KR20200038319A

KR20200038319A - 폴리펩티드 다량체를 정제하기 위한 폴리펩티드의 개변방법

Info

Publication number: KR20200038319A
Application number: KR1020207009446A
Authority: KR
Inventors: 도모유키 이가와; 젠지로 삼페이; 데츠야 와카바야시; 에리코 이토
Original assignee: 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤
Priority date: 2009-12-25
Filing date: 2010-12-24
Publication date: 2020-04-10
Also published as: US20220135618A1; EP2522724A1; AU2010336277B2; ES2777901T3; KR20120123055A; KR102380315B1; KR20180049249A; US20200207805A1; SI2522724T1; MX2012007497A; EP2522724B1; EP2522724A4; RU2606264C2; US20210040147A1; AU2010336277A1; HRP20200464T1; WO2011078332A1; US20170275332A1; BR112012017124B8; KR102103093B1

Abstract

프로테인 A에 대한 결합력을 개변함으로써, 2종류 이상의 항원에 대해 결합활성을 갖는 다중 특이성 항체를, 프로테인 A 정제공정으로만 고순도로 또한 효율적으로 정제 또는 제조하는 방법이 제공되었다. 본 발명의 다중 특이성 항체의 정제 또는 제조방법은, 항체 중쇄 불변영역 및/또는 항체 중쇄 가변영역의 아미노산 잔기를 개변하는 것을 특징으로 한다. 항체에 본 발명의 아미노산의 개변을 도입함으로써, 프로테인 A에 대한 결합력이 개변된 항체로서, 인간 IgG1과 동등 이상의 혈장중 체류성을 갖는 다중 특이성 항체를 고순도로 또한 효율적으로 취득할 수 있다.

Description

폴리펩티드 다량체를 정제하기 위한 폴리펩티드의 개변방법{Polypeptide modification method for purifying polypeptide multimers}

본 발명은, 폴리펩티드 다량체의 제조방법, 정제방법, 및 프로테인 A로의 결합력이 개변된 폴리펩티드 다량체 등에 관한 것이다.

인간 불변영역을 갖는 IgG 타입의 이중 특이성 항체(한쪽 팔이 항원 A에 대한 결합 특이성, 다른 쪽 팔이 항원 B에 대한 결합 특이성을 갖는 항체로서, 인간 불변영역을 갖는 IgG 타입의 항체)의 제작방법으로서, 지금까지 몇 가지 방법이 보고되어 있다. 일반적으로 IgG 타입의 이중 특이성 항체는, 2종류의 H쇄(즉 항원 A에 대한 H쇄와 항원 B에 대한 H쇄), 및 2종류의 L쇄(즉 항원 A에 대한 L쇄와 항원 B에 대한 L쇄)로 된다. 이러한 IgG 타입의 이중 특이성 항체를 발현시키는 경우, 2종류의 H쇄와 2종류의 L쇄를 발현시키기 위해, H2L2의 조합으로서는 10종류의 조합을 생각할 수 있다. 그 중 목적의 특이성(한쪽 팔이 항원 A에 대한 결합 특이성을 갖고, 다른 쪽 팔이 항원 B에 대한 결합 특이성)을 갖는 조합은 1종류이다. 이 때문에, 목적의 이중 특이성 항체를 취득하기 위해서는, 10종류의 항체로부터 1종류의 목적의 항체를 정제할 필요가 있어, 매우 효율이 낮고, 또한 곤란하다.

이 문제를 해결하는 방법으로서, 항원 A에 대한 L쇄와 항원 B에 대한 L쇄를 동일한 아미노산 서열로 한 공통 L쇄를 사용하는 방법이 보고되어 있다(특허문헌 1, 2). 이러한 공통 L쇄를 갖는 IgG 타입의 이중 특이성 항체를 발현시키는 경우, 2종류의 H쇄와 1종류의 공통 L쇄를 발현시키기 위해, H2L2의 조합으로서는, 3종류의 조합을 생각할 수 있다. 그 중 1종류가 목적의 이중 특이성 항체가 된다. 이들 3종류의 조합은, 항원 A에 대한 단일 특이성 항체(항원 A에 대한 H쇄의 호모 항체), 항원 A와 항원 B에 대한 이중 특이성 항체(항원 A에 대한 H쇄와 항원 B에 대한 H쇄의 헤테로 항체), 및 항원 B에 대한 단일 특이성 항체(항원 B에 대한 H쇄의 호모 항체)이다. 이들의 비율은 일반적으로 1:2:1이 되기 때문에, 목적의 이중 특이성 항체의 발현효율은 약 50%이다. 이 효율을 더욱 높이기 위해 2종류의 H쇄를 헤테로 회합화(會合化)시키는 방법이 보고되어 있다(특허문헌 3). 이것에 의해 목적의 이중 특이성 항체의 발현효율을 약 90~95%까지 높이는 것이 가능하다. 또한, 이들 2종류의 호모 항체의 불순물을 효율적으로 제거하는 방법으로서, 2종류의 H쇄의 가변영역에 아미노산 치환을 도입하여 등전점의 차를 부여함으로써, 2종류의 호모 항체와 목적의 이중 특이성 항체(헤테로 항체)를 이온 교환 크로마토그래피로 정제 가능하게 하는 방법이 보고되어 있다(특허문헌 4). 이들 방법을 조합함으로써, IgG 타입의 인간 불변영역을 갖는 항체의 이중 특이성 항체(헤테로 항체)를 효율적으로 제조하는 것이 가능해졌다.

한편, IgG 타입의 항체의 상업적 제조에 있어서는 반드시 프로테인 A 크로마토그래피에 의한 정제공정이 사용되고 있으나, 이온 교환 크로마토그래피는 정제공정에 반드시 사용되는 것은 아니다. 이 때문에, 이중 특이성 항체를 고순도로 제조하기 위해서 이온 교환 크로마토그래피를 사용하는 것은 제조 비용의 증대로 이어진다. 또한, 이온 교환 크로마토그래피만을 사용한 정제법의 경우는 의약품의 정제법으로서의 완건성(頑健性)을 확보하지 못할 가능성이 있어, 복수의 크로마토그래피 공정에서 불순물을 제거하는 것이 바람직하다.

어느 경우에도, 이온 교환 크로마토그래피와는 상이한 분리 모드를 갖는 크로마토그래피 공정에 있어서도 이중 특이성 항체를 고순도화할 수 있는 것이 바람직하고, 그 분리 모드로서 IgG 타입의 항체의 상업적 제조에 있어서는 반드시 사용되는 프로테인 A 크로마토그래피에 의해 이중 특이성 항체를 고순도화할 수 있는 것이 요망되고 있었다.

프로테인 A를 사용하여 이중 특이성 항체(헤테로 항체)를 정제하는 방법으로서, 지금까지, 프로테인 A에 결합하는 마우스 IgG2a의 H쇄와 프로테인 A에 결합하지 않는 랫트 IgG2b의 H쇄로 되는 이중 특이성 항체를 사용하는 방법이 보고되어 있다. 이 방법에 있어서, 프로테인 A 정제공정만을 사용하여 목적의 이중 특이성 항체를 95%의 순도까지 정제하는 것이 가능한 것이 보고되어 있다(비특허문헌 1, 특허문헌 5). 그러나 이 방법에 있어서는, 추가적으로 이중 특이성 항체의 순도를 높이기 위해, 이온 교환 크로마토그래피를 사용하고 있다. 즉, 프로테인 A 크로마토그래피에 의한 정제공정만으로는 고순도의 이중 특이성 항체의 정제는 달성하지 못하고 있다. 또한 전술한 방법으로 제작한 마우스 IgG2a의 H쇄와 랫트 IgG2b의 H쇄로 되는 이중 특이성 항체인 Catumaxomab은, 인간에 있어서의 반감기가 약 2.1일로, 통상의 인간 IgG1의 반감기 2~3주간과 비교하여 매우 짧다(비특허문헌 2). 반감기가 짧을뿐 아니라, 마우스 및 랫트의 불변영역을 사용하고 있는 것으로부터 면역원성이 매우 높다(비특허문헌 3). 따라서, 이러한 방법으로 얻어진 이중 특이성 항체는 의약품으로서 적합하지 않다고 생각되었다.

한편, 면역원성의 관점에서 프로테인 A에 결합하지 않는 불변영역으로서, 인간 IgG3 불변영역을 사용할 수 있을 가능성이 시사되어 있다(비특허문헌 1). 그러나, 인간 IgG1과 인간 IgG3에 있어서는 H쇄간의 회합이 거의 일어나지 않는 것이 알려져 있는 것으로부터(비특허문헌 1), 마우스 IgG2a의 H쇄와 랫트 IgG2b의 H쇄로 되는 이중 특이성 항체와 동일한 방법으로, 인간 IgG1의 H쇄와 인간 IgG3의 H쇄를 사용하여 목적의 이중 특이성 항체를 제조하는 것은 불가능하다. 또한, 일반적으로 인간 IgG3는 인간에 있어서의 반감기가 인간 IgG1, 인간 IgG2, 인간 IgG4와 비교하여 짧은 것이 보고되어 있다(비특허문헌 4, 5). 이 때문에, 인간 IgG3를 사용한 이중 특이성 항체는, 마우스 IgG2a와 랫트 IgG2b를 사용한 이중 특이성 항체와 동일하게 인간에 있어서의 반감기가 짧을 가능성을 생각할 수 있다. 인간 IgG1과 인간 IgG3에 있어서는 H쇄간의 회합이 거의 일어나지 않는 이유로서, 인간 IgG3의 힌지 서열이 원인일 가능성이 시사되어 있으나(비특허문헌 1), 인간 IgG3 불변영역의 반감기가 짧은 이유는 충분히 명확하게 되어 있지 않다. 이 때문에, 프로테인 A에 결합하지 않는 불변영역으로서, 인간 IgG3 불변영역을 사용한 이중 특이성 항체에 관한 보고는 지금까지 없다. 하물며, 인간 IgG1과 동일하게 긴 반감기를 나타내 인간 불변영역을 갖는 이중 특이성 항체를 프로테인 A 정제공정만으로 고순도로 또한 효율적으로 정제 또는 제조하는 방법에 관한 보고도 없다.

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98050431

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95033844

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The Journal of Immunology, 1995, 155:219-225 J Clin Oncol 26: 2008(May 20 suppl; abstr 14006) Clin Cancer Res 2007 13:3899-3905 Nat Biotechnol. 2007 Dec;25(12):1369-72 J. Clin Invest 1970; 49:673-80

일반적으로 IgG 타입의 통상의 항체는 프로테인 A 정제공정에 의해 IgG를 고순도로 또한 효율적으로 제조 가능하다. 그러나, 고순도의 이중 특이성 항체를 제조하기 위해서는, 이온 교환 크로마토그래피에 의한 정제공정을 추가할 필요가 있다. 이온 교환 크로마토그래피에 의한 정제공정의 추가는 제조의 복잡함과 제조 비용의 증대로 이어진다. 이 때문에, 프로테인 A 정제공정만으로 고순도의 이중 특이성 항체를 제조하는 것이 바람직하다. 본 발명의 목적은, 프로테인 A 정제공정만으로, 인간 항체 중쇄 불변영역을 갖는 IgG 타입의 항체의 이중 특이성 항체를, 고순도로 또한 효율적으로 정제 또는 제조하는 방법을 제공하는 것에 있다.

또한, Fc영역에 있어서의 프로테인 A 결합 부위는, Fc영역에 있어서의 FcRn 결합 부위와 동일한 것으로부터, 인간 FcRn으로의 결합을 유지한 채로 프로테인 A로의 결합 활성을 조정하는 것은 곤란하다고 예상된다. 인간 FcRn으로의 결합력의 유지는, IgG 타입의 항체의 특징인 인간에 있어서의 긴 혈장중 체류성(긴 반감기)에 매우 중요하다. 본 발명은, 인간 IgG1과 동등 이상의 혈장중 체류성을 유지한 이중 특이성 항체를, 프로테인 A 정제공정으로만 고순도로 또한 효율적으로 정제 또는 제조하는 방법을 제공한다.

본 발명자들은, 프로테인 A에 대한 결합력을 개변함으로써, 2종 이상의 항원에 결합 가능한 폴리펩티드 다량체, 특히 인간 불변영역(human constant region)을 갖는 IgG 타입의 다중 특이성 항체를, 프로테인 A 정제공정만으로 고순도로 또한 효율적으로 정제 또는 제조하는 방법을 발견하였다.

또한, 제1 항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드와 제2 항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드가 회합할 때 형성되는 계면을 구성하는 아미노산을 개변하여, 폴리펩티드간의 회합을 제어하는 방법과 조합함으로써, 목적의 폴리펩티드 다량체를 고순도로 또한 효율적으로 정제 또는 제조하는 것이 가능해졌다.

또한, 중쇄 불변영역에 있어서의 EU 넘버링 435번 위치의 아미노산 잔기를 개변함으로써, 인간 IgG1과 동등 이상의 혈장중 체류성을 유지하면서, 프로테인 A에 대한 결합력을 조정할 수 있는 것을 발견하였다. 당해 지견에 의해, 인간 IgG1과 동등 이상의 혈장중 체류성을 갖는 이중 특이성 항체를 고순도로 또한 효율적으로, 정제 또는 제조하는 것이 가능해졌다.

본 발명은 이러한 지견(知見)에 기초하는 것으로, 이하 [1] 내지 [55]를 제공한다.

[1] 제1 항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드 및 제2 항원 결합 활성을 갖거나 또는 항원 결합 활성을 갖지 않는 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드 다량체의 제조방법으로서, 그 방법은

(a) 제1 항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드를 코드하는 DNA 및 제2 항원 결합 활성을 갖거나 또는 항원 결합 활성을 갖지 않는 폴리펩티드를 코드하는 DNA를 발현시키는 공정, 및

(b) 공정(a)의 발현산물을 회수하는 공정,

을 포함하고,

제1 항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드 및 제2 항원 결합 활성을 갖거나 또는 항원 결합 활성을 갖지 않는 폴리펩티드의 프로테인 A로의 결합력에 차가 생기도록, 제1 항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드 및 제2 항원 결합 활성을 갖거나 또는 항원 결합 활성을 갖지 않는 폴리펩티드의 양쪽 또는 어느 한쪽에 있어서 1 또는 복수의 아미노산 잔기가 개변되어 있는,

방법.

[2] 공정(b)에 있어서, 발현산물이 프로테인 A 친화성 크로마토그래피를 사용하여 회수되는, [1]에 기재된 방법.

[3] 제1 항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드를 프로테인 A로부터 용출시키는 용매의 pH 및 제2 항원 결합 활성을 갖거나 또는 항원 결합 활성을 갖지 않는 폴리펩티드를 프로테인 A로부터 용출시키는 용매의 pH에 차가 생기도록, 제1 항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드 및 제2 항원 결합 활성을 갖거나 또는 항원 결합 활성을 갖지 않는 폴리펩티드의 양쪽 또는 어느 한쪽에 있어서 1 또는 복수의 아미노산 잔기가 개변되어 있는, [1] 또는 [2]에 기재된 방법.

[4] 제1 항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드 또는 제2 항원 결합 활성을 갖거나 또는 항원 결합 활성을 갖지 않는 폴리펩티드 중 어느 한쪽의 프로테인 A로의 결합력이 증가 또는 저하되도록, 제1 항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드 또는 제2 항원 결합 활성을 갖거나 또는 항원 결합 활성을 갖지 않는 폴리펩티드에 있어서 1 또는 복수의 아미노산 잔기가 개변되어 있는, [1] 내지 [3] 중 어느 하나에 기재된 방법.

[5] 제1 항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드 또는 제2 항원 결합 활성을 갖거나 또는 항원 결합 활성을 갖지 않는 폴리펩티드 중 어느 한쪽의 폴리펩티드의 프로테인 A로의 결합력이 증가하고, 다른 쪽의 폴리펩티드의 프로테인 A로의 결합력이 저하되도록, 제1 항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드 및 제2 항원 결합 활성을 갖거나 또는 항원 결합 활성을 갖지 않는 폴리펩티드에 있어서 1 또는 복수의 아미노산 잔기가 개변되어 있는, [1] 내지 [4] 중 어느 하나에 기재된 방법.

[6] 회수된 폴리펩티드 다량체의 순도가 95% 이상인, [1] 내지 [5] 중 어느 하나에 기재된 방법.

[7] 제1 항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드 및 제2 항원 결합 활성을 갖거나 또는 항원 결합 활성을 갖지 않는 폴리펩티드가 항체 Fc영역 또는 항체 중쇄 불변영역의 아미노산 서열을 포함하는, [1] 내지 [6] 중 어느 하나에 기재된 방법.

[8] 항체 Fc영역 또는 항체 중쇄 불변영역의 아미노산 서열에 있어서의 EU 넘버링 250~255번 위치, 308~317번 위치 및 430~436번 위치로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 잔기가 개변되어 있는, [7]에 기재된 방법.

[9] 제1 항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드 및 제2 항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드가 항체 중쇄 가변영역의 아미노산 서열을 포함하는, [1] 내지 [8] 중 어느 하나에 기재된 방법.

[10] 항체 중쇄 가변영역의 FR1, CDR2 및 FR3의 아미노산 서열에 있어서 하나 이상의 아미노산 잔기가 개변되어 있는, [9]에 기재된 방법.

[11] 폴리펩티드 다량체가 1개 또는 2개의 제3 항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드를 포함하고, 공정(a)가 당해 제3 항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드를 코드하는 DNA를 발현시키는 것을 포함하는, [1] 내지 [10] 중 어느 하나에 기재된 방법.

[12] 제3 항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드가 항체 경쇄의 아미노산 서열을 포함하는, [11]에 기재된 방법.

[13] 폴리펩티드 다량체가 제4 항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드를 추가로 포함하고, 공정(a)가 당해 제4 항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드를 코드하는 DNA를 발현시키는 것을 포함하는, [11] 또는 [12]에 기재된 방법.

[14] 제3 및 제4 항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드 중 하나 이상의 폴리펩티드가 항체 경쇄의 아미노산 서열을 포함하는, [13]에 기재된 방법.

[15] 제1 항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드가 항체 경쇄 가변영역과 항체 중쇄 불변영역의 아미노산 서열을 포함하고, 제2 항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드가 항체 중쇄의 아미노산 서열을 포함하며, 제3 항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드가 항체 중쇄 가변영역과 항체 경쇄 불변영역의 아미노산 서열을 포함하고, 제4 항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드가 항체 경쇄의 아미노산 서열을 포함하는, [13]에 기재된 방법.

[16] 폴리펩티드 다량체가 다중 특이성 항체인, [1] 내지 [15] 중 어느 하나에 기재된 방법.

[17] 다중 특이성 항체가 이중 특이성 항체인, [16]에 기재된 방법.

[18] 제1 항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드와 제2 항원 결합 활성을 갖지 않는 폴리펩티드를 가지며, 제1 항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드가 수용체의 항원 결합 도메인 및 항체 Fc영역의 아미노산 서열을 포함하고, 제2 항원 결합 활성을 갖지 않는 폴리펩티드가 항체 Fc영역의 아미노산 서열을 포함하는, [1] 내지 [8] 중 어느 하나에 기재된 방법.

[19] 항체 Fc영역 또는 항체 중쇄 불변영역이 인간 IgG 유래인, [7] 내지 [18] 중 어느 하나에 기재된 방법.

[20] [1] 내지 [19] 중 어느 하나에 기재된 방법에 의해 제조되는 폴리펩티드 다량체.

[21] 제1 항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드 및 제2 항원 결합 활성을 갖거나 또는 항원 결합 활성을 갖지 않는 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드 다량체의 정제방법으로서, 그 방법은

(b) 공정(a)의 발현산물을 프로테인 A 친화성 크로마토그래피에 의해 회수하는 공정,

을 포함하고,

방법.

[22] 제1 항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드 또는 제2 항원 결합 활성을 갖거나 또는 항원 결합 활성을 갖지 않는 폴리펩티드의 프로테인 A로의 결합력이 증가 또는 저하되도록, 제1 항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드 또는 제2 항원 결합 활성을 갖거나 또는 항원 결합 활성을 갖지 않는 폴리펩티드에 있어서 1 또는 복수의 아미노산 잔기가 개변되어 있는, [21]에 기재된 방법.

[23] 제1 항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드 또는 제2 항원 결합 활성을 갖거나 또는 항원 결합 활성을 갖지 않는 폴리펩티드 중 어느 한쪽의 폴리펩티드의 프로테인 A로의 결합력이 증가하고, 다른 쪽의 폴리펩티드의 프로테인 A로의 결합력이 저하되도록, 제1 항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드 및 제2 항원 결합 활성을 갖거나 또는 항원 결합 활성을 갖지 않는 폴리펩티드에 있어서 1 또는 복수의 아미노산 잔기가 개변되어 있는, [20] 또는 [21]에 기재된 방법.

[24] 회수된 폴리펩티드 다량체의 순도가 95% 이상인, [21] 내지 [23] 중 어느 하나에 기재된 방법.

[25] 제1 항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드 및 제2 항원 결합 활성을 갖거나 또는 항원 결합 활성을 갖지 않는 폴리펩티드가 항체 Fc영역 또는 항체 중쇄 불변영역의 아미노산 서열을 포함하는, [21] 내지 [24] 중 어느 하나에 기재된 방법.

[26] 항체 Fc영역 또는 항체 중쇄 불변영역의 아미노산 서열에 있어서의 EU 넘버링 250~255번 위치, 308~317번 위치 및 430~436번 위치로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 잔기가 개변되어 있는, [25]에 기재된 방법.

[27] 제1 항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드 및 제2 항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드가 항체 중쇄 가변영역의 아미노산 서열을 포함하는, [21] 내지 [26] 중 어느 하나에 기재된 방법.

[28] 항체 중쇄 가변영역의 FR1, CDR2 및 FR3의 아미노산 서열에 있어서 하나 이상의 아미노산 잔기가 개변되어 있는, [27]에 기재된 방법.

[29] 폴리펩티드 다량체가 1개 또는 2개의 제3 항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드를 포함하고, 공정(a)가 당해 제3 항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드를 코드하는 DNA를 발현시키는 것을 포함하는, [21] 내지 [28] 중 어느 하나에 기재된 방법.

[30] 제3 항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드가 항체 경쇄의 아미노산 서열을 포함하는, [29]에 기재된 방법.

[31] 폴리펩티드 다량체가 제4 항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드를 추가로 포함하고, 공정(a)가 당해 제4 항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드를 코드하는 DNA를 발현시키는 것을 포함하는, [29] 또는 [30]에 기재된 방법.

[32] 제3 및 제4 항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드 중 하나 이상의 폴리펩티드가 항체 경쇄의 아미노산 서열을 포함하는, [31]에 기재된 방법.

[33] 제1 항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드가 항체 경쇄 가변영역과 항체 중쇄 불변영역의 아미노산 서열을 포함하고, 제2 항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드가 항체 중쇄의 아미노산 서열을 포함하며, 제3 항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드가 항체 중쇄 가변영역과 항체 경쇄 불변영역의 아미노산 서열을 포함하고, 제4 항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드가 항체 경쇄의 아미노산 서열을 포함하는, [31]에 기재된 방법.

[34] 폴리펩티드 다량체가 다중 특이성 항체인, [21] 내지 [33] 중 어느 하나에 기재된 방법.

[35] 다중 특이성 항체가 이중 특이성 항체인, [34]에 기재된 방법.

[36] 항체 Fc영역 또는 항체 중쇄 불변영역이 인간 IgG 유래인, [25] 내지 [35] 중 어느 하나에 기재된 방법.

[37] 제1 항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드 및 제2 항원 결합 활성을 갖거나 또는 항원 결합 활성을 갖지 않는 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드 다량체로서,

제1 항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드와 제2 항원 결합 활성을 갖거나 또는 항원 결합 활성을 갖지 않는 폴리펩티드의 프로테인 A로의 결합력이 상이한,

폴리펩티드 다량체.

[38] 제1 항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드를 프로테인 A로부터 용출시키는 용매의 pH 및 제2 항원 결합 활성을 갖거나 또는 항원 결합 활성을 갖지 않는 폴리펩티드를 프로테인 A로부터 용출시키는 용매의 pH가 상이한, [37]에 기재된 폴리펩티드 다량체.

[39] 제1 항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드 또는 제2 항원 결합 활성을 갖거나 또는 항원 결합 활성을 갖지 않는 폴리펩티드가 항체 Fc영역 또는 항체 중쇄 불변영역의 아미노산 서열을 포함하고,

그 항체 Fc영역 또는 항체 중쇄 불변영역의 아미노산 서열에 있어서 EU 넘버링 250~255번 위치, 308~317번 위치 및 430~436번 위치로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 잔기가 개변되어 있는,

[37] 또는 [38]에 기재된 폴리펩티드 다량체.

[40] 제1 항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드 및 제2 항원 결합 활성을 갖거나 또는 항원 결합 활성을 갖지 않는 폴리펩티드가 항체 Fc영역 또는 항체 중쇄 불변영역의 아미노산 서열을 포함하고,

제1 항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드 또는 제2 항원 결합 활성을 갖거나 또는 항원 결합 활성을 갖지 않는 폴리펩티드 중 어느 한쪽의 폴리펩티드에 있어서, 항체 Fc영역 또는 항체 중쇄 불변영역의 아미노산 서열에 있어서의 EU 넘버링 435번 위치의 아미노산 잔기가 히스티딘 또는 아르기닌이고,

다른 쪽의 폴리펩티드에 있어서, 항체 Fc영역 또는 항체 중쇄 불변영역의 아미노산 서열에 있어서의 EU 넘버링 435번 위치의 아미노산 잔기가 한쪽의 폴리펩티드와는 상이한 아미노산 잔기인,

[37] 내지 [39] 중 어느 하나에 기재된 폴리펩티드 다량체.

[41] 제1 항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드 및 제2 항원 결합 활성을 갖거나 또는 항원 결합 활성을 갖지 않는 폴리펩티드가 항체 Fc영역 또는 항체 중쇄 불변영역의 아미노산 서열을 포함하고,

제1 항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드 또는 제2 항원 결합 활성을 갖거나 또는 항원 결합 활성을 갖지 않는 폴리펩티드 중 어느 한쪽의 폴리펩티드에 있어서, 항체 Fc영역 또는 항체 중쇄 불변영역의 아미노산 서열에 있어서의 EU 넘버링 435번 위치 아미노산 잔기가 히스티딘이고,

다른 쪽의 폴리펩티드에 있어서, 항체 Fc영역 또는 항체 중쇄 불변영역의 아미노산 서열에 있어서의 EU 넘버링에 의한 435번 위치의 아미노산 잔기가 아르기닌인,

[37] 내지 [40] 중 어느 하나에 기재된 폴리펩티드 다량체.

[42] 제1 항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드 및 제2 항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드가 항체 중쇄 가변영역의 아미노산 서열을 포함하고,

그 중쇄 가변영역의 FR1, CDR2 및 FR3의 아미노산 서열에 있어서 하나 이상의 아미노산 잔기가 개변되어 있는,

[37] 내지 [41] 중 어느 하나에 기재된 폴리펩티드 다량체.

[43] 폴리펩티드 다량체가 1개 또는 2개의 제3 항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드를 추가로 포함하는, [37] 내지 [42] 중 어느 하나에 기재된 폴리펩티드 다량체.

[44] 제3 항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드가 항체 경쇄의 아미노산 서열을 포함하는, [43]에 기재된 폴리펩티드 다량체.

[45] 폴리펩티드 다량체가 제4 항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드를 추가로 포함하는, [43] 또는 [44]에 기재된 폴리펩티드 다량체.

[46] 제3 및 제4 항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드 중 하나 이상의 폴리펩티드가 항체 경쇄의 아미노산 서열을 포함하는, [45]에 기재된 폴리펩티드 다량체.

[47] 제1 항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드가 항체 경쇄 가변영역과 항체 중쇄 불변영역의 아미노산 서열을 포함하고, 제2 항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드가 항체 중쇄의 아미노산 서열을 포함하며, 제3 항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드가 항체 중쇄 가변영역과 항체 경쇄 불변영역의 아미노산 서열을 포함하고, 제4 항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드가 항체 경쇄의 아미노산 서열을 포함하는, [45]에 기재된 폴리펩티드 다량체.

[48] 다중 특이성 항체인, [37] 내지 [47] 중 어느 하나에 기재된 폴리펩티드 다량체.

[49] 다중 특이성 항체가 이중 특이성 항체인, [48]에 기재된 폴리펩티드 다량체.

[50] 제1 항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드와 제2 항원 결합 활성을 갖지 않는 폴리펩티드를 가지며, 제1 항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드가 수용체의 항원 결합 도메인 및 항체 Fc영역의 아미노산 서열을 포함하고, 제2 항원 결합 활성을 갖지 않는 폴리펩티드가 항체 Fc영역의 아미노산 서열을 포함하는, [37] 내지 [41] 중 어느 하나에 기재된 폴리펩티드 다량체.

[51] 항체 Fc영역 또는 항체 중쇄 불변영역이 인간 IgG 유래인, [39] 내지 [50] 중 어느 하나에 기재된 폴리펩티드 다량체.

[52] [20], [37] 내지 [51] 중 어느 하나에 기재된 폴리펩티드 다량체를 구성하는 폴리펩티드를 코드하는 핵산.

[53] [52]에 기재된 핵산이 삽입된 벡터.

[54] [52]에 기재된 핵산 또는 [53]에 기재된 벡터를 포함하는 세포.

[55] [20], [37] 내지 [51] 중 어느 하나에 기재된 폴리펩티드 다량체를 유효성분으로서 함유하는 의약 조성물.

본 발명에서는, 프로테인 A에 대한 결합력을 개변함으로써, 2종류 이상의 항원에 대해 결합 활성을 갖는 폴리펩티드 다량체(다중 특이성 항체)를, 프로테인 A 정제공정만으로 고순도로 또한 효율적으로 정제 또는 제조하는 방법이 제공되었다. 본 발명의 방법을 이용함으로써, 다른 목적의 아미노산 개변의 효과를 손상시키지 않고, 목적의 폴리펩티드 다량체를 고순도로 또한 효율적으로 정제 또는 제조하는 것이 가능해졌다. 특히 2종의 단백질 도메인간의 회합을 제어하는 방법과 조합함으로써, 보다 고순도로 또한 효율적으로 목적의 폴리펩티드 다량체의 정제 또는 제조가 가능하다.

본 발명의 다중 특이성 항체의 정제 및 제조방법은, 항체 중쇄 불변영역 및/또는 항체 중쇄 가변영역의 아미노산 잔기를 개변하는 것을 특징으로 한다. 이들 영역에 본 발명의 아미노산 잔기의 개변을 도입함으로써 프로테인 A에 대한 결합력이 개변된다. 또한, 다른 목적의 아미노산 개변의 효과, 예를 들면, 인간 IgG1과 동등 이상의 혈장중 체류성을 얻는 것도 가능하다. 본 발명의 방법에 의해, 이러한 아미노산 개변의 효과를 갖는 다중 특이성 항체를 고순도로 또한 효율적으로 취득할 수 있다.

일반적으로, IgG 타입의 다중 특이성 항체를 고순도로 제조하기 위해서는, 이온 교환 크로마토그래피에 의한 정제공정을 행할 필요가 있다. 그러나 이 정제공정의 추가는 제조의 복잡함과 제조 비용의 증대로 이어진다. 한편으로, 단일의 이온 교환 크로마토그래피에만 의존한 정제는, 의약품의 정제방법으로서 완건성(頑健性)이 부족할 가능성이 있다. 이 때문에, IgG 타입의 이중 특이성 항체를 프로테인 A 정제공정만으로 제조하는 방법, 또는, 프로테인 A 정제공정과 이온 교환 크로마토그래피공정의 2공정을 사용한 완건성이 높은 제조방법의 개발이 과제가 되고 있었다. 본 발명은 이러한 과제를 해결하는 것이다.

도 1은 MRA-IgG1 및 MRA-z106/z107k의 인간 FcRn 형질전환 마우스(transgenic mice)에 있어서의 혈장중 체류성의 평가를 나타내는 그래프이다.
도 2는 항체의 Fc영역의 동일한 부위가 protein A와 FcRn에 결합하는 모습을 나타내는 도면이다.
도 3은 Q499-z118/J339-z119/L377-k와 Q499-z121/J339-z119/L377-k를 인간 FcRn 형질전환 마우스에 투여한 후의 혈장중 농도 추이를 나타내는 도면이다.
도 4는 암 특이적 항원인 glypican-3(GPC3)에 2가로 결합하고, T세포 항원인 CD3에 1가로 결합하는 GC33-IgG1-CD3-scFv 분자의 모식도이다.
도 5는 프로테인 A에 의해 정제를 행한 NTA1L/NTA1R/GC33-k0와 NTA2L/NTA2R/GC33-k0의 사이즈 배제 크로마토그래피 분석의 결과를 나타내는 도면이다.
도 6은 1가로 glypican-3에 결합하는 항GPC3 IgG 항체 분자의 모식도이다.
도 7은 프로테인 A에 의해 정제를 행한 NTA4L-cont/NTA4R-cont/GC33-k0와 NTA4L-G3/NTA4R-cont/GC33-k0와 NTA4L/NTA4R/GC33-k0의 사이즈 배제 크로마토그래피 분석의 결과를 나타내는 도면이다.
도 8은 NTA4L-cont/NTA4R-cont/GC33-k0와 NTA4L-G3/NTA4R-cont/GC33-k0와 NTA4L/NTA4R/GC33-k0의 pH 구배 용출 조건에 따른 프로테인 A 칼럼크로마토그래피 정제의 크로마토그램을 나타내는 도면이다.
도 9는 1가로 IgA에 결합하는 Fcalpha 리셉터 Fc 융합 단백질 분자의 모식도이다.
도 10은 프로테인 A에 의해 정제를 행한 IAL-cont/IAR-cont와 IAL/IAR의 사이즈 배제 크로마토그래피 분석의 결과를 나타내는 도면이다.
도 11은 천연형 항IL-6 리셉터·항GPC3 이중 특이성 항체인 no1의 모식도이다.
도 12는 no1에 대해, 항GPC3 항체의 VH 도메인과 VL 도메인을 교환한 no2의 모식도이다.
도 13은 no2에 대해, 각 사슬의 등전점을 개변하는 개변을 도입한 no3의 모식도이다.
도 14는 no3에 대해, H쇄 헤테로 회합화를 촉진하는 개변과 프로테인 A에 의해 헤테로 회합화한 항체를 정제하기 위한 개변을 도입한 no5의 모식도이다.
도 15는 no5에 대해, 목적의 H쇄와 목적의 L쇄의 회합을 촉진하는 개변을 도입한 no6의 모식도이다.
도 16은 항IL-6 리셉터·항GPC3 이중 특이성 항체인 no1, no2, no3, no5, no6의 발현 패턴을 양이온 교환 크로마토그래피에 의해 평가한 크로마토그램을 나타내는 도면이다.
도 17은 no6의 CM을 HiTrap protein A HP 칼럼(GE Healthcare)을 사용하여 pH 구배 용출을 행한 크로마토그램을 나타내는 도면이다.
도 18은 no6의 프로테인 A 정제 분획을 SP Sepharose HP 칼럼(GE Healthcare)으로 정제하여 얻어진 메인 피크 분획에 대해서 양이온 교환 크로마토그래피 분석에 의해 평가한 크로마토그램을 나타내는 도면이다.

본 발명은, 제1 항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드 및 제2 항원 결합 활성을 갖거나 또는 항원 결합 활성을 갖지 않는 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드 다량체의 제조방법을 제공한다. 본 발명의 폴리펩티드 다량체의 제조방법은,

(b) 공정(a)의 발현산물을 회수하는 공정,

을 포함하고,

제1 항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드 및 제2 항원 결합 활성을 갖거나 또는 항원 결합 활성을 갖지 않는 폴리펩티드의 프로테인 A로의 결합력에 차가 생기도록, 제1 항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드 및 제2 항원 결합 활성을 갖거나 또는 항원 결합 활성을 갖지 않는 폴리펩티드의 양쪽 또는 어느 한쪽에 있어서 1 또는 복수의 아미노산 잔기가 개변되어 있는 것을 특징으로 하는 방법이다.

본 발명의 폴리펩티드 다량체의 제조방법은, 프로테인 A로의 결합력이 개선된 폴리펩티드 다량체의 제조방법으로 표현하는 것도 가능하다.

또한 본 발명에 있어서 「제1 항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드」는 「항원 결합 활성을 갖는 제1 폴리펩티드」로 표현할 수 있다. 「제2 항원 결합 활성을 갖거나 또는 항원 결합 활성을 갖지 않는 폴리펩티드」는, 「항원 결합 활성을 갖거나 또는 항원 결합 활성을 갖지 않는 제2 폴리펩티드」로 표현할 수 있다. 후술하는 「제3 항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드」, 「제4 항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드」도 동일하게 표현할 수 있다.

본 발명에 있어서 「포함한다」는, 「포함한다」, 「으로 된다」 모두를 의미한다.

또한 본 발명은, 제1 항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드 및 제2 항원 결합 활성을 갖거나 또는 항원 결합 활성을 갖지 않는 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드 다량체의 정제방법을 제공한다. 본 발명의 폴리펩티드 다량체의 정제방법은,

을 포함하고,

1 또는 복수의 아미노산 잔기가 개변된 항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드는, 항원 결합 활성을 갖거나 또는 항원 결합 활성을 갖지 않는 폴리펩티드를 코드하는 DNA를 조제하고, 당해 DNA의 1 또는 복수의 염기를 개변하여, 이것을 당업자에게 주지의 세포에 도입하고, 당해 세포를 배양하여 이들 DNA를 발현시키고, 발현산물을 회수함으로써 취득할 수 있다.

따라서 본 발명의 폴리펩티드 다량체의 제조방법은 이하(a)~(d)의 공정을 포함하는 방법으로 표현하는 것도 가능하다.

(a) 제1 항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드를 코드하는 DNA 및 제2 항원 결합 활성을 갖거나 또는 항원 결합 활성을 갖지 않는 폴리펩티드를 코드하는 DNA를 제공하는 공정,

(b) 제1 항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드 및 제2 항원 결합 활성을 갖거나 또는 항원 결합 활성을 갖지 않는 폴리펩티드의 프로테인 A로의 결합력에 차가 생기도록, 공정의 (a)의 제1 폴리펩티드를 코드하는 DNA 및 제2 폴리펩티드를 코드하는 DNA의 양쪽 또는 어느 한쪽에 있어서, 1 또는 복수의 염기를 개변하는 공정,

(c) 공정(b)의 DNA를 숙주세포에 도입하고, DNA가 발현되도록 숙주세포를 배양하는 공정, 및

(d) 공정(c)의 발현산물을 숙주세포 배양물로부터 회수하는 공정.

또한 본 발명의 폴리펩티드 다량체의 정제방법은, 이하(a)~(d)의 공정을 포함하는 방법으로 표현하는 것도 가능하다.

(d) 공정(c)의 발현산물을 숙주세포 배양물로부터 프로테인 A 친화성 크로마토그래피에 의해 회수하는 공정.

본 발명에 있어서 폴리펩티드 다량체란, 제1 폴리펩티드와 제2 폴리펩티드를 포함하는 헤테로 다량체를 의미한다. 제1 폴리펩티드와 제2 폴리펩티드는, 서로 상이한 항원에 대해 결합 활성을 나타내는 것이 바람직하다. 서로 다른 항원 결합 활성을 나타내는 제1 폴리펩티드와 제2 폴리펩티드는, 한쪽의 폴리펩티드가 다른 쪽의 폴리펩티드와는 상이한 항원 결합 부위(아미노산 서열)를 가지고 있는 한 조금도 한정되지 않는다. 예를 들면, 후술하는 도 4에 나타내어지는 바와 같이, 한쪽의 폴리펩티드는, 다른 쪽의 폴리펩티드와는 상이한 항원 결합 활성 부위와 융합되어 있어도 된다. 또는, 후술하는 도 4, 도 6이나 도 9에 나타내어지는 바와 같이, 한쪽의 폴리펩티드는, 다른 쪽의 폴리펩티드가 갖는 항원 결합 활성 부위를 갖지 않는 1가로 항원에 결합하는 폴리펩티드여도 된다. 이러한 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드 다량체도 본 발명의 폴리펩티드 다량체에 포함된다.

다량체로서는 2량체, 3량체, 4량체 등을 들 수 있지만 이들에 한정되지 않는다.

또한 본 발명의 제1 폴리펩티드 및/또는 제2 폴리펩티드는, 1개 또는 2개의 제3 폴리펩티드와 다량체를 형성할 수 있다.

따라서 본 발명은, 제1 항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드, 제2 항원 결합 활성을 갖거나 또는 항원 결합 활성을 갖지 않는 폴리펩티드, 및 1개 또는 2개의 제3 항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드 다량체의 제조방법으로서,

(a) 제1 항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드를 코드하는 DNA, 제2 항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드를 코드하는 DNA, 및 2개의 제3 항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드를 코드하는 DNA를 발현시키는 공정, 및

(b) 공정(a)의 발현산물을 회수하는 공정,

또는,

(a) 제1 항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드를 코드하는 DNA, 제2 항원 결합 활성을 갖지 않는 폴리펩티드를 코드하는 DNA, 및 1개의 제3 항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드를 코드하는 DNA를 발현시키는 공정, 및

(b) 공정(a)의 발현산물을 회수하는 공정,

을 포함하고,

제1 항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드 및 제2 항원 결합 활성을 갖거나 또는 항원 결합 활성을 갖지 않는 폴리펩티드의 프로테인 A로의 결합력에 차가 생기도록, 제1 항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드 및 제2 항원 결합 활성을 갖거나 또는 항원 결합 활성을 갖지 않는 폴리펩티드의 양쪽 또는 어느 한쪽에 있어서 1 또는 복수의 아미노산 잔기가 개변되어 있는 방법을 제공한다.

상기 방법은 이하(a)~(d)의 공정을 포함하는 방법으로 표현하는 것도 가능하다.

(a) 제1 항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드를 코드하는 DNA, 제2 항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드를 코드하는 DNA, 및 2개의 제3 항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드를 코드하는 DNA를 제공하는 공정,

(b) 제1 항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드 및 제2 항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드의 프로테인 A로의 결합력에 차가 생기도록, 공정의 (a)의 제1 및 제2 폴리펩티드를 코드하는 DNA의 양쪽 또는 어느 한쪽에 있어서, 1 또는 복수의 염기를 개변하는 공정,

(c) 제1, 제2, 및 2개의 제3 폴리펩티드를 코드하는 DNA를 숙주세포에 도입하고, DNA가 발현되도록 숙주세포를 배양하는 공정, 및

또는,

(a) 제1 항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드를 코드하는 DNA, 제2 항원 결합 활성을 갖지 않는 폴리펩티드를 코드하는 DNA, 및 1개의 제3 항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드를 코드하는 DNA를 제공하는 공정,

(b) 제1 항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드 및 제2 항원 결합 활성을 갖지 않는 폴리펩티드의 프로테인 A로의 결합력에 차가 생기도록, 공정의 (a)의 제1 및 제2 폴리펩티드를 코드하는 DNA의 양쪽 또는 어느 한쪽에 있어서, 1 또는 복수의 염기를 개변하는 공정,

(c) 제1, 제2, 및 제3 폴리펩티드를 코드하는 DNA를 숙주세포에 도입하고, DNA가 발현되도록 숙주세포를 배양하는 공정, 및

또한 본 발명의 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드는, 제3 폴리펩티드 및 제4 폴리펩티드와 다량체를 형성할 수 있다.

따라서 본 발명은, 제1 항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드, 제2 항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드, 제3 항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드 및 제4 항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드 다량체의 제조방법으로서,

(a) 제1 항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드를 코드하는 DNA, 제2 항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드를 코드하는 DNA, 제3 항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드 및 제4 항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드를 코드하는 DNA를 발현시키는 공정, 및

(b) 공정(a)의 발현산물을 회수하는 공정,

을 포함하고,

제1 항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드 및 제2 항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드의 프로테인 A로의 결합력에 차가 생기도록, 제1 항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드 및 제2 항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드의 양쪽 또는 어느 한쪽에 있어서 1 또는 복수의 아미노산 잔기가 개변되어 있는 방법을 제공한다.

(a) 제1 항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드를 코드하는 DNA, 제2 항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드를 코드하는 DNA, 제3 항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드 및 제4 항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드를 코드하는 DNA를 제공하는 공정,

(c) 제1, 제2, 제3 폴리펩티드 및 제4 폴리펩티드를 코드하는 DNA를 숙주세포에 도입하고, DNA가 발현되도록 숙주세포를 배양하는 공정, 및

본 발명은, 제1 항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드, 제2 항원 결합 활성을 갖거나 또는 항원 결합 활성을 갖지 않는 폴리펩티드, 및 1개 또는 2개의 제3 항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드 다량체의 정제방법으로서,

(b) 공정(a)의 발현산물을 회수하는 공정,

또는,

(b) 공정(a)의 발현산물을 회수하는 공정,

을 포함하고,

(a) 제1 항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드를 코드하는 DNA, 제2 항원 결합 활성을 갖거나 또는 항원 결합 활성을 갖지 않는 폴리펩티드를 코드하는 DNA, 및 2개의 제3 항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드를 코드하는 DNA를 제공하는 공정,

또는,

또한 본 발명은, 제1 항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드, 제2 항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드, 제3 항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드, 및 제4 항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드 다량체의 정제방법으로서,

(a) 제1 항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드를 코드하는 DNA, 제2 항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드를 코드하는 DNA, 제3 항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드를 코드하는 DNA, 및 제4 항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드를 코드하는 DNA를 발현시키는 공정, 및

을 포함하고,

(a) 제1 항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드를 코드하는 DNA, 제2 항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드를 코드하는 DNA, 제3 항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드를 코드하는 DNA, 및 제4 항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드를 코드하는 DNA를 제공하는 공정,

(b) 제1 항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드 및 제2 항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드의 프로테인 A로의 결합력에 차가 생기도록, 공정의 (a)의 제1 폴리펩티드를 코드하는 DNA 및 제2 폴리펩티드를 코드하는 DNA의 양쪽 또는 어느 한쪽에 있어서, 1 또는 복수의 염기를 개변하는 공정,

(c) 제1, 제2, 제3 및 제4 폴리펩티드를 코드하는 DNA를 숙주세포에 도입하고, DNA가 발현되도록 숙주세포를 배양하는 공정, 및

본 발명의 제1 폴리펩티드, 제2 폴리펩티드, 및 1개 또는 2개의 제3 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드 다량체에 있어서, 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드는 각각, 제3 폴리펩티드와 다량체(2량체)를 형성할 수 있다. 또한 형성된 2량체끼리가 다량체를 형성할 수 있다. 2개의 제3 폴리펩티드는 완전히 동일한 아미노산 서열을 가지고 있어도 된다(동일한 항원에 대해 결합 활성을 가지고 있어도 된다). 또는 동일한 아미노산 서열이면서, 2개 이상의 활성이 있어도 된다(예를 들면, 2개 이상의 상이한 항원에 대해 결합 활성을 가지고 있어도 된다). 또한, 제3 폴리펩티드가 1개인 경우는, 제3 폴리펩티드는, 제1 폴리펩티드 또는 제2 폴리펩티드 중 어느 한쪽과 2량체를 형성하여, 폴리펩티드 다량체를 형성할 수 있다.

본 발명의 폴리펩티드 다량체에 있어서, 제1 폴리펩티드와 제2 폴리펩티드는 상이한 항원에 대해 결합 활성을 갖는 것이 바람직하다. 한편, 제3 폴리펩티드는, 제1 폴리펩티드나 제2 폴리펩티드 중 어느 하나 또는 양쪽과 동일한 항원에 대해 결합 활성을 갖는 폴리펩티드여도 된다. 또는, 제1 폴리펩티드나 제2 폴리펩티드와는 상이한 항원에 대해 결합 활성을 갖는 폴리펩티드여도 된다.

또는 본 발명의 폴리펩티드 다량체는, 제1 폴리펩티드, 제2 폴리펩티드, 제3 폴리펩티드, 및 제4 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드 다량체로 하는 것도 가능하다. 이러한 폴리펩티드 다량체에 있어서, 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드는 각각, 제3 폴리펩티드 및 제4 폴리펩티드와 다량체(2량체)를 형성할 수 있다. 예를 들면, 제1 폴리펩티드와 제3 폴리펩티드, 제2 폴리펩티드와 제4 폴리펩티드간에 디설피드 결합을 형성함으로써, 2량체를 형성할 수 있다.

본 발명 폴리펩티드 다량체에 있어서는, 제1 폴리펩티드와 제2 폴리펩티드는 상이한 항원에 대해 결합 활성을 갖는 것이 바람직하다. 한편 제3 폴리펩티드는, 제1 폴리펩티드나 제2 폴리펩티드 중 어느 하나 또는 양쪽과 동일한 항원에 대해 결합 활성을 갖는 폴리펩티드여도 된다. 또는, 제1 폴리펩티드나 제2 폴리펩티드와는 상이한 항원에 대해 결합 활성을 갖는 폴리펩티드여도 된다. 또한 제4 폴리펩티드는, 제1 폴리펩티드나 제2 폴리펩티드 중 어느 하나와 동일한 항원에 대해 결합 활성을 갖는 폴리펩티드여도 된다. 또는, 제1 폴리펩티드나 제2 폴리펩티드와는 상이한 항원에 대해 결합 활성을 갖는 폴리펩티드여도 된다.

구체적으로는, 예를 들면, 제1 폴리펩티드와 제2 폴리펩티드가 각각 항원 A에 대한 항체 중쇄의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 항원 B에 대한 항체 중쇄의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드인 경우, 제3 폴리펩티드를 항원 A에 대한 항체 경쇄의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 제4 폴리펩티드를 항원 B에 대한 항체 경쇄의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드로 할 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드 다량체가 각각 상이한 2종류의 항체 경쇄의 아미노산 서열을 포함하는 제3 폴리펩티드 및 제4 폴리펩티드를 갖는 경우, 제1 폴리펩티드와 제2 폴리펩티드의 프로테인 A로의 결합력의 차에 더하여, 제3 폴리펩티드와 제4 폴리펩티드의 pI값을 후술하는 방법에 따라서 상이한 값으로 하거나, 또는, protein L으로의 결합력에 차를 생기게 함으로써, 목적의 폴리펩티드 다량체를 보다 고순도로 또한 효율적으로 정제 또는 제조하는 것이 가능하다.

또한, 예를 들면, 제1 폴리펩티드를 항원 A에 대한 항체 중쇄의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 제2 폴리펩티드를 항원 B에 대한 항체 경쇄 가변영역의 아미노산 서열과 항체 중쇄 불변영역의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드로 하고, 제3 폴리펩티드를 항원 A에 대한 항체 경쇄의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 제4 폴리펩티드를 항원 B에 대한 항체 중쇄 가변영역의 아미노산 서열과 항체 경쇄 불변영역의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드로 하는 경우도, 본 발명을 이용함으로써, 목적의 제1~제4 폴리펩티드를 갖는 폴리펩티드 다량체를 보다 고순도로 또한 효율적으로 정제 또는 제조할 수 있다. 이 경우, 후술하는 실시예 12에 기재하는 바와 같이, 폴리펩티드의 pI값을 개변하는 아미노산 변이, 목적의 폴리펩티드의 회합을 촉진하는 아미노산 변이(WO2006/106905)를, 본 발명의 프로테인 A로의 결합력에 차가 생긴 폴리펩티드에 도입함으로써, 목적의 제1~제4 폴리펩티드를 갖는 폴리펩티드 다량체를 보다 고순도로 또한 효율적으로 정제 또는 제조하는 것이 가능하다. 폴리펩티드의 회합을 촉진하기 위해 도입되는 아미노산 변이로서는, Protein Eng. 1996 Jul;9(7):617-21., Protein Eng Des Sel. 2010 Apr;23(4):195-202., J Biol Chem. 2010 Jun 18;285(25):19637-46., WO2009080254 등에 기재된 항체 불변영역의 CH3 도메인의 개변에 의해 2종류로 중쇄 불변영역을 포함하는 폴리펩티드를 헤테로 회합화하는 방법, 및 WO2009080251, WO2009080252, WO2009080253 등에 기재된 중쇄와 경쇄의 특정 조합의 회합화를 촉진하는 방법 등을 사용하는 것도 가능하다.

본 발명에 있어서 「항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드」란, 항체 중쇄 또는 경쇄의 가변영역, 리셉터, 리셉터와 Fc영역의 융합 펩티드, Scaffold 및 이들의 단편 등, 항원, 리간드 등의 단백질이나 펩티드에 대해 결합 가능한 도메인(영역)을 갖는 5 아미노산 이상의 길이를 갖는 펩티드 및 단백질을 가리킨다. 즉 항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드는, 항체 가변영역, 리셉터, 리셉터와 Fc영역의 융합 펩티드, Scaffold, 또는 이들 단편의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

scaffold로서는, 하나 이상의 항원에 결합할 수 있는 입체 구조적으로 안정한 폴리펩티드라면, 어떠한 폴리펩티드여도 사용할 수 있다. 그러한 폴리펩티드로서는, 예를 들면, 항체 가변영역 단편, 피브로넥틴, Protein A 도메인, LDL 수용체 A 도메인, 리포칼린 등 외에, Nygren등(Current Opinion in Structural Biology, 7:463-469(1997), Journal of Immunol Methods, 290:3-28(2004)), Binz등(Nature Biotech 23:1257-1266(2005)), Hosse등(Protein Science 15:14-27(2006))에 기재된 분자를 들 수 있지만 이들에 한정되지 않는다.

항체의 가변영역, 리셉터, 리셉터와 Fc영역의 융합 펩티드, Scaffold 및 이들 단편의 취득방법은 당업자에게 주지이다.

당해 항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드는, 생물 유래의 것, 인공적으로 설계된 것 중 어느 것이어도 된다. 또한, 천연의 단백질 유래, 합성된 단백질 유래, 재조합 단백질 유래 등 중 어느 것이어도 된다. 또한, 항원에 대한 결합능력을 가지고 있으면, 항원, 리간드 등의 단백질이나 펩티드에 대해 결합 가능한 도메인(영역)을 갖는 10 아미노산 이상의 길이를 갖는 펩티드 및 단백질의 단편이여도 되고, 또한 항원(리간드도 포함한다)에 대해 결합 가능한 영역을 복수 포함해도 된다.

항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드는, 항원 결합 단백질 도메인을 갖는 폴리펩티드로 표현하는 것도 가능하다.

본 발명에 있어서 「항원 결합 활성을 갖지 않는 폴리펩티드」란, 항원 결합 활성을 가지고 있지 않은 항체의 단편, Fc영역, Scaffold 및 이들의 단편 등 5 아미노산 이상의 길이를 갖는 펩티드 및 단백질을 가리킨다. 즉항원 결합 활성을 갖지 않는 폴리펩티드는, 항체 불변영역, Fc영역, Scaffold, 또는 이들 단편의 아미노산 서열을 포함할 수 있지만 이들에 한정되지 않는다. 항원 결합 활성을 갖지 않는 폴리펩티드와 항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드를 조합함으로써, 항원에 대해 1가로 결합하는 폴리펩티드 다량체를 제조하는 것도 가능하다.

또한 본 발명의 제1 항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드 및 제2 항원 결합 활성을 갖거나 또는 항원 결합 활성을 갖지 않는 폴리펩티드는, 항체 중쇄 불변영역의 아미노산 서열 또는 항체 Fc영역의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 항체 Fc영역 또는 항체 중쇄 불변영역의 아미노산 서열로서는, 인간 IgG 타입의 불변영역 또는 Fc영역의 아미노산 서열을 들 수 있지만 이들에 한정되지 않는다. IgG 타입의 불변영역 또는 Fc영역으로서는, 천연형 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4의 아이소타입 중 어느 것이어도 된다. 또는 이들의 개변체여도 된다.

또한 본 발명의 제3 항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드 및 제4 항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드는, 항체 경쇄 불변영역의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 항체 경쇄 불변영역의 아미노산 서열로서는, 인간 kappa, 인간 lambda 타입의 불변영역의 아미노산 서열을 들 수 있지만 이것에 한정되지 않는다. 또는 이들의 개변체여도 된다.

또한 본 발명의 항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드는, 항체 가변영역의 아미노산 서열(예를 들면 CDR1, CDR2, CDR3, FR1, FR2, FR3, FR4의 아미노산 서열)을 포함할 수 있다.

또한 본 발명의 항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드는, 항체 중쇄의 아미노산 서열 또는 항체 경쇄의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 보다 구체적으로는, 제1 항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드 및 제2 항원 결합 활성을 갖거나 또는 항원 결합 활성을 갖지 않는 폴리펩티드는, 항체 중쇄의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 또한 제3 항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드 및 제4 항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드는, 항체 경쇄의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

또한, 목적의 폴리펩티드 다량체가, 제1 폴리펩티드와 제3 폴리펩티드로 2량체를 형성하고, 제2 폴리펩티드와 제4 폴리펩티드로 2량체를 형성하며, 또한 이들 2량체끼리가 다량체를 형성하는 4량체인 경우에는, 본 발명의 폴리펩티드 다량체로서, 예를 들면, 제1과 제2 항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드가 항체 중쇄의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 제3과 제4 항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드가 항체 경쇄의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 사용하는 것도 가능하고, 제1 항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드가 항체 중쇄의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 제2 항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드가 항체 경쇄 가변영역의 아미노산 서열과 항체 중쇄 불변영역의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 제3 항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드가 항체 경쇄의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 제4 항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드가 항체 중쇄 가변영역의 아미노산 서열과 항체 경쇄 불변영역의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 사용하는 것도 가능하다.

즉, 본 발명의 폴리펩티드 다량체는, 다중 특이성 항체일 수 있다.

본 발명에 있어서 「다중 특이성 항체」란, 적어도 2종류의 상이한 항원에 대해 특이적으로 결합하는 것이 가능한 항체를 의미한다.

본 발명에 있어서 「상이한 항원」에는, 항원 분자 자체가 상이할뿐 아니라, 항원 분자가 동일하고 항원 결정기가 상이한 것도 포함된다. 따라서, 예를 들면, 단일 분자 내의 상이한 항원 결정기는 본 발명의 「상이한 항원」에 포함된다. 또한, 이러한 단일 분자 내의 상이한 항원 결정기를 각각 인식하는 항체는, 본 발명에 있어서 「상이한 항원에 대해 특이적으로 결합하는 것이 가능한 항체」로서 취급된다.

본 발명에 있어서의 다중 특이성 항체로서, 2종류의 항원에 대해 특이적으로 결합할 수 있는 이중 특이성 항체를 들 수 있지만 이것에 한정되지 않는다. 본 발명의 바람직한 이중 특이성 항체로서, 인간 IgG 불변영역을 갖는 H2L2 타입(2종류의 H쇄 및 2종류의 L쇄로 된다)의 IgG 항체를 들 수 있다. 보다 구체적으로는, 예를 들면 IgG 타입의 키메라 항체, 인간화 항체 또는 인간 항체 등을 들 수 있지만 이들에 한정되지 않는다.

또한 항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드는, 예를 들면, 중쇄 가변영역, 경쇄 가변영역, 중쇄 불변영역, 경쇄 불변영역 중 적어도 2개가 단일 사슬로서 연결된 구조의 분자여도 된다. 또는 중쇄 가변영역, 경쇄 가변영역, Fc영역(CH1 도메인을 결실한 불변영역), 경쇄 불변영역 중 적어도 2개가 단일 사슬로서 연결된 구조의 항체여도 된다.

본 발명에 있어서 「항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드의 프로테인 A로의 결합력에 차가 생긴다」는 것은, 항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드의 표면 아미노산의 개변을 행함으로써, 2종류 이상의 폴리펩티드간에, 프로테인 A로의 결합력이 동일해지지 않는(상이한) 것을 말한다. 보다 구체적으로는 예를 들면, 제1 항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드의 프로테인 A로의 결합력과 제2 항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드의 프로테인 A로의 결합력이 상이한 것을 의미한다. 프로테인 A로의 결합력의 차는, 예를 들면, 프로테인 A 친화성 크로마토그래피를 사용함으로써 확인할 수 있다.

항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드의 프로테인 A로의 결합력의 강도는, 용출에 사용하는 용매의 pH와 상관하여, 폴리펩티드의 프로테인 A로의 결합력이 강해질수록, 용출을 위한 용매의 pH가 낮아진다. 따라서 「항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드의 프로테인 A로의 결합력에 차가 생긴다」는 것은, 「항원 결합 활성을 갖는 2종 이상의 폴리펩티드를 프로테인 A 친화성 크로마토그래피를 사용하여 용출할 때, 각각의 폴리펩티드간에 용출 용매의 pH가 상이하다」로 표현하는 것도 가능하다. 용출 용매의 pH의 차로서는, 0.1 이상, 바람직하게는 0.5 이상, 더욱 바람직하게는 1.0 이상을 들 수 있지만 이들에 한정되지 않는다.

또한 본 발명에 있어서는, 당해 항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드의 다른 활성(예를 들면 혈장중 체류성)을 저하시키지 않고 프로테인 A로의 결합력을 개변하는 것이 바람직하다.

제1 항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드와 제2 항원 결합 활성을 갖거나 또는 항원 결합 활성을 갖지 않는 폴리펩티드의 프로테인 A에 대한 결합력의 차를 이용하여, 프로테인 A 친화성 크로마토그래피를 사용해서 목적의 제1 항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드와 제2 항원 결합 활성을 갖거나 또는 항원 결합 활성을 갖지 않는 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드 다량체를 제조 또는 정제하는 것이 가능하다. 구체적으로는, 예를 들면 본 발명의 폴리펩티드 다량체가 L쇄를 공통화시킨(제3 폴리펩티드와 제4 폴리펩티드가 동일한 아미노산 서열을 갖는) 이중 특이성 항체인 경우, 이하의 방법에 의해 폴리펩티드 다량체를 제조 또는 정제할 수 있다. 먼저, 항체 중쇄 불변영역의 아미노산 서열에 있어서의 EU 넘버링 435번 위치의 아미노산이 아르기닌(R)인 제1 항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드(보다 구체적으로는 제1 항체 중쇄)를 코드하는 핵산과, 435번 위치의 아미노산이 히스티딘(H)인 제2 항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드(보다 구체적으로는 제2 항체 중쇄)를 코드하는 핵산, 제3 항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드(공통 L쇄)를 코드하는 핵산을 숙주세포에 도입하고, 당해 세포를 배양하여 DNA를 일과성으로 발현시킨다. 다음으로, 얻어진 발현산물을 프로테인 A 칼럼에 부하하고, 세정 후, pH가 높은 용출액부터 pH가 낮은 용출액의 순서로 용출한다. 2개의 제1 항체 중쇄 및 2개의 공통 L쇄로 되는 호모 항체에는, 중쇄 불변영역에 프로테인 A의 결합 부위가 존재하지 않는다. 제1 항체 중쇄, 제2 항체 중쇄, 및 2개의 공통 L쇄로 되는 이중 특이성 항체에는 중쇄 불변영역에 프로테인 A의 결합 부위가 1개 존재한다. 2개의 제2 항체 중쇄 및 2개의 공통 L쇄로 되는 호모 항체에는 중쇄 불변영역에 프로테인 A의 결합 부위가 2개 존재한다. 전술한 바와 같이, 폴리펩티드의 프로테인 A의 결합력은, 프로테인 A 친화성 크로마토그래피에 있어서 폴리펩티드가 용출되는 용매의 pH와 상관하여, 프로테인 A와의 결합력이 강할수록 용출 용매 pH는 낮아진다. 이 때문에, pH가 높은 용출액부터 pH가 낮은 용출액의 순으로 용출하면, 다음의 순서로 항체가 용출된다.

·2개의 제1 항체 중쇄 및 2개의 공통 L쇄로 되는 호모 항체,

·제1 항체 중쇄, 제2 항체 중쇄, 및 2개의 공통 L쇄로 되는 이중 특이성 항체,

·2개의 제2 항체 중쇄 및 2개의 공통 L쇄로 되는 호모 항체

이것에 의해, 목적의 폴리펩티드 다량체(이중 특이성 항체)를 제조 또는 정제하는 것이 가능해진다.

본 발명의 제조방법 또는 정제방법에 의해 얻어지는 폴리펩티드 다량체는, 적어도 95% 이상(예를 들면 96%, 97%, 98%, 99% 이상)의 순도를 갖는다.

제1 항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드와 제2 항원 결합 활성을 갖거나 또는 항원 결합 활성을 갖지 않는 폴리펩티드의 프로테인 A로의 결합력에 차가 생기는 아미노산 잔기의 개변으로서는,

(1) 제1 항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드 또는 제2 항원 결합 활성을 갖거나 또는 항원 결합 활성을 갖지 않는 폴리펩티드 중 어느 한쪽의 폴리펩티드의 프로테인 A로의 결합력이 증가하도록, 당해 어느 한쪽의 폴리펩티드의 아미노산 서열에 있어서 1 또는 복수의 아미노산 잔기를 개변하는 것,

(2) 제1 항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드 또는 제2 항원 결합 활성을 갖거나 또는 항원 결합 활성을 갖지 않는 폴리펩티드 중 어느 한쪽의 폴리펩티드의 프로테인 A로의 결합력이 저하되도록, 당해 어느 한쪽의 폴리펩티드의 아미노산 서열에 있어서 1 또는 복수의 아미노산 잔기를 개변하는 것,

(3) 제1 항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드 또는 제2 항원 결합 활성을 갖거나 또는 항원 결합 활성을 갖지 않는 폴리펩티드 중 어느 한쪽의 폴리펩티드의 프로테인 A로의 결합력이 증가하고, 다른 쪽의 폴리펩티드의 프로테인 A로의 결합력이 저하되도록, 제1 항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드 및 제2 항원 결합 활성을 갖거나 또는 항원 결합 활성을 갖지 않는 폴리펩티드에 있어서 1 또는 복수의 아미노산 잔기를 개변하는 것,

을 들 수 있지만 이들에 한정되지 않는다.

본 발명에 있어서는, 항원 결합 활성을 갖거나 또는 항원 결합 활성을 갖지 않는 폴리펩티드의 표면에 있는 아미노산을 개변하는 것이 바람직하다. 또한 개변에 의한 폴리펩티드의 다른 활성에 대한 영향을 적게 하도록 고려하는 것이 바람직하다.

따라서 본 발명에 있어서는, 예를 들면, 항체의 Fc영역 또는 중쇄 불변영역에 있어서의 EU 넘버링 250-255번 위치의 TLMISR, 308-317번 위치의 VLHQDWLNGK, 430-436번 위치의 EALHNHY,

바람직하게는 250-254번 위치의 TLMIS, 309-312번 위치의 LHQD, 314-315번 위치의 LN, 430번 위치의 E, 432-436LHNHY,

더욱 바람직하게는 251-254번 위치의 LMIS, 309-311번 위치의 LHQ, 314번 위치의 L, 432-435번 위치의 LHNH,

특히 252-254번 위치의 MIS, 309번 위치의 L, 311번 위치의 Q, 434-436번 위치의 NHY의 아미노산 잔기를 개변하는 것이 바람직하다.

항체의 중쇄 가변영역의 아미노산의 개변에 관해서는, FR1, CDR2, FR3를 바람직한 개변 위치로서 들 수 있다. 보다 바람직한 개변 위치로서는, 예를 들면, EU 넘버링 H15-H23, H56-H59, H63-H72, H79-H83을 들 수 있다.

이들 아미노산의 개변으로서, FcRn으로의 결합을 저하시키지 않는 개변, 인간 FcRn 형질전환 마우스에 있어서의 혈장중 체류성을 악화시키지 않는 개변이 보다 바람직하다.

보다 구체적으로는, 폴리펩티드의 프로테인 A로의 결합력이 증가하는 개변으로서, 항체 Fc영역 또는 항체 중쇄 불변영역의 아미노산 서열에 있어서의 EU 넘버링 435번 위치의 아미노산 잔기의 히스티딘(His)으로의 개변을 들 수 있지만 이것에 한정되지 않는다.

또한 폴리펩티드의 프로테인 A로의 결합력이 저하되는 개변으로서, 항체 Fc영역 또는 항체 중쇄 불변영역의 아미노산 서열에 있어서의 EU 넘버링 435번 위치의 아미노산 잔기의 아르기닌으로의 개변을 들 수 있지만 이들에 한정되지 않는다.

또한, 항체의 중쇄 가변영역에 있어서는, VH3 서브클래스의 중쇄 가변영역은 프로테인 A로의 결합성을 갖는 것으로부터, 프로테인 A로의 결합력을 높게 하기 위해서는, 전술한 개변 위치의 아미노산 서열이 VH3 서브클래스의 중쇄 가변영역 서열과 동일한 것이 바람직하고, 프로테인 A로의 결합력을 낮게 하기 위해서는, 그 밖의 서브클래스의 중쇄 가변영역 서열과 동일한 것이 바람직하다.

아미노산 잔기의 개변은, 후술하는 바와 같이 폴리펩티드를 코드하는 DNA에 있어서 1 또는 복수의 염기를 개변하고, 당해 DNA를 숙주세포에서 발현시킴으로써 행할 수 있다. 당업자라면, 개변 후의 아미노산 잔기의 종류에 따라, 개변해야 할 염기의 수나 위치, 종류를 용이하게 결정할 수 있다.

본 발명에 있어서 개변이란, 치환, 결손, 부가, 삽입 중 어느 하나, 또는 그들의 조합을 의미한다.

또한 항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드는, 전술한 아미노산 서열의 개변에 더하여, 추가로 부가적인 개변을 포함할 수 있다. 부가적인 개변은, 예를 들면, 아미노산의 치환, 결손, 및 수식 중 어느 하나, 또는 그들의 조합으로부터 선택할 수 있다. 구체적으로는, 그 아미노산 서열에 다음과 같은 개변을 포함하는 폴리펩티드는, 모두 본 발명에 포함된다.

·이중 특이성 항체의 2종류의 H쇄의 헤테로 회합률을 높이기 위한 아미노산의 개변

·제1 항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드와 제2 항원 결합 활성을 갖거나 또는 항원 결합 활성을 갖지 않는 폴리펩티드간의 디설피드 결합을 안정화시키기 위한 아미노산 개변

·항체의 혈장중 체류성을 개선하기 위한 아미노산 개변

·산성 조건하에 있어서의 안정성 향상을 위한 개변

·이질성(heterogeneity) 저감을 위한 개변

·탈아미드화 반응 억제를 위한 개변

·2종류의 폴리펩티드간에 등전점의 차이를 도입하기 위한 개변

·Fcγ 리셉터로의 결합성을 변화시키기 위한 개변

이하에 이들 아미노산의 개변에 관하여 기술한다.

이중 특이성 항체의 2종류의 H쇄의 헤테로 회합률을 높이기 위한 아미노산의 개변

본 발명의 아미노산의 개변과 WO2006106905에 기재된 아미노산의 개변을 조합하는 것이 가능하다. 개변 개소로서는, 2개의 항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드 내의 계면을 형성하는 아미노산이라면 한정되지 않는다. 구체적으로는, 예를 들면 중쇄 불변영역을 개변하는 경우, 제1 항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드의 중쇄 불변영역의 아미노산 서열에 있어서의 EU 넘버링 356번 위치와 439번 위치, 357번 위치와 370번 위치, 및 399번 위치와 409번 위치의 조합 중, 하나 이상의 조합을 동일 전하를 갖는 아미노산으로 개변하는 것, 제2 항원 결합 활성을 갖거나 또는 항원 결합 활성을 갖지 않는 폴리펩티드의 중쇄 불변영역의 EU 넘버링 356번 위치와 439번 위치, 357번 위치와 370번 위치, 및 399번 위치와 409번 위치의 조합 중, 하나 이상의 조합을 제1 항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드와는 반대의 전하를 갖는 아미노산으로 개변하는 것을 들 수 있다. 보다 구체적으로는, 예를 들면, 제1 항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드와 제2 항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드의 중쇄 불변영역의 아미노산 서열에 있어서, 어느 한쪽의 폴리펩티드에 EU 넘버링 356번째의 Glu를 Lys로 치환하는 변이를 도입하고, 다른 쪽의 폴리펩티드에 EU 넘버링 439번째의 Lys를 Glu로 치환하는 변이를 도입하는 것을 들 수 있다. 이러한 개변을 본 발명의 개변과 조합함으로써, 목적의 폴리펩티드를, 프로테인 A를 사용한 정제만으로, 더욱 고순도로 얻는 것이 가능하다.

또한, 제1 항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드의 중쇄 가변영역의 Kabat 넘버링 39번째 및/또는 중쇄 불변영역의 EU 넘버링 213번째와, 제2 항원 결합 활성을 갖거나 또는 항원 결합 활성을 갖지 않는 폴리펩티드의 중쇄 가변영역의 Kabat 넘버링 39번째 및/또는 중쇄 불변영역의 EU 넘버링 213번째를, 각각 반대의 전하를 갖는 아미노산으로 개변하고, 제3 항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드의 경쇄 가변영역의 Kabat 넘버링 38번째 및/또는 EU 넘버링 123번째와, 제4 항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드의 경쇄 가변영역의 Kabat 넘버링 38번째 및/또는 EU 넘버링 123번째를, 각각 반대의 전하를 갖는 아미노산으로 개변함으로써, 제1~제4 항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드를 포함하는 목적의 폴리펩티드 다량체를 보다 고순도로 또한 효율적으로 정제 또는 제조하는 것도 가능하다.

제1 항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드와 제2 항원 결합 활성을 갖거나 또는 항원 결합 활성을 갖지 않는 폴리펩티드간의 디설피드 결합을 안정화시키기 위한 아미노산 개변

공지의 문헌(Mol. Immunol. 1993, 30, 105-108 및 Mol. Immunol. 2001, 38, 1-8)에 기재된 바와 같이, IgG4 중쇄 불변영역의 아미노산 서열에 있어서의 EU 넘버링 228번째의 Ser을 Pro로 치환함으로써 IgG4의 이질성이 해소되어 안정한 구조의 유지가 가능하다.

항체의 혈장중 체류성을 개선하기 위한 아미노산 개변

혈장중 체류성을 제어하기 위해, 본 발명의 아미노산의 개변과 항체의 pI값을 개변시키기 위한 아미노산의 개변을 조합하는 것이 가능하다. 불변영역의 개변에 대해서는, 예를 들면, 공지의 문헌(J. Immunol. 2006, 176(1):346-356이나 Nat. Biotechnol. 1997 15(7):637-640 등)에 기재된 EU 넘버링 250번 위치나 428번 위치 등의 아미노산의 개변을 들 수 있다. 또한, 가변영역의 개변으로서 WO2007/114319나 WO2009/041643에 기재된 아미노산의 개변을 들 수 있다. 개변되는 아미노산은, 항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드의 표면에 노출되어 있는 아미노산이 바람직하다. 예를 들면, 항체 불변영역의 아미노산 서열에 있어서의 EU 넘버링 196번 위치의 아미노산의 치환을 들 수 있다. 중쇄 불변영역이 IgG4인 경우, 예를 들면 196번째의 리신을 글루타민으로 치환함으로써 pI값을 낮게 하고, 혈장중 체류성을 높이는 것이 가능하다.

또한, 혈장중 체류성은 FcRn에 대한 결합력을 개변함으로써도 제어 가능하다. FcRn에 대한 결합력 개변을 위한 아미노산 개변으로서는, 예를 들면, 공지의 문헌(The Journal of Biological Chemistry vol.276, No.9 6591-6604, 2001이나 Molecular Cell, Vol.7, 867-877, 2001이나 Curr Opin Biotechnol. 2009, 20(6):685-91.)에 기재된 항체 중쇄 불변영역의 아미노산의 치환을 들 수 있다. 예를 들면, EU 넘버링 233번 위치, 238번 위치, 253번 위치, 254번 위치, 255번 위치, 256번 위치, 258번 위치, 265번 위치, 272번 위치, 276번 위치, 280번 위치, 285번 위치, 288번 위치, 290번 위치, 292번 위치, 293번 위치, 295번 위치, 296번 위치, 297번 위치, 298번 위치, 301번 위치, 303번 위치, 305번 위치, 307번 위치, 309번 위치, 311번 위치, 312번 위치, 315번 위치, 317번 위치, 329번 위치, 331번 위치, 338번 위치, 360번 위치, 362번 위치, 376번 위치, 378번 위치, 380번 위치, 382번 위치, 415번 위치, 424번 위치, 433번 위치, 434번 위치, 435번 위치, 436번 위치 등의 위치의 아미노산의 치환을 들 수 있다.

산성 조건하에 있어서의 안정성 향상을 위한 개변

중쇄 불변영역으로서 IgG4를 이용한 경우는, 산성 조건하에 있어서의 IgG4의 half-molecule화를 억제하여 안정한 4쇄 구조(H2L2 구조)를 유지시키는 것이 바람직하다. 이 때문에, 4쇄 구조의 유지에 중요한 역할을 하고 있는 EU 넘버링 409번 위치의 아미노산인 아르기닌(Immunology 2002, 105, 9-19)을, 산성 조건하에 있어서도 안정한 4쇄 구조를 유지하는 IgG1 타입의 리신으로 치환하는 것이 바람직하다. 또한, IgG2의 안정성을 향상시키기 위해서 EU 넘버링 397번 위치의 아미노산인 메티오닌을 발린으로 치환하는 것도 가능하다. 이러한 개변을 본 발명의 아미노산의 개변과 조합하여 사용할 수 있다.

이질성 저감을 위한 개변

본 발명의 아미노산의 개변과 WO2009041613에 기재된 방법을 조합하는 것이 가능하다. 구체적으로는, 예를 들면 IgG1 중쇄 불변영역의 C말단의 2 아미노산, 즉 EU 넘버링 446번째의 글리신 및 447번째의 리신을 결손시키는 개변을 본 발명의 실시예에 기초하는 아미노산의 개변과 조합하는 것이 가능하다.

탈아미드화 반응 억제를 위한 개변

본 발명의 아미노산의 개변과 탈아미드화 반응의 억제를 위한 아미노산의 개변을 조합하는 것이 가능하다. 탈아미드화 반응은, 특히 아스파라긴(N)과 글리신(G)이 인접한 부위(…NG…)에 있어서 일어나기 쉬운 것이 보고되어 있다(Geiger등 J. Bio. Chem. 1987; 262:785-794). 본 발명의 폴리펩티드 다량체(다중 특이성 항체)에 아스파라긴과 글리신이 인접한 부위가 존재하는 경우에는, 당해 아미노산 서열을 개변함으로써 탈아미드화 반응을 억제할 수 있다. 구체적으로는 예를 들면, 아스파라긴과 글리신 중 어느 한쪽 또는 양쪽의 아미노산을 다른 아미노산으로 치환한다. 보다 구체적으로는 예를 들면, 아스파라긴을 아스파라긴산으로 치환하는 것을 들 수 있다.

2종류의 폴리펩티드간에 등전점의 차이를 도입하기 위한 개변

본 발명의 아미노산의 개변과 등전점의 차이를 도입하기 위한 아미노산의 개변을 조합하는 것이 가능하다. 구체적인 방법은, 예를 들면 WO2007/114325에 기재되어 있다. 본 발명의 개변에 더하여, 제1 항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드와 제2 항원 결합 활성을 갖거나 또는 항원 결합 활성을 갖지 않는 폴리펩티드의 아미노산 서열을 개변하고, 이들 폴리펩티드의 등전점의 값에 차를 생기게 함으로써, 목적의 폴리펩티드를 보다 고순도로 또한 효율적으로 정제 또는 제조하는 것이 가능하다. 또한, 제3 항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드와 제4 항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드의 등전점에 차를 생기게 함으로써, 제1~제4 폴리펩티드를 포함하는 목적의 폴리펩티드 다량체를 보다 고순도로 또한 효율적으로 정제 또는 제조하는 것도 가능하다. 구체적인 개변 위치로서는, 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드가 항체 중쇄의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드인 경우, 예를 들면, Kabat 넘버링에 있어서의 1, 3, 5, 8, 10, 12, 13, 15, 16, 19, 23, 25, 26, 39, 42, 43, 44, 46, 68, 71, 72, 73, 75, 76, 81, 82b, 83, 85, 86, 105, 108, 110, 112번 위치를 들 수 있다. 제3 폴리펩티드 및 제4 폴리펩티드가 항체 경쇄의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드인 경우, 예를 들면, Kabat 넘버링에 있어서의 1, 3, 7, 8, 9, 11, 12, 16, 17, 18, 20, 22, 38, 39, 41, 42, 43, 45, 46, 49, 57, 60, 63, 65, 66, 68, 69, 70, 74, 76, 77, 79, 80, 81, 85, 100, 103, 105, 106, 107, 108번 위치를 들 수 있다. 한쪽의 폴리펩티드 중의 상기 위치 중 하나 이상의 아미노산 잔기를 전하를 갖는 아미노산으로 하고, 다른 쪽의 폴리펩티드 중의 상기 위치 중 하나 이상의 아미노산 잔기를 당해 전하와 반대의 전하를 갖는 아미노산 잔기 또는 전하를 갖지 않는 아미노산 잔기로 함으로써 등전점에 차를 생기게 하는 것이 가능하다.

Fcγ 리셉터로의 결합성을 변화시키기 위한 개변

본 발명의 아미노산 개변과 Fcγ 리셉터로의 결합성을 변화시키기(증가시키거나, 또는, 저감시키기) 위한 아미노산의 개변을 조합하는 것이 가능하다. Fcγ 리셉터로의 결합성을 변화시키는 개변으로서는 Curr Opin Biotechnol. 2009, 20(6):685-91.에 기재된 개변을 들 수 있지만, 이것에 한정되지 않는다. 구체적인 방법은, 예를 들면, 본 발명의 개변과, IgG1 중쇄 불변영역의 EU 넘버링 234번째 및 235번째의 류신, 및 272번째의 아스파라긴을 다른 아미노산으로 치환하는 개변을 조합함으로써, Fcγ 리셉터로의 결합성을 변화시키는 것이 가능하다. 치환 후의 아미노산으로서는 알라닌을 들 수 있지만 이것에 한정되지 않는다.

이하, 항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드를 코드하는 DNA의 조제, 1 또는 복수의 염기의 개변, DNA의 발현, 발현산물의 회수에 대해서 설명한다.

항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드를 코드하는 DNA의 조제

본 발명에 있어서, 항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드를 코드하는 DNA 또는 항원 결합 활성을 갖지 않는 폴리펩티드를 코드하는 DNA는, 기지의 서열(천연에 존재하는 서열, 존재하지 않는 서열)의 전장 또는 일부, 또는 그들의 조합을 사용하는 것이 가능하다. 이러한 DNA는 당업자에게 공지의 방법으로 취득할 수 있다. 예를 들면, 항체 라이브러리로부터 취득하는 것이 가능하고, 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마로부터 항체를 코드하는 유전자를 클로닝하여 취득하는 것도 가능하다.

항체 라이브러리에 대해서는 이미 많은 것이 공지이고, 또한, 항체 라이브러리의 제작방법도 공지이기 때문에, 당업자는 적절히 항체 라이브러리를 입수하는 것이 가능하다. 예를 들면, 항체 파지 라이브러리에 대해서는, Clackson et al., Nature 1991, 352: 624-8, Marks et al., J. Mol. Biol. 1991, 222: 581-97, Waterhouses et al., Nucleic Acids Res. 1993, 21: 2265-6, Griffiths et al., EMBO J. 1994, 13: 3245-60, Vaughan et al., Nature Biotechnology 1996, 14: 309-14, 또는 일본국 특허공표 평20-504970호 공보 등의 문헌을 참조할 수 있다. 그 밖에, 진핵세포를 라이브러리로 하는 방법(WO95/15393호 팸플릿)이나 리보솜 제시법 등의 공지의 방법을 사용하는 것이 가능하다. 또한, 인간 항체 라이브러리를 사용하여, 팬닝에 의해 인간 항체를 취득하는 기술도 알려져 있다. 예를 들면, 인간 항체의 가변영역을 단일 사슬 항체(scFv)로서 파지 디스플레이법에 의해 파지의 표면에 발현시키고, 항원에 결합하는 파지를 선택할 수 있다. 선택된 파지의 유전자를 해석하면, 항원에 결합하는 인간 항체의 가변영역을 코드하는 DNA 서열을 결정할 수 있다. 항원에 결합하는 scFv의 DNA 서열이 명확해지면, 당해 서열을 토대로 적당한 발현 벡터를 제작하여, 인간 항체를 취득할 수 있다. 이들 방법은 이미 주지이고, WO92/01047, WO92/20791, WO93/06213, WO93/11236, WO93/19172, WO95/01438, WO95/15388을 참고로 할 수 있다.

하이브리도마로부터 항체를 코드하는 유전자를 취득하는 방법은, 기본적으로는 공지 기술을 사용할 수 있다. 구체적으로는, 목적하는 항원 또는 목적하는 항원을 발현하는 세포를 감작 항원으로서 사용하고, 이를 통상의 면역방법에 따라 면역한다. 얻어지는 면역세포를 통상의 세포 융합법에 의해 공지의 친세포와 융합하고, 통상의 스크리닝법에 의해, 단일클론 항체 생산 세포(하이브리도마)를 스크리닝한다. 얻어진 하이브리도마의 mRNA를, 역전사효소를 사용하여 역전사함으로써, 항체의 가변영역(V영역)의 cDNA를 취득할 수 있다. 이를 목적하는 항체 불변영역(C영역)을 코드하는 DNA와 연결함으로써, 항체를 코드하는 유전자를 취득할 수 있다.

보다 구체적으로는, 이하의 방법을 예시할 수 있으나 이것에 한정되지 않는다.

항체 중쇄 및 경쇄를 코드하는 항체 유전자를 얻기 위한 감작 항원은, 면역원성을 갖는 완전 항원과, 면역원성을 나타내지 않는 합텐 등을 포함하는 불완전 항원의 양쪽을 포함한다. 예를 들면, 목적 단백질의 전장 단백질, 또는 부분 펩티드 등을 사용할 수 있다. 그 밖에, 다당류, 핵산, 지질 등으로 구성되는 물질이 항원이 될 수 있는 것이 알려져 있어, 본 발명에 있어서 항원은 특별히 한정되는 것은 아니다. 항원의 조제는, 당업자에게 공지의 방법에 의해 행할 수 있고, 예를 들면, 바큘로바이러스를 사용한 방법(예를 들면, WO98/46777 등) 등에 준하여 행할 수 있다. 하이브리도마의 제작은, 예를 들면, 밀스테인등의 방법(G. Kohler and C. Milstein, Methods Enzymol. 1981, 73: 3-46) 등에 준하여 행할 수 있다. 항원의 면역원성이 낮은 경우에는, 알부민 등의 면역원성을 갖는 거대분자와 결합시켜, 면역을 행하면 된다. 또한, 필요에 따라 항원을 다른 분자와 결합시킴으로써 가용성 항원으로 하는 것도 가능하다. 수용체와 같은 막관통 분자를 항원으로서 사용하는 경우, 수용체의 세포외영역 부분을 단편으로서 사용하거나, 막관통 분자를 세포 표면상에 발현하는 세포를 면역원으로서 사용하는 것도 가능하다.

항체 생산 세포는, 전술한 적당한 감작 항원을 사용하여 동물을 면역화함으로써 얻을 수 있다. 또는, 항체를 생산할 수 있는 림프구를 인 비트로(in vitro)에서 면역화하여 항체 생산 세포로 하는 것도 가능하다. 면역화하는 동물로서는, 각종 포유동물을 사용할 수 있으나, 설치목, 토끼목, 영장목의 동물이 일반적으로 사용된다. 마우스, 랫트, 햄스터 등의 설치목, 토끼 등의 토끼목, 게잡이원숭이, 빨간털원숭이, 망토비비, 침팬지 등의 원숭이 등의 영장목의 동물을 예시할 수 있다. 그 밖에, 인간 항체 유전자의 레퍼토리를 갖는 형질전환 동물도 알려져 있어, 이러한 동물을 사용함으로써 인간 항체를 얻는 것도 가능하다(WO96/34096; Mendez et al., Nat. Genet. 1997, 15: 146-56 참조). 이러한 형질전환 동물의 사용 대신에, 예를 들면, 인간 림프구를 in vitro에서 목적하는 항원 또는 목적하는 항원을 발현하는 세포로 감작하여, 감작 림프구를 인간 골수종 세포, 예를 들면 U266과 융합시킴으로써, 항원으로의 결합 활성을 갖는 목적하는 인간 항체를 얻는 것도 가능하다(일본국 특허공고 평1-59878호 공보 참조). 또한, 인간 항체 유전자의 모든 레퍼토리를 갖는 형질전환 동물을 목적하는 항원으로 면역함으로써 목적하는 인간 항체를 취득할 수 있다(WO93/12227, WO92/03918, WO94/02602, WO96/34096, WO96/33735 참조).

동물의 면역화는, 예를 들면, 감작 항원을 Phosphate-Buffered Saline(PBS) 또는 생리식염수 등으로 적절히 희석, 현탁하고, 필요에 따라 애쥬번트를 혼합하여 유화한 후, 동물의 복강 내 또는 피하에 주사함으로써 행해진다. 그 후, 바람직하게는, 프로인트 불완전 애쥬번트에 혼합한 감작 항원을 4~21일마다 수 회 투여한다. 항체 생산의 확인은, 동물의 혈청 중의 목적으로 하는 항체 역가를 관용의 방법에 의해 측정함으로써 행해질 수 있다.

하이브리도마는, 목적하는 항원으로 면역화한 동물 또는 림프구로부터 얻어진 항체 생산 세포를, 관용의 융합제(예를 들면, 폴리에틸렌글리콜)를 사용해서 골수종 세포와 융합하여 제작할 수 있다(Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, 1986, 59-103). 필요에 따라 하이브리도마 세포를 배양·증식하고, 면역 침강, 방사 면역 분석(RIA), 효소결합 면역흡착 분석(ELISA) 등의 공지의 분석법에 의해 그 하이브리도마로부터 생산되는 항체의 결합 특이성을 측정한다. 그 후, 필요에 따라, 목적으로 하는 특이성, 친화성 또는 활성이 측정된 항체를 생산하는 하이브리도마를 한계희석법 등의 수법에 의해 서브 클로닝하는 것도 가능하다.

계속해서, 선택된 항체를 코드하는 유전자를 하이브리도마 또는 항체 생산 세포(감작 림프구 등)로부터, 항체에 특이적으로 결합 가능한 프로브(예를 들면, 항체 불변영역을 코드하는 서열에 상보적인 올리고뉴클레오티드 등)를 사용하여 클로닝할 수 있다. 또한, mRNA로부터 RT-PCR에 의해 클로닝하는 것도 가능하다. 면역 글로불린은, IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM의 5개의 상이한 클래스로 분류된다. 또한, 이들 클래스는 몇 개의 서브클래스(아이소타입)(예를 들면, IgG-1, IgG-2, IgG-3, 및 IgG-4;IgA-1 및 IgA-2 등)로 나뉜다. 본 발명에 있어서 항체의 제조에 사용하는 중쇄 및 경쇄는, 이들 중 어느 클래스 및 서브클래스에 속하는 항체에 유래하는 것이여도 되고, 특별히 한정되지 않지만, IgG는 특히 바람직한 것이다.

여기서, 중쇄 및 경쇄를 코드하는 유전자를 유전자 공학적 수법에 의해 개변하는 것도 가능하다. 예를 들면, 마우스 항체, 랫트 항체, 토끼 항체, 햄스터 항체, 양 항체, 낙타 항체 등의 항체에 대해서, 인간에 대한 이종(異種) 항원성을 저하시키는 것 등을 목적으로 하여 인위적으로 개변한 유전자 재조합형 항체, 예를 들면, 키메라 항체, 인간화 항체 등을 적절히 제작할 수 있다. 키메라 항체는, 인간 이외의 포유동물, 예를 들면, 마우스 항체의 중쇄, 경쇄의 가변영역과 인간 항체의 중쇄, 경쇄의 불변영역으로 되는 항체로, 마우스 항체의 가변영역을 코드하는 DNA를 인간 항체의 불변영역을 코드하는 DNA와 연결하고, 이것을 발현 벡터에 삽입하여 숙주에 도입해서 생산시킴으로써 얻을 수 있다. 인간화 항체는, 재구성(reshaped) 인간 항체로도 칭해지고, 인간 이외의 포유동물, 예를 들면 마우스 항체의 상보성 결정영역(CDR; complementary determining region)을 연결하도록 설계한 DNA 서열을, 말단부에 오버랩되는 부분을 갖도록 제작한 수 개의 올리고뉴클레오티드로부터 PCR법에 의해 합성한다. 얻어진 DNA를 인간 항체 불변영역을 코드하는 DNA와 연결하고, 이어서 발현 벡터에 삽입하여, 이것을 숙주에 도입해서 생산시킴으로써 얻어진다(EP239400; WO96/02576 참조). CDR을 매개로 연결되는 인간 항체의 FR은, 상보성 결정영역이 양호한 항원 결합 부위를 형성하는 것이 선택된다. 필요에 따라, 재구성 인간 항체의 상보성 결정영역이 적절한 항원 결합 부위를 형성하도록 항체의 가변영역의 프레임워크영역의 아미노산을 치환해도 된다(K. Sato et al., Cancer Res. 1993, 53: 851-856). 본 발명의 단일클론 항체에는, 이러한 인간화 항체나 키메라 항체가 포함된다.

본 발명에 있어서의 항체가 키메라 항체 또는 인간화 항체인 경우에는, 이들 항체의 불변영역은，바람직하게는 인간 항체 유래의 것이 사용된다. 예를 들면 중쇄의 경우는, Cγ1, Cγ2, Cγ3, Cγ4를, 경쇄의 경우는 Cκ, Cλ를 사용할 수 있다. 또한, 항체 또는 그의 생산의 안정성을 개선하기 위해, 인간 항체 불변영역을 필요에 따라 수식해도 된다. 본 발명에 있어서의 키메라 항체는, 바람직하게는 인간 이외의 포유동물 유래 항체의 가변영역과 인간 항체 유래의 불변영역으로 된다. 한편, 인간화 항체는, 바람직하게는 인간 이외의 포유동물 유래 항체의 CDR과, 인간 항체 유래의 FR 및 C영역으로 된다. 인간 항체 유래의 불변영역은, IgG(IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), IgM, IgA, IgD 및 IgE 등의 아이소타입별로 고유의 아미노산 서열을 갖는다. 본 발명에 있어서의 인간화 항체에 사용되는 불변영역은, 어느 아이소타입에 속하는 항체의 불변영역이여도 된다. 바람직하게는, 인간 IgG의 불변영역이 사용되는데, 이것에 한정되는 것은 아니다. 또한, 인간화 항체에 이용되는 인간 항체 유래의 FR도 특별히 한정되지 않고, 어느 아이소타입에 속하는 항체의 것이여도 된다.

본 발명에 있어서의 키메라 항체 및 인간화 항체의 가변영역 및 불변영역은, 원래의 항체의 결합 특이성을 나타내는 한, 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가 등에 의해 개변되어 있어도 된다.

인간 유래의 서열을 이용한 키메라 항체 및 인간화 항체는, 인간 체내에 있어서의 항원성이 저하되어 있기 때문에, 치료 목적 등으로 인간에 투여하는 경우에 유용할 것으로 생각된다.

본 발명에 있어서는, 항체의 생물학적 특성을 개변하기 위해서 아미노산이 개변되어 있어도 된다.

또한, 저분자화 항체는, 체내 동태의 성질면에서도, 대장균, 식물세포 등을 사용하여 저비용으로 제조할 수 있는 점에서도 항체로서 유용하다.

항체 단편은 저분자화 항체의 일종이다. 또한, 저분자화 항체는, 항체 단편을 그 구조의 일부로 하는 항체도 포함한다. 본 발명에 있어서의 저분자화 항체는, 항원으로의 결합능을 가지고 있으면 특별히 그의 구조, 제조법 등은 한정되지 않는다. 저분자화 항체 중에는, 전장 항체보다도 높은 활성을 갖는 항체도 존재한다(Orita et al., Blood(2005) 105: 562-566). 본 명세서에 있어서 「항체 단편」이란, 전장 항체(whole antibody, 예를 들면 whole IgG 등)의 일부분이라면 특별히 한정되지 않지만, 중쇄 가변영역(VH) 또는 경쇄 가변영역(VL)을 포함하고 있는 것이 바람직하다. 바람직한 항체 단편의 예로서는, 예를 들면, Fab, F(ab')2, Fab', Fv 등을 들 수 있다. 항체 단편 중의 중쇄 가변영역(VH) 또는 경쇄 가변영역(VL)의 아미노산 서열은, 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입에 의해 개변되어 있어도 된다. 또한 항원으로의 결합능을 보유하는 한, 중쇄 가변영역(VH) 또는 경쇄 가변영역(VL)의 아미노산 서열의 일부를 결손시켜도 된다. 예를 들면, 전술한 항체 단편 중 「Fv」는, 완전한 항원 인식 부위와 결합 부위를 포함하는 최소의 항체 단편이다. 「Fv」는, 1개의 중쇄 가변영역(VH) 및 1개의 경쇄 가변영역(VL)이 비공유 결합에 의해 강하게 결합한 다이머(VH-VL 다이머)이다. 각 가변영역의 3개의 상보성 결정영역(complementarity determining region；CDR)에 의해, VH-VL 다이머의 표면에 항원 결합 부위를 형성한다. 6개의 CDR이 항체에 항원 결합 부위를 부여하고 있다. 그러나, 1개의 가변영역(또는, 항원에 특이적인 3개의 CDR만을 포함하는 Fv의 절반)이더라도, 전체 결합 부위보다도 친화성은 낮으나, 항원을 인식하고, 결합하는 능력을 갖는다. 따라서, 이러한 Fv보다 작은 분자도 본 발명에 있어서의 항체 단편에 포함된다. 또한, 항체 단편의 가변영역은 키메라화나 인간화되어 있어도 된다.

저분자화 항체는, 중쇄 가변영역(VH)과 경쇄 가변영역(VL) 양쪽을 포함하고 있는 것이 바람직하다. 저분자화 항체의 예로서는, Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv 등의 항체 단편, 및 항체 단편을 이용하여 제작될 수 있는 scFv(싱글 체인 Fv)(Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1988) 85: 5879-83; Pluckthun「The Pharmacology of Monoclonal Antibodies」Vol.113, Resenburg 및 Moore편, Springer Verlag, New York, pp.269-315,(1994)), Diabody(Holliger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1993) 90: 6444-8; EP404097호; WO93/11161호; Johnson et al., Method in Enzymology(1991) 203: 88-98; Holliger et al., Protein Engineering(1996) 9: 299-305; Perisic et al., Structure(1994) 2: 1217-26; John et al., Protein Engineering(1999) 12(7): 597-604; Atwell et al., Mol.Immunol.(1996) 33: 1301-12), sc(Fv)2(Hudson et al, J Immunol. Methods(1999) 231: 177-89 ; Orita et al., Blood(2005) 105: 562-566), Triabody(Journal of Immunological Methods(1999) 231: 177-89), 및 Tandem Diabody(Cancer Research(2000) 60: 4336-41) 등을 들 수 있다.

항체 단편은, 항체를 효소, 예를 들면 파파인, 펩신 등의 프로테아제에 의해 처리해서 얻을 수 있다(Morimoto et al., J. Biochem. Biophys. Methods(1992) 24: 107-17; Brennan et al., Science(1985) 229: 81 참조). 또한, 그 항체 단편의 아미노산 서열을 토대로, 유전자 재조합에 의해 제조하는 것도 가능하다.

항체 단편을 개변한 구조를 갖는 저분자화 항체는, 효소처리 또는 유전자 재조합에 의해 얻어진 항체 단편을 이용해서 구축할 수 있다. 또는, 저분자화 항체 전체를 코드하는 유전자를 구축하고, 이를 발현 벡터에 도입한 후, 적당한 숙주세포에서 발현시키는 것도 가능하다(예를 들면, Co et al., J. Immunol.(1994) 152: 2968-76; Better and Horwitz, Methods Enzymol.(1989) 178: 476-96; Pluckthun and Skerra, Methods Enzymol.(1989) 178: 497-515; Lamoyi, Methods Enzymol.(1986) 121: 652-63; Rousseaux et al., Methods Enzymol.(1986) 121: 663-9; Bird and Walker, Trends Biotechnol.(1991) 9: 132-7 참조).

또한, 상기 「scFv」는, 2개의 가변영역을, 필요에 따라 링커 등을 매개로, 결합시킨 단일 사슬 폴리펩티드이다. scFv에 포함되는 2개의 가변영역은, 통상, 1개의 VH와 1개의 VL인데, 2개의 VH 또는 2개의 VL이여도 된다. 일반적으로 scFv 폴리펩티드는, VH 및 VL 도메인 사이에 링커를 포함하고, 그것에 의해 항원 결합을 위해 필요한 VH 및 VL의 쌍부분(paired portion)이 형성된다. 통상, 동일한 분자 내에서 VH 및 VL 사이에서 쌍부분을 형성시키기 위해, 일반적으로, VH 및 VL을 연결하는 링커를 10 아미노산 이상의 길이의 펩티드 링커로 한다. 그러나, 본 발명에 있어서의 scFv의 링커는, scFv의 형성을 방해하지 않는 한, 이러한 펩티드 링커에 한정되는 것은 아니다. scFv의 총설로서, Pluckthun『The Pharmacology of Monoclonal Antibody』Vol.113(Rosenburg and Moore ed., Springer Verlag, NY, pp.269-315(1994))을 참조할 수 있다.

또한, 「디아바디(diabody; Db)」는, 유전자 융합에 의해 구축된 2가(bivalent)의 항체 단편을 가리킨다(P.Holliger et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90: 6444-6448(1993), EP404,097호, WO93/11161호 등). 디아바디는, 2개의 폴리펩티드 사슬로 구성되는 다이머로, 폴리펩티드 사슬은 각각, 동일한 사슬 중에서 경쇄 가변영역(VL) 및 중쇄 가변영역(VH)이, 서로 결합할 수 없을 정도로 짧은, 예를 들면, 5염기 정도의 링커에 의해 결합되어 있다. 동일 폴리펩티드 사슬 상에 코드되는 VL과 VH는, 그 사이의 링커가 짧기 때문에 경쇄 V영역 프래그먼트를 형성할 수 없어 이량체를 형성하기 위해, 디아바디는 2개의 항원 결합 부위을 갖게 된다. 이 때 2개의 상이한 에피토프(a, b)에 대한 VL과 VH를 VLa-VHb와 VLb-VHa의 조합으로 5잔기 정도의 링커로 결합한 것을 동시에 발현시키면 이중 특이성 Db로서 분비된다.

Diabody는, 2분자의 scFv를 포함하는 것으로부터, 4개의 가변영역을 포함하고, 그 결과, 2개의 항원 결합 부위를 갖게 된다. 다어미를 형성시키지 않는 scFv의 경우와 달리, Diabody의 형성을 목적으로 하는 경우, 통상, 각 scFv 분자 내의 VH 및 VL 사이를 연결하는 링커는, 펩티드 링커로 하는 경우에는, 5 아미노산 전후의 것으로 한다. 그러나, Diabody를 형성하는 scFv의 링커는, scFv의 발현을 방해하지 않고, Diabody의 형성을 방해하지 않는 한, 이러한 펩티드 링커에 한정되지 않는다.

또한, 본 발명의 저분자화 항체 및 항체 단편은, 추가로 항체 중쇄 불변영역 및/또는 경쇄 불변영역의 아미노산 서열을 갖는 것이 바람직하다.

1 또는 복수의 염기의 개변

본 발명에 있어서 「염기의 개변」이란, DNA에 의해 코드되는 폴리펩티드가 목적의 아미노산 잔기를 갖도록, DNA에 대해 적어도 1염기를 삽입, 결실 또는 치환하는 유전자 조작 또는 변이처리를 행하는 것을 의미한다. 즉, 원래의 아미노산 잔기를 코드하는 코돈을, 목적의 아미노산 잔기를 코드하는 코돈으로 변환하는 것을 의미한다. 이러한 염기의 개변은, 부위 특이적 돌연변이(예를 들면, Kunkel(1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 488 참조), PCR 변이 도입법, 카세트 변이 등의 방법에 의해 행할 수 있다. 일반적으로, 생물학적 특성이 개선된 항체 변이체는 70% 이상, 보다 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상(예를 들면, 95% 이상, 97%, 98%, 99% 등)의 아미노산 서열의 상동성 및/또는 유사성을 기초가 된 항체의 가변영역의 아미노산 서열에 대해 갖는다. 본 명세서에 있어서, 서열의 상동성 및/또는 유사성은, 서열의 상동성이 최대의 값을 취하도록 필요에 따라 서열을 정렬화, 및 갭 도입한 후, 기초가 된 아미노산 잔기와 상동(동일한 잔기) 또는 유사(일반적인 아미노산의 측쇄의 특성에 기초하여 동일한 그룹으로 분류되는 아미노산 잔기)한 아미노산 잔기의 비율로서 정의된다. 통상, 천연의 아미노산 잔기는, 그 측쇄의 성질을 토대로 (1) 소수성：알라닌, 이소류신, 발린, 메티오닌 및 류신；(2) 중성 친수성：아스파라긴, 글루타민, 시스테인, 트레오닌 및 세린；(3) 산성：아스파라긴산 및 글루타민산；(4) 염기성：아르기닌, 히스티딘 및 리신；(5) 사슬의 배향에 영향을 미치는 잔기：글리신 및 프롤린；및(6) 방향족성：티로신, 트립토판 및 페닐알라닌의 그룹으로 분류된다. 아미노산의 개변체는, 예를 들면 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1 아미노산으로 할 수 있지만 이들에 한정되지 않는다.

통상, 중쇄 및 경쇄의 가변영역 중에 존재하는 전부 6개의 상보성 결정영역(초가변부;CDR)이 상호 작용하여, 항체의 항원 결합 부위를 형성하고 있다. 이 중 1개의 가변영역이더라도 전체 결합 부위를 포함하는 것보다는 낮은 친화성이 되는 것과, 항원을 인식하고, 결합하는 능력이 있는 것이 알려져 있다. 따라서, 본 발명의 항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드는 목적하는 항원과의 결합성을 유지하고 있으면 되고, 항체 중쇄 및 경쇄 각각의 항원 결합 부위를 포함하는 단편 부분을 코드하고 있어도 된다.

본 발명의 방법에 의해, 전술한 바와 같이, 예를 들면, 목적하는, 실제로 활성을 보유하는, 폴리펩티드 다량체를 효율적으로 취득할 수 있다.

본 발명의 바람직한 태양에 있어서 「개변」에 제공하는 아미노산 잔기로서는, 예를 들면, 항체 중쇄 및 경쇄의 가변영역의 아미노산 서열, 항체 경쇄 및 경쇄의 가변영역의 아미노산 서열 중에서 적절히 선택할 수 있다.

DNA의 발현

이와 같이 개변된 폴리펩티드를 코드하는 DNA는, 적당한 벡터로 클로닝(삽입)되어, 숙주세포로 도입된다. 벡터로서는, 삽입한 핵산을 안정하게 보유하는 것이라면 특별히 제한되지 않고, 예를 들면 숙주에 대장균을 사용하는 것이라면, 클로닝용 벡터를 들 수 있다. 클로닝용 벡터로서는 pBluescript 벡터(Stratagene사 제조) 등이 바람직하나, 시판의 각종 벡터를 이용할 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드 다량체 또는 폴리펩티드를 생산할 목적에 있어서 벡터를 사용하는 경우에는, 특히 발현 벡터가 유용하다. 발현 벡터로서는, 시험관 내, 대장균 내, 배양세포 내, 생물개체 내에서 폴리펩티드를 발현하는 벡터라면 특별히 제한되지 않는다. 예를 들면, 시험관 내 발현이라면 pBEST 벡터(프로메가사 제조), 대장균 내 발현이라면 pET 벡터(Invitrogen사 제조), 배양세포 내 발현이라면 pME18S-FL3 벡터(GenBank Accession No. AB009864), 생물개체 내에서의 발현이라면 pME18S 벡터(Mol Cell Biol. 8:466-472(1988)) 등이 바람직하다. 벡터로의 DNA의 삽입은, 통상의 방법에 의해, 예를 들면, 제한효소 사이트를 사용한 거즈 반응에 의해 행할 수 있다(Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al.(1987) Publish. John Wiley & Sons．Section 11.4-11.11).

상기 숙주세포로서는 특별히 제한은 없고, 목적에 따라 각종 숙주세포가 사용된다. 폴리펩티드를 발현시키기 위한 세포로서는, 예를 들면, 세균세포(예：스트렙토코커스, 스타필로코커스, 대장균, 스트렙토마이세스, 고초균), 진균세포(예：효모, 아스퍼질러스), 곤충세포(예：드로소필라S2, 스포도프테라SF9), 동물세포(예：CHO, COS, HeLa, C127, 3T3, BHK, HEK293, Bowes 흑색종 세포) 및 식물세포를 예시할 수 있다. 숙주세포로의 벡터 도입은, 예를 들면, 인산칼슘 침강법, 전기 펄스 천공법(Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al.(1987) Publish. John Wiley & Sons．Section 9.1-9.9), 리포펙션법, 마이크로인젝션법 등의 공지의 방법으로 행하는 것이 가능하다.

숙주세포에 있어서 발현한 폴리펩티드를 소포체의 내강에, 세포 주변강에, 또는 세포외의 환경에 분비시키기 위해서, 적당한 분비 시그날을 목적의 폴리펩티드에 삽입할 수 있다. 이들 시그날은 목적의 폴리펩티드에 대해 내인성이여도 되고, 이종 시그날이여도 된다.

또한 제1~제4 폴리펩티드의 발현 벡터의 구축에 있어서는, 제1~제4 폴리펩티드를 코드하는 DNA를 별개의 벡터에 도입하여, 발현 벡터로 할 수 있다. 또는, 제1~제4 폴리펩티드를 코드하는 DNA 중 복수의 DNA(예를 들면 제1 폴리펩티드를 코드하는 DNA와 제2 폴리펩티드를 코드하는 DNA)를 1개의 벡터에 도입하여, 발현 벡터로 할 수 있다. 1개의 벡터에 복수의 DNA를 도입하여 발현 벡터로 하는 경우, 도입되는 폴리펩티드를 코드하는 DNA의 조합은 한정되지 않는다.

발현산물의 회수

발현산물의 회수는, 폴리펩티드가 배지에 분비되는 경우는, 배지를 회수한다. 폴리펩티드가 세포 내에 생산되는 경우는, 그 세포를 먼저 용해하고, 그 후에 폴리펩티드를 회수한다.

재조합 세포 배양물로부터 폴리펩티드를 회수하여 정제하기 위해서는, 황산암모늄 또는 에탄올 침전, 산 추출, 음이온 또는 양이온 교환 크로마토그래피, 포스포셀룰로오스 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 히드록실아파타이트 크로마토그래피 및 렉틴 크로마토그래피를 포함한 공지의 방법을 사용할 수 있다.

본 발명에 있어서는 프로테인 A 친화성 크로마토그래피가 바람직하다.

프로테인 A를 사용한 칼럼으로서는, Hyper D(PALL 제조), POROS(Applied Biosystems 제조), Sepharose F. F.(GE 제조), ProSep(Millipore 제조) 등을 들 수 있지만 이들에 한정되지 않는다. 또한, 프로테인 A 친화성 크로마토그래피에는, 프로테인 A의 IgG 결합능을 mimic하는 리간드를 결합시킨 수지를 사용하는 것도 가능하다. 프로테인 A mimic을 사용한 경우도, 본 발명의 아미노산 개변에 의해, 그 결합력에 차가 생겨, 목적의 폴리펩티드 다량체를 분리·정제하는 것이 가능하다. 프로테인 A mimic으로서는, 예를 들면, mabSelect SuRE(GE Healthcare 제조)를 들 수 있지만 이것에 한정되지 않는다.

또한 본 발명은, 본 발명의 제조방법 또는 정제방법에 의해 얻어지는 폴리펩티드 다량체를 제공한다.

또한 본 발명은, 제1 항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드 및 제2 항원 결합 활성을 갖거나 또는 항원 결합 활성을 갖지 않는 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드 다량체로서, 제1 폴리펩티드와 제2 폴리펩티드의 프로테인 A로의 결합력이 상이한 폴리펩티드 다량체를 제공한다.

이러한 폴리펩티드 다량체는, 본 명세서에 기재된 방법에 의해 취득할 수 있다. 또한 이러한 폴리펩티드 다량체의 구체적인 구조나 성질은 전술한 바와 같다. 이하에 그 개요를 나타낸다.

본 발명의 폴리펩티드 다량체는, 아미노산 개변 전과 비교하여 프로테인 A로의 결합력이 개변되어 있다. 보다 구체적으로는, 제1 항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드 및 제2 항원 결합 활성을 갖거나 또는 항원 결합 활성을 갖지 않는 폴리펩티드의 양쪽 또는 어느 한쪽의 프로테인 A로의 결합력이 개변되어 있다. 본 발명의 폴리펩티드 다량체는, 제1 항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드의 프로테인 A로의 결합력과 제2 항원 결합 활성을 갖거나 또는 항원 결합 활성을 갖지 않는 폴리펩티드의 프로테인 A로의 결합력이 상이하다. 이 때문에, 친화성 크로마토그래피에 있어서 제1 폴리펩티드를 프로테인 A로부터 용출시키는 용매의 pH와, 제2 폴리펩티드를 프로테인 A로부터 용출시키는 용매의 pH가 상이하다.

또한 제1 폴리펩티드 및/또는 제2 폴리펩티드는, 1개 또는 2개의 제3 폴리펩티드와 다량체를 형성할 수 있다.

따라서 본 발명은, 제1 항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드, 제2 항원 결합 활성을 갖거나 또는 항원 결합 활성을 갖지 않는 폴리펩티드, 및 1개 또는 2개의 제3 항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드 다량체로서, 제1 폴리펩티드와 제2 폴리펩티드의 프로테인 A로의 결합력이 상이한 폴리펩티드 다량체에 관한 것이다. 이러한 폴리펩티드 다량체도 또한, 본 명세서에 기재된 방법에 의해 취득할 수 있다.

또한 상기 폴리펩티드 다량체에는, 제4 폴리펩티드가 포함되어 있어도 된다. 제1 폴리펩티드 또는 제2 폴리펩티드 중 어느 한쪽이 제3 폴리펩티드와 다량체를 형성하고, 다른 쪽이 제4 폴리펩티드와 다량체를 형성할 수 있다.

따라서 본 발명은, 제1 항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드, 제2 항원 결합 활성을 갖거나 또는 항원 결합 활성을 갖지 않는 폴리펩티드, 제3 항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드 및 제4 항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드 다량체로서, 제1 폴리펩티드와 제2 폴리펩티드의 프로테인 A로의 결합력이 상이한 폴리펩티드 다량체에 관한 것이다. 이러한 폴리펩티드 다량체도 또한, 본 명세서에 기재된 방법에 의해 취득할 수 있다.

상기 제1 항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드 및 제2 항원 결합 활성을 갖거나 또는 항원 결합 활성을 갖지 않는 폴리펩티드는, 항체 중쇄 불변영역의 아미노산 서열 또는 항체 Fc영역의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 항체 중쇄 불변영역 또는 항체 Fc영역의 아미노산 서열로서, 인간 IgG 유래의 불변영역의 아미노산 서열을 들 수 있지만 이것에 한정되지 않는다.

또한 상기 제3 항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드 및 제4 항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드는, 항체 경쇄 불변영역의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

또한 항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드는, 항체 가변영역(예를 들면 CDR1, CDR2, CDR3, FR1, FR2, FR3, FR4의 아미노산 서열)의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

또한 상기 제1 항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드 및 제2 항원 결합 활성을 갖거나 또는 항원 결합 활성을 갖지 않는 폴리펩티드는, 항체 중쇄의 아미노산 서열 또는 항체 경쇄 가변영역과 항체 중쇄 불변영역으로 되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 상기 제3 항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드 및 제4 항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드는, 항체 경쇄의 아미노산 서열 또는 항체 중쇄 가변영역과 항체 경쇄 불변영역으로 되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

본 발명의 폴리펩티드 다량체는, 다중 특이성 항체일 수 있다. 본 발명에 있어서의 다중 특이성 항체로서, 2종류의 항원에 대해 특이적으로 결합할 수 있는 이중 특이성 항체를 들 수 있지만 이것에 한정되지 않는다.

본 발명의 폴리펩티드 다량체는, 제1 항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드의 프로테인 A로의 결합력과 제2 항원 결합 활성을 갖거나 또는 항원 결합 활성을 갖지 않는 폴리펩티드의 프로테인 A로의 결합력이 상이하도록(차가 생기도록), 1 또는 복수의 아미노산 잔기가 개변되어 있다. 개변 위치로서는, 전술한 바와 같이, 예를 들면 항체의 Fc영역 또는 중쇄 불변영역에 있어서의 EU 넘버링 250-255번 위치의 TLMISR, 308-317번 위치의 VLHQDWLNGK, 430-436번 위치의 EALHNHY, 바람직하게는 250-254번 위치의 TLMIS, 309-312번 위치의 LHQD, 314-315번 위치의 LN, 430번 위치의 E, 432-436LHNHY, 더욱 바람직하게는 251-254번 위치의 LMIS, 309-311번 위치의 LHQ, 314번 위치의 L, 432-435번 위치의 LHNH, 특히 252-254번 위치의 MIS, 309번 위치의 L, 311번 위치의 Q, 434-436번 위치의 NHY의 아미노산 잔기를 들 수 있지만 이들에 한정되지 않는다. 또한 항체의 중쇄 가변영역의 아미노산의 개변에 관해서는, FR1, CDR2, FR3를 바람직한 개변 위치로서 들 수 있다.

보다 구체적으로는, 본 발명의 폴리펩티드 다량체로서, 제1 항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드 또는 제2 항원 결합 활성을 갖거나 또는 항원 결합 활성을 갖지 않는 폴리펩티드 중 어느 한쪽의 폴리펩티드에 있어서, 항체 Fc영역 또는 항체 중쇄 불변영역의 아미노산 서열에 있어서의 EU 넘버링 435번 위치의 아미노산 잔기가 히스티딘 또는 아르기닌이고,

다른 쪽의 폴리펩티드에 있어서, 항체 Fc영역 또는 항체 중쇄 불변영역의 아미노산 서열에 있어서의 EU 넘버링 435번 위치의 아미노산 잔기가 한쪽의 폴리펩티드와는 상이한 아미노산 잔기인 폴리펩티드 다량체를 들 수 있지만 이것에 한정되지 않는다.

또한 본 발명의 폴리펩티드 다량체로서, 제1 항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드 또는 제2 항원 결합 활성을 갖거나 또는 항원 결합 활성을 갖지 않는 폴리펩티드 중 어느 한쪽의 폴리펩티드에 있어서, 항체 중쇄 불변영역의 아미노산 서열에 있어서의 EU 넘버링 435번 위치 아미노산 잔기가 히스티딘이고,

다른 쪽의 폴리펩티드에 있어서, 항체 중쇄 불변영역의 아미노산 서열에 있어서의 EU 넘버링에 의한 435번 위치의 아미노산 잔기가 아르기닌인 폴리펩티드 다량체를 들 수 있지만 이것에 한정되지 않는다.

또한 본 발명의 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드 다량체로서 이하를 예시할 수 있지만 이들에 한정되지 않는다.

(1) 인간 IgG 유래의 항체 중쇄 불변영역의 아미노산 서열에 있어서의 EU 넘버링 435번 위치 및 436번 위치의 아미노산 잔기가 각각 히스티딘(His) 및 티로신(Tyr)으로 개변된 아미노산 서열을 포함하는 제1 폴리펩티드 또는 제2 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드 다량체.

이러한 폴리펩티드 다량체로서, 예를 들면, 서열번호：9, 11, 13 또는 15에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 제1 폴리펩티드 또는 제2 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드 다량체를 들 수 있지만 이들에 한정되지 않는다.

(2) 인간 IgG 유래의 항체 중쇄 불변영역의 아미노산 서열에 있어서의 EU 넘버링 435번 위치 및 436번 위치의 아미노산 잔기가 각각 아르기닌(Arg) 및 페닐알라닌(Phe)으로 개변된 아미노산 서열을 포함하는 제1 폴리펩티드 또는 제2 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드 다량체.

이러한 폴리펩티드 다량체로서, 예를 들면, 서열번호：10 또는 12에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 제1 폴리펩티드 또는 제2 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드 다량체를 들 수 있지만 이들에 한정되지 않는다.

(3) 인간 IgG 유래의 항체 중쇄 불변영역의 아미노산 서열에 있어서의 EU 넘버링 435번 위치 및 436번 위치의 아미노산 잔기가 각각 아르기닌(Arg) 및 티로신(Tyr)으로 개변된 아미노산 서열을 포함하는 제1 폴리펩티드 또는 제2 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드 다량체.

이러한 폴리펩티드 다량체로서, 예를 들면, 서열번호：14에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 제1 폴리펩티드 또는 제2 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드 다량체를 들 수 있지만 이들에 한정되지 않는다.

(4) 제1 폴리펩티드 또는 제2 폴리펩티드 중 어느 한쪽의 폴리펩티드에 있어서, 인간 IgG 유래의 항체 중쇄 불변영역의 아미노산 서열에 있어서의 EU 넘버링 435번 위치 및 436번 위치의 아미노산 잔기가 각각 히스티딘(His) 및 티로신(Tyr)으로 개변된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 및 다른 쪽의 폴리펩티드에 있어서 항체 중쇄 불변영역의 아미노산 서열에 있어서의 EU 넘버링 435번 위치 및 436번 위치의 아미노산 잔기가 각각 아르기닌(Arg) 및 페닐알라닌(Phe)으로 개변된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드 다량체.

이러한 폴리펩티드 다량체로서, 예를 들면, 서열번호：9, 11, 13 또는 15에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 제1 폴리펩티드 및 서열번호：10 또는 12에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 제2 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드 다량체를 들 수 있지만 이들에 한정되지 않는다.

(5) 제1 폴리펩티드 또는 제2 폴리펩티드 중 어느 한쪽의 폴리펩티드에 있어서, 인간 IgG 유래의 항체 중쇄 불변영역의 아미노산 서열에 있어서의 EU 넘버링 435번 위치 및 436번 위치의 아미노산 잔기가 각각 히스티딘(His) 및 티로신(Tyr)으로 개변된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 및 다른 쪽의 폴리펩티드에 있어서 항체 중쇄 불변영역의 아미노산 서열에 있어서의 EU 넘버링 435번 위치 및 436번 위치의 아미노산 잔기가 각각 아르기닌(Arg) 및 티로신(Tyr)으로 개변된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드 다량체.

이러한 폴리펩티드 다량체로서, 예를 들면, 서열번호：9, 11, 13 또는 15에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 제1 폴리펩티드 및 서열번호：14에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 제2 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드 다량체를 들 수 있지만 이들에 한정되지 않는다.

(6) 제1 폴리펩티드 또는 제2 폴리펩티드 중 어느 한쪽의 폴리펩티드에 있어서, 인간 IgG 유래의 항체 중쇄 불변영역의 아미노산 서열에 있어서의 EU 넘버링 435번 위치 및 436번 위치의 아미노산 잔기가 각각 아르기닌(Arg) 및 페닐알라닌(Phe)으로 개변된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 및 다른 쪽의 폴리펩티드에 있어서 항체 중쇄 불변영역의 아미노산 서열에 있어서의 EU 넘버링 435번 위치 및 436번 위치의 아미노산 잔기가 각각 아르기닌(Arg) 및 티로신(Tyr)으로 개변된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드 다량체.

　이러한 폴리펩티드 다량체로서, 예를 들면, 서열번호：10 또는 12에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 제1 폴리펩티드 및 서열번호：14에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 제2 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드 다량체를 들 수 있지만 이들에 한정되지 않는다.

상기 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드는, 추가로 항체 중쇄 가변영역을 포함할 수 있다. 또한 상기(1)~(6)의 폴리펩티드 다량체는, 제3 폴리펩티드 및/또는 제4 폴리펩티드를 가지고 있어도 된다.

또한 본 발명은, EU 넘버링 435번 위치 및 436번 위치의 아미노산 잔기 중 어느 한쪽에 변이를 갖는 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드 변이체를 제공한다. 이러한 폴리펩티드 변이체로서, 실시예에 예로 들어져 있는 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드 변이체를 들 수 있지만 이들에 한정되지 않는다.

또한 본 발명은, 본 발명의 폴리펩티드 다량체를 구성하는 폴리펩티드(항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드)를 코드하는 핵산을 제공한다. 또한 그 핵산을 담지하는 벡터를 제공한다.

또한 본 발명은, 상기 핵산 또는 벡터를 포함하는 숙주세포를 제공한다. 그 숙주세포는, 특별히 제한되지 않고, 예를 들면, 대장균이나 각종 식물세포, 동물세포 등을 들 수 있다. 숙주세포는, 예를 들면, 본 발명의 폴리펩티드 다량체 또는 폴리펩티드의 제조나 발현을 위한 생산계로서 사용할 수 있다. 폴리펩티드 다량체 또는 폴리펩티드 제조를 위한 생산계에는, in vitro 및 in vivo의 생산계가 있다. in vitro의 생산계로서는, 진핵세포를 사용하는 생산계 및 원핵세포를 사용하는 생산계를 들 수 있다.

숙주세포로서 사용할 수 있는 진핵세포로서, 예를 들면, 동물세포, 식물세포, 진균세포를 들 수 있다. 동물세포로서는, 포유류세포, 예를 들면, CHO(J. Exp. Med.(1995) 108: 945), COS, HEK293, 3T3, 골수종, BHK(baby hamster kidney), HeLa, Vero 등, 양서류세포, 예를 들면 아프리카발톱개구리 난모세포(Valle et al., Nature(1981) 291: 338-340), 및 곤충세포, 예를 들면, Sf9, Sf21, Tn5가 예시된다. 본 발명의 폴리펩티드 다량체 또는 폴리펩티드의 발현에 있어서는, CHO-DG44, CHO-DX11B, COS7세포, HEK293세포, BHK세포가 매우 적합하게 사용된다. 동물세포에 있어서, 대량 발현을 목적으로 하는 경우에는 특히 CHO세포가 바람직하다. 숙주세포로의 벡터의 도입은, 예를 들면, 인산칼슘법, DEAE 덱스트란법, 양이온성 리포솜 DOTAP(Boehringer Mannheim 제조)를 사용한 방법, 전기천공법, 리포펙션 등의 방법으로 행하는 것이 가능하다.

식물세포로서는, 예를 들면, 니코티아나 타바쿰(Nicotiana tabacum) 유래의 세포 및 개구리밥(Lemna minor)이 단백질 생산계로서 알려져 있어, 이 세포를 캘러스 배양하는 방법에 의해 본 발명의 폴리펩티드 다량체 또는 폴리펩티드를 생산시킬 수 있다. 진균세포로서는, 효모, 예를 들면, 사카로마이세스(Saccharomyces)속의 세포(사카로마이세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae), 사카로마이세스 폼베(Saccharomyces pombe) 등), 및 사상균, 예를 들면, 아스퍼질러스(Aspergillus)속의 세포(아스퍼질러스 니거(Aspergillus niger) 등)를 사용한 단백질 발현계가 공지이고, 본 발명의 폴리펩티드 다량체 또는 폴리펩티드 생산의 숙주로서 이용할 수 있다.

원핵세포를 사용하는 경우, 세균세포를 사용하는 생산계가 있다. 세균세포로서는, 전술한 대장균(E. coli)에 더하여, 고초균을 사용한 생산계가 알려져 있어, 본 발명의 폴리펩티드 다량체 또는 폴리펩티드 생산에 이용할 수 있다.

본 발명의 숙주세포를 사용하여 폴리펩티드 다량체 또는 폴리펩티드를 생산하는 경우, 본 발명의 폴리펩티드 다량체 또는 폴리펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터에 의해 형질전환된 숙주세포의 배양을 행하여, 폴리뉴클레오티드를 발현시키면 된다. 배양은, 공지의 방법에 따라서 행할 수 있다. 예를 들면, 동물세포를 숙주로 한 경우, 배양액으로서, 예를 들면, DMEM, MEM, RPMI1640, IMDM을 사용할 수 있다. 그 때, FBS, 소태아혈청(FCS) 등의 혈청 보액을 병용해도 되고, 무혈청배양에 의해 세포를 배양해도 된다. 배양시의 pH는, 약 6~8로 하는 것이 바람직하다. 배양은, 통상, 약 30~40℃에서 약 15~200시간 행하고, 필요에 따라 배지의 교환, 통기, 교반을 추가한다.

한편, in vivo에서 폴리펩티드를 생산시키는 계로서는, 예를 들면, 동물을 사용하는 생산계나 식물을 사용하는 생산계를 들 수 있다. 이들 동물 또는 식물에 목적으로 하는 폴리뉴클레오티드를 도입하여, 동물 또는 식물의 체내에서 폴리펩티드를 생산시키고, 회수한다. 본 발명에 있어서의 「숙주」란, 이들 동물, 식물을 포함한다.

동물을 사용하는 경우, 포유류동물, 곤충을 사용하는 생산계가 있다. 포유류동물로서는, 염소, 돼지, 양, 마우스, 소 등을 사용할 수 있다(Vicki Glaser, SPECTRUM Biotechnology Applications(1993)). 또한, 포유류동물을 사용하는 경우, 형질전환 동물을 사용할 수 있다.

예를 들면, 본 발명의 폴리펩티드 다량체 또는 폴리펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드를, 염소β카제인과 같은 유즙 중에 고유하게 생산되는 폴리펩티드를 코드하는 유전자와의 융합 유전자로서 조제한다. 이어서, 이 융합 유전자를 포함하는 폴리뉴클레오티드 단편을 염소의 배(胚)로 주입하고, 이 배를 암컷의 염소에게 이식한다. 배를 수용한 염소로부터 태어나는 형질전환 염소 또는 그의 자손이 생산하는 유즙으로부터, 목적의 항체를 얻을 수 있다. 형질전환 염소로부타 생산되는 항체를 포함하는 유즙량을 증가시키기 위해, 적절히 호르몬을 형질전환 염소에 투여해도 된다(Ebert et al., Bio/Technology(1994) 12: 699-702).

또한, 본 발명의 폴리펩티드 다량체 또는 폴리펩티드를 생산시키는 곤충으로서는, 예를 들면 누에를 사용할 수 있다. 누에를 사용하는 경우, 목적의 폴리펩티드 다량체 또는 폴리펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드를 삽입한 바큘로바이러스를 누에에 감염시킴으로써, 이 누에의 체액으로부터 목적의 폴리펩티드 다량체 또는 폴리펩티드를 얻을 수 있다(Susumu et al., Nature(1985) 315: 592-4).

또한, 식물을 본 발명의 폴리펩티드 다량체 또는 폴리펩티드 생산에 사용하는 경우, 예를 들면 담배를 사용할 수 있다. 담배를 사용하는 경우, 목적으로 하는 폴리펩티드 다량체 또는 폴리펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드를 식물 발현용 벡터, 예를 들면 pMON 530에 삽입하고, 이 벡터를 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)와 같은 박테리아에 도입한다. 이 박테리아를 담배, 예를 들면, 니코티아나 타바쿰(Nicotiana tabacum)에 감염시키고, 본 담뱃잎으로부터 목적하는 폴리펩티드 다량체 또는 폴리펩티드를 얻을 수 있다(Ma et al., Eur. J. Immunol.(1994) 24: 131-8). 또한, 동일한 박테리아를 개구리밥(Lemna minor)에 감염시키고, 클론화한 후에 개구리밥의 세포로부터 목적하는 폴리펩티드 다량체 또는 폴리펩티드를 얻을 수 있다(Cox KM et al. Nat. Biotechnol. 2006 Dec;24(12):1591-1597).

이와 같이 하여 얻어진 폴리펩티드 다량체 또는 폴리펩티드는, 숙주세포 내 또는 세포외(배지, 유즙 등)로부터 단리하여, 실질적으로 순수하고 균일한 폴리펩티드 다량체 또는 폴리펩티드로서 정제할 수 있다. 폴리펩티드 다량체 또는 폴리펩티드의 분리, 정제는, 통상의 폴리펩티드의 정제에서 사용되고 있는 분리, 정제방법을 사용하면 되고, 조금도 한정되는 것은 아니다. 예를 들면, 크로마토그래피 칼럼, 필터, 한외여과, 염석, 용매 침전, 용매 추출, 증류, 면역 침강, SDS-폴리아크릴아미드겔 전기영동, 등전점 전기영동법, 투석, 재결정 등을 적절히 선택, 조합해서 항체를 분리, 정제할 수 있다.

크로마토그래피로서는, 예를 들면 친화성 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 소수성 크로마토그래피, 겔여과, 역상 크로마토그래피, 흡착 크로마토그래피 등을 들 수 있다(Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual. Ed Daniel R. Marshak et al.(1996) Cold Spring Harbor Laboratory Press). 이들 크로마토그래피는, 액상 크로마토그래피, 예를 들면 HPLC, FPLC 등의 액상 크로마토그래피를 사용하여 행할 수 있다. 친화성 크로마토그래피에 사용하는 칼럼으로서는, 프로테인 A 칼럼, 프로테인 G 칼럼을 들 수 있다. 예를 들면, 프로테인 A를 사용한 칼럼으로서, Hyper D, POROS, Sepharose F. F.(Pharmacia 제조) 등을 들 수 있지만 이들에 한정되지 않는다.

필요에 따라, 폴리펩티드 다량체 또는 폴리펩티드의 정제 전 또는 정제 후에 적당한 단백질 수식 효소를 작용시킴으로써, 임의로 수식을 가하거나 부분적으로 펩티드를 제거하는 것도 가능하다. 단백질 수식 효소로서는, 예를 들면, 트립신, 키모트립신, 리실엔도펩티다아제, 프로테인키나아제, 글루코시다아제 등이 사용된다.

전술한 바와 같이 본 발명의 숙주세포를 배양하고, 그 세포 배양물로부터 폴리펩티드를 회수하는 공정을 포함하는, 본 발명의 폴리펩티드 다량체 또는 폴리펩티드의 제조방법도 또한, 본 발명의 바람직한 태양의 하나이다.

또한 본 발명은, 본 발명의 폴리펩티드 다량체 또는 폴리펩티드, 및 의약적으로 허용되는 담체를 포함하는 의약 조성물(약제)에 관한 것이다. 본 발명에 있어서 의약 조성물이란, 통상, 질환의 치료 또는 예방, 또는 검사·진단을 위한 약제를 말한다.

본 발명의 의약 조성물은, 당업자에게 공지의 방법으로 제제화하는 것이 가능하다. 예를 들면, 물 또는 그것 이외의 약학적으로 허용 가능한 액체와의 무균성 용액, 또는 현탁액제의 주사제의 형태로 비경구적으로 사용할 수 있다. 예를 들면, 약리학상 허용되는 담체 또는 촉매, 구체적으로는, 멸균수나 생리식염수, 식물유, 유화제, 현탁제, 계면활성제, 안정제, 향미제, 부형제, 비히클, 방부제, 결합제 등과 적절히 조합하여, 일반적으로 인정된 제약 실시에 요구되는 단위용량 형태로 혼화함으로써 제약화하는 것을 생각할 수 있다. 이들 제제에 있어서의 유효 성분량은, 지시된 범위의 적당한 용량이 얻어지도록 설정한다.

주사를 위한 무균 조성물은 주사용 증류수와 같은 비히클을 사용하여 통상의 제제 실시에 따라 처방할 수 있다.

주사용 수용액으로서는, 예를 들면 생리식염수, 포도당이나 기타 보조약(예를 들면 D-소르비톨, D-만노오스, D-만니톨, 염화나트륨)을 포함하는 등장액을 들 수 있다. 적당한 용해 보조제, 예를 들면 알코올(에탄올 등), 폴리알코올(프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜 등), 비이온성 계면활성제(폴리소르베이트 80(TM), HCO-50 등)를 병용해도 된다.

유성액으로서는 참기름, 대두유를 들 수 있고, 용해 보조제로서 안식향산 벤질 및/또는 벤질알코올을 병용해도 된다. 또한, 완충제(예를 들면, 인산염 완충액 및 초산나트륨 완충액), 무통화제(예를 들면, 염산프로카인), 안정제(예를 들면, 벤질알코올 및 페놀), 산화방지제와 배합해도 된다. 조제된 주사액은 통상, 적당한 앰플에 충전한다.

본 발명의 의약 조성물은, 바람직하게는 비경구투여에 의해 투여된다. 예를 들면, 주사제형, 경비 투여제형, 경폐 투여제형, 경피 투여형의 조성물로 할 수 있다. 예를 들면, 정맥내 주사, 근육내 주사, 복강내 주사, 피하 주사 등에 의해 전신 또는 국부적으로 투여할 수 있다.

투여방법은, 환자의 연령, 증상에 따라 적절히 선택할 수 있다. 폴리펩티드 다량체 또는 폴리펩티드, 또는 그들을 코드하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 의약 조성물의 투여량은, 예를 들면, 1회당 체중 1 ㎏당 0.0001 ㎎~1000 ㎎의 범위로 설정하는 것이 가능하다. 또는, 예를 들면, 환자당 0.001~100000 ㎎의 투여량으로 하는 것도 가능하나, 본 발명은 이들 수치에 반드시 제한되는 것은 아니다. 투여량 및 투여방법은, 환자의 체중, 연령, 증상 등에 따라 변동되나, 당업자라면 그들의 조건을 고려하여 적당한 투여량 및 투여방법을 설정하는 것이 가능하다.

또한, 필요에 따라 본 발명의 다중 특이성 항체를, 그 밖의 의약 성분과 조합하여 제제화하는 것도 가능하다.

또한 본 명세서에 있어서 인용된 모든 선행기술문헌은, 참조로써 본 명세서에 포함된다.

실시예

이하, 실시예를 사용하여 본 발명을 더욱 구체적으로 설명한다. 단, 본 발명의 기술적 범위는 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

[실시예 1] 항체 유전자 발현 벡터의 제작과 각 항체의 발현

항체 H쇄 가변영역으로서, 다음의 것이 사용되었다. Q153(항인간 F.IX 항체의 H쇄 가변영역, 서열번호：1), Q407(항인간 F.IX 항체의 H쇄 가변영역, 서열번호：2), J142(항인간 F.X 항체의 H쇄 가변영역, 서열번호：3), J300(항인간 F.X 항체의 H쇄 가변영역, 서열번호：4), MRA-VH(항인간 인터류킨-6 수용체 항체의 H쇄 가변영역, 서열번호：5).

항체 L쇄로서, 다음의 것이 사용되었다. L180-k(항인간 F.IX 항체/항인간 F.X 항체 공통 L쇄, 서열번호：6), L210-k(항인간 F.IX 항체/항인간 F.X 항체 공통 L쇄, 서열번호：7), MRA-k(항인간 인터류킨-6 수용체 항체의 L쇄, 서열번호：8).

항체 H쇄 불변영역으로서, 다음의 것이 사용되었다. IgG4에 EU 넘버링 228번째의 Ser을 Pro로 치환하는 변이를 도입하여 C말단의 Gly 및 Lys를 제거한 G4d(서열번호：9), G4d에 EU 넘버링 435번째의 His를 Arg로 치환하는 변이, EU 넘버링 436번째의 Tyr을 Phe로 치환하는 변이 및 EU 넘버링 445번째의 Leu를 Pro로 치환하는 변이를 도입한 z72(서열번호：10), G4d에 EU 넘버링 356번째의 Glu를 Lys로 치환하는 변이를 도입한 z7(서열번호：11), z72에 EU 넘버링 439번째의 Lys를 Glu로 치환하는 변이를 도입한 z73(서열번호：12), z7에 EU 넘버링 196번째의 Lys를 Gln으로 치환하는 변이, EU 넘버링 296번째의 Phe를 Tyr로 치환하는 변이 및 EU 넘버링 409번째의 Arg를 Lys로 치환하는 변이를 도입한 z106(서열번호：13), z73에 EU 넘버링 196번째의 Lys를 Gln으로 치환하는 변이, EU 넘버링 296번째의 Phe를 Tyr로 치환하는 변이, EU 넘버링 409번째의 Arg를 Lys로 치환하는 변이 및 EU 넘버링 436번째의 Phe를 Tyr로 치환하는 변이를 도입한 z107(서열번호：14), IgG1의 C말단의 Gly 및 Lys를 제거한 G1d(서열번호：15). EU 넘버링 356번째의 Glu를 Lys로 치환하는 변이 및 EU 넘버링 439번째의 Lys를 Glu로 치환하는 변이는, 헤테로 항체를 생산할 때, 각 H쇄의 헤테로 분자를 효율적으로 형성시키기 위함이다((WO 2006/106905) PROCESS FOR PRODUCTION OF POLYPEPTIDE BY REGULATION OF ASSEMBLY).

Q153의 하류에 G4d 또는 z7을 연결함으로써, 항인간 F.IX 항체 H쇄 유전자 Q153-G4d 또는 Q153-z7이 제작되었다. Q407의 하류에 z106을 연결함으로써, 항인간 F.IX 항체 H쇄 유전자 Q407-z106이 제작되었다. J142의 하류에 G4d, z72 또는 z73을 연결함으로써, 항인간 F.X 항체 H쇄 유전자 J142-G4d, J142-z72 또는 J142-z73이 제작되었다. J300의 하류에 z107을 연결함으로써, 항인간 F.X 항체 H쇄 유전자 J300-z107가 제작되었다. MRA-VH의 하류에 G1d, z106 또는 z107을 연결함으로써, 항인간 인터류킨-6 수용체 항체 H쇄 유전자 MRA-G1d, MRA-z106 또는 MRA-z107이 제작되었다.

각 항체 유전자(Q153-G4d, Q153-z7, Q407-z106, J142-G4d, J142-z72, J142-z73, J300-z106, MRA-G1d, MRA-z106, MRA-z107, L180-k, L210-k, MRA-k)는, 동물세포 발현 벡터에 삽입되었다.

제작한 발현 벡터를 사용하여, 이하의 항체를 FreeStyle293세포(invitrogen)로의 트랜스펙션에 의해, 일과성으로 발현시켰다. 이하와 같이, 트랜스펙션하는 복수의 항체 유전자를 나열한 것을 항체명으로서 표기하였다.

MRA-G1d/MRA-k

MRA-z106/MRA-z107/MRA-k

Q153-G4d/J142-G4d/L180-k

Q153-G4d/J142-z72/L180-k

Q153-z7/J142-z73/L180-k

Q407-z106/J300-z107/L210-k

[실시예 2] 프로테인 A 친화성 크로마토그래피의 용출 조건의 검토

Q153-G4d/J142-G4d/L180-k 및 Q153-G4d/J142-z72/L180-k를 일과성으로 발현시켜서 얻어진 FreeStyle293세포 배양액(이하 CM으로 줄인다)을 시료로 하여, 프로테인 A 친화성 크로마토그래피의 용출 조건을 검토하였다. D-PBS로 평형화한 rProtein A Sepharose Fast Flow 칼럼(GE Healthcare)에, ø0.22 ㎛ 필터로 여과한 CM을 부하하고, 표 1에 나타내는 세정 1, 2, 용출 1~5를 단계적으로 실시하였다. 칼럼에 부하하는 항체량이 20 ㎎/mL resine이 되도록 CM의 부하량을 조절하였다. 각 조건의 용출 분획을 분취하고, 양이온 교환 크로마토그래피 분석에 의해, 각 용출 분획에 포함되어 있는 성분을 동정하였다. 대조에는 각 CM을 rProtein G Sepharose Fast Flow 수지(GE Healthcare)에 부하하고, 배치로 용출함으로써 정제한 시료를 사용하였다. 프로테인 G는 항체의 Fab 부분에 결합하기 때문에, 프로테인 G를 사용함으로써, 프로테인 A로의 친화성과는 무관하게, CM 중에 존재하는 모든 항체(목적의 2종류의 H쇄가 헤테로 회합화한 이중 특이성 항체(헤테로 항체), 및 불순물의 1종류의 H쇄가 호모 회합화한 단일 특이성의 호모 항체)를 정제하는 것이 가능하다.

Q153-G4d/J142-G4d/L180-k 및 Q153-G4d/J142-z72/L180-k를 발현시킨 CM의 프로테인 A 칼럼의 각 용출 분획(용출 1~5)의 양이온 교환 크로마토그래피 분석을 행하였다. Q153-G4d/J142-G4d/L180-k는, 용출 1 분획에서 용출 5 분획으로 됨에 따라, 즉 용출에 사용한 용매의 pH가 내려감에 따라, 각 분획에 포함되는 항체 성분이, 호모 항체 J142-G4d/L180-k에서 헤테로 항체 Q153-G4d/J142-G4d/L180-k, 그리고 호모 항체 Q153-G4d/L180-k의 순으로 변화되고 있는 것이 판명되었다. 용출의 순번은 프로테인 A로의 결합력의 강도에 준하고 있는 것으로 생각된다. 즉, 고pH에서 용출된 호모체 J142-G4d/L180-k(FX에 대한 호모 항체)보다도 저pH가 될 때까지 결합한 그대로였던 호모 항체 Q153-G4d/L180-k 쪽이 프로테인 A에 대한 결합력이 강한 것이 된다. 가변영역 J142는 프로테인 A에 결합하지 않는 서열인 것을 알 수 있다. 즉, 호모체 J142-G4d/L180-k(FX에 대한 호모 항체)는 프로테인 A로의 결합 부위가 2개소, 헤테로 항체 Q153-G4d/J142-G4d/L180-k는 3개소, 호모 항체 Q153-G4d/L180-k(FIX에 대한 호모 항체)는 4개소로 되어 있다. 따라서, 프로테인 A로의 결합 부위 수가 많을수록, 프로테인 A에 강하게 결합하여, 용출시키기 위해 필요한 pH가 낮아진다는 것이 판명되었다.

한편 Q153-G4d/J142-z72/L180-k의 경우는, 용출 1 분획에서 용출 5 분획으로 됨에 따라, 각 분획에 포함되는 항체 성분이, 헤테로 항체 Q153-G4d/J142-z72/L180-k 이어서 호모 항체 Q153-G4d/L180-k의 순서로 변화되어 있는 것이 판명되었다. 호모 항체 J142-z72/L180-k(FX에 대한 호모 항체)는 각 용출 분획에 있어서 거의 검출되지 않았기 때문에, 프로테인 A에 대한 결합이 결실되어 있는 것이 시사되었다. J142-z72에 도입되어 있는 EU 넘버링 435번째의 His를 Arg로 치환하는 변이에 의해, 프로테인 A에 결합하지 않게 되는 것으로 생각된다. 호모 항체 J142-z72/L180-k(FX에 대한 호모 항체)는 프로테인 A로의 결합 부위가 없고, 헤테로 항체 Q153-G4d/J142-z72/L180-k는 2개소, 호모 항체 Q153-G4d/L180-k(FIX에 대한 호모 항체)는 4개소가 된다. 호모 항체 J142-z72/L180-k(FX에 대한 호모 항체)는 프로테인 A에 결합하지 않고 그대로 지나가기 때문에, 각 용출 분획에서 검출되지 않았다. 또한, Q153-G4d/J142-G4d/L180-k 및 Q153-G4d/J142-z72/L180-k 모두, pH 3.6으로 그 이하의 pH에서 헤테로 항체와 호모 항체 Q153-G4d/L180-k(FIX에 대한 호모 항체)를 분리할 수 있을 가능성이 시사되었다.

[실시예 3] 프로테인 A 크로마토그래피에 의한 헤테로 항체의 분리 정제

하기에 나타내는 항체의 CM을 시료로서 사용하였다.

·Q153-G4d/J142-G4d/L180-k

·Q153-G4d/J142-z72/L180-k

·Q153-z7/J142-z73/L180-k

·Q407-z106/J300-z107/L210-k

D-PBS로 평형화한 rProtein A Sepharose Fast Flow 칼럼(GE Healthcare)에 ø0.22 ㎛ 필터로 여과한 CM을 부하하고, 표 2에 나타내는 세정 1, 2, 용출 1, 2를 실시하였다(Q407-z106/J300-z107/L210-k는 용출 1만의 실시). 용출 조건은 실시예 2의 결과를 참고로 하였다. 부하하는 항체량이 20 ㎎/mL resine이 되도록 CM의 부하량을 조절하였다. 각 조건의 용출 분획을 분취하고, 양이온 교환 크로마토그래피 분석에 의해, 각 용출 분획에 포함되어 있는 성분을 동정하였다. 대조에는 실시예 2와 동일하게, 각 CM을 rProtein G Sepharose Fast Flow 수지(GE Healthcare)에 부하하고, 배치로 용출함으로써 정제한 시료를 사용하였다.

각 용출 분획의 양이온 교환 크로마토그래피 분석의 결과를 이하의 표 3에 나타내었다. 값은 용출 피크의 면적을 퍼센트로 표기하였다. Q153-G4d/J142-G4d/L180-k 이외의 항체에서는 FX에 대한 호모 항체가 어느 용출 분획에도 거의 검출되지 않았다. 실시예 2에서 나타낸 호모 항체 J142-z72(FX에 대한 호모 항체)뿐 아니라, 호모 항체 J142-z73 및 J300-z107(FX에 대한 호모 항체)도 프로테인 A에 결합하지 않게 되어 있다고 하는 것이 판명되었다. 이는, FX에 대한 항체의 H쇄 불변영역에 도입되어 있는 EU 넘버링 435번째의 His를 Arg로 치환하는 변이에 의해 FX에 대한 호모 항체에 있어서 프로테인 A에 대한 결합성이 상실되어 있기 때문이라고 생각되었다. 목적의 이중 특이성 항체인 헤테로 항체는 대부분이 용출 1 분획에서 검출되고, FIX에 대한 호모 항체는 용출 1 분획에도 조금 검출되었으나, 대부분이 용출 2에서 용출되어 있었다. Q153-G4d/J142-z72/L180-k와 비교하여, Q153-z7/J142-z73/L180-k 및 Q407-z106/J300-z107/L210-k에 있어서, pH 3.6 용출 분획의 목적의 이중 특이성 항체인 헤테로 항체의 비율이 대폭 향상되었다. EU 넘버링 435번째의 His를 Arg로 치환하는 변이에 더하여, 각 H쇄의 헤테로 분자를 효율적으로 형성시키기 위한 EU 넘버링 356번째의 Glu를 Lys로 치환하는 변이 및 EU 넘버링 439번째의 Lys를 Glu로 치환하는 변이를 도입함으로써, 프로테인 A 정제공정만으로, 목적의 이중 특이성 항체인 헤테로 항체를 98% 이상의 순도로 정제 가능한 것이 명확해졌다.

이상으로부터, 호모 항체와 헤테로 항체의 프로테인 A 결합부위의 수의 차를 이용하여, 프로테인 A 크로마토그래피 공정만을 사용함으로써, 헤테로 항체를 고순도로 또한 효율적으로 분리 정제하는 것이 가능한 것을 발견하였다.

[실시예 4] 인간 FcRn 형질전환 마우스에 있어서의 약물동태 평가

실시예 3의 검토에 의해, 이중 특이성 항체의 각 H쇄 불변영역에 z106(서열번호：13) 및 z107(서열번호：14)을 사용함으로써, 목적의 이중 특이성 항체인 헤테로 항체를 프로테인 A 공정만으로 98% 이상의 순도로 정제 가능한 것이 발견되었다. 한편, 프로테인 A와 인간 FcRn은 IgG 항체의 동일 개소를 인식하기 때문에(J Immunol. 2000 164(10):5313-8.), 프로테인 A로의 결합성을 상실케 함으로써, 인간 FcRn으로의 결합성도 상실될 가능성이 높다. 실제로, 프로테인 A를 사용하여 95%의 순도까지 이중 특이성 항체를 정제하는 방법으로서 보고되어 있는 랫트 IgG2b의 H쇄(프로테인 A에 결합하지 않는다)를 사용하는 방법이 보고되어 있으나, 이 방법을 사용하여 정제된 이중 특이성 항체인 Catumaxomab은, 인간에 있어서의 반감기가 약 2.1일로, 통상의 인간 IgG1의 반감기는 2~3주간인 것과 비교하여 매우 짧다(비특허문헌 2). 이에, 실시예 3에 사용한 z106(서열번호：13)과 z107(서열번호：14)을 불변영역으로서 갖는 항체의 약물동태의 평가를 행하였다.

인간에 있어서의 반감기를 예측하는 약물동태 시험으로서, 인간 FcRn 형질전환 마우스(B6.mFcRn-/-.hFcRn Tg line 276 +/+ 마우스, Jackson Laboratories)를 사용한 약물동태의 평가는 이하와 같이 행하였다. IgG1을 불변영역으로서 갖는 MRA-G1d/MRA-k(이하 MRA-IgG1) 및 z106/z107을 불변영역으로서 갖는 MRA-z106/MRA-z107/MRA-k(이하 MRA-z106/z107)를 각각 마우스에 1 ㎎/㎏의 투여량으로 정맥 내에 단회 투여하고 적시 채혈을 행하였다. 채취한 혈액은 바로 4℃, 15,000 rpm으로 15분간 원심 분리하여, 혈장을 얻었다. 분리한 혈장은, 측정을 실시할 때까지 -20℃ 이하로 설정된 냉동고에 보존하였다. 혈장중 농도는 ELISA법을 사용해서 측정하였다.

MRA-IgG1 및 MRA-z106/z107k의 인간 FcRn 형질전환 마우스에 있어서의 혈장중 체류성의 평가를 행한 결과, 도 1에 나타내는 바와 같이, MRA-z106/z107은 MRA-IgG1과 비교하여 동등 이상의 혈장중 체류성을 나타내었다. 이것에 의해, 헤테로 항체를 프로테인 A 정제공정만으로 고순도로 또한 효율적으로 정제 또는 제조할 수 있는 불변영역인 z106/z107은, 인간 IgG1과 동등 이상의 혈장중 체류성을 갖는 것이 발견되었다.

[실시예 5] 항체 유전자 발현 벡터의 제작과 각 항체의 발현

항체 H쇄 가변영역으로서, 다음의 것이 사용되었다.

·Q499(항인간 F.IX 항체의 H쇄 가변영역, 서열번호：16)

·J339(항인간 F.X 항체의 H쇄 가변영역, 서열번호：17).

항체 L쇄로서, 다음의 것이 사용되었다.

·L377-k(항인간 F.IX 항체/항인간 F.X 항체 공통 L쇄, 서열번호：18).

항체 H쇄 불변영역으로서, 다음의 것이 사용되었다.

·실시예 1에 기재된 z106에 EU 넘버링 405번째의 Leu를 Phe로 치환하는 변이를 도입한 z118(서열번호：19)

　·z118에 EU 넘버링 435번째의 His를 Arg로 치환하는 변이를 도입한 z121(서열번호：20)

·z118에 EU 넘버링 356번째의 Lys를 Glu로 치환하는 변이 및 EU 넘버링 439번째의 Glu를 Lys로 치환하는 변이를 도입한 z119(서열번호：21)

Q499의 하류에 z118 또는 z121을 연결함으로써, 항인간 F.IX 항체 H쇄 유전자 Q499-z118 또는 Q499-z121이 제작되었다. J339의 하류에 z119를 연결함으로써, 항인간 F.X 항체 H쇄 유전자 J339-z119가 제작되었다.

각 항체 유전자(Q499-z118, Q499-z121, J339-z119, L377-k)는, 동물세포 발현 벡터에 삽입되었다.

Q499-z118/J339-z119/L377-k

Q499-z121/J339-z119/L377-k

상기 2개의 항체는, 항인간 F.IX 항체 H쇄의 EU 넘버링 435번째의 아미노산이 다를뿐이다. z118은 435번째가 His이고, 프로테인 A에 대한 결합능을 가지고 있으나, z121은 435번째가 Arg이고, 실시예 2보다 프로테인 A에 대한 결합은 없어진다고 생각된다. Q499는 그 서열로부터 프로테인 A에는 결합하는 것이 예상되기 때문에, Q499-z118/J339-z119/L377-k의 호모체 J339-z119/L377-k(FX에 대한 호모 항체)는 프로테인 A로의 결합 부위가 2개소, 헤테로 항체 Q499-z118/J339-z119/L377-k는 3개소, 호모 항체 Q499-z118/L377-k(FIX에 대한 호모 항체)는 4개소로 되어 있다. 한편, 프로테인 A 비결합 개변이 도입된 Q499-z121/J339-z119/L377-k의 호모체 J339-z119/L377-k는 프로테인 A로의 결합 부위가 2개소, 헤테로 항체 Q499-z121/J339-z119/L377-k는 2개소, 호모 항체 Q499-z121/L377-k는 2개소로 되어 있다. 즉, 프로테인 A 비결합 개변(예를 들면 EU 넘버링 435번째의 아미노산을 Arg로 치환하는 개변)은, 가변영역에서 프로테인 A에 결합하는 H쇄에만 도입해도, 프로테인 A 정제공정만으로 헤테로 항체를 고순도로 또한 효율적으로 분리 정제하는 효과는 얻어지지 않는다. 그러나, Q499에 결합하지 않는 개변 프로테인 A인 MabSelct SuRe(GE Healthcare)를 사용함으로써, 프로테인 A 비결합 개변의 효과를 낼 수 있다. MabSelect SuRe는 공업적 요구를 만족시키기 위해 개발된 항체 정제용 크로마토그래피 담체이고, 리간드는 유전자 공학적으로 알칼리 내성을 유지시킨 제조합 프로테인 A이다. 높은 pH 안정성을 갖기 때문에, 낮은 가격으로 또한 효율적인 NaOH에 의한 세정이 가능하다. 또한, Q499 등의 VH3 서브클래스의 중쇄 가변영역에 결합하지 않는다고 하는 특징을 가지고 있다. Q499-z118/J339-z119/L377-k의 호모체 J339-z119/L377-k는 MabSelect SuRe으로의 결합 부위가 2개소, 헤테로 항체 Q499-z118/J339-z119/L377-k는 2개소, 호모 항체 Q499-z118/L377-k는 2개소로 되어 있다. 한편, Q499-z121/J339-z119/L377-k의 호모체 J339-z119/L377-k는 MabSelect SuRe으로의 결합 부위가 2개소, 헤테로 항체 Q499-z121/J339-z119/L377-k는 1개소, 호모 항체 Q499-z121/L377-k는 0개소로 되어 있다. 즉, MabSelect SuRe 등, 항체 가변영역에 결합하지 않는 개변 프로테인 A와, 프로테인 A 비결합 개변을 조합함으로써, 중쇄 가변영역의 프로테인 A 결합능에 관계없이, 프로테인 A 정제공정만으로 헤테로 항체를 고순도로 또한 효율적으로 분리 정제할 수 있다고 생각된다.

[실시예 6] 개변 프로테인 A 친화성 크로마토그래피에 의한헤테로 항체의 분리 정제

Q499-z118/J339-z119/L377-k 및 Q499-z121/J339-z119/L377-k를 발현시킨 CM의 개변 프로테인 A 친화성 크로마토그래피를 행하였다. D-PBS로 평형화한 Mab Select SuRe 칼럼(GE Healthcare)에 ø0.22 ㎛ 필터로 여과한 CM을 부하하고, 표 7에 나타내는 세정 1, 2, 용출을 실시하였다. Mab Select SuRe는, 재조합 프로테인 A의 IgG 결합능을 갖는 5개의 도메인(A~E) 중, B 도메인에 대해 유전자 공학이 실시되어, 그 개변 B 도메인을 테트라머화한 구조로 된다. Mab Select SuRe는, 항체의 가변영역으로의 결합능이 결실되어 있어, 그것에 의해 통상의 재조합 프로테인 A보다도 온화한 조건에서 항체를 용출할 수 있다고 하는 특징을 가지고 있다. 또한, 알칼리 내성이 증강되어 있어, 0.1~0.5 M NaOH에서의 정치 세정이 가능하기 때문에, 생산에 보다 적합한 수지이다. 본 실시예에서는, 실시예 3과 같은 pH 3.6 및 pH 2.7의 단계적 용출이 아닌, 표 7에 나타내는 바와 같이 50 mM Acetic acid(pH 미조정, 실측 pH 3.0 부근)를 채용하였다. 용출 분획을 분취하고, 양이온 교환 크로마토그래피 분석에 의해 각 용출 분획에 포함되어 있는 성분을 동정하였다. 대조에는 실시예 2와 동일하게, 각 CM을 rProtein G Sepharose Fast Flow 수지(GE Healthcare)에 부하하고, 배치로 용출함으로써 정제한 시료를 사용하였다.

프로테인 A 용출 분획은, 이어서 이온 교환 크로마토그래피를 행하였다. 평형화 버퍼(20 mM NaPhosphate buffer, pH 6.0)로 평형화한 SP Sepharose High Performance 칼럼(GE Healthcare)에, 1.5 M Tris-HCl, pH 7.4에 의한 중화 후, 평형화 버퍼로 3배 희석한 프로테인 A 용출 분획을 부하하였다. 25 column volume(CV)으로 50 mM~350 mM의 NaCl 농도 구배를 걸음으로써, 칼럼에 결합한 항체를 용출시켰다. 헤테로 항체가 용출된 분획은, superdex200에 의한 겔 여과 크로마토그래피 정제에 제공하여, 모노머 성분을 분취하였다. 이것을 실시예 7에 기재하는 인간 FcRn 형질전환 마우스에 있어서의 약물동태 평가에 사용하였다.

각 용출 분획의 양이온 교환 크로마토그래피 분석 결과를 표 8 및 표 9에 나타내었다. Q499-z118/J339-z119/L377-k의 경우는, 표 8에 나타내는 바와 같이, 용출 분획에 포함되는 각 성분의 비율이 대조와 비교하여 그다지 변화하지 않았다. 이는, J339-z119/L377-k(F.X에 대한 호모 항체), Q499-z118/L377-k(F.IX에 대한 호모 항체), Q499-z118/J339-z119/L377-k(헤테로 항체)의 3종 모두의 개변 프로테인 A에 대한 결합 부위가 2개소이기 때문에, 프로테인 A 정제공정 중의 결합이나 해리에 차가 생기지 않았기 때문이라고 생각되었다.

한편, Q499-z121/J339-z119/L377-k는, 표 9에 나타내는 바와 같이, 용출 분획에 포함되는 Q499-z121/L377-k(F.IX에 대한 호모 항체)의 비율이, 대조와 비교하여 현저히 감소하였다. 이에 대해, J339-z119/L377-k(F.X에 대한 호모 항체) 및 Q499-z121/J339-z119/L377-k(헤테로 항체)의 용출 분획의 비율은, Q499-z121/L377-k가 감소한 것에 수반하여, 대조와 비교하여 상대적으로 증가하는 결과가 되었다. 이는, 개변 프로테인 A에 대한 결합 부위가, J339-z119/L377-k(F.X에 대한 호모 항체)가 2개소, Q499-z121/J339-z119/L377-k(헤테로 항체)가 1개소, Q499-z121/L377-k(F.IX에 대한 호모 항체)가 0개소로, 대부분의 Q499-z121/L377-k가 개변 프로테인 A에 결합하지 않고 그냥 지나갔기 때문이라고 생각되었다.

이상으로부터, 프로테인 A 결합능을 갖는 가변영역을 갖는 항체에 있어서도, 프로테인 A 비결합 개변과 개변 프로테인 A를 조합함으로써, 프로테인 A 정제공정만으로 한쪽의 호모 항체를 현저히 감소히켜, 헤테로 항체의 순도를 높일 수 있는 것을 발견하였다.

[실시예 7] 인간 FcRn 형질전환 마우스에 있어서의 약물동태 평가

실시예 6에서 조제된 Q499-z118/J339-z119/L377-k와 Q499-z121/J339-z119/L377-k의 약물동태 평가를 행하였다.

도 2와 같이, 프로테인 A와 인간 FcRn은 IgG 항체의 동일 개소를 인식하기 때문에(J Immunol. 2000 164(10):5313-8.), 인간 FcRn으로의 결합을 유지한 채로 프로테인 A로의 결합 활성을 조정하는 것은 곤란할 것으로 예상된다. 인간 FcRn으로의 결합력의 유지는, IgG 타입의 항체의 특징인 인간에 있어서의 긴 혈장중 체류성(긴 반감기)에 매우 중요하다. 이에, 실시예 6에서 조제된 Q499-z118/J339-z119/L377-k와 Q499-z121/J339-z119/L377-k의 약물동태를 비교하였다.

인간에 있어서의 반감기를 예측하는 약물동태 시험으로서, 인간 FcRn 형질전환 마우스(B6.mFcRn-/-.hFcRn Tg line 276 +/+ 마우스, Jackson Laboratories)를 사용한 약물동태의 평가는 이하와 같이 행하였다. Q499-z118/J339-z119/L377-k 및 Q499-z121/J339-z119/L377-k를 각각 마우스에 5 ㎎/㎏의 투여량으로 정맥 내에 단회 투여하고 적시 채혈을 행하였다. 채취한 혈액은 바로 4℃, 15,000 rpm으로 15분간 원심 분리하여, 혈장을 얻었다. 분리한 혈장은, 측정을 실시할 때까지 -20℃ 이하로 설정된 냉동고에 보존하였다. 혈장중 농도는 ELISA법을 사용해서 측정하였다.

그 결과, 도 3에 나타내는 바와 같이, Q499-z118/J339-z119/L377-k와 Q499-z121/J339-z119/L377-k는 동 정도의 혈장중 체류성을 나타내었다. 이것에 의해, 한쪽의 H쇄에 Protein A 비결합 개변이 도입된 불변영역인 z121/z119는, 프로테인 A 비결합 개변이 도입되어 있지 않은 z118/z119와 동등한 혈장중 체류성을 갖는 것이 발견되었다. 따라서, 가변영역에 의하지 않고 프로테인 A 정제공정만으로 헤테로 항체를 고순도로 또한 효율적으로 분리 정제할 수 있고, 약물동태에도 영향을 미치지 않는, 프로테인 A 비결합 개변(예를 들면 EU 넘버링 435번째의 아미노산을 Arg로 치환하는 개변)을 발견할 수 있었다.

[실시예 8] GC33-IgG1-CD3-scFv의 CH3 도메인으로의 변이 도입에 의한 프로테인 A 정제공정만을 사용한 목적 분자의 조제

프로테인 A에 의한 GC33-IgG1-CD3-scFv 분자의 정제를 위한 변이 도입

항GPC3 IgG 항체의 2개의 H쇄 중, 한쪽의 H쇄에만 항CD3 scFv 항체를 부여한 분자(도 4)의 제작을 검토하였다. 본 분자는, 암 특이적 항원인 glypican-3(GPC3)에 2가로 결합하고, T세포 항원인 CD3에 1가로 결합함으로써, 암세포에 T세포를 리쿠르팅(recruiting)하여 암세포를 살상하는 것이 가능하다고 생각되었다. CD3에 1가로 결합하기 위해서는, 2개의 H쇄 중, 한쪽의 H쇄에만 항CD3 scFv 항체가 부가되어 있을 필요가 있기 때문에, 이들 2종류의 H쇄의 헤테로 회합화한 분자의 정제가 필요하다.

이에, 실시예 3과 동일한 수법을 사용하여, 한쪽의 H쇄에 EU 넘버링 435번째의 His를 Arg로 치환하는 변이를 도입하고, 또한, 2종류의 H쇄의 헤테로 회합화를 촉진하는 개변으로서 WO 2006/106905(PROCESS FOR PRODUCTION OF POLYPEPTIDE BY REGULATION OF ASSEMBLY)에 기재된 변이(한쪽의 H쇄의 EU 넘버링 356번째의 Asp를 Lys로 치환하고, 다른 쪽의 H쇄의 EU 넘버링 439번째의 Lys를 Glu로 치환한다)를 조합함으로써, 프로테인 A 크로마토그래피만으로, 목적으로 하는 분자를 정제하는 것이 가능한지 여부를 검증하였다.

항체 유전자 발현 벡터의 제작과 각 항체의 발현

항체 H쇄 가변영역으로서, GPC3(항인간 Glypican-3 항체 H쇄 가변영역, 서열번호：22)를 코드하는 유전자를 당업자에게 공지의 방법에 의해 제작하였다. 항체 L쇄로서, GC33-k0(항인간 Glypican-3 항체 L쇄, 서열번호：23)를 코드하는 유전자를 당업자에게 공지의 방법에 의해 제작하였다. 항체 H쇄 불변영역으로서, 이하에 나타내는 유전자를 당업자에게 공지의 방법에 의해 제작하였다.

·IgG1에 EU 넘버링 234번째 및 235번째의 Leu를 Ala로 치환하고, 297번째의 Asn을 Ala로 치환하는 변이를 도입하여, C말단의 Gly 및 Lys를 제거한 LALA-G1d(서열번호：24)

·LALA-G1d에 CD3의 scFv(항인간 CD3 항체 H쇄 가변영역 및 항인간 CD3 항체 L쇄 가변영역을 폴리펩티드 링커로 결합한 것)를 C말단에 결합한 LALA-G1d-CD3(서열번호：25)

·LALA-G1d에 EU 넘버링 435번째의 His를 Arg로 치환하는 변이 및 EU 넘버링 439번째의 Lys를 Glu로 치환하는 변이를 도입한 LALA-G3S3E-G1d(서열번호：26), LALA-G1d-CD3에 EU 넘버링 356번째의 Asp를 Lys로 치환하는 변이를 도입한 LALA-S3K-G1d-CD3(서열번호：27).

항인간 Glypican-3 항체의 H쇄 가변영역 GPC3의 하류에, H쇄 불변영역에 항CD3 scFv 항체를 부여한 LALA-G1d-CD3 또는 H쇄 불변영역인 LALA-G1d를 연결함으로써, 항인간 GPC3 항체 H쇄 유전자 NTA1L 또는 NTA1R이 제작되었다. 또한, GPC3의 하류에 H쇄 불변영역에 항CD3 scFv 항체를 부여하고, 또한, EU 넘버링 356번째의 Asp를 Lys로 치환하는 변이를 도입한 LALA-S3K-G1d-CD3 또는 EU 넘버링 435번째의 His를 Arg로 치환하는 변이 및 EU 넘버링 439번째의 Lys를 Glu로 치환하는 변이를 도입한 LALA-G3S3E-G1d를 연결함으로써, 항인간 GPC3 항체 H쇄 유전자 NTA2L 또는 NTA2R이 제작되었다. 제작한 유전자는 이하와 같다.

H쇄

·NTA1L：GPC3-LALA-G1d-CD3

·NTA1R：GPC3-LALA-G1d

·NTA2L：GPC3-LALA-S3K-G1d-CD3

·NTA2R：GPC3-LALA-G3S3E-G1d

L쇄

·GC33-k0

각 항체 유전자(H쇄；NTA1L, NTA1R, NTA2L, NTA2R, L쇄；GC33-k0)는, 동물세포 발현 벡터에 삽입되었다. 제작한 발현 벡터를 사용하여, 이하의 항체를 당업자에게 공지의 방법으로 FreeStyle293세포(invitrogen)로 트랜스펙션하여, 일과성으로 발현시켰다. 이하와 같이, 트랜스펙션하는 복수의 항체 유전자를 나열한 것을 항체명으로서 표기하였다(제1 H쇄/제2 H쇄/L쇄).

·NTA1L/NTA1R/GC33-k0

·NTA2L/NTA2R/GC33-k0

발현 샘플의 프로테인 정제와 헤테로다이머 수율의 평가

하기에 나타내는 항체의 FreeStyle293세포의 배양상청(CM)을 시료로서 사용하였다.

·NTA1L/NTA1R/GC33-k0

·NTA2L/NTA2R/GC33-k0

D-PBS로 평형화한 rProtein A Sepharose Fast Flow 칼럼(GE Healthcare)에 ø0.22 ㎛ 필터로 여과한 CM을 부하하고, 표 10에 나타내는 세정 1, 2, 용출 1을 실시하였다. 부하하는 항체량이 20 ㎎/mL resine이 되도록 CM의 부하량을 조절하였다. 용출 분획을 분취하고, 사이즈 배제 크로마토그래피 분석에 의해, 용출 분획에 포함되어 있는 성분을 동정하였다.

각 용출 분획의 사이즈 배제 크로마토그래피 분석의 결과를 이하의 도 5 및 표 11에 나타내었다. 값은 용출 피크의 면적을 퍼센트로 표기하였다. NTA1L/NTA1R/GC33-k0 및 NTA2L/NTA2R/GC33-k0는 양쪽 사슬에 항CD3 scFv 항체를 갖는 호모 항체(NTA1L 호모 항체 및 NTA2L 호모 항체)가 거의 검출되지 않았다. 이는 일반적으로 scFv 분자의 발현량이 낮은 것으로부터, 항CD3 scFv 항체를 포함하는 H쇄의 발현이 매우 낮은 것에 기인하는 것으로 생각되었다. 양쪽 사슬에 항CD3 scFv 항체를 갖지 않는 호모 항체에 대해서는, NTA1L/NTA1R/GC33-k0에 있어서는 NTA1R 호모 항체가 76% 정도 검출된 것에 대해, NTA2R 호모 항체가 NTA2L/NTA2R/GC33-k0에 있어서는 2% 정도밖에 검출되지 않았다. 즉, EU 넘버링 435번째의 His를 Arg로 치환하는 변이에 더하여, 각 H쇄의 헤테로 분자를 효율적으로 형성시키기 위한 EU 넘버링 356번째의 Glu를 Lys로 치환하는 변이 및 EU 넘버링 439번째의 Lys를 Glu로 치환하는 변이를 도입함으로써, 프로테인 A 정제공정만으로, 목적으로 하는 분자형의 헤테로 항체를 98% 이상의 순도로 효율적으로 정제 가능한 것이 명확해졌다.

[실시예 9] Monovalent type 항체의 CH3 도메인으로의 변이 도입에 의한 프로테인 A 정제공정만을 사용한 목적 분자의 조제

프로테인 A에 의한 monovalent type 항체 분자의 정제를 위한 변이 도입

통상의 항GPC3 IgG 항체는 2개의 H쇄에 의해 암특이적 항원인 glypican-3(GPC3)에 2가로 결합한다. 본 실시예에서는, 1가로 glypican-3에 결합하는 항GPC3 IgG 항체 분자(도 6)의 제작을 검토하였다. 본 분자는, 암특이적 항원인 glypican-3(GPC3)에 1가로 결합함으로써, 통상의 2가의 항체와 비교하여 avidity가 아닌 affinity로 결합하고, 추가로 항원을 크로스링크하지 않고 결합하는 것이 가능할 것으로 생각되었다. Glypican-3(GPC3)에 1가로 결합하기 위해서는, 2개의 H쇄 중, 한쪽의 H쇄는 통상의 H쇄이고, 다른 쪽의 H쇄는 가변영역과 CH1 도메인을 결손시킨 힌지 Fc 도메인의 H쇄일 필요가 있기 때문에, 이들 2종류의 H쇄의 헤테로 회합화한 분자의 정제가 필요하다.

항체 유전자 발현 벡터의 제작과 각 항체의 발현

항체 H쇄 가변영역으로서, 다음의 것이 사용되었다. GPC3(항인간 Glypican-3 항체 H쇄 가변영역, 서열번호：22).

항체 L쇄로서, 다음의 것이 사용되었다. GC33-k0(항인간 Glypican-3 항체의 L쇄, 서열번호：23).

항체 H쇄 불변영역으로서, 다음의 것이 사용되었다.

·LALA-G1d에 EU 넘버링 435번째의 His를 Arg로 치환하는 변이를 도입한 LALA-G3-G1d(서열번호：28)

·LALA-G3-G1d에 EU 넘버링 439번째의 Lys를 Glu로 치환하는 변이를 도입한 LALA-G3S3E-G1d(서열번호：26)

·LALA-G1d의 EU 넘버링 1번째부터 215번째까지를 결손시킨 LALA-G1Fc(서열번호：29), G1Fc에 EU 넘버링 356번째의 Asp를 Lys로 치환하는 변이를 도입한 LALA-G1Fc-S3K(서열번호：30).

항인간 Glypican-3 항체의 H쇄 가변영역 GPC3의 하류에 H쇄 불변영역인 LALA-G1d, EU 넘버링 435번째의 His를 Arg로 치환하는 변이를 도입한 LALA-G3-G1d 또는 EU 넘버링 435번째의 His를 Arg로 치환하는 변이와 EU 넘버링 439번째의 Lys를 Glu로 치환하는 변이를 도입한 LALA-G3S3E-G1d를 연결함으로써, 항인간 GPC3 항체 H쇄 유전자 NTA4L-cont, NTL4L-G3 또는 NTA4L이 제작되었다. 또한 항인간 힌지 Fc 도메인인 LALA-G1Fc 또는 EU 넘버링 356번째의 Asp를 Lys로 치환하는 변이를 도입한 힌지 Fc 도메인인 LALA-G1Fc-S3K로서, Fc 유전자 NTA4R-cont 또는 NTA4R이 제작되었다. 제작한 유전자는 이하와 같다.

H쇄

·NTA4L-cont：GPC3-LALA-G1d

·NTA4L-G3：GPC3-LALA-G3-G1d

·NTA4L：GPC3-LALA-G3S3E-G1d

·NTA4R-cont: LALA-G1Fc

·NTA4R: LALA-G1Fc-S3K

L쇄

·GC33-k0

각 항체 유전자(NTA4L, NTA4L-cont, NTA4L-G3, NTA4R, NTA4R-cont, GC33-k0)는, 동물세포 발현 벡터에 삽입되었다.

　　·NTA4L-cont/NTA4R-cont/GC33-k0

　　·NTA4L-G3/NTA4R-cont/GC33-k0

　　·NTA4L/NTA4R/GC33-k0

발현 샘플의 프로테인 정제와 헤테로다이머 수율의 평가

하기에 나타내는 항체의 CM을 시료로서 사용하였다.

·NTA4L-cont/NTA4R-cont/GC33-k0

·NTA4L-G3/NTA4R-cont/GC33-k0

·NTA4L/NTA4R/GC33-k0

D-PBS로 평형화한 rProtein A Sepharose Fast Flow 칼럼(GE Healthcare)에 ø0.22 ㎛ 필터로 여과한 CM을 부하하고, 표 12에 나타내는 세정 1, 2, 용출 1을 실시하였다. 부하하는 항체량이 20 ㎎/mL resine이 되도록 CM의 부하량을 조절하였다. 용출 분획을 분취하고, 사이즈 배제 크로마토그래피 분석에 의해, 용출 분획에 포함되어 있는 성분을 동정하였다.

각 용출 분획의 사이즈 배제 크로마토그래피 분석의 결과를 이하의 도 7 및 표 13에 나타내었다. 값은 용출 피크의 면적을 퍼센트로 표기하였다.

NTA4L-cont/NTA4R-cont/GC33-k0는 GPC3에 대해 2가로 결합하는 호모 항체(NTA4L-cont 호모 항체) 및 GPC3 결합 부위를 갖지 않는 호모 분자(NTA4R-cont 호모 항체)가 용출되어, 목적으로 하는 NTA4L-cont/NTA4R-cont 헤테로 항체는 겨우 46.5%였다.

NTA4L-G3/NTA4R-cont/GC33-k0에 있어서는, GPC3에 대해 2가로 결합하는 호모 항체(NTA4L-G3호모 항체)가 거의 검출되지 않았으나, GPC3 결합 부위를 갖지 않는 호모 분자(NTA4R-cont 호모 항체)는 많이 포함되어 있어, 목적으로 하는 NTA4L-G3/NTA4R-cont 헤테로 항체는 66.7%였다. NTA4L/NTA4R/GC33-k0에 있어서는, GPC3에 대해 2가로 결합하는 호모 항체(NTA4L호모 항체)가 거의 검출되지 않고, 또한 GPC3 결합 부위를 갖지 않는 호모 분자(NTA4R)의 비율이 대폭 저감되어, 목적으로 하는 NTA4L/NTA4R 헤테로 항체의 비율은 93.0%까지 대폭 향상되었다. 즉, EU 넘버링 435번째의 His를 Arg로 치환하는 변이에 더하여, 각 H쇄의 헤테로 분자를 효율적으로 형성시키기 위한 EU 넘버링 356번째의 Asp를 Lys로 치환하는 변이 및 EU 넘버링 439번째의 Lys를 Glu로 치환하는 변이를 도입함으로써, 프로테인 A 정제공정만으로, 목적으로 하는 분자형의 헤테로 항체를 93% 이상의 순도로 효율적으로 정제 가능한 것이 명확해졌다.

[실시예 10] pH 구배 용출에 의한 프로테인 A 칼럼크로마토그래피 정제공정을 사용한 헤테로 항체의 조제

실시예 9에 기재한 바와 같이 한쪽 팔에만 가변영역을 갖는 항체는, EU 넘버링 435번째의 His를 Arg로 치환하는 변이, WO 2006/106905(PROCESS FOR PRODUCTION OF POLYPEPTIDE BY REGULATION OF ASSEMBLY)에 기재된 변이(한쪽의 H쇄 또는 Fc의 EU 넘버링 356번째의 Asp를 Lys로 치환하고, 다른 쪽의 H쇄의 EU 넘버링 439번째의 Lys를 Glu로 치환한다)를 조합함으로써, 프로테인 A 정제공정만으로 효율적으로 헤테로 항체를 정제할 수 있는 것이 발견되었다. 그러나, 용출액 1(2 mM HCl, pH 2.7)로 용출하는 것만으로는, 헤테로 항체의 순도는 충분히 높다고는 할 수 없어, 추가적인 정제공정을 필요로 한다.

이에 실시예에서는, 프로테인 A에 대한 결합 부위 수가 많을수록 프로테인 A에 강하게 결합하여, 용출시키기 위해 필요한 pH가 낮아지는 것을 이용한 pH 구배 용출에 의한 프로테인 A 칼럼크로마토그래피 정제에 의해, 보다 고순도로 헤테로 항체를 분리 정제 가능한지 여부를 검증하였다. pH 구배 용출에 의해, 헤테로 항체의 순도를 100% 가까이까지 높일 수 있으면, 정제공정의 코스트 다운과 효율화를 달성할 수 있다.

하기에 나타내는 항체의 CM을 시료로서 사용하였다.

·NTA4L-cont/NTA4R-cont/GC33-k0

·NTA4L-G3/NTA4R-cont/GC33-k0

·NTA4L/NTA4R/GC33-k0

D-PBS로 평형화한 HiTrap protein A HP 칼럼(GE Healthcare)에, ø0.22 ㎛ 필터로 여과한 CM을 부하하고, 표 14에 나타내는 세정 1, 2, 용출 A·B를 사용한 pH 구배 용출을 순서대로 실시하였다. pH 구배 용출은, 용출A：용출B(100:0)→(30:70) 35분의 직선 구배로 하여 실시하였다. 용출 분획을 분취하고, 사이즈 배제 크로마토그래피 분석에 의해, 각 용출 분획에 포함되어 있는 성분을 동정하였다.

NTA4L-cont/NTA4R-cont/GC33-k0とNTA4L-G3/NTA4R-cont/GC33-k0와 NTA4L/NTA4R/GC33-k0의 pH 구배 용출 조건에 따른 프로테인 A 칼럼크로마토그래피 정제의 크로마토그램을 도 8에 나타내었다. NTA4L-cont/NTA4R-cont/GC33-k0는 브로드한 피크가 1개 용출되었다. NTA4L-G3/NTA4R-cont/GC33-k0는 pH 구배 용출에 의해, 2개의 용출 피크가 확인되고, 고pH측의 피크를 용출 1, 저pH측의 피크를 용출 2로 하였다. NTA4L/NTA4R/GC33-k0는 NTA4L-G3/NTA4R-cont/GC33-k0와 대략 동일한 결과로 되었으나, 용출 2의 피크 면적이 작았다.

각 용출 피크의 사이즈 배제 크로마토그래피 분석결과를 표 15에 나타내었다. NTA4L-cont/NTA4R-cont/GC33-k0는, 용출되는 순번으로, GPC3에 대해 2가로 결합하는 호모 항체(NTA4L-cont 호모 항체), GPC3에 대해 1가로 결합하는 헤테로 항체(NTA4L-cont/NTA4R-conc 헤테로 항체), GPC3 결합 부위를 갖지 않는 호모 분자(NTA4R-cont 호모 항체)의 3성분이 검출되었다. 각 성분의 프로테인 A에 대한 결합 부위 수가 동일(2개)하기 때문에, pH 구배 용출로 3성분을 분리할 수 없었다고 생각된다. NTA4L-G3/NTA4R-cont/GC33-k0의 용출 1은, GPC3에 대해 2가로 결합하는 호모 항체(NTA4L-G3 호모 항체) 및 GPC3 결합 부위를 갖지 않는 호모 분자(NTA4R-cont 호모 항체)가 검출한계 이하이며, GPC3에 대해 1가로 결합하는 헤테로 항체(NTA4L-G3/NTA4R-conc 헤테로 항체)가 99.6%인 것이 판명되었다. 용출 2에서는, 98.8%가 GPC3 결합 부위를 갖지 않는 호모 분자(NTA4R-cont 호모 항체)인 것이 판명되었다. NTA4L-G3 호모 항체는 EU 넘버링 435번째의 His를 Arg로 치환하는 변이에 의해, 프로테인 A에 결합할 수 없기 때문에, 프로테인 A 칼럼을 그대로 지나간다. 또한, 프로테인 A에 대한 결합 부위 수는 NTA4L-G3/NTA4R-conc 헤테로 항체가 1개, NTA4R-cont 호모 항체는 2개이며, 결합 부위 수가 많을수록 프로테인 A에 강하게 결합하여 용출시키기 위해 필요한 pH가 낮아지기 때문에, NTA4R-cont 호모 항체가 NTA4L-G3/NTA4R-conc 헤테로 항체보다도 저pH에서 용출되었다고 생각된다. NTA4L/NTA4R/GC33-k0에 대해서도 대략 동일한 결과로 되었다. 사이즈 배제 크로마토그래피 분석결과는, NTA4L-G3/NTA4R-cont/GC33-k0와 거의 동일한 성분비였으나, 프로테인 A의 크로마토그램에는 차이가 있어, NTA4L/NTA4R/GC33-k0 쪽이 용출 1에 대한 용출 2의 피크 면적이 작았다. 이는 NTA4L-G3/NTA4R-conc 헤테로 항체를 효율적으로 형성시키기 위한 변이가 도입되어 있기 때문에, 용출 2의 메인 성분인 NTA4R-cont 호모 항체의 발현비율이 저하되었기 때문이다. 상기 아미노산 변이에 의해, pH 구배 용출에 의한 프로테인 A 칼럼크로마토그래피 정제의 헤테로 항체의 정제의 수율 및 견뢰성이 향상될 수 있었다.

이상으로부터, pH 구배 용출에 의한 프로테인 A 칼럼크로마토그래피 정제공정만으로, 헤테로 항체를 고순도로 또한 효율적으로 분리 정제하는 것이 가능한 것을 발견하였다.

[실시예 11] Monovalent Fcalpha 리셉터 Fc 융합 단백질의 CH3 도메인으로의 변이 도입에 의한 프로테인 A 정제공정만을 사용한 목적 분자의 조제

CH3 도메인으로의 변이 도입에 의해 프로테인 A 정제공정에 의한 Monovalent Fcalpha 리셉터 Fc 융합 단백질의 조제

Eternercept나 Abatacept를 비롯한 통상의 Fc 리셉터 Fc 융합 단백질은 호모다이머로, 리간드에 대해 2가로 결합할 수 있다. 본 실시예에서는, 리간드인 IgA에 대해 1가로 결합하는 Fcalpha 리셉터 Fc 융합(도 9)의 제작을 검토하였다. Fcalpha 리셉터가 IgA에 1가로 결합하기 위해서는, 2개의 Fc 리셉터 Fc 융합 H쇄 중, 한쪽의 H쇄는 전장이고, 힌지 Fc 도메인의 H쇄일 필요가 있기 때문에, 이들 2종류의 H쇄의 헤테로 회합화한 분자의 정제가 필요하다.

이에, 실시예 6과 동일한 수법을 사용하여, 한쪽의 H쇄에 EU 넘버링 435번째의 His를 Arg로 치환하는 변이를 도입하고, 또한, 2종류의 H쇄의 헤테로 회합화를 촉진하는 개변으로서 WO 2006/106905(PROCESS FOR PRODUCTION OF POLYPEPTIDE BY REGULATION OF ASSEMBLY)에 기재된 변이(한쪽의 H쇄의 EU 넘버링 356번째의 Asp를 Lys로 치환하고, 다른 쪽의 H쇄의 EU 넘버링 439번째의 Lys를 Glu로 치환한다)를 조합함으로써, 프로테인 A 크로마토그래피만으로, 목적으로 하는 분자를 정제하는 것이 가능한지 여부를 검증하였다.

항체 유전자 발현 벡터의 제작과 각 항체의 발현

Fc 리셉터로서 FcalphaR(인간 IgA1 리셉터, 서열번호：31)을 사용하였다.

융합 H쇄 불변영역으로서 다음의 것이 사용되었다.

·IgG1의 EU 넘버링 1번째부터 223번째까지와 C말단의 Gly 및 Lys를 결손시킨 인간 힌지 Fc 도메인인 G1Fc(서열번호：32)

·G1Fc에 EU 넘버링 356번째의 Asp를 Lys로 치환하는 변이를 도입하고, 추가적으로 435번째의 His를 Arg로 치환하는 변이를 도입한 G1Fc-G3S3K(서열번호：33)

·G1Fc에 EU 넘버링 439번째의 Lys를 Glu로 치환하는 변이를 도입한 G1Fc-S3E(서열번호：34)

FcalphaR의 하류에 폴리펩티드 링커(서열번호 35)를 매개로, H쇄 불변영역인 G1Fc, 및 EU 넘버링 356번째의 Asp를 Lys로, 435번째의 His를 Arg로 치환하는 변이를 도입한 G1Fc-G3S3K를 연결함으로써, FcalphaR-Fc 융합 단백질 IAL-cont 및 IAL이 제작되었다.

또한 인간 힌지 Fc 도메인인 G1Fc 또는 EU 넘버링 439번째의 Lys를 Glu로 치환하는 변이를 도입한 힌지 Fc 도메인인 G1Fc-S3E로서, Fc 유전자 IAR-cont 또는 IAR이 제작되었다. 제작한 유전자는 이하와 같다.

H쇄

·IAL-cont：FcalphaR-G1Fc

·IAL：FcalphaR-G1Fc-G3S3K

·IAR-cont: G1Fc

·IAR:G1Fc-S3E

각 항체 유전자(IAL-cont, IAL, IAR-cont, IAR)는, 동물세포 발현 벡터에 삽입되었다.

·IAL-cont/IAR-cont

·IAL/IAR

발현 샘플의 프로테인 정제와 헤테로다이머 수율의 평가

하기에 나타내는 항체의 CM을 시료로서 사용하였다.

·IAL-cont/IAR-cont

·IAL/IAR

D-PBS로 평형화한 rProtein A Sepharose Fast Flow 칼럼(GE Healthcare)에 ø0.22 ㎛ 필터로 여과한 CM을 부하하고, 표 16에 나타내는 세정 1, 2, 용출 1을 실시하였다. 부하하는 항체량이 20 ㎎/mL resine이 되도록 CM의 부하량을 조절하였다. 용출 분획을 분취하고, 사이즈 배제 크로마토그래피 분석에 의해, 용출 분획에 포함되어 있는 성분을 동정하였다.

각 용출 분획의 사이즈 배제 크로마토그래피 분석의 결과를 이하의 도 10 및 표 17에 나타내었다. 값은 용출 피크의 면적을 퍼센트로 표기하였다. IAL-cont/IAR-cont는 IgA에 대해 2가로 결합하는 호모 항체(IAL-cont 호모 항체) 및 IgA 결합 부위를 갖지 않는 호모 분자(IAR-cont 호모 항체)가 용출되어, 목적으로 하는 IAL-cont/IAR-cont 헤테로 항체는 겨우 30%였다. IAL/IAR에 있어서는, IgA에 대해 2가로 결합하는 호모 항체(IAL호모 항체)가 검출되지 않고, 또한 IgA 결합 부위를 갖지 않는 호모 분자(IAR 호모 항체)의 비율이 대폭 저감되어, 목적으로 하는 IAL/IAR 헤테로 항체의 비율은 대략 96%까지 대폭 향상되었다. 즉, EU 넘버링 435번째의 His를 Arg로 치환하는 변이에 더하여, 각 H쇄의 헤테로 분자를 효율적으로 형성시키기 위한 EU 넘버링 356번째의 Asp를 Lys로 치환하는 변이 및 EU 넘버링 439번째의 Lys를 Glu로 치환하는 변이를 도입함으로써, 프로테인 A 정제공정만으로, 목적으로 하는 분자형의 헤테로 항체를 95% 이상의 순도로 효율적으로 정제 가능한 것이 명확해졌다.

[실시예 12] 4쇄 IgG형 이중 특이성 항체의 조제

항체 유전자 발현 벡터의 제작과 각 항체의 발현

실시예 1에서 조제한 인간 F.IX와 인간 F.X에 대한 이중 특이성 항체는, 각각의 항원을 인식하는 2종류의 H쇄와 공통의 L쇄로 구성된다. 이러한 공통 L쇄를 갖는 이중 특이성 항체는 취득하는 것이 용이하지 않다. 그것은 2종류의 항원을 공통의 서열을 갖는 L쇄로 인식하는 것이 곤란하기 때문이다. 이와 같이 공통 L쇄의 취득이 매우 곤란한 것으로부터, 2종류의 항원을 인식하는 2종류의 H쇄와 2종류의 L쇄로 구성되는 이중 특이성 항체 쪽이 바람직하다고 생각되나, 2종류의 H쇄와 2종류의 L쇄를 발현시키면, 이들이 랜덤으로 조합됨으로써 10종류의 H2L2형의 IgG 분자가 발현되어 버린다. 이들 10종류 중 목적으로 하는 이중 특이성 항체를 정제하는 것은 매우 곤란하다.

본 실시예에서는, 인간 IL-6 리셉터와 인간 glypican-3(GPC3)에 대한 2종류의 H쇄와 2종류의 L쇄로 구성되는 이중 특이성 항체의 조제를 검토하였다. 2종류의 H쇄와 2종류의 L쇄로 되는 이중 특이성 항체를 효율적으로 조제하기 위해서는, 동일한 항원에 대한 H쇄와 L쇄의 회합을 촉진하고, 또한, 2종류의 H쇄의 헤테로 회합화를 촉진할 필요가 있다. 또한 얻어진 발현산물로부터 바른 조합을 갖는 이중 특이성 항체를 정제할 수 있을 필요가 있다.

동일한 항원에 대한 H쇄와 L쇄의 회합을 촉진하기 위해, 항GPC3 항체인 GC33의 H쇄(GC33-VH-CH1-hinge-CH2-CH3)의 가변영역(VH)과 L쇄(GC33-VL-CL)의 가변영역(VL)을 각각 교환한 H쇄(GC33-VL-CH1-hinge-CH2-CH3)와 L쇄(GC33-VH-CL)를 제작하였다(VH 도메인과 VL 도메인을 교환). GC33-VL-CH1-hinge-CH2-CH3는, GC33-VH-CL과는 회합하나, 항IL-6 리셉터 항체의 L쇄(MRA-VL-CL)와의 회합은 VL/VL의 상호작용이 불안정하기 때문에 저해된다. 동일하게 하여, 항IL-6 리셉터 항체의 H쇄(MRA-VH-CH1-hinge-CH2-CH3)는, MRA-VL-CL과는 회합하나, 항GPC3 항체의 L쇄(GC33-VH-CL)는 VH/VH의 상호작용이 불안정하기 때문에 저해된다. 이와 같이 하여, 동일한 항원에 대한 H쇄와 L쇄의 회합을 촉진하는 것이 가능하나, VH/VL의 상호작용보다는 불안정하지만 VH/VH 및 VL/VL의 상호작용도 일어나는 것으로부터(VH/VH의 보고：FEBS Lett. 2003 Nov 20;554(3):323-9., J Mol Biol. 2003 Oct 17;333(2):355-65., VL/VL의 보고：J Struct Biol. 2002 Jun;138(3):171-86., Proc Natl Acad Sci U S A. 1985 Jul;82(14):4592-6.), 바람직하게는 H쇄끼리 및 L쇄끼리의 회합도 적잖이 일어나게 된다. 이 때문에, VH 도메인과 VL 도메인을 교환하는 것만으로는, 목적으로 하는 이중 특이성 항체의 비율은 향상되지만, 역시 10종류 정도의 조합의 산물이 발현되어 버린다.

통상, 이 10종류 중 목적으로 하는 이중 특이성 항체를 정제하는 것은 매우 곤란하나, 이들 10종류의 성분이 각각 상이한 등전점을 갖도록 개변을 도입함으로써, 이온 교환 크로마토그래피에 의한 10종류의 성분의 분리를 향상시키는 것이 가능하다. 이에, 항IL-6 리셉터 항체의 H쇄 가변영역인 MRA-VH에 등전점을 저하시키는 개변을 도입하여, 등전점을 저하시킨 H54-VH를 제작하였다. 동일하게 하여, 항IL-6 리셉터 항체의 L쇄 가변영역인 MRA-VL에 등전점을 저하시키는 개변을 도입하여, 등전점을 저하시킨 L28-VL을 제작하였다. 또한 항GPC3 항체의 H쇄 가변영역인 GC33-VH에 등전점을 상승시키는 개변을 도입하여, 등전점을 상승시킨 Hu22-VH를 제작하였다.

항GPC3 항체의 H쇄와 L쇄의 VH와 VL을 교환함으로써, 목적으로 하는 H쇄와 L쇄의 조합은 향상되었으나, H54-VH/Hu22-VH 및 L28-VL/GC33-VL의 상호작용이 완전히 억제되지 않는 것으로부터, 바람직하지 않은 H쇄와 L쇄의 회합도 적잖이 일어나게 된다. VH/VH가 상호작용할 때, 통상의 항체 서열은 39번째가 글루타민이고, VH/VH 계면에 있어서 글루타민끼리가 수소결합하는 것으로 생각되고 있다. 이에, H54-VH/Hu22-VH의 상호작용을 더욱 감약시키기 위해, Kabat 넘버링 39번째의 글루타민을 리신으로 치환하였다. 이것에 의해 VH/VH 계면에 있어서 리신끼리가 정전 반발함으로써 VH/VH의 상호작용이 대폭 감약되는 것으로 생각되었다. 이에, H54-VH 및 Hu22-VH의 서열 중의 Kabat 넘버링 39번째의 글루타민을 리신으로 치환한 H54-VH-Q39K 및 Hu22-VH-Q39K를 제작하였다. 동일하게 하여, VL/VL의 상호작용에 있어서도, 통상의 항체 서열은 38번째가 글루타민이기 때문에, VL/VL 계면에 있어서 글루타민끼리가 수소결합하는 것으로 생각되고 있다. 이에, L28-VL/GC33-VL의 상호작용을 더욱 감약시키기 위해, Kabat 넘버링 38번째의 글루타민을 글루타민산으로 치환하였다. 이것에 의해 VL/VL 계면에 있어서 글루타민산끼리가 정전 반발함으로써 VL/VL의 상호작용이 대폭 감약되는 것으로 생각되었다. 이에, L28-VL 및 GC33-VL의 서열 중의 Kabat 넘버링 39번째의 글루타민을 글루타민산으로 치환한 L28-VL-Q38E 및 GC33-VL-Q38E를 제작하였다.

더욱 효율적으로 목적으로 하는 이중 특이성 항체를 발현·정제하기 위해, 실시예 3과 동일한 수법을 사용하여, 한쪽의 H쇄에 EU 넘버링 435번째의 His를 Arg로 치환하는 변이를 도입하고, 또한, 2종류의 H쇄의 헤테로 회합화를 촉진하는 개변으로서 WO 2006/106905(PROCESS FOR PRODUCTION OF POLYPEPTIDE BY REGULATION OF ASSEMBLY)에 기재된 변이(한쪽의 H쇄의 EU 넘버링 356번째의 Asp를 Lys로 치환하고, 다른 쪽의 H쇄의 EU 넘버링 439번째의 Lys를 Glu로 치환한다)를 조합함으로써, 2종류의 H쇄가 헤테로 회합화한 분자를 프로테인 A 크로마토그래피만으로 정제할 수 있도록 하였다.

즉, 항체 H쇄 가변영역으로서, 다음의 것이 사용되었다.

·MRA-VH(항인간 인터류킨-6 수용체 항체의 H쇄 가변영역, 서열번호：36)

·GC33-VH(항GPC3 항체의 H쇄 가변영역, 서열번호：37)

·MRA-VH의 등전점을 저하시킨 H54-VH(항인간 인터류킨-6 수용체 항체의 H쇄 가변영역, 서열번호：38)

·GC33-VH의 등전점을 상승시킨 Hu22-VH(항GPC3 항체의 H쇄 가변영역, 서열번호：39)

·H54-VH의 서열 중의 Kabat 넘버링 39번째의 Gln이 Lys로 치환된 H54-VH-Q39K(서열번호：40)

·Hu22-VH의 서열 중의 Kabat 넘버링 39번째의 Gln이 Lys로 치환된 Hu22-VH-Q39K(서열번호：41)

또한, 항체 H쇄 불변영역으로서, 다음의 것이 사용되었다.

·IgG1의 H쇄 불변영역의 서열에 있어서, EU 넘버링 234번째 및 235번째의 Leu가 Ala로 치환되고, 297번째의 Asn이 Ala로 치환되며, C말단의 Gly 및 Lys가 제거된 IgG1-LALA-N297A-CH(서열번호：42)

·IgG1-LALA-N297A-CH의 서열의 N말단에 Ser이 2개 부가된 IgG1-LALA-N297A-CHr(서열번호：43)

·IgG1-LALA-N297A-CH의 서열 중의 EU 넘버링 439번째의 Lys가 Glu로 치환된 IgG1-LALA-N297A-s3-CH(서열번호：44)

·IgG1-LALA-N297A-CHr의 서열 중의 EU 넘버링 356번째의 Asp가 Lys로 치환되고, 435번째의 His가 Arg로 치환된 IgG1-LALA-N297A-G3s3-CHr(서열번호：45)

또한, 항체 L쇄 가변영역으로서, 다음의 것이 사용되었다.

·MRA-VL(항인간 인터류킨-6 수용체 항체의 L쇄 가변영역, 서열번호：46)

·GC33-VL(항GPC3 항체의 L쇄 가변영역, 서열번호：47)

·MRA-VL의 등전점을 저하시킨 L28-VL(항인간 인터류킨-6 수용체 항체의 L쇄 가변영역, 서열번호：48)

·L28-VL의 서열 중의 Kabat 넘버링 38번째의 Gln이 Glu로 치환된 L28-VL-Q38E(서열번호：49)

·GC33-VL의 서열 중의 Kabat 넘버링 38번째의 Gln이 Glu로 치환된 GC33-VL-Q38E(서열번호：50)

또한, 항체 L쇄 불변영역으로서, 다음의 것이 사용되었다.

·IgG1-CL(IgG1의 L쇄 불변영역, 서열번호：51)

·IgG1-CL의 서열의 C말단의 Ala 및 Ser이, Arg 및 Thr로 치환된 IgG1-CLr(서열번호：52)

MRA-VH의 하류에 IgG1-LALA-N297A-CH를 연결함으로써, 유전자 no1-Mh-H가 제작되었다. MRA-VL의 하류에 IgG1-CL을 연결함으로써, 유전자 no1-Mh-L이 제작되었다. GC33-VH의 하류에 IgG1-LALA-N297A-CH를 연결함으로써, 유전자 no1-Gh-H가 제작되었다. GC33-VL의 하류에 IgG1-CL을 연결함으로써, 유전자 no1-Gh-L이 제작되었다.

GC33-VL의 하류에 IgG1-LALA-N297A-CHr을 연결함으로써, 유전자 no2-Gh-H가 제작되었다. GC33-VH의 하류에 IgG1-CLr을 연결함으로써, 유전자 no2-Gh-L이 제작되었다.

H54-VH의 하류에 IgG1-LALA-N297A-CH를 연결함으로써, 유전자 no3-Ml-H가 제작되었다. L28-VL의 하류에 IgG1-CL을 연결함으로써, 유전자 no3-Ml-L이 제작되었다. Hu22-VH의 하류에 IgG1-CLr을 연결함으로써, 유전자 no3-Ghh-L이 제작되었다.

H54-VH의 하류에 IgG1-LALA-N297A-s3-CH를 연결함으로써, 유전자 no5-Ml-H가 제작되었다. GC33-VL의 하류에 IgG1-LALA-N297A-G3s3-CHr을 연결함으로써, 유전자 no5-Gh-H가 제작되었다.

H54-VH-Q39K의 하류에 IgG1-LALA-N297A-s3-CH를 연결함으로써, 유전자 no6-Ml-H가 제작되었다. L28-VL-Q38E의 하류에 IgG1-CL을 연결함으로써, 유전자 no6-Ml-L이 제작되었다. GC33-VL-Q38E의 하류에 IgG1-LALA-N297A-G3s3-CHr을 연결함으로써, 유전자 no6-Gh-H가 제작되었다. Hu22-VH-Q39K의 하류에 IgG1-CLr을 연결함으로써, 유전자 no6-Ghh-L이 제작되었다.

각 유전자(no1-Mh-H, no1-Mh-L, no1-Gh-H, no1-Gh-L, no2-Gh-H, no2-Gh-L, no3-Ml-H, no3-Ml-L, no3-Ghh-L, no5-Ml-H, no5-Gh-H, no6-Ml-H, no6-Ml-L, no6-Gh-H, no6-Ghh-L)는, 동물세포 발현 벡터에 삽입되었다.

이하에 나타내는 조합의 발현 벡터가 FreeStyle293-F세포에 도입되어, 각 목적 분자를 일과성으로 발현시켰다.

A．목적 분자：no1(도 11)

　설명：천연형 항IL-6 리셉터·항GPC3 이중 특이성 항체

　발현 벡터에 삽입된 폴리뉴클레오티드에 의해 코드되는 폴리펩티드：no1-Mh-H(서열번호：53), no1-Mh-L(서열번호：54), no1-Gh-H(서열번호：55), no1-Gh-L(서열번호：56)

B．목적 분자：no2(도 12)

　설명：no1에 대해, 항GPC3 항체의 VH 도메인과 VL 도메인을 교환

　발현 벡터에 삽입된 폴리뉴클레오티드에 의해 코드되는 폴리펩티드：no1-Mh-H, no1-Mh-L, no2-Gh-H(서열번호：57), no2-Gh-L(서열번호：58)

C．목적 분자：no3(도 13)

　설명：no2에 대해, 각 사슬의 등전점을 개변하는 개변을 도입

　발현 벡터에 삽입된 폴리뉴클레오티드에 의해 코드되는 폴리펩티드：no3-Ml-H(서열번호：59), no3-Ml-L(서열번호：60), no2-Gh-H, no3-Ghh-L(서열번호：61)

D．목적 분자：no5(도 14)

　설명：no3에 대해, H쇄 헤테로 회합화를 촉진하는 개변과 프로테인 A에 의해 헤테로 회합화한 항체를 정제하기 위한 개변을 도입

발현 벡터에 삽입된 폴리뉴클레오티드에 의해 코드되는 폴리펩티드：no5-Ml-H(서열번호：62), no3-Ml-L, no5-Gh-H(서열번호：63), no3-Ghh-L

E．목적 분자：no6(도 15)

　설명：no5에 대해, 목적의 H쇄와 목적의 L쇄의 회합을 촉진하는 개변을 도입

　발현 벡터에 삽입된 폴리뉴클레오티드에 의해 코드되는 폴리펩티드：no6-Ml-H(서열번호：64), no6-Ml-L(서열번호：65), no6-Gh-H(서열번호：66), no6-Ghh-L(서열번호：67)

ø0.22 ㎛ 필터로 여과하여 얻어진 배양상청에, 배지로 평형화한 rProtein A Sepharose Fast Flow 수지(GE Healthcare)가 첨가되고, 배치로 용출함으로써 정제하였다. 프로테인 G는 항체의 Fab 부분에 결합하기 때문에, 프로테인 G를 사용함으로써, 프로테인 A로의 친화성과는 무관하게, CM 중에 존재하는 모든 항체를 정제하는 것이 가능하다.

제작한 항체(no1, no2, no3, no5, no6)의 발현 패턴을, 양이온 교환 크로마토그래피(IEC)에 의해 평가하였다. 양이온 교환 크로마토그래피는, 분석용 칼럼인 ProPac WCX-10 칼럼(Dionex)을 사용하고, 이동상 A에 20 mM MES-NaOH, pH 6.1, 이동상 B에 20 mM MES-NaOH, 250 mM NaCl, pH 6.1을 사용하고, 0.5 mL/min의 유속으로 적절한 구배로 실시하였다. 각 항체의 IEC에 의한 평가결과를 도 16에 나타내었다. 천연형 항IL-6 리셉터·항GPC3 이중 특이성 항체의 no1에서는 복수의 피크가 근접해 있어, 어느 피크가 목적으로 하는 이중 특이성 항체인지를 판별하는 것은 불가능하였다. no1에 대해, 항GPC3 항체의 VH 도메인과 VL 도메인을 교환한 no2에 있어서도 동일하였다. no2에 대해, 각 사슬의 등전점을 개변하는 개변을 도입한 no3에 있어서 비로소 목적으로 하는 이중 특이성 항체의 피크를 분리하는 것이 가능해졌다. no3에 대해, H쇄 헤테로 회합화를 촉진하는 개변과 프로테인 A에 의해 헤테로 회합화한 항체를 정제하기 위한 개변을 도입한 no5에 있어서, 목적으로 하는 이중 특이성 항체의 피크의 비율이 대폭 향상되었다. no5에 대해, 목적의 H쇄와 목적의 L쇄의 회합을 촉진하는 개변을 도입한 no6에 있어서, 목적으로 하는 이중 특이성 항체의 피크의 비율이 더욱 향상되었다.

이에, no6의 CM을 사용하여 정제용 칼럼으로 목적으로 하는 이중 특이성 항체를 고순도로 정제하는 것이 가능한지 여부를 검토하였다. D-PBS로 평형화한 HiTrap protein A HP 칼럼(GE Healthcare)에, ø0.22 ㎛ 필터로 여과한 CM을 부하하고, 표 18에 나타내는 세정 1, 2, 용출 A·B를 사용한 pH 구배 용출을 순서대로 실시하였다. pH 구배 용출은, 용출A：용출B(100:0)→(35:65) 40분의 직선 구배로 하여 실시하였다.

No6의 pH 구배 용출의 결과를 도 17에 나타내었다. 프로테인 A에 결합하지 않는 항GPC3 항체의 H쇄의 호모 항체는 프로테인 A를 그대로 지나가고, 1번째의 용출 피크는 항GPC3 항체의 H쇄와 항IL-6 리셉터 항체의 H쇄의 헤테로 항체이며, 2번째의 용출 피크는 항IL-6 리셉터 항체의 H쇄의 호모 항체인 것을 알 수 있었다. 이것으로부터, EU 넘버링 435번째의 His를 Arg로 치환함으로써, 프로테인 A 정제공정만으로 항GPC3 항체의 H쇄와 항IL-6 리셉터 항체의 H쇄의 헤테로 항체를 정제 가능한 것이 확인되었다.

1번째의 용출 분획에 대해서, 20 mM 초산나트륨 완충액, pH 5.5로 평형화한 HiTrap SP Sepharose HP 칼럼(GE Healthcare)에 첨가하고, 동액으로 세정 후에 0 mM부터 500 mM까지 NaCl 농도 구배 용출을 실시하였다. 얻어진 메인 피크 분획에 대해서 동일한 방법으로 양이온 교환 크로마토그래피 분석을 행하였다. 그 결과를 도 18에 나타내었다. 목적으로 하는 이중 특이성 항체를 매우 높은 순도로 정제할 수 있는 것이 나타내어졌다.

본 발명에서는, 프로테인 A에 대한 결합력을 개변함으로써, 2종류 이상의 항원에 대해 결합 활성을 갖는 폴리펩티드 다량체(다중 특이성 항체)를, 프로테인 A 정제공정만으로 고순도로 또한 효율적으로 정제 또는 제조하는 방법이 제공되었다. 본 발명의 방법을 이용함으로써, 다른 목적의 아미노산 개변의 효과를 손상시키지 않고, 목적의 폴리펩티드 다량체를 고순도로 또한 효율적으로 정제 또는 제조하는 것이 가능해졌다. 특히 2종의 단백질 도메인간의 회합을 제어하는 방법과 조합함으로써, 보다 고순도로 또한 효율적으로 목적의 폴리펩티드 다량체의 정제 또는 제조가 가능해졌다.

SEQUENCE LISTING <110> CHUGAI SEIYAKU KABUSHIKI KAISHA <120> Polypeptide modification method for purifying multimeric polypeptides <130> C1-A0916P <150> JP 2009-294391 <151> 2009-12-25 <160> 67 <170> PatentIn version 3.4 <210> 1 <211> 123 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Tyr Tyr 20 25 30 Asp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Ser Ile Ser Pro Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Arg Arg Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Thr Arg Ala Gly His Asn Tyr Gly Ala Gly Trp Tyr Phe Asp Tyr 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 2 <211> 123 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Tyr Tyr 20 25 30 Asp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Ser Pro Ser Gly Gln Ser Thr Tyr Tyr Arg Arg Glu Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Arg Ala Gly His Asn Tyr Gly Ala Gly Trp Tyr Phe Asp Tyr 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 3 <211> 119 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Asn 20 25 30 Asn Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Asp Ile Asn Thr Arg Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Asn Glu Glu Phe 50 55 60 Gln Asp Arg Val Thr Met Thr Ile Asp Lys Ser Thr Gly Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Arg Arg Ser Tyr Gly Tyr Tyr His Asp Glu Trp Gly Glu Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 4 <211> 119 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Asn 20 25 30 Asn Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Asp Ile Asn Thr Arg Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Asn Glu Glu Phe 50 55 60 Gln Asp Arg Val Ile Met Thr Val Asp Lys Ser Thr Asp Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr His Cys 85 90 95 Ala Arg Arg Lys Ser Tyr Gly Tyr Tyr Leu Asp Glu Trp Gly Glu Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 5 <211> 119 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp 20 25 30 His Ala Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp 35 40 45 Ile Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Thr Tyr Asn Pro Ser Leu 50 55 60 Lys Ser Arg Val Thr Met Leu Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser 65 70 75 80 Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Leu Ala Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Ser Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 6 <211> 214 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Arg Asn Ile Glu Arg Asn 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Glu Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Arg Lys Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Arg Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Leu Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ser Pro Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 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Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 8 <211> 214 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile 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<213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <400> 66 Met Arg Leu Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Met Leu Trp Val Ser 1 5 10 15 Gly Ser Ser Gly Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro 20 25 30 Val Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser 35 40 45 Leu Val His Ser Asn Arg Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Glu Lys 50 55 60 Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe 65 70 75 80 Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 85 90 95 Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr 100 105 110 Cys Ser Gln Asn Thr His Val Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys 115 120 125 Leu Glu Ile Lys Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 130 135 140 Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly 145 150 155 160 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 165 170 175 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 180 185 190 Ser Ser Gly Leu 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Claims

제1 항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드 및 제2 항원 결합 활성을 갖거나 또는 항원 결합 활성을 갖지 않는 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드 다량체의 정제방법으로서, 그 방법은
(a) 제1 항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드를 코드하는 DNA 및 제2 항원 결합 활성을 갖거나 또는 항원 결합 활성을 갖지 않는 폴리펩티드를 코드하는 DNA를 발현시키는 공정, 및
(b) 공정(a)의 발현산물을 프로테인 A 친화성 크로마토그래피에 의해 회수하는 공정,
을 포함하고,
제1 항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드 및 제2 항원 결합 활성을 갖거나 또는 항원 결합 활성을 갖지 않는 폴리펩티드의 프로테인 A로의 결합력에 차가 생기도록, 제1 항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드 및 제2 항원 결합 활성을 갖거나 또는 항원 결합 활성을 갖지 않는 폴리펩티드의 양쪽 또는 어느 한쪽에 있어서 1 또는 복수의 아미노산 잔기가 개변되어 있는,
방법.
제1항에 있어서,
제1 항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드 또는 제2 항원 결합 활성을 갖거나 또는 항원 결합 활성을 갖지 않는 폴리펩티드의 프로테인 A로의 결합력이 증가 또는 저하되도록, 제1 항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드 또는 제2 항원 결합 활성을 갖거나 또는 항원 결합 활성을 갖지 않는 폴리펩티드에 있어서 1 또는 복수의 아미노산 잔기가 개변되어 있는, 방법.
제1항에 있어서,
제1 항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드 또는 제2 항원 결합 활성을 갖거나 또는 항원 결합 활성을 갖지 않는 폴리펩티드 중 어느 한쪽의 폴리펩티드의 프로테인 A로의 결합력이 증가하고, 다른 쪽의 폴리펩티드의 프로테인 A로의 결합력이 저하되도록, 제1 항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드 및 제2 항원 결합 활성을 갖거나 또는 항원 결합 활성을 갖지 않는 폴리펩티드에 있어서 1 또는 복수의 아미노산 잔기가 개변되어 있는, 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
회수된 폴리펩티드 다량체의 순도가 95% 이상인, 방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
제1 항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드 및 제2 항원 결합 활성을 갖거나 또는 항원 결합 활성을 갖지 않는 폴리펩티드가 항체 Fc영역 또는 항체 중쇄 불변영역의 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
제5항에 있어서,
항체 Fc영역 또는 항체 중쇄 불변영역의 아미노산 서열에 있어서의 EU 넘버링 250~255번 위치, 308~317번 위치 및 430~436번 위치로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 잔기가 개변되어 있는, 방법.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
제1 항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드 및 제2 항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드가 항체 중쇄 가변영역의 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
제7항에 있어서,
항체 중쇄 가변영역의 FR1, CDR2 및 FR3의 아미노산 서열에 있어서 하나 이상의 아미노산 잔기가 개변되어 있는, 방법.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
폴리펩티드 다량체가 1개 또는 2개의 제3 항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드를 포함하고, 공정(a)가 당해 제3 항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드를 코드하는 DNA를 발현시키는 것을 포함하는, 방법.
제9항에 있어서,
제3 항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드가 항체 경쇄의 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
제9항 또는 제10항에 있어서,
폴리펩티드 다량체가 제4 항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드를 추가로 포함하고, 공정(a)가 당해 제4 항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드를 코드하는 DNA를 발현시키는 것을 포함하는, 방법.
제11항에 있어서,
제3 및 제4 항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드 중 하나 이상의 폴리펩티드가 항체 경쇄의 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
제11항에 있어서,
제1 항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드가 항체 경쇄 가변영역과 항체 중쇄 불변영역의 아미노산 서열을 포함하고, 제2 항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드가 항체 중쇄의 아미노산 서열을 포함하며, 제3 항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드가 항체 중쇄 가변영역과 항체 경쇄 불변영역의 아미노산 서열을 포함하고, 제4 항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드가 항체 경쇄의 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
폴리펩티드 다량체가 다중 특이성 항체인, 방법.
제14항에 있어서,
다중 특이성 항체가 이중 특이성 항체인, 방법.
제5항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서,
항체 Fc영역 또는 항체 중쇄 불변영역이 인간 IgG 유래인, 방법.