ES2074490T5

ES2074490T5 - Procedimiento para la elaboracion de un preparado de inmunoglobulina g tolerable por via intravenosa.

Info

Publication number: ES2074490T5
Application number: ES90105405T
Authority: ES
Inventors: Norbert Dr. Dipl.-Chem. Kothe; Dieter Dr. Dipl.-Chem. Rudnick; Detlef Dr. Dipl.-Chem. Piechaczek; Herwald Dr. Klein; Detlef Dr. Dipl.-Biol. Rohm; Michael Dr. Dipl.-Chem. Kloft
Original assignee: Biotest Pharma GmbH
Current assignee: Biotest Pharma GmbH
Priority date: 1990-03-22
Filing date: 1990-03-22
Publication date: 2004-02-16
Anticipated expiration: 2010-03-22
Also published as: EP0447585B1; EP0447585A1; JPH06107561A; EP0447585B2; DE59009020D1; ES2074490T3; DK0447585T3; DK0447585T4; US5164487A; ATE122054T1

Abstract

METODO Y ELABORACION DE UN PREPARADO G, QUE SOPORTA LA INMUNOGLOBINA INTRAVENENOSA, EL CUAL ESTA LIBRE DE GRUPOS, SUSTANCIAS VASOACTIVAS Y ENCIMAS PROTEOLITICAS Y ES APROPIADO PARA UN COLECTIVO DE PACIENTES, CONCRETAMENTE PARA LOS PACIENTES "INMUNOSUPRIMIDOS", QUE CONSTA DE UN MATERIAL DE SALIDA CON UN CONTENIDO G DE INMUNOGLOBINA, LIBRE DE FACTORES DE COAGULACION, CON UN TRATAMIENTO DE UN % DE VOLUMEN DE 0,4 A 1,5 DE ACIDOS DE OCTANO Y/O CON UNA CROMATOGRAFIA SIGUIENTE, ESPECIALMENTE, EN EL INTERCAMBIO DE CATIONES O ANIONES O DE UNA MATRIX DE CROMATOGRAFIA DE HIDROFOBEN.

Description

Procedimiento para la elaboración de un preparado de inmunoglobina G tolerable por vía intravenosa.

La invención se refiere al procedimiento descrito en las reivindicaciones de la patente para la elaboración de un preparado tolerable por vía intravenosa de inmunoglobulina G.

Desde hace muchos años, se utilizan preparados de inmunoglobulinas, obtenidos de plasma humano para la terapia de enfermedades inmunodeficitarias hereditarias y adquiridas. Originalmente la inmunoglobulina G se obtenía por precipitación fraccionada con etanol a partir de plasma humano. Los preparados elaborados de esta forma, sin embargo, sólo se podían administrar por vía intramuscular, puesto que su uso intravenoso daba lugar a gravísimos efectos secundarios.

En la administración intramuscular, la dosificación está limitada. Para alcanzar niveles suficientes de inmunoglobulinas en plasma, tal como es preciso en un tratamiento eficaz, era por tanto deseable la elaboración de preparados de inmunoglobulina G tolerables por vía intravenosa.

Hasta la fecha, se han descrito diversos procedimientos para este fin. Así, por ejemplo, la molécula de IgG se separó con enzimas o se modificó con reactivos químicos. Otros procedimientos describen la aplicación de etapas de precipitación, adsorción y cromatografía para elaborar preparados tolerables por vía intravenosa.

En las publicaciones "Krankenhauspharmazie", Año 6, Nº 5, 1985, pág. 226-231 (1) y "Der Bayerische Internist" 9, 1 1989, pág. 36-44 (2), se ofrece una panorámica de los procedimientos usados en esa época.

Todos los preparados allí descritos se pueden aplicar por vía intravenosa, si bien, dependiendo del tipo de elaboración, muestran diversos inconvenientes. Así, las inmunoglobulinas escindidas enzimáticamente tienen una semivida intravascular marcadamente reducida y no pueden desencadenar la activación del complemento, necesaria para la defensa contra las infecciones. Tampoco los preparados químicamente modificados pueden satisfacer todas las funciones biológicas. También en este caso se describen una reducida semivida intravascular, así como una activación alterada del complemento.

Al objeto de obviar los citados inconvenientes, se desarrollaron procedimientos mejorados para la elaboración de un preparado de IgG no modificada, tolerable por vía i.v.

Así, por ejemplo, el documento DE-A 30 39 855 da a conocer una filtración sobre una membrana de polisulfona, para eliminar, de forma especial, sustancias poliméricas (agregados).

En el documento DE-A 36 41 115 se propone efectuar una purificación por medio de polietilenglicoles para la eliminación de los agregados.

Sin embargo, con ninguno de los dos procedimientos resulta posible eliminar actividades proteolíticas o, respectivamente, sustancias vasoactivas. De estas sustancias, en especial del activador de la precalicreína (PKA), la precalicreína, el cininógeno y la calicreína, que pueden estar presentes en los preparados de inmunoglobulina G, se conoce sin embargo que pueden actuar como causantes de graves efectos secundarios, especialmente como desencadenantes de las reacciones de hipotensión (véase M.F. Makula y col., Develop. Biol. Standard, Vol. 67, 257-265, 1987; W.K. Bleeker y col., Vox. Sang. 52, 281-2190, 1987).

Los intentos de eliminar las enzimas proteolíticas mediante adsorción con bentonita, gel de sílice, sulfato de bario, carbón activado e intercambiadores de afinidad, no condujeron a una separación específica de todas las proteasas perturbadoras, sino que, dependiendo del procedimiento de elaboración de los preparados de inmunoglobulina G, se pudieron determinar cantidades al menos todavía diferentes de precalicreína, cininógeno y calicreína, con la utilización de procedimientos de medición inmunológicos y enzimáticos, incluso cuando no se puedo demostrar una cantidad significativa del activador de la precalicreína (PKA).

La administración de estos preparados que contienen las citadas sustancias condujo, aun cuando estos preparados fueron muy bien tolerados por vía i.v. en otras aplicaciones, a graves efectos secundarios, sobre todo en pacientes inmunosuprimidos. De Esta forma, incluso cuando no se demuestra la existencia de PKA, en presencia de precalicreína se puede liberar calicreína, la cual libera, a su vez, la bradicinina vasoactiva a partir del cininógeno de elevado peso molecular. Ello provoca, en función de la concentración, un descenso más o menos marcado de la tensión arterial. Esto tiene lugar sobre todo en pacientes cuyo potencial de inhibidor está alterado, como sucede en la inmunosupresión.

Por consiguiente, un preparado de inmunoglobulina G aplicable en general y tolerables por vía intravenosa, se impone la condición de que esté exento.

a) de agregados, de forma que sólo se produzca una baja activación inespecífica del sistema de complemento,

b) de enzimas proteolíticos,

c) de sustancias vasoactivas de los sistemas de coagulación y de cinina, como el activador de la precalicreína (PKA), precalicreína, cininogeno, calicreína, factor XI y factor XII

así como que

d) esté biológicamente intacta, es decir, que durante el proceso de elaboración no se produzcan alteraciones estructurales de la fracción Fc de la inmunoglobulina G y que no se empleen modificaciones químicas.

La presente invención tiene, por tanto, el objetivo de poner a punto un preparado de inmunoglobulina G que se pueda administrar a todos los colectivos de pacientes, tolerables por vía intravenosa y que esté exento de agregados, sustancias vasoactivas y actividad proteolítica, a base de un material de partida que contenga inmunoglobulina, como una fracción de suero libre de factores de coagulación que contenga inmunoglobulina G (Pasta de Cohn II o II/III).

Este objetivo se resuelve, según la invención, sometiendo al material de partida que contiene inmunoglobulina G, seleccionado de una fracción de gammaglobulina obtenida por fraccionamiento de Cohn (Pasta de Cohn II o II/III), o bien, de una solución que contiene inmunoglobulina G bruta, purificada previamente por cromatografía a partir del suero, a un tratamiento con 0,4-1,5% en volumen de ácido octanoico y a una cromatografía.

El uso del ácido octanoico está descrito en la literatura (Biochemistry and Biophysics 134, 279-284, 1969). El ácido octanoico se utiliza, aquí, en concentraciones de aproximadamente 6,8% en volumen para la precipitación de proteínas a partir del plasma o suero, mientras que la IgG se mantiene en el sobrenadante.

Sorprendentemente, se encontró que el ácido octanoico, a concentraciones de 0,4 hasta 1,5% en volumen y, preferentemente, de 0,8 hasta 1,0% en volumen, puede eliminar de forma específica enzimas proteolíticas y compuestos capaces de desencadenar reacciones vasoactivas como, por ejemplo, precalicreína, calicreína y cininógeno, de soluciones de IgG previamente purificadas, sin que provoque una precipitación apreciable de proteínas.

A partir de una solución así purificada que contenga inmunoglobulina G, se puede eliminar, seguidamente, el ácido octanoico por centrifugación, preferentemente –sin embargo- por filtración, bajo la adición de iones de calcio.

En las siguientes tablas 1 y 2 aparece reflejada la eficacia del tratamiento con ácido octanoico con respecto a la eliminación de enzimas proteolíticas, así como de sustancias vasoactivas, a partir de soluciones que contienen inmunoglobulina G^{1)}.

TABLA 1

Concentración de ácido octanoico (V/V %)	Actividad proteolítica (U/l)
0	850
0,4	23
0,6	1
0,8	0,0
1,0	0,0
1) Material de partida: Fracción bruta de inmunoglobulina G, del proceso de Cohn
(como en el ejemplo 1).

TABLA 2

Concentración de ácido octanoico (V/V %)	Precalicreína*	Calicreína*
0	++	++
0,8	-	-
81,0	-	-
1,5	-	-
* Determinación por inmunodifusión según Ouchterlony
1) Material de partida: Fracción bruta de inmunoglobulina G a partir de procesos
cromatográficos, como en el ejemplo 5.

Tal como muestran los resultados anteriores, de acuerdo con la invención, se eliminan las sustancias vasoactivas y los enzimas proteolíticos de las soluciones que contiene inmunoglobulina G.

En una etapa siguiente, la solución que contiene inmunoglobulina G se puede liberar por cromatografía de las moléculas agregadas de IgG.

Para ello resultan adecuadas las fases de cromatografía sobre gel de sílice o una base polimérica, donde se pueden utilizar intercambiadores tanto de cationes como de aniones.

Preferentemente, se utilizan aquellas fases de cromatografía adecuadas para la HPLC (cromatografía líquida de alto rendimiento), puesto que con este procedimiento se pueden elaborar grandes cantidades de inmunoglobulina G, en poco tiempo y de forma económica.

Con el empleo de intercambiadores catiónicos como, por ejemplo CM-Accell®, SP-Spherodex®, SP-Trisacryl-LS® o Fraktogel-TSK-SP 650®, la concentración salina de los eluentes se ajusta a 50-200 mM de cloruro sódico y el valor de pH a 4,0-6,0. Bajo estas condiciones se unen a los soportes y la fracción purificada de IgG atraviesa la matriz sin uniones.

De acuerdo con el mismo procedimiento, es posible llevar a cabo la eliminación de los agregados de las soluciones de inmunoglobulina G también con intercambiadores aniónicos como, por ejemplo, QMA- Accell® y DEAE-Spherosil®, ajustando la concentración de iones a 0-50 mM de cloruro sódico y un valor de pH de 6,0 hasta 8,0.

Además, se ha demostrado que por medio de las citadas fases de cromatografía, en especial con el uso de intercambiadores catiónicos o fases hidrófobas, se pueden eliminar las sustancias vasoactivas. Para ello se utilizan preferentemente fases cromatográficas en base al gel de sílice, como CM-Accell®, SP-Spherodex-M® y Polypropil-A®, o bien, en base a fases preparadas con polímeros sintéticos, como SP-Trisacryl-LS)R) y CM-Trisacryl-LS®.

En el caso de un intercambiador de cationes, se selecciona la fuerza iónica y el valor de pH de los eluentes de tal forma, que la fracción de inmunoglobulina G purificada atraviesa sin uniones la columna y las impurezas permanecen unidas a la fase de cromatografía.

En el caso de CM-Accel®, se utilizan, por ejemplo, soluciones tampón con una concentración salina de 50-200 mM de cloruro sódico, con un valor de pH de 4,0 hasta 6,0.

Si la purificación se lleva a cabo mediante cromatografía de interacción hidrófoba con Polypropil A®, la solución que contiene IgG se une con una solución tampón de sulfato de amonio altamente molar a la fase, las impurezas se eliminan por lavado posterior y, a continuación, se eluye la fracción de inmunoglobulina G con un gradiente de intensidad iónica de descenso lineal.

La eficacia de la eliminación cromatográfica de sustancias vasoactivas, a partir de soluciones de inmunoglobulina G, aparece representada en la tabla siguiente.

TABLA 3

Fracción IgG	Precalicreína*	Calicreína*
sin tratamiento	++	++
tras cromatografía SP	-	-
tras cromatografía CM	-	-
tras cromatografía sobre	-	-
Polypropil A®
* Determinación por inmunodifusión, según Ouchterlony
** Material de partida: fracción bruta de inmunoglobulina G de
procesos cromatográficos, como en el ejemplo 5.

De esta forma, se pueden elaborar preparados de inmunoglobulina G altamente purificados y tolerables por vía i.v., por medio del tratamiento, según la invención, con ácido octanoico y/o cromatografía. Para ello, se puede utilizar como material de partida una fracción de gammaglobulina obtenida por un fraccionamiento habitual de Cohn (Pasta de Cohn II o Pasta II/III, o soluciones correspondientes), tal como se obtienen en grandes cantidades en la fabricación a escala industrial de albúmina humana. Adicionalmente, el procedimiento según la invención se puede emplear también sobre fracciones de IgG aisladas por cromatografía. Estos materiales de partida se pueden obtener tanto de grupos de donantes normales, como, preferentemente, de donantes seleccionados, con títulos elevados de anticuerpos contra antígenos víricos, bacterianos o celulares.

De modo preferente, se utiliza como material de partida del procedimiento según la invención, fracciones brutas que contengan inmunoglobulina G de procesos cromatográficos o de Cohn, sometidas a un procedimiento de esterilización. Las fracciones cromatográficas contienen habitualmente aproximadamente 0,5 hasta 1,5% de agregados, que preferentemente se pueden eliminar por completo con intercambiadores catiónicos como, por ejemplo, CM-Acell®. Si se parte de una Pasta de Cohn II o II/III, que puede contener hasta un 5% de agregados, la completa eliminación de éstos se puede llevar a cabo, según la invención, con ayuda de CM-Acell® o QMA-Accell®. La eliminación de sustancias vasoactivas también se puede realizar por cromatografía, como se ha descrito anteriormente.

Siempre que haya enzimas proteolíticos, éstos se eliminan previamente por medio del ácido octanoico. Sin embargo, este paso se puede obviar en el caso de soluciones que contengan inmunoglobulina G caracterizada por una elevada pureza.

Dado que las fracciones plasmáticas o séricas aplicadas al procedimiento según la invención pueden estar contaminadas con virus patógenos para el ser humano, como la hepatitis A, B, No A B y VIH, es preferible someter a la solución que contiene inmunoglobulina G a una esterilización.

A tal fin, se pueden utilizar tratamientos, preferentemente previos a la etapa cromatográfica, con \beta-propiolactona, TNBP/Tween, TNBP/colato de Na, TNBP, dado el caso, en asociación con irradiación UV. En este sentido, es especialmente preferible la esterilización por medio de 0,03.0,1% en volumen de \beta-propiolactona, en combinación con una irradiación UV.

Los productos así elaborados, según la invención, se pueden almacenar de forma líquida o liofilizada.

La ventaja del procedimiento según la invención radica en el hecho de que se pueden purificar, de manera rápida y sencilla, los más diversos materiales de partida que contienen inmunoglobulina G, de modo que los productos purificados obtenidos se pueden administrar, por vía intravenosa, sin efectos secundarios a todos los colectivos de pacientes y, en especial, a los pacientes inmunosuprimidos.

Seguidamente, se analizará la tolerancia de los preparados elaborados según la invención, en comparación con los productos obtenidos de acuerdo con el estado de la técnica, en ensayos con animales.

Para ello, se ha utilizado un modelo en ratas (véase Bleeker y col., Vox Sang. 52, 281-290 (1987)), en el que se analizó la influencia sobre la tensión arterial y la frecuencia cardiaca de las sustancias vasoactivas, tal como pueden estar presentes en los presentes en los productos actuales.

Los resultados aparecen resumidos en la siguiente tabla 4.

TABLA 4

Preparado	% de desviación de	Frecuencia cardiaca	Sustancias vasoactivas
	la tensión arterial
			Precalicreína^{1)}	Calicreína^{1)}	Cininógeno^{1)}
1^{2)} (Comp.)	-30	+6	+	+	+
2^{2)} (Comp.)	-42	-8	++	+	+
3^{2)} (Comp.)	-32	+2	++	+	+
4* (Inv.)	-2	-4	-	-	-
5* (Inv.)	-3	+3	-	-	-
6** (Inv.)	-4	+1	-	-	-
7** (Inv.)	0	+1	-	-	-
EC de 7***	-13	+10	++	+	+
1) determinado por inmunodifusión, según Ouchterlony.
2) fracción bruta de inmunoglobulina G de procesos cromatográficos, como en el ejemplo 5.
* elaborado según el ejemplo 8
** elaborado según el ejemplo 9
*** eluato de columna del preparado 7, como control positivo (contiene sustancias vasoactivas).

La solución se considera tolerable con un descenso de la tensión arterial de hasta un -10%.

Tal como lo demuestran los resultados de este ensayo, los preparados purificados, según la invención, sobre un intercambiador iónico no provocan prácticamente variaciones relativas a la tensión arterial y a la frecuencia cardíaca, lo cual documenta su superior tolerancia en comparación con los preparados actuales.

En otro experimento, se analizó en el modelo canino, según M.F. Makula y col., Develop`. Biol. Standard Vol. 67, 257-265, 1987, la tolerancia de las soluciones de inmunoglobulina G elaboradas según la invención, en comparación con los preparados elaborados como en la actualidad.

De acuerdo con este modelo, se determina, de forma predominante, la influencia producida por las sustancias poliméricas (agregados), midiendo las alteraciones del volumen cardíaco de llenado.

En la siguiente tabla 5 se resumen los resultados.

TABLA 5

Preparado	% de desviación del volumen	Agregados %HPSEC	Sustancias vasoactivas
	cardiaco de llenado
			Precalicreína	Calicreína	Cininógeno
8^{2)} (Comp.)	-50	1,1	+	+	+
9^{3)} (Comp.)	-49	1,91	++	+	+
10* (Inv.)	0	0	-	-	-
11** (Inv.)	-13	0	-	-	-
12*** (Inv.)	0	0	-	-	-
1) determinado por inmunodifusión, según Ouchterlony
2) fracción bruta de inmunoglobulina G de procesos cromatográficos, como en el ejemplo 5
3) fracción bruta de inmunoglobulina G de proceso de Cohn, como en el ejemplo 1
* elaborado según el ejemplo 1 de la presente invención
** elaborado según el ejemplo 8 de la presente invención
*** elaborado según el ejemplo 5 de la presente invención

La solución se considera tolerable con una desviación del volumen cardíaco de llenado de hasta un - 15%.

Tal como demuestra también este ensayo, los preparados elaborados según la invención tienen una pureza superior y, por tanto, una ausencia de efectos secundarios, de las que carecen los productos conocidos hasta ahora. A través de la completa eliminación de agregados, sustancias proteolíticas, así como compuestos vasoactivos se pueden elaborar preparados de inmunoglobulina G que se pueden utilizar, de modo especial, también en pacientes inmunosuprimidos.

La invención se explicará por medio de los siguientes ejemplos.

Ejemplo 1

Se disuelven 5 kg de Pasta de Cohn II en 45 l de una solución tampón de 0,1 M NaCl y 0,075 M de acetato sódico, de pH 5,5. Se añaden 10 ml de ácido octanoico por litro de solución y se agita durante 1 hora a temperatura ambiente. A continuación, la solución se enfría a 0ºC, se añaden 12,3 g de acetato de calcio por litro de solución, se agita durante 3 horas y, por último, se filtra. El filtrado claro se diafiltra contra el volumen 10 veces mayor de una solución tampón Tris 0,022 molar, a pH 7,0, y seguidamente, se ajusta a una concentración de proteínas del 4%. A la solución de proteínas al 4% se añade, a pH 7,0, \beta-propiolactona al 0,05% y se agita durante 12 horas con un valor de pH constante. Después, se diluye con solución tampón Tris 0,022 M hasta una contenido en proteínas del 1% y se irradia esta solución en un aparataje de paso UV velocidad de paso de 20 l por hora.

Tras la adición de 2 g de cloruro sódico por litro de solución, se filtra bajo condiciones de esterilidad.

La purificación cromatográfica tiene lugar en una instalación preparatoria de HPLC dotada con una columna de HPLC de 5 l, rellena con QMA-Accell.

Después de equilibrar la columna con una solución tampón de Tris 0,022 M/NaCl 0,035 M, a pH 7,0, se cromatografía la solución esterilizada de inmunoglobulina en porciones de 15 l, con lo que las impurezas y agregados quedan unidos a la fase cromatográfica. La fracción IgG altamente purificada atraviesa la columna sin unirse. Para la purificación de la cantidad total, se requieren 8 ciclos. Un ciclo, incluidos el aporte de proteínas, la elución y la regeneración, dura 2 horas.

La fracción de IgG purificada se concentra, con ayuda de una instalación de ultrafiltración ("cut off" 10.000 D) a 50 g/l y se diafiltra contra un volumen 10 veces mayor de una solución de cloruro sódico al 0,45. Se añaden 0,15 m/l de glicina y se lleva a cabo una filtración estéril.

La solución de inmunoglobulina G así obtenida tiene las siguientes propiedades:

1

Ejemplo 2

Se procede como en el ejemplo 1.

La etapa cromatográfica se lleva a cabo bajo presión normal en una columna de 5 l, rellena con QMA. Accell. En un ciclo se pueden esterilizar 15 l de la solución de inmunoglobulina G. La duración del ciclo es, en este caso, de 4 ½ horas.

Los restantes pasos se llevan a cabo según se ha descrito en el ejemplo 1.

La solución de inmunoglobulina G tiene las siguientes propiedades:

2

Ejemplo 3

Se procede como en el ejemplo 2.

En lugar de la columna de 5 l con QMA-Accell, se utiliza como fase cromatográfica-Spherosil-LS.

3

Ejemplo 4

Se procede como en el ejemplo 1.

El filtrado claro, tras el tratamiento con ácido octanoico, se diafiltra contra un volumen 10 veces mayor & con una solución tampón de acetato de sodio 0,025 M, a pH 7,0, y se ajusta a un 4% de proteínas.

Seguidamente, se lleva a cabo el tratamiento con \beta-propiolactona con irradiación UV, de forma análoga al ejemplo 1. A la solución esterilizada se añaden 2 g de cloruro sódico por litro de solución, el valor de pH se ajusta a 5,0 y se filtra de forma estéril.

Como fase de cromatografía, se utiliza CM-Accel. La IgG se une en la columna equilibrada con acetato sódico 0,025 M, NaCl 0,035 M, a pH 5,0 y se eluye a continuación con acetato sódico 0,025 M, NaCl 0,200 a pH 5,0.

El resto del procesamiento tiene lugar como se ha descrito en el ejemplo 1.

La solución de inmunoglobulina G tiene las siguientes propiedades:

4

Ejemplo 5

Se descongela a +4ºC plasma humano congelado y el crioprecipitado se separa por centrifugación. La separación de los factores de coagulación del complejo PPSB tiene lugar mediante la adaptación del lote a DEAE-Sephadez A 50. Tras la separación del intercambiador iónico, se añade al sobrenadante alcohol al 9% en volumen, a pH 5,3. El precipitado se elimina por centrifugación. El plasma así obtenido, exento de factores de coagulación, se ajusta, con ayuda de una cromatografía sobre gel (Sephadex G-25) a un medio iónico de Tris 0,22 M/HCl, a pH 7,5.

En una columna rellena con DEAE-Trisacryl-LS y equilibrada con el mismo tampón, se elimina de la IgG las restantes proteínas plasmáticas. Se obtiene la IgG bruta en la fracción de recorrido que, porultrafiltración, se concentra hasta 40 g/l de proteínas.

Por litro de solución, se agregan 5,8 g de NaCl, 10,2 g de acetato sódico, se establece el valor de pH a pH 5,5 y se añaden 10 ml de ácido octanoico. Tras un tiempo de reacción de una hora a temperatura ambiente y adición de 12,3 g de acetato de calcio por litro de solución, se agita durante 3 horas a 0ºC.

La mezcla de reacción se filtra contra el volumen 10 veces mayor con solución tampón de acetato de Na 0,025 M/NaCl 0,140 M, a pH 7,0, se diafiltra y se ajusta a un 4% de proteínas.

La esterilización con \beta-propiolactona e irradiación UV se lleva a cabo de forma análoga al ejemplo 1.

El valor de pH de la solución de IgG esterilizada se ajusta a pH 5,0.

Para la cromatografía, se utiliza una columna rellena con CM-Accel y equilibrada con acetato de Na 0,025 M, NaCl 0,140 M, a pH 5,0. Por litro de la fase cromatográfica se añaden 9 l de la solución de IgG esterilizada. Bajo estas condiciones, las impurezas y agregados se unen a la fase y la fracción de IgG altamente purificada atraviesa la columna.

El resto del procesamiento corresponde al descrito en el ejemplo 1.

La solución de inmunoglobulina tiene las siguientes propiedades:

5

Ejemplo 6

Se procede como en el ejemplo 5.

La solución de IgG aislada por cromatografía, tratada con ácido octanoico y esterilizada, se ajusta pH 5,0 y se filtra de forma estéril.

La cromatografía, a continuación, tiene lugar en una columna rellena con SP-Trisacryl-LS y equilibrada con acetato de Na 0,025 M y NaCl 0,150 M, pH 5,0. Por litro de fase de cromatografía, se añaden 3 l de la solución de IgG esterilizada.

Se continúa el procedimiento como se describe en el ejemplo 5.

La solución de inmunoglobulina tiene las siguientes propiedades:

6

Ejemplo 7

Se procede como en el ejemplo 5.

La solución de IgG aislada por cromatografía y tratada con ácido octanoico se diafiltra contra el volumen 10 veces mayor con solución tampón de fosfato 0,1 M, a pH 7,0, y se ajusta a un 4% de proteínas.

La esterilización con \beta-propiolactona e irradiación UV se llevan a cabo de forma análoga al ejemplo 1.

La solución de IgG esterilizada, con un contenido en proteínas del 1%, se mezcla con sulfato de amonio sólido hasta una concentración final de 1 mol de sulfato de amonio por litro y se lleva a cabo una filtración estéril.

Se equilibra una columna de HPLC, rellena con Polypropil-A, con una solución tampón de sulfato de amonio 1 M, fosfato 0,1 M, a pH 7,0. Se añaden dos litros de las soluciones de IgG ajustadas por litro de la fase de cromatografía. Bajo estas condiciones, la IgG se une a la fase y las impurezas se eliminan por lavado conjuntamente con el tampón de equilibrio. La fracción de IgG se eluye con fosfato 0,1 M a pH 7,0.

La solución de inmunoglobulina tiene las siguientes propiedades:

7

\newpage

Ejemplo 8

Se procede como en el ejemplo 5

La fracción de IgG concentrada hasta 40 g/l se mezcla con 8,2 g de NaCl y 2,05 g de acetato de sodio por litro de solución, sometiéndola -de forma análoga al ejemplo 1- a esterilización con \beta-propiolactona e irradiación UV.

El valor de pH de la solución de IgG esterilizada se ajusta a pH 5,0.

Esta solución se cromatografía sobre una columna rellena con CM-Accell y equilibrada con acetato sódico 0,025 M y NaCl 0,140 M, a pH 5,0.

La fracción de IgG altamente purificada atraviesa la columna, mientras que las impurezas y agregados se unen a la fase.

El resto de proceso tiene lugar del modo descrito en el ejemplo 1.

La solución de inmunoglobulina tiene las siguientes propiedades:

8

Ejemplo 9

Se procede como en el ejemplo 5.

La solución de IgG aislada por cromatografía y esterilizada se mezcla, por litro de solución, con 9 g de NaCl y 2,05 g de acetato de sodio; el valor de pH se ajusta a pH 5,0.

La cromatografía se lleva a cabo en una columna rellena con SP-Trisacryl-LS y equilibrada con acetato de sodio 0,025 y NaCl 0,150 M, a pH 5,0.

El resto del proceso corresponde a lo descrito en el ejemplo 5.

La solución que contiene inmunoglobulina tiene las siguientes propiedades:

9

Claims

1. Procedimiento para la elaboración de una solución de inmunoglobulina G policlonal, tolerable por vía intravenosa, a partir de un material inicial que contiene inmunoglobulina G, exento de factores de coagulación, seleccionado de una fracción de gammaglobulina obtenida por fraccionamiento de Cohn (Pasta de Cohn o II/III), o bien, de una solución que contiene inmunoglobulina G bruta, purificada previamente por cromatografía a partir del suero, caracterizado porque

a): el material de partida, procesado de forma habitual, se trata con ácido octanoico al 0,4 hasta 1,5% en volumen, la solución se purifica a continuación y

b): la solución así obtenida se cromatografía sobre intercambiadores de aniones o cationes, o bien, por medio de una cromatografía de interacción hidrófoba.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque la solución que contiene inmunoglobulina G se trata en la etapa a) con ácido octanoico al 0,8 hasta 1% en volumen.

3. Procedimiento, según una de las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizado porque la cromatografía tiene lugar en fases adecuadas para la cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC).

4. Procedimiento, según una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque como intercambiador aniónico se utiliza QMA-Accell® o DEAE-Spherosil®.

5. Procedimiento, según una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque como intercambiador catiónico se utiliza CM-Accell®, SP-Spherodex®, SP-Trisacryl-LS® o Fraktogel TSK SP 650®.

6. Procedimiento, según una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque la cromatografía tiene lugar sobre Polypropyl A® como fase hidrófoba.

7. Procedimiento, según una de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque la cromatografía se lleva a cabo sobre un intercambiador aniónico a una concentración de iones de 0 hasta 50 mM de NaCl y un valor de pH de 6,0 hasta 8,0.

8. Procedimiento, según una de las reivindicaciones 1, 3 ó 5, caracterizado porque la cromatografía se lleva a cabo sobre un intercambiador catiónico a una concentración de iones de 50 hasta 200 mM de NaCl y un valor de pH de 4,0 hasta 6,0.

9. Procedimiento, según una de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque, antes de la purificación cromatográfica, según la etapa b), tiene lugar una esterilización mediante tratamiento con \beta-propiolactona, TNBP/Tween, TNBP/colato de sodio o TNBP.

10. Procedimiento, según la reivindicación 9, caracterizado porque la esterilización se emprende, adicionalmente, en combinación con irradiación UV.

11. Procedimiento, según la reivindicación 10, caracterizado porque la esterilización tiene lugar mediante el tratamiento con \beta-propiolactona al 0,03-0,1% en volumen e irradiación UV.

12. Procedimiento, según una de las reivindicaciones 1 a 11, caracterizado porque como material de partida se utiliza una fracción que contiene inmunoglobulina G con elevados títulos de anticuerpos contra antígenos víricos, bacterianos o celulares.