JP4198751B2

JP4198751B2 - 抗体の精製

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Publication number: JP4198751B2
Application number: JP52187995A
Authority: JP
Inventors: シャドレ，ポーラ・ジェイ; エリックソン，ジョン・シー; スコット，ロバート・ジー; スミス，トーマス・エム
Original assignee: SmithKline Beecham Corp
Current assignee: SmithKline Beecham Corp
Priority date: 1994-02-22
Filing date: 1995-02-21
Publication date: 2008-12-17
Anticipated expiration: 2023-12-17
Also published as: NO319182B1; CN1146730A; ES2177632T3; CA2183888A1; DK0746398T3; KR100372209B1; AU1843395A; MX9603637A; CZ292001B6; DE69526929T2; SI0746398T1; ZA951372B; WO1995022389A1; EP0746398A4; AU689552B2; USRE40070E1; NO963475L; HU9602313D0; US5429746A; HUT74845A

Description

発明の分野：
本発明は、蛋白精製の分野に関する。より詳細には、本発明は、免疫グロブリンＧモノマーの分離のための疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）、およびＩｇＧ抗体分子の精製のための組み合わせクロマトグラフィープロトコール中へのＨＩＣの導入に関する。
発明の背景：
歴史的には、蛋白精製スキームは、精製すべき蛋白と望ましくない蛋白汚染混入物質との間のサイズ、電荷および溶解度といった分子の特性の相違に基づいている。これらのパラメーターに基づくプロトコールは、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、分別沈殿等を包含する。
ゲル濾過またはゲル透過クロマトグラフィーとしても知られるサイズ排除クロマトグラフィーは、移動相中の高分子の固定相粒子の孔中への透過性に基づいている。異なる透過性は粒子の流体力学的体積の機能である。したがって、理想的な条件下ではより大型の分子は粒子の内部から排除されるが、より小型の分子はこの体積に出入りでき、溶出体積と分子量の対数との間に直線関係が存在するので蛋白のサイズにより溶出順序が予想できる。
架橋デキストラン、例えばセファデックス（SEPHADEX）（登録商標）、球状アガロースビーズ、例えばセファロース（SEPHAROSE）（登録商標）（両方とも、スェーデン、ウプサラのファルマシアＡＢ（Pharmacia AB）から市販されている）、架橋ポリアクリルアミド、例えばバイオ−ゲル（BIO-GEL）（登録商標）（カリフォルニア州、リッチモンドのバイオラッド・ラボラトリーズ（BioRad Laboratories）から市販されている）、またはエチレングリコール−メタクリラートコポリマー、例えばトヨパール（TOYOPEARL）ＨＷ６５（日本、東京のトーソー・ハース（Yoso Haas）から市販されている）を基礎としたクロマトグラフィー用支持体が、本発明のある態様の実施におけるサイズ排除クロマトグラフィー、またはＨＩＣクロマトグラフィー用の種々のクロマトグラフィー用カラムの作成において有用である。
沈殿法は、蛋白の粗混合物中の個々の蛋白の溶解度が広範囲に変化しうるという事実に基づいている。水性媒体中の蛋白の溶解度は種々の因子に依存するが、この議論の目的からすると、蛋白と溶媒との相互作用が同一種または同種の蛋白との相互作用よりも強力であれば、蛋白は可溶性であろうということが一般的に言える。沈殿現象を説明するいかなる特別な機械的理論にも拘束されることを望まないのであるが、いくつかのタイプの非荷電基との間の水素結合により、および／または静電気的に、双極子のように、さらに荷電基との相互作用により、蛋白と水分子との間の相互作用が起こる可能性があり、その結果、１価カチオンの塩（例えば、硫酸アンモニウム）のごとき沈殿生起物質は水分子を求めて蛋白と競争すると考えられている。よって、高塩濃度において蛋白は「脱水」され、水性環境との相互作用が減じられ、同様または同種の蛋白とともに凝集して媒体から沈殿を生じる。
イオン交換クロマトグラフィーは、試料中の荷電官能基と吸着剤表面上の逆の電荷のイオン性官能基との相互作用を用いる。２種の一般的なタイプの相互作用が知られている。アニオン交換クロマトグラフィーは、正に荷電した表面と相互作用する負に荷電したアミノ酸側鎖（例えば、アスパラギン酸およびグルタミン酸）により行われ、カチオン交換クロマトグラフィーは、負に荷電した表面と相互作用する正に荷電したアミノ酸側鎖（例えば、リジンおよびアルギニン）により行われる。
より最近になって、アフィニティークロマトグラフィーおよび疎水性相互作用クロマトグラフィー法が開発されて、より伝統的なサイズ排除およびイオン交換クロマトグラフィープロトコールに加わった。アフィニティークロマトグラフィーは、蛋白と固定化リガンドとの特異的相互作用によるものである。リガンドは興味ある特定の蛋白に特異的である可能性があり、この場合、リガンドは基質、基質アナログ、阻害剤、受容体または抗体である。別法として、リガンドがいくつかの関連蛋白と反応できるものであってもよい。アデノシンモノホスフェート、アデノシンジホスフェート、ニコチンアデニンジヌクレオチドまたはある種の色素のごとき基特異的リガンドを用いて特定のクラスの蛋白を回収してもよい。
抗体分子の精製に関しては、特別な方法および一般的な方法の両方が適用できる。抗体の精製のためのリガンドの最も特別な選択は、所望抗体が反応する抗原（またはそのエピトープ）である。酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）のごとき多くのよく知られた免疫吸着アッセイはかかる抗原／抗体相互作用に基づいている。
しかしながら、一般的なアフィニティー法も有用である。例えば、スタフィロコッカスの蛋白Ａ（STAPHYLOCOCCAL PROTEIN A）（プロテインＡ）はＩｇＧクラスのある種の抗体に結合することが知られている（例えば、エイ，ピー・エル（Ey,P.L.）ら、イムノケミストリー（Immunochemistry）第１５巻：４２９〜４３６頁（１９７８年）参照）。別法として、異種生物中で生じた抗血清（例えば、ウサギ・抗−マウス抗血清）を用いて一般的なグループの抗体を分離してもよい（上記カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー（Current Protocols in Molecular Biology）、第１１章参照）。
疎水性相互作用クロマトグラフィーは、最初は、炭化水素スペーサーアームからなるがアフィニティーリガンドを欠いているアフィニティーゲル上に蛋白が保持されうるという観察結果によって開発された。この分野において、用語「疎水的クロマトグラフィー」が時々用いられ、用語「疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）」が好ましい。なぜなら、溶質とゲルとの間の相互作用が疎水的であって、該クロマトグラフィー法が疎水的でないからである。疎水性相互作用は高イオン強度において最強であり、それゆえ、便利には、この形態の分離は塩による沈殿またはイオン交換法の後に行う。溶媒、ｐＨ、イオン強度を変化させることにより、あるいはカオトロピック（chaotropic）試薬またはエチレングリコールもしくはプロピレングリコールのごとき有機修飾剤を添加することにより、ＨＩＣ支持体からの溶離を行うことができる。疎水性相互作用クロマトグラフィーの一般的原理の記載は、米国特許第３，９１７，５２７号および米国特許第４，０００，０９８号において見られる。特定の蛋白の精製へのＨＩＣの適用は、以下の開示を参照することにより例示される：ヒト・成長ホルモン（米国特許第４，３３２，７１７号）、毒素抱合体（米国特許第４，７７１，１２８号）、抗溶血因子（米国特許第４，７４３，６８０号）、腫瘍壊死因子（米国特許第４，８９４，４３９号）、インターロイキン−２（米国特許第４，９０８，４３４号）、ヒト・リンフォトキシン（米国特許第４，９２０，１９６号）およびリゾチーム種（ファウスナウ，ジェイ・エル（Fausnaugh,J.L.）およびエフ・イー・レグニア（F.E.Regnier）、ジャーナル・オブ・クロマトグラフィー（J.Chromatog.）第３５９巻：１３１〜１４６頁（１９８６年））および可溶性補体受容体（米国特許第５，２５２，２１６号）。高品質液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）との関連においてＨＩＣは、インタクトな抗体分子からの抗体フラグメント（例えば、Ｆ（ａｂ’）₂）の単一工程での分離に用いられている（モリモト，ケイ（Morimoto,K.）ら、ジャーナル・バイオケミ・バイオフィジ・メソ（J.Biochem.Biophys.Meth.）第２４巻：１０７〜１１７頁（１９９２年））。
アフィニティーおよびＨＩＣ法のほかに、１種またはそれ以上の伝統的な蛋白精製スキームが抗体精製に適用されている。例えば、ハカラーティ，エル（Hakalahti,L.）ら（ジャーナル・オブ・イミュノロ・メソ（J.Immunol.Meth.）第１１７巻：１３１〜１３６頁（１９８９年））は、２つの連続したイオン交換工程を用いるプロトコールまたは単一のイオン交換工程の後にＨＩＣ工程を用いるプロトコールを開示している。ダニエルソン，エイ（Danielsson,A.）ら（ジャーナル・オブ・イミュノロ・メソ第１１５巻：７９〜８８頁（１９８８年））は、それぞれアニオン交換、カチオン交換、クロマトフォーカシングおよびＨＩＣに基づく単一工程プロトコールを比較している。
蛋白Ａアフィニティーカラムクロマトグラフィーは広く使用されているが、かかるカラムからの抗体の溶離は支持体からの蛋白Ａの漏出を引き起こす可能性があることも認識されている。サイズ排除ＨＰＬＣ（ダス（Das）ら、アナリティカル・バイオケミストリー（Analytical Biochem.）第１４５巻：２７〜３６頁（１９８５年））およびアニオン交換クロマトグラフィー（ＥＰＯ３４５５４９、１９８９年１２月１３日公開）は、この問題を扱う手段として示唆されている。
驚くべきことに、蛋白Ａクロマトグラフィー支持体から溶離したＩｇＧ混合物から混入蛋白Ａを除去するためにＨＩＣが有用であることが見いだされた。
本発明は、ＩｇＧを含有する混合物からのモノマーＩｇＧの分離へのＨＩＣの適用、および蛋白Ａならびにイオン交換クロマトグラフィーを組み合わせた免疫グロブリンＧ分子精製のためのプロトコール中へのＨＩＣの取り入れに関する。
発明の簡単な説明：
本発明は、ＩｇＧを含有する混合物中の凝集物からＩｇＧモノマーを分離する方法であって、該混合物を疎水性相互作用クロマトグラフィー支持体と接触させ、次いで、支持体からモノマーを選択的に溶離することによる方法に関する。
もう１つの態様において、本発明は、ＩｇＧを含有するならし細胞培地からのＩｇＧ抗体の精製方法であって、該培地を連続的に（ａ）蛋白Ａクロマトグラフィー、（ｂ）イオン交換クロマトグラフィー、次いで、（ｃ）疎水性相互作用クロマトグラフィーに供することからなる方法を提供する。
もう１つの態様において、本発明は、蛋白Ａおよび抗体からなる混合物からの蛋白Ａの除去方法であって、該混合物を疎水性相互作用支持体と接触させ、次いで、支持体から抗体を選択的に溶離することからなる方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
図１は、本発明による抗体精製の１のプロセスのフローダイヤグラムを示す。
発明の詳細な説明：
本発明は、免疫グロブリン分子の大スケール精製に適用する蛋白精製法に関する。本発明は、＞９５％純度のモノマーＩｇＧを回収可能であるため、特に有用である。本発明をいくつかの異なる免疫グロブリンＧ分子の精製に適用してもよい。
抗体様蛋白は本明細書記載のプロトコールにより精製されうる蛋白であり、必要ならば、過度の実験を課さない日常的で非発明的な調整により、かかるプロトコールは修飾される。かかる蛋白は、免疫グロブリン遺伝子のイソタイプ、アロタイプおよびアリール、切断形態、キメラ抗体およびヒト化抗体のごとき変化した抗体等、ＰＥＧ処理のような化学的に修飾された抗体、および免疫グロブリン部分を含有する融合蛋白を包含する。これらの蛋白は抗体様といわれる。なぜなら、それらは、本発明方法により精製が可能な十分な免疫グロブリン蛋白の性質（例えば、Ｆｃ決定基）を有するかまたは保持しているからである。特記しない限り、用語「抗体」または「免疫グロブリン蛋白」も抗体様蛋白を包含する。
免疫動物の血清、腹水、ハイブリドーマまたはミエローマの上清、免疫グロブリン分子を発現する組み換え細胞系を培養することにより得られるならし培地、および免疫グロブリンを産生するすべての細胞抽出物を包含するいくつかの源（これらに限定しない）から本発明の免疫グロブリン分子を単離することができる。特に、本発明は種々の抗体産生細胞系のならし細胞培地からの抗体の精製に有用である。本明細書の開示に基づいて、細胞系ごとのいくつかの変化および種々の抗体生成物が考えられるが、抗体蛋白および産生細胞系の特定の組み合わせに本発明を適用することは十分に当業者の範囲内である。
一般的には、所望ポリペプチド領域をコードするＤＮＡ配列を組み換えＤＮＡビヒクル（例えば、ベクター）中に組み込み、適当な原核宿主または真核宿主を形質転換またはトランスフェクションすることにより、抗体のごとき蛋白をコードする遺伝子をクローン化することができる。適当な原核宿主は、エシェリシア（Escherichia）、ストレプトマイセス（Streptomyces）、バチルス（Bacillus）等を包含するが、これらに限定しない。適当な真核宿主は、サッカロマイセス（Saccharomyces）のごとき酵母およびＶＥＲＯ、ＨｅＬａ、マウス・Ｃ１２７、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）、ＷＩ−３８、ＢＨＫ、ＣＯＳ、ＭＤＣＫ、ミエローマのごとき培養動物細胞、および昆虫細胞系を包含するが、これらに限定しない。特に好ましい宿主は、ＡＴＣＣＣＲＬ１７９３、ＣＲＬ９０９６のごときジヒドロ葉酸レダクターゼ欠損ＣＨＯ細胞系および下記の他の細胞系である。かかる組み換え法は現在よく知られるようになっており、メソッズ・イン・エンザイモロジー（Methods in Enzymology）（アカデミック・プレス（Academic Press））第６５巻ならびに６９巻（１９７９年）、第１００巻ならびに１０１巻（１９８３年）、およびそれらの中で引用された文献に記載されている。最も一般的に用いられる組み換えＤＮＡ法を具体化するさらなる技術的議論は、マニアティス（Maniatis）ら、モレキュラー・クローニング（Molecular Cloning）、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Cold Spring Harbor Laborartory）（１９８２年）またはカレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー（Current Protocoles in Molecular Biology）、グリーン・パブリッシング、ウィリー・インターサイエンス（Greene Publishing,Wiley Interscience）（１９８８、１９９１、１９９３年）に見いだされる。
抗体分子のごとき所望ポリペプチドをコードするＤＮＡフラグメントを得るための１の方法はｃＤＮＡクローニングによるものである。この方法において、所望蛋白を産生することが知られているかまたはその可能性のある細胞からメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を単離する。一連の酵素反応により、細胞のｍＲＮＡ集団が相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）中にコピーされる。次いで、得られたｃＤＮＡをクローニングビヒクル中に挿入し、次いで、適当な原核または真核宿主を形質転換するのに用いる。得られたｃＤＮＡライブラリーは形質転換細胞の集団からなり、それぞれが単一遺伝子または遺伝子フラグメントを含んでいる。理論的には、ライブラリー全体は、出発材料として用いたｍＲＮＡ混合物中に存在するコーディング情報の標本試料を提供する。核酸または抗体プローブを用いてライブラリーをスクリーニングして特定のＤＮＡ配列を同定することができる。単離したならば、これらのＤＮＡ配列を修飾することができ、あるいは組み立てて完全な遺伝子とすることができる。
抗体遺伝子の特定のフラグメントを、遺伝子の残りの部分とは無関係に加工することができる。相補性決定領域（ＣＤＲｓ）をコードするＤＮＡフラグメントを異種生物種由来のＤＮＡフレームワーク配列中に組み込んで変化した抗体を得ることができる。これらの変化した抗体は、望ましくない生理学的症状の治療において有意な有用性を有する。例えば、ＰＣＴ／ＧＢ９１／０１５４４（ＷＯ９２／０４３８１として公開）は、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）感染の治療および予防に有用な「ヒト化」抗体の製造を開示している。別法として、抗体遺伝子の全可変領域を第２の抗体の不変ドメインに融合させて、「キメラ抗体」としても知られる変化した抗体を形成することもできる。例えば、ＰＣＴ／ＵＳ９２／０６１９４（ＷＯ９３／０２１０８として公開）は、ヒトＣＤ４受容体と反応するサル／ヒト・キメラ抗体を開示している。
抗体遺伝子または遺伝子フラグメントをクローン化したならば、ＤＮＡを発現ベクター中に導入することができ、その構築物を用いて適当な宿主細胞を形質転換する。発現ベクターは、本明細書において定義される発現調節配列であって、興味あるＤＮＡ配列がそれに作動可能に結合している発現調節配列を有するものとして特徴づけられ、該ベクターは、該ベクターを含んでいる宿主細胞中において、興味あるＤＮＡ配列によりコードされる生成物の生産を指令することができる。特に本発明に関しては、単一コーディング配列のフラグメントを組み立てて発現の際に抗体分子が形成されるようにすることが可能である。組み換え抗体製造へのこのプロトコールの特に有効な適用は、上で引用した１９９２年３月１９日公開のハリス（Harris）らのＰＣＴ出願ＷＯ９２／０４３８１、および上で引用した１９９３年２月４日公開のニューマン（Newman）らのＰＣＴ公開ＷＯ９３／０２１０８に見いだされる。
組み換え生成物を製造した後に生成物を回収することが望ましい。産生細胞により生成物が排出される場合には生成物を細胞培養培地から直接回収することができる。生成物が細胞内に保持される場合には、機械的、化学的または生物学的手段により細胞を物理的に破壊して細胞内生成物を得なければならない。
蛋白生成物の場合、精製プロトコールは、標品中の全蛋白に関して少なくとも８０％、好ましくは９５％よりも高純度である、他の蛋白を本質的に含まない蛋白生成物を提供すべきであるのみならず、他の宿主細胞混入物質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、存在しうるパイロジェン等を除去または許容できるレベルにまで減少させるべきである。さらにそのうえ、組み換え発現系による抗体製造に関して、１５００００ダルトンのＩｇＧ生成物のより高分子量種への凝集が起こり得ることが理解されている。したがって、生成物の純度および標準化の目的から、ネイティブな１５００００ダルトンの種をより高分子量の凝集物および他の誤って折り畳まれた形態から分離することも有用である。１５００００ダルトンのＩｇＧ種が４つのポリペプチド鎖（２つの重鎖および２つの軽鎖）からなることが理解されているのであるが、１５００００ダルトンの種を本明細書では「モノマー」または「モノマーＩｇＧ」という。
上記のごとく、種々の宿主細胞を本発明抗体の製造のために用いることができる。個々の宿主細胞の選択は、とりわけ、抗体の性質、その合成速度、その分解速度および抗体発現を指令する組み換えベクターの特性を考慮すると、十分に当業者の範囲内である。宿主細胞発現系の選択は、使用する細胞培養方法の性質を大いに決定する。発現系を決定したならば、バッチ法であっても連続法であっても、あるいはスピンナー（spinner）であってもエアリフト（air lift）であっても、あるいは液体であっても固定化であっても、個々の製造方法の選択を行うことができる。したがって、細胞マイクロキャリア（cell microcarrier）を伴った、あるいは伴っていない、流動床バイオリアクター、ホローファイバーバイオリアクター、ローラーボトル培養、または撹拌タンクバイオリアクターをさまざまに用いることができる。かかる選択の判断基準は細胞培養の分野において理解されている。それらを本明細書では詳述しない。なぜなら、それらは本発明の範囲外だからである。本発明は、ならし細胞培養培地、ハイブリドーマ上清、抗血清、ミエローマ上清または腹水中に存在する抗体の精製に関する。
上記のように、本発明は、とりわけ、抗体分子の分離および精製への疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）の適用に関する。水性溶媒中の疎水性分子は自己会合するであろう。この会合は疎水性相互作用による。蛋白のごとき高分子は、予期される親水性基のほかに広い疎水性パッチをその表面上に有することが、現在理解されている。一部には、ＨＩＣはこれらのパッチとクロマトグラフィー支持体に結合した疎水性リガンドとの相互作用に基づく。マトリックスの結合した疎水性リガンドは、本明細書において、ＨＩＣ支持体、ＨＩＣゲルまたはＨＩＣカラムとさまざまに呼ばれる。蛋白とＨＩＣ支持体との間の相互作用の強度は蛋白上の極性表面に対する無極性表面の割合の関数であるのみならず、無極性表面ならびにＨＩＣ支持体の化学によるものである。
数多くのクロマトグラフィー支持体がＨＩＣカラムの調製に用いられており、最も広く用いられているのがアガロース、シリカおよび有機ポリマーもしくはコポリマー樹脂である。有用な疎水性リガンドは、ブチル、プロピル、またはオクチルのごとき２ないし８個の炭素原子を有するアルキル基；フェニルのごときアリール基を包含するが、これらに限定しない。ゲルおよびカラム用の慣用的なＨＩＣ製品は、例えば、スェーデンのウプサラのファルマシアＬＫＢＡＢ（Pharmacia LKB AB）から商品名ブチル−セファロース（登録商標）フェニルまたはブチル−セファロース（登録商標）ＣＬ−４Ｂ、ブチル−セファロース（登録商標）ＦＦ、オクチル−セファロース（登録商標）ＦＦおよびフェニル−セファロース（登録商標）ＦＦとして；日本の東京のトーソー・コーポレイション（Tosoh Corporation）から商品名トヨパールエーテル６５０、フェニル６５０またはブチル６５０（フラクトゲル）として；イスラエルのレホボトのマイルス−イェダ（Miles-Yeda）から商品名アルキル−アガロースとして（アルキル基は２〜１０個の炭素原子を含む）、およびニュージャージー州フィリップスバーグのジェイ・ティー・ベイカー（J.T.Baker）から商品名ベイクボンドＷＰ−ＨＩ−プロピルとして市販されている。
慣用的な化学を用いて所望のＨＩＣを調製することも可能である（例えば、アー−エル，ゼット（Er-el,Z.）ら、バイオケミ・バイオフィジ・リサ・コミュ（Biochem．Biophys．Res．Comm.）第４９巻：３８３頁（１９７２年）またはウルブリヒ，ブイ（Ulbrich,V.）ら、コレ・ツェック・ケミ・コミュニ（Coll.Czech.Chem.Commum.）第９巻：１４６６頁（１９６４年）参照）。
相互作用の強度のみならずカラムのキャパシティーに影響するという点で、リガンド密度は重要なパラメーターである。市販されているフェニルまたはオクチルフェニルゲルのリガンド密度は４０μモル／ｍｌゲルベッドのオーダーである。ゲルのキャパシティーは、問題としている個々の蛋白、並びにｐＨ、温度、そして塩のタイプと濃度の関数であるが、一般的には、３〜２０ｍｇ／ｍｌゲルの範囲と考えられる。
当業者により個々のゲルの選択が決定されうる。一般的には、蛋白とＨＩＣリガンドの相互作用の強度は、アルキルリガンドの鎖長に伴って増加するが、約４個ないし約８個の炭素原子を有するリガンドがほとんどの分離に適する。フェニル基はペンチル基とほぼ同じ疎水性を有するが、蛋白の芳香族基とのパイ−パイ軌道相互作用の可能性のため、選択性が全く異なる。支持体樹脂の化学により選択性も影響される。
ＨＩＣカラムへの蛋白の吸着は、高塩濃度によって支持されるが、実際の濃度は蛋白および選択した個々のＨＩＣリガンドの性質により広範囲に変動しうる。種々のイオンは、それが疎水性相互作用を促進する（塩析効果）か、あるいは水の構造を破壊して疎水性相互作用の弱体化を招く（カオトロピック効果（chaotropic effect））かどうかによって、いわゆるソルフォービックシリーズ（soluphobic series）に並ぶ。カチオンは、塩析効果の増大に関してランク付けされ、Ｂａ⁺⁺＜Ｃａ⁺⁺＜Ｍｇ⁺⁺＜Ｌｉ⁺＜Ｃｓ⁺＜Ｎａ⁺＜Ｋ⁺＜Ｒｂ⁺＜ＮＨ₄ ⁺であり、一方、アニオンは、カオトロピック効果の増大に関してランク付けでき、ＰＯ₄ ^---＜ＳＯ₄ ^--＜ＣＨ₃ＣＯＯ^-＜Ｃｌ^-＜Ｂｒ^-＜ＮＯ₃ ^-＜ＣｌＯ₄ ^-＜Ｉ^-＜ＳＣＮ^-である。
したがって、以下の関係式に示すように、相互作用の強度に影響する塩を公式化してもよい：
（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄＞Ｎａ₂ＳＯ₄＞ＮａＣｌ＞ＮＨ₄Ｃｌ＞ＮａＢｒ＞ＮａＳＣＮ
一般的には、約０．７５ないし約２Ｍの間の塩濃度の硫酸アンモニウム、または蛋白１ないし４Ｍの間のＮａＣｌが有用である。
ＨＩＣ分離に対する温度の影響は単純ではないが、一般的には、温度の低下は相互作用を低下させる。しかしながら、温度を上昇させることにより生じるであろう何らかの利益も、例えば、蛋白の安定性に対する悪影響に対して衡量しなければならない。
ステップワイズであってもグラジエントの形態であっても、溶離を種々の方法で行うことができる：（ａ）塩濃度を変化させることによる、（ｂ）溶媒の極性を変化させることによる、または（ｃ）界面活性剤を添加することによる。塩濃度を低下することにより、疎水性が高くなる順番で吸着蛋白が溶離される。エチレンもしくはプロピレングリコールまたは（イソ）プロパノールのごとき溶媒の添加により極性の変化も影響されるかもしれず、それにより、疎水性相互作用の強度が低下する。界面活性剤は蛋白の置換物質として機能し、主として膜蛋白の精製と組み合わせて用いられている。
上記のように、ＨＩＣクロマトグラフィーのみを用いてモノマーＩｇＧ（分子量１５００００）を凝集物および誤って折り畳まれた種から分離することができたが、ＨＩＣは他の蛋白精製法と組み合わせて用いた場合に特に有用である。すなわち、他の蛋白精製プロトコールにより部分精製された混合物にＨＩＣを適用することが好ましい。用語「部分精製された」は、興味ある蛋白が少なくとも５重量％、より好ましくは少なくとも１０％、最も好ましくは少なくとも４５％存在する蛋白標品を意味する。用語「混合物」は、１種またはそれ以上の免疫グロブリン凝集物、誤って折り畳まれた種宿主細胞蛋白、もし使用された場合には蛋白Ａのごとき前のクロマトグラフィー工程からの残余物質（これらに限定しない）のごとき望ましくない汚染混入物質と混合している所望のモノマーＩｇＧ抗体分子を意味する。したがって、アフィニティー精製モノマー抗体のごとき免疫グロブリン蛋白を得るための全精製プロトコールに関して、ＨＩＣの適用も考えられる。例えば、ＨＩＣ適用前に、ならし細胞培養培地を部分精製に供することが有用であるとわかっている。用語「ならし細胞培養培地」は、細胞の増殖および／または細胞の維持を支持し、分泌生成物を含有している細胞培養培地を意味する。かかる培地の試料を、ＨＩＣ工程の前に、１またはそれ以上の蛋白精製工程に供する。第１工程として、試料をスタフィロコッカスの蛋白Ａを用いるアフィニティークロマトグラフィーに供してもよい。例えば、コントロールドポアガラス（controlled pore glass）に共有結合した蛋白ＡからなるPROSEP-A（登録商標）（英国のバイオプロセッシング・リミテッド（BioProcessing Ltd.））を有用に使用することができる。他の有用な蛋白Ａ処方はプロテインＡセファロース（登録商標）ファストフロー（ProteinA SEPHAROSE（登録商標）Fast Flow）（ファルマシア）およびトヨパール６５０ＭプロテインＡ（トーソー・ハース）である。第２工程として、イオン交換クロマトグラフィーを用いてもよい。このことについて、種々のアニオンまたはカチオン置換基をマトリックスに結合させてクロマトグラフィー用アニオンまたはカチオン支持体を形成してもよい。アニオン交換基は、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）、４級アミノエチル（ＯＡＥ）および４級アミン（Ｑ）基を包含する。カチオン交換基は、カルボキシメチル（ＣＭ）、スルホエチル（ＳＥ）、スルホプロピル（ＳＰ）、ホスフェート（Ｐ）およびスルホネート（Ｓ）を包含する。ＤＥ２３、ＤＥ３２、ＤＥ５２、ＣＭ−２３、ＣＭ−３２およびＣＭ−５２のごときセルロースイオン交換樹脂は、英国ケント州、メイドストーンのワットマン・リミテッド（Whatman Ltd.）から市販されている。セファデックス（登録商標）に基づくイオン交換体および架橋イオン交換体も知られている。例えば、ＤＥＡＥ−、ＱＡＥ−、ＣＭ−ならびにＳＰ−セファデックス（登録商標）、およびＤＥＡＥ−、Ｑ−、ＣＭ−ならびにＳ−セファロース（登録商標）、およびセファロース（登録商標）ファスト・フローはすべてファルマシアＡＢから市販されている。さらに、トヨパールＤＥＡＥ−６５０ＳもしくはＭ、およびトヨパールＣＭ−６５０ＳもしくはＭのごときＤＥＡＥ−およびＣＭ−誘導体化エチレングリコール−メタクリレートコポリマーはペンシルベニア州フィラデルフィアのトーソー・ハースから市販されている。通常は、イオン交換支持体からの溶離には塩の添加を用いる。なぜなら、上記のように、ＨＩＣは上昇した塩濃度において促進されるからであり、イオン交換工程または他の塩を用いる精製工程の後にＨＩＣ工程を導入することは特に好ましい。さらなるイオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、ウイルス不活性化、濃縮および凍結乾燥をはじめとするさらなる精製プロトコール（これらに限定されない）を付加してもよい。
説明のみの目的で、本発明をいくつかのＩｇＧイソタイプ抗体の精製に適用した。より詳細には、ハリス（Harris）ら、１９９２年、国際特許出願公開第ＷＯ９２／０４３８１号（１９９２年３月１９日公開）により記載されているＲＳＶ感染の治療に有用なヒト化抗体（以後「ＲＳＨＺ−１９」という）およびニューマン（Newman）ら、国際特許出願公開第ＷＯ９３／０２１１０８号（１９９３年２月４日公開）により記載されたＣＤ４抗原と特異的に反応するキメラ抗体（以後「ＣＨ−ＣＤ４」という）に適用した。ＲＳＨＺ−１９およびＣＨ−ＣＤ４キメラ抗体の製造用の組み換え系の構築は、上記ＰＣＴ出願に詳述されており、バックグラウンドのためにそれらの内容を参照により本明細書に記載されているものと見なし、以下に要約する。
ＲＳＨＺ−１９コーディング配列を含む発現プラスミドを、ｐＳＶ２ｄｈｆｒとともにｄｈｆｒ要求性チャイニーズハムスター卵巣細胞系（ＣＨＯＤＵＸＢII）中に同時トランスフェクションした。トランスフェクションを増殖培地中で行い、ＤＮＡクローニング（DNA Cloning）、ディー・エム・グロバー（D.M.Glover）編（第１５章、シー・ゴーマン（C.Gorman））に記載されているカルシウム共沈／グリセロールショック本明細書を用いた。トランスフェクション後、選択工程の前に細胞を増殖条件下（上記）の増殖培地に４６時間維持した。
選択および同時増幅工程を、本質的にはアール・ジェイ・カウフマン（R.J.Kaufman）ら、モレ・セル・バイオロ（Mol.Cell.Biol.）第５巻：１７５０〜１７５９頁（１９８５年）に記載のごとく行った。トランスフェクションから４６時間後、細胞を選択培地（ＭＥＭＡＬＰＨＡ（０４１−０２５７１））、１％ストックグルタミン、１％ストックペン／ストレップ（０４３−０５０７０）中に移し、ウシ・胎児血清（２２０−６３００ＡＪ）（スコットランドのペイスリーのギブコ（Gibco）製）に対して透析した。ｄｈｆｒ⁺コロニーが出現するまで細胞を選択培地に８〜１０日間維持した。コロニーを株化した後、細胞を、メトトレキセート（Ａ６６７０、ミズーリ州セントルイスのシグマ（Sigma）製）を含有する選択培地中に移した。最初はメトトレキセート濃度を０．０２μＭとし、段階的５μＭまで増加させた。増幅工程の間、増殖中の細胞から得られる増殖培地の一部を、ヒト・ＩｇＧによりＲＳＨＺ−１９産生に関してアッセイした。本発明により精製されるならし培地を提供するために、いかなる抗体分泌組み換え細胞系を用いてもよく、特定の細胞系は確かに必要ない。
ＲＳＨＺ−１９を産生する形質転換ＣＨＯ細胞系を、種々の細胞培養法により培養することができる。本発明の適用のためには、特定の培養方法は重要でない。
上記のように、特定の組み換え生産系および特定の細胞培養プロトコールは本発明の範囲外である。上記系およびプロトコールは、当業者に利用可能な多くのオプションの代表例であり、それらを説明のみの目的で本明細書に取り入れる。どのようにして製造または培養されたかにかかわらず、種々の組み換え抗体および抗体様蛋白に対して、本発明の主題である精製プロトコールは、通常の修飾のみを行って、適用可能である。例えば、ＣＤ４に対するキメラモノクローナル抗体も、本発明方法により精製された。
本発明の実施により得られる精製抗体は以下の特性を有する：１）９７重量％より多い抗体蛋白；２）４℃において少なくとも３カ月間蛋白分解に対して安定；３）少ない（＜０．１Ｅ．Ｕ．／ｍｇ蛋白）エンドトキシン；４）少ないＤＮＡ（＜１ｐｇ／ｍｇ蛋白）ＤＮＡ；５）５重量％未満の非抗体蛋白；および６）ウイルス不活性である。以下の実施例はさらに本発明を説明するが、本明細書の請求の範囲の限定のために提供されるのではない。
実施例１
導入
以下に概説する方法は、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）に対するモノクローナル抗体の単離および精製のために開発された。この抗体は、ＣＨＯ細胞において発現される「ヒト化」ＩｇＧであり、撹拌タンクバイオリアクター中で増殖させられる。この抗体はＰＣＴＷＯ９２／０４３８１においてより十分に説明されており、断らないかぎり、本明細書ではＲＳＨＺ−１９という。該方法は純度が９５％よりも高いＲＳＨＺ−１９を調製し、一方では、宿主細胞、細胞培養培地、または他の原料由来の汚染混入物質を除去するために設計されている。該方法は、その最も好ましい具体例において、３つの精製工程（蛋白Ａアフィニティー、カチオン交換、および疎水性相互作用クロマトグラフィー）、２つのウイルス不活性化工程、および生成物を最終の選択バッファー中に移すための１つの限界濾過工程からなる（概略を図１に示す）。すべての工程を室温（１８〜２５℃）で行う。すべてのバッファーをＷＦＩで調製し、使用前に０．２ミクロンのフィルターまたは１００００ＭＷＣＯ膜のいずれかで濾過した。バッファー処方を表１に示し、表２、４、６および８は、例えば、それぞれ実施例ＩＡ、ＩＢ、ＩＣおよびＩＤのカラムのパラメーターを示す。表３、５および７ならびに９は、例えば、それぞれ実施例ＩＡ、ＩＢ、ＩＣおよびＩＤの精製のまとめを示す。
該方法における第１工程（ＰｒｏＳｅｐＡによる蛋白Ａアフィニティークロマトグラフィー）を迅速に回転させて種々の量の無細胞培養液（ＣＣＦ）を用意することができ、１リットルのＰｒｏＳｅｐＡにつき約１５グラムのＲＳＨＺ−１９のキャパシティーを有する。例えば、４００〜５００グラムのＩｇＧを含有する５００リットルのＣＣＦを５〜６サイクルで処理することができる。該方法の下流の工程（カチオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＣ）および疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ））は１サイクルあたり約１３０〜１４０グラムのＲＳＨＺ−１９が得られるような規模である。よって、ＰｒｏＳｅｐＡの後、４００〜５００グラムのＩｇＧを含有する５００リットルの培養物を３回の下流サイクルで処理する。
疎水性相互作用クロマトグラフィー工程（ＨＩＣ）は、溶離の間に蛋白Ａカラムから漏出した残存蛋白Ａを除去することが示されている（実施例ＩＡ〜Ｄ参照）。さらに、実施例ＩＣ〜ＩＤに示すように、ＩｇＧの凝集物をＨＩＣで除去することができる。
該方法の説明はいかなる規模についても標準化され；掲載した線流速はカラム直径とは無関係である。１グラム、４０グラムおよび１２５グラムの規模における操作および回収に関する例が提供される（実施例ＩＡ〜ＩＤ）。
精製方法の説明
培養物からの細胞の除去
培養液を得るために、０．６５ミクロンのフィルターを装備した交差流れ精密濾過装置（プロスタク（Prostak））または等価物を用いて細胞を除去する。生成物は透過液中に回収される。小体積培養については遠心分離を用いることができる。
蛋白Ａクロマトグラフィーによるアフィニティー捕捉
前以てＰＢＳで平衡化しておいたＰｒｏＳｅｐＡ（バイオプロセッシング・リミテッド（BioProcessing Ltd.））のカラムによる吸着クロマトグラフィーによりＣＣＦからＩｇＧを回収する。流速を１０００ｃｍ／時までとし、負荷比を１リットルのカラム体積あたり１５グラムＩｇＧまでとして培地をカラムに適用する。カラムに負荷した後、少なくとも３カラム体積の０．１Ｍグリシン含有ＰＢＳでカラムを洗浄する。ＲＳＨＺ−１９は、約３カラム体積の溶離バッファーを適用することにより低ｐＨバッファーとともに溶離する。
蛋白Ａクロマトグラフィーにより細胞および培地由来の不純物の大部分が除去され（詳細には、素通りおよび洗浄画分中に蛋白およびＤＮＡ）、さらなる取り扱い用に溶離バッファー中にＲＳＨＺ−１９が濃縮される。
酸性ｐＨにおけるウイルス不活性化（所望により行ってもよい）
蛋白Ａカラム溶出液を集め、２．５ＭＨＣｌの添加によりｐＨ３．５に調節する。溶液を次の容器に移し、少なくとも３０分間ｐＨ３．５に維持してウイルス不活性化を行い、トリスバッファーの添加によりｐＨ５．５に再調節する。得られた溶液をプレフィルター（ミリポア・ポリガード（Millipore Polygard）または等価物）および滅菌済み０．２μｍフィルター（ミリポア・ミリパック（Millipore Millipak）または等価物）により濾過し、４℃において滅菌済み容器中に保存するか、または−７０℃で凍結保存する。
ｐＨ３．５での処理によりウイルス不活性化が行われ、ｐＨ５．５に調節することによりカチオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＣ）用の溶液が調製される。所望ならば、ｐＨ３．５の処理は省略することができる。
カチオン交換クロマトグラフィー
ｐＨ不活性化蛋白Ａ溶出液を、ＣＭセファロースＦＦ（ファルマシアＬＫＢ（Pharmacia LKB））カラムによるＣＥＣクロマトグラフィーによりさらに精製する。流速を１５０ｃｍ／時とし、負荷比を１リットルのＣＭセファロースあたり≦２０グラムの蛋白として試料を平衡化されたカラムに適用する。負荷後、カラムを、３ないし５カラム体積の平衡化バッファーで洗浄する。生成物は３〜５カラム体積の溶離バッファーとともに溶離する。
該カチオン交換クロマトグラフィー工程により蛋白性および非蛋白性不純物が除去される。
グアニジンでのウイルス不活性化
２分の１体積のグアニジンストック溶液をゆっくりと添加（撹拌しながら）することにより、カチオン交換溶出液を約２．０Ｍのグアニジン塩酸濃度とする。５〜１５分かけて添加するように試薬添加速度を調節する。溶液を次の容器に移し、３０分間保持してウイルス不活性化を行う。保持後、同体積の硫酸アンモニウムストック溶液をゆっくりと添加（撹拌しながら）し、疎水性クロマトグラフィー（ＨＩＣ）工程を即座に行う。５〜１５分かけて添加するように試薬添加速度を調節する。
酸不活性化工程を用いた場合には、グアニジン処理により２回目のウイルス不活性化工程が提供され、硫酸アンモニウム添加後ＲＳＨＺ−１９は可溶性のままである。硫酸アンモニウムの添加によりグアニジンは希釈され、ＨＩＣ用溶液が調製される。
疎水性相互作用クロマトグラフィー
前以て平衡化バッファーで平衡化しておいたトヨパールフェニル−６５０ＭからなるＨＩＣカラムへの適用により、グアニジン処理溶液をさらに精製する。流速を１５０ｃｍ／時とし、負荷比を１リットルのフェニル−６５０Ｍあたり≦２０グラムの蛋白としてグアニジン処理溶液をカラムに適用する。負荷後、カラムを、３ないし５カラム体積の平衡化バッファーで洗浄する。流速１００〜１５０ｃｍ／時で硫酸アンモニウムを減じていく直線グラジエントを適用すると、ＲＳＨＺ−１９は１つの主要ピークとして溶離し、不純物はグラジエントの後の方で溶離する。グラジエントの勾配はカラム体積の約２０倍であり、１００％平衡化バッファーから開始して１００グラジエントバッファーで終了する（硫酸アンモニウム１．３Ｍから０Ｍまで）。吸光度が最大ピーク吸光度の２０％に減少するまでピークを集め、次いで、生成物フラクションの収集を終了する。グラジエント終了後、約３カラム体積の洗い流し用バッファーでカラムを洗浄する。
ＨＩＣクロマトグラフィー工程によりさらなる蛋白性および非蛋白性不純物が除去され、最も明らかな残存物は、蛋白Ａ、ＩｇＧ凝集物、および宿主ＤＮＡである。
濃縮、透析濾過および最終濾過
分子量３００００カットオフのフィルターを装備した交差流れ限界濾過装置（ミリポアＣＵＦのごとき）を用いてＨＩＣ溶出液を１ミリリットルあたり約１０ミリグラムにまで濃縮し、適当な処方バッファー中に透析濾過し、滅菌済み０．２μｍフィルター（ミリポア・ミリパック（Millipore Millipak）または等価物）で滅菌済み容器中に濾過する。
イン−プロセスアッセイ（In-Process Assays）
ＯＤ２８０またはブラッドフォードアッセイによる全蛋白濃度、ＨＰＬＣ、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によるＲＳＨＺ−１９濃度に関してプロセスの中間生成物をアッセイする。凝集生成物をＴＳＫ３０００ＳＷＸＬによるサイズ排除ＨＰＬＣによってアッセイし、蛋白Ａ残余をＥＬＩＳＡを用いてアッセイする。
貯留の判断基準
蛋白Ａ捕捉およびカチオン交換工程からの溶離フラクションを、クロマトグラム上のＵＶ追跡に基づいて貯留し、ビーク全体を集める。ＨＩＣ工程からの溶出液をＵＶ追跡に基づいて貯留し、ピークのテイリングがピークの最大値の２０％に達するまで主ピークを貯留しておく。ＨＩＣテイリング部分のフラクションは蛋白Ａおよび凝集ＩｇＧを含む。

実施例ＩＡ．トヨパールフェニル−６５０Ｍを用いる１グラムスケールのＲＳＨＺ−１９精製
５．０リットル（直径２０ｃｍ、長さ１６ｃｍ）のＰｒｏＳｅｐＡアフィニティーカラムを、５．２リットル／分のＰＢＳ（表１参照）で平衡化した。１リットルあたり０．８グラムのＲＳＨＺ−１９モノクローナル抗体を含有する１００リットルのならし培地を上記精密濾過により清澄化し、流速５．２リットル／分でカラムに適用した。負荷後、約１５リットルのＰＢＳ／グリシンを同じ流速でカラムに適用した。１５〜２０リットルのＰｒｏＳｅｐＡ溶離バッファーを適用することによりＩｇＧを溶離した。非結合物ピークおよび溶出液ピークのフラクションを集め、ＨＰＬＣアッセイを用いてＩｇＧ含量についてアッセイした。溶出液は体積約１５リットルであり、１ミリリットルあたり約５ミリグラムの蛋白を含有していた。
溶離後すぐに、２．５Ｍ塩酸の添加により試料をｐＨ３．５に調節し、約３０分保ち、次いで、約３５０ミリリットルの１Ｍトリス塩基の添加によりｐＨ５．５に調節した。ｐＨ５．５に中和後、滅菌済み０．２ミクロンのミリパック２００（Millipak 200）に直列接続した０．１ミクロンのポリガードＣＲ（Polygard CR）フィルターで試料を滅菌済み容器中に濾過した。濾液を４℃で貯蔵した。濾液試料を、ＨＰＬＣを用いてＩｇＧ含量について、２８０ナノメーターにおける吸光度により全蛋白について分析した。ＥＬＩＳＡ法により試料を蛋白Ａ含量についても分析した。このｐＨ３．５処理され濾過されたＰｒｏＳｅｐＡ溶出液を、実施例ＩＡ、ＢおよびＣにおけるＣＭセファロース負荷物として使用した。
４００ミリリットルのｐＨ３．５処理され濾過されたＰｒｏＳｅｐＡ溶出液を、前以てＣＭ平衡化バッファーで平衡化しておいた２００ミリリットル（直径４．４ｃｍ、長さ１５ｃｍ）のＣＭセファロースＦＦカラムに３８ｍＬ／分で直接負荷した。負荷後、３８ｍＬ／分の約７００ミリリットルのＣＭ平衡化バッファーで洗浄した。ＣＭ溶離バッファーを３８ｍＬ／分で適用することによりＩｇＧを溶離した。約１ベッド体積の溶離バッファーを流した後ＩｇＧが溶離してきた。ピーク全体をＣＭセファロース溶出液として集めた。ＣＭ非結合、溶出液、洗い流しのフラクションを集め、上記のごとくＩｇＧ含量、全蛋白含量、および蛋白Ａ含量について分析した。溶出液は体積約１６０ミリリットルであり、１ミリリットルあたり約１２ミリグラムの蛋白を含有していた。このＣＭセファロース溶出液を約８０ミリリットルの２つの等しい部分に分け、ＨＩＣ負荷用に実施例ＩＡおよびＩＢにおいて使用した。
８０ミリリットルのＣＭセファロース溶出液に、全部で４０ミリリットルのグアニジンストック溶液を添加した（一定の撹拌をしながらゆっくりと）。これによりウイルス不活性化用のグアニジン濃度が２Ｍとなった。グアニジン処理された溶液を撹拌する間、全部で１２０ミリリットルの２．６Ｍ硫酸アンモニウムストック溶液を添加した。得られた溶液は１．０Ｍグアニジン、１．３Ｍ硫酸アンモニウムとなった。該硫酸アンモニウム処理溶液を、前以てフェニル平衡化バッファーで平衡化しておいた８０ｍＬのトヨパールフェニル−６５０Ｍカラム（直径３．２ｃｍｘ長さ１０ｃｍ）に適用した。操作中一貫流速は２０ｍＬ／分であった。負荷後、約３５０ミリリットルのフェニル平衡化バッファーでカラムを洗浄した。８５％平衡化バッファー／１５％グラジエントバッファーから始めて０％平衡化バッファー／１００％グラジエントバッファーで終了する、１８〜１９カラム体積の直線的グラジエントを適用することによりＩｇＧを溶離した。このことは、出発硫酸アンモニウム濃度が約１．１Ｍで、最終濃度が０Ｍであることを意味する。このグラジエントの勾配は、１カラム体積あたり約４．７％の溶離バッファーの増加、あるいは１カラム体積あたり−０．０６１Ｍの硫酸アンモニウムの増加であった。ＩｇＧは、グラジエント中約７カラム体積で溶離し始め、約１３カラム体積で溶離終了した（硫酸アンモニウム濃度約０．７Ｍから０．３Ｍまで）。ピークのテイリングサイドのＵＶ吸光度がピーク高さの２０％にまで低下するまで溶離フラクションを集め、次いで、別の容器に切り替えて集めた（テイルフラクション（tail fraction））。グラジエント終了時に、約２５０ｍＬのＨＩＣ洗い流しバッファーを適用してカラムを再生した。フェニル非結合、溶出液、テイルおよび洗い流しフラクションを集め、上記のごとくＩｇＧ含量、全蛋白含量、および蛋白Ａ含量について分析した。溶出液は体積約３００ミリリットルであり、１ミリリットルあたり約２．４ミリグラムの蛋白を含有していた。
表２は、この実施例に関するカラムパラメーターをまとめる。１ミリグラムＩｇＧあたりの蛋白Ａのナノグラム数（ｎｇ／ｍｇ）として表示した蛋白Ａ含量とともに、各工程に関する生成物および蛋白回収率のデータを表３に示す。表３からわかるように、フェニル−６５０Ｍで蛋白Ａは約４倍に減少し、回収率は約９４％である。

実施例ＩＢ．トヨパールブチル−６５０Ｍを用いる１グラムスケールでのＲＳＨＺ−１９精製
この標品には上記実施例ＩＡと同じＣＭセファロース溶出液を用い、フェニル−６５０Ｍのかわりにトヨパールブチル−６５０Ｍを用いてＨＩＣ工程を行った。ＣＭセファロース溶出液の調製は上記実施例ＩＡに記載してある。８０ミリリットルのＣＭセファロース溶出液に、全部で４０ミリリットルのグアニジンストック溶液を添加した（一定の撹拌をしながらゆっくりと）。これによりウイルス不活性化用のグアニジン濃度が２Ｍとなった。グアニジン処理された溶液を撹拌する間、全部で１２０ミリリットルの２．０Ｍ硫酸アンモニウムストック溶液を添加した。得られた溶液は１．０Ｍグアニジン、１．０Ｍ硫酸アンモニウムとなった。該硫酸アンモニウム処理溶液を、前以てブチル平衡化バッファーで平衡化しておいた８０ｍＬのトヨパールブチル−６５０Ｍカラム（直径３．２ｃｍｘ長さ１０ｃｍ）に適用した。操作中一貫流速は２０ｍＬ／分であった。負荷後、約３５０ミリリットルのブチル平衡化バッファーでカラムを洗浄した。６５％平衡化バッファー／３５％グラジエントバッファーから始めて２０％平衡化バッファー／８０％グラジエントバッファーで終了する、１２〜１３カラム体積の直線的グラジエントを適用することによりＩｇＧを溶離した。このことは、出発硫酸アンモニウム濃度が約０．６５Ｍで、最終濃度が約０．２Ｍであることを意味する。このグラジエントの勾配は、１カラム体積あたり約３．３％の溶離バッファーの増加、あるいは１カラム体積あたり−０．０３３Ｍの硫酸アンモニウムの増加であった。ＩｇＧは、グラジエント中約２カラム体積で溶離し始め、約９カラム体積で溶離終了した（硫酸アンモニウム濃度約０．５８Ｍから０．３５Ｍまで）。ピークのテイリングサイドのＵＶ吸光度がピーク高さの１０％にまで低下するまで溶離フラクションを集め、次いで、別の容器に切り替えて集めた。グラジエント終了時に、約２５０ｍＬのブチルグラジエントバッファーを適用し、溶離した小ピークを集めた。約２５０ｍＬのＨＩＣ洗い流しバッファーを適用してカラムを再生した。ブチル非結合、溶出液、テイルおよび洗い流しフラクションを集め、上記のごとくＩｇＧ含量、全蛋白含量、および蛋白Ａ含量について分析した。溶出液は体積約４００ミリリットルであり、１ミリリットルあたり約１．５ミリグラムの蛋白を含有していた。
表４は、この実施例に関するカラムパラメーターをまとめる。１ミリグラムＩｇＧあたりの蛋白Ａのナノグラム数（ｎｇ／ｍｇ）として表示した蛋白Ａ含量とともに、各工程に関する生成物および蛋白回収率のデータを表５に示す。実施例ＩＡと比較するとＩｇＧの回収率は低いが（９４％に対して７９％）、ＨＩＣ工程としてブチル−６５０Ｍを用いると蛋白Ａ含量は約２０倍減少した。

実施例ＩＣ：トヨパールフェニル−６５０Ｍを用いる４０グラムスケールでのＲＳＨＺ−１９精製
この標品には上記実施例ＩＡと同じＰroＳepＡ溶出液を用い、ＨＩＣ媒体としてトヨパールフェニル−６５０Ｍを用いて約４０ｇの蛋白を取り扱えるように下流工程をスケールアップした。ＣＭセファロース負荷物の調製は上記実施例ＩＡに記載してある。７．８リットルのｐＨ処理され濾過されたＰｒｏＳｅｐＡ溶出液を、前以て１．２Ｌ／分のＣＭセファロースバッファーで平衡化しておいた４．２リットル（直径２５ｃｍｘ長さ８．５ｃｍ）のＣＭセファロースＦＦのカラムに直接負荷した。負荷後、１．２Ｌ／分の約８リットルのＣＭ平衡化バッファーで洗浄した。ＣＭ溶離バッファーを１．２Ｌ／分で適用することによりＩｇＧを溶離した。約１ベッド体積の溶離バッファーを流した後、ＩｇＧがカラムから出てきた。ピーク全体をＣＭセファロース溶出液として集めた。ＣＭ非結合および溶出液のカラムフラクションを集め、ＩｇＧ含量、全蛋白含量、および蛋白Ａ含量について上記のごとく分析した。溶出液は体積約５．７リットルであり、１ミリリットルあたり約６〜７ミリグラムの蛋白を含有していた。
５．６リットルのＣＭセファロース溶出液に、全部で２．８リットルのグアニジンストック溶液（重量で３．２キログラム）を添加した（一定の撹拌をしながらゆっくりと）。これによりウイルス不活性化用のグアニジン濃度が２Ｍ、体積８．３リットルとなった。グアニジン処理された溶液を撹拌する間、全部で８．３リットルの２．６Ｍ硫酸アンモニウムストック溶液を添加した。得られた溶液は１．０Ｍグアニジン、１．３Ｍ硫酸アンモニウム、最終体積１６．７リットルとなった。該硫酸アンモニウム処理溶液を、前以てフェニル平衡化バッファーで平衡化しておいた4.6リットルのトヨパールフェニル−６５０Ｍカラム（直径１８ｃｍｘ長さ１８ｃｍ）に適用した。操作中一貫流速は０．５〜０．６Ｌ／分であった。負荷後、約１４リットルのフェニル平衡化バッファーでカラムを洗浄した。１００％平衡化バッファーから始めて１００％グラジエントバッファーで終了する、２０カラム体積の直線的グラジエントを適用することによりＩｇＧを溶離した。このことは、出発硫酸アンモニウム濃度が約１．３Ｍで、最終濃度が０Ｍであることを意味する。このグラジエントの勾配は、１カラム体積あたり約５％の溶離バッファーの増加、あるいは１カラム体積あたり−０．０６５Ｍの硫酸アンモニウムの増加であった。ＩｇＧは、グラジエント中約７カラム体積で溶離し始め、約１２カラム体積で溶離終了した（硫酸アンモニウム濃度約０．８５Ｍから０．５Ｍまで）。ピークのテイリングサイドのＵＶ吸光度がピーク高さの２０％にまで低下するまで溶離フラクションを集め、次いで、別の容器に切り替えて集めた（テイル）。フェニル非結合、溶出液およびテイルおよび洗い流しフラクションを集め、上記のごとくＩｇＧ含量、全蛋白含量、および蛋白Ａ含量について分析した。溶出液は体積約１５．４Ｌであり、１ミリリットルあたり約２．２ミリグラムの蛋白を含有していた。
分子量３００００ＣＯオメガ膜（フィルトロン・コーポレイション（Filtron Corp））を装備した交差流れ装置（ＣＵＦ、ミリポア・コーポレイション（Millipore Corp））を用いてフェニル溶出液を約１６ｍｇ／ｍＬにまで濃縮し、適当な処方のバッファーに対する透析濾過によりバッファー交換を行った。
表６は、この実施例に関するカラムパラメーターをまとめる。ＩｇＧ１ミリグラムあたりの蛋白Ａのナノグラム数（ｎｇ／ｍｇ）として表示した蛋白Ａ含量とともに、各工程に関する生成物および蛋白回収率のデータを表７に示す。表７からわかるように、フェニル−６５０Ｍでの蛋白Ａの減少は約３倍で、回収率は約９０％である。ＩｇＧ凝集物は、ＣＭセファロース溶出液中０．５％から、処方された生成物中０．０６％にまで減少した。

実施例１Ｄ．トヨパールフェニル−６５０Ｍを用いる１２５グラムスケールのＲＳＨＺ−１９精製
５．５リットル（直径２０ｃｍ、長さ１８ｃｍ）のＰｒｏＳｅｐＡアフィニティーカラムを、４．８リットル／分のＰＢＳ（表１参照）で平衡化した。１リットルあたり０．９４グラムのＲＳＨＺ−１９モノクローナル抗体を含有する４５０リットルのならし培地を上記精密濾過により清澄化し、４つの別個の９０〜９５リットルの部分および１つの４０リットルの部分として流速４．８リットル／分（以後一貫して）でカラムに適用した。カラム上での各サイクルを以下のように行った：負荷後、約１７リットルのＰＢＳ／グリシンを同じ流速でカラムに適用した。１５〜２０リットルのＰｒｏＳｅｐＡ溶離バッファーを適用することによりＩｇＧを溶離した。非結合物ピークおよび溶出液ピークのフラクションを集め、ＨＰＬＣアッセイを用いてＩｇＧ含量についてアッセイした。各サイクルからの溶出液は体積約９リットルであり、１ミリリットルあたり約５〜１０ミリグラムの蛋白を含有していた。溶離後すぐに、２．５Ｍ塩酸の添加によりＰｒｏＳｅｐＡ溶出液をｐＨ３．５に調節し、約３０分保ち、次いで、約２５０ミリリットルの１Ｍトリス塩基の添加によりｐＨ５．５に調節した。ｐＨ５．５に中和後、溶出液を一緒にし、滅菌済み０．２ミクロンのミリパック２００（Millipak 200）に直列接続した０．１ミクロンのポリガードＣＲ（Polygard CR）フィルターで溶出液のうち５リットルを滅菌済み容器中に濾過した。濾液を４℃で貯蔵した。濾液試料を、ＨＰＬＣを用いてＩｇＧ含量について、２８０ナノメーターにおける吸光度により全蛋白について分析した。ＥＬＩＳＡ法により試料を蛋白Ａ含量について、ＨＰＬＣによりＩｇＧ凝集物についても分析した。
約１２０〜１４０グラムの蛋白を取り扱えるように下流工程をスケールアップした。１６．３リットルのｐＨ３．５処理され濾過されたＰｒｏＳｅｐＡ溶出液を、前以てＣＭ平衡化バッファーで平衡化しておいた１４．４リットル（直径３５ｃｍ、長さ１５ｃｍ）のＣＭセファロースＦＦカラムに２．４Ｌ／分で直接負荷した。負荷後、２．４Ｌ／分の約４５リットルのＣＭ平衡化バッファーで洗浄した。ＣＭ溶離バッファーを２．４Ｌ／分で適用することによりＩｇＧを溶離した。約１〜２ベッド体積の溶離バッファーを流した後ＩｇＧが溶離してきた。ピーク全体をＣＭセファロース溶出液として集めた。ＣＭ非結合物、溶出液を集め、上記のごとくＩｇＧ含量、全蛋白含量、およびＩｇＧ凝集物について分析した。溶出液は体積約２１リットルであり、約１２０グラムの蛋白を含有していた。
１９．４リットルのＣＭセファロース溶出液に、全部で９．７リットルのグアニジンストック溶液を添加した（一定の撹拌をしながらゆっくりと）。これによりウイルス不活性化用のグアニジン濃度が２Ｍ、体積２９．１リットルとなった。グアニジン処理された溶液を撹拌する間、全部で２９．１リットルの２．６Ｍ硫酸アンモニウムストック溶液を添加した。得られた溶液は１．０Ｍグアニジン、１．３Ｍ硫酸アンモニウム、最終体積５８．２リットルとなった。該硫酸アンモニウム処理溶液を、前以てフェニル平衡化バッファーで平衡化しておいた１２．４リットルのトヨパールフェニル−６５０Ｍカラム（直径３０ｃｍｘ長さ１８ｃｍ）に適用した。操作中一貫流速は１．１〜１．３Ｌ／分であった。負荷後、約３７リットルのフェニル平衡化バッファーでカラムを洗浄した。８０％平衡化バッファー／２０％グラジエントバッファーから始めて２０％平衡化バッファー／８０％グラジエントバッファーで終了する、１２カラム体積の直線的グラジエントを適用することによりＩｇＧを溶離した。このことは、出発硫酸アンモニウム濃度が約１．０Ｍで、最終濃度が約０．２６Ｍであることを意味する。このグラジエントの勾配は、１カラム体積あたり約５％の溶離バッファーの増加、あるいは１カラム体積あたり−０．０６５Ｍの硫酸アンモニウムの増加であった。ＩｇＧは、本質的にグラジエント中央部分で溶離し、ピークは約０．８Ｍの硫酸アンモニウムを含んでいた。ピークのテイリングサイドのＵＶ吸光度がピーク高さの２０％にまで低下するまで溶離フラクションを集め、次いで、別の容器に切り替えて集めた（テイル）。フェニル非結合、溶出液、テイルおよび洗い流しフラクションを集め、上記のごとくＩｇＧ含量、全蛋白含量、およびＩｇＧ凝集物について分析した。溶出液は体積約２９リットルであり、約１００グラムの蛋白を含有していた。
分子量３００００ＣＯオメガ膜（フィルトロン・コーポレイション（Filtron Corp））を装備した交差流れ装置（ＣＵＦ、ミリポア・コーポレイション（Millipore Corp））を用いてフェニル溶出液を約１０ｍｇ／ｍＬにまで濃縮し、適当な処方のバッファーに対する透析濾過によりバッファー交換を行った。生成物を、ＩｇＧ含量、全蛋白、蛋白ＡおよびＩｇＧ凝集物について分析した。
表８は、この実施例に関するカラムパラメーターをまとめる。１ミリグラムＩｇＧあたりの蛋白Ａのナノグラム数（ｎｇ／ｍｇ）として表示した蛋白Ａ含量とともに、各工程に関する生成物および蛋白回収率のデータを表９に示す。表９からわかるように、フェニル−６５０Ｍでの蛋白Ａ減少は約７倍であり、回収率は約７０％である。ＩｇＧ凝集物は、ＣＭセファロース溶出液中０．４％から、処方された生成物中０．０６％に減少した。

実施例II
抗ＣＤ−４モノクローナル抗体ＣＨ−ＣＤ１４を細胞培養法により作成し、アニオン交換樹脂を用いた以外は実施例Ｉで用いたのと同様の方法で蛋白Ａおよびイオン交換クロマトグラフィーを用いて部分精製した。アミコンカラム（直径１ｃｍ、高さ１０ｃｍ）に８ｍＬのフェニルトヨパール６５０Ｍ樹脂（ロット番号６５ＰＨＭ０１Ｈ）を充填した。すべての工程の間、流速を２ｍＬ／分に維持した。２０ｍＬの平衡化バッファー（１Ｍ硫酸アンモニウム、５０ｍＭリン酸ナトリウム，ｐＨ７．０）でカラムを平衡化した。５ｍＬの部分精製ＣＨ−ＣＤ４モノクローナル抗体（２８０ｎｍにおける吸光度による濃度１７ｍｇ／ｍＬ）を取り、２．５ｍＬの６ＭグアニジンＨＣｌ、５０ｍＭリン酸ナトリウム，ｐＨ７．０を添加し、混合し、３０分間保持し、次いで、７．５ｍＬの２Ｍ硫酸アンモニウム、５０ｍＭリン酸ナトリウム，ｐＨ７．０を添加することにより生成物をカラム負荷用に調製した。負荷物の最終硫酸アンモニウム濃度は１Ｍ、最終グアニジン濃度は１Ｍ、試料を取った後の最終体積は１２ｍＬ、最終生成物濃度は５．６ｍｇ／ｍＬであった。次いで、この材料を２ｍＬ／分でカラムに負荷し、次いで、平衡化バッファーから５０ｍＭリン酸ナトリウム，ｐＨ７．０までの１０カラム体積の直線的グラジエントで溶離した。カラムから溶離される生成物として約４ｍＬのフラクションを取った。
結果を表１１に示す。結局、すべての生成物がグラジエントで溶離した。蛋白Ａも溶離され、グラジエントの後ろの方のフラクションに多かった。最終生成物中の蛋白Ａを減少させるためには、グラジエントの終わりのいくつかのフラクションを排除することが必要であり、かくして、生成物収率が低下した。生成物収率８６％で蛋白Ａの２倍の減少が可能であり、収率５０％では３倍の減少が可能であった。

実施例IIＢ：
ＣＨ−ＣＤ４モノクローナル抗体を部分精製し、実施例IIＡ記載のＨＩＣカラムに負荷するために調製した。実施例IIＡ記載と同一のカラム、流速、平衡化および負荷を用いた。この実施例において、カラムに負荷し、平衡化バッファーで洗浄した後、カラムを１８ｍＬの洗浄バッファー（１Ｍ硫酸アンモニウム、５０ｍＭクエン酸ナトリウム，ｐＨ３．５）で洗浄した。次いで、１３．５ｍＬの平衡化バッファー（実施例IIＡに記載）でさらに洗浄した。グラジエントでカラムの溶離を行い、次いで、実施例IIＡ記載のごとく水洗した。カラム溶出液を１４個のフラクションに分け、次いで、それらを生成物および蛋白Ａについて分析した。
結果を表１２に示す。９０％収率において蛋白Ａは６倍減少し、収率７８％では８倍減少した。

実施例IIＢの結果を実施例IIＡと比較すると、ｐＨ３．５での洗浄を用いた場合、約８０％の収率で、蛋白Ａは６ないし８倍減少したが、ｐＨ３．５での洗浄をしなかった場合には、ＣＨ−ＣＤＨ収率８０％で、蛋白Ａはわずか２倍減少しただけであった。
実施例IIＣ：
スケールを増大させた以外は、実施例IIＢと同様にしてこの実施例を行った。平衡化および洗浄バッファーは実施例IIＢに記載してある。カラムは直径５ｃｍ、高さ２８ｃｍであり、流速は５０ｍＬ／分であった。実施例IIＡ記載のごとくＣＨ−ＣＤ４モノクローナル抗体を調製し、部分精製した。部分精製生成物（４４０ｍＬ）を２２０ｍＬの６ＭグアニジンＨＣｌと３１分間混合した。次いで、６６０ｍＬの２Ｍ硫酸アンモニウム、５０ｍＭリン酸ナトリウム，ｐＨ７．０を添加した。最終硫酸アンモニウム濃度は１Ｍであり、最終抗体濃度は５．３ｍｇ／ｍＬであった。サンプリング後の負荷体積は１２９０ｍＬであった。
２カラム体積の平衡化バッファーでカラムを平衡化し、次いで、カラムに負荷した。次いで、カラムを６３０ｍＬの平衡化バッファー、１０００ｍＬの洗浄バッファー、８００ｍＬの平衡化バッファーで洗浄し、次いで、０．７５Ｍ硫酸アンモニウム、５０ｍＭリン酸ナトリウム，ｐＨ７．０から５０ｍＭリン酸ナトリウム，ｐＨ７．０までの５カラム体積のグラジエントで溶離した。溶離の間にフラクションを集めた。
結果を表１３に示す。収率７０％で、蛋白Ａは１００倍減少し、あるいは収率８０％で、３０倍減少した。

実施例IIＤ
部分精製ＣＨ−ＣＤ４モノクローナル抗体を実施例IIＡに示すように調製した。平衡化および洗浄バッファーは実施例IIＢに記載されている。４ミリリットルの６ＭグアニジンＨＣｌ、５０ｍＭリン酸ナトリウム，ｐＨ７．０を部分精製ＣＨ−ＣＤ４モノクローナル抗体９．５ｍｇ／ｍＬ溶液８ｍＬに添加し、３０分インキュベーションした。次いで、１２ｍＬの２Ｍ硫酸アンモニウム、５０ｍＭリン酸ナトリウム，ｐＨ７．０をゆっくりと添加した。カラムは直径０．５ｃｍ、高さ２０ｃｍ（４ｍＬ）であり、すべての工程に関して流速は０．５ｍＬ／分であった。カラムを２カラム体積の水および平衡化バッファーそれぞれですすいだ。次いで、２２ｍＬの負荷溶液をカラムに通し、次いで、２カラム体積の平衡化バッファーを通し、その後、カラム溶出液のｐＨが３．５になるまで平衡化バッファーを通した。０．３Ｍ硫酸アンモニウム、５０ｍＭリン酸ナトリウム，ｐＨ７．０でカラムを溶離した。ＵＶトレース値が上昇し始めた後、１２．６ｍＬの溶出液を集め、生成物および蛋白Ａについて分析した。生成物の収率は８０％で、蛋白Ａは２８ｎｇ／ｍｇから６ｎｇ／ｍｇに減少し、４．７倍の減少であった。

Claims

モノマーＩｇＧ抗体およびプロテインＡを含有する混合物からモノマーＩｇＧ抗体を精製する方法であって、（ｉ）該混合物を疎水性相互作用クロマトグラフィー支持体と接触させ、次いで、（ｉｉ）モノマーＩｇＧ抗体を支持体から選択的に溶離することを特徴とする方法。
疎水性相互作用クロマトグラフィー支持体がアルキルＣ２〜Ｃ８アガロース、アリール−アガロース、アルキル−シリカ、アリール−シリカ、アルキル有機ポリマー樹脂およびアリール有機ポリマー樹脂からなる群より選択される請求項１記載の方法。
支持体がブチル−、フェニル−ならびにオクチル−アガロース、およびブチル−、フェニル−ならびにエーテル−有機ポリマー樹脂からなる群より選択される請求項２記載の方法。
支持体がフェニル−有機ポリマー樹脂である請求項３記載の方法。
支持体がブチル−有機ポリマー樹脂である請求項３記載の方法。
低塩バッファーで抗体が選択的に溶離される請求項１記載の方法。
塩を減少させて５０ｍＭリン酸塩，ｐＨ７．０に至るグラジエントで抗体が選択的に溶離される請求項６記載の方法。
ＩｇＧ抗体を含有するならし細胞培地からのＩｇＧ抗体の精製方法であって、培地を（ａ）プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー、（ｂ）イオン交換クロマトグラフィー、次いで（ｃ）疎水性相互作用クロマトグラフィーに順次供することを特徴とする方法。
イオン交換クロマトグラフィーが、ＣＭ−２３−、ＣＭ−３２−、ＣＭ−５２−セルロース；ＣＭ−ならびにＳＰ−架橋デキストラン、ＣＭ−ならびにＳ−アガロース；ＣＭ−有機ポリマー樹脂；ＤＥＡＥ−、ＱＡＥ−、Ｑ−架橋デキストラン；ＤＥＡＥ−、ＱＡＥ−、Ｑ−結合アガロース；およびＤＥＡＥ有機ポリマー樹脂からなる群より選択される支持体を用いるものであり、緩衝化された塩溶液によるものである請求項８記載の方法。
支持体がＣＭ−アガロースファストフロー（CM-agarose Fast Flow）であり、塩がＮａＣｌである請求項９記載の方法。
緩衝化された塩溶液が１００ｍＭＮａＣｌを含有するｐＨ６．０の４０ｍＭクエン酸塩である請求項９記載の方法。
疎水性相互作用クロマトグラフィーが、アルキルＣ２〜Ｃ８−アガロース、アリール−アガロース、アルキル−シリカ、アリール−シリカ、アルキル−有機ポリマー樹脂およびアリール−有機ポリマー樹脂からなる群より選択される支持体を用いるものである請求項８記載の方法。
支持体がブチル−、フェニル−ならびにオクチル−アガロース、およびブチル−、フェニル−ならびにエーテル−有機ポリマー樹脂からなる群より選択される請求項１２記載の方法。
支持体がフェニル−有機ポリマー樹脂またはブチル−有機ポリマー樹脂である請求項１３記載の方法。
支持体がフェニル−またはブチル−有機ポリマー樹脂であり、抗体が低塩バッファーで選択的に溶離される請求項８記載の方法。
５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー，ｐＨ７．０まで減少させるグラジエントで抗体が選択的に溶離される請求項１５記載の方法。
プロテインＡクロマトグラフィーがコントロールドポアガラス（controlled pore glass）に結合したプロテインＡを支持体として用い、溶離が低ｐＨバッファーにより行われる請求項８記載の方法。
該バッファーが２５ｍＭクエン酸塩，ｐＨ３．５である請求項１７記載の方法。
ならし細胞培地から抗体を精製する方法であって、以下の工程：
（ａ）抗体をプロテインＡクロマトグラフィー支持体上に吸着させ；
（ｂ）吸着抗体を少なくとも１種のバッファーで洗浄し；
（ｃ）工程（ｂ）からの抗体を溶離し；
（ｄ）工程（ｃ）からの抗体をイオン交換クロマトグラフィー支持体上に吸着させ；
（ｅ）吸着抗体を少なくとも１種のバッファーで洗浄し；
（ｆ）工程（ｅ）からの抗体を選択的に溶離し；
（ｇ）工程（ｆ）の溶出液を疎水性相互作用クロマトグラフィー支持体に吸着させ；
（ｈ）吸着抗体を少なくとも１種のバッファーで洗浄し；
（ｉ）吸着抗体を溶離し；次いで、
（ｊ）抗体を回収する
からなる方法。
存在する場合には任意に行われる１またはそれ以上のウイルス不活性化工程を包含する請求項１９記載の方法。
ウイルス不活性化工程が工程（ｆ）の後であって工程（ｇ）の前に行われる請求項２０記載の方法。
該ウイルス不活性工程が、ウイルスを不活性化するに十分な時間グアニジン塩酸で溶出液を処理し、次いで、硫酸アンモニウム溶液を添加することからなる請求項２１記載の方法。
グアニジン塩酸が２．０Ｍで存在し、処理後、工程（ｆ）からの溶出液が１．３Ｍ硫酸アンモニウムに調節される請求項２２記載の方法。
さらなるウイルス不活性化工程が工程（ｃ）の後であって工程（ｄ）の前に行われる請求項２１記載の方法。
該さらなるウイルス不活性化工程が、工程（ｃ）の溶出液を酸で処理することからなる請求項２４記載の方法。
溶出液のｐＨがｐＨ３．５に調節され、ウイルスを不活性化するに十分な時間該ｐＨに維持され、ｐＨを５．５に調節することにより該処理が終了する請求項２５記載の方法。
工程（ｄ）のイオン交換支持体が、カルボキシメチル（ＣＭ）、スルホエチル（ＳＥ）、スルホプロピル（ＳＰ）、ホスファート（Ｐ）、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）、４級アミノエチル（ＱＡＥ）、および４級（Ｑ）で置換されたセルロース樹脂、架橋デキストラン、アガロースおよび有機ポリマー樹脂からなる群より選択される請求項１９記載の方法。
カチオン支持体がＣＭ−アガロースである請求項２７記載の方法。
疎水性相互作用クロマトグラフィー支持体が、アルキルＣ２〜Ｃ８−アガロース、アリール−アガロース、アルキル−シリカ、アリール−シリカ、アルキル−有機ポリマー樹脂およびアリール−有機ポリマー樹脂からなる群より選択される請求項１９記載の方法。
支持体が、ブチル−、フェニル−ならびにオクチル−アガロース、およびフェニル−、エーテルならびにブチル−有機ポリマー樹脂からなる群より選択される請求項２９記載の方法。
支持体がフェニル−またはブチル−有機ポリマー樹脂である請求項３０記載の方法。
クロマトグラフィー工程（ｉ）からの蛋白含有フラクションを貯留し、限界濾過により濃縮することにより、該蛋白が回収される請求項１９記載の方法。
工程（ａ）のクロマトグラフィー支持体がコントロールドポアガラスに結合したプロテインＡである請求項１９記載の方法。
工程（ｈ）の吸着抗体が２種のバッファー、すなわち、第１の平衡化バッファーおよび第２の低ｐＨ洗浄バッファーで洗浄される請求項１９記載の方法。
第２のバッファーのｐＨが４．０未満である請求項３４記載の方法。
第２のバッファーが１Ｍ硫酸アンモニウム、５０ｍＭクエン酸ナトリウム，ｐＨ３．５である請求項３５記載の方法。
プロテインＡおよび抗体からなる混合物からプロテインＡを除去する方法であって、該混合物を疎水性相互作用クロマトグラフィー支持体と接触させ、次いで、支持体から抗体を選択的に溶離させることを特徴とする方法。
溶離の前に７．０未満のｐＨを有するバッファーで支持体を洗浄することを包含する請求項３７記載の方法。
洗浄バッファーのｐＨが４．０未満である請求項３８記載の方法。
バッファーが１Ｍ硫酸アンモニウム、５０ｍＭクエン酸ナトリウム，ｐＨ３．５である請求項３９記載の方法。