JP7105761B2 - ガレクチンのｃｒｄのレクチン活性に基づく組換えタンパク質のアフィニティー精製のための方法 - Google Patents

Description

本発明は、ガレクチンのレクチンドメイン、好ましくはＣＲＤドメイン（炭水化物認識ドメイン）の全部または一部のレクチン活性に基づく親和性による、関連する組換えタンパク質の単一ステップ精製のための新規な方法に関する。

本発明は主に、公的および私的研究室に、ならびにまた基礎的研究の目的で、または治療的利益のために組換えタンパク質を生産する必要性がある医薬産業に適用可能である。

以下の記載において、角括弧（［］）の間の参考文献は、本文の末尾に提示する参考文献のリストを指す。

低コストで、多くの生命科学適用において不可欠である関連する純粋なタンパク質を製造するために、大量の関連する組換えタンパク質を宿主中で製造し、下流の処理ステップを単純化することが、必須である。

関連する組換えタンパク質を天然に（融合パートナー、すなわちタグなしで）精製するための多くの方法があるが、このタイプの精製は、依然として複雑であり、低い収率および時には不完全な純度を伴う。

したがって、タグに融合した組換えタンパク質の発現および精製のための方法が、提案されている。一般的に使用されるタグの中には、ヒスチジンタグ（少なくとも６つのヒスチジンから構成される）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）およびグルタチオンＳ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）があり、後者の２種は、タンパク質である。

ヒスチジンタグは、ＩＭＡＣ（固定化金属アフィニティー）技術の文脈において使用される。この方法は、イミダゾール環の、樹脂上に固定化された２価の金属イオン（主にニッケル）との相互作用を介して、ヒスチジンタグに融合した組換えタンパク質を精製することにある。融合タンパク質を、次にイミダゾールの溶液で溶出する。しかしながら、その低い特異性のために、この精製方法によって、汚染物質の同時精製が系統的にもたらされ、その後の追加のステップが必要である。加えて、第１に、ニッケルはアレルゲン性であり、胎児毒性であり、かつ環境に有害であり、第２に、イミダゾールもまた、胎児毒性かつ生殖毒性の化合物である。したがって、微量のニッケルおよびイミダゾールのＩＭＡＣによって精製された組換えタンパク質の溶液中での可能な存在によって、ｉｎ ｖｉｔｒｏ／ｉｎ ｖｉｖｏ適用のためのその使用が制限される。さらに、金属イオンに基づくプロセスによって、精製されたタンパク質のいくつかの残基の修飾がこのようにしてもたらされ得る［１、２］。

ＭＢＰおよびＧＳＴについて、それらを使用して、組換えタンパク質をそれぞれアミロースまたはグルタチオンに対する親和性によって精製する。ＭＢＰの分子量に起因する立体障害のために、融合タンパク質は切断するのが困難であり、それによって精製した組換えタンパク質の最終的な製造収率が低下し得る。ＧＳＴについて、それは、グルタチオンセファロース樹脂に対する低い親和性を有する［３、４］。

レクチンをタグとして使用することに基づいて、樹脂上でのアフィニティークロマトグラフィーによる容易かつ効果的な精製を低コストで可能にする関連するタンパク質を発現するための他の方法が、開発されている。レクチンの利点は、それらが特定の多糖類に特異的かつ可逆的に結合することである。実際、それらのアミノ酸配列、それらの三次元構造およびまた糖結合部位の性質によって異なるいくつかのクラスのレクチンがある。したがって、関連するタンパク質を発現させ、精製するための方法は、レクチン、例えばセファロース４Ｂからなるクロマトグラフィーカラム上のアメーバ［６］から生じるキノコレクチンＬＳＬ［５］またはディスコイジンに基づいて開発されている。しかし、これらの方法において、グラフトしていない樹脂の使用によって樹脂への非特異的結合の危険性がもたらされ、したがって細菌タンパク質による汚染がもたらされる。

緑膿菌からのＬｅｃＢレクチンによって認識されるマンノースをグラフトした樹脂を用いて関連するタンパク質を精製する方法もまた、公知である［７］。しかしながら、マンノースは、複雑かつ費用がかかる合成を伴う糖である。

関連するタンパク質を、ラット肝臓レクチンのレクチンドメインおよび関連する分子を含み、当該２つの間に挿入されたプロテアーゼによる切断のための部位を有する融合タンパク質を用いて精製する２段階法もまた、知られている［１３］。それは、カチオンキレート剤の存在下で機能する欠点を有し、それによって関連するタンパク質の生物学的活性が阻害され得る。

先行技術のプロセスの欠点を克服する、関連するタンパク質を発現させ、精製するための方法についての必要性がある。

本発明者らによって提案された解決策は、これまでの不溶性タンパク質（封入体の形態において産生される）を、その溶解度を改善することによって発現させ、関連するタンパク質をアフィニティーによって精製するために、大部分のタンパク質の活性を改変および／または損傷しない利点を有する。

本発明者らは、したがって、組換えタンパク質を単一ステップにおいて、高い特異性および高い収率を伴って精製することを可能にする新規な方法を開発した。本発明の前記方法は、ラクトースに結合する能力を保持するガレクチンのレクチンドメインまたは前記ドメインの一部、例えばガレクチンのＣＲＤ_ＳＡＴドメイン、例えばヒトガレクチン－３を、関連するタンパク質の融合パートナーとして使用する。このレクチンタグによって、したがって、ラクトース分子でグラフトしたセファロース樹脂を使用して、単一のアフィニティークロマトグラフィーステップにおける関連するタンパク質の精製が可能になる。

本発明の主題は、したがって、ＴＥＶプロテアーゼによる切断のための部位を含む配列を介して関連するタンパク質と融合したガレクチンのレクチンドメインの全部または一部を含む融合タンパク質である（２つの可能な切断の選択肢；図７を参照）。

本発明の目的のために、「レクチンドメインまたはＧＬＥＣＴドメイン」は、β－ガラクトシル誘導体、例えばラクトースおよびその誘導体に結合するガレクチンのドメインを意味することを意図し、その活性は、２価のカチオンに依存しない。ＧＬＥＣＴ保存ドメインについてのＮＣＢＩ保存ドメインデータベースにおけるアクセス番号は、ｃｄ０００７０である。

本発明の特定の実施形態によれば、使用するレクチンドメインの部分は、ラクトースに結合し；好ましくは、これは、ガレクチンのＣＲＤドメインであり、最も好ましくは、それは、例えば配列、配列番号：１を含むかまたはそれからなるガレクチンのＣＲＤ_ＳＡＴドメインである

ＣＲＤ_ＳＡＴドメインは、高度に保存されたドメイン（哺乳動物の中で約８３～９９％の配列相同性）である（図９を参照）。それは、β－ガラクトシド、例えばラクトースおよびその誘導体に特異的に結合することができるＧＬＥＣＴ（ガラクトース結合ＬＥＣＴｉｎ）ドメインスーパーファミリーに属する。

本発明の別の主題は、融合タンパク質のための発現ベクターであり、前記ベクターは、以下の機能的に連結された要素を含む：
ａ）以下に記載する要素ｂ）、ｃ）およびｄ）およびｅ）の５’に配置されたプロモーター；
ｂ）ガレクチンのレクチンドメインの全部または一部をコードする配列；
ｃ）ＴＥＶによる切断のための部位を含むスペーサーアームをコードする配列；
ｄ）関連するタンパク質をコードする配列を受けるクローニング部位；
ｅ）転写終了シグナル。

本発明の目的のために、「プロモーター」は、ポリペプチドをコードする配列の転写開始部位の５’に位置し、それにＲＮＡポリメラーゼのＤＮＡ配列が結合し、正確な転写を開始することができ、任意にアクチベーターを含むシス作用性ＤＮＡ配列を意味することを意図する。

本発明の発現ベクターにおいて、ガレクチンのレクチンドメインの全部または一部に対応する配列は、例えばクローニング部位の近傍、上流およびプロモーターの下流に位置する。代替法は、前記配列を近傍に、クローニング部位の後に配置することである。両方の場合において、前記配列の関連する分子の配列との融合によって、樹脂上での精製が可能になる。好ましくは、配列ｂ）は、ラクトースに結合するレクチンドメインの一部をコードし、ガレクチンのＣＲＤ_ＳＡＴドメインを優先的にコードし、配列番号：１を含むＣＲＤ_ＳＡＴドメインを最も優先的にコードする。

本発明の特定の実施形態によれば、プロテアーゼによる切断についての部位は、ＴＥＶプロテアーゼによって認識される。

本発明の特定の実施形態によれば、発現ベクターは、ｐＥＴプラスミドから誘導されるｐＣＡＲＧＨＯ（人類からのガレクチン－３の炭水化物認識ドメインを表す）発現ベクターである。

本発明の別の主題は、関連する精製したタンパク質を製造する方法であって、前記方法が以下のステップ：
ａ）本発明の発現ベクターを調製するステップ；
ｂ）宿主細胞を前記発現ベクターで形質転換するステップ；
ｃ）前記形質転換した宿主細胞を、ガレクチンのレクチンドメインの全部または一部のアミノ酸配列および関連するタンパク質のアミノ酸配列を含む融合タンパク質の発現および翻訳を可能にする条件下で培養し、ガレクチンのレクチンドメインの全部または一部のアミノ酸配列が宿主細胞における関連するタンパク質の溶解を促進するステップ；
ｄ）関連するタンパク質を宿主細胞または培養培地から単離するステップ
を含む、前記方法である。

本発明の方法において、単離または精製ステップｄ）を、例えば、融合タンパク質を、ガレクチンのレクチンドメインまたは前記ドメインの一部を介して、ラクトース分子でグラフトしたクロマトグラフィー担体に、好ましくはラクトース分子でグラフトしたアガロースまたはセファロース樹脂に結合し、次いで（ｉ）プロテアーゼによって切断して、ガレクチンのレクチンドメインまたは前記ドメインの一部を除去し（すなわち配列タグ）、関連する分子およびプロテアーゼを溶出および分離し、または（ｉｉ）融合タンパク質を溶出し、溶液中のプロテアーゼにより切断し、ならびに関連するタンパク質およびプロテアーゼを分離することによって実施する。

本発明の特定の実施形態によれば、プロテアーゼおよび関連するタンパク質の分離のステップを、イオン交換クロマトグラフィーまたはサイズ排除クロマトグラフィーまたは疎水性相互作用クロマトグラフィーによって行う。

本発明の別の主題は、関連する分子を精製する方法であり、前記方法は、以下のステップを含む：
選択肢番号１：
ａ）本発明の融合タンパク質を、ラクトース分子をグラフトしたクロマトグラフィー担体、好ましくはラクトース分子をグラフトしたセファロースまたはアガロース樹脂のカラムに結合するステップ；
ｂ）プロテアーゼによる融合タンパク質の特定の切断部位での切断のステップ；
ｃ）関連する精製した分子の溶出のステップ；
ｄ）プロテアーゼの、このようにして精製した関連するタンパク質からの分離のステップ。

本発明の特定の実施形態によれば、ステップｄ）を、イオン交換クロマトグラフィーまたはサイズ排除クロマトグラフィーまたは疎水性相互作用クロマトグラフィーによって行う。

レクチンドメインまたは前記ドメインの一部（すなわちタグ）を、ラクトース溶液との競合による溶出によってカラムから除去し、カラムを再生させる。

選択肢番号２：
ａ）本発明の融合タンパク質を、ラクトース分子をグラフトしたクロマトグラフィー担体、好ましくはラクトース分子をグラフトしたセファロースまたはアガロース樹脂のカラムに結合するステップ；
ｂ）ラクトース溶液との競合による融合タンパク質の溶出のステップ；
ｃ）溶液中の融合タンパク質の特定の部位でのプロテアーゼによる切断のステップ；
ｄ）レクチンドメインまたは前記ドメインの一部（すなわちタグ）およびＴＥＶプロテアーゼの、このようにして精製した関連する分子からの分離のステップ。

本発明の特定の実施形態によれば、ステップｄ）を、イオン交換クロマトグラフィーまたはサイズ排除クロマトグラフィーによって行う。

本発明の方法は、いかなる毒性、発がん性または催奇形性化合物をも使用しないという利点を有する。さらに、ガレクチン－３のＣＲＤドメインのレクチン活性は、すべての他の精製方法よりもはるかに特異的であり、９５％より高い純度を得るために単一のステップのみを必要とする。さらに、融合タンパク質の溶出についての条件は、タグをＴＥＶプロテアーゼによって切断するのに最適である。許容される還元剤には、制限はない。ＣＲＤタグ、特にＣＲＤ_ＳＡＴは、極めて低い分子量（１７．３ｋＤａ、ＴＥＶプロテアーゼによる切断後に得られる形態については１８．８ｋＤａ）を有し、それによって、サイズ排除クロマトグラフィーによるその容易な除去が可能になる。さらに、それは、主にβシートから構成され、極めて高い程度の安定性を付与する。最後に、その等電点は、高度に塩基性であり（ｐＩ＝９．３、ＴＥＶプロテアーゼによる切断後に得られる形態についてｐＩ＝８．７）、陽イオン交換カラム上でのその容易な捕捉が可能になる。等電点がまた塩基性である（ｐＩ＝８．８）ＣＲＤおよびＴＥＶプロテアーゼを、それらを陽イオン交換カラム上に結合することによって一緒に除去することが、可能である。関連するタンパク質は、次いで樹脂によって保持されない画分中に純粋に溶出する（図１０）。

本発明の別の主題は、ガレクチンから誘導されたＣＲＤ_ＳＡＴ融合パートナー（またはタグ）である。好ましくは、ＣＲＤ_ＳＡＴドメインのアミノ酸配列は、配列、配列番号：１を含み、ここで３６位におけるアミノ酸は、アルギニンまたはリジン、最も好ましくはリジンであり得、かつ／またはここで１５２位におけるアミノ酸は、アラニンまたはトレオニン、最も好ましくはトレオニンであり得る。ＣＲＤ融合パートナーはまた、現在まで尿素または塩化グアニジウムにおける封入体の長く、退屈な再生の後に得られる、不溶性として記載されているタンパク質を可溶化する特性を有する；例えば、ヒト膜受容体ＴＲＥＭ－１およびより特定的にはその細胞外ドメイン［１４～１５］。

図１は、ｐＣＡＲＧＨＯベクターの円形の、および直線状の図式を示す。 図２は、ｐＣＡＲＧＨＯベクター（配列番号：２および３）の主な特徴を示す。 図３は、ヒトガレクチン－３の図式的構造を示す。 図４は、ヒトガレクチン－３および設計された３種のＣＲＤのタンパク質配列（配列番号：４）を示す。 図５は、ラクトースと相互作用するガレクチン－３のレクチンＣＲＤドメインの３Ｄ構造を示す。 図６は、ラクトースアフィニティークロマトグラフィーによるヒトガレクチン－３の精製をモニタリングすることを示す。 図７は、ラクトースアフィニティーによる本発明の精製方法の図式を示す。 図８は、ラクトースアフィニティークロマトグラフィーによる３種の形態の短縮されたヒトガレクチン－３の精製をモニタリングすることを示す。ＣＲＤ_{ＬＩＴＩＬ}（Ａ）、ＣＲＤ_{ＧＧＶＶＰ}（Ｂ）およびＣＲＤ_ＳＡＴ（Ｃ）は、大腸菌ロゼッタ２（ＤＥ３）細菌において発現した。細菌を溶解し、精製試験をラクトース－アガロースカラム上で実施した。各精製ステップで、試料を採取して、アクリルアミドゲル（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）上で泳動させた。電気泳動移動後、ゲルを、クーマシーブリリアントブルーで染色した。ＳＳＯ：ラクトースアフィニティーカラムに通じる前の細菌抽出物の上清。ＣＳＯ：ラクトースアフィニティーカラムに通じる前の細菌抽出物のペレット。ＳＰＲ：ラクトースアフィニティーカラムを通過した後の上清。Ｅ：溶出画分。＜－－－：関連するタンパク質の位置。 図９は、異なる哺乳動物におけるガレクチン－３のＣＲＤ_ＳＡＴドメインのアミノ酸配列アラインメント、および前記ＣＲＤ_ＳＡＴドメインのコンセンサス配列を示す。 図１０は、本発明の処理によるラクトースアフィニティークロマトグラフィーによる細菌性チオレドキシン（Ｔｒｘ１）の精製のモニタリングを示す。 図１１は、本発明の処理によるラクトースアフィニティークロマトグラフィーによる細胞外ドメインＴＲＥＭ－１、残基２１～１３６の精製のモニタリングを示す。

実施例１：短縮されたヒトガレクチン－３の最適な形態の研究：ラクトースアフィニティークロマトグラフィーによる３種の短縮された形態の精製のモニタリング
ガレクチン－３
ガレクチン－３は、種に依存する２４３～２８６アミノ酸の動物レクチンである（Ｃｏｏｐｅｒ，Ｂｉｏｃｈｉｍ．＆Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１５７２（２－３））：２０９－２３１，２００２）［８］。それは、約３０ｋＤａであり、小さいＮ末端ドメイン、側鎖およびＣ末端レクチンドメイン（ＣＲＤ：炭水化物認識ドメイン）から構成される（図３および４）（Ｌｅｆｆｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊ．Ｊ．，１９：４３３－４４０，２００４；Ｏｃｈｉｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．＆Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１３７９：９７－１０６，１９９８）［９、１０］。数種のベータシートから形成して（Ｓａｌｏｍｏｎｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８５：３５０７９－３５０９１，２０１０；Ｓｅｅｔｈａｒａｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７３：１３０４７－１３０５２，１９９８）［１１、１２］、レクチンドメインによって、タンパク質がβ－ガラクトシド残基を含む分子、例えばラクトースと相互作用することが可能になる（図５）。

そのレクチン特性を考慮して、ガレクチン－３を、単一ステップにおいて、前に記載したプロトコルに従って、ラクトース分子でグラフトしたアガロース樹脂を用いるアフィニティークロマトグラフィーによって特異的に精製することができた（図６）。

この目的のために、ガレクチン－３（全形態）を、大腸菌Ｃ４１（ＤＥ３）細菌中で発現させ、次いでラクトース－アガロースカラム上で精製した。各精製ステップで、試料を採取して、アクリルアミドゲル（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）上で泳動させた。電気泳動的移動の後、ゲルを、クーマシーブリリアントブルーで染色した。Ａ：ラクトースアフィニティーカラムに通じる前の細菌抽出物。Ｂ：ラクトースアフィニティーカラムを通過した後の細菌抽出物。ＣおよびＤ：カラム洗浄。Ｅ：ガレクチン－３の溶出画分；ＰＢＳ＋ラクトース １５０ｍＭの溶液での溶出。

結果を、図６に提示する。

この精製を行うことの容易さ、およびまた得られる高い程度の純度によって、本発明者らは、ラクトースアフィニティークロマトグラフィーによる組換えタンパク質の精製を意図した融合パートナー（タグ）を開発するアイデアを指摘された。当該アイデアは、この融合パートナーを構成し、このパートナーがＴＥＶプロテアーゼによって切断され得る単一ステップにおける精製を可能にするために、ラクトースに結合することができるガレクチン－３（ＣＲＤ）のレクチンドメインの一部を使用することであった（図７）。

短縮されたガレクチン－３の最適な形態の研究
ＣＲＤ_ＳＡＴをコードする最適化されたヌクレオチド配列の作製およびｐＥＴ－２０ｂタイプの発現ベクター中への組み込み
ヒトガレクチン－３のヌクレオチド配列から出発して、３種の異なるＣＲＤタンパク質をコードする３種のＣＲＤ配列を、クローニングした：ＣＲＤ_{ＬＩＴＩＬ}（１４ｋＤａ）、ＣＲＤ_{ＧＧＶＶＰ}（１５ｋＤａ）およびＣＲＤ_ＳＡＴ（約１７ｋＤａ、天然形態、非合成的、最適化していない）（図４）。

それから、３種のＣＲＤが発現されるが、様々な可溶性を有することが明らかになる。したがって、ＣＲＤ_{ＬＩＴＩＬ}（Ａ）は、完全に不溶性の形態（ペレット）にあり、溶出液中には位置しておらず、したがって精製することは不可能であった。ＣＲＤ_{ＧＧＶＶＰ}（Ｂ）は、少量において、部分的に可溶性の形態において生成したが、そのレクチン機能を失い、したがって精製することができなかった。ＣＲＤ_ＳＡＴ（Ｃ）は、完全に可溶性の形態において生成し、精製することができた（溶出液中に位置していた）（図８）。

実施した種々の試験を考慮して、ＣＲＤ_ＳＡＴを選択して、所望の融合パートナーを構成した。ｉｎ ｓｉｌｉｃｏで測定したこのタンパク質の物理化学的特性は、以下の通りである：

（配列番号１、天然形態）
アミノ酸の数：１５６
分子量：１７ ３６０．９Ｄａ
等電点：９．３０
負に荷電したアミノ酸（Ａｓｐ＋Ｇｌｕ）の総数：１３
正に荷電したアミノ酸（Ａｒｇ＋Ｌｙｓ）の総数：１７
モル吸光係数：１２ ９５０Ｍ^－１ｃｍ^－１（２８０ｎｍで）
Ａｂｓ ０．１％（＝１ｇ／ｌ） ０．７４６、ただしすべてのシステインは、還元された形態にある。

ＣＲＤ_ＳＡＴをコードする配列を、大腸菌におけるこの異種タンパク質の発現を促進し（コドンバイアスの除去）、その溶解度（アルギニン３６のリジンでの置換）、およびまた嵩を増加させることによってその剛性が増加するのを可能にするために（アルギニン１５２のトレオニンでの置換）、ｉｎ ｓｉｌｉｃｏで最適化し、それによってプロテアーゼが下流の１４個のアミノ酸を切断することが可能になった。

この最適化されたＣＲＤ_ＳＡＴ配列を、ｐＥＴ－２０ｂタイプの発現ベクター：ｐＣＡＲＧＨＯベクター中に、実施例３に従って関連するタンパク質の発現および精製を可能にするために組み込んだ（図２）。

実施例２：ｐＣＡＲＧＨＯ：材料および方法
ｐＣＡＲＧＨＯプラスミドによって、順序正しく：ヒトガレクチン－３からのＣＲＤ_ＳＡＴ、フレキシビリティーを可能にするスペーサーアーム、ＴＥＶプロテアーゼによる切断のための部位および関連するタンパク質からなる融合タンパク質の産生が可能になる。

使用する大腸菌株は、（ＤＥ３）タイプでなければならず、すなわちそのゲノム中に組み込まれたＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を有さなければならない。

ｐＣＡＲＧＨＯプラスミドは、ＮｏｖａｇｅｎからのｐＥＴ２０ｂ（＋）から誘導され、以下の要素を含む（図１）：

ｐＣＡＲＧＨＯベクターの主な特徴を、図２に示す（配列番号：２および３）。

ｐＣＡＲＧＨＯプラスミドにおけるクローニング
以下のプロトコルは、ｐＣＡＲＧＨＯベクターにおける関連するタンパク質のＰＣＲフラグメントのクローニングの例である。いくつかの実験（酵素消化、連結反応、細菌形質転換）について、特に使用する試薬の供給業者を参照するべきである。

使用するＰＣＲフラグメントは、Ｎｃｏｌ制限部位をその５’末端に、ならびに別のＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩ、ＳａｃＩ、ＳａｌＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＮｏｔＩおよびＸｈｏＩ制限部位をその３’末端に含まなければならない。末端は、平滑であるか、または３’アデノシンによって伸長され得る。ＰＣＲフラグメントの組成によって読み枠が開始コドンＡＴＧから従うことが保証されることを、確実にしなければならない。

１）１μｇのｐＣＡＲＧＨＯプラスミドおよび１μｇのＰＣＲフラグメントを、並行して、２０μｌの１Ｘ消化緩衝液（１０×ストック）中で、選択した１０単位のＮｃｏＩおよび１０単位の第２のエンドヌクレアーゼ（ＭＣＳにおいて利用可能な部位に依存して）で、３７℃で１時間～２時間消化する。酵素を、次いで６５℃で１０分間不活性化する。
２）アガロースゲル（５μｌ）上での移動後のプラスミドの完全な消化を立証する。
３）ＭＣＳ断片をプラスミドから、および遊離末端をＰＣＲ断片から除去することを目的として、消化したＰＣＲ断片およびプラスミドを精製する。精製を、ゲル上で、および／または特定のキットを用いて行ってもよい。
４）プラスミドおよびＰＣＲ断片（挿入断片）をアッセイする。
５）以下の連結混合物を調製する：
３０～５０ｎｇの消化プラスミド
１μｌの保存連結緩衝液１０×中の５０ｎｇの挿入断片
１μｌのＴ４ ＤＮＡリガーゼ
Ｈ_２Ｏ 加えて１０μｌ
６）室温で１０分～２時間または１６℃で１６時間インキュベートする。
７）コンピテントクローニング細菌（ＴＯＰ１０、ＤＨ５αタイプ）を形質転換する：２μｌの連結反応液を採取し、５０μｌの細菌を加える。氷中で３０分間インキュベートする。４２℃に１分間加熱する。
８）２００μｌのＳＯＣ（またはＬＢ）培地を添加し、３７℃で２０分～１時間インキュベートする。選択的寒天（ＬＢ寒天、１００μｇ／ｍｌのアンピシリン）上に拡散させる。３７℃で一晩インキュベートする。
９）当該分野において周知の方法、例えば直接コロニー上のＰＣＲ、プラスミドＤＮＡの少量調製、好適な制限酵素による消化およびアガロースゲル上での移動、融合タンパク質の過剰発現の試験により、陽性クローンの存在を探索する（プラスミド中の挿入断片の存在を立証する）。
１０）分子クローニングを検証するために、クローンから抽出したプラスミドを陽性であると仮定して配列決定する。

融合タンパク質「ＣＲＤ_ＳＡＴ－関連するタンパク質」の発現
融合タンパク質の発現の試験
１）コンピテント発現細菌［ＢＬ２１（ＤＥ３）タイプ］を、ｐＣＡＲＧＨＯ－Ｘベクター（Ｘは、ＣＲＤ_ＳＡＴタグに融合した関連するタンパク質をコードする配列である）で形質転換する。
２）５ｍｌのＬＢ培地＋アンピシリン１００μｇ／ｍｌ中の寒天上に単離されたコロニーを接種し、２×１０^８細胞／ｍｌ（Ａ_６００＝０．５～０．６）まで培養する。
３）試料を２．５ｍｌの２つの培養物に分割する。
４）ＩＰＴＧを培養物の１つ中に、１ｍＭの最終濃度で添加する。両方の培養物を３７℃で２～３時間インキュベートする。
５）５００μｌを各培養物から試料採取する。最高速度で１分間遠心分離し、上清を分注し、細菌ペレットを１００μｌのＬａｅｍｍｌｉ緩衝液１Ｘで懸濁させる。
６）試料を１分間煮沸する。１０μｌの各試料および分子量マーカーを、ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル上で適切なパーセンテージで泳動させる。移動させ、例えばクーマシーブリリアントブルーで染色することにより明らかにする。

融合タンパク質の産生
配列決定および発現試験を立証した後、ＣＲＤ_ＳＡＴタグに融合された関連するタンパク質（ＣＲＤ_ＳＡＴ－関連するタンパク質）を、以下の手順に従って産生することができる。
１）コンピテント発現細菌［ＢＬ２１（ＤＥ３）タイプ］を、ｐＣＡＲＧＨＯ－Ｘベクター（Ｘは、ＣＲＤ_ＳＡＴタグに融合した関連するタンパク質をコードする配列である）で形質転換する。Ｌｕｒｉａ Ｂｅｒｔａｎｉ ＬＢ培地＋アンピシリン１００μｇ／ｍｌ中で３７℃で１６時間前培養を行う。
２）この前培養物を１／１００に、Ｌｕｒｉａ Ｂｅｒｔａｎｉ ＬＢタイプ＋アンピシリン１００μｇ／ｍｌの富栄養培地１リットル中で接種する。
３）２×１０^８細胞／ｍｌ（Ａ_６００＝０．５～０．６）まで３７℃で培養する。ＩＰＴＧを１ｍＭの最終濃度で添加する。細菌を３７℃で撹拌しながら２～３時間インキュベートする。
４）２０μｌの粗細菌懸濁液（Ａ）を試料採取し、培養物を遠心分離し（４０００ｇ、２０分間）、上清を除去し、細菌ペレットを２５ｍｌの溶解緩衝液に懸濁させる。

種々のアジュバントによって、タンパク質分解（エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、フェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）等）または酸化（ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、β－メルカプトエタノール）を回避することが可能になり得る。
５）試料を氷中に配置し、超音波処理器またはフレンチプレスを用いて細菌を溶解する。２０μｌのこの溶解した細菌懸濁液（Ａ’）を試料採取する。
６）溶解した細菌懸濁液を２００００ｇで２０分間遠心分離する。タンパク質上清（Ｓｐ）を回収する。２０μｌのこの上清（Ｂ）を試料採取する。適切な場合には、溶解緩衝液またはカラム緩衝液で希釈する。

融合タンパク質「ＣＲＤ_ＳＡＴ－関連するタンパク質」の精製
自動モードにおける精製
１）０．４５μｍ膜で濾過した後、試料Ｓｐを、５ＣＶ（カラム容量）のカラム緩衝液で予め平衡化したラクトース－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）樹脂（１５～２０ｍｌ）上に注入する。クロマトグラフィーカラムを流れた可溶性画分２０μｌ（Ｃ）を試料採取する。
２）カラムを１０ＣＶのカラム緩衝液で洗浄する。カラム出口での洗浄液２０μｌ（Ｄ）を試料採取する。
３）融合タンパク質を１～２ＣＶのカラム緩衝液および＋１５０ｍＭのラクトースで溶出する。対応する画分（画分のサイズ：カラムの体積の約１／５）を採集する。２０μｌの溶出液（Ｅ）を試料採取する。
採集した画分中に存在する融合タンパク質を、２８０ｎｍでの吸収および／または比色法（ＢＣＡ、Ｂｒａｄｆｏｒｄなど）によってモニタリングする。

ＣＲＤ_ＳＡＴタグが関連するタンパク質のその後の適用に所望されない場合、それを融合タンパク質の溶出後に切断することが可能である（融合タンパク質の切断に関する節を参照）。
４）融合タンパク質を含む画分を一緒にして、所要に応じて濃縮する。関連するタンパク質を、－８０℃で、液体窒素中で凍結させた後に、３０～５０％のグリセロールを添加して、または添加せずに保存する。
５）ＳＤＳ－ＰＡＧＥ＋染色による精製の質を評価する：試料Ａ～ＥをＬａｅｍｍｌｉ ２Ｘ緩衝液で半分の強度に希釈し、次に煮沸し（９５℃、５分間）、その後それらをアクリルアミドゲル上で好適なパーセンテージで移動させる。
６）カラムを５ＣＶの２Ｍ ＮａＣｌ溶液、次いで５ＣＶの水で再生させる。カラムを水＋エタノール２０％またはＴｒｉｓ－ＨＣｌ ２０ｍＭ、ＥＤＴＡ １ｍＭ中に保存する。

バッチモードにおける精製
１）試料Ｓｐを、５～１０ＣＶのカラム緩衝液（Ｔｒｉｓ ２０ｍＭ、ＥＤＴＡ ５ｍＭ、ＮａＣｌ １５０ｍＭ、ｐＨを関連するタンパク質に依存して適合させるべきである）で予め平衡化したラクトースアガロース樹脂（１０～１５ｍｌ）上に堆積させ、弱い攪拌下に１～２時間配置する。次に、カラムにフリットディスクを配置する。クロマトグラフィーカラムに流した可溶性画分２０μｌ（Ｃ）を試料採取する。
２）カラムを１０ＣＶのカラム緩衝液で、次いで１０ＣＶのＰＢＳ緩衝液で洗浄する。カラム出口で２０μｌを試料採取する。
３）融合タンパク質を２．５ＣＶのＰＢＳ緩衝液および＋１５０ｍＭのラクトースで溶出する。
４）精製の質を評価し、融合タンパク質をアッセイし、次いでそれを自動モードにおける精製の節に記載した手順に従って保存する。
５）カラムを１０ＣＶの２Ｍ ＮａＣｌ溶液で再生させる。

融合タンパク質「ＣＲＤ_ＳＡＴ－関連するタンパク質」の切断
融合タンパク質を、ＴＥＶプロテアーゼによって切断し、その切断部位は、ＣＲＤ_ＳＡＴタグのＣ末端に位置する。切断は、融合タンパク質の溶出後に起こり、ＣＲＤ_ＳＡＴタグ（ｐＩ＝８．７、ＭＷ＝１８．８ｋＤａ）およびＴＥＶプロテアーゼ（ｐＩ＝８．８、ＭＷ＝２７ｋＤａ）を関連するタンパク質から分離するために、陽イオン交換またはサイズ排除クロマトグラフィーのいずれかのステップを後続させなければならない。

１）融合タンパク質の濃縮溶液を、切断緩衝液中で１～２ｍｇ／ｍｌの濃度に希釈する：２５ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８、１５０～５００ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのβ－メルカプトエタノール。２０μｌの試料（Ａ）を試料採取する。
２）ＴＥＶプロテアーゼを１：１００の比で、すなわち１００ｍｇの融合タンパク質当たり１ｍｇ（１０，０００単位）のプロテアーゼで添加する。「理想的な」比を最適化することができる。
３）混合物を４℃で一晩、または他には室温で、もしくは３０～３７℃で、より短い時間インキュベートし、制限因子は関連するタンパク質の安定性である。切断後の試料２０μｌを試料採取する（Ｂ）。
４）切断の有効性を検証するために、試料ＡおよびＢをＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル上で泳動させる。

５）ＣＲＤ_ＳＡＴタグおよびまたＴＥＶプロテアーゼを以下により除去する：
ａ）陽イオン交換クロマトグラフィー：
ｉ．切断反応混合物を、イオン強度を２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、２５ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７緩衝液で低下させる目的で透析または希釈する。塩濃度は２５ｍＭを超えてはならない。
ｉｉ．ＳＰ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）または同等のカラムを５ＣＶのカラム緩衝液で平衡化する（製造業者の推奨に従って）。
ｉｉｉ．混合物をカラム上に堆積させ、関連するタンパク質を含有する、保持していない画分を直ちに採集する（関連するタンパク質が酸のｐＩ（＜７）を有する限り）。
ｉｖ．適切な場合に関連するタンパク質を濃縮し、それを８０℃で、液体窒素中で凍結させた後に、３０～５０％のグリセロールを添加して、または添加せずに保存する。
ｖ．カラムを５ＣＶの２ＭのＮａＣｌ緩衝液（ＣＲＤ_ＳＡＴタグおよびＴＥＶプロテアーゼの溶出）、５ＣＶの水で再生させる。水＋２０％エタノール中で保存する。

ｂ）サイズ排除クロマトグラフィー
ｉ．Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５（登録商標）またはＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００（登録商標）または同等のカラムを２ＣＶのカラム緩衝液で平衡化する（製造業者の推奨に従って）。
ｉｉ．当該混合物をカラム上に注入し、タグを有さない関連するタンパク質に対応する画分を採集する［その分子量（サイズ）の関数として］。
ｉｉｉ．適切な場合に関連するタンパク質を濃縮し、それを８０℃で、液体窒素中で凍結させた後に、または３０～５０％のグリセロールを添加して保存する。

タグが関連するタンパク質の分子量（ＭＷ）と極めて異なる分子量（ＭＷ）を有する場合、ゲルを染色することによる検出で十分である。しかしながら、そのＭＷが極めて類似している場合、ウエスタンブロットによるより特異的な検出が、抗ＣＲＤ_ＳＡＴ抗体を用いて可能である。
ｉｖ．カラムを水＋２０％エタノール中に保存する。

補遺：ＴＥＶ消化を行わない場合、およびラクトースが精製したタンパク質のその後の適用に不適切である場合、透析を行ってもよいか、またはゲル濾過カラムを行ってもよい。

実施例３：ラクトースアフィニティークロマトグラフィーによる細菌性チオレドキシン（Ｔｒｘ１）の精製のモニタリング
ＣＲＤ_ＳＡＴに融合したＴｒｘ１を、大腸菌ロゼッタ２（ＤＥ３）細菌において、上に記載したプロトコルに従って発現させた。

細菌を溶解し、精製をラクトース－アガロースカラム上で上に記載したプロトコルに従って行った。

異なる精製ステップで、試料を採取して、アクリルアミドゲル上で泳動させた（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）。

電気泳動的移動の後、ゲルをクーマシーブリリアントブルーで染色した。

結果を、図１０に提示する。
ＭＷ：分子量。
Ｌａｃ：ラクトース－アガロース樹脂上のＴｒｘ１－ＣＲＤ_ＳＡＴ融合タンパク質の精製した画分、１５０ｍＭのラクトースで溶出。
ＴＥＶ：周囲温度で一晩、ＴＥＶプロテアーゼで１／１００に切断した後の画分。
ＳＰフロースルー：消化反応培地（ＴＥＶ）のＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（陽イオン交換）カラム上への注入後に保持されていない画分。
ＳＰ １００％：１ＭのＮａＣｌ（ＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）で溶出した画分。

実施例４：ラクトースアフィニティークロマトグラフィーによるヒト膜受容体ＴＲＥＭ－１（細胞外ドメイン）の精製のモニタリング
ＣＲＤ_ＳＡＴに融合したＴＲＥＭ－１（２１～１３６）を、大腸菌Ｃ４１（ＤＥ３）細菌において、上に記載したプロトコルに従って発現させた。

細菌を溶解し、精製をラクトース－アガロースカラム上で上に記載したプロトコルに従って行った。

異なる精製ステップで、試料を採取して、アクリルアミドゲルで泳動させた（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）。

電気泳動的移動の後、ゲルをクーマシーブリリアントブルーで染色した。

結果を、図１１に提示する。
ＭＷ：分子量。
Ｌａｃ：ラクトース－アガロース樹脂上のＣＲＤ－ＴＲＥＭ－１（２１～１３６）融合タンパク質の精製した画分、１５０ｍＭのラクトースで溶出。
ＴＥＶ：周囲温度で一晩、ＴＥＶプロテアーゼで１／１００に切断した後の画分。
Ｐｈｅ１：ＣＲＤタグを含有する消化反応培地（ＴＥＶ）のフェニルセファロース（疎水性相互作用）カラム上への注入後に保持されていない画分。
Ｐｈｅ２：ＴＲＥＭ－１、１３．７ｋＤａ、残基２１～１３６を含む、３００ｍＭの硫酸アンモニウムで、４ｍｇ／ｌの細菌培養物の収量で溶出した画分。

参考文献リスト
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１２．Ｓｅｅｔｈａｒａｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７３：１３０４７－１３０５２，１９９８
１３．Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２７４：５７５－５８０，１９９１
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１５．Ｒａｄａｅｖ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ １１，１５２７－１５３５，２００３

Claims (14)

1. 関心対象のタンパク質と融合したガレクチンのレクチンドメインの一部を含み、プロテアーゼによる切断のための部位が前記関心対象のタンパク質と前記レクチンドメインの一部の間に挿入された、融合タンパク質であって、前記レクチンドメインの一部が、ガレクチンのＣＲＤ_ＳＡＴドメインであり、前記ＣＲＤ_ＳＡＴドメインが配列番号：１で表されるアミノ酸配列からなる、融合タンパク質。
2. 前記切断部位がＴＥＶプロテアーゼによる切断のための部位である、請求項１に記載の融合タンパク質。
3. 請求項１又は２に記載の融合タンパク質についての発現ベクターであって、前記ベクターが以下の機能的に連結された要素：
   ａ）下記要素ｂ）、ｃ）およびｄ）のうちの最も５’側に位置する要素ｂ）の５’側に配置されたプロモーター；
   ｂ）ガレクチンのレクチンドメインの一部である配列番号：１で表されるアミノ酸配列からなるＣＲＤ _ＳＡＴ ドメインをコードする配列；
   ｃ）関心対象のタンパク質をコードする配列を受けるクローニング部位；
   ｄ）転写終了シグナル
   を５’側から上記ａ）～ｄ）の順で含み；
   かつここでプロテアーゼによる切断のための部位が前記配列ｂ）と前記クローニング部位ｃ）との間に位置する、
   前記発現ベクター。
4. 前記配列ｂ）が前記プロモーターの３’と、前記クローニング部位ｃ）の５’との間に配置される、請求項３に記載の発現ベクター。
5. 配列ｂ）が、ガレクチンのＣＲＤ_ＳＡＴドメインをコードし、前記ＣＲＤ_ＳＡＴドメインが配列番号：１で表されるアミノ酸配列からなる、請求項３または４に記載の発現ベクター。
6. 前記プロテアーゼによる切断のための部位がＴＥＶプロテアーゼによる切断についての部位である、請求項３～５のいずれか一項に記載の発現ベクター。
7. 前記ベクターがｐＥＴ２０ｂ（＋）ベクターから誘導され、以下の要素：
   配列番号２における位置１９４４での複製の起点；
   位置７９７～８１３でのＴ７プロモーター；
   位置７４２～７４７でのリボソーム結合部位（ＲＢＳ）；
   位置２４２～７３６でのＣＲＤ_ＳＡＴ配列；
   位置２２１～２４１でのＴＥＶ認識部位配列；
   位置１５９～２１５での多重クローニング部位；
   位置２６～７２でのＴ７ターミネーター；
   位置３６９４～４１４９でのＦ１起点；および
   位置２７０５～３５６２でのｂｌａアンピシリン耐性遺伝子
   を含むヒトガレクチン－３の炭水化物認識ドメイン発現プラスミドベクターである、請求項３～６のいずれか一項に記載の発現ベクター。
8. 関心対象の精製したタンパク質を製造するための方法であって、前記方法が以下のステップ：
   ａ）請求項３～７のいずれか一項に記載の発現ベクターにおける前記クローニング部位に関心対象のタンパク質をコードする配列を組み込んだ発現ベクターを調製するステップ；
   ｂ）宿主細胞を前記発現ベクターで形質転換するステップ；
   ｃ）上記ステップｂ）により形質転換した前記宿主細胞を、前記融合タンパク質の発現を可能にする条件下で培養し、宿主細胞における前記融合タンパク質の可溶化を促進するステップ；
   ｄ）前記関心対象のタンパク質を精製するステップ
   を含む、前記方法。
9. 前記精製ステップｄ）を以下のステップ：
   （ｉ）前記融合タンパク質を、ガレクチンのレクチンドメインの一部である配列番号：１で表されるアミノ酸配列からなるＣＲＤ _ＳＡＴ ドメインを介して、ラクトース分子をグラフトしたクロマトグラフィー担体に結合するステップ；
   （ｉｉ）前記関心対象のタンパク質のプロテアーゼによる切断のステップ；
   （ｉｉｉ）前記関心対象のタンパク質の溶出のステップ；
   （ｉｖ）前記プロテアーゼおよび前記関心対象のタンパク質の分離のステップ
   により行う、請求項８に記載の方法。
10. 前記精製ステップｄ）を以下のステップ：
    （ｉ）前記融合タンパク質を、ガレクチンのレクチンドメインの一部である配列番号：１で表されるアミノ酸配列からなるＣＲＤ _ＳＡＴ ドメインを介して、ラクトース分子をグラフトしたクロマトグラフィー担体に結合するステップ；
    （ｉｉ）前記融合タンパク質の溶出のステップ；
    （ｉｉｉ）溶液中の前記関心対象のタンパク質のプロテアーゼによる切断のステップ；
    （ｉｖ）前記プロテアーゼおよび前記レクチンドメインの一部である配列番号：１で表されるアミノ酸配列からなるＣＲＤ _ＳＡＴ ドメインの、前記関心対象のタンパク質からの分離のステップ
    により行う、請求項８に記載の方法。
11. 前記「ラクトース分子をグラフトしたクロマトグラフィー担体」が、「ラクトース分子をグラフトしたセファロースまたはアガロース樹脂のカラム」である、請求項９又は１０に記載の方法。
12. 前記分離ステップ（ｉｖ）をイオン交換クロマトグラフィーまたはサイズ排除クロマトグラフィーまたは疎水性相互作用クロマトグラフィーによって行う、請求項９または１０に記載の方法。
13. 前記溶出ステップをラクトース溶液で行う、請求項９～１２のいずれか一項に記載の方法。
14. 配列番号：１で表されるアミノ酸配列からなる、ＣＲＤ_ＳＡＴドメイン。
    

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