CZ292001B6 - Způsob čištění monomerní imunoglobulinové G protilátky - Google Patents

Abstract

Zp sob iÜt n monomern imunoglobulinov G protil tky ze sm si obsahuj c tuto monomern imunoglobulinovou G protil tku, imunoglobulinov agreg ty a protein A, zahrnuje p°i jednom z krok uveden t to sm si do styku s nosi em pro hydrof bn interak n chromatografii a selektivn eluov n monomern imunoglobulinov G protil tky z nosi e.\

Description

Oblast techniky

Tento vynález se týká oblasti čištění proteinů. Vynález se zvláště týká způsobu čištění monomemí imunoglobulinové G protilátky.

Dosavadní stav techniky

Z historického hlediska programy čištění proteinu mají základ v rozdílných molekulových vlastností odvislých od velikosti, náboje a rozpustnosti, mezi proteinem určeným k vyčištění a nežádoucími kontaminanty proteinu. Pracovní předpisy založené na těchto parametrech zahrnují rozměrovou vylučovací chromatografíí, iontoměničovou chromatografíí, diferenciální srážení a podobně.

Rozměrová vylučovací chromatografie, jinak známá jako gelová filtrace nebo gelová chromatografie, se opírá o pronikání makromolekul v mobilní fázi do pórů částic stacionární fáze. Rozdílné pronikání je funkcí hydrodynamického objemu částic. Proto za ideálních podmínek se větší molekuly vylučují zvnitřku částic, zatímco menší molekuly jsou přístupné tomuto objemu a pořadí eluování se může předem stanovit podle velikosti proteinů, protože existuje lineární vztah mezi elučním objemem a logaritmem molekulové hmotnosti.

Chromatografické nosiče na bázi zesítěných dextranů, například SEPHADEX®, sférických agarózových kuliček SEPHAROSE® (oboje komerčně dostupné od firmy Pharmacia AB, Uppsala, Švédsko), na bázi zesítěných polyakrylamidů, například BIO-GEL® (komerčně dostupný od firmy BioRad Laboratories, Richmond, Kalifornie, USA) nebo založené na kopolymeru ethylenglykolu s methakrylátem, například TOYOPEARL HW65 (komerčně dostupný od firmy Toso Haas Co., Tokio, Japonsko) jsou vhodné pro přípravu různých chromatografických kolon pro hydrofobní interakční chromatografii, pří provádění určitých aspektů tohoto vynálezu.

Srážecí metody jsou založeny na skutečnosti, že v surových směsích proteinů se rozpustnosti jednotlivých proteinů pravděpodobně široce mění. Třebaže rozpustnost proteinu ve vodném prostředí závisí na různých okolnostech, pro účely tohoto rozboru se může obecně uvést, že protein bude rozpustný, pokud jeho interakce s rozpouštědlem bude silnější než je jeho interakce s molekulami proteinu stejného nebo podobného druhu. Aniž by bylo přáním se vázat na nějakou zvláštní teorii mechanismu, popisující jev srážení, se nicméně předpokládá, že interakce mezi proteinem a molekulami vody může proběhnout vázáním vodíku s několika typy skupin bez náboje a/nebo elektrostaticky, jako dipóly, s nabitými skupinami, a že precipitanty, jako jsou soli monovalentních kationů (například síranu amonného) úspěšně soutěží s proteiny o molekuly vody. Tak při vysokých koncentracích solí se proteiny stávají „dehydratované“, co snižuje jejich interakci s vodným prostředím a zvyšuje agregaci se stejnými nebo podobnými proteiny s tím výsledkem, že se vysráží z prostředí.

Iontoměničová chromatografie zahrnuje interakci nabitých funkčních skupin ve vzorku s iontovými funkčními skupinami opačného náboje na povrchu absorbentu. Jsou známy dva obecné typy interakce. Aniontoměničová chromatografie je zprostředkována negativně nabitými bočními řetězci aminokyseliny (například kyseliny asparagové nebo kyseliny glutamové), které reagují s pozitivně nabitými povrchy. Kationtoměničová chromatografie je zprostředkována pozitivně nabitými zbytky aminokyselin (jako je například lysin nebo arginin), které podléhají interakci s negativně nabitými povrchy.

-1 CZ 292001 B6

Nedávno byla vyvinuta afmitní chromatografie a hydrofobní interakční chromatografícká technika, k doplnění tradičnějšího pracovního předpisu na bázi rozměrové vylučovací chromatografie a iontoměničové chromatografie. Afmitní chromatografie se opírá o specifickou interakci proteinu s mobilizovaným ligandem. Ligand může být specifický pro jednotlivý protein, o který je zájem, přičemž v tomto případě ligandem je substrát, substrátový analog, inhibitor, receptor nebo protilátka. Podle jiného provedení ligand může být schopen reagovat s řadou příbuzných proteinů. Může se použít takový soubor specifických ligandů, jako monofosfát adenosinu, difosfát adenosinu, nikotin-adeninový dinukleotid nebo určitá barviva, aby se získala zvláštní skupina proteinů.

S ohledem na čištění molekul protilátek jsou přijatelné oba zvláštní a zevšeobecněné afinitní technické postupy. Nejcharakterističtější volba ligandu pro afinitní čištění protilátky je antigen (nebo jeho epitop), se kterým požadovaná protilátka reaguje. Řada dobře známých imunosorbentových zkoušek, jako jsou imunosorbentové zkoušky vázaného enzymu (ELISA), má základ ve specifických afinitních interakcích antigenu a protilátky.

Zobecněné afinitní technické postupy jsou však také vhodné. Například stafylokokový protein A je znám tím, že váže určité protilátky ze třídy IgG (viz P. L. Ey a kol., Immunochemistry 15, 429-436 (1978/). Podle jiného provedení antiséra získaná v heterologních druzích (například králičí protimyší antiséra) se mohou použít pro oddělení obecných skupin protilátek (viz Current Protocols in Molecular Biology, cit. výše, kap. 11).

Hydrofobní interakční chromatografie se nejprve vyvinula po zjištění, že protein by se mohl zadržet na afinitních gelech, které obsahují uhlovodíková vymezovací ramena (spacer arms), ale kteiým chybí afinitní ligand. Třebaže v této oblasti se výraz hydrofobní chromatografie někdy používá, výraz hydrofobní interakční chromatografie (HIC) je výhodný, protože dochází k interakci mezi solutem a gelem, který není hydrofobní při chromatografickém postupu. Hydrofobní interakce jsou nejsilnější při vysoké iontové síle, proto tato forma oddělení se obvykle provádí po vysrážení sol nebo iontoměničových procedurách. Eluování z nosičů pro hydrofobní interakční chromatografií se může provádět změnou rozpouštědla, hodnoty pH, iontové síly nebo přidáním chaotropních přípravků nebo organických modifíkátorů, jako je ethylenglykol nebo propylenglykol. Popis obecné podstaty hydrofobní interakční chromatografie se dá najít v patentu US 3 917 527 a v patentu US 4 000 098. Aplikace hydrofobní interakční chromatografie na čištění specifických proteinů je uvedena formou příkladů s odkazem na dále uvedené objevy: lidský růstový hormon (patent US 4 332 717), toxinové konjugáty (patent US 4 771 128), antihemolytický faktor (patent US 4 743 680), faktor tumorové nekrózy (patent US 4 894 439), interleukin-2 patent US 4 908 434), lidský lymfotoxin (patent US 4 920 196), druhy lysozymu (J. L. Fausnaugh a F. E. Regnier, J. Chromatog. 359, 131-146 /1986/) a rozpustné komplementární receptory (patent US 5 252 216). Hydrofobní interakční chromatografie v souvislosti s vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií (HPLC) se používá k oddělování fragmentů protilátek (například F(ab')2) z molekul intaktní protilátky podle pracovního předpisu v jediném stupni (K. Morimoto a kol., J. Biochem. Biophys. Meth., 24, 107— 117/1992/).

Kromě afinitního technického postupu a technického postupu hydrofobní interakční chromatografie se na čištění protilátky aplikuje alespoň jeden z běžných programů pro čištění proteinů. Například L. Hakalahti a kol. (J. Immunol. Meth., 117, 131-136 /1989/) uvádí pracovní předpis, používající dvou následujících iontoměničových chromatografických stupňů nebo pracovní předpis používající jediného iontoměničového stupně, s následujícím stupněm hydrofobní interakční chromatografie. A. Danielsson a kol. (J. Immunol. Methods, 115. 79-88 /1988/) srovnává jednostupňový pracovní předpis, založený na aniontoměniči, kationtoměniči, chromatografickém fokusování a hydrofobní interakční chromatografií.

Ačkoliv se afinitní sloupcová chromatografie pro protein A široce používá, je třeba také vzít v úvahu, že eluování protilátky z takových sloupců může mít za výsledek vyluhování výsledného

-2CZ 292001 B6 proteinu A z nosiče. Rozměrová vylučovací HPLC (Das a kol., Analytical Biochem., 145. 27-36 /1985/) a aniontoměničová chromatografie (EPO 345 549, publikováno dne 13. prosince 1989) jsou také navrženy jako prostředek pro řešení tohoto problému.

Nyní bylo s překvapením nalezeno, že hydrofobní interakční chromatografie se může výhodně používat k odstranění kontaminujícího proteinu A ze směsi IgG eluovaných zchromatografického nosiče proteinu A.

Tento vynález se týká aplikace hydrofobní interakční chromatografie na oddělování monomerního IgG ze směsí sjeho obsahem a zabudování hydrofobní interakční chromatografie do pracovního předpisu, který kombinuje protein A a iontoměničovou chromatografíi pro čištění molekul imunoglobulinu G.

Podstata vynálezu

Předmětem tohoto vynálezu je způsob čištění monomemí imunoglobulinové G protilátky ze směsi obsahující tuto monomemí imunoglubulinové G protilátky ze směsi obsahující tuto monomemí imunoglobulinovou G protilátku, imunoglobulinové agregáty a protein A, jehož podstata spočívá v tom, že se směs při jednom z kroků uvede do styku s nosičem pro hydrofobní interakční chromatografíi a monomemí imunoglobulinová G protilátka se selektivně eluuje z nosiče.

Při výhodném provedení způsobu podle tohoto vynálezu je imunoglobulin G zvolen ze souboru zahrnujícího humanizovanou antirespirační protilátku syncyciálního viru a opičí/lidskou chimémí protilátku antihumánního receptorů CD4.

Při jiném výhodném provedení způsobu podle tohoto vynálezu je nosič pro hydrofobní interakční chromatografíi vybrán ze souboru sestávajícího z alkylagarózy se 2 až 8 atomy uhlíku v alkylové části, arylagarózy, alkylem modifikovaného oxidu křemičitého (dále též alkyl—silika), arylem modifikovaného oxidu křemičitého (dále též aryl-silika) a organické polymemí pryskyřice, která obsahuje alkylové nebo arylové skupiny. Zvláště výhodné je, pokud je nosič vybrán ze skupiny sestávající zbutyl-, fenyl- a oktylagarózy a butyl-, fenyl- a ether- organické polymemí pryskyřice. Jako obzvláště výhodné se ukazuje, pokud takovým nosičem je fenyl-organická polymemí pryskyřice nebo pokud takovým nosičem je butyl-organická polymemí pryskyřice.

Při jiném výhodném provedení způsobu podle tohoto vynálezu se protilátka selektivně eluuje pufrem s nízkým obsahem soli. Přitom je obzvláště výhodné, pokud se protilátka selektivně eluuje s gradientovým poklesem obsahu soli do 50 mM fosforečnanu sodného, hodnota pH 7,0.

Přehled obrázku na výkresu

Obr. 1 ilustruje průtokové schéma způsobu čištění protilátky podle tohoto vynálezu.

Dále se uvádí detailní popis tohoto vynálezu v širších souvislostech.

Definice

V další části popisu se používají výrazy, které mají význam zde vysvětlený. Další významy jsou objasněny přímo v místech svého prvního použití.

- „Koncentrace x M“ znamená koncentraci „x mol na litr“. Objem je objemem roztoku.

-3CZ 292001 B6

- „Gradientovy pufr“ znamená pufrovaný roztok, který se používá k vyvíjení gradientu, obvykle jde o koncentraci soli. Pufr se používá k udržení hodnoty pH při změně koncentrace soli v roztoku.

- „CM nevázaná frakce“ označuje frakci obsahující látky, která protéká CM sloupcem aniž by došlo kjejímu navázání na pryskyřici. Odlišuje se od CM eluátu, protože CM eluáty byly původně vázány na CM pryskyřici za podmínek ekvilibračního pufru, ale navázaly se na CM pryskyřici poté co byl na sloupec aplikován gradient soli.

- „CM ekvilibrační pufr“ je pufr používaný k ekvilibraci pryskyřice před vnesením směsi proteinů na sloupec a pro usnadnění vázání požadovaných proteinů na sloupec. Často jde o výchozí bod elučního gradientu.

- „CM eluční pufr“ je pufr používaný k eluování požadovaných proteinů poté co se proteiny vázaly na pryskyřici.

- „Fenyl nevázaná frakce“ je frakce obsahující protein a jiné látky, která přímo protéká sloupcem bez vázání na fenyl-650 piyskyřici za podmínek ekvilibračního pufru.

- „Butyl-650 nevázaná frakce“ je frakce, která obsahuje proteiny a jiné látky a která protéká přímo sloupcem bez vázání na butyl-650 pryskyřici za podmínek ekvilibračního pufru.

- „Aplikace lineárního pufru“ označuje použití gradientu, kde koncentrace soli se zvyšuje nebo klesá konstantní rychlostí s ohledem na objem roztoku protékající kolonou, například o 0,01 mmol na litr.

Detailní údaje

Tento vynález se týká čisticího technického postupu pro protein, který se dá aplikovat v širokém rozsahu na čištění molekul imunoglobulinu. Vynález je zvláště vhodný, protože dovoluje získávání monomemího IgG o čistotě více než 95 % proteinu. Vynález se dá použít pro čištění řady rozdílných molekul imunoglobulinu G.

Proteiny podobné protilátce jsou proteiny, které se mohou čistit podle pracovního předpisu zde popsaného, přičemž tento pracovní předpis se podle potřeby upravuje rutinním uspořádáním, bez nároku na vynálezecké řešení, které nemá za následek nežádoucí experimentování. Takové proteiny zahrnují izotopy, alotopy a alely imunoglobulinových genů, omezené formy, upravené protilátky, jako chimémí protilátky, humanizované protilátky a podobně, chemicky modifikované formy, jako se dosahují zpracováním s olyethylenglykolem, a kondenzované proteiny, obsahující imunoglobulinové Části. Tyto proteiny se označují jako podobné protilátkám, protože mají nebo uchovávají dostatek vlastností imunoglobulinových proteinů (například F_c determintů), které vedou k čištění způsobem podle tohoto vynálezu. Pokud není uvedeno jinak, výrazy protilátka a imunoglobulinový protein také zahrnují proteiny podobné protilátce.

Molekuly imunoglobuliny podle tohoto vynálezu se mohou také izolovat z řady zdrojů včetně séra imunizovaných zvířat, ascitové kapaliny, hybridomových nebo myelomových supematantů, kondicionovaného prostředí odvozeného od kultivace rekombinantní buněčné linie, která exprimuje molekuly imunoglobulinu a ze všech buněčných extraktů buněk produkujících imunoglobulin. Tento vynález je zvláště vhodný pro použití při čištění protilátek od kondicionovaných prostředí buněčné kultury různých protilátek produkujících rekombinantní buněčné linie. Třebaže se mohou očekávat určité proměny od buněčné linie k buněčné linii a mezi různými protilátkovými produkty, které jsou založené na zde uvedeném zjištění, je zcela v kompetenci odborníka v oboru upravit tento vynález pro zvláštní kombinaci protilátkového proteinu a produkující buněčné linie.

-4CZ 292001 B6

Obecně geny kódující proteiny jako protilátky mohou být klonovány inkorporujícími DNA sekvencemi kódujícími pro požadované oblasti polypeptidu v rekombinantním DNA nosiči (například vektoru) a transformujícími nebo transferujícími vhodné prokaryotické nebo eukaryotické hostitele. Mezi vhodné prokaryotické hostitele se zahrnuje Escherichia, Streptomyces, Bacillus a podobně, avšak výčet není na ně omezen. Mezi vhodné eukaryotické hostitele se zahrnují kvasinky, jako je Saccharomyces a zvířecí buňky v kulturách, jako je VĚRO, HeLa, myš Cl27, vaječník čínského křečka (CHO), WI-38, BHK, COS, MDCK, myelomy a buněčné linie hmyzu, na něž však výčet není omezen. Obzvláště výhodní hostitelé jsou buněčné linie CHO odlišné v dihydrofolát reduktáze, jako ATCC CRL 1793, CRL 9096 a jiné buněčné linie zde popsané dále. Takové rekombinantní technické postupy se nyní stávají dobře známé a jsou popsány v Methods in Enzymology, sv. 65 a 69 /1979/, 100 a 101 /1983/ (Academie Press) a v odkazech tam uvedených. Rozsáhlá technická diskuze zahrnující nejběžněji používanou rekombinantní DNA metodologii se může zjistit v Maniatis-ově a kol. publikaci Molecular Cloning. Cold Spring Harbor Laboratory /1982/ nebo v Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing, Wiley Interscience/1988, 1991, 1993/.

Jednou cestou k získání DNA fragmentu kódujícího požadovaný polypeptid, jako molekulu protilátky , je cesta klonování komplementární DNA. Při tomto procesu se mediátorová RNA (mRNA) izoluje z buněk, které jsou známé nebo podezřelé, že produkují požadovaný protein. Radami enzymatických reakcí se mediátorová RNA populace buněk kopíruje do komplementární DNA (cDNA). Výsledná komplementární DNA se potom vpravuje do klonujících přenašečů a následně použije k transformaci vhodného prokaryotického nebo eukaryotického hostitele. „Sbírka“ výsledných komplementárních DNA sestává z populace transformovaných hostitelských buněk, z nichž každá obsahuje jediný gen nebo fragment genu. Celá sbírka, z teoretického hlediska, poskytuje reprezentativní vzorek kódující přítomnou informaci ve směsi mediátorových RNA, která je použita jako výchozí materiál. Sbírka se může třídit za použití nukleové kyseliny nebo zkušebních protilátek, za účelem identifikace specifických sekvencí DNA. Tyto sekvence DNA jednou izolované se mohou modifikovat nebo se mohou zabudovat do kompletních genů.

Specifické fragmenty genu protilátky se mohou připravit metodami genového inženýrství nezávisle na zbytku genu. DNA fragmenty kódující komplementární determinující oblasti (CDR) se mohou integrovat do DNA sekvencí základní struktury z heterologních druhů, aby se dostaly změněné protilátky. Tyto změněné protilátky mají významné použití při ošetřování nežádoucích fyziologických stavů. Například PCT/GB91/01554 (publikováno jako WO 92/04381) popisuje přípravu „humanizovaných“ protilátek vhodných pro ošetřování nebo prevenci infekce vyvolané respiračním syncyciálním virem (RSV). Podle jiného provedení celá variabilní oblast genu protilátky se může kondenzovat ke konstantní doméně druhé protilátky za vzniku pozměněné protilátky, která je jinak známa jako „chimémí protilátka“. Například PCT/US92/06194 (publikováno jako WO 93/02108) uvádí opice/člověk chimémí protilátku, která může reagovat s lidským CD4 receptorem.

Jakmile je protilátkový gen nebo genový fragment klonován, DNA se může zavést do exprimovaného vektoru a tato konstrukce se použije pro transformaci vhodné buňky hostitele. Exprimovaný vektor je charakterizován jako vektor, který má expresní kontrolní sekvence jak jsou zde definovány, takže když je k němu operativně vázána významná DNA sekvence, vektor je schopen řídit přípravu produktu kódovaného významnou DNA sekvencí v hostitelově buňce obsahující vektor. Se zvláštním odkazem na tento vynález je možné sestavit fragmenty zjednotlivé kódující sekvence, jako se vytvoří po expresi molekuly protilátky. Zvláště účinná aplikace tohoto pracovního předpisu k produkci rekombinantní protilátky se nachází v Harrisově a kol. PCT přihlášce WO 92/04381, publikované dne 19. března 1992, citováno výše, a v PCT přihlášce WO 93/02108, publikované dne 4. února 1993, citováno výše, původce Newman a kol.

-5CZ 292001 B6

Poté co se připraví rekombinantní produkt, je žádoucí, aby se tento produkt získal. Pokud se produkt exportuje buňkou, která tento produkt vyprodukovala, produkt se může získat přímo z prostředí buněčné kultury. Jestliže se produkt zadržuje intracelulámě, buňky se musí fyzikálně narušit mechanickými, chemickými nebo biologickými prostředky, za účelem získání intracelulámího produktu.

V případě, že produktem je protein, pracovní předpis pro čištění by neměl poskytnout pouze produkovaný protein, který je v podstatě zbaven jiných proteinů, přičemž produkovaným proteinem se rozumí produkt s alespoň 80% a výhodně více než 95% čistotou, s ohledem na celkový protein v přípravku, ale měl by také eliminovat nebo snížit na žádoucí úrovně jiné kontaminanty z hostitelské buňky, DNA, RNA, potenciální pyrogeny a podobné látky. Kromě toho v souvislosti s produkcí protilátky rekombinantním expresním systémem je třeba vzít v úvahu, že může nastat agregace IgG produktu o 150 000 daltonech do druhů s vyšší molekulovou hmotností. Proto pro účely čištění produktu a normalizace je také vhodné oddělit přírodní monomemí druhy o 150 000 daltonech od agregátů o vyšší molekulové hmotnosti a jiných nežádoucích násobných forem. I když se vezme v úvahu, že druhy imunoglobulinu G se 150 000 daltony sestávají ze čtyř polypeptidových řetězců (2 těžké řetězce a 2 lehké řetězce), druhy o 150 000 daltonech se zde označují jako „monomer“ nebo „monomemí IgG“.

Jak již bylo uvedeno výše, mohou se používat různé hostitelské buňky pro přípravu protilátek podle tohoto vynálezu. Volba zvláštní hostitelské buňky je zcela v kompetenci odborníka v oboru, který bere mimo jiné v úvahu povahu protilátky, rychlost její syntézy, rychlost jejího rozkladu a charakteristiky rekombinantního vektoru řídícího expresi protilátky. Volba expresního systému hostitelské buňky je diktována ve velikém rozsahu povahou procedur pro buněčné kultury, které se mají použít. Výběr zvláštního způsobu přípravy, která je šaržovitá nebo kontinuální, spojená s otáčením pracovního prostoru nebo dodávkou vzduchu, prováděná v kapalině nebo v imobilizovaném stavu, se může provést, jakmile se vybere expresní systém. Proto se mohou použít fluidizovaná lóže biologických reaktorů, duté vlákenné biologické reaktory, válcové láhve pro kultivaci nebo míchané zásobníkové biologické reaktory, s nebo bez mikronosičů buněk. Kritéria pro takový výběr jsou ohodnocena v oboru buněčné kultury. Zde se neuvádějí podrobnosti, protože spadají mimo rozsah tohoto vynálezu. Tento vynález se týká čištění protilátek daných jejich existencí v kondicionovaném prostředím buněčné kultury, hybridomového supematantu, antiséra, myelomového supematantu nebo ascitové kapaliny.

Jak bylo uvedeno výše, tento vynález se týká mimo jiné použití hydrofobní interakční chromatografie (HIC) k oddělení vyčištěných molekul protilátky. Hydrofobní molekuly ve vodném rozpouštědle jsou samopřipojitelné. Toto připojení je důsledkem hydrofobní interakce. Nyní bylo zjištěno, že makromolekuly, jako proteiny, mají na svém povrchu rozsáhlá hydrofobní místa, kromě předpokládaných hydrofobních skupin. Hydrofobní interakční chromatografie má z části základ v interakci těchto míst s hydrofobními ligandy, připojenými k chromatografickému nosiči. Hydrofobní ligandy kondenzované k základní hmotě se zde označují různými názvy, jako nosič pro hydrofobní interakční chromatografií, hydrofobní interakční chromatografícký gel nebo kolona, popřípadě sloupec pro hydrofobní interakční chromatografii. Dále je třeba vzít v úvahu, že síla interakce mezi proteinem a nosičem pro hydrofobní interakční chromatografii není pouze funkcí poměru nepolárních povrchů k polárním povrchům na proteinu, ale také distribuce nepolárních povrchů, stejně jako chemických vlastností nosiče pro hydrofobní interakční chromatografii.

Pro přípravu sloupce pro hydrofobní interakční chromatografii (HIC) se může používat řada chromatografických nosičů, přičemž nej rozšířenější použití nachází agaróza, silika (oxid křemičitý) a organické polymemí nebo kopolymemí pryskyřice. Mezi vhodné hydrofobní ligandy se zahrnují alkylové skupiny obsahující přibližně od 2 do zhruba 8 atomů uhlíku, jako je butyl, propyl nebo oktyl, anebo arylové skupiny, jako je fenyl. Na uvedené skupiny však výčet není omezen. Běžné HIC produkty pro gely a sloupce se mohou dostat z komerčních zdrojů od dodavatelů, jako je Pharmacia LKB AB, Uppsala, Švédsko, pod názvy butyl-SEPHAROSE®,

-6CZ 292001 B6 fenyl- nebo butyl-SEPHAROSE® CL-4B, butyl-SEPHAROSE® FF, od Tosoh Corporation,

Tokio, Japonsko, produkty pod označením TOYOPEARL ether 650, fenyl 650 nebo butyl 650 (Fractogel), od Miles-Yeda, Rehovot, Izrael pod názvem produktu alkyl-agaróze, kde alkylová skupina obsahuje od 2 do 10 atomů uhlíku a od J. T. Baker, Phillipsburg, N. J., USA, s pojmenováním produktu Bakerbond WP-HI-propyl.

Je také možné připravit požadovaný sloupec pro hydrofobní interakční chromatografií za použití obvyklého chemického postupu (viz například Z. Er-el a kol., Biochem. Biophys. Res. Comm., 49, 383 /1972/ nebo V. Ulbrich a kol., Coli. Czech. Chem. Commun., 9 1466 /1964/).

Hustota ligandu je důležitým parametrem v tom, že ovlivňuje nejen sílu interakce, ale stejně tak kapacitu sloupce. Hustota ligandu komerčně dostupných fenylových nebo oktylfenylových gelů je řádově 40 pmol/ml gelového lóže. Kapacita gelu je funkcí zvláštního zmíněného proteinu, stejně jako hodnoty pH, teploty, typu soli a její koncentrace, ale obecně se může předpokládat, že spadá do rozmezí od 3 do 20 mg/ml gelu.

Volbu zvláštního gelu může určit odborník v oboru. Obecně síla interakce proteinu a hydrofobního interakčního chromatografického ligandu se zvyšuje s délkou řetězce alkylových ligandů, ale ligandy, které obsahují od přibližně 4 do zhruba 8 atomů uhlíku, jsou vhodné pro většinu separací. Fenylová skupina má přibližně stejnou hydrofobicitu jako pentylová skupina, třebaže selektivita může být naprosto odlišná díky možnosti π-π orbitální interakce s aromatickými skupinami na proteinu. Selektivně může být také ovlivněna chemickým účinkem nosné pryskyřice.

Adsorpce proteinů na sloupci pro hydrofobní interakční chromatografií je zvýhodněna vysokými koncentracemi soli, ale skutečné koncentrace se mohou měnit v širokém rozmezí, v závislosti na povaze proteinu a na zvláštním zvoleném hydrofobním interakčním chromatografickém ligandu. Různé ionty se mohou uspořádat do tak zvaných solufóbních řad v závislosti na tom, zda napomáhají hydrofobním interakcím (vysolovací účinky) nebo narušují strukturu vody (chaotropní účinek) a vedou ke slábnutí hydrofobní interakce. Kationty jsou rozděleny vzhledem ke zvyšujícímu se vysolovacímu účinku jako

Ba⁺⁺ < Ca⁺⁺< Mg⁺⁺< Li⁺ <Na⁺<K⁺ <Rb⁺ <NH4⁺, zatímco anionty mohou být rozděleny s ohledem na zvyšující se chaotropní účinek jako PO4~ < SO₄~ < CH₃COO“ < Cf < Br < No₃ ^_ < C1O₄’ < Γ < SCN”.

Soli mohou být proto formulovány tak, že ovlivňují sílu interakce, jak je dána dále uvedeným vztahem:

(NH|)2SO₄ > Na₂SO₄ > NaCl > ΝΗ,ΟΙ > NaBr > NaSCN.

Z obecného hlediska jsou vhodné koncentrace solí, které činí od přibližně 0,75 do zhruba 2M síranu amonného nebo od přibližně 1 do 4M chloridu sodného.

Vliv teplot na separace prováděné hydrofobní interakční chromatografií není jednoduchý, třebaže obecně při poklesu teploty nastává pokles interakce. Jakékoli výhody, které by vyplynuly ze zvýšení teploty, musí však také být vyváženy proti nepříznivým účinkům, jaké takové zvýšení může mít na stabilitu proteinu.

Eluování, buď postupné, nebo ve formě gradientu, může být dosahováno různými způsoby:

a) změnou koncentrace soli,

b) změnou polarity rozpouštědla nebo

c) přidáním detergentů.

S poklesem koncentrace soli se adsorbované proteiny eluují v pořadí zvyšující se hydrofobicity. Změny polarity se mohou dosahovat přidáním rozpouštědel, jako ethylenglykol, propylenglykol,

-ΊCZ 292001 B6 propanol nebo izopropanol, přičemž klesá síla hydrofobních interakcí. Detergenty fungují jako náhrada proteinů a používají se především v souvislosti s Čištěním membránových proteinů.

Třebaže bylo nalezeno, že hydrofobní interakční chromatografie se může používat samotná k oddělení monomemího IgG (molekulová hmotnost 150 000) z agregátů a nežádoucích násobných forem, jak je uvedeno výše, hydrofobní interakční chromatografie je zvláště vhodná, pokud se používá v kombinaci s jinou čisticí technikou pro proteiny. Mělo by se uvést, že je výhodné aplikovat hydrofobní interakční chromatografii na směsi, které jsou částečně vyčištěny jinými způsoby pro čištění proteinů. Výraz „částečně vyčištěný“ označuje proteinový přípravek, ve kterém je uvažovaný protein přítomen v množství alespoň 5 % hmotnostních, výhodněji alespoň 10 % hmotnostních a obzvláště výhodně alespoň 45 % hmotnostních. Výraz „směs“ označuje požadované molekuly monomemí IgG protilátky v kombinaci s nežádoucími kontaminanty, jako je alespoň jeden z imunoglobulinových agregátů, jejich vícenásobných forem, proteinu hostitelské buňky, zbytkového materiálu z předcházejících chromatografických stupňů, jakým je protein A, pokud se použil. Proto aplikace hydrofobní interakční chromatografie se může také ocenit v souvislosti s celkovým pracovním předpisem pro čištění imunoglobulinových proteinů, tak jako afínitně vyčištěné monoklonální protilátky. Například bylo nalezeno, že je vhodné vzorek kondicionovaného prostředí buněčné kultury podrobit částečnému vyčištění před aplikací hydrofobní interakční chromatografie. Výrazem „kondicionované prostředí buněčné kultury“ se rozumí prostředí buněčné kultury, které podporuje růst buněk a/nebo udržování buněk a obsahuje segregovaný produkt. Vzorek takového prostředí se podrobí alespoň jednomu čisticímu stupni před aplikací stupně hydrofobní interakční chromatografie. Vzorek se může podrobit afinitní chromatografii za použití stafylokokového proteinu A jako prvního stupně. Například se úspěšně může použít PROSEP-A® (BioProcessing Ltd., U.K.) který sestává z proteinu A kovalentně kondenzovaného ke sklu s řízenými póry. Jiné vhodné přípravky z proteinu A jsou SEPHAROSE® Fast Flow (Pharmacia) a TOYOPEARL 65OM Protein A (Toso Haas). Jako druhý stupeň se může použít iontoměničová chromatografie. V tomto ohledu se mohou k základní hmotě připojit různé aniontové a kationtové substituenty, za účelem vytvoření aniontového nebo kationtového nosiče pro chromatografii. Mezi substituenty přítomné na aniontoměniči se zahrnuje diethylaminoethyl (DEAE), kvartémí aminoethyl (QAE) a kvartémí aminoskupiny. Mezi substituenty přítomné na kationtoměniči se zahrnuje karboxymethyl (CM), sulfoethyl (SE), sulfopropyl (SP), fosfát (P) a sulfonát (S). Iontoměničové pryskyřice na bázi celulózy, jako je DE23, DE32, DE52, CM-23, CM-32 a CM-52 jsou dostupné od firmy Whatman Ltd. Maidstone, Kent, Velká Británie, iontoměniče na bázi SEPHADEX® a zesítěného SEPHADEX® jsou také známé. Například DEAE-, QAE-, CM-, a SP-SEPHADEX®, DEAE-, Q-, CM- a S-SEPHAROSE® a SEPHAROSE® Fast Flow jsou dostupné u firmy Pharmacia AB. Kromě toho jak DEAE, tak CM derivovaný ethylenglykol-methakrylátová kopolymer, jako je TOYOPEARL DEAE-650S nebo M a TOYOPEARL CM-650S nebo M jsou dostupné u firmy Toso Haas Co., Philadelphia, PA, USA. Protože eluování z iontoměničového nosiče obvykle vyžaduje přidání soli a protože, jak již bylo uvedeno, hydrofobní interakční chromatografie se zlepšuje při vzrůstajících koncentracích solí, zavedení stupně hydrofobní interakční chromatografie po iontoměničovém chromatografickém stupni nebo jiných čisticích stupních zprostředkovaných solí, je obzvláště výhodné. Mohou se připojit dodatkové pracovní stupně pro čištění, ale nejsou nezbytně omezeny na další iontoměničovou chromatografii, rozměrovou vylučovací chromatografii, virovou inaktivaci, koncentrování a sušení vymražováním.

Pouze k ilustrativním účelům se uvádí, že tento vynález se aplikoval na čištění několika protilátek IgG izotypu. Uvedeno přesněji, použila se humanizovaná protilátka vhodná pro ošetřování RSV infekce, kterou popsal Harris a kol. /1992/ v publikované mezinárodní patentové přihlášce číslo WO 92/04381, zveřejněné dne 19. března 1992 (zde dále označována jako „RSHZ-19“), a chimémí protilátka specificky reaktivní sCD4 antigenem, kterou popsal Newman a kol. v publikované mezinárodní patentové přihlášce číslo WO 93/02108, zveřejněné dne 4. února 1993 (zde dále označováno jako CH-CD4). Konstrukce rekombinantních systémů pro produkci RSHZ-19 a CH-CD4 chimémích protilátek je podrobně popsána ve výše

-8CZ 292001 B6 uvedených PCT přihláškách, jejichž obsah se zde zahrnuje do dosavadního stavu techniky, a v souhrnu se uvádí dále.

Expresivní plazmid, obsahující RSHZ-19 kódující sekvenci, se kontransfekuje spSV2dhfr do buněčné linie dhfr-nárokujícího vaječníků čínského křečka (CHODUXBII). Transfekce se provádí v růstovém prostředí a využívá kalciové koprecipitace a glycerolové šokové procedury, jak je popsáno v DNA Cloning, vyd. D. M. Glover (kapitola 15, C. Gorman). Po transfekci se buňky udržují v růstovém prostředí po dobu 46 hodin za růstových podmínek (jako jsou popsány výše), před selekčním postupem.

Selekce a ko-amplifikační postup se provádějí v podstatě jak popsal R. J. Kaufman a kol. (Mol. Cell. Biol., 5, 1750-1759 /1985/). 46 hodin po transfekci se buňky vnesou do selektivního prostředí MEM ALPHA (041-02571), s obsahem 1 % zásobního glutaminu, 1 % zásobního pen/strep (043-050070) a dialýzovaného hovězího fetálního telecího séra (220-6300AJ) (Gibco, 15 Paisley, Skotsko). Buňky se udržují se selektivním prostředí po dobu 8 až 10 dnů, až se objeví kolonie dhfr⁺. Jakmile jsou kolonie založeny, buňky se vnesou do selektivního prostředí, které obsahuje methotrexát (A6770, Sigma Chem. Co., St. Louis, MO, USA). Koncentrace methotrexátu je z počátku 0,02 μΜ a postupně se zvyšuje na 5 μΜ. Během amplifikačního postupu se zkoušejí alikvoty růstového prostředí z růstových buněk na produkci RSHZ-19 20 lidským IgG. Jakákoli rekombinantní buněčná linie způsobující sekreci protilátky se může použít k dodávce kondicionovaného prostředí pro čištění podle tohoto vynálezu, přičemž určité se nevyžaduje zvláštní buněčná linie.

Transfekovaná CHO buněčná linie schopná produkovat RSHZ-19 se může kultivovat změnou 25 technického postupu pro buněčné kultury. Pro aplikace podle tohoto vynálezu není rozhodující zvláštní metoda kultivace.

Jak již bylo zmíněno výše, zvláštní rekombinantní produkční systém a zvláštní pracovní předpis pro kultivaci buněk nespadají do rozsahu tohoto vynálezu. Systém a pracovní předpis, které jsou 30 uvedeny výše, jsou reprezentativními případy z řady možných voleb dostupných odborníkovi v oboru a jsou zde zahrnuty toliko k ilustračním účelům. Pracovní předpis pro čištění, který je předmětem tohoto vynálezu, je aplikovatelný toliko s běžnými úpravami na různé druhy rekombinantních protilátek a proteiny podobné protilátce bez ohledu na to, jak se produkují nebo kultivují. Například chimérická monoklonální protilátka kCD4 se také čistí způsobem podle 35 tohoto vynálezu.

Vyčištěné protilátky, získané provedením způsobu podle tohoto vynálezu, mají tyto vlastnosti:

1) obsahují více než 97 % hmotnostních protilátkového proteinu,

2) jsou stabilní k proteolytické degradaci za teploty 4 °C po dobu alespoň tří měsíců,

3) obsahují málo (méně než 0,1 mezinárodní jednotky na mg proteinu) endotoxinu,

4) obsahují málo (méně než 1 pg/mg proteinu) DNA,

5) obsahují ne-protilátkový protein v množství menším než 5 % hmotnostních a

6) jsou virově inaktivní.

Příklady provedení vynálezu

Dále uvedené příklady blíže ilustrují tento vynález, aniž by způsobovaly omezení zde 50 připojených patentových nároků.

-9CZ 292001 B6

Příklad 1

Úvod

Postup naznačený dále byl vyvinut pro izolaci a čištění monoklonální protilátky proti respiračnímu syncyiálnímu viru (RSV). Touto protilátkou je „humanizovaný“ imunoglobulin G exprimovaný vCHO buňkách a roste vmíchaném zásobníkovém biologickém reaktoru. Protilátka je podrobněji popsána v PCT WO 92/04381 a jinak je zde označována jako RSHZ-19. Způsob je určen pro přípravu RSHZ-19 o čistotě větší než 95 %, přičemž se odstraňují kontaminanty vzniklé z hostitelských buněk, prostředí buněčné kultury nebo jiné suroviny. Tento způsob je nejvýhodnějším provedením sestávajícím ze tří čisticích stupňů (protein A afinitní, kationtoměničová a hydrofobní interakční chromatografie), dvou virových inaktivačních stupňů a diafiltračního stupně, k výměně produktu do zvoleného finálního pufru (naznačeno na obr. 1). Všechny stupně se provádějí za teploty místnosti (od 18 do 25 °C). Všechny pufry se připravují s WFI a před použitím filtrují buď přes 0,2-pm filtr, nebo membránu 10 000 MWCO. Pufrové prostředky jsou uvedeny v tabulce 1. Tabulky 2, 4, 6 a 8 ukazují parametry sloupce pro příklady ΙΑ, 1B, IC a ID. Tabulky 3, 5, 7 a 9 poskytují souhrnné výsledky o čištění provedeném v příkladech ΙΑ, 1B, IC a ID.

První stupeň při způsobu (protein A afinitní chromatografie na ProSepA) se může rychle cyklizovat, aby se vyhovělo měnícím se množstvím kultivační tekutiny prosté buněk (CCF). Kapacita činí přibližně 15 g RSHZ-19 na 1 litr ProSep A. Například 500 litrů CCF, která obsahuje 400 až 500 g IgG, se může zpracovat v 5 nebo 6 cyklech. Následující stupně procesu (kationtoměničová chromatografie, zkráceně CEC, a hydrofobní interakční chromatografie, zkráceně HIC) jsou přizpůsobeny k nahromadění přibližně 130 až 140 g RSZH-19 na cyklus. Tak 500 litrů kultury, která obsahuje 400 až 500 g RSHZ-19, se zpracuje ve třech po sobě následujících cyklech po zachycení na ProSep A.

Stupeň hydrofobní interakční chromatografie (HIC) je demonstrován na odstranění zbytkového proteinu A, který se vyluhoval ze sloupce proteinu A během eluování (viz příklady 1A až ID). Kromě toho agregáty IgG se mohou odstraňovat hydrofobní interakční chromatografií, jak je ukázáno v příkladech IC a ID.

Popis způsobu je normalizován pro libovolné měřítko, uvedené lineární průtokové rychlosti jsou nezávislé na průměru sloupce a dávkovači poměry jsou uváděny v hmotnostech na jednotku sloupcového objemu. Příklady ukazují pracovní postup a výtěžky v rozsahu 1 g, 40 g a 125 g (příklady 1A až ID).

Popis způsobu čištění

Odstranění buněk z kultury

K zachycení kultivační tekutiny se buňky odstraní za použití mikrofiltračního zařízení s tangenciálním přítokem (Prostak), které je vybaveno 0,65-pm filtrem nebo jeho ekvivalentem. Produkt se získává v permeátu. Pro malý objem kultur se může použít odstředivka.

Afinitní zachycování protein A chromatografií

IgG se zachycuje z CCF adsorpční chromatografií na sloupci ProSep A (BioPrecessing Ltd.), který byl předem ekvilibrován PBS. Prostředí se aplikuje na sloupec při průtokové rychlosti až do 1000 ml/h, při dávkovacím poměru až do 15 g IgG na litr sloupcového objemu. Po nadávkování na sloupec se tento sloupec promyje alespoň 3 sloupcovými objemy PBS, který obsahuje 0,1 M glycinu. RSHZ-19 se eluuje pufrem s nízkou hodnotou pH, při použití přibližně 3 sloupcových objemů elučního pufru.

-10CZ 292001 B6

Protein A chromatografie odstraní veliký podíl buněk a nečistot z prostředí (zvláště proteinu a

DNA do průtokových a promývacích frakcích) a koncentráty RSHZ-19 do elučního pufru pro další zpracování.

(Případná) virová inaktivace v kyselé oblasti pH

Eluát ze sloupce proteinu A se zachycuje a upravuje na hodnotu pH 3,5 přídavkem 2,5M kyseliny chlorovodíkové. Roztok se přenese do druhé nádoby a udržuje při hodnotě pH 3,5 přinejmenším po dobu 30 minut, aby se dosáhlo inaktivace virů, a nato se znovu upraví hodnota pH na 5,5 přidáním Tris pufru. Výsledný roztok se filtruje předfiltrem (Millipore Polygard nebo jeho ekvivalentem), sterilizuje 0,2-μιη filtrem (Millipore Millipak nebo jeho ekvivalentem) a udržuje ve sterilních zásobnících za teploty 4 °C nebo se vymrazí a udržuje za teploty -70 °C.

Zpracování na hodnotu pH 3,5 skýtá inaktivaci virů a úprava na hodnotu pH 5,5 poskytne roztok pro kationtoměničovou chromatografii (CEC). Pokud je to zapotřebí, může se vynechat zpracování na hodnotu pH 3,5.

Kationtoměničová chromatografie

Eluát inaktivovaného proteinu A s danou hodnotou pH se dále čistí kationtoměničovou chromatografii na sloupci CM SEPHAROSE FF (Pharmacia KLB). Vzorek se aplikuje na ekvilibrovaný sloupec pří průtokové rychlosti 150ml/h a dávkovacím poměru rovném nebo menším než 20 g proteinu na 1 litr CM SEPHAROSE FF. Po nadávkování se sloupec promyje 3 až 5 sloupcovými objemy ekvilibračního pufru. Produkt se eluuje 3 až 5 sloupcovými objemy elučního pufru.

Stupeň kationtoměničové chromatografie odstraňuje proteinové a neproteinové nečistoty.

Inaktivace viru guanidinem

Kationtoměničový eluát se upraví přibližně na 2,0 M hydrochloridu guanidinu pomalým přidáváním (za míchání) poloviny objemu zásobního roztoku guanidinu. Rychlost přidávání reakčního činidla se upraví tak, že se přidá během časového období 5 až 15 minut. Roztok se přenese do druhé nádoby a udržuje po dobu 30 minut, aby se dosáhlo inaktivace viru. Poté se pomalu přidá rovný objem zásobního roztoku síranu amonného (za míchání) a hned nato se provede stupeň hydrofobní interakční chromatografie (HIC). Rychlost přidávání reakčního činidla se upraví tak, že se přidá během časového období 5 až 15 minut.

Zpracování s guanidinem poskytuje druhý stupeň inaktivace virů, pokud se použije stupeň inaktivace viru v kyselé oblasti, a udržuje RSHZ-19 rozpustný po přidání síranu amonného. Přidání síranu amonného slouží ke zředění guanidinu a k přípravě roztoku pro hydrofobní interakční chromatografii.

Hydrofobní interakční chromatografie

Roztok zpracovaný s guanidinem se dále čistí aplikací na sloupec pro hydrofobní interakční chromatografii, který obsahuje TOYOPEARL fenyl-650M, jenž byl předem ekvilibrován ekvilibračním pufrem. Roztok zpracovaný s guanidinem se aplikuje na sloupec při průtokové rychlosti 150 ml/h a při dávkovacím poměru rovném nebo menším než 20 g proteinu na 1 litr TOYOPEARL fenyl-650M. Po nadávkování se sloupec promyje 3 až 5 sloupcovými objemy ekvilibračního pufru. Aplikuje se lineární gradient klesajícího množství síranu amonného při průtokové rychlosti 100 až 150 ml/h a eluuje se RSHZ-19 jako hlavní pík s nečistotami eluujícími se později při gradientu. Strmost gradientu je přibližně 20 sloupcových objemů, přičemž se vychází ze 100% ekvilibračního pufru a končí se 100% gradientovým pufrem (1,3 až 0M síranu amonného). Pík se zachycuje až absorbance poklesne na hodnotu 20 % maximální

-11CZ 292001 B6 absorbance a poté se zachycování frakce obsahující produkt ukončí. Poté co je gradientově zpracování ukončeno, sloupec se promyje přibližně 3 sloupcovými objemy stripovacího pufru.

Stupeň hydrofobní interakční chromatografie odstraňuje proteinové a neproteinové nečistoty, 5 zvláště zbytkový protein A, IgG agregáty a DNA hostitele.

Koncentrování, diafíltrace a finální filtrace

Eluát z hydrofobní interakční chromatografie (HIC) se koncentruje na přibližně 10 mg na mililitr ío za použití ultrafialového zařízení s tangenciálním přítokem (jako Millipore CUF), vybaveném molekulární hranou pro hmotnost 30 000, diafiltruje ve vhodném pufrovém prostředku a filtruje přes sterilizující 0,2-pm filtr (Millipore Millipak nebo jeho ekvivalent) do sterilizovaných zásobníků.

Zkoušky v průběhu operace

Meziprodukty dosažené při způsobu se testují na koncentraci všech proteinů testem OD280 nebo Bradfordovou zkouškou, koncentrace RSHZ-19 se stanovuje pomocí vysoko účinné kapalinové chromatografie nebo natriumdodecylsulfát polyakrylamidovou gelovou elektroforézou (SDS20 PAGE). Agregovaný produkt se stanovuje rozměrovou vylučovací chromatografií na TSK3000 SWXL a zbytky proteinu A se zjišťují za použití ELISA.

Sdružovací kritéria

Frakce eluátu ze zachyceného proteinu A a kationtoměničových stupňů se sdružují na základě sledování chromatogramu v ultrafialovém záření a zachytí se celkový pík. Eluát ze stupně hydrofobní interakční chromatografie se sdružuje na základě sledování v ultrafialovém zářen a hlavní pík se jímá až koncová strana píku v ultrafialovém záření dosáhne 20 % maxima píku. Frakce z koncové strany hydrofobní interakční chromatografie obsahuje hlavní podíl proteinu A a 30 agregované imunoglobuliny G.

Tabulka 1: Pufrovací prostředky

Název pufru	Složení
PBS	20 mM fosforečnan sodný, 150 mM chlorid sodný, pH 7
PBS/glycin	PBS a 0,1 M glycin
ProSep eluční pufr	25 mM citrát, pH 3,5
CM SEPHAROSE ekvilibrační pufr	10 mM citrát, pH 5,5
CM SEPHAROSE eluční pufr	40 mM citrát, 100 mM chlorid sodný, pH 6
guanidinový zásobní roztok	6 M hydrochloridu guanidinu, 50 mM fosforečnanu sodného, pH 7
zásobní roztok 2,6M síranu amonného	2,6 M síranu amonného, 50 mM fosforečnanu sodného, pH 7
zásobní roztok 2,0M síranu amonného	2,0 M síranu amonného, 50 mM fosforečnanu sodného, pH 7
Fenyl-650 ekvilibrační pufr	1,3 M síranu amonného, 50 mM fosforečnanu sodného, pH 7
Fenyl-650 gradientový pufr	50 mM fosforečnanu sodného, pH 7
Butyl-650 ekvilibrační pufr	1,0 M síranu amonného, 50 mM fosforečnanu sodného, pH 7
Butyl-650 gradientový pufr	50 mM fosforečnanu sodného, pH 7
HIC stripovací pufr	0,2 M NaOH

-12CZ 292001 B6

Příklad 1A

RSHZ-19 čištění v rozsahu 1 gramu, za použití TOYOPEARL Fenyl-650M

Afinitní sloupec ProSep A o objemu 5,0 litrů (poměr 20 cm, délka 16 cm) se ekvilibruje s PBS (viz tabulka 1) při průtokové rychlosti 5,2 1/min. 100 litrů kondicionovaného prostředí kultuiy, které obsahuje 0,8 g RSHZ-19 monoklonální protilátky na litr, se čistí mikrofiltrací, jak je popsáno výše, a aplikuje se na sloupec při průtokové rychlosti 5,2 1/min. Po nadávkování se na sloupec aplikuje přibližně 15 litrů PBS/glycinu při stejné průtokové rychlosti. IgG se eluuje při použití 15 až 20 litrů ProSep elučního pufru. Frakce navázaného píku a elučního píku se zachytí a zkoušejí na obsah IgG, za použití zkoušky vysoko účinnou kapalinovou chromatografii. Eluát má objem přibližně 15 litrů a obsahuje přibližně 5 mg proteinu na mililitr.

Bezprostředně po eluování se vzorky upraví na hodnotu pH přibližně 3,5 pomocí 2,5M kyseliny chlorovodíkové, udržují se přibližně 30 minut a nato upraví na hodnotu pH 5,5 přidáním zhruba 350 ml 1M Tris báze. Po neutralizaci na hodnotu pH 5,5 se vzorek filtruje filtrem 0,1 pm Polygard CR, zařazeným za sebou sterilním filtrem 0,2 pm Millipak 200, do sterilního zásobníku. Filtrát se skladuje za teploty 4 °C. Vzorky filtrátu se analyzují na obsah IgG za použití zkoušky vysoko účinnou kapalinovou chromatografíí a pro stanovení celkového proteinu absorbancí při vlnové délce 280 nm. Vzorky se také analyzují na obsah proteinu A za použití pracovního postupu ELISA. Tento eluát ProSep A, zpracovaný na hodnotu pH 3,5 a filtrovaný, se použijí jako CM SEPHAROSE náplň v příkladech 1 A, 1B a 1C.

400 ml ProSep A eluátu, zpracovaného na hodnotu pH 3,5 a filtrovaného, se naplní přímo na sloupec CM SEPHAROSE FF o objemu 220 ml (průměr 4,4 mm, délka 15 cm) při průtokové rychlosti 38 ml/min. Použitý sloupec byl předtím ekvilibrován CM ekvilibračním pufrem. Po nadávkování se sloupec promývá, při průtokové rychlosti 38 ml/min, přibližně 700 ml CM ekvilibračního pufru. IgG se eluuje za použití CM elučního pufru, při průtokové rychlosti 38 ml/min. IgG odchází ze sloupce po projití přibližně 1 objemu lože elučního pufru. Celkový pík se zachytí jako CM SEPHAROSE eluát. CM nevázané frakce, eluát a stripované frakce se zachycují a analyzují na obsah IgG, obsah celkového proteinu a obsah proteinu A, jak již bylo popsáno. Eluát má objem přibližně 160 ml a obsahuje zhruba 12 mg proteinu na mililitr. Tento CM SEPHAROSE eluát se rozdělí do dvou stejných podílů o objemu přibližně vždy 80 ml a použije se v příkladech 1A a 1B jako náplň pro hydrofobní interakční chromatografii.

K 80 ml CM SEPHAROSE eluátu se přidá (pomalu za nepřetržitého míchání) celkem 40 ml guanidinového zásobního roztoku. Tak se dosáhne koncentrace guanidinu 2M pro inaktivaci viru. Zatímco se provádí míchání roztoku zpracovaného sguanidinem, přidá se celkem 120 ml zásobního roztoku 2,6M síranu amonného. Výsledný roztok obsahuje l,0M guanidinu a 1,3M síranu amonného. Roztok zpracovaný se síranem amonným se aplikuje na sloupec o objemu 80 ml (průměr 3,2 mm, délka 10 cm) TOYOPEARL fenyl-650M, který byl ekvilibrován fenyl650 ekvilibračním pufrem. Během pokusu činí průtoková rychlost 20 ml/min. Po naplnění se sloupec promyje přibližně 350 ml fenyl-650 ekvilibračního pufru. IgG se eluuje za použití lineárního gradientu, přičemž se vychází z 85% ekvilibračního pufru a 15 % guanidinového pufru a končí s 0% ekvilibračního pufru a 100 % gradientového pufru, za použití 18 až 19 sloupcových objemů. To znamená, že výchozí koncentrace síranu amonného je přibližně 1,1M a konečná koncentrace odpovídá 0M. Strmost tohoto gradientu odpovídá přibližně 4,7 % zvýšení velučním pufru na sloupcový objem neboli přibližně 0,061M síranu amonného na sloupcový objem. IgG se začne eluovat ze sloupce po přibližně 7 sloupcových objemech a končí po zhruba 13 sloupcových objemech v gradientu (koncentrace síranu amonného je přibližně 0,7 až 0,3M). Eluované frakce se zachycují až UV absorbance na koncové straně píku poklesne na 20 % výšky píku. Potom se jímá do jiné nádoby (koncová frakce). Na konci gradientu se k regeneraci sloupce aplikuje přibližně 250 ml HIC stripovacího pufru. Fenylové nevázané frakce, eluát, koncové a stripované frakce se zachycují a analyzují na obsah IgG, celkový obsah proteinu a obsah

-13CZ 292001 B6 proteinu A, jako je popsáno výše. Eluát má objem přibližně 300 ml a obsahuje zhruba 2,4 mg proteinu na mililitr.

V tabulce 2 jsou shrnuty parametry sloupce z tohoto příkladu. Údaje o dosaženém produktu a proteinu pro každý stupeň jsou uvedeny v tabulce 3, společně s obsahem proteinu A, vyjádřeným v ng proteinu A na mg IgG (ng/mg). Jak je zřejmé z tabulky 3, protein A se sníží přibližně čtyřnásobně, vzhledem k fenyl-650M, a dostane se ve zhruba 94% výtěžku.

Tabulka 2: Parametry sloupce v rozsahu 1 gramu, za použití fenyl-650M

Stupeň	Objem sloupce (litrů)	Průměr x délka sloupce (cm)	Dávkovači poměr	Průtoková lychlost (cm/h) (ml/min)
ProSep A	5,0	20x16	16,0 IgG na litr objemu lože	1000	5200
CM SEPHAROSE FF	0,22	4,4x15	9,1 g proteinu na litr objemu lože	150	38
Fenyl-650M	0,08	3,2x10	10,4 g proteinu na litr objemu lože	150	20

Tabulka 3: Souhrn údajů o čištění pro příklad 1A v rozsahu 1 gramu, za použití fenyl-650M

Stupeň	Objem (litry)	Celkem RSHZ-19a (gramy)	Celkem proteinub (gramy)	Výtěžek stupně (%)	Protein Ac (ng/mg)
Kultivační kapalina prostá buněk	100	80,3	nestán.	—	0
ProSep A eluát	15,8	73,8	80,4	92	20,2
CM SEPHAROSE“ náplň	(M)3	(l,87)d	(2,04)d
CM SEPHAROSE eluát	0,16	2,01	1,88	100	14,5
Fenyl-650Md náplň	(0,21)d	(0,72)d	(0,83)d
Fenyl-650M eluát	0,31	0,68	0,73	94	3,5
(Fenyl koncový	0,59	0,075	0,10	—	133)e
Kumulativní výtěžek (%)				86

^a pomocí vysoko účinné kapalinové chromatografie ^b stanoveno absorbancí při 280 nm + 1,27 ml mg^-1 .cm“^{1 c} pomocí ELISA ^d převede se pouze část celkového eluátu z předchozího sloupce, jak je popsáno výše ^e do koncové frakce migruje především protein A

Příklad 1B: Čištění RSHZ-19 v rozsahu 1 gramu, za použití TOYOPEARL butyl-650M

Při této přípravě se použije stejný CM SEPHAROSE eluát, jako je popsán v příkladu 1A, a stupeň pro hydrofobní interakční chromatografii se provádí za použití TOYOPEARL butyl650M na místo fenyl-650M. Způsob přípravy CM SEPHAROSE eluátu je popsán výše, v příkladu ΙΑ. K 80 ml CM SEPHAROSE eluátu se přidá (pomalu za nepřetržitého míchání) celkem 40 ml guanidinového zásobního roztoku. Tak se dosáhne koncentrace guanidinu 2M, pro inaktivaci viru. Zatímco se provádí míchání roztok zpracovaného s guanidinem, přidá se celkem

-14CZ 292001 B6

120 ml zásobního roztoku 2,0M síranu amonného. Výsledný roztok obsahuje 1,0M guanidinu a l,0M síranu amonného. Roztok zpracovaný se síranem amonným se aplikuje na sloupec o objemu 80 ml (průměr 3,2 mm, délka 10 cm) TOYOPEARL butyl-650M, který byl ekvilibrován butyl-650 ekvilibračním pufřem. Během pokusu činí průtoková rychlost 20 ml/min. Po naplnění 5 se sloupec promyje přibližně 350 ml butyl-650 ekvilibračního pufru. IgG se eluuje za použití lineárního gradientu, přičemž se vychází z 65 % ekvilibračního pufru a 35 % gradientového pufru a končí s 20 % ekvilibračního pufru a 80 % gradientového pufru, za použití 12 až 13 sloupcových objemů. To znamená, že výchozí koncentrace síranu amonného je přibližně 0,65 M a konečná koncentrace odpovídá 0,2 M. Strmost tohoto gradientu odpovídá přibližně 3,3 % zvýšení ío elučního pufru na sloupcový objem neboli přibližně 0.033M síranu amonného na sloupcový objem. IgG se začne eluovat ze sloupce při přibližně 2 sloupcových objemech a končí při zhruba 9 sloupcových objemech v gradientu (koncentrace síranu amonného je přibližně 0,58 až 0,35M). Eluátová frakce se zachycují, až UV absorbance na koncové straně píku poklesne na 10 % výšky píku. Potom se jímání přesune do jiné nádoby. Na konci gradientu se aplikuje přibližně 250 ml 15 butyl-650 gradientového pufru a malý pík se eluuje a zachytí. K regeneraci sloupce se použije přibližně 250 ml HIC stripovacího pufru. Butyl nevázané frakce, eluát, koncová a stripovaná frakce se zachycují a analyzují na obsah IgG, celkový obsah proteinu a obsah proteinu A, jako je popsáno výše. Eluát má objem přibližně 400 ml a obsahuje přibližně 1,5 mg proteinu na mililitr.

V tabulce 4 jsou shrnuty parametry sloupce z tohoto příkladu. Údaje o dosaženém produktu a proteinu pro každý stupeň jsou uvedeny v tabulce 5, společně s obsahem proteinu A, vyjádřeným v ng proteinu A na mg IgG (ng/mg). Třebaže výtěžek IgG je nižší, v porovnání s příkladem 1A (79 % proti 94 %), obsah proteinu A se sníží přibližně dvacetinásobně vzhledem k použití butyl650M jako stupně pro hydrofobní interakční chromatografii.

Tabulka 4: Parametry sloupce v rozsahu 1 gramu, za použití butyl-650M

Stupeň	Objem sloupce (litrů)	Průměr x délka sloupce (cm)	Dávkovači poměr	Průtoková rychlost
(cm/h)	(ml/min)
CM SEPHAROSE FF	0,22	4,4 x 15	9,1 g proteinu na litr objemu lóže	150	38
Butyl-650M	0,08	3,2x10	10,4 g proteinu na litr objemu lóže

Tabulka 5: Souhrn údajů o čištění z příkladu IB, v rozsahu 1 gramu za použití butyl-650M

Stupeň	Objem (litry)	Celkem RSHZ-19’ (gramy)	Celkem proteinu15 (gramy)	Výtěžek stupně (%)	Protein Ac (ng/mg)
Kultivační kapalina prostá buněk	100	80,3	nestán.	—	0
ProSep A eluát	15,8	73,8	80,4	92	20,2
CM SEPHAROSE“ náplň	(0,4)d	(l,87)d	(2,04)d “
CM SEPHAROSE eluát	0,16	2,01	1,88	100	14,5
Butyl-650Md náplň	(0,21)d	(0,76)d “	(0,86)d ’
Butyl-650M eluát	0,41	0,60	0,62	79	0,7
(Butyl koncový)	0,40	0,03	0,03	—	31,4)ef
(Butyl stripovací	0,53	0,10	0,10	—	nestán.)8
Kumulativní výtěžek (%)				73
Hmotnostní bilance(% z násady)				95

^a pomocí vysoko účinné kapalinové chromatografie ^b stanoveno absorbancí při 280 nm -s-1,27 ml mg^-1.cm

-15CZ 292001 B6 ^c pomocí ELISA ^d převede se pouze část celkového eluátu z předchozího sloupce, jak je popsáno výše ^e do koncové frakce migruje především protein A ^f koncová frakce obsahuje 3 % náplně ^g stripovaná frakce obsahuje 13 % proteinu, který byl naplněn

Příklad ÍC: Čištění RSHZ-19 v rozsahu 40 gramů, za použití TOYOPEARL butyl-650M

Při této příprava se použije stejný ProSep A eluát, jako je popsán v příkladu IA, a dále zařazené stupně se zvětší, aby se přizpůsobily přibližně 40 g proteinu, za použití TOYOPEARL fenyl650M. jako prostředí pro hydrofobní interakční chromatografíi. Způsob přípravy CM SEPHAROSE náplně je popsán výše, v příkladu IA. 7,8 litrů ProSep A eluátu, zpracovaného na hodnotu pH 3,5 a filtrovaného, se vnese přímo na sloupec o objemu 4,2 litru (průměr 25 cm, délka 8,5 cm) naplněný CM SEPHAROSE FF, který byl předem ekvilibrován CM ekvilibračním pufrem, při průtokové rychlosti 1,2 1/min. Po naplnění se sloupec propláchne přibližně 8 litry CM ekvilibračního pufru, při průtokové rychlosti 1,2 1/min. IgG se eluuje za použití CM elučního pufru, při průtokové rychlosti 1,2 1/min. IgG vychází ze sloupce poté, co projde přibližně 1 objem lóže elučního pufru. Celkový pík se zachytí jako CM SEPHAROSE eluát. CM nevázané frakce z kolony a eluát se zachycují a analyzují na obsah IgG, obsah celkového proteinu a obsah proteinu A, jak již bylo popsáno. Eluát má objem přibližně 5,7 litrů a obsahuje zhruba 6 až 7 mg proteinu na mililitr.

K 5,6 litrům CM SEPHAROSE eluátu se přidá (pomalu za nepřetržitého míchání) celkem 2,8 litrů guanidinového zásobního roztoku (3,2 kg, uvedeno hmotnostně). Tak se dosáhne koncentrace guanidinu 2M, pro inaktivaci viru, při objemu 8,3 litrů. Zatímco se provádí míchání roztoku zpracovaného s guanidinem, přidá se celkem 8,3 litrů (9,7 kg, uvedeno hmotnostně) zásobního roztoku 2,6M síranu amonného. Výsledný roztok obsahuje l,0M guanidinu a 1,3M síranu amonného a má konečný objem 16,7 litrů. Roztok zpracovaný se síranem amonným se aplikuje na sloupec o objemu 4,6 litrů (průměr 18 mm, délka 18 cm) TOYOPEARL fenyl-650M, který byl ekvilibrován fenyl-650 ekvilibračním pufrem. Během pokusu činí průtoková rychlost 0,5 až 0,61/min. Po naplnění se sloupec promyje přibližně 14 litry fenyl-650 ekvilibračního pufru. IgG se eluuje za použití lineárního gradientu, přičemž se vychází ze 100 % ekvilibračního pufru a končí se 100% gradientového pufru, ve 20 sloupcových objemech. To znamená, že výchozí koncentrace síranu amonného je přibližně l,3Ma konečná koncentrace odpovídá 0M. Strmost tohoto gradientu odpovídá přibližně 5 % zvýšení elučního pufru na sloupcový objem neboli přibližně 0,065M síranu amonného na sloupcový objem. IgG se začne eluovat z sloupce za přibližně 7 sloupcových objemech a končí za zhruba 12 sloupcových objemů v gradientu (koncentrace síranu amonného je přibližně 0,85 až 0,5M). Eluované frakce se zachycují, až UV absorbance na koncové straně píku poklesne na 20 % výšky píku. Potom se jímání přesune do jiné nádoby (koncová frakce). Fenyl nevázané frakce, eluát, koncové a stripované frakce se zachycují a analyzují na obsah IgG, celkový obsah proteinu a obsah proteinu A, jak je popsáno výše. Eluát má objem přibližně 15,4 litrů a obsahuje přibližně 2,2 mg proteinu na mililitr.

Fenyl eluát se koncentruje na přibližně 16 mg/ml za použití ultrafiltračního zařízení s tangenciálním přítokem (CUF, Millipore Corp.), vybaveném membránami 30 000 MWCO Omega (Filtron Corp.) a výměnou pufru kontinuální diafiltraci proti vhodnému pufrovacímu prostředku.

V tabulce 6 jsou shrnuty parametry sloupce z tohoto příkladu, údaje o dosaženém produktu a proteinu pro každý stupeň jsou uvedeny v tabulce 7, společně s obsahem proteinu A, vyjádřeným vng proteinu A na mg IgG (ng/mg), a obsahem IgG agregátu, vyjádřeným jako procento z celkového IgG. Jak je zřejmé z tabulky 7, protein A se sníží přibližně trojnásobně, vzhledem k fenyI-650M, a dosáhne se zhruba 90% výtěžek. IgG agregáty se sníží z přibližně 0,5 % v CM SEPHAROSE eluátu na 0,06 % ve zpracovaném produktu.

-16CZ 292001 B6

Tabulka 6: Parametry sloupce v rozsahu 40 gramů

Stupeň	Objem sloupce (litrů)	Průměr x délka sloupce	Dávkovači poměr	Průtoková rychlost
(cm/h)	(1/min)
CM SEPHAROSE FF	4,2	25 x 8,5	8,9 g proteinu na litr objemu lože	150	1,2
Fenyl-650M	4,6	18x 18	10,4 g proteinu na litr objemu lože	140	0,6

Tabulka 7: Souhrn údajů o čištění z příkladu IC, v rozsahu 40 gramů

Stupeň	objem (litry)	Celkem RSHZ-19a (gramy)	Celkem proteinu15 (gramy)	Výtěžek stupně (%)	Protein Ac (ng/mg)	Agregát IgG (%)
Kultivační kapalina prostá buněk	100	80,3	nestán.	—	0	nestán.
ProSep A eluát	15,8	73,8	80,4	92	20,2	nestán.
CM SEPHAROSEd násada	(7,84)d	(36,0)d	(37,3)d
CM SEPHAROSE eluát	5,71	36,5	37,3	100	21,4	0,5
Butyl-650M eluát (produkt)	15,4	32,8	33,6	90	0,8	<0,05
(Fenyl konečný)	24,6	2,5	3,0	—	78,0	5,l)e
Zpracovaný produkt	2,0	32,8	32,0	100	6,5	0,06
Kumulativní výtěžek (%)				83
Hmotnostní bilance (%z násady)				97

^a pomocí vysoko účinné kapalinové chromatografie ^b stanoveno absorbancí při 280 nm 1,27 ml mg’¹ .cm'^{1 c} pomocí ELISA ^d převede se pouze část celkového eluátu z předchozího sloupce ^e do koncové frakce migruje především protein A a agregáty IgG

Příklad ID: Čištění RSHZ-19 v rozsahu 125 gramů, za použití TOYOPEARL fenyl-650M

Afínitní sloupec ProSep A o objemu 5,5 litrů (průměr 20 cm, délka 18 cm) se ekvilibruje s PBS (viz tabulka 1) při průtokové rychlosti 4,8 1/min. 450 litrů kondicionovaného prostředí kultury, které obsahuje 0,94 g RSHZ-19 monoklonální protilátky na litr se čistí mikrofíltrací, jak je popsáno výše, a použije se ve čtyřech oddělených podílech vždy o objemu 90 až 95 litrů a jednom podílu o objemu 40 litrů na sloupci při průtokové rychlosti 4,8 1/min, (a to od začátku do konce). Každý cyklus na sloupci probíhá takto: Po naplnění se na sloupec aplikuje přibližně 17 litrů PBS/glycinu při stejné průtokové rychlosti. IgG se eluuje za použití 15 až 20 litrů ProSep A elučního pufru. Frakce nevázaného píku a elučního píku se zachytí a zkoušejí na obsah IgG za použití vysoko účinné kapalinové chromatografie. Eluát z každého cyklu má objem přibližně 9 litrů a obsahuje přibližně 5 až 10 mg proteinu na mililitr. Bezprostředně po eluování se ProSep A eluáty upraví na hodnotu pH 3,5 přidáním 2,5 M kyseliny chlorovodíkové, ponechají se přibližně 30 minut a nato upraví na hodnotu pH 5,5 přidáním zhruba 250 ml 1 M

Tris báze. Po neutralizaci na hodnotu pH 5,5 se eluáty spojí dohromady a filtrují filtrem 0,1 pm Polygard CR zařazeným za sebou se sterilním filtrem 0.2 pm Millipak 200, do 5 litrů alikvotu ve sterilním zásobníku. Filtrát se skladuje za teploty 4 °C. Vzorky filtrátu se analyzují na obsah IgG za použití zkoušky vysoko účinnou kapalinovou chromatografií a pro stanovení celkového proteinu absorbancí při vlnové délce 280 nm. Vzorky se také analyzují na obsah proteinu A za použití pracovního předpisu ELISA a agregáty IgG pomocí vysoko účinné kapalinové chromatografie.

Dále zařazené stupně jsou zvětšeny na rozsah přibližně 120 až 140 g proteinu. 16,3 litrů ProSep A eluátu, zpracovaného na hodnotu pH 3,5 a filtrovaného, který obsahuje přibližně 130 g proteinu, se naplní přímo na sloupec o objemu 14.4 litrů (průměr 35 cm, délka 15 cm) CM SEPHAROSE FF, při průtokové rychlosti 2,4 1/min. Použitý sloupec byl předem ekvilibrován CM ekvilibračním pufrem. Po naplnění se sloupec promývá, při průtokové rychlosti 2,4 1/min, přibližně 45 litry CM ekvilibračního pufru. IgG se eluuje za použití CM elučního pufru při průtokové rychlosti 2,4 1/min. IgG začne být eluován ze sloupce poté, co projdou přibližně 1 až 2 objemy lóže elučního pufru. Celkový pík se zachytí jako CM SEPHAROSE eluát. CM nevázané frakce a eluát se zachycují a analyzují na obsah IgG, obsah celkového proteinu, obsah proteinu A a agregát IgG. Eluát má objem přibližně 21 litru a obsahuje zhruba 120 gramů proteinu.

K 19,4 litrům CM SEPHAROSE eluátu se přidá (pomalu za nepřetržitého míchání) celkem 9,7 litrů guanidinového zásobního roztoku. Tak se dosáhne koncentrace guanidinu 2M, pro inaktivaci viru, při objemu 29,1 litrů. Zatímco se provádí míchání roztoku zpracovaného s guanidinem, přidá se celkem 29,1 litrů zásobního roztoku 2,6M síranu amonného. Výsledný roztok obsahuje l,0M guanidinu a 1,3M síranu amonného, při konečném objemu 58,2 litrů. Roztok zpracovaný se síranem amonným se aplikuje na sloupec o objemu 12,4 litrů (průměr 18 mm, délka 18 cm) TOYOPEARL fenyl-650M, který byl ekvilibrován fenyl-650 ekvilibračním pufrem. Během pokusu činí průtoková rychlost 1,1 až 1,3 1/min. Po naplnění se sloupec promyje přibližně 37 litry fenyl-650 ekvilibračního pufru. IgG se eluuje za použití lineárního gradientu, přičemž se vychází z 80 % ekvilibračního pufru a 20 % gradientového pufru a končí s 20 % ekvilibračního pufru a 80 % gradientového pufru, za použití 12 sloupcových objemů. To znamená, že výchozí koncentrace síranu amonného je přibližně l,0M a konečná koncentrace odpovídá 0,26M. Strmost tohoto gradientu odpovídá přibližně 5 % zvýšení gradientového pufru na sloupcový objem neboli přibližně 0,065M síranu amonného na sloupcový objem. IgG opouští sloupec v podstatě uprostřed gradientu, s pikem při přibližné koncentraci síranu amonného 0,8M. Eluované frakce se zachycují, až UV absorbance na koncové straně píku poklesne na 20 % výšky píku. Potom se jímání přemístí do jiné nádoby (koncová frakce). Fenyl nevázané frakce, eluát, koncové a stripované frakce se zachycují a analyzují na obsah IgG, celkový obsah proteinu a agregovaný IgG. Eluát má objem přibližně 29 litrů a obsahuje zhruba 100 g proteinu.

Fenyl eluát se koncentruje na přibližně 10 mg/ml za použití ultrafiltračního zařízení s tangenciálním přítokem (CUF, Millipore Corp.), vybaveným membránami 30 000 MWCO Omega (Filtron Corp.), a výměnou pufru kontinuální diafiltrací proti vhodnému pufrovému prostředku. Produkt se analyzuje na obsah IgG, celkový protein, protein A a IgG agregát.

V tabulce 8 jsou shrnuty parametry sloupce z tohoto příkladu. Údaje o dosaženém produktu a proteinu pro každý stupeň jsou uvedeny v tabulce 9, společně s obsahem proteinu A, vyjádřeným jako ng proteinu A na mg IgG (ng/mg) a obsahem IgG agregátu, vyjádřeným jako procento z celkového IgG. Jak je zřejmé z tabulky 9, protein A se sníží přibližně sedminásobné, vzhledem k CM SEPHAROSE a fenyl-650M, a dosáhne se kumulativní výtěžek zhruba 70 %. IgG agregáty se sníží z přibližně 0,45 % v CM SEPHAROSE eluátu na 0,06 % ve zpracovaném produktu.

-18CZ 292001 B6

Tabulka 8: Parametry sloupce v rozsahu 125 gramů

Stupeň	Objem sloupce (litrů)	Průměr x délka sloupce (cm)	Dávkovači pufr	Průtoková rychlost
(cm/h)	(1/min)
ProSep A	5,0	20 x 18	Maž 16gRSHZ-19 na litr objemu lóže	915	4,8
CM SEPHAROSE FF	14,4	35x15	8,4 g proteinu na litr objemu lóže	150	2,4
Fenyl-650M	12,4	30x 18	8,6 g proteinu na litr objemu lóže	100	1,2

Tabulka 9: Souhrn údajů o čištění z příkladu ID, v rozsahu 125 gramů

Stupeň	Objem (litry)	Celkem RSHZ-193 (gramy)	Celkem proteinub (gramy)	Výtěžek stupně (%)	Protein Ac (ng/mg)	Agregát IgG(%)
Kultivační kapalina prostá buněk	416	392	477c	—	0	nestán.
ProSep A eluát	48,7	375	384	96	11,7	0,4
CM SEPHAROSE“ násada	(16,3)d	(125)d	(129)d	—
CM SEPHAROSE eluát	20,6	116	117	93	nestán.	0,4
Fenyl-650M eluát	29,1	98,1	99,8	85	nestán.	<0,05
Zpracovaný produkt	9,29	89,8	91,1	92	1,7	0,06
Kumulativní výtěžek (%)				70

^a pomocí vysoko účinné kapalinové chromatografie s reverzní fází ^b stanoveno na základě absorbance při 280 nm -t· 1,27 ml mg'¹.cm“^{1 c} pomocí Bradfordovy zkoušky ^d kapacita pro další část způsobuje přibližně 140 g, převede se pouze část celkového ProSep A eluátu

Tabulka 10: Rozbor čistoty, pro rozsah 125 gramů

Stupeň	Agregáty (% z celkového IgG)	Čistota3 (% z celkové plochy)	Aktivitab (%)
ProSep eluát	0,4	98,5	105
CM eluát	0,4	98,4	109
Fenyl eluát	<0,05	98,3	99
Finální produkt	0,06	99,7	125

³ stanoveno skanovací denzitometrií redukující SDS-PAGE, součet plochy těžkých a lehkých řetězců IgG ^b vypočtený poměr aktivity (stanoveno ELISA vázající hovězí RS virus) ke koncentraci RSHZ19 (stanoveno A280) ^c vypočtený poměr aktivity (stanoveno ELISA vázající hovězí RS virus) ke koncentraci RSHZ19 (stanoveno vysoko účinnou kapalinovou chromatografií)

-19CZ 292001 B6

Příklad 2

Anti-CD4 monoklonální protilátka CH-CD4 se připraví technickým postupem kultivace buněk, 5 částečně vyčištěním za použití proteinu A a iontoměničovou chromatografíí podobným způsobem, jako se použil v příkladu 1 s tím rozdílem, že se použije aniontoměničové pryskyřice.

Kolona Amicon (průměr 1 cm, délka 10 cm) se naplní 8 ml pryskyřice TOYOPEARL fenyl650M (šarže #65PHM01 H). Průtokový rychlost se udržuje 2 ml/min ve všech stupních. Kolona se ekvilibruje 20 ml ekvilibračního pufru (1M síranu amonného, 50 mM fosforečnanu sodného, 10 hodnota pH 7,0). Produkt se připraví pro náplň kolony za použití 5 ml částečně vyčištěné CHCD4 monoklonální protilátky (koncentrace 17 mg/ml, absorbance při vlnové délce 280 nm), přidáním 2,5 ml 6 M hydrochloridu guanidinu, 50 ml fosforečnanu sodného, hodnota pH 7,0, smícháním, ponecháním po dobu 30 minut, a potom přidáním 7,5 ml 2 M síranu amonného a 50 mM fosforečnanu sodného, hodnota pH 7,0. Konečná koncentrace síranu amonného v náplni 15 obnáší 1M, konečná koncentrace hydrochloridu guanidinu činí 1M, konečný objem po odebrání vzorku je 12 ml a konečná koncentrace produktu odpovídá 5,6 mg/ml. Tato látka se potom naplní na sloupec průtokovou rychlostí 2 ml/min a potom eluuje 10 sloupcovými objemy, za použití lineárního gradientu ekvilibračního pufru do 50 mM fosforečnanu sodného, hodnota pH 7,0. Frakce o objemu přibližně 4 ml se odebírají jako produkt eluovaný ze sloupce.

V tabulce 11 jsou shrnuty výsledky. Všechny produkty jsou popřípadě eluovány v gradientu. Také se eluuje protein A, který je obohacen v posledních frakcích z gradientu. Aby se dosáhlo snížení proteinu A v konečném produktu, je nezbytné vyloučit některé frakce na konci gradientu a tak snížit výtěžek produktu. Dvojnásobné snížení proteinu A je možné s výtěžkem produktu 25 86 % a trojnásobné snížení je možné s výtěžkem 50 %.

Tabulka 11

Frakce č.	Objem (ml)	Produkt (mg/ml)	Protein A (ng/ml)	Kumulativní specifický protein A (ng/mg)	Kumulativní výtěžek produktu	Faktor3 odstranění proteinu A
Náplň 0	12	5,8	200,7	35
Eluát 1	5,5	0,04	0,0	0	0%
2	3	0,31	0,0	0	2%
3	4,2	1,32	6,4	4	10%	8,6
4	4,2	3,1	16,9	5	28%	7,0
5	4	4	68,3	10	51 %	3,3
6	4,2	3,4	80,9	14	72%	2,4
7	4,2	2,3	94,1	19	86%	1,9
8	4,2	1,3	79,3	22	94%	1,6
9	4,2	0,71	49,9	24	98%	1,4
10	4,2	0,36	32,8	26	100 %	1,3
11	4	0,19	22,9	27	101 %	1,3
12	4	0,11	13,5	27	102%	1,3
13	9,6	0,05	8,5	28	102%	1,2

^a Faktor odstranění se vypočítá spojením eluátových frakcí od začátku eluátu k požadované frakci a dělením počátečního proteinu A v náplni proteinem A (v ng/mg) ve spojených eluátových frakcích. Například faktor 8,6 se vypočítá vydělením součtu proteinu A ve frakcích 1 až 3 součtem produktu ve frakcích 1 až 3, což činí 4 mg/mg. Toto číslo je potom děleno 35 ng/mg v náplni a dostane se 8,6.

-20CZ 292001 B6

Příklad 2B

CH-CD4 monoklonální protilátka je částečně vyčištěna a připravena pro naplnění kolony pro hydrofobní interakční chromatografii (HIC), jak je popsáno v příkladu 2A. Použije se stejná kolona, ekvilibrace a náplň, jako v příkladu 2A. Použije se stejná kolona, ekvilibrace a náplň, jako v příkladu 2A. V tomto příkladu se po naplnění kolony a jejím promytí ekvilibračním pufrem provádí promývání 18 ml promývacího pufru (1M síranu amonného, 50 ml citrátu sodného, hodnota pH 3,5). Potom se provede promytí 13,5 ml ekvilibračního pufru (popsán v příkladu 2A). Kolona se potom eluuje gradientově a poté se promyje vodou, jak je popsáno v příkladu 2A. Eluát z kolony se rozděluje na frakce o objemu 14 ml, které se potom analyzují na produkt a protein A.

Výsledky jsou uvedeny v tabulce 12. Protein A by se mohl snížit šestkrát při výtěžku 90 % a osmkrát při výtěžku 78 %.

Tabulka 12

Frakce č.	Objem (ml)	Produkt (mg/ml)	Protein A (ng/ml	Kumulativní specifický protein A (ng/mg)	Kumulativní výtěžek produktu	Faktor1 odstranění proteinu A
Náplň 0	12	5,80	167,1	29
Eluát 1	14	1,50	0	0,0	30%
2	14	2,35	13,6	3,5	78%	8,1
3	14	0,38	8,3	5,2	85%	5,6
4	14	0,18	0	5,0	89%	5,8
5	9	0,13	0	4,9	91 %	5,9

¹ Jako v poznámce „a“ k tabulce 11

Při porovnání výsledků z příkladu 2B s výsledky z příkladu 2A může být zřejmé, že se obsah proteinu A sníží šestkrát až osmkrát při dosažení přibližně 80% výtěžku, pokud je zahrnuto promývání při hodnotě pH 3,5, ale snížení je pouze dvojnásobné při dosažení 80% výtěžku CHCDH, pokud se neprovádí promývání při hodnotě pH 3,5.

Příklad 2C

Tento příklad se provádí podobně jako příklad 2B s tím rozdílem, že se zvětší rozsah. Ekvilibrace a promývací pufr jsou popsány v příkladu 2B. Kolona má průměr 5 cm a délku 28 cm, průtoková rychlost činí 50 ml/min. CH-CD4 monoklonální protilátka se připraví a částečně vyčistí, jak je popsáno v příkladu 2A. 440 ml částečně vyčištěného produktu se míchá s 220 ml 6 M hydrochloridu guanidinu po dobu 31 minuty a potom se přidá 660 ml roztoku, který obsahuje 2M síranu amonného a 50 mM fosforečnanu sodného, hodnota pH činí 7,0. Konečná koncentrace síranu amonného je 1M a finální koncentrace protilátka je 5,3 mg/ml. Po odebrání vzorku objem náplně odpovídá 1290 ml.

Kolona se nejprve ekvilibruje 2 sloupcovými objemy ekvilibračního pufru a potom se kolona naplní. Kolona se nato promyje 630 ml ekvilibračního pufru, 1000 ml vodného pufru a 800 ml ekvilibračního pufru a potom gradientově eluuje 5 sloupcovými objemy 0,75 M síranu amonného a 50 mM fosforečnanu sodného, hodnota pH 7, 0, až 50 mM fosforečnanu sodného, hodnota pH 7,0. Během eluování se zachycují frakce.

-21CZ 292001 B6

Výsledky jsou uvedeny v tabulce 13. Protein A se sníží stonásobně, při výtěžku 70%, nebo třicetinásobně, při výtěžku 80 %.

Tabulka 13

Frakce č.	Objem (ml)	Produkt (mg/ml)	Protein A (ng/ml	Kumulativní specifický protein A (ng/mg)	Kumulativní výtěžek produktu	Faktor1 odstranění proteinu A
Náplň 0	1290	5,30	198	37
Eluát 1	581	0,03	0	0,0	0%
2	304	3,60	0	0,0	16%
3	243	5,40	0	0,0	35%
4	238	4,50	0	0,0	51 %
5	237	3,40	2,4	0,1	63%	282
6	239	2,2	4,7	0,4	71 %	107
7	256	1,2	4,8	0,6	75%	66
8	252	0,7	7,6	0,9	78%	41
9	240	0,4	5,3	1,1	79%	33
10	250	0,4	5,7	1,4	81%	27
11	202	0,4	4,38	1,5	82%	25
12	210	1	148,5	6,8	85%	5

Příklad 2D

Částečně vyčištěná CH-CD4 monoklonální protilátka se připraví, jak je uvedeno v příkladu 2A, Ekvilibrace a promývací pufry jsou popsány v příkladu 2B. K 8 ml 9,5-mg/ml roztoku částečně vyčištěné CH-CD4 monoklonální protilátky se přidají 4 ml 6 M hydrochloridu guanidinu, 50 ml fosforečnanu sodného, hodnota pH 7,0, a vše se inkubuje po dobu 30 minut. K reakční směsi se potom pomalu přidá 12 ml 2 M síranu amonného a 50 mM fosforečnanu sodného, hodnota pH 7,0. Kolona o objemu 4 ml (průměr 0,5 cm, délka 20 cm) a průtoková rychlost 0,5 ml/min se používají ve všech stupních. Kolona se propláchne 2 sloupcovými objemy jak vody, tak ekvilibračního pufru. Potom se kolonou vede 22 ml dávkovacího roztoku, nato se zavedou 2 sloupcové objemy ekvilibračního pufru a potom se zavádí promývací pufr, až hodnota pH efluentu z kolony má hodnotu pH3,5. To se opakuje s ekvilibračním pufrem, až efluent má hodnotu pH 7,0. Kolona se eluuje 0,3 M síranu amonného a 50 mM fosforečnanu sodného, hodnota pH 7,0. Poté co se začnou zvyšovat UV stopy, zachytí se 12,6 ml eluátu a analyzuje na produkt a protein A. Výtěžek produktu činí 80 % a protein A se sníží z 28 ng/mg na 6 ng/mg, co představuje 4,7-násobné snížení.

Claims (6)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Způsob čištění monomemí imunoglobulinové G protilátky ze směsi obsahující tuto monomemí imunoglobulinovou G protilátku, imunoglobulinové agregáty a protein A, vyznačující se t í m, že se směs při jednom z kroků uvede do styku s nosičem pro hydrofobní interakční chromatografii a monomemí imunoglobulinová G protilátka se selektivně eluuje z nosiče.
2. 2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že imunoglobulin G je zvolen ze souboru zahrnujícího humanizovanou antirespirační protilátku syncytiálního viru a opičí/lidskou chimémí protilátku antihumánního receptorů CD4.
3. 3. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že nosič pro hydrofobní interakční chromatografii je vybrán ze souboru sestávajícího z alkylagarózy se 2 až 8 atomy uhlíku v alkylové části, arylagarózy, alkylem modifikovaného oxidu křemičitého, arylem modifikovaného oxidu křemičitého a organické polymemí pryskyřice, která obsahuje alkylové nebo arylové skupiny.
4. 4. Způsob podle nároku 3, vyznačující se tím, že nosič je vybrán ze skupiny sestávající z butyl-, fenyl- a oktylagarózy a organické polymemí pryskyřice, která obsahuje butylové, fenylové a etherové skupiny.
5. 5. Způsob podle nároku 4, vyznačující se tím, že nosičem je organická polymemí pryskyřice, která obsahuje fenylové skupiny.
6. 6. Způsob podle nároku 4, vyznačující se tím, že nosičem je organická polymemí pryskyřice, která obsahuje butylové skupiny.