CN108164593B - 一种基于钙调蛋白性质的蛋白纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种基于钙调蛋白性质的蛋白纯化方法。具体技术方案如下:将多肽链CBD固定在色谱柱填料上成为CBD色谱柱,多肽链CBD是能与钙调蛋白特异性结合的多肽;将目的蛋白以LIC克隆方法克隆到带有钙调蛋白标签的HCT表达载体中,转化表达蛋白,采用超生破碎法破菌取上清,获得可溶蛋白溶液;将所得蛋白溶液用CBD色谱柱纯化;然后用疏水色谱柱进一步纯化,继而用TEV酶进行酶切;最后用Talon柱除去标签和TEV酶。该方法利用同一标签进行多步亲和层析,非常快速高效。
Description
技术领域:
本发明涉及重组蛋白,具体为一种基于钙调蛋白性质的蛋白纯化方法。
背景技术:
钙调蛋白是真核生物细胞中的胞质溶胶蛋白,由148个氨基酸组成单条多肽,相对分子质量为16.7kDa。钙调蛋白的外形似哑铃,有两个球形的末端,中间被一个长而富有弹性的螺旋结构相连,每个末端有两个与Ca2+结合的结构域,每个结构域可以结合一个Ca2+,一个钙调蛋白可以结合4个Ca2+。钙调蛋白与Ca2+结合后在构型上会产生明显的变化,在每一个球形末端均会暴露出疏水表面。该疏水表面的暴露使其可以与其他蛋白疏水锚定残基或疏水色谱柱填料特异性结合,故钙调蛋白可作为蛋白纯化的标签。本发明串联使用钙调蛋白能与特定疏水锚定残基和疏水色谱柱相结合的性质。利用两种特异性结合的纯化方式进行纯化,从而的到高纯度的蛋白。Andrew J.McCluskey于2007年发表得文章曾将His标签与钙调蛋白标签融合,使用镍柱等金属离子亲和柱及疏水色谱中联合使用纯化蛋白,His标签与金属离子亲和柱的结合特异性不高,本发明设计新型CBD(能与钙调蛋白特异性结合的多肽)柱,充分利用CBD与钙调蛋白特异性结合的性质,依次使用CBD柱与疏水色谱柱,从而快速获得高纯度重组表达蛋白。
发明内容:
本发明的目的是提出一种快速高效,而且为定向克隆的基于钙调蛋白性质的蛋白纯化方法。具体技术方案如下:
一种基于钙调蛋白性质的蛋白纯化方法,过程如下:
步骤一:将多肽链CBD固定在色谱柱填料上成为CBD色谱柱;多肽链CBD是能与钙调蛋白特异性结合的多肽;
步骤二:将目的蛋白以LIC克隆方法克隆到HCT表达载体中,转化表达蛋白,采用超生破碎法破菌取上清,获得可溶蛋白溶液;
步骤三:将所得蛋白溶液用CBD色谱柱纯化;
步骤四:然后用疏水色谱柱进一步纯化,继而用TEV酶进行酶切;
步骤五:最后用Talon柱除去标签和TEV酶。
优选方案,该多肽链CBD为家兔鱼尼丁受体中能与钙调蛋白特异性结合的区域。
所述步骤二可以包括如下过程:
将HCT-GFP质粒转化到BL21(DE3)细胞中,2YT培养基(含50μg/mL卡那霉素)37℃培养到OD到达约0.6,0.4mM IPTG 30℃诱导培养6小时;离心收集250ml表达蛋白的细菌培养物,8000g离心10min;加入40ml Lysis buffer重悬,冰浴下超声破碎;40,000g离心30分钟,弃沉淀,取上清;所述Lysis buffer包括:10mM HEPES pH 7.4,250mM KCl,25mg/ml DNA酶,25mg/ml溶菌酶,1mM PMSF,5mM CaCl2。
所述步骤三可以包括如下过程:
预先将多肽链CBD固定在色谱柱上,用5倍柱体积CBD柱Buffer A进行平衡;以1-2ml/min的流速上样于预先平衡好的CBD色谱柱;然后用2倍柱体积CBD柱Buffer C将色谱柱上的残留样品洗去;用5倍柱体积CBD柱Buffer B洗脱,收集洗脱样品;所得样品用2L透析BufferA进行4h透析,除去所含EDTA,透析过后加入10mM CaCl2;所述CBD柱Buffer A包括:10mM HEPES pH7.4,250mM KCl,5mM CaCl2;所述CBD柱Buffer B包括:10mM HEPES pH7.4,250mM KCl,5mM EDTA;所述CBD柱Buffer C包括:10mM HEPES pH7.4,250mM KCl。
所述步骤四可以包括如下过程:
用5倍柱体积疏水柱Buffer A平衡疏水色谱柱;以1-2ml/min的流速上样于预先平衡好的色谱柱;用2倍柱体积疏水柱Buffer C将色谱柱上的残留样品洗去;用5倍柱体积疏水柱Buffer B洗脱,收集洗脱样品;所得样品用2L透析BufferB进行透析(除去所含EDTA)并用TEV酶进行酶切;所述疏水柱Buffer A包括:10mM HEPES pH7.4,150mM KCl,10mM CaCl2;所述疏水柱Buffer B包括:10mM HEPES pH7.4,75mM KCl,10mM EDTA;所述疏水柱Buffer C包括:10mM HEPES pH7.4,150mM KCl。
所述步骤五可以包括如下过程:
用5倍柱体积Talon柱Buffer A平衡色谱柱;以1-2ml/min的流速上样于预先平衡好的色谱柱;用5倍柱体积Talon柱Buffer B洗脱,收集未与色谱柱结合的样品;所述Talon柱Buffer A包括:10mMHEPES pH7.4,250mM KCl;
所述Talon柱Buffer B包括:10mM HEPES pH7.4,250mM KCl,150mM咪唑。
本发明相对于现有技术的有点在于:
本发明利用钙调蛋白性质,寻找一段能与其特异性结合的多肽链CBD,(SRYALLMRAFTMSAAETARRTREFR),该多肽链为家兔鱼尼丁受体中能与钙调蛋白特异性结合的区域,并将其固定在色谱柱填料上形成CBD柱。钙调蛋白在与Ca2+结合后能与该多肽链特异性结合,在EDTA条件下,钙调蛋白与该多肽链分离。且在Ca2+与钙调蛋白结合后,钙调蛋白可与疏水色谱柱特异性结合,在EDTA条件下,钙调蛋白与色谱柱填料分离。利用两步特异性结合,可以得到高纯度带有钙调蛋白标签的目的蛋白。该发明设计一种新型pET基因表达载体*(HCT),该表达载体含有组氨酸标签HIS、钙调蛋白标签CaM、TEV酶切位点,且该表达载体可以采用LIC(Ligation-Independentcloning)克隆方法,该方法非常快速高效,而且为定向克隆。TEV酶可在TEV酶切位点将组氨酸标签、钙调蛋白标签与目的蛋白切开,得到纯净的目的蛋白。
附图说明:
图1为CBD柱色谱图;图中,横坐标代表色谱柱洗脱体积,单位为ml,左侧纵坐标代表280nm处紫外吸收,单位为mAU,右侧纵坐标代表所含Buffer B百分比,单位为1。
图2为疏水柱色谱图;图中,横坐标代表色谱柱洗脱体积,单位为ml,左侧纵坐标代表280nm处紫外吸收,单位为mAU,右侧纵坐标代表所含Buffer B百分比,单位为1。
图3为Talon柱色谱图;图中,横坐标代表色谱柱洗脱体积,单位为ml,左侧纵坐标代表280nm处紫外吸收,单位为mAU,右侧纵坐标代表所含Buffer B百分比,单位为1。
图4为纯化过程SDS-PAGE;泳道1:细胞裂解液;泳道2:CBD柱未挂柱组分;泳道3:CBD柱洗脱组分(目的蛋白);泳道4:疏水色谱柱未挂柱组分;泳道5:疏水色谱柱洗脱组分(目的蛋白);泳道6:TEV酶切后;泳道7:Talon柱未挂柱组分(目的蛋白);泳道8:Talon柱洗脱组分。
具体实施方式:
实施例:
将绿色荧光蛋白(GFP)将目的蛋白以LIC克隆方法克隆到HCT表达载体中。用大肠杆菌进行蛋白表达。
实验中使用试剂及缓冲液的配制:
Lysis buffer:10mM HEPES pH 7.4,250mM KCl,25mg/ml DNA酶,25mg/ml溶菌酶,1mM PMSF,5mM CaCl2
CBD柱Buffer A:10mM HEPES pH7.4,250mM KCl,5mM CaCl2;Buffer B:10mMHEPES pH7.4,250mM KCl,5mM EDTA;Buffer C:10mM HEPES pH7.4,250mM KCl;
疏水柱Buffer A:10mM HEPES pH7.4,150mM KCl,10mM CaCl2;Buffer B:10mMHEPES pH7.4,75mM KCl,10mM EDTA;Buffer C:10mM HEPES pH7.4,150mM KCl;
Talon柱Buffer A:10mM HEPES pH7.4,250mM KCl;Buffer B:10mM HEPES pH7.4,250mM KCl,150mM咪唑
透析Buffer A:10mM HEPES pH7.4,150mM KCl;
透析Buffer B:10mM HEPES pH7.4,250mM KCl;
实验方法
(一)样品准备
将HCT-GFP质粒转化到BL21(DE3)细胞中,2YT培养基(含50μg/mL卡那霉素)37℃培养到OD到达约0.6,0.4mM IPTG 30℃诱导培养6小时;离心收集250ml表达蛋白的细菌培养物,8000g离心10min;加入40ml Lysis buffer重悬,冰浴下超声破碎;40,000g离心30分钟,弃沉淀,取上清。
(二)CBD色谱柱
预先将多肽链CBD固定在色谱柱上,用5倍柱体积CBD柱Buffer A进行平衡;以1-2ml/min的流速上样于预先平衡好的CBD色谱柱;然后用2倍柱体积CBD柱Buffer C将色谱柱上的残留样品洗去;用5倍柱体积CBD柱Buffer B洗脱,收集洗脱样品;所得样品用2L透析BufferA进行4h透析,除去所含EDTA,透析过后加入10mM CaCl2
(三)疏水色谱柱
用5倍柱体积疏水柱Buffer A平衡疏水色谱柱;以1-2ml/min的流速上样于预先平衡好的色谱柱;用2倍柱体积疏水柱Buffer C将色谱柱上的残留样品洗去;用5倍柱体积疏水柱Buffer B洗脱,收集洗脱样品;所得样品用2L透析BufferB进行透析,除去所含EDTA,并用TEV酶进行酶切。
(四)Talon色谱柱
用5倍柱体积Talon柱Buffer A平衡色谱柱;以1-2ml/min的流速上样于预先平衡好的色谱柱;用5倍柱体积Talon柱Buffer B洗脱,收集未与色谱柱结合的样品。
SDS-PAGE:
安装玻璃板,按照表中数值配置15%w/v的分离胶溶液和4%积层胶溶液,并分别灌注:
上样:将各步骤样品留样,各取20μl样品与5μl 5×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液混匀,上样于聚丙烯酰胺凝胶电泳分离。
170V恒压电泳约40min,凝胶进行考马斯亮蓝染色约30min,脱色8h.,进行观察分析。
GFP(绿色荧光蛋白)产率及活性检测
将每一纯化步骤所得样品用NANODROP ONEC(Thermoscientific)测量浓度,A280法测量;
GFP蛋白活性用FLS980(Edinburgh instruments)测量其荧光,激发波长474nm,发射波长506nm.;
GFP蛋白质含量及活性检测结果:
SDS-PAGE结果表明所得目的蛋白纯度可达99%。
Claims (2)
1.一种基于钙调蛋白性质的蛋白纯化方法,其特征在于,过程如下:
步骤一:将多肽链CBD固定在色谱柱填料上成为CBD色谱柱;多肽链CBD是能与钙调蛋白特异性结合的多肽,该多肽链CBD为家兔鱼尼丁受体中能与钙调蛋白特异性结合的区域并且氨基酸序列为SRYALLMRAFTMSAAETARRTREFR;
步骤二:将目的蛋白以LIC克隆方法克隆到HCT表达载体中,转化表达蛋白,采用超声破碎法破菌取上清,获得可溶蛋白溶液;
步骤三:将所得蛋白溶液用CBD色谱柱纯化;
步骤四:然后用疏水色谱柱进一步纯化,继而用TEV酶进行酶切;
步骤五:最后用Talon柱除去标签和TEV酶;
所述步骤三包括如下过程:
预先将多肽链CBD固定在色谱柱上, 用5倍柱体积CBD柱Buffer A进行平衡;
以1-2 ml/min的流速上样于预先平衡好的CBD色谱柱;
然后用2倍柱体积CBD柱Buffer C 将色谱柱上的残留样品洗去;
用5倍柱体积CBD柱Buffer B 洗脱,收集洗脱样品;
所得样品用2L透析Buffer A进行4h透析,除去所含EDTA,透析过后加入10mM CaCl2;
所述CBD柱Buffer A包括:10mM HEPES pH7.4,250mM KCl,5mM CaCl2;
所述CBD柱Buffer B包括:10mM HEPES pH7.4,75mM KCl, 10mM EDTA;
所述CBD柱Buffer C包括:10mM HEPES pH7.4,150mM KCl;
所述透析Buffer A为10mM HEPES pH7.4,150mM KCl;
所述步骤四包括如下过程:
用5倍柱体积疏水柱Buffer A平衡疏水色谱柱;
以1-2 ml/min的流速上样于预先平衡好的色谱柱;
用2倍柱体积疏水柱Buffer C 将色谱柱上的残留样品洗去;
用5倍柱体积疏水柱Buffer B 洗脱,收集洗脱样品;
所得样品用2L透析Buffer B进行透析并用TEV酶进行酶切;
所述疏水柱Buffer A包括:10mM HEPES pH7.4,150mM KCl,10mM CaCl2;
所述疏水柱Buffer B包括:10mM HEPES pH7.4,75mM KCl, 10mM EDTA;
所述疏水柱Buffer C包括:10mM HEPES pH7.4,150mM KCl;
所述透析Buffer B为10mM HEPES pH7.4,250mM KCl;
所述步骤五包括如下过程:
用5倍柱体积Talon柱Buffer A平衡色谱柱;
以1-2 ml/min的流速上样于预先平衡好的色谱柱;
用5倍柱体积Talon柱Buffer B 洗脱,收集未与色谱柱结合的样品;
所述Talon柱Buffer A包括:10mM HEPES pH7.4,250mM KCl;
所述Talon柱Buffer B包括:10mM HEPES pH7.4,250mM KCl,150mM 咪唑。
2.根据权利要求1所述一种基于钙调蛋白性质的蛋白纯化方法,其特征在于,所述步骤二包括如下过程:
将HCT-GFP质粒转化到BL21(DE3)细胞中,在含50 µg/mL卡那霉素的2YT培养基37°C培养到OD到达约0.6,0.4mM IPTG 30°C诱导培养6小时;
离心收集250ml表达蛋白的细菌培养物,8000g离心10min;
加入40ml Lysis buffer重悬,冰浴下超声破碎;
40,000g离心30分钟,弃沉淀,取上清;
所述Lysis buffer包括:10mM HEPES pH 7.4, 250 mM KCl,25 mg/ml DNA酶, 25 mg/ml溶菌酶 , 1 mM PMSF,5mM CaCl2。
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A New Versatile Immobilization Tag Based on the Ultra High Affinity and Reversibility of the Calmodulin–Calmodulin Binding Peptide Interaction;Mukherjee等;《Journal of Molecular Biology》;20150814;第427卷(第16期);第2719页左栏第2段 * |
The Carboxy-Terminal Calcium Binding Sites of Calmodulin Control Calmodulin’s Switch from an Activator to an Inhibitor of RYR1;Rodney等;《Biochemistry》;20010921(第40期);第12430页摘要 * |
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