BR112012017124B1

BR112012017124B1 - Método para produzir e para purificar um multímero polipeptídico

Info

Publication number: BR112012017124B1
Application number: BR112012017124-0A
Authority: BR
Inventors: Tomoyuki Igawa; Zenjiro Sampei; Tetsuya Wakabayashi; Eriko Ito
Original assignee: Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha
Priority date: 2009-12-25
Filing date: 2010-12-24
Publication date: 2021-04-06
Also published as: PL2522724T3; US20210292360A1; US20210040147A1; US20220389054A1; KR102103093B1; EP2522724A1; CN102770537A; JP6087054B2; KR102380315B1; US20220135618A1; US20190062368A1; KR20180049249A; CA2785414C; US20170275332A1; US20180162902A1; WO2011078332A1; SI2522724T1; MX2012007497A; US20130018174A1; CA2785414A1

Abstract

método para produção de um multímero polipeptídico, multíme-ros polipeptídicos, método para purificar um multímero polipep-tídico, ácido nucleico, vetor, célula, e composição farmacêutica. a presente invenção fornece métodos eficientes baseados na alteração da afinidade de ligação à proteína a, para produzir ou purificar anticorpos multiespecíficos que têm a atividade da ligação a dois ou mais tipos de antígenos com alta pureza por somente uma etapa de purificação baseada em proteína a. os métodos da presente invenção para produção ou purificação de anticorpos multiespecíficos que caracterizam resídu-os de aminoácido alterados da região constante e/ou região variável da cadeia pesada do anticorpo. os anticorpos multiespecíficos com uma atividade de ligação à proteína a alterada, que exibem retenção plasmática comparável ou mais longa do que aquela de igg1 humana, podem ser eficientemente preparados com alta pureza pela introdu-ção de alterações de aminoácidos da presente invenção em anticorpos.

Description

MÉTODO PARA PRODUZIR E PARA PURIFICAR UM MULTÍMERO POLIPEPTÍDICO

Campo Técnico

[0001] A presente invenção refere-se a métodos para produção ou purificação de multímeros polipeptídicos, multímeros polipeptídicos com uma capacidade de ligação à proteína A alterada, e similares.

Técnica de Referência

[0002] Há alguns métodos anteriormente relatados para produzir anticorpo biespecífico tipo IgG tendo uma região constante humana (anticorpo tipo IgG que tem uma região constante humana e no qual um dos braços tem uma atividade de ligação específica ao antígeno A e o outro tem uma atividade de ligação específica ao antígeno B). Em geral, anticorpo biespecífico tipo IgG é composto de dois tipos de cadeias H (isto é, cadeia H contra o antígeno A e cadeia H contra o antígeno B) e dois tipos de cadeias L (isto é, cadeia L contra o antígeno A e cadeia L contra o antígeno B). Quando tal anticorpo biespecífico tipo IgG é expresso, dois tipos de cadeias H e dois tipos de cadeias L são expressos, e há dez combinações possíveis da combinação H2L2. Destes, somente uma combinação tem a especificidade de interesse (um braço tem atividade de ligação específica ao antígeno A e o outro tem atividade de ligação específica ao antígeno B). Dessa forma, para obter um anticorpo biespecífico de interesse, é necessário purificar um anticorpo único de interesse de dez tipos de anticorpos. Isto é um processo extremamente ineficiente e difícil.

[0003] Há métodos relatados para solução deste problema que usam uma cadeia L comum de forma que a cadeia L contra o antígeno A e a cadeia L contra o antígeno B tenham uma sequência de aminoácidos idêntica (Documentos de Patentes 1 e 2). Quando anticorpo biespecífico tipo IgG tendo tal cadeia L comum é expresso, dois tipos de cadeias H e um tipo de cadeia L comum é expresso, e há três combinações possíveis para a combinação H2L2. Uma destas combinações é um anticorpo biespecífico de interesse. Estas três combinações são: anticorpo monoespecífico contra antígeno A (anticorpo de cadeia H homomérico contra antígeno A), anticorpo biespecífico tanto contra antígeno A como contra antígeno B (anticorpo heteromérico com uma cadeia H contra antígeno A e uma cadeia H contra antígeno B), e anticorpo monoespecífico contra antígeno B (anticorpo de cadeia H homomérico contra antígeno B). Uma vez que sua proporção é em geral 1:2:1, a eficiência de expressão do anticorpo biespecífico desejado é aproximadamente 50%. Um método da melhora adicional desta eficiência foi relatado que permite dois tipos de cadeias H associadas heteromericamente (Documento de Patente 3). Isto pode aumentar a eficiência de expressão do anticorpo biespecífico desejado até aproximadamente 90-95%. Entretanto, um método foi relatado para remover eficientemente dois tipos de anticorpos homoméricos que são impurezas, nas quais as substituições de aminoácidos são introduzidas nas regiões variáveis de dois tipos de cadeias H para fornecer a eles pontos isoelétricos diferentes para que dois tipos de anticorpos homoméricos e o anticorpo biespecífico de interesse (anticorpo heteromérico) possam ser purificados por cromatografia de troca iônica (Documento de Patente 4). Uma combinação dos métodos supracitados permitiu produzir eficientemente um anticorpo biespecífico (anticorpo heteromérico) tendo uma região constante humana tipo IgG.

[0004] Por outro lado, na produção industrial de anticorpos tipo IgG, uma etapa de purificação por cromatografia em proteína A deve ser usada, mas a cromatografia de troca iônica não necessariamente é usada na etapa de purificação. Por isso, o uso da cromatografia de troca iônica para produzir um anticorpo biespecífico altamente puro leva a um aumento de custos de produção. Além disso, uma vez que a cromatografia de troca iônica sozinha não pode assegurar um método de purificação robusto de produtos farmacêuticos, é preferencial realizar mais de uma etapa cromatográfica para remover as impurezas.

[0005] Em qualquer caso, é preferencial que os anticorpos biespecíficos também possam ser altamente purificados por uma etapa cromatográfica que tem um modo de separação diferente daquele de cromatografia de troca iônica. É desejável que como um dos tais modos de separação, cromatografia em proteína A, que deve ser usada na produção industrial de anticorpos tipo IgG, seja capaz de purificar anticorpos biespecíficos à alta pureza.

[0006] Um método anteriormente relatado para purificar um anticorpo biespecífico (anticorpo heteromérico) usando a proteína A é usar um anticorpo biespecífico tendo uma cadeia H de IgG2a de camundongo que se liga à proteína A e uma cadeia H de IgG2b de rato que não se liga à proteína A. Relatou-se que este método permite um anticorpo biespecífico de interesse ser purificado a uma pureza de 95% pela etapa de purificação baseada em proteína A sozinha (Documento não Patente 1 e Documento de Patente 5). Entretanto, este método também usa cromatografia de troca iônica para melhorar a pureza do anticorpo biespecífico. Em outras palavras, a purificação de um anticorpo biespecífico altamente puro não pode ser alcançada pela etapa de purificação usando somente cromatografia em proteína A. Além disso, catumaxomabe, um anticorpo biespecífico produzido pelo método acima descrito e tendo uma cadeia H de IgG2a de camundongo e uma cadeia H de IgG2b de rato, tem uma meia-vida de aproximadamente 2,1 dias em seres humanos, que é extremamente mais curta do que aquela de IgG1 humana normal (2 a 3 semanas) (Documento não Patente 2). Além de ter uma meia-vida curta, catumaxomabe é altamente imunogênico por causa de suas regiões constantes de camundongo e rato (Documento não Patente 3). Dessa forma, um anticorpo biespecífico obtido por tais métodos considera-se impróprio como um produto farmacêutico.

[0007] Por outro lado, foi sugerido que do ponto de vista da imunogenicidade, uma região constante de IgG3 humana possa ser usada como uma região constante de não ligação à proteína A (Documento não Patente 1). Entretanto, como é conhecido que as cadeias H de IgG1 humana e IgG3 humana apenas se associam entre si (Documento não Patente 1), é impossível produzir um anticorpo biespecífico de interesse usando uma cadeia H de IgG1 humana e uma cadeia H de IgG3 humana pelo mesmo método usado para o anticorpo biespecífico tendo uma cadeia H de IgG2a de camundongo e uma cadeia H de IgG2b de rato. Além disso, foi relatado que a meia-vida de IgG3 humana em seres humanos é geralmente mais curta do que aquela de IgG1 humana, IgG2 humana, e IgG4 humana (Documentos não Patentes 4 e 5). Consequentemente, como o anticorpo biespecífico usando uma IgG2a de camundongo e uma IgG2b de rato, um anticorpo biespecífico usando IgG3 humana também poderia ter uma meia-vida curta em humano. Sugere-se que a razão que a associação de cadeia H raramente ocorre entre IgG1 humana e IgG3 humana seja a sequência de dobradiça de IgG3 humana (Documento não Patente 1). Entretanto, a razão da meia-vida curta da região constante de IgG3 humana não foi totalmente elucidada ainda. Dessa forma, não houve nenhum relato por enquanto quanto a anticorpos biespecíficos que usam uma região constante IgG3 humana como uma região constante de não ligação à proteína A. Além disso, não há também nenhum relato quanto a métodos para produção ou purificação eficiente de anticorpos biespecíficos altamente puros que têm uma região constante humana e mostram uma meia-vida similarmente longa como IgG1 humana.
Documentos da Técnica Anterior
Documentos Patentes
Documento de Patente 1: WO98050431
Documento de Patente 2: WO2006109592
Documento de Patente 3: WO2006106905
Documento de Patente 4: WO2007114325
Documento de Patente 5: WO95033844
Documentos não Patentes
Documento não Patente 1: The Journal of Immunology, 1995, 155:219-225
Documento não Patente 2: J Clin Oncol 26: 2008 (May 20 suppl; abstr 14006)
Documento não Patente 3: Clin Cancer Res 2007 13:38993905
Documento não Patente 4: Nat Biotechnol. 2007 Dec; 25(12):1369-72
Documento não Patente 5: J. Clin Invest 1970; 49:673-80

Revelação da Invenção [Problemas a serem Resolvidos pela Invenção]

[0008] Em geral, um anticorpo tipo IgG ordinário pode ser eficientemente produzido como uma IgG altamente pura por uma etapa de purificação baseada em proteína A. Entretanto, a produção de um anticorpo biespecífico altamente puro requer uma etapa de purificação adicional usando cromatografia de troca iônica. A adição de tal etapa de purificação por cromatografia de troca iônica pode complicar a produção e aumentar o custo de produção. Dessa forma, é preferencial produzir um anticorpo biespecífico altamente puro por uma etapa de purificação baseada em proteína A sozinha. Um objetivo da presente invenção é fornecer métodos que usam somente uma etapa de purificação baseada em proteína A para produzir ou purificar eficientemente anticorpo biespecífico tipo IgG altamente puro tendo uma região constante da cadeia pesada de anticorpo humano.

[0009] Entretanto, uma vez que o sítio de ligação à proteína A no domínio Fc é idêntico ao sítio de ligação FcRn no domínio Fc, espera-se que seja difícil de ajustar a atividade de ligação à proteína A conservando a ligação a FcRn humano. Conservar a capacidade de ligação a FcRn humano é muito importante para a retenção plasmática longa (meia-vida longa) em seres humanos que é característica de anticorpos tipo IgG. A presente invenção fornece métodos que usam somente uma etapa de purificação baseada em proteína A para produzir ou purificar eficientemente um anticorpo biespecífico altamente puro que mantém um tempo de retenção plasmática comparável ou mais longo do que aquele de IgG1 humana.

[Meios para Resolver os Problemas]

[00010] Os presentes inventores descobriram métodos que usam somente uma etapa de purificação baseada em proteína A para purificar ou produzir eficientemente um multímero polipeptídico altamente puro capaz de ligação a dois ou mais antígenos, especialmente, um anticorpo tipo IgG multiespecífico tendo uma região constante humana, alterando sua capacidade de ligação à proteína A.

[00011] Além disso, estes métodos foram combinados com métodos para regular a associação entre um primeiro polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno e um segundo polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno modificando aminoácidos que constituem a interface formada na associação dos polipeptídeos. Por esta combinação, a presente invenção permite a produção ou purificação eficiente de um multímero polipeptídico altamente puro de interesse.

[00012] Os presentes inventores também descobriram que modificando o resíduo de aminoácido na posição 435 (numeração EU) na região constante da cadeia pesada, a capacidade de ligação à proteína A pode ser ajustada mantendo sua retenção plasmática comparável ou mais longa do que aquela de IgG1 humana. Baseado neste achado, um anticorpo biespecífico altamente puro com o tempo de retenção plasmática comparável ou mais longo do que aquele de IgG1 humana pode ser produzido ou purificado.

[00013] A presente invenção é baseada nos achados descritos acima, e fornece [1] a [55] abaixo:

[00014] [1] Um método para produção de um multímero polipeptídico que compreende um primeiro polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno e um segundo polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno ou sem atividade de ligação ao antígeno, que compreende as etapas de:

(a) expressão de um DNA que codifica o primeiro polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno e um DNA que codifica o segundo polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno ou sem atividade de ligação ao antígeno; e
(b) coleta do produto de expressão da etapa (a),

em que um ou mais resíduos de aminoácido em um ou tanto no primeiro polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno quanto no segundo polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno ou sem atividade de ligação ao antígeno foram modificados, para que haja uma maior diferença da capacidade de ligação à proteína A entre o primeiro polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno e o segundo polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno ou sem atividade de ligação ao antígeno.

[00015] [2] O método de [1], em que o produto de expressão é coletado usando cromatografia de afinidade em proteína A na etapa (b).

[00016] [3] O método de [1] ou [2], em que um ou mais resíduos de aminoácidos em um ou tanto no primeiro polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno quanto no segundo polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno ou sem atividade de ligação ao antígeno foram modificados, para que haja uma maior diferença entre o pH solvente para eluir o primeiro polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno da proteína A e aquele para eluir o segundo polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno ou sem atividade de ligação ao antígeno da proteína A.

[00017] [4] O método de qualquer um de [1] a [3], em que um ou mais resíduos de aminoácidos no primeiro polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno ou no segundo polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno ou sem atividade de ligação ao antígeno foram modificados, para aumentar ou reduzir a capacidade de ligação à proteína A de um do primeiro polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno e do segundo polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno ou de nenhuma atividade de ligação ao antígeno.

[00018] [5] O método de qualquer um de [1] a [4], em que um ou mais resíduos de aminoácidos no primeiro polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno e no segundo polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno ou sem atividade de ligação ao antígeno foram modificados, para aumentar a capacidade de ligação à proteína A de um do primeiro polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno e do segundo polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno ou de nenhuma atividade de ligação ao antígeno, e reduzir a capacidade de ligação à proteína A de outro polipeptídeo.

[00019] [6] O método de qualquer um de [1] a [5], em que a pureza do multímero polipeptídico coletado é 95% ou mais.

[00020] [7] O método de qualquer um de [1] a [6], em que o primeiro polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno e o segundo polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno ou sem atividade de ligação ao antígeno compreende uma sequência de aminoácidos de um domínio Fc de anticorpo ou uma sequência de aminoácidos da região constante da cadeia pesada do anticorpo.

[00021] [8] O método de [7], em que pelo menos um resíduo de aminoácido selecionado a partir dos resíduos de aminoácidos das posições 250 a 255, 308 a 317, e 430 a 436 (numeração EU) na sequência de aminoácidos do domínio Fc de anticorpo ou região constante da cadeia pesada do anticorpo foi modificado.

[00022] [9] O método de qualquer um de [1] a [8], em que o primeiro polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno e o segundo polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno compreende uma sequência de aminoácidos de uma região variável da cadeia pesada de anticorpo.

[00023] [10] O método de [9], em que pelo menos um resíduo de aminoácido foi modificado nas sequências de aminoácidos de FR1, CDR2, e FR3 da região variável da cadeia pesada de anticorpo.

[00024] [11] O método de qualquer um de [1] a [10], em que o multímero polipeptídico compreende um ou dois terceiros polipeptídeos tendo uma atividade de ligação ao antígeno, e etapa (a) compreende a expressão de um DNA que codifica o terceiro polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno.

[00025] [12] O método de [11], em que o terceiro polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno compreende uma sequência de aminoácidos de uma cadeia leve de anticorpo.

[00026] [13] O método de [11] ou [12], em que o multímero polipeptídico adicionalmente compreende um quarto polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno, e etapa (a) compreende a expressão de um DNA que codifica o quarto polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno.

[00027] [14] O método de [13], em que pelo menos um dos terceiros e quartos polipeptídeos tendo uma atividade de ligação ao antígeno compreende uma sequência de aminoácidos de uma cadeia leve de anticorpo.

[00028] [15] O método de [13], em que o primeiro polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno compreende sequências de aminoácidos de uma região variável da cadeia leve de anticorpo e a região constante da cadeia pesada do anticorpo; o segundo polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno compreende uma sequência de aminoácidos de uma cadeia pesada de anticorpo; o terceiro polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno compreende sequências de aminoácidos de uma região variável da cadeia pesada de anticorpo e uma região constante da cadeia leve de anticorpo; e o quarto polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno compreende uma sequência de aminoácidos de uma cadeia leve de anticorpo.

[00029] [16] O método de qualquer um de [1] a [15], em que o multímero polipeptídico é um anticorpo multiespecífico.

[00030] [17] O método de [16], em que o anticorpo multiespecífico é um anticorpo biespecífico.

[00031] [18] O método de qualquer um de [1] a [8], que compreende o primeiro polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno e o segundo polipeptídeo não tendo nenhuma atividade de ligação ao antígeno, e em que o primeiro polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno compreende uma sequência de aminoácidos de um domínio de ligação ao antígeno de um receptor e uma sequência de aminoácidos de um domínio Fc de anticorpo, e o segundo polipeptídeo não tendo nenhuma atividade de ligação ao antígeno compreende uma sequência de aminoácidos de um domínio Fc de anticorpo.

[00032] [19] O método de qualquer um de [7] a [18], em que o domínio Fc de anticorpo ou região constante da cadeia pesada do anticorpo é derivado de IgG humana.

[00033] [20] Um multímero polipeptídico produzido pelo método de qualquer um de [1] a [19].

[00034] [21] Um método para purificação de um multímero polipeptídico que compreende um primeiro polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno e um segundo polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno ou sem atividade de ligação ao antígeno, que compreende as etapas de:

(a) expressão de um DNA que codifica o primeiro polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno e um DNA que codifica o segundo polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno ou sem atividade de ligação ao antígeno; e
(b) coleta do produto de expressão da etapa (a) por cromatografia de afinidade em proteína A,

em que um ou mais resíduos de aminoácidos em um ou tanto no primeiro polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno quanto no segundo polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno ou sem atividade de ligação ao antígeno foram modificados, para que haja uma maior diferença da capacidade de ligação à proteína A entre o primeiro polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno e o segundo polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno ou sem atividade de ligação ao antígeno.

[00035] [22] O método de [21], em que um ou mais resíduos de aminoácidos no primeiro polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno ou o segundo polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno ou sem atividade de ligação ao antígeno foram modificados, para aumentar ou reduzir a capacidade de ligação à proteína A do primeiro polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno ou o segundo polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno ou sem atividade de ligação ao antígeno.

[00036] [23] O método de [20] ou [21], em que um ou mais resíduos de aminoácidos no primeiro polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno e no segundo polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno ou sem atividade de ligação ao antígeno foram modificados, para aumentar a capacidade de ligação à proteína A de um do primeiro polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno e do segundo polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno ou de nenhuma atividade de ligação ao antígeno, e reduzir a capacidade de ligação à proteína A de outro polipeptídeo.

[00037] [24] O método de qualquer um de [21] a [23], em que a pureza do multímero polipeptídico coletado é 95% ou mais.

[00038] [25] O método de qualquer um de [21] a [24], em que o primeiro polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno e o segundo polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno ou sem atividade de ligação ao antígeno compreende uma sequência de aminoácidos de um domínio Fc de anticorpo ou uma sequência de aminoácidos da região constante da cadeia pesada do anticorpo.

[00039] [26] O método de [25], em que pelo menos um resíduo de aminoácido selecionado a partir dos resíduos de aminoácidos das posições 250 a 255, 308 a 317, e 430 a 436 (numeração EU) na sequência de aminoácidos do domínio Fc de anticorpo ou região constante da cadeia pesada do anticorpo foi modificado.

[00040] [27] O método de qualquer um de [21] a [26], em que o primeiro polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno e o segundo polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno compreende uma sequência de aminoácidos de uma região variável da cadeia pesada de anticorpo.

[00041] [28] O método de [27], em que pelo menos um resíduo de aminoácido foi modificado nas sequências de aminoácidos de FR1, CDR2, e FR3 da região variável da cadeia pesada de anticorpo.

[00042] [29] O método de qualquer um de [21] a [28], em que o multímero polipeptídico compreende um ou dois terceiros polipeptídeos tendo uma atividade de ligação ao antígeno, e etapa (a) compreende a expressão de um DNA que codifica o terceiro polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno.

[00043] [30] O método de [29], em que o terceiro polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno compreende uma sequência de aminoácidos de uma cadeia leve de anticorpo.

[00044] [31] O método de [29] ou [30], em que o multímero polipeptídico adicionalmente compreende um quarto polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno, e a etapa (a) compreende a expressão de um DNA que codifica o quarto polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno.

[00045] [32] O método de [31], em que pelo menos um dos terceiros e quartos polipeptídeos tendo uma atividade de ligação ao antígeno compreende uma sequência de aminoácidos de uma cadeia leve de anticorpo.

[00046] [33] O método de [31], em que o primeiro polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno compreende sequências de aminoácidos de uma região variável da cadeia leve de anticorpo e região constante da cadeia pesada do anticorpo; o segundo polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno compreende uma sequência de aminoácidos de uma cadeia pesada de anticorpo; o terceiro polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno compreende sequências de aminoácidos de uma região variável da cadeia pesada de anticorpo e uma região constante da cadeia leve de anticorpo; e o quarto polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno compreende uma sequência de aminoácidos de uma cadeia leve de anticorpo.

[00047] [34] O método de qualquer um de [21] a [33], em que o multímero polipeptídico é um anticorpo multiespecífico.

[00048] [35] O método de [34], em que o anticorpo multiespecífico é um anticorpo biespecífico.

[00049] [36] O método de qualquer um de [25] a [35], em que o domínio Fc de anticorpo ou região constante da cadeia pesada do anticorpo é derivado de IgG humana.

[00050] [37] Um multímero polipeptídico que compreende um primeiro polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno e um segundo polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno ou sem atividade de ligação ao antígeno, em que a capacidade de ligação à proteína A é diferente para o primeiro polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno e o segundo polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno ou sem atividade de ligação ao antígeno.

[00051] [38] O multímero polipeptídico de [37], em que há uma diferença entre o pH solvente para eluir o primeiro polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno da proteína A e aquele para eluir o segundo polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno ou sem atividade de ligação ao antígeno da proteína A.

[00052] [39] O multímero polipeptídico de [37] ou [38], em que o primeiro polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno ou o segundo polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno ou sem atividade de ligação ao antígeno compreende uma sequência de aminoácidos de um domínio Fc de anticorpo ou uma sequência de aminoácidos da região constante da cadeia pesada do anticorpo, e em que pelo menos um resíduo de aminoácido selecionado a partir dos resíduos de aminoácidos das posições 250 a 255, 308 a 317, e 430 a 436 (numeração EU) na sequência de aminoácidos do domínio Fc de anticorpo ou região constante da cadeia pesada do anticorpo foi modificado.

[00053] [40] O multímero polipeptídico de qualquer um de [37] a [39] , em que o primeiro polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno e o segundo polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno ou sem atividade de ligação ao antígeno compreende uma sequência de aminoácidos de um domínio Fc de anticorpo ou uma sequência de aminoácidos da região constante da cadeia pesada do anticorpo;
em que o resíduo de aminoácido da posição 435 (numeração EU) na sequência de aminoácidos do domínio Fc de anticorpo ou a região constante da cadeia pesada do anticorpo é histidina ou arginina em um do primeiro polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno e do segundo polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno ou sem atividade de ligação ao antígeno; e
em que o resíduo de aminoácido da posição 435 (numeração EU) na sequência de aminoácidos do domínio Fc de anticorpo ou a região constante da cadeia pesada do anticorpo em qualquer dos ditos polipeptídeos é diferente daquela em outro polipeptídeo.

[00054] [41] O multímero polipeptídico de qualquer um de [37] a [40] , em que o primeiro polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno e o segundo polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno ou sem atividade de ligação ao antígeno compreende uma sequência de aminoácidos de um domínio Fc de anticorpo ou uma sequência de aminoácidos da região constante da cadeia pesada do anticorpo;
em que o resíduo de aminoácido da posição 435 (numeração EU) na sequência de aminoácidos do domínio Fc de anticorpo ou região constante da cadeia pesada do anticorpo é histidina em um do primeiro polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno e do segundo polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno ou sem atividade de ligação ao antígeno; e
em que o resíduo de aminoácido da posição 435 (numeração EU) na sequência de aminoácidos do domínio Fc de anticorpo ou região constante da cadeia pesada do anticorpo é arginina em outro polipeptídeo.

[00055] [42] O multímero polipeptídico de qualquer um de [37] a [41] , em que o primeiro polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno e o segundo polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno compreende uma sequência de aminoácidos de uma região variável da cadeia pesada de anticorpo, e pelo menos um resíduo de aminoácido foi modificado nas sequências de aminoácidos de FR1, CDR2, e FR3 da região variável da cadeia pesada.

[00056] [43] O multímero polipeptídico de qualquer um de [37] a [42] , que adicionalmente compreende um ou dois terceiros polipeptídeos tendo uma atividade de ligação ao antígeno.

[00057] [44] O multímero polipeptídico de [43], em que o terceiro polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno compreende uma sequência de aminoácidos de uma cadeia leve de anticorpo.

[00058] [45] O multímero polipeptídico de [43] ou [44], que adicionalmente compreende um quarto polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno.

[00059] [46] O multímero polipeptídico de [45], em que pelo menos um dos terceiros e quartos polipeptídeos tendo uma atividade de ligação ao antígeno compreende uma sequência de aminoácidos de uma cadeia leve de anticorpo.

[00060] [47] O multímero polipeptídico de [45], em que o primeiro polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno compreende sequências de aminoácidos de uma região variável da cadeia leve de anticorpo e região constante da cadeia pesada do anticorpo; o segundo polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno compreende uma sequência de aminoácidos de uma cadeia pesada de anticorpo; o terceiro polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno compreende sequências de aminoácidos de uma região variável da cadeia pesada de anticorpo e uma região constante da cadeia leve de anticorpo; e o quarto polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno compreende uma sequência de aminoácidos de uma cadeia leve de anticorpo.

[00061] [48] O multímero polipeptídico de qualquer um de [37] a [47], que é um anticorpo multiespecífico.

[00062] [49] O multímero polipeptídico de [48], em que o anticorpo multiespecífico é um anticorpo biespecífico.

[00063] [50] O multímero polipeptídico de qualquer um de [37] a [41], que compreende o primeiro polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno e o segundo polipeptídeo não tendo nenhuma atividade de ligação ao antígeno, e em que o primeiro polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno compreende uma sequência de aminoácidos de um domínio de ligação ao antígeno de um receptor e uma sequência de aminoácidos de um domínio Fc de anticorpo, e o segundo polipeptídeo não tendo nenhuma atividade de ligação ao antígeno compreende uma sequência de aminoácidos de um domínio Fc de anticorpo.

[00064] [51] O multímero polipeptídico de qualquer um de [39] a [50], em que o domínio Fc de anticorpo ou a região constante da cadeia pesada do anticorpo é derivado de IgG humana.

[00065] [52] Um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo que constitui o multímero polipeptídico de qualquer um de [20] e [37] a [51].

[00066] [53] Um vetor inserido com o ácido nucleico de [52].

[00067] [54] Uma célula compreendendo o ácido nucleico de [52] ou o vetor [de 53].

[00068] [55] Uma composição farmacêutica compreendendo o multímero polipeptídico de qualquer um de [20] e [37] a [51] como ingrediente ativo.

[Efeitos da Invenção]

[00069] A presente invenção fornece métodos que usam somente uma etapa de purificação baseada em proteína A para purificar ou produzir eficientemente um multímero polipeptídico altamente puro tendo atividade de ligação contra dois ou mais antígenos (anticorpo multiespecífico), alterando sua capacidade de ligação à proteína A. Os métodos da presente invenção permitem purificação ou produção eficiente de um multímero polipeptídico altamente puro de interesse sem prejudicar os efeitos de outras modificações de aminoácido de interesse. Especialmente, combinando estes métodos com um método para regular a associação entre dois domínios proteicos, os multímeros polipeptídicos de interesse podem ser mais eficientemente produzidos ou purificados à pureza mais alta.

[00070] Os métodos da presente invenção para produzir ou purificar anticorpos multiespecíficos são caracterizados em que os resíduos de aminoácidos na sua região constante da cadeia pesada de anticorpo e/ou região variável da cadeia pesada de anticorpo é modificada. As modificações de aminoácido da presente invenção são introduzidas nestas regiões para modificar sua capacidade de ligação à proteína A. Além disso, outros efeitos da modificação de aminoácido de interesse, por exemplo, o tempo de retenção plasmática comparável ou mais longo do que aquele de IgG1 humana também pode ser obtido. Os métodos da presente invenção permitem a preparação eficiente de anticorpos multiespecíficos altamente puros tendo tais efeitos de modificação de aminoácidos.

[00071] Em geral, a produção de anticorpos multiespecíficos tipo IgG altamente puros requer uma etapa de purificação usando cromatografia de troca iônica. Entretanto, a adição desta etapa de purificação complica a produção e aumenta o custo de produção. Por outro lado, a purificação usando somente cromatografia de troca iônica pode não ser bastante robusta como um método de purificação de produtos farmacêuticos. Dessa forma, é uma tarefa de desenvolver um método para produção do anticorpo biespecífico tipo IgG usando somente uma etapa de purificação baseada em proteína A, ou desenvolver um método de produção robusto usando uma etapa de purificação baseada em proteína A e uma etapa de cromatografia de troca iônica.

Breve Descrição dos Desenhos

[00072] A Fig. 1 é um gráfico mostrando uma avaliação do tempo de retenção plasmática de MRA-IgG1 e MRA-z106/z107k em camundongos transgênicos com FcRn humano.

[00073] A Fig. 2 é um diagrama mostrando que a mesma região no domínio Fc de anticorpo se liga à proteína A e FcRn.

[00074] A Fig. 3 mostra um curso de tempo das concentrações plasmáticas de Q499-z118/J339-z119/L377-k e Q499-z121/J339-z119/L377-k após administração a camundongos transgênicos com FcRn humano.

[00075] A Fig. 4 é um diagrama esquemático de uma molécula GC33-IgG1-CD3-scFv que divalentemente se liga ao antígeno glipicano-3 câncer específico (GPC3) e monovalentemente liga-se ao antígeno de célula T CD3.

[00076] A Fig. 5 mostra o resultado de análise de NTA1L/NTA1R/GC33-k0 e NTA2L/NTA2R/GC33-k0 purificados com cromatografia por exclusão de tamanho de proteína A.

[00077] A Fig. 6 é um diagrama esquemático de um molécula de anticorpo IgG anti-GPC3 que se liga monovalentemente a glipicano-3.

[00078] A Fig. 7 mostra o resultado de análise de NTA4L-cont/NTA4R-cont/GC33-k0, NTA4L-G3/NTA4R-cont/GC33-k0, e NTA4L/NTA4R/GC33-k0 purificados com cromatografia por exclusão de tamanho de proteína A.

[00079] A Fig. 8 mostra cromatogramas de NTA4L-cont/NTA4R- cont/GC33-k0, NTA4L-G3/NTA4R-cont/GC33-k0, e NTA4L/NTA4R/GC33-k0 submetidos à purificação com cromatografia de coluna de proteína A com eluição de gradiente de pH.

[00080] A Fig. 9 é um diagrama esquemático de uma molécula de proteína de fusão receptor alfa Fc-Fc que se liga monovalentemente à IgA.

[00081] A Fig. 10 mostra o resultado de análise de IAL-cont/IAR-cont e IAL/IAR purificados com cromatografia por exclusão de tamanho de proteína A.

[00082] A Fig. 11 é um diagrama esquemático de no1, um anticorpo biespecífico de ocorrência natural de anti-receptor de IL-6/anti-GPC3.

[00083] A Fig. 12 é um diagrama esquemático de no2, que foi obtido permutando o domínio VH e o domínio VL do anticorpo anti-GPC3 em no1.

[00084] A Fig. 13 é um diagrama esquemático de no3, que foi obtido modificando no2 para alterar o ponto isoelétrico de cada cadeia.

[00085] A Fig. 14 é um diagrama esquemático de no5, que foi obtido modificando no3 para aumentar a associação heteromérica de cadeias H e purificar heteromericamente anticorpo associado usando a proteína A.

[00086] A Fig. 15 é um diagrama esquemático de no6, que foi obtido modificando no5 para aumentar a associação entre a cadeia H de interesse e a cadeia L de interesse.

[00087] A Fig. 16 são cromatogramas de anticorpos biespecíficos no1, no2, no3, no5 e no6 de anti-receptor IL-6 /anti-GPC3 na cromatografia de troca catiônica para avaliar seus modelos de expressão.

[00088] A Fig. 17 é um cromatograma de CM no6 eluído com um gradiente de pH de uma coluna HiTrap HP proteína A (GE Healthcare).

[00089] A Fig. 18 é um cromatograma da análise de cromatografia de troca catiônica para avaliar uma fração do pico principal obtida pela purificação de uma fração de no6 purificada em proteína A usando uma coluna SP Sepharose HP (GE Healthcare).

Modo para Realizar a Invenção

[00090] A presente invenção fornece métodos para produzir um multímero polipeptídico que compreende um primeiro polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno e um segundo polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno ou sem atividade de ligação ao antígeno. Os métodos da presente invenção para produzir um multímero polipeptídico compreendem as etapas de:

(a) expressão de um DNA que codifica um primeiro polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno e DNA que codifica um segundo polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno ou sem atividade de ligação ao antígeno; e
(b) coleta dos produtos de expressão da etapa (a); em que

um ou mais resíduos de aminoácidos em um ou tanto no primeiro polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno quanto no segundo polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno ou sem atividade de ligação ao antígeno foram modificados para que haja uma maior diferença da capacidade de ligação à proteína A entre o primeiro polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno e o segundo polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno ou sem atividade de ligação ao antígeno.

[00091] Os métodos da presente invenção para produção de um multímero polipeptídico também podem ser expressos como métodos para produção de um multímero polipeptídico com uma capacidade de ligação à proteína A alterada.

[00092] Na presente invenção, "um polipeptídeo tendo uma primeira atividade de ligação ao antígeno" pode ser referido como "um primeiro polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno". "Um polipeptídeo tendo uma segunda atividade de ligação ao antígeno ou sem atividade de ligação ao antígeno" pode ser referido como "um segundo polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno ou sem atividade de ligação ao antígeno". O mesmo aplica-se a "um polipeptídeo tendo uma terceira atividade de ligação ao antígeno" e "um polipeptídeo tendo uma quarta atividade de ligação ao antígeno" descritos abaixo.

[00093] Na presente invenção, o termo "compreender" significa tanto "compreender" como "consistir de".

[00094] A presente invenção também fornece métodos para purificação de um multímero polipeptídico que compreende um primeiro polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno e um segundo polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno ou sem atividade de ligação ao antígeno. Os métodos da presente invenção para purificação de um multímero polipeptídico compreendem as etapas de:

(a) expressão de um DNA que codifica um primeiro polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno e DNA que codifica um segundo polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno ou sem atividade de ligação ao antígeno; e
(b) coleta dos produtos de expressão da etapa (a) por cromatografia de afinidade em proteína A; em que

um ou mais resíduos de aminoácidos em um ou tanto no primeiro polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno quanto no segundo polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno ou sem atividade de ligação ao antígeno foram modificados para que a capacidade de ligação à proteína A seja diferente entre o primeiro polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno e o segundo polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno ou sem atividade de ligação ao antígeno.

[00095] Um polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno na qual um ou mais resíduos de aminoácidos foram modificados pode ser obtido por:
preparação de um DNA que codifica um polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno ou sem atividade de ligação ao antígeno,
modificação de um ou mais nucleotídeos em DNA;
introdução do DNA resultante em células conhecidas pelos versados na técnica;
cultura das células para expressar DNA; e
coleta do produto de expressão.

[00096] Dessa forma, os métodos da presente invenção para produção de um multímero polipeptídico também podem ser expressos como métodos compreendendo as etapas de:

(a) fornecimento de DNA que codifica um primeiro polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno e DNA que codifica um segundo polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno ou sem atividade de ligação ao antígeno;
(b) alteração de um ou mais nucleotídeos em um ou em ambos dos DNAs da etapa (a) que codificam os primeiros e segundos polipeptídeos para que haja uma maior diferença da capacidade de ligação à proteína A entre o primeiro polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno e o segundo polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno ou sem atividade de ligação ao antígeno;
(c) introdução dos DNAs da etapa (b) em células hospedeiras e cultura das células hospedeiras para expressar os DNAs; e
(d) coleta dos produtos de expressão da etapa (c) da cultura de células hospedeiras.

[00097] Os métodos da presente invenção para purificação de um multímero polipeptídico também podem ser expressos como métodos compreendendo a etapa de:

(a) fornecimento de DNA que codifica um primeiro polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno e DNA que codifica um segundo polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno ou sem atividade de ligação ao antígeno;
(b) alteração de um ou mais nucleotídeos em um ou em ambos dos DNAs da etapa (a) que codificam os primeiros e segundos polipeptídeos para que haja uma maior diferença da capacidade de ligação à proteína A entre o primeiro polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno e o segundo polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno ou sem atividade de ligação ao antígeno;
(c) introdução dos DNAs da etapa (b) em células hospedeiras e cultura das células hospedeiras para expressar os DNAs; e
(d) coleta dos produtos de expressão da etapa (c) da cultura de células hospedeiras por cromatografia de afinidade em proteína A.

[00098] Na presente invenção, um multímero polipeptídico refere-se a um multímero heteromérico contendo o primeiro e o segundo polipeptídeo. É preferencial que os primeiros e segundos polipeptídeos cada um tenham uma atividade da ligação a um antígeno diferente. Os primeiros e segundos polipeptídeos cada um tendo uma atividade de ligação ao antígeno diferente não são particularmente limitados enquanto um dos polipeptídeos tem um domínio de ligação ao antígeno (sequência de aminoácido) diferente daquele de outro polipeptídeo. Por exemplo, como mostrado na Fig. 4 descrito abaixo, um polipeptídeo pode ser fusionado com um domínio de ligação ao antígeno que é diferente daquele de outro polipeptídeo. Alternativamente, como mostrado nas Figs 4, 6, e 9 descritas abaixo, um polipeptídeo pode ser um polipeptídeo que monovalentemente se liga a um antígeno e não tem o domínio de ligação ao antígeno possuído por outro polipeptídeo. Os multímeros polipeptídicos contendo tais primeiros e segundos polipeptídeos também estão incluídos nos multímeros polipeptídicos da presente invenção.

[00099] Os multímeros incluem dímeros, trímeros e tetrâmeros, mas não são limitados a isso.

[000100] Na presente invenção, um primeiro polipeptídeo e/ou um segundo polipeptídeo podem formar um multímero com um ou dois terceiros polipeptídeos.

[000101] Dessa forma, a presente invenção fornece métodos para produção de um multímero polipeptídico compreendendo um primeiro polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno, um segundo polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno ou sem atividade de ligação ao antígeno, e um ou dois terceiros polipeptídeos tendo uma atividade de ligação ao antígeno, que compreendem as etapas de:

(a) expressão de um DNA que codifica um primeiro polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno, um DNA que codifica um segundo polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno, e um DNA que codifica dois terceiros polipeptídeos tendo uma atividade de ligação ao antígeno; e
(b) coleta dos produtos de expressão da etapa (a);

ou

(a) expressão de um DNA que codifica um primeiro polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno, DNA que codifica um segundo polipeptídeo não tendo nenhuma atividade de ligação ao antígeno, e DNA que codifica um terceiro polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno; e
(b) coleta dos produtos de expressão da etapa (a);

em que um ou mais resíduos de aminoácidos em um ou tanto no primeiro polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno quanto no segundo polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno ou sem atividade de ligação ao antígeno foram modificados para que haja uma maior diferença da capacidade de ligação à proteína A entre o primeiro polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno e o segundo polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno ou sem atividade de ligação ao antígeno.

[000102] Os métodos descritos acima também podem ser expressos como métodos compreendendo as etapas de:

(a) fornecimento de um DNA que codifica um primeiro polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno, um DNA que codifica um segundo polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno, e um DNA que codifica dois terceiros polipeptídeos tendo uma atividade de ligação ao antígeno;
(b) alteração de um ou mais nucleotídeos em um ou em ambos dos DNAs da etapa (a) que codificam os primeiros e segundos polipeptídeos para que haja uma maior diferença da capacidade de ligação à proteína A entre o primeiro polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno e o segundo polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno;
(c) introdução dos DNAs que codificam o primeiro,segundo, e dois terceiros polipeptídeos em células hospedeiras, e cultura das células hospedeiras para expressar os DNAs; e
(d) coleta dos produtos de expressão da etapa (c) da cultura de células hospedeiras;

ou

(a) fornecimento de um DNA que codifica um primeiro polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno, DNA que codifica um segundo polipeptídeo não tendo nenhuma atividade de ligação ao antígeno, e DNA que codifica um terceiro polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno;
(b) alteração de um ou mais nucleotídeos em um ou em ambos dos DNAs da etapa (a) que codificam os primeiros e segundos polipeptídeos para que haja uma maior diferença da atividade de ligação à proteína A entre o primeiro polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno e o segundo polipeptídeo não tendo nenhuma atividade de ligação ao antígeno;
(c) introdução dos DNAs que codificam os primeiros, segundos, e terceiros polipeptídeos em células hospedeiras e cultura das células hospedeiras para expressar os DNAs; e
(d) coleta dos produtos de expressão da etapa (c) da cultura de células hospedeiras.

[000103] Além disso, na presente invenção, os primeiros e segundos polipeptídeos podem formar um multímero com terceiros e quartos polipeptídeos.

[000104] Dessa forma, a presente invenção fornece métodos para produção de um multímero polipeptídico compreendendo um primeiro polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno, um segundo polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno, um terceiro polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno, e um quarto polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno, que compreendem as etapas de:

(a) expressão de um DNA que codifica um primeiro polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno, um DNA que codifica um segundo polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno, e um DNA que codifica um terceiro polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno e um quarto polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno; e
(b) coleta dos produtos de expressão da etapa (a);

em que um ou mais resíduos de aminoácidos em um ou tanto no primeiro polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno quanto no segundo polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno foram modificados para que haja uma maior diferença da capacidade de ligação à proteína A entre o primeiro polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno e o segundo polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno.

[000105] Os métodos descritos acima também podem ser expressos como métodos compreendendo as etapas de:

(a) fornecimento de um DNA que codifica um primeiro polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno, um DNA que codifica um segundo polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno, e um DNA que codifica um terceiro polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno e um quarto polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno;
(b) alteração de um ou mais nucleotídeos em um ou em ambos dos DNAs da etapa (a) que codificam os primeiros e segundos polipeptídeos para que haja uma maior diferença da capacidade de ligação à proteína A entre o primeiro polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno e o segundo polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno;
(c) introdução dos DNAs que codificam os primeiros, segundos, terceiros, e quartos polipeptídeos em células hospedeiras e cultura das células hospedeiras para expressar os DNAs; e
(d) coleta dos produtos de expressão da etapa (c) da cultura de células hospedeiras.

[000106] A presente invenção fornece métodos para purificação de um multímero polipeptídico que compreende um primeiro polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno, um segundo polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno ou sem atividade de ligação ao antígeno, e um ou dois terceiros polipeptídeos tendo uma atividade de ligação ao antígeno, que compreendem as etapas de:

ou

[000107] Os métodos descritos acima também podem ser expressos como métodos compreendendo as etapas de:

(a) fornecimento de um DNA que codifica um primeiro polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno, um DNA que codifica um segundo polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno ou sem atividade de ligação ao antígeno, e um DNA que codifica dois terceiros polipeptídeos tendo uma atividade de ligação ao antígeno;
(b) alteração de um ou mais nucleotídeos em um ou em ambos dos DNAs da etapa (a) que codificam os primeiros e segundos polipeptídeos para que haja uma maior diferença da capacidade de ligação à proteína A entre o primeiro polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno e o segundo polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno;
(c) introdução dos DNAs que codificam o primeiro, segundo, e dois terceiros polipeptídeos em células hospedeiras e cultura das células hospedeiras para expressar os DNAs; e
(d) coleta dos produtos de expressão da etapa (c) da cultura de células hospedeiras;

ou

(a) fornecimento de um DNA que codifica um primeiro polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno, DNA que codifica um segundo polipeptídeo não tendo nenhuma atividade de ligação ao antígeno, e DNA que codifica um terceiro polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno;
(b) alteração de um ou mais nucleotídeos em um ou em ambos dos DNAs da etapa (a) que codificam os primeiros e segundos polipeptídeos para que haja uma maior diferença da capacidade de ligação à proteína A entre o primeiro polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno e o segundo polipeptídeo não tendo nenhuma atividade de ligação ao antígeno;
(c) introdução dos DNAs que codificam os primeiros, segundos, e terceiros polipeptídeos em células hospedeiras e cultura das células hospedeiras para expressar os DNAs; e
(d) coleta dos produtos de expressão da etapa (c) da cultura de células hospedeiras.

[000108] A presente invenção também fornece métodos para purificação de um multímero polipeptídico que compreende um primeiro polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno, um segundo polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno, um terceiro polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno, e um quarto polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno, que compreendem as etapas de:

(a) expressão de um DNA que codifica um primeiro polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno, um DNA que codifica um segundo polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno, um DNA que codifica um terceiro polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno, e um DNA que codifica um quarto polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno; e
(b) coleta dos produtos de expressão da etapa (a) por cromatografia de afinidade em proteína A;

[000109] Os métodos descritos acima também podem ser expressos como métodos que compreendem as etapas de:

(a) fornecimento de um DNA que codifica um primeiro polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno, um DNA que codifica um segundo polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno, um DNA que codifica um terceiro polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno, e um DNA que codifica um quarto polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno;
(b) alteração de um ou mais nucleotídeos em um ou em ambos dos DNAs da etapa (a) que codificam os primeiros e segundos polipeptídeos para que haja uma maior diferença da capacidade de ligação à proteína A entre o primeiro polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno e o segundo polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno;
(c) introdução dos DNAs que codificam os primeiros, segundos, terceiros, e quartos polipeptídeos em células hospedeiras e cultura das células hospedeiras para expressar os DNAs; e
(d) coleta dos produtos de expressão da etapa (c) da cultura de células hospedeiras por cromatografia de afinidade em proteína A.

[000110] Em um multímero polipeptídico da presente invenção contendo um primeiro polipeptídeo, um segundo polipeptídeo, e um ou dois terceiros polipeptídeos, os primeiros e segundos polipeptídeos podem formar cada um multímero (dímero) com o terceiro polipeptídeo. Além disso, dois dímeros resultantes podem formar um multímero entre si. Dois terceiros polipeptídeos podem ter completamente a mesma sequência de aminoácidos (pode ter uma atividade de ligação ao mesmo antígeno). Alternativamente, os terceiros polipeptídeos podem ter a mesma sequência de aminoácidos e duas ou mais atividades (por exemplo, pode ter atividades de ligação a dois ou mais antígenos diferentes). Quando somente um terceiro polipeptídeo está presente, o terceiro polipeptídeo pode formar um multímero polipeptídico através da dimerização com o primeiro polipeptídeo ou com o segundo polipeptídeo.

[000111] Em um multímero polipeptídico da presente invenção, os primeiros e segundos polipeptídeos preferencialmente têm atividade de ligação a antígenos diferentes. Entretanto, o terceiro polipeptídeo pode ter atividade de ligação ao mesmo antígeno que aquela de um ou de ambos os primeiros e segundos polipeptídeos. Alternativamente, o terceiro polipeptídeo pode ter atividade de ligação a um antígeno diferente daquela dos primeiros e segundos polipeptídeos.

[000112] Alternativamente, um multímero polipeptídico da presente invenção pode conter um primeiro polipeptídeo, segundo polipeptídeo, terceiro polipeptídeo, e quarto polipeptídeo. Em tal multímero polipeptídico, o primeiro polipeptídeo e o segundo polipeptídeo podem formar um multímero (dímero) com o terceiro polipeptídeo e quarto polipeptídeo, respectivamente. Por exemplo, pela formação de ligações dissulfeto no meio, o primeiro polipeptídeo e o terceiro polipeptídeo podem formar um dímero, e o segundo polipeptídeo e o quarto polipeptídeo podem formar um dímero.

[000113] Em um multímero polipeptídico da presente invenção, os primeiros e segundos polipeptídeos preferencialmente têm atividade de ligação a antígenos diferentes. Entretanto, o terceiro polipeptídeo pode ter atividade de ligação ao mesmo antígeno que aquela de um ou de ambos os primeiros e segundos polipeptídeos. Alternativamente, o terceiro polipeptídeo pode ter atividade de ligação a um antígeno diferente daquela dos primeiros e segundos polipeptídeos. Além disso, o quarto polipeptídeo pode ter atividade de ligação ao mesmo antígeno que aquela de um ou de ambos os primeiros e segundos polipeptídeos. Alternativamente, o quarto polipeptídeo pode ter atividade de ligação a um antígeno diferente daquela dos primeiros e segundos polipeptídeos.

[000114] Especificamente, por exemplo, quando os primeiros e segundos polipeptídeos contêm a sequência de aminoácidos de uma cadeia pesada de anticorpo contra o antígeno A e a sequência de aminoácidos de uma cadeia pesada de anticorpo contra o antígeno B, respectivamente, os terceiros e quartos polipeptídeos podem conter a sequência de aminoácidos de uma cadeia leve de anticorpo contra o antígeno A e a sequência de aminoácidos de uma cadeia leve de anticorpo contra o antígeno B, respectivamente. Quando um multímero polipeptídico da presente invenção tem terceiros e quartos polipeptídeos que contêm duas sequências de aminoácidos da cadeia leve de anticorpo diferentes, um multímero polipeptídico altamente puro de interesse pode ser eficientemente produzido ou purificado tornando os valores de pi do terceiro e quarto polipeptídeo diferentes usando os métodos descritos abaixo, ou diferenciando sua capacidade de ligação à proteína L, além da diferenciação da capacidade de ligação à proteína A entre os primeiros e segundos polipeptídeos.

[000115] Alternativamente, por exemplo, quando o primeiro polipeptídeo tem a sequência de aminoácidos de uma cadeia pesada de anticorpo contra o antígeno A, o segundo polipeptídeo tem a sequência de aminoácidos de uma região variável da cadeia leve de anticorpo contra o antígeno B e a sequência de aminoácidos de uma região constante da cadeia pesada de anticorpo, o terceiro polipeptídeo tem a sequência de aminoácidos de uma cadeia leve de anticorpo contra o antígeno A, e o quarto polipeptídeo tem a sequência de aminoácidos de uma região variável da cadeia pesada de anticorpo contra o antígeno B e a sequência de aminoácidos de uma região constante da cadeia leve de anticorpo, um multímero polipeptídico altamente puro de interesse tendo os primeiros, segundos, terceiros, e quartos polipeptídeos também pode ser eficientemente produzido ou purificado usando a presente invenção. Neste caso, como descrito no Exemplo 12 abaixo, a introdução de mutações de aminoácidos para alterar o valor de pi de um polipeptídeo ou introdução de mutações de aminoácido para promover a associação de polipeptídeos de interesse (WO2006/106905) permite a purificação mais eficiente ou a produção de um multímero polipeptídico de interesse tendo o primeiro, segundo, terceiro e quarto polipeptídeo em pureza mais alta. Mutações de aminoácido a serem introduzidas para promover a associação de polipeptídeos podem ser os usados nos métodos descritos em Protein Eng. 1996 Jul., 9(7):617-21; Protein Eng Des Sel. 2010 Apr., 23(4):195-202; J Biol Chem. 2010 Jun. 18, 285(25):19637-46; WO2009080254; e tais, no qual dois polipeptídeos tendo uma região constante da cadeia pesada são associados heteromericamente modificando o domínio CH3 da região constante da cadeia pesada; e aquelas usados nos métodos descritos em WO2009080251, WO2009080252, WO2009080253, e tal, pelo qual a associação de um par particular da cadeia pesada e cadeia leve é promovida.

[000116] Na presente invenção, "polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno" refere-se a um peptídeo ou proteína de cinco ou mais aminoácidos de comprimento tendo um domínio (região) capaz de ligação a uma proteína ou peptídeo, tais como um antígeno ou ligante, por exemplo, uma região variável da cadeia pesada ou cadeia leve do anticorpo, receptor, peptídeo de fusão de domínio de receptor-Fc, estrutura, ou um fragmento dos mesmos. Especificamente, um polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno pode conter a sequência de aminoácidos de uma região variável de anticorpo, receptor, peptídeo de fusão de domínio de receptor-Fc, estrutura, ou um fragmento dos mesmos.

[000117] A estrutura pode ser qualquer polipeptídeo enquanto é um polipeptídeo conformacionalmente estável capaz de ligação a pelo menos um antígeno. Tais polipeptídeos incluem, mas não são limitados a, por exemplo, fragmentos de região variável de anticorpo, fibronectina, domínios de proteína A, domínios A de receptor de LDL, lipocalinas, e moléculas mencionadas em Nygren et al. (Current Opinion in Structural Biology, 7:463-469 (1997); Journal of Immunol. Methods, 290:3-28 (2004)), Binz et al. (Nature Biotech 23:1257-1266 (2005)), and Hosse et al. (Protein Science 15:14-27 (2006))

[000118] Métodos para obter regiões variáveis de anticorpo, receptores, peptídeos de fusão de domínio de receptor-Fc, estrutura, e fragmentos dos mesmos são conhecidos pelos versados na técnica.

[000119] Tais polipeptídeos tendo uma atividade de ligação ao antígeno podem ser derivados de um organismo vivo ou projetados artificialmente. Os polipeptídeos podem ser derivados de proteínas naturais, proteínas sintéticas, proteínas recombinantes, e tais. Além disso, os polipeptídeos podem ser peptídeos ou fragmentos proteicos de 10 ou mais aminoácidos de comprimento que têm um domínio (região) capaz de ligação a uma proteína ou peptídeo, tal como um antígeno ou ligante, enquanto têm a capacidade de ligar-se a um antígeno. Os polipeptídeos podem ter mais de um domínio capaz de ligação a um antígeno (incluindo o ligante).

[000120] Um polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno também pode ser referido como um polipeptídeo tendo um domínio(s) proteico de ligação ao antígeno.

[000121] Na presente invenção, "polipeptídeo não tendo nenhuma atividade de ligação ao antígeno" se refere a um peptídeo ou a proteína de cinco ou mais aminoácidos de comprimento, tais como um fragmento de anticorpo não tendo nenhuma atividade de ligação ao antígeno, domínio de Fc, estrutura, ou um fragmento dos mesmos. Especificamente, um polipeptídeo não tendo nenhuma atividade de ligação ao antígeno pode conter a sequência de aminoácidos de uma região constante de anticorpo, domínio de Fc, estrutura, ou fragmento dos mesmos, mas a sequência de aminoácidos não é limitada aos exemplos acima. Um polipeptídeo não tendo nenhuma atividade de ligação ao antígeno pode ser combinado com um polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno para produzir um multímero polipeptídico que se liga monovalentemente a um antígeno.

[000122] Na presente invenção, o primeiro polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno e o segundo polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno ou sem atividade de ligação ao antígeno pode conter a sequência de aminoácidos de uma região constante da cadeia pesada de anticorpo ou sequência de aminoácidos de um domínio Fc de anticorpo. A sequência de aminoácidos de um domínio Fc de anticorpo ou uma cadeia pesada de região constante de anticorpo inclui, mas não é limitada a, aquelas de regiões constantes tipo IgG humana e domínios Fc. Regiões constantes tipo IgG ou domínios Fc podem ser de isotipo natural IgG1, IgG2, IgG3, ou IgG4, ou podem ser variantes das mesmas.

[000123] Entretanto, na presente invenção, o terceiro polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno e o quarto polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno pode conter a sequência de aminoácidos de uma região constante da cadeia leve de anticorpo. A sequência de aminoácidos de uma região constante da cadeia leve de anticorpo inclui, mas não é limitada a, aquelas de regiões constantes tipo kappa humana e lambda humana, e variantes das mesmas.

[000124] Além disso, na presente invenção, os polipeptídeos tendo uma atividade de ligação ao antígeno podem conter a sequência de aminoácidos de uma região variável de anticorpo (por exemplo, as sequências de aminoácidos de CDR1, CDR2, CDR3, FR1, FR2, FR3 e FR4).

[000125] Além disso, na presente invenção, os polipeptídeos tendo uma atividade de ligação ao antígeno podem conter a sequência de aminoácidos de uma cadeia pesada de anticorpo ou uma cadeia leve de anticorpo. Mais especificamente, o primeiro polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno e o segundo polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno ou sem atividade de ligação ao antígeno pode conter a sequência de aminoácidos de uma cadeia pesada de anticorpo. Entretanto, o terceiro polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno e o quarto polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno pode conter a sequência de aminoácidos de uma cadeia leve de anticorpo.

[000126] Quando um multímero polipeptídico de interesse é um tetrâmero que é formado por multimerização entre um dímero formado pelo primeiro e terceiro polipeptídeo e um dímero formado pelo segundo e quarto polipeptídeo, por exemplo, um polipeptídeo no qual o primeiros e segundo polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno contêm a sequência de aminoácidos de uma cadeia pesada de anticorpo, e um polipeptídeo no qual o terceiro e quarto polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno contêm a sequência de aminoácidos de uma cadeia leve de anticorpo, pode ser usado para o multímero polipeptídico da presente invenção. Alternativamente, um polipeptídeo no qual o primeiro polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno contém a sequência de aminoácidos de uma cadeia pesada de anticorpo, um polipeptídeo no qual o segundo polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno contém a sequência de aminoácidos de uma região variável da cadeia leve de anticorpo e a sequência de aminoácidos de uma região constante da cadeia pesada de anticorpo, um polipeptídeo no qual o terceiro polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno contém a sequência de aminoácidos de uma cadeia leve de anticorpo, e um polipeptídeo no qual o quarto polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno contém a sequência de aminoácidos de uma região variável da cadeia pesada de anticorpo, também pode ser usado.

[000127] Especificamente, um multímero polipeptídico da presente invenção pode ser um anticorpo multiespecífico.

[000128] Na presente invenção, "um anticorpo multiespecífico" refere-se a um anticorpo capaz de ligar-se especificamente a pelo menos dois antígenos diferentes.

[000129] Na presente invenção, "antígenos diferentes" se referem não somente a moléculas de antígeno diferentes per se, mas também aos determinantes de antígeno diferentes presentes nas mesmas moléculas de antígeno. Consequentemente, por exemplo, determinantes de antígeno diferentes presentes dentro de uma molécula única está incluído nos "antígenos diferentes" da presente invenção. Na presente invenção, os anticorpos que reconhecem vários determinantes de antígeno diferentes em uma molécula única são considerados como "anticorpos capazes de ligar-se especificamente a antígenos diferentes".

[000130] Na presente invenção, os anticorpos multiespecíficos incluem, mas não são limitados a, anticorpos biespecíficos capazes de ligar-se especificamente a dois tipos de antígenos. Anticorpos biespecíficos preferenciais da presente invenção incluem anticorpos IgG tipo H2L2 (composto de dois tipos de cadeias H e dois tipos de cadeias L) ter uma região constante de IgG humana. Mais especificamente, tais anticorpos incluem, mas não são limitados a, por exemplo, anticorpos quiméricos tipo IgG, anticorpos humanizados e anticorpos humanos.

[000131] Além disso, um polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno pode ser, por exemplo, uma molécula na qual pelo menos duas de uma região variável da cadeia pesada, região variável da cadeia leve, região constante da cadeia pesada, e região constante da cadeia leve, são ligadas em conjunto como uma cadeia única. Alternativamente, o polipeptídeo pode ser um anticorpo no qual pelo menos duas de uma região variável da cadeia pesada, região variável da cadeia leve, domínio de Fc (região constante sem domínio CH1), e região constante da cadeia leve, são ligados em conjunto como uma cadeia única.

[000132] Na presente invenção, a frase "há uma maior diferença da capacidade de ligação à proteína A entre polipeptídeos tendo uma atividade de ligação ao antígeno" significa que a capacidade de ligação à proteína A não é a mesma (é diferente) entre dois ou mais polipeptídeos em consequência de modificações de aminoácidos na superfície de polipeptídeos tendo uma atividade de ligação ao antígeno. Mais especificamente, esta frase significa que, por exemplo, a capacidade de ligação à proteína A do primeiro polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno é diferente daquela do segundo polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno. A diferença da capacidade de ligação à proteína A pode ser examinada, por exemplo, usando cromatografia de afinidade em proteína A.

[000133] A força da capacidade de ligação à proteína A de um polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno é correlacionada com o pH do solvente usado para a eluição. Quanto maior a capacidade de ligação à proteína A do polipeptídeo é, mais baixo o pH do solvente usado para a eluição se torna. Dessa forma, a frase "há uma maior diferença da capacidade de ligação à proteína A entre polipeptídeos tendo uma atividade de ligação ao antígeno" também pode ser expressa como "quando dois ou mais polipeptídeos tendo uma atividade de ligação ao antígeno são eluídos usando cromatografia de afinidade em proteína A, cada polipeptídeo é eluído em um pH de solvente diferente". A diferença no pH do solvente de eluição é 0,1 ou mais, preferencialmente 0,5 ou mais, e ainda mais preferencialmente 1,0 ou mais, mas não é limitada a isso.

[000134] Além disso, na presente invenção, é preferencial alterar a capacidade de ligação à proteína A sem reduzir outras atividades (por exemplo, retenção plasmática) dos polipeptídeos tendo uma atividade de ligação ao antígeno.

[000135] Um multímero polipeptídico de interesse que compreende o primeiro polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno e o segundo polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno ou sem atividade de ligação ao antígeno pode ser produzido ou purificado usando cromatografia de afinidade em proteína A baseada na diferença da capacidade de ligação à proteína A entre o primeiro polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno e o segundo polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno ou sem atividade de ligação ao antígeno. Especificamente, por exemplo, quando o multímero polipeptídico da presente invenção é um anticorpo biespecífico que tem uma cadeia L comum (isto é, a mesma sequência de aminoácidos no terceiro e quarto polipeptídeo), o multímero polipeptídico pode ser produzido ou purificado pelo método descrito abaixo. Em primeiro lugar, as células hospedeiras são introduzidas com o seguinte: um ácido nucleico que codifica o primeiro polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno (mais especificamente, a primeira cadeia pesada do anticorpo) cujo aminoácido na posição 435 (numeração EU) na sequência de aminoácidos da região constante da cadeia pesada de anticorpo é arginina (R); um ácido nucleico que codifica o segundo polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno (mais especificamente, a segunda cadeia pesada do anticorpo) cujo aminoácido na posição 435 (numeração EU) na sequência de aminoácidos da região constante da cadeia pesada do anticorpo é histidina (H); e um ácido nucleico que codifica o terceiro polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno (cadeia L comum). As células são cultivadas para expressar DNAs transientemente. Em seguida, os produtos de expressão resultantes são carregados para uma coluna de proteína A. Após lavagem, a eluição é realizada primeiro com uma solução de eluição de alto pH e em seguida com uma solução de eluição de baixo pH. Um anticorpo homomérico que compreende duas unidades da primeira cadeia pesada do anticorpo e duas unidades da cadeia L comum não tem nenhum sítio de ligação à proteína A na sua região constante da cadeia pesada. Entretanto, um anticorpo biespecífico que compreende a primeira cadeia pesada do anticorpo, a segunda cadeia pesada do anticorpo, e duas unidades da cadeia L comum tem um sítio de ligação à proteína A único na sua região constante da cadeia pesada. Um anticorpo homomérico que compreende duas unidades da segunda cadeia pesada do anticorpo e duas unidades da cadeia L comum tem dois sítios de ligação à proteína A na sua região constante da cadeia pesada. Como descrito acima, a capacidade de ligação à proteína A de um polipeptídeo está correlacionada com o pH de solvente para eluir o polipeptídeo na cromatografia de afinidade em proteína A. Quanto maior a capacidade de ligação à proteína A é, mais baixo o pH de solvente da eluição se torna. Dessa forma, quando a eluição é realizada primeiro com uma solução de eluição de alto pH e em seguida com uma solução de eluição de baixo pH, os anticorpos são eluídos na seguinte ordem:

- um anticorpo homomérico compreendendo duas unidades da primeira cadeia pesada do anticorpo e duas unidades da cadeia L comum
- um anticorpo biespecífico compreendendo a primeira cadeia pesada do anticorpo, a segunda cadeia pesada do anticorpo, e duas unidades da cadeia L comum
- um anticorpo homomérico compreendendo duas unidades da segunda cadeia pesada do anticorpo e duas unidades da cadeia L comum

[000136] Isto permite a produção ou purificação dos multímeros polipeptídicos (anticorpos biespecíficos) de interesse.

[000137] A pureza dos multímeros polipeptídicos obtidos pelos métodos de purificação ou produção da presente invenção é pelo menos 95% ou maior (por exemplo, 96%, 97%, 98%, 99% ou maior).

[000138] As modificações de resíduos de aminoácidos para criar uma diferença na capacidade de ligação à proteína A entre o primeiro polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno e o segundo polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno ou sem atividade de ligação ao antígeno incluem, mas não são limitadas a:

(1) modificação de um ou mais resíduos de aminoácidos na sequência de aminoácidos de um do primeiro polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno e do segundo polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno ou de nenhuma atividade de ligação ao antígeno, tal que a capacidade de ligação à proteína A de um dos polipeptídeos é aumentada;
(2) modificação de um ou mais resíduos de aminoácidos na sequência de aminoácidos de um do primeiro polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno e do segundo polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno ou de nenhuma atividade de ligação ao antígeno, tal que a capacidade de ligação à proteína A de um dos polipeptídeos é reduzida; e
(3) modificação de um ou mais resíduos de aminoácidos no primeiro polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno e no segundo polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno ou sem atividade de ligação ao antígeno, tal que a capacidade de ligação à proteína A de um do primeiro polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno e do segundo polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno ou de nenhuma atividade de ligação ao antígeno é aumentada, e a capacidade de ligação à proteína A de outro polipeptídeo é reduzida.

[000139] Na presente invenção, é preferencial que os aminoácidos na superfície de um polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno ou sem atividade de ligação ao antígeno são modificados. Além disso, também é preferencial para considerar a redução da influência da modificação em outras atividades do polipeptídeo.

[000140] Consequentemente, na presente invenção, é preferencial modificar, por exemplo, os resíduos de aminoácidos nas seguintes posições (numeração EU) no domínio Fc ou região constante da cadeia pesada do anticorpo:
TLMISR nas posições 250-255, VLHQDWLNGK nas posições 308-317, e EALHNHY nas posições 430-436;
preferencialmente, TLMIS nas posições 250-254, LHQD nas posições 309-312, LN nas posições 314 e 315, E na posição 430, e LHNHY nas posições 432-436;
mais preferencialmente, LMIS nas posições 251-254, LHQ nas posições 309-311, L na posição 314, e LHNH nas posições 432435; e especialmente, sistema informativo de direção nas posições 252-254, L na posição 309, Q na posição 311, e NHY nas posições 434-436.

[000141] Quanto a modificações de aminoácido da região variável da cadeia pesada de anticorpo, os sítios de mutação preferenciais incluem FR1, CDR2 e FR3. Os sítios de mutação mais preferenciais incluem, por exemplo, posições H15-H23, H56-H59, H63-H72, e H79-H83 (numeração EU).

[000142] Das modificações de aminoácido acima, as modificações que não reduzem a ligação a FcRn ou retenção plasmática em camundongos transgênicos com FcRn humano são mais preferenciais.

[000143] Mais especificamente, as modificações que aumentam a capacidade de ligação à proteína A de um polipeptídeo incluem, mas não são limitadas à substituição de histidina (His) do resíduo de aminoácido na posição 435 (numeração EU) na sequência de aminoácidos de um domínio Fc do anticorpo ou uma região constante da cadeia pesada do anticorpo.

[000144] Entretanto, modificações que reduzem a capacidade de ligação à proteína A de um polipeptídeo incluem, mas não são limitadas à substituição da arginina do resíduo de aminoácido na posição 435 (numeração EU) na sequência de aminoácidos de um domínio Fc de anticorpo ou uma região constante da cadeia pesada de anticorpo.

[000145] Quanto à região variável da cadeia pesada de anticorpo, a região variável da cadeia pesada da subclasse VH3 tem atividade de ligação à proteína A. Dessa forma, para aumentar a capacidade de ligação à proteína A, sequências de aminoácidos nos sítios de modificação acima são preferencialmente idênticas àquelas da região variável da cadeia pesada da subclasse VH3. Para reduzir a capacidade de ligação à proteína A, as sequências de aminoácidos são preferencialmente idênticas àquelas da região variável da cadeia pesada de outra subclasse.

[000146] Como descrito abaixo, a modificação de resíduos de aminoácidos pode ser alcançada alterando um ou mais nucleotídeos em um DNA que codifica um polipeptídeo, e expressando o DNA em células hospedeiras. Os versados na técnica podem determinar prontamente o número, sítio, e tipo de nucleotídeos alterados dependendo do tipo de resíduos de aminoácidos após modificação.

[000147] Neste pedido, modificação (alteração) refere-se à substituição, deleção, adição ou inserção, ou combinações das mesmas.

[000148] O polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno pode compreender outras modificações além das modificações de resíduos de aminoácidos acima. Tais modificações adicionais podem ser selecionadas a partir de, por exemplo, substituições, deleções e modificações de aminoácidos, e combinações das mesmas. Especificamente, todos os polipeptídeos cujas sequências de aminoácidos compreendem uma modificação descrita abaixo estão incluídos na presente invenção:

- modificação de aminoácido para aumentar a taxa da associação heteromérica de dois tipos de cadeias H em um anticorpo biespecífico
- modificação de aminoácido para estabilizar as ligações dissulfeto entre o primeiro polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno e o segundo polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno ou sem atividade de ligação ao antígeno
- modificação de aminoácido para melhorar a retenção plasmática de um anticorpo
- modificação para aumentar a estabilidade sob condições acídicas
- modificação para reduzir a heterogeneidade
- modificação para suprimir a reação de deamidação
- modificação para introduzir uma diferença entre os pontos isoelétricos de dois tipos de polipeptídeos
- modificação para alterar a capacidade de ligação pelo receptor γ

[000149] Estas modificações de aminoácido são descritas abaixo.

Modificação de aminoácido para aumento da taxa da associação heteromérica entre dois tipos de cadeias H em um anticorpo biespecífico

[000150] As modificações de aminoácido da presente invenção podem ser combinadas com as modificações de aminoácido descritas em WO2006106905. Não há nenhuma limitação nos sítios de modificação enquanto os aminoácidos formam a interface entre dois polipeptídeos tendo uma atividade de ligação ao antígeno. Especificamente, por exemplo, quando uma região constante da cadeia pesada é modificada, tais modificações incluem modificações que fazem os aminoácidos de pelo menos uma das combinações das posições 356 e 439, posições 357 e 370, e posições 399 e 409 (numeração EU) na sequência de aminoácidos da região constante da cadeia pesada do primeiro polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno terem a mesma carga elétrica; e os aminoácidos de pelo menos uma das combinações das posições 356 e 439, posições 357 e 370, e posições 399 e 409 (numeração EU) na região constante da cadeia pesada do segundo polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno ou sem atividade de ligação ao antígeno têm a carga elétrica em oposição àquela do primeiro polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno. Mais especificamente, tais modificações incluem, por exemplo, a introdução de uma mutação que substitui Glu na posição 356 (numeração EU) por Lys na sequência de aminoácidos da região constante da cadeia pesada de qualquer do primeiro polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno e do segundo polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno, e uma mutação que substitui Lys na posição 439 (numeração EU) com Glu na sequência de aminoácidos da região constante da cadeia pesada de outro polipeptídeo. Quando estas modificações são combinadas com as modificações da presente invenção, o polipeptídeo de interesse pode ser obtido com uma pureza mais alta pela purificação baseada em proteína A sozinha.

[000151] Alternativamente, o multímero polipeptídico de interesse que compreende o primeiro, segundo, terceiro e quarto polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno pode ser eficientemente produzido ou purificado a uma pureza mais alta, quando a modificação é realizada para produzir os aminoácidos na posição 39 (numeração Kabat) na região variável da cadeia pesada e/ou na posição 213 (numeração EU) na região constante da cadeia pesada do primeiro polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno tem uma carga elétrica em oposição àquela do aminoácido na posição 39 (numeração Kabat) na região variável da cadeia pesada e/ou o aminoácido na posição 213 (numeração EU) na região constante da cadeia pesada do segundo polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno ou sem atividade de ligação ao antígeno, e o aminoácido na posição 38 (numeração Kabat) e/ou o aminoácido na posição 123 (numeração EU) na região variável da cadeia leve do terceiro polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno têm uma carga elétrica em oposição àquela do aminoácido na posição 38 (numeração Kabat) e/ou o aminoácido na posição 123 (numeração EU) na região variável da cadeia leve do quarto polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno.

Modificação de aminoácido para estabilização das ligações dissulfeto entre o primeiro polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno e o segundo polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno ou sem atividade de ligação ao antígeno

[000152] Como descrito em documentos publicados (Mol. Immunol. 1993, 30, 105-108; e Mol. Immunol. 2001, 38, 1-8), a heterogeneidade de IgG4 é eliminada e sua estrutura estável pode ser mantida substituindo Pro por Ser na posição 228 (numeração EU) na sequência de aminoácidos da região constante da cadeia pesada de IgG4.

Modificação de aminoácido para melhora da retenção plasmática de um anticorpo

[000153] A fim de regular a retenção plasmática, é possível combinar as modificações de aminoácido da presente invenção com modificações de aminoácido que alteram o valor de pI do anticorpo. Modificações a regiões constantes incluem, por exemplo, modificações de aminoácido nas posições 250 e 428 (numeração EU) e tais descritos em documentos publicados (J. Immunol. 2006, 176 (1):346-356; e Nat. Biotechnol. 1997 15 (7):637-640). Modificações a regiões variáveis incluem modificações de aminoácido descritas em WO2007/114319 e WO2009/041643. Os aminoácidos a serem modificados são preferencialmente expostos na superfície de um polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno. As modificações incluem, por exemplo, a substituição de aminoácido na posição 196 (numeração EU) na sequência de aminoácidos de uma região constante da cadeia pesada. Em caso da região constante da cadeia pesada de IgG4, a retenção plasmática pode ser aumentada, por exemplo, substituindo glutamina por lisina na posição 196 por meio disso reduzindo o valor de pI.

[000154] Além disso, a retenção plasmática pode ser regulada alterando a capacidade de ligação a FcRn. Modificações de aminoácido que alteram a capacidade de ligação a FcRn incluem, por exemplo, substituições de aminoácidos na região constante da cadeia pesada de anticorpo descrita em documentos publicados (The Journal of Biological Chemistry vol.276, No.9 6591-6604, 2001; Molecular Cell, Vol.7, 867-877, 2001; Curr Opin Biotechnol. 2009, 20 (6):685-91). Tais substituições de aminoácidos incluem, por exemplo, substituições nas posições 233, 238, 253, 254, 255, 256, 258, 265, 272, 276, 280, 285, 288, 290, 292, 293, 295, 296, 297, 298, 301, 303, 305, 307, 309, 311, 312, 315, 317, 329, 331, 338, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 415, 424, 433, 434, 435 e 436 (numeração EU).

Modificação para melhora da estabilidade sob condições acídicas

[000155] Quando a região constante da cadeia pesada de IgG4 é usada, a estrutura de quatro cadeias estável (estrutura H2L2) é preferencialmente mantida suprimindo a conversão de IgG4 na forma de meia-molécula sob condições acídicas. Dessa forma, arginina na posição de aminoácido 409 (sistema de numeração EU) que desempenha um papel importante na manutenção da estrutura de quatro cadeias (Immunology 2002, 105, 9-19) é preferencialmente substituída por lisina do tipo IgG1 que mantém uma estrutura de quatro cadeias estável até sob condições acídicas. Além disso, para melhorar a estabilidade acídica de IgG2, metionina na posição de aminoácido 397 (sistema de numeração EU) pode ser substituída por valina. Estas modificações podem ser usadas em combinação com as modificações de aminoácido da presente invenção.

Modificação para redução da heterogeneidade

[000156] As modificações de aminoácido da presente invenção podem ser combinadas com os métodos descritos em WO2009041613. Especificamente, por exemplo, a modificação na qual os dois aminoácidos no C-terminal da região constante da cadeia pesada de IgG1 (isto é, glicina e lisina nas posições 446 e 447 [numeração EU], respectivamente) são deletados pode ser combinada com as modificações de aminoácido descritas nos Exemplos neste pedido.

Modificação para supressão da reação de deamidação

[000157] As modificações de aminoácido da presente invenção podem ser combinadas com modificações de aminoácido para suprimir a reação de deamidação. Foi relatado que a reação de deamidação ocorra mais frequentemente em um sítio onde asparagina (N) e glicina (G) são adjacentes entre si (---NG---) (Geiger et al., J. Bio. Chem. (1987) 262:785-794). Quando um multímero polipeptídico (anticorpo multiespecífico) da presente invenção tem um sítio onde asparagina e glicina são adjacentes entre si, a reação de deamidação pode ser suprimida modificando a sequência de aminoácido. Especificamente, por exemplo, ou tanto asparagina quanto glicina são substituídas por outros aminoácidos. Mais especificamente, por exemplo, asparagina é substituída por ácido aspártico.

Modificação para introdução de uma diferença no ponto isoelétrico entre dois tipos de polipeptídeos

[000158] As modificações de aminoácido da presente invenção podem ser combinadas com modificações de aminoácido para introdução de uma diferença no ponto isoelétrico. Métodos específicos são descritos, por exemplo, em WO2007/114325. Além das modificações da presente invenção, as sequências de aminoácidos do primeiro polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno e do segundo polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno ou sem atividade de ligação ao antígeno são modificadas para que haja uma maior diferença no ponto isoelétrico entre estes polipeptídeos. Isto permite a produção eficiente ou purificação do polipeptídeo de interesse a uma pureza mais alta. Além disso, uma maior diferença no ponto isoelétrico pode ser produzida entre o terceiro polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno e o quarto polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno. Isto permite o multímero polipeptídico de interesse compreendendo o primeiro, segundo, terceiro e quarto polipeptídeo ser eficientemente produzido ou purificado a uma pureza mais alta. Especificamente, quando o primeiro e segundo polipeptídeo cada um compreendem uma sequência de aminoácidos de uma cadeia pesada de anticorpo, os sítios de modificação incluem, por exemplo, as posições 1, 3, 5, 8, 10, 12, 13, 15, 16, 19, 23, 25, 26, 39, 42, 43, 44, 46, 68, 71, 72, 73, 75, 76, 81, 82b, 83, 85, 86, 105, 108, 110 e 112 (numeração Kabat). Quando o terceiro e quarto polipeptídeo cada um compreendem uma sequência de aminoácidos de uma cadeia leve de anticorpo, os sítios de modificação incluem, por exemplo, posições 1, 3, 7, 8, 9, 11, 12, 16, 17, 18, 20, 22, 38, 39, 41,42, 43, 45, 46, 49, 57, 60, 63, 65, 66, 68, 69, 70, 74, 76, 77, 79, 80, 81, 85, 100, 103, 105, 106, 107 e 108 (numeração Kabat). Uma maior diferença no ponto isoelétrico pode ser produzida modificando pelo menos um dos resíduos de aminoácidos nas posições acima em um polipeptídeo para ter uma carga elétrica, e modificando pelo menos um dos resíduos de aminoácidos nas posições acima em outro polipeptídeo não para ter nenhuma carga ou carga elétrica oposta ao acima mencionado.

Modificação para alteração da capacidade de ligação ao receptor de Fcγ

[000159] As modificações de aminoácido da presente invenção podem ser combinadas com modificações de aminoácido que alteram (aumentam ou reduzem) a capacidade de ligação ao receptor de Fcγ. As modificações para alterar a capacidade de ligação ao receptor de Fcγ incluem, mas não são limitadas às modificações descritas em Curr Opin Biotechnol. 2009, 20 (6):685-91. Especificamente, a capacidade de ligação ao receptor de Fcγ pode ser alterada, por exemplo, combinando as modificações da presente invenção com uma modificação que substitui leucina nas posições 234 e 235 e asparagina na posição 272 (numeração EU) de uma região constante da cadeia pesada IgG1 por outros aminoácidos. Os aminoácidos após substituição incluem, mas não são limitados à alanina.

[000160] A preparação de DNAs que codificam polipeptídeos tendo uma atividade de ligação ao antígeno, modificação de um ou mais nucleotídeos, expressão de um DNA, e recuperação de produtos de expressão é descrita abaixo.

Preparação de DNAs que codificam polipeptídeos tendo uma atividade de ligação ao antígeno

[000161] Na presente invenção, um DNA que codifica um polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno ou um polipeptídeo não tendo nenhuma atividade de ligação ao antígeno pode ser o total ou uma porção de uma sequência conhecida (sequência que ocorre naturalmente ou artificial), ou combinações das mesmas. Tais DNAs podem ser obtidos por métodos conhecidos pelos versados na técnica. Os DNAs podem ser isolados, por exemplo, de bibliotecas de anticorpos, ou por clonagem dos genes codificam anticorpos de hibridomas que produzem anticorpos monoclonais.

[000162] Quanto a bibliotecas de anticorpo, muitas já são bem conhecidas, e os versados na técnica podem obter apropriadamente bibliotecas de anticorpos uma vez que métodos para produção de bibliotecas de anticorpos são conhecidos. Por exemplo, quanto a bibliotecas de fago de anticorpo, pode referir-se à literatura, tal como Clackson et al., Nature 1991, 352: 624-8; Marks et al., J. Mol. Biol. 1991, 222: 581-97; Waterhouses et al., Nucleic Acids Res. 1993, 21: 2265-6; Griffiths et al., EMBO J. 1994, 13: 3245-60; Vaughan et al., Nature Biotechnology 1996, 14: 309-14; ou Publicação de Patente Japonesa Kohyo No. (JP-A) H20-504970 (publicação de fase nacional japonesa não examinada correspondente a uma publicação internacional não japonesa). Além disso, métodos conhecidos, tais como métodos que usam células eucarióticas como bibliotecas (WO95/15393) e métodos de exposição de ribossomos podem ser usados. Além disso, técnicas para obter anticorpos humanos por separação usando bibliotecas de anticorpo humanas também são conhecidas. Por exemplo, regiões variáveis de anticorpos humanos podem ser expressas na superfície de fagos como anticorpos de cadeia única (scFvs) usando métodos de exposição de fago, e os fagos que se ligam a antígenos podem ser selecionados. A análise genética dos fagos selecionados pode determinar as sequências de DNA que codificam as regiões variáveis de anticorpos humanos que se ligam aos antígenos. Uma vez que as sequências de DNA de scFvs que se ligam aos antígenos são reveladas, vetores de expressão adequados podem ser produzidos baseados nestas sequências para obter anticorpos humanos. Estes métodos já são bem conhecidos, e podem referir-se a WO92/01047, WO92/20791, WO93/06213, WO93/11236, WO93/19172, WO95/01438 e WO95/15388.

[000163] Quanto a métodos para obtenção de genes que codificam anticorpos de hibridomas, basicamente, técnicas conhecidas podem ser usadas. Especificamente, antígenos desejados ou células expressando os antígenos desejados são usados como antígenos sensibilizantes para imunização de acordo com os métodos de imunização convencionais. As células imunes obtidas dessa forma são fusionadas com células parentais conhecidas por métodos de fusão celulares ordinários, e o anticorpo monoclonal que produz células (hibridomas) é rastreado por métodos de rastreamento ordinários. cDNAs de regiões variáveis de anticorpo (regiões V) podem ser obtidos pela transcrição reversa de mRNAs dos hibridomas obtidos usando transcriptase reversa. Os genes codificantes de anticorpo podem ser obtidos ligando-os com DNAs que codificam as regiões constantes de anticorpo desejadas (regiões C).

[000164] Mais especificamente, sem limitações, os seguintes métodos são exemplos.

[000165] Antígenos sensibilizantes para obtenção dos genes de anticorpo que codificam cadeias pesadas e leves de anticorpo incluem tanto antígenos completos com imunogenicidade como antígenos incompletos compostos de haptenos e similares que não mostram antigenicidade. Por exemplo, proteínas completas e peptídeos parciais de proteínas de interesse podem ser usados. Além disso, conhece-se que as substâncias compostas de polissacarídeos, ácidos nucleicos, lipídios, e similares podem tornar-se antígenos. Dessa forma, não há nenhuma limitação particular de antígenos na presente invenção. Os antígenos podem ser preparados por métodos conhecidos pelos versados na técnica, e podem ser preparados, por exemplo, pelos seguintes métodos usando baculovírus (por exemplo, WO98/46777). Os hibridomas podem ser produzidos, por exemplo, pelos seguintes métodos de Milstein et al. (G. Kohler e C. Milstein, Methods Enzymol. 1981, 73: 3-46), e similares. Quando a imunogenicidade de um antígeno é baixa, pode ser ligada a uma macromolécula que tem a imunogenicidade, tal como albumina, e em seguida usado para a imunização. Além disso, ligando antígenos com outras moléculas se necessário, podem ser convertidos em antígenos solúveis. Quando moléculas de transmembrana, tais como receptores, são usadas como antígenos, as porções das regiões extracelulares dos receptores podem ser usadas como um fragmento, ou células que expressam moléculas de transmembrana na sua superfície celular podem ser usadas como imunógenos.

[000166] Células produtoras de anticorpo podem ser obtidas imunizando animais usando os antígenos sensibilizantes adequados descritos acima. Alternativamente, células produtoras de anticorpo podem ser preparadas pela imunização in vitro de linfócitos que podem produzir anticorpos. Vários mamíferos podem ser usados como animais para imunização, onde roedores, lagomorfos e primatas são geralmente usados. Exemplos de tais animais incluem camundongos, ratos, e hamsteres para roedores, coelhos para lagomorfos, e macacos incluindo macaco cinomolgus, macaco rhesus, babuínos e chimpanzés para primatas. Além disso, os animais transgênicos que carregam repertórios gênicos de anticorpos humanos também são conhecidos, e os anticorpos humanos podem ser obtidos usando estes animais (ver WO96/34096; Mendez et al., Nat. Genet. 1997, 15: 14656). Em vez de usar tais animais transgênicos, por exemplo, anticorpos humanos desejados tendo atividade de ligação contra antígenos podem ser obtidos pela sensibilização in vitro de linfócitos humanos com antígenos desejados ou células que expressam os antígenos desejados, e em seguida fusionando os linfócitos sensibilizados com células de mieloma humano, tais como U266 (ver Publicação de Pedido de Patente Japonesa Kokoku No. (JP-B) H1-59878 (examinado, pedido de patente japonês publicado aprovado para oposição)). Além disso, os anticorpos humanos desejados podem ser obtidos imunizando animais transgênicos que carregam um repertório completo de genes de anticorpo humanos, com antígenos desejados (ver WO93/12227, WO92/03918, WO94/02602, WO96/34096 e WO96/33735).

[000167] Imunização animal pode ser realizada diluindo-se e suspendendo apropriadamente um antígeno sensibilizante em Salina Tamponada em Fosfato (PBS), salina fisiológica, ou similar, e formando uma emulsão misturando um adjuvante se necessário, seguida por uma injeção intraperitonial ou subcutânea nos animais. A seguir, o antígeno sensibilizante misturado com o adjuvante incompleto de Freund é preferencialmente administrado várias vezes a cada quatro a 21 dias. A produção de anticorpo pode ser confirmada medindo o título de anticorpo alvo em soros de animais usando métodos convencionais.

[000168] Células produtoras de anticorpo obtidas de linfócitos ou animais imunizados com um antígeno desejado podem ser fusionadas com células de mieloma para gerar hibridomas usando agentes de fusão convencionais (por exemplo, polietilenoglicol) (Goding, Antibodies: Principles and Practice Monoclonal, Academic Press, 1986, 59-103). Quando necessário, células de hibridoma podem ser cultivadas e desenvolvidas, e a especificidade de ligação do anticorpo produzido destes hibridomas pode ser medida usando métodos de análise conhecidos, tais como imunoprecipitação, radioimunoensaio (RIA), e ensaio imunoabsorvente ligado à enzima (ELISA). A seguir, os hibridomas que produzem anticorpos de interesse cuja especificidade, afinidade ou atividade foram determinadas podem ser subclonados por métodos, tais como limitação de diluição.

[000169] A seguir, os genes que codificam os anticorpos selecionados podem ser clonados de hibridomas ou células produtoras de anticorpo (linfócitos sensibilizados, e similares) usando sondas que podem ligar-se especificamente aos anticorpos (por exemplo, oligonucleotídeos complementares a sequências que codificam regiões constantes do anticorpo). Clonagem do mRNA usando RT-PCR é também possível. As imunoglobulinas são classificadas em cinco classes diferentes, IgA, IgD, IgE, IgG e IgM. Estas classes são ainda divididas em várias subclasses (isotipos) (por exemplo, IgG-1, IgG-2, IgG-3, e IgG-4; IgA-1 e IgA-2; e similares). As cadeias pesadas e as cadeias leves usadas na presente invenção para produzir anticorpos não são particularmente limitadas e podem derivar de anticorpos que pertencem a qualquer uma destas classes ou subclasses; entretanto, IgG é particularmente preferencial.

[000170] Neste pedido, é possível modificar genes que codificam a cadeia pesada e genes que codificam a cadeia leve usando técnicas de engenharia genética. Anticorpos geneticamente modificados, tais como anticorpos quiméricos, anticorpos humanizados que foram artificialmente modificados com o objetivo de reduzir a antigenicidade heteróloga e similares contra humanos, podem ser apropriadamente produzidos se necessário para anticorpos, tais como anticorpos de camundongo, anticorpos de rato, anticorpos de coelho, anticorpos de hamster, anticorpos de ovelhas e anticorpos de camelo. Anticorpos quiméricos são anticorpos compostos de regiões variáveis da cadeia pesada e cadeia leve de anticorpo de um mamífero não humano, tais como anticorpo de camundongo, e regiões constantes da cadeia pesada e cadeia leve do anticorpo humano. Podem ser obtidos por ligação do DNA que codifica uma região variável de um anticorpo de camundongo ao DNA que codifica uma região constante de um anticorpo humano, incorporando-os em um vetor de expressão, e introduzindo o vetor em um hospedeiro para produção do anticorpo. Um anticorpo humanizado, que também é chamado de um anticorpo humano reformado, pode ser sintetizado por PCR de diversos oligonucleotídeos produzidos para que tenham porções de sobreposição nas extremidades de sequências de DNA projetadas para ligar as regiões de determinação complementares (CDRs) do anticorpo de um mamífero não humano, tais como um camundongo. O DNA obtido pode ser ligado a DNA que codifica um região constante de anticorpo humano. DNA ligado pode ser incorporado em um vetor de expressão, e o vetor pode ser introduzido em um hospedeiro para produzir o anticorpo (ver EP239400 e WO96/02576). FRs de anticorpo humanos que são ligadas através de CDR são selecionadas quando a CDR forma um sítio de ligação ao antígeno favorável. Se necessário, os aminoácidos na região de região conservada de uma região variável de anticorpo podem ser substituídos tal que a CDR do anticorpo humano reformado forme um sítio de ligação ao antígeno apropriado (K. Sato et al., Cancer Res. 1993, 53: 851-856). Os anticorpos monoclonais da presente invenção incluem tais anticorpos humanizados e anticorpos quiméricos.

[000171] Quando os anticorpos da presente invenção são anticorpos quiméricos ou anticorpos humanizados, as regiões constantes destes anticorpos são preferencialmente derivadas de anticorpos humanos. Por exemplo, Cg1, Cg2, Cg3, e Cg4 podem ser usadas para a cadeia pesada, enquanto Ck e Cl podem ser usadas para a cadeia leve. Além disso, a região constante de anticorpo humano pode ser modificada de acordo com a necessidade para melhorar o anticorpo ou sua estabilidade de produção. Um anticorpo quimérico da presente invenção preferencialmente compreende uma região variável de um anticorpo derivado de um mamífero não humano e uma região constante de um anticorpo humano. Entretanto, um anticorpo humanizado da presente invenção preferencialmente compreende CDRs de um anticorpo derivado de um mamífero não humano, e regiões FRs e C do anticorpo humano. As regiões constantes derivadas de anticorpos humanos compreendem sequências de aminoácidos específicas, que variam dependendo do isotipo, tal como IgG (IgG1, IgG2, IgG3, e IgG4), IgM, IgA, IgD e IgE. As regiões constantes usadas para preparar os anticorpos humanizados da presente invenção podem ser regiões constantes de anticorpos de qualquer isotipo. Uma região constante de IgG humana é preferencialmente usada, mas as regiões constantes não são limitadas a isso. Entretanto, não há nenhuma limitação particular de FRs derivadas do anticorpo humano que são usadas para preparar anticorpos humanizados, e podem ser derivadas de um anticorpo de qualquer isotipo.

[000172] As regiões variáveis e constantes de anticorpos quiméricos ou humanizados da presente invenção podem ser modificadas por deleção, substituição, inserção e/ou adição, enquanto os anticorpos exibem a mesma especificidade de ligação que os anticorpos originais.

[000173] Espera-se que anticorpos quiméricos e humanizados que usam sequências derivadas de maneira humana sejam úteis quando administrados a seres humanos para fins terapêuticos ou similares, uma vez que sua antigenicidade no corpo humano foi atenuada.

[000174] Na presente invenção, os aminoácidos podem ser modificados para alterar as propriedades biológicas de um anticorpo.

[000175] Os minicorpos (anticorpos de baixo peso molecular) são úteis como os anticorpos por causa de suas propriedades cinéticas in vivo e produção de baixo custo usando E. coli, células vegetais, ou similares.

[000176] Os fragmentos de anticorpo são um tipo de minicorpo. Os minicorpos incluem anticorpos que compreendem um fragmento de anticorpo como sua estrutura parcial. Os minicorpos da presente invenção não são particularmente limitados pela sua estrutura ou método de produção, embora tenham capacidade de ligação ao antígeno. Alguns minicorpos têm uma atividade maior do que aquela de um anticorpo inteiro (Orita et al., Blood (2005) 105: 562-566). Neste pedido, "fragmentos de anticorpo" não são particularmente limitados embora sejam uma porção de um anticorpo inteiro (por exemplo, IgG inteiro). Entretanto, os fragmentos de anticorpo preferencialmente compreendem uma região variável da cadeia pesada (VH) ou uma região variável da cadeia leve (VL). Os fragmentos de anticorpo preferenciais incluem, por exemplo, Fab, F(ab’)2, Fab’ e Fv. A sequência de aminoácidos de uma região variável da cadeia pesada (VH) ou região variável da cadeia leve (VL) em um fragmento de anticorpo pode ser modificada por substituição, deleção, adição e/ou inserção. Além disso, algumas porções de uma região variável da cadeia pesada (VH) ou região variável da cadeia leve (VL) podem ser deletadas, embora os fragmentos conservem sua capacidade de ligação ao antígeno. Por exemplo, dos fragmentos de anticorpo acima, "Fv" é um fragmento de anticorpo mínimo que compreende sítios completos de reconhecimento e ligação a antígeno. "Fv" é um dímero (dímero VH-VL) em que a região variável da cadeia pesada (VH) e uma região variável da cadeia leve (VL) são ligadas firmemente por ligação não covalente. As três regiões de determinação de complementaridade (CDRs) de cada região variável formam um sítio de ligação ao antígeno na superfície do dímero VH-VL. Seis CDRs conferem um sítio de ligação ao antígeno ao anticorpo. Entretanto, mesmo uma região variável (ou metade de um Fv compreendendo somente três CDRs específicas para o antígeno) tem a capacidade de reconhecer e ligar-se a um antígeno, embora sua afinidade seja mais baixa do que aquele do sítio de ligação completo. Dessa forma, tais moléculas que são menores do que Fv também estão incluídas nos fragmentos de anticorpo da presente invenção. Além disso, as regiões variáveis de um fragmento de anticorpo podem ser quimerizadas ou humanizadas.

[000177] É preferencial que os minicorpos compreendam tanto uma região variável da cadeia pesada (VH) como uma região variável da cadeia leve (VL). Os minicorpos incluem, por exemplo, fragmentos de anticorpo, tais como Fab, Fab’, F(ab’)2, e Fv, e scFv (Fv de cadeia única) que podem ser preparados usando fragmentos de anticorpo (Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1988) 85: 5879-83; Plickthun "The Pharmacology of Monoclonal Antibodies" Vol. 113, Resenburg e Moore (eds.), Springer Verlag, New York, pp. 269-315, (1994)); diacorpos (Holliger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1993) 90:6444-8; EP 404097; WO93/11161; Johnson et al., Method in Enzymology (1991) 203: 88-98; Holliger et al., Protein Engineering (1996) 9:299305; Perisic et al., Structure (1994) 2:1217-26; John et al., Protein Engineering (1999) 12 (7):597-604; Atwell et al., Mol. Immunol. (1996) 33:1301-12); sc (Fv) 2 (Hudson et al., J Immunol. Methods (1999) 231:177-89; Orita et al., Blood (2005) 105:562-566); triacorpos (Journal of Immunological Methods (1999) 231: 177-89); e diacorpos em tandem (Cancer Research (2000) 60:4336-41).

[000178] Um fragmento de anticorpo pode ser preparado pelo tratamento de um anticorpo com uma enzima, por exemplo, uma protease, tal como papaína e pepsina (ver Morimoto et al., J. Biochem. Biophys. Methods (1992) 24:107-17; Brennan et al., Science (1985) 229:81). Alternativamente, um fragmento de anticorpo também pode ser produzido pela recombinação genética baseada na sua sequência de aminoácidos.

[000179] Um minicorpo compreendendo uma estrutura que resulta da modificação de um fragmento de anticorpo pode ser construído usando um fragmento de anticorpo obtido por tratamento de enzima ou recombinação genética. Alternativamente, após construir um gene que codifica um minicorpo inteiro e introdução dele em um vetor de expressão, o minicorpo pode ser expresso em células hospedeiras apropriadas (ver, por exemplo, Co et al., J. Immunol. (1994) 152:296876; Better e Horwitz, Methods Enzymol. (1989) 178:476-96; Pluckthun e Skerra, Methods Enzymol. (1989) 178: 497-515; Lamoyi, Methods Enzymol. (1986) 121:652-63; Rousseaux et al., Methods Enzymol. (1986) 121:663-9; Bird e Walker, Trends Biotechnol. (1991) 9:132-7).

[000180] O scFv acima é um polipeptídeo de cadeia única que compreende duas regiões variáveis ligadas em conjunto através de um ligante ou similar, de acordo com a necessidade. Duas regiões variáveis contidas em um scFv são tipicamente um VH e um VL, mas um scFv pode ter dois VH ou dois VL. Em geral, os polipeptídeos de scFv compreendem um ligante entre domínios VH e VL, por meio disso formando uma porção pareada de VH e VL necessária para a ligação de antígeno. Um ligante peptídico de dez ou mais aminoácidos é tipicamente usado como o ligante entre VH e VL para formar uma porção intramolecularmente pareada entre VH e VL. Entretanto, os ligantes do scFv da presente invenção não são limitados a tais ligantes peptídicos, embora não inibam a formação de scFv. Para rever scFv, ver Pluckthun "The Pharmacology of Monoclonal Antibody", Vol. 113 (Rosenburg e ed. Moore, Springer Verlag, NY, pp.269-315 (1994)).

[000181] Entretanto, "diacorpos (Db)" refere-se a fragmentos de anticorpo divalentes construídos por fusão gênica (P. Holliger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993); EP 404.097; WO93/11161; etc.). Os diacorpos são dímeros compreendendo duas cadeias polipeptídicas, nas quais cada cadeia polipeptídica compreende dentro da mesma cadeia uma região variável da cadeia leve (VL) e uma região variável da cadeia pesada (VH) ligado através de um ligante bastante curto para prevenir a interação destes dois domínios, por exemplo, um ligante de aproximadamente cinco resíduos. VL e VH codificados na mesma cadeia de polipeptídeo formarão um dímero porque o ligante entre VL e VH é demasiado curto para formar o fragmento de região V de cadeia única. Por isso, os diacorpos têm dois sítios de ligação ao antígeno. Neste caso, quando VL e VH direcionados contra dois epítopos diferentes (a e b) são expressos simultaneamente como combinações de VLa-VHb e VLb-VHa unidos com um ligante de aproximadamente cinco resíduos, são secretados como Db biespecífico.

[000182] Os diacorpos compreendem duas moléculas de scFv e dessa forma têm quatro regiões variáveis. Como resultado, os diacorpos têm dois sítios de ligação a antígeno. Diferentemente de situações nas quais scFv não forma dímeros, na formação de diacorpo, o comprimento do ligante entre o VH e VL em cada molécula de scFv tem geralmente aproximadamente cinco aminoácidos quando o ligante é um ligante peptídico. Entretanto, o ligante de scFv que forma um diacorpo não é limitado a tal ligante peptídico, enquanto não inibe a expressão de scFv e a formação de diacorpo.

[000183] Além disso, é preferencial que os minicorpos e fragmentos de anticorpo da presente invenção adicionalmente compreendam uma sequência de aminoácidos de uma região constante da cadeia pesada de anticorpo e/ou uma sequência de aminoácidos de uma região constante da cadeia leve.

Alteração de um ou mais nucleotídeos

[000184] Neste pedido, "alteração de nucleotídeos" significa que a manipulação gênica ou mutagênese é realizada para inserir, deletar ou substituir pelo menos um nucleotídeo em um DNA para que o polipeptídeo codificado por DNA tenha resíduos de aminoácidos de interesse. Especificamente, isto significa que o códon que codifica o resíduo de aminoácido original é substituído por um códon que codifica o resíduo de aminoácido de interesse. Tais alterações de nucleotídeos podem ser introduzidas usando métodos, tais como mutagênese sítio-dirigida (ver, por exemplo, Kunkel (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 488), mutagênese de PCR, e mutagênese de cassete. Em geral, anticorpos mutantes cujas propriedades biológicas foram melhoradas mostraram uma homologia e/ou similaridade de sequência de aminoácidos de 70% ou mais alto, mais preferencialmente 80% ou mais, e ainda mais preferencialmente 90% ou mais (por exemplo, 95% ou mais, 97%, 98%, 99%, etc.), quando comparados com a sequência de aminoácidos da região variável de anticorpo original. Neste pedido, homologia e/ou similaridade de sequência são definidas como a proporção de resíduos de aminoácidos que são homólogos (o mesmo resíduo) ou similares (resíduos de aminoácidos classificados no mesmo grupo baseado nas propriedades gerais das cadeias laterais de aminoácido) aos resíduos de aminoácidos originais, após maximizar o valor da homologia de sequência realizando alinhamento de sequência e introdução de lacuna de acordo com a necessidade. Em geral, os resíduos de aminoácidos que ocorrem naturalmente são classificados nos seguintes grupos baseados nas características das suas cadeias laterais: (1) hidrofóbicas: alanina, isoleucina, valina, metionina e leucina; (2) neutras hidrofílicas: asparagina, glutamina, cisteína, treonina e serina; (3) acídicas: ácido aspártico e ácido glutâmico; (4) básicas: arginina, histidina e lisina; (5) resíduos que têm uma influência na conformação de cadeia: glicina e prolina; e (6) aromáticas: tirosina, triptofano e fenilalanina. O número de aminoácidos modificados é, por exemplo, dez, nove, oito, sete, seis, cinco, quatro, três, dois ou um, mas não é limitado a isso.

[000185] Em geral, um total de seis regiões de determinação de complementaridade (CDRs; regiões hipervariáveis) presentes nas regiões variáveis da cadeia pesada e cadeia leve interagem para formar o sítio(s) de ligação ao antígeno de um anticorpo. É conhecido que uma destas regiões variáveis tem a capacidade de reconhecer e ligar-se ao antígeno, embora a afinidade seja mais baixa do que quando todos os sítios de ligação estão incluídos. Dessa forma, os polipeptídeos da presente invenção tendo uma atividade de ligação ao antígeno podem codificar porções de fragmento contendo os respectivos sítios de ligação ao antígeno da cadeia pesada e cadeia leve do anticorpo enquanto mantêm a atividade de ligação ao antígeno desejada.

[000186] Os métodos da presente invenção permitem a preparação eficiente, por exemplo, de multímeros polipeptídicos desejados que de fato têm a atividade acima descrita.

[000187] Em uma modalidade preferencial da presente invenção, os resíduos de aminoácidos apropriados a serem "modificados" podem ser selecionados a partir de, por exemplo, as sequências de aminoácidos de regiões variáveis da cadeia pesada e cadeia leve do anticorpo e as sequências de aminoácidos da região variável da cadeia leve e cadeia leve do anticorpo.

Expressão de DNA

[000188] DNAs que codificam os polipeptídeos modificados são clonados (inseridos) em um vetor apropriado e em seguida introduzidos em células hospedeiras. Não há nenhuma limitação particular dos vetores enquanto carregam estavelmente os ácidos nucleicos inseridos. Por exemplo, usando E. coli como o hospedeiro, os vetores incluem vetores de clonagem. Vetores de clonagem preferenciais incluem vetores pBluescript (Stratagene). É possível usar vários vetores comercialmente disponíveis. Vetores de expressão são particularmente úteis como vetores para produzir multímeros polipeptídicos ou polipeptídeos da presente invenção. Não há nenhuma limitação particular dos vetores de expressão enquanto expressam polipeptídeos in vitro, em E. coli, células de cultura, ou organismos. Vetores preferenciais incluem, por exemplo, vetores pBEST (Promega) para expressão in vitro; vetores pET (Invitrogen) para expressão em E. coli; o vetor pME18S-FL3 (Acesso GenBank No. AB009864) para expressão em células de cultura; e o vetor pME18S (Mol. Cell. Biol. 8:466-472 (1988)) para expressão em organismos. DNAs podem ser inseridos em vetores por métodos convencionais, tais como reação de ligase usando sítios de enzima de restrição (Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley & Sons. Section 11.4-11.11).

[000189] Não há nenhuma limitação particular das células hospedeiras acima, e várias células hospedeiras podem ser usadas dependendo do alvo. Células para expressar polipeptídeos incluem, por exemplo, células bacterianas (por exemplo, Streptococcus, Staphylococcus, E. coli, Streptomyces e Bacillus subtilis), células fúngicas (por exemplo, levedura e Aspergillus), células de inseto (por exemplo, Drosophila S2 e Spodoptera SF9), células animais (por exemplo, CHO, COS, HeLa, C127, 3T3, BHK, HEK293, célula de melanoma de Bowes), e células vegetais. Os vetores podem ser introduzidos em células hospedeiras usando métodos conhecidos, tais como o método de precipitação em fosfato de cálcio, método de eletroporação (Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley & Sons. Section 9.1-9.9), método de lipofecção e método de microinjeção.

[000190] A fim de secretar polipeptídeos expressos pela célula hospedeira no lúmen do retículo endoplasmático, espaço periplasmático, ou ambiente extracelular, sinais de secreção apropriados podem ser incorporados nos polipeptídeos de interesse. Estes sinais podem ser intrínsecos ou estranhos aos polipeptídeos de interesse.

[000191] Vetores de expressão do primeiro, segundo, terceiro e quarto polipeptídeo podem ser construídos inserindo DNAs que codificam os polipeptídeos individualmente em vetores separados. Alternativamente, alguns DNAs que codificam o primeiro, segundo, terceiro e quarto polipeptídeo (por exemplo, um DNA que codifica o primeiro polipeptídeo e um DNA que codifica o segundo polipeptídeo) podem ser inseridos em um vetor único para construir vetores de expressão. Quando um vetor de expressão é construído inserindo múltiplos DNAs em um vetor único, não há nenhuma limitação da combinação de DNAs codificam o polipeptídeo a ser inserido.

Recuperação de produtos de expressão

[000192] Quando os polipeptídeos são secretados para um meio de cultura, os produtos de expressão são recuperados por coleta do meio. Quando os polipeptídeos são produzidos em células, as células são primeiro lisadas e em seguida os polipeptídeos são coletados.

[000193] Os polipeptídeos podem ser coletados e purificados de uma cultura de células recombinantes por métodos conhecidos incluindo precipitação em sulfato de amônio ou etanol, extração ácida, cromatografia de troca aniônica ou catiônica, cromatografia em fosfocelulose, cromatografia de interação hidrofóbica, cromatografia de afinidade, cromatografia em hidroxilapatita e cromatografia em lectina.

[000194] Cromatografia de afinidade em Proteína A é preferencialmente usada na presente invenção.

[000195] Colunas de Proteína A incluem, mas não são limitadas a, Hyper D (PALL), POROS (Applied Biosystems), Sepharose F.F. (GE), e ProSep (Millipore). Alternativamente, cromatografia de afinidade em proteína A pode ser realizada usando uma resina ligada por um ligante que mimetiza a capacidade de ligação à IgG da proteína A. Também quando tal mimético de proteína A é usado, os multímeros polipeptídicos de interesse podem ser isolados e purificados criando uma diferença na capacidade de ligação em consequência das modificações de aminoácidos da presente invenção. Tais miméticos de proteína A incluem, mas não são limitados a, por exemplo, mabSelect SuRE (GE Healthcare).

[000196] Além disso, a presente invenção fornece multímeros polipeptídicos obtidos pelos métodos de purificação ou produção da presente invenção.

[000197] A presente invenção também fornece multímeros polipeptídicos compreendendo o primeiro polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno e o segundo polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno ou sem atividade de ligação ao antígeno, em que a capacidade de ligação à proteína A é diferente entre o primeiro e segundo polipeptídeo.

[000198] Tais multímeros polipeptídicos podem ser obtidos pelos métodos descritos neste pedido. As estruturas e propriedades dos multímeros polipeptídicos são como descritas acima, e resumidas abaixo.

[000199] Quando comparado com antes da modificação de aminoácidos, a capacidade de ligação à proteína A dos multímeros polipeptídicos da presente invenção foi alterada. Mais especificamente, a capacidade de ligação à proteína A foi alterada em um ou tanto no primeiro polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno quanto no segundo polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno ou sem atividade de ligação ao antígeno. Em um multímero polipeptídico da presente invenção, a capacidade de ligação à proteína A do primeiro polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno é diferente daquela do segundo polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno ou sem atividade de ligação ao antígeno. Consequentemente, o pH de solvente para eluição em proteína A é diferente para o primeiro polipeptídeo e o segundo polipeptídeo na cromatografia de afinidade.

[000200] Além disso, o primeiro polipeptídeo e/ou o segundo polipeptídeo podem formar um multímero com um ou dois terceiros polipeptídeos.

[000201] Dessa forma, a presente invenção refere-se a multímeros polipeptídicos que compreendem o primeiro polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno, o segundo polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno ou sem atividade de ligação ao antígeno, e um ou dois terceiros polipeptídeos tendo uma atividade de ligação ao antígeno, em que a capacidade de ligação à proteína A é diferente para o primeiro e segundo polipeptídeo. Tais multímeros polipeptídicos também podem ser obtidos pelos métodos descritos neste pedido.

[000202] Os multímeros polipeptídicos podem compreender adicionalmente um quarto polipeptídeo. Qualquer do primeiro polipeptídeo e do segundo polipeptídeo podem formar um multímero com o terceiro polipeptídeo, enquanto o outro pode formar outro multímero com o quarto polipeptídeo.

[000203] Dessa forma, a presente invenção refere-se a multímeros polipeptídicos que compreendem o primeiro polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno, o segundo polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno ou sem atividade de ligação ao antígeno, o terceiro polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno, e o quarto polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno, em que a capacidade de ligação à proteína A é diferente para o primeiro e segundo polipeptídeo. Tais multímeros polipeptídicos também podem ser obtidos pelos métodos descritos neste pedido.

[000204] O primeiro polipeptídeo acima tendo uma atividade de ligação ao antígeno e segundo polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno ou sem atividade de ligação ao antígeno pode compreender uma sequência de aminoácidos de uma região constante da cadeia pesada de anticorpo ou uma sequência de aminoácidos de um domínio Fc de anticorpo. A sequência de aminoácidos de uma região constante da cadeia pesada de anticorpo ou um anticorpo o domínio de Fc inclui, mas não é limitado a, uma sequência de aminoácidos de uma região constante derivada de IgG humana.

[000205] Entretanto, o terceiro polipeptídeo acima tendo uma atividade de ligação ao antígeno e quarto polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno pode compreender uma sequência de aminoácidos de uma região constante da cadeia leve de anticorpo.

[000206] Além disso, os polipeptídeos tendo uma atividade de ligação ao antígeno podem compreender uma sequência de aminoácidos de uma região variável de anticorpo (por exemplo, as sequências de aminoácidos da CDR1, CDR2, CDR3, FR1, FR2, FR3 e FR4).

[000207] O primeiro polipeptídeo acima tendo uma atividade de ligação ao antígeno e segundo polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno ou sem atividade de ligação ao antígeno pode compreender uma sequência de aminoácidos de uma cadeia pesada de anticorpo, ou sequência de aminoácidos que compreende uma região variável da cadeia leve de anticorpo e uma região constante da cadeia pesada de anticorpo. O terceiro polipeptídeo acima tendo uma atividade de ligação ao antígeno e quarto polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno pode compreender uma sequência de aminoácidos de uma cadeia leve de anticorpo, ou sequência de aminoácidos que compreende uma região variável da cadeia pesada de anticorpo e uma região constante da cadeia leve de anticorpo.

[000208] Um multímero polipeptídico da presente invenção pode ser um anticorpo multiespecífico. Os anticorpos multiespecíficos da presente invenção incluem, mas não são limitados a anticorpos biespecíficos capazes de ligar-se especificamente a dois tipos de antígenos.

[000209] Em um multímero polipeptídico da presente invenção, um ou mais resíduos de aminoácidos foram modificados para que haja (uma maior) diferença da capacidade de ligação à proteína A entre o primeiro polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno e o segundo polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno ou sem atividade de ligação ao antígeno. Como descrito acima, os sítios de modificação incluem, mas não são limitados, por exemplo, aos seguintes resíduos de aminoácidos: TLMISR nas posições 250-255, VLHQDWLNGK nas posições 308-317, EALHNHY nas posições 430436, preferencialmente TLMIS nas posições 250-254, LHQD nas posições 309-312, LN nas posições 314-315, E na posição 430, LHNHY nas posições 432-436, mais preferencialmente LMIS nas posições 251-254, LHQ nas posições 309-311, L na posição 314, LHNH nas posições 432-435, e particularmente LMIS nas posições 252-254, L na posição 309, Q na posição 311, e NHY nas posições 434-436 (numeração EU) em um domínio Fc de anticorpo ou uma região constante da cadeia pesada. Entretanto, quanto a modificações de aminoácido de uma região variável da cadeia pesada de anticorpo, os sítios de modificação preferenciais incluem FR1, CDR2 e FR3.

[000210] Mais especificamente, os multímeros polipeptídicos da presente invenção incluem, mas não são limitados a, multímeros polipeptídicos nos quais o resíduo de aminoácido na posição 435 (numeração EU) na sequência de aminoácidos de um domínio Fc de anticorpo ou região constante da cadeia pesada de anticorpo é histidina ou arginina em um do primeiro polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno e do segundo polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno ou sem atividade de ligação ao antígeno, enquanto outro polipeptídeo tem um resíduo de aminoácido diferente na posição 435 (numeração EU) na sequência de aminoácidos de um domínio Fc de anticorpo ou região constante da cadeia pesada de anticorpo.

[000211] Além disso, os multímeros polipeptídicos da presente invenção incluem, mas não são limitados a, multímeros polipeptídicos nos quais o resíduo de aminoácido na posição 435 (numeração EU) na sequência de aminoácidos de uma cadeia pesada de região constante de anticorpo é histidina em um do primeiro polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno e do segundo polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno ou sem atividade de ligação ao antígeno, enquanto o resíduo de aminoácido na posição 435 (numeração EU) na sequência de aminoácidos de uma cadeia pesada de região constante de anticorpo é arginina em outro polipeptídeo.

[000212] Além disso, os multímeros polipeptídicos da presente invenção que compreende o primeiro e segundo polipeptídeo incluem, mas não são limitados aos exemplos abaixo.

(1) Multímeros polipeptídicos que compreendem o primeiro ou segundo polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos na qual os resíduos de aminoácidos nas posições 435 e 436 (numeração EU) na sequência de aminoácidos de uma região constante da cadeia pesada de anticorpo derivada de uma IgG humana foram modificados para histidina (His) e tirosina (Tyr), respectivamente.

[000213] Tais multímeros polipeptídicos incluem, mas não são limitados, por exemplo, a multímeros polipeptídicos compreendendo o primeiro ou segundo polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 9, 11, 13 ou 15.
(2) Multímeros polipeptídicos que compreendem o primeiro ou segundo polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos na qual os resíduos de aminoácidos nas posições 435 e 436 (numeração EU) na sequência de aminoácidos de uma região constante da cadeia pesada de anticorpo derivada de uma IgG humana foram modificados para arginina (Arg) e fenilalanina (Phe), respectivamente.

[000214] Tais multímeros polipeptídicos incluem, mas não são limitados, por exemplo, a multímeros polipeptídicos que compreendem o primeiro ou segundo polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 10 ou 12.
(3) Multímeros polipeptídicos que compreendem o primeiro ou segundo polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos na qual os resíduos de aminoácidos nas posições 435 e 436 (numeração EU) na sequência de aminoácidos de uma região constante da cadeia pesada de anticorpo derivada de uma IgG humana foram modificados para arginina (Arg) e tirosina (Tyr), respectivamente.

[000215] Tais multímeros polipeptídicos incluem, mas não são limitados, por exemplo, a multímeros polipeptídicos que compreendem o primeiro ou segundo polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 14.
(4) Multímeros polipeptídicos que compreendem o primeiro e segundo polipeptídeo, em que qualquer dos polipeptídeos compreende uma sequência de aminoácidos na qual os resíduos de aminoácidos nas posições 435 e 436 (numeração EU) na sequência de aminoácidos de uma região constante da cadeia pesada de anticorpo derivada de uma IgG humana foram modificados para histidina (His) e tirosina (Tyr), respectivamente; e outro polipeptídeo compreende uma sequência de aminoácidos na qual os resíduos de aminoácidos nas posições 435 e 436 (numeração EU) na sequência de aminoácidos de uma região constante da cadeia pesada de anticorpo foram modificados para arginina (Arg) e fenilalanina (Phe), respectivamente.

[000216] Tais multímeros polipeptídicos incluem, mas não são limitados, por exemplo, a multímeros polipeptídicos que compreendem o primeiro polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 9, 11, 13 ou 15 e o segundo polipeptídeo que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 10 ou 12.
(5) Multímeros polipeptídicos que compreendem o primeiro e segundo polipeptídeo, em que qualquer dos polipeptídeos compreende uma sequência de aminoácidos na qual os resíduos de aminoácidos nas posições 435 e 436 (numeração EU) na sequência de aminoácidos de uma região constante da cadeia pesada de anticorpo derivada de uma IgG humana foram modificados para histidina (His) e tirosina (Tyr), respectivamente; e outro polipeptídeo compreende uma sequência de aminoácidos na qual os resíduos de aminoácidos nas posições 435 e 436 (numeração EU) na sequência de aminoácidos de uma região constante da cadeia pesada de anticorpo foram modificados para arginina (Arg) e tirosina (Tyr), respectivamente.

[000217] Tais multímeros polipeptídicos incluem, mas não são limitados, por exemplo, a multímeros polipeptídicos que compreendemo primeiro polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 9, 11, 13 ou 15 e o segundo polipeptídeo que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 14.
(6) Multímeros polipeptídeos que compreendem o primeiro e segundo polipeptídeo, em que qualquer dos polipeptídeos compreende uma sequência de aminoácidos na qual os resíduos de aminoácidos nas posições 435 e 436 (numeração EU) na sequência de aminoácidos de uma região constante da cadeia pesada de anticorpo derivada de uma IgG humana foram modificados para arginina (Arg) e fenilalanina (Phe), respectivamente; e outro polipeptídeo compreende uma sequência de aminoácidos na qual os resíduos de aminoácidos nas posições 435 e 436 (numeração EU) na sequência de aminoácidos de uma região constante da cadeia pesada de anticorpo foram modificados para arginina (Arg) e tirosina (Tyr), respectivamente.

[000218] Tais multímeros polipeptídeos incluem, mas não são limitados, por exemplo, a multímeros polipeptídeos que compreendem o primeiro polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 10 ou 12 e o segundo polipeptídeo que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 14.

[000219] O primeiro e segundo polipeptídeo acima podem compreender adicionalmente uma região variável da cadeia pesada de anticorpo. Os multímeros polipeptídeos de (1) a (6) acima podem também compreender o terceiro polipeptídeo e/ou o quarto polipeptídeo.

[000220] Além disso, a presente invenção fornece variantes polipeptídicas que compreendem um polipeptídeo compreendendo uma mutação no resíduo de aminoácido na posição 435 ou 436 (numeração EU). Tais variantes polipeptídicas incluem, mas não são limitadas a variantes polipeptídicas compreendendo um polipeptídeo descrito nos Exemplos.

[000221] Além disso, a presente invenção fornece ácidos nucleicos que codificam um polipeptídeo (polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno) que constitui um multímero polipeptídico da presente invenção. A presente invenção também fornece vetores que carregam tais ácidos nucleicos.

[000222] A presente invenção também fornece células hospedeiras que compreendem os ácidos nucleicos ou vetores acima. Não há limitação particular das células hospedeiras, e incluem, por exemplo, E. coli e várias células vegetais e animais. As células hospedeiras podem ser usadas, por exemplo, como um sistema de produção para produzir e expressar os multímeros polipeptídicos ou polipeptídeos da presente invenção. Há sistemas de produção in vitro e in vivo para produzir os multímeros polipeptídicos ou polipeptídeos. Sistemas de produção in vitro incluem os que usam células eucarióticas e células procarióticas.

[000223] Células eucarióticas que podem ser usadas como células hospedeiras incluem, por exemplo, células animais, células vegetais e células fúngicas. Células animais incluem: células mamíferas, por exemplo, CHO (J. Exp. Med. (1995) 108, 945), COS, HEK293, 3T3, mieloma, BHK (rim de filhote de hamster), HeLa, e Vero; células anfíbias, tais como oócitos de Xenopus laevis (Valle, et al., Nature (1981) 291: 338-340); e células de inseto, tais como Sf9, Sf21, e Tn5. Para expressar os multímeros polipeptídicos ou polipeptídeos da presente invenção, CHO-DG44, CHO-DX11B, células COS7, células HEK293 e células BHK podem ser apropriadamente usadas. Das células animais, células CHO são particularmente preferenciais para a expressão em larga escala. Os vetores podem ser introduzidos em uma célula hospedeira, por exemplo, por métodos em fosfato de cálcio, métodos em DEAE-dextrana, métodos usando DOTAP lipossoma catiônico (Boehringer-Mannheim), métodos de eletroporação ou métodos de lipofecção.

[000224] É conhecido que células vegetais, tais como células derivadas de Nicotiana tabacum e células de Lemna minor são sistemas de produção proteica, e estas células podem ser usadas para produzir multímeros polipeptídicos ou polipeptídeos da presente invenção por métodos que cultivam calos destas células. Os sistemas de expressão proteica que usam células fúngicas incluindo células de levedura, por exemplo, células do gênero Saccharomyces (Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces pombe, etc.), e células de fungos filamentosos, por exemplo, o gênero Aspergillus (Aspergillus niger, etc.) são conhecidos, e estas células podem ser usadas como um hospedeiro para produzir multímeros polipeptídicos ou polipeptídeos da presente invenção.

[000225] Quando células procarióticas são usadas, sistemas de produção que usam células bacterianas estão disponíveis. Sistemas de produção que usam células bacterianas incluindo Bacillus subtilis bem como E. coli descritos acima são conhecidos, e podem ser usados para produzir multímeros polipeptídicos ou polipeptídeos da presente invenção.

[000226] Quando um multímero polipeptídico ou polipeptídeo são produzidos usando uma célula hospedeira da presente invenção, um polinucleotídeo que codifica o multímero polipeptídico ou o polipeptídeo da presente invenção pode ser expresso cultivando a célula hospedeira transformada com um vetor de expressão compreendendo o polinucleotídeo. Cultura pode ser realizada de acordo com os métodos conhecidos. Por exemplo, quando células animais são usadas como um hospedeiro, DMEM, MEM, RPMI 1640, ou IMDM pode ser usado como meio de cultura. Meio de cultura pode ser usado com soluções de suplemento de soro, tais como FBS ou soro fetal de bezerro (FCS). Alternativamente, as células podem ser cultivadas em culturas sem soro. O pH preferencial é aproximadamente 6 a 8 durante o curso da cultura. A incubação é realizada tipicamente em aproximadamente 30 a 40°C por aproximadamente 15 a 200 horas. Meio é trocado, ventilado, ou agitado, de acordo com a necessidade.

[000227] Por outro lado, os sistemas para produção de polipeptídeos in vivo incluem, por exemplo, aqueles usando animais e aqueles usando plantas. Um polinucleotídeo de interesse é introduzido em um animal ou planta para produzir o polipeptídeo no corpo do animal ou planta, e em seguida o polipeptídeo é coletado. O "hospedeiro" da presente invenção inclui tais animais e plantas.

[000228] Quando animais são usados, sistemas de produção que usam mamíferos ou insetos estão disponíveis. Mamíferos, tais como cabra, porco, ovelhas, camundongo e gado podem ser usados (Vicki Glaser, SPECTRUM Biotechnology Applications (1993)). Quando mamíferos são usados, animais transgênicos podem ser usados.

[000229] Por exemplo, um polinucleotídeo que codifica um multímero polipeptídico ou polipeptídeo da presente invenção pode ser preparado como um gene de fusão com um gene que codifica um polipeptídeo especificamente produzido no leite, tal como β-caseína de cabra. A seguir, os fragmentos de polinucleotídeos contendo este gene de fusão são injetados em embriões de cabra, que então são introduzidos de volta em cabras. O anticorpo de interesse pode ser obtido do leite produzido pelas cabras transgênicas, que nascem das cabras que receberam os embriões, ou pela sua descendência. Hormônios apropriados podem ser administrados às cabras transgênicas para aumentar o volume de leite contendo o anticorpo produzido pelas cabras transgênicas (Ebert et al., Bio/Technology (1994) 12: 699-702).

[000230] Insetos, tais como bichos da seda, podem ser usados para produzir multímeros polipeptídicos ou polipeptídeos da presente invenção. Quando bichos da seda são usados, baculovírus que carregam um polinucleotídeo que codifica um multímero polipeptídico ou polipeptídeo de interesse podem ser usados para infectar bichos da seda, para que o multímero polipeptídico ou polipeptídeo de interesse possam ser obtidos dos fluidos corporais destes bichos da seda (Susumu et al., Nature (1985) 315:592-594).

[000231] As plantas usadas para produzir multímeros polipeptídicos ou polipeptídeos da presente invenção incluem, por exemplo, o tabaco. Quando o tabaco é usado, um polinucleotídeo que codifica um multímero polipeptídico ou polipeptídeo de interesse é inserido em um vetor de expressão vegetal, por exemplo, pMON 530, e em seguida o vetor é introduzido em uma bactéria, tal como Agrobacterium tumefaciens. As bactérias então são usadas para infectar o tabaco, tal como Nicotiana tabacum, e o multímero polipeptídico ou polipeptídeo desejado podem ser obtidos das folhas de tabaco (Ma et al., Eur. J. Immunol. (1994) 24: 131-138). Alternativamente, as mesmas bactérias podem ser usadas para infectar Lemna minor, e após clonagem, o multímero polipeptídico ou polipeptídeo desejado podem ser obtidos das células de Lemna minor (Cox K.M et al., Nat. Biotechnol. 2006 Dec; 24 (12):1591-1597).

[000232] O multímero polipeptídico ou polipeptídeo obtido dessa forma pode ser isolado do interior ou exterior (tal como o meio e leite) de células hospedeiras, e purificados como um multímero polipeptídico ou polipeptídeo substancialmente puro e homogêneo. Os métodos usados para separar e purificar um multímero polipeptídico ou polipeptídeo não são limitados, e os métodos usados na purificação de polipeptídeo padrão podem ser aplicados. Os anticorpos podem ser isolados e purificados selecionando uma combinação apropriada, por exemplo, de colunas cromatográficas, filtração, ultrafiltração, salting out, precipitação de solvente, extração de solvente, destilação, imunoprecipitação, eletroforese em gel de SDS-poliacrilamida, focagem isoelétrica, diálise, recristalização e similares.

[000233] As cromatografias incluem, por exemplo, cromatografia de afinidade, cromatografia de troca iônica, cromatografia hidrofóbica, filtração em gel, cromatografia em fase reversa e cromatografia de adsorção (Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual. Ed Daniel R. Marshak et al., (1996) Cold Spring Harbor Laboratory Press). Estas cromatografias podem ser realizadas usando cromatografia em fase líquida, tal como HPLC e FPLC. Exemplos de colunas da cromatografia de afinidade incluem colunas de proteína A e colunas de proteína G. Exemplos das colunas que usam proteína A incluem, mas não são limitadas a, Hyper D, POROS, e Sepharose F. F. (Pharmacia).

[000234] De acordo com a necessidade, modificações podem ser adicionadas e peptídeos podem ser deletados de um multímero polipeptídico ou polipeptídeo arbitrariamente pelo tratamento com uma enzima de modificação proteica apropriada antes ou após purificação do multímero polipeptídico ou polipeptídeo. Tais enzimas de modificação proteica incluem, por exemplo, tripsina, quimiotripsina, lisil endopeptidase, proteína quinase e glucosidase.

[000235] Outra modalidade preferencial da presente invenção inclui um método para produção de um multímero polipeptídico ou polipeptídeo da presente invenção, que compreende as etapas de cultura das células hospedeiras da presente invenção como descrito acima e coleta do polipeptídeo da cultura celular.

[000236] Além disso, a presente invenção refere-se a composições farmacêuticas (agentes) compreendendo um multímero polipeptídico ou polipeptídeo da presente invenção e um veículo farmaceuticamente aceitável. Na presente invenção, "composições farmacêuticas" geralmente se referem a agentes para tratamento ou prevenção, ou teste e diagnóstico de doenças.

[000237] As composições farmacêuticas da presente invenção podem ser formuladas por métodos conhecidos pelos versados na técnica. Por exemplo, tais composições farmacêuticas podem ser usadas parenteralmente na forma de injeções, que são soluções estéreis ou suspensões preparadas com água ou outro líquido farmaceuticamente aceitável. Por exemplo, tais composições podem ser formuladas combinando-se apropriadamente com um veículo ou meio farmaceuticamente aceitável, especificamente, água estéril, salina fisiológica, óleo vegetal, emulsificante, suspensão, tensoativo, estabilizante, agente flavorizante, excipiente, veículo, conservante, ligante, ou similares, e misturadas em uma forma de dose de unidade que satisfaz as exigências geralmente aceitas para preparação de produtos farmacêuticos. Em tais preparações, a quantidade do ingrediente ativo é ajustada tal que uma quantidade adequada dentro de uma faixa especificada seja obtida.

[000238] Composições estéreis para injeção podem ser formuladas usando veículos, tais como água destilada para injeção, de acordo com os protocolos padrão da formulação.

[000239] As soluções aquosas para injeção incluem, por exemplo, salina fisiológica e soluções isotônicas contendo glicose ou outros adjuvantes (por exemplo, D-sorbitol, D-manose, D-manitol e cloreto de sódio). Solubilizantes apropriados, por exemplo, álcoois (etanol e similares), poliálcoois (propilenoglicol, polietilenoglicol e similares), tensoativos não iônicos (polissorbato 80TM, HCO-50 e similares) podem ser usados em combinação.

[000240] Os óleos incluem óleos de soja e sésamo. Benzoato de benzila e/ou álcool benzílico podem ser usados como solubilizantes em combinação. Tampões (por exemplo, tampão de fosfato e tampão de acetato de sódio), agentes calmantes (por exemplo, hidrocloreto de procaína), estabilizantes (por exemplo, álcool benzílico e fenol) e/ou antioxidantes também podem ser combinados. As injeções preparadas são geralmente enchidas em ampolas apropriadas.

[000241] As composições farmacêuticas da presente invenção são preferencialmente administradas parenteralmente. Por exemplo, as composições podem ser na forma de injeções, agentes transnasais, agentes transpulmonares, ou agentes transdérmicos. Por exemplo, tais composições podem ser administradas sistemicamente ou localmente por injeção intravenosa, injeção intramuscular, injeção intraperitonial, injeção subcutânea ou similares.

[000242] Os métodos de administração podem ser apropriadamente selecionados considerando a idade e sintomas de um paciente. A dosagem de uma composição farmacêutica que compreende um multímero polipeptídico ou polipeptídeo ou um polinucleotídeo que codifica um multímero polipeptídico ou polipeptídeo pode ser estabelecida, por exemplo, dentro da faixa de 0,0001 a 1000 mg/kg de peso para cada administração. Alternativamente, a dosagem pode ser, por exemplo, de 0,001 a 100.000 mg por paciente. Entretanto, na presente invenção, a dosagem não necessariamente é limitada às faixas descritas acima. Embora a dosagem e o método de administração variem dependendo de peso de um paciente, idade, sintomas, e similares, os versados na técnica podem selecionar a dosagem apropriada e métodos de administração considerando estes fatores.

[000243] Os anticorpos multiespecíficos da presente invenção podem ser formulados combinando-os com outros componentes farmacêuticos de acordo com a necessidade.

[000244] Todas as referências da técnica anterior citadas neste pedido são incorporadas por referência neste relatório descritivo.

Exemplos

[000245] A seguir, a presente invenção será especificamente descrita com referência aos Exemplos, mas não deve ser interpretado como limitada a isso.

[Exemplo 1] Construção de vetores de expressão de genes de anticorpo e expressão de respectivos anticorpos

[000246] As regiões variáveis de cadeia H do anticorpo usadas foram:

[000247] Q153 (a região variável de cadeia H de um anticorpo F.IX anti-humano, SEQ ID NO: 1), Q407 (a região variável de cadeia H de um anticorpo F.IX anti-humano, SEQ ID NO: 2), J142 (a região variável de cadeia H de um anticorpo F.X anti-humano, SEQ ID NO: 3), J300 (a região variável de cadeia H de um anticorpo F.X anti-humano, SEQ ID NO: 4), e MRA-VH (a região variável de cadeia H de um anticorpo antireceptor de interleucina-6 humano, SEQ ID NO: 5).

[000248] As regiões variáveis de cadeia L do anticorpo usadas foram:

[000249] L180-k (uma cadeia L comum a um anticorpo F.IX anti-humano e um anticorpo F.X anti-humano, SEQ ID NO: 6), L210-k (uma cadeia L comum a um anticorpo F.IX anti-humano/anticorpo F.X anti-humano, SEQ ID NO: 7), e MRA-k (a cadeia L de um anticorpo antireceptor de interleucina-6 humano, SEQ ID NO: 8).

[000250] As regiões constantes de cadeia H do anticorpo usadas foram:

[000251] G4d (SEQ ID NO: 9), que foi construído de IgG4 introduzindo uma mutação de substituição de Pro por Ser na posição 228 (numeração EU) e eliminação de Gly e Lys C-terminais; z72 (SEQ ID NO: 10), que foi construído de G4d introduzindo as seguintes mutações: uma mutação de substituição de Arg por His na posição 435 (numeração EU); uma mutação de substituição de Phe por Tyr na posição 436 (numeração EU); e uma mutação de substituição de Pro por Leu na posição 445 (numeração EU); z7 (SEQ ID NO: 11), que foi construído de G4d introduzindo uma mutação de substituição de Lys por Glu na posição 356 (numeração EU); z73 (SEQ ID NO: 12), que foi construído de z72 introduzindo uma mutação de substituição de Glu por Lys na posição 439 (numeração EU); z106 (SEQ ID NO: 13), que foi construído de z7 introduzindo as seguintes mutações: uma mutação de substituição de Gln por Lys na posição 196 (numeração EU); uma mutação de substituição de Tyr por Phe na posição 296 (numeração EU); e uma mutação de substituição de Lys por Arg na posição 409 (numeração EU); z107 (SEQ ID NO: 14), que foi construído de z73 introduzindo as seguintes mutações: uma mutação de substituição de Gln por Lys na posição 196 (numeração EU); uma mutação de substituição de Tyr por Phe na posição 296 (numeração EU); uma mutação de substituição de Lys por Arg na posição 409 (numeração EU); e uma mutação de substituição de Tyr por Phe na posição 436 (numeração EU); e G1d (SEQ ID NO: 15), que foi construído deletando Gly e Lys C-terminais de IgG1. As mutações de substituição de Lys por Glu na posição 356 (numeração EU) e Glu por Lys na posição 439 (numeração EU) foram introduzidas para a formação eficiente de moléculas heteroméricas das respectivas cadeias H na produção de anticorpos heteroméricos ((WO 2006/106905) PROCESS FOR PRODUCTION OF POLYPEPTIDE BY REGULATION OF ASSEMBLY).

[000252] Os genes Q153-G4d e Q153-z7 da cadeia H do anticorpo F.IX anti-humano foram construídos ligando respectivamente G4d e z7 a jusante de Q153. O gene Q407-z106 da cadeia H do anticorpo F.IX anti-humano foi construído ligando z106 a jusante de Q407. Os genes J142-G4d, J142-z72 e J142-z73 da cadeia H do anticorpo F.X anti-humano foram construídos ligando respectivamente G4d, z72, e z73 a jusante de J142. O gene J300-z107 da cadeia H do anticorpo F.X anti-humano foi construído ligando z107 a jusante de J300. Os genes MRA-G1d, MRA-z106 e MRA-z107A da cadeia H do anticorpo antireceptor de interleucina-6 humano foram construídos ligando respectivamente G1d, z106, e z107 a jusante de MRA-VH.

[000253] Os respectivos genes de anticorpo (Q153-G4d, Q153-z7, Q407-z106, J142-G4d, J142-z72, J142-z73, J300-z106, MRA-G1d, MRA-z106, MRA-z107, L180-k, L210-k e MRA-k) foram inseridos em vetores de expressão de células animais.

[000254] Os seguintes anticorpos foram expressos transientemente em células FreeStyle293 (Invitrogen) pela transfecção usando os vetores de expressão construídos. Como mostrado abaixo, os anticorpos foram denominados usando as combinações de genes de anticorpo transfectados.
MRA-G1d/MRA-k
MRA-z106/MRA-z107/MRA-k
Q153-G4d/J142-G4d/L180-k
Q153-G4d/J142-z72/L180-k
Q153-z7/J 142-z73/L180-k
Q407-z106/J300-z107/L210-k

[Exemplo 2] Avaliação das condições de eluição de cromatografia de afinidade em proteína A

[000255] Q153-G4d/J142-G4d/L180-k e Q153-G4d/J142-z72/L180-k foram expressos transientemente, e o meio da cultura celular FreeStyle293 resultante (a seguir abreviado como CM) foi usado como uma amostra para avaliar as condições de eluição da cromatografia de afinidade em proteína A. As amostras de CM foram filtradas por um filtro com um tamanho de poro de 0,22 μm, e carregadas para uma coluna rProtein A Sepharose Fast Flow (GE Healthcare) equilibrada com D-PBS. A coluna foi submetida a lavagens 1 e 2 e eluições 1 a 5 de uma maneira gradual como mostrado na Tabela 1. O volume de CM a ser carregado para a coluna foi ajustado para 20 mg anticorpo/ml de resina. As frações eluídas sob cada condição foram coletadas, e as respectivas frações eluídas foram analisadas por cromatografia de troca catiônica para identificar seus componentes. Para preparar controles, cada CM foi carregado em resina rProtein G Sepharose Fast Flow (GE Healthcare). As amostras purificadas por eluição descontínua foram usadas como controles. Uma vez que a proteína o G liga-se ao domínio Fab de um anticorpo, todas as espécies de anticorpo (um anticorpo biespecífico de interesse no qual os dois tipos de cadeias H se associam de uma maneira heteromérica (anticorpo heteromérico) e como uma impureza, anticorpos homoméricos monoespecíficos em que cadeias H tipo simples são homomericamente associadas) no CM pode ser purificado usando proteína G, apesar da sua afinidade de ligação à proteína A.
Tabela 1

[000256] O CM no qual Q153-G4d/J142-G4d/L180-k ou Q153-G4d/J142-z72/L180-k tinha sido expresso foi eluído de uma coluna de proteína A (eluição 1 a 5), e as respectivas frações eluídas foram analisadas por cromatografia de troca catiônica. Quanto a Q153-G4d/J142-G4d/L180-k, a análise revelou que como a condição de eluição foi alterada de 1 a 5, isto é, como o pH do tampão de eluição foi reduzido, a composição de anticorpo das frações eluídas modificadas gradualmente na ordem do anticorpo homomérico J142-G4d/L180-k ao anticorpo heteromérico Q153-G4d/J142-G4d/L180-k, e em seguida ao anticorpo homomérico Q153-G4d/L180-k. Entende-se que a ordem de eluição é conforme a capacidade de ligação da proteína A. Isto implica que o anticorpo homomérico Q153-G4d/L180-k, que permaneceu ligado até exposto ao baixo pH, tem uma maior capacidade de ligação da proteína A do que as espécies homoméricas J142-G4d/L180-k (um anticorpo homomérico contra FX) eluído em um alto pH. Conhece-se que a região variável J142 é uma sequência incapaz de ligação à proteína A. Especificamente, a espécie homomérica J142-G4d/L180-k (um anticorpo homomérico contra FX) tem dois sítios de ligação à proteína A; o anticorpo heteromérico Q153-G4d/J142-G4d/L180-k tem três; e o anticorpo homomérico Q153-G4d/L180-k (anticorpo homomérico contra FX) tem quatro sítios de ligação à proteína A. Dessa forma, foi revelado que mais sítios de ligação à proteína A resultaram em ligação mais forte à proteína A, e dessa forma um pH mais baixo foi necessário para a eluição.

[000257] Entretanto, quanto a Q153-G4d/J142-z72/L180-k, foi revelado que como a condição de eluição foi alterada de 1 a 5, a composição de anticorpo na fração eluída modificada do anticorpo heteromérico Q153-G4d/J142-z72/L180-k ao anticorpo homomérico Q153-G4d/L180-k. O anticorpo homomérico J142-z72/L180-k (um anticorpo homomérico contra FX) quase não foi detectável em qualquer fração eluída. Isto sugere que J142-z72/L180-k não tem capacidade de ligação à proteína A. Acredita-se que a falta da capacidade de ligação à proteína A de J142-z72 poderia ser devido à mutação de substituição introduzida de Arg por His na posição 435 (numeração EU). O anticorpo homomérico J142-z72/L180-k (um anticorpo homomérico contra FX) não tem sítio de ligação à proteína A, enquanto o anticorpo heteromérico Q153-G4d/J142-z72/L180-k tem dois sítios de ligação à proteína A e o anticorpo homomérico Q153-G4d/L180-k (um anticorpo homomérico contra FIX) tem quatro. O anticorpo homomérico J142-z72/L180-k (um anticorpo homomérico contra FX) passa pela coluna porque não se liga à proteína A. Isto é a razão porque J142-z72/L180-k foi não detectável em qualquer fração eluída. Além disso, em ambos os casos de Q153-G4d/J142-G4d/L180-k e Q153-G4d/J142-z72/L180-k, foi sugerido que o anticorpo heteromérico e o anticorpo homomérico Q153-G4d/L180-k (um anticorpo homomérico contra o FIX) fossem separáveis um do outro em pH 3,6 ou um pH mais baixo.

[Exemplo 3] Isolamento e purificação de anticorpos heteroméricos por cromatografia em proteína A

[000258] As amostras de CM contendo os seguintes anticorpos foram usadas:
Q153-G4d/J142-G4d/L180-k
Q153-G4d/J142-z72/L180-k
Q153-z7/J 142-z73/L180-k
Q407-z106/J300-z107/L210-k

[000259] As amostras de CM foram filtradas por um filtro com um tamanho de poro de 0,22 μm, e carregadas para uma coluna rProtein A Sepharose Fast Flow (GE Healthcare) equilibrada com D-PBS. A coluna foi submetida a lavagens 1 e 2 e eluições 1 e 2 como mostrado na Tabela 2 (exceto que Q407-z106/J300-z107/L210-k foi submetido à eluição 1 somente). As condições de eluição foram determinadas baseadas no resultado descrito no Exemplo 2. O volume do CM a ser carregado para a coluna foi ajustado para 20 mg anticorpo/ml de resina. As respectivas frações eluídas sob cada condição foram coletadas e analisadas por cromatografia de troca catiônica para identificar seus componentes. Para preparar os controles, cada CM foi carregado em resina rProtein G Sepharose Fast Flow (GE Healthcare) da mesma maneira que descrito no Exemplo 2. As amostras purificadas pela eluição descontínua foram usadas como controles.
Tabela 2

[000260] O resultado da análise de cromatografia de troca catiônica de cada fração eluída é mostrado na Tabela 3 abaixo. Os valores representam a área de pico de eluição expresso em porcentagem. Exceto para o anticorpo Q153-G4d/J142-G4d/L180-k, os anticorpos homoméricos contra FX quase não foram detectáveis em qualquer fração eluída. Dessa forma, foi revelado que não somente o anticorpo homomérico J142-z72 (um anticorpo homomérico contra FX) descrito no Exemplo 2 mas também os anticorpos homoméricos J142-z73 e J300-z107 (um anticorpo homomérico contra FX) foram incapazes de ligação à proteína A. Acredita-se que a falta da capacidade de ligação à proteína A no anticorpo homomérico contra FX foi devido à mutação de substituição de Arg por His na posição 435 (numeração EU), que foi introduzida na região constante da cadeia H do anticorpo contra FX. O anticorpo heteromérico, que é um anticorpo biespecífico de interesse, foi detectado na maior parte na fração da eluição 1. Entretanto, a maioria dos anticorpos homoméricos contra FIX foram eluídos pela eluição 2, embora também fossem detectados em um nível muito baixo na fração de eluição 1. Quando comparado com Q153-G4d/J142-z72/L180-k, nos casos de Q153-z7/J142-z73/L180-k e Q407-z106/J300-z107/L210-k, a proporção do anticorpo heteromérico (o anticorpo biespecífico de interesse) foi consideravelmente aumentada na fração eluída em pH 3,6. Dessa forma, demonstrou-se que quando as mutações de substituição de Lys por Glu na posição 356 (numeração EU) e de Glu por Lys na posição 439 (numeração EU) para a formação eficiente de moléculas heteroméricas das respectivas cadeias H foram introduzidas em combinação com a mutação de substituição de Arg por His na posição 435 (numeração EU), o anticorpo heteromérico (anticorpo biespecífico de interesse) pode ser purificado a uma pureza de 98% ou mais pela etapa de purificação baseada em proteína A sozinha.

[000261] Como descrito acima, os presentes inventores revelaram que baseado em diferenças no número de sítios de ligação à proteína A entre o anticorpo heteromérico e anticorpos homoméricos, o anticorpo heteromérico pode ser isolado e purificado à alta pureza pela etapa de cromatografia em proteína A sozinha.
Tabela 3

Tabela 4

Tabela 5

Tabela 6

[Exemplo 4] Avaliação de farmacocinética em camundongos transgênicos com FcRn humano

[000262] Como descrito no Exemplo 3 acima, os presentes inventores demonstraram que usando z106 (SEQ ID NO: 13) e z107 (SEQ ID NO: 14) para as respectivas regiões constantes da cadeia H do anticorpo biespecífico, o anticorpo heteromérico (anticorpo biespecífico de interesse) pode ser purificado a uma pureza de 98% ou mais pela etapa em proteína A sozinha. Entretanto, a perda da afinidade de ligação à proteína A provavelmente resulta na perda da atividade de ligação a FcRn humano porque a proteína A e FcRn humano reconhecem o mesmo sítio em um anticorpo IgG (J Immunol. 2000, 164 (10):5313-8). De fato, há um método relatado para purificar um anticorpo biespecífico a uma pureza de 95% usando proteína A. O método usa uma cadeia H de IgG2b de rato que não se liga à proteína A. Catumaxomabe (um anticorpo biespecífico) purificado por este método tem uma meia-vida de aproximadamente 2,1 dias em seres humanos. Sua meia-vida é significativamente mais curta do que a meia-vida de uma IgG1 humana normal que é 2 a 3 semanas (Documento não Patente 2). Neste contexto, os anticorpos que têm z106 (SEQ ID NO: 13) e z107 (SEQ ID NO: 14) descritos no Exemplo 3 como regiões constantes foram avaliados para sua farmacocinética.

[000263] Em um experimento farmacocinético para calcular a meia-vida em seres humanos, a farmacocinética em camundongos transgênicos com FcRn humano (camundongos B6.mFcRn-/-.hFcRn linhagem Tg 276 +/+, Jackson Laboratories) foi avaliada pelo seguinte procedimento. MRA-G1d/MRA-k (a seguir abreviado como MRA-IgG1) tendo a região constante de IgG1 e MRA-z106/MRA-z107/MRA-k (a seguir abreviado como MRA-z106/z107) tendo z106/z107 como região constante foi cada um intravenosamente administrado uma vez em uma dose de 1 mg/kg para camundongos, e o sangue foi coletado em pontos de tempo apropriados. O sangue coletado foi imediatamente centrifugado em 15.000 rpm e 4°C por 15 minutos para obter o plasma sanguíneo. O plasma separado foi armazenado em um refrigerador a -20°C ou abaixo até o uso. A concentração plasmática foi determinada por ELISA.

[000264] MRA-IgG1 e MRA-z106/z107k foram avaliados por sua retenção plasmática em camundongos transgênicos com FcRn humano. Como mostrado na Fig. 1, o resultado indica que a retenção de MRA-z106/z107 no plasma foi comparável ou mais longa do que aquela de MRA-IgG1. Como descrito acima, z106/z107, uma região constante que permite a produção eficiente ou purificação do anticorpo heteromérico à alta pureza pela etapa de purificação baseada em proteína A sozinha, foi demonstrada ser comparável ou superior à IgG1 humana quanto a retenção plasmática.

[Exemplo 5] Construção de vetores de expressão dos genes de anticorpo e expressão dos respectivos anticorpos

[000265] As regiões variáveis de cadeia H de anticorpo usadas foram:
Q499 (a região variável de cadeia H de um anticorpo F.IX anti-humano, SEQ ID NO: 16).
J339 (a região variável de cadeia H de um anticorpo F.X anti-humano, SEQ ID NO: 17).

[000266] A cadeia L do anticorpo usada foi:
L377-k (a cadeia L comum a um anticorpo F.IX anti-humano e um anticorpo F.X anti-humano, SEQ ID NO: 18).

[000267] As regiões constantes da cadeia H do anticorpo usadas foram:
z118 (SEQ ID NO: 19), que foi construído de z106 descrito no Exemplo 1, introduzindo uma mutação de substituição de Phe por Leu na posição 405 (numeração EU);
z121 (SEQ ID NO: 20), que foi construído de z118 introduzindo uma mutação de substituição de Arg por His na posição 435 (numeração EU); e
z119 (SEQ ID NO: 21), que foi construído de z118 introduzindo mutações de substituição de Glu por Lys na posição 356 (numeração EU) e Lys por Glu na posição 439 (numeração EU).

[000268] Os genes Q499-z118 e Q499-z121 da cadeia H do anticorpo F.IX anti-humano foram construídos ligando respectivamente z118 e z121 a jusante de Q499. O gene J339-z119 da cadeia H do anticorpo F. X anti-humano foi construído ligando-se z119 a jusante de J339.

[000269] Cada um dos genes de anticorpo (Q499-z118, Q499-z121, J339-z119, e L377-k) foi inserido em um vetor de expressão de célula dos animais.

[000270] Os seguintes anticorpos foram expressos transientemente em células FreeStyle293 (Invitrogen) pela transfecção usando os vetores de expressão construídos. Como mostrado abaixo, os anticorpos foram denominados usando as combinações de genes de anticorpo transfectados.
Q499-z118/J339-z119/L377-k
Q499-z121/J339-z119/L377-k

[000271] Os dois anticorpos acima são somente diferentes no aminoácido da posição 435 no sistema de numeração EU na cadeia H do anticorpo F.IX anti-humano. z118 tem His na posição 435 e tem afinidade de ligação à proteína A. Entretanto, z121 tem Arg na posição 435, e é predito não ter atividade de ligação à proteína A baseado no achado descrito no Exemplo 2. Q499 é predito ligar-se à proteína A baseado na sua sequência. Dessa forma, quanto a Q499-z118/J339-z119/L377-k, a espécie homomérica J339-z119/L377-k (um anticorpo homomérico contra FX) tem dois sítios de ligação à proteína A; o anticorpo heteromérico Q499-z118/J339-z119/L377-k tem três; e o anticorpo homomérico Q499-z118/L377-k (anticorpo homomérico contra FIX) tem quatro sítios de ligação à proteína A. Entretanto, quanto a Q499-z121/J339-z119/L377-k introduzido com uma modificação que leva à perda da afinidade de ligação à proteína A, a espécie homomérica J339-z119/L377-k tem dois sítios de ligação à proteína A; o anticorpo heteromérico Q499-z121/J339-z119/L377-k tem dois; e o anticorpo homomérico Q499-z121/L377-k tem dois. Especificamente, mesmo se uma modificação que leva à perda da afinidade de ligação à proteína A (por exemplo, uma modificação que substitui Arg pelo aminoácido na posição 435, numeração EU) fosse introduzida somente na cadeia H que se liga à proteína A pela sua região variável, não produziria o efeito que permite o isolamento/purificação eficiente do anticorpo heteromérico à alta pureza pela etapa de purificação baseada em proteína A sozinha. Entretanto, a modificação que leva à perda da capacidade de ligação à proteína A pode produzir o efeito quando MabSelct SuRe (GE Healthcare) é usado. MabSelct SuRe é uma proteína A modificada incapaz de ligação a Q499 e um veículo cromatográfico para uso na purificação de anticorpos. O veículo foi desenvolvido para satisfazer condições. O ligante é uma proteína A recombinante que foi modificado por engenharia genética para ser resistente a condições alcalinas. A grande estabilidade de pH permite lavagem com NaOH eficiente e de baixo custo.

[000272] Além disso, o veículo é característico em que não se liga à região variável da cadeia pesada da subclasse VH3, tal como Q499. Com respeito a Q499-z118/J339-z119/L377-k, a espécie homomérica J339-z119/L377-k tem dois sítios de ligação MabSelct SuRe; o anticorpo heteromérico Q499-z118/J339-z119/L377-k tem dois; e o anticorpo homomérico Q499-z118/L377-k tem dois. Entretanto, quanto a Q499-z121/J339-z119/L377-k, a espécie homomérica J339-z119/L377-k tem dois sítios de ligação MabSelct SuRe; o anticorpo heteromérico Q499-z121/J339-z119/L377-k tem um sítio único; e o anticorpo homomérico Q499-z121/L377-k não tem nenhum sítio de ligação MabSelct SuRe. Especificamente, entende-se que combinando uma proteína A modificada incapaz de ligação à região variável de anticorpo, tal como MabSelct SuRe, com uma modificação que leva à perda da afinidade de ligação à proteína A, o anticorpo heteromérico pode ser eficientemente isolado e purificado à alta pureza pela etapa de purificação baseada em proteína A sozinha apesar da atividade de ligação à proteína A da região variável da cadeia pesada.

[Exemplo 6] Isolamento e purificação de anticorpos heteroméricos por cromatografia de afinidade usando proteína A modificada

[000273] O CM no qual Q499-z118/J339-z119/L377-k ou Q499-z121/J339-z119/L377-k tinha sido expresso foi submetido à cromatografia usando proteína A modificada. As amostras de CM foram filtradas por um filtro com um tamanho de poro de 0,22 μm, e carregadas para uma coluna Mab Select SuRe (GE Healthcare) equilibrada com D-PBS. A coluna foi submetida a lavagens 1 e 2 e eluição como mostrado na Tabela 7. A proteína A recombinante consiste em cinco domínios (A a E) que têm a atividade de ligação à IgG. Em Mab Select SuRe, o domínio B foi modificado por engenharia genética para ter uma estrutura tetramérica. Mab Select SuRe não tem afinidade para a região variável de anticorpo, e é vantajosa em que permite à eluição de anticorpo até sob condições mais brandas comparando com a proteína A convencional recombinante. Além disso, a resina melhorou a resistência alcalina e permite limpeza no lugar usando NaOH de 0,1 a 0,5 M, e é dessa forma mais adequada para a produção. No experimento descrito neste Exemplo como mostrado na Tabela 7, ácido acético 50 mM (o pH não foi ajustado e o pH medido foi aproximadamente 3,0) foi usado para eluição em vez de eluição gradual em pH 3,6 e pH 2,7 descrito no Exemplo 3. As respectivas frações eluídas foram coletadas e analisadas por cromatografia de troca catiônica para identificar seus componentes. Para preparar controles, cada CM foi carregado para resina rProtein G Sepharose Fast Flow (GE Healthcare) da mesma maneira que descrito no Exemplo 2. As amostras purificadas por eluição descontínua foram usadas como controles.

[000274] A seguir, as frações eluídas da proteína A foram submetidas à cromatografia de troca iônica. Uma coluna Sepharose High Performance SP (GE Healthcare) foi equilibrada com um tampão de equilíbrio (tampão fosfato de sódio 20 mM, pH 6,0). Então, frações eluídas da proteína A foram neutralizadas com Tris-HCl 1,5 M, (pH7.4), e diluídas três vezes com tampão de equilíbrio, e carregadas. Os anticorpos ligados à coluna foram eluídos com 25 volumes de coluna (CV) de um gradiente de concentração NaCl de 50 a 350 mM. As frações eluídas contendo anticorpo heteromérico foram purificadas por cromatografia de filtração em gel usando superdex200. As frações de monômero resultantes foram coletadas, e usadas na avaliação da farmacocinética em camundongos transgênicos com FcRn humano descritos no Exemplo 7.
Tabela 7

[000275] O resultado da análise de cromatografia de troca catiônica de cada fração eluída é mostrado nas Tabelas 8 e 9. Como mostrado na Tabela 8, com respeito a Q499-z118/J339-z119/L377-k, a proporção componente de cada fração eluída não é muito diferente daquela do controle. A razão consiste provavelmente em que as três espécies J339-z119/L377-k (um anticorpo homomérico contra F.X), Q499-z118/L377-k (um anticorpo homomérico contra F.IX) e Q499-z118/J339-z119/L377-k (um anticorpo heteromérico) tenham dois sítios de ligação da proteína modificada, e dessa forma não houve nenhuma diferença quanto a associação/dissociação durante a etapa de purificação baseada em proteína A.

[000276] Entretanto, no caso de Q499-z121/J339-z119/L377-k, a proporção de Q499-z121/L377-k (um anticorpo homomérico contra F.IX) na fração eluída foi significativamente reduzida quando comparada ao controle como mostrado na Tabela 9. Ao contrário, as proporções de J339-z119/L377-k (um anticorpo homomérico contra F.X) e Q499-z121/J339-z119/L377-k (um anticorpo heteromérico) na fração eluída foram relativamente aumentadas quando comparadas ao controle junto com uma redução de Q499-z121/L377-k. Acreditou-se que isto é em razão de J339-z119/L377-k (um anticorpo homomérico contra F.X) ter dois sítios de ligação à proteína A modificada e Q499-z121/J339-z119/L377-k (um anticorpo heteromérico) tem um. Entretanto, Q499-z121/L377-k (um anticorpo homomérico contra F.IX) não tem sítio de ligação, e consequentemente a maioria de Q499-z121/L377-k passou pela coluna sem ligar-se à proteína A modificada.

[000277] Como descrito acima, a presente invenção também demonstra que com respeito a anticorpos cujas regiões variáveis têm a atividade de ligação à proteína A, quando a proteína A modificada é combinada com uma modificação que leva à perda da afinidade de ligação à proteína A, um dos anticorpos homoméricos pode ser significativamente reduzido, e como isso a pureza do anticorpo heteromérico é aumentada pela etapa de purificação baseada em proteína A sozinha.
Tabela 8

Tabela 9

[Exemplo 7] Avaliação de farmacocinética em camundongos transgênicos com FcRn humano

[000278] Q499-z118/J339-z119/L377-k e Q499-z121/J339-z119/L377-k preparados como descritos no Exemplo 6 foram avaliados para sua farmacocinética.

[000279] Provavelmente será difícil ajustar a atividade de ligação à proteína A sem a perda da ligação de FcRn humana, porque a proteína A e FcRn humano reconhecem o mesmo sítio em um anticorpo IgG (J Immunol. 2000 164 (10):5313-8) como mostrado na Fig. 2. Conservar a afinidade de ligação para FcRn humano é muito importante para a retenção plasmática longa (meia-vida longa) em seres humanos, que é característico de anticorpos tipo IgG. Neste contexto, a farmacocinética foi comparada entre Q499-z118/J339-z119/L377-k e Q499-z121/J339-z119/L377-k preparados como descrito no Exemplo 6.

[000280] Em um experimento farmacocinético para predizer a meia-vida em seres humanos, a farmacocinética em camundongos transgênicos com FcRn humano (camundongos B6.mFcRn-/-.hFcRn linhagem Tg 276 +/+, Jackson Laboratories) foi avaliada pelo seguinte procedimento. Q499-z118/J339-z119/L377-k e Q499-z121/J339-z119/L377-k foram cada um intravenosamente administrados de uma vez em uma dose de 5 mg/kg para camundongos, e o sangue foi coletado em pontos de tempo apropriados. O sangue coletado foi imediatamente centrifugado em 15.000 rpm e 4°C por 15 minutos para obter o plasma sanguíneo. O plasma separado foi armazenado em um refrigerador a -20°C ou abaixo até o uso. A concentração de sangue foi determinada por ELISA.

[000281] Como mostrado na Fig. 3, o resultado indica que Q499-z118/J339-z119/L377-k e Q499-z121/J339-z119/L377-k foram comparáveis entre si quanto a retenção plasmática. Dessa forma, z121/z119, uma região constante na qual qualquer uma das cadeias H é introduzida com uma modificação que leva à perda da capacidade de ligação à proteína A foi demonstrada ser comparável quanto a retenção plasmática com z118/z119 que não tem a modificação que leva à perda da afinidade de ligação à proteína A. Como descrito acima, os presentes inventores revelaram uma modificação (por exemplo, uma mutação de substituição de Arg por aminoácido na posição 435, numeração EU) que leva à perda da capacidade de ligação à proteína A mas não tem nenhuma influência na farmacocinética, e que permite isolamento/purificação eficiente do anticorpo heteromérico à alta pureza pela etapa de purificação baseada em proteína A sozinha apesar da região variável.

[Exemplo 8] Introdução de mutações no domínio CH3 de GC33-IgG1-CD3-scFv e preparação de moléculas projetadas através da etapa de purificação baseada em proteína A sozinha Introdução de mutações de purificação baseada em proteína A da molécula GC33-IgG1-CD3-scFv

[000282] Os inventores projetaram um molécula de anticorpo IgG anti-GPC3 na qual um anticorpo scFv anti-CD3 é ligado a uma das duas cadeias H (Fig. 4). Esperou-se que esta molécula fosse capaz de matar células de câncer recrutando células T para células de câncer pela ligação divalente a glipicano-3 (GPC3), um antígeno específico para o câncer, e ligação monovalente a CD3, um antígeno de célula T Um anticorpo scFv anti-CD3 deve ser ligado a somente uma das duas cadeias H para alcançar a ligação monovalente a CD3. Neste caso, é necessário purificar a molécula formada através da associação heteromérica de dois tipos de cadeias H.

[000283] Dessa forma, usando o mesmo método descrito no Exemplo 3, uma mutação de substituição de Arg por His na posição 435 (numeração EU) foi introduzida em uma das cadeias H. Além disso, a mutação acima foi combinada com as mutações (uma substituição de Lys por Asp na posição 356, numeração EU, é introduzida em uma cadeia H e uma substituição de Glu por Lys na posição 439, numeração EU, é introduzida em outra cadeia H) descrita em WO 2006/106905 (PROCESS FOR PRODUCTION OF POLYPEPTIDE BY REGULATION OF ASSEMBLY) como uma modificação para aumentar a associação heteromérica de duas cadeias H. Os presentes inventores testaram se foi possível com as mutações combinadas purificarem a molécula de interesse por cromatografia em proteína A sozinha.

Construção de vetores de expressão de genes de anticorpo e expressão de respectivos anticorpos

[000284] O gene que codifica GPC3 (região variável de cadeia H do anticorpo Glipicano-3 anti-humano, SEQ ID NO: 22) como uma região variável da cadeia H do anticorpo foi construído por um método conhecido pelos versados na técnica. Além disso, o gene que codifica GC33-k0 (cadeia L do anticorpo Glipicano-3 anti-humano, SEQ ID NO: 23) como uma cadeia L do anticorpo foi construído por um método conhecido pelos versados na técnica. Além disso, os genes descritos abaixo foram construídos como uma região constante da cadeia H do anticorpo por um método conhecido pelos versados na técnica.
LALA-G1d (SEQ ID NO: 24), que foi construído de IgG1 substituindo Ala por Leu nas posições 234 e 235 (numeração EU), e Ala por Asn na posição 297 (numeração EU), e eliminação de Gly e Lys C-terminais
LALA-G1d-CD3 (SEQ ID NO: 25), que foi construído de LALA-G1D ligando um scFv anti-CD3 (no qual a região variável de cadeia H do anticorpo CD3 anti-humano é ligada através de um ligante peptídico ao terminal C da região variável de cadeia L do anticorpo CD3 anti-humano)
LALA-G3S3E-G1d (SEQ ID NO: 26), que foi construído de LALA-G1D substituindo Arg por His na posição 435 (numeração EU) e Glu por Lys na posição 439 (numeração EU); e
LALA-S3K-G 1d-CD3 (SEQ ID NO: 27), que foi construído de LALA-G1D-CD3 substituindo Lys por Asp na posição 356 (numeração EU).

[000285] Os genes NTA1L e NTA1R da cadeia H do anticorpo GPC3 anti-humano foram construídos ligando respectivamente LALA-G1d-CD3 (no qual um anticorpo scFv anti-CD3 é ligado à cadeia H região constante) e LALA-G1d (uma região constante da cadeia H) a jusante de GPC3, que é a região variável da cadeia H de um anticorpo Glipicano-3 anti-humano. Além disso, os genes NTA2L e NTA2R da cadeia H do anticorpo GPC3 anti-humano foram construídos ligando um anticorpo scFv anti-CD3 a jusante de GPC3 como uma região constante da cadeia H, e ligando LALA-S3K-G1d-CD3 introduzida com uma mutação de substituição de Lys por Asp na posição 356 (numeração EU) ou LALA-G3S3E-G1d introduzida com mutações de substituição de Arg por His na posição 435 (numeração EU) e de Glu por Lys na posição 439 (numeração EU). Os genes construídos foram listados abaixo.
cadeia H
NTA1L・ F GPC3-LALA-G1d-CD3
NTA1R・ F GPC3-LALA-G1d
NTA2L・ F GPC3-LALA-S3K-G1d-CD3
NTA2R・ F GPC3-LALA-G3S3E-G1d
cadeia L
GC33-k0

[000286] Cada um dos genes de anticorpo (cadeias H: NTA1L, NTA1R, NTA2L, e NTA2R; cadeia L: GC33-k0) foi inserido em um vetor de expressão de células animais. Usando um método conhecido pelos versados na técnica, os anticorpos listados abaixo foram expressos transientemente em células FreeStyle293 (Invitrogen) transfectando as células com os vetores de expressão construídos. Como mostrado abaixo, os anticorpos foram denominados usando as combinações de genes de anticorpo transfectados (primeira cadeia H/segunda cadeia H/cadeia L).
NTA1L/NTA1R/GC33-k0
NTA2L/NTA2R/GC33-k0

Purificação proteica das amostras expressas e avaliação de rendimento de heterodímero

[000287] Os sobrenadantes de cultura de células FreeStyle293 (CM) contendo os seguintes anticorpos foram usados como uma amostra.
NTA1L/NTA1R/GC33-k0
NTA2L/NTA2R/GC33-k0

[000288] As amostras de CM foram filtradas por um filtro com um tamanho de poro de 0,22 μm, e carregadas para uma coluna rProtein A Sepharose Fast Flow (GE Healthcare) equilibrada com D-PBS. A coluna foi submetida a lavagens 1 e 2 e eluição 1 como mostrado na Tabela 10. O volume do CM a ser carregado para a coluna foi ajustado para 20 mg anticorpo/ml de resina. As respectivas frações eluídas sob cada condição foram coletadas e analisadas por cromatografia por exclusão de tamanho para identificar seus componentes.
Tabela 10

[000289] O resultado da cromatografia por exclusão de tamanho de cada fração eluída é mostrado na Fig. 5 e na Tabela 11 abaixo. Os valores representam a área de pico de eluição expresso em porcentagem. Para NTA1L/NTA1 R/GC33-k0 e NTA2L/NTA2R/GC33-k0, os anticorpos homoméricos (anticorpos com NTA1L homomérico ou NTA2L homomérico) que têm o anticorpo scFv anti-CD3 em ambas as cadeias quase não foram detectáveis. Pensa-se que isto é causado pelo nível de expressão extremamente baixo das cadeias H contendo o anticorpo scFv anti-CD3 porque o nível de expressão de uma molécula de scFv geralmente é baixo. Quanto a anticorpos homoméricos que não contêm o anticorpo scFv anti-CD3 nas suas duas cadeias, aproximadamente 76% do anticorpo homomérico NTA1R foi observado no caso de NTA1L/NTA1R/GC33-k0, enquanto somente aproximadamente 2% do anticorpo NTA2R homomérico foi observado no caso de NTA2L/NTA2R/GC33-k0. Dessa forma, a presente invenção demonstrou que quando as mutações de substituição de Lys por Glu na posição 356 (numeração EU) e de Glu por Lys na posição 439 (numeração EU) para a formação eficiente de moléculas heteroméricas das respectivas cadeias H, foram combinadas com a mutação de substituição de Arg por His na posição 435 (numeração EU), o anticorpo heteromérico (anticorpo biespecífico de interesse) pode ser eficientemente purificado a uma pureza de 98% ou mais pela etapa de purificação baseada em proteína A sozinha.
Tabela 11

[Exemplo 9] Introdução de mutações no domínio CH3 de anticorpos monovalentes e preparação de moléculas projetadas pela etapa de purificação baseada em proteína A sozinha Introdução de mutações da purificação de moléculas de anticorpo monovalente usando proteína A

[000290] Um anticorpo IgG anti-GPC3 ordinário liga-se divalentemente via duas cadeias H a glipicano-3 (GPC3), um antígeno específico para o câncer. No experimento descrito neste Exemplo, os inventores projetaram e avaliaram um molécula de anticorpo IgG anti-GPC3 (Fig. 6) que monovalentemente se liga a glipicano-3. Acredita-se que quando comparada com anticorpos divalentes ordinários, a ligação monovalente da molécula a glipicano-3 (GPC3), um antígeno específico para o câncer, foi baseada em afinidade e não em avidez. Dessa forma, foi esperado que a molécula fosse capaz de ligação ao antígeno sem reticulação. Para alcançar a ligação monovalente de duas cadeias H a glipicano-3 (GPC3), cada uma tem que ser uma cadeia H consistindo de um domínio de dobradiça-Fc que não tem a região variável e domínio CH1, enquanto a outra é uma cadeia H ordinária. Neste caso, é necessário purificar a molécula que resulta da associação heteromérica de dois tipos de cadeias H.

[000291] Dessa forma, usando o mesmo método que descrito no Exemplo 3, uma mutação de substituição de Arg por His na posição 435 (numeração EU) foi introduzida em uma das cadeias H. Além disso, a mutação acima foi combinada com as mutações (uma substituição de Lys por Asp na posição 356, numeração EU, é introduzido em uma cadeia H e uma substituição de Glu por Lys na posição 439, numeração EU, é introduzida em outra cadeia H) descrita em WO 2006/106905 (PROCESS FOR PRODUCTION OF POLYPEPTIDE BY REGULATION OF ASSEMBLY) como uma modificação para aumentar a associação heteromérica de duas cadeias H. Os presentes inventores avaliaram se foi possível com as mutações combinadas purificar a molécula de interesse por cromatografia em proteína A sozinha.

Construção de vetores de expressão de genes de anticorpo e expressão dos respectivos anticorpos

[000292] A região variável da cadeia H do anticorpo usada foi:
GPC3 (a região variável de cadeia H de um anticorpo Glipicano-3 anti-humano, SEQ ID NO: 22).

[000293] A cadeia L do anticorpo usada foi:
GC33-k0 (a cadeia L de um anticorpo Glipicano-3 anti-humano, SEQ ID NO: 23).

[000294] As regiões constantes da cadeia H do anticorpo usadas foram:
LALA-G1d (SEQ ID NO: 24), que foi construído de IgG1 introduzindo mutações de substituição de Ala por Leu nas posições 234 e 235 (numeração EU), e de Ala por Asn na posição 297 (numeração EU), e eliminação de Gly e Lys C-terminais;
LALA-G3-G1d (SEQ ID NO: 28), que foi construído de LALA-G1D introduzindo uma mutação de substituição de Arg por His na posição 435 (numeração EU);
LALA-G3S3E-G1d (SEQ ID NO: 26), que foi construído de LALA-G3-G1D introduzindo uma mutação de substituição de Glu por Lys na posição 439 (numeração EU);
LALA-G1Fc (SEQ ID NO: 2), que foi construído de LALA-G1D deletando a região de posições 1 a 215 (numeração EU); e
LALA-G1Fc-S3K (SEQ ID NO: 30), que foi construído de G1Fc introduzindo uma mutação de substituição de Lys por Asp na posição 356 (numeração EU).

[000295] Os genes NTA4L-cont, NTL4L-G3, e NTA4L da cadeia H do anticorpo GPC3 anti-humano foram construídos ligando-se a jusante de GPC3 (a região variável de cadeia H de um anticorpo Glipicano-3 anti-humano), respectivamente, LALA-G1d (uma cadeia H região constante), LALA-G3-G1d introduzido com uma mutação de substituição de Arg por His na posição 435 (numeração EU), e LALA-G3S3E-G1d introduzido com mutações de substituição de Arg por His na posição 435 (numeração EU) e de Glu por Lys na posição 439 (numeração EU). Além disso, os genes de Fc NTA4R-cont e NTA4R foram construídos usando LALA-G1Fc (um domínio Fc de dobradiça anti-humano) e LALA-G1Fc-S3K (um domínio Fc de dobradiça introduzido com uma mutação de substituição de Lys por Asp na posição 356, numeração EU). Os genes construídos são:
cadeia H
NTA4L-cont・ F GPC3-LALA-G1d
NTA4L-G3 ・ F GPC3-LALA-G3-G1d
NTA4L ・ F GPC3-LALA-G3S3E-G1 d
NTA4R-cont: LALA-G1Fc
NTA4R: LALA-G1Fc-S3K
cadeia L
GC33-k0

[000296] Os genes de anticorpo (NTA4L, NTA4L-cont, NTA4L-G3, NTA4R, NTA4R-cont, e GC33-k0) foram cada um inseridos em um vetor de expressão de células animais.

[000297] Os seguintes anticorpos foram expressos transientemente em células FreeStyle293 (Invitrogen) pela transfecção usando os vetores de expressão construídos. Como mostrado abaixo, os anticorpos foram denominados usando as combinações de genes de anticorpo transfectados.
NTA4L-cont/NTA4R-cont/GC33-k0
NTA4L-G3/NTA4R-cont/GC33-k0
NTA4L/NTA4R/GC33-k0

Purificação proteica de amostras expressas e avaliação de rendimento de heterodímero

[000298] O CM contendo o seguinte anticorpo foi usado como uma amostra:
NTA4L-cont/NTA4R-cont/GC33-k0
NTA4L-G3/NTA4R-cont/GC33-k0
NTA4L/NTA4R/GC33-k0

[000299] As amostras de CM foram filtradas por um filtro com um tamanho de poro de 0,22 μm, e carregadas para uma coluna rProtein A Sepharose Fast Flow (GE Healthcare) equilibrada com D-PBS. A coluna foi submetida a lavagens 1 e 2 e eluição 1 como mostrado na Tabela 12. O volume do CM a ser carregado para a coluna foi ajustado para 20 mg anticorpo/ml de resina. As respectivas frações eluídas sob cada condição foram coletadas e analisadas por cromatografia por exclusão de tamanho para identificar seus componentes.
Tabela 12

[000300] O resultado da análise de cromatografia por exclusão de tamanho de cada fração eluída é mostrado na Fig. 7 e na Tabela 13 abaixo. Os valores representam a área de pico de eluição expressa em porcentagem.

[000301] Quanto a NTA4L-cont/NTA4R-cont/GC33-k0, o anticorpo homomérico que divalentemente se liga a GPC3 (anticorpo homomérico NTA4L-cont) e a molécula homomérica que não tem domínio de ligação a GPC3 (anticorpo homomérico NTA4R-cont) foi eluído, enquanto o anticorpo heteromérico de interesse, NTA4L-cont/NTA4R-cont, contabilizou somente 46,5%.

[000302] No caso de NTA4L-G3/NTA4R-cont/GC33-k0, o anticorpo homomérico que divalentemente se liga a GPC3 (anticorpo homomérico NTA4L-G3) quase não foi detectável, enquanto a molécula homomérica que não tem domínio de ligação a GPC3 (anticorpo homomérico NTA4R-cont) foi abundante. O anticorpo heteromérico de interesse, NTA4L-G3/NTA4R-cont, contabilizou 66,7%. No caso de NTA4L/NTA4R/GC33-k0, o anticorpo homomérico que divalentemente se liga a GPC3 (anticorpo homomérico NTA4L) quase não foi detectável, e a proporção da molécula homomérica que não tem domínio de ligação a GPC3 (NTA4R) foi consideravelmente reduzida, resultando em um aumento significante de até 93,0% na proporção do anticorpo heteromérico de interesse, NTA4L/NTA4R. Dessa forma, a presente invenção demonstrou que quando as mutações de substituição de Lys por Asp na posição 356 (numeração EU) e de Glu por Lys na posição 439 (numeração EU) para a formação eficiente de moléculas heteroméricas das respectivas cadeias H foram introduzidas em combinação com a mutação de substituição de Arg por His na posição 435 (numeração EU), o anticorpo heteromérico (um anticorpo biespecífico de interesse) pode ser eficientemente purificado a uma pureza de 93% ou mais pela etapa de purificação baseada em proteína A sozinha.
Tabela 13

[Exemplo 10] Preparação de anticorpos heteroméricos por uma etapa de purificação por cromatografia de coluna em proteína A usando eluição de gradiente de pH

[000303] Como descrito no Exemplo 9, os presentes inventores demonstraram que no caso de um anticorpo tendo a região variável somente em um braço, o anticorpo heteromérico pode ser eficientemente purificado pela etapa de purificação baseada em proteína A sozinha combinando a mutação de substituição de Arg por His na posição 435 (numeração EU) com as mutações (uma substituição de Lys por Asp na posição 356, numeração EU, é introduzida em uma cadeia H e uma substituição de Glu por Lys na posição 439, numeração EU, é introduzida em outra cadeia H) descritas em WO 2006/106905 (PROCESS FOR PRODUCTION OF POLYPEPTIDE BY REGULATION OF ASSEMBLY). Entretanto, o anticorpo heteromérico não é purificado a uma pureza suficientemente alta com a eluição 1 (tampão de eluição: 2 mM HCl, pH 2,7) sozinho. Uma etapa de purificação adicional é necessária.

[000304] Então, neste Exemplo, os presentes inventores avaliaram se o anticorpo heteromérico pode ser isolado e purificado à alta pureza por cromatografia de coluna em proteína A usando eluição com um gradiente de pH. Isto foi baseado supondo que mais sítios de ligação à proteína A levem à ligação mais forte do anticorpo heteromérico à proteína A, e como resultado, menor pH é necessário para a eluição. A purificação pode ser alcançada mais eficientemente com um custo mais baixo quando a pureza do anticorpo heteromérico pode ser aumentada a quase 100% usando tal eluição de gradiente de pH.

[000305] As amostras de CM contendo os seguintes anticorpos foram usadas:
NTA4L-cont/NTA4R-cont/GC33-k0
NTA4L-G3/NTA4R-cont/GC33-k0
NTA4L/NTA4R/GC33-k0

[000306] As amostras de CM foram filtradas por um filtro com um tamanho de poro de 0,22 μm, e carregadas para uma coluna HiTrap protein A HP (GE Healthcare) equilibrada com D-PBS. A coluna foi submetida a lavagens 1 e 2 sucessivamente, e em seguida eluição com um gradiente de pH usando eluição A e B como mostrado na Tabela 14. A eluição de gradiente de pH foi alcançada com o seguinte gradiente linear: eluição A / eluição B = (100:0) ↑ (30:70) por 35 minutos. As frações eluídas foram coletadas e analisadas por análise de cromatografia por exclusão de tamanho para identificar seus componentes.
Tabela 14

[000307] NTA4L-cont/NTA4R-cont/GC33-k0, NTA4L-G3/NTA4R-cont/GC33-k0 e NTA4L/NTA4R/GC33-k0 foram purificados por cromatografia de coluna em proteína A sob condição de eluição de gradiente de pH. Os cromatogramas resultantes são mostrados na Fig. 8. A eluição de NTA4L-cont/NTA4R-cont/GC33-k0 resultou em um largo pico. Entretanto, a eluição de gradiente de pH de NTA4L-G3/NTA4R-cont/GC33-k0 forneceu dois picos de eluição. Os picos do pH alto e baixo foram marcados como "eluição 1" e "eluição 2", respectivamente. O resultado para NTA4L/NTA4R/GC33-k0 foi aproximadamente o mesmo como aquele para NTA4L-G3/NTA4R-cont/GC33-k0, exceto que a área de pico da eluição 2 foi menor.

[000308] O resultado da análise de cromatografia por exclusão de tamanho de cada pico é mostrado na Tabela 15. NTA4L-cont/NTA4R-cont/GC33-k0 forneceu três componentes eluídos nesta ordem: um anticorpo homomérico que divalentemente se liga a GPC3 (anticorpo homomérico NTA4L-cont), um anticorpo heteromérico que se liga monovalentemente a GPC3 (anticorpo heteromérico NTA4L-cont/NTA4R-conc), e uma molécula homomérica que não tem domínio de ligação a GPC3 (anticorpo homomérico NTA4R-cont). Acredita-se que a razão porque estes componentes não foram separados pela eluição de gradiente de pH consiste em que têm o mesmo número (dois) de sítios de ligação à proteína A. Entretanto, foi revelado que na eluição 1 de NTA4L-G3/NTA4R-cont/GC33-k0, os níveis do anticorpo homomérico que divalentemente se liga a GPC3 (anticorpo homomérico NTA4L-G3) e molécula homomérica que não tem domínio de ligação a GPC3 (anticorpo homomérico NTA4R-cont) estavam abaixo do limite de detecção, enquanto o anticorpo heteromérico que monovalentemente se liga a GPC3 (anticorpo NTA4L-G3/NTA4R-conc heteromérico) contabilizou 99,6%. Na eluição 2, encontrou-se que a molécula homomérica que não tem domínio de ligação a GPC3 (anticorpo homomérico NTA4R-cont) contabilizava 98,8%. O anticorpo NTA4L-G3 homomérico passa pela coluna de proteína A porque não pode ligar-se à proteína A devido à mutação de substituição de Arg por His na posição 435 (numeração EU). Entretanto, o anticorpo heteromérico NTA4L-G3/NTA4R-conc tem um sítio de ligação à proteína A único, enquanto o anticorpo homomérico NTA4R-cont tem dois. Mais sítios de ligação à proteína A significam ligação mais forte à proteína A, e como resultado, pH mais baixo foi necessário para a eluição. Pensa-se que isto é a razão porque o anticorpo homomérico NTA4R-cont foi eluído em um pH mais baixo do que o anticorpo heteromérico NTA4L-G3/NTA4R-conc. Quase o mesmo resultado foi obtido para NTA4L/NTA4R/GC33-k0. O resultado da análise de cromatografia por exclusão de tamanho mostra que a proporção de componentes foi comparável com aquela de NTA4L-G3/NTA4R-cont/GC33-k0. Houve uma diferença entre cromatogramas de proteína A, e a proporção da área de pico da eluição 2 para eluição 1 foi menor em NTA4L/NTA4R/GC33-k0. A proporção de expressão do anticorpo homomérico NTA4R-cont, que é o componente principal da eluição 2, foi reduzida devido às mutações introduzidas para geração eficiente do anticorpo heteromérico NTA4L-G3/NTA4R-conc. As mutações de aminoácido descritas acima melhoraram o rendimento de purificação do anticorpo heteromérico e a robustez de purificação por cromatografia de coluna em proteína A com eluição de gradiente de pH.

[000309] Como descrito acima, os presentes inventores demonstraram que o anticorpo heteromérico pode ser eficientemente isolado e purificado à alta pureza pela etapa de purificação usando cromatografia de coluna em proteína A sozinha com eluição de gradiente de pH.
Tabela 15

[Exemplo 11] Introdução de mutação no domínio CH3 de proteína de fusão de receptor-Fc de Fcalfa monovalente e preparação de moléculas projetadas pela etapa de purificação baseada em proteína A sozinha

[000310] Introdução de mutação em domínio CH3 e preparação de proteína de fusão de receptor-Fc de Fcalfa monovalente pela etapa de purificação baseada em proteína A

[000311] As proteínas de fusão de receptor de Fc -Fc convencionais, tais como Eternercept e Abatacept são homodímeros que podem ligar-se divalentemente a ligantes. No experimento descrito neste Exemplo, os inventores projetaram e avaliaram uma proteína de fusão receptor de Fc-Fc que monovalentemente se liga a IgA como um ligante (Fig. 9). Para alcançar a ligação monovalente do receptor Fcalfa a IgA, uma das duas cadeias H da proteína de fusão receptor de Fc-Fc deve ser a cadeia H inteira tendo domínio dobradiça- Fc. Neste caso, é necessário purificar a molécula que resulta da associação heteromérica de dois tipos de cadeias H

[000312] Dessa forma, usando o mesmo método descrito no Exemplo 6, uma mutação de substituição de Arg por His na posição 435 (numeração EU) foi introduzida em uma das duas cadeias H. Além disso, a mutação acima foi combinada com mutações (uma substituição de Lys por Asp na posição 356, numeração EU, é introduzida em uma cadeia H e uma substituição de Glu por Lys na posição 439, a numeração EU é introduzida em outra cadeia H) descritas em WO 2006/106905 (PROCESS FOR PRODUCTION OF POLYPEPTIDE BY REGULATION OF ASSEMBLY) como uma modificação para aumentar a associação heteromérica de dois tipos de cadeias H. Os presentes inventores avaliaram se foi possível com as mutações combinadas purificar a molécula de interesse por cromatografia em proteína A sozinha.

[000313] O receptor de Fc usado foi FcalfaR (receptor de IgA1 humana, SEQ ID NO: 31). As regiões constantes da cadeia H de fusão usadas foram:
G1Fc (SEQ ID NO: 32), que é um domínio dobradiça-Fc humano construído de IgG1 deletando Gly e Lys C-terminais, e resíduos de posições 1 a 223 (numeração EU);
G1Fc-G3S3K (SEQ ID NO: 33), que foi construído de G1Fc introduzindo mutações de substituição de Lys por Asp na posição 356 (numeração EU) e de Arg por His na posição 435 (numeração EU); e
G1Fc-S3E (SEQ ID NO: 34), que foi construído de G1Fc introduzindo uma mutação de substituição de Glu por Lys na posição 439 (numeração EU).

[000314] As proteínas de fusão FcalfaR-Fc IAL-cont e IAL foram construídas ligando a jusante de FcalfaR através de um ligante polipeptídico (SEQ ID NO: 35), G1Fc (uma região constante da cadeia H) e G1Fc-G3S3K introduzido com mutações de substituição de Lys por Asp na posição 356 (numeração EU) e de Arg por His na posição 435 (numeração EU).

[000315] Além disso, os genes de Fc IAR-cont e IAR foram construídos para codificar G1Fc (um domínio dobradiça-Fc humano) e G1Fc-S3E (um domínio dobradiça Fc introduzido com uma mutação de substituição de Glu por Lys na posição 439, numeração EU), respectivamente. Os genes construídos foram:
cadeia H
IAL-cont ・ F FcalfaR-G1Fc
IAL・ F FcalfaR-G1Fc-G3S3K
IAR-cont: G1Fc
IAR: G1Fc-S3E

[000316] Os genes de anticorpo (IAL-cont, IAL, IAR-cont, e IAR) foram cada um inseridos em um vetor de expressão de células animais.

[000317] Os seguintes anticorpos foram expressos transientemente em células FreeStyle293 (Invitrogen) pela transfecção usando os vetores de expressão construídos. Como mostrado abaixo, os anticorpos foram denominados usando as combinações de genes de anticorpos transfectados.
IAL-cont/IAR-cont
IAL/IAR
Purificação de proteínas de amostra expressa e avaliação de rendimento de heterodímero
As amostras de CM contendo o seguinte anticorpo foram usadas:
IAL-cont/IAR-cont
IAL/IAR

[000318] As amostras de CM foram filtradas por um filtro com um tamanho de poro de 0,22 μm, e carregadas para uma coluna rProtein A Sepharose Fast Flow (GE Healthcare) equilibrada com D-PBS. A coluna foi submetida a lavagens 1 e 2 e eluição 1 como mostrado na Tabela 16. O volume do CM a ser carregado para a coluna foi ajustado para 20 mg anticorpo/ml de resina. As respectivas frações eluídas sob cada condição foram coletadas e analisadas por cromatografia por exclusão de tamanho para identificar seus componentes.
Tabela 16

[000319] O resutado da análise de cromatografia por exclusão de tamanho de cada fração eluída é mostrado na Fig. 10 e na Tabela 17 abaixo. Os valores representam a área de pico de eluição expressa na porcentagem. Quanto a IAL-cont/IAR-cont, um anticorpo homomérico que divalentemente se liga a IgA (anticorpo homomérico IAL-cont) e uma molécula homomérica que não tem nenhum sítio de ligação à IgA (anticorpo homomérico IAR-cont) foi eluído, enquanto o anticorpo heteromérico IAL-cont/IAR-cont de interesse contabilizou somente 30%. No caso de IAL/IAR, o anticorpo homomérico que divalentemente se liga a IgA (anticorpo homomérico IAL) não foi detectável, e a proporção da molécula homomérica que não tem nenhum sítio de ligação à IgA (anticorpo homomérico IAR) foi consideravelmente reduzida; dessa forma, o anticorpo heteromérico IAL/IAR de interesse foi significativamente aumentado até aproximadamente 96%. Dessa forma, a presente invenção demonstrou que quando as mutações de substituição de Lys por Asp na posição 356 (numeração EU) e de Glu por Lys na posição 439 (numeração EU) para a formação eficiente de moléculas heteroméricas das respectivas cadeias H foram introduzidas em combinação com a mutação de substituição de Arg por His na posição 435 (numeração EU), o anticorpo heteromérico, anticorpo biespecífico de interesse, pode ser eficientemente purificado a uma pureza de 95% ou mais pela etapa de purificação baseada em proteína A sozinha.
Tabela 17

[Exemplo 12] Construção de um anticorpo biespecífico tipo IgG de quatro cadeias Construção de vetores de expressão de genes de anticorpo e expressão de respectivos anticorpos

[000320] O anticorpo biespecífico contra F.IX humano e F.X humano, que foi projetado como descrito no Exemplo 1, consiste em uma cadeia L comum e dois tipos de cadeias H em que cada uma reconhece um antígeno diferente. Obter um anticorpo biespecífico com uma cadeia L comum não é fácil, porque é difícil para uma sequência da cadeia L comum reconhecer dois tipos diferentes de antígenos. Como descrito acima, obter uma cadeia L comum é extremamente difícil. Dessa forma, pode-se suspeitar que uma opção mais preferencial é um anticorpo biespecífico consistindo de dois tipos de cadeias H e dois tipos de cadeias L que reconhecem dois tipos de antígenos. Se dois tipos de cadeias H e dois tipos de cadeias L forem expressos, formarão dez tipos de moléculas de IgG H2L2 em combinações randômicas. É muito difícil purificar o anticorpo biespecífico de interesse de dez tipos de anticorpos.

[000321] No experimento descrito neste Exemplo, os presentes inventores prepararam e avaliaram anticorpos biespecíficos consistindo de dois tipos de cadeias H e dois tipos de cadeias L contra IL humano-6 receptor e glipicano-3 humano (GPC3). Para preparar eficientemente anticorpos biespecíficos consistindo de dois tipos de cadeias H e dois tipos de cadeias L, é necessário aumentar a associação de cadeias H e cadeias L contra o mesmo antígeno bem como a associação heteromérica de dois tipos de cadeias H. Além disso, é essencial que o anticorpo biespecífico com a combinação certa possa ser purificado dos produtos de expressão obtidos.

[000322] Para aumentar a associação entre cadeias H e cadeias L contra o mesmo antígeno, a região variável (VH) da cadeia H (GC33-VH-CH1-dobradiça-CH2-CH3) e a região variável (VL) da cadeia L (GC33-VL-CL) de GC33 (um anticorpo anti-GPC3) foram trocados entre si para produzir a cadeia H GC33-VL-CH1-dobradiça-CH2-CH3 e cadeia L (GC33-VH-CL) (o domínio VH e domínio VL foram trocados entre si). GC33-VL-CH1-dobradiça-CH2-CH3 associa-se com GC33-VH-CL; entretanto, sua associação com a cadeia L (MRA-VL-CL) do anticorpo anti-receptor de IL-6 é inibida devido à instabilidade da interação VL/VL. Do mesmo modo, a cadeia H (MRA-VH-CH1-dobradiça-CH2-CH3) do anticorpo anti-receptor de IL-6 associa-se com MRA-VL-CL; entretanto, sua associação com a cadeia L (GC33-VH-CL) do anticorpo anti-GPC3 é inibida devido à instabilidade da interação VH/VH. Como descrito acima, é possível aumentar a associação entre cadeias H e cadeias L contra o mesmo antígeno. Entretanto, a interação VH/VH e a interação VL/VL também ocorrem embora sejam menos estáveis do que a interação VH/VL FEBS Lett. 2003 Nov 20, 554(3):323-9; J Mol Biol. 2003 Oct 17, 333(2):355-65; for VL/VL, ver: J Struct Biol. 2002 Jun, 138(3):171-86; Proc Natl Acad Sci USA. 1985 Jul, 82(14):4592-6), e dessa forma embora não frequentemente, desfavorável mesmo a associação de cadeias H e cadeias L também ocorra. Por isso, embora a porcentagem do anticorpo biespecífico de interesse seja aumentada trocando simplesmente o domínio VH e domínio VL entre si, os produtos expressos ainda contêm aproximadamente dez tipos de combinações.

[000323] Em geral, é extremamente difícil purificar o anticorpo biespecífico de interesse de dez tipos. Entretanto, é possível melhorar a separação de dez tipos de componentes na cromatografia de troca iônica introduzindo uma modificação para que dez tipos de componentes cada um tenham um ponto isoelétrico diferente. Neste contexto, MRA-VH, que é a região variável de cadeia H de um anticorpo anti-receptor de IL-6, foi modificado para abaixar o ponto isoelétrico, e isto produziu H54-VH com um ponto isoelétrico mais baixo. Na mesma maneira, MRA-VL, que é a região variável de cadeia L de um anticorpo anti-receptor de IL-6, foi modificado para abaixar o ponto isoelétrico, e isto produziu L28-VL com um ponto isoelétrico mais baixo. Além disso, GC33-VH, que é a região variável de cadeia H de um anticorpo anti-GPC3, foi modificado para aumentar o ponto isoelétrico. Isto produziu Hu22-VH com um ponto isoelétrico aumentado.

[000324] A combinação das cadeias H e L de interesse foram melhoradas trocando o VH e VL entre as cadeias H e as cadeias L do anticorpo anti-GPC3. Entretanto, embora não frequentemente, a associação desfavorável de cadeia H / cadeia L ocorre porque é impossível suprimir completamente a interação H54-VH/Hu22-VH e a interação L28-VL/GC33-VL. Uma sequência de anticorpo ordinária tem glutamina na posição 39 em VH. Na interação VH/VH, acredita-se que glutaminas formam ligações de hidrogênio na interface VH/VH. Então, lisina foi substituída por glutamina na posição 39 (numeração Kabat) para prejudicar interação H54-VH/Hu22-VH. Espera-se dessa forma que a interação VH/VH fosse significativamente prejudicada devido à repulsão eletrostática entre duas lisinas na interface VH/VH. A seguir, H54-VH-Q39K e Hu22-VH-Q39K foram construídos substituindo lisina por glutamina na posição 39 (numeração Kabat) nas sequências de H54-VH e Hu22-VH. Do mesmo modo, uma sequência de anticorpo ordinária tem glutamina na posição 38 em VL. Na interação VL/VL, espera-se que glutaminas formem ligações de hidrogênio na interface de VL/VL. Então, ácido glutâmico foi substituído por glutamina na posição 38 (numeração Kabat) para prejudicar a interação L28-VL/GC33-VL. Espera-se dessa forma que a interação VL/VL fosse significativamente prejudicada devido à repulsão eletrostática entre dois ácidos glutâmicos na interface VL/VL. Após, L28-VL-Q38E e GC33-VL-Q38E foram construídos substituindo ácido glutâmico por glutamina na posição 39 (numeração Kabat) nas sequências de L28-VL e GC33-VL.

[000325] Para melhorar mais a eficiência da expressão/purificação do anticorpo biespecífico de interesse, uma mutação de substituição de Arg por His na posição 435 (numeração EU) foi introduzida em uma cadeia H usando o mesmo método descrito no Exemplo 3. Além disso, a mutação acima foi combinada com as mutações (uma substituição de Lys por Asp na posição 356, numeração EU, é introduzida em uma cadeia H e uma substituição de Glu por Lys na posição 439, numeração EU, é introduzida em outra cadeia H) descritas em WO 2006/106905 (PROCESS FOR PRODUCTION OF POLYPEPTIDE BY REGULATION OF ASSEMBLY) como uma modificação para aumentar a associação heteromérica de dois tipos de cadeias H. As mutações combinadas permitem a purificação da molécula que resulta da associação heteromérica de dois tipos de cadeias H por cromatografia em proteína A sozinha.

[000326] Especificamente, as regiões variáveis de cadeia H do anticorpo usadas foram:
MRA-VH (a região variável de cadeia H de um anticorpo anti-receptor de interleucina-6 humano, SEQ ID NO: 36);
GC33-VH (a região variável de cadeia H de um anticorpo anti-GPC3, SEQ ID NO: 37);
H54-VH (a região variável de cadeia H de um anticorpo anti-receptor de interleucina-6 humano, SEQ ID NO: 38) com um ponto isoelétrico mais baixo do que aquele de MRA-VH;
Hu22-VH (a região variável de cadeia H de um anticorpo anti-GPC3, SEQ ID NO: 39) com um ponto isoelétrico mais alto do que aquele de GC33-VH;
H54-VH-Q39K (SEQ ID NO: 40) onde Lys é substituída por Gln na posição 39 (numeração Kabat) na sequência de H54-VH; e
Hu22-VH-Q39K (SEQ ID NO: 41) onde Lys é substituída por Gln na posição 39 na sequência de Hu22-VH.

[000327] As regiões constantes da cadeia H do anticorpo seguintes também foram usadas:
IgG1-LALA-N297A-CH (SEQ ID NO: 42) onde Ala é substituída por Leu nas posições 234 e 235 (numeração EU), e Ala é substituída por Asn na posição 297 (numeração EU), e Gly e Lys C-terminais são deletadas na sequência da região constante da cadeia H de IgG1;
IgG1-LALA-N297A-CHr (SEQ ID NO: 43) onde a sequência de IgG1-LALA-N297A-CH tem dois resíduos extras de Ser no terminal N;
IgG1-LALA-N297A-s3-CH (SEQ ID NO: 44) onde Glu é substituída por Lys na posição 439 (numeração EU) na sequência de IgG1-LALA-N297A-CH; e
IgG1-LALA-N297A-G3s3-CHr (SEQ ID NO: 45) onde Lys é substituída por Asp na posição 356 (numeração EU) e Arg é substituída por His na posição 435 (numeração EU) na sequência de IgG1-LALA-N297A-CHr.

[000328] Entretanto, as regiões variáveis da cadeia L do anticorpo usadas foram:
MRA-VL (a região variável de cadeia L de um anticorpo anti-receptor de interleucina-6 humano, SEQ ID NO: 46);
GC33-VL (a região variável de cadeia L de um anticorpo anti-GPC3, SEQ ID NO: 47);
L28-VL (a região variável de cadeia L de um anticorpo antireceptor de interleucina-6 humano, SEQ ID NO: 48) com um ponto isoelétrico mais baixo do que aquele de MRA-VL;
L28-VL-Q38E (SEQ ID NO: 49) onde Glu é substituída por Gln na posição 38 (numeração Kabat) na sequência de L28-VL; e
GC33-VL-Q38E (SEQ ID NO: 50) onde Glu é substituída por Gln na posição 38 (numeração Kabat) na sequência de GC33-VL.

[000329] As regiões constantes da cadeia L do anticorpo seguintes também foram usadas.
IgG1-CL (a região constante da cadeia L de IgG1, SEQ ID NO: 51).
IgG1-CLr (SEQ ID NO: 52), que foi construído substituindo Arg e Thr por Ala e Ser C-terminais, respectivamente, na sequência de IgG1-CL.
Gene no1-Mh-H foi construído ligando IgG1-LALA-N297A-CH a jusante de MRA-VH. Gene no1-Mh-L foi construído ligando IgG1-CL a jusante de MRA-VL. Gene no1-Gh-H foi construído ligando IgG1-LALA-N297A-CH a jusante de GC33-VH. Gene no1-Gh-L foi construído ligando IgG1-CL a jusante de GC33-VL.
Gene no2-Gh-H foi construído ligando IgG1-LALA-N297A-CHr a jusante de GC33-VL. Gene no2-Gh-L foi construído ligando IgG1-CLr a jusante de GC33-VH.
Gene no3-Ml-H foi construído ligando IgG1-LALA-N297A-CH a jusante de H54-VH. Gene no3-Ml-L foi construído ligando IgG1-CL a jusante de L28-VL. Gene no3-Ghh-L foi construído ligando IgG1-CLr a jusante de Hu22-VH.
Gene no5-Ml-H foi construído ligando IgG1-LALA-N297A-s3-CH a jusante de H54-VH. Gene no5-Gh-H foi construído ligando IgGl -LALA-N297A-G3s3-CHr a jusante de GC33-VL.
Gene no6-Ml-H foi construído ligando IgG1-LALA-N297A-s3-CH a jusante de H54-VH-Q39K. Gene no6-Ml-L foi construído ligando IgG1-CL a jusante de L28-VL-Q38E. Gene no6-Gh-H foi construído ligando IgG1-LALA-N297A-G3s3-CHr a jusante de GC33-VL-Q38E. Gene no6-Ghh-L foi construído ligando IgG1-CLr a jusante de Hu22-VH-Q39K.

[000330] Os respectivos genes (no1-Mh-H, no1-Mh-L, no1-Gh-H, no1-Gh-L, no2-Gh-H, no2-Gh-L, no3-Ml-H, no3-Ml-L, no3-Ghh-L, no5-Ml-H, no5-Gh-H, no6-Ml-H, no6-Ml-L, no6-Gh-H, e no6-Ghh-L) foram inseridos em vetores de expressão de células animais.

[000331] As seguintes combinações de vetores de expressão foram introduzidas em células FreeStyle293-F para expressar transientemente cada molécula projetada.

A. Molécula projetada: no1 (Fig. 11)

[000332] Descrição: anticorpo anti-receptor de IL-6 natural/anti-GPC3 biespecífico.
Os polipeptídeos codificados por polinucleotídeos inseridos no vetor de expressão: no1-Mh-H (SEQ ID NO: 53), no1-Mh-L (SEQ ID NO: 54), no1-Gh-H (SEQ ID NO: 55), e no1-Gh-L (SEQ ID NO: 56).

B. Molécula projetada: no2 (Fig. 12)

[000333] Descrição: construída de no1 trocando os domínios VH e VL do anticorpo anti-GPC3.

[000334] Os polipeptídeos codificados por polinucleotídeos inseridos no vetor de expressão: no1-Mh-H, no1-Mh-L, no2-Gh-H (SEQ ID NO: 57), e no2-Gh-L (SEQ ID NO: 58).

C. Molécula projetada: no3 (Fig. 13)

[000335] Descrição: construída de no2 introduzindo modificações a cada cadeia para alterar seu ponto isoelétrico.

[000336] Os polipeptídeos codificados por polinucleotídeos inseridos no vetor de expressão: no3-Ml-H (SEQ ID NO: 59), no3-Ml-L (SEQ ID NO: 60), e no2-Gh-H, e no3-Ghh-L (SEQ ID NO: 61).

D. Molécula projetada: no5 (Fig. 14)

[000337] Descrição: construída de no3 introduzindo uma modificação para aumentar associação de cadeia H heteromérica e uma modificação que permite a purificação baseada em proteína A do anticorpo gerado via associação heteromérica.

[000338] Os polipeptídeos codificados por polinucleotídeos inseridos no vetor de expressão: no5-Ml-H (SEQ ID NO: 62), no3-Ml-L, no5-Gh-H (SEQ ID NO: 63), e no3-Ghh-L.

E. Molécula projetada: no6 (Fig. 15)

[000339] Descrição: construída de no5 introduzindo uma modificação para aumentar a associação entre uma cadeia H de interesse e uma cadeia L de interesse.

[000340] Os polipeptídeos codificados por polinucleotídeos inseridos no vetor de expressão: no6-Ml-H (SEQ ID NO: 64), no6-Ml-L (SEQ ID NO: 65), no6-Gh-H (SEQ ID NO: 66), e no6-Ghh-L (SEQ ID NO: 67).

[000341] Os sobrenadantes de cultura filtrados por um filtro com um tamanho de poro de 0,22 pm foram carregados na resina rProtein A Sepharose Fast Flow (GE Healthcare) equilibrada com o meio. A resina foi eluída de uma maneira descontínua para purificar as moléculas. Uma vez que a proteína G liga-se ao domínio Fab de um anticorpo, todas as espécies de anticorpo no CM podem ser purificadas com a proteína G apesar da afinidade para a proteína A.

[000342] Os anticorpos projetados (no1, no2, no3, no5, e no6) foram avaliados para sua expressão por cromatografia de troca catiônica (IEC) usando uma coluna WCX-10 ProPac (Dionex), uma coluna analítica. A cromatografia de troca catiônica foi realizada em uma taxa de fluxo de 0,5 ml/min com um gradiente adequado usando fase A móvel (MES-NaOH 20 mM, pH 6,1) e fase móvel B (MES-NaOH 20 mM, NaCl 250 mM, pH 6,1). O resultado da avaliação IEC de cada anticorpo é mostrado na Fig. 16. Anticorpo natural anti-receptor de IL-6/anti-GPC3 biespecífico no1 forneceu diversos picos em maior proximidade um do outro. Foi impossível determinar que pico corresponde ao anticorpo biespecífico de interesse. O mesmo aplicou-se a no2 que resulta da troca do domínio VH e domínio VL do anticorpo anti-GPC3 em no1. O pico do anticorpo biespecífico de interesse pode ser isolado pela primeira vez em no3 que foi modificado de no2 introduzindo uma modificação para alterar o ponto isoelétrico de cada cadeia de no2. A proporção do pico correspondente ao anticorpo biespecífico de interesse foi significativamente aumentada em no5 que foi construído de no3 introduzindo uma modificação para aumentar a associação heteromérica da cadeia H e uma modificação que permite purificação baseada em proteína A do anticorpo gerado via associação heteromérica. A proporção do pico correspondente ao anticorpo biespecífico de interesse foi ainda aumentada em no6 que foi construído de no5 introduzindo uma modificação que aumenta a associação entre a cadeia H e a cadeia L de interesse.

[000343] Então, os presentes inventores avaliaram se o anticorpo biespecífico de interesse pode ser purificado do CM no6 à alta pureza usando uma coluna de purificação. As amostras de CM foram filtradas por um filtro com um tamanho de poro de 0,22 μm e carregadas para uma coluna HiTrap protein A HP (GE Healthcare) equilibrada com D-PBS. A coluna foi submetida sucessivamente a lavagens 1 e 2 e eluição com um gradiente de pH usando eluição A e B como mostrado na Tabela 18. O gradiente de pH durante a eluição foi alcançado com o seguinte gradiente linear: eluição A/eluição B = (100:0)-> (35:65) por 40 minutos.
Tabela 18

[000344] O resultado da eluição de gradiente de pH de No6 é mostrado na Fig. 17. O anticorpo homomérico tendo a cadeia H do anticorpo anti-GPC3 que foi incapaz de ligação à proteína A passou por proteína A; o primeiro pico de eluição correspondeu ao anticorpo heteromérico tendo a cadeia H do anticorpo anti-GPC3 e a cadeia H do anticorpo anti-receptor de IL-6; e o segundo pico de eluição correspondeu ao anticorpo homomérico tendo as cadeias H do anticorpo anti-receptor de IL-6. Dessa forma, os presentes inventores demonstraram que substituindo Arg por His na posição 435 (numeração EU), o anticorpo heteromérico tendo a cadeia H do anticorpo anti-GPC3 e a cadeia H do anticorpo anti-receptor de IL-6 pode ser purificado pela etapa de purificação baseada em proteína A sozinha.

[000345] A primeira fração de eluição foi carregada para uma coluna HiTrap SP Sepharose HP (GE Healthcare) equilibrada com tampão de acetato de sódio 20 mM (pH 5,5). Após lavagem com o mesmo tampão, a coluna foi eluída com um gradiente de concentração de NaCl de 0 a 500 mM. O pico principal resultante foi analisado por cromatografia de troca catiônica da mesma maneira que descrito acima. O resultado é mostrado na Fig. 18. O anticorpo biespecífico de interesse foi demonstrado ser purificado a uma pureza muito alta.

Aplicabilidade Industrial

[000346] A presente invenção fornece métodos eficientes baseados na alteração da capacidade de ligação à proteína A, para produzir ou purificar multímeros polipeptídicos de alta pureza (anticorpos multiespecíficos) tendo a atividade da ligação a dois ou mais tipos de antígenos pela etapa de purificação baseada em proteína A sozinha. Usando os métodos da presente invenção, os multímeros polipeptídicos de interesse podem ser eficientemente produzidos ou purificados à alta pureza sem a perda de outros efeitos produzidos por mutações de aminoácido de interesse. Especialmente, quando os métodos são combinados com um método para regular a associação entre dois tipos de domínios proteicos, os multímeros polipeptídicos de interesse podem ser mais eficientemente produzidos ou purificados a uma pureza mais alta.

Claims

Método para produção de um multímero polipeptídico compreendendo um primeiro polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno e um segundo polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno ou nenhuma atividade de ligação ao antígeno, caracterizado pelo fato de que compreende as seguintes etapas:
- (a) expressar DNA que codifica o primeiro polipeptídeo e um DNA que codifica o segundo polipeptídeo; e
- (b) coletar o produto de expressão da etapa (a) usando cromatografia por afinidade com proteína A, em que o primeiro polipeptídeo e o segundo polipeptídeo compreendem uma sequência de aminoácidos de um domínio Fc do anticorpo ou uma sequência de aminoácidos de uma região constante da cadeia pesada do anticorpo,
em que o domínio Fc do anticorpo ou a região constante da cadeia pesada do anticorpo é derivada de IgG humana;
em que o resíduo de aminoácido na posição 435, de acordo com a numeração EU, na sequência de aminoácidos do domínio Fc ou da região constante da cadeia pesada é histidina ou arginina no primeiro polipeptídeo e arginina ou histidina, respectivamente, no segundo polipeptídeo; em que a combinação de aminoácidos nas posições 356 e 439 na sequência de aminoácidos da região Fc ou região constante da cadeia pesada do primeiro polipeptídeo foi modificada para aminoácidos com a mesma carga elétrica; e
em que a combinação de aminoácidos nas posições 356 e 439 na sequência de aminoácidos da região Fc ou região constante da cadeia pesada do segundo polipeptídeo foi modificada para aminoácidos com uma carga elétrica oposta àquela das posições 356 e 439 do primeiro polipeptídeo.
Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que
i) a pureza do multímero polipeptídico coletado é 95 % ou mais;
e/ou
ii) o primeiro polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno e o segundo polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno compreendem uma sequência de aminoácidos de uma região variável da cadeia pesada do anticorpo,
particularmente,
em que pelo menos um resíduo de aminoácido foi modificado nas sequências de aminoácido de FR1, CDR2 e FR3 da região variável da cadeia pesada do anticorpo;
e/ou
iii) em que o multímero polipeptídico compreende um ou dois terceiros polipeptídeos que têm uma atividade de ligação ao antígeno, e a etapa (a) compreende a expressão de DNA que codifica o terceiro polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno,
particularmente
a) em que o terceiro polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno compreende uma sequência de aminoácidos de uma cadeia leve de anticorpo,
e/ou
b) em que o multímero polipeptídico adicionalmente compreende um quarto polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno, e a etapa (a) compreende a expressão de DNA que codifica o quarto polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno,
especialmente
b1) em que pelo menos um dos terceiro e quarto polipeptídeos que têm uma atividade de ligação ao antígeno compreende uma sequência de aminoácidos de uma cadeia leve de anticorpo,
ou
b2) em que o primeiro polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno compreende sequências de aminoácido de uma região variável da cadeia leve do anticorpo e a região constante da cadeia pesada do anticorpo; o segundo polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno compreende uma sequência de aminoácidos de uma cadeia pesada de anticorpo; o terceiro polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno compreende sequências de aminoácido de uma região variável da cadeia pesada do anticorpo e uma região constante da cadeia leve do anticorpo; e o quarto polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno compreende uma sequência de aminoácidos de uma cadeia leve de anticorpo;
e/ou
iv) em que o multímero polipeptídico é um anticorpo multiespecífico,
particularmente em que o anticorpo multiespecífico é um anticorpo biespecífico.
Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 e 2 i) a 2 iv), caracterizado pelo fato de que compreende o primeiro polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno e o segundo polipeptídeo que não tem nenhuma atividade de ligação ao antígeno, e em que o primeiro polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno compreende uma sequência de aminoácidos de um domínio de ligação a antígeno de um receptor e uma sequência de aminoácidos de um domínio Fc do anticorpo, e o segundo polipeptídeo que não tem nenhuma atividade de ligação ao antígeno compreende uma sequência de aminoácidos de um domínio Fc do anticorpo.
Método para purificar um multímero polipeptídico compreendendo um primeiro polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno e um segundo polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno ou nenhuma atividade de ligação ao antígeno, caracterizado pelo fato de que compreende as seguintes etapas:
- (a) expressar o DNA que codifica o primeiro polipeptídeo e um DNA que codifica o segundo polipeptídeo; e
- (b) coletar o produto de expressão da etapa (a) por cromatografia por afinidade com proteína A, em que o primeiro polipeptídeo e o segundo polipeptídeo compreendem uma sequência de aminoácidos de um domínio Fc do anticorpo ou uma sequência de aminoácidos da região constante da cadeia pesada do anticorpo,
em que o domínio Fc do anticorpo ou a região constante da cadeia pesada do anticorpo é derivada de IgG humana;
em que o resíduo de aminoácido na posição 435, de acordo com a numeração EU, na sequência de aminoácidos do domínio Fc ou da região constante da cadeia pesada é histidina ou arginina no primeiro polipeptídeo e arginina ou histidina, respectivamente, no segundo polipeptídeo; em que a combinação de aminoácidos nas posições 356 e 439 na sequência de aminoácidos da região Fc ou região constante da cadeia pesada do primeiro polipeptídeo foi modificada para aminoácidos com a mesma carga elétrica; e
em que a combinação de aminoácidos nas posições 356 e 439 na sequência de aminoácidos da região Fc ou região constante da cadeia pesada do segundo polipeptídeo foi modificada para aminoácidos com uma carga elétrica oposta àquela das posições 356 e 439 do primeiro polipeptídeo.
Método de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que,
i) a pureza do multímero polipeptídico coletado é 95% ou mais;
e/ou
ii) o primeiro polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno e o segundo polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno compreende uma sequência de aminoácidos de uma região variável da cadeia pesada do anticorpo,
particularmente em que pelo menos um resíduo de aminoácido foi modificado na sequência de aminoácidos de FR1, CDR2 e FR3 da região variável da cadeia pesada do anticorpo;
e/ou
iii) o multímero polipeptídico compreende um ou dois terceiros polipeptídeos que têm uma atividade de ligação ao antígeno, e a etapa (a) compreende a expressão do DNA que codifica o terceiro polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno,
particularmente
a) em que o terceiro polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno compreende uma sequência de aminoácidos de uma cadeia leve de anticorpo,
e/ou
b) em que o multímero polipeptídico adicionalmente compreende um quarto polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno, e a etapa (a) compreende a expressão do DNA que codifica o quarto polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno,
especialmente
b1) em que pelo menos um dos terceiro e quarto polipeptídeos que têm uma atividade de ligação ao antígeno compreende uma sequência de aminoácidos de uma cadeia leve de anticorpo,
ou
b2) em que o primeiro polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno compreende sequências de aminoácidos de uma região de variável de cadeia leve de anticorpo e da região constante da cadeia pesada do anticorpo; o segundo polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno compreende uma sequência de aminoácidos de uma cadeia pesada de anticorpo; o terceiro polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno compreende sequência de aminoácidos de uma região variável da cadeia pesada do anticorpo e uma região constante da cadeia leve do anticorpo; e o quarto polipeptídeo tendo uma atividade de ligação ao antígeno compreende uma sequência de aminoácidos de uma cadeia leve de anticorpo;
e/ou
iv) o multímero polipeptídico é um anticorpo multiespecífico,
particularmente, em que o anticorpo multiespecífico é um anticorpo biespecífico.