CZ292001B6 - Způsob čištění monomerní imunoglobulinové G protilátky - Google Patents
Způsob čištění monomerní imunoglobulinové G protilátky Download PDFInfo
- Publication number
- CZ292001B6 CZ292001B6 CZ19962481A CZ248196A CZ292001B6 CZ 292001 B6 CZ292001 B6 CZ 292001B6 CZ 19962481 A CZ19962481 A CZ 19962481A CZ 248196 A CZ248196 A CZ 248196A CZ 292001 B6 CZ292001 B6 CZ 292001B6
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- protein
- column
- antibody
- eluate
- igg
- Prior art date
Links
- 229940027941 immunoglobulin g Drugs 0.000 title claims description 15
- 238000000746 purification Methods 0.000 title description 29
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 184
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 175
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 50
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 18
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 claims abstract description 12
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 claims abstract description 12
- 239000000178 monomer Substances 0.000 claims abstract description 9
- 238000004191 hydrophobic interaction chromatography Methods 0.000 claims description 68
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 claims description 16
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 13
- 125000000484 butyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 claims description 8
- 229920000620 organic polymer Polymers 0.000 claims description 8
- 239000002952 polymeric resin Substances 0.000 claims description 8
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 8
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 claims description 6
- -1 alkyl modified silica Chemical class 0.000 claims description 6
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 claims description 4
- 108010041397 CD4 Antigens Proteins 0.000 claims description 3
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 claims description 3
- 230000003097 anti-respiratory effect Effects 0.000 claims description 2
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 125000001033 ether group Chemical group 0.000 claims 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 abstract description 22
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 abstract description 13
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 173
- 125000002057 carboxymethyl group Chemical group [H]OC(=O)C([H])([H])[*] 0.000 description 57
- 239000000047 product Substances 0.000 description 47
- ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N Guanidine Chemical compound NC(N)=N ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 46
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 45
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 45
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 45
- 239000006167 equilibration buffer Substances 0.000 description 44
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 38
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 34
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 32
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 26
- CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N N-methyl-guanidine Natural products CNC(N)=N CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 23
- SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N dimethylaminoamidine Natural products CN(C)C(N)=N SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 23
- 229960004198 guanidine Drugs 0.000 description 23
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 19
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 19
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 19
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 17
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 16
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 15
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 13
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 13
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 13
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 12
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 12
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 12
- 230000001186 cumulative effect Effects 0.000 description 11
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 10
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 10
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 10
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 9
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 238000005277 cation exchange chromatography Methods 0.000 description 9
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 9
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 9
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 9
- OCKGFTQIICXDQW-ZEQRLZLVSA-N 5-[(1r)-1-hydroxy-2-[4-[(2r)-2-hydroxy-2-(4-methyl-1-oxo-3h-2-benzofuran-5-yl)ethyl]piperazin-1-yl]ethyl]-4-methyl-3h-2-benzofuran-1-one Chemical compound C1=C2C(=O)OCC2=C(C)C([C@@H](O)CN2CCN(CC2)C[C@H](O)C2=CC=C3C(=O)OCC3=C2C)=C1 OCKGFTQIICXDQW-ZEQRLZLVSA-N 0.000 description 8
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 8
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 8
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 8
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 7
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical class O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 7
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 7
- 241000894007 species Species 0.000 description 7
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 7
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 7
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N Propylene glycol Chemical compound CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 6
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 6
- 229960000789 guanidine hydrochloride Drugs 0.000 description 6
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 5
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 5
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 5
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 5
- 230000001143 conditioned effect Effects 0.000 description 5
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 5
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 5
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 5
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 241000725643 Respiratory syncytial virus Species 0.000 description 4
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 4
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 4
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 4
- 239000012532 cell-free culture fluid Substances 0.000 description 4
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 4
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 4
- 238000011067 equilibration Methods 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 4
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 4
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 4
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 4
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 4
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 3
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 3
- 239000012619 Butyl Sepharose® Substances 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 3
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 3
- MZVQCMJNVPIDEA-UHFFFAOYSA-N [CH2]CN(CC)CC Chemical group [CH2]CN(CC)CC MZVQCMJNVPIDEA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 3
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 3
- 238000005341 cation exchange Methods 0.000 description 3
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 3
- 230000003196 chaotropic effect Effects 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 239000003636 conditioned culture medium Substances 0.000 description 3
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 3
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 3
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 3
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 3
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 3
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 3
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 3
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 3
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 2
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 2
- 238000009010 Bradford assay Methods 0.000 description 2
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 2
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 2
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- 108010088160 Staphylococcal Protein A Proteins 0.000 description 2
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 2
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 2
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 2
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 2
- 125000000129 anionic group Chemical group 0.000 description 2
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 description 2
- 210000000628 antibody-producing cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000013357 binding ELISA Methods 0.000 description 2
- 239000006172 buffering agent Substances 0.000 description 2
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 2
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 2
- 238000012832 cell culture technique Methods 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 238000011035 continuous diafiltration Methods 0.000 description 2
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 2
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 2
- 238000011026 diafiltration Methods 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 2
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 2
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 2
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 2
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 description 2
- 238000001471 micro-filtration Methods 0.000 description 2
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 2
- 238000012856 packing Methods 0.000 description 2
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 2
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 2
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 2
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 2
- 238000005185 salting out Methods 0.000 description 2
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 2
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 2
- JHJLBTNAGRQEKS-UHFFFAOYSA-M sodium bromide Chemical compound [Na+].[Br-] JHJLBTNAGRQEKS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 2
- 125000000022 2-aminoethyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])N([H])[H] 0.000 description 1
- MNIQECRMTVGZBM-UHFFFAOYSA-N 3-(1-methylpyrrolidin-2-yl)pyridine;7h-purin-6-amine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1NC=N2.CN1CCCC1C1=CC=CN=C1 MNIQECRMTVGZBM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XTWYTFMLZFPYCI-KQYNXXCUSA-N 5'-adenylphosphoric acid Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O XTWYTFMLZFPYCI-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 1
- XTWYTFMLZFPYCI-UHFFFAOYSA-N Adenosine diphosphate Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1OC(COP(O)(=O)OP(O)(O)=O)C(O)C1O XTWYTFMLZFPYCI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010053567 Coagulopathies Diseases 0.000 description 1
- UDMBCSSLTHHNCD-UHFFFAOYSA-N Coenzym Q(11) Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1OC(COP(O)(O)=O)C(O)C1O UDMBCSSLTHHNCD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000019750 Crude protein Nutrition 0.000 description 1
- 101150074155 DHFR gene Proteins 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 1
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 description 1
- 230000005526 G1 to G0 transition Effects 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 101100005713 Homo sapiens CD4 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000002265 Human Growth Hormone Human genes 0.000 description 1
- 108010000521 Human Growth Hormone Proteins 0.000 description 1
- 239000000854 Human Growth Hormone Substances 0.000 description 1
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 1
- 108700005091 Immunoglobulin Genes Proteins 0.000 description 1
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 1
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 102000004083 Lymphotoxin-alpha Human genes 0.000 description 1
- 108090000542 Lymphotoxin-alpha Proteins 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- CERQOIWHTDAKMF-UHFFFAOYSA-M Methacrylate Chemical compound CC(=C)C([O-])=O CERQOIWHTDAKMF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 1
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 206010061603 Respiratory syncytial virus infection Diseases 0.000 description 1
- 241000235070 Saccharomyces Species 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 description 1
- 108010022394 Threonine synthase Proteins 0.000 description 1
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 1
- 239000002250 absorbent Substances 0.000 description 1
- 230000002745 absorbent Effects 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- UDMBCSSLTHHNCD-KQYNXXCUSA-N adenosine 5'-monophosphate Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O UDMBCSSLTHHNCD-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 1
- LNQVTSROQXJCDD-UHFFFAOYSA-N adenosine monophosphate Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1OC(CO)C(OP(O)(O)=O)C1O LNQVTSROQXJCDD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005377 adsorption chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 238000001261 affinity purification Methods 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 description 1
- 239000003957 anion exchange resin Substances 0.000 description 1
- 210000000776 antibody secreting cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 239000012062 aqueous buffer Substances 0.000 description 1
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 description 1
- 239000003125 aqueous solvent Substances 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010364 biochemical engineering Methods 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 239000008366 buffered solution Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 238000011210 chromatographic step Methods 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 230000035602 clotting Effects 0.000 description 1
- 229920006026 co-polymeric resin Polymers 0.000 description 1
- 238000000975 co-precipitation Methods 0.000 description 1
- 102000006834 complement receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010047295 complement receptors Proteins 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 239000005289 controlled pore glass Substances 0.000 description 1
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000000326 densiometry Methods 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 102000004419 dihydrofolate reductase Human genes 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- GKEMUBZAKCZMKO-UHFFFAOYSA-N ethane-1,2-diol;ethene Chemical compound C=C.OCCO GKEMUBZAKCZMKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 210000003918 fraction a Anatomy 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 238000001641 gel filtration chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012510 hollow fiber Substances 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 125000001165 hydrophobic group Chemical group 0.000 description 1
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 239000003547 immunosorbent Substances 0.000 description 1
- 239000002596 immunotoxin Substances 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000003456 ion exchange resin Substances 0.000 description 1
- 229920003303 ion-exchange polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 238000002386 leaching Methods 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 1
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 239000003607 modifier Substances 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 238000010606 normalization Methods 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 125000002347 octyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 239000006174 pH buffer Substances 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 125000001147 pentyl group Chemical group C(CCCC)* 0.000 description 1
- 239000012466 permeate Substances 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000011176 pooling Methods 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 238000011045 prefiltration Methods 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- BDERNNFJNOPAEC-UHFFFAOYSA-N propan-1-ol Chemical compound CCCO BDERNNFJNOPAEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000001436 propyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 239000012264 purified product Substances 0.000 description 1
- 239000002510 pyrogen Substances 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 238000010187 selection method Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 238000003998 size exclusion chromatography high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- VGTPCRGMBIAPIM-UHFFFAOYSA-M sodium thiocyanate Chemical compound [Na+].[S-]C#N VGTPCRGMBIAPIM-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- BDHFUVZGWQCTTF-UHFFFAOYSA-M sulfonate Chemical compound [O-]S(=O)=O BDHFUVZGWQCTTF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 229920003002 synthetic resin Polymers 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 238000000844 transformation Methods 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 102000003390 tumor necrosis factor Human genes 0.000 description 1
- 230000003313 weakening effect Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
- C07K1/36—Extraction; Separation; Purification by a combination of two or more processes of different types
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01D—SEPARATION
- B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
- B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
- B01D15/26—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism
- B01D15/32—Bonded phase chromatography
- B01D15/325—Reversed phase
- B01D15/327—Reversed phase with hydrophobic interaction
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01D—SEPARATION
- B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
- B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
- B01D15/26—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism
- B01D15/36—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism involving ionic interaction
- B01D15/361—Ion-exchange
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01D—SEPARATION
- B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
- B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
- B01D15/26—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism
- B01D15/38—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism involving specific interaction not covered by one or more of groups B01D15/265 - B01D15/36
- B01D15/3804—Affinity chromatography
- B01D15/3809—Affinity chromatography of the antigen-antibody type, e.g. protein A, G, L chromatography
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
- C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
- C07K1/22—Affinity chromatography or related techniques based upon selective absorption processes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/06—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies from serum
- C07K16/065—Purification, fragmentation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
- C07K16/10—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from RNA viruses
- C07K16/1027—Paramyxoviridae, e.g. respiratory syncytial virus
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
- C07K16/2812—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against CD4
Abstract
Zp sob iÜt n monomern imunoglobulinov G protil tky ze sm si obsahuj c tuto monomern imunoglobulinovou G protil tku, imunoglobulinov agreg ty a protein A, zahrnuje p°i jednom z krok uveden t to sm si do styku s nosi em pro hydrof bn interak n chromatografii a selektivn eluov n monomern imunoglobulinov G protil tky z nosi e.\
Description
Oblast techniky
Tento vynález se týká oblasti čištění proteinů. Vynález se zvláště týká způsobu čištění monomemí imunoglobulinové G protilátky.
Dosavadní stav techniky
Z historického hlediska programy čištění proteinu mají základ v rozdílných molekulových vlastností odvislých od velikosti, náboje a rozpustnosti, mezi proteinem určeným k vyčištění a nežádoucími kontaminanty proteinu. Pracovní předpisy založené na těchto parametrech zahrnují rozměrovou vylučovací chromatografíí, iontoměničovou chromatografíí, diferenciální srážení a podobně.
Rozměrová vylučovací chromatografie, jinak známá jako gelová filtrace nebo gelová chromatografie, se opírá o pronikání makromolekul v mobilní fázi do pórů částic stacionární fáze. Rozdílné pronikání je funkcí hydrodynamického objemu částic. Proto za ideálních podmínek se větší molekuly vylučují zvnitřku částic, zatímco menší molekuly jsou přístupné tomuto objemu a pořadí eluování se může předem stanovit podle velikosti proteinů, protože existuje lineární vztah mezi elučním objemem a logaritmem molekulové hmotnosti.
Chromatografické nosiče na bázi zesítěných dextranů, například SEPHADEX®, sférických agarózových kuliček SEPHAROSE® (oboje komerčně dostupné od firmy Pharmacia AB, Uppsala, Švédsko), na bázi zesítěných polyakrylamidů, například BIO-GEL® (komerčně dostupný od firmy BioRad Laboratories, Richmond, Kalifornie, USA) nebo založené na kopolymeru ethylenglykolu s methakrylátem, například TOYOPEARL HW65 (komerčně dostupný od firmy Toso Haas Co., Tokio, Japonsko) jsou vhodné pro přípravu různých chromatografických kolon pro hydrofobní interakční chromatografii, pří provádění určitých aspektů tohoto vynálezu.
Srážecí metody jsou založeny na skutečnosti, že v surových směsích proteinů se rozpustnosti jednotlivých proteinů pravděpodobně široce mění. Třebaže rozpustnost proteinu ve vodném prostředí závisí na různých okolnostech, pro účely tohoto rozboru se může obecně uvést, že protein bude rozpustný, pokud jeho interakce s rozpouštědlem bude silnější než je jeho interakce s molekulami proteinu stejného nebo podobného druhu. Aniž by bylo přáním se vázat na nějakou zvláštní teorii mechanismu, popisující jev srážení, se nicméně předpokládá, že interakce mezi proteinem a molekulami vody může proběhnout vázáním vodíku s několika typy skupin bez náboje a/nebo elektrostaticky, jako dipóly, s nabitými skupinami, a že precipitanty, jako jsou soli monovalentních kationů (například síranu amonného) úspěšně soutěží s proteiny o molekuly vody. Tak při vysokých koncentracích solí se proteiny stávají „dehydratované“, co snižuje jejich interakci s vodným prostředím a zvyšuje agregaci se stejnými nebo podobnými proteiny s tím výsledkem, že se vysráží z prostředí.
Iontoměničová chromatografie zahrnuje interakci nabitých funkčních skupin ve vzorku s iontovými funkčními skupinami opačného náboje na povrchu absorbentu. Jsou známy dva obecné typy interakce. Aniontoměničová chromatografie je zprostředkována negativně nabitými bočními řetězci aminokyseliny (například kyseliny asparagové nebo kyseliny glutamové), které reagují s pozitivně nabitými povrchy. Kationtoměničová chromatografie je zprostředkována pozitivně nabitými zbytky aminokyselin (jako je například lysin nebo arginin), které podléhají interakci s negativně nabitými povrchy.
-1 CZ 292001 B6
Nedávno byla vyvinuta afmitní chromatografie a hydrofobní interakční chromatografícká technika, k doplnění tradičnějšího pracovního předpisu na bázi rozměrové vylučovací chromatografie a iontoměničové chromatografie. Afmitní chromatografie se opírá o specifickou interakci proteinu s mobilizovaným ligandem. Ligand může být specifický pro jednotlivý protein, o který je zájem, přičemž v tomto případě ligandem je substrát, substrátový analog, inhibitor, receptor nebo protilátka. Podle jiného provedení ligand může být schopen reagovat s řadou příbuzných proteinů. Může se použít takový soubor specifických ligandů, jako monofosfát adenosinu, difosfát adenosinu, nikotin-adeninový dinukleotid nebo určitá barviva, aby se získala zvláštní skupina proteinů.
S ohledem na čištění molekul protilátek jsou přijatelné oba zvláštní a zevšeobecněné afinitní technické postupy. Nejcharakterističtější volba ligandu pro afinitní čištění protilátky je antigen (nebo jeho epitop), se kterým požadovaná protilátka reaguje. Řada dobře známých imunosorbentových zkoušek, jako jsou imunosorbentové zkoušky vázaného enzymu (ELISA), má základ ve specifických afinitních interakcích antigenu a protilátky.
Zobecněné afinitní technické postupy jsou však také vhodné. Například stafylokokový protein A je znám tím, že váže určité protilátky ze třídy IgG (viz P. L. Ey a kol., Immunochemistry 15, 429-436 (1978/). Podle jiného provedení antiséra získaná v heterologních druzích (například králičí protimyší antiséra) se mohou použít pro oddělení obecných skupin protilátek (viz Current Protocols in Molecular Biology, cit. výše, kap. 11).
Hydrofobní interakční chromatografie se nejprve vyvinula po zjištění, že protein by se mohl zadržet na afinitních gelech, které obsahují uhlovodíková vymezovací ramena (spacer arms), ale kteiým chybí afinitní ligand. Třebaže v této oblasti se výraz hydrofobní chromatografie někdy používá, výraz hydrofobní interakční chromatografie (HIC) je výhodný, protože dochází k interakci mezi solutem a gelem, který není hydrofobní při chromatografickém postupu. Hydrofobní interakce jsou nejsilnější při vysoké iontové síle, proto tato forma oddělení se obvykle provádí po vysrážení sol nebo iontoměničových procedurách. Eluování z nosičů pro hydrofobní interakční chromatografií se může provádět změnou rozpouštědla, hodnoty pH, iontové síly nebo přidáním chaotropních přípravků nebo organických modifíkátorů, jako je ethylenglykol nebo propylenglykol. Popis obecné podstaty hydrofobní interakční chromatografie se dá najít v patentu US 3 917 527 a v patentu US 4 000 098. Aplikace hydrofobní interakční chromatografie na čištění specifických proteinů je uvedena formou příkladů s odkazem na dále uvedené objevy: lidský růstový hormon (patent US 4 332 717), toxinové konjugáty (patent US 4 771 128), antihemolytický faktor (patent US 4 743 680), faktor tumorové nekrózy (patent US 4 894 439), interleukin-2 patent US 4 908 434), lidský lymfotoxin (patent US 4 920 196), druhy lysozymu (J. L. Fausnaugh a F. E. Regnier, J. Chromatog. 359, 131-146 /1986/) a rozpustné komplementární receptory (patent US 5 252 216). Hydrofobní interakční chromatografie v souvislosti s vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií (HPLC) se používá k oddělování fragmentů protilátek (například F(ab')2) z molekul intaktní protilátky podle pracovního předpisu v jediném stupni (K. Morimoto a kol., J. Biochem. Biophys. Meth., 24, 107— 117/1992/).
Kromě afinitního technického postupu a technického postupu hydrofobní interakční chromatografie se na čištění protilátky aplikuje alespoň jeden z běžných programů pro čištění proteinů. Například L. Hakalahti a kol. (J. Immunol. Meth., 117, 131-136 /1989/) uvádí pracovní předpis, používající dvou následujících iontoměničových chromatografických stupňů nebo pracovní předpis používající jediného iontoměničového stupně, s následujícím stupněm hydrofobní interakční chromatografie. A. Danielsson a kol. (J. Immunol. Methods, 115. 79-88 /1988/) srovnává jednostupňový pracovní předpis, založený na aniontoměniči, kationtoměniči, chromatografickém fokusování a hydrofobní interakční chromatografií.
Ačkoliv se afinitní sloupcová chromatografie pro protein A široce používá, je třeba také vzít v úvahu, že eluování protilátky z takových sloupců může mít za výsledek vyluhování výsledného
-2CZ 292001 B6 proteinu A z nosiče. Rozměrová vylučovací HPLC (Das a kol., Analytical Biochem., 145. 27-36 /1985/) a aniontoměničová chromatografie (EPO 345 549, publikováno dne 13. prosince 1989) jsou také navrženy jako prostředek pro řešení tohoto problému.
Nyní bylo s překvapením nalezeno, že hydrofobní interakční chromatografie se může výhodně používat k odstranění kontaminujícího proteinu A ze směsi IgG eluovaných zchromatografického nosiče proteinu A.
Tento vynález se týká aplikace hydrofobní interakční chromatografie na oddělování monomerního IgG ze směsí sjeho obsahem a zabudování hydrofobní interakční chromatografie do pracovního předpisu, který kombinuje protein A a iontoměničovou chromatografíi pro čištění molekul imunoglobulinu G.
Podstata vynálezu
Předmětem tohoto vynálezu je způsob čištění monomemí imunoglobulinové G protilátky ze směsi obsahující tuto monomemí imunoglubulinové G protilátky ze směsi obsahující tuto monomemí imunoglobulinovou G protilátku, imunoglobulinové agregáty a protein A, jehož podstata spočívá v tom, že se směs při jednom z kroků uvede do styku s nosičem pro hydrofobní interakční chromatografíi a monomemí imunoglobulinová G protilátka se selektivně eluuje z nosiče.
Při výhodném provedení způsobu podle tohoto vynálezu je imunoglobulin G zvolen ze souboru zahrnujícího humanizovanou antirespirační protilátku syncyciálního viru a opičí/lidskou chimémí protilátku antihumánního receptorů CD4.
Při jiném výhodném provedení způsobu podle tohoto vynálezu je nosič pro hydrofobní interakční chromatografíi vybrán ze souboru sestávajícího z alkylagarózy se 2 až 8 atomy uhlíku v alkylové části, arylagarózy, alkylem modifikovaného oxidu křemičitého (dále též alkyl—silika), arylem modifikovaného oxidu křemičitého (dále též aryl-silika) a organické polymemí pryskyřice, která obsahuje alkylové nebo arylové skupiny. Zvláště výhodné je, pokud je nosič vybrán ze skupiny sestávající zbutyl-, fenyl- a oktylagarózy a butyl-, fenyl- a ether- organické polymemí pryskyřice. Jako obzvláště výhodné se ukazuje, pokud takovým nosičem je fenyl-organická polymemí pryskyřice nebo pokud takovým nosičem je butyl-organická polymemí pryskyřice.
Při jiném výhodném provedení způsobu podle tohoto vynálezu se protilátka selektivně eluuje pufrem s nízkým obsahem soli. Přitom je obzvláště výhodné, pokud se protilátka selektivně eluuje s gradientovým poklesem obsahu soli do 50 mM fosforečnanu sodného, hodnota pH 7,0.
Přehled obrázku na výkresu
Obr. 1 ilustruje průtokové schéma způsobu čištění protilátky podle tohoto vynálezu.
Dále se uvádí detailní popis tohoto vynálezu v širších souvislostech.
Definice
V další části popisu se používají výrazy, které mají význam zde vysvětlený. Další významy jsou objasněny přímo v místech svého prvního použití.
- „Koncentrace x M“ znamená koncentraci „x mol na litr“. Objem je objemem roztoku.
-3CZ 292001 B6
- „Gradientovy pufr“ znamená pufrovaný roztok, který se používá k vyvíjení gradientu, obvykle jde o koncentraci soli. Pufr se používá k udržení hodnoty pH při změně koncentrace soli v roztoku.
- „CM nevázaná frakce“ označuje frakci obsahující látky, která protéká CM sloupcem aniž by došlo kjejímu navázání na pryskyřici. Odlišuje se od CM eluátu, protože CM eluáty byly původně vázány na CM pryskyřici za podmínek ekvilibračního pufru, ale navázaly se na CM pryskyřici poté co byl na sloupec aplikován gradient soli.
- „CM ekvilibrační pufr“ je pufr používaný k ekvilibraci pryskyřice před vnesením směsi proteinů na sloupec a pro usnadnění vázání požadovaných proteinů na sloupec. Často jde o výchozí bod elučního gradientu.
- „CM eluční pufr“ je pufr používaný k eluování požadovaných proteinů poté co se proteiny vázaly na pryskyřici.
- „Fenyl nevázaná frakce“ je frakce obsahující protein a jiné látky, která přímo protéká sloupcem bez vázání na fenyl-650 piyskyřici za podmínek ekvilibračního pufru.
- „Butyl-650 nevázaná frakce“ je frakce, která obsahuje proteiny a jiné látky a která protéká přímo sloupcem bez vázání na butyl-650 pryskyřici za podmínek ekvilibračního pufru.
- „Aplikace lineárního pufru“ označuje použití gradientu, kde koncentrace soli se zvyšuje nebo klesá konstantní rychlostí s ohledem na objem roztoku protékající kolonou, například o 0,01 mmol na litr.
Detailní údaje
Tento vynález se týká čisticího technického postupu pro protein, který se dá aplikovat v širokém rozsahu na čištění molekul imunoglobulinu. Vynález je zvláště vhodný, protože dovoluje získávání monomemího IgG o čistotě více než 95 % proteinu. Vynález se dá použít pro čištění řady rozdílných molekul imunoglobulinu G.
Proteiny podobné protilátce jsou proteiny, které se mohou čistit podle pracovního předpisu zde popsaného, přičemž tento pracovní předpis se podle potřeby upravuje rutinním uspořádáním, bez nároku na vynálezecké řešení, které nemá za následek nežádoucí experimentování. Takové proteiny zahrnují izotopy, alotopy a alely imunoglobulinových genů, omezené formy, upravené protilátky, jako chimémí protilátky, humanizované protilátky a podobně, chemicky modifikované formy, jako se dosahují zpracováním s olyethylenglykolem, a kondenzované proteiny, obsahující imunoglobulinové Části. Tyto proteiny se označují jako podobné protilátkám, protože mají nebo uchovávají dostatek vlastností imunoglobulinových proteinů (například Fc determintů), které vedou k čištění způsobem podle tohoto vynálezu. Pokud není uvedeno jinak, výrazy protilátka a imunoglobulinový protein také zahrnují proteiny podobné protilátce.
Molekuly imunoglobuliny podle tohoto vynálezu se mohou také izolovat z řady zdrojů včetně séra imunizovaných zvířat, ascitové kapaliny, hybridomových nebo myelomových supematantů, kondicionovaného prostředí odvozeného od kultivace rekombinantní buněčné linie, která exprimuje molekuly imunoglobulinu a ze všech buněčných extraktů buněk produkujících imunoglobulin. Tento vynález je zvláště vhodný pro použití při čištění protilátek od kondicionovaných prostředí buněčné kultury různých protilátek produkujících rekombinantní buněčné linie. Třebaže se mohou očekávat určité proměny od buněčné linie k buněčné linii a mezi různými protilátkovými produkty, které jsou založené na zde uvedeném zjištění, je zcela v kompetenci odborníka v oboru upravit tento vynález pro zvláštní kombinaci protilátkového proteinu a produkující buněčné linie.
-4CZ 292001 B6
Obecně geny kódující proteiny jako protilátky mohou být klonovány inkorporujícími DNA sekvencemi kódujícími pro požadované oblasti polypeptidu v rekombinantním DNA nosiči (například vektoru) a transformujícími nebo transferujícími vhodné prokaryotické nebo eukaryotické hostitele. Mezi vhodné prokaryotické hostitele se zahrnuje Escherichia, Streptomyces, Bacillus a podobně, avšak výčet není na ně omezen. Mezi vhodné eukaryotické hostitele se zahrnují kvasinky, jako je Saccharomyces a zvířecí buňky v kulturách, jako je VĚRO, HeLa, myš Cl27, vaječník čínského křečka (CHO), WI-38, BHK, COS, MDCK, myelomy a buněčné linie hmyzu, na něž však výčet není omezen. Obzvláště výhodní hostitelé jsou buněčné linie CHO odlišné v dihydrofolát reduktáze, jako ATCC CRL 1793, CRL 9096 a jiné buněčné linie zde popsané dále. Takové rekombinantní technické postupy se nyní stávají dobře známé a jsou popsány v Methods in Enzymology, sv. 65 a 69 /1979/, 100 a 101 /1983/ (Academie Press) a v odkazech tam uvedených. Rozsáhlá technická diskuze zahrnující nejběžněji používanou rekombinantní DNA metodologii se může zjistit v Maniatis-ově a kol. publikaci Molecular Cloning. Cold Spring Harbor Laboratory /1982/ nebo v Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing, Wiley Interscience/1988, 1991, 1993/.
Jednou cestou k získání DNA fragmentu kódujícího požadovaný polypeptid, jako molekulu protilátky , je cesta klonování komplementární DNA. Při tomto procesu se mediátorová RNA (mRNA) izoluje z buněk, které jsou známé nebo podezřelé, že produkují požadovaný protein. Radami enzymatických reakcí se mediátorová RNA populace buněk kopíruje do komplementární DNA (cDNA). Výsledná komplementární DNA se potom vpravuje do klonujících přenašečů a následně použije k transformaci vhodného prokaryotického nebo eukaryotického hostitele. „Sbírka“ výsledných komplementárních DNA sestává z populace transformovaných hostitelských buněk, z nichž každá obsahuje jediný gen nebo fragment genu. Celá sbírka, z teoretického hlediska, poskytuje reprezentativní vzorek kódující přítomnou informaci ve směsi mediátorových RNA, která je použita jako výchozí materiál. Sbírka se může třídit za použití nukleové kyseliny nebo zkušebních protilátek, za účelem identifikace specifických sekvencí DNA. Tyto sekvence DNA jednou izolované se mohou modifikovat nebo se mohou zabudovat do kompletních genů.
Specifické fragmenty genu protilátky se mohou připravit metodami genového inženýrství nezávisle na zbytku genu. DNA fragmenty kódující komplementární determinující oblasti (CDR) se mohou integrovat do DNA sekvencí základní struktury z heterologních druhů, aby se dostaly změněné protilátky. Tyto změněné protilátky mají významné použití při ošetřování nežádoucích fyziologických stavů. Například PCT/GB91/01554 (publikováno jako WO 92/04381) popisuje přípravu „humanizovaných“ protilátek vhodných pro ošetřování nebo prevenci infekce vyvolané respiračním syncyciálním virem (RSV). Podle jiného provedení celá variabilní oblast genu protilátky se může kondenzovat ke konstantní doméně druhé protilátky za vzniku pozměněné protilátky, která je jinak známa jako „chimémí protilátka“. Například PCT/US92/06194 (publikováno jako WO 93/02108) uvádí opice/člověk chimémí protilátku, která může reagovat s lidským CD4 receptorem.
Jakmile je protilátkový gen nebo genový fragment klonován, DNA se může zavést do exprimovaného vektoru a tato konstrukce se použije pro transformaci vhodné buňky hostitele. Exprimovaný vektor je charakterizován jako vektor, který má expresní kontrolní sekvence jak jsou zde definovány, takže když je k němu operativně vázána významná DNA sekvence, vektor je schopen řídit přípravu produktu kódovaného významnou DNA sekvencí v hostitelově buňce obsahující vektor. Se zvláštním odkazem na tento vynález je možné sestavit fragmenty zjednotlivé kódující sekvence, jako se vytvoří po expresi molekuly protilátky. Zvláště účinná aplikace tohoto pracovního předpisu k produkci rekombinantní protilátky se nachází v Harrisově a kol. PCT přihlášce WO 92/04381, publikované dne 19. března 1992, citováno výše, a v PCT přihlášce WO 93/02108, publikované dne 4. února 1993, citováno výše, původce Newman a kol.
-5CZ 292001 B6
Poté co se připraví rekombinantní produkt, je žádoucí, aby se tento produkt získal. Pokud se produkt exportuje buňkou, která tento produkt vyprodukovala, produkt se může získat přímo z prostředí buněčné kultury. Jestliže se produkt zadržuje intracelulámě, buňky se musí fyzikálně narušit mechanickými, chemickými nebo biologickými prostředky, za účelem získání intracelulámího produktu.
V případě, že produktem je protein, pracovní předpis pro čištění by neměl poskytnout pouze produkovaný protein, který je v podstatě zbaven jiných proteinů, přičemž produkovaným proteinem se rozumí produkt s alespoň 80% a výhodně více než 95% čistotou, s ohledem na celkový protein v přípravku, ale měl by také eliminovat nebo snížit na žádoucí úrovně jiné kontaminanty z hostitelské buňky, DNA, RNA, potenciální pyrogeny a podobné látky. Kromě toho v souvislosti s produkcí protilátky rekombinantním expresním systémem je třeba vzít v úvahu, že může nastat agregace IgG produktu o 150 000 daltonech do druhů s vyšší molekulovou hmotností. Proto pro účely čištění produktu a normalizace je také vhodné oddělit přírodní monomemí druhy o 150 000 daltonech od agregátů o vyšší molekulové hmotnosti a jiných nežádoucích násobných forem. I když se vezme v úvahu, že druhy imunoglobulinu G se 150 000 daltony sestávají ze čtyř polypeptidových řetězců (2 těžké řetězce a 2 lehké řetězce), druhy o 150 000 daltonech se zde označují jako „monomer“ nebo „monomemí IgG“.
Jak již bylo uvedeno výše, mohou se používat různé hostitelské buňky pro přípravu protilátek podle tohoto vynálezu. Volba zvláštní hostitelské buňky je zcela v kompetenci odborníka v oboru, který bere mimo jiné v úvahu povahu protilátky, rychlost její syntézy, rychlost jejího rozkladu a charakteristiky rekombinantního vektoru řídícího expresi protilátky. Volba expresního systému hostitelské buňky je diktována ve velikém rozsahu povahou procedur pro buněčné kultury, které se mají použít. Výběr zvláštního způsobu přípravy, která je šaržovitá nebo kontinuální, spojená s otáčením pracovního prostoru nebo dodávkou vzduchu, prováděná v kapalině nebo v imobilizovaném stavu, se může provést, jakmile se vybere expresní systém. Proto se mohou použít fluidizovaná lóže biologických reaktorů, duté vlákenné biologické reaktory, válcové láhve pro kultivaci nebo míchané zásobníkové biologické reaktory, s nebo bez mikronosičů buněk. Kritéria pro takový výběr jsou ohodnocena v oboru buněčné kultury. Zde se neuvádějí podrobnosti, protože spadají mimo rozsah tohoto vynálezu. Tento vynález se týká čištění protilátek daných jejich existencí v kondicionovaném prostředím buněčné kultury, hybridomového supematantu, antiséra, myelomového supematantu nebo ascitové kapaliny.
Jak bylo uvedeno výše, tento vynález se týká mimo jiné použití hydrofobní interakční chromatografie (HIC) k oddělení vyčištěných molekul protilátky. Hydrofobní molekuly ve vodném rozpouštědle jsou samopřipojitelné. Toto připojení je důsledkem hydrofobní interakce. Nyní bylo zjištěno, že makromolekuly, jako proteiny, mají na svém povrchu rozsáhlá hydrofobní místa, kromě předpokládaných hydrofobních skupin. Hydrofobní interakční chromatografie má z části základ v interakci těchto míst s hydrofobními ligandy, připojenými k chromatografickému nosiči. Hydrofobní ligandy kondenzované k základní hmotě se zde označují různými názvy, jako nosič pro hydrofobní interakční chromatografií, hydrofobní interakční chromatografícký gel nebo kolona, popřípadě sloupec pro hydrofobní interakční chromatografii. Dále je třeba vzít v úvahu, že síla interakce mezi proteinem a nosičem pro hydrofobní interakční chromatografii není pouze funkcí poměru nepolárních povrchů k polárním povrchům na proteinu, ale také distribuce nepolárních povrchů, stejně jako chemických vlastností nosiče pro hydrofobní interakční chromatografii.
Pro přípravu sloupce pro hydrofobní interakční chromatografii (HIC) se může používat řada chromatografických nosičů, přičemž nej rozšířenější použití nachází agaróza, silika (oxid křemičitý) a organické polymemí nebo kopolymemí pryskyřice. Mezi vhodné hydrofobní ligandy se zahrnují alkylové skupiny obsahující přibližně od 2 do zhruba 8 atomů uhlíku, jako je butyl, propyl nebo oktyl, anebo arylové skupiny, jako je fenyl. Na uvedené skupiny však výčet není omezen. Běžné HIC produkty pro gely a sloupce se mohou dostat z komerčních zdrojů od dodavatelů, jako je Pharmacia LKB AB, Uppsala, Švédsko, pod názvy butyl-SEPHAROSE®,
-6CZ 292001 B6 fenyl- nebo butyl-SEPHAROSE® CL-4B, butyl-SEPHAROSE® FF, od Tosoh Corporation,
Tokio, Japonsko, produkty pod označením TOYOPEARL ether 650, fenyl 650 nebo butyl 650 (Fractogel), od Miles-Yeda, Rehovot, Izrael pod názvem produktu alkyl-agaróze, kde alkylová skupina obsahuje od 2 do 10 atomů uhlíku a od J. T. Baker, Phillipsburg, N. J., USA, s pojmenováním produktu Bakerbond WP-HI-propyl.
Je také možné připravit požadovaný sloupec pro hydrofobní interakční chromatografií za použití obvyklého chemického postupu (viz například Z. Er-el a kol., Biochem. Biophys. Res. Comm., 49, 383 /1972/ nebo V. Ulbrich a kol., Coli. Czech. Chem. Commun., 9 1466 /1964/).
Hustota ligandu je důležitým parametrem v tom, že ovlivňuje nejen sílu interakce, ale stejně tak kapacitu sloupce. Hustota ligandu komerčně dostupných fenylových nebo oktylfenylových gelů je řádově 40 pmol/ml gelového lóže. Kapacita gelu je funkcí zvláštního zmíněného proteinu, stejně jako hodnoty pH, teploty, typu soli a její koncentrace, ale obecně se může předpokládat, že spadá do rozmezí od 3 do 20 mg/ml gelu.
Volbu zvláštního gelu může určit odborník v oboru. Obecně síla interakce proteinu a hydrofobního interakčního chromatografického ligandu se zvyšuje s délkou řetězce alkylových ligandů, ale ligandy, které obsahují od přibližně 4 do zhruba 8 atomů uhlíku, jsou vhodné pro většinu separací. Fenylová skupina má přibližně stejnou hydrofobicitu jako pentylová skupina, třebaže selektivita může být naprosto odlišná díky možnosti π-π orbitální interakce s aromatickými skupinami na proteinu. Selektivně může být také ovlivněna chemickým účinkem nosné pryskyřice.
Adsorpce proteinů na sloupci pro hydrofobní interakční chromatografií je zvýhodněna vysokými koncentracemi soli, ale skutečné koncentrace se mohou měnit v širokém rozmezí, v závislosti na povaze proteinu a na zvláštním zvoleném hydrofobním interakčním chromatografickém ligandu. Různé ionty se mohou uspořádat do tak zvaných solufóbních řad v závislosti na tom, zda napomáhají hydrofobním interakcím (vysolovací účinky) nebo narušují strukturu vody (chaotropní účinek) a vedou ke slábnutí hydrofobní interakce. Kationty jsou rozděleny vzhledem ke zvyšujícímu se vysolovacímu účinku jako
Ba++ < Ca++< Mg++< Li+ <Na+<K+ <Rb+ <NH4+, zatímco anionty mohou být rozděleny s ohledem na zvyšující se chaotropní účinek jako PO4~ < SO4~ < CH3COO“ < Cf < Br < No3 _ < C1O4’ < Γ < SCN”.
Soli mohou být proto formulovány tak, že ovlivňují sílu interakce, jak je dána dále uvedeným vztahem:
(NH|)2SO4 > Na2SO4 > NaCl > ΝΗ,ΟΙ > NaBr > NaSCN.
Z obecného hlediska jsou vhodné koncentrace solí, které činí od přibližně 0,75 do zhruba 2M síranu amonného nebo od přibližně 1 do 4M chloridu sodného.
Vliv teplot na separace prováděné hydrofobní interakční chromatografií není jednoduchý, třebaže obecně při poklesu teploty nastává pokles interakce. Jakékoli výhody, které by vyplynuly ze zvýšení teploty, musí však také být vyváženy proti nepříznivým účinkům, jaké takové zvýšení může mít na stabilitu proteinu.
Eluování, buď postupné, nebo ve formě gradientu, může být dosahováno různými způsoby:
a) změnou koncentrace soli,
b) změnou polarity rozpouštědla nebo
c) přidáním detergentů.
S poklesem koncentrace soli se adsorbované proteiny eluují v pořadí zvyšující se hydrofobicity. Změny polarity se mohou dosahovat přidáním rozpouštědel, jako ethylenglykol, propylenglykol,
-ΊCZ 292001 B6 propanol nebo izopropanol, přičemž klesá síla hydrofobních interakcí. Detergenty fungují jako náhrada proteinů a používají se především v souvislosti s Čištěním membránových proteinů.
Třebaže bylo nalezeno, že hydrofobní interakční chromatografie se může používat samotná k oddělení monomemího IgG (molekulová hmotnost 150 000) z agregátů a nežádoucích násobných forem, jak je uvedeno výše, hydrofobní interakční chromatografie je zvláště vhodná, pokud se používá v kombinaci s jinou čisticí technikou pro proteiny. Mělo by se uvést, že je výhodné aplikovat hydrofobní interakční chromatografii na směsi, které jsou částečně vyčištěny jinými způsoby pro čištění proteinů. Výraz „částečně vyčištěný“ označuje proteinový přípravek, ve kterém je uvažovaný protein přítomen v množství alespoň 5 % hmotnostních, výhodněji alespoň 10 % hmotnostních a obzvláště výhodně alespoň 45 % hmotnostních. Výraz „směs“ označuje požadované molekuly monomemí IgG protilátky v kombinaci s nežádoucími kontaminanty, jako je alespoň jeden z imunoglobulinových agregátů, jejich vícenásobných forem, proteinu hostitelské buňky, zbytkového materiálu z předcházejících chromatografických stupňů, jakým je protein A, pokud se použil. Proto aplikace hydrofobní interakční chromatografie se může také ocenit v souvislosti s celkovým pracovním předpisem pro čištění imunoglobulinových proteinů, tak jako afínitně vyčištěné monoklonální protilátky. Například bylo nalezeno, že je vhodné vzorek kondicionovaného prostředí buněčné kultury podrobit částečnému vyčištění před aplikací hydrofobní interakční chromatografie. Výrazem „kondicionované prostředí buněčné kultury“ se rozumí prostředí buněčné kultury, které podporuje růst buněk a/nebo udržování buněk a obsahuje segregovaný produkt. Vzorek takového prostředí se podrobí alespoň jednomu čisticímu stupni před aplikací stupně hydrofobní interakční chromatografie. Vzorek se může podrobit afinitní chromatografii za použití stafylokokového proteinu A jako prvního stupně. Například se úspěšně může použít PROSEP-A® (BioProcessing Ltd., U.K.) který sestává z proteinu A kovalentně kondenzovaného ke sklu s řízenými póry. Jiné vhodné přípravky z proteinu A jsou SEPHAROSE® Fast Flow (Pharmacia) a TOYOPEARL 65OM Protein A (Toso Haas). Jako druhý stupeň se může použít iontoměničová chromatografie. V tomto ohledu se mohou k základní hmotě připojit různé aniontové a kationtové substituenty, za účelem vytvoření aniontového nebo kationtového nosiče pro chromatografii. Mezi substituenty přítomné na aniontoměniči se zahrnuje diethylaminoethyl (DEAE), kvartémí aminoethyl (QAE) a kvartémí aminoskupiny. Mezi substituenty přítomné na kationtoměniči se zahrnuje karboxymethyl (CM), sulfoethyl (SE), sulfopropyl (SP), fosfát (P) a sulfonát (S). Iontoměničové pryskyřice na bázi celulózy, jako je DE23, DE32, DE52, CM-23, CM-32 a CM-52 jsou dostupné od firmy Whatman Ltd. Maidstone, Kent, Velká Británie, iontoměniče na bázi SEPHADEX® a zesítěného SEPHADEX® jsou také známé. Například DEAE-, QAE-, CM-, a SP-SEPHADEX®, DEAE-, Q-, CM- a S-SEPHAROSE® a SEPHAROSE® Fast Flow jsou dostupné u firmy Pharmacia AB. Kromě toho jak DEAE, tak CM derivovaný ethylenglykol-methakrylátová kopolymer, jako je TOYOPEARL DEAE-650S nebo M a TOYOPEARL CM-650S nebo M jsou dostupné u firmy Toso Haas Co., Philadelphia, PA, USA. Protože eluování z iontoměničového nosiče obvykle vyžaduje přidání soli a protože, jak již bylo uvedeno, hydrofobní interakční chromatografie se zlepšuje při vzrůstajících koncentracích solí, zavedení stupně hydrofobní interakční chromatografie po iontoměničovém chromatografickém stupni nebo jiných čisticích stupních zprostředkovaných solí, je obzvláště výhodné. Mohou se připojit dodatkové pracovní stupně pro čištění, ale nejsou nezbytně omezeny na další iontoměničovou chromatografii, rozměrovou vylučovací chromatografii, virovou inaktivaci, koncentrování a sušení vymražováním.
Pouze k ilustrativním účelům se uvádí, že tento vynález se aplikoval na čištění několika protilátek IgG izotypu. Uvedeno přesněji, použila se humanizovaná protilátka vhodná pro ošetřování RSV infekce, kterou popsal Harris a kol. /1992/ v publikované mezinárodní patentové přihlášce číslo WO 92/04381, zveřejněné dne 19. března 1992 (zde dále označována jako „RSHZ-19“), a chimémí protilátka specificky reaktivní sCD4 antigenem, kterou popsal Newman a kol. v publikované mezinárodní patentové přihlášce číslo WO 93/02108, zveřejněné dne 4. února 1993 (zde dále označováno jako CH-CD4). Konstrukce rekombinantních systémů pro produkci RSHZ-19 a CH-CD4 chimémích protilátek je podrobně popsána ve výše
-8CZ 292001 B6 uvedených PCT přihláškách, jejichž obsah se zde zahrnuje do dosavadního stavu techniky, a v souhrnu se uvádí dále.
Expresivní plazmid, obsahující RSHZ-19 kódující sekvenci, se kontransfekuje spSV2dhfr do buněčné linie dhfr-nárokujícího vaječníků čínského křečka (CHODUXBII). Transfekce se provádí v růstovém prostředí a využívá kalciové koprecipitace a glycerolové šokové procedury, jak je popsáno v DNA Cloning, vyd. D. M. Glover (kapitola 15, C. Gorman). Po transfekci se buňky udržují v růstovém prostředí po dobu 46 hodin za růstových podmínek (jako jsou popsány výše), před selekčním postupem.
Selekce a ko-amplifikační postup se provádějí v podstatě jak popsal R. J. Kaufman a kol. (Mol. Cell. Biol., 5, 1750-1759 /1985/). 46 hodin po transfekci se buňky vnesou do selektivního prostředí MEM ALPHA (041-02571), s obsahem 1 % zásobního glutaminu, 1 % zásobního pen/strep (043-050070) a dialýzovaného hovězího fetálního telecího séra (220-6300AJ) (Gibco, 15 Paisley, Skotsko). Buňky se udržují se selektivním prostředí po dobu 8 až 10 dnů, až se objeví kolonie dhfr+. Jakmile jsou kolonie založeny, buňky se vnesou do selektivního prostředí, které obsahuje methotrexát (A6770, Sigma Chem. Co., St. Louis, MO, USA). Koncentrace methotrexátu je z počátku 0,02 μΜ a postupně se zvyšuje na 5 μΜ. Během amplifikačního postupu se zkoušejí alikvoty růstového prostředí z růstových buněk na produkci RSHZ-19 20 lidským IgG. Jakákoli rekombinantní buněčná linie způsobující sekreci protilátky se může použít k dodávce kondicionovaného prostředí pro čištění podle tohoto vynálezu, přičemž určité se nevyžaduje zvláštní buněčná linie.
Transfekovaná CHO buněčná linie schopná produkovat RSHZ-19 se může kultivovat změnou 25 technického postupu pro buněčné kultury. Pro aplikace podle tohoto vynálezu není rozhodující zvláštní metoda kultivace.
Jak již bylo zmíněno výše, zvláštní rekombinantní produkční systém a zvláštní pracovní předpis pro kultivaci buněk nespadají do rozsahu tohoto vynálezu. Systém a pracovní předpis, které jsou 30 uvedeny výše, jsou reprezentativními případy z řady možných voleb dostupných odborníkovi v oboru a jsou zde zahrnuty toliko k ilustračním účelům. Pracovní předpis pro čištění, který je předmětem tohoto vynálezu, je aplikovatelný toliko s běžnými úpravami na různé druhy rekombinantních protilátek a proteiny podobné protilátce bez ohledu na to, jak se produkují nebo kultivují. Například chimérická monoklonální protilátka kCD4 se také čistí způsobem podle 35 tohoto vynálezu.
Vyčištěné protilátky, získané provedením způsobu podle tohoto vynálezu, mají tyto vlastnosti:
1) obsahují více než 97 % hmotnostních protilátkového proteinu,
2) jsou stabilní k proteolytické degradaci za teploty 4 °C po dobu alespoň tří měsíců,
3) obsahují málo (méně než 0,1 mezinárodní jednotky na mg proteinu) endotoxinu,
4) obsahují málo (méně než 1 pg/mg proteinu) DNA,
5) obsahují ne-protilátkový protein v množství menším než 5 % hmotnostních a
6) jsou virově inaktivní.
Příklady provedení vynálezu
Dále uvedené příklady blíže ilustrují tento vynález, aniž by způsobovaly omezení zde 50 připojených patentových nároků.
-9CZ 292001 B6
Příklad 1
Úvod
Postup naznačený dále byl vyvinut pro izolaci a čištění monoklonální protilátky proti respiračnímu syncyiálnímu viru (RSV). Touto protilátkou je „humanizovaný“ imunoglobulin G exprimovaný vCHO buňkách a roste vmíchaném zásobníkovém biologickém reaktoru. Protilátka je podrobněji popsána v PCT WO 92/04381 a jinak je zde označována jako RSHZ-19. Způsob je určen pro přípravu RSHZ-19 o čistotě větší než 95 %, přičemž se odstraňují kontaminanty vzniklé z hostitelských buněk, prostředí buněčné kultury nebo jiné suroviny. Tento způsob je nejvýhodnějším provedením sestávajícím ze tří čisticích stupňů (protein A afinitní, kationtoměničová a hydrofobní interakční chromatografie), dvou virových inaktivačních stupňů a diafiltračního stupně, k výměně produktu do zvoleného finálního pufru (naznačeno na obr. 1). Všechny stupně se provádějí za teploty místnosti (od 18 do 25 °C). Všechny pufry se připravují s WFI a před použitím filtrují buď přes 0,2-pm filtr, nebo membránu 10 000 MWCO. Pufrové prostředky jsou uvedeny v tabulce 1. Tabulky 2, 4, 6 a 8 ukazují parametry sloupce pro příklady ΙΑ, 1B, IC a ID. Tabulky 3, 5, 7 a 9 poskytují souhrnné výsledky o čištění provedeném v příkladech ΙΑ, 1B, IC a ID.
První stupeň při způsobu (protein A afinitní chromatografie na ProSepA) se může rychle cyklizovat, aby se vyhovělo měnícím se množstvím kultivační tekutiny prosté buněk (CCF). Kapacita činí přibližně 15 g RSHZ-19 na 1 litr ProSep A. Například 500 litrů CCF, která obsahuje 400 až 500 g IgG, se může zpracovat v 5 nebo 6 cyklech. Následující stupně procesu (kationtoměničová chromatografie, zkráceně CEC, a hydrofobní interakční chromatografie, zkráceně HIC) jsou přizpůsobeny k nahromadění přibližně 130 až 140 g RSZH-19 na cyklus. Tak 500 litrů kultury, která obsahuje 400 až 500 g RSHZ-19, se zpracuje ve třech po sobě následujících cyklech po zachycení na ProSep A.
Stupeň hydrofobní interakční chromatografie (HIC) je demonstrován na odstranění zbytkového proteinu A, který se vyluhoval ze sloupce proteinu A během eluování (viz příklady 1A až ID). Kromě toho agregáty IgG se mohou odstraňovat hydrofobní interakční chromatografií, jak je ukázáno v příkladech IC a ID.
Popis způsobu je normalizován pro libovolné měřítko, uvedené lineární průtokové rychlosti jsou nezávislé na průměru sloupce a dávkovači poměry jsou uváděny v hmotnostech na jednotku sloupcového objemu. Příklady ukazují pracovní postup a výtěžky v rozsahu 1 g, 40 g a 125 g (příklady 1A až ID).
Popis způsobu čištění
Odstranění buněk z kultury
K zachycení kultivační tekutiny se buňky odstraní za použití mikrofiltračního zařízení s tangenciálním přítokem (Prostak), které je vybaveno 0,65-pm filtrem nebo jeho ekvivalentem. Produkt se získává v permeátu. Pro malý objem kultur se může použít odstředivka.
Afinitní zachycování protein A chromatografií
IgG se zachycuje z CCF adsorpční chromatografií na sloupci ProSep A (BioPrecessing Ltd.), který byl předem ekvilibrován PBS. Prostředí se aplikuje na sloupec při průtokové rychlosti až do 1000 ml/h, při dávkovacím poměru až do 15 g IgG na litr sloupcového objemu. Po nadávkování na sloupec se tento sloupec promyje alespoň 3 sloupcovými objemy PBS, který obsahuje 0,1 M glycinu. RSHZ-19 se eluuje pufrem s nízkou hodnotou pH, při použití přibližně 3 sloupcových objemů elučního pufru.
-10CZ 292001 B6
Protein A chromatografie odstraní veliký podíl buněk a nečistot z prostředí (zvláště proteinu a
DNA do průtokových a promývacích frakcích) a koncentráty RSHZ-19 do elučního pufru pro další zpracování.
(Případná) virová inaktivace v kyselé oblasti pH
Eluát ze sloupce proteinu A se zachycuje a upravuje na hodnotu pH 3,5 přídavkem 2,5M kyseliny chlorovodíkové. Roztok se přenese do druhé nádoby a udržuje při hodnotě pH 3,5 přinejmenším po dobu 30 minut, aby se dosáhlo inaktivace virů, a nato se znovu upraví hodnota pH na 5,5 přidáním Tris pufru. Výsledný roztok se filtruje předfiltrem (Millipore Polygard nebo jeho ekvivalentem), sterilizuje 0,2-μιη filtrem (Millipore Millipak nebo jeho ekvivalentem) a udržuje ve sterilních zásobnících za teploty 4 °C nebo se vymrazí a udržuje za teploty -70 °C.
Zpracování na hodnotu pH 3,5 skýtá inaktivaci virů a úprava na hodnotu pH 5,5 poskytne roztok pro kationtoměničovou chromatografii (CEC). Pokud je to zapotřebí, může se vynechat zpracování na hodnotu pH 3,5.
Kationtoměničová chromatografie
Eluát inaktivovaného proteinu A s danou hodnotou pH se dále čistí kationtoměničovou chromatografii na sloupci CM SEPHAROSE FF (Pharmacia KLB). Vzorek se aplikuje na ekvilibrovaný sloupec pří průtokové rychlosti 150ml/h a dávkovacím poměru rovném nebo menším než 20 g proteinu na 1 litr CM SEPHAROSE FF. Po nadávkování se sloupec promyje 3 až 5 sloupcovými objemy ekvilibračního pufru. Produkt se eluuje 3 až 5 sloupcovými objemy elučního pufru.
Stupeň kationtoměničové chromatografie odstraňuje proteinové a neproteinové nečistoty.
Inaktivace viru guanidinem
Kationtoměničový eluát se upraví přibližně na 2,0 M hydrochloridu guanidinu pomalým přidáváním (za míchání) poloviny objemu zásobního roztoku guanidinu. Rychlost přidávání reakčního činidla se upraví tak, že se přidá během časového období 5 až 15 minut. Roztok se přenese do druhé nádoby a udržuje po dobu 30 minut, aby se dosáhlo inaktivace viru. Poté se pomalu přidá rovný objem zásobního roztoku síranu amonného (za míchání) a hned nato se provede stupeň hydrofobní interakční chromatografie (HIC). Rychlost přidávání reakčního činidla se upraví tak, že se přidá během časového období 5 až 15 minut.
Zpracování s guanidinem poskytuje druhý stupeň inaktivace virů, pokud se použije stupeň inaktivace viru v kyselé oblasti, a udržuje RSHZ-19 rozpustný po přidání síranu amonného. Přidání síranu amonného slouží ke zředění guanidinu a k přípravě roztoku pro hydrofobní interakční chromatografii.
Hydrofobní interakční chromatografie
Roztok zpracovaný s guanidinem se dále čistí aplikací na sloupec pro hydrofobní interakční chromatografii, který obsahuje TOYOPEARL fenyl-650M, jenž byl předem ekvilibrován ekvilibračním pufrem. Roztok zpracovaný s guanidinem se aplikuje na sloupec při průtokové rychlosti 150 ml/h a při dávkovacím poměru rovném nebo menším než 20 g proteinu na 1 litr TOYOPEARL fenyl-650M. Po nadávkování se sloupec promyje 3 až 5 sloupcovými objemy ekvilibračního pufru. Aplikuje se lineární gradient klesajícího množství síranu amonného při průtokové rychlosti 100 až 150 ml/h a eluuje se RSHZ-19 jako hlavní pík s nečistotami eluujícími se později při gradientu. Strmost gradientu je přibližně 20 sloupcových objemů, přičemž se vychází ze 100% ekvilibračního pufru a končí se 100% gradientovým pufrem (1,3 až 0M síranu amonného). Pík se zachycuje až absorbance poklesne na hodnotu 20 % maximální
-11CZ 292001 B6 absorbance a poté se zachycování frakce obsahující produkt ukončí. Poté co je gradientově zpracování ukončeno, sloupec se promyje přibližně 3 sloupcovými objemy stripovacího pufru.
Stupeň hydrofobní interakční chromatografie odstraňuje proteinové a neproteinové nečistoty, 5 zvláště zbytkový protein A, IgG agregáty a DNA hostitele.
Koncentrování, diafíltrace a finální filtrace
Eluát z hydrofobní interakční chromatografie (HIC) se koncentruje na přibližně 10 mg na mililitr ío za použití ultrafialového zařízení s tangenciálním přítokem (jako Millipore CUF), vybaveném molekulární hranou pro hmotnost 30 000, diafiltruje ve vhodném pufrovém prostředku a filtruje přes sterilizující 0,2-pm filtr (Millipore Millipak nebo jeho ekvivalent) do sterilizovaných zásobníků.
Zkoušky v průběhu operace
Meziprodukty dosažené při způsobu se testují na koncentraci všech proteinů testem OD280 nebo Bradfordovou zkouškou, koncentrace RSHZ-19 se stanovuje pomocí vysoko účinné kapalinové chromatografie nebo natriumdodecylsulfát polyakrylamidovou gelovou elektroforézou (SDS20 PAGE). Agregovaný produkt se stanovuje rozměrovou vylučovací chromatografií na TSK3000 SWXL a zbytky proteinu A se zjišťují za použití ELISA.
Sdružovací kritéria
Frakce eluátu ze zachyceného proteinu A a kationtoměničových stupňů se sdružují na základě sledování chromatogramu v ultrafialovém záření a zachytí se celkový pík. Eluát ze stupně hydrofobní interakční chromatografie se sdružuje na základě sledování v ultrafialovém zářen a hlavní pík se jímá až koncová strana píku v ultrafialovém záření dosáhne 20 % maxima píku. Frakce z koncové strany hydrofobní interakční chromatografie obsahuje hlavní podíl proteinu A a 30 agregované imunoglobuliny G.
Tabulka 1: Pufrovací prostředky
| Název pufru | Složení |
| PBS | 20 mM fosforečnan sodný, 150 mM chlorid sodný, pH 7 |
| PBS/glycin | PBS a 0,1 M glycin |
| ProSep eluční pufr | 25 mM citrát, pH 3,5 |
| CM SEPHAROSE ekvilibrační pufr | 10 mM citrát, pH 5,5 |
| CM SEPHAROSE eluční pufr | 40 mM citrát, 100 mM chlorid sodný, pH 6 |
| guanidinový zásobní roztok | 6 M hydrochloridu guanidinu, 50 mM fosforečnanu sodného, pH 7 |
| zásobní roztok 2,6M síranu amonného | 2,6 M síranu amonného, 50 mM fosforečnanu sodného, pH 7 |
| zásobní roztok 2,0M síranu amonného | 2,0 M síranu amonného, 50 mM fosforečnanu sodného, pH 7 |
| Fenyl-650 ekvilibrační pufr | 1,3 M síranu amonného, 50 mM fosforečnanu sodného, pH 7 |
| Fenyl-650 gradientový pufr | 50 mM fosforečnanu sodného, pH 7 |
| Butyl-650 ekvilibrační pufr | 1,0 M síranu amonného, 50 mM fosforečnanu sodného, pH 7 |
| Butyl-650 gradientový pufr | 50 mM fosforečnanu sodného, pH 7 |
| HIC stripovací pufr | 0,2 M NaOH |
-12CZ 292001 B6
Příklad 1A
RSHZ-19 čištění v rozsahu 1 gramu, za použití TOYOPEARL Fenyl-650M
Afinitní sloupec ProSep A o objemu 5,0 litrů (poměr 20 cm, délka 16 cm) se ekvilibruje s PBS (viz tabulka 1) při průtokové rychlosti 5,2 1/min. 100 litrů kondicionovaného prostředí kultuiy, které obsahuje 0,8 g RSHZ-19 monoklonální protilátky na litr, se čistí mikrofiltrací, jak je popsáno výše, a aplikuje se na sloupec při průtokové rychlosti 5,2 1/min. Po nadávkování se na sloupec aplikuje přibližně 15 litrů PBS/glycinu při stejné průtokové rychlosti. IgG se eluuje při použití 15 až 20 litrů ProSep elučního pufru. Frakce navázaného píku a elučního píku se zachytí a zkoušejí na obsah IgG, za použití zkoušky vysoko účinnou kapalinovou chromatografii. Eluát má objem přibližně 15 litrů a obsahuje přibližně 5 mg proteinu na mililitr.
Bezprostředně po eluování se vzorky upraví na hodnotu pH přibližně 3,5 pomocí 2,5M kyseliny chlorovodíkové, udržují se přibližně 30 minut a nato upraví na hodnotu pH 5,5 přidáním zhruba 350 ml 1M Tris báze. Po neutralizaci na hodnotu pH 5,5 se vzorek filtruje filtrem 0,1 pm Polygard CR, zařazeným za sebou sterilním filtrem 0,2 pm Millipak 200, do sterilního zásobníku. Filtrát se skladuje za teploty 4 °C. Vzorky filtrátu se analyzují na obsah IgG za použití zkoušky vysoko účinnou kapalinovou chromatografíí a pro stanovení celkového proteinu absorbancí při vlnové délce 280 nm. Vzorky se také analyzují na obsah proteinu A za použití pracovního postupu ELISA. Tento eluát ProSep A, zpracovaný na hodnotu pH 3,5 a filtrovaný, se použijí jako CM SEPHAROSE náplň v příkladech 1 A, 1B a 1C.
400 ml ProSep A eluátu, zpracovaného na hodnotu pH 3,5 a filtrovaného, se naplní přímo na sloupec CM SEPHAROSE FF o objemu 220 ml (průměr 4,4 mm, délka 15 cm) při průtokové rychlosti 38 ml/min. Použitý sloupec byl předtím ekvilibrován CM ekvilibračním pufrem. Po nadávkování se sloupec promývá, při průtokové rychlosti 38 ml/min, přibližně 700 ml CM ekvilibračního pufru. IgG se eluuje za použití CM elučního pufru, při průtokové rychlosti 38 ml/min. IgG odchází ze sloupce po projití přibližně 1 objemu lože elučního pufru. Celkový pík se zachytí jako CM SEPHAROSE eluát. CM nevázané frakce, eluát a stripované frakce se zachycují a analyzují na obsah IgG, obsah celkového proteinu a obsah proteinu A, jak již bylo popsáno. Eluát má objem přibližně 160 ml a obsahuje zhruba 12 mg proteinu na mililitr. Tento CM SEPHAROSE eluát se rozdělí do dvou stejných podílů o objemu přibližně vždy 80 ml a použije se v příkladech 1A a 1B jako náplň pro hydrofobní interakční chromatografii.
K 80 ml CM SEPHAROSE eluátu se přidá (pomalu za nepřetržitého míchání) celkem 40 ml guanidinového zásobního roztoku. Tak se dosáhne koncentrace guanidinu 2M pro inaktivaci viru. Zatímco se provádí míchání roztoku zpracovaného sguanidinem, přidá se celkem 120 ml zásobního roztoku 2,6M síranu amonného. Výsledný roztok obsahuje l,0M guanidinu a 1,3M síranu amonného. Roztok zpracovaný se síranem amonným se aplikuje na sloupec o objemu 80 ml (průměr 3,2 mm, délka 10 cm) TOYOPEARL fenyl-650M, který byl ekvilibrován fenyl650 ekvilibračním pufrem. Během pokusu činí průtoková rychlost 20 ml/min. Po naplnění se sloupec promyje přibližně 350 ml fenyl-650 ekvilibračního pufru. IgG se eluuje za použití lineárního gradientu, přičemž se vychází z 85% ekvilibračního pufru a 15 % guanidinového pufru a končí s 0% ekvilibračního pufru a 100 % gradientového pufru, za použití 18 až 19 sloupcových objemů. To znamená, že výchozí koncentrace síranu amonného je přibližně 1,1M a konečná koncentrace odpovídá 0M. Strmost tohoto gradientu odpovídá přibližně 4,7 % zvýšení velučním pufru na sloupcový objem neboli přibližně 0,061M síranu amonného na sloupcový objem. IgG se začne eluovat ze sloupce po přibližně 7 sloupcových objemech a končí po zhruba 13 sloupcových objemech v gradientu (koncentrace síranu amonného je přibližně 0,7 až 0,3M). Eluované frakce se zachycují až UV absorbance na koncové straně píku poklesne na 20 % výšky píku. Potom se jímá do jiné nádoby (koncová frakce). Na konci gradientu se k regeneraci sloupce aplikuje přibližně 250 ml HIC stripovacího pufru. Fenylové nevázané frakce, eluát, koncové a stripované frakce se zachycují a analyzují na obsah IgG, celkový obsah proteinu a obsah
-13CZ 292001 B6 proteinu A, jako je popsáno výše. Eluát má objem přibližně 300 ml a obsahuje zhruba 2,4 mg proteinu na mililitr.
V tabulce 2 jsou shrnuty parametry sloupce z tohoto příkladu. Údaje o dosaženém produktu a proteinu pro každý stupeň jsou uvedeny v tabulce 3, společně s obsahem proteinu A, vyjádřeným v ng proteinu A na mg IgG (ng/mg). Jak je zřejmé z tabulky 3, protein A se sníží přibližně čtyřnásobně, vzhledem k fenyl-650M, a dostane se ve zhruba 94% výtěžku.
Tabulka 2: Parametry sloupce v rozsahu 1 gramu, za použití fenyl-650M
| Stupeň | Objem sloupce (litrů) | Průměr x délka sloupce (cm) | Dávkovači poměr | Průtoková lychlost (cm/h) (ml/min) | |
| ProSep A | 5,0 | 20x16 | 16,0 IgG na litr objemu lože | 1000 | 5200 |
| CM SEPHAROSE FF | 0,22 | 4,4x15 | 9,1 g proteinu na litr objemu lože | 150 | 38 |
| Fenyl-650M | 0,08 | 3,2x10 | 10,4 g proteinu na litr objemu lože | 150 | 20 |
Tabulka 3: Souhrn údajů o čištění pro příklad 1A v rozsahu 1 gramu, za použití fenyl-650M
| Stupeň | Objem (litry) | Celkem RSHZ-19a (gramy) | Celkem proteinub (gramy) | Výtěžek stupně (%) | Protein Ac (ng/mg) |
| Kultivační kapalina prostá buněk | 100 | 80,3 | nestán. | — | 0 |
| ProSep A eluát | 15,8 | 73,8 | 80,4 | 92 | 20,2 |
| CM SEPHAROSE“ náplň | (M)3 | (l,87)d | (2,04)d | ||
| CM SEPHAROSE eluát | 0,16 | 2,01 | 1,88 | 100 | 14,5 |
| Fenyl-650Md náplň | (0,21)d | (0,72)d | (0,83)d | ||
| Fenyl-650M eluát | 0,31 | 0,68 | 0,73 | 94 | 3,5 |
| (Fenyl koncový | 0,59 | 0,075 | 0,10 | — | 133)e |
| Kumulativní výtěžek (%) | 86 |
a pomocí vysoko účinné kapalinové chromatografie b stanoveno absorbancí při 280 nm + 1,27 ml mg-1 .cm“1 c pomocí ELISA d převede se pouze část celkového eluátu z předchozího sloupce, jak je popsáno výše e do koncové frakce migruje především protein A
Příklad 1B: Čištění RSHZ-19 v rozsahu 1 gramu, za použití TOYOPEARL butyl-650M
Při této přípravě se použije stejný CM SEPHAROSE eluát, jako je popsán v příkladu 1A, a stupeň pro hydrofobní interakční chromatografii se provádí za použití TOYOPEARL butyl650M na místo fenyl-650M. Způsob přípravy CM SEPHAROSE eluátu je popsán výše, v příkladu ΙΑ. K 80 ml CM SEPHAROSE eluátu se přidá (pomalu za nepřetržitého míchání) celkem 40 ml guanidinového zásobního roztoku. Tak se dosáhne koncentrace guanidinu 2M, pro inaktivaci viru. Zatímco se provádí míchání roztok zpracovaného s guanidinem, přidá se celkem
-14CZ 292001 B6
120 ml zásobního roztoku 2,0M síranu amonného. Výsledný roztok obsahuje 1,0M guanidinu a l,0M síranu amonného. Roztok zpracovaný se síranem amonným se aplikuje na sloupec o objemu 80 ml (průměr 3,2 mm, délka 10 cm) TOYOPEARL butyl-650M, který byl ekvilibrován butyl-650 ekvilibračním pufřem. Během pokusu činí průtoková rychlost 20 ml/min. Po naplnění 5 se sloupec promyje přibližně 350 ml butyl-650 ekvilibračního pufru. IgG se eluuje za použití lineárního gradientu, přičemž se vychází z 65 % ekvilibračního pufru a 35 % gradientového pufru a končí s 20 % ekvilibračního pufru a 80 % gradientového pufru, za použití 12 až 13 sloupcových objemů. To znamená, že výchozí koncentrace síranu amonného je přibližně 0,65 M a konečná koncentrace odpovídá 0,2 M. Strmost tohoto gradientu odpovídá přibližně 3,3 % zvýšení ío elučního pufru na sloupcový objem neboli přibližně 0.033M síranu amonného na sloupcový objem. IgG se začne eluovat ze sloupce při přibližně 2 sloupcových objemech a končí při zhruba 9 sloupcových objemech v gradientu (koncentrace síranu amonného je přibližně 0,58 až 0,35M). Eluátová frakce se zachycují, až UV absorbance na koncové straně píku poklesne na 10 % výšky píku. Potom se jímání přesune do jiné nádoby. Na konci gradientu se aplikuje přibližně 250 ml 15 butyl-650 gradientového pufru a malý pík se eluuje a zachytí. K regeneraci sloupce se použije přibližně 250 ml HIC stripovacího pufru. Butyl nevázané frakce, eluát, koncová a stripovaná frakce se zachycují a analyzují na obsah IgG, celkový obsah proteinu a obsah proteinu A, jako je popsáno výše. Eluát má objem přibližně 400 ml a obsahuje přibližně 1,5 mg proteinu na mililitr.
V tabulce 4 jsou shrnuty parametry sloupce z tohoto příkladu. Údaje o dosaženém produktu a proteinu pro každý stupeň jsou uvedeny v tabulce 5, společně s obsahem proteinu A, vyjádřeným v ng proteinu A na mg IgG (ng/mg). Třebaže výtěžek IgG je nižší, v porovnání s příkladem 1A (79 % proti 94 %), obsah proteinu A se sníží přibližně dvacetinásobně vzhledem k použití butyl650M jako stupně pro hydrofobní interakční chromatografii.
Tabulka 4: Parametry sloupce v rozsahu 1 gramu, za použití butyl-650M
| Stupeň | Objem sloupce (litrů) | Průměr x délka sloupce (cm) | Dávkovači poměr | Průtoková rychlost | |
| (cm/h) | (ml/min) | ||||
| CM SEPHAROSE FF | 0,22 | 4,4 x 15 | 9,1 g proteinu na litr objemu lóže | 150 | 38 |
| Butyl-650M | 0,08 | 3,2x10 | 10,4 g proteinu na litr objemu lóže |
Tabulka 5: Souhrn údajů o čištění z příkladu IB, v rozsahu 1 gramu za použití butyl-650M
| Stupeň | Objem (litry) | Celkem RSHZ-19’ (gramy) | Celkem proteinu15 (gramy) | Výtěžek stupně (%) | Protein Ac (ng/mg) |
| Kultivační kapalina prostá buněk | 100 | 80,3 | nestán. | — | 0 |
| ProSep A eluát | 15,8 | 73,8 | 80,4 | 92 | 20,2 |
| CM SEPHAROSE“ náplň | (0,4)d | (l,87)d | (2,04)d “ | ||
| CM SEPHAROSE eluát | 0,16 | 2,01 | 1,88 | 100 | 14,5 |
| Butyl-650Md náplň | (0,21)d | (0,76)d “ | (0,86)d ’ | ||
| Butyl-650M eluát | 0,41 | 0,60 | 0,62 | 79 | 0,7 |
| (Butyl koncový) | 0,40 | 0,03 | 0,03 | — | 31,4)ef |
| (Butyl stripovací | 0,53 | 0,10 | 0,10 | — | nestán.)8 |
| Kumulativní výtěžek (%) | 73 | ||||
| Hmotnostní bilance(% z násady) | 95 |
a pomocí vysoko účinné kapalinové chromatografie b stanoveno absorbancí při 280 nm -s-1,27 ml mg-1.cm
-15CZ 292001 B6 c pomocí ELISA d převede se pouze část celkového eluátu z předchozího sloupce, jak je popsáno výše e do koncové frakce migruje především protein A f koncová frakce obsahuje 3 % náplně g stripovaná frakce obsahuje 13 % proteinu, který byl naplněn
Příklad ÍC: Čištění RSHZ-19 v rozsahu 40 gramů, za použití TOYOPEARL butyl-650M
Při této příprava se použije stejný ProSep A eluát, jako je popsán v příkladu IA, a dále zařazené stupně se zvětší, aby se přizpůsobily přibližně 40 g proteinu, za použití TOYOPEARL fenyl650M. jako prostředí pro hydrofobní interakční chromatografíi. Způsob přípravy CM SEPHAROSE náplně je popsán výše, v příkladu IA. 7,8 litrů ProSep A eluátu, zpracovaného na hodnotu pH 3,5 a filtrovaného, se vnese přímo na sloupec o objemu 4,2 litru (průměr 25 cm, délka 8,5 cm) naplněný CM SEPHAROSE FF, který byl předem ekvilibrován CM ekvilibračním pufrem, při průtokové rychlosti 1,2 1/min. Po naplnění se sloupec propláchne přibližně 8 litry CM ekvilibračního pufru, při průtokové rychlosti 1,2 1/min. IgG se eluuje za použití CM elučního pufru, při průtokové rychlosti 1,2 1/min. IgG vychází ze sloupce poté, co projde přibližně 1 objem lóže elučního pufru. Celkový pík se zachytí jako CM SEPHAROSE eluát. CM nevázané frakce z kolony a eluát se zachycují a analyzují na obsah IgG, obsah celkového proteinu a obsah proteinu A, jak již bylo popsáno. Eluát má objem přibližně 5,7 litrů a obsahuje zhruba 6 až 7 mg proteinu na mililitr.
K 5,6 litrům CM SEPHAROSE eluátu se přidá (pomalu za nepřetržitého míchání) celkem 2,8 litrů guanidinového zásobního roztoku (3,2 kg, uvedeno hmotnostně). Tak se dosáhne koncentrace guanidinu 2M, pro inaktivaci viru, při objemu 8,3 litrů. Zatímco se provádí míchání roztoku zpracovaného s guanidinem, přidá se celkem 8,3 litrů (9,7 kg, uvedeno hmotnostně) zásobního roztoku 2,6M síranu amonného. Výsledný roztok obsahuje l,0M guanidinu a 1,3M síranu amonného a má konečný objem 16,7 litrů. Roztok zpracovaný se síranem amonným se aplikuje na sloupec o objemu 4,6 litrů (průměr 18 mm, délka 18 cm) TOYOPEARL fenyl-650M, který byl ekvilibrován fenyl-650 ekvilibračním pufrem. Během pokusu činí průtoková rychlost 0,5 až 0,61/min. Po naplnění se sloupec promyje přibližně 14 litry fenyl-650 ekvilibračního pufru. IgG se eluuje za použití lineárního gradientu, přičemž se vychází ze 100 % ekvilibračního pufru a končí se 100% gradientového pufru, ve 20 sloupcových objemech. To znamená, že výchozí koncentrace síranu amonného je přibližně l,3Ma konečná koncentrace odpovídá 0M. Strmost tohoto gradientu odpovídá přibližně 5 % zvýšení elučního pufru na sloupcový objem neboli přibližně 0,065M síranu amonného na sloupcový objem. IgG se začne eluovat z sloupce za přibližně 7 sloupcových objemech a končí za zhruba 12 sloupcových objemů v gradientu (koncentrace síranu amonného je přibližně 0,85 až 0,5M). Eluované frakce se zachycují, až UV absorbance na koncové straně píku poklesne na 20 % výšky píku. Potom se jímání přesune do jiné nádoby (koncová frakce). Fenyl nevázané frakce, eluát, koncové a stripované frakce se zachycují a analyzují na obsah IgG, celkový obsah proteinu a obsah proteinu A, jak je popsáno výše. Eluát má objem přibližně 15,4 litrů a obsahuje přibližně 2,2 mg proteinu na mililitr.
Fenyl eluát se koncentruje na přibližně 16 mg/ml za použití ultrafiltračního zařízení s tangenciálním přítokem (CUF, Millipore Corp.), vybaveném membránami 30 000 MWCO Omega (Filtron Corp.) a výměnou pufru kontinuální diafiltraci proti vhodnému pufrovacímu prostředku.
V tabulce 6 jsou shrnuty parametry sloupce z tohoto příkladu, údaje o dosaženém produktu a proteinu pro každý stupeň jsou uvedeny v tabulce 7, společně s obsahem proteinu A, vyjádřeným vng proteinu A na mg IgG (ng/mg), a obsahem IgG agregátu, vyjádřeným jako procento z celkového IgG. Jak je zřejmé z tabulky 7, protein A se sníží přibližně trojnásobně, vzhledem k fenyI-650M, a dosáhne se zhruba 90% výtěžek. IgG agregáty se sníží z přibližně 0,5 % v CM SEPHAROSE eluátu na 0,06 % ve zpracovaném produktu.
-16CZ 292001 B6
Tabulka 6: Parametry sloupce v rozsahu 40 gramů
| Stupeň | Objem sloupce (litrů) | Průměr x délka sloupce | Dávkovači poměr | Průtoková rychlost | |
| (cm/h) | (1/min) | ||||
| CM SEPHAROSE FF | 4,2 | 25 x 8,5 | 8,9 g proteinu na litr objemu lože | 150 | 1,2 |
| Fenyl-650M | 4,6 | 18x 18 | 10,4 g proteinu na litr objemu lože | 140 | 0,6 |
Tabulka 7: Souhrn údajů o čištění z příkladu IC, v rozsahu 40 gramů
| Stupeň | objem (litry) | Celkem RSHZ-19a (gramy) | Celkem proteinu15 (gramy) | Výtěžek stupně (%) | Protein Ac (ng/mg) | Agregát IgG (%) |
| Kultivační kapalina prostá buněk | 100 | 80,3 | nestán. | — | 0 | nestán. |
| ProSep A eluát | 15,8 | 73,8 | 80,4 | 92 | 20,2 | nestán. |
| CM SEPHAROSEd násada | (7,84)d | (36,0)d | (37,3)d | |||
| CM SEPHAROSE eluát | 5,71 | 36,5 | 37,3 | 100 | 21,4 | 0,5 |
| Butyl-650M eluát (produkt) | 15,4 | 32,8 | 33,6 | 90 | 0,8 | <0,05 |
| (Fenyl konečný) | 24,6 | 2,5 | 3,0 | — | 78,0 | 5,l)e |
| Zpracovaný produkt | 2,0 | 32,8 | 32,0 | 100 | 6,5 | 0,06 |
| Kumulativní výtěžek (%) | 83 | |||||
| Hmotnostní bilance (%z násady) | 97 |
a pomocí vysoko účinné kapalinové chromatografie b stanoveno absorbancí při 280 nm 1,27 ml mg’1 .cm'1 c pomocí ELISA d převede se pouze část celkového eluátu z předchozího sloupce e do koncové frakce migruje především protein A a agregáty IgG
Příklad ID: Čištění RSHZ-19 v rozsahu 125 gramů, za použití TOYOPEARL fenyl-650M
Afínitní sloupec ProSep A o objemu 5,5 litrů (průměr 20 cm, délka 18 cm) se ekvilibruje s PBS (viz tabulka 1) při průtokové rychlosti 4,8 1/min. 450 litrů kondicionovaného prostředí kultury, které obsahuje 0,94 g RSHZ-19 monoklonální protilátky na litr se čistí mikrofíltrací, jak je popsáno výše, a použije se ve čtyřech oddělených podílech vždy o objemu 90 až 95 litrů a jednom podílu o objemu 40 litrů na sloupci při průtokové rychlosti 4,8 1/min, (a to od začátku do konce). Každý cyklus na sloupci probíhá takto: Po naplnění se na sloupec aplikuje přibližně 17 litrů PBS/glycinu při stejné průtokové rychlosti. IgG se eluuje za použití 15 až 20 litrů ProSep A elučního pufru. Frakce nevázaného píku a elučního píku se zachytí a zkoušejí na obsah IgG za použití vysoko účinné kapalinové chromatografie. Eluát z každého cyklu má objem přibližně 9 litrů a obsahuje přibližně 5 až 10 mg proteinu na mililitr. Bezprostředně po eluování se ProSep A eluáty upraví na hodnotu pH 3,5 přidáním 2,5 M kyseliny chlorovodíkové, ponechají se přibližně 30 minut a nato upraví na hodnotu pH 5,5 přidáním zhruba 250 ml 1 M
Tris báze. Po neutralizaci na hodnotu pH 5,5 se eluáty spojí dohromady a filtrují filtrem 0,1 pm Polygard CR zařazeným za sebou se sterilním filtrem 0.2 pm Millipak 200, do 5 litrů alikvotu ve sterilním zásobníku. Filtrát se skladuje za teploty 4 °C. Vzorky filtrátu se analyzují na obsah IgG za použití zkoušky vysoko účinnou kapalinovou chromatografií a pro stanovení celkového proteinu absorbancí při vlnové délce 280 nm. Vzorky se také analyzují na obsah proteinu A za použití pracovního předpisu ELISA a agregáty IgG pomocí vysoko účinné kapalinové chromatografie.
Dále zařazené stupně jsou zvětšeny na rozsah přibližně 120 až 140 g proteinu. 16,3 litrů ProSep A eluátu, zpracovaného na hodnotu pH 3,5 a filtrovaného, který obsahuje přibližně 130 g proteinu, se naplní přímo na sloupec o objemu 14.4 litrů (průměr 35 cm, délka 15 cm) CM SEPHAROSE FF, při průtokové rychlosti 2,4 1/min. Použitý sloupec byl předem ekvilibrován CM ekvilibračním pufrem. Po naplnění se sloupec promývá, při průtokové rychlosti 2,4 1/min, přibližně 45 litry CM ekvilibračního pufru. IgG se eluuje za použití CM elučního pufru při průtokové rychlosti 2,4 1/min. IgG začne být eluován ze sloupce poté, co projdou přibližně 1 až 2 objemy lóže elučního pufru. Celkový pík se zachytí jako CM SEPHAROSE eluát. CM nevázané frakce a eluát se zachycují a analyzují na obsah IgG, obsah celkového proteinu, obsah proteinu A a agregát IgG. Eluát má objem přibližně 21 litru a obsahuje zhruba 120 gramů proteinu.
K 19,4 litrům CM SEPHAROSE eluátu se přidá (pomalu za nepřetržitého míchání) celkem 9,7 litrů guanidinového zásobního roztoku. Tak se dosáhne koncentrace guanidinu 2M, pro inaktivaci viru, při objemu 29,1 litrů. Zatímco se provádí míchání roztoku zpracovaného s guanidinem, přidá se celkem 29,1 litrů zásobního roztoku 2,6M síranu amonného. Výsledný roztok obsahuje l,0M guanidinu a 1,3M síranu amonného, při konečném objemu 58,2 litrů. Roztok zpracovaný se síranem amonným se aplikuje na sloupec o objemu 12,4 litrů (průměr 18 mm, délka 18 cm) TOYOPEARL fenyl-650M, který byl ekvilibrován fenyl-650 ekvilibračním pufrem. Během pokusu činí průtoková rychlost 1,1 až 1,3 1/min. Po naplnění se sloupec promyje přibližně 37 litry fenyl-650 ekvilibračního pufru. IgG se eluuje za použití lineárního gradientu, přičemž se vychází z 80 % ekvilibračního pufru a 20 % gradientového pufru a končí s 20 % ekvilibračního pufru a 80 % gradientového pufru, za použití 12 sloupcových objemů. To znamená, že výchozí koncentrace síranu amonného je přibližně l,0M a konečná koncentrace odpovídá 0,26M. Strmost tohoto gradientu odpovídá přibližně 5 % zvýšení gradientového pufru na sloupcový objem neboli přibližně 0,065M síranu amonného na sloupcový objem. IgG opouští sloupec v podstatě uprostřed gradientu, s pikem při přibližné koncentraci síranu amonného 0,8M. Eluované frakce se zachycují, až UV absorbance na koncové straně píku poklesne na 20 % výšky píku. Potom se jímání přemístí do jiné nádoby (koncová frakce). Fenyl nevázané frakce, eluát, koncové a stripované frakce se zachycují a analyzují na obsah IgG, celkový obsah proteinu a agregovaný IgG. Eluát má objem přibližně 29 litrů a obsahuje zhruba 100 g proteinu.
Fenyl eluát se koncentruje na přibližně 10 mg/ml za použití ultrafiltračního zařízení s tangenciálním přítokem (CUF, Millipore Corp.), vybaveným membránami 30 000 MWCO Omega (Filtron Corp.), a výměnou pufru kontinuální diafiltrací proti vhodnému pufrovému prostředku. Produkt se analyzuje na obsah IgG, celkový protein, protein A a IgG agregát.
V tabulce 8 jsou shrnuty parametry sloupce z tohoto příkladu. Údaje o dosaženém produktu a proteinu pro každý stupeň jsou uvedeny v tabulce 9, společně s obsahem proteinu A, vyjádřeným jako ng proteinu A na mg IgG (ng/mg) a obsahem IgG agregátu, vyjádřeným jako procento z celkového IgG. Jak je zřejmé z tabulky 9, protein A se sníží přibližně sedminásobné, vzhledem k CM SEPHAROSE a fenyl-650M, a dosáhne se kumulativní výtěžek zhruba 70 %. IgG agregáty se sníží z přibližně 0,45 % v CM SEPHAROSE eluátu na 0,06 % ve zpracovaném produktu.
-18CZ 292001 B6
Tabulka 8: Parametry sloupce v rozsahu 125 gramů
| Stupeň | Objem sloupce (litrů) | Průměr x délka sloupce (cm) | Dávkovači pufr | Průtoková rychlost | |
| (cm/h) | (1/min) | ||||
| ProSep A | 5,0 | 20 x 18 | Maž 16gRSHZ-19 na litr objemu lóže | 915 | 4,8 |
| CM SEPHAROSE FF | 14,4 | 35x15 | 8,4 g proteinu na litr objemu lóže | 150 | 2,4 |
| Fenyl-650M | 12,4 | 30x 18 | 8,6 g proteinu na litr objemu lóže | 100 | 1,2 |
Tabulka 9: Souhrn údajů o čištění z příkladu ID, v rozsahu 125 gramů
| Stupeň | Objem (litry) | Celkem RSHZ-193 (gramy) | Celkem proteinub (gramy) | Výtěžek stupně (%) | Protein Ac (ng/mg) | Agregát IgG(%) |
| Kultivační kapalina prostá buněk | 416 | 392 | 477c | — | 0 | nestán. |
| ProSep A eluát | 48,7 | 375 | 384 | 96 | 11,7 | 0,4 |
| CM SEPHAROSE“ násada | (16,3)d | (125)d | (129)d | — | ||
| CM SEPHAROSE eluát | 20,6 | 116 | 117 | 93 | nestán. | 0,4 |
| Fenyl-650M eluát | 29,1 | 98,1 | 99,8 | 85 | nestán. | <0,05 |
| Zpracovaný produkt | 9,29 | 89,8 | 91,1 | 92 | 1,7 | 0,06 |
| Kumulativní výtěžek (%) | 70 |
a pomocí vysoko účinné kapalinové chromatografie s reverzní fází b stanoveno na základě absorbance při 280 nm -t· 1,27 ml mg'1.cm“1 c pomocí Bradfordovy zkoušky d kapacita pro další část způsobuje přibližně 140 g, převede se pouze část celkového ProSep A eluátu
Tabulka 10: Rozbor čistoty, pro rozsah 125 gramů
| Stupeň | Agregáty (% z celkového IgG) | Čistota3 (% z celkové plochy) | Aktivitab (%) |
| ProSep eluát | 0,4 | 98,5 | 105 |
| CM eluát | 0,4 | 98,4 | 109 |
| Fenyl eluát | <0,05 | 98,3 | 99 |
| Finální produkt | 0,06 | 99,7 | 125 |
3 stanoveno skanovací denzitometrií redukující SDS-PAGE, součet plochy těžkých a lehkých řetězců IgG b vypočtený poměr aktivity (stanoveno ELISA vázající hovězí RS virus) ke koncentraci RSHZ19 (stanoveno A280) c vypočtený poměr aktivity (stanoveno ELISA vázající hovězí RS virus) ke koncentraci RSHZ19 (stanoveno vysoko účinnou kapalinovou chromatografií)
-19CZ 292001 B6
Příklad 2
Anti-CD4 monoklonální protilátka CH-CD4 se připraví technickým postupem kultivace buněk, 5 částečně vyčištěním za použití proteinu A a iontoměničovou chromatografíí podobným způsobem, jako se použil v příkladu 1 s tím rozdílem, že se použije aniontoměničové pryskyřice.
Kolona Amicon (průměr 1 cm, délka 10 cm) se naplní 8 ml pryskyřice TOYOPEARL fenyl650M (šarže #65PHM01 H). Průtokový rychlost se udržuje 2 ml/min ve všech stupních. Kolona se ekvilibruje 20 ml ekvilibračního pufru (1M síranu amonného, 50 mM fosforečnanu sodného, 10 hodnota pH 7,0). Produkt se připraví pro náplň kolony za použití 5 ml částečně vyčištěné CHCD4 monoklonální protilátky (koncentrace 17 mg/ml, absorbance při vlnové délce 280 nm), přidáním 2,5 ml 6 M hydrochloridu guanidinu, 50 ml fosforečnanu sodného, hodnota pH 7,0, smícháním, ponecháním po dobu 30 minut, a potom přidáním 7,5 ml 2 M síranu amonného a 50 mM fosforečnanu sodného, hodnota pH 7,0. Konečná koncentrace síranu amonného v náplni 15 obnáší 1M, konečná koncentrace hydrochloridu guanidinu činí 1M, konečný objem po odebrání vzorku je 12 ml a konečná koncentrace produktu odpovídá 5,6 mg/ml. Tato látka se potom naplní na sloupec průtokovou rychlostí 2 ml/min a potom eluuje 10 sloupcovými objemy, za použití lineárního gradientu ekvilibračního pufru do 50 mM fosforečnanu sodného, hodnota pH 7,0. Frakce o objemu přibližně 4 ml se odebírají jako produkt eluovaný ze sloupce.
V tabulce 11 jsou shrnuty výsledky. Všechny produkty jsou popřípadě eluovány v gradientu. Také se eluuje protein A, který je obohacen v posledních frakcích z gradientu. Aby se dosáhlo snížení proteinu A v konečném produktu, je nezbytné vyloučit některé frakce na konci gradientu a tak snížit výtěžek produktu. Dvojnásobné snížení proteinu A je možné s výtěžkem produktu 25 86 % a trojnásobné snížení je možné s výtěžkem 50 %.
Tabulka 11
| Frakce č. | Objem (ml) | Produkt (mg/ml) | Protein A (ng/ml) | Kumulativní specifický protein A (ng/mg) | Kumulativní výtěžek produktu | Faktor3 odstranění proteinu A |
| Náplň 0 | 12 | 5,8 | 200,7 | 35 | ||
| Eluát 1 | 5,5 | 0,04 | 0,0 | 0 | 0% | |
| 2 | 3 | 0,31 | 0,0 | 0 | 2% | |
| 3 | 4,2 | 1,32 | 6,4 | 4 | 10% | 8,6 |
| 4 | 4,2 | 3,1 | 16,9 | 5 | 28% | 7,0 |
| 5 | 4 | 4 | 68,3 | 10 | 51 % | 3,3 |
| 6 | 4,2 | 3,4 | 80,9 | 14 | 72% | 2,4 |
| 7 | 4,2 | 2,3 | 94,1 | 19 | 86% | 1,9 |
| 8 | 4,2 | 1,3 | 79,3 | 22 | 94% | 1,6 |
| 9 | 4,2 | 0,71 | 49,9 | 24 | 98% | 1,4 |
| 10 | 4,2 | 0,36 | 32,8 | 26 | 100 % | 1,3 |
| 11 | 4 | 0,19 | 22,9 | 27 | 101 % | 1,3 |
| 12 | 4 | 0,11 | 13,5 | 27 | 102% | 1,3 |
| 13 | 9,6 | 0,05 | 8,5 | 28 | 102% | 1,2 |
a Faktor odstranění se vypočítá spojením eluátových frakcí od začátku eluátu k požadované frakci a dělením počátečního proteinu A v náplni proteinem A (v ng/mg) ve spojených eluátových frakcích. Například faktor 8,6 se vypočítá vydělením součtu proteinu A ve frakcích 1 až 3 součtem produktu ve frakcích 1 až 3, což činí 4 mg/mg. Toto číslo je potom děleno 35 ng/mg v náplni a dostane se 8,6.
-20CZ 292001 B6
Příklad 2B
CH-CD4 monoklonální protilátka je částečně vyčištěna a připravena pro naplnění kolony pro hydrofobní interakční chromatografii (HIC), jak je popsáno v příkladu 2A. Použije se stejná kolona, ekvilibrace a náplň, jako v příkladu 2A. Použije se stejná kolona, ekvilibrace a náplň, jako v příkladu 2A. V tomto příkladu se po naplnění kolony a jejím promytí ekvilibračním pufrem provádí promývání 18 ml promývacího pufru (1M síranu amonného, 50 ml citrátu sodného, hodnota pH 3,5). Potom se provede promytí 13,5 ml ekvilibračního pufru (popsán v příkladu 2A). Kolona se potom eluuje gradientově a poté se promyje vodou, jak je popsáno v příkladu 2A. Eluát z kolony se rozděluje na frakce o objemu 14 ml, které se potom analyzují na produkt a protein A.
Výsledky jsou uvedeny v tabulce 12. Protein A by se mohl snížit šestkrát při výtěžku 90 % a osmkrát při výtěžku 78 %.
Tabulka 12
| Frakce č. | Objem (ml) | Produkt (mg/ml) | Protein A (ng/ml | Kumulativní specifický protein A (ng/mg) | Kumulativní výtěžek produktu | Faktor1 odstranění proteinu A |
| Náplň 0 | 12 | 5,80 | 167,1 | 29 | ||
| Eluát 1 | 14 | 1,50 | 0 | 0,0 | 30% | |
| 2 | 14 | 2,35 | 13,6 | 3,5 | 78% | 8,1 |
| 3 | 14 | 0,38 | 8,3 | 5,2 | 85% | 5,6 |
| 4 | 14 | 0,18 | 0 | 5,0 | 89% | 5,8 |
| 5 | 9 | 0,13 | 0 | 4,9 | 91 % | 5,9 |
1 Jako v poznámce „a“ k tabulce 11
Při porovnání výsledků z příkladu 2B s výsledky z příkladu 2A může být zřejmé, že se obsah proteinu A sníží šestkrát až osmkrát při dosažení přibližně 80% výtěžku, pokud je zahrnuto promývání při hodnotě pH 3,5, ale snížení je pouze dvojnásobné při dosažení 80% výtěžku CHCDH, pokud se neprovádí promývání při hodnotě pH 3,5.
Příklad 2C
Tento příklad se provádí podobně jako příklad 2B s tím rozdílem, že se zvětší rozsah. Ekvilibrace a promývací pufr jsou popsány v příkladu 2B. Kolona má průměr 5 cm a délku 28 cm, průtoková rychlost činí 50 ml/min. CH-CD4 monoklonální protilátka se připraví a částečně vyčistí, jak je popsáno v příkladu 2A. 440 ml částečně vyčištěného produktu se míchá s 220 ml 6 M hydrochloridu guanidinu po dobu 31 minuty a potom se přidá 660 ml roztoku, který obsahuje 2M síranu amonného a 50 mM fosforečnanu sodného, hodnota pH činí 7,0. Konečná koncentrace síranu amonného je 1M a finální koncentrace protilátka je 5,3 mg/ml. Po odebrání vzorku objem náplně odpovídá 1290 ml.
Kolona se nejprve ekvilibruje 2 sloupcovými objemy ekvilibračního pufru a potom se kolona naplní. Kolona se nato promyje 630 ml ekvilibračního pufru, 1000 ml vodného pufru a 800 ml ekvilibračního pufru a potom gradientově eluuje 5 sloupcovými objemy 0,75 M síranu amonného a 50 mM fosforečnanu sodného, hodnota pH 7, 0, až 50 mM fosforečnanu sodného, hodnota pH 7,0. Během eluování se zachycují frakce.
-21CZ 292001 B6
Výsledky jsou uvedeny v tabulce 13. Protein A se sníží stonásobně, při výtěžku 70%, nebo třicetinásobně, při výtěžku 80 %.
Tabulka 13
| Frakce č. | Objem (ml) | Produkt (mg/ml) | Protein A (ng/ml | Kumulativní specifický protein A (ng/mg) | Kumulativní výtěžek produktu | Faktor1 odstranění proteinu A |
| Náplň 0 | 1290 | 5,30 | 198 | 37 | ||
| Eluát 1 | 581 | 0,03 | 0 | 0,0 | 0% | |
| 2 | 304 | 3,60 | 0 | 0,0 | 16% | |
| 3 | 243 | 5,40 | 0 | 0,0 | 35% | |
| 4 | 238 | 4,50 | 0 | 0,0 | 51 % | |
| 5 | 237 | 3,40 | 2,4 | 0,1 | 63% | 282 |
| 6 | 239 | 2,2 | 4,7 | 0,4 | 71 % | 107 |
| 7 | 256 | 1,2 | 4,8 | 0,6 | 75% | 66 |
| 8 | 252 | 0,7 | 7,6 | 0,9 | 78% | 41 |
| 9 | 240 | 0,4 | 5,3 | 1,1 | 79% | 33 |
| 10 | 250 | 0,4 | 5,7 | 1,4 | 81% | 27 |
| 11 | 202 | 0,4 | 4,38 | 1,5 | 82% | 25 |
| 12 | 210 | 1 | 148,5 | 6,8 | 85% | 5 |
Příklad 2D
Částečně vyčištěná CH-CD4 monoklonální protilátka se připraví, jak je uvedeno v příkladu 2A, Ekvilibrace a promývací pufry jsou popsány v příkladu 2B. K 8 ml 9,5-mg/ml roztoku částečně vyčištěné CH-CD4 monoklonální protilátky se přidají 4 ml 6 M hydrochloridu guanidinu, 50 ml fosforečnanu sodného, hodnota pH 7,0, a vše se inkubuje po dobu 30 minut. K reakční směsi se potom pomalu přidá 12 ml 2 M síranu amonného a 50 mM fosforečnanu sodného, hodnota pH 7,0. Kolona o objemu 4 ml (průměr 0,5 cm, délka 20 cm) a průtoková rychlost 0,5 ml/min se používají ve všech stupních. Kolona se propláchne 2 sloupcovými objemy jak vody, tak ekvilibračního pufru. Potom se kolonou vede 22 ml dávkovacího roztoku, nato se zavedou 2 sloupcové objemy ekvilibračního pufru a potom se zavádí promývací pufr, až hodnota pH efluentu z kolony má hodnotu pH3,5. To se opakuje s ekvilibračním pufrem, až efluent má hodnotu pH 7,0. Kolona se eluuje 0,3 M síranu amonného a 50 mM fosforečnanu sodného, hodnota pH 7,0. Poté co se začnou zvyšovat UV stopy, zachytí se 12,6 ml eluátu a analyzuje na produkt a protein A. Výtěžek produktu činí 80 % a protein A se sníží z 28 ng/mg na 6 ng/mg, co představuje 4,7-násobné snížení.
Claims (6)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. Způsob čištění monomemí imunoglobulinové G protilátky ze směsi obsahující tuto monomemí imunoglobulinovou G protilátku, imunoglobulinové agregáty a protein A, vyznačující se t í m, že se směs při jednom z kroků uvede do styku s nosičem pro hydrofobní interakční chromatografii a monomemí imunoglobulinová G protilátka se selektivně eluuje z nosiče.
- 2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že imunoglobulin G je zvolen ze souboru zahrnujícího humanizovanou antirespirační protilátku syncytiálního viru a opičí/lidskou chimémí protilátku antihumánního receptorů CD4.
- 3. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že nosič pro hydrofobní interakční chromatografii je vybrán ze souboru sestávajícího z alkylagarózy se 2 až 8 atomy uhlíku v alkylové části, arylagarózy, alkylem modifikovaného oxidu křemičitého, arylem modifikovaného oxidu křemičitého a organické polymemí pryskyřice, která obsahuje alkylové nebo arylové skupiny.
- 4. Způsob podle nároku 3, vyznačující se tím, že nosič je vybrán ze skupiny sestávající z butyl-, fenyl- a oktylagarózy a organické polymemí pryskyřice, která obsahuje butylové, fenylové a etherové skupiny.
- 5. Způsob podle nároku 4, vyznačující se tím, že nosičem je organická polymemí pryskyřice, která obsahuje fenylové skupiny.
- 6. Způsob podle nároku 4, vyznačující se tím, že nosičem je organická polymemí pryskyřice, která obsahuje butylové skupiny.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US08/200,126 US5429746A (en) | 1994-02-22 | 1994-02-22 | Antibody purification |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ248196A3 CZ248196A3 (en) | 1997-04-16 |
| CZ292001B6 true CZ292001B6 (cs) | 2003-07-16 |
Family
ID=22740445
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ19962481A CZ292001B6 (cs) | 1994-02-22 | 1995-02-21 | Způsob čištění monomerní imunoglobulinové G protilátky |
Country Status (22)
| Country | Link |
|---|---|
| US (4) | US5429746A (cs) |
| EP (1) | EP0746398B1 (cs) |
| JP (1) | JP4198751B2 (cs) |
| KR (1) | KR100372209B1 (cs) |
| CN (1) | CN1146730A (cs) |
| AT (1) | ATE218387T1 (cs) |
| AU (1) | AU689552B2 (cs) |
| BR (1) | BR9507100A (cs) |
| CA (1) | CA2183888C (cs) |
| CZ (1) | CZ292001B6 (cs) |
| DE (1) | DE69526929T2 (cs) |
| DK (1) | DK0746398T3 (cs) |
| ES (1) | ES2177632T3 (cs) |
| HK (1) | HK1013806A1 (cs) |
| HU (1) | HU217850B (cs) |
| MX (1) | MX9603637A (cs) |
| NO (1) | NO319182B1 (cs) |
| NZ (1) | NZ281480A (cs) |
| PT (1) | PT746398E (cs) |
| SI (1) | SI0746398T1 (cs) |
| WO (1) | WO1995022389A1 (cs) |
| ZA (1) | ZA951372B (cs) |
Families Citing this family (163)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB9022545D0 (en) | 1990-10-17 | 1990-11-28 | Wellcome Found | Culture medium |
| US5935800A (en) * | 1994-10-31 | 1999-08-10 | Beth Israel Deaconess Medical Center | Assays and kits for determining male fertility |
| US5641870A (en) * | 1995-04-20 | 1997-06-24 | Genentech, Inc. | Low pH hydrophobic interaction chromatography for antibody purification |
| DK1864999T3 (da) * | 1996-11-27 | 2009-06-29 | Genentech Inc | Affinitetsoprensning af polypeptid på protein A-matrix |
| JP2001510483A (ja) | 1997-06-13 | 2001-07-31 | ジェネンテク，インコーポレイテッド | タンパク質の回収 |
| US5993653C1 (en) * | 1997-08-11 | 2001-11-06 | Phenomenex | Composition and column used in hplc |
| CN1088605C (zh) * | 1997-09-30 | 2002-08-07 | 中国科学院新疆化学研究所 | 生产石油磺酸钠的质量控制方法 |
| IL121900A (en) * | 1997-10-07 | 2001-12-23 | Omrix Biopharmaceuticals Ltd | A method for the purification of immunoglobulins |
| DE69936946T2 (de) * | 1998-05-06 | 2008-05-15 | Genentech, Inc., South San Francisco | Reinigung von Antikörpern durch Ionenaustauschchromatographie |
| DK1308455T3 (da) * | 1998-05-06 | 2006-07-31 | Genentech Inc | Sammensætning omfattende anti-HER2-antistoffer |
| TR200504220T2 (tr) | 1998-12-17 | 2007-04-24 | Biogen Idec Ma Inc. | Aktif limfotoksin-beta reseptör imunoglobülin şimeAktif limfotoksin-beta reseptör imunoglobülin şimerik proteinlerinin yüksek düzey ifadesi ve saflaştrik proteinlerinin yüksek düzey ifadesi ve saflaştırılması için bir yöntem.ırılması için bir yöntem. |
| GB9907553D0 (en) * | 1999-04-01 | 1999-05-26 | Cantab Pharma Res | Purification of biological preparations |
| DE19932782A1 (de) | 1999-07-14 | 2001-01-18 | Biotest Pharma Gmbh | Verfahren zur chromatographischen Fraktionierung von Plasma oder Serum, so erhaltene Präparate und deren Verwendung |
| ES2343023T3 (es) | 2000-03-27 | 2010-07-21 | Genetics Institute, Llc | Procedimientos para purificar proteinas altamente anionicas. |
| SE0001128D0 (sv) * | 2000-03-30 | 2000-03-30 | Amersham Pharm Biotech Ab | A method of producing IgG |
| US7064191B2 (en) * | 2000-10-06 | 2006-06-20 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | Process for purifying antibody |
| US7332289B2 (en) * | 2001-03-09 | 2008-02-19 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Method of purifying protein |
| WO2002086070A2 (en) * | 2001-04-18 | 2002-10-31 | Dyax Corp. | Binding molecules for fc-region polypeptides |
| ATE421536T1 (de) * | 2001-06-05 | 2009-02-15 | Genetics Inst Llc | Verfahren zur reinigung stark anionischer proteine |
| US7452539B2 (en) * | 2001-12-19 | 2008-11-18 | Genentech, Inc. | Stabilizing polypeptides which have been exposed to urea |
| ES2319636T3 (es) * | 2002-02-05 | 2009-05-11 | Genentech, Inc. | Purificacion de proteinas. |
| BRPI0307976B8 (pt) † | 2002-02-28 | 2021-07-27 | Microsens Biophage Ltd | processo para a ligação seletiva de uma forma anormal agregativa de uma proteína, e, processo ou ensaio quanto à presença de uma forma agregativa anormal de uma proteína de uma amostra |
| US20160279239A1 (en) | 2011-05-02 | 2016-09-29 | Immunomedics, Inc. | Subcutaneous administration of anti-cd74 antibody for systemic lupus erythematosus and autoimmune disease |
| GB0220894D0 (en) * | 2002-09-09 | 2002-10-16 | Millipore Uk Ltd | Method of separation |
| ES2626268T3 (es) * | 2002-09-11 | 2017-07-24 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Método de purificación de proteínas |
| US20040092719A1 (en) * | 2002-09-17 | 2004-05-13 | Eszter Birck-Wilson | Isolation of immunoglobulin molecules that lack inter-heavy chain disulfide bonds |
| GB0304576D0 (en) * | 2003-02-28 | 2003-04-02 | Lonza Biologics Plc | Protein a chromatography |
| DK1601697T3 (da) * | 2003-02-28 | 2007-10-01 | Lonza Biologics Plc | Oprensning af antistof ved protein A- og ionbytningskromatografi |
| WO2004087761A1 (ja) * | 2003-03-31 | 2004-10-14 | Kirin Beer Kabushiki Kaisha | ヒトモノクローナル抗体およびヒトポリクローナル抗体の精製 |
| EP1641827A2 (en) | 2003-06-27 | 2006-04-05 | Biogen Idec MA Inc. | Use of hydrophobic-interaction-chromatography or hinge-region modifications for the production of homogeneous antibody-solutions |
| US6913695B2 (en) * | 2003-07-08 | 2005-07-05 | Bayer Healthcare Llc | Sanitization of chromatographic media |
| RS53476B (en) * | 2003-07-18 | 2014-12-31 | Amgen Fremont Inc. | Hepatocyte Growth Factor Binders |
| PT3095793T (pt) | 2003-07-28 | 2020-05-04 | Genentech Inc | Redução da lixiviação de proteína a durante a cromatografia por afinidade com proteína a |
| EP1677886A1 (en) * | 2003-09-30 | 2006-07-12 | Chromba, Inc. | Multicapillary column for chromatography and sample preparation |
| US20070017870A1 (en) | 2003-09-30 | 2007-01-25 | Belov Yuri P | Multicapillary device for sample preparation |
| CA2542951C (en) * | 2003-10-24 | 2016-08-30 | Abhinav A. Shukla | Process for purifying proteins in a hydrophobic interaction chromatography flow-through fraction |
| SE0400501D0 (sv) * | 2004-02-27 | 2004-02-27 | Amersham Biosciences Ab | Antibody purification |
| US7750129B2 (en) * | 2004-02-27 | 2010-07-06 | Ge Healthcare Bio-Sciences Ab | Process for the purification of antibodies |
| RU2429245C2 (ru) | 2004-03-30 | 2011-09-20 | Глаксо Груп Лимитед | Иммуноглобулины |
| SE0400886D0 (sv) * | 2004-04-02 | 2004-04-02 | Amersham Biosciences Ab | Process of purification |
| TWI307630B (en) | 2004-07-01 | 2009-03-21 | Glaxo Group Ltd | Immunoglobulins |
| KR101243601B1 (ko) * | 2004-10-21 | 2013-03-20 | 지이 헬스케어 바이오-사이언시스 에이비 | 크로마토그래피 리간드 |
| EP1831243B1 (en) * | 2004-12-23 | 2010-03-17 | Novo Nordisk A/S | Antibody binding affinity ligands |
| WO2006074399A2 (en) | 2005-01-05 | 2006-07-13 | Biogen Idec Ma Inc. | Multispecific binding molecules comprising connecting peptides |
| JP2008529495A (ja) * | 2005-02-04 | 2008-08-07 | グラクソ グループ リミテッド | 異種ポリペプチド発現の最適化 |
| US20160355591A1 (en) | 2011-05-02 | 2016-12-08 | Immunomedics, Inc. | Subcutaneous anti-hla-dr monoclonal antibody for treatment of hematologic malignancies |
| PL1869065T3 (pl) * | 2005-03-11 | 2020-09-21 | Wyeth Llc | Sposób prowadzenia chromatografii podziałowej ze słabym wiązaniem |
| DE102005012594A1 (de) * | 2005-03-18 | 2006-09-21 | Bayer Technology Services Gmbh | Elektrofiltrationsverfahren |
| TWI391399B (zh) | 2005-05-25 | 2013-04-01 | Hoffmann La Roche | 測定溶離多肽之鹽濃度之方法 |
| US20070049732A1 (en) * | 2005-09-01 | 2007-03-01 | Zurlo Eugene J | Ultra-high yield intravenous immune globulin preparation |
| BRPI0616242A2 (pt) * | 2005-09-15 | 2011-06-14 | Wyeth Corp | floculaÇço de proteÍna usando sais |
| GB0525662D0 (en) | 2005-12-16 | 2006-01-25 | Glaxo Group Ltd | Immunoglobulins |
| AR058568A1 (es) | 2005-12-20 | 2008-02-13 | Bristol Myers Squibb Co | Metodos para producir una composicion con moleculas ctla4-ig a partir de un medio de cultivo |
| PL2253644T3 (pl) | 2005-12-20 | 2014-04-30 | Bristol Myers Squibb Co | Kompozycje i sposoby wytwarzania kompozycji |
| WO2007071068A1 (en) * | 2005-12-22 | 2007-06-28 | Conjuchem Biotechnologies Inc. | Process for the production of preformed conjugates of albumin and a therapeutic agent |
| CN101935665B (zh) * | 2006-03-17 | 2013-08-28 | 上海抗体药物国家工程研究中心有限公司 | 一种重组蛋白a基因及其表达产物的制备方法和用途 |
| DE102006014579A1 (de) * | 2006-03-29 | 2007-10-04 | Epcos Ag | Verfahren zur Reinigung einer Monomer-Lösung und Herstellungsverfahren für ein elektrisches Bauelement umfassend das Reinigungsverfahren |
| SG170837A1 (en) | 2006-04-05 | 2011-05-30 | Abbott Biotech Ltd | Antibody purification |
| US20100234577A1 (en) * | 2006-06-14 | 2010-09-16 | Smithkline Beecham Corporation | Methods for purifying antibodies using ceramic hydroxyapatite |
| AU2007294731B2 (en) | 2006-09-13 | 2014-04-17 | Abbvie Inc. | Cell culture improvements |
| WO2008127305A2 (en) * | 2006-11-01 | 2008-10-23 | Biogen Idec Ma Inc. | Method of isolating biomacromolecules using low ph and divalent cations |
| US7589183B2 (en) * | 2006-11-28 | 2009-09-15 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Prevention of leaching of ligands from affinity-based purification systems |
| WO2009007993A2 (en) * | 2007-04-23 | 2009-01-15 | Arvind Mallinath Lali | A process for purification of immunoglobulins using a pseudobioaffinity adsorbent |
| KR101226353B1 (ko) | 2007-06-01 | 2013-01-24 | 에프. 호프만-라 로슈 아게 | 면역글로불린 정제 |
| US20090149638A1 (en) * | 2007-10-03 | 2009-06-11 | Ley Arthur C | Systems and methods for purifying proteins |
| PT2215117E (pt) | 2007-10-30 | 2015-04-01 | Genentech Inc | Purificação de anticorpo por cromatografia de troca de catiões |
| WO2009058769A1 (en) * | 2007-10-30 | 2009-05-07 | Schering Corporation | Purification of antibodies containing hydrophobic variants |
| PT2220107T (pt) * | 2007-11-12 | 2017-02-08 | Chreto Aps | Polipéptidos de afinidade dupla para purificação |
| JP2011517773A (ja) * | 2008-03-28 | 2011-06-16 | バイオティクス， インコーポレイテッド | サンプル調製デバイスおよび分析物の処理方法 |
| EP2274098B1 (en) * | 2008-03-28 | 2013-12-25 | Biotix, Inc. | Multicapillary sample preparation devices and methods for processing analytes |
| CA2720048A1 (en) * | 2008-04-16 | 2009-10-22 | Biogen Idec Ma Inc. | Method of isolating biomacromolecules using polyalkylene glycol and transition metals |
| SG2013061528A (en) * | 2008-08-14 | 2015-03-30 | Merck Sharp & Dohme | Methods for purifying antibodies using protein a affinity chromatography |
| US20100111853A1 (en) * | 2008-10-20 | 2010-05-06 | Abbott Laboratories, Inc. | Antibodies that bind to il-12 and methods of purifying the same |
| CA2911256A1 (en) * | 2008-10-20 | 2010-12-09 | Robert K. Hickman | Isolation and purification of antibodies using protein a affinity chromatography |
| NZ592097A (en) * | 2008-10-20 | 2013-01-25 | Abbott Lab | Viral inactivation during purification of il-12 and il-18 antibodies |
| TW201030016A (en) * | 2008-10-20 | 2010-08-16 | Abbott Lab | Antibodies that bind to IL-18 and methods of purifying the same |
| AR074777A1 (es) | 2008-12-19 | 2011-02-09 | Glaxo Group Ltd | Proteinas de union a antigeno |
| US9631008B2 (en) | 2008-12-22 | 2017-04-25 | Hoffmann-La Roche Inc. | Immunoglobulin purification |
| CA2748807C (en) * | 2009-01-08 | 2019-01-29 | Ge Healthcare Bio-Sciences Ab | Separation method using single polymer phase systems |
| WO2010117598A2 (en) | 2009-03-31 | 2010-10-14 | 3M Innovative Properties Company | Hydrophobic monomers, hydrophobically-derivatized supports, and methods of making and using the same |
| MX2012004711A (es) * | 2009-10-20 | 2012-05-23 | Abbott Lab | Aislamiento y purificacion de los anticuerpos anti-il-13 al usar cromatografia de afinidad con proteina a. |
| WO2011080050A2 (en) | 2009-12-11 | 2011-07-07 | Novartis Ag | Binding molecules |
| CA2784278C (en) | 2009-12-18 | 2019-02-26 | Novartis Ag | Wash solution and method for affinity chromatography |
| KR20130028055A (ko) | 2010-01-28 | 2013-03-18 | 글락소 그룹 리미티드 | Ｃｄ １２７ 결합 단백질 |
| UA108227C2 (xx) | 2010-03-03 | 2015-04-10 | Антигензв'язуючий білок | |
| WO2011133894A2 (en) | 2010-04-23 | 2011-10-27 | Purdue Research Foundation | Protein drug formulations and packages |
| KR101152036B1 (ko) | 2010-04-27 | 2012-06-08 | (주)셀트리온 | 컬럼 순환 및 시료 연속주입법을 이용한 단백질 ａ 크로마토그래피 정제 방법 |
| AR081556A1 (es) | 2010-06-03 | 2012-10-03 | Glaxo Group Ltd | Proteinas de union al antigeno humanizadas |
| WO2011162210A1 (ja) * | 2010-06-21 | 2011-12-29 | 協和発酵キリン株式会社 | アミノ酸を利用したタンパク質の精製方法 |
| US8987423B2 (en) | 2010-07-22 | 2015-03-24 | Glaxosmithkline Biologicals, S.A. | MAGE antigen binding proteins |
| BR112013013884A2 (pt) * | 2010-12-06 | 2016-09-13 | Pall Corp | métodos de processamento contínuo para produtos biológicos |
| JP5838221B2 (ja) | 2010-12-21 | 2016-01-06 | エフ・ホフマン−ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト | アイソフォーム濃縮抗体調製物及びこれを得る方法 |
| EP2686334B2 (en) | 2011-03-16 | 2020-07-01 | F.Hoffmann-La Roche Ag | Ion exchange chromatography with improved selectivity for the separation of polypeptide monomers, aggregates and fragments by modulation of the mobile phase |
| ES2784628T3 (es) | 2011-03-29 | 2020-09-29 | Glaxosmithkline Llc | Sistema de tampón para purificación de proteína |
| WO2012149197A2 (en) | 2011-04-27 | 2012-11-01 | Abbott Laboratories | Methods for controlling the galactosylation profile of recombinantly-expressed proteins |
| WO2012151199A1 (en) | 2011-05-02 | 2012-11-08 | Immunomedics, Inc. | Ultrafiltration concentration of allotype selected antibodies for small-volume administration |
| MX354922B (es) | 2011-06-30 | 2018-03-26 | Genzyme Corp | Inhibidores de la activación de las células t. |
| SG10201605397PA (en) | 2011-07-01 | 2016-08-30 | Hoffmann La Roche | Method For Separation Of Monomeric Polypeptides From Aggregated Polypeptides |
| ES2657743T3 (es) | 2011-07-19 | 2018-03-06 | Philogen S.P.A. | Terapia secuencial con anti-CTLA-4 e IL-2 dirigida |
| UY34317A (es) | 2011-09-12 | 2013-02-28 | Genzyme Corp | Anticuerpo antireceptor de célula T (alfa)/ß |
| US8685241B1 (en) | 2011-12-21 | 2014-04-01 | Sepragen Corporation | Axial and radial flow columns with inflatable seals to facilitate packing and unpacking |
| EP2647709B1 (en) | 2012-04-05 | 2016-02-24 | F. Hoffmann-La Roche AG | Amine compounds for the selective preparation of biological samples |
| US9067990B2 (en) | 2013-03-14 | 2015-06-30 | Abbvie, Inc. | Protein purification using displacement chromatography |
| US9334319B2 (en) | 2012-04-20 | 2016-05-10 | Abbvie Inc. | Low acidic species compositions |
| WO2013158273A1 (en) | 2012-04-20 | 2013-10-24 | Abbvie Inc. | Methods to modulate c-terminal lysine variant distribution |
| WO2013176754A1 (en) | 2012-05-24 | 2013-11-28 | Abbvie Inc. | Novel purification of antibodies using hydrophobic interaction chromatography |
| EP2855504B1 (en) * | 2012-05-31 | 2018-10-24 | Agency For Science, Technology And Research | Chromatographic purification of immunoglobulin g preparations with particles having multimodal functionalities |
| EP2889617B1 (en) * | 2012-08-27 | 2017-10-11 | Asahi Kasei Medical Co., Ltd. | Antibody purification method by means of temperature-responsive chromatography |
| KR20150043523A (ko) | 2012-09-02 | 2015-04-22 | 애브비 인코포레이티드 | 단백질 불균일성의 제어 방법 |
| US9512214B2 (en) | 2012-09-02 | 2016-12-06 | Abbvie, Inc. | Methods to control protein heterogeneity |
| JOP20200308A1 (ar) | 2012-09-07 | 2017-06-16 | Novartis Ag | جزيئات إرتباط il-18 |
| MY178616A (en) | 2012-09-17 | 2020-10-19 | Grace W R & Co | Chromatography media and devices |
| CN103073616A (zh) * | 2013-01-06 | 2013-05-01 | 西北大学 | 使用混合模式层析技术去除抗体聚集体的方法 |
| SG11201507230PA (en) | 2013-03-12 | 2015-10-29 | Abbvie Inc | Human antibodies that bind human tnf-alpha and methods of preparing the same |
| US10023608B1 (en) | 2013-03-13 | 2018-07-17 | Amgen Inc. | Protein purification methods to remove impurities |
| WO2014159579A1 (en) | 2013-03-14 | 2014-10-02 | Abbvie Inc. | MUTATED ANTI-TNFα ANTIBODIES AND METHODS OF THEIR USE |
| WO2014151878A2 (en) | 2013-03-14 | 2014-09-25 | Abbvie Inc. | Methods for modulating protein glycosylation profiles of recombinant protein therapeutics using monosaccharides and oligosacharides |
| US9017687B1 (en) | 2013-10-18 | 2015-04-28 | Abbvie, Inc. | Low acidic species compositions and methods for producing and using the same using displacement chromatography |
| CN105188872B (zh) * | 2013-03-15 | 2019-01-15 | 葛兰素史克知识产权第二有限公司 | 用于纯化抗体的方法 |
| EP2970865B1 (en) * | 2013-03-15 | 2020-09-02 | Alder Biopharmaceuticals, Inc. | Antibody purification and purity monitoring |
| JP2016519144A (ja) * | 2013-05-13 | 2016-06-30 | メディミューン，エルエルシー | 最小限の単量体の分離を伴う組換えポリクローナル多量体の分離 |
| ES2531459B1 (es) * | 2013-06-10 | 2015-12-28 | Antonio VILA SANJURJO | Método para la separación física de "traductomas" convolucionados |
| AR096713A1 (es) * | 2013-06-25 | 2016-01-27 | Cadila Healthcare Ltd | Proceso de purificación para anticuerpos monoclonales |
| WO2015038888A1 (en) | 2013-09-13 | 2015-03-19 | Genentech, Inc. | Methods and compositions comprising purified recombinant polypeptides |
| RU2016107435A (ru) | 2013-09-13 | 2017-10-18 | Дженентек, Инк. | Композиции и способы обнаружения и количественного определения белка клеток-хозяев в клеточных линиях и рекомбинантные полипептидные продукты |
| EP3903599A1 (en) * | 2013-09-25 | 2021-11-03 | Bioverativ Therapeutics Inc. | On-column viral inactivation methods |
| US9598667B2 (en) | 2013-10-04 | 2017-03-21 | Abbvie Inc. | Use of metal ions for modulation of protein glycosylation profiles of recombinant proteins |
| US8946395B1 (en) | 2013-10-18 | 2015-02-03 | Abbvie Inc. | Purification of proteins using hydrophobic interaction chromatography |
| US9085618B2 (en) | 2013-10-18 | 2015-07-21 | Abbvie, Inc. | Low acidic species compositions and methods for producing and using the same |
| US9181337B2 (en) | 2013-10-18 | 2015-11-10 | Abbvie, Inc. | Modulated lysine variant species compositions and methods for producing and using the same |
| EP3069137A1 (en) | 2013-11-05 | 2016-09-21 | Novartis Ag | Organic compounds |
| WO2015073884A2 (en) | 2013-11-15 | 2015-05-21 | Abbvie, Inc. | Glycoengineered binding protein compositions |
| JP6853670B2 (ja) | 2014-01-16 | 2021-04-07 | ダブリュー・アール・グレース・アンド・カンパニー−コーンＷ Ｒ Ｇｒａｃｅ ＆ Ｃｏ−Ｃｏｎｎ | 親和性クロマトグラフィー媒体及びクロマトグラフィーデバイス |
| TWI709569B (zh) | 2014-01-17 | 2020-11-11 | 美商健臻公司 | 無菌層析樹脂及其用於製造方法的用途 |
| TWI709570B (zh) | 2014-01-17 | 2020-11-11 | 美商健臻公司 | 無菌層析法及製法 |
| SG11201607001PA (en) * | 2014-02-27 | 2016-09-29 | Agency Science Tech & Res | Methods for reducing chromatin content in protein preparations by treatment with alkyl cations |
| WO2015135884A1 (en) * | 2014-03-10 | 2015-09-17 | Richter Gedeon Nyrt. | Immunoglobulin purification using pre-cleaning steps |
| US10435670B2 (en) | 2014-04-15 | 2019-10-08 | Boehringer Ingelheim International Gmbh | Methods, apparatuses, and systems for continuously inactivating a virus during manufacture of a biological product |
| CN107847907A (zh) | 2014-05-02 | 2018-03-27 | 格雷斯公司 | 官能化载体材料以及制备和使用官能化载体材料的方法 |
| US10266563B2 (en) | 2014-06-24 | 2019-04-23 | Ge Healthcare Bio-Process R&D Ab | Chromatography method |
| WO2016059602A2 (en) | 2014-10-16 | 2016-04-21 | Glaxo Group Limited | Methods of treating cancer and related compositions |
| SI3215528T1 (sl) | 2014-11-06 | 2019-11-29 | Hoffmann La Roche | Variante regije Fc s spremenjeno vezavo FcRn in postopki uporabe |
| GB201506868D0 (en) | 2015-04-22 | 2015-06-03 | Ucb Biopharma Sprl | Method for protein purification |
| EP3302784B1 (en) | 2015-06-05 | 2021-10-06 | W.R. Grace & Co.-Conn. | Adsorbent bioprocessing clarification agents and methods of making and using the same |
| IL258537B1 (en) | 2015-10-09 | 2024-01-01 | Genzyme Corp | Improved combustion technology (flow cytometry that reduces the expression of the reporter) for rapid sorting of substances in high masses |
| US11407981B2 (en) | 2016-03-11 | 2022-08-09 | Boehringer Ingelheim International Gmbh | Methods for continuously inactivating a virus during manufacture of a protein |
| JP7187436B2 (ja) | 2016-07-25 | 2022-12-12 | セファロン インコーポレイテッド | アフィニティークロマトグラフィー洗浄バッファー |
| SG11201900201YA (en) | 2016-08-16 | 2019-02-27 | Regeneron Pharma | Methods for quantitating individual antibodies from a mixture |
| WO2018047080A1 (en) | 2016-09-07 | 2018-03-15 | Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited | Methods for purifying antibodies |
| US20180119192A1 (en) | 2016-10-07 | 2018-05-03 | Genzyme Corporation | Early post-transfection isolation of cells (epic) for biologics production |
| SG11201902667UA (en) | 2016-10-25 | 2019-05-30 | Regeneron Pharma | Methods and systems for chromatography data analysis |
| GB201622343D0 (en) * | 2016-12-29 | 2017-02-15 | Ge Healthcare Bio Sciences Ab | Method in bioprocess purification system |
| EP3606964A4 (en) | 2017-04-03 | 2020-12-09 | Immunomedics, Inc. | SUBCUTANE ADMINISTRATION OF ANTIBODY DRUG CONJUGATES FOR CANCER THERAPY |
| CA3067735A1 (en) | 2017-08-17 | 2019-02-21 | Just Biotherapeutics, Inc. | Method of purifying glycosylated protein from host cell galectins and other contaminants |
| CN111818980B (zh) * | 2018-03-08 | 2022-10-11 | 生物辐射实验室股份有限公司 | 阴离子交换-疏水混合模式色谱树脂 |
| EP3769083A1 (en) | 2018-03-21 | 2021-01-27 | Waters Technologies Corporation | Non-antibody high-affinity-based sample preparation, sorbents, devices and methods |
| TW202005694A (zh) | 2018-07-02 | 2020-02-01 | 美商里珍納龍藥品有限公司 | 自混合物製備多肽之系統及方法 |
| WO2020046602A1 (en) | 2018-08-31 | 2020-03-05 | Genzyme Corporation | Sterile chromatography resin and use thereof in manufacturing processes |
| AU2020253455A1 (en) | 2019-04-03 | 2021-11-04 | Genzyme Corporation | Anti-alpha beta TCR binding polypeptides with reduced fragmentation |
| HUP1900112A1 (hu) | 2019-04-04 | 2020-10-28 | Richter Gedeon Nyrt | Immunglobulinok affinitás kromatográfiájának fejlesztése kötést megelõzõ flokkulálás alkalmazásával |
| AR119270A1 (es) * | 2019-06-10 | 2021-12-09 | Millennium Pharm Inc | MÉTODOS PARA PRODUCIR UN ANTICUERPO ANTI-a4b7 |
| CN114907430B (zh) * | 2022-06-21 | 2023-12-01 | 中国科学院过程工程研究所 | 一种mRNA的分离纯化方法 |
| WO2024062074A1 (en) | 2022-09-21 | 2024-03-28 | Sanofi Biotechnology | Humanized anti-il-1r3 antibody and methods of use |
Family Cites Families (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4639513A (en) * | 1984-02-02 | 1987-01-27 | Cuno Inc. | Intravenously injectable immunoglobulin G (IGG) and method for producing same |
| DK166763C (da) * | 1983-03-16 | 1993-07-12 | Immuno Ag | Immunoglobulin-g-holdig fraktion |
| US5268306A (en) * | 1988-02-29 | 1993-12-07 | Boehringer Mannheim Gmbh | Preparation of a solid phase matrix containing a bound specific binding pair |
| US4983722A (en) | 1988-06-08 | 1991-01-08 | Miles Inc. | Removal of protein A from antibody preparations |
| US5115101A (en) * | 1988-06-08 | 1992-05-19 | Miles Inc. | Removal of protein A from antibody preparations |
| DE3825429C2 (de) * | 1988-07-27 | 1994-02-10 | Biotest Pharma Gmbh | Verfahren zur Herstellung eines intravenös verabreichbaren polyklonalen Immunglobulin-Präparates mit hohem IgM-Gehalt |
| AU6355790A (en) * | 1989-08-04 | 1991-03-11 | Peter Grandics | An integrated cell culture-protein purification system for the automated production and purification of cell culture products |
| JPH0778025B2 (ja) * | 1990-03-20 | 1995-08-23 | 日本赤十字社 | 免疫グロブリンｇの製造方法 |
| ATE122054T1 (de) * | 1990-03-22 | 1995-05-15 | Biotest Pharma Gmbh | Verfahren zur herstellung eines intravenös verträglichen immunglobulin-g-präparates. |
| JPH0480959A (ja) * | 1990-07-24 | 1992-03-13 | Seiko Epson Corp | 半導体装置 |
| GB9019812D0 (en) | 1990-09-11 | 1990-10-24 | Scotgen Ltd | Novel antibodies for treatment and prevention of infection in animals and man |
| CZ289472B6 (cs) | 1991-07-25 | 2002-01-16 | Idec Pharmaceuticals Corporation | Chimérická protilátka, nukleová kyselina, která ji kóduje, způsob její produkce a farmaceutická kompozice, která ji obsahuje |
| US5252216A (en) * | 1992-03-24 | 1993-10-12 | Smithkline Beecham Corporation | Protein purification |
| KR0160900B1 (ko) * | 1995-07-31 | 1998-12-15 | 배순훈 | 브이.씨.알의 드럼모터 장치 |
-
1994
- 1994-02-22 US US08/200,126 patent/US5429746A/en not_active Ceased
-
1995
- 1995-02-20 ZA ZA951372A patent/ZA951372B/xx unknown
- 1995-02-21 JP JP52187995A patent/JP4198751B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1995-02-21 SI SI9530606T patent/SI0746398T1/xx unknown
- 1995-02-21 PT PT95910250T patent/PT746398E/pt unknown
- 1995-02-21 MX MX9603637A patent/MX9603637A/es unknown
- 1995-02-21 HU HU9602313A patent/HU217850B/hu unknown
- 1995-02-21 AT AT95910250T patent/ATE218387T1/de active
- 1995-02-21 KR KR1019960704604A patent/KR100372209B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1995-02-21 CA CA002183888A patent/CA2183888C/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-02-21 CZ CZ19962481A patent/CZ292001B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1995-02-21 AU AU18433/95A patent/AU689552B2/en not_active Expired
- 1995-02-21 DE DE69526929T patent/DE69526929T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1995-02-21 DK DK95910250T patent/DK0746398T3/da active
- 1995-02-21 WO PCT/US1995/001823 patent/WO1995022389A1/en active IP Right Grant
- 1995-02-21 EP EP95910250A patent/EP0746398B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-02-21 NZ NZ281480A patent/NZ281480A/en not_active IP Right Cessation
- 1995-02-21 ES ES95910250T patent/ES2177632T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1995-02-21 CN CN95192680A patent/CN1146730A/zh active Pending
- 1995-02-21 BR BR9507100A patent/BR9507100A/pt not_active Application Discontinuation
-
1996
- 1996-08-21 NO NO19963475A patent/NO319182B1/no not_active IP Right Cessation
-
1998
- 1998-12-15 HK HK98113495A patent/HK1013806A1/xx not_active IP Right Cessation
-
2005
- 2005-05-27 US US11/140,525 patent/USRE40070E1/en not_active Expired - Lifetime
-
2007
- 2007-05-18 US US11/804,729 patent/USRE41555E1/en not_active Expired - Lifetime
-
2009
- 2009-03-13 US US12/403,799 patent/USRE41595E1/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CZ292001B6 (cs) | Způsob čištění monomerní imunoglobulinové G protilátky | |
| US11667671B2 (en) | Separation method | |
| JP5752558B2 (ja) | プロテインａおよびイオン交換クロマトグラフィーによる抗体精製 | |
| EP3249047B1 (en) | Mutant protein | |
| EP2831096B1 (en) | Affinity chromatography matrix | |
| AU2004286938B2 (en) | Removal of high molecular weight aggregates using hydroxyapatite chromatography | |
| US10703774B2 (en) | Separation method | |
| EP1601697B1 (en) | Antibody purification by Protein A and ion exchange chromatography | |
| EP2654915B1 (en) | Affinity chromatography matrix | |
| KR100241172B1 (ko) | 단백질의 정제 방법 | |
| KR101753569B1 (ko) | Ｆｃ―함유 단백질을 정제하는 크로마토그래피 방법 | |
| WO2004087761A1 (ja) | ヒトモノクローナル抗体およびヒトポリクローナル抗体の精製 | |
| EP3455242B1 (en) | Separation method | |
| JPH08512323A (ja) | タンパク精製方法 | |
| EP1989189B1 (en) | Adsorbents for protein purification | |
| Subramanian | Isolation of recombinant proteins by affinity chromatography |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PD00 | Pending as of 2000-06-30 in czech republic | ||
| MK4A | Patent expired |
Effective date: 20150221 |