ligando. As proteínas podem ser separadas com base no tamanho, através da cromatografia de exclusão por tamanho. Os métodos de exclusão por tamanho incluem, por exemplo, filtração em gel.

[0230] Os métodos de cromatografia de modo misto separam as proteínas baseadas em uma combinação de parâmetros de separação. Por exemplo, a combinação de dois ou mais dos princípios de separação de troca iônica conhecidos foi denotada por trocadores de íons de modo misto. Consulte, por exemplo, o documento no WO 97/29825, “Process for Chromatographic Separation of Peptides and Nucleic Acid, and New High Affinity Ion Exchange Matrix”, que descreve os trocadores de ânions de modo misto.

[0231] Os ligandos de sal elevados (HSL) descritos, por exemplo, na patente U.S. no 8.138.306, podem funcionar como ligandos de troca catiônica de modo misto e têm demonstrado ser de interesse em aplicações industriais, tal como, a purificação de proteína, uma vez que os mesmoS podem suportar altas concentrações de sal e, consequentemente, não requerem diluição substancial da amostra.

[0232] Nas modalidades da presente invenção, a cromatografia de modo misto é usada para separar a rCSP das proteínas de células hospedeiras. Nas modalidades específicas, a cromatografia de hidroxiapatita é usada. Nas modalidades, a protease de célula hospedeira responsável por cortar o N-terminal da CSP é separada da rCSP por cromatografia de hidroxiapatita. Nas modalidades, a carga TMAE é usada na cromatografia de hidroxiapatita.

[0233] A cromatografia de hidroxiapatita é um método de purificação de proteínas que utiliza um fosfato de cálcio hidroxilado insolúvel [Ca1o(PO4)e(OH)2], que forma tanto a matriz como o ligando. Os grupos funcionais consistem em pares de íons de cálcio positivamente carregados (sítios C) e agrupamentos de grupos fosfato negativamente carregados (sítios P) . As interações entre hidroxiapatita e proteínas são complexas e multimodais. Em um método de interação, os grupos amino positivamente carregados em proteínas associadas aos sítios P negativamente carregados e os grupos carboxil proteínas interagem através da complexação em coordenação com os sítios C. As proteínas ácidas e básicas geralmente interagem com a resina cHA através de mecanismos diferentes: uma proteína ácida geralmente se liga aos sítios C através de uma ligação de coordenação ao grupo carboxila, enquanto uma proteína básica se liga aos sítios P através da interação de carga com os grupos amina. A cromatografia de hidroxiapatita cerâmica (cHA) supera algumas dificuldades associadas à hidroxiapatita cristalina, tais como, taxas de fluxo limitadas. A hidroxiapatita cerâmica tem alta durabilidade, boa capacidade de ligação à proteína e pode ser usada em taxas e pressões de fluxo mais altas que a hidroxiapatita cristalina. A separação cromatográfica usando cHA pode ser realizada em diversos modos distintos, tais como, modo de ligação, modo de fluxo passante ou uma combinação de modo de ligação/fluxo passante. Os métodos de uso de cromatografia de hidroxiapatita cerâmica são descritos, por exemplo, na patente U.S. no 8.058.407, “Purification of acidic proteins using ceramic hydroxyapatite chromatography”, incorporada a título de referência no presente documento em sua totalidade.

TROCA DE TAMPÃO

[0234] Nas modalidades, a troca de tampão é realizada após a iniciação do tratamento de redução preferencial. A troca de tampão pode remover determinados reagentes indesejados, por exemplo, reagentes redutores indesejados. Nas modalidades, a troca de tampão remove sais, ureia e/ou DTT. Qualquer método de troca de tampão que não permite que a rCSP forme prontamente agregados de peso molecular mais alto (por exemplo, tetrâmeros, hexâmeros e oligômeros) é útil nos métodos da invenção. Nas modalidades, a troca de tampão é realizada por métodos de diafiltração, por exemplo, cromatografia de filtração em gel (dessalinização) ou filtração de fluxo tangencial (TFF) com uma membrana UF/DF. Nas modalidades, a troca de tampão é realizada usando TFF com uma membrana UF/DF de cerca de 5 a cerca de 10 kDa de MWCO. Nas modalidades, a membrana UF/DF tem cerca de 5 a cerca de 9 kDa de MWCO, cerca de 5 a cerca de 8 kDa de MWCO, cerca de cerca de 5 a cerca de 7 kDa de MWCO ou cerca de 5 a cerca de 6 kDa de MWCO. Em determinadas modalidades, a troca de tampão é realizada usando TFF com uma membrana UF/DF de cerca de 5 kDa de MWCO. Nas modalidades, as membranas são equilibradas com 1x PBS antes da introdução do produto. Nas modalidades, a rCSP é trocada em um tampão no qual a rCSP é estável.

[0235] Nas modalidades, a rCSP moderadamente reduzida (monomerizada) é recirculada ao longo das membranas em 324 LMH (litros/m2/hora) e 720 LMH a cerca de 21 °C a 23 °C. Nas modalidades, um tampão de formulação que mantém a estabilidade de rCSP é recirculado ao longo das membranas. Nas modalidades, 1X de PBS, 10% (p/v) de arginina-HCl (0,5 M de arginina-HCl) (disponível, por exemplo, junto a J.T. Baker, número de peça 2067), 1 mM de monotioglicerol (disponível, por exemplo, junto a MP BIOMEDICALS, Santa Ana, CA, número de catálogo 155727 ou Research Organic, Cleveland, OH, número de catálogo 0178M), o pH 6,4 é recirculado ao longo das membranas em 324 LMH à temperatura ambiente (21 a 23 °C). Nas modalidades, uma TMP de 21 a 24 psi é aplicada ao retentado (carga diafiltrada) enquanto ao longo da membrana de 5 kDa. Nas modalidades, TMPs de 10 a 15 psi e 21 a 24 psi são aplicadas aos retentado enquanto ao longo da membrana das membranas de 5 kDa. Nas modalidades, a diafiltração de volume constante é realizada em múltiplos, por exemplo, 5 a 10 volumes de retentado (diavolumes). Nas modalidades, após diversos diavolumes, por exemplo, 3 a 10, o retentado é concentrado 2x e diafiltrado em outros diversos diavolumes, por exemplo, 3 a 10. O retentado é concentrado e diluído em 1,0 mg/mL. A rCSP purificada final é armazenada congelada a -80 °C.

FORMULAÇÃO LÍQUIDA ESTÁVEL DE RCSP

[0236] A rCSP purificada final pode ser diafiltrada em um tampão de formulação líquida para gerar uma formulação líquida estável de rCSP. Nas modalidades, a formulação líquida estável de rCSP permite que rCSP seja estavelmente mantida em alta concentração. Nas modalidades, a rCSP no tampão de formulação líquida mantém sua estabilidade física e química durante o armazenamento. A estabilidade da formulação líquida de rCSP pode ser avaliada após períodos de tempo selecionados a uma determinada temperatura. Os indicadores negativos de estabilidade de rCSP (ou indicadores de instabilidade) incluem, por exemplo, uma redução na quantidade ou porcentagem de monômero de rCSP (% de rCSP total), um aumento na quantidade ou porcentagem de dímero, um aumento nos agregados, um aumento nos produtos de degradação, um aumento na desnaturação, uma redução na porcentagem ou fração de rCSP determinada a ser ativa. Nas modalidades, os indicadores da qualidade de rCSP, conforme descrito no presente documento, são usados para indicar a estabilidade, à medida que a estabilidade pode ser considerada uma medida de qualidade ao longo do tempo. De maneira similar, os indicadores de estabilidade de rCSP também podem ser usados para indicar a qualidade de rCSP. Nas modalidades, a estabilidade de rCSP em uma formulação líquida estável é indicada pela presença ou manutenção de uma quantidade mínima de monômeros de rCSP, por exemplo, pelo menos cerca de 80% a cerca de 100% da proteína total. Nas modalidades,manutençãodecercade81%acercade100%,cercade82%a cercade100%,cercade83%acercade100%,cercade84%a cercade100%,cercade85%acercade100%,cercade86%a cercade100%,cercade87%acercade100%,cercade88%a cercade100%,cercade89%acercade100%,cercade90%a cercade100%,cercade91%acercade100%,cercade92%a cercade100%,cercade93%acercade100%,cercade94%a cercade100%,cercade95%acercade100%,cercade96%a cercade100%,cercade97%acercade100%,cercade98%a cercade100%,cercade99%acercade100%,cercade80%a cercade99%,cercade81%acercade99%,cercade82%a cercade99%,cercade83%acercade99%,cercade84%a cercade99%,cercade85%acercade99%,cercade86%a cercade99%,cercade87%acercade99%,cercade88%a cercade99%,cercade89%acercade99%,cercade90%a cercade99%,cercade91%acercade99%,cercade92%a cercade99%,cercade93%acercade99%,cercade94%a cercade99%,cercade95%acercade99%,cercade96%a cercade99%,cercade97%acercade99%,cercade98%a cercade99%,cercade80%acercade98%,cercade81%a cercade98%,cercade82%acercade98%,cercade83%a 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cercade96%,cercade93%acercade96%,cercade94%a cercade96%,cercade95%acercade96%,cercade80%a cercade95%,cercade81%acercade95%,cercade82%a cercade95%,cercade83%acercade95%,cercade84%a cercade95%,cercade85%acercade95%,cercade86%a cercade95%,cercade87%acercade95%,cercade88%a cercade95%,cercade89%acercade95%,cercade90%a cercade95%,cercade91%acercade95%,cercade92%a cercade95%,cercade93%acercade95%,cercade94%a cercade95%,cercade80%acercade94%,cercade81%a cercade94%,cercade82%acercade94%,cercade83%a cercade94%,cercade84%acercade94%,cercade85%a cercade94%,cercade86%acercade94%,cercade87%a cercade94%,cercade88%acercade94%,cercade89%a cercade94%,cercade90%acercade94%,cercade91%a cercade94%,cercade92%acercade94%,cercade93%a cercade94%,cercade80%acercade93%,cercade81%a cercade93%,cercade82%acercade93%,cercade83%a cercade93%,cercade84%acercade93%,cercade85%a cercade93%,cercade86%acercade93%,cercade87%a cercade93%,cercade88%acercade93%,cercade89%a cercade93%,cercade90%acercade93%,cercade91%a cercade93%,cercade92%acercade93%,cercade80%a cercade92%,cercade81%acercade92%,cercade82%a cercade92%,cercade83%acercade92%,cercade84%a cercade92%,cercade85%acercade92%,cercade86%a cercade92%,cercade87%acercade92%,cercade88%a cercade92%,cercade89%acercade92%,cercade90%a cercade92%,cercade91%acercade92%,cercade80%a cercade91%,cercade81%acercade91%,cercade82%a cercade91%,cercade83%acercade91%,cercade84%a cercade91%,cercade85%acercade91%,cercade86%a cercade91%,cercade87%acercade91%,cercade88%a cercade91%,cercade89%acercade91%,cercade90%a cercade91%,cercade80%acercade90%,cercade81%a cercade90%,cercade82%acercade90%,cercade83%a cercade90%,cercade84%acercade90%,cercade85%a cercade90%,cercade86%acercade90%,cercade87%a cercade90%,cercade88%acercade90%,cercade89%a cercade90%,cercade80%acercade89%,cercade81%a cercade89%,cercade82%acercade89%,cercade83%a cercade89%,cercade84%acercade89%,cercade85%a cercade89%,cercade86%acercade89%,cercade87%a cercade89%,cercade88%acercade89%,cercade80%a cercade88%,cercade81%acercade88%,cercade82%a cercade88%,cercade83%acercade88%,cercade84%a cercade88%,cercade85%acercade88%,cercade86%a cerca de 88%, cerca de 87% a cerca de 88%, cerca de 80%, cerca de 81%, cerca de 82%, cerca de 83%, cerca de 84%, cerca de 85%, cerca de 86%, cerca de 87%, cerca de 88%, cerca de 89%, cerca de 90%, cerca de 91%, cerca de 92%, cerca de 93%, cerca de 94%, cerca de 95%, cerca de 96%, cercade97%,cercade98%,cercade99%oucercade100% de monômeros de rCSP, quando armazenados por pelo menos cerca de 7 dias, pelo menos cerca de 8 dias, pelo menos cerca de 9 dias, pelo menos cerca de 10 dias, pelo menos cercade11dias,pelomenoscercade12dias,pelomenos cercade13dias,pelomenoscercade14dias,pelomenos cercade15dias,pelomenoscercade16dias,pelomenos cercade17dias,pelomenoscercade18dias,pelomenos cercade19dias,pelomenoscercade20dias,pelomenos cercade21dias,pelomenoscercade22dias,pelomenos cercade23dias,pelomenoscercade24dias,pelomenos cercade25dias,pelomenoscercade30dias,pelomenos cercade60dias,pelomenoscercade70dias,pelomenos cercade80dias,pelomenoscercade90dias,pelomenos cercade6mesesoupelomenoscercade1ano.Aquantidade de monômeros de rCSP pode ser determinada, conforme descrito no presente documento, ou por qualquer outro método apropriado conhecido na técnica, por exemplo, SE- HPLC. A quantidade de monômeros de rCSP antes do armazenamento pode ser usada para comparação.

[0237] Nas modalidades, a estabilidade de rCSP em uma formulação líquida estável é indicada por uma taxa máxima de redução no monômero de rCSP, por exemplo, uma redução menor ou igual a cerca de 10% ao longo de cerca de 9 dias a um ano em armazenamento. Nas modalidades, a quantidade de monômero de rCSP em uma formulação líquida estável diminui não mais que cerca de 0%, 0,5%, 1%, 1,5%, 2%, 2,5%, 3%, 3,5%, 4%, 4,5%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19% ou 20%, quando armazenada por pelo menos cerca de 7 dias, pelo menos cerca de 8 dias, pelo menos cerca de 9 dias, pelo menos cerca de de8dias,pelomenoscercade9dias,pelomenoscercade 10dias,pelomenoscercade11dias,pelomenoscercade 12dias,pelomenoscercade13dias,pelomenoscercade 14dias,pelomenoscercade15dias,pelomenoscercade 16dias,pelomenoscercade17dias,pelomenoscercade 18dias,pelomenoscercade19dias,pelomenoscercade 20dias,pelomenoscercade21dias,pelomenoscercade 22dias,pelomenoscercade23dias,pelomenoscercade 24dias,pelomenoscercade25dias,pelomenoscercade 30dias,pelomenoscercade60dias,pelomenoscercade 70dias,pelomenoscercade80dias,pelomenoscercade 90dias,pelomenoscercade6mesesoupelomenoscercade 1 ano. Em determinadas modalidades, a estabilidade de rCSP é indicada por uma taxa máxima de redução no monômero de rCSP menor ou igual a cerca de 1% a cerca de 3% ou a cerca de 5% quando armazenada por cerca de 9 dias a cerca de 25 dias. Em determinadas modalidades, a estabilidade de rCSP é indicada por uma taxa máxima de redução no monômero de rCSP menor ou igual a cerca de 1% quando armazenada por cerca de 9 dias a cerca de 25 dias.

[0238] Nas modalidades, a estabilidade de rCSP em uma formulação líquida estável é indicada, por exemplo, por não mais que um aumento máximo na quantidade de dímeros rCSP, espécies de agregados, espécies desnaturadas ou produtos de degradação. Nas modalidades, a quantidade de dímeros de rCSP, espécies de agregados, espécies desnaturadas e/ou produtos de degradação na formulação líquida estável aumenta em não mais que cerca de 0%, 0,5%, 1%, 1,5%, 2%, 2,5%, 3%, 3,5%, 4%, 4,5%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9% ou10%,quandoarmazenadosporpelomenoscercade7dias, pelo menos cerca de 8 dias, pelo menos cerca de 9 dias, pelomenoscercade10dias,pelomenoscercade11dias, pelomenoscercade12dias,pelomenoscercade13dias, pelomenoscercade14dias,pelomenoscercade15dias, pelomenoscercade16dias,pelomenoscercade17dias, pelomenoscercade18dias,pelomenoscercade19dias, pelomenoscercade20dias,pelomenoscercade21dias, pelomenoscercade22dias,pelomenoscercade23dias, pelomenoscercade24dias,pelomenoscercade25dias, pelomenoscercade30dias,pelomenoscercade60dias, pelomenoscercade70dias,pelomenoscercade80dias, pelomenoscercade90dias,pelomenoscercade6mesesou desnaturadas ou produtos de degradação menor ou igual a cerca de 1% a cerca de 3% ou a cerca de 5% quando armazenados por pelo menos cerca de 20 ou 25 dias. Em determinadas modalidades, a estabilidade de rCSP é indicada por uma taxa máxima de aumento nas espécies de agregados menor ou igual a cerca de 1% quando armazenadas por pelo menos cerca de 20 ou 25 dias. Em determinadas modalidades, a estabilidade de rCSP é indicada por uma taxa máxima de aumento nos produtos de degradação menor ou igual a cerca de 5% quando armazenados por pelo menos cerca de 20 ou 25 dias. Nas modalidades, a estabilidade de rCSP é indicada pela presença de menos de 10% de dímeros de rCSP, espécies de agregados, espécies desnaturadas ou produtos de degradação. Nas modalidades, a estabilidade de rCSP é indicada pela presença de dímeros de rCSP, espécies de agregados, espécies desnaturadas ou produtos de degradação em não mais que 10%, não mais que 9%, não mais que 8%, não mais que 7%, não mais que 6%, não mais que 5%, não mais que 4%, não mais que 3%, não mais que 2% ou não mais que 1% da proteína total ou CSP purificada obtida. As quantidades de dímeros de rCSP, espécies de agregados ou produtos de degradação podem ser determinadas pelos métodos descritos no presente documento ou por qualquer outro método apropriado conhecido na técnica, por exemplo, SE-HPLC. As quantidades antes do armazenamento (por exemplo, a T=0) podem ser usadas para comparação.

[0239] Nas modalidades, a manutenção estável da rCSP é indicada pela quantidade de rCSP total detectada, pela diferença percentual relativa na rCSP total em comparação a um controle ou pela diferença percentual relativa na pureza de rCSP em comparação a um controle. Nas modalidades, a manutenção estável da rCSP é indicada por uma quantidade de rCSP total detectada de cerca de 70% a cerca de 95%, por uma diferença percentual relativa na rCSP total de não mais que cerca de -5% a cerca de 5% em comparação a um controle ou por uma diferença percentual relativa na pureza de rCSP de não mais que cerca de -5% a cerca de 5% em comparação a um controle. Nas modalidades, a diferença percentual relativa na rCSP total ou a diferença percentual relativa na pureza de rCSP é de cerca de -5% a cerca de 5%, cerca de -4% a cerca de 4%, cerca de -3% a cerca de 3%, cerca de -2% a cerca de 2%, cerca de -2% a cerca de 1%, cerca de -2% a cerca de 0,5%, cerca de -2% a cercade0%oucercade0%acercade2%,emcomparaçãoa umcontrole.Nasmodalidades,ocontroleéumpontode tempozeroouumaamostraarmazenadaa180°C.

[0240] Nasmodalidades,aquantidadederCSP totaldetectadaédecercade70%acercade95%,cercade 70%acercade90%,cercade70%acercade85%,cercade 70%acercade80%,cercade75%acercade95%,cercade 75%acercade90%,cercade75%acercade85%,cercade 80%acercade95%,cercade80%acercade90%,cercade 85%acercade95%,cercade72%acercade92%,cercade 70%, cerca de 11%, cerca de 72%, cerca de 73%, cerca de 74%, cerca de 75%, cerca de 76%, cerca de 77%, cerca de 78%, cerca de 79%, cerca de 80%, cerca de 81%, cerca de 82%, cerca de 83%, cerca de 84%, cerca de 85%, cerca de 86%, cerca de 87%, cerca de 88%, cerca de 89%, cerca de 90%,cercade91%,cercade92%,cercade93%,cercade94% oucercade95%.

[0241] Nas modalidades, a rCSP é estavelmente mantida na formulação líquida estável a cerca de 4 °C a cerca de 25 °C. Nas modalidades, a rCSP é mantida na formulação líquida estável a cerca de 4 °C a cerca de 25 °C, cerca de 4 °C a cerca de 24 °C, cerca de 4 °C a cerca de 23 °C, cerca de 4 °C a cerca de 22 °C, cerca de 4 °C a cerca de 21 °C, cerca de 4 °C a cerca de 20 °C, cerca de 4 °C a cerca de 19 °C, cerca de 4 °C a cerca de 18 °C, cerca de 4 °C a cerca de 17 °C, cerca de 4 °C a cerca de 16 °C, cerca de 4 °C a cerca de 15 °C, cerca de 4 °C a cerca de 14 °C, cerca de 4 °C a cerca de 13 °C, cerca de 4 °C a cerca de 12 °C, cerca de 4 °C a cerca de 11 °C, cerca de 4 °C a cerca de 10 °C, cerca de 4 °C a cerca de 9 °C, cerca de 4 °C a cerca de 8 °C, cerca de 4 °C a cerca de 7 °C, cerca de 4 °C a cerca de 6 °C ou cerca de 4 °C a cerca de 5 °C. Em determinadas modalidades, a rCSP é estavelmente mantida na formulação líquida estável a cerca de 4 °C.

[0242] Nas modalidades, a rCSP é mantida na formulação líquida estável a uma alta concentração, por exemplo, a uma concentração de pelo menos cerca de 1 mg/ml a cerca de 50 mg/ml. Nas modalidades, a rCSP é mantida na formulação estável a uma concentração de pelo menos cerca de 1 mg/ml, pelo menos cerca de 1,5 mg/ml, pelo menos cerca de 2 mg/ml, pelo menos cerca de 2,5 mg/ml, pelo menos cerca de 3 mg/ml, pelo menos cerca de 3,5 mg/ml, pelo menos cerca de 4 mg/ml, pelo menos cerca de 4,5 mg/ml, pelo menos cerca de 5 mg/ml, pelo menos cerca de 6 mg/ml, pelo menos cerca de 7 mg/ml, pelo menos cerca de 8 mg/ml, pelo menos cerca de 9 mg/ml, pelo menos cerca de 10 mg/ml, pelo menos cerca de 15 mg/ml, pelo menos cerca de 20 mg/ml, pelo menos cerca de 25 mg/ml, pelo menos cerca de 30 mg/ml, pelo menos cerca de 35 mg/ml, pelo menos cerca de 40 mg/ml, pelo menos cerca de 45 mg/ml, pelo menos cerca de 50 mg/ml, cerca de 2 a cerca de 50 mg/ml, cerca de 3 a cerca de 50 mg/ml, cerca de 4 a cerca de 50 mg/ml, cerca de 5 a cerca de 50 mg/ml, cerca de 10 a cerca de 50 mg/ml, cerca de 15 a cerca de 50 mg/ml, cerca de 20 a cerca de 50 mg/ml, cerca de 30 a cerca de 50 mg/ml, cerca de 40 a cerca de 50 mg/ml, cerca de 2 a cerca de 40 mg/ml, cerca de 3 a cerca de 40 mg/ml, cerca de 4 a cerca de 40 mg/ml, cerca de 5 a cerca de 40 mg/ml, cerca de 10 a cerca de 40 mg/ml, cerca de 15 a cerca de 40 mg/ml, cerca de 20 a cerca de 40 mg/ml, cerca de 30 a cerca de 40 mg/ml, cerca de 2 a cerca de 30 mg/ml, cerca de 3 a cerca de 30 mg/ml, cerca de 4 a cerca de 30 mg/ml, cerca de 5 a cerca de 30 mg/ml, cerca de 10 a cerca de 30 mg/ml, cerca de 15 a cerca de 30 mg/ml, cerca de 20 a cerca de 30 mg/ml, cerca de 2 a cerca de 20 mg/ml, cerca de 3 a cerca de 20 mg/ml, cerca de 4 a cerca de 20 mg/ml, cerca de 5 a cerca de 20 mg/ml, cerca de 10 a cerca de 20 mg/ml, cerca de 15 a cerca de 20 mg/ml, cerca de 2 a cerca de 15 mg/ml, cerca de 3 a cerca de 15 mg/ml, cerca de 4 a cerca de 15 mg/ml, cerca de 5 a cerca de 15 mg/ml, cerca de 10 a cerca de 15 mg/ml, cerca de 2 a cerca de 10 mg/ml, cerca de 3 a cerca de 10 mg/ml, cerca de 4 a cerca de 10 mg/ml, cerca de 5 a cerca de 10 mg/ml, cerca de 6 a cerca de 10 mg/ml, cerca de 7 a cerca de 10 mg/ml, cerca de 8 a cerca de 10 mg/ml, cerca de 9 a cerca de 10 mg/ml, cerca de 1 a cerca de 9 mg/ml, cerca de 2 a cerca de 9 mg/ml, cerca de 3 a cerca de 9 mg/ml, cerca de 4 a cerca de 9 mg/ml, cerca de 5 a cerca de 9 mg/ml, cerca de 6 a cerca de 9 mg/ml, cerca de 7 a cerca de 9 mg/ml, cerca de 8 a cerca de 9 mg/ml, cerca de 1 a cerca de 8 mg/ml, cerca de 2 a cerca de 8 mg/ml, cerca de 3 a cerca de 8 mg/ml, cerca de 4 a cerca de 8 mg/ml, cerca de 5 a cerca de 8 mg/ml, cerca de 6 a cerca de 8 mg/ml, cerca de 7 a cerca de 8 mg/ml, cerca de 1 a cerca de 7 mg/ml, cerca de 2 a cerca de 7 mg/ml, cerca de 3 a cerca de 7 mg/ml, cerca de 4 a cerca de 7 mg/ml, cerca de 5 a cerca de 7 mg/ml, cerca de 6 a cerca de 7 mg/ml, cerca de 1 a cerca de 6 mg/ml, cerca de 2 a cerca de 6 mg/ml, cerca de 3 a cerca de 6 mg/ml, cerca de 4 a cerca de 6 mg/ml, cerca de 5 a cerca de 6 mg/ml, cerca de 1 a cerca de 5 mg/ml, cerca de 2 a cerca de 5 mg/ml, cerca de 3 a cerca de 5 mg/ml, cerca de 4 a cerca de 5 mg/ml, cerca de 1 a cerca de 4 mg/ml, cerca de 2 a cerca de 4 mg/ml, cerca de 3 a cerca de 4 mg/ml, cerca de 1 a cerca de 3 mg/ml, cerca de 2 a cerca de 4 mg/ml ou cerca de 1 a cerca de 2 mg/ml.

[0243] Nas modalidades, a formulação líquida estável de rCSP compreende um agente redutor moderado, por exemplo, DTT, cisteína, acetilcisteína, glutationa, monotioglicerol (MTG), tioglicolato, ditiotiotreitol, ditioerititol, acetilcisteína, 2-Mercaptoetanol (B- mercaptoetanol), TCEP-HCl (Tris(2-carboxietil) cloridrato de fosfina pura, cristalina) ou 2-Mercaptoetilamina-HCl (2- MEA) ou qualquer outro agente redutor apropriado conhecido na técnica. Nas modalidades, o agente redutor moderado é DTT, MTG, acetilcisteína, glutationa, tioglicolato ou cisteína. Nas modalidades, o agente redutor moderado é MTG, cisteína ou acetilcisteína. Nas modalidades, o agente redutor moderado é MTG a uma concentração final de cerca de 0,5 mM a cerca de 4 mM, cerca de 0,5 mM a cerca de 3 mM, cerca de 0,5 mM a cerca de 2 mM, cerca de 0,5 mM a cerca de 1 mM, cerca de 0,6 mM a cerca de 2 mM, cerca de 0,6 mM a cerca de 1,5 mM, cerca de 0,6 mM a cerca de 1,4 mM, cerca de 0,6 mM a cerca de 1,3 mM, cerca de 0,6 mM a cerca de 1,2 mM, cerca de 0,6 mM a cerca de 1,1 mM, cerca de 0,6 mM a cerca de 1,05 mM, cerca de 0,6 mM a cerca de 1 mM, cerca de 0,7 mM a cerca de 2 mM, cerca de 0,7 mM a cerca de 1,5 mM, cerca de 0,7 mM a cerca de 1,4 mM, cerca de 0,7 mM a cerca de 1,3 mM, cerca de 0,7 mM a cerca de 1,2 mM, cerca de 0,7 mM a cerca de 1,1 mM, cerca de 0,7 mM a cerca de 1,05 mM, cerca de 0,7 mM a cerca de 1 mM, cerca de 0,8 mM a cerca de 2 mM, cerca de 0,8 mM a cerca de 1,5 mM, cerca de 0,8 mM a cerca de 1,4 mM, cerca de 0,8 mM a cerca de 1,3 mM, cerca de 0,8 mM a cerca de 1,2 mM, cerca de 0,8 mM a cerca de 1,1 mM, cerca de 0,8 mM a cerca de 1,05 mM, cerca de 0,8 mM a cerca de 1 mM, cerca de 0,9 mM a cerca de 2 mM, cerca de 0,9 mM a cerca de 1,5 mM, cerca de 0,9 mM a cerca de 1,4 mM, cerca de 0,9 mM a cerca de 1,3 mM, cerca de 0,9 mM a cerca de 1,2 mM, cerca de 0,9 mM a cerca de 1,1 mM, cerca de 0,9 mM a cerca de 1,05 mM, cerca de 0,9 mM a cerca de 1 mM, cerca de 1 mM a cerca de 1,5 mM, cerca de 1 mM a cerca de 1,4 mM, cerca de 1 mM a cerca de 1,3 mM, cerca de 1 mM a cerca de 1,2 mM, cerca de 1 mM a cerca de 1,1 mM, cerca de 0,5 mM, cerca de 0,6 mM, cerca de 0,7 mM, cerca de 0,8 mM, cerca de 0,9 mM, cerca de 1,0 mM, cerca de 1,1 mM, cerca de 1,2 mM, cerca de 1,3 mM, cerca de 1,4 mM, cerca de 1,5 mM, cerca de 1,6 mM, cerca de 1,7 mM, cerca de 1,8 mM, cerca de 1,9 mM, cerca de 2,0 mM, cerca de 3,0 mM, cerca de 4,0 mM ou cerca de 5,0 mM.

[0244] Nas modalidades, a formulação líquida estável de rCSP compreende um agente de desagregação. Nas modalidades, o agente de desagregação é arginina, guanidina HCl, um detergente, ureia ou qualquer outro agente de desagregação apropriado conhecido na técnica. Nas modalidades, a formulação compreende pelo menos cerca de 1% a cerca de 25% p/v de arginina. Nas modalidades, o tampão de armazenamento ou formulação compreende cerca de 1% a cerca de 24% p/v de arginina, cerca de 1% a cerca de 23% p/v de arginina, cerca de 1% a cerca de 22% p/v de arginina, cerca de 1% a cerca de 21% p/v de arginina, cerca de 1% a cerca de 20% p/v de arginina, cerca de 1% a cerca de 19% p/v de arginina, cerca de 1% a cerca de 18% p/v de arginina, cerca de 1% a cerca de 17% p/v de arginina, cerca de 1% a cerca de 16% p/v de arginina, cerca de 1% a cerca de 15% p/v de arginina, cerca de 1% a cerca de 14% p/v de arginina, cerca de 1% a cerca de 13% p/v de arginina, cerca de 1% a cerca de 12% p/v de arginina, cerca de 1% a cerca de 11% p/v de arginina, cerca de 1% a cerca de 10% p/v de arginina, cerca de 1% a cerca de 9% p/v de arginina, cerca de 1% a cerca de 8% p/v de arginina, cerca de 1% a cerca de 7% p/v de arginina, cerca de 1% a cerca de 6% p/v de arginina, cerca de 1% a cerca de 5% p/v de arginina, cerca de 5% a cerca de 24% p/v de arginina, cerca de 5% a cerca de 23% p/v de arginina, cerca de 5% a cerca de 22% p/v de arginina, cerca de 5% a cerca de 21% p/v de arginina, cerca de 5% a cerca de 20% p/v de arginina, cerca de 5% a cerca de 19% p/v de arginina, cerca de 5% a cerca de 18% p/v de arginina, cerca de 5% a cerca de 17% p/v de arginina, cerca de 5% a cerca de 16% p/v de arginina, cerca de 5% a cerca de 15% p/v de arginina, cerca de 5% a cerca de 14% p/v de arginina, cerca de 5% a cerca de 13% p/v de arginina, cerca de 5% a cerca de 12% p/v de arginina, cerca de 5% a cerca de 11% p/v de arginina, cerca de 5% a cerca de 10% p/v de arginina, cerca de 7% a cerca de 24% p/v de arginina, cerca de 7% a cerca de 23% p/v de arginina, cerca de 7% a cerca de 22% p/v de arginina, cerca de 7% a cerca de 21% p/v de arginina, cerca de 7% a cerca de 20% p/v de arginina, cerca de 7% a cerca de 19% p/v de arginina, cerca de 7% a cerca de 18% p/v de arginina, cerca de 7% a cerca de 17% p/v de arginina, cerca de 7% a cerca de 16% p/v de arginina, cerca de 7% a cerca de 15% p/v de arginina, cerca de 7% a cerca de 14% p/v de arginina, cerca de 7% a cerca de 13% p/v de arginina, cerca de 7% a cerca de 12% p/v de arginina, cerca de 7% a cerca de 11% p/v de arginina, cerca de 7% a cerca de 10% p/v de arginina, cerca de 8% a cerca de 24% p/v de arginina, cerca de 8% a cerca de 23% p/v de arginina, cerca de 8% a cerca de 22% p/v de arginina, cerca de 8% a cerca de 21% p/v de arginina, cerca de 8% a cerca de 20% p/v de arginina, cerca de 8% a cerca de 19% p/v de arginina, cerca de 8% a cerca de 18% p/v de arginina, cerca de 8% a cerca de 17% p/v de arginina, cerca de 8% a cerca de 16% p/v de arginina, cerca de 8% a cerca de 15% p/v de arginina, cerca de 8% a cerca de 14% p/v de arginina, cerca de 8% a cerca de 13% p/v de arginina, cerca de 8% a cerca de 12% p/v de arginina, cerca de 8% a cerca de 11% p/v de arginina, cerca de 8% a cerca de 10% p/v de arginina, cerca de 9% a cerca de 24% p/v de arginina, cerca de 9% a cerca de 23% p/v de arginina, cerca de 9% a cerca de 22% p/v de arginina, cerca de 9% a cerca de 21% p/v de arginina, cerca de 9% a cerca de 20% p/v de arginina, cerca de 9% a cerca de 19% p/v de arginina, cerca de 9% a cerca de 18% p/v de arginina, cerca de 9% a cerca de 17% p/v de arginina, cerca de 9% a cerca de 16% p/v de arginina, cerca de 9% a cerca de 15% p/v de arginina, cerca de 9% a cerca de 14% p/v de arginina, cerca de 9% a cerca de 13% p/v de arginina, cerca de 9% a cerca de 12% p/v de arginina, cerca de 9% a cerca de 11% p/v de arginina, cerca de 9% a cerca de 10% p/v de arginina, cerca de 10% a cerca de 24% p/v de arginina, cerca de 10% a cerca de 23% p/v de arginina, cerca de 10% a cerca de 22% p/v de arginina, cerca de 10% a cerca de 21% p/v de arginina, cerca de 10% a cerca de 20% p/v de arginina, cerca de 10% a cerca de 19% p/v de arginina, cerca de 10% a cerca de 18% p/v de arginina, cerca de 10% a cerca de 17% p/v de arginina, cerca de 10% a cerca de 16% p/v de arginina, cerca de 10% a cerca de 15% p/v de arginina, cerca de 10% a cerca de 14% p/v de arginina, cerca de 10% a cerca de 13% p/v de arginina, cerca de 10% a cerca de 12% p/v de arginina, cerca de 10% a cerca de 11% p/v de arginina, cerca de 11% a cerca de 24% p/v de arginina, cerca de 11% a cerca de 23% p/v de arginina, cerca de 11% a cerca de 22% p/v de arginina, cerca de 11% a cerca de 21% p/v de arginina, cerca de 11% a cerca de 20% p/v de arginina, cerca de 11% a cerca de 19% p/v de arginina, cerca de 11% a cerca de 18% p/v de arginina, cerca de 11% a cerca de 17% p/v de arginina, cerca de 11% a cerca de 16% p/v de arginina, cerca de 11% a cerca de 15% p/v de arginina, cerca de 11% a cerca de 14% p/v de arginina, cerca de 11% a cerca de 13% p/v de arginina, cerca de 11% a cerca de 12% p/v de arginina, cerca de 12% a cerca de 24% p/v de arginina, cerca de 12% a cerca de 23% p/v de arginina, cerca de 12% a cerca de 22% p/v de arginina, cerca de 12% a cerca de 21% p/v de arginina, cerca de 12% a cerca de 20% p/v de arginina, cerca de 12% a cerca de 19% p/v de arginina, cerca de 12% a cerca de 18% p/v de arginina, cerca de 12% a cerca de 17% p/v de arginina, cerca de 12% a cerca de 16% p/v de arginina, cerca de 12% a cerca de 15% p/v de arginina, cerca de 12% a cerca de 14% p/v de arginina ou cerca de 12% a cerca de 13% p/v de arginina. Em determinadas modalidades, o tampão de armazenamento compreende cerca de 10% de arginina.

[0245] Nas modalidades, a formulação líquida estável de rCSP compreende um tampão. Nas modalidades, o tampão é um tampão PBS, Hepes, Histidina ou Tris. Nas modalidades, o tampão é 1X de PBS ou 0,5X de PBS. Nas modalidades, a formulação de rCSP estável tem um pH de cerca de 6,0 a cerca de pH 7,5, Nas modalidades, a formulação de rCSP estável tem um pH de cerca de pH 6,0, cerca de pH 6,1, cerca de pH 6,2, cerca de pH 6,3, cerca de pH 6,4, cerca de pH 6,5, cerca de pH 6,6, cerca de pH 6,7, cerca de pH 6,8, cerca de pH 6,9, cerca de pH 7,0, cerca de pH 7,1, cerca de pH 7,2, cerca de pH 7,3, cerca de pH 7,4 ou cerca de pH 7,5, Nas modalidades, a formulação de rCSP estável tem um pH de cerca de pH 6,0 a cerca de pH 7,4, cerca de pH 6,0 a cerca de pH 7,3, cerca de pH 6,0 a cerca de pH 7,2, cerca de pH 6,0 a cerca de pH 7,1, cerca de pH 6,0 a cerca de pH 7,0, cerca de pH 6,0 a cerca de pH 7,5, cerca de pH 6,0 a cerca de pH 7,4, cerca de pH 6,0 a cerca de pH 7,3, cerca de pH 6,0 a cerca de pH 7,2, cerca de pH 6,0 a cerca de pH 7,1, cerca de pH 6,0 a cerca de pH 7,0, cerca de pH 6,0a cerca de pH 6,9, cerca de pH 6,0a cerca 6,8, cerca de pH 6,0 a cerca de pH 6,7, cerca de pH cerca de pH 6,6, cerca de pH 6,0 a cerca de pH 6,5, de pH 6,1 a cerca de pH 7,5, cerca de pH 6,1 a cerca 7,4, cerca de pH 6,1 a cerca de pH 7,3, cerca de pH cerca de pH 7,2, cerca de pH 6,1 a cerca de pH 7,1, de pH 6,1 a cerca de pH 7,0, cerca de pH 6,1 a cerca 6,9, 6,1 a cerca de pH 6,8, cerca de pH 6,1 a cerca 6,7, cerca de pH 6,1 a cerca de pH 6,6, cerca de pH cerca de pH 6,5, cerca de pH 6,2 a cerca de pH 7,5, de pH 6,2 a cerca de pH 7,4, cerca de pH 6,2 a cerca 7,3, cerca de pH 6,2 a cerca de pH 7,2, cerca de pH cerca de pH 7,1, cerca de pH 6,2 a cerca de pH 7,0, cerca de pH 6,9, cerca de pH 6,2 a cerca de pH 6,8, de pH 6,2 a cerca de pH 6,7, cerca de pH 6,2 a cerca 6,6, cerca de pH 6,0 a cerca de pH 6,5, cerca de pH cerca de pH 7,5, cerca de pH 6,3 a cerca de pH 7,4, de pH 6,3 a cerca de pH 7,3, cerca de pH 6,3 a cerca 7,2, cerca de pH 6,3 a cerca de pH 7,1, cerca de pH cerca de pH 7,0, 6,3 a cerca de pH 6,9, cerca de pH cerca de pH 6,8, cerca de pH 6,3 a cerca de pH 6,7, de pH 6,3 a cerca de pH 6,6, cerca de pH 6,3 a cerca 6,5, cerca de pH 6,4 a cerca de pH 7,5, cerca de pH cerca de pH 7,4, cerca de pH 6,4 a cerca de pH 7,3, de pH 6,4 a cerca de pH 7,2, cerca de pH 6,4 a cerca 7,1, cerca de pH 6,4 a cerca de pH 7,0, 6,4 a cerca 6,9, cerca de pH 6,4 a cerca de pH 6,8, cerca de pH cerca de pH 6,7, cerca de pH 6,4 a cerca de pH 6,6, de pH 6,4 a cerca de pH 6,5, cerca de pH 6,5 a cerca 7,5, cerca de pH 6,5 a cerca de pH 7,4, cerca de pH cerca de pH 7,3, cerca de pH 6,5 a cerca de pH 7,2, cerca de pH 6,5 a cerca de pH 7,1, cerca de pH 6,5 a cerca de pH 7,0, 6,6 a cerca de pH 6,9, cerca de pH 6,6 a cerca de pH 6,8, cerca de pH 6,6 a cerca de pH 6,7, cerca de pH 6,6 a cerca de pH 6,6, cerca de pH 6,6 a cerca de pH 6,5, cerca de pH 6,6 a cerca de pH 7,5, cerca de pH 6,6 a cerca de pH 7,4, cerca de pH 6,6 a cerca de pH 7,3, cerca de pH 6,6 a cerca de pH 7,2, cerca de pH 6,6 a cerca de pH 7,1, cerca de pH 6,6 a cerca de pH 7,0, 6,6 a cerca de pH 6,9, cerca de pH 6,6 a cerca de pH 6,8, cerca de pH 6,6 a cerca de pH 6,7, cerca de pH 6,7 a cerca de pH 7,5, cerca de pH 6,7 a cerca de pH 7,4, cerca de pH 6,7 a cerca de pH 7,3, cerca de pH 6,7 a cerca de pH 7,2, cerca de pH 6,7 a cerca de pH 7,1, cerca de pH 6,7 a cerca de pH 7,0, 6,7 a cerca de pH 6,9, cerca de pH 6,7 a cerca de pH 6,8, cerca de pH 6,7 a cerca de pH 6,7, cerca de pH 6,7 a cerca de pH 6,6, cerca de pH 6,7 a cerca de pH 6,5, cerca de pH 6,8 a cerca de pH 7,5, cerca de pH 6,8 a cerca de pH 7,4, cerca de pH 6,8 a cerca de pH 7,3, cerca de pH 6,8 a cerca de pH 7,2, cerca de pH 6,8 a cerca de pH 7,1, cerca de pH 6,8 a cerca de pH 7,0, 6,8 a cerca de pH 6,9, cerca de pH 6,8 a cerca de pH 6,8, cerca de pH 6,8 a cerca de pH 6,7, cerca de pH 6,9 a cerca de pH 7,5, cerca de pH 6,9 a cerca de pH 7,4, cerca de pH 6,9 a cerca de pH 7,3, cerca de pH 6,9 a cerca de pH 7,2, cerca de pH 6,9 a cerca de pH 7,1, pH 6,9 a cerca de pH 7,0, cerca de pH 7,0 a cerca de pH 7,5, cerca de pH 7,0 a cerca de pH 7,4, cerca de pH 7,0 a cerca de pH 7,3, cerca de pH 7,0 a cerca de pH 7,2 ou cerca de pH 7,0 a cerca de pH 7,1.

[0246] Nas modalidades, a formulação líquida estável de rCSP compreende cerca de 1 a cerca de 5, cerca de 1 a cerca de 10, cerca de 1 a cerca de 20, cerca de 1 a cerca de 30, cerca de 1 a cerca de 40 ou cerca de 1 a cerca de 50 mg/ml de rCSP, cerca de 0,5 a cerca de 1,5 mM de MTG e cerca de 10% a cerca de 20% de arginina em 1X de PBS a um pH de cerca de 6,4 a cerca de 7,2, Em determinadas modalidades, a formulação de rCSP estável compreende 1 mM de MTG e 10% de arginina em 1X de PBS a um pH de cerca de 6,4 a cerca de 7,2, Nas modalidades, o pH é de cerca de 6,4 a 7,0, Em determinadas modalidades, o pH é de cerca de 6,7, Nas modalidades, a formulação líquida estável de rCSP é armazenada a temperatura de armazenamento de cerca de 4 °C.

[0247] Nas modalidades, a formulação líquida estável de rCSP compreende cerca de 1 a cerca de 5, cerca de 1 a cerca de 10, cerca de 1 a cerca de 20, cerca de 1 a cerca de 30, cerca de 1 a cerca de 40 ou cerca de 1 a cerca de 50 mg/ml de rCSP, cerca de 0,5 a cerca de 1,5 mM de MTG e cerca de 1% a cerca de 20% de arginina, em 0,5X ou 1X de PBS, a um pH de cerca de 6,0 a cerca de 7,5.

[0248] Nas modalidades, a formulação líquida estável de rCSP compreende cerca de 1 a cerca de 5, cerca de 1 a cerca de 10, cerca de 1 a cerca de 20, cerca de 1 a cerca de 30, cerca de 1 a cerca de 40 ou cerca de 1 a cerca de 50 mg/ml de rCSP, cerca de 0,5 a cerca de 1,5 mM de MTG e cerca de 10% a cerca de 20% de arginina, em 0,5X ou 1X de PBS, a um pH de cerca de 6,4 a cerca de 7,2.

[0249] Nas modalidades, a formulação líquida estável de rCSP compreende cerca de 1 a cerca de 5, cerca de 1 a cerca de 10, cerca de 1 a cerca de 20, cerca de 1 a cerca de 30, cerca de 1 a cerca de 40 ou cerca de 1 a cerca de 50 mg/ml de rCSP, cerca de 0,5 a cerca de 1,5 mM de MTG e cerca de 10% a cerca de 20% de arginina, em 0,5X ou 1X de PBS, a um pH de cerca de 6,4 a cerca de 7,0.

[0250] Nas modalidades, a formulação líquida estável de rCSP compreende cerca de 1 a cerca de 5 ou cerca de 1 a cerca de 10 mg/ml de rCSP, cerca de 0,8 a cerca de 1,2 mM de MTG, cerca de 5% a cerca de 15% de arginina, em 1X de PBS, a um pH de cerca de 6,4 a cerca de 7,0.

[0251] Nas modalidades, a formulação líquida estável de rCSP compreende cerca de 1 a cerca de 5 mg/ml de rCSP, cerca de 1,0 mM de MTG e cerca de 10% de arginina, em 1X de PBS, a um pH de cerca de 6,4 a cerca de 7,0.

[0252] Em outras modalidades, a formulação líquida estável de rCSP compreende 10 mM de base de Tris, 4,2% de Manitol, 2% de Arginina-HCl, 100 μM de EDTA e 1 mM de MTG, pH 7,5. Nas modalidades, a formulação de rCSP estável compreende 10 mM de Histidina, 4,2% de Manitol, 2% de Arginina-HCl, 100 μM de EDTA e 1 mM de MTG, a pH 7,0.

[0253] Nas modalidades, a formulação líquida estável de rCSP compreende cerca de 0,5 mM de MTG a cerca de 1,5 mM de MTG e cerca de 0,3 a cerca de 0,7 M de arginina em PBS, a cerca de pH 6,4 a cerca de pH 7,0. Nas modalidades, a formulação líquida estável de rCSP compreende cerca de 1 mM de MTG e cerca de 0,2 a cerca de 0,7 M de arginina em PBS a cerca de pH 6,4 a cerca de pH 7,0. Nas modalidades, a formulação líquida estável de rCSP compreende cerca de 1 mM de glutationa ou 1 mM de cisteína e cerca de 1% p/v de arginina em PBS a cerca de pH 6,4 a cerca de pH 7,0. Nas modalidades, a formulação líquida estável de rCSP compreende cerca de 1 mM de MTG e cerca de 1% p/v de arginina ou cerca de 0,5 M de arginina em PBS a cerca de pH 7,0.

[0254] Nas modalidades adicionais, as formulações líquidas estáveis da presente invenção facilitam o uso da rCSP para a fabricação de produtos, por exemplo, vacinas, a serem administradas aos pacientes. Nesse aspecto, é desejável que os excipientes usados na formulação de rCSP atendam os padrões da United States Pharmacopeial Convention (Rockville, MD) , conforme publicados no United States Pharmacopeia - National Formulary (USP-NF) ou padrões análogos em países fora dos Estados Unidos conforme publicados, por exemplo, em The International Pharmacopeia (Organização Mundial de Saúde).

[0255] A invenção refere-se adicionalmente a métodos para manter estavelmente a rCSP nas formulações líquidas estáveis de rCSP ao longo do tempo. A manutenção estável de rCSP em uma formulação líquida estável de rCSP é avaliada ao longo do tempo, usando os mesmos indicadores de estabilidade descritos acima, por exemplo, a manutenção estável é positivamente indicada pela % de rCSP total e negativamente indicada pela % de dímeros de rCSP, pela % de rCSP agregada, pela % de rCSP desnaturada e/ou % de rCSP degradada presente após um determinado tempo na formulação. Nas modalidades, a porcentagem de rCSP total é a porcentagem de rCSP (o monômero de rCSP) presente após um determinado tempo. Portanto, a manutenção estável pode ser indicada pela presença de uma determinada quantidade mínima de rCSP após um determinado tempo na formulação líquida estável. Nas modalidades, a porcentagem de rCSP total é a porcentagem de rCSP presente após um determinado tempo na formulação em relação à quantidade inicial de rCSP na formulação. Em outras modalidades, a porcentagem de rCSP total é a porcentagem de rCSP presente após um determinado tempo. A quantidade de rCSP pode ser avaliada por métodos conhecidos, conforme descrito em outro local no presente documento. A % de rCSP total é igual à % de monômero de rCSP, por exemplo, conforme determinado pela RP-HPLC ou SE- HPLC e descrito no presente documento nos Exemplos. Nas modalidades, a % de rCSP total compreende a rCSP nativa e as espécies de monoméricas de rCSP piroglutamato.

[0256] Nas modalidades, a rCSP estavelmente mantida na formulação líquida estável de rCSP é preparada, de acordo com os métodos descritos e reivindicados no presente documento, por exemplo, por um processo para purificar a proteína circunsporozoíta P. falciparum recombinante, o dito processo que compreende: (a) obter uma preparação de lisado celular bacteriano que compreende dímero de proteína circunsporozoíta P. falciparum recombinante; (b) separar a preparação de lisado celular bacteriano da etapa (a) em uma fração solúvel que compreende o dímero de proteína circunsporozoíta P. falciparum e uma fração insolúvel; (c) separar o dímero de proteína circunsporozoíta P. falciparum recombinante na fração solúvel da etapa (b) das proteínas de células hospedeiras na fração solúvel; e (d) submeter o dímero de proteína circunsporozoíta P. falciparum recombinante obtido na etapa (c) às condições de redução preferenciais para obter a proteína circunsporozoíta P. falciparum, e (e) separar a proteína circunsporozoíta P. falciparum recombinante obtida na etapa (d) das proteínas de células hospedeiras obtendo, desse modo, a proteína circunsporozoíta P. falciparum recombinante purificada. Nas modalidades, a separação da etapa (e) compreende a cromatografia de interação hidrofóbica.

[0257] Nesses métodos, a rCSP é estavelmente mantida a uma temperatura de cerca de 3 °C a cerca de 25 °C por pelo menos cerca de 7 dias, pelo menos cerca de 8 dias, pelo menos cerca de 9 dias, pelo menos cerca de 10 dias, pelo menos cerca de 11 dias, pelo menos cerca de 12 dias, pelo menos cerca de 13 dias, pelo menos cerca de 14 dias, pelo menos cerca de 15 dias, pelo menos cerca de 16 dias, pelo menos cerca de 17 dias, pelo menos cerca de 18 dias, pelo menos cerca de 19 dias, pelo menos cerca de 20 dias, pelo menos cerca de 21 dias, pelo menos cerca de 22 dias, pelo menos cerca de 23 dias, pelo menos cerca de 24 dias, pelo menos cerca de 25 dias, pelo menos cerca de 30 dias, pelo menos cerca de 60 dias, pelo menos cerca de 70 dias, pelo menos cerca de 80 dias, pelo menos cerca de 90 dias, pelo menos cerca de 6 meses ou pelo menos cerca de 1 ano.

[0258] Nas modalidades, a invenção refere-se a um método para manter estavelmente a rCSP em uma formulação líquida estável, o método que compreende proporcionar ou preparar uma formulação líquida estável de rCSP, em que a rCSP é estavelmente mantida a uma temperatura de cerca de 3 °C a cerca de 25 °C.

[0259] Nas modalidades, a invenção refere-se a um método para manter estavelmente a rCSP em uma formulação líquida estável, o método que compreende proporcionar uma formulação que compreende cerca de 1 a cerca de 5, cerca de 1 a cerca de 10, cerca de 1 a cerca de 20, cerca de 1 a cerca de 30, cerca de 1 a cerca de 40 ou cerca de 1 a cerca e50mg/mlderCSP,cercade0,5acercade1,5mMdeMTG ecercade1%acercade20%deargininaem0,5Xou1Xde PBSaumpHdecercade6,0acercade7,5,emquearCSPé estavelmentemantidaaumatemperaturadecercade3°Ca cercade25°C,porpelomenoscercade7dias,pelomenos cerca de 8 dias, pelo menos cerca de 9 dias, pelo menos cercade10dias,pelomenoscercade11dias,pelomenos cercade12dias,pelomenoscercade13dias,pelomenos cercade14dias,pelomenoscercade15dias,pelomenos cercade16dias,pelomenoscercade17dias,pelomenos cercade18dias,pelomenoscercade19dias,pelomenos cercade20dias,pelomenoscercade21dias,pelomenos cercade22dias,pelomenoscercade23dias,pelomenos cercade24dias,pelomenoscercade25dias,pelomenos cercade30dias,pelomenoscercade60dias,pelomenos cercade70dias,pelomenoscercade80dias,pelomenos cercade90dias,pelomenoscercade6mesesoupelomenos cercade1ano.

[0260] Nasmodalidades,ainvençãorefere1sea um método para manter estavelmente a rCSP em uma formulação líquida estável, o método que compreende proporcionar uma formulação que compreende cerca de 1 a cerca de 5, cerca de 1 a cerca de 10, cerca de 1 a cerca de 20, cerca de 1 a cerca de 30, cerca de 1 a cerca de 40 ou cerca de 1 a cerca de 50 mg/ml de rCSP, cerca de 0,5 a cerca de 1,5 mM de MTG e cerca de 10% a cerca de 20% de arginina em 1X de PBS a um pH de cerca de 6,4 a cerca de 7,2, em que a rCSP é estavelmente mantida a uma temperatura de cerca de 3 °C a cerca de 25 °C, por pelo menos cerca de 7 dias, pelo menos cerca de 8 dias, pelo menos cerca de 9 dias, pelo menos cerca de 10 dias, pelo menos cerca de 11 dias, pelo menos cerca de 12 dias, pelo menos cerca de 13 dias, pelo menos cerca de 14 dias, pelo menos cerca de 15 dias, pelo menos cerca de 16 dias, pelo menos cerca de 17 dias, pelo menos cerca de 18 dias, pelo menos cerca de 19 dias, pelo menos cerca de 20 dias, pelo menos cerca de 21 dias, pelo menos cerca de 22 dias, pelo menos cerca de 23 dias, pelo menos cerca de 24 dias, pelo menos cerca de 25 dias, pelo menos cerca de 30 dias, pelo menos cerca de 60 dias, pelo menos cerca de 70 dias, pelo menos cerca de 80 dias, pelo menos cerca de 90 dias, pelo menos cerca de 6 me ses ou pelo menos cerca de 1 ano.

[0261] Nas modalidades, a invenção refere-se a um método para manter estavelmente a rCSP em uma formulação líquida estável, o método que compreende proporcionar uma formulação que compreende cerca de 1 a cerca de 5, cerca de 1 a cerca de 10, cerca de 1 a cerca de 20, cerca de 1 a cerca de 30, cerca de 1 a cerca de 40 ou cerca de 1 a cerca de 50 mg/ml de rCSP, cerca de 0,5 a cerca de 1,5 mM de MTG e cerca de 10% a cerca de 20% de arginina em 1X de PBS a um pH de cerca de 6,4 a cerca de 7,0, em que a rCSP é estavelmente mantida a uma temperatura de cerca de 3 °C a s cerca de 7 dias, pelo menos cerca de 9 dias, pelo menos cerca de 11 dias, pelo menos cerca de 13 dias, pelo menos cerca de 15 dias, pelo menos cerca de 17 dias, pelo menos cerca de 19 dias, pelo menos cerca de 21 dias, pelo menos cerca de 22 dias, pelo menos cerca de 23 dias, pelo menos cerca de 24 dias, pelo menos cerca de 25 dias, pelo menos cerca de 30 dias, pelo menos cerca de 60 dias, pelo menos cerca de 70 dias, pelo menos cerca de 80 dias, pelo menos cerca de 90 dias, pelo menos cerca de 6 meses ou pelo menos cerca de 1 ano.

[0262] Nas modalidades, a invenção refere-se a um método para manter estavelmente a rCSP em uma formulação líquida estável, o método que compreende proporcionar uma formulação que compreende cerca de 1 a cerca de 5 ou cerca de 1 a cerca de 10 mg/ml de rCSP, cerca de 0,8 a cerca de 1,2 mM de MTG, cerca de 5% a cerca de 15% de arginina, em 1X de PBS, a um pH de cerca de 6,4 a cerca de 7, 0, em que a rCSP é estavelment e mantida a uma temperatura de cerca de 3 °C a cerca de 25 °C, por pele > menos cerca . de 7 dias, pelo menos cerca de 8 dias, pelo menos cerca de 9 dias, pelo menos cerca de 10 dias, pelo menos cerca de 11 dias, pelo menos cerca de 12 dias, pelo menos cerca de 13 dias, pelo menos cerca de 14 dias, pelo menos cerca de 15 dias, pelo menos cerca de 16 dias, pelo menos cerca de 17 dias, pelo menos cerca de 18 dias, pelo menos cerca de 19 dias, pelo menos cerca de 20 dias, pelo menos cerca de 21 dias, pelo menos cerca de 22 dias, pelo menos cerca de 23 dias, pelo menos cerca de 24 dias, pelo menos cerca de 25 dias, pelo menos cerca de 30 dias, pelo menos cerca de 60 dias, pelo menos cerca de 70 dias, pelo menos cerca de 80 dias, pelo menos cerca de 90 dias, pelo menos cerca de 6 me ses ou pelo menos cerca de 1 ano.

[0263] Nas modalidades, a invenção refere -se a um método para manter estavelmente a rCSP em uma formulação líquida estável, o método que compreende proporcionar a formulação que compreende cerca de 1 a cerca de 5 mg/ml de rCSP, cerca de 1,0 mM de MTG e cerca de 10% de arginina, em 1X de PBS, a um pH de cerca de 6,4 a cerca de 7,0, em que a rCSP é estavelment e mantida a uma temperatura de cerca de 3 °C a cerca de 25 °C, por pelo menos cerca de 7 dias, pelo menos cerca de 8 dias, pelo menos cerca de 9 dias, pelo menos cerca de 10 dias, pelo menos cerca de 11 dias, pelo menos cerca de 12 dias, pelo menos cerca de 13 dias, pelo menos cerca de 14 dias, pelo menos cerca de 15 dias, pelo menos cerca de 16 dias, pelo menos cerca de 17 dias, pelo menos cerca de 18 dias, pelo menos cerca de 19 dias, pelo menos cerca de 20 dias, pelo menos cerca de 21 dias, pelo menos cerca de 22 dias, pelo menos cerca de 23 dias, pelo menos cerca de 24 dias, pelo menos cerca de 25 dias, pelo menos cerca de 30 dias, pelo menos cerca de 60 dias, pelo menos cerca de 70 dias, pelo menos cerca de 80 dias, pelo menos cerca de 90 dias, pelo menos cerca de 6 meses ou pelo menos cerca de 1 ano.

[0264] Nas modalidades específicas, a formulação líquida estável de rCSP compreende cerca de 1 a cerca de 5 mg/ml de rCSP, cerca de 1,0 mM de MTG e cerca de 10% ou 0,5M arginina, em 1X de PBS, a um pH de cerca de 6,4 a cerca de 7,0. Nas modalidades, quando armazenada a 2 a 8 °C por pelo menos cerca de 120 horas, observa-se que essa formulação contém cerca de 85 a cerca de 95% de rCSP total. Nas modalidades, quando armazenada a 25 °C por pelo menos cerca de 24 horas, observa-se que essa formulação contém cerca de 85% a cerca de 95% de rCSP total, cerca de 85% a cerca de 90% de rCSP total, pelo menos cerca de 85% de rCSP total, pelo menos cerca de 86% de rCSP total, pelo menos cerca de 87% de rCSP total, pelo menos cerca de 88% de rCSP total, pelo menos cerca de 89% de rCSP total, pelo menos cerca de 90% de rCSP total, pelo menos cerca de 91% de rCSP total, pelo menos cerca de 92% de rCSP total, pelo menos cerca de 93% de rCSP total, pelo menos cerca de 94% de rCSP total ou pelo menos cerca de 95% de rCSP total.

PROCESSO

[0265] Nas modalidades, o método de purificação é realizado usando um caldo total de fermentação de P. fluorescens. O caldo é diluído com tampão na presença de um desagregante para obter uma alimentação por homogeneização que é ^ 20% de sólidos, por exemplo, em 3,1 M de ureia, 31 mM de Tris, pH 8,2. O caldo de fermentação diluído é lisado por microfluidização, que gera o lisado celular. O lisado é diluído 1:1 com 2 M de ureia, 20 mM de Tris, pH 8,2, criando um lisado de 10% de sólidos. Os sólidos de P. fluorescens no lisado são separados do tampão contendo rCSP através da centrifugação de pilha de discos e da filtração profunda. O tampão contendo rCSP é adicionalmente 0,2 μm filtrado e congelado. Nas modalidades, o tampão contendo rCSP filtrado (lisado) é congelado em garrafas de 1 L ou 2 L, por exemplo, garrafas PETG Nalgene®. Nas modalidades, os lisados são congelados em garrafas PETG de 1 L a -72 °C por pelo menos 7 horas. Nas modalidades, os lisados são congelados por pelo menos cerca de 7 horas a pelo menos cerca de 18 horas ou qualquer faixa de cerca de 2 a cerca de 6 horas situada entre cerca de 7 e 18 horas. Nas modalidades, os lisados são congelados por pelo menos cerca de 8 horas, pelo menos cerca de 9 horas, pelo menos cerca de 10 horas, pelo menos cerca de 11 horas, pelo menos cerca de 12 horas, pelo menos cerca de 13 horas, pelo menos cerca de 14 horas, pelo menos cerca de 15 horas, pelo menos cerca de 16 horas ou pelo menos cerca de 17 horas. O extrato celular clarificado de rCSP é descongelado e, então, purificado por cromatografia de troca aniônica (AEX). Nas modalidades, o lisado descongelado é mantido à temperatura ambiente antes da cromatografia. Nas modalidades, o lisado descongelado é submetido à filtração após o descongelamento e antes da AEX. Nas modalidades, a filtração é a filtração por membrana. Nas modalidades, a filtração tem de 0,2 a 0,45 μm de filtração por membrana. O eluato de AEX contendo rCSP é coletado e adicionalmente purificado por cromatografia de hidroxiapatita (HA), e o eluato de HA contendo rCSP é coletado e armazenado a 2 a 8°C. O eluato de HA é trazido de volta à temperatura ambiente e 0,2 μm filtrados, e a rCSP é submetida a condições de redução preferenciais. As frações de eluição em cromatografia que contêm CSP dimerizada em tampão são agrupadas em um volume final de 200 a 600 mL. O agrupamento é submetido à redução preferencial através da adição do redutor ditiotreitol a uma concentração final de 2 0 μM ou redutor MTG a uma concentração final de 1 mM, e rapidamente agitado com uma barra de agitação magnética e placa de agitação por 12 a 24 horas à temperatura ambiente. De maneira alternativa, a rCSP agregada em PBS é submetida ao mesmo processo adicionando-se primeiro 2 M de ureia ao material antes de sofrer redução preferencial. Nas modalidades, a rCSP é, então, adicionalmente purificada por HIC.

[0266] Após ser submetida a condições de redução preferenciais e/ou após a purificação por HIC, a rCSP é concentrada e diafiltrada no tampão de formulação por TFF.

[0267] De maneira alternativa, o eluato de HA é submetido a condições de redução preferenciais à temperatura ambiente e mantido de um dia para o outro antes de ser diafiltrado no tampão de formulação ou carregado em HIC e, então, concentrado e diafiltrado.

[0268] Nas modalidades, o tampão de formulação compreende 1 mM de MTG e 10% de arginina. A rCSP diafiltrada no tampão de formulação é passada através de um filtro de 0,2 μm final para produzir uma substância ativa a granel.

ANÁLISE DE PROTEÍNA CIRCUNSPOROZOÍTA P. FALCIPARUM PURIFICADA ESPECIFICAÇÕES DE PRODUTO

[0269] Inúmeros métodos de ensaio são conhecidos na técnica para avaliar o rendimento e/ou qualidade das proteínas. O uso de qualquer método apropriado para caracterizar a proteína recombinante é considerado no presente documento.

RENDIMENTO DE PROTEÍNA

[0270] O rendimento de purificação total ou rendimento de processo total da rCSP purificada é a quantidade total de rCSP purificada obtida usando os métodos da invenção em relação à quantidade de rCSP determinada a estar presente no material de partida. O mesmo geralmente é expresso como um rendimento percentual. Entende-se que a determinação do rendimento percentual irá depender não apenas da quantidade de proteína medida no material de partida, por exemplo, cultura celular, a preparação de lisado celular bacteriano ou a fração solúvel (antes ou após a clarificação), mas, também, da carga usada para cada etapa. Nas modalidades, em que o rendimento total de uma etapa, por exemplo, a etapa de colheita, não é processado na próxima etapa, por exemplo, a etapa de ruptura de célula, o rendimento de processo total deve ser calculado usando as cargas e rendimentos de etapa. Onde o rendimento total de todas as etapas for usado, o rendimento de processo total pode ser calculado dividindo-se o rendimento final pela quantidade de rCSP no material de partida. Qualquer método apropriado para medir a proteína conhecida na técnica ou, conforme descrito no presente documento, pode ser usado, por exemplo, SDS-PAGE, incluindo a análise de SDS-CGE e Western blot. A SDS-PAGE pode ser realizada sob condições redutoras ou não redutoras. A SDS- PAGE realizada sob condições não redutoras permite a comparação individual de espécies monoméricas, diméricas e de agregados (agregados HMW). Por exemplo, tais comparações podem ser usadas para determinar o rendimento de monômero de rCSP purificado em relação ai monômero de rCSP no material de partida ou em relação às espécies de dímero, monômero e agregados de rCSP no material de partida. A avaliação sob condições redutoras fornece uma medida todas as espécies de rCSP. Os ensaios de atividade, por exemplo, ensaios de ligação, conforme descrito no presente documento e conhecido na técnica, também podem proporcionar informações que se referem ao rendimento de proteína.

[0271] De maneira típica, a quantidade inicial ou carga de rCSP inicial é determinada medindo-se a concentração de proteína em uma alíquota da cultura celular, lisado celular bacteriano, fração solúvel ou fração de lisado clarificado. A quantidade total de proteína colocada no processo de purificação é, então, calculada pela extrapolação dos dados de alíquota com o volume de material processado nas etapas subsequentes (a "carga"). Nas modalidades, a quantidade de carga inicial é usada na determinação do rendimento de processo total. Nas modalidades, a quantidade inicial de rCSP compreende cerca de 1 grama a cerca de 3.000 gramas, cerca de 100 gramas a cerca de 3.000 gramas, cerca de 250 gramas a cerca de 3.000 gramas, cerca de 500 gramas a cerca de 3.000 gramas, cerca de 750 gramas a cerca de 3.000 gramas, cerca de 1.000 gramas a cerca de 3.000 gramas, cerca de 100 gramas a cerca de 2.000 gramas, cerca de 250 gramas a cerca de 2.000 gramas, cerca de 500 gramas a cerca de 2.000 gramas, cerca de 750 gramas a cerca de 2.000 gramas, cerca de 1.000 gramas a cerca de 2.000 gramas, cerca de 100 gramas a cerca de 1.000 gramas, cerca de 150 gramas a cerca de 1.000 gramas, cerca de 200 gramas a cerca de 1.000 gramas, cerca de 250 gramas a cerca de 1.000 gramas, cerca de 300 gramas a cerca de 1.000 gramas, cerca de 400 gramas a cerca de 1.000 gramas, cerca de 500 gramas a cerca de 1.000 gramas ou cerca de 750 gramas a cerca de 1.000 gramas.

[0272] Comparando-se a quantidade total de rCSP purificada obtida com a quantidade de rCSP medida no material de partida, se fornece o processo de rendimento de purificação total como um rendimento percentual (ou rendimento fracionário). Nas modalidades da presente invenção, o rendimento percentual de processo de purificação total da rCSP purificada obtida é de cerca de 10% a cerca de 75%. Nas modalidades, o rendimento percentual da rCSP purificada obtida é de pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 15%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 25%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 35 %, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 50 %, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, cerca de 10% a cerca de 70%, cerca de 10% a cerca de 65%, cerca de 10% a cerca de 60%, cerca de 20% a cerca de 75%, cerca de 2 0% a cerca de 70%, cerca de 20% a cerca de 65%, cerca de 25% a cerca de 75%, cerca de 25% a cerca de 70%, cerca de 25% a cerca de 65%, cerca de 25% a cerca de 60%, cerca de 30% a cerca de 75%, cerca de 30% a cerca de 70%, cerca de 30% a cerca de 65%, cerca de 30% a cerca de 60%, cerca de 30% Í a cerca de 65% ou cerca de 30% a cerca de 60% . Nas modalidades , esses rendimento de processo são os rendimentos de rCSP que contêm quantidades limitadas de rCSP desnaturada, degradada, dimerizada ou agregada. Nas modalidades, esse rendimento de processo compreende não mais que 10% de rCSP desnaturada, não mais que 10% de rCSP degradada, 10% de rCSP agregada e/ou 10% de rCSP dimerizada. Nas modalidades, esse rendimento de processo compreende não mais que 5% de rCSPs desnaturadas, não mais que 5% de rCSP degradada, 5% de rCSP agregada e/ou não mais que 5% de rCSP dimerizada.

[0273] O rendimento de proteína também pode ser expresso como a percentagem ou fração de proteína celular total (tcp), a quantidade de proteína/célula ou a porcentagem ou proporção de biomassa seca. Nas modalidades em que o rendimento é expresso em termos de volume de cultura, a densidade de célula de cultura pode ser levada em consideração, particularmente quando rendimentos entre culturas diferentes estão sendo comparados. Entende-se que os rendimentos de recuperação também podem ser determinados para cada etapa ou para múltiplas etapas do processo de purificação (em oposição à descrição de um rendimento de purificação total).

QUALIDADE DE PROTEÍNA

[0274] Nas modalidades relacionadas, a rCSP é descrita em termos de qualidade de proteína em qualquer etapa do processo de purificação. Nas modalidades, conforme descrito no presente documento, a qualidade de proteína pode ser descrita como uma função da quantidade ou porcentagem da rCSP que é dimerizada ou não dimerizada, degradada ou não degrada (ou recortada) no N-terminal ou desnaturada ou não desnaturada, isto é, tendo ligações dissulfeto intactas na região C-terminal ou qualquer combinação das mesmas. As medidas de qualidade também incluem a porcentagem ou fração de CSP determinada para ser ativa, por exemplo, através do ensaio de ligação. Nessas modalidades, a atividade pode ser expressa comparando-se a quantidade de proteína determinada para ser ativa com a quantidade total de proteína analisada. A quantidade de proteína em qualquer etapa de purificação que é determinada, por exemplo, a ser dimerizada, não dimerizada, agregada, não agregada, degradada, não degradada, desnaturada, não desnaturada, inativa ou ativa pode ser comparada com a quantidade total da proteína na mesma etapa. Por exemplo, a quantidade de rCSP não dimerizada, não agregada, não degradada, não desnaturada ou ativa na proteína purificada obtida pode ser comparada à quantidade total de rCSP purificada obtida, para chegar a um valor percentual ou fracionário da quantidade de rCSP não dimerizada, não agregada, não degradada, não desnaturada ou ativa, etc. De maneira alternativa, a quantidade de rCSP não dimerizada, não agregada, não degradada, não desnaturada ou ativa, etc. na proteína purificada obtida pode ser comparada com a quantidade de rCSP não dimerizada, não agregada, não degradada, não desnaturada ou ativa, etc. no material de partida, para chegar a um valor percentual ou fracionário da quantidade recuperada de rCSP que é não dimerizada, não agregada, não degradada, não desnaturada ou que é ativa, etc.

[0275] Qualquer método para avaliar a formação de dímero de rCSP, conforme descrito no presente documento ou conforme conhecido na técnica, pode ser usado para determinar a formação de dímero de rCSP percentual. Os métodos podem incluir, por exemplo, HPLC (incluindo RP-HPLC e SE-HPLC). Os métodos para avaliar a formação de agregado HMW podem incluir, por exemplo, HPLC e SDS-PAGE.

[0276] Nas modalidades da presente invenção, a rCSP purificada obtida compreende menos de cerca de 12% de dímeros. Nas modalidades, a rCSP purificada obtida compreende menos de cerca de 11%, menos de cerca de 10%, menos de cerca de 9%, menos de cerca de 8%, menos de cerca de 7%, menos de cerca de 6%, menos de cerca de 5%, menos de cerca de 4%, menos de cerca de 3%, menos de cerca de 2% ou menos de cerca de 1% de dímero. Nas modalidades relacionadas, a rCSP purificada obtida compreende pelo menos 88% de monômeros. Nas modalidades, a rCSP purificada obtida compreende pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, pelo menos 100% de monômeros.

[0277] Qualquer método para avaliar a degradação de rCSP, conforme descrito no presente documento ou conforme conhecido na técnica, pode ser usado para determinar a degradação de rCSP percentual. Os métodos podem incluir, por exemplo, LC-MS/massa intacta, SDS-PAGE, HPLC (incluindo RP-HPLC e SE-HPLC) e sequenciamento N- terminal.

[0278] Nas modalidades da presente invenção, a rCSP purificada obtida compreende menos de cerca de 10% de espécies de rCSP totais degradas no N-terminal. Nas modalidades, a rCSP purificada obtida compreende menos de cerca de 9%, menos de cerca de 8%, menos de cerca de 7%, menos de cerca de 6%, menos de cerca de 5%, menos de cerca de 4%, menos de cerca de 3%, menos de cerca de 2% ou menos de cerca de 1% de espécies de rCSP totais degradadas no N- terminal. Nas modalidades, nenhuma rCSP purificada obtida é degradada no N-terminal. Nas modalidades, a degradação percentual é a porcentagem recortada em C5/Y6 ou V14/L15, Nas modalidades, a degradação percentual é a porcentagem recortada tanto em C5/Y6 como em V14/L15, Nas modalidades, a degradação percentual é a porcentagem recortada em C5/Y6, V14/L15 e/ou N29/E30. Em outras modalidades, a degradação percentual é a porcentagem recortada em C5/Y6, V14/L15, N29/E30 e/ou S44/L45, Nas modalidades, a degradação percentual é a porcentagem de rCSP obtida que é não especificamente degradada. Nas modalidades, a rCSP purificada obtida compreende menos de cerca de 10%, menos de cerca de 9%, menos de cerca de 8%, menos de cerca de 7%, menos de cerca de 6%, menos de cerca de 5%, menos de cerca de 4%, menos de cerca de 3%, menos de cerca de 2% ou menos de cerca de 1% de rCSP que é não especificamente degradada no N-terminal. Nas modalidades, nenhuma rCSP purificada obtida é não especificamente degradada no N-terminal. Nas modalidades, a degradação percentual é a porcentagem de rCSP obtida que é recortada em C5/Y6, V14/L15, N29/E30 e/ou S44/L45 combinada com a porcentagem de rCSP que é não especificamente degradada no N-terminal. Nas modalidades relacionadas, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% da rCSP obtida é não degradada no N-terminal, não especificamente ou através do corte em C5/Y6, V14/L15, N29/E30 e/ou S44/L45.

[0279] Nas modalidades da presente invenção, não mais que 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% ou nenhuma rCSP purificada obtida é degradada, recortada ou proteolizada em um aminoácido selecionado a partir dos resíduos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 e 50 (onde o resíduo 1 é o primeiro resíduo na proteína expressa que não inclui a líder, por exemplo, Q na Figura 2C, SEQ ID NO: 3, e M na Figura 2B, SEQ ID NO: 2) . Nas modalidades, pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% da rCSP purificada obtida é intacta em um aminoácido selecionado a partir dos resíduos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, e 50.

[0280] Nas modalidades específicas, a rCSP purificada é obtida em um processo de rendimento de purificação total de cerca de 10% a cerca de 75%, em que a rCSP purificada compreende menos de cerca de 5% de dímeros, compreende menos de cerca de 10% de espécies recortadas de C5/Y6 e V14/L15 totais, e menos de cerca de 5% de rCSPs desnaturadas.

[0281] Qualquer método para avaliar a desnaturação de rCSP, conforme descrito no presente documento ou conforme conhecido na técnica pode ser usado para determinar a porcentagem de proteína desnaturada. Por exemplo, os métodos para analisar a estrutura secundária, por exemplo, CD e a fluorescência intrínseca, e métodos para analisar ligação dissulfeto, por exemplo, mapeamento de peptídeos e alquilação/massa intacta/digestão de Glu-C, podem ser usados.

[0282] Nas modalidades, a rCSP purificada obtida compreende menos de cerca de 10%, menos de cerca de 9%, menos de cerca de 8%, menos de cerca de 7%, menos de cerca de 6%, menos de cerca de 5%, menos de cerca de 4%, menos de cerca de 3%, menos de cerca de 2% ou menos de cerca de 1% de rCSP desnaturada, por exemplo, rCSP tendo ligação dissulfeto imprópria. A ligação dissulfeto imprópria é identificada quando pelo menos uma das duas ligações dissulfeto nativas na região C-terminal é desemparelhada ou não emparelhada. Nas modalidades, pelo menos cerca de 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%, respectivamente, das rCSPs purificadas têm ligações dissulfeto intactas. Em outras modalidades, a desnaturação é determinada comparando-se uma ou mais medidas de estrutura secundária da rCSP purificada a uma rCSP padrão de referência.

[0283] Entende-se que a numeração usada para descrever os sítios de corte ou as cisteínas e ligações dissulfeto pode variar dependendo da sequência de aminoácido de rCSP.

[0284] Espécies Contendo Piroglutamato

[0285] Em determinadas modalidades, pode ser desejável que as espécies de rCSP contendo piroglutamato, por exemplo, a rCSP em que a glutamina é desamidada em glutamato e, subsequentemente, o glutamato é ciclizado em piroglutamato (glutamina ^ ácido glutâmico ^ piroglutamato) sejam limitadas. Conforme descrito no presente documento, observou-se que as espécies contendo não piroglutamato de rCSP diminuíram ao longo do tempo à medida que as espécies contendo piroglutamato aumentaram ao longo do tempo. O piroglutamato pode ser medido por qualquer outro método apropriado conhecido na técnica, por exemplo, RP-HPLC.

[0286] Nas modalidades, a rCSP purificada obtida compreende menos de cerca de 20%, menos de cerca de 18%, menos de cerca de 15%, menos de cerca de 10%, menos de cerca de 9%, menos de cerca de 8%, menos de cerca de 7%, menos de cerca de 6%, menos de cerca de 5%, menos de cerca de 4%, menos de cerca de 3%, menos de cerca de 2% ou menos de cerca de 1% de rCSP contendo piroglutamato.

[0287] Nas modalidades, o rendimento de processo compreende não mais que cerca de 20%, 18%, 15%, 10%, 5% ou 1% de rCSP contendo piroglutamato.

[0288] Nas modalidades, a quantidade de espécies contendo piroglutamato em uma formulação de rCSP aumenta em não mais que cerca de 0%, 0,5%, 1%, 1,5%, 2%, armazenadas por J □ elo 1 menos cerca de 7 dias, pelo menos cerca de 8 dias, pelo menos cerca de 9 dias, pelo menos cerca de 10 dias, pelo menos cerca de 11 dias, pelo menos cerca de 12 dias, pelo menos cerca de 13 dias, pelo menos cerca de 14 dias, pelo menos cerca de 15 dias, pelo menos cerca de 16 dias, pelo menos cerca de 17 dias, pelo menos cerca de 18 dias, pelo menos cerca de 19 dias, pelo menos cerca de 20 dias, pelo menos cerca de 21 dias, pelo menos cerca de 22 dias, pelo menos cerca de 23 dias, pelo menos cerca de 24 dias, pelo menos cerca de 25 dias, pelo menos cerca de 30 dias, pelo menos cerca de 60 dias, pelo menos cerca de 70 dias, pelo menos cerca de 80 dias, pelo menos cerca de 90 dias, pelo menos cerca de 6 meses ou pelo menos 2,5%, 3%, 3,5%, 4%, 4,5%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9% ou 10%, quando cerca de 1 ano. Em determinadas modalidades, a taxa máxima de aumento em espécies contendo piroglutamato é menor ou igual a cerca de 1% a cerca de 3% ou a cerca de 5% quando armazenadas por cerca de 9 dias a cerca de 25 dias. As quantidades antes do armazenamento (por exemplo, a T=0) podem ser usadas para comparação.

[0289] Nas modalidades, a qualidade de rCSP é indicada pela presença de menos de cerca de 10% de espécies de rCSP contendo piroglutamato. Nas modalidades, a qualidade de rCSP é indicada pela ausência de espécies contendo piroglutamato, em que essas espécies estão presentes em não mais que cerca de 10%, não mais que cerca de 9%, não mais que cerca de 8%, não mais que cerca de 7%, não mais que cerca de 6%, não mais que cerca de 5%, não mais que cerca de 4%, não mais que cerca de 3%, não mais que cerca de 2% ou não mais que cerca de 1% da proteína total ou CSP purificada obtida.

PUREZA DE PROTEÍNA

[0290] Nas modalidades, a pureza da rCSP é avaliada por SDS-CGE e/ou SDS-PAGE em qualquer etapa no processo de purificação, e um valor de pureza consequentemente atribuído. A pureza pode ser calculada pelo software de instrumento SDS-CGE, que divide a área de pico da proteína alvo (por exemplo, monômero de rCSP) em um eletroferograma pela área dos outros picos. Nas modalidades, a pureza da rCSP purificada obtida usando os métodos da invenção é de cerca de 85% a 100%. Nas modalidades, a pureza é de pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 86%, pelo menos cerca de 87%, pelo menos cerca de 88%, pelo menos cerca de 89%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 91%, pelo menos cerca de 92%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 94%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99%, cerca de 85% a cerca de 99%, cerca de 85% a cerca de 98%, cerca de 85% a cerca de 97%, cerca de 85% a cerca de 96%, cerca de 90% a cerca de 99%, cerca de 90% a cerca de 98%, cerca de 90% a cerca de 97%, cerca de 90% a cerca de 96% ou cerca de 90% a cerca de 95%.

[0291] Em determinadas modalidades, a rCSP purificada obtida tem uma pureza de 96%, contém não mais que 5% de dímeros, contém agregados de alto peso molecular não detectáveis (HMW), contém menos de 10 EU/mg de endotoxina, e tem corte proteolítico não detectável. Nas modalidades a endotoxina está presente em não mais que cerca de 10 EU/mg, não mais que cerca de 25 EU/mg, não mais que cerca de 50 EU/mg, não mais que cerca de 100 EU/mg, não mais que cerca de 250 EU/mg, não mais que cerca de 400 EU/mg ou não mais que cerca de 500 EU/mg.

ANÁLISE DE PRODUTO

[0292] Nas modalidades da presente invenção, a CSP recombinante é avaliada em qualquer etapa do processo de purificação da invenção para qualquer um dentre rendimento, pureza, qualidade e estabilidade usando os métodos, conforme descrito no presente documento, relatados na literatura e conhecidos na técnica. Os ensaios para avaliar as rCSP são proporcionados no presente documento como exemplos não limitativos.

DETERMINAÇÃO DE RENDIMENTO DE PROTEÍNA

[0293] A presente invenção proporciona um processo útil para obter a rCSP purificada em um alto rendimento de purificação total. Os métodos SDS-PAGE, por exemplo, SDS-CGE ou Western blot, podem ser usados para determinar o rendimento e monitorar a pureza de rCSP, conforme apropriado em qualquer etapa do processo de purificação. Nas modalidades, a proteína incluída na medição de rendimento inclui rCSP monomérica e não dimérica ou rCSP agregada. Nas modalidades, o rendimento de etapa e/ou rendimento total é determinado. Nas modalidades, a sujeição da rCSP às condições de redução preferenciais resulta em um rendimento de etapa aumentado de monômero de rCSP devido à conversão de dímeros rCSP em monômeros.

[0294] Os métodos adequados para determinar o rendimento são conhecidos por aqueles versados na técnica, por exemplo, as amostras de proteína podem ser analisadas por eletroforese capilar em gel SDS microchip HTP (SDS-CGE) usando um instrumento LabChip GXII (Caliper LifeSciences, Hopkinton, MA) com um HT Protein Express v2 chip e reagentes correspondentes (números de peça 760499 e 760328, respectivamente, Caliper LifeSciences). As amostras são preparadas seguindo o protocolo do fabricante (Protein User Guide Document no 450589, Rev. 3) e submetidas à eletroforese em géis de poliacrilamida. Após a separação o gel é corado, descorado e digitalmente imageado.

[0295] As concentrações de proteína de amostras de rCSP purificada podem ser determinadas pela absorbância a 280 nm (A280 para 1 mg/ml = 0, 61 AU, conforme determinado pelo Vector NTI Invitrogen) usando um Eppendorf BioPhotometer (Eppendorf, Hamburg, Alemanha).

[0296] A análise Western blot para determinar o rendimento ou pureza pode ser realizada de acordo com qualquer método apropriado conhecido na técnica ao transferir a CSP separada em géis SDS-PAGE para uma membrana de nitrocelulose e incubar a membrana com um anticorpo de CSP monoclonal anti-Pf.

[0297] Os anticorpos de CSP úteis para quaisquer métodos analíticos descritos no presente documento podem ser gerados através dos procedimentos adequados conhecidos por aqueles versados na técnica. Os anticorpos úteis também foram descritos na literatura e são comercialmente disponíveis. Os anticorpos monoclonais de conformação de CSP específicos adequados foram descritos, por exemplo, os anticorpos 4C2, 4B3 e 1G12 foram caracterizados e relatados como sensíveis à desnaturação de CSP por Plassmeyer, et al., 2009, os anticorpos de CSP que têm características de ligação desejadas podem ser gerados e analisados de acordo os com métodos descritos na literatura, por exemplo, por Plassmeyer, et al., 2009, DETERMINAÇÃO DE DESNATURAÇÃO DE PROTEÍNA

[0298] Nas modalidades, o processo de purificação da presente invenção é usado para obter o monômero de rCSP purificado que é não desnaturado, sem a necessidade de reenovelamento. A rCSP que é não desnaturada tem uma estrutura nativa que pode ser avaliada, por exemplo, em comparação a um padrão de referência interno. Nas modalidades, a desnaturação é analisada com base na presença de ligação dissulfeto apropriada na região C- terminal. A estrutura secundária ou terciária da proteína e a presença de ligação dissulfeto apropriada na região C- terminal podem ser analisadas por métodos conhecidos na técnica ou descritos no presente documento.

[0299] A estrutura secundária da proteína pode ser analisada usando, por exemplo, dicroísmo circular (CD) ou fluorescência intrínseca. O CD pode empregar um espectropolarímetro (por exemplo, Jasco J-815, JASCO). A região UV-CD distante de 185 a 250 nm monitora as diferenças estruturais secundárias (isto é, a-hélices, b- folhas e espirais aleatórias). A espectroscopia UV CD distante (240 a 190 nm) pode ser realizada no espectropolarímetro Jasco J-815 com a largura de banda ajustada em 1 nm e velocidade de varredura de 100 nm/min., Tempo de Integração Digital (DIT) = 1 seg., com 5 x acumulações, usando cadinho de comprimento de caminho de 0,1 mm. As amostras podem ser analisadas a 20 °C em x 5 mM de Tris (Sigma, número de catálogo T7818-250G)/ 16,7 mM de tampão de sulfato de sódio (Sigma, número de catálogo S9627-500G) pH, 7,5. O software de análise, por exemplo, K2D2, descrito por Perez-Iratxeta, et al., 2008, “K2D2: estimation of protein secondary structure from circular dichroism spectra”, BMC Structural Biology 8:25 (doi:10.1186/1472-6807-8-25), pode ser usado para avaliar a porcentagem de hélice alfa e folha beta na proteína. A CSP é relatada por conter 5% de hélice alfa e 27% de folha beta (por exemplo, por Plassmeyer, et al., 2009).

[0300] Para a fluorescência intrínseca, a temperatura de espectropolarímetro inicial pode ajustada a 20 °C, seguida por aumentos graduais de 40, 45, 55, 65 e 75 °C, após um retorno para 20 °C. A fluorescência é lida em cada ajuste de temperatura e as leituras de fluorescência podem ser ajustadas da seguinte maneira: Excitação a 280 nm; Emissão a 295 a 395 nm; Sensibilidade = 790 V; Distância entre dados = 1 nm; Tempo de Integração Digital (DIT) = 1 seg.; Emissão de largura de banda = 10nm; Acumulações de espectro = 3; Barra de agitação rpm = 200.

[0301] A desnaturação/conformação da rCSP obtida pode ser avaliada usando a interferometria de biocamadas (BLI) que mede a ligação de rCSP a um alvo selecionado. Nas modalidades, a ligação aos anticorpos de conformação específica (por exemplo, anticorpos que não irão se ligar à proteína desnaturada) e/ou à heparina é medida. Os ensaios de ligação funcionais são úteis para monitorar as diferenças na conformação de rCSP e podem ser empregados como ensaios de potência substitutos. Os exemplos de anticorpos de conformação específica úteis nesses métodos são descritos no presente documento e por Plassmeyer, et al., 2009. As configurações de biossensor exemplificativas que usam heparina e anticorpos de conformação específica são descritas no presente documento nos Exemplos.

[0302] A estrutura enovelada globular pode ser analisada usando a HPLC de exclusão por tamanho (SE-HPLC). A exclusão por tamanho separa as proteínas com base no tamanho das proteínas maiores que eluem antes das menores. Nas modalidades, a HPLC de exclusão por tamanho (SE) é realizada usando uma coluna TSK-GEL G3000SWXL. De maneira notável, conforme descrito nos Exemplos, a rCSP (que é de ~38 kDa) tem um tempo de retenção mais curto que o esperado.

[0303] A ligação dissulfeto pode ser analisada usando o mapeamento de peptídeos, conforme descrito no presente documento nos Exemplos. A rCSP pode ser submetida a uma digestão de protease dupla, primeiro com tripsina e, então, com elastase. As digestões duplas são analisadas por LC-MS/MS, e os dados resultantes processado usando BiopharmaLynx (Waters Corp., Milford, MA) para identificar os dois dipeptídeos ligados ao dissulfeto. Como um procedimento de controle negativo, os mesmos dados podem ser processados usando um arquivo de método contendo o inverso das ligações dissulfeto acima (isto é, incorretas), C314 — C354 e C318 — C34 9,

DETERMINAÇÃO DE DEGRADAÇÃO DE PROTEÍNA

[0304] A presente invenção proporciona um processo de purificação útil para obter a rCSP purificada que é não degradada na região N-terminal. Nas modalidades, a LC-MS é usada para monitorar o corte proteolítico, desamidação, oxidação e fragmentação, e para verificar que a cisteína da região N-terminal é não emparelhada.

[0305] Nas modalidades, a cisteína N-terminal livre é identificada por alquilação e mapeamento de peptídeos, por exemplo, conforme descrito no presente documento nos Exemplos.

[0306] Nas modalidades, a RP-HPLC é usada para detectar a fragmentação, desamidação e oxidação.

[0307] A HPLC pode ser usada para caracterizar a rCSP, proporcionando informações estruturais que incluem teor de monômero e dímero. Nas modalidades, a HPLC de Fase Reversa (RP-HPLC) é usada para avaliar o teor de monômero e dímero, fragmentação, desamidação e oxidação. A adição de um agente redutor, por exemplo, 20 μM de DTT, pode auxiliar na identificação das espécies deslocando-se o dímero observado em direção ao monômero, e os agregados ao dímero ou monômero. Os métodos para RP-HPLC, incluindo as colunas de fase reversa apropriadas (RP), são conhecidos na técnica e descritos na literatura. Em determinadas modalidades, uma coluna Jupiter C4 (Phenomenex) é usada.

[0308] Nas modalidades, a cromatografia preparativa hidrofóbica é usada para solucionar as formas monoméricas e diméricas de rCSP.

[0309] Nas modalidades, a heterogeneidade de carga de proteína é analisada usando, por exemplo, a focalização isoelétrica capilar (cIEF) ou a focalização isoelétrica capilar imageada (icIEF). Nessas modalidades, um padrão, por exemplo, um padrão de referência interno de rCSP, pode ser usado para comparação. Conforme descrito nos Exemplos no presente documento, um padrão de referência interno de rCSP avaliado usando a cIEF mostra os picos principais em pI 5,20 e pI 5,76 e picos menores em pI 4,99, 5, 08 e 5,52.

[0310] Nas modalidades, a micro- heterogeneidade de CSP é analisada usando a espectrometria de massa de mapeamento de peptídeos.

DETERMINAÇÃO DE PUREZA DE PROTEÍNA

[0311] Nas modalidades, os contaminantes que incluem proteínas de células hospedeiras e ácidos nucleicos são avaliados usando métodos bem conhecidos na técnica.

[0312] Conforme descrito em relação à determinação de rendimento, os métodos SDS-PAGE são úteis para identificar as espécies de agregados de dímero e HMW contaminantes. Nas modalidades, a SE-HPLC é usada para identificar espécies de agregados.

[0313] Nas modalidades, os métodos ELISA são usados para medir a proteína de célula hospedeira. Por exemplo, o ELISA de proteína de célula hospedeira (HCP) pode ser realizado usando o kit "Immunoenzymetric Assay for the Measurement of Pseudomonas fluorescens Host Cell Proteins", disponível junto a Cygnus Technologies, Inc., número de catálogo F450, de acordo com o protocolo do fabricante. A placa pode ser lida em um SPECTRAmax Plus (Molecular Devices), usando o software Softmax Pro v3.1.2.

[0314] Nas modalidades, a endotoxina é avaliada por um teste Limulus amebocyte lysate (LAL). Os testes LAL são bem conhecidos na técnica e foram aprovados pela FDA para testar fármacos, dispositivos e outros produtos que entram em contato com o sangue. Nas modalidades, a quantidade de endotoxina nas frações de eluição é analisada usando um analisador de endotoxina portátil Endosafe-PTS (Charles River Laboratories (CHL)) seguindo os de operação fornecidos pelo fabricante, usando cartuchos com faixas de sensibilidade de 1 a 0,01 EU/mL (CHL, número de peça PTS2001F) e 10 a 0,1 EU/mL (CHL, número de peça PTS201F).

[0315] Nas modalidades, o DNA de célula hospedeira é analisado usando Q-PCR. O DNA de célula hospedeira pode ser avaliado usando, por exemplo, os iniciadores de oligonucleotídeos específicos para o gene de DNA Polimerase I. As sequências de cadeia principal de plasmídeo de expressão da cepa de expressão são detectadas por PCR quantitativa em tempo real. A PCR em tempo real pode ser realizada, por exemplo, com um DNA Engine Opticon System PTC-200 DNA Engine Cycler (MJ Research, CFD-3200 Opticon).

PURIFICAÇÃO DE PADRÃO DE REFERÊNCIA INTERNO DE RCSP

[0316] Nas modalidades, um padrão de referência interno de rCSP é usado na análise realizada em associação com os métodos da presente invenção. O padrão de referência pode ser realizado de acordo com os métodos conhecidos na técnica ou conforme descrito no presente documento. Por exemplo, a pasta celular das células hospedeiras que expressam rCSP pode ser microfluidizada, separada para remover detritos celulares sólidos e separada para remover proteínas de células hospedeiras. A rCSP purificada final pode ter o tampão trocado por PBS (pH 7,2) por filtração em gel, filtro esterilizado e armazenada a - 80°C. A pureza do padrão de referência interno pode ser analisada, por exemplo, por SDS-PAGE. Nas modalidades, a pureza do padrão de referência interno de rCSP é determinada para ser >90% por SDS-PAGE. Nas modalidades, o padrão contém menos de 10% de dímero. A análise Western blot pode ser usada para confirmar a identidade da rCSP e revelar a presença de espécies fragmentadas. Um ensaio de anticorpo de conformação específica pode ser realizado, por exemplo, usando um anticorpo que é sensível ao domínio C- terminal, em que as duas ligações dissulfeto nativas são intactas e apropriadamente emparelhadas. Os anticorpos apropriados foram descritos na literatura, por exemplo, por Plassmeyer, et al., 2009. As amostras reduzidas e alquiladas podem ser analisadas para perda de sinal que indica que o padrão de rCSP purificada tem a estrutura dissulfeto correta. Nas modalidades, a concentração do padrão de rCSP é determinada pela absorbância a 280 nm. Nas modalidades, o material de referência demonstrou potência em estudos de animais.

[0317] Nas modalidades da presente invenção, o processo de recuperação primária tem duas opções. As células são colhidas por centrifugação e a pasta celular congelada. A pasta celular pode, então, ser descongelada e microfluidizada para produzir homogenato celular. De maneira alternativa, o caldo celular pode ser diluído e diretamente micofluidizado para produzir homogenato celular sem uma etapa de retenção.

[0318] Em determinadas modalidades, a opção de formação de pasta celular é usada. O homogenato é, então, clarificado usando uma centrífuga de pilha de discos, seguida pela filtração profunda usando a membrana X0HC em tandem com filtração de 0,2 μm. O material é, então, mantido congelado como uma etapa de retenção e, então, descongelado e carregado na coluna de captura TMAE HiCap. O material eluído é passado através de um filtro de 0,2 μm e, então, diretamente carregado na coluna de Hidroxiapatita Cerâmica Tipo I (CHT) . O eluato de coluna CHT é, então, submetido à filtração de 0,2 μm e tratamento de redução moderada enquanto é mantido à temperatura ambiente. O material pós-tratamento de redução moderada tem, então, o tampão trocado por TFF, filtrado a 0,2 μm e armazenado congelado a -80 °C.

[0319] Nas modalidades, a rCSP purificada obtida usando os métodos da invenção tem mais de 90% de pureza, conforme determinado por SDS-PAGE (SDS-CGE), menos de 10% de dímero, conforme determinado por SE-HPLC, agregados de peso molecular mais alto não detectáveis (HMW), conforme determinado por SE-HPLC, menos de 5% de fragmentos detectáveis por LC/MS e menos de 100 EU/mg de endotoxina. Embora as modalidades preferidas da presente invenção tenham sido mostradas e descritas no presente documento, será obvio para aqueles versados na técnica que tais modalidades são proporcionadas apenas por meio de exemplo. Inúmeras variações, alterações e substituições irão ocorrer agora para aqueles versados na técnica sem desviar da invenção. Deve-se compreender que diversas alternativas para as modalidades da invenção descrita no presente documento podem ser empregadas na prática da invenção. Pretende-se que as reivindicações a seguir definam o escopo da invenção e que os métodos e estruturas dentro do escopo dessas reivindicações e seus equivalentes, desse modo, sejam cobertos.

EXEMPLOS

[0320] As etapas do processo de purificação foram identificadas e testadas para uso nos métodos da presente invenção. Uma análise SDS-CGE foi usada para avaliar rendimentos e pureza de proteína. Amostras de proteína foram analisadas por eletroforese por gel capilar SDS com microchip HTP com o uso de um instrumento LabChip GXII (Caliper LifeSciences, Hopkinton, MA) com um chip HT Protein Express v2 e reagentes correspondentes (números de parte 760499 e 760328, respectivamente, Caliper LifeSciences). As amostras foram preparadas seguindo o protocolo do fabricante (Documento Guia de Usuário de Proteína no 450589, Rev. 3).

[0321] As concentrações de proteína de amostras rCSP purificadas foram determinadas repetidamente pela absorvância em 280 nm (A280 para 1 mg/ml = 0, 61 AU conforme determinado por Vector NTI Invitrogen) com o uso de um BioFotômetro Eppendorf (Eppendorf, Hamburg, Alemanha).

[0322] Lotes de pasta celular usados no desenvolvimento de processo e desenvolvimento de ensaio foram preparados de células hospedeiras bacterianas, projetados para expressar de forma recombinante CSP com o uso de métodos descritos na presente invenção. A sequência de nucleotídeos CSP expressa pelas cepas de P. fluorescens que foram usadas para preparar os lotes de pasta celular compreendeu a sequência de nucleotídeos otimizada apresentada na SEQ ID NO: 5 (sequência de aminoácidos correspondente apresentada na SEQ ID NO: 3). A cepa CS533- 129 é P. fluorescens DC469 (ΔpyrF, lacIQ, LhtpX) que contém um vetor de expressão que codifica CSP (SEQ ID NO: 3) unido ao condutor de secreção LAO. A cepa CS533-211 é P. fluorescens DC488 (deleção de degP2) que contém um vetor de expressão que codifica CSP (SEQ ID NO: 3) unido ao condutor CupA2.

EXEMPLOS EXEMPLO 1: REDUÇÃO PREFERENCIAL DE PROTEÍNA CIRCUNSPOROZOÍTA DE PLASMODIUM FALCIPARUM PRODUZIDA DE FORMA RECOMBINANTE CONVERSÃO DE DÍMERO DE RCSP PARA MONÔMERO

[0323] Esse Exemplo descreve experimentos executados para identificar condições de redução preferenciais úteis para reduzir seletivamente as ligações dissulfeto intermoleculares de rCSP dimerizada enquanto se preserva as ligações dissulfeto intramoleculares de região C-terminal e estado estrutural nativo necessário para imunogenicidade de CSP.

[0324] Conforme discutido, a rCSP dimeriza imediatamente durante uma purificação devido a uma cisteína livre de região N-terminal que está disponível para formar uma ligação dissulfeto intermolecular. O dímero pode, então, formar agregados com maior peso molecular dependentes do tempo, concentração e temperatura. A CSP recombinante contém adicionalmente duas ligações dissulfeto na região C-terminal da mesma que são consideradas importantes para a potência da CSP. Para aumentar a recuperação de monômero de rCSP, foram investigadas condições que poderiam reduzir a ligação dissulfeto intermolecular e converter o dímero para monômero. Foram desejadas condições que não reduzissem os dissulfetos de região C-terminal intramoleculares.

[0325] Um ditiotreitol (DTT) foi testado como um agente redutor e foi adicionado a amostras de 1 ml de rCSP dimerizada de frações de cromatografia de Butyl 650S em concentrações variadas. As amostras foram agitadas ao longo da noite em uma placa de agitação magnética na temperatura ambiente. As amostras foram, então, analisadas pelo teor de monômero e dímero por RP-HPLC (Figura 4). O Painel A mostra os resultados que correspondem a concentrações de DTT de 0,5 mM (representadas pelo menor pico de monômero e o segundo maior pico de dímero), 0,1 mM (segundo maior pico de monômero que sobrepõe com pico de 0,03, segundo menor pico de dímero), 0,03 mM (segundo maior pico de monômero que sobrepõe o pico de 0,03, menor pico de dímero), e nenhum DTT (maior pico de monômero, maior pico de dímero) . O Painel B mostra os resultados que correspondem a concentrações de DTT de 0,01 mM (maior pico de monômero, menor pico de dímero) 0,003 mM (pico de monômero mediano, pico de dímero mediano) e nenhum DTT (menor pico de monômero, maior pico de dímero).

[0326] Existem três recursos para a cromatografia de RP-HPLC que são observados normalmente ao analisar uma rCSP: a rCSP principal em forma monomérica, um pico posterior do pico de rCSP principal e um pico que elui 1,4 minutos depois do pico principal que é a forma de dímero de rCSP. Conforme mostrado na Figura 4, uma adição de DTT, de modo geral, diminuiu a concentração do dímero e aumentou a concentração do pico de monômero; entretanto, se a concentração de DTT foi muito alta (0,5 mM na Figura 4A) ou muito baixa (0,003 mM na Figura 4B), a conversão de dímero para monômero foi mínima. A melhor faixa de concentração de redução preferencial de DTT para conversão foi determinada para ser de 0,010 a 0,030 mM de DTT.

[0327] O experimento foi repetido com o uso de um lote de rCSP (533-128) que continha dímero e agregados de HMW de dímero. Aproximadamente 3 g do lote 533-128 foram produzidas com o uso de um processo de purificação em pequena escala em múltiplos ciclos para pureza > 90% conforme determinado por SDS-PAGE. O lote 533-128 foi determinado, posteriormente, como sendo agregado. Foi observado que a adição de 2 M de ureia interrompe os agregados de HMW, o que quebra os mesmos para a forma de dímero (dados não mostrados). Foi adicionado DTT a um ml de amostras de 533-128 que contêm 2 M de ureia com concentrações variadas de DTT em pH 7,2 e pH 8,0 e incubadas por 6 h na temperatura ambiente. As amostras foram agitadas por 6 h em uma placa de agitação magnética na temperatura ambiente. A análise RP-HPLC das amostras é mostrada na Figura 5. As concentrações de DTT usadas para o experimento na Figura 5A e na Figura 5B são mostradas na Tabela 5 e na Tabela 6, respectivamente. TABELA 5. RP-HPLC EM PH 7,2 EM CONCENTRAÇÕES VARIADAS DE DTT Altura de Pico 1 Altura de Concentração % de Completamente Reduzido Pico 2 de DTT

TABELA 6. RP-HPLC EM PH 8,0 EM CONCENTRAÇÕES VARIADAS DE DTT

[0328] Em pH 7,2, foi determinado que as melhores concentrações de DTT são 12 μM e 25 μM para conversão e para um pH 8,0, a melhor concentração foi 25 μM. A maior concentração de DTT (10 mM) diminuiu o pico de dímero completamente para ambas as amostras de pH 7,2 e de pH 8,0 e causou um deslocamento no tempo de retenção para a esquerda (tempo de retenção mais curto), o que provavelmente é a forma completamente reduzida de rCSP.

[0329] Com base nos experimentos realizados, foi determinado que a concentração ideal de DTT usada no processo de redução brando era 20 μM. A realização da etapa de redução ao longo da noite (16 a 18 h) não teve impacto negativo na qualidade de rCSP, logo essa etapa foi usada como um ponto de retenção antes do inicio da troca de tampão UF/DF final.

[0330] A Figura 6 mostra um exemplo onde aproximadamente 120 mg de rCSP dimérica de cromatografia de Butyl 650S (lote de rCSP 533-241) foram tratadas por 16 h com 20 μM de DTT e misturação. O lote antes do tratamento conteve 92,1% de dímero por análise por RP-HPLC (Figura 6A) e um pós-tratamento com troca de tampão final por TFF conteve 94,2% de monômero (Figura 6B) . O material que trocou de tampão final foi analisado por SE-HPLC e nenhum agregado de HMW foi observado (Figura 7). O método de redução branda pareceu ser bem robusto e não teve impacto por diferenças pequenas na composição de tampão base. As frações de dímero de CSP recombinante que eluem de cromatografia de hidróxipatita cerâmica também foram sujeitas a um tratamento de redução branda com sucesso conforme discutido abaixo.

[0331] Conforme descrito em detalhes no presente documento, lotes de rCSP que foram sujeitos ao tratamento de redução branda foram analisados por LC/MS e um mapeamento de peptídeo para demonstrar que a Cisteína de N-terminal estava livre e os dissulfetos de C-terminal estavam intactos.

EXEMPLO 2: DESENVOLVIMENTO DE ENSAIOS PARA ANALISAR PROTEÍNA CIRCUNSPOROZOÍTA DE PLASMODIUM FALCIPARUM RECOMBINANTE PREFERENCIALMENTE REDUZIDA

[0332] Métodos analíticos em processo e no produto final foram desenvolvidos para avaliar proteína circunsporozoíta de Plasmodium falciparum recombinante. Esses métodos são contemplados para uso na avaliação de rCSP obtida com o uso das condições de redução preferencial descritas no Exemplo 1 ou por qualquer outro método.

1. PURIFICAÇÃO DE PADRÃO DE REFERÊNCIA INTERNO DE RCSP A purificação de rCSP (lote 533-191) para uso como uma referência interna foi realizada conforme a seguir. PREPARO DE LISATOS PARA PURIFICAÇÃO

[0333] Pastas celulares congeladas (aproximadamente 70 g) de células de CS533-129 cultivadas foram derretidas e ressuspensas em 20 mM de Tris, tampão de pH 8,0 (solução padrão de um molar, pH 8,0 diluída 50 vezes com água Milli-Q preparada com o uso de 1M de TRIS padrão, número de catálogo T1080, Teknova, Hollister, CA) sem inibidores de protease e homogeneizadas ao passar uma vez através de um Microfluidics Microfluidizer M-110Y em 103.421,25 kPa (15.000 psi). Os lisatos foram centrifugados em 12.000 g por 60 min e filtrados ao passar através de uma cápsula de filtro Sartorius Sartobran P 0,45/0,2 μm (número de catálogo 5235307H8-0-A, Sartorius-Stedim, Bohemia, NY). Os lisatos filtrados foram ajustados para 2,0 M de ureia com o uso de uma solução padrão de 8,0 M de ureia (número de catálogo 4203-08, JT Baker, Phillipsburg, NJ).

CROMATOGRAFIA

[0334] Operações de cromatografia de líquido de proteína rápida (FPLC) foram realizadas com o uso de sistemas de cromatografia ÃKTAexplorer 100 (GE Healthcare) equipados com coletores de fração Frac-950. As condições para a execução de purificação usado no preparo de 30 mg de CSP purificada são resumidos na Tabela 7 abaixo. Materiais usados: Q-Sepharose FF (número de catálogo 17-0510-01, GE Healthcare, Piscataway, NJ); colunas AK26/20 (número de parte 28-9889-48, GE Healthcare); Butyl-650S (número de catálogo 14701, TosohUSA, Flemington, NJ); NaCl (número de catálogo 13423, Sigma/Riedel de Haen, St. Louis, MO); NaOH (número de catálogo 5674-03, JT Baker, Phillipsburg, NJ) ; sulfato de amônio (número de catálogo BDH9001, VWR, West Chester, PA); e ureia (número de catálogo 4203-08, JT Baker, Phillipsburg, NJ). TABELA 7. CONDIÇÕES DE EXECUÇÃO DE PURIFICAÇÃO

CONVERSÃO DE DÍMERO DE RCSP PARA MONÔMERO

[0335] Frações de eluição de cromatografia de interação hidrofóbica que contêm CSP dimerizada em tampão [tampão de eluição: 2 M de ureia, 200 a 600 mM de sulfato de amônio e 20 mM de Tris, pH 8,0] foram agrupados até um volume final de 200 a 600 ml. O agrupamento foi submetido à redução seletiva pela adição de redutor ditiotreitol (JT Baker, número de parte JT-F780-2, Phillipsburg, NJ) até uma concentração final de 20 μM e agitado rapidamente com uma barra de agitação magnética e uma placa de agitação por 12 a 24 horas na temperatura ambiente. Alternativamente, rCSP agregado em PBS (por exemplo, lote 533-128) foi submetido ao mesmo processo primeiro pela adição de 2 M de ureia ao material antes de passar por redução seletiva.

TROCA DE TAMPÃO FINAL

[0336] O agrupamento de rCSP reduzido de forma branda foi trocado em um tampão 1X PBS pela cromatografia de dessalinização (coluna PD-10, número de catálogo 17-0851-01, GE Healthcare) . Para preparos maiores, o agrupamento de rCSP reduzido preferencialmente foi diafiltrado com 1x PBS (Teknova, P0191, 20x de concentração) através de filtração de fluxo tangencial. membranas de celulose regenerada Pellicon XL (10 kDa, 50 cm2) e Pellicon 2 (5 kDa, 0,1 m2 e 10 kDa, 50 cm2 e 0,1 m2) (EMD Millipore, Billerica, MA) foram usadas para reter CSP durante a troca de tampão. Unidades FilterTec e SciPres (Scilog, Inc., Madison, WI) foram usadas para coletar pressão transmembrana (TMP) e permear dados de massa de um equilíbrio. Bombas peristálticas FilterTec ou Masterflex L/S (Cole Parmer, Vernon Hills, IL) foram usadas para reter recirculação. Recipientes de Polipropileno e PETG foram usados como vasos de mistura e recirculação. Foi usada uma tubulação Tygon (Cole Parmer) e de silicone curado com Platina (Cole Parmer; AdvantaPure, Southampton, PA) para direcionar correntes de fluido. A carga (CSP reduzida de forma branda) e o retido (carga diafiltrada) foram filtrados com uma membrana de 0,22 μm esterilizante Millipak Durapore® (EMD Millipore) ou Sartobran® P (Aubagne, França).

[0337] As membranas foram equilibradas com 1x PBS antes da introdução de produto. Uma CSP preferencialmente reduzida foi recirculada pelas membranas a 324 litros por metro quadrado por hora (LMH) e 648 LMH na temperatura ambiente (21 a 23°C) . TMPs de 68,94 a 103,42 kPa (10 a 15 psi) e 144,78 a 165,47 kPa (21 a 24 psi) foram aplicadas ao retido enquanto estava sobre as membranas de 10 kDa e 5 kDa, respectivamente. Uma diafiltração de volume constante foi executada para seis volumes retidos (diavolumes) . As razões de carga de massa (alvo ^ área de membrana) foram 2,6 a 14,6 g/m2. Em um experimento, após três diavolumes, o retido foi concentrado 2x e diafiltrado para outros três diavolumes. O retido foi misturado com uma barra de agitação magnética e uma placa de agitação. As membranas foram limpas pela recirculação de 0,1 N de NaOH na temperatura ambiente por > 60 minutos. A regeneração da membrana foi verificada por medições de permeabilidade de água normalizadas.

[0338] Vários lotes retrabalhados desse material foram analisados conforme métodos foram desenvolvidos e são discutidos em múltiplas seções abaixo.

2. HPLC HPLC DE FASE REVERSA (RP-HPLC)

[0339] Métodos de HPLC de Fase Reversa (RP- HPLC) foram desenvolvidos para avaliar teor de monômero e de dímero de rCSP, fragmentação, deamidação e oxidação.

[0340] Foram feitas separações em um sistema de cromatografia líquida 1100 Series (Agilent Technologies, Inc., Palo Alto, CA) equipado com um autoamostrador, bomba quaternária e módulos de detecção de múltiplos comprimentos de onda (UV-vis). Os reagentes de fase móvel foram de grau analítico ou melhor disponíveis. O acetonitrilo usado foi de grau HPLC (J.T. Baker, solvente HPLC ‘Baker Analyzed’®, > 99,9%, número de catálogo 9017-33). TFA (ácido trifluoroacético) foi obtido a partir da Pierce (número de catálogo 28904). Água deionizada foi obtida com o uso de um sistema Milli-Q (Millipore, Bedford, MA) e filtrada antes do uso com um aparelho de filtro-esterilização PES Filter Unit, 1.000 ml, 90 mm, 0,2 μm (Nalgene, número de catálogo 567-0020) . A fase móvel A continha 0,1% de TFA em água (v/v); O solvente B continha 0,1% de TFA em Acetonitrilo (v/v) . As amostras foram diluídas com PBS, pH 7,2 (número de catálogo 14200, GIBCO, Carlsbad, CA) e 30 a 60 μl injetadas em uma coluna Jupiter C4 (Phenomenex, Número de Parte 00G-4167-E0) (300 Â de poro, 5 μm de tamanho de partícula, 4,6 x 250 mm) equipada com um cartucho protetor (Security Guard, 4x3 mm, número de catálogo KJO-4282). As condições de gradiente foram 22% a 32% de Mobile B em 20 min. A temperatura de coluna era 50°C. A taxa de fluxo era 1 ml/min. A Detecção era 214 nm e 280 nm.

[0341] É mostrada na Figura 8 a análise de amostras em processo para determinar formas diméricas e monoméricas de rCSP. Cromatografia hidrofóbica preparatória resolveu formas monoméricas e diméricas de rCSP determinadas pela análise SDS-CGE de redução e não redução (Figuras 8A a C). A análise das formas isoladas por RP-HPLC mostrou picos unitários com diferentes momentos de retenção consistentes com os momentos de retenção para misturas de monômero e dímero descritas acima (Figura 8D). HPLC DE EXCLUSÃO DE TAMANHO (SE-HPLC) Foram desenvolvidos métodos de SE-HPLC para identificar espécies agregadas e analisar estrutura globular de rCSP. A cromatografia de exclusão de tamanho foi executada em um TSKgel G3000SWXL, 7,8 mm ID x 300 mm, 5 micro (Tosoh, número de catálogo 8541) com uma Barreira TSKgel SWXL (Tosoh, número de catálogo 8543) equipada em um sistema de cromatografia líquida Agilent 1100 Series (Agilent Technologies, Inc.). A fase móvel foi fosfato tamponado salino (PBS), pH 7,4, diluído de 10X (Mediatech, número de catálogo 46-013-CM) com água MilliQ e filtrada antes do uso com uma PES Filter Unit, 1.000 ml, 90 mm, aparelho de filtro-esterilização de 0,2 μm (Nalgene, número de catálogo 567-0020) . A taxa de fluxo foi 0,5 ml-min”1; o volume de injeção foi 50 a 100 μl; e a absorvância foi monitorada em 280 nm. A Figura 9A mostra um cromatogramas SE de rCSP (533-191) onde uma coluna TSK-GEL G3000SWXL, a qual forneceu o melhor desempenho, foi usada. Sendo que as proteínas separadas por exclusão de tamanho com base no tamanho de proteínas maiores que eluíram antes das menores. Com base no peso molecular de rCSP (aproximadamente 38 kDa) , o momento de retenção deve ser maior que o que é observado. Por exemplo, a execução da cromatografia de um padrão de calibração como BSA na mesma coluna que tem um peso molecular de aproximadamente 67 kDa (aproximadamente 1,8 x maior em tamanho que rCSP), elui em um momento de retenção 1,66 min depois de rCSP na Figura 11B. Uma explicação para isso é a estrutura não globular altamente estendida de CSP, a qual pode ser enganosa para dimensionamento por SE-HPLC. O peso molecular de rCSP foi medido por detecção por espalhamento de luz de laser de múltiplos ângulos (MALS) acoplada a SE-HPLC e foi determinado como 42 a 4 6 kDa, o que é próximo ao peso molecular real da mesma (não mostrado) . O tamanho de BSA medido por MALS foi 70,5 kDa, o qual também está próximo ao peso molecular do mesmo. Os estudos de degradação forçada de rCSP foram analisados por SE-HPLC, junto com amostras que foram determinadas por outros métodos como tendo a qualidade comprometida. Formas agregadas de rCSP foram analisadas conforme mostrado na Figura 10. A Figura 10A mostra uma amostra que foi concentrada com o uso de um dispositivo de concentração centrífugo que, no caso para rCSP, produz dímero e agregados de alto peso molecular (HMW) . A Figura 10B mostra análise SE-HPLC de lote de rCSP 533-128, o qual foi provou ser altamente agregado.

3. SDS-PAGE

[0342] Um método SDS-PAGE foi desenvolvido para analisar pureza de rCSP e fragmentos de degradação. As amostras foram diluídas 1:1 com Tampão de Amostra Laemmli (Bio-Rad, número de catálogo 161-0737) e, então, aquecidas por 5 minutos a 95°C em um termociclador. Foi permitido que as amostras alcançassem a temperatura ambiente e, então, fossem carregadas para um Bio-Rad 10% Bis-Tris gels de 18 cavidades (Bio-Rad, número de catálogo 345-0112) e passaram por eletroforese a 100 V por 20 minutos, seguido por 200 V por 60 minutos, em tampão de teste 1X MOPS (Bio-Rad, número de catálogo 161-0788). Os tampões de teste foram resfriados para 10 °C durante separação por PAGE. Após a separação, o gel foi manchado com Mancha Azul GelCode (Pierce, número de catálogo 24592), desmanchado e imageado com o uso de um instrumento de imageamento digital.

4. WESTERN BLOT

[0343] Um método Western Blotting foi desenvolvido para monitorar fragmentos de degradação de pureza de rCSP.

[0344] As proteínas foram transferidas de géis SDS-PAGE a 100V por 60 minutos em uma membrana de nitrocelulose de 0,2 m (Bio-Rad, número de catálogo 162-0232) com o uso de Tampão de Transferência 1X NuPAGE (Invitrogen, número de catálogo NP0006-1) com 20% de metanol. Algumas amostras foram submetidas a uma alquilação antes de SDS-PAGE. Para essa análise, foi adicionada iodoacetamida (Sigma, p/n I6125) em excesso a amostras reduzidas até uma concentração final de 5 mM e incubadas por 30 min. na temperatura ambiente no escuro. As membranas foram bloqueadas por 1 hora na temperatura ambiente em Caseína Blocker™ em PBS (Pierce, 37528). Para detecção, os diluentes foram derramados e mais foram adicionados que contêm uma diluição 1:2000 de um anti-Pf CSP monoclonal. As manchas foram incubadas com balanço ao longo da noite a 4°C. As manchas foram lavadas três vezes com PBS-Tween por 5 minutos cada uma e foram, então, incubadas em mais diluente que contém uma diluição de 1:5.000 de IgG anti camundongo (específico de cadeia Y)-peroxidase, derivada em cabra (Southern Biotech, 1030-05) na temperatura ambiente por 1 hora. As manchas foram lavadas três vezes com PBS- Tween (Sigma, P3563) por 5 minutos cada uma, antes do desenvolvimento de cor uso de substrato Immunopure Metal Enhanced DAB (Pierce, 34065) por 1 minuto na temperatura ambiente. Um imageamento foi realizado com um Alpha Innotech FluorImager.

5. INTERFEROMETRIA DE BIOCAMADA (BLI)

[0345] Ensaios de ligação para rCSP foram desenvolvidos com o uso de interferometria de biocamada (BLI) como o método de detecção. A BLI pode ser usada para monitorar enovelamento e funcionalidade pela habilidade da rCSP em se ligar a anticorpos e/ou heparina de conformação específica. Ensaios de ligação funcionais são, portanto, úteis para detectar diferenças na conformação de rCSP e podem ser empregados como ensaios de atividade. Três estratégias foram desenvolvidas: sendo que uma envolve heparina onde CSP se liga a heparina como parte da função da mesma em se ligar a proteoglicanos de sulfato de heparina hepatócitos e duas outras que envolvem anticorpos monoclonais de conformação específica.

[0346] Método: anticorpo anti-CSP monoclonal IG12 ou 4C2 (descrito por Plassmeyer, et al., 2009, referido acima, o qual também descreve métodos para isolar anticorpos que reconhecem CSP) foi biotinilado com o uso do método descrito na Nota Técnica de ForteBio (Menlo Park, CA) : “Biotinylation of Protein for Immobilization onto Streptavidin Sensors” com o uso de NHS-LC-LC-biotin (Pierce, número de catálogo 21343) em uma razão molar sobre anticorpo de 2,5:1. Heparina da Calbiochem (número de catálogo 375095, Calbiochem é uma divisão da EMD Chemicals, Gibbstown, NJ) foi biotinilada conforme acima. Os biossensores (Biossensores de estreptavidina, ForteBio, número de catálogo 18-0009) foram hidratados em tampão cinético 1x (10 diluições de Tampão Cinético 1Qx, ForteBio, número de catálogo 18-5032 em PBS) por pelo menos 10 minutos. Os sensores foram carregados com 10 μg/ml de substrato biotinilado diluído em diluente de amostra (ForteBio, número de catálogo 18-5028) por 90 minutos na temperatura ambiente e 1.000 rpm em um agitador/misturador Sidekick™ (ForteBio) ou alongo da noite sem mistura a 4 °C.

[0347] As amostras foram diluídas ou em diluente de amostra ou em tampão cinético 1x. As amostras e padrões foram carregados em um volume de 100 Dl em placas de meia área (E&K Scientific, número de catálogo EK-78076) ou 200 μl em placas de 96 cavidades de tamanho padrão (E&K Scientific, número de catálogo EK-25209).

[0348] Os sensores foram saturados em tampão cinético 1x por aproximadamente 5 minutos e, então, pré- equilibrados por 40 minutos a 1.000 rpm em um agitador/misturador SidekickD em uma diluição de fração solúvel nula em uma concentração de proteína total aproximada de amostras de teste. A placa de amostras foi pré-equilibrada em 30 °C no instrumento Octet BLI por 10 minutos antes de iniciar o ensaio. As amostras foram lidas em 1.000 rpm, 30 °C por 180 s e uma quantificação foi calculada de uma curva padrão de substrato em 64, 32, 16, 8, 4, 2, 1 e 0,5 μg/ml.

[0349] Resultados: É mostrada na Figura 11A a configuração de biossensor com o uso de heparina para ligação de rCSP. Três preparos de rCSP, cada um preparado a partir de células que expressam a rCSP apresentada na SEQ ID NO: 3, foram ensaiados por ligação de heparina: lote 533-036; um lote 533-191 que foi purificado como um padrão de referência interna; e um lote 533-128. São mostrados na Figura 11B os resultados das taxas de ligação para esses preparos em concentrações variadas. As taxas para cada concentração de amostra foram bem diferentes entre si (Figuras 11B e C).

6. FOCALIZAÇÃO ISOELÉTRICA CAPILAR (cIEF)

[0350] Um método analítico de Focalização Isoelétrica Capilar foi desenvolvido para monitorar heterogeneidade de carga de rCSP.

[0351] Preparo de amostra: Uma amostra foi reduzida por incubação por 2 h em 2M de ureia (JT Baker, número de catálogo 4203-08) e 10 mM de DTT e, então, concentração para >1,5 mg/ml com o uso de 10 kDa de um concentrador centrífugo Millipore Microcon (número de catálogo 42407) . Trinta microlitros de amostra foram, então, misturados com 5 μl de 40% de Pharmalytes de pH 2,5 a 5 (GE Healthcare, número de catálogo 17-0451-01), 5 μl de 40% de Pharmalytes de pH 5 a 8 (GE Healthcare, número de catálogo 17-0453-01), 35 μl de 1% de metilcelulose (ProteinSimple, número de catálogo 101876), 25 μl de 8M de ureia e marcadores pI 4,22 e 6,14 (ProteinSimple, número de catálogos 102350 e 102220, respectivamente).

[0352] Método: A aquisição e a análise foram realizadas em um Analisador iCE280 (Convergent Bioscience, Toronto, Canadá, NÚMERO DE SÉRIE 1348) equipado com um Software CFR Versão 2.3.6, um revestimento FC de cartucho cIEF (Convergent Bioscience, número de catálogo 101700) e um Microinjetor PrinCE (Convergent Bioscience, número de série 54-20-07-4-048). As seguintes definições de analisador foram usadas: Período de Foco 1= 1.500 V por 1,0 min; Período de Foco 2 = 3.000V por 7,0 min; Tempo de Transferência de Amostra = 135 s; Duração de Lavagem = 0 s; Média de Varreduras = 16; Tempo de Exposição = 73 ms; Corrente de Dessalinização = 101 DA; Retardo de Tempo de Transferência =0,0 min; Detecção = 280 nm.

[0353] A calibração de marcadores de pl foi realizada pelo software iCE seguida pela conversão e pelo processamento de dados por ChromPerfect versão 5.5.6. Reagentes de tanque eletrolítico incluíram 0,08% de ácido fosfórico em 0,1% de metilcelulose e 0,1 M de hidróxido de sódio em 0,1% de metilcelulose (ambas as partes de reagente de Kit SimpleProtein, número de parte 102506).

[0354] Um método para analisar heterogeneidade de carga de rCSP foi desenvolvido com o uso de cIEF e são mostrados resultados na Figura 12. O lote de referência interna de rCSP 533-191 mostrou picos principais em pI 5,20 e pI 5,76 e picos menores em pI 4,99, 5,08 e 5,52 (Figura 12A) . O pI calculado com base na sequência de aminoácidos primária foi pI 5,21. Os menores picos de pI provavelmente foram devido à deamidação de resíduos de aspariginas em rCSP que criaram carga negativa e diminuíram o pI.

7. DICROÍSMO CIRCULAR E FLUORESCÊNCIA INTRÍNSECA

[0355] Um método de dicroísmo circular (CD) foi desenvolvido para rCSP. A região UV-CD distante de 185 a 250 nm monitora diferenças estruturais secundárias (isto é, a-hélices, β-folhas e espirais aleatórias). A Fluorescência Intrínseca foi avaliada para monitoramento de diferenças estruturais terciárias.

[0356] Método: Espectroscopia Far-UV CD (240 a 190 nm) foi executada em um espectropolarímetro Jasco J-815 (JASCO) com largura de banda definida para 1 nm e velocidade de varredura de 100 nm/min, Tempo de Integração Digital (DIT) = 1 s, com 5 x acúmulos com o uso de cadinhos de comprimento de trajetória de 0,1 mm. As amostras foram analisadas em 20 °C em x 5 mM de tris (Sigma, número de catálogo T7818-250G)/ 16,7 mM de tampão de sulfato de sódio (Sigma, número de catálogo S9627-500G) de pH 7,5.

[0357] Resultados: A Figura 13A mostra o espectro de linha CD pelo material de referência de rCSP em 0,37 mg/ml em fosfato tamponado salino. O espectro de CD exibiu um mínimo em 2 00 nm sem nenhum outro máximo ou mínimo distinto. Esses recursos sugerem uma baixa porcentagem de alfa hélice. A análise foi realizada com o uso de software K2D2, o que produz resultados de 8% de alfa hélice e 29% de filamento beta na Figura 16B. O erro máximo era 0,23. Esses valores são consistente com aqueles relatados na literatura (5% de alfa hélice e 27% de filamento beta, por exemplo, em Plassmeyer, M.L. et al., 2009, Structure of the Plasmodium falciparum Circumsporozoite Protein, a Leading Malaria Vaccine Candidate, JBC 284 (39): 26951-26963).

[0358] O espectro de fluorescência de rCSP foi determinado para o padrão de referência 533-191. A definição de temperatura inicial para análise era 20 °C seguida por aumentos graduais para 40 e 75 °C, seguidos por um retorno para 20 °C. O espectro de fluorescência foi lido em cada definição de temperatura. A emissão máxima era 340 nm e não deslocou significativamente conforme a temperatura aumentou. Entretanto, a linha base aumentou por motivos que não são claros. A intensidade de emissão no máximo foi diminuída significativamente em 75 °C após desnaturação. Após um retorno para 20 °C, a intensidade da emissão retornou para um nível maior que a leitura inicial; isso pode ser devido ao deslocamento para cima na linha base.

8. ANÁLISE DE ESPECTROMETRIA EM MASSA ANÁLISE DE MASSA INTACTA POR LC-MS

[0359] Método: Um preparo de 533-191 foi submetido a uma análise de massa intacta. A análise de massa intacta é útil para monitorar corte proteolítico, por exemplo, no N-terminal, deamidação, oxidação e fragmentação. Essa amostra foi analisada por LC-MS sob condições não reduzidas e reduzidas.

[0360] Resultados: Para análise reduzida, amostras de 533 purificadas foram misturadas com um volume igual de tampão UTD (7,2 M de ureia, 100 mM de Tris pH 7, 100 mM de DTT) . A amostra reduzida foi, então, aquecida a 37 °C por 30 min. antes da análise. Para análise não reduzida, amostras foram testadas de modo limpo. Para amostras alquiladas, consulte abaixo. As amostras (10 μg) foram submetidas à análise de LC-MS com o uso de um autoamostrador interconectado, aquecedor de coluna, detector de UV e HPLC (Agilent 1100) acoplados a um espectrômetro em micromassa de Q-Tof (Waters) com uma interface de eletroaspersão. Antes de uma execução, o espectrômetro em massa foi calibrado de 600 a 2600 rn/z com o uso de NaCsI. Uma coluna de CN (Zorbax 5 μm, 300SB-CN, 2,1 x 150 mm, Agilent, P/N 883750-905) encaixada com uma coluna de segurança (Zorbax 5 μm, 300SB-CN, 4,6 x 12,5 mm, Agilent, P/N 820950-923) foi usada para separação em 50 °C. Os tampões de HPLC usados eram tampão A (0,1% de ácido fórmico) e tampão B (90% de Acetonitrilo 0,1% de ácido fórmico). No novo método desenvolvido, após injeção de amostra em 5% de B, a coluna foi desenvolvida imediatamente com um gradiente de 17 min. de 5% a 30% de B e, então, trazida para 100% de B por 5 min., o que termina com 5% de B por 5 min. A taxa de fluxo foi 0,3 ml/min e o fluxo foi desviado para resíduos com o uso da válvula de comutação de MS pelos primeiros 10 min para permitir dessalinização da amostra. A proteína alvo 533 (CSP) eluiu em aproximadamente 17,9 min.

[0361] A absorvância de UV foi coletada de 180 a 500 nm antes de MS. A fonte de ESI-MS foi usada no modo positivo em 2,5 kV. Varreduras de MS foram executadas com o uso de uma faixa de 600 a 2600 rn/z em 2 varreduras por segundo. Dados de MS e UV foram analisados com o uso de software MassLynx (Waters). Cromatogramas de UV e cromatogramas de corrente de íons total de MS (TIC) foram gerados. Os espectros de MS do pico alvo foram somados. O espectro somado foi desconvolucionado com o uso de varredura MaxEnt 1 (Waters) para uma faixa de peso molecular de 10.000 a 80.000 com resolução de 1 Da por canal e uma largura Gaussiana de 0,25 Da. O MW teórico do 533 completamente processado foi determinado como sendo 38.725,0 Da e 38.721,0 Da para reduzido e não reduzido, respectivamente.

[0362] A diferença entre o MW observado e o teórico (delta MW) foi 1 e 4 Da para as amostras reduzidas e não reduzidas, respectivamente. Isso está dentro da precisão de massa esperada de 4 Da +/- 4 Da para a análise de uma proteína desse tamanho com o uso de um instrumento com uma resolução de 5.000. Devido à limitação de precisão de massa do instrumento, não é possível determinar o estado da formação de ligação de dissulfeto pela análise de massa intacta sozinha. Os resultados dessa análise são mostrados na Figura 14.

ALQUILAÇÃO DE CISTEÍNA SEGUIDA POR ANÁLISE DE MASSA INTACTA

[0363] Para investigar o estado de formação de ligação de dissulfeto, um preparo de 533-191 foi submetido a um experimento de alquilação de cisteína.

[0364] Método: Amostras de 533-191 purificadas foram submetidas à alquilação para a análise de cisteína(s) livre na proteína nativa. Para essa análise, iodoacetamida (Sigma, p/n I6125) foi adicionada a amostras de 533 não reduzidas nativas até uma concentração final de 5 mM e incubadas por 30 min em R.T. no escuro. A reação foi dessalinizada subsequentemente em PBS para análise de massa intacta ou em 25 mM de NH4HCO3 para digestão com o uso de uma coluna do tipo spin de exclusão de tamanho (0,7 ml, Pierce, p/n 89849).

[0365] Amostras de 533-191 purificadas também foram submetidas à alquilação de todas as cisteínas após desnaturação e redução completa de todas as ligações de dissulfeto. Para a alquilação de amostras desnaturadas ou reduzidas, foi adicionada ureia até uma concentração final de 2 M, foi adicionado DTT até uma concentração final de 10 mM e as amostras foram incubadas em 37 °C por 30 min. Subsequentemente, foi adicionada iodoacetamida até uma concentração final de 30 mM e foram incubados por 30 min. na temperatura ambiente no escuro. As amostras foram, então, dessalinizadas conforme acima para análise de massa intacta ou digestão.

[0366] Resultados: Foi adicionada iodoacetamida a ambas as amostras reduzidas e não reduzidas conforme descrito acima. Essas amostras foram submetidas à análise de massa intacta por LC-MS e os resultados são mostrados na Figura 15. Para a amostra não reduzida e alquilada, a massa observada foi consistente com 533-191 que contém uma alquilação de cisteína na Figura 15A. Assume-se que a Cisteína de N-terminal é alquilada embora esse experimento não tenha identificado que cisteína é realmente alquilada. A análise da amostra reduzida e alquilada mostrou que todas as cinco cisteínas foram alquiladas quando 533-191 foi reduzida completamente na Figura 15B.

[0367] Foi observado que a 533-191 não reduzida alquilada tem um delta de 6,0 Da em comparação ao MW teórico de 533 com uma alquilação de cisteína. Foi observado que a 533-191 reduzida e alquilada tem um delta de 3,9 Da em comparação ao MW teórico de 533 com cinco alquilações de cisteína. Havia uma espécie adicional que correlaciona com 533 que contém quatro alquilações de cisteína e estava presente em aproximadamente 43% de abundância total. Essa observação foi mais provavelmente devido a uma alquilação incompleta.

IDENTIFICAÇÃO DA CISTEÍNA LIVRE DE N-TERMINAL POR ALQUILAÇÃO E MAPEAMENTO DE PEPTÍDEO

[0368] Um método analítico de mapeamento de peptídeo foi desenvolvido para avaliar microheterogeneidade de rCSP e identificar a cisteína disponível na região N- terminal de rCSP.

[0369] Método: Amostras de 533 ativas, não reduzidas e alquiladas e reduzidas e alquiladas foram dessalinizadas em 25 mM de NH4HCO3 conforme descrito acima. Para digestões individuais, 5 a 20 μg de amostra dessalinizada foram digeridas com diferentes proteases. Para digestões por tripsina (Sigma, nível proteômico, p/n T6567) e por Glu-C (Roche, nível de sequenciamento, p/n 11420399001), cada protease foi adicionada em 1:50 (peso:peso), enzima:substrato e incubada ao longo da noite em 37° C. Uma digestão dupla de tripsina e elastase também foi executada. Primeiro, as amostras foram digeridas com tripsina conforme acima. Após digestão por tripsina, foi adicionada elastase (Sigma, Tipo IV, p/n E0258) em diferentes razões, 1:20, 1:100 e 1:500 e incubada em 37° C por 7 h. Todas as digestões acima foram paradas com a adição de ácido fórmico até uma concentração final de 1 a 5% (vol:vol).

[0370] Duas μg de cada digestão foram submetidas à LC-MS/MS conforme descrito abaixo. Antes de uma execução, o espectrômetro em massa foi calibrado de 200 a 2000 rn/z com o uso de NaCsI. A configuração de LC-MS acima foi usada para a análise das digestões, exceto que uma coluna C38 (Zorbax 300SB C18, 2,1 x 250 mm, 5 μm, Agilent, número de parte 881750-902) foi usada para separação. A coluna foi desenvolvida com os seguintes segmentos LC: 10 min. em 5% de B, um gradiente de 5 a 40% de B por 50 min., um gradiente de 40 a 60% de B por 20 min., 100% de B por 5 min. e 5% de B por 5 min.; testado em 0,3 ml^min-1 e 50o C. A absorvância de UV foi coletada de 180 a 500 nm antes de MS. A fonte de MS foi usada no modo positivo em 2,5 kV. Uma estratégia de varredura MS/MS foi usada que inclui uma varredura de MS de pesquisa seguida por uma varredura de MS/MS independente de dados. As varreduras foram executadas com o uso de uma faixa de 100 a 2.000 rn/z e um tempo de varredura de 0,5 s; as varreduras de pesquisa foram em uma energia de colisão de 6 V e as varreduras de MS/MS independentes de dados foram em 28 V. Pós-aquisição, cada arquivo bruto foi calibrado com trava em massa com o uso de certos peptídeos, observados previamente, em momentos de retenção em particular.

[0371] Foi usada BiopharmaLynx (Waters) para analisar os resultados de LC-MS/MS. Para digestões de tripsina Asp-N e Glu-C individuais, os seguintes parâmetros foram usados: tolerância de massa de 60 ppm, duas clivagens erradas foram permitidas e semi-especificidade (foi permitido que uma extremidade de peptídeo não fosse específica); Foi permitido que Asp-N e Glu-C tivessem clivagem em ambos Asp e Glu (em termos de especificidade). Para a medição de cobertura de sequência, um filtro de 2% de intensidade foi usado (isto é, para contar como uma identificação, um íon de peptídeo tinha que ter mais que 2% da intensidade do íon de peptídeo identificado mais intenso); adicionalmente, foi buscada uma deamidação em N e Q para variabilidade. Para digestões não reduzidas, ligações dissulfeto esperadas de 533 (C314-C34 9 e C318-C354 ) foram usadas para as buscas de preparos de monômero; e para situações de busca por dimerização, duas cópias da sequência de 533 foram adicionadas, as ligações dissulfeto acima foram usadas, mais uma ligação dissulfeto intermolecular C5-C5 foi adicionada ao arquivo de método. Para as digestões reduzidas e alquiladas, uma modificação fixa em Cys (carbamidometil-Cys) foi usada para as buscas sem quaisquer ligações dissulfeto na sequência de proteína. Para amostras não reduzidas e alquiladas, uma alquilação variável em Cys foi usada para as buscas sem quaisquer ligações dissulfeto na sequência de proteína. Para as amostras de digestão dupla (tripsina e elastase), 100 ppm e nenhuma especificidade de enzima foram usadas para a busca. Uma busca não específica da sequência de proteína inteira com duas ligações dissulfeto tomaria uma quantidade extraordinária de tempo para terminar, o que torna as mesmas impráticas. Portanto, somente três segmentos curtos das sequências de 533 que contêm as quatro cisteínas que compõem as duas ligações dissulfeto foram usadas. Essas sequências consistiram de aminoácidos 303-325, 348-350 e 354-362 e são as sequências de peptídeos que compõem o tripeptídeo ligado por dissulfeto tríptico. Essas sequências foram adicionadas como sequências de proteína separadas no arquivo de método e as ligações dissulfeto corretas mencionadas acima foram usadas.

[0372] Resultados: Um mapeamento de peptídeo foi implantado para determinar que cisteína foi alquilada na amostra de 533-191 alquilada não reduzida mencionada acima. Glu-C foi a protease usada devido ao peptídeo dimensionado apropriadamente próximo ao N-terminal (E2) produzido. Esse peptídeo continha a primeira cisteína (C5), a cisteína livre esperada. A amostra digerida foi submetida à análise de LC-MS/MS. O peptídeo E2 alquilado foi identificado com o uso de software BiopharmaLynx conforme descrito na seção de métodos da Figura 16A. Esse peptídeo é um dos peptídeos mais intensos identificados e tinha íons 22 b- e y- identificados (dados não mostrados). A digestão por Glu-C também pode produzir dois outros peptídeos altamente visíveis, E18 que contém a segunda e a terceira cisteína (C314 e C318) e E23 que contém a quinta cisteína (C354 ) . Esses dois peptídeos podem ser observados, em altas intensidades, em amostras completamente reduzidas alquiladas (dados não mostrados). Entretanto, esses peptídeos não foram identificados em níveis significativos na análise mencionada acima de amostra não reduzida e alquilada de 533-191. Isso sugere que as cisteínas dentro desses peptídeos estão envolvidas primariamente em ligações dissulfeto. Por último, tentou-se identificar uma ligação dissulfeto intermolecular entre C5 e C5 na mesma amostra. Foi usada BiopharmaLynx para buscar os mesmos dados, mas foi permitida uma ligação dissulfeto entre duas cópias de 533 através de C1. Esse dipeptídeo ligado por dissulfeto, E1-E2:E1-E2, foi identificado nessa busca da Figura 16B . E1-E2 significa uma clivagem perdida em um resíduo de ácido glutâmico dentro do peptídeo. Nesse caso, a clivagem perdida pode ser devido a um acesso restrito para a protease causado pela ligação dissulfeto adjacente. Isso foi um íon de baixa intensidade, o que concorda com outros dados (por exemplo, RP-HPLC, SE-HPLC) de que o dímero nesse preparo era um componente menor em comparação ao monômero. No todo, a análise de Glu-C de 533-191 não reduzido alquilado sugeriu que a Cisteína próxima de N-terminal (C5) era a única cisteína livre e que essa era a forma primária de 533-191. Portanto, o método de redução seletiva pareceu reduzir somente a ligação dissulfeto intermolecular C5-C5 e não as ligações dissulfeto intramoleculares.

ANÁLISE DE LIGAÇÃO DISSULFETO POR MAPEAMENTO DE PEPTÍDEO

[0373] Uma natureza das ligações dissulfeto em 533 produzido por Pfenex foi analisada pelo mapeamento de peptídeo. 533-128 foi submetido a uma digestão dupla sequencial, primeiro com tripsina, então com elastase. A digestão com elastase foi testada em três razões de enzima:substrato diferentes. Todas as digestões duplas foram analisadas por LC-MS/MS e os dados resultantes foram processados com o uso de BiopharmaLynx. Primeiro, as ligações dissulfeto esperadas (C314-C349 e C318-C354 ) foram incluídas nos parâmetros de busca. Como resultado, múltiplos dipeptídeos ligados por dissulfeto foram identificados em todas as três digestões duplas. Dois desses dipeptídeos, o que compõe ambas as ligações dissulfeto, são mostrados na Tabela 8. Como um procedimento de controle negativo, os mesmos dados também foram processados com o uso de um arquivo de método que contém o inverso do acima (ou incorreto), ligações dissulfeto C314C354 e C318—C349. A partir dessa busca, alguns dipeptídeos ligados por dissulfeto foram identificados. Entretanto, essas identificações foram de qualidade significativamente pior em termos de intensidade de íon, delta de massa e íons de fragmento b/y encontrados em comparação à busca anterior com o uso das ligações dissulfeto corretas (dados não mostrados). No todo, os dados das digestões duplas sugerem que a forma principalmente ou possivelmente a única forma de 533-128 contém as ligações dissulfeto esperadas C314-C349 e C318-C354. TABELA 8. ANÁLISE DE LIGAÇÃO DISSULFETO PELO MAPEAMENTO DE PEPTÍDEO

[0374] Para cobertura de sequência de aminoácido completa pelo mapeamento de peptídeo, múltiplas proteases foram testadas em uma amostra reduzida e alquilada (533-128) . Cada digestão foi submetida à LC-MS/MS e analisada por BiopharmaLynx. A combinação dos dados de digestões de Asp-N e tripsina (ou Lys-C) forneceram os melhores resultados. Conforme mostrado na Figura 17A, a cobertura de sequência obtida com Asp-N foi 75,4%. Para tripsina, conforme mostrado na Figura 17B, a cobertura de sequência obtida foi 56,9%. Os peptídeos identificados em cada uma dessas análises são mostrados nas Tabelas 9 e 10, respectivamente. Os cromatogramas de LC-MS associados às digestões de Asp-N e tripsina são mostrados nas Figuras 17C e 17D, respectivamente. A cobertura de sequência para Lys-C foi 66,9% (dados não mostrados). A cobertura de sequência obtida pela combinação dos resultados das digestões por Asp-N e tripsina/Lys-C é menor que 100%. Isso é devido a incapacidade de BiopharmaLynx de identificar peptídeos grandes. Devido à grande região de repetição de 533, dois peptídeos esperados de Asp-N são a.a. 107-178 e 179-267. Os pesos moleculares teóricos para esses dois peptídeos são 7.178,2 Da e 8.971,2 Da, respectivamente. Pelo exame manual dos dados brutos, foram observados ambos os peptídeos no cromatograma da digestão por Asp-N. Esses peptídeos foram identificados pela massa (com o uso de MaxEnt1) e eluídos em 30,5 e 29,1 min., respectivamente. Os espectros desconvolucionados dos picos respectivos são mostrados na Figura 18. No todo, pelo processo automatizado de combinação com o uso de BiopharmaLynx e um processamento manual, digestões de proteína por Asp-N mais tripsina/Lys-C permitiram cobertura de sequência de 100%. TABELA 9. PEPTÍDEOS IDENTIFICADOS POR DIGESTÃO POR ASP-N DE

[0375] A Tabela 9 revela SEQ ID NOS 29-34, 34- 48, 47-50, 50-59, 59-66 e 66-76, respectivamente, na ordem em que aparecem. TABELA 10. PEPTÍDEOS IDENTIFICADOS POR DIGESTÃO POR TRIPSINA DE

[0376] A Tabela 10 revela SEQ ID NOS 77-78, 78, 78-79, 78, 80-81, 81-86, 86-94, 94-101, 101-102, 102103, 103-105 e 104-109, respectivamente, na ordem em que aparecem.

9. ANÁLISES DE CÉLULA HOSPEDEIRA ENSAIO DE PROTEÍNA DE CÉLULA HOSPEDEIRA (HCP)

[0377] A ELISA de proteína de célula hospedeira (HCP) ELISA foi realizada com o uso do kit "Immunoenzymetric Assay for the Measurement of Pseudomonas fluorescens Host Cell Proteins" da Cygnus Technologies, Inc., número de catálogo F450. O ensaio foi realizada com o uso do protocolo do fabricante.

ENSAIO DE DNA DE CÉLULA HOSPEDEIRA Q-PCR

[0378] Para analisar um DNA de célula hospedeira, iniciadores de oligonucleotídeos contra o gene de DNA Polimerase I e sequências de cadeia principal de plasmídeo de expressão foram projetadas para a detecção de DNA de P. fluorescens por PCR quantitativo em tempo real. Os iniciadores foram sintetizados pela Integrated DNA Technologies, Inc. A PCR em tempo real foi realizada com um Sistema DNA Engine Opticon PTC-200 DNA Engine Cycler (MJ Research, CFD-3200 Opticon).

10. ENSAIO DE ENDOTOXINA

[0379] A endotoxina nas frações de eluição foi analisada com o uso de um analisador de endotoxina Endosafe-PTS portátil (Charles River Laboratories (CHL)) seguindo os procedimentos operacionais fornecidos pelo fabricante com o uso de cartuchos com faixas de sensibilidade de 1 a 0,01 EU/ml (CHL, número de parte PTS2001F) e 10 a 0,1 EU/ml (CHL, número de parte PTS201F).

EXEMPLO 3: PURIFICAÇÃO DE RCSP E REDUÇÃO PREFERENCIAL DE DÍMERO DE RCSP

[0380] Foi obtida CSP recombinante purificada com o uso de um método identificado com base nos resultados descritos no Exemplo 2 em que o dímero de rCSP purificado foi submetido a condições de redução preferenciais e separado em monômeros. Rendimentos de processo geral de 36% foram obtidos em todos os experimentos e 0% de espécie degradada foi observada por LC-MS.

VISÃO GERAL:

[0381] O caldo inteiro de fermentação de Pseudomonas fluorescens (10 litros) foi transferido para um vaso de resultado para recuperação primária. O caldo inteiro de fermentação foi diluído primeiro com 3,1 M de ureia, 31 mM de Tris, pH 8,2 para obter uma alimentação de homogeneização que tinha d 20% de sólidos. O caldo de fermentação diluído foi lisado por microfluidização, o que gera lisato de célula. O lisato foi diluído 1:1 com 2 M de ureia, 20 mM de Tris, pH 8,2, o que cria um lisato com 10% de sólidos. Os sólidos de P. fluorescens no lisato foram separados do tampão que contém rCSP por centrifugação de empilhamento de disco e filtração de profundidade. O tampão que contém rCSP foi, então, filtrado em 0,2 μm e congelado adicionalmente. Uma porção do extrato celular clarificado de rCSP, uma vez derretida, foi purificada por cromatografia de troca de ânion (AEX) . O eluato de AEX que contém rCSP foi coletado e purificado adicionalmente por cromatografia de hidróxiapatita (HA) . O eluato de HA que contém rCSP foi coletado e armazenado em 2 a 8°C. Uma vez que o eluato de HA foi retornado para a temperatura ambiente e filtrado em 0,2 μm, a rCSP foi submetida a condições de redução preferenciais. As frações de cromatografia de eluição que contêm CSP dimerizada em tampão foram agrupadas até um volume final de 200 a 600 ml. O agrupamento foi submetido a uma redução preferencial pela adição de ditiotreitol redutor (JT Baker, número de parte JT-F780-2, Phillipsburg, NJ) até uma concentração final de 20 μM e agitado rapidamente com uma barra de agitação magnética e uma placa de agitação por 12 a 24 horas na temperatura ambiente. Alternativamente, rCSP agregada em PBS (por exemplo, lote 533-128) foi submetida ao mesmo processo primeiro pela adição de 2 M de ureia ao material antes de passar por redução seletiva.

[0382] Após ser submetida a condições de redução preferenciais, a rCSP foi concentrada e diafiltrada em um tampão de formulação por TFF. A rCSP diafiltrada foi, então, passa através de um filtro de 0,2 μm final para render a substância ativa em batelada.

[0383] Sumários de purificação para as duas purificações integradas são apresentados na Tabela 11. As etapas de recuperação primária foram realizadas em 500 g de pasta celular congelada e processadas através de filtração de profundidade com um rendimento de recuperação de aproximadamente 85% com uma pureza de 8%. Esse material foi, então, cromatografado sobre a coluna TMAE (teste de 533-402 e teste de 533-404) com uma recuperação média de 83% e pureza de 78% (Figuras 19 e 20) . Os agrupamentos de TMAE foram, então, passados sobre Hidroxipatita cerâmica Tipo I (teste de 533-403 e teste de 533-405) com uma recuperação média de 69% e uma pureza de 96% por SDS-CGE (Figuras 21 e 22). O material de CHT foi, então, submetido ao processo de redução branda e o tampão trocado em PBS por TFF com um rendimento de aproximadamente 75% e pureza final de 96% por SDS-CGE. As concentrações de rCSP foram determinadas como sendo 1,0 mg/ml e 1,2 mg/ml por absorvância em 280 nm para lotes 533-406 e 533-407, respectivamente (Tabela 11) . A rCSP purificada (lotes 533-406 e 533-407) foi, então, aliquotada e armazenada em -80 °C para análise e caracterização adicional conforme discutido abaixo. O rendimento de purificação geral para ambos os testes integrados foi aproximadamente 36%, o que representa uma melhoria de aproximadamente 10 vezes sobre os processos de purificação de estágio anterior. Por exemplo, um processo de estágio anterior que envolve troca de ânion seguida por cromatografia de interação hidrofóbica e executado em pequena escala (com menos de 0,5 g de rCSP no material inicial) resultou em um rendimento de processo geral de 3,2% para CS533-129, um rendimento de processo geral de 6,5% para CS533-211 e um rendimento de processo geral 3,1% para CS533-249 (o que expressa a rCSP de SEQ ID NO: 3 fundida a um líder pbp).

[0384] Conforme mostrado na Figura 23, o material purificado foi analisado por SDS-PAGE e a pureza foi determinada como sendo consistente com SDS-CGE (>95% de pureza). A análise de Western blot confirmou a identidade e mostrou baixa fragmentação (Figura 24) . Um anticorpo específico de conformação (4C2) que é sensível ao domínio de C-terminal que contém dois dissulfetos mostrou um sinal forte (2) . As amostras reduzidas e alquiladas mostraram perda de sinal, o que sugere que a rCSP purificada tinha a estrutura de dissulfeto correta (Figura 24). A endotoxina era < 10 EU/mg para ambos os lotes (Tabela 11). A HCP-ELISA mediu proteína de célula hospedeira em aproximadamente 4.000 ppm para ambas as purificações (Tabela 11) que é consistente com 96% de pureza medida por SDS-CGE. O DNA hospedeiro (genômico) foi medido para ser 78 a 98 pg/mg por Q-PCR (Tabela 11) . A análise por SE-HPLC mostrou <5% de dímero para ambos os preparos e nenhum agregado de HMW (Figura 25 e Tabela 11) . A RP-HPLC mostrou 11% de dímero para ambos os preparos (Tabela 11) e um perfil de pico consistente com a referência 533-191 (Figura 26) . A massa intacta foi consistente com o peso molecular teórico para ambos 533-406 e 533-407, sem corte detectável no N-terminal (Figura 27) . Uma análise de mapeamento de peptídeo com o uso de proteólise de Glu-C para ambos os preparos foi comparada à referência 533-191 (Figura 28) . Essa análise demonstrou que a cisteína próxima ao N-terminal foi livre e que as ligações dissulfeto foram intactas (não mostrado). A heterogeneidade de carga para os preparos correspondeu ao perfil de referência interno de 533-191 (Figura 29). Leves diferenças nas intensidades dos picos de pI foram observadas devido a diferenças nas diferenças concentrações de amostra. A análise de Far-UV-CD para ambos os preparos foi similar ao material de referência (Figura 30A) . A análise com o uso de software K2D2 calculou 10,45% de a- hélice e 29,09% de β-filamento para o lote 533-406 e 10,45% de a-hélice e 29,09% de β-filamento para o lote 533-407 e 10,04% de a-hélice e 29,65% de β-filamento para a referência 533-191. Os espectros de fluorescência Intrínseca para ambos os preparos correspondeu ao material de referência (Figura 30B).

[0385] Em resumo, os lotes 533-406 e 533-407 dos testes de purificação integrada são de alta qualidade e pureza e correspondem a todas as especificações analíticas para esse estágio do projeto. A análise comparativa mostrou diferenças mínimas entre os preparos, assim como com o padrão de referência533-191. TABELA 11A. SUMÁRIO DE PURIFICAÇÃO PARA TESTE DE

EXEMPLO 4: PURIFICAÇÃO DE RCSP DE UMA FERMENTAÇÃO DE CINCO LITROS

[0386] Um método de purificação da presente invenção conforme descrito no Exemplo 43 foi usado para obter rCSP purificada de uma cultura de fermentação de 5 litros de uma cepa de expressão de P. fluorescens que tem um vetor de expressão que compreende SEQ ID NO: 5. Foi determinado que a degradação do N-terminal é 5,1%. O rendimento do processo geral foi 60%.

EXEMPLO 5: PURIFICAÇÃO DE RCSP CODIFICADA POR SEQ ID NO: 6

[0387] Um método de purificação da presente invenção, conforme usado no Exemplo 3, foi usado para obter rCSP de uma cultura de uma cepa de expressão de P. fluorescens que tem um vetor de expressão que compreende SEQ ID NO: 6. A SEQ ID NO: 6 é uma sequência de nucleotídeos de CSP otimizada que codifica a rCSP conforme apresentado na SEQ ID NO: 3. O gene de CSP foi fundido à sequência codificadora principal de secreção pbp.

EXEMPLO 6: OTIMIZAÇÃO DE CONCENTRAÇÕES DE AGENTE REDUTOR PARA USO EM TAMPÕES DE REDUÇÃO PREFERENCIAIS

[0388] Seguindo a estratégia geral descrita no Exemplo 1, são testados outros agentes redutores conforme feito com DTT para identificar uma concentração ideal para reduzir preferencialmente dímeros de rCSP para uma forma monomérica sem desnaturar a proteína. Os outros agentes redutores testados incluem DTT, cisteína, glutationa, monotioglicerol, tioglicolato, ditiotiotreitol, ditioerititol, acetilcisteína, 2-Mercatoetanol (B- mercatoetanol), TCEP-HCl (Cloridrato de Tris(2- carboxietil)fosfina puro cristalino) ou 2-Mercatoetilamina- HCl (2-MEA).

EXEMPLO 7: AVALIAÇÃO DE MONOTIOGLICEROL COMO UM AGENTE REDUTOR

[0389] Outros agentes redutores/condições foram avaliados para otimizar a produção de monômero de rCSP. Isso incluiu testar formulações de teste e procedimentos para intensificar adicionalmente a estabilidade de rCSP na forma líquida. Os reagentes foram avaliados pela capacidade dos mesmos em preservar rCSP como um monômero ativo com base nos efeitos dos mesmos na degradação, dimerização e agregação de rCSP. Esses estudos demonstraram que a rCSP pode ser mantida em > 85% de teor de monômero em um tampão PBS que contém monotioglicerol e arginina em 4 0C por até 23 dias.

[0390] O efeito estabilizante de arginina foi demonstrado em experimentos nos quais a arginina sozinha e a arginina com o agente redutor monotioglicerol reforçaram amostras de rCSP em PBS com um pH de 7,2. Estudos adicionais mediram 80 por cento de teor de monômero de rCSP após troca de tampão por ultrafiltração/diafiltração em PBS que contém monotioglicerol e arginina. Esse nível de estabilidade foi demonstrado com rCSP em concentrações de 1 mg/ml a > 5 mg/ml. Por outro lado, tampões de Tris e histidina que contêm manitol, monotioglicerol e arginina exibiram formação de agregado de aproximadamente 11% da rCSP total.

[0391] Frações de eluição de HPLC de fase reversa foram analisadas por cromatografia líquida/espectroscopia em massa (LC/MS) e SDS-PAGE para determinar peso molecular e diferenças em estrutura química. Esses estudos mostraram que uma fração do eluato de RP-HPLC continha rCSP que tem uma porção de piroglutamato. Estudos que comparam estabilidade de CSP recombinante em PBS que contém 1mM de monotioglicerol e 10% de p/v de arginina em três níveis de pH mostraram que a fração que contém piroglutamato aumentou ao longo do tempo como a fração de rCSP nativa que não continha piroglutamato diminuiu. Níveis de estabilidade para rCSP total em 4 0C e pH 6,4 após 21 e 23 dias foram comparados a uma estabilidade em pH 7,0; em 25 oC a estabilidade diminuiu significativamente ao longo do mesmo período.

[0392] Esses estudos foram executados com o uso de rCSP preparada da cepa CS533-129 com o uso do método descrito para preparo padrão de referência interna no Exemplo 2. Todos os métodos são conforme descrito no Exemplo 2 a menos que especificado o contrário.

ESTUDOS DE REFORÇO

[0393] Para estabilizar rCSP como um monômero ativo, inúmeros excipientes de tampão de formulação foram avaliados pela capacidade dos mesmos em diminuir ou impedir dimerização, agregação e degradação geral de rCSP.

EXPERIMENTO DE REFORÇO 1: EFEITO DE AGENTES REDUTORES E ARGININA NA ESTABILIDADE DE RCSP

[0394] Um painel de agentes redutores foi testado para eficácia na prevenção de formação de dímero de rCSP. Os agentes redutores testados foram monotioglicerol (MTG), L-cisteína, acetilcisteína, glutationa e tioglicolato. A arginina foi testada em combinação com cada agente redutor como um meio para diminuir a taxa de agregação de rCSP. Os reagentes foram usados em um experimento de estabilidade em pequena escala no qual amostras individuais de rCSP (1 mg/ml em PBS, pH 7,2) foram reforçadas, cada uma, com um dos seis agentes redutores na presença e na ausência de 1% de arginina.

[0395] As amostras foram mantidas na temperatura ambiente (25 0C) por 3, 6 ou 14 dias e, então, analisadas por SE-HPLC. A HPLC foi executada conforme descrito no Exemplo 2. Quatro regiões de pico distintas foram observadas: A primeira região continha agregados de rCSP de alto peso molecular (HMW); a segunda região de pico continha dímeros de rCSP; a terceira região de pico continha monômero de rCSP; a última região de pico de eluição continha produtos de degradação de baixo peso molecular.

[0396] As amostras de rCSP mantidas em PBS reforçadas com monotioglicerol (MTG), cisteína ou acetilcisteína tinham a maior porcentagem de proteína no pico principal (monômero) e menor porcentagem nos picos de alto peso molecular (agregado) e de baixo peso molecular (produto de degradação) em 6 e 14 dias em comparação a amostras armazenadas pelos mesmos períodos nos outros excipientes (Tabelas 12A a C) . As colunas de “Pico principal” indicam porcentagens de monômero de rCSP. TABELA 12A. EXPERIMENTO DE REFORÇO 1: SE-HPLC DE RCSP ARMAZENADA POR 3 DIAS Amostra

[0397] As amostras que foram reforçadas somente com 1% de arginina mostraram aumentos nos tamanhos do pico de dímero e no pico de agregado de alto peso molecular, junto com uma diminuição no tamanho do pico de monômero de 3 dias a 14 dias. A combinação de arginina com outros excipientes também foi avaliada.

[0398] A adição de arginina teve um pequeno efeito na proporção de monômero em 3 e 6 dias, mas em 14 dias, um agente redutor mais arginina resultou em uma quantidade de 9% a 23% maior de monômero que um agente redutor sozinho. Monotioglicerol mais arginina mantiveram uma quantidade 2% maior de material no pico principal que cisteína mais arginina e uma quantidade 5% maior que acetilcisteína mais arginina.

[0399] Experimento de Reforço 2: Efeito de Monotioglicerol e Arginina na Estabilidade de rCSP.

[0400] Um conjunto de experimentos foi conduzido para avaliar a estabilidade de rCSP em PBS, pH 7,2, reforçado com MTG e uma faixa mais ampla de concentrações de arginina. As amostras foram mantidas por 3 ou 12 dias em PBS sozinho, 1 mM de MTG sozinho ou 1 mM de MTG mais 1, 5, 10 ou 20% de arginina. A estabilidade de proteína foi analisada por SE-HPLC. Em MTG sozinho, o pico de monômero principal diminuiu em tamanho relativo conforme o pico de baixo peso molecular aumentou em tamanho relativo do dia 3 ao dia 12. Concentrações crescentes de arginina resultaram em porcentagens crescentes de proteína total no pico principal (monômero). Concentrações crescentes de arginina também resultaram em uma porcentagem progressivamente maior de cada amostra no pico de baixo peso molecular (MW) e uma porcentagem progressivamente menor no pico de alto MW, o que indica um efeito inibitório de arginina na formação de agregado. Todas as amostras em MTG não mostraram material no pico de dímero; somente a amostra mantida em PBS sozinho exibiu dimerização (Tabelas 13A e B). TABELA 13A. EXPERIMENTO DE REFORÇO 2: SE-HPLC DE RCSP ARMAZENADA POR 3 DIAS

[0401] Foi selecionado o Monotioglicerol com 10% de Arginina para uso nos experimentos de concentração subsequente e estabilidade de pH. A formulação que contém 20% de Arginina forneceu resultados de estabilidade levemente melhores. Os dados de SE-HPLC para as formulações de excipiente testadas são resumidos na Tabela 13. Nenhuma das amostras dos Experimentos de Reforço 1 e 2 exibiram fragmentação significativa em SDS-CGE e todas mostraram a faixa principal no MW esperado para rCSP.

ESTUDO DE CONCENTRAÇÃO

[0402] A estabilidade de rCSP concentrada para 5 mg/ml em 1 mM de MTG mais 10% de Arginina foi avaliada. Amostras de rCSP em PBS com 1 mM de MTG e 10% de Arginina ou em PBS sozinho foram concentradas 8 vezes em um concentrador centrífugo. A SE-HPLC foi realizada em amostras na concentração inicial de 0,8 mg/ml e em 6,4 mg/ml com ou sem uma etapa de retenção de 16 horas em 4 0C. Em PBS sozinho, o monômero diminuiu de 8 6% a 50% após concentração de 8 vezes; com a adição de uma retenção de 16 horas após a concentração, o pico de monômero diminuiu para 29%. As amostras de rCSP em 1 mM de MTG com 10% de Arginina exibiram muito mais estabilidade. O pico de monômero principal diminuiu de 86% para 80% com concentração de 8 vezes e não diminuiu com uma retenção de 16 horas. Dados de tamanho de pico relativo são resumidos na Tabela 14. Esses dados confirmaram os resultados dos estudos de reforço e mostraram que uma concentração até 5 mg/ml poderia ser obtida sem uma diminuição drástica no monômero de rCSP. TABELA 14. TAMANHOS DE PICO DE SE-HPLC RELATIVOS PARA AMOSTRA CONCENTRADA

[0403] As formulações que contêm 4,2% de manitol, 2% de Arginina, 1 mM de MTG, e 10 μM de ácido etilenediaminotetraácetico (EDTA) foram testadas em tampões de Tris e Histidina (Tabela 15) . Esses experimentos foram executados para testar os efeitos estabilizantes dos sistemas de tampão em rCSP. A estabilidade foi ensaiada após a troca de tampão por ultrafiltração/diafiltração (UF/DF) . TABELA 15. FORMULAÇÕES DE TAMPÃO DIFERENTE DE PBS Número de

[0404] Em ambos os experimentos A e B, um eluato da coluna de hidróxipatita cerâmica (CHT) foi submetido a uma redução branda e, então, trocado nos tampões de excipiente de teste por UF/DF. Para o processo de UF/DF, eluato de CHT reduzido de forma branda foi concentrado por ultrafiltração até 1,0 mg/ml e diafiltrado contra seis diavolumes da formulação especificada. O retido foi concentrado adicionalmente até aproximadamente 5,0 mg/ml antes de ser recuperado do sistema e submetido a uma filtração de 0,22 μm. A análise por SE-HPLC mostrou que para ambas as formulações de excipiente, as amostras retidas por dois dias ou mais exibiram 11% de formação de agregado. Os dados de SE-HPLC executada em proteína em eluato de CHT reduzido de forma branda que foi trocado em 10 mM de Tris base, 4,2% de Manitol, 2% de Arginina-HCl, 100 μM de EDTA, 1mM de monotioglicerol, pH 7,5, são resumidos na Tabela 16 (UF 1 = 0,0 horas até -1,0 hora; DF =1,0 hora até 4,5 horas; UF 2 = 4,5 horas até 5,0 horas).

[0405] Os dados de SE-HPLC executada em proteína em eluato de CHT reduzido de forma branda que foi trocado em 10 mM de Histidina, 4,2% de Manitol, 2% de Arginina-HCl, 100 μM de EDTA, 1mM de monotioglicerol, pH 7,0, são resumidos na Tabela 17 (UF 1 = 0,0 horas até 1,0 hora; DF =1,0 hora até 4,5 horas; UF 2= 4,5 horas até 5,0 horas). TABELA 16. TROCA DE TAMPÃO EM TAMPÃO DE TRIS POR FILTRAÇÃO DE FLUXO TANGENCIAL (UF/DF)

ESTUDO DE ESTABILIDADE DE pH

[0406] O tampão de formulação que contém 1X PBS, 0,5M de arginina e 1 mM de monotioglicerol foi testado em três níveis de pH diferentes por 21 dias em 2 a 8 0C e na temperatura ambiente (aproximadamente 25 0Q) . Um controle congelado em -70 0C também foi analisado em cada ponto no tempo. As amostras tiveram o tampão trocado por filtração de fluxo tangencial. A rCSP foi, então, concentrada para 1 e 5 mg/ml por UF/DF e o pH foi ajustado para 6,44 com 6 N de HCl e passou por QS para 1 l (Lote 1, 533-551), para pH 7,0 com 10 N de NaOH e passou por QS para 1 l (Lote 2, 533-550) ou para pH 7,5 com 10 N de NaOH e passou por QS para 1 l (Lote 3, 533-549) . Os pontos no tempo foram analisados por RP-HPLC em 214 nm e por SE-HPLC em 280 nm. As amostras de SE-HPLC foram analisadas imediatamente nos pontos no tempo finais. As amostras de RP-HPLC foram congeladas em -80 0C nos pontos no tempo finais das mesmas e, então, descongeladas e analisadas. Não teve dados disponíveis para pH 7,0, 25 °C, 21 dias.

[0407] RP-HPLC foi realizada em amostras de estudo de estabilidade de pH de rCSP em três níveis de pH: 6,4, 7,0, e 7.5. As amostras analisadas nesses experimentos exibiram um pico principal que contém rCSP nativa com um ressalto que elui ligeiramente depois que consiste em rCSP com a porção de piroglutamato discutida acima. Juntas, as áreas do pico de CSP nativa e do ressalto que contém piroglutamato compuseram a área de cromatograma que representa uma rCSP total. Três outros grupos de picos foram observados: Grupo 1 em aproximadamente 10 minutos, Grupo 2 logo à frente do pico principal e Grupo 3 logo após o ressalto que contém piroglutamato. A Figura 31 mostra as posições relativas dos picos de Grupos 1 a 3 observados em uma amostra de estabilidade de controle T0 de 1 mg/ml de rCSP armazenada em 4 °C, pH 7,5.

[0408] Amostras em pH 7,5 (Lote 3) que contêm rCSP ou em 1 mg/ml ou em 5 mg/ml foram analisadas por RP- HPLC em T=0 ou armazenadas ou em 4 0C ou em 25 0C e analisadas em 5 dias, 14 dias ou 21 dias. A análise ao longo do tempo foi realizada da mesma maneira para amostras em pH 7,0 (Lote 2) e pH 6,4 (Lote 1) . Em, todos os três níveis de pH, o material na fração de CSP nativa diminuiu ao longo do tempo enquanto que o material na fração que contém piroglutamato aumentou ao longo do tempo; isso foi observado até uma extensão destacavelmente superior em amostras mantidas em 25 0C que aquelas mantidas em 4 0C.

[0409] Comparações de dados de estabilidade lado a lado foram feitas dos três níveis de pH ao longo do tempo em 1 e 5 mg/ml e em 4 0C e 25 0C com o uso ou de fração de CSP total ou material que elui somente no pico de RP-HPLC nativa (principal), o que excluiu o ressalto que contém piroglutamato (Tabelas 18 a 20). Para amostras de 1 mg/ml e de 5 mg/ml em 4 0C, tampões em pH 6,4 e pH 7,0 forneceram maiores níveis de estabilidade em 14/15 dias e 21/23 dias que o tampão forneceu em pH 7,5. A análise por RP-HPLC mostrou uma diferença na estabilidade de aproximadamente 2% entre pH 6,4 e pH 7,0 em 21/23 dias para rCSP nativa em 1 mg/ml e 1,6% em 5 mg/ml. Para amostras de CSP nativa e total em ambas as concentrações em 25 0C, pH 6,4 e 7,0 forneceram maiores níveis de estabilidade que um pH 7,5 em 5/6 dias e níveis comparáveis em 14/15 dias e 21/23 dias. As amostras em 5 mg/ml que foram mantidas em pH 7,5 mostraram um maior aumento no material nos picos do grupo 1 em 21 dias que as amostras mantidas em tampões de pH 6,4 e pH 7,0 mostraram.

[0410] As amostras que contêm ou 5 mg/ml ou 1 mg/ml de rCSP foram mantidas em tampão em pH 6,4, 7,0 ou 7,5 em 4 0C ou 25 0C e analisadas por SE-HPLC em 1/3 dias, 5/6 dias, 14/15 dias e 21/23 dias (Tabelas 21 e 22) . Um aumento no declínio de pico foi observado que foi mais pronunciado nas amostras mantidas em 25 0C pela mesma quantidade de tempo. A tendência foi similar para amostras de 1 mg/ml mantidas em 4 0C e em 25 0C.

[0411] Foram realizadas comparações de dados lado a lado dos três níveis de pH em 4 0C e 25 0C com amostras de 1 mg/ml e 5 mg/ml em 1/3 dias, 5/6 dias, 14/15 dias e 21/23 dias. As amostras mais estáveis eram aquelas no tampão de pH 7,0 em ambos 4 0C e 25 0C e em ambas 1 mg/ml e 5 mg/ml. De forma similar à RP-HPLC, a SE-HPLC indica estabilidade levemente maior da amostra de 5 mg/ml em 25 0C com tampão de pH 6,4 que com um pH 7,0 em 1, 5 e 14 dias. No ponto final do dia 21, foi medida uma estabilidade de certa forma maior para pH 7,0 que para pH 6, 4 . TABELA 18. ÁREAS RELATIVAS DE RP-HPLC DE FORMULAÇÃO LÍQUIDA (533-549) DE PH 7,5 A 4 °C E 25 °C, E 1 MG/ML E 5 MG/ML DE RCSP, ATÉ 28 DIAS.

[0412] Todas as amostras de RP-HPLC listadas na Tabela 18 foram congeladas a -80 °C até a análise. RCSP nativa não contém piroglutamato. pE-CSP é uma espécie de piroglutamato. TABELA 19. ÁREAS RELATIVAS DE RP-HPLC DE FORMULAÇÃO LÍQUIDA (533-550)

[0413] Todas as amostras de RP-HPLC listadas na Tabela 19 foram congeladas a -80 °C até a análise. TABELA 20. ÁREAS RELATIVAS DE RP-HPLC DE FORMULAÇÃO LÍQUIDA (533-551) DE PH 6,4 A 4 °C E 25 °C PARA CONCENTRAÇÕES DE RCSP DE 1 MG/ML E 5 MG/ML, ATÉ 28 DIAS.

[0414] Todas as amostras de RP-HPLC listadas na Tabela 20 foram congeladas a -80 °C até a análise. TABELA 21. ÁREA DE MONÔMERO RELATIVA A SE-HPLC DE FORMULAÇÃO LÍQUIDA DE 1 MG/ML DE RCSP (533-549-550-551)

[0415] Amostras listadas em itálico na Tabela 21 foram congeladas a -80 °C em 0 dias. Todas as outras amostras foram mantidas liquidas (não congeladas) até o tempo de análise. TABELA 22. ÁREA DE MONÔMERO RELATIVA A SE-HPLC DE FORMULAÇÃO LÍQUIDA DE 5 MG/ML DE RCSP (533-549-550-551)

[0416] Amostras listadas em itálico na Tabela 22 foram congeladas a -80 °C em 0 dias. Todas as outras amostras foram mantidas líquidas (não congeladas) até o tempo de análise.

[0417] Estudos de estabilidade nos quais o nível de proteínas de célula hospedeira na preparação de rCSP foi reduzida pelo uso de uma etapa adicional de cromatografia de interação hidrofóbica (por exemplo, conforme descrito no Exemplo 9 no presente documento) foram realizados. A rCSP total detectada por RP-HPLC depois de 120 horas a 2-8 °C no tampão de formulação de estabilização foi observada como sendo tão alto quanto 91,4% (consulte as Tabelas 23 e 24), representando um RDP de 0,2%. Nesses estudos, dois lotes de rCSP (Lote 533-616 e 533-618) em 1 mM de MTG e 0,5M de arginina em PBS, pH 6,7, foram avaliados em 3, 6, 16, 24, 48, 72, 96, e 120 horas a -80, 2-8, 25, e 40 °C.

[0418] HPLC de fase reversa foi executada conforme descrito no presente documento, antes da análise de amostras, a coluna foi condicionada fluindo-se 30 ml de fase móvel A em uma taxa de 1 ml/minuto. Injeções de 30 μg de padrão de referência de rCSP (em PBS, 0,5 M de arginina- HCL, 1 mM de monotioglicerol, pH 7,0) foram analisadas no mesmo volume de concentração e injeção que as amostras para avaliar a capacidade de repetição e tempo de retenção. Injeções vazias que contêm somente tampão diluente (PBS, 0,5 M de arginina-HCL, 1 mM de monotioglicerol, pH 7,0) foram executados para avaliação de adequabilidade de sistema. As amostras de substância ativa a granel foram injetadas em triplicato. O gradiente para fase móvel B foi de 22% a 32% em 20 minutos. As amostras padrões, e amostras vazias foram monitoradas em 214 nm e 280 nm e relatórios de área foram geradas. As áreas dos picos foram usadas para determinar a qualidade e pureza de rCSP. A análise de RP rastreou o teor da CSP (CSP nativo & CSP de piroglutamato) e 3 grupos de pico 1 a 3.

[0419] Médias replicadas para cada ponto de dados (condição de tempo/armazenamento) são mostradas nas Tabelas 23 e 24. Os lotes de amostra foram analisados em execuções específicas de ponto de tempo distintos dos controles e suas amostras estressadas correspondentes. Mudanças/degradação de produto foram rastreadas por RPD (diferença de porcentagem relativa) entre as mesmas por área cromatográfica e pureza (área-%). TABELA 23. RESULTADOS DE LOTE 533-616 Tratamento Tempo F/T Controle Área Crom de Pureza (Área-%) Lote Tipo °C/%RH horas Ciclo horas n-CSP p-CSP CSP_ Total % de RDP CSP n-CSP p-CSP CSP_ Total % de RDP CSP 616

[0420] F/T = congelamento/descongelamento; Controle = controle; Área = área sob pico; % RDP = diferença de porcentagem relativa em produto conforme comparado ao controle; n-CSP = CSP nativo; p-CSP = piroglutamato CSP; CSP Total = n-CSP+p-CSP; RH=umidade relativa. TABELA 24. LOTE 533-618 RESULTADOS

[0421] F/T = congelamento/descongelamento; Controle = controle; Área = área sob pico; % RDP = diferença de porcentagem relativa em produto conforme comparado ao controle; n-CSP = CSP nativo; p-CSP = piroglutamato CSP; CSP Total = n-CSP+p-CSP; RH=umidade relativa.

[0422] Foram produzidos gráficos específicos de lote que descrevem pureza cromatográfica (versus tempo por condição de armazenamento) e linearidade de taxa de degradação (Mancha de Arrhenius). Com base nas mudanças relativas (diferença de porcentagem relativa de pureza ou % total de rCSP) nos dois lotes, o produto foi observado como sendo estável (<2% de perda de pureza) por 5 dias a 4 °C. Perdas de pureza de até 6% ocorreram a 25 °C pela mesma duração. Previu-se que degradação significativa do produto (5%) em 40 °C ocorresse por interpolação de curva de degradação por 24 horas. A mancha de Arrheniuss (r = - 0,996) para as taxas cinéticas de degradação entre as três condições de tratamento (temperaturas), sugerem um único processo limitado por taxa. As manchas para cada Lote conformaram, demonstrando similaridade de degradação entre os lotes.

CONCLUSÕES

[0423] Os estudos de estabilidade mostram que preparações de CSP recombinante produzidos conforme descrito no presente documento mantiveram um teor de monômero de >85% por até 23 dias a 4 0C quando mantido em um pH de 6,4 a 7,0 em um tampão de excipiente de PBS contendo 1 mM de monotioglicerol e 0,5M de arginina. No PBS, 1mM de MTG, 10% de rCSP de tampão de arginina que consiste em 80% de monômero foi mantido por 16 horas a 4 0C seguindo concentração a 5 mg/ml, enquanto amostras concentradas de PBS sozinho continham 29% de monômero depois de 16 horas a 4 0C. Por meio de análises RP-HPLC e SE-HPLC, rCSP em tampão em pH 7,5 demonstraram menos estabilidade em quase todos os pontos de tempo que rCSP em tampão tanto em pH 6,4 como em 7,0.

[0424] Estudos adicionais de estabilidade com o uso confirmado e aprimorado mediante os resultados acima, que mostram um aumento de cerca de 10% de rCSP total. As proteínas de célula hospedeira na preparação de rCSP usadas para esses estudos foram reduzidas pelo uso de cromatografia de interação hidrofóbica.

EXEMPLO 8: EXECUÇÕES DE MANIPULAÇÃO

[0425] Quatro execuções de manipulação foram realizadas no escalonamento de teste do processo descrito no Exemplo 3 para maiores quantidades.

[0426] Os inóculos para as culturas fermentadoras foram gerados inoculando-se frascos de agitação que contêm 600 ml de um meio quimicamente definido suplementados com extrato de levedura e glicerol com um estoque de cultura congelada da cepa selecionada. Depois de aproximadamente 21 horas de incubação com agitamento a 32 °C, uma cultura de frasco de agitamento foi transferida de modo asséptico a um biorreator de 20 l (New Brunswick Scientific, SE-20L) que contêm um meio quimicamente definido projetado para suportar alta biomassa. Oxigênio dissolvido foi mantido em um nível positivo na cultura líquida regulando-se o fluxo lavado de ar atmosférico comprimido assim como a taxa de agitação. O pH foi controlado no ponto ajustado desejado através da adição de amônia aquosa. O processo de fermentação de alta densidade celular alimentada por lote foi dividido em uma fase de crescimento inicial, seguida por uma fase de expressão (indução) de gene na qual 0,38 g de IPTG foi adicionado (para uma concentração de 0,2 mM no caldo com base em um volume estimado de 8 l em indução) para iniciar expressão recombinante de gene. As células foram cultivadas a 27 a 32 °C em pH 6,85 a 7,2. A fase de indução da fermentação foi então permitida a continuar por 24 horas. Nos pontos de tempo durante essa fase, amostras foram retiradas do fermentador para determinar densidade celular e alíquotas de 100 μl foram então congeladas a -20 °C para determinação posterior de expressão de gene alvo. No ponto de tempo final de 24 horas, todo o caldo de fermentação, aproximadamente 10 l para cada biorreator de 20 l, foi colhido em alíquotas de 1 l por centrifugação (Beckman Coulter, Avanti J-20) em 15, 900 x g por 90 min. A pasta celular foi congelada a -80 °C. Para todas as quatro execuções, a pasta celular anteriormente congelada foi descongelada em 2M de ureia, 20mM de tris, pH 8,0 em 20% de concentração (solução de pasta celular/l), ressuspensa em uma solução homogênea, e microfluidizada.

[0427] Execução de Manipulação 1: Nessa execução, TMAE foi realizado em lisado fresco (não anteriormente congelado). Seguindo a coleta, microfluidização, centrifugação de pilha de discos, e filtração de 0,2 μm, 9,9 g de rCSP crua foi recuperada e o rendimento total de 20% de lisado celular foi de 81%. 10g de CSP foi carregado na coluna de TMAE em uma concentração de 0,31 mg/ml e pureza de 7% conforme medido por SDS-CGE. 3g de proteína de CSP foi eluído em uma concentração de 0,05 mg/ml e pureza de 40%.

[0428] Cromatografia de polimento em hidroxiapatite (CHT) de cerâmica foi executada no eluato de TMAE. A pureza do eluato de TMAE carregado na coluna de CHT foi de 45% e a pureza do eluato de CHT foi de 75% por SDS- CGE. A concentração de eluato de CHT foi de 0,04 mg/ml (de 0,05 ng/ml de eluato de TMAE) . O rendimento foi de 81%, todo na eluição. O equilíbrio calculado de CSP foi 96% (o restante de CSP, não coletado na eluição, poderia ser contado nas frações além do eluato) .

[0429] A recuperação da coluna de TMAE da execução de manipulação 1 foi de 27% por SDS-PAGE. Estudos foram empreendidos para determinar as causas do baixo rendimento e pureza de material obtidos nessa execução conforme comparado às execuções (10 litros) descritas acima no Exemplo 3.

[0430] A resina (resina condicionada vs. nova), carregamento de resina, pasta de lisado (pasta provada de uma execução bem sucedida-através da pasta vs. Execução de Manipulação 1), condutividade, carregamento de resina, e taxa de fluxo linear (tempo de residência) combinado, e repetição de todas as condições de uma execução bem sucedida, incluindo o uso de lisado congelado.

[0431] Amostras de SDS-CGE de lisado fresco e lisado congelado/descongelado revelaram "encadeamento" de bandas de alto peso molecular acima da banda principal de rCSP em todas as amostras de lisado fresco. Todas as amostras de lisado que exibem encadeamento proporcionaram rendimento e pureza inaceitáveis de TMAE. Amostras congeladas que foram descongeladas e imediatamente analisadas por eletroforese também mostraram encadeamento; no entanto, amostras congeladas que foram descongeladas e mantidas em RT por 6 horas antes da análise não mostraram encadeamento. Os tempos de filtração e de retenção após o congelamento foram avaliados para se efetuarem em encadeamento. Constatou-se que a filtragem não afeta de forma significativa o encadeamento, embora um tempo de retenção após o congelamento de 6 horas tenha reduzido de forma significativa o encadeamento (Figura 32) . Os tempos de retenção pós-congelamento/descongelamento de 1 h, 3h, 6 h, 7,5 h, e 14 h foram avaliados. Constatou-se que as amostras que dissolveram em 4 M de ureia exibem de forma significativa menos encadeamento do que as amostras de 2 M ureia nos mesmos tempos de retenção. Além disso, o aumento dos tempos de retenção em até 6 horas reduziram diretamente o encadeamento em amostras de ureia tanto de 2 M quanto de 4 M; além de 6 horas, tempo de retenção não mostrou efeito discernível de encadeamento em amostras de ureia de 4 M, mas reduziu o encadeamento de amostras de ureia de 2 M.

[0432] Em resumo, uma forte associação foi medida entre a presença de agregados em amostras carregadas na coluna de TMAE, conforme evidenciado por "encadeamento" de altas bandas de MW em SDS-CGE, e resultados de cromatografia de fraca troca aniônica. Mediante eliminação de uma série de possíveis variáveis de processo, determinou-se que o tempo de retenção após o congelamento e descongelamento é o parâmetro primário que afeta a detecção de agregados na amostras de lisado. Os resultados sugeriram que um tempo de retenção de seis horas após o congelamento e descongelamento reduziria amplamente a formação de agregado. Os outros fatores avaliados - condutividade, carregamento de resina, taxa de fluxo linear, diferenças de pasta celular entre as execuções de manipulação e passagens de processo, e se a resina era nova ou condicionada - foram excluídas como causas para os resultados de cromatografia de fraca troca aniônica.

[0433] Execução de Manipulação 2: Nessa execução, um ciclo de congelamento/descongelamento com uma retenção de 6 horas do lisado entre a filtração profunda e cromatografia de TMAE foi realizado, com resultados satisfatórios. A recuperação primária medida por Q-PAGE seguida de filtração profunda foi de 12,8g rCSP; o rendimento total de 20% de lisado celular foi de 91%. A coluna de captura de troca aniônica foi carregada com lisado em uma concentração de 0,30 mg/ml e pureza de 5% conforme medido por SDS-CGE. A rCSP foi eluída em uma concentração de 0,58 mg/ml e pureza de 78%. A coluna de TMAE mostrou alguns sinais de incrustação, mas o desempenho não foi afetado. A precipitação foi detectada no lisado carregado, que não fora filtrado. O eluato de TMAE foi filtrado em 0,2 μm e o filtrado submetido à cromatografia de polimento por CHT. A pureza da carga de HA (CHT) após a filtração de 0,2 μm de eluato de TMAE foi 82%. A pureza de eluato de CHT foi de 97%, a concentração foi de 0,75 mg/ml, e resultado foi de 113% conforme medido por SDS-CGE.

[0434] Seguindo a filtração de 0,2 μm do eluato de CHT (533-511) e um RT retido de 12 horas, redução branda por DTT foi realizada (533 a 512). DTT de dez mM foi reforçado no eluato filtrado para uma concentração final de 20 μM. O eluato foi então recirculado por 19 horas em 1,5 a 2,5 l/min em uma bolsa de 20 l com uma bomba peristáltica (16,6 l de eluato de CHT a 0,72 g/l CSP na bolsa). A recuperação dessa etapa foi de 102%. A análise de cromatografia de HPLC de exclusão de tamanho de eluato de CHT pré e pós-redução mostrou um claro aumento de teor de monômero, de 85% a 100%.

[0435] Troca de tampão por filtração de fluxo tangencial (TFF) foi executada no material brandamente reduzido para remover sais, ureia, e DTT. O monômero de CSP foi diafiltrado com peso molecular 1x PBS. 5 kDa cortado, 0,1 m2 de membrana de celulose regenerada foi usada para reter CSP. A recuperação a partir da etapa de troca de tampão foi de 86,2% com 7,3% de CSP no permeado e 0,4% de volume de retenção dentro do sistema. A análise do produto final mostrou 0,66 g/l em A280, um nível de endotoxina de 10,3 EU/ml, 4700 ppm de proteínas de célula hospedeira por HCP-ELISA, e 97% de pureza por SDS-CGE. LC/MS revelou 5,1% de rCSP foi N-terminalmente cortado. Os tempos de retenção de RP-HPLC foram consistentes com o padrão de CSP. 10,6 g de CSP foi recuperado após UF/DF e congelado a -80 °C. A cromatografia de exclusão de tamanho de substância ativa a granel pós-UF/DF (533-513) mostrou baixos níveis de dimerização e agregação de rCSP durante essa etapa em comparação ao controle (533-407), resultando no teor que foi 90% de monômero, 7% de dímero, e 3% de agregado.

[0436] Essa execução confirmou que rCSP purificada que se conforma a níveis almejados de pureza, resultado, concentração, teor de monômero, corte, e endotoxina poderia ser produzida em escala com o uso da fermentação e processos descritos de purificação integrada.

[0437] Execução de Manipulação 3: Nessa execução, a coleta, ruptura de célula, e clarificação de lisado foram realizadas de acordo com o mesmo protocolo que a execução de manipulação 2. O lisado foi mantido a -80 °C por seis horas e mantido em temperatura ambiente por seis horas antes de ser carregado na coluna de TMAE, mas o congelamento incompleto do lisado foi observado. Recuperação primária medida por Q-PAGE Seguindo a filtração profunda foi de 14,8g CSP, e o rendimento total foi de 98% de 20% de lisado celular. Precipitação pesada foi observada no lisado descongelado e incrustação de coluna pesada observada precocemente no processo de carregamento e tornou-se cada vez pior à medida que a execução progrediu. A pureza e resultado para a Execução de Manipulação 3 foram notavelmente reduzidas em comparação à Execução de Manipulação 2. Por SDS-CGE, o equilíbrio de rCSP para ER3 foi de 41%, com 23% na eluição, 4% na lavagem, e 13% no fluxo de passagem. Cromatografia de polimento e troca de tampão não foram executados.

[0438] Execução de Manipulação 4: Nessa execução, coleta, ruptura de célula, e clarificação de lisado foram novamente realizadas de acordo com o mesmo protocolo que o da Execução de Manipulação 2, mas tampões de baixa temperatura foram usadas para a cromatografia de TMAE.

[0439] A recuperação primária medida por SDS- PAGE (Q-PAGE) quantitativo seguindo a filtração profunda foi de 13,7g de CSP; o rendimento total de 20% de lisado celular foi de 81%. Depois do descongelamento, a precipitação foi observada e o lisado foi filtrado por 0,45 μm de filtração antes do carregamento na coluna de TMAE. A incrustação da coluna não foi observada. Tampões usados nessa execução de coluna foram de 6 a 12 °C quando usados. A pureza foi de 65% por SDS-CGE. A concentração de lisado carregado foi de 0,34 ng/ml e 0,24 ng/ml para a eluição. O resultado foi de 54% na eluição, 4% na lavagem, 1% no fluxo-através de, e 3% na tira. Equilíbrio de massa de CSP foi de 62%. Esses resultados são significativamente inferiores aos da Execução de Manipulação 2 e acredita-se que tenham sido resultados uso de tampões de baixa temperatura.

[0440] Cromatografia de polimento em CHT foi conduzida. O eluato de TMAE carregado foi 65% puro por SDS- CGE e a pureza de eluição de CHT foi DE 94%. A concentração do material carregado foi de 0,25 mg/ml; A eluição foi de 0,27 mg/ml. O resultado por SDS-CGE foi de 112%, sendo que toda a proteína sai na eluição. 7,2 g de eluato de CHT foi recuperado e armazenado a -80 °C. A causa mais provável para pureza ligeiramente inferior a ER2 foi concentração e pureza de eluato de TMAE potencialmente inferior.

CONCLUSÃO

[0441] O processo de fermentação e purificação produziu de modo bem sucedido quantidades de múltiplas gramas de rCSP que cumprem ou excedem valores de pureza para pureza, resultado, teor de monômero, corte de N- terminal, e endotoxina. A execução de manipulação 2 produziu 10, 6 g de substância purificada de fármaco de volume de CSP. A execução de manipulação 4 produziu 7,2 g de eluato de CHT. A pureza do material produzido por ambas essas Execuções de manipulação cumpriu valores alvo por HPLC-SEC e RP-HPLC. A precipitação observada nas execuções maiores se deu potencialmente devido ao tempo adicional exigido para as maiores quantidades de lisado para congelar, o que pode ter resultado em algumas porções do lisado não congelando, ou resultado em um tempo de congelamento mais curto exigido para desagregação.

EXEMPLO 9: MÉTODOS PARA REMOÇÃO DE PROTEÍNA DE CÉLULA HOSPEDEIRA

[0442] Métodos para remoção adicional de proteínas de célula hospedeira foram desenvolvidos. Duas resinas de exclusão de tamanho e cinco resinas de interação hidrofóbica foram avaliadas para uso em uma terceira etapa de cromatografia para reduzir a quantidade de proteína de célula hospedeira na substância ativa a granel. Constatou- se que a cromatografia de interação hidrofóbica com o uso de Toyo Hexyl-650C reduz a proteína de célula hospedeira a menos do que 100 ppm com excelente pureza de rCSP, concentração, resultado e massa intacta. O uso de MTG nas condições de redução branda também aprimorou a liberação.

[0443] Uma execução de manipulação em grande escala que utiliza os procedimentos de processo aprimorado, incluindo uma terceira etapa de cromatografia de 4,56 l Hexyl-650C, foi realizada. Essa execução produziu 7,6 g de substância ativa a granel na formulação de tampão de excipiente final descrita no Exemplo 7, com teor de monômero de 96,3% e proteínas de célula hospedeira de 152 ppm.

AVALIAÇÃO DE MÉTODOS PARA REMOVER PROTEÍNA DE CÉLULA HOSPEDEIRA

[0444] Métodos de separação analítica para redução de HCP foram avaliados. SE-HPLC foi usado para resolver rCSP de HCPs e coletado (microfracionado) para análise por SDS-PAGE e HCP-ELISA. A análise de SE-HPLC de 533-407 (um padrão de referência de rCSP interna preparada a partir da cepa 533-129 com o uso de métodos descritos no Exemplo 2) mostraram um nível amplamente reduzido de HCPs na de SE-HPLC principal por ELISA: 350 ppm para o pico de SE-HPLC versus 4100 ppm pré-SE-HPLC. Quando analisados por SDS-PAGE, nas bandas de HCP foram evidentes na amostra de pico principal de rCSP de 533-407 seguida de SE-HPLC.

AVALIAÇÃO DE CROMATOGRAFIA DE INTERAÇÃO HIDROFÓBICA PREPARATIVA PARA REDUÇÃO DE HCP

[0445] Hexyl 650 C, Phenyl HP, Butyl HP, e PPG 600M foram avaliados para a terceira purificação de coluna por cromatografia de interação hidrofóbica (HIC). As tensões de ligação relativa e tempos de retenção das resinas de interação hidrofóbica testadas da mais forte (a maior retenção) à mais fraca (a menor retenção) são: Hexyl 650 C > Butyl HP > Phenyl HP > PPG 600M. execuções em escala de bancada com o uso de colunas de 5, 13 ml foram executadas para todas as resinas testadas. As amostras de eluato de CHT reduzidas com MTG (533-565 e 533-563) e DTT (533-523) foram comparadas, com o uso de gradientes de eluição de 20 CV de 1,0M a 0M de sulfato de amônio. Operações de cromatografia líquida rápida de proteína (FPLC) foram executadas com o uso de sistemas de cromatografia ÃKTAexplorer 100 (GE Healthcare) equipada com coletor de fração Frac-950. Materiais usados: Tosoh resina Hexyl 650C (Lot-no 65HECB501N0); ácido HEPES (número de catálogo 4018-06, JT Baker, Phillipsburg, NJ) ; Hepes Na salt (número de catálogo 4153-05, JT Baker, Phillipsburg, NJ) ; NaCl (número de catálogo 13423, Sigma/Riedel de Haen, St. Louis, MO); Sulfato de amônio (número de catálogo BDH8001-12Kg, BDH) ; ureia (número de catálogo 4203-60, JT Baker, Phillipsburg, NJ) ; Monotioglicerol (MP Biomedicals número de catálogo 155727); Hexyl 650C e PPG 600M (número de catálogo 21399, Tosoh USA, Flemington, NJ) GE Healthcare, Piscataway, NJ); Phenyl HP(GE, 17-5195-01); Butyl HP (GE, 28-4110-01) .

[0446] Das resinas de coluna testadas para a terceira coluna, Hexyl 650-C produziu os menores níveis de HCPs (< 100 ppm) junto a baixo corte de N-terminal e altos níveis de pureza, resultado, e separação de monômero do dímero. Hexyl-650C foi otimizado em uma escala intermediária com o uso de uma coluna de 112,5 ml a fim de fornecer previsibilidade suficiente de desempenho na escala de fabricação muito maior. Os parâmetros de cromatografia são mostrados na Tabela 25. TABELA 25. PARÂMETROS DE CROMATOGRAFIA PARA EXECUÇÕES DE PURIFICAÇÃO INTEGRADA

[0447] Uma coluna de Toyo-Hexyl 650-C (0,66 cm diâmetro x15 cm altura) foi executada com 1 mM de eluato de CHT reduzido por MTG (533-565) e eluído com um gradiente de volume de 15 colunas (CV) de 1M a 0 M de sulfato de amônio com 1 mM de MTG seguidas por 3 CVs em 0M de sulfato de amônio com 1 mM de MTG. O eluato de coluna foi designado 533 a 597. SDS-CGE foi executado nas frações eluídas e níveis de HCP determinados por HCP-ELISA. Frações precoces do pico de eluição exibiram maiores níveis de HCP do que as frações posteriores, e todas as frações estavam bem abaixo de 100 ppm. Uma parte do monômero de rCSP e quase todo o dímero eluíram na tira de água de coluna. O mesmo amostra material de amostra (eluato de CHT 533-565) usado para 533597 foi carregado para obter eluato 533-594 e eluído sob as mesmas condições. A análise de SDS-CGE de 533-594 revelou que essas frações que eluem logo à frente das frações de rCSP de pico exibiram bandagem dupla, indicando presença de HCPs, enquanto a fração de eluição de rCSP de pico não mostrou bandas duplas em SDS-CGE. Da forma mais significativa, a quantidade de HCP na fração de pico, conforme medido por ELISA, foi 50 ppm. Eletroferogramas de frações selecionadas mostraram picos únicos naquelas frações próximas ao centro da faixa de eluição. A análise por RP-HPLC de 533-594 mostrou que a fração F2, que exibiram duas bandas de SDS-CGE, foi enriquecida nas impurezas de grupo 2 que eluíram a frente do pico de CSP principal. O ombro de ajuste do pico de CSP principal, designado “fração #2” (consulte o Exemplo 7), continha espécie de rCSP que tem medições de massa intacta consistentes com Piroglutamato de N-terminal. A fração de eluição 7, próxima ao centro do pico de eluição, mostrou muito pouco CSP de piroglutamato; fração F12, próxima ao centro do pico, exibiu mais CSP de piroglutamato e menos das impurezas de grupo 2 do que F7. A tira de coluna continua uma quantidade maior de pE-CSP e dímero de grupo 3 do que qualquer parte do gradiente de eluição. A tabela 26 compara as Execuções de RP-HPLC das frações de pico de eluição de Hexyl 650-C 533-594,

2. EXECUÇÕES DE HEXYL-650C EM ESCALA DE BANCADA: 0,5M A 0M DE GRADIENTE DE SULFATO DE AMÔNIO COM MTG E ETAPA ELUIÇÕES

[0448] Execuções adicionais de coluna adicional de Hexyl 650-C eluída por gradiente 3-6 utilizaram um gradiente de eluição de 0,5M a 0M de sulfato de amônio. O faixa de gradiente mais estreita permitiu melhor resolução dentro da faixa de eluição de rCSP. As Execuções 3 & 4 compararam eluatos de CHT reduzidos com 1 mM de MTG (533-606) com aqueles reduzidos com 100 mM DTT (533-610) em colunas eluídas com um gradiente de 0,5M a 0M de sulfato de amônio. A comparação de níveis de HCP de frações individuais de eluato e agrupamentos de fração de 533-610 indicaram maior concentração de HCP próxima ao pico de eluição, mas níveis muito inferiores de HCP de aproximadamente 900 ppm em comparação a 7000 ppm no material carregado (533-523). O corte no material carregado foi de 15%, mediante corte para as frações de pico principal do eluato Hexyl (frações E2-F2) foi 6,2%. As Execuções 5 & 6, cada uma, usaram uma etapa eluição 3 CV de 0,1M de sulfato de amônio com eluato de CHTs reduzido com MTG (533-607 e 533-611) . A análise de SDS-CGE mostrou que a eluição de gradiente alcançou separação significativamente melhor de monômero do dímero e HCPs do que da etapa eluição. A tabela 27 mostra os dados analíticos dessas execuções de coluna. O menor nível de HCP junto a baixo corte e alta pureza foi alcançado com 533-606; portanto, redução de 1 mM de MTG seguido por Cromatografia de Hexyl- 650C com um 0,5 a 0M de gradiente de sulfato de amônio foi escolhida para o intermediário subsequente- e execuções em escala total.

EXECUÇÕES DE HEXYL-650C DE FASE INTERMEDIÁRIA(533-615) E SUBSTÂNCIA ATIVA A GRANEL (533-616)

[0449] Com base nos resultados obtidos das colunas de gradiente de Hexyl de escala de bancada, uma coluna preparativa de Hexyl em larga escala com um volume de coluna de 112,6 ml foi carregado com eluato de CHT reduzido por MTG (533-563) e eluído com um gradiente de 0,5M a 0M de sulfato de amônio; eluato foi designado 533615 (Execução 7) . HCP por ELISA de 533-615 foi 152 ppm e pureza de rCSP foi 99,2%. Dados para pureza por SDS-CGE, concentração total de proteína por absorbância em 280 nm, corte de aminoácido por LC/MS, e nível de proteína de célula hospedeira por ELISA por 533-615 junto a 533-606, - 610, -607, e -611 são resumidas na Tabela 27. RCSP total (formas nativas mais piroglutamato) conforme medido por HPLC de fase reversa aumentou de 82,4% após CHT a 91,5% após Hexyl 650C. TABELA 27. DADOS ANALÍTICOS PARA PRÉ E PÓS-PURIFICAÇÃO DE HEXYL

TROCADETAMPÃOUF/DF(5331616)

TROCA DE TAMPÃO UF/DF (533-616)

[0450] O agrupamento de eluição de Hexyl 533616 foi concentrado por filtração de fluxo tangencial e diafiltrado no tampão de excipiente final que consiste em 1x PBS, 0,5M de arginina-HCl, 1mM monotioglicerol, pH 6,7.

[0451] Membranas foram equilibradas com 1X PBS antes da introdução de produto. 1X PBS, 10% (p/v) de arginina-HCl (0,5M de arginina-HCl para 533-616) (J.T. Baker, número de parte 2067), 1mM de monotioglicerol (MP BIOMEDICALS número de catálogo 155727), pH 6,4 foi recirculado através das membranas em 324 LMH em temperatura ambiente (21 a 23 °C). TMPs de 68,9 a 103,4 Kpa(10 a 15 psi) e 144,7 a 165,4 Kpa(21 a 24 psi) foram aplicados ao retentado ao mesmo tempo sobre as membranas 5 kDa. O volume de retenção foi calculado com o tampão em 60,2 ml. Para 533-616, a concentração do eluato foi de um volume original de 1532 ml em 0,173mg/ml a um volume de 189,3 ml em 1,4 mg/ml. Depois de concentrar, diafiltração de volume constante foi realizada para oito volumes de retentado: 189,3 ml x 8 = 1514,4 ml. O mesmo foi então concentrado a um volume de 163,4 ml e diluído a um final volume de 221,9 ml (209, 5 ml para 533-616) em 1,0 mg/ml. Membranas foram lavadas a jato com 52,3 ml de tampão e limpas recirculando- se 0,1 N NaOH em temperatura ambiente por > 60 minutos. A regeneração das membranas foi verificada por medições de permeabilidade de água normalizada. O CSP purificado final foi armazenado congelado a -80 °C.

[0452] A recuperação a partir da etapa de troca de tampão foi de 87,6%; pureza por SDS-CGE foi 99,8%. SDS-PAGE mostrou uma diminuição na quantidade de dímero após a troca no tampão final; monômero foi de 97,6% por SEC-HPLC. O corte de N-terminal após a redução foi de 2,7% por LC/MS e rCSP foi 90,3% por RP-HPLC. A análise do produto final mostrou 1,05 mg/ml em A280, um nível de endotoxina de 4 EU/mg, e um nível de proteína de célula hospedeira de 216 ppm por HCP-ELISA. Os dados analíticos são resumidos na Tabela 28. TABELA 28. FINAL SUBSTÂNCIA ATIVA A GRANEL: RESUMO DE DADOS ANALÍTICOS MEDIDOS

[0453] A produção em escala com o uso de uma Terceira Coluna (533-618) de Hexyl-650C de 20 cm

[0454] Após alcançar a redução satisfatória de HCP e dímero os resultados com o uso de Hexyl-650C na escala de bancada e na escala de 112 ml, uma execução de produção de transferência de tecnologia em escala total foi tentada com o uso de uma coluna de Hexyl-650C de 4,56 l de 20 cm. Material centrado que fora congelado a -80 °C foi descongelado 14 dias depois e purificado por TMAE e CHT. A redução com 1 mM de MTG começou no mesmo dia que a redução de purificação de TMAE e CHT. A purificação de Hexyl-650C começou no dia seguinte (eluato Hexyl: 533-617). O próximo dia o eluato 533-617 Hexyl-650C foi transferido ao tampão de volume que consiste em 1X PBS com 1 mM de MTG, 0,5M de arginina, pH 6,7 por UF/DF e designado 533-618. O cromatograma A280 de 533-617 mostra um pico de pequenas moléculas que saem da coluna no fluxo de passagem. A análise do 533-618 BDS a partir da coluna de 20 cm mostrou que todos os critérios principais de desempenho estão dentro das especificações (Tabela 29) . TABELA 29. RESULTADOS DE TESTE DE LIBERAÇÃO DE SUBSTÂNCIA ATIVA A GRANEL PARA 533-618

[0455] Conclusão: As proteínas de célula hospedeira foram identificadas por análise de banco de dados de peptídeo de espectrometria de massa. Nenhuma das proteínas identificadas de célula hospedeira foi identificada como tóxica. Um estudo de imunogenicidade que compara "alta" (purificação de 2 colunas) e 'baixa' (purificação de 3 colunas) quantidades de HCP-que contêm lotes de rCSP não indicou uma diferença de imunogenicidade de rCSP resultante de diferentes níveis de HCPs na preparação de rCSPs.

[0456] O nível de HCPs na substância ativa a granel foi reduzido por uma terceira etapa de cromatografia. O menor nível de HCP junto ao baixo corte e alta pureza foi alcançado com o uso de condições de redução branda que compreende 1 mM de MTG, seguido por cromatografia de Hexyl-650C com um 0,5 a 0M de gradiente de sulfato de amônio.

EXEMPLO 11: MÉTODOS PARA REDUZIR PRECIPITAÇÃO EM LISADO

[0457] Métodos para reduzir precipitação no lisado antes da cromatografia de troca aniônica foram avaliadas para seu efeito em rendimento e pureza de rCSP.

[0458] Conforme descrito, o congelamento e descongelamento de lisado antes do carregamento na coluna de troca aniônica de TMAE pode intensificar a concentração de pureza de rCSP, concentração, e resultado. O congelamento de lisado em garrafas de 2 l foi avaliado como uma alternativa para recipientes maiores devido a sua maior razão de área de superfície para volume. Dez porcento de lisado foi preparado pelo processo descrito para as Execuções de manipulação. Uma garrafa de PETG de 2 l que contém 10% de sobrenadante de lisado (533-555, preparado a partir de pasta celular 533-446) e garrafas de PETG de 5 x 2 l que contêm água deionizada foram colocadas em um freezer Revco a -80 °C. A Tabela 30 destaca o progresso do congelamento ao longo do tempo. TABELA 30. PROGRESSO DE CONGELAMENTO DE LISADO EM GARRAFAS DE PETG DE

[0459] Para estabelecer um tempo esperado para descongelamento, a garrafa PETG de 2 l que contêm 10% de lisado congelado (533-555), junto a garrafas de PETG de 6 x 2L que contêm água DI e várias garrafas de PETG de 1 l e 500 ml que contêm liquido congelado em < -7 6 °C (totalizando 24 l de liquido congelado) foram colocadas em um lote de água Precision 270 (Thermo Scientific) ajustado para 25 °C, e a temperatura de lote de água nunca caiu abaixo de 22 °C. Depois de 3,25 horas, com algumas misturas leves das garrafas, os 10% de lisado congelado foram completamente descongelados a 22 a 23 °C.

[0460] Para reduzir mais a precipitação, a filtração de lisado descongelado que fora totalmente congelado foi avaliada. Dez por cento de lisado (533-558) feito da mesma pasta celular usada para preparar o lisado para a Execução de Manipulação 3 (533-485) foi preparado pelo processo descrito, congelado em garrafas de PETG de 2 l, e descongelado conforme descrito acima em 2 horas e 35 minutos. Em luz da possibilidade de corte de N-terminal aumentado durante o tempo adicional exigido para centrifugação, a filtração sem centrifugação foi considerada desejável se foi constatado que a mesma reduza adequadamente a quantidade de precipitante. A fim de determinar o comprimento de tempo e força exigidos para centrifugação, filtração de lisado descongelado através do filtro de membrana de Sartobran P (0,45 μm /0,2 μm) foi avaliada sob três diferentes condições: sem centrifugação, 15 minutos em 15.000 x g, e 30 minutos em 30.000 x g. A metodologia Vmax foi seguida para determinar capacidades de filtração. Considerou-se que os valores V75 têm limites práticos de capacidade devido ao fato de que a taxa de fluxo em 75% de plugamento foi de aproximadamente 25% das taxas de fluxo iniciais. Constatou-se que a filtração de membrana sem centrifugação produz valores V75 adequados para fabricação (Tabela 31) . Com filtração em 0,45 μm (um tamanho pequeno o suficiente para evitar incrustação da resina TMAE) determinada para ser pratica sem centrifugação, a cromatografia de TMAE foi realizada com filtração mas sem centrifugação de lisado congelado/descongelado. A área de filtração maior exigida justificado quando pesado o potencial para corte proteolítico aumentado. Não houve diminuição aparente na concentração de rCSP nas taxas de rendimento de filtro exigidos para amostra não centrifugada. TABELA 31. LISADO DESCONGELADO 533-558 FILTRADO COM FILTROS DE MEMBRANA SARTOBRAN

[0461] Um filtro de membrana de 0,65μm /0,45μm, uma combinação de tamanho conhecida por fornecer remoção adequada de particulado para proteger a coluna de TMAE da incrustação, foi usada. As taxas de rendimento de 25 l/m2 foram alcançadas com lisado não centrifugado, e nenhuma incrustação de coluna de TMAE incrustação ocorreu.

[0462] Os resultados indicam o uso de filtração de membrana de 0,2/0,45 μm ou 0,65μm /0,45μm, sem centrifugação, seguindo congelamento-descongelamento do lisado em garrafas de 2 l. Essa etapa adicional reduziu a precipitação para permitir cromatografia bem sucedida, e resultou em um baixo nível de corte de N-terminal de rCSP relacionado ao tempo de processamento encurtado.

Claims

1. Processo para purificar proteína circunsporozoíta P. falciparum recombinante (rCSP), sendo o dito processo caracterizado pelo fato de que compreende: (a) obter uma preparação de lisado de célula bacteriana que compreende dímero de proteína circunsporozoíta P. falciparum recombinante; (b) separar a preparação de lisado de célula bacteriana da etapa (a) em uma fração solúvel que compreende o dímero de proteína circunsporozoíta P. falciparum recombinante, e uma fração insolúvel; (c) separar o dímero de proteína circunsporozoíta P. falciparum recombinante na fração solúvel da etapa (b) de proteínas de célula hospedeira na fração solúvel; e (d) submeter o dímero de proteína circunsporozoíta P. falciparum recombinante obtido na etapa (c) às condições de redução preferenciais, em que as condições de redução preferenciais compreendem um agente de redução suave selecionado de DTT, cisteína, acetilcisteína, glutationa, monotioglicerol (MTG), tiogliolato, ditotiotreitol, ditioerititol, acetilcisteína, 2-Mercaptoetanol (β- mercaptoetanol), TCEP-HCl (puro, cristalino Tris(2- carboxietil)cloridrato de fosfina), ou 2-Mercaptoetilamina- HCl (2-MEA), e um agente desagregador selecionado de ureia, arginina, guanidina HCl e um detergente, em que as condições de redução preferenciais reduzem as ligações dissulfeto intermoleculares enquanto preservam as ligações dissulfeto intramoleculares de cada monômero; obtendo assim a proteína de circunsporozoíta P. falciparum recombinante purificada sem a necessidade de desnaturação ou a etapa de redobragem da proteína, em que a proteína circunsporozoíta P. falciparum recombinante purificada obtida está intacta no terminal N a partir do resíduo 25 da SEQ ID NO: 1, e em que 0 a 10% da proteína circunsporozoita de P. falciparum recombinante purificada obtida é dimerizada, e 0 a 5 % da proteína circunsporozoíta de P. falciparum recombinante purificada obtida está presente como agregados de elevado peso molecular.

2. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente: (e) separar a proteína circunsporozoíta P. falciparum recombinante obtida na etapa (d) de proteínas de célula hospedeira, rCSP N-terminalmente degradada, e/ou outras espécies de rCSP indesejadas.

3. Processo, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a separação da etapa (e) compreende cromatografia de interação hidrofóbica.

4. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a proteína circunsporozoíta P. falciparum recombinante purificada é obtida com um rendimento de purificação geral de 10% a 75%; e/ou em que a proteína circunsporozoíta P. falciparum recombinante purificada obtida compreende de 90 a 100% do monômero de proteína circunsporozoíta P. falciparum recombinante.

5. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a separação da etapa (c) compreende cromatografia, e em que a cromatografia compreende cromatografia de troca aniônica e cromatografia de modo misto, de preferência em que a cromatografia de modo misto é cromatografia de hidroxiapatita.

6. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o agente de redução suave é DTT a uma concentração de 0,01 a 0,03 mM, ou MTG a uma concentração de 0,5 mM a 1,5 mM.

7. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende preparar uma formulação de proteína circunsporozoíta P. falciparum recombinante líquida estável, que compreende diafiltrar 1 mg/ml a 50 mg/ml, 1 mg/ml a 25 mg/ml, 1 mg/ml a 10 mg/ml, 1 mg/ml a 5 mg/ml, 5 mg/ml a 50 mg/ml, 5 mg/ml a 25 mg/ml, ou 5 mg/ml a 10 mg/ml de proteína circunsporozoíta P. falciparum recombinante em um tampão de formulação que compreende 0,5 mM a 1,5 mM de MTG e 10% a 20% de arginina e armazenar a formulação de proteína estável em que a temperatura de armazenamento é de 3 °C a 25 °C.

8. Processo, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o tampão de formulação compreende 0,5X ou 1X PBS.

9. Processo, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o tampão de formulação tem um pH de 6,0 a 7,5, 6,4 a 7,2, 6,4 a 7,0, 6,6 a 6,8, ou 6,7.

10. Processo, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o tampão de formulação compreende 1,0 mM de MTG, 10% a 20% de arginina, 1X PBS, tem um pH de 6,4 a 7,5, e em que a temperatura de armazenamento é de 4 °C a 6 °C.

11. Processo, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que compreende ainda a preparação de uma formulação de proteína circunsporozoíta P. falciparum recombinante líquida estável, que compreende a diafiltração de 1 mg/ml a 50 mg/ml, 1 mg/ml a 25 mg/ml, 1 mg/ml a 10 mg/ml, 1 mg/ml a 5 mg/ml, 5 mg/ml a 50 mg/ml, 5 mg/ml a 25 mg/ml, ou 5 mg/ml a 10 mg/ml proteína circunsporozoíta P. falciparum recombinante em um tampão de formulação compreendendo 0,5 mM a 1,5 mM de MTG e 10% a 20% de arginina e armazenamento da formulação de proteína estável em que a temperatura de armazenamento é de 3 °C a 25 °C.

12. Processo, de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que a formulação de proteína circunsporozoíta P. falciparum recombinante líquida estável contém pelo menos um dentre os seguintes: 0 a 1%, 0 a 2%, 0 a 3%, 0 a 4%, 0 a 5%, 0 a 6%, 0 a 7%, 0 a 8%, 0 a 9%, 0 a 10% de dímero de proteína circunsporozoíta P. falciparum recombinante; 0 a 1%, 0 a 2%, 0 a 3%, 0 a 4%, 0 a 5%, 0 a 6%, 0 a 7%, 0 a 8%, 0 a 9%, ou 0 a 10% agregados de alto peso molecular de proteína circunsporozoíta P. falciparum recombinante; 0 a 1%, 0 a 2%, 0 a 3%, 0 a 4%, 0 a 5%, 0 a 6%, 0 a 7%, 0 a 8%, 0 a 9%, ou 0 a 10% de proteína circunsporozoíta P. falciparum recombinante desnaturada, e; 0 a 1%, 0 a 2%, 0 a 3%, 0 a 4%, 0 a 5%, 0 a 6%, 0 a 7%, 0 a 8%, 0 a 9%, ou 0 a 10% de produtos de degradação de proteína circunsporozoíta P. falciparum recombinante.

13. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o lisado de células bacterianas é preparado a partir de células hospedeiras transformadas com um vetor de expressão compreendendo uma sequência de ácido nucleico conforme estabelecido na SEQ ID NO: 5, ou uma sequência degenerada da mesma que codifica a sequência de aminoácidos de circunsporozoíta P. falciparum recombinante conforme estabelecido na SEQ ID NO: 3.

14. Processo, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que as células hospedeiras são células Pseudomonad; preferencialmente em que as células hospedeiras são células de Pseudomonas.

15. Processo, de acordo com a reivindicação 13 ou 14, caracterizado pelo fato de que a sequência de aminoácidos conforme estabelecida na SEQ ID NO: 3 é fundida a uma sequência de sinal de secreção periplasmática.

16. Processo, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente manter de modo estável a proteína purificada de circunsporozoíta P. falciparum recombinante em uma formulação líquida estável, sendo que o processo compreende fornecer uma formulação que compreende 1 a 5, 1 a 10, 1 a 20, 1 a 30, 1 a 40, ou 1 a 50 mg/ml de rCSP, 0,5 a 1,5 mM de MTG e 1% a 20% de arginina em 0,5X ou 1X PBS em um pH de cerca de 6,0 a 7,5, em que a rCSP é mantida de modo estável em uma temperatura de 3 °C a 25 °C, por 7 dias, 8 dias, 9 dias, 10 dias, 11 dias, 12 dias, 13 dias, 14 dias, 15 dias, 16 dias, 17 dias, 18 dias, 19 dias, 20 dias, 21 dias, 22 dias, 23 dias, 24 dias, 25 dias, 30 dias, 60 dias, 70 dias, 80 dias, 90 dias, 6 meses, ou 1 ano.

17. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7-11 ou 15, caracterizado pelo fato de que (i) a formulação líquida estável compreende 1,0 mM de MTG e 10% de arginina em 1X PBS a um pH de 6,4 a 7,0, em que o rCSP é estavelmente mantido a uma temperatura de 3 °C a 5 °C, por 7 dias, 8 dias, 9 dias, 10 dias, 11 dias, 12 dias, 13 dias, 14 dias, 15 dias, 16 dias, 17 dias, 18 dias, 19 dias, 20 dias, 21 dias, 22 dias, 23 dias, 24 dias, 25 dias, 30 dias, 60 dias, 70 dias, 80 dias, 90 dias, 6 meses ou 1 ano; e/ou (ii) em que a manutenção estável do rCSP é indicada pela quantidade de rCSP total na formulação, a diferença percentual relativa em rCSP total na formulação quando comparada a um controle ou a diferença percentual relativa na pureza de rCSP quando comparada a um controle; em particular em que a manutenção estável do rCSP é indicada por uma quantidade de rCSP total na formulação de 70% a 95%, ou por uma diferença percentual relativa no rCSP total na formulação ou uma diferença percentual relativa na pureza de rCSP de -5% a 5%, -4% a 4%, -3% a 3%, -2% a 2%, -2% a 1%, - 2% a 0,5%, -2% a 0% ou 0% a 2%, quando comparado a um controle.

18. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a proteína circunsporozoíta P. falciparum recombinante purificada obtida está N terminalmente intacta a partir do resíduo 24 da SEQ ID NO: 1; em particular do resíduo 23 da SEQ ID NO: 1; do resíduo 22 da SEQ ID NO: 1; e/ou a partir do resíduo 22 da SEQ ID NO: 1.

19. Formulação líquida estável de proteína circunsporozoíta P. falciparum recombinante caracterizada pelo fato de que compreende 1 a 5 ou 1 a 10 mg/ml de proteína circunsporozoíta P. falciparum recombinante em um tampão de formulação compreendendo 0,5 a 1,5 mM de MTG e 10% a 20% de arginina, em que a temperatura de armazenamento é de 3 °C a 8 °C.

20. Formulação líquida estável, de acordo com a reivindicação 19, caracterizada pelo fato de que o tampão de formulação compreende 0,5X ou 1X PBS; e em que o tampão de formulação tem um pH de 6,0 a 7,5, 6,4 a 7,2, 6,4 a 7,0, 6,6 a 6,8, 6,4, 6,7 ou 7,0; preferencialmente em que a formulação líquida estável compreende 1 a 5 mg/ml de rCSP, 1,0 mM de MTG, 10% de arginina, 1X PBS, tem um pH de 6,0 a 7,5, e em que a temperatura de armazenamento é de 4 °C a 6 °C.

21. Formulação líquida estável, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que a formulação líquida estável de proteína circunsporozoíta P. falciparum recombinante, contém uma das seguintes: 0 a 10% de dímero de proteína circunsporozoíta P. falciparum recombinante; 0 a 1%, 0 a 2%, 0 a 3%, 0 a 4%, 0 a 5%, 0 a 6%, 0 a 7%, 0 a 8%, 0 a 9%, ou 0 a 10% agregados de alto peso molecular de proteína circunsporozoíta P. falciparum recombinante, e; 0 a 1%, 0 a 2%, 0 a 3%, 0 a 4%, 0 a 5%, 0 a 6%, 0 a 7%, 0 a 8%, 0 a 9%, ou 0 a 10% de produtos de degradação de proteína circunsporozoíta P. falciparum recombinante.

22. Processo para manter de forma estável rCSP em uma formulação líquida estável, sendo que o processo é caracterizado pelo fato de que compreende fornecer uma formulação líquida estável conforme definida na reivindicação 20, em que a rCSP é mantida de modo estável em uma temperatura de 3 °C a 8 °C, por 7 dias, 8 dias, 9 dias, 10 dias, 11 dias, 12 dias, 13 dias, 14 dias, 15 dias, 16 dias, 17 dias, 18 dias, 19 dias, 20 dias, 21 dias, 22 dias, 23 dias, 24 dias, ou 25.

23. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o dímero de proteína circunsporozoíta P. falciparum recombinante é compreendido por uma sequência de aminoácidos correspondente à SEQ ID NO: 3.

24. Processo, de acordo com a reivindicação 13 ou 14, caracterizado pelo fato de que a sequência de ácido nucleico apresentada na SEQ ID NO: 5, ou uma sequência degenerada da mesma que codifica a sequência de aminoácidos do circunsporozoíto P. falciparum recombinante, conforme estabelecido na SEQ ID NO: 3 é fundido a uma sequência codificadora de sinal de secreção periplasmática.