WO2006106905A1 - 会合制御によるポリペプチド製造方法 - Google Patents

会合制御によるポリペプチド製造方法 Download PDF

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WO2006106905A1
WO2006106905A1 PCT/JP2006/306803 JP2006306803W WO2006106905A1 WO 2006106905 A1 WO2006106905 A1 WO 2006106905A1 JP 2006306803 W JP2006306803 W JP 2006306803W WO 2006106905 A1 WO2006106905 A1 WO 2006106905A1
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amino acid
antibody
polypeptide
interface
acid residue
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Tomoyuki Igawa
Hiroyuki Tsunoda
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Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a polypeptide by controlling association within each molecule or between molecules.
  • the present invention relates to a polypeptide in which association within each molecule or between molecules is controlled, and a pharmaceutical composition containing the polypeptide as an active ingredient.
  • Antibodies are attracting attention as pharmaceuticals because of their high stability in blood and few side effects. Among them are bispecific antibodies that can simultaneously recognize two types of antigens. MDX-210, currently undergoing clinical trials, is an IgG-type bispecific antibody that retargets monocytes that express Fc ⁇ RI to cancer cells that express HER-2 / neu. Yes (see Non-Patent Document 1). In general, a gene recombination technique is often used for producing an antibody.
  • DNA encoding an antibody protein is cloned from a phage library that presents antibody-producing cells such as cells, ibridomas, sensitized lymphocytes that produce antibodies, or antibody genes, It is a technology that is incorporated into an appropriate vector and introduced into a host cell for production.
  • the production of IgG-type bispecific antibodies using genetic recombination technology involves introducing a total of four genes, the H and L chain genes that make up the two types of IgG of interest, and secreting them by co-expression. . In such expression, when the wild type H chain and L chain constituent genes are expressed, two types of H chain covalent bonds and H chain and L chain noncovalent bonds occur randomly. The ratio of the target bispecific antibody is very low.
  • the target bispecific antibody is only one type out of 10 and the production efficiency is lowered.
  • a decrease in the production efficiency of the target antibody will increase non-uniformity such as lot-to-lot differences, which will be an obstacle to purification of the target antibody, leading to an increase in production cost.
  • Patent Document 1 International Publication No. 96/27011
  • Non-patent literature l Segal DM et al., Current Opinion in Immunology, 1999, Vol. 11, P.5 58-562
  • Non-patent literature 2 Ridgway JB et al., Protein Engineering, 1996, Vol. 9, p.617-621
  • Non-patent literature 3 Merchant AM et al., Nature Biotechnology, 1998, Vol. 16, p.677-68
  • Non-Patent Document 4 Zhe Z et al., Protein Science, 1997, Vol. 6, p. 781-788
  • the present invention has been made in view of such a situation, and an object of the present invention is to provide a method for controlling association of polypeptides, a polypeptide in which association is controlled, and the polypeptide. It is in providing the manufacturing method of. Another object of the present invention is to provide a method for efficiently producing a bispecific antibody by controlling the association at the interface between VH and VL. It is another object of the present invention to provide a method for efficiently producing one structural isomer of sc (Fv) 2.
  • VH and VL of antibodies as polypeptides to be used for the control of association, and conducted extensive research on methods capable of controlling the association of VH and VL.
  • heteromolecules by simply substituting one type of amino acid (2 amino acids in total with VH and VL) present at the interface between VH and VL. Can be formed. Further, from the viewpoint of antigenicity, fewer amino acid substitutions are better. According to one embodiment of the present invention, a heteromolecule can be efficiently formed only by substituting one amino acid present at the interface between VH and VL.
  • the association between VH and VL can be controlled by the knowledge found by the present inventors.
  • the present invention can be applied not only to control association between VH and VL, but also to control association between arbitrary polypeptides.
  • the present inventors have confirmed that the bispecific antibody force obtained by the association control method of the present invention actually retains its function.
  • the present invention relates to a method for controlling association of polypeptides, a polypeptide with controlled association, and a method for producing the polypeptide, more specifically,
  • a method for producing a polypeptide having a mutation in an amino acid residue that forms an interface in a polypeptide so that association of the polypeptides is controlled comprising: (a) an amino acid that forms an interface in the polypeptide The nucleic acid encoding the residue is modified from the original nucleic acid so that association within the polypeptide is inhibited; (b) the host cell is cultured to express the nucleic acid; and (c) a host cell culture.
  • a method for producing a polypeptide variant comprising recovering the polypeptide from the enzyme; [2] a heterologous abundance having a mutation in an amino acid residue that forms an interface between the polypeptides so that the association of the heterologous multimer is controlled; (A) a nucleic acid encoding an amino acid residue that forms an interface between polypeptides is modified from the original nucleic acid so that association between the polypeptides is inhibited, and (b) a host The nucleic acid expresses the cell And (c) a method for producing a heteromultimer comprising recovering the heteromultimer from a host cell culture, [3] a polypeptide capable of forming two or more structural isomers, The above structural differences The method according to [1], wherein a nucleic acid encoding an amino acid residue that forms an interface in the polypeptide is modified from the original nucleic acid so that association of the polypeptide forming the sex body is inhibited, [4] Encodes amino acid residues that form the interface
  • the method according to [2], wherein the nucleic acid to be modified is modified from the original nucleic acid, [5]
  • the interface in the step (a) is modified so that two or more amino acid residues forming the interface have the same kind of charge.
  • step (a) is such that amino acid residue mutations are introduced into the interface such that the amino acid residues forming the hydrophobic core present at the interface become charged amino acid residues.
  • the polypeptide interface is formed by two or more heavy chain constant regions [1] or [ 2),
  • polypeptide is a single-chain polypeptide in which two or more heavy chain variable regions and two or more light chain variable regions are linked by a linker.
  • heterologous multimer is a multispecific antibody comprising two or more heavy chain variable regions and two or more light chain variable regions
  • polypeptide variant according to [25] or the heterologous multimer according to [26], wherein the polypeptide interface is formed by a heavy chain variable region and a light chain variable region of an antibody [42] a polypeptide The polypeptide variant according to [25] or the heterologous multimer according to [26], wherein the interface is formed by two or more heavy chain variable regions,
  • the heterologous multimer contains two or more heavy chain variable regions and two or more light chain variable regions
  • the heteromultimer according to [26] which is a multispecific antibody
  • composition comprising the polypeptide variant according to [25] or the heteromultimer according to [26], and a pharmaceutically acceptable carrier,
  • a method for controlling the association of polypeptides which comprises modifying the amino acid residues forming the interface in the original polypeptide so that the association in the polypeptide is inhibited.
  • a method for controlling the association of heterologous multimers which involves modifying amino acid residues that form the interface between the original polypeptides so that the association between the polypeptides is inhibited.
  • polypeptide is a single-chain polypeptide in which two or more heavy chain variable regions and two or more light chain variable regions are linked by a linker.
  • heterologous multimer is a multispecific antibody comprising two or more heavy chain variable regions and two or more light chain variable regions
  • An antibody comprising a heavy chain variable region and a light chain variable region, comprising the following (1) and (
  • An antibody comprising a heavy chain variable region and a light chain variable region, wherein either one of the following (1) or (2) is an amino acid residue having a charge,
  • polypeptide according to any one of [75] to [77], wherein the polypeptide is a single-chain polypeptide in which two or more heavy chain variable regions and two or more light chain variable regions are linked by a linker.
  • composition comprising the antibody according to any one of [75] to [77] and a pharmaceutically acceptable carrier,
  • a set of amino acid residues selected from the set of amino acid residues shown in the above (1) to (3) in the second heavy chain CH3 region, and the same type in the first heavy chain CH3 region 1 to 3 amino acid residues corresponding to the amino acid residues shown in the above (1) to (3) having opposite charges are opposite to the corresponding amino acid residues in the first heavy chain CH3 region.
  • the antibody according to [87] which is a multispecific antibody comprising two or more heavy chain variable regions and two or more light chain variable regions,
  • composition comprising the antibody according to [87] and a pharmaceutically acceptable carrier, [95] a nucleic acid encoding the polypeptide constituting the antibody according to [87],
  • FIG. 1 Modeling the Fv region of humanized SB04, (A) H39 and L38 amino acid residues at the VH and VL interface, (B) H45 amino acid residue at the VH and VL interface Show L44! /
  • FIG. 2 is a photograph showing the results of evaluating the association of H chain and L chain in the modified antibodies of H39 and L38. As a result, all the modified antibodies showed an increase in the target antibody binding ratio compared to the wild type.
  • M Molecular weight marker 1: Humanized XB12 H chain (Q) + Humanized XB12 L chain), 2: Humanized XB12 H chain (Q) + Humanized SB04 L chain (Q), 3: Wild type: Humanized X B12 H chain (Q) + Human ⁇ XB12 L chain (Q) + Human ⁇ ⁇ SB04 L chain (Q), 4: D modified: humanized XB12 H chain (D) + humanized XB12 L chain (Q ) + Humanized SB04 L chain (D), 5: E modified: humanized XB12 H chain (E) + Humanized XB12 L chain (Q) + humanized SB04 L chain (E), 6: R modified: Humanized XB12 H chain (R) + Humanized XB12 H chain
  • FIG. 3 shows the results of evaluation of the coagulation activity of the modified antibodies of ⁇ 39 and L38.
  • the bispecific antibody obtained by modifying the XB12 chain ( ⁇ 39) and the SB04 L chain (L38) to Glu showed a coagulation activity equal to or greater than that of the wild type.
  • FIG. 4 shows the evaluation results of FactorlXa binding activity of the modified antibodies of H39 and L38. As a result, all the modified antibodies showed binding activity equivalent to that of the wild type.
  • FIG. 5 shows the results of evaluating FactorX binding activity of the modified antibodies of H39 and L38. As a result, all the modified antibodies showed binding activity equivalent to that of the wild type.
  • FIG. 6 is a photograph showing the results of evaluating the association of H chain and L chain in the modified antibody of L44. As a result, all the modified antibodies showed an increase in the association ratio of the target antibody compared to the wild type.
  • Lane description 1 Wild type: humanized XB12 H chain + humanized XB12 L chain (P) + humanized SB04 L chain (P), 2: D modified: humanized XB12 H chain + humanized XB12 L chain ( P) + humanized SB04 chain (D), 3: E modified: humanized XB12 H chain + humanized XB12 L chain (P) + humanized SB04 L chain (E), 4: R modified Type: humanized XB12 H chain + human ⁇ XB12 L chain (P) + humanized SB04 L chain (R), 5: K modified: humanized XB 12 ⁇ chain + human ⁇ XB12 L chain ( ⁇ ) + humanized SB04 L chain ( ⁇ )
  • FIG. 7 shows the evaluation results of the coagulation activity of the modified L44 antibody. As a result, all the modified antibodies showed a coagulation activity exceeding that of the wild type.
  • FIG. 8 shows the evaluation results of FactorX binding activity of the modified L44 antibody. As a result, all the modified antibodies showed binding activity equivalent to that of the wild type.
  • FIG. 9 is a photograph showing the results of evaluating the association of H chain and L chain in modified antibodies of H39, L38 and L44. As a result, all the modified antibodies showed an increase in the association ratio of the target antibody compared to the wild type.
  • Lane Description 1 Wild type: Humanized XB12 H chain (H39: Q)
  • FIG. 10 shows the results of evaluating the coagulation activity of the modified antibodies of H39, L38 and L44.
  • the bispecific antibody obtained by modifying the XB12 chain ( ⁇ 39) and the SB04 L chain (L38, L44) showed a coagulation activity equal to or higher than that of the wild type.
  • FIG. 11 shows the evaluation results of FactorlXa binding activity in the modified antibodies of H39, L38 and L44. As a result, all the modified antibodies showed binding activity equivalent to that of the wild type.
  • FIG. 12 is a diagram schematically showing an example of the structure of sc (Fv) 2 containing two types of heavy chain variable regions (VH1 and VH2) and two types of light chain variable regions (VL1 and VL2).
  • Sc (Fv) 2 having the structure (a) mainly has two types of structural isomers shown in (b).
  • FIG. 13 shows the results of separation by cation exchange chromatography of peakl and peak2, which are structural isomers of u2-wz4.
  • FIG. 14 shows peakl and peak2 peptide mapping separated by cation exchange chromatography.
  • FIG. 15 is a photograph showing the result of reduced SDS-PAGE after subtilisin treatment of u2-wz4 structural isomers, peakl and peak2, and u2_wz4 before separation. The structure of the obtained band is shown on the right.
  • FIG. 16 shows the difference in degradation pattern after subtilisin limited digestion caused by the difference in structure between bivalent scFv and single chain antibody.
  • the bivalent scFv structure a low molecular weight fragment surrounded by a dotted line is generated.
  • FIG. 17 shows the results of gel filtration chromatography after limited degradation of u2-wz4, which is the structural isomers of u2-wz4, and subtilisin of u2-wz4 before separation.
  • the arrow indicates the elution position of the low molecular weight peak.
  • FIG. 18 shows the results of gel filtration chromatography of u2-wz4, modified vl, and modified v3 after purification on an MG10-GST fusion protein-immobilized column.
  • FIG. 19 shows the results of cation exchange chromatography of u2-wz4, variant vl, variant v3.
  • FIG. 20 is a photograph showing the results of isoelectric focusing of u2-wz4, u2-wz4 purified peakl, u2-wz4 purified peak2, variant vl, variant v3.
  • FIG. 21 shows the results of gel filtration chromatography analysis after limited degradation of proteases of u2-wz4 purified peakl, u2-wz4 purified peak2, modified vl, and modified v3.
  • FIG. 22 shows the results of evaluation of TPO-like agonist activity of u2-wz4 purified peakl, u2-wz4 purified peak2, variant vl, and variant v3.
  • FIG. 23 shows the results of DSC analysis of u2-wz4 purified peakl, u2-wz4 purified peak2, variant vl, and variant v3.
  • FIG. 24 shows the residual monomer ratio obtained by gel filtration chromatography analysis in the thermal acceleration test of u2-wz4 purified peakl, u2-wz4 purified peak2, modified vl, and modified v3.
  • FIG. 25 shows the content ratio of structural isomers obtained by cation exchange chromatography analysis in thermal acceleration tests of u2-wz4 purified peakl, u2-wz4 purified peak2, modified vl, and modified v3.
  • FIG. 26 shows the results of evaluating the coagulation activity of humanized bispecific antibodies (humanized A69 (hA69-PFL) / humanized B26 (hB26-PF) / humanized B BA (hAL-AQ)). Yes. As a result, chimera double special It showed a coagulation activity equivalent to or better than that of an isomeric antibody.
  • FIG. 27 is a conceptual diagram for modifying the heavy chain constant region to improve the formation efficiency of the bispecific antibody.
  • EU numbering Kabat EA et al. 1991. sequences of Proteins of Immunological Interest. NIH was adopted.
  • FIG. 28 shows a chromatogram of IEX analysis of a humanized bispecific antibody (IgG4 type) with a modified CH3 interface.
  • FIG. 29 shows the formation ratio of A-Homo, BiAb, and B-Homo obtained by IEX analysis of a humanized bispecific antibody (IgG4 type) with a modified CH3 interface.
  • FIG. 30 shows the residual ratio of monomer after a 60 ° C-1W thermal acceleration test of BiAb purified from a humanized bispecific antibody (IgG4 type) with a modified CH3 interface.
  • FIG. 31 shows the results of evaluating the coagulation activity of a humanized bispecific antibody (IgG4 type) with a modified CH3 interface. As a result, the coagulation activity was the same as that of the unmodified bispecific antibody.
  • FIG. 32 shows the formation ratio obtained by IEX analysis of A-Homo, BiAb, and B-Homo of a humanized bispecific antibody (IgGl type) with a modified CH3 interface.
  • the present invention relates to a method for controlling association of polypeptides or association of heterologous multimers constituted by polypeptides.
  • the present invention relates to a polypeptide association control method, which comprises modifying an amino acid residue that forms an interface in an original polypeptide so that association in the polypeptide is inhibited.
  • a method for controlling peptide association is provided.
  • the polypeptide in the present invention usually refers to peptides and proteins having a length of about 10 amino acids or more.
  • it is usually a biological polypeptide, but is not particularly limited, and may be, for example, a polypeptide comprising an artificially designed sequence. Further, it may be a natural polypeptide, a synthetic polypeptide, a recombinant polypeptide, or the like.
  • fragments of the above polypeptides are also included in the polypeptides of the present invention.
  • Polypeptide association in the present invention refers to, for example, two or more polypeptide regions. In other words, it refers to the state of interaction.
  • controlling the association refers to controlling to achieve a desired state of association, more specifically, so that an undesirable association is not formed in the polypeptide. Say to control.
  • the "interface” in the present invention usually refers to an association surface at the time of association (interaction), and the amino acid residues forming the interface are usually included in the polypeptide region subjected to the association.
  • the interaction includes a case where amino acid residues approaching at the time of association form a hydrogen bond, an electrostatic interaction, a salt bridge, and the like.
  • amino acid residue forming the interface in the present invention means, specifically, an amino acid residue contained in the polypeptide region in the polypeptide region constituting the interface.
  • the polypeptide region constituting the interface refers to a polypeptide region responsible for selective binding within or between molecules of antibodies, ligands, receptors, substrates, etc., as an example. Specifically, in an antibody, a heavy chain variable region, a light chain variable region, etc. can be exemplified.
  • the "modification" of an amino acid residue in the method of the present invention specifically includes substitution of the original amino acid residue with another amino acid residue, deletion of the original amino acid residue, This refers to adding a new amino acid residue, etc., but preferably refers to substituting the original amino acid residue with another amino acid residue.
  • polypeptide in the present invention is preferably a polypeptide that can form two or more structural isomers.
  • the structural isomers generally refer to proteins having the same amino acid sequence but different force steric structures (tertiary structures). Usually, structural isomers often differ in at least one of their chemical or physical properties.
  • a preferred embodiment of the present invention relates to a method for preferentially (effectively) obtaining a desired structural isomer from among two or more structural isomers that may exist. That is, in one embodiment, in a polypeptide that can form two or more structural isomers, the association between the polypeptides that form one or more structural isomers is inhibited. Interface The present invention relates to a method for modifying an amino acid residue to be formed.
  • first to fourth polypeptide regions in a polypeptide when there are first to fourth polypeptide regions in a polypeptide and any two of these regions can associate, (1) the first and second polypeptide regions associate In addition, the third and fourth polypeptide regions associate, (2) the first and third polypeptide regions associate, and the second and fourth polypeptide regions associate, (3) ) It is conceivable that the first and fourth polypeptide regions are associated, and the second and third polypeptide regions are associated, and there are mainly three structural isomers.
  • the first polypeptide region contains the third and fourth polypeptides. Modification of the amino acid residues forming the interface existing in these first, third or fourth polypeptide regions can be mentioned so that the association with the peptide region is inhibited.
  • the method of the present invention is also a method for controlling the association of heterologous multimers, which modifies amino acid residues that form the interface between the original polypeptides so that the association between the polypeptides is inhibited.
  • the present invention relates to a method for controlling the association of heterologous multimers.
  • heteromultimer refers to a multimer of proteins that are composed of a plurality of types of polypeptides and that the polypeptides can associate with each other. More particularly, a “heterologous multimer” has at least a first polypeptide and a second polypeptide, wherein the second polypeptide is at least one amino acid sequence from the first polypeptide. Molecules with different amino acid residues. Moreover, although not particularly limited, the heteromultimer preferably has binding specificity for at least two different ligands, antigens, receptors, substrates, and the like.
  • the heterologous multimer may be a “heterologous dimer” formed by the first and second polypeptides, and another species of polypeptide may be present. That is, the “heterologous multimer” of the present invention is not limited to a heterodimer, and includes, for example, a heterotrimer, a heterotetramer and the like.
  • the heterogeneous multimer capable of forming two or more multimers is inhibited so that the association between the polypeptides forming one or more multimers is inhibited.
  • This is a method of modifying amino acid residues that form an interface between polypeptides.
  • modification of an amino acid residue forming an interface of a polypeptide results in an amino acid having two or more residues forming the interface. It is a method characterized by introducing an amino acid residue mutation at the interface so that the residue has the same kind of charge.
  • the two or more amino acid residues involved in the association at the interface are modified so that they have the same type of charge, and the repulsive force of the charge It is considered that the association between these amino acid residues is inhibited.
  • the amino acid residues to be modified are preferably two or more amino acid residues that are close to each other at the time of association between the polypeptide regions forming the interface. .
  • Amino acid residues approaching at the time of association are found, for example, by analyzing the three-dimensional structure of the polypeptide and examining the amino acid sequence of the polypeptide region that forms the interface at the time of association of the polypeptide. Can do. Amino acid residues that are close to each other at the interface are preferred targets for “modification” in the method of the present invention.
  • amino acids charged amino acids are known. Generally, lysine), arginine (R), and histidine (H) are known as positively charged amino acids (positively charged amino acids). Aspartic acid (D), glutamic acid (E), and the like are known as negatively charged amino acids (negatively charged amino acids). Therefore, preferably, in the present invention, the same type of charged amino acids means amino acids having positive charges or amino acids having negative charges.
  • the present invention is not necessarily limited to this.
  • the amino acid residue introduced by modification is not necessarily limited. When there are a plurality of groups, these amino acid residues do not have a charge and may contain about a few amino acid residues.
  • the number of amino acid residues subjected to modification in the method of the present invention is not particularly limited.
  • the method of the present invention can control the association by modifying both or one of two amino acid residues that are close to each other at the interface, as shown in the examples described later.
  • the “small number” represents, for example, a number of about 1 to 10, preferably about 1 to 5, more preferably about 1 to 3, most preferably 1 or 2.
  • amino acid residues introduced (subjected to modification) by modification are all amino acid residues selected from the above positively charged amino acids, or Are preferably amino acid residues selected from the above negatively charged amino acids.
  • amino acid residue introduced in the present invention is preferably glutamic acid (E), asparagine (D), lysine), arginine (R), or histidine (H).
  • the polypeptide is close to the amino acid residue at the time of association. It is also a preferred embodiment of the present invention to modify the amino acid residue to be the same amino acid residue (or an amino acid residue having the same kind of charge) as the amino acid residue (X). In this embodiment, it is only necessary to modify one of the amino acid residues forming the interface.
  • the modification of the amino acid residue forming the interface of the polypeptide results in the amino acid residue forming the hydrophobic core existing in the interface being It is a method characterized by introducing an amino acid residue mutation at the interface so as to be a charged amino acid residue.
  • hydrophobic core is sparse inside an associated polypeptide. It refers to the part formed by the assembly of side chains of aqueous amino acids. Examples of hydrophobic amino acids include alanine, isoleucine, leucine, methionine, phenylalanin, proline, tryptophan, and norin.
  • the formation of the hydrophobic core may involve amino acid residues other than hydrophobic amino acids (eg tyrosine).
  • This hydrophobic core serves as a driving force for promoting the association of water-soluble polypeptides together with the hydrophilic surface where the side chains of hydrophilic amino acids are exposed to the outside.
  • Hydrophobic amino acids of two different domains are present on the surface of the molecule, and when exposed to water molecules, entropy increases and free energy increases. Thus, the two domains associate with each other to reduce and stabilize the free energy, and the hydrophobic amino acids at the interface are buried inside the molecule, forming a hydrophobic core.
  • the present invention is an association control method characterized in that an amino acid residue capable of forming a hydrophobic core at an interface is altered to an amino acid residue having a charge.
  • Preferred examples of the charged amino acid residue in the above method include glutamic acid (E), aspartic acid (D), lysine), arginine (R), and histidine (H).
  • the association control method of the present invention is a method for preferentially obtaining (manufacturing) a target antibody (polypeptide) in the production of an antibody or antibody fragment and a polypeptide having antibody-like activity. Can be used.
  • the term “antibody” is used in the broadest sense. As long as the desired biological activity is exhibited, monoclonal antibodies, polyclonal antibodies, and antibody variants (chimeric antibodies, humanized antibodies, low molecular weight antibodies) Antibodies (including antibody fragments), multispecific antibodies, etc.).
  • “antibody” may be either a polypeptide or a heteromultimer. Preferred antibodies are monoclonal antibodies, chimeric antibodies, humanized antibodies, and low molecular weight antibodies such as antibody fragments.
  • the association control method of the present invention can be preferably used when obtaining (creating) these antibodies.
  • multispecific antibody refers to an antibody that can specifically bind to different types of epitopes.
  • a multispecific antibody is an antibody having specificity for at least two different epitopes and includes antibodies that recognize different epitopes as well as antibodies that recognize different epitopes on the same antigen.
  • the antigen is a heteroreceptor
  • the multispecific antibody recognizes the different domains that make up the heteroreceptor, or if the antigen is a monomer, the multispecific antibody is a monomeric antigen. Recognize multiple locations).
  • such a molecule binds to two antigens (bispecific antibody: bispedfic antibody; used herein with the same meaning as “bispecific antibody”), but more It may have specificity for (for example, three types of) antigens.
  • the amino acid sequence of the above-mentioned antibody is further modified by amino acid substitution, deletion, addition and Z or insertion, or chimerization or humanization. Things are included. Amino acid substitution, deletion, addition and / or insertion, and modification of the amino acid sequence such as humanization and chimerization can be performed by methods known to those skilled in the art. Similarly, the variable region and constant region of an antibody used when the antibody of the present invention is produced as a recombinant antibody are also substituted by amino acid substitution, deletion, addition and Z or insertion, or by crystallization or humanization. The amino acid sequence may be modified.
  • the antibody in the present invention may be any animal-derived antibody such as a mouse antibody, a human antibody, a rat antibody, a rabbit antibody, a goat antibody, or a camel antibody.
  • a modified antibody in which an amino acid sequence is substituted such as a chimeric antibody and a humanized antibody, among others, may be used.
  • any antibody such as a modified antibody, an antibody fragment, or a low molecular weight antibody to which various molecules are bound may be used.
  • a "chimeric antibody” is an antibody produced by combining sequences derived from different animals. For example, a mouse antibody heavy chain and light chain variable (V) region and a human antibody heavy chain and light chain constant (C) region can be exemplified.
  • V antibody heavy chain and light chain variable
  • C human antibody heavy chain and light chain constant
  • the production of a chimeric antibody is known, for example, by linking DNA encoding an antibody V region with DNA encoding a human antibody C region, incorporating this into an expression vector, introducing it into a host, and producing it.
  • Antibody can be obtained
  • Humanized antibody refers to a non-human mammal, also called a reshaped human antibody.
  • a complementarity determining region (CDR) of a conventional antibody, such as a mouse antibody is transplanted to a CDR of a human antibody.
  • CDR complementarity determining region
  • Methods for identifying CDRs are known (Kabat et al., Sequence of Proteins of Immunological Interest (1987), National Institute of Health, Bethesda, Md .; Chothia et al, Nature (1989) 342: 877).
  • general gene recombination techniques are also known (see European Patent Application Publication No. EP 125023, WO 96/02576).
  • DNA encoding an antibody in which the CDR and a framework region (FR) of a human antibody are linked is obtained, and a humanized antibody is usually obtained. It can be produced by a system using the above expression vector. Such DNA can be synthesized by PCR using several oligonucleotides prepared as overlapping primers in both CDR and FR terminal regions (see W098 / 13388). See the description method).
  • the FR of the human antibody linked via CDR is selected such that the CDR forms a good antigen binding site.
  • FR amino acids in the variable region of the antibody may be modified so that the CDRs of the reshaped human antibody form the appropriate antigen binding site (Sato et al., Cancer Res. (1993) 53 : 851-6).
  • the amino acid residues in FR that can be modified include those that directly bind non-covalently to the antigen (Amit et al., Science (1986) 233: 747-53), and those that affect or act on the CDR structure (Chothia et al., J. Mol. Biol. (1987) 196: 901-17) and the portion related to the VH-VL interaction (EP239400 patent publication).
  • the C region of these antibodies is preferably derived from a human antibody.
  • C 1, C ⁇ 2, C ⁇ 3 and C ⁇ 4 can be used for the H chain, and C ⁇ and C ⁇ can be used for the L chain.
  • the human antibody C region may be modified as necessary to improve the stability of the antibody or its production.
  • the chimeric antibody in the present invention preferably comprises a variable region of a non-human mammal-derived antibody and a constant region derived from a human antibody.
  • the humanized antibody preferably has the CDR of an antibody derived from a mammal other than a human and the FR and C regions derived from a human antibody.
  • the variable region will be described together in (3) -3.
  • the constant region derived from a human antibody has a unique amino acid sequence for each isotype such as IgG (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), IgM, IgA, IgD, and IgE.
  • the constant region used for the humanized antibody in the present invention is an antibody belonging to any isotype. It may be a constant region of the body. Preferably, the HgG constant region is used, but is not limited thereto.
  • FR derived from a human antibody used for a human rabbit antibody is not particularly limited, and may be an antibody belonging to any isotype.
  • variable region and constant region of the chimeric antibody and humanized antibody in the present invention may be modified by deletion, substitution, insertion and / or addition as long as the binding specificity of the original antibody is exhibited.
  • Chimeric antibodies and humanized antibodies using human-derived sequences are considered useful when administered to humans for therapeutic purposes and the like due to their reduced antigenicity in the human body.
  • the low molecular weight antibody is also useful as an antibody because of its ability to be produced at low cost using Escherichia coli, plant cells, etc. from the viewpoint of the pharmacokinetic properties.
  • An antibody fragment is a kind of low molecular weight antibody.
  • the low molecular weight antibody includes an antibody having an antibody fragment as a part of its structure.
  • the structure, production method and the like of the low molecular weight antibody in the present invention are not particularly limited as long as it has the ability to bind to an antigen.
  • Some low molecular weight antibodies have higher activity than full-length antibodies (Orita et al., Blood (2005) 105: 562-5 66).
  • the “antibody fragment” is not particularly limited as long as it is a part of a full-length antibody (for example, whole IgG), but may be a heavy chain variable region (VH) or a light chain variable region ( VL) is preferably included.
  • Examples of preferred antibody fragments include, for example, Fab, F (ab ′) 2, Fab ′, Fv and the like.
  • the amino acid sequence of VH or VL in the antibody fragment may be modified by substitution, deletion, addition and Z or insertion. Furthermore, as long as the antigen-binding ability is maintained, a part of VH and VL may be deleted.
  • “Fv” is the smallest antibody fragment containing a complete antigen recognition site and a binding site.
  • “Fv” is a dimer (V H-VL dimer) in which one VH and one VL are strongly bound by a non-covalent bond.
  • An antigen binding site is formed on the surface of the VH-VL dimer by three complementary region determining regions (CDRs) of each variable region.
  • CDRs complementary region determining regions
  • Six CDRs confer antigen binding sites on the antibody.
  • one variable region or half of an Fv containing only three CDRs specific to the antigen
  • have the ability to Therefore, such a molecule smaller than Fv is also included in the antibody fragment in the present invention.
  • the variable region of the antibody fragment is a key. If it becomes mela, it can be humanized.
  • the low molecular weight antibody preferably contains both VH and VL.
  • Examples of low molecular weight antibodies include antibody fragments such as Fab, Fab ', F (ab') 2 and Fv, and scFv (single chain Fv) (Huston et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA (19 88) 85: 5879-83; Plickthun “The Pharmacology of Monoclonal Antibodies” Vol. 113, edited by Resenburg and Moore, Springer Verlag, New York, pp.269-315, (1994)), Diabody (Holliger et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
  • Antibody fragments can be obtained by treating an antibody with an enzyme, for example, a protease such as papain or pepsin (Morimoto et al., J. Biochem. Biophys. Methods (1992) 24: 107 -17; Brennan et al. al., Science (1985) 229: 81). It can also be produced by gene recombination based on the amino acid sequence of the antibody fragment.
  • an enzyme for example, a protease such as papain or pepsin (Morimoto et al., J. Biochem. Biophys. Methods (1992) 24: 107 -17; Brennan et al. al., Science (1985) 229: 81). It can also be produced by gene recombination based on the amino acid sequence of the antibody fragment.
  • a low molecular weight antibody having a structure obtained by modifying an antibody fragment can be constructed using an antibody fragment obtained by enzyme treatment or gene recombination.
  • a gene encoding the entire low-molecular-weight antibody can be constructed, introduced into an expression vector, and then expressed in an appropriate host cell (for example, Co et al., J. Immunol. (1994) 152: 2968-76; Bette r and Horwitz, Methods Enzymol. (1989) 178: 476-96; Pluckthun and Skerra, Metho ds Enzymol. (1989) 178: 497—515; Lamoyi, Methods Enzymol. (1986) 121: 652—63; Rousseaux et al., Methods Enzymol. (1986) 121: 663-9; Bird and Walker, Trends Biotechnol. (1991) 9: 132-7).
  • the "scFv” is a single-chain polypeptide in which two variable regions are combined through a linker or the like as necessary.
  • the two variable regions included in scFv are usually 1 VH and 1 Two VLs, but two VHs or two VLs may be used.
  • scFv polypeptides contain a linker between the VH and VL domains, thereby forming the VH and VL paired portions necessary for antigen binding.
  • the linker that connects VH and VL is generally a peptide linker having a length of 10 amino acids or more.
  • the scFv linker in the present invention is not limited to such a peptide linker as long as it does not interfere with the formation of scFv.
  • a total of 13 ⁇ 4 of scFv reference can be made to Pluckthdeci he Pharmacology of Monoclonal Antibody JVol. 113 (Rosenburg and Moore ed., Springer Verlag, NY, pp. 269-315 (1994)).
  • diabody (Db) refers to a bivalent antibody fragment constructed by gene fusion (P. Holliger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993), EP404,097, W093 / 11161, etc.).
  • Diabodies are dimers composed of two polypeptide chains, each of which is so short that the light chain variable region (VL) and heavy chain variable region (VH) cannot bind to each other in the same chain. For example, they are linked by a linker having about 5 residues.
  • VL and VH encoded on the same polypeptide chain cannot form a single-chain V region fragment because the linker between them is short, a dimer forms two antigen-binding sites. Will have.
  • VL and VH for two different epitopes (a, b) are combined with VLa-VHb and VLb-VHa and linked together by a linker of about 5 residues, bispecific Db is expressed. Secreted.
  • the two different epitopes may be two different epitopes on the same antigen, or may be two epitopes in each of two different antigens.
  • Diabody contains two molecules of scFv, it contains four variable regions, resulting in two antigen-binding sites. Unlike the case of scFv that does not form a dimer, when the purpose is to form diabody, the linker that connects VH and VL in each scFv molecule is usually about 5 amino acids when it is a peptide linker. Shall. However, the scFv linker that forms diabody is not limited to such peptide linkers as long as it does not interfere with scFv expression and diabody formation.
  • Preferred polypeptides or heterologous multimers used in the method of the present invention include, for example, polypeptides having antibody heavy chain variable regions and light chain variable regions, or heterologous multimers.
  • the body can be mentioned. More preferably, in a preferred embodiment of the present invention, association control when the polypeptide or heteromultimer of the present invention comprises two or more heavy chain variable regions and two or more light chain variable regions. Is the method.
  • the polypeptide or heterologous multimer is preferably one that recognizes two or more epitopes. For example, a multispecific antibody can be exemplified.
  • a bispecific antibody can be mentioned as a multispecific antibody.
  • first heavy chain and second heavy chain two types of heavy chain variable regions
  • first light chain two types of light chain variable regions
  • second light chain for controlling the association of a bispecific antibody
  • the above “first heavy chain” is one of the two H chains forming the antibody.
  • One H chain, and the second H chain is the other H chain different from the first H chain. That is, any one of the two H chains can be a first H chain and the other can be a second H chain.
  • the “first light chain” is one L chain of two L chains that form a bispecific antibody, and the second L chain is the other one different from the first L chain.
  • One of the two L chains can optionally be the first L chain and the other can be the second L chain.
  • the first L chain and the first H chain are derived from the same antibody that recognizes a certain antigen (or epitope), and the second L chain and the second H chain are also certain antigens (or epitopes). Derived from the same antibody that recognizes.
  • the first H chain 'the L chain-H chain pair formed by the L chain is the first pair
  • the second H chain' the L chain-H chain pair formed by the L chain is the second pair. Call it.
  • the antigen (or epitope) used in preparing the antibody from which the second pair is derived is different from that used in preparing the antibody from which the first pair is derived.
  • the antigens recognized by the first and second pairs may be the same, but preferably recognize different antigens (or epitopes).
  • the H chain and L chain of the first pair and the second pair have different amino acid sequences.
  • the first and second pairs recognize different epitopes, the first and second pairs may recognize completely different antigens, and different sites on the same antigen (different epitopes) May be recognized.
  • One of them recognizes antigens such as proteins, peptides, genes, and sugars.
  • cytotoxic substances such as radioactive substances, chemotherapeutic agents, and cell-derived toxins may be recognized.
  • the specific H chain and L chain can be arbitrarily selected as a first pair and a second pair. Can be determined.
  • the “bispecific antibody” is not necessarily limited to an antibody comprising two types of heavy chains and two types of light chains.
  • two types of heavy chain variable regions and two types of light chain variable regions are used.
  • a known sequence is used for the gene encoding the H chain or L chain of the antibody before mutagenesis in the method of the present invention (in this specification, it may be simply referred to as "the antibody of the present invention”). It can also be obtained by methods known to those skilled in the art. For example, it can be obtained from an antibody library, or a hybridoma that produces a monoclonal antibody can also be obtained by cloning a gene encoding the antibody.
  • antibody libraries many antibody libraries are already known, and methods for preparing antibody libraries are also known, so that those skilled in the art can appropriately obtain antibody libraries. is there.
  • antibody phage libraries Clackson et al., Nature 1991, 352: 624-8, Marks et al., J. Mol. Biol. 1991, 222: 581-97, Water houses et al "Nucleic Acids Res 1993, 21: 2265-6, Griffiths et al "EMBO J. 1994, 13: 3245-60, Vaughan et al., Nature Biotechnology 1996, 14: 309-14, and JP 20-504970 You can refer to the literature.
  • variable region of a human antibody can be expressed as a single chain antibody (scFv) on the surface of a phage by the phage display method, and a phage that binds to an antigen can be selected.
  • scFv single chain antibody
  • an appropriate expression vector can be prepared based on the sequence to obtain a human antibody.
  • a method for obtaining a gene encoding an antibody for the production of an antibody in that a known technique or a cell expressing a desired antigen is used as a sensitizing antigen.
  • the obtained immune cells are fused with known parental cells by the usual cell fusion method, and monoclonal antibody-producing cells (nobridoma) are screened by the usual screening method.
  • monoclonal antibody-producing cells nobridoma
  • V region variable region
  • the sensitizing antigen for obtaining the antibody gene encoding the H chain and L chain is a complete antigen having immunogenicity. And incomplete antigens including haptens that do not exhibit immunogenicity.
  • a full-length protein of the target protein or a partial peptide can be used.
  • substances composed of polysaccharides, nucleic acids, lipids and the like can serve as antigens, and the antigen of the antibody of the present invention is not particularly limited.
  • Antigens can be prepared by methods known to those skilled in the art, for example, according to methods using baculovirus (eg, W098 / 46777).
  • Hypridoma can be prepared according to, for example, the method of Milstein et al. (G. Kohler and C. Milstein, Methods Enzymol. 1981, 73: 3-46).
  • the immunogenicity of the antigen is low, it may be immunized by binding to an immunogenic macromolecule such as albumin.
  • a soluble antigen can be obtained by binding an antigen to other molecules as necessary.
  • a transmembrane molecule such as a receptor
  • the extracellular region of the receptor can be used as a fragment, or a cell expressing the transmembrane molecule on the cell surface can be used as an immunogen. .
  • Antibody-producing cells can be obtained by immunizing an animal with the appropriate sensitizing antigen described above.
  • antibody-producing cells can be obtained by immunizing lymphocytes capable of producing antibodies in vitro.
  • mammals to be immunized various mammals can be used, but rodents, maggots, and primates are generally used. Examples include primates such as rodents such as mice, rats, mice, and mussters, maggots such as magpies, and monkeys such as cynomolgus monkeys, monkeys, baboons and chimpanzees.
  • Other human antibody genes Transgenic animals with a repertoire are also known, and human antibodies can be obtained by using such animals (WO96 / 34096; Mendez et al., Nat.
  • human lymphocytes are sensitized in vitro with the desired antigen or cells expressing the desired antigen, and the sensitized lymphocytes are human myeloma cells such as U266.
  • the sensitized lymphocytes are human myeloma cells such as U266.
  • Can be obtained to obtain a desired human antibody having an antigen-binding activity see Japanese Patent Publication No. 59878.
  • a desired human antibody can be obtained by immunizing a transgenic animal having all repertoires of human antibody genes with a desired antigen (W093 / 12227, WO92 / 03918, W094 / 02602, WO96 / 34096, see W096 / 33735).
  • a sensitized antigen is appropriately diluted and suspended in Phosphate-Buffered Saline (PBS) or physiological saline, etc., mixed with an adjuvant as necessary, and then emulsified. Performed by intraperitoneal or subcutaneous injection. Thereafter, preferably, a sensitizing antigen mixed with Freund's incomplete adjuvant is administered several times every 4 to 21 days. Confirmation of antibody production can be performed by measuring the desired antibody titer in the serum of animals by a conventional method.
  • PBS Phosphate-Buffered Saline
  • physiological saline etc.
  • a sensitizing antigen mixed with Freund's incomplete adjuvant is administered several times every 4 to 21 days. Confirmation of antibody production can be performed by measuring the desired antibody titer in the serum of animals by a conventional method.
  • Hyperidoma is prepared by fusing antibody-producing cells obtained from animals or lymphocytes immunized with a desired antigen with myeloma cells using a conventional fusion agent (eg, polyethylene glycol).
  • a conventional fusion agent eg, polyethylene glycol
  • the hybridoma cells are cultured and proliferated, and the binding specificity of the antibody produced by the hybridoma is determined by a known analysis method such as immunoprecipitation, radioimmunoassay (RIA), enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), etc. taking measurement.
  • the hybridoma producing the antibody having the measured specificity, affinity or activity can be subcloned by a technique such as limiting dilution.
  • a probe for example, a sequence encoding an antibody constant region
  • a probe capable of specifically binding the antibody from a hybridoma or an antibody-producing cell (such as sensitized lymphocyte) to a gene encoding the selected antibody.
  • Complementary oligonucleotides etc. It is also possible to clone from mRNA by RT-PCR.
  • Immunoglobulins fall into five different classes: IgA, IgD, IgE, IgG and IgM. In addition, these Classes are divided into several subclasses (isotypes) (eg, IgG-1, IgG-2, IgG-3, and IgG-4; IgA-1, IgA-2, etc.).
  • the H chain and L chain used for antibody production in the present invention may be derived from antibodies belonging to any of these classes and subclasses, but are not particularly limited, but IgG is particularly preferred.
  • chimeric antibodies, humanized antibodies and the like can be appropriately prepared.
  • a chimeric antibody is an antibody consisting of the variable regions of the non-human mammal, for example, the H chain and L chain of a mouse antibody, and the constant regions of the H chain and L chain of a human antibody, and encodes the variable region of a mouse antibody.
  • the DNA to be obtained can be obtained by ligating the DNA encoding the constant region of a human antibody, incorporating it into an expression vector, introducing it into a host, and producing it.
  • the human rabbit antibody is also called a reshaped human antibody, and has a DNA sequence designed to link the complementarity determining regions (CDRs) of non-human mammals such as mouse antibodies.
  • CDRs complementarity determining regions
  • Several oligonucleotides prepared so as to have overlapping parts are synthesized by the PCR method.
  • the obtained DNA is obtained by ligating with DNA encoding the constant region of a human antibody, then incorporating it into an expression vector, introducing it into a host and producing it (see EP239400; WO96 / 02576).
  • the human antibody FR to be ligated via CDR is selected such that the complementarity determining region forms a good antigen-binding site. If necessary, the amino acid in the framework region of the variable region of the antibody may be substituted so that the complementarity-determining region of the reshaped human antibody forms the appropriate antigen-binding site (K. Sato et al, Cancer Res. 1993, 53: 851-856).
  • antibody variants with improved biological properties are 70% or more, more preferably 80% or more, more preferably 90% or more (e.g., 95% or more, 97%, 98%, 99%, etc.) amino acids Of antibodies based on sequence homology and / or similarity It has the amino acid sequence of the variable region.
  • sequence homology and / or similarity is defined as the difference between the original antibody residues after aligning the sequences and introducing gaps as necessary so that the sequence homology takes the maximum value. Defined as the percentage of amino acid residues that are homologous (same residues) or similar (amino acid residues classified into the same group based on the general amino acid side chain properties).
  • Natural amino acid residues are usually based on their side chain properties: (1) Hydrophobic: alanine, isoleucine, norleucine, norin, methionine and leucine; (2) neutral hydrophilicity: asparagine, glutamine, cysteine, (3) Acidity: aspartic acid and glutamic acid; (4) Basicity: arginine, histidine and lysine; (5) Residues affecting chain orientation: glycine and proline; and (6) Aromaticity: It is classified into tyrosine, tryptophan and ferulanine groups.
  • variable regions Normally, a total of six complementarity determining regions (hypervariable regions; CDR) present in the variable regions of the H and L chains interact to form the antigen-binding site of the antibody.
  • CDR complementarity determining regions
  • even one variable region is known to be capable of recognizing and binding to an antigen, although it has a lower affinity than that containing the entire binding site. Therefore, the antibody gene encoding the H chain and L chain of the present invention is not limited as long as the polypeptide encoded by the gene maintains the binding property with the desired antigen. It suffices if the fragment portion containing the antigen binding site is coded.
  • a desired bispecific antibody can be obtained preferentially (efficiently) as described above. That is, a bispecific antibody having a monomer mixture power that is a desired heteromultimer can be efficiently formed.
  • IgG type bispecific antibody having two types of heavy chain variable regions (VH1 and VH2) and two types of light chain variable regions (VL1 and VL2) will be described in more detail.
  • the method of the present invention can be similarly applied to other heteromultimers.
  • One epitope is recognized by the first heavy chain variable region (VH1) and the first light chain variable region (VL1), and the second heavy chain variable region (VH2) and the second light chain variable region are recognized.
  • VH1 first heavy chain variable region
  • VL2 first light chain variable region
  • VH2 second heavy chain variable region
  • VL2 variable region
  • association between heavy chains (VH1 and VH2) or between light chains (VL1 and VL2) can be suppressed.
  • the heavy chain variable region is usually composed of three CDR regions and an FR region.
  • the amino acid residue subjected to “modification” can be appropriately selected from, for example, amino acid residues located in the CDR region or FR region.
  • modification of amino acid residues in the CDR region may reduce the antigen-binding ability. Therefore, the amino acid residues to be used for “modification” in the present invention are not particularly limited, but are preferably selected appropriately from amino acid residues located in the FR region.
  • sequences that can be used as FRs of antibody variable regions in organisms such as humans or mice can be appropriately obtained by those skilled in the art using public databases and the like. More specifically, FR region amino acid sequence information can be obtained by the means described in the Examples below.
  • position 39 on the heavy chain variable region is shown.
  • (FR2 region) e.g., position 39 in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 6)
  • glutamine (Q) at position 38 FR2 region
  • leucine (L2) at position 45 (FR2) for example, position 45 in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 6 on the heavy chain variable region.
  • proline (P) at position 44 (FR2) on the opposite light chain variable region for example, position 50 in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 8.
  • proline (P) at position 44 (FR2) on the opposite light chain variable region for example, position 50 in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 8.
  • the present invention relates to an antibody (polypeptide (eg, sc (Fv) 2) or heteromultimer (eg, IgG type antibody) comprising a heavy chain variable region and a light chain variable region.
  • polypeptide eg, sc (Fv) 2
  • heteromultimer eg, IgG type antibody
  • amino acid residues are amino acid residues having the same kind of charge.
  • amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 6 or 8 is for more specifically illustrating the position of the amino acid residue to be modified in the present invention. Not limited to light chain variable regions with these amino acid sequences! ,.
  • amino acid residues described in (1) and (2), (3) and (4) above approach each other when they are associated, as shown in the Examples and FIG. ing.
  • Those skilled in the art will recognize homology modules using commercially available software for the desired heavy chain variable region or light chain variable region.
  • a site corresponding to the amino acid residues described in the above (1) to (4) can be found by deringing or the like, and the amino acid residue at the site can be appropriately subjected to modification.
  • amino acid residue having a charge is selected from, for example, the following (a) or (b)!
  • the present invention provides an antibody (polypeptide or heteromultimer, etc.) comprising a heavy chain variable region and a light chain variable region, wherein one of the following (3) and (4) is a charge:
  • An antibody which is an amino acid residue having The side chains of amino acid residues shown in (3) and (4) below are close to each other and can form a hydrophobic core.
  • the "charged amino acid residue” is, for example, glutamic acid (E), aspartic acid (D), lysine (K), arginine (R), or histidine (H). I prefer that.
  • amino acid residues described in (1) to (4) above are usually (1) glutamine (Q), (2) glutamine (Q), (3) leucine ( L), (4) Proline (P). Therefore, in a preferred embodiment of the present invention, these amino acid residues are subjected to modification (for example, substitution with a charged amino acid).
  • the types of amino acid residues (1) to (4) are not necessarily limited to the above amino acid residues, and may be other amino acids corresponding to the amino acids.
  • the amino acid corresponding to position 44 in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 8 on the light chain variable region may be, for example, histidine (H) in the case of humans.
  • H histidine
  • the production method for the above-mentioned antibody and the association control method of the present invention characterized by modifying the amino acid residues of (1) to (4) above are also preferred according to the present invention. It is an aspect.
  • the present invention relates to an antibody containing two or more heavy chain CH3 regions and an Fc region binding protein (for example, an IgG type antibody, minibody (Alt M et al. FEBS Letters 199 9; 454: 90-94 ), Imnoadhesin (Non-patent Document 2), etc.), which are selected from the following amino acid residue pairs shown in (1) to (3) in the first heavy chain CH3 region: In which the amino acid residue has the same kind of charge.
  • an antibody containing two or more heavy chain CH3 regions and an Fc region binding protein for example, an IgG type antibody, minibody (Alt M et al. FEBS Letters 199 9; 454: 90-94 ), Imnoadhesin (Non-patent Document 2), etc.
  • the present invention provides a second different from the first heavy chain CH3 region.
  • a set of amino acid residues selected from the set of amino acid residues shown in (1) to (3) in the heavy chain CH3 region, wherein the first heavy chain CH3 region has the same kind of charge An antibody having 1 to 3 amino acid residues corresponding to the amino acid residue groups shown in 1) to (3) having a charge opposite to that of the corresponding amino acid residue in the first heavy chain CH3 region. provide.
  • the “charged amino acid residue” is preferably selected from, for example, the following (a) or (b)!
  • the antibody may have the first heavy chain CH3 region and the second heavy chain CH3 region crosslinked by a disulfide bond.
  • amino acid residues to be subjected to “modification” are not limited to the amino acid residues in the above-described antibody variable region or antibody constant region.
  • a person skilled in the art can find amino acid residues that form an interface for polypeptide variants or heterologous multimers by homology modeling using commercially available software, etc. It is possible to subject these amino acid residues to modification.
  • the method of the present invention is not essential, but may be carried out by combining known techniques. Noh.
  • the amino acid side chain present in the variable region of one H chain is a larger side chain.
  • the protrusion is placed in the cavity.
  • the association control method of the present invention can be suitably implemented when a desired sc (Fv) 2 is acquired preferentially (efficiently).
  • a desired sc (Fv) 2 is acquired preferentially (efficiently).
  • sc (Fv) 2 having two types of heavy chain variable regions (HI and H2) and two types of light chain variable regions (L1 and L2) will be described in more detail.
  • sc (Fv) 2 is a single-chain polypeptide in which two heavy chain variable regions (VH1 and VH2) and two light chain variable regions (VL1 and VL2) are linked by a linker. That is, sc (Fv) 2 is a low molecular weight antibody in which four antibody variable regions are linked to each other with a linker or the like to form a single chain. Usually, sc (Fv) 2 is an antibody in which four variable regions of two light chain variable regions and two heavy chain variable regions are combined with a linker or the like to form a single chain (Hudson et al, J Immunol. Methods 1999; 231: 177-189
  • sc (Fv) 2 can be prepared by a method known to those skilled in the art.
  • sc (Fv) 2 can be prepared by linking scFv with a linker.
  • scFv contains antibody VH and VL, and these regions are present in a single polypeptide chain (for a review of scFv, see Pluckthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibomes J Vol.llj (Rosenburg and Moore ed ( Springer Verlag, New York) pp.269-315, 1994)).
  • the order of the two VHs and the two VLs is not particularly limited to the above arrangement, and may be arranged in any order. For example, the following arrangement can also be mentioned.
  • sc (Fv) 2 may contain an amino acid sequence other than the antibody variable region and the linker.
  • variable region of the antibody may be the full length of the variable region, or may be a partial sequence of the variable region as long as the binding activity to the antigen is maintained.
  • the amino acid sequence in the variable region may be substituted, deleted, added, inserted or the like.
  • chimeras may be humanized in order to reduce antigenicity.
  • any peptide linker that can be introduced by genetic engineering, or a synthetic compound linker see, for example, Protein Engineering, 9 (3), 299-305, 1996)
  • a peptide linker is preferable.
  • the length of the peptide linker is not particularly limited, and can be appropriately selected by those skilled in the art according to the purpose, but the preferred length is 12 amino acids or more (the upper limit is not particularly limited, but usually 30 amino acids or less, Preferably, it is 20 amino acids or less), particularly preferably 15 amino acids.
  • sc (Fv) 2 includes three peptide linkers, peptide linkers having the same length may be used, or peptide linkers having different lengths may be used.
  • n is an integer of 1 or more.
  • the length and sequence of the peptide linker can be appropriately selected by those skilled in the art according to the purpose.
  • Preferred sc (Fv) 2 embodiments include, for example, the following sc (Fv) 2.
  • Synthetic chemical linkers are commonly used for cross-linking peptides such as N-hydroxysuccinimide (NHS), disuccinimidyl suberate (DSS), bismuth. (Sulfosuccinimidyl) suberate (BS 3 ), dithiobis (succinimidyl propionate) (DSP), dithiopis (sulfosuccinimidyl propionate) (DTSSP), ethylene glycol Bis (succinimidyl succinate) (EGS), ethylene glycol bis (sulfosuccinimidyl succinate) (sulfo EGS), disuccinimidyl tartrate (DST), disulfosuccinimidyl tartrate (Sulfo-DST), bis [2- (succinimidoxycarboxyl) ethyl] sulfone (BSOCOES), bis [2- (sulfosuccinimidoc
  • sc (Fv) 2 As structural isomers in sc (Fv) 2, for example, there are a single chain diabody type and a bivalent scFv type.
  • sc (Fv) 2 are arranged in the order of [Variable region 1] (Linker 1) [Variable region 2] (Linker 1) [Variable region 3] (Linker 1) [Variable region 4]
  • the bivalent scFv type refers to sc (Fv) 2 having a structure in which variable region 1 and variable region 2 are associated, and variable region 3 and variable region 4 are associated.
  • the single chain diabody type refers to sc (Fv) 2 having a structure in which variable region 1 and variable region 4 are associated and variable region 2 and variable region 3 are associated.
  • the single chain diabody type is, for example, sc (Fv) 2 having the structure shown on the right side of FIG. 12 (b), and the bivalent scFv type is, for example, having the structure shown on the left side of FIG. 12 (b). sc (Fv) 2.
  • sc (Fv) 2 has a structure of a single chain diabody type or a bivalent scFv type can be analyzed by, for example, a protease-restricted degradation method. For example, it can be analyzed by the following method.
  • test sc (Fv) 2 is subjected to limited degradation using subtilisin A, a kind of protease that can partially and limitedly degrade the linker portion of sc (Fv) 2.
  • the reaction product can be analyzed by, for example, gel filtration chromatography analysis.
  • the abundance ratio of the bivalent sc (Fv) 2 structure and the single chain diabody structure contained in sc (Fv) 2 can be quantitatively evaluated based on the peak area using chromatography.
  • the association control method of the present invention is preferably used when it is desired to preferentially obtain one of the above-mentioned sc (Fv) 2 types, i.e., single chain diabody type or bivalent scFv type. Can do.
  • the present invention can also be carried out in the same manner when sc (Fv) 2 is a monospecific antibody.
  • VH and VL domains can be cross-linked by disulfide bonds (Clin Cancer Res. 1996 Feb; 2 (2): 245-52).
  • an active antibody or polypeptide By utilizing the association control method of the present invention, for example, an active antibody or polypeptide can be efficiently produced.
  • the activity include binding activity, neutralization activity, cytotoxic activity, antagonist activity, antagonist activity, enzyme activity and the like.
  • the agonist activity is an activity that induces a change in some physiological activity, for example, when a signal is transmitted into a cell by binding an antibody to an antigen such as a receptor.
  • physiological activities include proliferation activity, survival activity, differentiation activity, transcription activity, membrane transport activity, binding activity, proteolytic activity, phosphate ⁇ Z dephosphate ⁇ activity, acid ⁇ reduction activity, Examples thereof include, but are not limited to, metastasis activity, nucleolytic activity, dehydration activity, cell death inducing activity, and apoptosis inducing activity.
  • the method of the present invention can efficiently produce an antibody or polypeptide that recognizes a desired antigen or binds to a desired receptor.
  • the antigen is not particularly limited and may be any antigen.
  • antigens include, but are not limited to, a receptor or a fragment thereof, a cancer antigen, an MHC antigen, a split antigen, and the like.
  • Examples of the receptor include, for example, hematopoietic factor receptor family, site force-in receptor family, tyrosine kinase type receptor family, serine Z threonine kinase type receptor family, TNF receptor family, G Examples include receptors belonging to receptor families such as protein-coupled receptor family, GPI anchor type receptor family, tyrosine phosphatase type receptor family, adhesion factor family, hormone receptor family, and the like. There are a number of receptors belonging to these receptor families and their characteristics. For example, Cooke BA., King RJB., Van der Molen HJ. Ed. New Comp rehesive Biochemistry V0I.I8B Hormones and their Actions Part II ⁇ pp.l-46 (1988)
  • Specific receptors belonging to the above receptor family include, for example, human or mouse erythroid poetin (EPO) receptor, human or mouse granulocyte colony stimulating factor (G-CSF) receptor, human or mouse thrombopoi.
  • EPO erythroid poetin
  • G-CSF granulocyte colony stimulating factor
  • Etine (TPO) receptor human or mouse insulin receptor, human or mouse Flt-3 ligand receptor, human or mouse platelet derived growth factor (PDGF) receptor, human or mouse interferon (IFN)- ⁇ , j8 receptor , Human or mouse leptin receptor, human or mouse growth hormone (GH) receptor, human or mouse interleukin (IL) -10 receptor, human or mouse insulin-like growth factor (IGF) -I receptor, human or mouse Examples include leukemia inhibitory factor (LIF) receptor, human or mouse ciliary neurotrophic factor (CNTF) receptor (hEPOR: Simon, S. et al. (1990) Blood 76, 31-35 .; mEPO R: D'Andrea, AD. Et al.
  • LIF leukemia inhibitory factor
  • CNTF ciliary neurotrophic factor
  • Cancer antigens are antigens that are expressed as cells become malignant, and are also called tumor-specific antigens.
  • abnormal sugar chains appearing on the cell surface and protein molecules when cells become cancerous are also cancerous. It becomes an antigen and is specifically called a cancer sugar chain antigen.
  • cancer antigens include CA19-9, CA 15-3, serial SSEA-1 (SLX), and the like.
  • MHC antigens are roughly classified into MHC class I antigens and MHC class II antigens.
  • MHC class I antigens are classified as HLA-,- ⁇ , -C, - ⁇ , -F, -G,- H is included, and MHC class II antigens include HLA-DR, -DQ, -DP.
  • Anti-antigens include CDl, CD2, CD3, CD4, CD5, CD6, CD7, CD8, CD10, CDlla, CDllb, CDllc, CD13, CD14, CD15s, CD16, CD18, CD19, CD20, CD21 , CD23, CD25, CD28, CD29, CD30, CD32, CD33, CD34, CD35, CD38, CD40, CD41a, CD41b, CD42a, CD42b, CD43, CD44, CD45, CD45RO, CD48, CD49a, CD49b, CD49c, CD49d, CD49e CD49f, CD51, CD54, CD55, CD56, CD57, CD58, CD61, CD62E, CD62L, CD62P, CD64, CD69, CD71, CD73, CD95, CD102, CD106, CD122, CD126, CDwl30, etc. are included.
  • the present invention also provides polypeptide variants or heteromultimers whose association is controlled by the method of the present invention. That is, the present invention relates to a polypeptide or a heteromultimer obtained by the association control method of the present invention.
  • modification of amino acid residues forming an interface in a polypeptide variant is inhibited so that association in the original polypeptide is inhibited.
  • polypeptide variants are provided.
  • the heterologous multimer has a modification of an amino acid residue that forms an interface between the polypeptides so that association between the original polypeptides is inhibited.
  • the “original polypeptide” refers to a polypeptide in a state before being modified so that association is controlled by the method of the present invention.
  • polypeptide variant of the present invention a variant in which the original polypeptide can form two structural isomers can be mentioned.
  • An example of the heterologous multimer is a multimer in which the original polypeptide can form two or more multimers.
  • Polypeptide variants or heterologous multimers whose association is controlled by the above-described association control method of the present invention are also included in the present invention. That is, the above-mentioned meeting control method is preferred.
  • a polypeptide or heterologous multimer with controlled association is also a preferred embodiment of the present invention.
  • the present invention also provides a method for producing a polypeptide or multimer in which association of the polypeptide or multimer is controlled.
  • a preferred embodiment of the production method of the present invention is a method for producing a polypeptide having a mutation in an amino acid residue that forms an interface in a polypeptide so that the association of the polypeptides is controlled. ) Nucleic acid encoding an amino acid residue that forms an interface in the polypeptide is modified so that the association in the polypeptide is inhibited, and (b) the host cell is cultured so that the nucleic acid is expressed. And (c) the ability to culture a host cell, a method for producing a polypeptide variant comprising recovering the polypeptide.
  • a method for producing a heteromultimer having a mutation in an amino acid residue that forms an interface between polypeptides so that the association of the heteromultimers is controlled.
  • a nucleic acid encoding an amino acid residue that forms an interface between polypeptides is modified from the original nucleic acid so that association between the polypeptides is inhibited, and
  • the host cell is treated with the nucleic acid.
  • recovering the heterologous multimer from a host cell culture.
  • association control method of the present invention a nucleic acid encoding an amino acid residue that forms an interface between (in between) polypeptides is inhibited so that the association of the polypeptides is inhibited.
  • the method comprising the step of modifying from the nucleic acid is also one of the preferred embodiments of the production method of the present invention.
  • modifying a nucleic acid refers to modifying a nucleic acid so as to correspond to the amino acid residue introduced by the "modification" in the present invention. More specifically, it means that a nucleic acid encoding an original (before modification) amino acid residue is modified to a nucleic acid encoding an amino acid residue introduced by the modification. Usually, it means that genetic manipulation or mutation treatment is performed such that at least one base is inserted, deleted or substituted into the original nucleic acid so as to be a codon for coding the target amino acid residue. That is, the codon encoding the original amino acid residue is replaced by the codon encoding the amino acid residue introduced by the modification.
  • nucleic acid modifications are known to those skilled in the art, for example, For example, site-directed mutagenesis or PCR mutagenesis can be used as appropriate.
  • the nucleic acid of the present invention is usually carried (inserted) into an appropriate vector and introduced into a host cell.
  • the vector is not particularly limited as long as it stably holds the inserted nucleic acid.
  • Escherichia coli is used as the host, a pBluescript vector (Stratagene) is preferred as a cloning vector. It is possible to use various commercially available vectors.
  • An expression vector is particularly useful when a vector is used for the purpose of producing the polypeptide of the present invention.
  • the expression vector is not particularly limited as long as it is a vector that expresses a polypeptide in vitro, in E. coli, in cultured cells, or in an individual organism.
  • a pBEST vector manufactured by Promega
  • pET vector manufactured by Invitrogen
  • pME18S-FL 3 vector GenBank Accession No. AB009864
  • pME18S vector Mol Cell Biol. 8: 466-472 (1988)
  • the DNA of the present invention can be inserted into a vector by a conventional method, for example, by a ligase reaction using a restriction enzyme site (Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. Wiley & Sons. Section 11.4-11.11).
  • the host cell is not particularly limited, and various host cells may be used depending on the purpose.
  • Examples of cells for expressing a polypeptide include bacterial cells (eg, Streptococcus, Staphylococcus, E. coli, Streptomyces, Bacillus subtilis), fungal cells (eg, yeast, Aspergillus), and insect cells (eg, Drosophila).
  • S2, Spodoptera SF9 animal cells (eg CHO, COS, HeLa, C127, 3T3, BHK, HEK293, Bowes melanoma cells) and plant cells can be exemplified.
  • Vector introduction into host cells can be performed by, for example, calcium phosphate precipitation method, electric pulse perforation method (Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley & Sons. Section 9.1-9.9), lipophectamine method (GIBC O-BRL) and a known method such as a microinjection method.
  • calcium phosphate precipitation method for example, calcium phosphate precipitation method, electric pulse perforation method (Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley & Sons. Section 9.1-9.9), lipophectamine method (GIBC O-BRL) and a known method such as a microinjection method.
  • electric pulse perforation method Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley & Sons. Section 9.1-9.9
  • lipophectamine method GIBC O-BRL
  • an appropriate secretion signal can be incorporated into the polypeptide of interest. These signals are endogenous to the polypeptide of interest. Or a heterogeneous signal.
  • the polypeptide is recovered when the polypeptide of the present invention is extracted in the medium.
  • the polypeptide of the present invention is produced in a cell, the cell is first lysed, and then the polypeptide is recovered.
  • the ability of recombinant cell culture to recover and purify the polypeptides of the invention also includes ammonium sulfate or ethanol precipitation, acid extraction, cation or cation exchange chromatography, phosphocellulose chromatography, hydrophobicity.
  • Known methods including interaction chromatography, affinity chromatography, hydroxylapatite chromatography and lectin chromatography can be used.
  • the present invention also relates to a composition (drug) comprising the polypeptide variant of the present invention or the heterologous multimer of the present invention and a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the pharmaceutical composition usually refers to a drug for treatment or prevention of a disease, or examination / diagnosis.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be formulated by methods known to those skilled in the art. For example, it can be used parenterally in the form of a sterile solution with water or other pharmaceutically acceptable liquid, or an injection in the form of a suspension.
  • a pharmacologically acceptable carrier or medium specifically, sterilized water or physiological saline, vegetable oil, emulsifier, suspension, surfactant, stabilizer, flavoring agent, excipient, vehicle, antiseptic It may be formulated in combination with drugs, binders, etc., by mixing in unit dosage forms generally required for pharmaceutical practice.
  • the amount of active ingredient in these preparations is set so that an appropriate amount within the specified range can be obtained.
  • Sterile compositions for injection can be formulated according to conventional pharmaceutical practice using a vehicle such as distilled water for injection.
  • aqueous solutions for injection include isotonic solutions containing, for example, physiological saline, glucose and other adjuvants (eg, D-sorbitol, D-mannose, D-mannitol, sodium chloride).
  • a suitable solubilizing agent such as alcohol (ethanol, etc.), polyalcohol (propylene glycol, polyethylene glycol, etc.), nonionic surfactant (polysorbate 80 (TM), HCO-50, etc.) may be used in combination.
  • the oily liquid include sesame oil and soybean oil, and benzyl benzoate and Z or benzyl alcohol may be used in combination as a solubilizing agent.
  • a buffer for example, phosphate buffer solution and sodium acetate buffer
  • a soothing agent for example, pro-hydrochloric acid hydrochloride
  • a stabilizer for example, benzyl alcohol and phenol
  • an antioxidant for example, benzyl alcohol and phenol
  • the pharmaceutical composition of the present invention is preferably administered by parenteral administration.
  • the composition can be an injection, nasal, pulmonary, or transdermal composition.
  • it can be administered systemically or locally by intravenous injection, intramuscular injection, intraperitoneal injection, subcutaneous injection, or the like.
  • the administration method can be appropriately selected depending on the age and symptoms of the patient.
  • the dose of the pharmaceutical thread or the composition containing the antibody or the polynucleotide encoding the antibody can be set, for example, in the range of O.OOOlmg to lOOOmg per kg body weight at a time. Or, for example, the power that can be a dose of 0.001 to 100,000 mg per patient.
  • the present invention is not necessarily limited to these values.
  • the dose and administration method vary depending on the weight, age, symptoms, etc. of the patient, but those skilled in the art can set an appropriate administration dose and administration method in consideration of these conditions.
  • polypeptide of the present invention or the heteromultimer can be formulated in combination with other pharmaceutical ingredients.
  • the present invention also provides a nucleic acid encoding the polypeptide variant of the present invention or the heterologous multimer of the present invention. Furthermore, a vector carrying the nucleic acid is also included in the present invention.
  • the present invention provides a host cell having the nucleic acid.
  • the host cell is not particularly limited, and examples thereof include E. coli and various animal cells.
  • the host cell can be used, for example, as a production system for production and expression of the antibody or polypeptide of the present invention.
  • Production systems for polypeptide production include in vitro and in vivo production systems. Examples of in vitro production systems include production systems that use eukaryotic cells and production systems that use prokaryotic cells.
  • Examples of eukaryotic cells that can be used as host cells include animal cells, plant cells, and fungal cells.
  • Animal cells include mammalian cells such as CHO (j. Exp. Med. (1995 108: 945), COS ⁇ 3T3, myeloma, BHK (baby hamster kidney), HeLa, Vero, etc.
  • Amphibian cells such as Xenopus laevis oocytes (Valle et al., Nature (1981) 291: 338- 340), and insect cells such as S19, Sf21, Tn5.
  • CHO-DG44, CH0-DX11B, COS7 cells, and BHK cells are preferably used.
  • Vectors can be introduced into host cells by methods such as calcium phosphate method, DEAE dextran method, cationic ribosome DOTAP (manufactured by Boehringer Mannheim), electroporation method, lipofussion method, etc. .
  • a cell derived from Nicotiana tabacum is known as a protein production system, and the antibody of the present invention can be produced by a method of culturing this cell.
  • fungal cells include yeasts such as Saccharomyces saccharomyces (Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces pombe, etc.) and filamentous fungi such as Aspergillus.
  • yeasts such as Saccharomyces saccharomyces (Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces pombe, etc.) and filamentous fungi such as Aspergillus.
  • a protein expression system using the above-mentioned cells (such as Aspergillus niger) is known and can be used as the antibody production host of the present invention.
  • prokaryotic cells there are production systems using bacterial cells.
  • a production system using Bacillus subtilis in addition to the above-mentioned E. coli is known and can be used for the production of the antibody of the present invention.
  • a host cell transformed with an expression vector containing a polynucleotide encoding the antibody of the present invention is cultured to express the polynucleotide.
  • the culture can be performed according to a known method. For example, when animal cells are used as hosts, for example, DMEM, MEM, RPMI1640, and IMDM can be used as a culture solution. At that time, the cells may be cultured by serum-free culture, even in combination with serum supplements such as FBS and fetal calf serum (FCS).
  • the pH during culture is preferably about 6-8. Cultivation is usually performed at about 30 to 40 ° C for about 15 to 200 hours, with medium exchange, aeration, and agitation as necessary.
  • examples of the system for producing a polypeptide in vivo include a production system using animals and a production system using plants.
  • the target poly for these animals or plants Nucleotides are introduced to produce and recover the polypeptide in the animal or plant body.
  • the “host” in the present invention includes these animals and plants.
  • mice When animals are used, there are production systems using mammals and insects. As mammals, goats, pigs, hidges, mice, mice, etc. can be used (Vicki Glaser, SPECTRU M Biotechnology Applications (1993)). In addition, when a mammal is used, a transgenic animal can be used.
  • a polynucleotide encoding the antibody of the present invention is prepared as a fusion gene with a gene encoding a polypeptide inherently produced in milk such as goat j8 casein.
  • the polynucleotide fragment containing the fusion gene is then injected into a goat embryo and the embryo is transferred to a female goat.
  • the antibody of interest can be obtained from the milk produced by the transgene goat born from the goat that received the embryo or its progeny.
  • hormones may be administered to Transgene goats as appropriate (Ebert et al., Bio / Technology (1994) 12: 699-702) .
  • a silkworm As an insect that produces the antibody of the present invention, for example, a silkworm can be used.
  • the antibody of interest can be obtained from the body fluid of the silkworm by infecting the silkworm with baculovirus inserted with a polynucleotide encoding the antibody of interest (Susumu et al, Nature (1985) 315 : 592-4).
  • a plant for producing the antibody of the present invention
  • tobacco can be used.
  • a polynucleotide encoding the antibody of interest is inserted into a plant expression vector, such as pMON530, and this vector is introduced into a bacterium such as Agrobacterium tumefaciens.
  • This bacterium is infected with tobacco, for example, Nicotiana tabacum, and the desired antibody can be obtained from the leaves of this tobacco (Ma et al., Eur. J. Immunol. (1994) 24: 131- 8)
  • the antibody thus obtained can be isolated from the inside of the host cell or outside the cell (medium, milk, etc.) and purified as a substantially pure and homogeneous antibody. Separation and purification of antibodies are not limited in any way as long as separation and purification methods used in usual polypeptide purification are used. For example, chromatography column, filter, ultrafiltration , Salting out, solvent precipitation, solvent extraction, distillation, immunoprecipitation, SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, isoelectric focusing, dialysis, recrystallization, etc. Can do.
  • chromatography examples include affinity chromatography, ion-exchange chromatography, hydrophobic chromatography, gel filtration, reverse phase chromatography, adsorption chromatography ⁇ , etc .; ⁇ 2 » Protein Purincation ana Charactenzatio n: A Laboratory Course Manual. Ed Daniel R. Marshak et al. (199b Cold Spring Harbor Laboratory Press)
  • chromatographies are liquid phase chromatography, for example, liquid phase chromatography such as HPLC and FPLC.
  • Columns used for affinity mouthmatography include protein A columns and protein G.
  • columns using protein A include Hyper D, POROS, and Sepharose FF. (Pharmacia) and the like.
  • an appropriate protein-modifying enzyme can be allowed to act before or after purification of the antibody to arbitrarily modify or partially remove the peptide.
  • the protein modifying enzyme include trypsin, chymotrypsin, lysyl endobeptidase, protein kinase, darcosidase and the like.
  • the method for producing a polypeptide variant or heteromultimer of the present invention comprising the steps of culturing the host cell of the present invention as described above and recovering the cell culture force polypeptide is also provided.
  • One of the embodiments is preferred.
  • Factor IXa ⁇ emulsified with FIA Factor IXa ⁇ emulsified with FIA (Freund's incomplete adjuvant (Difco lab oratories)) was subcutaneously administered at 40 ⁇ g / head. Thereafter, booster immunization was performed 3 to 7 times at weekly intervals. After confirming the increase in serum antibody titer against Factor ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ by ELISA (Enzyme linked immunosorbent assay), PB S (-) (phosphate buffered saline without calcium and magnesium ions) was used as the final immunization. Dilute Factor IXa was administered intravenously at 40 g / head.
  • Fused cells suspended in RPMI1640 medium (Invitrogen) containing 10% FBS (In vitrogen) (hereinafter referred to as 10% FBS / RPMI1640) were seeded in a 96-well culture plate, and 1, 2, 3, 5 days after the fusion
  • 10% FBS / RPMI1640 10% FBS / RPMI1640
  • HAT selective medium 10% FBS / RPMI1640 / 2% HAT 50x concentrate (Dainippon Pharmaceutical) / 5% BM-Condimed HI (Roche's Diagnostics)
  • a hyperpridoma having Factor IXa binding activity was selected by measuring the binding activity to Factor IXa by ELISA shown in 1-2. . Subsequently, neutralization activity for the enzyme activity of Factor IXa was measured by the method shown in 5-3, and a hyperidoma having no neutralization activity for Factor IXa was selected.
  • Hypridoma was cloned twice by limiting dilution by seeding one cell per well in a 96-well culture plate to establish hybridoma XB12 producing anti-factor IXa antibody.
  • the plate was blocked with R) 20, 0.02% sodium azide) for 2 hours at room temperature. After removing Buffer, plate The culture supernatant of mouse antiserum or hybridoma diluted with diluent buffer was added at 100 ⁇ L / well and incubated at room temperature for 1 hour. After washing the plate 3 times, add 100 / z L / well of alkaline phosphatase-labeled goat anti-mouse IgG (H + L) (Zymed Labor atories) diluted 1/2000 with diluent buffer for 1 hour at room temperature. Incubated.
  • a 400 g / mL phospholipid solution was prepared by dissolving Phospholipid (Sigma-Aldrich) in distilled water for injection and subjecting it to ultrasonic treatment.
  • Phospholipid Sigma-Aldrich
  • Tris buffered saline containing 0.1% ushi serum albumin hereinafter TBSB O / z L and 30 ng / mL Factor IXa jS (Enzyme Research Laboratories) 10 ⁇ L and 400 ⁇ g / mL phospholipid solution 5 L and 100 mM CaCl
  • the binding activity to Factor X was measured by ELISA shown in 2-2.
  • Hypridoma having Factor X binding activity was selected, and the neutral activity of Factor Xa with respect to the enzyme activity was measured by the method shown in 2-3.
  • Hypridoma without neutralizing activity against Factor Xa was cloned by performing limiting dilution twice to establish a hybridoma SB04 that produces anti-Factor X antibody.
  • alkaline phosphatase-labeled goat anti-mouse IgG (H + L) diluted 1/2000 in diluent buffer was added and incubated at room temperature for 1 hour.
  • 100 ⁇ L / well of chromogenic substrate Blue-Phos TM Phosphate Substrate (Kirkegaad & Perry Laboratories) was added and incubated at room temperature for 20 minutes.
  • Blue-Phos Stop Solution was added at 100 ⁇ L / well, and the absorbance at 595 nm was measured with Microplate Reader Model 3550 (Bio-Rad Laboratories).
  • TBSB phosphatidylcholine
  • phosphatidylserine 75: 25, Sigma-Aldrich
  • 20 g / mL prothrombin Enzyme Research Laboratories
  • 100 ng / mL activated coagulation factor V Fact or Va (Haematologic Technologies)
  • the reaction was stopped by adding 10 L of 0.5 M EDTA.
  • 1 mM S-2238 solution Chromogenix
  • RNA was dissolved in 40 L of sterile water.
  • Single-stranded cDNA was synthesized by RT-PCR using the Superscript cDNA synthesis system (Invitrogen) in accordance with the method described in the instructions, using the purified R 1 to 2 ⁇ g in a bowl shape.
  • the reaction solution was subjected to 1% agarose gel electrophoresis.
  • the amplification fragment of the desired size (about 400 bp) was purified using the QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN) according to the method described in the attached instruction, and eluted with 30 ⁇ 1 of sterilized water.
  • the base sequence of each DNA fragment was determined using the BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems) and the DNA sequencer ABI PRISM 3100 Ge The determination was made using netic Analyzer (Applied Biosystems) according to the method described in the attached manual. The sequence group determined by this method was compared and analyzed with analysis software GENETYX-SV / RC Version 6.1 (Genetyx), and those having different sequences were selected.
  • PCR was performed using the thermal cycler GeneAmp PCR system 9700 (Parkin Elmer) according to the efficiency of fragment amplification under the conditions A (heated at 98 ° C for 3 minutes, 98 ° C for 20 seconds, 58 ° C for 20 seconds, Reactions consisting of 72 ° C for 30 seconds and 32 cycles) or condition B (94 ° C for 20 seconds, 46 ° C for 20 seconds, 68 ° C for 30 seconds after heating at 94 ° C for 3 minutes)
  • a cycle consisting of 5 cycles and a reaction consisting of 94 ° C for 20 seconds, 58 ° C for 20 seconds, and 72 ° C for 30 seconds was performed under any of the following conditions: 30 cycles for one cycle.
  • the reaction solution was subjected to 1% agarose gel electrophoresis.
  • the amplified fragment of the desired size (about 400 bp) was purified by QIAquick Gel Extraction Kit (QIAG EN) according to the method described in the attached instruction, and eluted with 30 L of sterilized water.
  • VL Mouse antibody L chain variable region
  • DNA polymerase KOD plus (Toyobo) was prepared.
  • PCR was performed using a thermal cycler GeneAmp PCR system 9700 (Parkin Elmer) according to the efficiency of fragment amplification, after heating at 94 ° C for 3 minutes, 94 ° C for 20 seconds, 46 ° C for 20 seconds, 68 5 cycles of a reaction at 30 ° C for 30 seconds, and another cycle of 94 ° C for 20 seconds, 58 ° C for 20 seconds, 72 ° C for 30 seconds As 30 cycles.
  • the reaction solution was subjected to 1% agarose gel electrophoresis.
  • the amplified fragment of the desired size (about 400 bp) was purified by QIAqucick Gel Extractio Kit (QIAGE N) by the method described in the attached instruction, and eluted with 30 L of sterilized water.
  • the fragment is in a state in which (Gly4Ser) 3-linker sequence derived from the primer LF is added to the C-terminus.
  • (Gly4Ser) 3-linker sequence derived from the primer LF is added to the C-terminus.
  • the IgG3 knobs-into-holes technology (Non-patent Document 3) is used to form a heteromolecule for each H chain.
  • An amino acid substitution product was prepared.
  • Type a (IgG4 ya) is a substitute for Y349C and T366W
  • type b (IgG4 yb) is a substitute for E356C, T366S, L368A, and Y407V.
  • a substitution (-ppcpScp->-ppcpPcp-) was also introduced into the hinge region of both substitutions.
  • each region of the H chain or L chain ie, an animal cell signal sequence (IL3ss) (Proc Natl. Acad. Sci. USA. 1984; 81: 1075) suitable mouse antibody variable regions (VH and VL) and human IgG4 ya constant regions (SEQ ID NO: 9)! A ⁇ constant region (SEQ ID NO: 10) (pcDNA4-g4H! And pcDNA4-g4L) was prepared.
  • IL3ss animal cell signal sequence
  • pcDNA4 was digested with restriction enzyme cleavage sites Eco RV and Not I (Takara Bio) existing in the multicloning site.
  • Chimeric bispecific antibody with appropriate antibody variable region right arm H chain tanned L chain expression unit (each 1.6 kb tanned about l.Okb) was digested with Xho 1 (Takara Bio), then QIAquick PCR
  • the product was purified by Purification Kit (QIAGEN) according to the method described in the attached instruction, and reacted at 72 ° C for 10 minutes with DNA polymerase KOD (Toyobo) using the reaction liquid composition described in the attached instruction to smooth the ends.
  • the blunt end fragment was purified by QIAquick PCR Purification Kit (QIAGEN) by the method described in the attached instruction, and digested with Not 1 (Takara Bio).
  • the Not blunt fragment (about 1.6 kb to l.Okb, respectively) and pcDNA4 digested with Eco RV-Not I were subjected to ligation using Ligation High (Toyobo) according to the method described in the attached instructions.
  • Escherichia coli DH5a strain (Competent high DH5a (Toyobo)) was transformed with the reaction solution. Plasmid DNAs were isolated from the obtained ampicillin metaclones using QIAprep Spin Miniprep Kit (QIAGEN).
  • the other arm (referred to as the left arm HL molecule for the sake of convenience) is directed to the etadyson analog-derived vector pIND (Invitrogen).
  • This region of the H chain or L chain ie, the signal sequence for animal cells (IL3ss) ( EMBO. J. 1987; 6: 2939) downstream of the appropriate mouse antibody variable region (VH, VL) and human IgG4 yb constant region (SEQ ID NO: 11) or ⁇ constant region (pIND-g4H Or pIND-g4L) was prepared according to the method described above, and each plasmid DNA was isolated.
  • Plasmid DNAs were isolated from the target clones using QIAprep Spin Miniprep Kit (QIAGEN) and dissolved in 100 L of sterile water.
  • the anti-F. IXa antibody chimeric H chain expression vector, the anti-F. IXa antibody chimeric L chain expression vector, the anti-F. X antibody chimeric H chain expression vector, and the anti-F. X antibody chimeric L chain expression vector are respectively pcDNA4- g4 They were named XB12H, pcDNA4-g4 XB1 2L, pIND-g4 SB04H and pIND-g4 SB04L.
  • Antibody right arm HL molecule expression vectors (pcDNA4-g4 XB12H and pcDNA4-g4 XB12L) are induced by tetracycline. In the absence of tetracycline, the plasmid pcDNA6 / TR (Invitrogen) encoding the Tet repressor is required to completely suppress expression under circumstances.
  • antibody left arm HL molecule expression vectors (pIND-g4 SB04H and p IND-g4 SB04L) are produced by the insect hormone etadyson analog (ponasterone A). Current guidance takes.
  • the plasmid pVgRXR (Invitrogen) encoding etadyson receptor and retinoid X receptor that reacts with and induces Bonasterone A is required. Therefore, a total of six types of plasmid DNA mixtures were prepared for animal cell transfection. For 10 mL of cell culture medium, 3 ⁇ g each of pcDNA4- g4 XB12H, pcDNA4-g4 XB12L, pIND-g4 S B04H and pIND-g4 SB04L, and 18 ⁇ g each of pcDNA6 / TR and pVgRXR were used.
  • Human embryonic kidney cancer cell-derived HEK293H strain (Invitrogen) is suspended in D MEM medium (Invitrogen) containing 10% FCS (MOREGATE), and a dish for adherent cells (diameter 10cm, CORNING, at a cell density of 5 X 10 5 cells / mL) ) 10 mL each to each dish of CO) CO incubator (37
  • the cells were cultured overnight at 5 ° C. in ° C. Transfer the plasmid DNA mixture prepared in 4-1.
  • the cell culture fluid force transformed as described in the previous section is also removed by aspiration, and 10 mL CHO-S-SFM-II (Invitrogen) medium containing 1 ⁇ g / mL tetracycline (Wako Pure Chemical Industries) is added. Incubate for 1 day in a CO incubator (37 ° C, 5% CO)
  • Example 4 Add 100 ⁇ L of rProtein A Sepharose TM Fast Flow (Amersham Biosciences) to 10 mL of the culture supernatant obtained by the method described in 3 and mix by inverting at 4 ° C for 4 hours or more. It was. Transfer the solution to a 0.22 ⁇ m filter cup Ultrafree (R) -MC ( Millipore), wash 3 times with 500 ⁇ L of TBS containing 0.01% Tween (R) 20, and then add 100 ⁇ l of rProtein A Sepharose TM rosin. The suspension was suspended in 10 mM HC1, pH 2.0 containing 0.01% Tween (R) 20 and allowed to stand for 2 minutes, and then the antibody was eluted. Immediately, 5 ⁇ L of 1M Tris-HCl, pH 8.0 was added and neutralized.
  • Goat anti-human Igu (Biosource International) was prepared in a coating buffer of “tl ⁇ g / mL and immobilized on a Nunc-Immuno plate (Nunc). After blocking with Diluent buffer (DB), DB As a standard for calculating antibody concentration, HI HgG4 (humanized anti-antigen) was diluted 1 to 11 in DB in a 3-fold series from 2000 ng / mL.
  • TF antibody (see WO 99/51743) was added in the same manner 7 washes 7 This was reacted with uoat anti-human Igu and alkaline phosphatase (Biosource Internation) After 5 washes, Sigma 104 ( R) Color was developed using phosphatase substrate (Sigma-Aid rich) as a substrate, and absorbance at 405 nm was measured at a reference wavelength of 655 nm using an absorbance reader Model 3550 (Bio-Rad Laboratories) Microplate Manager III (Bio-Rad Laboretories) ) From the standard calibration curve using software, human Ig G in the culture supernatant Concentration was calculated.
  • Hemophilia To determine whether bispecific antibodies correct blood clotting ability, we examined the effect of the antibody on active ⁇ partial thromboplastin time (APTT) using Fact or VIII-deficient plasma. . A mixture of 50 ⁇ L of antibody solution of various concentrations 50 ⁇ L Factor VIII deficient plasma (Biomeri eux) and 50 ⁇ L of APTT reagent (Dade Behring) was heated at 37 ° C. for 3 minutes. The coagulation reaction is initiated by adding 50 L of 20 mM CaCl (Dade Behring) to the mixture.
  • APTT active ⁇ partial thromboplastin time
  • SB04-L chain variable region EMBL Accession No. AB064111 (IMGT Database)
  • Humanized antibodies were prepared by grafting the complementary antigen-determining regions (hereinafter CDRs) of each mouse antibody into the FRs of human antibodies (l)-(4).
  • SB04- H chain variable region GenBank Accession No. BC019337
  • [0198] 6-2 Construction of humanized antibody gene expression vector
  • 12 synthetic oligo DNAs of about 50bases were prepared alternately so that the ends were annealed by about 20bases.
  • the primer having the Sfil cleavage sequence was prepared by annealing to the 5 ′ end of the antibody variable region gene and the primer having the Xhol cleavage sequence and the 3rd end of the antibody variable region gene.
  • Synthetic oligo DNA prepared in 2.5 ⁇ was mixed at 1 ⁇ L each, and lx TaKaRa Ex Taq Buffer, 0.4 mM dNTPs, 0.5 units TaKaRa Ex Taq (all Takara Shuzo) was added, and the reaction solution was added to 48 ⁇ L. It prepared so that it might become. After incubating at 94 ° C for 5 minutes, the reaction comprising 94 ° C for 2 minutes, 55 ° C for 2 minutes, and 72 ° C for 2 minutes was performed for 2 cycles to assemble and extend each synthetic oligo DNA.
  • the fragment was cloned using pGEM-T Easy Vector Systems (Promega) by the method described in the attached instructions.
  • the base sequence of each DNA fragment was determined using the BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems) with the DNA sequencer ABI PRISM 3700 DNA Sequencer (Applied Biosystems) according to the method described in the attached instructions.
  • digested tetracycline was prepared in Example 3-3 inducible expression plasmid (pcDNA4-g4H, pcDNA4-g4L ) and Eguda Ison analogues inducible expression plasmid (pIND- g4H, P IND-g4L ) with EcoRI and Sfil After that, a fragment (about 5 kb) containing the antibody constant region was purified by QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGE N) by the method described in the attached instructions and eluted with sterile water 301.
  • QIAquick Gel Extraction Kit QIAquick Gel Extraction Kit
  • an expression vector was prepared as follows. -Plasmids (pCAG-g4H, pCAG-g ⁇ ) in which the wild-type antibody constant region was inserted into pCAGG S (Niwa et al.
  • Example 4 2 Using the humanized H chain antibody expression vector and humanized L chain antibody expression vector prepared in Example 6-3 to express a normal humanized antibody, not a bispecific antibody The gene was introduced into 1 "3 ⁇ 41 2931" [by the method shown in FIG. After transfection, 10 mL of C HO-S-SFM- ⁇ medium (Invitrogen) was added and removed, washed, and then added with 10 mL of C HO- S-SFM-II, and the CO incubator (37 Incubate for 3 days in ° C, 5% CO)
  • Humanized bispecific antibody (humanized XB12 antibody (VH: hXB12f-A, VL: hXBVL) / humanized) having activity equivalent to that of XB12 / SB04 by repeated amino acid modification of FR sequence and evaluation of blood coagulation ability SB04 antibody (VH: hSB04e, VL: hSBVL-F31) was obtained, and each antibody variable region sequence is shown in the following sequence number.
  • an antibody Fv region model was prepared by homology modeling using MOE software (Chemical Computing Group Inc.).
  • MOE software Chemical Computing Group Inc.
  • the amino acids H39 and L38 were both daltamine (Gin), confirming that hydrogen bonds were formed by the side chains of both residues (Fig. 1 (A)).
  • the amino acids of H45 and L44 were leucine (Leu) and proline (Pro), respectively, and it was confirmed that the side chains of both residues were very close and formed a hydrophobic core (Fig. 1). (B)). It is reported that these two amino acid residues are highly conserved in human antibodies.
  • H39 glutamine of the humanized XB12 heavy chain and the L38 glutamine of the humanized SB04 light chain are inhibited so as to inhibit the association of the humanized XB12 heavy chain and the humanized SB04 light chain.
  • both amino acids H39, L38
  • both amino acids have a positive charge on the side chain lysine (Lys) or arginine (Arg), so as to repel the charge by inhibiting hydrogen bonding on the side chain of glutamine
  • Substitution was made with glutamic acid (Glu) or aspartic acid (Asp) having a negative charge on the side chain.
  • humanized XB12 H chain (modified H39), humanized SB04 L chain (modified L38), and wild type humanized XB12 L chain.
  • humanized XB12 H chain (modified H39), humanized SB04 L chain (modified L38), and wild type humanized XB12 L chain.
  • Example 4-2 humanized XB12 H chain
  • humanized SB04 L chain (modified L38)
  • wild type humanized XB12 L chain was used to introduce a gene into HEK293H by the method shown in Example 4-2, and the antibody was secreted into the culture supernatant.
  • antibody purification and antibody concentration quantification were performed by the methods shown in Sarako, Examples 4-5 and 4-6.
  • the ratio (%) of the target XB12-L chain was calculated by “XB12-L chain ZL chain total amount (XB12-L chain + SB04-L chain) ⁇ 100”.
  • Humanized XB12 H chain (H39) and humanized SB04 L chain (L38) amino acids are 50% when wild-type glutamine (Gin), whereas H39 and L38 are replaced. It was confirmed that the ratio of the Xenopus XB12 L chain increased, and when it was replaced with glutamic acid (Glu), it increased by 82% to 1.6%.
  • the gene was introduced into HEK293H by the method shown in Example 4-2, and the antibody was secreted into the culture supernatant. Furthermore, antibody purification and antibody concentration quantification were carried out by the methods shown in Examples 45 and 46.
  • proline of L44 of the humanized SB04 L chain was replaced with an amino acid having a charge on the side chain so as to inhibit the association of the humanized XB12 H chain and the humanized SB04 L chain.
  • proline present in the hydrophobic core at the interface between VH and VL is lysine (Lys) or arginine (Arg) with a positive charge on the side chain, and glutamic acid (Glu) with a negative charge on the side chain.
  • Aspartic acid (Asp) for replacement of the human rabbit antibody gene, mutation was introduced by the method described in the attached instruction using QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene). Each humanized antibody gene fragment in which amino acids were substituted was inserted into the bispecific antibody expression vector used in Example 6-2 or a normal antibody expression vector.
  • the fluorescence intensity of the H chain and L chain bands was calculated by Image Quant ver. 4.2 (Amersham Biosciences). The results are shown in FIG. Using the calculated fluorescence intensity values, the ratio (%) of the target XB12-L chain was calculated by “XB12-L chain ZL chain total amount (XB12-L chain + SB04-L chain) ⁇ 100”.
  • the amino acid of human SB04 L chain (L44) is wild-type proline (Pro), it is 47%, but when L44 is substituted, the ratio of human ⁇ XB12 L chain increases. 86-90%, a 1.8-1.9-fold increase.
  • the humanized SB04 L chain (L44 modified) bispecific antibody expression vector and wild type humanized XB12 H chain, humanized XB12 L chain and humanized SB04 H chain bispecific Gene introduction and expression induction into HEK293H were carried out by the methods shown in Examples 4-2 and 4-3 using the sex antibody expression vectors pcDNA6 / TR and pVgRXR. Furthermore, antibody purification and antibody concentration quantification were carried out by the methods shown in Example 4 5 and 46.
  • the gene was introduced into HEK2 93H by the method shown in Example 42 using wild type humanized SB04 H chain and human SB04 L chain (L44 modified) antibody expression vector.
  • the antibody was secreted into the culture supernatant. Furthermore, the antibody concentration in the culture supernatant was quantified by the method shown in Example 46.
  • the purpose is to reduce the binding activity to antigen, coagulation activity substituting FactoVin, and aquatic activity by modifying L44 of SB04 L chain and the other amino acid. It was suggested that it is possible to increase the ratio of bispecific antibodies. Examples of controlling the association without reducing the function simply by introducing a mutation at one amino acid in the polypeptide are the first findings that have not been reported so far, including methods using knobs and holes. You can say that. [Example 10] Production and evaluation of human ivy antibody modified with amino acids H39, L38 and L44
  • the humanized XB12 heavy chain H39 and the humanized SB04 light chain L38 and L44 are positioned so as to inhibit the association of the humanized XB12 heavy chain and the humanized SB04 light chain.
  • the amino acid was charged with a charge in the chain.
  • both amino acids H39 of the human XB12 H chain and L38 of the humanized SB04 L chain were substituted with glutamic acid (Glu), which was most effective in Example 8, and L44 of the humanized SB04 L chain was used.
  • the proline present in 1 was substituted with lysine (Lys) or arginine (Arg) having a positive charge in the side chain, glutamic acid (Glu) or aspartic acid (Asp) having a negative charge in the side chain.
  • mutation was introduced by the method described in the attached instruction using QuikChange Site-Directed Muta genesis Kit (Stratagene). Each humanized antibody gene fragment substituted with amino acid was inserted into the bispecific antibody expression vector used in Example 6-2 or a normal antibody expression vector.
  • Example 3 In order to evaluate the association control of H chain and L chain, Example 3 was carried out using three types of antibody expression vectors: modified humanized SB04 L chain, modified humanized XB12 H chain, and wild type humanized XB12 L chain.
  • the gene was introduced into HEK293H by the method shown in 4-2, and the antibody was secreted into the culture supernatant. Furthermore, antibody purification and antibody concentration quantification were performed by the methods shown in Examples 4 5 and 4-6.
  • the target XB12-L chain The ratio (%) was calculated by “XB12-L chain ZL chain total amount (XB12-L chain + SB04-L chain) ⁇ 100”.
  • humanized XB12 heavy chain (H39) and humanized SB04 light chain (L38) amino acids are modified to glutamic acid (Glu)
  • humanized SB04 light chain (L44) is wild-type proline (Pro)
  • Glu glutamic acid
  • Glu glutamic acid
  • Glu glutamic acid
  • Glu glutamic acid
  • Glu glutamic acid
  • the modified humanized XB12 H chain, human ⁇ XB1 2 L chain and humanized SB04 H chain bispecific antibody expression vector and wild type humanized XB12 H chain, humanized Using the XB12 L chain and humanized SB04 H chain bispecific antibody expression vectors, pcDNA6 / TR and pVgRXR, gene introduction and expression induction were performed in HEK293H by the methods shown in Examples 4-2 and 4-3. Furthermore, antibody purification and antibody concentration quantification were performed by the methods shown in Examples 45 and 46.
  • the gene was introduced into HEK293 H by the method shown in Example 42, and cultured.
  • the antibody was secreted during the cleansing. Further, the antibody concentration in the culture supernatant was quantified by the method shown in Example 46.
  • a method for producing a humanized anti-Mpl antibody hVB22B u2-wz4 sc (Fv) 2 (hereinafter u2-wz4) is shown in WO20 05/56604.
  • the gene uses a nucleotide sequence encoding a linker sequence (GlyGlyGlyGlySer) x3, and a nucleotide sequence composed of VH linker sequence VL linker sequence VH linker sequence VL (SEQ ID NO: 12; SEQ ID NO: WO2005 / 56604 : See 286).
  • the DNA fragment was cloned into the expression vector PCXND3 to construct an expression vector, and the gene was introduced into CHO-DG44 cells to produce a stable expression cell line. Specifically, 0.75 mL of CHO-DG44 cells (1 X 10 7 cells / mL) suspended in PBS mixed with the expression vector (20 ⁇ g) was cooled on ice for 10 minutes and transferred to a cuvette. Thereafter, a pulse was applied using a Gene Pulser Xcell (BioRad) at a capacity of 1.5 kV and 25 ⁇ FD.
  • BioRad Gene Pulser Xcell
  • electoral-posure-treated cells were selected by adding them to CH OS-SFMII medium (Invitrogen) containing g / mL Geneticin (lnvitrogen), and u2-wz4 producing CHO cells Established stocks.
  • the humanized antibody hVB22B u2- wz4 sc (Fv) 2 has a Flag tag attached! /, !, and thus the purification of the culture supernatant force is a recognized epitope MG10 (human The Gln213 force of the Mpl amino acid sequence was also determined using Ala 231) and the GST fusion protein.
  • the MG10 and GST fusion protein was purified using Glutathione Sepharose 4B (manufactured by Amersham Biosciences) according to the manufacturer's protocol. Further, the purified MG10 and GST fusion protein was immobilized on HiTrap NHS-activated HP (Amersham Biosciences) according to the manufacturer's protocol to prepare a affinity column.
  • Humanized antibody hVB22B u2-wz4 sc (Fv) 2 expression CHO cell culture supernatant is applied to the MG10-GST fusion protein-fixed column, adsorbed with human antibody hVB22B u2-wz4 sc (Fv) 2, 100 mM Elution was performed with Glycine-HCl (pH 3.5) and 0.01% Tween80. The elution fraction was immediately neutralized with 1 M Tris-HCl (pH 7.4) and subjected to gel filtration chromatography using HiLoad 16/60 Superdex200pg (Amersham Biosciences) to purify the monomer. Gel filtration chromatography buffer is 20 mM citrate buffer (pH 7.5) 300 mM NaCl, 0.01% Tween 80 was used.
  • hVB22B u2-wz4 sc (Fv) 2 has the sequence of VH -linker- VL -linker- VH -linker- VL
  • sc (Fv) 2 is similar to that of VB22B sc (Fv) 2, and the structure is Fv (a molecule that is non-covalently bound between VH and VL). Forming bivale
  • nt scFv type VH and VL ⁇ VH and VL form Fv, respectively, single chain diabody type
  • Mobile phase A 20 mM sodium phosphate, pH 7.5
  • Mobile phase B 20 mM sodium phosphate, 500 mM NaCl, pH 7.5
  • Peptide mapping was performed for peakl and peak2. After reductive denaturation and carboxymethylation, it was decomposed into peptide fragments using trypsin, and a peptide map was obtained by reverse phase chromatography (YMC-Pack-ODS). When the peptide maps of peakl and peak2 were compared, the mapping patterns of peakl and peak2 were the same as shown in FIG. 14, indicating that the amino acid primary structure was the same.
  • hVB22B u2- wz4 sc (Fv) 2 has a sugar chain and peakl and peak2 are measured by TOF-MASS measurement Since the molecular weight is the same, and peakl and peak2 have the same mapping pattern, it was revealed that peakl and peak2 are conformational isomers having different steric structures.
  • hVB22B u2- wz4 sc (Fv) 2 has the sequence VH -linker- VL -linker- VH -linker- VL
  • VH and VL and VH and VL form Fv by combining Fv (molecules that are non-covalently bound between VH and VL), respectively.
  • Fv type, VH and VL, VH and VL each form Fv, single chain diabody type
  • peakl and peak2 were considered to be either bivalent scFv type or single chain diabody type structures, respectively.
  • Gin and VL at position 39 of VH which is an amino acid forming the VH / VL interface of u2-wz4 (position 39 in the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 13; see SEQ ID NO: 289 of WO2005 / 56604)
  • the Gin at position 38 was modified as follows.
  • Gin (gene codon CAG) at position 39 in VH1 is Glu (gene codon GAG), Gin at position 38 in VL2 (gene codon CAG) is Glu (gene codon GAG), and Gin at position 39 in VH3 (gene codon GAG)
  • vl the nucleotide sequence is shown in SEQ ID NO: 15, and the amino acid sequence encoded by the nucleotide sequence is shown in SEQ ID NO: 16).
  • Gin (gene codon CAG) at position 39 in VH 1 is Glu (gene codon GAG), Gln (gene codon CAG) at position 38 in VL2 is Lys (gene codon AAG), and Gin at position 39 in VH3 (gene codon AAG).
  • Gene codon CA G is Lys (gene codon AAG), and Gin (gene codon CAG) at position 38 of VL4 is Glu (gene HVB22B u2-wz4 (v3) sc (Fv) 2 modified to codon GAG (hereinafter v3, the nucleotide sequence is shown in SEQ ID NO: 17 and the amino acid sequence encoded by the nucleotide sequence is shown in SEQ ID NO: 18) Was made.
  • v3 the nucleotide sequence is shown in SEQ ID NO: 17 and the amino acid sequence encoded by the nucleotide sequence is shown in SEQ ID NO: 18
  • a point mutation was introduced using QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit (manufactured by STRATA GENE) according to the manufacturer's protocol.
  • the DNA fragment was cloned into the expression vector pCXND3 to construct an expression vector, and the gene was introduced into CHO-DG44 cells to produce a stable expression cell line.
  • a vl-producing CHO cell line and a v3-producing CHO cell line were established by the method shown in Example 11.
  • the modified molecules vl and v3 were purified by the method shown in Example 11 using a MG10-GST fusion protein-immobilized column. From the results of gel filtration chromatography shown in Fig. 18, in the modified vl and v3, aggregates of dimer or higher decreased in the culture supernatant, and the monomer ratio was compared with 59% of u2-wz4 before modification. It was revealed that vl increased to 89% and v3 increased to 77%. It is inferred that the modified vl and v3 inhibited the unfavorable association by charge repulsion by modifying the amino acid at the VH / VL interface and promoted the favorable association. Based on the above, we succeeded in expressing monomer molecules efficiently by controlling the association.
  • the structural heterogeneity ratios of the obtained VH / VL interface variants vl and v3 and the unmodified u2-wz4 were analyzed by cation exchange chromatography and isoelectric focusing. Moreover, the structure identification by the protease limited decomposition method was implemented.
  • Isoelectric focusing was performed as follows. PhastGel Dry IEF gel (Amersham Biosciences) was swollen with the following gel swelling solution for 30 minutes or more. The sample was added to the previously swollen gel and electrophoresed by PhastSystem under the following electrophoresis conditions. After electrophoresis, the sample was immersed in a 20% TCA solution for 30 minutes, then washed with Milli-Q water for 5 minutes x 3 times or more, and stained with Komashii or silver depending on the protein concentration of the sample. In Kumasi staining, staining was performed using 0.02% CBB containing 0.1% CuS 0 (w / v) as the staining solution, and 30% methanol containing 10% acetic acid.
  • Step 1 2000 V 2.5 mA 3.5 W 15 ° C 75 Vh
  • Step 2 200 V 2.5 mA 3.5 W 15 ° C 15 Vh
  • Step 3 2000 V 2.5 mA 3.5 W 15 ° C 410 Vh
  • subtilisin A u2-wz4 purified peakl and u2-wz4 purified peak2 were reacted under the following conditions, and variant vl and variant v3 were reacted. 20 mM sodium citrate, 150 mM NaCl, pH 7.5
  • reaction solution was analyzed by gel filtration chromatography under the following conditions.
  • the modified v3 has a low molecular weight peak similar to the u2-wz4 purified peakl, and the modified vl is low as the u2-wz4 purified peak2.
  • the absence of a molecular peak indicates that variant vl is expressed as a single chain diabody-type structural isomer and variant v3 is expressed as a bivalent scFv-type structural isomer. It was.
  • the anti-human Mpl antibody VB22B sc (Fv) 2 has been reported in the literature (Blood 2005; 105: 562-566) to exhibit TPO-like agonist activity. Therefore, we evaluated the TPO-like agonist activity of structural isomers isolated using BaF3-human Mp or BaF3-monkey Mpl, which show TPO-dependent growth.
  • Each cell was washed twice with RPMI1640 (Invitrogen) containing 1% Fetal Bovine Serum (Invitrogen), and then suspended in RPMI 1640 containing 10% Fetal Bovine Serum so that the concentration was 4 ⁇ 10 5 cells / mL. It became cloudy and dispensed into a 96-well plate at 60 ⁇ L / well.
  • concentration of rhTPO (R & D) or structural isomer sample was varied, and 40 L was added to each well and cultured at 37 ° C under 5% CO for 24 hours.
  • WST-8 reagent Cell Count Reagent SF, Nacalai Tester
  • Benchmark Plus The absorbance at nm (control 655 nm) was measured. Since the WST-8 reagent exhibits a 450 nm color reaction depending on the number of living cells, TPO-like antigen activity was evaluated using the change in absorbance over 2 hours as an index.
  • Fig. 17 shows the results of evaluating the TPO-like antigen activity in BaF3-human Mpl and BaF3-monkey Mpl using the purified structural isomer of VB22B sc (Fv) 2. Comparing the agonist activities of the structural isomers of peakl and ⁇ eak2, it was found that peak2 is significantly higher in activity. This suggests that the anti-Mpl antibody sc (Fv) 2 must have a single chain diabody structure in order to exhibit TPO-like antigen activity.
  • Tm value intermediate denaturation temperature
  • Solution conditions 20 mM sodium citrate, 300 mM NaCl, pH 7.0
  • Solution conditions 20 mM sodium citrate, pH 6.0
  • VH / VL interface modification applied to vl and v3, it can be expressed in the state where only one of the two structural isomers exists. I found it.
  • VH / VL interface control to obtain single-chain antibodies of the desired structure.
  • the method of controlling the structure of bispecific diabody using knobs-into-hole technology (Protein Sci. 1997 Apr; 6 (4): 78-8, Remodeling domain interfaces to enhance heterodimer forma tion., Zhu Z, Presta LG, Zapata G, Carter P.) is known.
  • the formation rate of the target heterodimer structure increased from 72% to 92% by modifying a total of 4 amino acids per VH / VL interface.
  • the present invention succeeded in obtaining the target structure at a ratio of 100% without altering the thermal stability and the stability of the structural isomer by modifying the amino acid at four positions.
  • anti-Factor Xa antibody A69-VH, anti-Factor X antibody B26_VH, and hybrid L chain (BBA), which have the highest effect on shortening the blood clotting time, are combined as follows. Humanization was performed.
  • A69- heavy chain variable region KABATID- 000064 (Kabat Database)
  • B26- H chain variable region EMBL Accession No. AB063872 (IMGT Database)
  • Humanized antibodies were prepared by grafting the complementary antigen-determining regions (hereinafter referred to as CDRs) of each mouse antibody to the FRs of human antibodies (l)-(3).
  • the homology search Web site http: ⁇ www.ncbi.nlm. nih. gov / BLAST / was used to search for the secretory signal sequence of a human antibody highly homologous to the human antibodies of (1)-(3). The following secretory signal sequences obtained from the search were used.
  • A69- heavy chain variable region GenBank Accession No. AF062257
  • 3 synthetic oligo DNAs of about 50 bases were prepared alternately so that the terminal side annealed about 20 bases. Furthermore, it anneals to the 5 ′ end of the antibody variable region gene, anneals to the 3 ′ end of the primer having the Xho I cleavage sequence and the antibody variable region gene, has the Sfil cleavage sequence, and the 5 ′ end sequence of the intron sequence.
  • a coding primer was made.
  • Synthetic oligo DNA prepared in 2.5 ⁇ was mixed at 1 ⁇ L each, and 1 x TaKaRa Ex Taq Buffer, 0.4 mM dNTPs, 0.5 units TaKaRa Ex Taq (all Takara Shuzo) were prepared, and reaction solution 48 ⁇ L It prepared so that it might become. After incubating at 94 ° C for 5 minutes, reactions of 94 ° C for 2 minutes, 55 ° C for 2 minutes, and 72 ° C for 2 minutes were performed for 2 cycles to assemble and extend each synthetic oligo DNA.
  • the fragment was cloned using pGEM-T Easy Vector Systems (Promega) according to the method described in the attached instructions.
  • the base sequence of each DNA fragment was determined using the BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems) with the DNA sequencer ABI PRISM 3 730xL DNA Sequencer (Applied Biosystems) according to the method described in the attached instructions.
  • the H chain variable region fragment insertion plasmid confirmed to be the correct humanized antibody variable region gene sequence was digested with Xhol and Sfil, and the L chain variable region fragment insertion plasmid was digested with EcoRI. Thereafter, the reaction solution was subjected to 1% agarose gel electrophoresis. A DNA fragment of the desired size (about 400 bp) was purified using the QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN) by the method described in the attached instruction, and eluted with sterilized water 301. Thereafter, an expression vector for animal cells was prepared as follows.
  • IgG4 which is a heterogeneous combination of H chains
  • an amino acid substitution to the CH3 part of IgG4 was used with reference to the knobs-into-hole technology of IgG1 (Non-patent Document 3).
  • an amino acid substitution (-ppcpScp- ⁇ -ppcpPcp-) was also introduced into the hinge to promote dimer formation of the H chain.
  • Human embryonic kidney cancer cell-derived HEK293H strain (Invitrogen) is suspended in DMEM medium (Invitrogen) containing 10% FCS (Invitrogen), and a dish for adherent cells with a cell density of 5-6 X 10 5 cells / mL (diameter 10 cm) , CORNING) 10 mL to each dish
  • O-S-SFM-II (Invitrogen) medium was added. 14 Mix 1 ml / mL Polyethylenimine (Polysciences Inc.) 20.7 ⁇ L of the plasmid DNA mixture prepared in 2 with 690 L of CHO-S-SF ⁇ medium and let stand at room temperature for 10 minutes. Cells were loaded into each dish and incubated in a CO incubator (5% CO at 37 ° C) for 4-5 hours. afterwards
  • Example 44 antibody purification was carried out by the method shown in Example 44 and antibody concentration was quantified by the method shown in Example 45 or the method shown below.
  • ProteinA was immobilized on Sensor Chip CM5 (BIACORE) using BIAcore3000 (BIACORE). Specifically, according to the manufacturer's protocol, react the Protein A solution diluted to 50 ⁇ g / mL with 10 mM sodium acetate aqueous solution (pH 4.0, BIACORE) at 5 ⁇ L / min for 30 minutes on the activated sensor chip. Thereafter, a blocking operation was performed to prepare a ProteinA-fixed protein sensor chip. Using this sensor chip, the concentration of culture supernatant and purified product was measured using BIAcore Q.
  • HBS-EP Buffer (BIACORE) was used for sensor chip fixation and concentration measurement.
  • HgG4 humanized anti-TF antibody, refer to WO 99/51743
  • HBS-EP Buffer diluted 6-fold with HBS-EP Buffer in a 2-fold series from 2000 ng / mL was used as a standard for concentration measurement.
  • the isoelectric point of the humanized A69 heavy chain variable region is lowered and the isoelectric point of the humanized B26 heavy chain variable region is decreased.
  • Amino acid modifications that increase were performed. Specifically, mutations were introduced into the humanized antibody variable region using the QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene) according to the method described in the attached instructions. After digesting the H chain variable region fragment insertion plasmid that was confirmed to be the target humanized antibody variable region gene sequence with Xhol and Sfil and the L chain variable region fragment insertion plasmid with EcoRI, the reaction solution was 1% It was subjected to agarose gel electrophoresis.
  • a DNA fragment of the desired size (about 400 bp) was purified by QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN) according to the method described in the attached instruction, and eluted with 30 ⁇ 1 of sterilized water. Thereafter, an expression vector for animal cells was prepared by the method shown in Example 14-2. did. Humanized bispecific antibodies were prepared by the method shown in Example 14-3, and blood coagulation activity was evaluated by the method shown in Example 5.
  • Humanized bispecific antibody humanized A69 (hA6) with activity equivalent to that of the chimeric bispecific antibody (A69 / B26 / BBA) by repeated amino acid modification of FR sequence and evaluation of blood coagulation ability 9-PFL) / humanized B26 (hB26-PF) / humanized BBA (hAL-AQ) was obtained (FIG. 26).
  • Each antibody variable region sequence is shown in the following SEQ ID NOs.
  • H chain constant region genes of HI HgGl and HI HgG4 were designed in a saddle type so that the nucleotide sequence encoding the 2 amino acids (Ala-Ser) on the N-terminal side of the H chain constant region would be the Nhel recognition sequence (GCTAGC) 5.
  • PCR amplification of each heavy chain constant region using primers designed to have a terminal primer and an annealing at the end, and a No tl recognition site, and pBluescriptKS + vector (Toyobo) Nhel, Notl (both Takara Shuzo) PBCH (including the IgGl constant region gene) and pBCH4 (including the IgG4 constant region gene) ligated with the vector digested in (1) were prepared.
  • a primer complementary to the 5 'terminal nucleotide sequence of the H chain variable region of the humanized A69 antibody and humanized B26 antibody, and having a Kozak sequence (CCACC) and EcoRI recognition sequence, and a 3' terminal nucleotide sequence having an Nhe I recognition sequence PCR was performed using primers, and the resulting PCR product was inserted into pBCH or pBCH4 digested with EcoRI and Nhel (both Takara Shuzo) to link the variable and constant regions.
  • Example 14-3 For the preparation of the humanized bispecific antibody, the method shown in Example 14-3 was followed.
  • the modified amino acid sites are summarized in Table 1.
  • EU numbering Kabat EA et al. 1991. Sequences of Proteins of Immunological Interest. NIH was adopted.
  • the alphabet before the modification site number is a single letter code of the amino acid before modification
  • the alphabet after the modification site number is a single letter code of the amino acid after modification.
  • KiH indicates a modified product using the Knobs-into-holes technique described in Non-Patent Document 3.
  • BiAb cation exchange chromatography
  • Wild type, KiH, s2, s3, slC, s2C, s3C, w3C, w3C2 BiAb was purified by fractionating the BiAb peak.
  • the BiAb fraction was concentrated with Amicon Ultra, MWCO 10000 (Millipore), dialyzed against 20 mM sodium acetate, 150 mM NaCl, pH 6.0 overnight in a cold place, then collected, and the BiAb concentration was 0.1 mg / mL
  • the vials were dispensed into two vials each at 60 ° C-1 week, and the stability test was conducted at 60 ° C-1 week.
  • Fig. 28 shows the IEX chromatogram of wild type, si, s2, s3, and wl of IgG4. Wild type, KiH, si, s2, s3, wl, w2, w3, slC, s2C, s3C, The formation ratios of A-Homo, BiAb, and B-Homo of w3C and w3C2 are shown in FIG.
  • Fig. 30 shows the residual monomer ratio after 60 ° C_1 weeks.
  • the modified CH3 interface found in the present example greatly improved the target BiAb formation efficiency as compared with the wild type. Since CH3 is in the stationary region, when the natural amino acid strength is modified, the modified site should have as little force as possible from the viewpoint of antigenicity. KiH has been modified in 6 locations in total, 2 locations for introducing disulfide bonds, in addition to 4 locations for both H chains to introduce knobs and holes. Therefore, high BiAb formation efficiency is obtained as shown in FIG. However, from the results of the stability test shown in Fig. 30, the thermal stability is greatly reduced in comparison with the wild type despite the introduction of disulfide bonds. In order to develop an antibody as an ethical drug, a stable formulation is required, and therefore high thermal stability is desirable.
  • the modified CH3 interface found in this example succeeded in greatly improving the target BiAb formation efficiency compared to the wild type in terms of V-shift.
  • s2, s3, wl, w2, w3, and slC have a total of 2 locations less than KiH (6 locations modified).
  • KiH 6 locations modified
  • s2, s3, w3, w3C, and w3C2 have a high BiAb formation efficiency of 90% or more and higher thermal stability than KiH.
  • S3, s2c, s3C, w3C, and w3C2 have higher thermal stability than the wild type and are useful for developing stable pharmaceutical preparations. It is.
  • the purpose is to introduce molecular repulsion due to charge by modifying the amino acids of the 356th, 357th, 370th, 399th, 409th, and 439th H chains at the CH3 interface. It has been found that the BiAb formation efficiency can be greatly improved. In addition, the introduction of these single, combination, and disulfide linkages can significantly improve the BiAb formation efficiency with fewer modifications than KiH, and have higher stability than KiH and higher heat than wild type. We found that the stability of BiAb formation can be greatly improved by stability.
  • Example 16 Using the IgG4 type bispecific antibody (si, s2, s3, wl, w2, w3) purified in Example 16 and having a modified CH3 interface, the coagulation activity was evaluated according to the method shown in Example 5. As shown in Fig. 31, changing the amino acid at the constant region CH3 interface does not change the coagulation activity, indicating that the amino acid modification at the CH3 interface does not affect the structure of the variable region involved in the reaction with the antigen. It was.
  • the IgGl wild type, KiH, wl, w2, and w3 were analyzed by cation exchange chromatography (IEX) to evaluate the BiAb formation efficiency.
  • the cation exchange chromatography analysis conditions were as follows: A-Homo, which is a homodimer of humanized A69 antibody, BiAb, which is a heterodimer of humanized A69 antibody and humanized B26 antibody, and Homodimer of humanized B26 antibody The peak area ratio of B-Homo was calculated.
  • Fig. 32 shows the formation ratio of A-Homo, BiAb, and B-Homo in IgGl type wild type, KiH, wl, w2, and w3. Similar to the IgG4 type, the target BiAb formation efficiency was greatly improved compared to the wild type. Similar to IgG4 type, the modification of 4 sites less than KiH has achieved a high BiAb formation efficiency of over 90%, and the antigenic risk is considered to be smaller.
  • the method for modifying amino acids at the 356th, 357th, 370th, 399th, 409th, and 439th H chains at the CH3 interface is applicable not only to IgG4 but also to IgGl. It has been found that it can be applied to IgG antibodies in general.

Abstract

　ポリペプチド間の会合の際の界面を形成するアミノ酸残基を、同種の電荷を有するアミノ酸へ改変することによって、該会合を抑制することが可能であることを見出した。本発明によって、効率よくヘテロ分子を形成させることが可能となった。 　本発明は、例えば、二重特異性抗体の作製の際に好適に利用することができる。

Description

明 細 書
会合制御によるポリペプチド製造方法
技術分野
[0001] 本発明は、各分子内または各分子間の会合の制御によるポリペプチドの製造方法
、各分子内または各分子間の会合が制御されたポリペプチド、および該ポリペプチド を有効成分として含有する医薬組成物等に関する。
背景技術
[0002] 抗体は血中での安定性が高ぐ副作用も少ないことから医薬品として注目されてい る。その中には二種類の抗原を同時に認識できる二重特異性抗体がある。現在、臨 床試験が行なわれている MDX-210は、 Fc γ RIを発現している monocyte等を HER-2/ neuを発現して ヽる癌細胞に retargetingする IgG型二重特異性抗体である（非特許文 献 1参照)。抗体の製造は、一般的に遺伝子組み換え技術を用いることが多い。具体 的には、抗体の蛋白質をコードする DNAをノ、イブリドーマ、抗体を産生する感作リン パ球等の抗体産生細胞、または抗体遺伝子を提示して 、るファージライブラリーから クロー-ングし、適当なベクターに組み込み、これを宿主細胞に導入し産生させる技 術である。遺伝子組み換え技術を用いた IgG型二重特異性抗体の製造は、目的の二 種類の IgGを構成する H鎖及び L鎖の遺伝子、合計 4種の遺伝子を細胞に導入し、共 発現により分泌させる。このような発現において、野生型の H鎖及び L鎖の構成遺伝 子を発現させた場合には、 2種類の H鎖の共有結合や H鎖と L鎖の非共有結合はラン ダムに起こるため、目的の二重特異性抗体の比率は極めて少なくなる。具体的には 、目的の二重特異性抗体は 10種類中 1種類のみであり、生産効率は低下してしまう。 目的抗体の生産効率の低下は、目的抗体の精製の障害になるば力りでなぐロット間 差などの不均一性を増大させ、生産コストの肥大を招くことになる。
[0003] 二重特異性抗体の効率的生産に関する知見としては、 IgG H鎖の CH3領域にァミノ 酸置換を施すことにより、 H鎖について異種な組合せの IgGを優先的に分泌させるこ とが報告されている (特許文献 1および非特許文献 2および 3参照)。具体的には、一 方の H鎖の CH3領域に存在するアミノ酸側鎖をより大きい側鎖 (knob;突起）に置換し 、もう一方の H鎖の CH3領域に存在するアミノ酸側鎖をより小さい側鎖 (hole;空隙）に 置換することにより突起が空隙内に配置されえるようにして異種 H鎖形成の促進およ び同種 H鎖形成の阻害を引き起こす方法である。 H鎖可変領域 (以下、 VH)と L鎖可 変領域 (以下、 VL)が会合する界面に同様の" knob;突起"ど' hole;空隙〃を利用した知 見も報告されている（非特許文献 4参照)。 Zheらの報告によると、 VHと VLの界面に存 在するアミノ酸について 2種類（両鎖で 4種類)を置換することにより 1.28倍効率的に ヘテロ分子形成が促進している（野生型; 72%、改変体; 92%)。また、 1種類のアミノ酸 置換 (両鎖で 2種類)では、野生型と同程度の効率となっている。しかし、 VHと VLに kn ob (突起）と hole (空隙)を設ける方法は、ヘテロ分子の形成促進が十分とは言えな 、
[0004] 特許文献 1 :国際公開第 96/27011号
非特許文献 l : Segal DMら著、 Current Opinion in Immunology, 1999年、 Vol.11, P.5 58-562
非特許文献 2 : Ridgway JBら著、 Protein Engineering, 1996年、 Vol.9, p.617-621 非特許文献 3 : Merchant AMら著、 Nature Biotechnology, 1998年、 Vol.16, p.677- 68
1
非特許文献 4 : Zhe Zら著、 Protein Science, 1997年、 Vol.6, p.781-788
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0005] 本発明はこのような状況に鑑みて為されたものであり、その目的は、ポリペプチドの 会合を制御する方法、および、会合が制御されたポリペプチド、並びに、該ポリぺプ チドの製造方法を提供することにある。また本発明は、その一態様として、 VHと VLの 界面における会合を制御して二重特異性抗体を効率よく製造する方法を提供するこ とを目的とする。また、 sc(Fv)2の一方の構造異性体を効率よく製造する方法を提供 することを目的とする。
課題を解決するための手段
[0006] 本発明者らは会合の制御に供するポリペプチドとして抗体の VHおよび VLを選択し 、これら VHと VLの会合を制御可能な方法について、鋭意研究を行った。 [0007] その結果、 VHと VLの界面に存在するアミノ酸を電荷を有するアミノ酸へ置換するこ とにより、 VHと VLの会合を抑制することができ、上述の knobと holeを用いる方法よりも 、効率よくへテロ分子が形成されることを見出した。
[0008] 驚くべきことに、本発明の方法によれば、 VHと VLの界面に存在するそれぞれ 1種 類のアミノ酸 (VHと VLで計 2アミノ酸)を置換するだけで、効率よくへテロ分子を形成 させることが可能である。また、抗原性の観点からはアミノ酸の置換は少ない方がよい 。本発明の一態様によれば、 VHと VLの界面に存在する 1つのアミノ酸を置換するだ けで効率よくへテロ分子を形成されることが可能である。
[0009] 即ち、本発明者らによって見出された知見によって、 VHと VLとの会合を制御するこ とが可能である。また、本発明は VHと VLとの会合の制御に適用可能なだけではなく 、任意のポリペプチド間の会合の制御に応用することが可能である。
[0010] さらに本発明者らは、本発明の会合制御方法によって取得された二重特異性抗体 力 実際に機能を保持していることを確認した。
[0011] 上述の如く本発明者らは、任意のポリペプチド間の会合を制御し得る方法の開発 に成功し、本発明を完成させた。
[0012] 本発明は、ポリペプチドの会合を制御する方法、および、会合が制御されたポリべ プチド、並びに、該ポリペプチドの製造方法に関し、より具体的には、
〔1〕 ポリペプチドの会合が制御されるようにポリペプチド内の界面を形成するァミノ 酸残基に変異を有するポリペプチドの製造方法であって、 (a)ポリペプチド内の界面 を形成するアミノ酸残基をコードする核酸を、ポリペプチド内の会合が阻害されるよう に元の核酸から改変し、（b)宿主細胞を該核酸が発現するように培養し、（c)宿主細 胞培養物から該ポリペプチドを回収することを含むポリペプチド変異体の製造方法、 〔2〕 異種多量体の会合が制御されるようにポリペプチド間の界面を形成するァミノ 酸残基に変異を有する異種多量体の製造方法であって、 (a)ポリペプチド間の界面 を形成するアミノ酸残基をコードする核酸を、ポリペプチド間の会合が阻害されるよう に元の核酸から改変し、（b)宿主細胞を該核酸が発現するように培養し、（c)宿主細 胞培養物から該異種多量体を回収することを含む異種多量体の製造方法、 〔3〕 2種以上の構造異性体を形成し得るポリペプチドにおいて、 1種以上の構造異 性体を形成するポリペプチドの会合が阻害されるように、ポリペプチド内の界面を形 成するアミノ酸残基をコードする核酸を元の核酸から改変する〔1〕に記載の方法、 〔4〕 2種以上の多量体を形成し得る異種多量体において、 1種以上の多量体を形 成するポリペプチド間の会合が阻害されるように、ポリペプチド間の界面を形成する アミノ酸残基をコードする核酸を元の核酸から改変する〔2〕に記載の方法、 〔5〕 工程 (a)の改変が、界面を形成する 2残基以上のアミノ酸残基が同種の電荷と なるように該界面にアミノ酸残基の変異が導入されるように、元の核酸を改変すること である、〔1〕または〔2〕に記載の方法、
〔6〕 導入されるアミノ酸残基がグルタミン酸 (E)である〔5〕に記載の方法、
〔7〕 導入されるアミノ酸残基がァスパラギン酸 (D)である〔5〕に記載の方法、
〔8〕 導入されるアミノ酸残基がリジン (K)である〔5〕に記載の方法、
〔9〕 導入されるアミノ酸残基がアルギニン (R)である〔5〕に記載の方法、
〔10〕 導入されるアミノ酸残基がヒスチジン (H)である〔5〕に記載の方法。
〔11〕 工程 (a)の改変が、界面に存在する疎水性コアを形成するアミノ酸残基が電 荷を有するアミノ酸残基となるように該界面にアミノ酸残基の変異が導入されるように
、元の核酸を改変することである、〔1〕または〔2〕に記載の方法、
〔12〕 導入されるアミノ酸残基がグルタミン酸 (E)である〔11〕に記載の方法、
〔13〕 導入されるアミノ酸残基がァスパラギン酸 (D)である〔11〕に記載の方法、
〔14〕 導入されるアミノ酸残基がリジン (K)である〔11〕に記載の方法、
[15] 導入されるアミノ酸残基がアルギニン (R)である〔11〕に記載の方法、
〔16〕 導入されるアミノ酸残基がヒスチジン (H)である〔11〕に記載の方法、
〔17〕 ポリペプチドの界面が、抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域により形成 される〔1〕または〔2〕に記載の方法、
〔18〕 ポリペプチドの界面が、 2種以上の重鎖可変領域により形成される〔1〕または〔 2〕に記載の方法、
〔19〕 ポリペプチドの界面が、抗体の重鎖定常領域および軽鎖定常領域により形成 される〔1〕または〔2〕に記載の方法、
〔20〕 ポリペプチドの界面が、 2種以上の重鎖定常領域により形成される〔1〕または〔 2〕に記載の方法、
〔21〕 ポリペプチドが、 2つ以上の重鎖可変領域と 2つ以上の軽鎖可変領域をリンカ 一で結合した一本鎖ポリペプチドである〔1〕に記載の方法、
[22] 異種多量体が、 2種以上の重鎖可変領域と 2種以上の軽鎖可変領域を含む 多重特異性抗体である〔2〕に記載の方法、
〔23〕 異種多量体が、二重特異性抗体である〔22〕に記載の方法、
〔24〕 〔1〕または〔2〕に記載の方法により製造されるポリペプチド変異体または異種 多量体、
〔25〕 ポリペプチド変異体であって、元のポリペプチド内の会合が阻害されるように、 該ポリペプチド内の界面を形成するアミノ酸残基の改変を有するポリペプチド変異体
〔26〕 異種多量体であって、元のポリペプチド間の会合が阻害されるように、該ポリ ペプチド間の界面を形成するアミノ酸残基の改変を有する異種多量体、
[27] 元のポリペプチドが 2種以上の構造異性体を形成し得る、 [25]に記載のポリ ペプチド変異体、
〔28〕 元のポリペプチドが 2種以上の多量体を形成し得る、〔26〕に記載の異種多量 体、
〔29〕 前記ポリペプチドの界面を形成するアミノ酸残基の改変力 界面を形成する 2 残基以上のアミノ酸残基が同種の電荷となるように該界面にアミノ酸残基の変異を導 入することである、〔25〕に記載のポリペプチド変異体または〔26〕に記載の異種多量 体、
〔30〕 導入されるアミノ酸残基がグルタミン酸 (E)である〔29〕に記載のポリペプチド 変異体または異種多量体、
〔31〕 導入されるアミノ酸残基がァスパラギン酸 (D)である〔29〕に記載のポリべプチ ド変異体または異種多量体、
〔32〕 導入されるアミノ酸残基がリジン (K)である〔29〕に記載のポリペプチド変異体 または異種多量体、
〔33〕 導入されるアミノ酸残基がアルギニン (R)である〔29〕に記載のポリペプチド変 異体または異種多量体、
〔34〕 導入されるアミノ酸残基がヒスチジン (H)である〔29〕に記載のポリペプチド変 異体または異種多量体、
〔35〕 前記ポリペプチドの界面を形成するアミノ酸残基の改変力 界面に存在する 疎水性コアを形成するアミノ酸残基が電荷を有するアミノ酸残基となるように該界面 にアミノ酸残基の変異を導入することである〔25〕に記載のポリペプチド変異体または 〔26〕に記載の異種多量体、
〔36〕 導入されるアミノ酸残基がグルタミン酸 (E)である〔35〕に記載のポリペプチド 変異体または異種多量体、
〔37〕 導入されるアミノ酸残基がァスパラギン酸 (D)である〔35〕に記載のポリべプチ ド変異体または異種多量体、
〔38〕 導入されるアミノ酸残基がリジン (K)である〔35〕に記載のポリペプチド変異体 または異種多量体、
〔39〕 導入されるアミノ酸残基がアルギニン (R)である〔35〕に記載のポリペプチド変 異体または異種多量体、
〔40〕 導入されるアミノ酸残基がヒスチジン (H)である〔35〕に記載のポリペプチド変 異体または異種多量体、
〔41〕 ポリペプチドの界面が、抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域により形成 される [25]に記載のポリペプチド変異体または〔26〕に記載の異種多量体、 〔42〕 ポリペプチドの界面が、 2種以上の重鎖可変領域により形成される [25]に記 載のポリペプチド変異体または〔26〕に記載の異種多量体、
〔43〕 ポリペプチドの界面が、抗体の重鎖定常領域および軽鎖定常領域により形成 される [25]に記載のポリペプチド変異体または〔26〕に記載の異種多量体、 〔44〕 ポリペプチドの界面が、 2種以上の重鎖定常領域により形成される [25]に記 載のポリペプチド変異体または〔26〕に記載の異種多量体、
〔45〕 ポリペプチドが、 2つ以上の重鎖可変領域と 2つ以上の軽鎖可変領域をリンカ 一で結合した一本鎖ポリペプチドである〔25〕に記載のポリペプチド変異体、
〔46〕 異種多量体が、 2種以上の重鎖可変領域と 2種以上の軽鎖可変領域を含む 多重特異性抗体である〔26〕に記載の異種多量体、
〔47〕 異種多量体が、二重特異性抗体である〔46〕に記載の異種多量体、
〔48〕 [25]に記載のポリペプチド変異体または〔26〕に記載の異種多量体、および 医薬的に許容される担体を含む組成物、
〔49〕 [25]に記載のポリペプチド変異体または〔26〕に記載の異種多量体をコード する核酸、
〔50〕 〔49〕に記載の核酸を有する宿主細胞、
〔51〕 [50]に記載の宿主細胞を培養する工程、細胞培養物からポリペプチドを回 収する工程を含む〔25〕に記載のポリペプチド変異体または〔26〕に記載の異種多量 体の製造方法、
〔52〕 ポリペプチドの会合制御方法であって、ポリペプチド内の会合が阻害されるよ うに、元のポリペプチド内の界面を形成するアミノ酸残基を改変することを含むポリべ プチドの会合制御方法、
〔53〕 異種多量体の会合制御方法であって、ポリペプチド間の会合が阻害されるよ うに、元のポリペプチド間の界面を形成するアミノ酸残基を改変することを含む異種 多量体の会合制御方法、
〔54〕 2種以上の構造異性体を形成し得るポリペプチドにおいて、 1種以上の構造 異性体を形成するポリペプチドの会合が阻害されるように、ポリペプチド内の界面を 形成するアミノ酸残基を改変する〔52〕に記載の方法、
〔55〕 2種以上の多量体を形成し得る異種多量体において、 1種以上の多量体を形 成するポリペプチド間の会合が阻害されるように、ポリペプチド間の界面を形成する アミノ酸残基を改変する〔53〕に記載の方法、
[56] 前記ポリペプチドの界面を形成するアミノ酸残基の改変力 界面を形成する 2 残基以上のアミノ酸残基が同種の電荷となるように該界面にアミノ酸残基の変異を導 入することである、〔52〕または〔53〕に記載の方法、
[57] 導入されるアミノ酸残基がグルタミン酸 (E)である〔56〕に記載の方法、
[58] 導入されるアミノ酸残基がァスパラギン酸 (D)である〔56〕に記載の方法、 [59] 導入されるアミノ酸残基がリジン (K)である〔56〕に記載の方法、 〔60〕 導入されるアミノ酸残基がアルギニン (R)である〔56〕に記載の方法、
〔61〕 導入されるアミノ酸残基がヒスチジン (H)である〔56〕に記載の方法、
〔62〕 前記ポリペプチドの界面を形成するアミノ酸残基の改変力 界面に存在する 疎水性コアを形成するアミノ酸残基が電荷を有するアミノ酸残基となるように該界面 にアミノ酸残基の変異を導入することである、〔52〕または〔53〕に記載の方法、
〔63〕 導入されるアミノ酸残基がグルタミン酸 (E)である〔62〕に記載の方法、
〔64〕 導入されるアミノ酸残基がァスパラギン酸 (D)である〔62〕に記載の方法、
〔65〕 導入されるアミノ酸残基がリジン (K)である〔62〕に記載の方法、
〔66〕 導入されるアミノ酸残基がアルギニン (R)である〔62〕に記載の方法、
〔67〕 導入されるアミノ酸残基がヒスチジン (H)である〔62〕に記載の方法、
〔68〕 ポリペプチドの界面が、抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域により形成 される〔52〕または〔53〕に記載の方法、
〔69〕 ポリペプチドの界面が、 2種以上の重鎖可変領域により形成される [52]また は〔53〕に記載の方法、
〔70〕 ポリペプチドの界面が、抗体の重鎖定常領域および軽鎖定常領域により形成 される〔52〕または〔53〕に記載の方法、
〔71〕 ポリペプチドの界面が、 2種以上の重鎖定常領域により形成される [52]また は〔53〕に記載の方法、
[72] ポリペプチドが、 2つ以上の重鎖可変領域と 2つ以上の軽鎖可変領域をリンカ 一で結合した一本鎖ポリペプチドである〔52〕に記載の方法、
〔73〕 異種多量体が、 2種以上の重鎖可変領域と 2種以上の軽鎖可変領域を含む 多重特異性抗体である〔53〕に記載の方法、
〔74〕 異種多量体が、二重特異性抗体である〔73〕に記載の方法、
〔75〕 重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む抗体であって、以下の（1)および（
2)のアミノ酸残基が同種の電荷を有するアミノ酸残基である抗体、
(1)重鎖可変領域に含まれるアミノ酸残基であって、配列番号: 6に記載のアミノ酸 配列における 39位 (グルタミン）に相当するアミノ酸残基
(2)軽鎖可変領域に含まれるアミノ酸残基であって、配列番号： 8に記載のアミノ酸 配列における 44位 (グルタミン）に相当するアミノ酸残基
〔76〕 重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む抗体であって、以下の（1)および（ 2)のアミノ酸残基が同種の電荷を有するアミノ酸残基である抗体、
(1)重鎖可変領域に含まれるアミノ酸残基であって、配列番号: 6に記載のアミノ酸 配列における 45位 (ロイシン）に相当するアミノ酸残基
(2)軽鎖可変領域に含まれるアミノ酸残基であって、配列番号： 8に記載のアミノ酸 配列における 50位 (プロリン）に相当するアミノ酸残基
[77] 重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む抗体であって、以下の（1)または（ 2)の 、ずれか一方が電荷を有するアミノ酸残基である抗体、
(1)重鎖可変領域に含まれるアミノ酸残基であって、配列番号: 6に記載のアミノ酸 配列における 45位 (ロイシン）に相当するアミノ酸残基
(2)軽鎖可変領域に含まれるアミノ酸残基であって、配列番号： 8に記載のアミノ酸 配列における 50位 (プロリン）に相当するアミノ酸残基
〔78〕 前記同種の電荷を有するアミノ酸残基が、以下の（a)または (b) V、ずれかの群 に含まれるアミノ酸残基から選択される [75]または〔76〕に記載の抗体：
(a)グルタミン酸 (E)、ァスパラギン酸 (D)；
(b)リジン（K)、ァノレギニン（R)、ヒスチジン（H)、
〔79〕 前記電荷を有するアミノ酸残基が、グルタミン酸 (E)、ァスパラギン酸 (D)、リジ ン（K)、アルギニン（R)またはヒスチジン (H)である〔77〕に記載の抗体、
〔80〕 ポリペプチドが、 2つ以上の重鎖可変領域と 2つ以上の軽鎖可変領域をリンカ 一で結合した一本鎖ポリペプチドである〔75〕〜〔77〕の 、ずれか 1項に記載の抗体、
〔81〕 ポリペプチドが、 2種以上の重鎖可変領域と 2種以上の軽鎖可変領域を含む 多重特異性抗体である〔75〕〜〔77〕の 、ずれか 1項に記載の抗体、
〔82〕 ポリペプチドが、二重特異性抗体である〔81〕に記載の抗体、
〔83〕 [75]〜〔77〕のいずれか 1項に記載の抗体および医薬的に許容される担体を 含む組成物、
〔84〕 [75]〜〔77〕のいずれか 1項に記載の抗体を構成するポリペプチドをコードす る核酸、 〔85〕 〔84〕に記載の核酸を有する宿主細胞、
〔86〕 [85]に記載の宿主細胞を培養する工程、細胞培養物からポリペプチドを回 収する工程を含む〔75〕〜〔77〕の 、ずれか 1項に記載の抗体の製造方法、 〔87〕 2種以上の重鎖 CH3領域を含む抗体であって、第 1の重鎖 CH3領域におけ る以下の（1)〜（3)に示すアミノ酸残基の組から選択される 1組ないし 3組のアミノ酸 残基が同種の電荷を有する抗体、
(1)重鎖 CH3領域に含まれるアミノ酸残基であって、 EUナンバーリングによる 356 位および 439位のアミノ酸残基
(2)重鎖 CH3領域に含まれるアミノ酸残基であって、 EUナンバーリングによる 357 位および 370位のアミノ酸残基
(3)重鎖 CH3領域に含まれるアミノ酸残基であって、 EUナンバーリングによる 399 位および 409位のアミノ酸残基
〔88〕 第 2の重鎖 CH3領域における前記（1)〜（3)に示すアミノ酸残基の組から選 択されるアミノ酸残基の組であって、前記第 1の重鎖 CH3領域において同種の電荷 を有する前記（1)〜（3)に示すアミノ酸残基の組に対応する 1組ないし 3組のアミノ酸 残基が、前記第 1の重鎖 CH3領域における対応するアミノ酸残基とは反対の電荷を 有する〔87〕に記載の抗体、
〔89〕 前記同種の電荷を有するアミノ酸残基が、以下の（a)または (b) V、ずれかの群 に含まれるアミノ酸残基から選択される〔87〕に記載の抗体：
(a)グルタミン酸 (E)、ァスパラギン酸 (D)；
(b)リジン（K)、ァノレギニン（R)、ヒスチジン（H)、
〔90〕 前記第 1の重鎖 CH3領域と第 2の重鎖 CH3領域がジスルフイド結合により架 橋している〔87〕に記載の抗体、
〔91〕 2種以上の重鎖定常領域を有する抗体である〔87〕に記載の抗体、
〔92〕 2種以上の重鎖可変領域と 2種以上の軽鎖可変領域を含む多重特異性抗体 である〔87〕に記載の抗体、
〔93〕 二重特異性抗体である〔92〕に記載の抗体、
〔94〕 〔87〕に記載の抗体および医薬的に許容される担体を含む組成物、 〔95〕 〔87〕に記載の抗体を構成するポリペプチドをコードする核酸、
〔96〕 [95]に記載の核酸を有する宿主細胞、
〔97〕 [96]に記載の宿主細胞を培養する工程、細胞培養物からポリペプチドを回 収する工程を含む〔87〕に記載の抗体の製造方法、を提供するものである。
図面の簡単な説明
[図 1]ヒト化 SB04の Fv舅域をモデリングした図であり、（A)VHと VL界面のアミノ酸残基 である H39と L38、（B)VHと VL界面のアミノ酸残基である H45と L44を示して!/、る。
[図 2]H39と L38の改変抗体における H鎖と L鎖の会合について評価した結果を示す 写真である。結果、全ての改変抗体において野生型と比較して目的とする抗体の会 合比率の上昇を示した。レーンの説明 M :分子量マーカー 1 :ヒト化 XB12 H鎖（Q) + ヒト化 XB12 L鎖 )、 2 :ヒト化 XB12 H鎖（Q) +ヒト化 SB04 L鎖 (Q)、 3 :野生型：ヒト化 X B12 H鎖（Q) +ヒトイ匕 XB12 L鎖 (Q) +ヒトイ匕 SB04 L鎖 (Q)、 4: D改変型：ヒト化 XB12 H 鎖（D) +ヒト化 XB12 L鎖 (Q) +ヒト化 SB04 L鎖 (D)、 5 : E改変型：ヒト化 XB12 H鎖（E) + ヒト化 XB12 L鎖 (Q) +ヒト化 SB04 L鎖 (E)、 6 : R改変型：ヒト化 XB12 H鎖（R) +ヒト化 X B12 L鎖 (Q) +ヒト化 SB04 L鎖 (R)、 7 : K改変型：ヒト化 XB12 Η鎖（Κ) +ヒト化 XB12 L 鎖 (Q) +ヒト化 SB04 L鎖 (Κ)
[図 3]Η39と L38の改変抗体における凝固活性にっ 、て評価した結果を示して 、る。 結果、 XB12 Η鎖 (Η39)と SB04 L鎖 (L38)を Gluに改変した二重特異性抗体が野生型と 同等以上の凝固活性を示した。
[図 4]H39と L38の改変抗体における FactorlXa結合活性について評価した結果を示 している。結果、全ての改変抗体において野生型と同等の結合活性を示した。
[図 5]H39と L38の改変抗体における FactorX結合活性について評価した結果を示し ている。結果、全ての改変抗体において野生型と同等の結合活性を示した。
[図 6]L44の改変抗体における H鎖と L鎖の会合について評価した結果を示す写真で ある。結果、全ての改変抗体において野生型と比較して目的とする抗体の会合比率 の上昇を示した。レーンの説明 1 :野生型:ヒト化 XB12 H鎖 +ヒト化 XB12 L鎖 (P) +ヒト 化 SB04 L鎖 (P)、 2 : D改変型：ヒト化 XB12 H鎖 +ヒト化 XB12 L鎖 (P) +ヒト化 SB04し鎖( D)、 3 : E改変型：ヒト化 XB12 H鎖 +ヒト化 XB12 L鎖 (P) +ヒト化 SB04 L鎖 (E)、 4: R改変 型：ヒト化 XB12 H鎖 +ヒトイ匕 XB12 L鎖 (P) +ヒト化 SB04 L鎖 (R)、 5 : K改変型：ヒト化 XB 12 Η鎖 +ヒトイ匕 XB12 L鎖 (Ρ) +ヒト化 SB04 L鎖 (Κ)
[図 7]L44の改変抗体における凝固活性にっ 、て評価した結果を示して 、る。結果、 全ての改変抗体において野生型を上回る凝固活性を示した。
[図 8]L44の改変抗体における FactorX結合活性にっ 、て評価した結果を示して 、る 。結果、全ての改変抗体において野生型と同等の結合活性を示した。
[図 9]H39、 L38および L44の改変抗体における H鎖と L鎖の会合につ!、て評価した結 果を示す写真である。結果、全ての改変抗体において野生型と比較して目的とする 抗体の会合比率の上昇を示した。レーンの説明 1 :野生型:ヒト化 XB12 H鎖 (H39: Q)
+ヒト化 XB12 L鎖 (L38: Q) +ヒトイ匕 SB04 L鎖 (L38:Q , L44: P)、 2 : E+D改変型：ヒトイ匕 XB12 H鎖（H39: E) +ヒトイ匕 XB12 L鎖 (L38: Q) +ヒトイ匕 SB04 L鎖 (L38:E , L44: D)、 3 ： E+E改変型：ヒト化 XB12 H鎖（H39: E) +ヒト化 XB12 L鎖 (L38: Q) +ヒト化 SB04し鎖( L38:E , L44: E)、 4: E+R改変型：ヒト化 XB12 H鎖（H39: E) +ヒト化 XB12 L鎖 (L38: Q)
+ヒトイ匕 SB04 L鎖 (L38:E , L44: R)、 5 : E+K改変型：ヒト化 XB12 H鎖（H39: E) +ヒトイ匕 XB12 L鎖 (L38: Q) +ヒト化 SB04 L鎖 (L38:E , L44: K)、 Μ :分子量マーカー
[図 10]H39、 L38および L44の改変抗体における凝固活性について評価した結果を示 している。結果、 XB12 Η鎖 (Η39)および SB04 L鎖 (L38, L44)を改変した二重特異性 抗体が野生型と同等以上の凝固活性を示した。
[図 11]H39、 L38および L44の改変抗体における FactorlXa結合活性について評価し た結果を示している。結果、全ての改変抗体において野生型と同等の結合活性を示 した。
[図 12]2種の重鎖可変領域 (VH1と VH2)および 2種の軽鎖可変領域 (VL1と VL2)を含 む sc(Fv)2の構造の一例を模式的に示す図である。（a)の構造の sc(Fv)2は、主に、（b) で示す 2種の型の構造異性体が存在する。
[図 13]u2-wz4の構造異性体である peaklと peak2の陽イオン交換クロマトグラフィーに よる分離の結果を示す。
[図 14]陽イオン交換クロマトグラフィーにより分離した peaklと peak2のペプチドマツピ ングを示す。 [図 15]u2-wz4の構造異性体である peaklと peak2、分離前の u2_wz4の subtilisin処理 後の還元 SDS-PAGEの結果を示す写真である。得られたバンドの構造を右に示した
[図 16]bivalent scFvと single chain antibodyの構造の違いにより生じる subtilisin限定分 解後の分解パターンの違いを示す。 Bivalent scFv構造の場合、点線で囲った低分子 量断片が生じる。
[図 17]u2- wz4の構造異性体である peaklと peak2、分離前の u2-wz4の Subtilisinによる 限定分解後のゲルろ過クロマトグラフィーの結果を示す。矢印により低分子量ピーク の溶出位置を示した。
[図 18]MG10-GST融合蛋白質固定ィ匕カラムで精製した後の u2-wz4、改変体 vl、改変 体 v3のゲルろ過クロマトグラフィーの結果を示す。
[図 19]u2-wz4、改変体 vl、改変体 v3の陽イオン交換クロマトグラフィーの結果を示す
[図 20]u2- wz4、 u2-wz4精製 peakl、 u2- wz4精製 peak2、改変体 vl、改変体 v3の等電 点電気泳動の結果を示す写真である。
[図 21]u2-wz4精製 peakl、 u2-wz4精製 peak2、改変体 vl、改変体 v3のプロテアーゼ 限定分解後のゲルろ過クロマトグラフィー分析の結果を示す。
[図 22]u2- wz4精製 peakl、 u2- wz4精製 peak2、改変体 vl、改変体 v3の TPO様ァゴニ スト活性評価の結果を示す。
[図 23]u2-wz4精製 peakl、 u2-wz4精製 peak2、改変体 vl、改変体 v3の DSC分析の結 果を示す。
[図 24]u2-wz4精製 peakl、 u2-wz4精製 peak2、改変体 vl、改変体 v3の熱加速試験に おけるゲルろ過クロマトグラフィー分析より得られたモノマー残存率を示す。
[図 25]u2-wz4精製 peakl、 u2-wz4精製 peak2、改変体 vl、改変体 v3の熱加速試験に おける陽イオン交換クロマトグラフィー分析より得られた構造異性体含有比率を示す
[図 26]ヒト化二重特異性抗体（ヒト化 A69 (hA69- PFL) /ヒト化 B26 (hB26- PF)/ヒト化 B BA (hAL-AQ) )の凝固活性について評価した結果を示している。結果、キメラ二重特 異性抗体と同等以上の凝固活性を示した。
[図 27]H鎖定常領域を改変して二重特異性抗体の形成効率を向上させるための概 念図である。改変箇所番号については、 EUナンバーリング（Kabat EA et al. 1991. sequences of Proteins of Immunological Interest. NIH) 採用した。
[図 28]CH3界面を改変したヒト化二重特異性抗体 (IgG4型）の IEX分析のクロマトダラ ムを示した。
[図 29]CH3界面を改変したヒト化二重特異性抗体 (IgG4型)の IEX分析により得られた A-Homo, BiAb, B- Homoの形成比率を示した。
[図 30]CH3界面を改変したヒト化二重特異性抗体 (IgG4型)より精製された BiAbの 60 °C-1Wの熱加速試験後のモノマー残存率を示した。
[図 31]CH3界面を改変したヒト化二重特異性抗体 (IgG4型）の凝固活性について評 価した結果を示している。結果、未改変の二重特異性抗体と同等の凝固活性を示し た。
[図 32]CH3界面を改変したヒト化二重特異性抗体（IgGl型）の A- Homo, BiAb, B- Ho moの IEX分析により得られた形成比率を示した。
発明を実施するための最良の形態
[0014] 本発明は、ポリペプチドの会合、またはポリペプチドによって構成される異種多量体 の会合を制御する方法に関する。
[0015] まず本発明は、ポリペプチドの会合制御方法であって、ポリペプチド内の会合が阻 害されるように、元のポリペプチド内の界面を形成するアミノ酸残基を改変することを 含むポリペプチドの会合制御方法を提供する。
[0016] 本発明におけるポリペプチドとは、通常、 10アミノ酸程度以上の長さを有するぺプ チド、およびタンパク質を指す。また、通常、生物由来のポリペプチドであるが、特に 限定されず、例えば、人工的に設計された配列からなるポリペプチドであってもよい。 また、天然ポリペプチド、あるいは合成ポリペプチド、組換えポリペプチド等のいずれ であってもよい。さらに、上記のポリペプチドの断片もまた、本発明のポリペプチドに 含まれる。
[0017] 本発明におけるポリペプチドの会合とは、例えば、 2以上のポリペプチド領域が相 互作用する状態を指すものと換言することができる。
[0018] 本発明にお 、て「会合を制御する」とは、所望の会合状態になるように制御すること を言い、より具体的には、ポリペプチド内において望ましくない会合が形成されないよ うに制御することを言う。
[0019] 本発明における「界面」とは、通常、会合 (相互作用）する際の会合面を指し、界面 を形成するアミノ酸残基とは、通常、その会合に供されるポリペプチド領域に含まれる 1もしくは複数のアミノ酸残基であって、より好ましくは、会合の際に接近し相互作用 に関与するアミノ酸残基を言う。該相互作用には、具体的には、会合の際に接近する アミノ酸残基同士が水素結合、静電的相互作用、塩橋を形成している場合等が含ま れる。
[0020] 本発明における「界面を形成するアミノ酸残基」とは、詳述すれば、界面を構成する ポリペプチド領域において、該ポリペプチド領域に含まれるアミノ酸残基を言う。界面 を構成するポリペプチド領域とは、一例を示せば、抗体、リガンド、レセプター、基質 等において、その分子内、もしくは分子間において選択的な結合を担うポリペプチド 領域を指す。具体的には、抗体においては、重鎖可変領域、軽鎖可変領域等を例 示することができる。
[0021] 本発明の方法におけるアミノ酸残基の「改変」とは、具体的には、元のアミノ酸残基 を他のアミノ酸残基へ置換すること、元のアミノ酸残基を欠失させること、新たなァミノ 酸残基を付加すること等を指すが、好ましくは、元のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基 へ置換することを指す。
[0022] また、本発明における「ポリペプチド」は、好ましくは、 2種以上の構造異性体を形成 し得るポリペプチドである。該構造異性体とは一般的に、アミノ酸配列は同一である 力 立体構造 (三次構造)が異なるタンパク質同士を指す。通常、構造異性体同士で は化学的又は物理的性質のうち少なくとも 1つは異なることが多い。
[0023] 本発明の好ましい態様においては、 2種以上存在し得る構造異性体の中から所望 の構造異性体を優先的 (効率的）に取得するための方法に関する。即ち、一態様とし ては、 2種以上の構造異性体を形成し得るポリペプチドにおいて、 1種以上の構造異 性体を形成するポリペプチド間の会合が阻害されるように、ポリペプチド内の界面を 形成するアミノ酸残基を改変する方法に関する。
[0024] 例えば、ポリペプチド内において、第一〜第四のポリペプチド領域が存在し、これら の任意の 2の領域が会合し得る場合、（1)第一および第二のポリペプチド領域が会合 し、さらに、第三および第四のポリペプチド領域が会合する、 (2)第一および第三のポ リペプチド領域が会合し、さらに、第二および第四のポリペプチド領域が会合する、 (3 )第一および第四のポリペプチド領域が会合し、さらに、第二および第三のポリぺプ チド領域が会合する場合が考えられ、主に 3種の構造異性体が存在し得る。
[0025] 上記の状況において (1)のように会合したポリペプチド (構造異性体)を優先的に取 得したい場合には、例えば、第一のポリペプチド領域が第三および第四のポリぺプ チド領域との会合が阻害されるように、これら第一、三または四のポリペプチド領域に 存在する界面を形成するアミノ酸残基を改変することを挙げることができる。
[0026] また本発明の方法は、異種多量体の会合制御方法であって、ポリペプチド間の会 合が阻害されるように、元のポリペプチド間の界面を形成するアミノ酸残基を改変す ることを含む異種多量体の会合制御方法に関する。
[0027] 本発明にお 、て「異種多量体 (ヘテロマルチマー）」とは、複数種のポリペプチドか ら構成され、該ポリペプチドが互いに会合し得るタンパク質の多量体を言う。より詳細 には、「異種多量体」は、少なくとも第一のポリペプチドおよび第二のポリペプチドを 有し、ここにおいて第二のポリペプチドはアミノ酸配列において第一のポリペプチドと は少なくとも 1個のアミノ酸残基が異なる分子である。また、特に限定されないが、該 異種多量体は、少なくとも 2種の異なるリガンド、抗原、レセプター、または基質等に 対して結合特異性を有することが好ましい。該異種多量体は、第一および第二のポリ ペプチドにより形成される「異種二量体」〖こカ卩えて、さらに別の種のポリペプチドが存 在していてもよい。即ち、本発明の「異種多量体」は、異種二量体に制限されず、例 えば、異種三量体、異種四量体等も含まれる。
[0028] 上記方法の好ましい態様においては、 2種以上の多量体を形成し得る異種多量体 につ 、て、 1種以上の多量体を形成するポリペプチド間の会合が阻害されるように、 ポリペプチド間の界面を形成するアミノ酸残基を改変する方法である。
[0029] 例えば、第一〜第四のポリペプチド力 構成されるタンパク質多量体において、こ れらの任意の 2のポリペプチドが会合し得る場合、（1)第一および第二のポリペプチド が会合し、さらに、第三および第四のポリペプチドが会合した多量体、（2)第一および 第三のポリペプチドが会合し、さらに、第二および第四のポリペプチドが会合した多 量体、または、 (3)第一および第四のポリペプチドが会合し、さらに、第二および第三 のポリペプチドが会合した多量体、が主に存在し得る。
[0030] 上記の状況において (1)のように会合した多量体を優先的に取得したい場合には、 例えば、第一のポリペプチドが第三および第四のポリペプチドと会合が阻害されるよ うに、これら第一、三または四のポリペプチドに含まれるアミノ酸残基を改変することを 挙げることができる。
[0031] 本発明のポリペプチドの会合制御方法の好ま 、態様にぉ 、ては、例えば、ポリべ プチドの界面を形成するアミノ酸残基の改変が、界面を形成する 2残基以上のァミノ 酸残基が同種の電荷となるように該界面にアミノ酸残基の変異を導入することを特徴 とする方法である。
[0032] 上記方法にお!、ては、界面にぉ 、て会合に関与する 2以上のアミノ酸残基が互 ヽ に同種の電荷となるように改変されることにより、その電荷の反発力によって、これら アミノ酸残基同士の会合が阻害されるものと考えられる。
[0033] 従って、上記方法にぉ 、て、改変されるアミノ酸残基は、界面を形成するポリぺプ チド領域間において、会合の際に互いに接近した 2以上のアミノ酸残基であることが 好ましい。
[0034] 会合の際に接近するアミノ酸残基は、例えば、ポリペプチドの立体構造を解析し、 該ポリペプチドの会合の際に界面を形成するポリペプチド領域のアミノ酸配列を調べ ることにより見出すことができる。界面において互いに接近したアミノ酸残基は、本発 明の方法における「改変」の好ま 、ターゲットとなる。
[0035] アミノ酸の中には、電荷を帯びたアミノ酸が知られている。一般的に正の電荷を帯 びたアミノ酸（正電荷アミノ酸）としては、リジン )、アルギニン (R)、ヒスチジン (H)が知 られている。負の電荷を帯びたアミノ酸 (負電荷アミノ酸）としては、ァスパラギン酸 (D) 、グルタミン酸 (E)等が知られている。従って、好ましくは、本発明において同種の電 荷のアミノ酸とは、正の電荷同士のアミノ酸、あるいは負の電荷同士のアミノ酸を言う [0036] 本発明の方法においては、変異する全てのアミノ酸残基が同種の電荷となるように 改変されることが好ましいが、この場合に必ずしも限定されず、例えば、改変によって 導入されるアミノ酸残基が複数の場合、これらアミノ酸残基の中に電荷を持たな 、ァ ミノ酸残基が少数程度含まれて 、てもよ ヽ。
[0037] 本発明の方法において改変に供されるアミノ酸残基の数は、特に制限されないが、 例えば、抗体の可変領域を改変する場合、抗原との結合活性を低下させないために 、また抗原性を上げないために、なるべく少数のアミノ酸残基を改変することが好まし い。本発明の方法は、後述の実施例で示すように、界面において近接する 2つのアミ ノ酸残基の双方もしくは一方を改変することにより、会合を制御することが可能である 。上記「少数」とは、例えば、 1〜10個程度の数、好ましくは、 1〜5程度の数、より好 ましくは 1〜3程度の数、最も好ましくは 1または 2を表す。
[0038] 本発明の好ましい態様においては、改変によって導入される（改変に供される）アミ ノ酸残基が全て上記の正電荷アミノ酸の中から選択されるアミノ酸残基であるか、もし くは、全て上記の負電荷アミノ酸の中から選択されるアミノ酸残基であることが好まし い。
[0039] また、本発明にお ヽて導入されるアミノ酸残基は、好ましくは、グルタミン酸 (E)、ァス パラギン (D)、リジン )、アルギニン (R)、ヒスチジン（H)である。
[0040] なお、元の（改変前の）ポリペプチドにお 1、て、界面を形成するアミノ酸残基 (X)が既 に電荷を有する場合、会合の際に該アミノ酸残基と近接し相対するアミノ酸残基を、 該アミノ酸残基 (X)と同一のアミノ酸残基 (もしくは同種の電荷のアミノ酸残基)となるよ うに改変することも本発明の好ましい態様の一つである。この態様のおいては、界面 を形成するアミノ酸残基の一方を改変すればょ ヽ。
[0041] また、本発明の会合制御方法の好ま 、態様にぉ 、ては、ポリペプチドの界面を形 成するアミノ酸残基の改変が、界面に存在する疎水性コアを形成するアミノ酸残基が 電荷を有するアミノ酸残基となるように、該界面にアミノ酸残基の変異を導入すること を特徴とする方法である。
[0042] 一般的に、「疎水性コア（hydrophobic core)」は、会合したポリペプチドの内側に疎 水性アミノ酸の側鎖が集合して形成する部分を指す。疎水性アミノ酸は、例えばァラ ニン、イソロイシン、ロイシン、メチォニン、フエ二ルァラニン、プロリン、トリプトファン、 ノリンなどが含まれる。また、疎水コアの形成には、疎水性アミノ酸以外のアミノ酸残 基 (例えばチロシン）が関わることもある。この疎水性コアは、親水性アミノ酸の側鎖が 外側に露出する親水性表面とともに、水溶性のポリペプチドの会合を進める駆動力と なる。異なる 2つのドメインの疎水性アミノ酸が分子表面に存在し、水分子に暴露され るとエントロピーが増大し自由エネルギーが増大してしまう。よって、 2つのドメインは 自由エネルギーを減少させ、安定化するために、互いに会合し、界面の疎水性ァミノ 酸は分子内部に埋もれ、疎水コアを形成することになる。
[0043] ポリペプチドの会合が起こる際に、疎水性コアを形成する疎水性アミノ酸から電荷を 持つ極性アミノ酸へ改変することにより、疎水性コアの形成が阻害され、その結果、ポ リペプチドの会合が阻害されるものと考えられる。
[0044] 当業者においては、所望のポリペプチドについてアミノ酸配列を解析することにより 、疎水性コアの存在の有無、および形成部位 (領域)等を知ることが可能である。即ち 本発明は、界面において疎水性コアを形成し得るアミノ酸残基について、電荷を有 するアミノ酸残基へ改変することを特徴とする、会合制御方法である。
[0045] 上記方法における電荷を有するアミノ酸残基としては、好ましくは、グルタミン酸 (E) 、ァスパラギン酸 (D)、リジン )、アルギニン (R)、ヒスチジン（H)を挙げることができる。
[0046] 本発明の会合制御方法は、抗体もしくは抗体断片、および抗体様活性を有するポ リペプチド等の製造にぉ 、て、目的の抗体 (ポリペプチド）を優先的に取得 (製造)す る方法に利用することができる。
[0047] 本発明において、「抗体」という用語は最も広い意味で使用され、所望の生物学的 活性を示す限り、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、抗体変異体 (キメラ抗体 、ヒト化抗体、低分子化抗体 (抗体断片も含む)、多重特異性抗体等)が含まれる。ま た、本発明において「抗体」は、ポリペプチドあるいは異種多量体のいずれであって もよい。好ましい抗体は、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、並びに、及び 抗体断片等の低分子化抗体である。本発明においては、これら抗体の取得 (作成） の際に、好適に本発明の会合制御方法を用いることができる。 [0048] 本発明にお 、て「多重特異性抗体」（本明細書では「多種特異性抗体」と同じ意味 で使用する）とは、異なる多種のェピトープと特異的に結合し得る抗体を言う。つまり 、多重特異性抗体は少なくとも 2種類の異なるェピトープに対して特異性を有する抗 体であり、異なる抗原を認識する抗体のほか、同一の抗原上の異なるェピトープを認 識する抗体も含まれる。（例えば、抗原がヘテロ受容体の場合には、多重特異性抗 体はへテロ受容体を構成する異なるドメインを認識する、あるいは、抗原がモノマー の場合には、多重特異性抗体はモノマー抗原の複数箇所を認識する)。通常、この ような分子は 2個の抗原と結合するものであるが（二重特異性抗体： bispedfic抗体； 本明細書では「二種特異性抗体」と同じ意味で使用する）、それ以上の（例えば、 3種 類の)抗原に対して特異性を有して 、てもよ 、。
[0049] 本発明における「抗体」には、上述の抗体に対してさらにアミノ酸の置換、欠失、付 加及び Z若しくは挿入、またはキメラ化やヒト化等により、そのアミノ酸配列が改変さ れたものが含まれる。アミノ酸の置換、欠失、付加及び/又は挿入、並びにヒト化、キ メラ化などのアミノ酸配列の改変は、当業者に公知の方法により行うことが可能である 。同様に、本発明における抗体を組換え抗体として作製する際に利用する抗体の可 変領域及び定常領域も、アミノ酸の置換、欠失、付加及び Z若しくは挿入、またはキ メラ化やヒト化等によりそのアミノ酸配列を改変してもよい。
[0050] 本発明における抗体はマウス抗体、ヒト抗体、ラット抗体、ゥサギ抗体、ャギ抗体、ラ クダ抗体など、どのような動物由来の抗体でもよい。さらに、例えば、キメラ抗体、中で もヒト化抗体などのアミノ酸配列を置換した改変抗体でもよい。また、各種分子を結合 させた抗体修飾物、抗体断片、低分子化抗体などいかなる抗体でもよい。
[0051] 「キメラ抗体」とは、異なる動物由来の配列を組合わせて作製される抗体である。例 えば、マウス抗体の重鎖、軽鎖の可変 (V)領域とヒト抗体の重鎖、軽鎖の定常 (C)領 域力 なる抗体を例示することができる。キメラ抗体の作製は公知であり、例えば、抗 体 V領域をコードする DNAをヒト抗体 C領域をコードする DNAと連結し、これを発現べ クタ一に組み込んで宿主に導入し産生させることによりキメラ抗体を得ることができる
[0052] 「ヒト化抗体」とは、再構成 (reshaped)ヒト抗体とも称される、ヒト以外の哺乳動物由 来の抗体、例えばマウス抗体の相補性決定領域（CDR;complementarity determining region)をヒト抗体の CDRへ移植したものである。 CDRを同定するための方法は公知 である (Kabat et ai., Sequence of Proteins of Immunological Interest (1987), National Institute of Health, Bethesda, Md.; Chothia et al, Nature (1989) 342: 877)。また、 その一般的な遺伝子組換え手法も公知である（欧州特許出願公開番号 EP 125023 号公報、 WO 96/02576号公報参照)。そこで公知の方法により、例えば、マウス抗体 の CDRを決定し、該 CDRとヒト抗体のフレームワーク領域（framework region ;FR)とが 連結された抗体をコードする DNAを取得し、ヒト化抗体を通常の発現ベクターを用い た系により産生することができる。このような DNAは、 CDR及び FR両方の末端領域に オーバーラップする部分を有するように作製した数個のオリゴヌクレオチドをプライマ 一として用いて PCR法により合成することができる (W098/13388号公報に記載の方 法を参照)。 CDRを介して連結されるヒト抗体の FRは、 CDRが良好な抗原結合部位を 形成するように選択される。必要に応じ、再構成ヒト抗体の CDRが適切な抗原結合部 位を形成するように、抗体の可変領域における FRのアミノ酸を改変してもよい（Sato e t al., Cancer Res. (1993) 53: 851-6)。改変できる FR中のアミノ酸残基には、抗原に 直接、非共有結合により結合する部分 (Amit et al., Science (1986) 233: 747- 53)、 C DR構造に影響または作用する部分（Chothia et al., J. Mol. Biol. (1987) 196: 901-17 )及び VH-VL相互作用に関連する部分 (EP239400号特許公報）が含まれる。
本発明における抗体がキメラ抗体またはヒト化抗体である場合には、これらの抗体 の C領域は，好ましくはヒト抗体由来のものが使用される。例えば H鎖では、 C y 1、 C γ 2、 C γ 3、 C γ 4を、 L鎖では C κ、 C λを使用することができる。また、抗体またはそ の産生の安定性を改善するために、ヒト抗体 C領域を必要に応じ修飾してもよい。本 発明におけるキメラ抗体は、好ましくはヒト以外の哺乳動物由来抗体の可変領域とヒト 抗体由来の定常領域とからなる。一方、ヒト化抗体は、好ましくはヒト以外の哺乳動物 由来抗体の CDRと、ヒト抗体由来の FRおよび C領域と力 なる。可変領域については 、（3)-3.においてまとめて説明する。ヒト抗体由来の定常領域は、 IgG (IgGl、 IgG2、 Ig G3、 IgG4)、 IgM、 IgA、 IgD及び IgE等のアイソタイプごとに固有のアミノ酸配列を有す る。本発明におけるヒト化抗体に用いられる定常領域は、どのアイソタイプに属する抗 体の定常領域であってもよい。好ましくは、ヒ HgGの定常領域が用いられるが、これ に限定されるものではない。また、ヒトイ匕抗体に利用されるヒト抗体由来の FRも特に限 定されず、どのアイソタイプに属する抗体のものであってもよい。
[0053] 本発明におけるキメラ抗体及びヒト化抗体の可変領域及び定常領域は、元の抗体 の結合特異性を示す限り、欠失、置換、挿入及び/または付加等により改変されてい てもよい。
[0054] ヒト由来の配列を利用したキメラ抗体及びヒト化抗体は、ヒト体内における抗原性が 低下しているため、治療目的などでヒトに投与する場合に有用と考えられる。
[0055] また、低分子化抗体は、体内動態の性質の面からも、大腸菌、植物細胞等を用い て低コストで製造できる点力もも抗体として有用である。
[0056] 抗体断片は低分子化抗体の一種である。また、低分子化抗体は、抗体断片をその 構造の一部とする抗体も含む。本発明における低分子化抗体は、抗原への結合能を 有していれば特にその構造、製造法等は限定されない。低分子化抗体の中には、全 長抗体よりも高い活性を有する抗体も存在する（Orita et al., Blood(2005) 105: 562-5 66)。本明細書において、「抗体断片」とは、全長抗体 (whole antibody,例えば whole I gG等)の一部分であれば特に限定されな 、が、重鎖可変領域 (VH)又は軽鎖可変領 域 (VL)を含んでいることが好ましい。好ましい抗体断片の例としては、例えば、 Fab, F(ab')2、 Fab'、 Fvなどを挙げることができる。抗体断片中の、 VHまたは VLのアミノ酸 配列は、置換、欠失、付加及び Z又は挿入により改変されていてもよい。さらに抗原 への結合能を保持する限り、 VH及び VLの一部を欠損させてもよい。例えば、前述の 抗体断片のうち「Fv」は、完全な抗原認識部位と結合部位を含む最小の抗体断片で ある。「Fv」は、 1つの VHおよび 1つの VLが非共有結合により強く結合したダイマー (V H- VLダイマー）である。各可変領域の 3つの相補鎖決定領域（complementarity dete rmining region ;CDR)によって、 VH-VLダイマーの表面に抗原結合部位を形成する 。 6つの CDRが抗体に抗原結合部位を付与している。し力しながら、 1つの可変領域（ または、抗原に特異的な 3つの CDRのみを含む Fvの半分)であっても、全結合部位よ りも親和性は低いが、抗原を認識し、結合する能力を有する。従って、このような Fvよ り小さい分子も本発明における抗体断片に含まれる。又、抗体断片の可変領域はキ メラ化ゃヒト化されて ヽてもよ 、。
[0057] 低分子化抗体は、 VHと VLの両方を含んで 、ることが好ま 、。低分子化抗体の例 としては、 Fab、 Fab'、 F(ab')2及び Fv等の抗体断片、並びに、抗体断片を利用して作 製され得る scFv (シングルチェイン Fv) (Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (19 88) 85: 5879-83; Plickthun「The Pharmacology of Monoclonal Antibodies] Vol.113, R esenburg及び Moore編, Springer Verlag, New York, pp.269- 315, (1994))、 Diabody (Holliger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1993) 90: 6444—8; EP404097号； W093 /11161号； Johnson et al., Method in Enzymology (1991) 203: 88—98; Holliger et al" Protein Engineering (1996) 9: 299—305; Perisic et al., Structure (1994) 2: 1217—26; John et al., Protein Engineering (1999) 12(7): 597-604; Atwell et al., Mol.Immunol. (1996) 33: 1301— 12)、 sc(Fv)2 (Hudson et al、 J Immunol. Methods (1999) 231: 177-8 9； Orita et al., Blood(2005) 105: 562- 566)、 Triabody (Journal of Immunological Met hods (1999) 231: 177- 89)、及び Tandem Diabody (Cancer Research (2000) 60: 4336 -41)等を挙げることができる。
[0058] 抗体断片は、抗体を酵素、例えばパパイン、ペプシン等のプロテアーゼにより処理 して得ることができる（Morimoto et al., J. Biochem. Biophys. Methods (1992) 24: 107 -17; Brennan et al., Science (1985) 229: 81参照）。また、該抗体断片のアミノ酸配列 を基に、遺伝子組換えにより製造することもできる。
[0059] 抗体断片を改変した構造を有する低分子化抗体は、酵素処理若しくは遺伝子組換 えにより得られた抗体断片を利用して構築することができる。又は、低分子化抗体全 体をコードする遺伝子を構築し、これを発現ベクターに導入した後、適当な宿主細胞 で発現させることもできる（例えば、 Co et al., J. Immunol. (1994) 152: 2968-76; Bette r and Horwitz, Methods Enzymol. (1989) 178: 476-96; Pluckthun and Skerra, Metho ds Enzymol. (1989) 178: 497—515; Lamoyi, Methods Enzymol. (1986) 121: 652—63; Rousseaux et al., Methods Enzymol. (1986) 121: 663-9; Bird and Walker, Trends Bi otechnol. (1991) 9: 132- 7参照）。
[0060] また、上記「scFv」は、 2つの可変領域を、必要に応じリンカ一等を介して、結合させ た一本鎖ポリペプチドである。 scFvに含まれる 2つの可変領域は、通常、 1つの VHと 1 つの VLであるが、 2つの VH又は 2つの VLであってもよい。一般に scFvポリペプチドは 、 VH及び VLドメインの間にリンカ一を含み、それにより抗原結合のために必要な VH 及び VLの対部分が形成される。通常、同じ分子内で VH及び VLの間で対部分を形 成させるために、一般に、 VH及び VLを連結するリンカ一を 10アミノ酸以上の長さの ペプチドリンカ一とする。しかしながら、本発明における scFvのリンカ一は、 scFvの形 成を妨げない限り、このようなペプチドリンカ一に限定されるものではない。 scFvの総 1¾として、 Pluckthunu i he Pharmacology of Monoclonal Antibody JVol.113(Rosenburg and Moore ed.， Springer Verlag, NY, pp.269- 315 (1994》を参照することができる。
[0061] また、「ダイァボディ (diabody; Db)」は、遺伝子融合により構築された二価 (bivalent) の抗体断片を指す (P.Holliger et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90: 6444-6448 (1993) 、 EP404,097号、 W093/11161号等)。ダイァボディは、 2本のポリペプチド鎖から構成 されるダイマーであり、ポリペプチド鎖は各々、同じ鎖中で軽鎖可変領域 (VL)及び重 鎖可変領域 (VH)が、互いに結合できない位に短い、例えば、 5残基程度のリンカ一 により結合されている。同一ポリペプチド鎖上にコードされる VLと VHとは、その間のリ ンカーが短いため単鎖 V領域フラグメントを形成することが出来ず二量体を形成する ため、ダイァボディは 2つの抗原結合部位を有することとなる。このとき 2つの異なるェ ピトープ (a、 b)に対する VLと VHを VLa-VHbと VLb-VHaの組合わせで 5残基程度のリ ンカーで結んだものを同時に発現させると二重特異性 Dbとして分泌される。このとき 2 つの異なるェピトープとは、同一の抗原上の異なる 2箇所のェピトープであってもよく 、また 2つの異なる抗原のそれぞれにある 2箇所のェピトープであってもよい。
[0062] Diabodyは、 2分子の scFvを含むことから、 4つの可変領域を含み、その結果、 2つの 抗原結合部位を持つこととなる。ダイマーを形成させない scFvの場合と異なり、 Diabo dyの形成を目的とする場合、通常、各 scFv分子内の VH及び VL間を結ぶリンカ一は 、ペプチドリンカ一とする場合には、 5アミノ酸前後のものとする。し力しながら、 Diabod yを形成する scFvのリンカ一は、 scFvの発現を妨げず、 Diabodyの形成を妨げない限 り、このようなペプチドリンカ一に限定されない。
[0063] 本発明の方法に供される好ましいポリペプチドもしくは異種多量体としては、例えば 、抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域を有するポリペプチドもしくは異種多量 体を挙げることができる。また、より好ましくは、本発明の好ましい態様においては、本 発明のポリペプチドもしくは異種多量体が、 2種以上の重鎖可変領域と、 2種以上の 軽鎖可変領域を含む際の、会合制御方法である。該ポリペプチドもしくは異種多量 体は、 2種以上のェピトープを認識するようなものが好ましぐ例えば、多重特異性抗 体を例示することができる。
[0064] 本発明にお 、てさらに好ましくは、多重特異性抗体として二重特異性抗体を挙げる ことができる。
[0065] 即ち、本発明の好ましい態様においては、例えば、 2種の重鎖可変領域 (第一の重 鎖と第二の重鎖)と、 2種の軽鎖可変領域 (第一の軽鎖と第二の軽鎖)から構成される 二重特異性抗体について会合を制御する方法に関する。
[0066] 本発明の好ま 、態様の「二重特異性抗体」につ!/、てさらに詳述すれば、上記「第 一の重鎖」とは抗体を形成する 2つの H鎖のうちの一方の H鎖であり、第二の H鎖は第 一の H鎖とは異なるもう一方の H鎖のことをいう。つまり、 2つの H鎖のうち任意にどちら か一方を第一の H鎖とし、他方を第二の H鎖とすることができる。同様に、「第一の軽 鎖」とは二重特異性抗体を形成する 2つの L鎖のうちの一方の L鎖であり、第二の L鎖 は第一の L鎖とは異なるもう一方の L鎖のことを指し、 2つの L鎖のうちどちらか一方を 任意に第一の L鎖とし、他方を第二の L鎖とすることができる。通常、第一の L鎖と第 一の H鎖は或る抗原 (又はェピトープ)を認識する同一の抗体より由来し、第二の L鎖 と第二の H鎖も或る抗原 (又はェピトープ)を認識する同一の抗体より由来する。ここで 、第一の H鎖 'L鎖で形成される L鎖- H鎖対を第一の対、第二の H鎖 'L鎖で形成され る L鎖- H鎖対を第二の対と呼ぶ。第二の対の由来となる抗体を作製する際に用いら れる抗原 (又はェピトープ)は、第一の対の由来となる抗体を作製する際に用いられる ものとは異なっていることが好ましい。即ち、第一の対と第二の対が認識する抗原は 同じでもよいが、好ましくは異なる抗原 (又はェピトープ)を認識する。この場合、第一 の対及び第二の対の H鎖と L鎖は互いに異なるアミノ酸配列を有していることが好まし い。第一の対と第二の対が異なるェピトープを認識する場合、該第一の対と第二の 対は全く異なる抗原を認識してもよ ヽし、同一抗原上の異なる部位 (異なるェピトープ )を認識してもよい。又、一方がタンパク質、ペプチド、遺伝子、糖などの抗原を認識し 、他方が放射性物質、化学療法剤、細胞由来トキシン等の細胞傷害性物質などを認 識してもよい。しかしながら、特定の H鎖と L鎖の組合せで形成される対を有する抗体 を作製したいと考えた場合には、その特定の H鎖と L鎖を第一の対及び第二の対とし て任意に決定することができる。
なお、上記「二重特異性抗体」は、必ずしも、 2種の重鎖および 2種の軽鎖からなる 抗体に限定されず、例えば、 2種の重鎖可変領域および 2種の軽鎖可変領域が 1本 鎖として連結した構造の抗体 (例えば、 sc(Fv)2)であってもよ 、。
[0067] 本発明の方法における変異導入前の抗体 (本明細書においては、単に「本発明の 抗体」と記載する場合あり）の H鎖又は L鎖をコードする遺伝子は既知の配列を用いる ことも可能であり、又、当業者に公知の方法で取得することもできる。例えば、抗体ラ イブラリーから取得することも可能であるし、モノクローナル抗体を産生するハイブリド 一マ力も抗体をコードする遺伝子をクローユングして取得することも可能である。
[0068] 抗体ライブラリーについては既に多くの抗体ライブラリーが公知になっており、又、 抗体ライブラリーの作製方法も公知であるので、当業者は適宜抗体ライブラリーを入 手することが可能である。例えば、抗体ファージライブラリーについては、 Clackson et al.， Nature 1991, 352: 624—8、 Marks et al., J. Mol. Biol. 1991, 222: 581—97、 Water houses et al" Nucleic Acids Res. 1993, 21: 2265-6、 Griffiths et al" EMBO J. 1994, 13: 3245-60、 Vaughan et al., Nature Biotechnology 1996, 14: 309-14、及び特表平 20— 504970号公報等の文献を参照することができる。その他、真核細胞をライブラリ 一とする方法 (W095/15393号パンフレット)やリボソーム提示法等の公知の方法を用 いることが可能である。さらに、ヒト抗体ライブラリーを用いて、パンユングによりヒト抗 体を取得する技術も知られている。例えば、ヒト抗体の可変領域を一本鎖抗体 (scFv) としてファージディスプレイ法によりファージの表面に発現させ、抗原に結合するファ ージを選択することができる。選択されたファージの遺伝子を解析すれば、抗原に結 合するヒト抗体の可変領域をコードする DNA配列を決定することができる。抗原に結 合する scFvの DNA配列が明らかになれば、当該配列を元に適当な発現ベクターを 作製し、ヒト抗体を取得することができる。これらの方法は既に周知であり、 WO92/01 047、 WO92/20791, WO93/06213, W093/11236, W093/19172, WO95/01438, W 095/15388を参考にすることができる。
[0069] ノ、イブリドーマ力 抗体をコードする遺伝子を取得する方法は、基本的には公知技 術を使用し、所望の抗原または所望の抗原を発現する細胞を感作抗原として使用し て、これを通常の免疫方法にしたがって免疫し、得られる免疫細胞を通常の細胞融 合法によって公知の親細胞と融合させ、通常のスクリーニング法により、モノクローナ ルな抗体産生細胞 (ノ、イブリドーマ)をスクリーニングし、得られたハイプリドーマの mR NAから逆転写酵素を用いて抗体の可変領域 (V領域)の cDNAを合成し、これを所望 の抗体定常領域 (C領域)をコードする DNAと連結することにより得ることができる。
[0070] より具体的には、特に以下の例示に限定される訳ではないが、上記の H鎖及び L鎖 をコードする抗体遺伝子を得るための感作抗原は、免疫原性を有する完全抗原と、 免疫原性を示さないハプテン等を含む不完全抗原の両方を含む。例えば、目的タン ノ ク質の全長タンパク質、又は部分ペプチドなどを用いることができる。その他、多糖 類、核酸、脂質等から構成される物質が抗原となり得ることが知られており、本発明の 抗体の抗原は特に限定されるものではない。抗原の調製は、当業者に公知の方法に より行うことができ、例えば、バキュロウィルスを用いた方法 (例えば、 W098/46777な ど)などに準じて行うことができる。ハイプリドーマの作製は、たとえば、ミルスティンら の方法 (G. Kohler and C. Milstein, Methods Enzymol. 1981, 73: 3- 46)等に準じて行 うことができる。抗原の免疫原性が低い場合には、アルブミン等の免疫原性を有する 巨大分子と結合させ、免疫を行えばよい。また、必要に応じ抗原を他の分子と結合さ せることにより可溶性抗原とすることもできる。受容体のような膜貫通分子を抗原とし て用いる場合、受容体の細胞外領域部分を断片として用いたり、膜貫通分子を細胞 表面上に発現する細胞を免疫原として使用することも可能である。
[0071] 抗体産生細胞は、上述の適当な感作抗原を用いて動物を免疫化することにより得 ることができる。または、抗体を産生し得るリンパ球を in vitroで免疫化して抗体産生 細胞とすることもできる。免疫化する動物としては、各種哺乳動物を使用できるが、ゲ ッ歯目、ゥサギ目、霊長目の動物が一般的に用いられる。マウス、ラット、ノ、ムスター 等のゲッ歯目、ゥサギ等のゥサギ目、力-クイザル、ァカゲザル、マントヒヒ、チンパン ジ一等のサル等の霊長目の動物を例示することができる。その他、ヒト抗体遺伝子の レパートリーを有するトランスジヱニック動物も知られており、このような動物を使用す ることによりヒト抗体を得ることもできる (WO96/34096; Mendez et al.， Nat. Genet. 199 7, 15: 146-56参照)。このようなトランスジエニック動物の使用に代えて、例えば、ヒトリ ンパ球を in vitroで所望の抗原または所望の抗原を発現する細胞で感作し、感作リン パ球をヒトミエローマ細胞、例えば U266と融合させることにより、抗原への結合活性を 有する所望のヒト抗体を得ることもできる (特公平ト 59878号公報参照)。また、ヒト抗体 遺伝子の全てのレパートリーを有するトランスジエニック動物を所望の抗原で免疫す ることで所望のヒト抗体を取得することができる (W093/12227、 WO92/03918、 W094 /02602、 WO96/34096、 W096/33735参照)。
[0072] 動物の免疫化は、例えば、感作抗原を Phosphate-Buffered Saline(PBS)または生理 食塩水等で適宜希釈、懸濁し、必要に応じてアジュバントを混合して乳化した後、動 物の腹腔内または皮下に注射することにより行われる。その後、好ましくは、フロイント 不完全アジュバントに混合した感作抗原を 4〜21日毎に数回投与する。抗体の産生 の確認は、動物の血清中の目的とする抗体力価を慣用の方法により測定することに より行われ得る。
[0073] ハイプリドーマは、所望の抗原で免疫化した動物またはリンパ球より得られた抗体 産生細胞を、慣用の融合剤 (例えば、ポリエチレングリコール)を使用してミエローマ細 胞と融合して作成することができる (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Pr actice, Academic Press, 1986, 59-103)。必要に応じハイプリドーマ細胞を培養'増殖 し、免疫沈降、放射免疫分析 (RIA)、酵素結合免疫吸着分析 (ELISA)等の公知の分 析法により該ハイブリドーマより産生される抗体の結合特異性を測定する。その後、 必要に応じ、 目的とする特異性、親和性または活性が測定された抗体を産生するハ イブリドーマを限界希釈法等の手法によりサブクローユングすることもできる。
[0074] 続 、て、選択された抗体をコードする遺伝子をハイブリドーマまたは抗体産生細胞（ 感作リンパ球等)から、抗体に特異的に結合し得るプローブ (例えば、抗体定常領域 をコードする配列に相補的なオリゴヌクレオチド等)を用いてクロー-ングすることがで きる。また、 mRNAから RT-PCRによりクローニングすることも可能である。免疫グロブリ ンは、 IgA、 IgD、 IgE、 IgG及び IgMの 5つの異なるクラスに分類される。さらに、これらの クラスは幾つかのサブクラス (アイソタイプ) (例えば、 IgG-l、 IgG-2、 IgG-3、及び IgG-4 ;IgA-l及び IgA-2等)に分けられる。本発明において抗体の製造に使用する H鎖及び L鎖は、これらいずれのクラス及びサブクラスに属する抗体に由来するものであっても よぐ特に限定されないが、 IgGは特に好ましいものである。
[0075] ここで、 H鎖及び L鎖をコードする遺伝子を遺伝子工学的手法により改変することも 可能である。例えば、マウス抗体、ラット抗体、ゥサギ抗体、ハムスター抗体、ヒッジ抗 体、ラクダ抗体等の抗体について、ヒトに対する異種抗原性を低下させること等を目 的として人為的に改変した遺伝子組換え型抗体、例えば、キメラ抗体、ヒト化抗体等 を適宜作製することができる。キメラ抗体は、ヒト以外の哺乳動物、例えば、マウス抗 体の H鎖、 L鎖の可変領域とヒト抗体の H鎖、 L鎖の定常領域からなる抗体であり、マウ ス抗体の可変領域をコードする DNAをヒト抗体の定常領域をコードする DNAと連結し 、これを発現ベクターに組み込んで宿主に導入し産生させることにより得ることができ る。ヒトイ匕抗体は、再構成 (reshaped)ヒト抗体とも称され、ヒト以外の哺乳動物、たとえ ばマウス抗体の相補性決定領域 (CDR; complementary determining region)を連結 するように設計した DNA配列を、末端部にオーバーラップする部分を有するように作 製した数個のオリゴヌクレオチドカゝら PCR法により合成する。得られた DNAをヒト抗体 定常領域をコードする DNAと連結し、次いで発現ベクターに組み込んで、これを宿主 に導入し産生させることにより得られる (EP239400; WO96/02576参照)。 CDRを介して 連結されるヒト抗体の FRは、相補性決定領域が良好な抗原結合部位を形成するもの が選択される。必要に応じ、再構成ヒト抗体の相補性決定領域が適切な抗原結合部 位を形成するように抗体の可変領域のフレームワーク領域のアミノ酸を置換してもよ い (K. Sato et al, Cancer Res. 1993, 53: 851-856)。
[0076] 上述のヒト化以外に、例えば、抗原との結合性等の抗体の生物学的特性を改善す るために改変を行うことも考えられる。このような改変は、部位特異的突然変異 (例え ば、 Kunkel (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 488参照)、 PCR変異、カセット変 異等の方法により行うことができる。一般に、生物学的特性の改善された抗体変異体 は 70%以上、より好ましくは 80%以上、さらに好ましくは 90%以上 (例えば、 95%以上 、 97%、 98%、 99%等)のアミノ酸配列相同性及び/または類似性を元となった抗体の 可変領域のアミノ酸配列に対して有する。本明細書において、配列の相同性及び/ または類似性は、配列相同性が最大の値を取るように必要に応じ配列を整列化、及 びギャップ導入した後、元となった抗体残基と相同 (同じ残基)または類似 (一般的な アミノ酸の側鎖の特性に基き同じグループに分類されるアミノ酸残基)するアミノ酸残 基の割合として定義される。通常、天然のアミノ酸残基は、その側鎖の性質に基づい て (1)疎水性：ァラニン、イソロイシン、ノルロイシン、ノ リン、メチォニン及びロイシン； (2 )中性親水性:ァスパラギン、グルタミン、システィン、スレオニン及びセリン; (3)酸性： ァスパラギン酸及びグルタミン酸； (4)塩基性：アルギニン、ヒスチジン及びリシン； (5)鎖 の配向に影響する残基:グリシンおよびプロリン;ならびに (6)芳香族性:チロシン、トリ プトファン及びフエ-ルァラニンのグループに分類される。
[0077] 通常、 H鎖及び L鎖の可変領域中に存在する全部で 6つの相補性決定領域 (超可 変部; CDR)が相互作用し、抗体の抗原結合部位を形成している。このうち 1つの可変 領域であっても全結合部位を含むものよりは低い親和性となるものの、抗原を認識し 、結合する能力があることが知られている。従って、本発明の H鎖及び L鎖をコードす る抗体遺伝子は、該遺伝子によりコードされるポリペプチドが所望の抗原との結合性 を維持していればよぐ H鎖及び L鎖の各々の抗原結合部位を含む断片部分をコー ドしていればよい。
[0078] 本発明の会合制御方法によって、上述のように、例えば、所望の二重特異性抗体 を優先的 (効率的）に取得することができる。即ち、モノマー混合物力も所望の異種 多量体である二重特異性抗体を効率的に形成させることができる。
[0079] 以下、 2種の重鎖可変領域 (VH1と VH2)および 2種の軽鎖可変領域 (VL1と VL2)を有 する IgG型二重特異性抗体の場合について、より詳細に説明するが、その他の異種 多量体についても同様に本発明の方法を適用することができる。
[0080] 第一の重鎖可変領域 (VH1)と第一の軽鎖可変領域 (VL1)により一方のェピトープを 認識し、また、第二の重鎖可変領域 (VH2)と第二の軽鎖可変領域 (VL2)により他方の ェピトープを認識するような二重特異性抗体を取得した!/、場合、該抗体の生産にお いて 4種のそれぞれの鎖を発現させると理論上 10種類の抗体分子が生産される可能 '性がある。 [0081] この場合、例えば、 VH1と VL2、および Zまたは VH2と VL1のポリペプチド間の会合 を阻害するように制御すれば、所望の抗体分子を優先的に取得することが可能であ る。
一例を示せば、 VH1のポリペプチドと VL2のポリペプチド間、および Zまたは、 VH2 のポリペプチドと VL1のポリペプチド間の界面を形成するアミノ酸残基を上述のように 改変することにより、これらポリペプチド間の会合を阻害することが挙げられる。
[0082] また、本発明の会合制御の方法を利用することにより、重鎖同士 (VH1と VH2)、ある いは、軽鎖同士 (VL1と VL2)の会合を抑制させることも可能である。
[0083] 重鎖可変領域は、上述のように、通常 3つの CDR領域と FR領域によって構成されて いる。本発明の好ましい態様において「改変」に供するアミノ酸残基としては、例えば 、 CDR領域あるいは FR領域に位置するアミノ酸残基の中から適宜選択することがで きる。一般的に CDR領域のアミノ酸残基の改変は、抗原に対する結合能を低下させ る場合がある。従って、本発明において「改変」に供するアミノ酸残基としては、特に 限定されるものではな ヽが、 FR領域に位置するアミノ酸残基の中から適宜選択するこ とが好ましい。
[0084] 当業者であれば、本発明の方法によって会合を制御したい所望のポリペプチドに っ 、て、会合した際の FRの界面にぉ 、て接近するアミノ酸残基の種類を適宜知るこ とが可能である。
[0085] また、ヒトもしくはマウス等の生物において、抗体の可変領域の FRとして利用可能な 配列を、当業者であれば、公共のデータベース等を利用して適宜取得することがで きる。より具体的には、後述の実施例に記載の手段にて、 FR領域のアミノ酸配列情 報を取得することが可能である。
[0086] 例えば、後述の実施例に示す二重特異性抗体については、会合した際の FRの界 面にお!、て接近するアミノ酸残基の具体例として、重鎖可変領域上の 39位 (FR2領域 ) (例えば、配列番号: 6に記載のアミノ酸配列における 39位)のグルタミン (Q)と、相対 (接触)する軽鎖可変領域上の 38位 (FR2領域) (例えば、配列番号: 8に記載のァミノ 酸配列における 44位)のグルタミン (Q)を挙げることができる。さらに、重鎖可変領域上 の 45位 (FR2) (例えば、配列番号： 6に記載のアミノ酸配列における 45位）のロイシン (L )と、相対する軽鎖可変領域上の 44位 (FR2) (例えば、配列番号: 8に記載のアミノ酸 配列における 50位)のプロリン (P)を好適に例示することができる。なお、これら部位の ナンバーリングについては、 Kabatらの文献 (Kabat EA et al. 1991. Sequence of Prote ins of Immunological Interest. NIH)を参考にして ヽる。
[0087] 後述の実施例で示すように、これらアミノ酸残基を改変し、本発明の方法を実施す ることにより、所望の抗体を優先的に取得することができる。
[0088] これらアミノ酸残基は、ヒトおよびマウスにおいて高度に保存されていることが知られ ている 0. Mol. Recognit. 2003; 16: 113-120)ことから、実施例に示す抗体以外の VH と VLの会合にっ 、ても、上記アミノ酸残基に対応するアミノ酸残基を改変すること〖こ よって、抗体の可変領域の会合を制御することができる。
[0089] 即ち好ま 、態様にぉ 、て本発明は、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む 抗体 (ポリペプチド (例えば、 sc(Fv)2)または異種多量体 (例えば、 IgG型抗体)等)で あって、以下の（1)と（2)、または、（3)と (4)のアミノ酸残基が同種の電荷を有するァ ミノ酸残基である抗体を提供する。
(1)重鎖可変領域に含まれるアミノ酸残基であって、配列番号: 6に記載のアミノ酸配 列における 39位に相当するアミノ酸残基
(2)軽鎖可変領域に含まれるアミノ酸残基であって、配列番号: 8に記載のアミノ酸配 列における 44位に相当するアミノ酸残基
(3)重鎖可変領域に含まれるアミノ酸残基であって、配列番号: 6に記載のアミノ酸配 列における 45位に相当するアミノ酸残基
(4)軽鎖可変領域に含まれるアミノ酸残基であって、配列番号: 8に記載のアミノ酸配 列における 50位に相当するアミノ酸残基
[0090] なお、上記の配列番号: 6または 8に記載のアミノ酸配列は、本発明において改変 に供するアミノ酸残基の位置をより具体的に例示するためのものであり、重鎖可変領 域または軽鎖可変領域が、これらのアミノ酸配列である場合に限定されな！、。
[0091] 上記（1)と（2)、（3)と (4)に記載のそれぞれのアミノ酸残基は、後述の実施例およ び図 1に示すように、会合した際に互いに接近している。当業者であれば、所望の重 鎖可変領域または軽鎖可変領域について、市販のソフトウェアを用いたホモロジーモ デリング等により、上記（1)〜(4)に記載のアミノ酸残基に対応する部位を見出すこと ができ、適宜、該部位のアミノ酸残基を改変に供することが可能である。
[0092] 上記抗体において、「電荷を有するアミノ酸残基」は、例えば、以下の（a)または (b) の!、ずれかの群に含まれるアミノ酸残基力も選択されることが好ま 、。
(a)グルタミン酸 (E)、ァスパラギン酸 (D)；
(b)リジン（K)、ァノレギニン（R)、ヒスチジン（H)。
[0093] さらに本発明は、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む抗体 (ポリペプチドまた は異種多量体等)であって、以下の（3)と (4)の 、ずれか一方が電荷を有するァミノ 酸残基である抗体を提供する。以下の（3)と (4)で示すアミノ酸残基の側鎖は近接し 、疎水性コアを形成し得る。
(3)重鎖可変領域に含まれるアミノ酸残基であって、配列番号: 6に記載のアミノ酸配 列における 45位に相当するアミノ酸残基
(4)軽鎖可変領域に含まれるアミノ酸残基であって、配列番号: 8に記載のアミノ酸配 列における 50位に相当するアミノ酸残基
[0094] 上記抗体にぉ ヽて、「電荷を有するアミノ酸残基」は、例えば、グルタミン酸 (E)、ァ スパラギン酸 (D)、リジン (K)、アルギニン (R)またはヒスチジン (H)であることが好まし い。
[0095] 上記（1)〜(4)に記載のアミノ酸残基は、通常、ヒトおよびマウスにおいてはそれぞ れ（1)グルタミン (Q)、 （2)グルタミン (Q)、 （3)ロイシン (L)、 （4)プロリン (P)である。従つ て本発明の好ましい態様においては、これらアミノ酸残基を改変（例えば、電荷アミノ 酸への置換）に供する。なお、上記（1)〜 (4)のアミノ酸残基の種類は、必ずしも上記 のアミノ酸残基に限定されず、該アミノ酸に相当する他のアミノ酸であってもよい。例 えば、軽鎖可変領域上の配列番号: 8に記載のアミノ酸配列における 44位に相当す るアミノ酸として、ヒトの場合、例えば、ヒスチジン (H)であってもよい。当業者において は、公知文献等（例えば、 J. Mol. Recognit. 2003; 16: 113-120)を参照することにより 、配列番号: 8上の任意の位置について、その位置に相当するアミノ酸残基の種類を 知ることが可能であり、適宜、該アミノ酸残基について改変（例えば、電荷アミノ酸へ 置換)することができる。 [0096] また、上述の抗体についての製造方法、および、上記（1)〜(4)のアミノ酸残基を 改変することを特徴とする本発明の会合制御方法もまた、本発明の好まし 、態様で ある。
[0097] また、本発明の別態様として、重鎖または軽鎖の定常領域の界面に電荷的な反発 を導入して、重鎖同士または重鎖と軽鎖の会合を抑制させる方法が挙げられる。重 鎖定常領域の界面で接触するアミノ酸残基としては、例えば CH3領域における 377位 (356位)と 470位 (439位)、 378位 (357位)と 393位 (370位)、 427位 (399位)と 440位 (409位） に相対する領域を挙げることができる。重鎖定常領域と軽鎖定常領域の界面で接触 するアミノ酸残基としては、例えば CH1領域の 221位 (213位)と CL領域の 123位の相対 する領域を挙げることができる。抗体定常領域のナンバーリングについては、 Kabatら の文献 (Kabat EA et al. 1991. sequences of Proteins of Immunological Interest. N IH)を参考にし、重鎖定常領域については EUナンバーリングについて括弧内に表示 した。
[0098] 後述の実施例で示すように、これらアミノ酸残基を改変し、本発明の方法を実施す ることにより、抗体の重鎖の会合を制御し、所望の抗体を優先的に取得することがで きる。
即ち好ましい態様において本発明は、 2種以上の重鎖 CH3領域を含む抗体およ び Fc領域結合蛋白質（例えば、 IgG型抗体、 minibody(Alt M et al. FEBS Letters 199 9; 454: 90-94)、ィムノアドへシン (非特許文献 2)等)であって、第 1の重鎖 CH3領域 における以下の（1)〜（3)に示すアミノ酸残基の組から選択される 1組ないし 3組のァ ミノ酸残基が同種の電荷を有する抗体を提供する。
(1)重鎖 CH3領域に含まれるアミノ酸残基であって、 EUナンバーリングによる 356 位および 439位のアミノ酸残基
(2)重鎖 CH3領域に含まれるアミノ酸残基であって、 EUナンバーリングによる 357 位および 370位のアミノ酸残基
(3)重鎖 CH3領域に含まれるアミノ酸残基であって、 EUナンバーリングによる 399 位および 409位のアミノ酸残基
[0099] 更に好ましい態様において本発明は、上記第 1の重鎖 CH3領域とは異なる第 2の 重鎖 CH3領域における前記（1)〜（3)に示すアミノ酸残基の組から選択されるァミノ 酸残基の組であって、前記第 1の重鎖 CH3領域において同種の電荷を有する前記（ 1)〜（3)に示すアミノ酸残基の組に対応する 1組ないし 3組のアミノ酸残基が、前記 第 1の重鎖 CH3領域における対応するアミノ酸残基とは反対の電荷を有する抗体を 提供する。
[0100] 上記（1)〜（3)に記載のそれぞれのアミノ酸残基は、後述の実施例および図 27に 示すように、会合した際に互いに接近している。当業者であれば、所望の重鎖 CH3 領域または重鎖定常領域について、市販のソフトウェアを用いたホモロジーモデリン グ等により、上記（1)〜（3)に記載のアミノ酸残基に対応する部位を見出すことがで き、適宜、該部位のアミノ酸残基を改変に供することが可能である。
上記抗体において、「電荷を有するアミノ酸残基」は、例えば、以下の（a)または (b) の!、ずれかの群に含まれるアミノ酸残基力も選択されることが好ま 、。
(a)グルタミン酸 (E)、ァスパラギン酸 (D)；
(b)リジン（K)、ァノレギニン（R)、ヒスチジン（H)。
[0101] 上記抗体において、「同種の電荷を有する」とは、例えば、 2つ以上のアミノ酸残基 の 、ずれもが、上記 (a)または (b)の 、ずれか 1の群に含まれるアミノ酸残基を有する ことを意味する。「反対の電荷を有する」とは、例えば、 2つ以上のアミノ酸残基のなか の少なくとも 1つのアミノ酸残基力 上記 (a)または (b)の 、ずれか 1の群に含まれる アミノ酸残基を有する場合に、残りのアミノ酸残基が異なる群に含まれるアミノ酸残基 を有することを意味する。
好ましい態様において上記抗体は、第 1の重鎖 CH3領域と第 2の重鎖 CH3領域が ジスルフイド結合により架橋されて 、てもよ 、。
本発明において「改変」に供するアミノ酸残基としては、上述した抗体の可変領域ま たは抗体の定常領域のアミノ酸残基に限られない。当業者であれば、ポリペプチド変 異体または異種多量体について、市販のソフトウェアを用いたホモロジ一モデリング 等により、界面を形成するアミノ酸残基を見出すことができ、会合を制御するように、 該部位のアミノ酸残基を改変に供することが可能である。
[0102] 本発明の方法は、必須ではな 、が、公知の技術を組み合わせて実施することも可 能である。例えば、 VH1と VL1、および Zまたは VH2と VL2の会合が促進されるように 、本発明の「改変」に加えて、一方の H鎖の可変領域に存在するアミノ酸側鎖をより大 きい側鎖 (knob;突起)に置換し、もう一方の H鎖の相対する可変領域に存在するアミ ノ酸側鎖をより小さい側鎖 (hole;空隙)に置換することによって、突起が空隙に配置さ れ得るようにして VH1と VL1、および Zまたは VH2と VL2の会合を促進させ、結果的に VH1と VL2、および Zまたは VH2と VL1のポリペプチド間の会合をさらに抑制すること が可能である。
[0103] 本発明の会合制御方法は、所望の sc(Fv)2を優先的 (効率的）に取得する際に、好 適に実施することができる。以下、一例として、 2種の重鎖可変領域 (HIと H2)および 2 種の軽鎖可変領域 (L1と L2)を有する sc(Fv)2の場合について、より詳細に説明する。
[0104] 一般的に sc(Fv)2は、 2つの重鎖可変領域 (VH1と VH2)と 2つの軽鎖可変領域 (VL1と VL2)をリンカ一で結合した一本鎖ポリペプチドである。即ち、 sc(Fv)2は、 4つの抗体 可変領域をリンカ一等で結合して一本鎖にした低分子化抗体である。通常、 sc(Fv)2 は 2つの軽鎖可変領域と 2つの重鎖可変領域の 4つの可変領域をリンカ一などで結合 して一本鎖にした抗体である（Hudson et al、 J Immunol. Methods 1999 ;231 : 177-189
) o
[0105] sc(Fv)2は、当業者に公知の方法で作製することができ、例えば、 scFvをリンカ一で 結ぶことによって作製できる。 scFvには、抗体の VHおよび VLが含まれ、これらの領域 は単一のポリペプチド鎖中に存在する（scFvの総説については、 Pluckthun『The Pha rmacology of Monoclonal AntibomesJVol.llj (Rosenburg and Moore ed (Springer Ve rlag, New York) pp.269-315, 1994)を参照）。
[0106] また 2つの VH及び 2つの VL力 一本鎖ポリペプチドの N末端側を基点として VH、 V L、 VH、 VL ( [VH]リンカ一 [VL]リンカ一 [VH]リンカ一 [VL] )の順に並んで!/、ることを 特徴とする抗体が好ましい。
[0107] 2つの VHと 2つの VLの順序は特に上記配置に限定されず、どのような順序で並べら れていてもよい。例えば以下のような、配置も挙げることができる。
[VL]リンカ一 [VH]リンカ一 [VH]リンカ一 [VL]
[VH]リンカ一 [VL]リンカ一 [VL]リンカ一 [VH] [VH]リンカ一 [VH]リンカ一 [VL]リンカ一 [VL]
[VL]リンカ一 [VL]リンカ一 [VH]リンカ一 [VH]
[VL]リンカ一 [VH]リンカ一 [VL]リンカ一 [VH]
[0108] sc(Fv)2は抗体可変領域、リンカ一以外のアミノ酸配列を含んでいてもよい。
上記抗体の可変領域は、可変領域の全長でもよいが、抗原への結合活性を維持 する限り可変領域の部分配列でもよい。又、可変領域中のアミノ酸配列を置換、欠失 、付加、挿入などがされていてもよい。例えば、抗原性を低下させるために、キメラィ匕 ゃヒトイ匕されていてもよい。
[0109] 抗体の可変領域を結合するリンカ一としては、遺伝子工学により導入し得る任意の ペプチドリンカ一、又は合成化合物リンカ一（例えば、 Protein Engineering, 9(3), 299 -305, 1996参照）に開示されるリンカ一等を用いることができる力 本発明においては ペプチドリンカ一が好ましい。ペプチドリンカ一の長さは特に限定されず、 目的に応じ て当業者が適宜選択することが可能であるが、好ましい長さは 12アミノ酸以上 (上限 は特に限定されないが、通常、 30アミノ酸以下、好ましくは 20アミノ酸以下)であり、特 に好ましくは 15アミノ酸である。 sc(Fv)2に 3つのペプチドリンカ一が含まれる場合には 、全て同じ長さのペプチドリンカ一を用いてもよいし、異なる長さのペプチドリンカ一を 用いてもよい。
[0110] 例えば、ペプチドリンカ一の場合：
Ser
Gly •Ser
Gly •Gly •Ser
Ser' Gly Gly
Gly •Gly 'Gly Ser
Ser' Gly Gly -Gly
Gly •Gly •Gly Gly Ser
Ser' Gly Gly 'Gly 'Gly
Gly •Gly' •Gly 'Gly 'Gly 'Ser
Ser' Gly 'Gly Gly Gly Gly Gly · Gly · Gly · Gly · Gly · Gly · Ser
Ser · Gly · Gly · Gly · Gly · Gly · Gly
(Gly · Gly · Gly · Gly · Ser)n
(Ser · Gly · Gly · Gly · Gly)n
[nは 1以上の整数である]等を挙げることができる。但し、ペプチドリンカ一の長さや 配列は目的に応じて当業者が適宜選択することができる。
[0111] 好ましい sc(Fv)2の態様としては、例えば、以下の sc(Fv)2を挙げることができる。
[VH]ペプチドリンカ一 (15アミノ酸) [VL]ペプチドリンカ一 (15アミノ酸) [VH]ペプチドリ ンカー (15アミノ酸) [VL]
[0112] 合成化学物リンカ一 (ィ匕学架橋剤）は、ペプチドの架橋に通常用いられている架橋 剤、例えば N-ヒドロキシスクシンイミド（NHS)、ジスクシンイミジルスべレート（DSS)、ビ ス（スルホスクシンィミジル)スべレート（BS3)、ジチォビス（スクシンィミジルプロビオネ ート）（DSP)、ジチオピス（スルホスクシンィミジルプロピオネート）（DTSSP)、エチレン グリコールビス（スクシンイミジルスクシネート）（EGS)、エチレングリコールビス（スルホ スクシンイミジルスクシネート）（スルホー EGS)、ジスクシンィミジル酒石酸塩（DST)、 ジスルホスクシンィミジル酒石酸塩 (スルホー DST)、ビス [2- (スクシンイミドォキシカ ルポ-ルォキシ）ェチル]スルホン（BSOCOES)、ビス [2- (スルホスクシンイミドォキシ カルボ-ルォキシ）ェチル]スルホン (スルホ- BSOCOES)などであり、これらの架橋剤 は市販されている。
[0113] 4つの抗体可変領域を結合する場合には、通常、 3つのリンカ一が必要となる力 全 て同じリンカ一を用いてもょ 、し、異なるリンカ一を用いてもょ 、。
また、 sc(Fv)2における構造異性体として、例えば、 single chain diabody型と bivalent scFv型が存在する。
[0114] sc(Fv)2が、 [可変領域 1] (リンカ一 1) [可変領域 2] (リンカ一 2) [可変領域 3] (リンカ一 3) [可変領域 4]の順で並んでいる場合、本発明において bivalent scFv型とは、可変領 域 1と可変領域 2が会合し、かつ可変領域 3と可変領域 4が会合した状態の構造を有 する sc(Fv)2をいう。本発明において single chain diabody型とは可変領域 1と可変領域 4が会合し、かつ可変領域 2と可変領域 3が会合した状態の構造を有する sc(Fv)2のこ とをいう。
[0115] single chain diabody型としては例えば図 12(b)の右に記載の構造を有する sc(Fv)2 であり、 bivalent scFv型としては例えば図 12(b)の左に記載の構造を有する sc(Fv)2で ある。
[0116] sc(Fv)2が single chain diabody型または bivalent scFv型のどちらの構造を有して!/、る かは、例えば、プロテアーゼ限定分解法によって解析することが可能である。一例を 示せば、以下のような方法によって解析することができる。
[0117] sc(Fv)2のリンカ一部分を部分的かつ限定的に分解できるプロテアーゼの一種の su btilisin Aを用いて、被検 sc(Fv)2の限定分解を行う。
[0118] single chain diabody型の場合は、 VHと VLの間の相互作用により sc(Fv)2が有する 3 つのリンカ一のうち、どのリンカ一に切断が起こった場合であっても、見かけの分子量 には変化が見られない。
[0119] 一方、 bivalent scFv型の場合は、中央のリンカ一に切断が起こった際に、半分の分 子量の分子種が生成する。
[0120] 従って、反応生成物を解析することにより、 bivalent scFv型と single chain diabody型 とを判別することが可能である。
[0121] 反応生成物は、例えば、ゲルろ過クロマトグラフィー分析によって、解析することが できる。また、クロマトグラフィーを用いて、ピーク面積を基に、 sc(Fv)2に含まれる bival ent sc(Fv)2構造と single chain diabody構造の存在比を定量的に評価することも可能 である。
本発明の会合制御方法は、上記の sc(Fv)2について、所望の型、即ち、 single chain diabody型と bivalent scFv型のどちらか一方を優先的に取得したい際に、好適に利 用することができる。
[0122] より具体的には、 sc(Fv)2が VH 1 -(リンカ一) -VL 1 - (リンカ一) -VH2- (リンカ一) -VL2の 構造を有するとき、本発明の会合制御方法を用いて、 bivalent scFv型の sc(Fv)2を優 先的に取得したい場合には、例えば、 VH1と VL2、および Zまたは、 VH2と VL1の会 合を抑制させればよい。（一例を示せば、 VH1と VL2の界面を形成するアミノ酸残基 が同種の電荷となるように変異を導入する。 ) [0123] また、 single-chain diabody型の sc(Fv)2を優先的に取得した!/、場合には、例えば、 V HIと VL1、および Zまたは、 VH2と VL2の会合を阻害させればよい。（一例を示せば、 VH1と VL1の界面を形成するアミノ酸残基が同種の電荷となるように変異を導入する o )
また、 sc(Fv)2が単特異性抗体 (monospecific antibody)である場合にも、同様にして 本発明を実施することが可能である。
また、これらの技術にカ卩えて、 VHと VLの各ドメインをジスルフイド結合により架橋さ れすることも可能である（Clin Cancer Res. 1996 Feb;2(2):245- 52)。
[0124] 本発明の会合制御方法を利用することにより、例えば、活性を有する抗体もしくは ポリペプチドを効率的に作成することができる。該活性としては、例えば、結合活性、 中和活性、細胞傷害活性、ァゴニスト活性、アンタゴニスト活性、酵素活性等を挙げ ることができる。ァゴニスト活性とは、受容体などの抗原に抗体が結合することにより、 細胞内にシグナルが伝達される等して、何らかの生理的活性の変化を誘導する活性 である。生理的活性としては、例えば、増殖活性、生存活性、分化活性、転写活性、 膜輸送活性、結合活性、タンパク質分解活性、リン酸ィ匕 Z脱リン酸ィ匕活性、酸ィ匕還 元活性、転移活性、核酸分解活性、脱水活性、細胞死誘導活性、アポトーシス誘導 活性等を挙げることができるが、これらに限定されない。
[0125] また本発明の方法によって、所望の抗原を認識する、または所望の受容体と結合 する抗体もしくはポリペプチドを効率的に作成することができる。
[0126] 該抗原は特に限定されず、どのような抗原でもよい。抗原の例としては、例えば、受 容体もしくはその断片、癌抗原、 MHC抗原、分ィ匕抗原等を挙げることができるが、特 にこれらに制限されない。
[0127] また、該受容体の例としては、例えば、造血因子受容体ファミリー、サイト力イン受容 体ファミリー、チロシンキナーゼ型受容体ファミリー、セリン Zスレオニンキナーゼ型受 容体ファミリー、 TNF受容体ファミリー、 Gタンパク質共役型受容体ファミリー、 GPIアン カー型受容体ファミリー、チロシンホスファターゼ型受容体ファミリー、接着因子フアミ リー、ホルモン受容体ファミリー、等の受容体ファミリーに属する受容体などを挙げる ことができる。これら受容体ファミリーに属する受容体、及びその特徴に関しては多数 の文献が存在し、例えば、 Cooke BA., King RJB., van der Molen HJ. ed. New Comp rehesive Biochemistry V0I.I8B Hormones and their Actions Part II〃pp.l- 46 (1988)
Elsevier Science Publishers BV., New York, USAゝ Patthy L. (1990) Cell, 61: 13-14. 、 Ullrich A" et al. (1990) Cell, 61: 203— 212.、 Massagul J. (1992) Cell, 69: 1067-107 0.、 Miyajima A., et al. (1992) Annu. Rev. Immunol, 10: 295- 331.、 Taga T. and Kish imoto T. (1992) FASEB J" 7: 3387-3396.、 Fantl WL, et al. (1993) Annu. Rev. Bioc hem., 62: 453- 481.、 Smith CA" et al. (1994) Cell, 76: 959-962.、 Flower DR. (1999)
Biochim. Biophys. Acta, 1422: 207-234.、宫坂昌之監修，細胞工学別冊ハンドブッ クシリーズ「接着因子ハンドブック」 (1994) (秀潤社，東京， 日本)等が挙げられる。上 記受容体ファミリーに属する具体的な受容体としては、例えば、ヒト又はマウスエリス口 ポェチン (EPO)受容体、ヒト又はマウス顆粒球コロニー刺激因子 (G-CSF)受容体、ヒト 又はマウストロンボポイエチン (TPO)受容体、ヒト又はマウスインスリン受容体、ヒト又は マウス Flt-3リガンド受容体、ヒト又はマウス血小板由来増殖因子 (PDGF)受容体、ヒト 又はマウスインターフェロン（IFN) - α、 j8受容体、ヒト又はマウスレプチン受容体、ヒト 又はマウス成長ホルモン (GH)受容体、ヒト又はマウスインターロイキン (IL) -10受容 体、ヒト又はマウスインスリン様増殖因子 (IGF) -I受容体、ヒト又はマウス白血病抑制 因子 (LIF)受容体、ヒト又はマウス毛様体神経栄養因子 (CNTF)受容体等を例示す ることができる（hEPOR: Simon, S. et al. (1990) Blood 76, 31—35.; mEPOR: D'Andrea , AD. Et al. (1989) Cell 57, 277-285.; hG- CSFR: Fukunaga, R. et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 87, 8702— 8706.； mG— CSFR: Fukunaga, R. et al. (1990) Cell 6 1, 341-350.； hTPOR: Vigon, I. et al. (1992) 89, 5640-5644. ; mTPOR: Skoda, RC. E t al. (1993) 12, 2645-2653.; hlnsR: Ullrich, A. et al. (1985) Nature 313, 756-761. ; h Flt-3: Small, D. et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 91, 459-463.; hPDGFR: Gronwald, RGK. Et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85, 3435-3439.; hlFN a / β Κ: Uze, G. et al. (1990) Cell 60, 225— 234.及び Novick, D. et al. (1994) Cell 77,
391-400.) o
癌抗原は細胞の悪性化に伴って発現する抗原であり、腫瘍特異性抗原とも呼ばれ る。又、細胞が癌化した際に細胞表面やタンパク質分子上に現れる異常な糖鎖も癌 抗原となり、特に癌糖鎖抗原と呼ばれる。癌抗原の例としては、例えば、 CA19-9、 CA 15-3、シリアル SSEA-l(SLX)などを挙げることができる。
[0129] MHC抗原には、 MHC class I抗原と MHC class II抗原に大別され、 MHC class I抗 原には、 HLA- Α,- Β,- C，- Ε,- F，- G，- Hが含まれ、 MHC class II抗原には、 HLA- DR,- DQ，- DPが含まれる。
[0130] 分ィ匕抗原には、 CDl,CD2,CD3,CD4,CD5,CD6,CD7,CD8,CD10,CDlla,CDllb,C Dllc,CD13,CD14,CD15s,CD16,CD18,CD19,CD20,CD21,CD23,CD25,CD28,CD29 ,CD30,CD32,CD33,CD34,CD35,CD38,CD40,CD41a,CD41b,CD42a,CD42b,CD43, CD44,CD45,CD45RO,CD48,CD49a,CD49b,CD49c,CD49d,CD49e,CD49f,CD51,C D54,CD55,CD56,CD57,CD58,CD61,CD62E,CD62L,CD62P,CD64,CD69,CD71,CD 73,CD95,CD102,CD106,CD122,CD126,CDwl30などが含まれる。
[0131] また本発明は、本発明の方法によって会合が制御されたポリペプチド変異体もしく は異種多量体を提供する。即ち本発明は、本発明の会合制御方法によって取得さ れるポリペプチド、または異種多量体に関する。
[0132] 本発明の好ましい態様においては、ポリペプチド変異体であって、元のポリべプチ ド内の会合が阻害されるように、該ポリペプチド内の界面を形成するアミノ酸残基の 改変を有するポリペプチド変異体を提供する。
[0133] また本発明の別の態様においては、異種多量体であって、元のポリペプチド間の 会合が阻害されるように、該ポリペプチド間の界面を形成するアミノ酸残基の改変を 有する異種多量体を提供する。
[0134] 本発明において「元のポリペプチド」とは、本発明の方法によって会合が制御される ように改変される前の状態のポリペプチドを言う。
[0135] 本発明の上記ポリペプチド変異体の一例としては、元のポリペプチドが 2種の構造 異性体を形成し得る変異体を挙げることができる。また、上記異種多量体の一例とし ては、元のポリペプチドが 2種以上の多量体を形成し得る多量体を挙げることができ る。
[0136] また、本発明の上述の会合制御方法によって、会合が制御されたポリペプチド変異 体もしくは異種多量体もまた、本発明に含まれる。即ち、上述の会合制御方法の好ま しい態様において、会合が制御されたポリペプチドもしくは異種多量体もまた、本発 明の好まし 、態様の一つである。
[0137] また本発明は、ポリペプチドまたは多種多量体の会合が制御されたポリペプチドま たは多種多量体の製造方法を提供する。
[0138] 本発明の製造方法の好ましい態様としては、ポリペプチドの会合が制御されるよう にポリペプチド内の界面を形成するアミノ酸残基に変異を有するポリペプチドの製造 方法であって、 (a)ポリペプチド内の界面を形成するアミノ酸残基をコードする核酸を 、ポリペプチド内の会合が阻害されるように元の核酸力 改変し、（b)宿主細胞を該 核酸が発現するように培養し、（c)宿主細胞培養物力 該ポリペプチドを回収するこ とを含むポリペプチド変異体の製造方法を提供する。
[0139] また、本発明の製造方法の別の態様においては、異種多量体の会合が制御される ようにポリペプチド間の界面を形成するアミノ酸残基に変異を有する異種多量体の製 造方法であって、 (a)ポリペプチド間の界面を形成するアミノ酸残基をコードする核酸 を、ポリペプチド間の会合が阻害されるように元の核酸から改変し、（b)宿主細胞を 該核酸が発現するように培養し、（c)宿主細胞培養物から該異種多量体を回収する ことを含む異種多量体の製造方法を提供する。
[0140] また、本発明の上述の会合制御方法を利用して、ポリペプチドの会合が阻害される ように、ポリペプチド内（間）の界面を形成するアミノ酸残基をコードする核酸を、元の 核酸から改変する工程を含む方法もまた、本発明の上記製造方法の好ま 、態様の 一つである。
[0141] 本発明の上記方法において「核酸を改変する」とは、本発明における「改変」によつ て導入されるアミノ酸残基に対応するように核酸を改変することを言う。より具体的に は、元（改変前）のアミノ酸残基をコードする核酸について、改変によって導入される アミノ酸残基をコードする核酸へ改変することを言う。通常、目的のアミノ酸残基をコ ードするコドンとなるように、元の核酸に対して、少なくとも 1塩基を挿入、欠失または 置換するような遺伝子操作もしくは変異処理を行うことを意味する。即ち、元のアミノ 酸残基をコードするコドンは、改変によって導入されるアミノ酸残基をコードするコドン によって置換される。このような核酸の改変は、当業者においては公知の技術、例え ば、部位特異的変異誘発法、 PCR変異導入法等を用いて、適宜実施することが可能 である。
[0142] また、本発明における核酸は、通常、適当なベクターへ担持 (挿入)され、宿主細胞 へ導入される。該ベクターとしては、挿入した核酸を安定に保持するものであれば特 に制限されず、例えば宿主に大腸菌を用いるのであれば、クローユング用ベクターと しては pBluescriptベクター (Stratagene社製）などが好まし!/、が、市販の種々のべクタ 一を利用することができる。本発明のポリペプチドを生産する目的においてベクター を用いる場合には、特に発現ベクターが有用である。発現ベクターとしては、試験管 内、大腸菌内、培養細胞内、生物個体内でポリペプチドを発現するベクターであれ ば特に制限されないが、例えば、試験管内発現であれば pBESTベクター（プロメガ社 製）、大腸菌であれば pETベクター（Invitrogen社製）、培養細胞であれば pME18S-FL 3ベクター（GenBank Accession No. AB009864)、生物個体であれば pME18Sベクタ 一（Mol Cell Biol. 8:466- 472(1988))などが好ましい。ベクターへの本発明の DNAの 挿入は、常法により、例えば、制限酵素サイトを用いたリガーゼ反応により行うことが でさる (Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. J ohn Wiley & Sons. Section 11.4-11.11)。
[0143] 上記宿主細胞としては特に制限はなぐ 目的に応じて種々の宿主細胞が用いられ る。ポリペプチドを発現させるための細胞としては、例えば、細菌細胞 (例:ストレブトコ ッカス、スタフイロコッカス、大腸菌、ストレプトミセス、枯草菌）、真菌細胞 (例:酵母、 ァスペルギルス）、昆虫細胞（例：ドロソフイラ S2、スポドプテラ SF9)、動物細胞（例： C HO、 COS, HeLa、 C127、 3T3、 BHK、 HEK293、 Bowesメラノーマ細胞）および植物細 胞を例示することができる。宿主細胞へのベクター導入は、例えば、リン酸カルシウム 沈殿法、電気パルス穿孔法（Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel e t al. (1987) Publish. John Wiley & Sons. Section 9.1-9.9)、リポフエクタミン法（GIBC O-BRL社製）、マイクロインジェクション法などの公知の方法で行うことが可能である。
[0144] 宿主細胞において発現したポリペプチドを小胞体の内腔に、細胞周辺腔に、また は細胞外の環境に分泌させるために、適当な分泌シグナルを目的のポリペプチドに 組み込むことができる。これらのシグナルは目的のポリペプチドに対して内因性であ つても、異種シグナルであってもよい。
[0145] 上記製造方法におけるポリペプチドの回収は、本発明のポリペプチドが培地に分 泌される場合は、培地を回収する。本発明のポリペプチドが細胞内に産生される場 合は、その細胞をまず溶解し、その後にポリペプチドを回収する。
[0146] 組換え細胞培養物力も本発明のポリペプチドを回収し精製するには、硫酸アンモ -ゥムまたはエタノール沈殿、酸抽出、ァ-オンまたはカチオン交換クロマトグラフィ 一、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ァフィ- ティクロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマト グラフィーを含めた公知の方法を用いることができる。
[0147] また本発明は、本発明のポリペプチド変異体または本発明の異種多量体、および 医薬的に許容される担体を含む組成物 (薬剤）に関する。
[0148] 本発明において医薬組成物とは、通常、疾患の治療もしくは予防、あるいは検査 · 診断のための薬剤を言う。
[0149] 本発明の医薬組成物は、当業者に公知の方法で製剤化することが可能である。例 えば、水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、又は懸濁液剤 の注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、薬理学上許容される担体もしくは 媒体、具体的には、滅菌水や生理食塩水、植物油、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、 安定剤、香味剤、賦形剤、べヒクル、防腐剤、結合剤などと適宜組み合わせて、一般 に認められた製薬実施に要求される単位用量形態で混和することによって製剤化す ることが考えられる。これら製剤における有効成分量は、指示された範囲の適当な容 量が得られるように設定する。
[0150] 注射のための無菌組成物は注射用蒸留水のようなべヒクルを用いて通常の製剤実 施に従って処方することができる。
[0151] 注射用の水溶液としては、例えば生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬 (例えば D-ソルビトール、 D-マンノース、 D-マン-トール、塩化ナトリウム）を含む等張液が挙 げられる。適当な溶解補助剤、例えばアルコール (エタノール等）、ポリアルコール（ プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等）、非イオン性界面活性剤（ポリソル ペート 80 (TM)、 HCO- 50等）を併用してもよい。 [0152] 油性液としてはゴマ油、大豆油があげられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル及 び Zまたはべンジルアルコールを併用してもよい。また、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩 衝液及び酢酸ナトリウム緩衝液)、無痛化剤 (例えば、塩酸プロ力イン)、安定剤 (例え ば、ベンジルアルコール及びフエノール）、酸化防止剤と配合してもよい。調製された 注射液は通常、適当なアンプルに充填する。
[0153] 本発明の医薬組成物は、好ましくは非経口投与により投与される。例えば、注射剤 型、経鼻投与剤型、経肺投与剤型、経皮投与型の組成物とすることができる。例えば 、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射などにより全身または局部的に 投与することができる。
[0154] 投与方法は、患者の年齢、症状により適宜選択することができる。抗体または抗体 をコードするポリヌクレオチドを含有する医薬糸且成物の投与量は、例えば、一回につ き体重 lkgあたり O.OOOlmgから lOOOmgの範囲に設定することが可能である。または、 例えば、患者あたり 0.001〜100000mgの投与量とすることもできる力 本発明はこれら の数値に必ずしも制限されるものではない。投与量及び投与方法は、患者の体重、 年齢、症状などにより変動するが、当業者であればそれらの条件を考慮し適当な投 与量及び投与方法を設定することが可能である。
[0155] また、必要に応じ本発明のポリペプチドもしくは異種多量体を、その他の医薬成分 と組み合わせて製剤化することもできる。
[0156] また本発明は、本発明のポリペプチド変異体または本発明の異種多量体をコード する核酸を提供する。さらに該核酸を担持するベクターもまた、本発明に含まれる。
[0157] さらに本発明は、上記核酸を有する宿主細胞を提供する。該宿主細胞は、特に制 限されず、例えば、大腸菌や種々の動物細胞などを挙げることができる。宿主細胞は 、例えば、本発明の抗体もしくはポリペプチドの製造や発現のための産生系として使 用することができる。ポリペプチド製造のための産生系には、 in vitroおよび in vivoの 産生系がある。 in vitroの産生系としては、真核細胞を使用する産生系及び原核細胞 を使用する産生系が挙げられる。
[0158] 宿主細胞として使用できる真核細胞として、例えば、動物細胞、植物細胞、真菌細 胞が挙げられる。動物細胞としては、哺乳類細胞、例えば、 CHO (j. Exp. Med. (1995 ) 108: 945)、 COSゝ 3T3、ミエローマ、 BHK (baby hamster kidney)、 HeLa、 Vero等、両 生類細胞、例えばアフリカッメガエル卵母細胞（Valle et al.， Nature (1981) 291: 338- 340)、及び昆虫細胞、例えば、 S19、 Sf21、 Tn5が例示される。本発明の抗体の発現に おいては、 CHO-DG44, CH0-DX11B、 COS7細胞、 BHK細胞が好適に用いられる。 動物細胞において、大量発現を目的とする場合には特に CHO細胞が好ましい。宿 主細胞へのベクターの導入は、例えば、リン酸カルシウム法、 DEAEデキストラン法、 カチォニックリボソーム DOTAP (Boehringer Mannheim製）を用いた方法、エレクトロポ レーシヨン法、リポフエクシヨンなどの方法で行うことが可能である。
[0159] 植物細胞としては、例えば、ニコチアナ 'タパカム（Nicotiana tabacum)由来の細胞 が蛋白質生産系として知られており、この細胞をカルス培養する方法により本発明の 抗体を産生させることができる。真菌細胞としては、酵母、例えば、サッカロミセス (Sac charomyces) の糸田胞 (サッカロミセス ·セレビシェ (Saccharomyces cerevisiaeリ、サッ カロミセス 'ボンべ（Saccharomyces pombe)等）、及び糸状菌、例えば、ァスペルギル ス（Aspergillus)属の細胞（ァスペルギルス · -ガー（Aspergillus niger)等）を用いた蛋 白質発現系が公知であり、本発明の抗体産生の宿主として利用できる。
[0160] 原核細胞を使用する場合、細菌細胞を用いる産生系がある。細菌細胞としては、上 述の大腸菌（E. coli)に加えて、枯草菌を用いた産生系が知られており、本発明の抗 体産生に利用できる。
[0161] 本発明の宿主細胞を用いて抗体を産生する場合、本発明の抗体をコードするポリ ヌクレオチドを含む発現ベクターにより形質転換された宿主細胞の培養を行 ヽ、ポリ ヌクレオチドを発現させればよい。培養は、公知の方法に従って行うことができる。例 えば、動物細胞を宿主とした場合、培養液として、例えば、 DMEM、 MEM, RPMI1640 、 IMDMを使用することができる。その際、 FBS、牛胎児血清 (FCS)等の血清補液を 併用しても、無血清培養により細胞を培養してもよい。培養時の pHは、約 6〜8とする のが好ましい。培養は、通常、約 30〜40°Cで約 15〜200時間行い、必要に応じて培 地の交換、通気、攪拌を加える。
[0162] 一方、 in vivoでポリペプチドを産生させる系としては、例えば、動物を使用する産生 系や植物を使用する産生系が挙げられる。これらの動物又は植物に目的とするポリ ヌクレオチドを導入し、動物又は植物の体内でポリペプチドを産生させ、回収する。 本発明における「宿主」とは、これらの動物、植物を包含する。
[0163] 動物を使用する場合、哺乳類動物、昆虫を用いる産生系がある。哺乳類動物として は、ャギ、ブタ、ヒッジ、マウス、ゥシ等を用いることができる（Vicki Glaser, SPECTRU M Biotechnology Applications (1993))。また、哺乳類動物を用いる場合、トランスジェ ニック動物を用いることができる。
[0164] 例えば、本発明の抗体をコードするポリヌクレオチドを、ャギ j8カゼインのような乳汁 中に固有に産生されるポリペプチドをコードする遺伝子との融合遺伝子として調製す る。次いで、この融合遺伝子を含むポリヌクレオチド断片をャギの胚へ注入し、この胚 を雌のャギへ移植する。胚を受容したャギから生まれるトランスジエニックャギ又はそ の子孫が産生する乳汁から、目的の抗体を得ることができる。トランスジエニックャギ から産生される抗体を含む乳汁量を増加させるために、適宜ホルモンをトランスジェ ニックャギに投与してもよい（Ebert et al.， Bio/Technology (1994) 12: 699-702)。
[0165] また、本発明の抗体を産生させる昆虫としては、例えばカイコを用いることができる。
カイコを用いる場合、目的の抗体をコードするポリヌクレオチドを挿入したバキュロウィ ルスをカイコに感染させることにより、このカイコの体液から目的の抗体を得ることがで きる（Susumu et al, Nature (1985) 315: 592—4)。
[0166] さらに、植物を本発明の抗体産生に使用する場合、例えばタバコを用いることがで きる。タバコを用いる場合、目的とする抗体をコードするポリヌクレオチドを植物発現 用ベクター、例えば pMON 530に挿入し、このベクターをァグロバタテリゥム'ッメファ シエンス（Agrobacterium tumefaciens)のようなバクテリアに導入する。このバクテリア をタバコ、例えば、ニコチアナ'タパカム（Nicotiana tabacum)に感染させ、本タバコの 葉より所望の抗体を得ることができる（Ma et al., Eur. J. Immunol. (1994) 24: 131-8)
[0167] このようにして得られた抗体は、宿主細胞内または細胞外 (培地、乳汁など)から単 離し、実質的に純粋で均一な抗体として精製することができる。抗体の分離、精製は 、通常のポリペプチドの精製で使用されている分離、精製方法を使用すればよぐ何 ら限定されるものではない。例えば、クロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過 、塩析、溶媒沈殿、溶媒抽出、蒸留、免疫沈降、 SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳 動、等電点電気泳動法、透析、再結晶等を適宜選択、組み合わせて抗体を分離、精 製することができる。
[0168] クロマトグラフィーとしては、例えばァフィ二ティクロマトグラフィー、イオン交換クロマ トグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過、逆相クロマトグラフィー、吸着クロ マトグフフィ ~~等; Ο2» げりれる (Strategies for Protein Purincation ana Charactenzatio n: A Laboratory Course Manual. Ed Daniel R. Marshak et al.(199b Cold Spring Har bor Laboratory Press)。これらのクロマトグラフィーは、液相クロマトグラフィー、例え ば HPLC、 FPLC等の液相クロマトグラフィーを用いて行うことができる。ァフィ-テイク 口マトグラフィ一に用いるカラムとしては、プロテイン Aカラム、プロテイン Gカラムが挙 げられる。例えば、プロテイン Aを用いたカラムとして、 Hyper D, POROS, Sepharose F. F. (Pharmacia製)等が挙げられる。
[0169] 必要に応じ、抗体の精製前又は精製後に適当なタンパク質修飾酵素を作用させる ことにより、任意に修飾を加えたり部分的にペプチドを除去することもできる。タンパク 質修飾酵素としては、例えば、トリプシン、キモトリブシン、リシルエンドべプチダーゼ 、プロテインキナーゼ、ダルコシダーゼなどが用いられる。
[0170] 上述のように本発明の宿主細胞を培養し、該細胞培養物力 ポリペプチドを回収す る工程を含む、本発明のポリペプチド変異体もしくは異種多量体の製造方法もまた、 本発明の好ま 、態様の一つである。
なお本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に 組み入れられる。
実施例
[0171] 以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に制限 されるものではない。
[0172] 〔実施例 1〕 Factor IXa (F. IXa)に対する非中和抗体の作製
1-1.免疫およびハイプリドーマ作製
BALB/cマウス（雄、免疫開始時 6週齢、 日本チヤ一ルス'リバ一） 8匹および MRL/lp rマウス（雄、免疫開始時 6週齢、 日本チヤ一ルス'リバ一） 5匹に、 Factor IXa jS (Enzy me Research Laboratories, Inc. )を以下の通り免疫した。初回免疫として FCA (フロイ ント完全アジュバント H37 Ra (Difco laboratories) )でェマルジヨン化した Factor IXa jS を 40 g/head皮下投与した。 2週間後に FIA (フロイント不完全アジュバント（Difco lab oratories) )でェマルジヨン化した Factor IXa βを 40 μ g/head皮下投与した。以後 1週 間間隔で追加免疫を 3〜7回行った。 Factor \ΧΆ βに対する血清抗体価の上昇を 1-2 に示した ELISA (Enzyme linked immunosorbent assay)で確認後、最終免疫として PB S(-)(カルシウムイオン、マグネシウムイオンを含まない phosphate buffered saline)に希 釈した Factor IXa を 40 g/head静脈内投与した。最終免疫の 3日後、マウスの脾臓 細胞とマウスミエローマ細胞 P3X63Ag8U. 1 (P3U1と称す、 ATCC CRL- 1597)を、 PE G1500 (ロシュ'ダイァグノスティックス）を用いた常法に従 、細胞融合した。 10%FBS(In vitrogen)を含む RPMI1640培地（Invitrogen) (以下、 10%FBS/RPMI1640と称す)に懸濁 した融合細胞を 96 well culture plateに播種し、融合 1 , 2, 3, 5日後に HAT選択培地（ 10%FBS/RPMI1640 / 2%HAT 50x concentrate (大日本製薬）/ 5% BM- Condimed HI (ロシュ'ダイァグノスティックス） )への置換を行うことにより、ハイプリドーマの選択培 養を行った。融合後 8日目または 9日目に採取した培養上清を用いて、 1-2に示した E LISAにより Factor IXaに対する結合活性を測定することにより、 Factor IXa結合活性 を有するハイプリドーマを選択した。続いて 5-3に示した方法で Factor IXaの酵素活 性に対する中和活性を測定し、 Factor IXaに対する中和活性を有さないハイプリドー マを選択した。ハイプリドーマは、 96 well culture plateに 1 wellあたり 1個の細胞を播 種することによる限界希釈を 2回行ってクローンィ匕し、抗 Factor IXa抗体を産生するハ イブリドーマ XB12を榭立した。
1-2. Factor IXa ELISA
し oating buffer (lOOmM sodium bicarbonate, pH 9·。, 0.02% soaium aziae)で 1 μ g/m Lに希釈した Factor IXa j8を、 Nunc— Immuno plate (Nunc— Immuno 96 Micro Well p lates MaxiSorp™(Nalge Nunc International) )に 100 μ L/wellで分注後、 4°Cでー晚ィ ンキュベーシヨンした。 Tween(R) 20を含む PBS (-)で 3回洗浄後、 diluent buffer (50mM Tris-HCl, pH8.1 , 1% bovine serum albumin, ImM MgCl , 0.15M NaCl, 0.05% Tween(
2
R) 20, 0.02% sodium azide)で plateを室温で 2時間 blockingした。 Bufferを除去後、 plate に diluent bufferで希釈したマウスの抗血清またはハイブリドーマの培養上清を 100 μ L/well添カ卩し、室温で 1時間インキュベーションした。 Plateを 3回洗浄後、 diluent buffe rで 1/2000希釈したアルカリホスファターゼ標識ャギ抗マウス IgG (H+L) (Zymed Labor atories)を 100 /z L/well添カ卩し、室温で 1時間インキュベーションした。 Plateを 6回洗浄 後、発色 質 Blue- Phos Phosphate Substrate (Kirkegaad & Perry Laboratoriesノ 100 μ L/well添カ卩し、室温で 20分インキュベーションした。 Blue- Phos™ Stop Solution (Kirkegaad & Perry Laboratories)を 100 μ L/well添カ卩した後、 595nmにおける吸光度 を Microplate Reader Model 3550 (Bio— Rad Laboratories)で測定した。
[0174] 1-3. Factor IXa中和活性測定
Phospholipid (Sigma-Aldrich)を注射用蒸留水で溶解し、超音波処理を施すこと〖こ より、 400 g/mLの phospholipid溶液を調製した。 0.1%ゥシ血清アルブミンを含むトリス 緩衝生理食塩液（以下、 TBSB O /z Lと 30ng/mL Factor IXa jS (Enzyme Research La boratories) 10 μ Lと 400 μ g/mL phospholipid溶液 5 Lと 100 mM CaCl
2、 20 mM MgCl を含む TBSB 5 μ Lとハイブリドーマ培養上清 10 μ Lを 96穴プレート中で混和し、室温
2
で 1時間インキュベーションした。この混合溶液に、 50 μ g/mL Factor X (Enzyme Res earch Laboratories) 20 μ Lおよび 3U/mL Factor Villa (Amrican diagnostica) 10 μ Lを 加え、室温で 30分間反応させた。これに 10 /z Lの 0.5M EDTAを添加することにより反 応を停止させた。この反応溶液に、 Lの S-2222溶液（Chromogenix)を添カ卩し、室 温で 30分間インキュベーションした後、測定波長 405nm、対照波長 655nmにおける吸 光度を Microplate Reader Model 3550 (Bio- Rad Laboratories, Inc. )により測定した。
[0175] 〔実施例 2〕 Factor X (F. X)に対する非中和抗体の作製
2-1.免疫およびハイプリドーマ作製
BALB/cマウス（雄、免疫開始時 6週齢、 日本チヤ一ルス'リバ一） 8匹および MRL/lp rマウス（雄、免疫開始時 6週齢、 日本チヤ一ルス'リバ一） 5匹に、 Factor X (Enzyme R esearch Laboratories)を以下の通り免疫した。初回免疫として FC Aでェマルジヨン化 した Factor Xを 40 μ g/head皮下投与した。 2週間後に FIAでェマルジヨン化した Facto r Xを 20または 40 g/head皮下投与した。以後 1週間間隔で追加免疫を合計 3〜6回 行った。 Factor Xに対する血清抗体価の上昇を 2_2に示した ELISAで確認後、最終 免疫として PBS (-)に希釈した Factor Xを 20または 40 g/head静脈内投与した。最終 免疫の 3日後、マウスの脾臓細胞とマウスミエローマ細胞 P3U1を、 PEG1500を用いた 常法に従い細胞融合した。 10%FBS/RPMI1640培地に懸濁した融合細胞を 96 well cu lture plateに播種し、融合 1, 2, 3, 5日後に HAT選択培地への置換を行うことにより、 ノ、イブリドーマの選択培養を行った。融合後 8日目に採取した培養上清を用いて 2- 2 に示した ELISAにより Factor Xに対する結合活性を測定した。 Factor X結合活性を有 するハイプリドーマを選択し、 2-3に示した方法で Factor Xaの酵素活性に対する中 和活性を測定した。 Factor Xaに対する中和活性を有さないハイプリドーマを、限界 希釈を 2回行うことによりクローン化し、抗 Factor X抗体を産生するハイブリドーマ SB0 4を榭立した。
[0176] 2-2. Factor X ELISA
Coating bufferで 1 μ g/mLに希釈し 7こ Factor Xを、 Nunc— Immuno plateに 100 μ L/we 11で分注後、 4°Cでー晚インキュベーションした。 Tween(R) 20を含む PBS (-)で 3回洗浄 後、 diluent bufferで plateを室温で 2時間 blockingした。 Bufferを除去後、 plateに diluent bufferで希釈したマウスの抗血清またはハイブリドーマの培養上清を添カ卩し、室温で 1時間インキュベーションした。 Plateを 3回洗浄後、 diluent bufferで 1/2000希釈したァ ルカリホスファターゼ標識ャギ抗マウス IgG (H+L)を添カ卩し、室温で 1時間インキュべ ーシヨンした。 Plateを 6回洗浄後、発色基質 Blue- Phos™ Phosphate Substrate (Kirkeg aad & Perry Laboratories)を 100 μ L/well添カ卩し、室温で 20分インキュベーションした 。 Blue- Phos Stop Solution (Kirkegaad & Perry Laboratories)を 100 μ L/well添加し た後、 595nmにおける吸光度を Microplate Reader Model 3550 (Bio- Rad Laboratories )で測定した。
[0177] 2- 3. Factor Xa中和活性測定
TBSBで 1/5希釈したハイプリドーマ培養上清 10 μ Lと 40 μ Lの 250 pg/mL Factor Xa (Enzyme Research Laboratories)を含む TBCP (2.78 mM CaCl 、 22.2 μ Mリン脂質（
2
フォスファチジルコリン：フォスファチジルセリン = 75： 25、 Sigma-Aldrich)を含む TBSB )を混和し、室温で 1時間インキュベーションした。この混合溶液に、 20 g/mLプロトロ ンビン（Enzyme Research Laboratories)および 100 ng/mL活性化凝固第 V因子（Fact or Va (Haematologic Technologies) )を含む TBCPを 50 μ L添カ卩して室温で 10分間反 応させた。 0.5 M EDTAを 10 L添加することにより反応を停止させた。この反応溶液 に、 1 mM S- 2238溶液（Chromogenix)を 50 /z L添カ卩し、室温で 30分間インキュベーシ ヨンした後、 405 nmにおける吸光度を Microplate Reader Model 3550 (Bio- Rad Labor atories)で測定した。
[0178] 〔実施例 3〕 キメラ二重特異性抗体発現ベクターの構築
3-1. ノ、イブリドーマからの抗体可変領域をコードする DNA断片の調製
抗 F. IXa抗体を産生するハイブリドーマ XB12あるいは抗 F. X抗体を産生するハイ ブリドーマ SB04から、 QIAGEN(R) RNeasy(R) Mini Kit (QIAGEN)を用いて説明書記載 の方法に従い全 RNAを抽出した。全 RNAを 40 Lの滅菌水に溶解した。精製された R ΝΑ1〜2 μ gを铸型に、 Superscript cDNA合成システム（Invitrogen)を用いて説明書 記載の方法に従い RT-PCR法により一本鎖 cDNAを合成した。
[0179] 3-2. 抗体 H鎖可変領域の PCRによる増幅と配列解析
マウス抗体 H鎖可変領域 (VH) cDNAの増幅用プライマーとして、 Krebberらの報告（ J. Immunol. Methods 1997;201 :35-55)に記載の HBプライマー混合物、および HF プライマー混合物を用意した。各 0.5 Lの 100 M HBプライマー混合物および 100 μ M HFプライマー混合物を用いて、反応液 25 μ L (3-1で調製した cDNA溶液 2.5 μ 1 、 KOD plus buffer (東洋紡績）、 0.2mM dNTPs, 1.5mM MgCl , 0.75 units DNA polym
2
erase KOD plus (東洋紡績））を調製した。 PCRは、サーマルサイクラ一 GeneAmp PC R system 9700 (Parkin Elmer)を用いて、 cDNA断片の増幅の効率性に応じて、条件 A (98°Cで 3分間加熱後、 98°C 20秒、 58°C 20秒、 72°C 30秒力 なる反応を 1サイクル として 32サイクル）ないし条件 B (94°Cで 3分間加熱後、 94°C 20秒、 46°C 20秒、 68°C 30秒からなる反応を 1サイクルとして 5サイクル、さらに 94°C 20秒、 58°C 20秒、 72°C 30 秒カゝらなる反応を 1サイクルとして 30サイクル）のいずれかの条件で行った。 PCR後、 反応液を 1%ァガローズゲル電気泳動に供した。 目的のサイズ (約 400bp)の増幅断片 を QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN)を用い、添付説明書記載の方法で精製し 、滅菌水 30 μ 1で溶出した。各 DNA断片の塩基配列は、 BigDye Terminator Cycle Se quencing Kit (Applied Biosystems)を用い、 DNAシークェンサ一 ABI PRISM 3100 Ge netic Analyzer (Applied Biosystems)にて、添付説明書記載の方法に従い決定した。 本方法により決定した配列群を解析ソフト GENETYX- SV/RC Version 6. 1 (Genetyx) にて比較解析し、異なる配列を有するものを選択した。
[0180] 3-3.クローユング用抗体可変領域 DNA断片の調製
クローニング用制限酵素 Sfi I切断サイトを抗体可変領域増幅断片の両末端へ付カロ するために、以下の操作を行った。
Sfi I切断部位付加 VH断片（Sfi I-VH)増幅のために、プライマー HBの（Gly4Ser)2- リンカ一配列を Sfi I切断部位を有するに示す配列へ変更したもの（プライマー VH-5 ' end)を用意した。各 0.5 μ 1の 10 μ Μ配列特異的プライマー VH- 5， endおよび 10 μ Μプライマー scfor (J. Immunol. Methods 1997; 201: 35- 55)を用いて、反応液 20 L (3- 2で調製した精製 VH cDNA増幅断片溶液 1 μ 1, KOD plus buffer (東洋紡績） 、 0.2mM dNTPs, 1.5mM MgCl , 0.5 units DNA polymerase KOD plus (東洋紡績））を
2
調製した。 PCRは、サーマルサイクラ一 GeneAmp PCR system 9700 (Parkin Elmer)を 用いて、断片の増幅の効率性に従い、条件 A (98°Cで 3分間加熱後、 98°C 20秒、 58 °C 20秒、 72°C 30秒からなる反応を 1サイクルとして 32サイクル）ないし条件 B (94°Cで 3分間加熱後、 94°C 20秒、 46°C 20秒、 68°C 30秒力 なる反応を 1サイクルとして 5サ イタル、さらに 94°C 20秒、 58°C 20秒、 72°C 30秒からなる反応を 1サイクルとして 30サ イタル）のいずれかの条件で行った。 PCR後、反応液を 1%ァガローズゲル電気泳動 に供した。 目的のサイズ (約 400bp)の増幅断片を QIAquick Gel Extraction Kit (QIAG EN)にて添付説明書記載の方法で精製し、滅菌水 30 Lで溶出した。
[0181] マウス抗体 L鎖可変領域 (VL) cDNA断片増幅のために、まず Krebberらの報告 (J. I mmunol. Methods 1997; 201: 35- 55)記載の各 0.5 μ Lの 100 μ M LBプライマー混合 物および 100 M LFプライマー混合物を用いて、反応液 25 L (3-lで調製した c- DNA溶液2.5 μ L, KOD plus buffer (東洋紡績）、 0.2mM dNTPs, 1.5mM MgCl , 0.75
2 units DNA polymerase KOD plus (東洋紡績））を調製した。 PCRは、サーマルサイクラ 一 GeneAmp PCR system 9700 (Parkin Elmer)を用いて、断片の増幅の効率性に従 い、 94°Cで 3分間加熱後、 94°C 20秒、 46°C 20秒、 68°C 30秒力 なる反応を 1サイク ルとして 5サイクル、さらに 94°C 20秒、 58°C 20秒、 72°C 30秒からなる反応を 1サイクル として 30サイクルの条件で行った。 PCR後、反応液を 1%ァガローズゲル電気泳動に 供した。 目的のサイズ (約 400bp)の増幅断片を QIAqucick Gel Extractio Kit (QIAGE N)にて添付説明書記載の方法で精製し、滅菌水 30 Lで溶出した。該断片はその C 末端にプライマー LF由来の（Gly4Ser)3-リンカ一配列が付加された状態にある。該 断片 C末端へ Sfi I切断部位を付加する目的で、プライマー LFの（Gly4Ser)3-リンカ一 配列を Sfi I切断部位を有するに示す配列へ変更したもの（プライマー VL-3' end)を 用意した。 Sfi I切断部位付加 VL断片 (Sfi I-VL)増幅のために、各 0.5 Lの 10 M V L- 3 ' endプライマー混合物および 10 M scbackプライマーを用いて、反応液 20 L (精製 VL cDNA増幅断片溶液 1 μ L, KOD plus buffer (東洋紡績）、 0.2mM dNTPs, 1. 5mM MgCl , 0.5 units DNA polymerase KOD plus (東洋紡績））を調製した。 PCRは、
2
サーマルサイクラ一 GeneAmp PCR system 9700 (Parkin Elmer)を用いて、 94°Cで 3分 間加熱後、 94°C 20秒、 46°C 20秒、 68°C 30秒力 なる反応を 1サイクルとして 5サイク ル、さらに 94°C 20秒、 58°C 20秒、 72°C 30秒からなる反応を 1サイクルとして 30サイク ルの条件で行った。 PCR後、反応液を 1%ァガローズゲル電気泳動に供した。 目的の サイズ (約 400bp)の増幅断片を QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN)を用い、添付 説明書記載の方法で精製し、滅菌水 30 Lで溶出した。
[0182] 精製 Sfi I-VHおよび Sfi I-VL断片は Sfi I (タカラノィォ）にて添付説明書記載の方法 に従い反応液を調製し、 50°Cで一晩消化を行った。その後、反応液を QIAquick PCR Purification Kit (QIAGEN)を用いて添付説明書記載の方法で精製し、該キット添付 の Buffer EB 30 μしで溶出した。
[0183] 3-4.ヒ HgG4-マウスキメラ二重特異性 IgG抗体発現用プラスミド
目的の二重特異性 IgG抗体を産生する際に、各 H鎖のへテロ分子を形成させるた めに IgGlの knobs-into-holes技術（非特許文献 3)を参考に IgG4の CH3部分へのアミ ノ酸置換体を作製した。タイプ a (IgG4 y a)は Y349C、 T366W置換体であり、タイプ b (I gG4 y b)は E356C、 T366S、 L368A、 Y407Vの置換体である。さらに、両置換体のヒン ジ領域にも置換 (-ppcpScp- - > -ppcpPcp-)を導入した。本技術により、殆どへテロ 体となり得る力 L鎖についてはその限りでなぐ不必要な抗体分子の生成がその後 の活性測定へ影響を及ぼしかねない。そのため、本方策では各特異性を有する抗 体分子片腕 (HL分子と称する）を別々に発現させ細胞内で目的型二重特異性 IgG抗 体を効率的に作らせる為に各 HL分子に対応する発現ベクターとして異なる薬剤で誘 導が力かるものを用いた。
[0184] 抗体分子片腕 (便宜上右腕 HL分子と称する）の発現用として、テトラサイクリン誘導 型ベクター pcDNA4 (Invitrogen)へ H鎖ないし L鎖それぞれの該領域、すなわち動物 細胞用シグナル配列（IL3ss) (Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1984; 81 : 1075)の下 流に適当なマウス抗体可変領域 (VHな 、し VL)とヒト IgG4 y a定常領域 (配列番号： 9 )な！、し κ定常領域（配列番号： 10)を組み込んだもの（pcDNA4- g4Hな!、し pcDNA4 - g4L)を作製した。まず、 pcDNA4をそのマルチクローユングサイトに存在する制限酵 素切断サイト Eco RVおよび Not I (タカラバイオ)で消化した。適当な抗体可変領域を 有するキメラ二重特異性抗体右腕 H鎖な ヽし L鎖発現ユニット (それぞれ約 1.6kbな ヽ し約 l .Okb)を Xho 1 (タカラバイオ）で消化した後に、 QIAquick PCR Purification Kit ( QIAGEN)にて添付説明書記載の方法で精製し、 DNA polymerase KOD (東洋紡績） を用いて添付説明書記載の反応液組成にて 72°C10分間反応させ、末端を平滑化し た。該平滑化末端断片を QIAquick PCR Purification Kit (QIAGEN)にて添付説明書 記載の方法で精製し、 Not 1 (タカラバイオ)で消化した。該 Notト blunt断片 (それぞれ 約 1.6kbないし l .Okb)と該 Eco RV-Not Iで消化した pcDNA4を、 Ligation High (東洋紡 績)を用いて添付説明書記載の方法に従い連結反応を行った。該反応液により大腸 菌 DH5 a株（Competent high DH5 a (東洋紡績） )を形質転換した。得られたアンピ シリン而性クローンより QIAprep Spin Miniprep Kit (QIAGEN)を用いて各々プラスミド DNAを単離した。
[0185] もう一方の片腕 (便宜上左腕 HL分子と称する）はエタダイソン類似体誘導型べクタ 一 pIND (Invitrogen)へ H鎖ないし L鎖それぞれの該領域、すなわち動物細胞用シグ ナル配列（IL3ss) (EMBO . J. 1987; 6: 2939)の下流に適当なマウス抗体可変領域（ VHな 、し VL)とヒト IgG4 y b定常領域 (配列番号： 11)ないし κ定常領域を組み込ん だもの（pIND- g4Hないし pIND- g4L)を前述の方法に則り作製し、各々のプラスミド D NAを単離した。
[0186] 3-5.二重特異性抗体発現ベクター構築 3- 4で調製されたテトラサイクリン誘導型発現プラスミド (PCDNA4- g4Hな 、し pcDNA 4-g4L)を Sfi Iで消化し、反応液を 1%ァガローズゲル電気泳動に供した。もともと有し て 、た抗体可変領域部分 (VHな!、し VL)が除かれた断片（約 5kb)を QIAquick Gel E xtraction Kit (QIAGEN)を用い、添付説明書記載の方法で精製し、滅菌水 30 しで 溶出した。該断片と、それぞれに対応する 3-3で調製された Sfi I消化抗 F. IXa抗体 X B12由来 Sfi I- VHないし Sfi I- VL断片を Quick Ligation Kit (New England Biolabs)を 用いて添付説明書記載の方法に従い連結反応を行った。該反応液により大腸菌 DH 5 α株（Competent high DH5 a (東洋紡績））を形質転換した。また、 3- 4で調製され た Sfi I消化エタダイソン類似体誘導型発現プラスミド (pIND- g4Hな!、し pIND- g4L)か ら、上述と同様の手法で抗体可変領域部分 (VHないし VL)を除いた断片と、それぞ れに対応する 3-3で調製された Sfi I消化抗 F. X抗体 SB04由来 Sfi I-VHないし Sfi I-V L断片を、同様の手法にて組込んだ。
[0187] 各 DNA断片の塩基配列は、 BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit (Applied Bio systems)を用い、 DNAシークェンサ一 ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer (Applied Bi ◦systems)にて添付説明書記載の方法に従い決定した。本方法により決定した配列 群を解析ソフト GENETYX- SV/RC Version 6. 1 (Genetyx)にて解析した。
[0188] 該目的クローンから、 QIAprep Spin Miniprep Kit (QIAGEN)を用いて各々プラスミド DNAを単離し、 100 Lの滅菌水へ溶解した。抗 F. IXa抗体キメラ H鎖発現ベクター、 抗 F. IXa抗体キメラ L鎖発現ベクター、抗 F. X抗体キメラ H鎖発現ベクター、そして抗 F. X抗体キメラ L鎖発現ベクターを、それぞれ pcDNA4- g4 XB12H、 pcDNA4-g4 XB1 2L、 pIND-g4 SB04Hそして pIND- g4 SB04Lと名付けた。
[0189] 〔実施例 4〕 キメラ二重特異性抗体の作製
4-1. DNA溶液の調製
抗体右腕 HL分子発現用ベクター（pcDNA4-g4 XB12Hそして pcDNA4-g4 XB12L) はテトラサイクリンにより発現誘導がかかる。テトラサイクリンが存在しな 、状況下で発 現を完全に抑制する為に Tetリプレッサーをコードするプラスミド pcDNA6/TR (Invitro gen)が要求される。また、抗体左腕 HL分子発現用ベクター（pIND- g4 SB04Hそして p IND-g4 SB04L)は昆虫ホルモンであるエタダイソン類似体（ポナステロン A)により発 現誘導がかかる。このとき、ボナステロン Aと反応し誘導を行うエタダイソンレセプター とレチノイド Xレセプターをコードするプラスミド pVgRXR (Invitrogen)が要求される。従 つて、動物細胞のトランスフエクシヨンの為に計 6種類のプラスミド DNA混液を調製し た。細胞培養液 10mLの為に、 pcDNA4- g4 XB12H, pcDNA4-g4 XB12L, pIND- g4 S B04Hそして pIND- g4 SB04Lを各 3 μ g、 pcDNA6/TRそして pVgRXRを各 18 μ g用いた
[0190] 4-2. 動物細胞のトランスフ クシヨン
ヒト胎児腎癌細胞由来 HEK293H株（Invitrogen)を 10%FCS (MOREGATE)を含む D MEM培地 (Invitrogen)へ懸濁し、 5 X 105個/ mLの細胞密度で接着細胞用ディッシュ（ 直径 10cm, CORNING)の各ディッシュへ 10mLずつ蒔きこみ COインキュベーター（37
2
°C、 5% CO )内で一昼夜培養した。 4-1で調製したプラスミド DNA混液をトランスフエ
2
クシヨン試薬、 Lipofectamine 2000 (Invitrogen) 75.8 Lと Opti— MEM I培地（Invitrogen ) 2708 Lの混液へカ卩えて室温 20分間静置したものを各 wellの細胞へ投入し、 4〜5 時間、 COインキュベーター（37°Cにて 5% CO )内でインキュベートした。
2 2
[0191] 4-3. 二重特異性 IgG抗体の発現誘導
前項のようにトランスフエクシヨンした細胞培養液力も培地を吸引除去し、 1 μ g/mL のテトラサイクリン（和光純薬工業）を含む 10mL CHO-S-SFM-II (Invitrogen)培地を 投入し、 COインキュベーター（37°C、 5% CO )内で 1日培養して、抗体右腕 HL分子
2 2
の第一次発現誘導を行った。その後、培地を吸引除去し、ー且 10 mL CHO-S-SFM -II培地にて洗浄した後、 5 μ Μのポナステロン A (Invitrogen)を含む 10 mL CHO-S-S FM-II培地を投入し、 COインキュベーター (37°C、 5% CO )内で 3日間培養して、抗
2 2
体左腕 HL分子の第二次発現誘導を行い培地中へ二重特異性 IgG抗体を分泌させ た。培養上清を回収した後、遠心分離 (約 2000g、 5分間、室温)して細胞を除去し、さ らに 0.22 μ mフィルター MILLEX(R)-GV(Millipore)を通して滅菌した。該サンプルは使 用するまで 4°Cで保存した。
[0192] 4-4.抗体精製
実施例 4 3に記載の方法で得られた 10mLの培養上清に 100 μ Lの rProtein A Sep harose™ Fast Flow (Amersham Biosciences)を添カ卩し、 4°Cで 4時間以上転倒混和し た。その溶液を 0.22 μ mのフィルターカップ Ultrafree(R)- MC (Millipore)に移し、 0.01% Tween(R) 20を含む TBS 500 μ Lにて 3回洗浄後、 rProtein A Sepharose™榭脂を 100 μ しの 0.01% Tween(R) 20を含む 10 mM HC1, pH2.0に懸濁して 2分間静置したのち、抗 体を溶出させた。直ちに、 5 μ Lの 1M Tris-HCl , pH8.0をカ卩えて中和した。
[0193] 4-5.ヒ HgG濃度の定量
Goat anti-human Igu (Biosource International)を coating bufferに "t l μ g/mLに 製し、 Nunc-Immuno plate(Nunc)に固相化した。 Diluent buffer (D. B. )にてブロッキ ング処理した後、 D. B.を用いて適当に希釈した培養上清サンプルを添加した。また 、抗体濃度算出のためのスタンダードとして、 2000 ng/mLから 3倍系列で D. B.にて 1 1段階希釈したヒ HgG4 (ヒト型化抗 TF抗体、 WO 99/51743参照）を同様に添加した。 3回洗 し 7この 、 uoat anti-human Igu, alkaline phosphatase (Biosource Internatio nal)を反応させた。 5回洗净したのち、 Sigma 104(R) phosphatase substrate (Sigma- Aid rich)を基質として発色させ、吸光度リーダー Model 3550 (Bio- Rad Laboratories)によ り、参照波長 655nmとして 405nmの吸光度を測定した。 Microplate Manager III (Bio- R ad Laboretories)ソフトウェアを用いて、スタンダードの検量線から培養上清中のヒト Ig G濃度を算出した。
[0194] 〔実施例 5〕 血漿凝固アツセィ
血友病 A血液の凝固能を二重特異性抗体が是正するか明らかにするために、 Fact or VIII欠乏血漿を用いた活性ィ匕部分トロンボプラスチン時間 (APTT)に対する同抗 体の影響を検討した。様々な濃度の抗体溶液 50 μ Factor VIII欠乏血漿 (Biomeri eux) 50 μ L及び APTT試薬（Dade Behring) 50 μ Lの混合液を 37°Cで 3分間加温した。 凝固反応は 20 mMの CaCl (Dade Behring) 50 Lを同混合液に加えることにより開始
2
させた。 CR-A (Amelung)が接続された KClOA (Amelung)により凝固するまでの時間 を測定した。
[0195] Factor VIII欠乏血漿の凝固時間を 0%、正常血漿の凝固時間を 100%としたときに作 製される検量線を用いて、二重特異性抗体を添加した際の凝固時間から二重特異 性抗体の Factor VIII様活性 (%)を算出した。
[0196] 〔実施例 6〕二重特異性抗体のヒトイ匕 血液凝固時間の短縮効果が最も高かった抗 FactorlXa抗体 XB12および抗 FactorX 抗体 SB04について、以下のようにヒト化を実施した。
6 - 1.ヒト抗体の相同性検索
——般公開されている Kabat Database (ftp://ftp. ebi. ac. uk/ pub/ aatabases/kaoat/) および IMGT Database (http：〃 imgt. cines. fr/)よりヒト抗体アミノ酸配列データを入 手し、構築した Databaseを用いてマウス XB12-H鎖可変領域、マウス XB12- L鎖可変 領域、マウス SB04-H鎖可変領域、マウス SB04-L鎖可変領域に分けてホモロジー検 索を行った。その結果、以下に示すヒト抗体配列と高い相同性を持つことが確認され たことからヒト化抗体のフレームワーク領域 (以下、 FR)に使用することにした。
(1) XB12- H鎖可変領域： KABATID- 020619 (Kabat Database)
(Marietteら、 Arthritis Rheum. 1993 ; 36 : 1315- 1324)
(2) XB12- L鎖可変領域： EMBL Accession No. X61642(IMGT Database)
(Markら、 J Mol Biol. 1991； 222： 581—597. )
(3) SB04-H鎖可変領域： KABATID- 025255 (Kabat Database)
(Demaisonら、 Immunogetetics 1995 ;42 : 342-352)
(4) SB04- L鎖可変領域： EMBL Accession No. AB064111 (IMGT Database)
(Unpublished data)
(l)-(4)のヒト抗体の FRに各マウス抗体の相補性抗原決定領域 (以下、 CDR)を移植し たヒト化抗体を作製した。
[0197] また、 NCBIより一般公開されている相同性検索 Web site (http：〃 www. ncbi. nlm. nih. gov/BLAST/)を使用して、（1)-(4)のヒト抗体に相同性の高いヒト抗体の分泌シグ ナル配列を検索した。検索により得られた以下に示す分泌シグナル配列を使用した
(1) XB12- H鎖可変領域： GenBank Accession No. AF062120
(2) XB12- L鎖可変領域： GenBank Accession No. M74019
(3) SB04- H鎖可変領域： GenBank Accession No. BC019337
(4) SB04- L鎖可変領域： GenBank Accession No. AY204756
[0198] 6 - 2.ヒト化抗体遺伝子発現ベクターの構築 分泌シグナル配列から抗体可変領域にいたるアミノ酸配列をコードする塩基配列 において、 50base程度の合成オリゴ DNAを 3，末端が約 20base程度ァニールするよう に交互に 12本作製した。さらに、抗体可変領域遺伝子の 5'末端にァニールし、 Xhol 切断配列を有するプライマーと抗体可変領域遺伝子の 3，末端にァ-—ルし、 Sfil切 断配列を有するプライマーを作製した。
[0199] 2.5 μ Μに調製した合成オリゴ DNAを各 1 μ Lで混合し、 lx TaKaRa Ex Taq Buffer, 0 .4mM dNTPs, 0.5units TaKaRa Ex Taq (全て宝酒造)を加え、反応液 48 μ Lになるよう に調製した。 94°C 5分保温した後に、 94°C 2分、 55°C 2分、 72°C 2分からなる反応を 2 サイクル行い、各合成オリゴ DNAのアッセンブルおよび伸長反応を実施した。次に、 抗体遺伝子の 5，末端および 3，末端にァ-—ルするプライマー (各 10 M)を 1 μ L添 加し、 94°C 30秒、 55°C 30秒、 72°C 1分力 なる反応を 35サイクル行い、 72°C 5分反 応させ、抗体可変領域遺伝子を増幅した。 PCR後、反応液全量を 1%ァガローズゲル 電気泳動に供した。 目的のサイズ (約 400bp)の増幅断片を QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN)を用いて、添付説明書記載の方法で精製し、滅菌水 30 1で溶出した 。該断片を pGEM- T Easy Vector Systems (Promega)を用いて、添付説明書記載の 方法でクローユングを行った。各 DNA断片の塩基配列は、 BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems)を用い、 DNAシークェンサ一 ABI PRISM 3700 DNA Sequencer (Applied Biosystems)にて、添付説明書記載の方法に従い決定した
[0200] 正しいヒトイ匕抗体可変領域遺伝子配列であることが確認されたプラスミドを EcoRIお よび Sfilで消化した後に、反応液を 1%ァガローズゲル電気泳動に供した。 目的のサイ ズ（約 400bp)の DNA断片を QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN)を用いて、添付 説明書記載の方法で精製し、滅菌水 30 1で溶出した。また、実施例 3— 3で作製し たテトラサイクリン誘導型発現プラスミド (pcDNA4-g4H、 pcDNA4-g4L)およびェグダ ィソン類似体誘導型発現プラスミド（pIND- g4H、 PIND-g4L)を EcoRIおよび Sfilで消化 した後に、抗体定常領域を含む断片（約 5kb)を QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGE N)を用いて、添付説明書記載の方法で精製し、滅菌水 30 1で溶出した。 EcoRIおよ び Sfilで消化したヒト化 XB12抗体遺伝子断片 (H鎖可変領域または L鎖可変領域)と Ec oRIおよび Sfilで消化したテトラサイクリン誘導型発現プラスミド（pcDNA4- g4H、 pcDNA 4-g4L)を Rapid DNA Ligation Kit (Roche Diagnostics)を用いて添付説明書記載の方 法で連結反応を行った。また、 EcoRIおよび Sfilで消化したヒト化 SB04抗体遺伝子断 片 (H鎖可変領域または L鎖可変領域)と EcoRIおよび Sfilで消化したエダダイソン類似 体誘導型発現プラスミド（pIND- g4H、 pIND-g4L)を Rapid DNA Ligation Kit (Roche D iagnostics)を用いて添付説明書記載の方法で連結反応を行った。各反応液の一部 を用いて大腸菌 DH5 α株（東洋紡績)を形質転換した。
[0201] また、二重特異性抗体ではな 、通常のヒト化抗体として発現させるために、以下の ようにして発現ベクターを作製した。 -ヮトリ βァクチンプロモーターを有する pCAGG S (Niwa et al. 1991 Gene, 108: 193-199. )に野生型の抗体定常領域が挿入された プラスミド（pCAG-g4H、 pCAG-g κ )を Xholおよび Sfilで消化し、上記の二重特異性 抗体発現ベクターを Xholおよび Sfilで消化して回収したヒト化 XB12抗体遺伝子断片（ H鎖可変領域または L鎖可変領域)またはヒト化 SB04抗体遺伝子断片 (H鎖可変領域 または L鎖可変領域)を挿入した発現プラスミドを作製した。 DNA連結反応は Rapid D NA Ligation Kit (Roche Diagnostics)を用い、大腸菌 DH5 α株（東洋紡績)を形質転 換した。
[0202] 6- 3.ヒト化二重特異性抗体の調製
4種類のヒトイ匕二重特異性抗体発現ベクターと pcDNA6/TR、 pVgRXRを用いて、実 施例 4 - 2, 4- 3に示す方法で HEK293Hへ遺伝子導入および発現誘導を行った。 さらに、実施例 4 5、 4 6に示す方法で抗体精製および抗体濃度の定量を実施し た。
[0203] 6-4.ヒト化抗体の調製
二重特異性抗体ではな 、通常のヒト化抗体を発現させるために、実施例 6— 3で作 製したヒト化 H鎖抗体発現ベクターおよびヒト化 L鎖抗体発現ベクターを用いて実施 例 4 2に示す方法で1"¾1 2931"[へ遺伝子導入を行った。遺伝子導入後に 10mLの C HO-S-SFM-Π培地 (Invitrogen)を添カ卩および除去して洗浄した後に、さらに 10mLの C HO- S- SFM- IIを添カ卩し、 COインキュベーター（37°C、 5% CO )内で 3日間培養して、
2 2
ヒト化抗体を分泌させた。 [0204] 6- 5.ヒトイヒ二重特異性抗体の活性評価および抗体配列の改変
調製したヒト化二重特異性抗体およびキメラ二重特異性抗体 (XB12/SB04)の血漿 凝固能を評価するために、実施例 5の方法に従って、 F. VIII欠乏血漿を用いて APT Tに対する抗体の影響を検討した。血液凝固能が低下したヒト化二重特異性抗体に ついて、活性上昇を目指して、ヒト抗体 FRのアミノ酸を改変した。また、熱安定性低下 などが危惧される XB12抗体 VHの CDR3のシスティン残基についてもァラニン残基に 変した。具体的には、 QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene)を 用いて、添付説明書記載の方法でヒト化抗体可変領域に変異を導入した。 FR配列の アミノ酸改変および血液凝固能の評価を繰り返すことで XB12/SB04と同等の活性を 有するヒト化二重特異性抗体（ヒト化 XB12抗体 (VH:hXB12f- A, VL:hXBVL) /ヒト化 S B04抗体 (VH:hSB04e, VL:hSBVL-F31)を取得した。各抗体可変領域配列を以下の配 列番号に示した。
[0205] (1)ヒトイ匕 XB12抗体 VH (hXB12f-A) 配列番号： 1 (塩基配列）、配列番号： 2 (アミノ酸 配列）
(2)ヒト化 XB12抗体 VL (hXBVL) 配列番号： 3 (塩基配列）、配列番号： 4 (アミノ酸配 列）
(3)ヒト化 SB04抗体 VH (hSB04e) 配列番号： 5 (塩基配列）、配列番号： 6 (アミノ酸配 列）
(4)ヒト化 SB04抗体 VL (hSBVL-F3f) 配列番号： 7 (塩基配列）、配列番号： 8 (アミノ酸 配列）
[0206] 〔実施例 7〕ヒト化抗体のモデリング
ヒト化 SB04抗体の VHと VLの界面のアミノ酸残基を確認するために、 MOEソフトゥェ ァ（Chemical Computing Group Inc. )を用いて、ホモロジ一モデリングにより抗体 Fv 領域モデルを作製した。 VHと VLの界面において、 H39と L38のアミノ酸はともにダル タミン (Gin)であり、両残基の側鎖により水素結合を形成していることが確認された（図 1(A))。また、 H45と L44のアミノ酸はそれぞれロイシン (Leu)とプロリン (Pro)であり、両 残基の側鎖は非常に近接し、かつ疎水性コアを形成していることが確認された（図 1( B))。これらの 2箇所のアミノ酸残基は、ヒト抗体において高く保存されていることが報 告されている（Vargas- Madrazo E et al. J. Mol. Recognit. 2003, 16: 113-120)。 H3 9, L38, H45, L44などの抗体のナンバーリングについては、 Kabatらの文献（Kabat E A et al. 199丄. sequences of Proteins of Immunological Interest. NIH)を参考にし ている。
[0207] 〔実施例 8〕H39, L38のアミノ酸を改変したヒト化抗体の作製と評価
8 - 1. H39および L38を改変した抗体発現ベクターの構築
ヒト化 XB12の H鎖とヒト化 SB04の L鎖の会合を阻害するように、実施例 7の知見に基 づいてヒト化 XB12 H鎖の H39のグルタミンとヒト化 SB04 L鎖の L38のグルタミンを置換 した。具体的には、グルタミンの側鎖の水素結合を阻害して電荷的に反発するように 、両アミノ酸 (H39, L38)を側鎖に正の電荷を持つリジン (Lys)またはアルギニン (Arg)、 側鎖に負の電荷を持つグルタミン酸 (Glu)またはァスパラギン酸 (Asp)に置換した。ヒト ィ匕抗体 ¾fe子の 換は、 QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene)を 用いて、添付説明書記載の方法で変異を導入した。アミノ酸が置換された各ヒト化抗 体遺伝子断片は、実施例 6— 2で使用した二重特異性抗体発現ベクターまたは通常 の抗体発現ベクターに挿入した。
[0208] 8 - 2.会合制御評価用抗体の調製と会合制御評価
H鎖と L鎖の会合制御について評価するために、作製したヒト化 XB12 H鎖 (H39改変 )、ヒト化 SB04 L鎖 (L38改変)、野生型ヒト化 XB12 L鎖の 3種類の抗体発現ベクターを 用いて、実施例 4— 2に示す方法で HEK293Hへ遺伝子導入し、培養上清中に抗体 を分泌させた。さら〖こ、実施例 4— 5、 4— 6に示す方法で抗体精製および抗体濃度 の定量を実施した。
[0209] 精製抗体 200ngをサンプルバッファー（TEFCO)中で還元処理し、 14% SDS-PAGE miniゲル（TEFCO)に注入して、電気泳動を行った。電気泳動後、 10%メタノールを含 む 7%酢酸溶液に 30分間浸して固定処理を行い、 SYPRO(R)Ruby protein gel stain液（ BIO- RAD)に一昼夜浸して染色を行った。次に、 10%メタノールを含む 7%酢酸溶液に 1時間浸して脱色処理を行い、蛍光検出装置 FluorImagerSI(Amersham Biosciences) を用いて、画像解析し、イメージング画像を取得した。得られた画像を用いて、 Image Quant ver4. 2 (Amersham Biosciences)により H鎖および L鎖のバンドの蛍光強度を算 出した。
[0210] 結果を図 2に示した。算出した蛍光強度強度値を用いて、目的となる XB12-L鎖の 比率（％)を「XB12-L鎖 ZL鎖総量（XB12-L鎖 + SB04-L鎖） x 100」で算出した。ヒト 化 XB12 H鎖 (H39)およびヒト化 SB04 L鎖 (L38)のアミノ酸が野生型のグルタミン (Gin) である場合には 50%であるのに対して、 H39および L38を置換した場合にはヒトイ匕 XB12 L鎖の比率が上昇し、グルタミン酸 (Glu)に置換した場合には 82%と 1.6倍上昇すること が確認された。
[0211] 8- 3.凝固活性評価用の二重特異性抗体の調製と凝固活性評価
凝固活性について評価するために、作製したヒト化 XB12 H鎖 (H39改変)およびヒト 化 SB04 L鎖 (L38改変）二重特異性抗体発現ベクターと野生型のヒト化 XB12 L鎖およ びヒト化 SB04 H鎖二重特異性抗体発現ベクター、 pcDNA6/TR、 pVgRXRを用いて、 実施例 4 - 2, 4- 3に示す方法で HEK293Hへ遺伝子導入および発現誘導を行った 。さらに、実施例 4 5、 4— 6に示す方法で抗体精製および抗体濃度の定量を実施 した。
凝固活性の評価は実施例 5に示す方法で実施した。結果を図 3に示した。会合制 御評価で 82%まで比率が上昇したグルタミン酸 (Glu:E)改変抗体にぉ 、て、野生型と 比較して同等以上の凝固活性を示すことが確認された。
[0212] 8-4.結合活性評価用抗体の調製
FactorlXaおよび FactorXへの結合活性について評価するために、ヒトイ匕 XB12 1鎖（ H39改変)および野生型ヒト化 XB12 L鎖抗体発現ベクター、または野生型ヒト化 SB04 H鎖およびヒト化 SB04 L鎖 (L38改変)抗体発現ベクターを用いて、実施例 4— 2に示 す方法で HEK293Hへ遺伝子導入し、培養上清中に抗体を分泌させた。さらに、実施 例 4 5、 4 6に示す方法で抗体精製および抗体濃度の定量を実施した。
[0213] FactorlXaおよび FactorXに対する結合活性の評価は、実施例 1 2、 2— 2に示す 方法で実施した。結果を図 4、図 5に示した。 H39および L38のアミノ酸を置換しても結 合活性に変化はな 、ことが確認された。
[0214] 以上の結果から、 XB12 H鎖の H39および SB04 L鎖の L38を改変することにより抗原 への結合活性、 FactoVinを代替する凝固活性と ヽぅ生物活性を低下させることなぐ 目的とする二重特異性抗体の比率を上昇させることが可能であることが示唆された。 ポリペプチド中の一箇所のアミノ酸に変異を導入するだけで、機能を低下させずに会 合を制御した例は、 knobと holeを用いた方法を含めてこれまでに報告がなぐはじめ ての知見であるといえる。
[0215] 〔実施例 9〕 L44のアミノ酸を改変したヒト化抗体の作製と評価
9 - 1. L44を改変した抗体発現ベクターの構築
ヒト化 XB12の H鎖とヒト化 SB04の L鎖の会合を阻害するように、実施例 7の知見に基 づいてヒト化 SB04 L鎖の L44のプロリンを側鎖に電荷を有するアミノ酸に置換した。具 体的には、 VHと VLの界面の疎水性コアに存在するプロリンを側鎖に正の電荷を持 つリジン (Lys)またはアルギニン (Arg)、側鎖に負の電荷を持つグルタミン酸 (Glu)また はァスパラギン酸 (Asp)に置換した。ヒトイ匕抗体遺伝子の置換は、 QuikChange Site-Di rected Mutagenesis Kit (Stratagene)を用いて、添付説明書記載の方法で変異を導 入した。アミノ酸が置換された各ヒト化抗体遺伝子断片は、実施例 6— 2で使用した二 重特異性抗体発現ベクターまたは通常の抗体発現ベクターに挿入した。
[0216] 9 - 2.会合制御評価用抗体の調製と会合制御評価
H鎖と L鎖の会合制御について評価するために、作製したヒト化 SB04 L鎖 (L44改変) 、野生型ヒト化 XB12 H鎖、野生型ヒト化 XB12 L鎖の 3種類の抗体発現ベクターを用 Vヽて、実施例 4 2に示す方法で HEK293Hへ遺伝子導入し、培養上清中に抗体を 分泌させた。さらに、実施例 4— 5、 4— 6に示す方法で抗体精製および抗体濃度の 定量を実施した。
[0217] 精製抗体 200ngをサンプルバッファー（TEFCO)中で還元処理し、 14% SDS-PAGE miniゲル（TEFCO)に注入して、電気泳動を行った。電気泳動後、 10%メタノールを含 む 7%酢酸溶液に 30分間浸して固定処理を行い、 SYPRO(R)Ruby protein gel stain液（ BIO- RAD)に一昼夜浸して染色を行った。次に、 10%メタノールを含む 7%酢酸溶液に 1時間浸して脱色処理を行い、蛍光検出装置 FluorImagerSI(Amersham Biosciences) を用いて、画像解析し、イメージング画像を取得した。得られた画像を用いて、 Image Quant ver4. 2 (Amersham Biosciences)により H鎖および L鎖のバンドの蛍光強度を算 出した。 [0218] 結果を図 6に示した。算出した蛍光強度強度値を用いて、目的となる XB12-L鎖の 比率（％)を「XB12-L鎖 ZL鎖総量（XB12-L鎖 + SB04-L鎖） x 100」で算出した。ヒト ィ匕 SB04 L鎖 (L44)のアミノ酸が野生型のプロリン (Pro)である場合には 47%であるのに 対して、 L44を置換した場合にはヒトイ匕 XB12 L鎖の比率が上昇し、 86-90%と 1.8-1.9倍 上昇することが確認された。
[0219] 9- 3.凝固活性評価用の二重特異性抗体の調製と凝固活性評価
凝固活性について評価するために、作製したヒト化 SB04 L鎖 (L44改変）二重特異 性抗体発現ベクターと野生型のヒト化 XB12 H鎖、ヒト化 XB12 L鎖およびヒト化 SB04 H鎖二重特異性抗体発現ベクター、 pcDNA6/TR、 pVgRXRを用いて、実施例 4— 2、 4— 3に示す方法で HEK293Hへ遺伝子導入および発現誘導を行った。さら〖こ、実施 例 4 5、 4 6に示す方法で抗体精製および抗体濃度の定量を実施した。
[0220] 凝固活性の評価は実施例 5に示す方法で実施した。結果を図 7に示した。会合制 御評価で比率が上昇した全ての改変抗体にぉ 、て、野生型の凝固活性を上回る凝 固活性を示すことが確認された。
[0221] 9-4.結合活性評価用抗体の調製
FactorXへの結合活性について評価するために、野生型ヒト化 SB04 H鎖およびヒト ィ匕 SB04 L鎖 (L44改変)抗体発現ベクターを用いて、実施例 4 2に示す方法で HEK2 93Hへ遺伝子導入し、培養上清中に抗体を分泌させた。さらに、実施例 4 6に示す 方法で培養上清中の抗体濃度の定量を実施した。
[0222] FactorXに対する結合活性の評価は、培養上清を用いて実施例 2— 2に示す方法 で実施した。結果を図 8に示した。 L44のアミノ酸を置換しても結合活性に変化はない ことが確認された。
[0223] 以上の結果から、 SB04 L鎖の L44と 、う一箇所のアミノ酸を改変することにより抗原 への結合活性、 FactoVinを代替する凝固活性と ヽぅ生物活性を低下させることなぐ 目的とする二重特異性抗体の比率を上昇させることが可能であることが示唆された。 ポリペプチド中の一箇所のアミノ酸に変異を導入するだけで、機能を低下させずに会 合を制御した例は、 knobと holeを用いた方法を含めてこれまでに報告がなぐはじめ ての知見であるといえる。 [0224] 〔実施例 10〕H39, L38のアミノ酸および L44のアミノ酸を改変したヒトイ匕抗体の作製と 評価
10- 1. H39, L38のアミノ酸 L44を改変した抗体発現ベクターの構築
ヒト化 XB12の H鎖とヒト化 SB04の L鎖の会合を阻害するように、実施例 8および 9の 知見に基づいてヒト化 XB12 H鎖の H39とヒト化 SB04 L鎖の L38および L44を側鎖に電 荷を有するアミノ酸に置換した。具体的には、ヒトイ匕 XB12 H鎖の H39とヒト化 SB04 L鎖 の L38の両アミノ酸を実施例 8において最も効果が見られたグルタミン酸 (Glu)に置換 し、且つヒト化 SB04 L鎖の L44に存在するプロリンを側鎖に正の電荷を持つリジン (Lys )またはアルギニン (Arg)、側鎖に負の電荷を持つグルタミン酸 (Glu)またはァスパラギ ン酸 (Asp)に置換した。ヒト化抗体遺伝子の置換は、 QuikChange Site-Directed Muta genesis Kit (Stratagene)を用いて、添付説明書記載の方法で変異を導入した。ァミノ 酸が置換された各ヒト化抗体遺伝子断片は、実施例 6— 2で使用した二重特異性抗 体発現ベクターまたは通常の抗体発現ベクターに挿入した。
[0225] 10- 2.会合制御評価用抗体の調製と会合制御評価
H鎖と L鎖の会合制御について評価するために、改変型ヒト化 SB04 L鎖、改変型ヒト 化 XB12 H鎖、野生型ヒト化 XB12 L鎖の 3種類の抗体発現ベクターを用いて、実施例 4- 2に示す方法で HEK293Hへ遺伝子導入し、培養上清中に抗体を分泌させた。さ らに、実施例 4 5、 4— 6に示す方法で抗体精製および抗体濃度の定量を実施した
[0226] 精製抗体 200ngをサンプルバッファー（TEFCO)中で還元処理し、 14% SDS- PAGE miniゲル（TEFCO)に注入して、電気泳動を行った。電気泳動後、 10%メタノールを含 む 7%酢酸溶液に 30分間浸して固定処理を行い、 SYPRO(R)Ruby protein gel stain液（ BIO- RAD)に一昼夜浸して染色を行った。次に、 10%メタノールを含む 7%酢酸溶液に 1時間浸して脱色処理を行い、蛍光検出装置 FluorImagerSI(Amersham Biosciences) を用いて、画像解析し、イメージング画像を取得した。得られた画像を用いて、 Image Quant ver4.2 (Amersham Biosciences)により H鎖および L鎖のバンドの蛍光強度を算 出した。
[0227] 結果を図 9に示した。算出した蛍光強度強度値を用いて、 目的となる XB12-L鎖の 比率（％)を「XB12-L鎖 ZL鎖総量（XB12-L鎖 + SB04-L鎖） x 100」で算出した。ヒト 化 XB12 H鎖 (H39)およびヒト化 SB04 L鎖 (L38)の両アミノ酸がグルタミン酸 (Glu)に改 変され、ヒト化 SB04 L鎖 (L44)は野生型のプロリン (Pro)であるた場合は 82%であるのに 対して、ヒト化 XB12 H鎖 (H39)およびヒト化 SB04 L鎖 (L38)の両アミノ酸のグルタミン酸 (Glu)への改変に加えて、 L44を置換した場合にはヒトイ匕 XB12 L鎖の比率が 94-96%ま で上昇した。この比率の向上は、実施例 9において L44を単独で置換した 86-90%より も高かった。
[0228] 10- 3.凝固活性評価用の二重特異性抗体の調製と凝固活性評価
凝固活性について評価するために、作製した改変型のヒト化 XB12 H鎖、ヒトイ匕 XB1 2 L鎖およびヒト化 SB04 H鎖二重特異性抗体発現ベクターと野生型のヒト化 XB12 H 鎖、ヒト化 XB12 L鎖およびヒト化 SB04 H鎖二重特異性抗体発現ベクター、 pcDNA6/ TR、 pVgRXRを用いて、実施例 4— 2、 4— 3に示す方法で HEK293Hへ遺伝子導入 および発現誘導を行った。さらに、実施例 4 5、 4 6に示す方法で抗体精製およ び抗体濃度の定量を実施した。
[0229] 凝固活性の評価は実施例 5に示す方法で実施した。結果を図 10に示した。会合制 御評価で比率が上昇した全ての改変抗体にぉ 、て、野生型の凝固活性と同等の凝 固活性を示すことが確認された。
[0230] 10-4.結合活性評価用抗体の調製
FactorXへの結合活性について評価するために、野生型ヒト化 SB04 H鎖および改 変型ヒト化 SB04 L鎖抗体発現ベクターを用いて、実施例 4 2に示す方法で HEK293 Hへ遺伝子導入し、培養上清中に抗体を分泌させた。さらに、実施例 4 6に示す方 法で培養上清中の抗体濃度の定量を実施した。
[0231] FactorXに対する結合活性の評価は、培養上清を用いて実施例 2— 2に示す方法 で実施した。結果を図 11に示した。 L38と L44の両アミノ酸を置換しても結合活性に変 化はないことが確認された。
[0232] 以上の結果から、 XB12 H鎖の H39および SB04 L鎖の L38, L44のアミノ酸を改変す ることにより抗原への結合活性、 FactoVinを代替する凝固活性と ヽぅ生物活性を低下 させることなく、目的とする二重特異性抗体の比率を上昇させることが可能であること が示唆された。二重特異性抗体の比率については、界面のアミノ酸改変の数を増す ことにより上昇することが確認された。
[0233] 〔実施例 11〕 hVB22B u2-wz4 sc(Fv)2の構造異性体の分離、構造決定
11-1. ヒト化抗ヒト Mpl抗体 hVB22B u2- wz4 sc(Fv)2の作製
ヒト化抗 Mpl抗体である hVB22B u2-wz4 sc(Fv)2 (以下 u2-wz4)の作製方法は WO20 05/56604に示されている。該遺伝子は、リンカ一配列 (GlyGlyGlyGlySer)x3をコード する塩基配列を用いて、 VH リンカー配列 VL リンカー配列 VH リンカ一配 列 VLで構成される塩基配列（配列番号： 12 ; WO2005/56604の配列番号： 286参 照）を持つように PCR法により作製した。遺伝子の塩基配列を確認した後、 DNA断片 を発現ベクター PCXND3にクローユングして発現ベクターを構築し、 CHO-DG44細胞 に遺伝子導入することで、安定発現細胞株を作製した。具体的には、発現ベクター（ 20 μ g)と PBSに懸濁した CHO- DG44細胞（1 X 107細胞/ mL)の 0.75 mLを混合したも のを氷上で 10分間冷却し、キュベットに移した後に Gene Pulser Xcell (BioRad)を用い て 1.5 kV、 25 μ FDの容量にてパルスを与えた。室温にて 10分間の回復期間の後、ェ レクト口ポレーシヨン処理された細胞を、 g/mL Geneticin (lnvitrogen)を含む CH O-S-SFMII培地（Invitrogen)に加えて選抜し、 u2-wz4産生 CHO細胞株を榭立した。
[0234] ヒト化抗体 hVB22B u2- wz4 sc(Fv)2は Flagタグを付カ卩して!/、な!/、ことから、培養上清 力 の精製は、認識するェピトープである MG10 (ヒト Mplアミノ酸配列の Gln213力も Ala 231)と GST融合蛋白質を利用して行った。 MG10と GST融合蛋白質の精製は、 Glutat hione Sepharose 4B (.Amersham Biosciences社製)を用 ヽて、メーカーのプロトコ一ノレ に従って精製した。さらに、精製した MG10と GST融合蛋白質をメーカーのプロトコ一 ルに従って、 HiTrap NHS- activated HP(Amersham Biosciences社製）に固定化し、 ァフィ-ティカラムを作製した。ヒト化抗体 hVB22B u2-wz4 sc(Fv)2発現 CHO細胞の 培養上清を MG10-GST融合蛋白質固定ィ匕カラムに流し、ヒトイ匕抗体 hVB22B u2-wz4 sc(Fv)2を吸着させ、 100 mM Glycine- HCl(pH 3.5),0.01 % Tween80で溶出させた。溶 出画分は直ちに 1 M Tris-HCl(pH 7.4)で中和を行い、 HiLoad 16/60 Superdex200pg (Amersham Biosciences社製）を用いてゲルろ過クロマトグラフィーを行い、モノマー を精製した。ゲルろ過クロマトグラフィーの緩衝液は、 20 mMクェン酸緩衝液 (pH 7.5) , 300 mM NaCl, 0.01 % Tween 80を使用した。
[0235] 11-2. hVB22B u2- wz4 sc(Fv)2の構造異性体の分離、精製
hVB22B u2-wz4 sc(Fv)2は VH -linker- VL -linker- VH -linker- VLの配列を有す
1 2 3 4
る sc(Fv)2であることから、 VB22B sc(Fv)2と同様に構造は Fv(VH,VL間で非共有結合 した分子）の組み合わせにより、 VHと VL、 VHと VLがそれぞれ Fvを形成する bivale
1 2 3 4
nt scFv型と、 VHと VLゝ VHと VLがそれぞれ Fvを形成する single chain diabody型の
1 4 2 3
2種類の構造異性体が存在すると考えられる（図 12)。
[0236] hVB22B u2-wz4 sc(Fv)2の構造異性体の分離を検討した結果、陽イオン交換クロマ トグラフィー BioAssist S(TOSOH)を用いて、下記の溶離条件により hVB22B u2- wz4 s c(Fv)2の各種成分の分離できることが示唆された。
[0237] 移動相 A： 20 mM sodium phosphate, pH 7.5
移動相 B： 20 mM sodium phosphate, 500 mM NaCl, pH 7.5
流速： 0.8 ml/min
グラジェント： B 0%→ B 35%(30 min)
[0238] 上記条件により、 hVB22B u2-wz4 sc(Fv)2は 2つのピークに分離した。図 13に示す ようなクロマトグラムが得られ、保持時間の短いピーク力もそれぞれ、 peakl、 peak2と 命名した。
peakl及び peak2に関して、 Q-TOF型質量分析計 (Q Tof Ultima, Micro Mass)を用 いて分子量の測定を行った。 Q-TOFに infosionにて試料溶液を導入し、得られた多 価イオンスペクトル (+)を、付属ソフト (MassLynx)を用いたデコンボリューシヨンを行った 結果、 peaklの分子量として 53768 Da、 peak2の分子量とし 53769 Daを得た。このこと から、 peaklと peak2は同一の分子量を有することが分かった。
[0239] peakl及び peak2に関して、ペプチドマッピングを行った。還元変性、 carboxymethyl 化後、トリプシンを用いてペプチド断片に分解し、逆相クロマトグラフィー (YMC- Pack -ODS)によりペプチドマップを得た。 peaklと peak2のペプチドマップを比較したところ 、図 14に示すように peaklと peak2のマッピングのパターンは同一であったことから、ァ ミノ酸一次構造は同一であることが分かった。
[0240] hVB22B u2- wz4 sc(Fv)2は糖鎖付カ卩がなぐ peaklと peak2は TOF- MASS測定による 分子量が同一であること、 peaklと peak2はマッピングのパターンが同一であることから 、 peaklと peak2は互いに異なる立体構造を有する構造異性体 (conformational isomer )であることが分力つた。
[0241] hVB22B u2- wz4 sc(Fv)2は VH -linker- VL -linker- VH -linker- VLの配列を有す
1 2 3 4
る sc(Fv)2であることから、図 12に示すとおり、構造は Fv(VH,VL間で非共有結合した 分子）の組み合わせにより、 VHと VL、 VHと VLがそれぞれ Fvを开成する bivalent sc
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Fv型と、 VHと VL、 VHと VLがそれぞれ Fvを开成する single chain diabody型の 2種
1 4 2 3
類の構造異性体が存在し、 peaklと peak2はそれぞれ bivalent scFv型と single chain di abody型のどちらかの構造であると考えられた。
[0242] 2種類の構造異性体を同定する分析法として、プロテアーゼ限定分解法を見出した 。 sc(Fv)2のリンカ一部分は、比較的自由な構造を取っているためプロテア一ゼに対 する耐性が低いと考えられ、プロテアーゼの一種である subtilisin Aを用いて、以下の 条件で peakl及び peak2及び hVB22B u2- wz4 sc(Fv)2 (peakl： peak2〜 1： 4)と反応 させた。
[0243] 20 mM sodium citrate, 150 mM NaCl, pH 7.5
hVB22B u2-wz4 sc(Fv)2 peakl or peak2： 0.15 mg/mL
Subtilisin A : 10 ^ g/mL
37°C, 30 min
[0244] 反応後、 Phastgel Homogeneous 12.5 %を用いて、還元 SDS- PAGEを行った。その 結果、図 15に示すとおり、 hVB22B u2- wz4 sc(Fv)2 bulk, peakl、 peak2いずれも同様 のバンドパターンを示した。 hVB22B u2-wz4 sc(Fv)2の 3箇所のリンカ一部分の切断 によると思われる各断片の特異的なバンドが得られたことから、上記反応条件を用い ることで、 hVB22B u2-wz4 sc(Fv)2のリンカ一部分を部分的且つ限定的に分解できる ことが分力つた。
[0245] bivalent scFv型と single chain diabody型の構造において、 3つのうちのリンカ一の一 箇所の切断が起こった場合、図 16に示すように、未変性状態では、 VHと VLの間の 非共有的な結合により single chain diabody型の構造においては、 3つのうちのどのリ ンカーに切断が起こっても見かけの分子量には変化が見られないが、 bivalent scFv 型においては、中央のリンカ一に切断が起こった場合、半分の分子量の分子種が生 成する。そこで、上記反応条件により部分的にリンカ一を切断した、 WB22B u2-wz4 sc(Fv)2 bulk, peakl、 peak2を TSK SuperSW2000(TOSOH)を用いてゲルろ過クロマト グラフィー分析を行った。ゲルろ過クロマトグラフィーは以下の条件で行った。
[0246] 移動相： DPBS (-) pH7.4
流速： 0.2ml/min
[0247] その結果、図 17に示すように、 peak2においては低分子量のピークが全く確認され なかったのに対して、 peaklにお 、ては低分子量 (約半分の分子量）のピークが確認 された。 peaklと peak2の混合物である hVB22B u2- wz4 sc(Fv)2 bulkは、 peaklの存在 比に相当する量の低分子量のピークが確認された。よって、本結果より、 peaklが biva lent scFv型であり、 peak2が single chain diabody型であると同定された。
[0248] 〔実施例 12〕VH/VL界面改変型 sc(Fv)2の作製、構造異性体分析および同定
12-1. VH/VL界面改変型 sc(Fv)2の作製
VH/VL界面改変による会合制御を低分子化抗体である sc(Fv)2に応用し、 sc(Fv)2 の構造異性体形成を制御できるかどうかを確認するために以下の方法で VH/VL界 面改変型 sc(Fv)2を作製した。
[0249] u2-wz4の VH/VL界面を形成するアミノ酸である VHの 39位（配列番号： 13に記載の アミノ酸配列における 39位； WO2005/56604の配列番号： 289参照）の Ginと VLの 38 位（配列番号： 14に記載のアミノ酸配列における 43位； WO2005/56604の配列番号 : 289参照）の Ginを以下のようにして改変した。はじめに、 VH1の 39位の Gin (遺伝子コ ドン CAG)を Glu (遺伝子コドン GAG)に、 VL2の 38位の Gin (遺伝子コドン CAG)を Glu ( 遺伝子コドン GAG)に、 VH3の 39位の Gin (遺伝子コドン CAG)を Lys (遺伝子コドン AA G)に、 VL4の 38位の Gin (遺伝子コドン CAG)を Lys (遺伝子コドン AAG)に改変した遺 伝子 hVB22B u2-wz4(vl) sc(Fv)2 (以下 vl、塩基配列を配列番号： 15に、該塩基配 列によってコードされるアミノ酸配列を配列番号： 16に示す)を作製した。さらに、 VH 1の 39位の Gin (遺伝子コドン CAG)を Glu (遺伝子コドン GAG)に、 VL2の 38位の Gln ( 遺伝子コドン CAG)を Lys (遺伝子コドン AAG)に、 VH3の 39位の Gin (遺伝子コドン CA G)を Lys (遺伝子コドン AAG)に、 VL4の 38位の Gin (遺伝子コドン CAG)を Glu (遺伝子 コドン GAG)に改変した遺伝子 hVB22B u2-wz4(v3) sc(Fv)2 (以下 v3、塩基配列を配 列番号： 17に、該塩基配列によってコードされるアミノ酸配列を配列番号： 18に示す )を作製した。遺伝子の改変は QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit(STRATA GENE社製)を用いてメーカーのプロトコールに従い、点突然変異を導入した。各遺伝 子の塩基配列を確認した後、 DNA断片を発現ベクター pCXND3にクローユングして 発現ベクターを構築し、 CHO-DG44細胞に遺伝子導入することで、安定発現細胞株 を作製した。実施例 11に示す方法で vl産生 CHO細胞株および v3産生 CHO細胞株 を榭立した。
[0250] 改変体 vl, v3は実施例 11に示す方法で、 MG10-GST融合蛋白質固定ィ匕カラムを 用いてモノマー分子を精製した。図 18に示したゲルろ過クロマトグラフィーの結果か ら、改変体 vl, v3は培養上清中でダイマー以上の凝集体が低下し、モノマー比率は 改変前の u2-wz4の 59 %と比較して、 vlが 89 %、 v3が 77 %と上昇していることが明らか になった。改変体 vl, v3は VH/VL界面のアミノ酸を改変することにより、電荷的な反 発により好ましくない会合を阻害し、好ましい会合を促進したことが推測される。以上 のことからこの会合制御により、効率的なモノマー分子の発現に成功した。
[0251] 12-2. VH/VL界面改変型 sc(Fv)2の構造異性体分析および同定
得られた VH/VL界面改変体である vl、 v3および未改変体である u2-wz4の構造異 性体存在比を陽イオン交換クロマトグライフィーおよび等電点電気泳動により分析し た。また、プロテアーゼ限定分解法による構造同定を実施した。
[0252] 陽イオン交換クロマトグラフィーは以下のとおり実施した。
カラム： TSK— gel Bioassist S, 4.6 mm X 50 mm (TOSOH社製） 流速： 0.8 mL/min
検出波長： 220 nm
溶出条件：
Eluent A : 20 mmol/L Phosphate buffer (pH 7.0)
Eluent B : 20 mmol/L Phosphate buffer I 500 mmol/L NaCl (pH 7.0) グラジェント：
Time (min) B% 0 0
5 0
25 30
25.1 100
35 100
35.1 0
[0253] 等電点電気泳動は以下のとおり実施した。 PhastGel Dry IEFゲル (Amersham Biosci ences社製)を以下のゲル膨潤液にて 30分以上膨潤した。試料を先に膨潤させたゲル に添加し、 PhastSystemにより以下の泳動条件で電気泳動した。泳動後、 20 % TCA溶 液に 30分間浸した後、ミリ Q水で 5分間 X 3回以上洗浄し、試料のたんぱく質濃度に 応じてクマシ一染色、または銀染色した。クマシ一染色では、染色液として 0.1 % CuS 0 (w/v)を含む 0.02 % CBBを用い、染色を行い、 10 %酢酸を含む 30 %メタノールで
4
脱色した。銀染色では、 Silver stain kit, Protein (Amersham Biosciences社製）を用い 、キットに添付された標準プロトコールにより染色を行った。
[0254] <ゲル膨潤液 >
Pharmalyte 8.5-10 80 し
Biolyte 7-9 10 し
Biolyte 3-9 10 し
20 % Gly . cerol 2.0 mL
[0255] <電気泳動プログラム >
SAMPLE APPLICATION DOWN AT step2 0 Vh
SAMPLE APPLICATION UP AT step3 0 Vh
Step 1 2000 V 2.5 mA 3.5 W 15°C 75 Vh
Step 2 200 V 2.5 mA 3.5 W 15°C 15 Vh
Step 3 2000 V 2.5 mA 3.5 W 15°C 410 Vh
[0256] プロテアーゼ限定分解法による構造同定は以下の条件で実施した。 subtilisin Aを 用いて、以下の条件で u2-wz4精製 peaklと u2-wz4精製 peak2、及び、改変体 vlと改 変体 v3を反応させた。 20mM sodium citrate, 150 mM NaCl, pH 7.5
hVB22B u2-wz4 sc(Fv)2 peakl or peak2： 0.15 mg/mL
Subtilisin A : 10 ^ g/mL
37°C, 30 min
[0257] 得られた反応液をゲルろ過クロマトグラフィーにより以下の条件で分析した。
Column： TSKgel Super2000sw (TOSOH)
Eluent： 50 mM sodium phosphate, 300 mM KC1, pH 7.0
Flow rate： 0.2 ml/ min
Detection： 220 nm
[0258] 図 19および図 20に示した陽イオン交換クロマトグラフィーと等電点電気泳動による 構造異性体の分析結果から、 u2- wz4は 24 %が bivalent scFv型、 76 %が single chain di abody型として両構造異性体の混合物として発現しているのに対して、改変体 vlは 10 0 %が single chain diabody型の構造異性体として発現しており、改変体 v3は 100 %が bi valent scFv型の構造異性体として発現していることが分かった。また図 21に示すとお り、プロテアーゼ限定分解の結果からも、改変体 v3は u2-wz4精製 peaklと同様に低分 子のピークが見られ、改変体 vlは u2-wz4精製 peak2と同様に低分子のピークが見ら れなかったことから、改変体 vlは single chain diabody型の構造異性体として発現して おり、改変体 v3は bivalent scFv型の構造異性体として発現していることが示された。
[0259] 〔実施例 13〕 VH/VL界面改変型 sc(Fv)2の活性評価および安定性評価
13-1. VH/VL界面改変型 sc(Fv)2の生物活性評価
抗ヒト Mpl抗体 VB22B sc(Fv)2は、文献（Blood 2005;105:562-566)において TPO様 ァゴ-スト活性を示すことが報告されている。そこで、 TPO依存性増殖を示す BaF3-h uman Mpほたは BaF3-monkey Mplを用いて分離した構造異性体の TPO様ァゴ-スト 活性を評価した。
[0260] 各細胞を 1 % Fetal Bovine Serum(Invitrogen)を含む RPMI1640 (Invitrogen)で 2回洗 浄した後、 4 X 105 cells/mLとなるように 10 % Fetal Bovine Serumを含む RPMI 1640に 懸濁し、 60 μ L/wellで 96 well plateに分注した。 rhTPO (R&D)または構造異性体サン プルの濃度を振り、各 wellに 40 Lカ卩え、 37°C、 5 % CO条件下で、 24時間培養した。 10 L/wellで WST- 8試薬（Cell Count Reagent SF、ナカライテスタ）を加え、直後に B enchmark Plusを用いて 450 nmの吸光度 (対照 655 nm)を測定し、 2時間培養後に、再 度 450 nmの吸光度 (対照 655 nm)を測定した。 WST-8試薬は生細胞数に応じて 450 n mの発色反応を呈することから、 2時間の吸光度変化を指標に TPO様ァゴ-スト活性 を評価した。
[0261] 精製した VB22B sc(Fv)2の構造異性体を用いて、 BaF3-human Mpl、 BaF3-monkey Mplにおける TPO様ァゴ-スト活性を評価した結果をそれぞれ図 17に示す。 peaklと ρ eak2の構造異性体のァゴニスト活性を比較すると、 peak2の方が著しく高 、活性を示 すことが明らかになった。このことから、抗 Mpl抗体 sc(Fv)2が TPO様ァゴ-スト活性を 発揮するためには、 single chain diabodyの構造を取る必要があることが示唆された。
[0262] 実施例 1に示す方法に従って、 VH/VL界面改変体 vlおよび v3のァゴニスト活性の 評価を行った。ァゴ-スト活性は構造異性体間で大きく異なり図 12に示すように、 sin gle chain diabody構造の peak2が非常に高いァゴ-スト活性を示すのに対して、 bivale nt scFv構造の peaklの活性は極めて低下する。図 22に示すとおり、改変体 vlは peak 2と同等の活性を示し、改変体 v3は peaklとほぼ同等の活性を示した。以上のことから 生物活性においても、改変体 vlが single chain diabody構造を、改変体 v3が bivalent s cFv構造を形成して 、ることが確認された。
[0263] 13-2. VH/VL界面改変型 sc(Fv)2の安定性評価
u2-wz4精製 peaklと u2-wz4精製 peak2、および、改変体 vlと改変体 v3の安定性評 価として、示走査型熱量測定（Differential Scanning Calorimetry)を用いて変性中間 温度 (Tm値)の測定を以下の条件下で行った。
DSC： N-DSCII (Applied Thermodynamics社製）
溶液条件： 20 mM sodium citrate, 300 mM NaCl, pH 7.0
タンパク質濃度: 0.1 mg/mL
スキャニング速度：1°C/分
[0264] 各 DSC測定の結果を図 23に示した。 u2-wz4精製 peak2と改変体 vlの Tm値は未改 変体とほぼ同等であり、安定性は同等であることが分力つた。 u2-wz4精製 peaklと改 変体 v3とでは、若干改変体 v3のほうが低い安定性を示した。 knobs-into-hole技術を 用いた方法による界面制御においては、例えば IgGの CH3ドメインのヘテロ会合にお いて、未改変 CH3ドメインの Tm値が 80.4°Cであったのに対して、改変 CH3ドメインの T m値は 69.4°Cであり、大幅に Tm値が低下し安定性が低下してしまうことが報告されて いる（Acta Pharmacol Sin. 2005 26(6):649- 58)。それに対して、本発明においては安 定性を低下させること無く会合を制御できることが確認された。
[0265] 続いて、 u2-wz4精製 peaklと u2-wz4精製 peak2および VH/VL界面改変体である改 変体 vlと改変体 v3の安定性評価として、以下の条件における熱加速試験による安定 性評価を実施した。
[0266] <熱加速条件 >
溶液条件： 20 mM sodium citrate, pH 6.0
タンパク質濃度: 0.25 mg/mL
加速条件： 40°C - 6 day, 12 day
[0267] 熱加速サンプルは、ゲルろ過クロマトグラフィーおよび陽イオン交換クロマトグラフィ 一により以下の条件で分析した。
[0268] 図 24に示すとおり、ゲルろ過クロマトグラフィーによる分析の結果、 u2-wz4精製 peak
2と改変体 vlのモノマー残存率はほぼ同等であり、会合ィヒに対する安定性はほぼ同 等であることが確認された。また、 u2-wz4精製 peaklと改変体 v3のモノマー残存率も モノマー残存率はほぼ同等であり、両構造異性体において会合ィヒに対する安定性 はほぼ同等であることが分かった。
[0269] 図 25に示すとおり、陽イオン交換クロマトグラフィーによる分析の結果、未改変体の 精製 peaklは異性化反応により peak2に異性化し、未改変体精製 peak2は異性化反応 により peaklに異性ィ匕したのに対して、 VH/VL界面改変体 vlと v3は熱加速後も異性 化反応は起こさな力つた。 VH/VL界面の改変を適用することによって、 2種類の構造 異性体のうち一方のみの構造異性体が 100%の状態で発現できることにカ卩えて、得ら れた各構造異性体は異性化反応を起こさず安定に保存可能であることが分かった。
[0270] 本実施例において、 vlおよび v3に適用した VH/VL界面改変を用いることによって、 2種類の構造異性体のうち一方のみの構造異性体が 100 %存在する状態で発現でき ることを見出した。目的の構造の一本鎖抗体を得るための VH/VL界面制御としては、 knobs- into- hole技術を用いて Bispecific diabodyの構造を制御する方法（Protein Sci . 1997 Apr;6(4):78 - 8, Remodeling domain interfaces to enhance heterodimer forma tion., Zhu Z, Presta LG, Zapata G, Carter P.)が知られている。この方法では、 VH/ VL界面あたり合計 4箇所のアミノ酸を改変することにより目的のへテロダイマー構造 の形成率が 72 %から 92 %まで上昇したことを報告している。それに対して、本発明は 4 箇所のアミノ酸を改変することにより、熱安定性および構造異性体の安定性を低下さ せることなく、目的の構造を 100 %の比率で取得することに成功した。
[0271] 〔実施例 14 イブリツド L鎖を持つ二重特異性抗体のヒトイ匕
血液凝固時間の短縮効果が最も高かった抗 FactorlXa抗体 A69-VH、抗 FactorX 抗体 B26_VH、ハイブリッド L鎖 (BBA)の組み合わせ力 成る二重特異性抗体 (特願 2 005-112514)について、以下のようにヒト化を実施した。
[0272] 14 1.ヒト抗体の相同性検索
——般公開されている Kabat Database (ftp://ftp. ebi. ac. uk/ pub/ aatabases/kaoat/) および IMGT Database (http：〃 imgt. cines. fr/)よりヒト抗体アミノ酸配列データを入 手し、構築した Databaseを用いてマウス A69-H鎖可変領域 (アミノ酸配列：配列番号： 57)、マウス B26- H鎖可変領域 (アミノ酸配列:配列番号： 58)、マウス BBA- L鎖可変 領域 (アミノ酸配列:配列番号： 59)に分けてホモロジ一検索を行った。その結果、以 下に示すヒト抗体配列と高い相同性を持つことが確認されたことからヒト化抗体のフレ ームワーク領域 (以下、 FR)に使用することにした。
(1) A69- H鎖可変領域： KABATID- 000064 (Kabat Database)
(Kippsら、 J Clin Invest. 1991 ; 87 : 2087-2096)
(2) B26- H鎖可変領域： EMBL Accession No. AB063872(IMGT Database)
(Unpublished data)
(3) BBA- L鎖可変領域： KABATID- 024300 (Kabat Database)
(Welschofb, J Immunol Method. 1995 ; 179 : 203-214)
(l)-(3)のヒト抗体の FRに各マウス抗体の相補性抗原決定領域 (以下、 CDR)を移植し たヒト化抗体を作製した。
[0273] また、 NCBIより一般公開されている相同性検索 Web site (http：〃 www. ncbi. nlm. nih. gov/BLAST/)を使用して、（1)-(3)のヒト抗体に相同性の高いヒト抗体の分泌シグ ナル配列を検索した。検索により得られた以下に示す分泌シグナル配列を使用した
(1) A69- H鎖可変領域： GenBank Accession No. AF062257
(2) B26- H鎖可変領域： GenBank Accession No. AAC 18248
(3) BBA- L鎖可変領域： GenBank Accession No. AAA59100
[0274] 14- 2.ヒト化抗体遺伝子発現ベクターの構築
分泌シグナル配列から抗体可変領域にいたるアミノ酸配列をコードする塩基配列 において、 50base程度の合成オリゴ DNAを 3，末端側が約 20base程度ァニールするよ うに交互に 12本作製した。さらに、抗体可変領域遺伝子の 5'末端にァニールし、 Xho I切断配列を有するプライマーと抗体可変領域遺伝子の 3'末端にァニールし、 Sfil切 断配列を有し且つイントロン配列の 5'末端配列をコードするプライマーを作製した。
[0275] 2.5 μ Μに調製した合成オリゴ DNAを各 1 μ Lで混合し、 1 x TaKaRa Ex Taq Buffer, 0.4 mM dNTPs, 0.5 units TaKaRa Ex Taq (全て宝酒造)をカロえ、反応液 48 μ Lになる ように調製した。 94°C 5分保温した後に、 94°C 2分、 55°C 2分、 72°C 2分からなる反応 を 2サイクル行い、各合成オリゴ DNAのアッセンブルおよび伸長反応を実施した。次 に、抗体遺伝子の 5，末端および 3，末端側にァニールするプライマー (各 10 M)を 1 μ L添加し、 94°C 30秒、 55°C 30秒、 72°C 1分力 なる反応を 35サイクル行い、 72°C 5 分反応させ、抗体可変領域遺伝子を増幅した。 PCR後、反応液全量を 1 %ァガローズ ゲル電気泳動に供した。 目的のサイズ (約 400 bp)の増幅断片を QIAquick Gel Extra ction Kit (QIAGEN)を用いて、添付説明書記載の方法で精製し、滅菌水 30 1で溶 出した。該断片を pGEM- T Easy Vector Systems (Promega)を用いて、添付説明書記 載の方法でクローユングを行った。各 DNA断片の塩基配列は、 BigDye Terminator C ycle Sequencing Kit (Applied Biosystems)を用い、 DNAシークェンサ一 ABI PRISM 3 730xL DNA Sequencer (Applied Biosystems)にて、添付説明書記載の方法に従い決 定した。
[0276] 正しいヒト化抗体可変領域遺伝子配列であることが確認された H鎖可変領域断片 挿入プラスミドを Xholおよび Sfilで、 L鎖可変領域断片挿入プラスミドを EcoRIで消化し た後に、反応液を 1 %ァガローズゲル電気泳動に供した。 目的のサイズ (約 400 bp)の DNA断片を QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN)を用いて、添付説明書記載の方 法で精製し、滅菌水 30 1で溶出した。その後、以下のようにして動物細胞用発現べ クタ一を作製した。 H鎖がヘテロな組み合わせである IgG4を優先的に発現させるため に、 IgGlの knobs-into-hole技術 (非特許文献 3)を参考に IgG4の CH3部分へのァミノ 酸置換体を用いた。さらに H鎖のダイマー形成促進のためにヒンジにもアミノ酸置換（ -ppcpScp-→- ppcpPcp- )を導入した。 -ヮトリ βァクチンプロモーターを有する pCA GGS (Niwa et al. 1991 Gene, 108: 193-199. )に Y349C、 T366Wに置換した定常領 域遺伝子を組み込んだ発現ベクターにヒト化 A69 H鎖可変領域抗体遺伝子断片を 挿入し、ヒト化 A69H鎖発現ベクターを作製した。また、 pCAGGSに E356C、 T366S、 L3 68A、 Y407Vに置換した定常領域遺伝子を組み込んだ発現ベクターにヒト化 B26 H鎖 可変領域抗体遺伝子断片を挿入し、ヒト化 B26H鎖発現ベクターを作製した。また、 p CAGGSに野生型の抗体 L鎖定常領域が挿入されたプラスミド (pCAG-g κ DNA)を Eco RIで消化し、ヒト化 BBA L鎖可変領域抗体遺伝子断片を挿入した発現ベクターを作 製した。連結反応は Rapid DNA Ligation Kit (Roche Diagnostics)を用い、大腸菌 DH 5ひ株（東洋紡績)を形質転換した。
14 - 3.ヒト化二重特異性抗体の調製
ヒト化二重特異性抗体の発現は、実施例 4 2に記載した方法か以下の方法を用 いて行った。ヒト胎児腎癌細胞由来 HEK293H株（Invitrogen)を 10 %FCS (Invitrogen) を含む DMEM培地 (Invitrogen)へ懸濁し、 5〜6 X 105個/ mLの細胞密度で接着細胞用 ディッシュ（直径 10 cm, CORNING)の各ディッシュへ 10 mLずつ蒔きこみ COインキュ
2 ベータ一（37°C、 5% CO )内で一昼夜培養した後に、培地を吸引除去し、 6.9 mL CH
2
O-S-SFM-II (Invitrogen)培地を添カ卩した。 14 2で調製したプラスミド DNA混合液（ 合計 13.8 g)を 1 g/mL Polyethylenimine (Polysciences Inc.) 20.7 μ Lと CHO— S— SF ΜΠ培地 690 Lと混合して室温 10分間静置したものを各ディッシュの細胞へ投入し、 4〜5時間、 COインキュベーター（37°Cにて 5 % CO )内でインキュベートした。その後
2 2
、 6.9 mLの CHO- S- SFM- II培地を添カ卩して、 3日間 COインキュベーター内で培養し
2
た。培養上清を回収した後、遠心分離 (約 2000 g、 5分間、室温)して細胞を除去し、 さらに 0.22 μ mフィルター MILLEX(R)-GV (Millipore)を通して滅菌した。該サンプルは 使用するまで 4°Cで保存した。
[0278] つづいて、実施例 4 4に示す方法で抗体精製および実施例 4 5に示す方法ま たは以下に示す方法で抗体濃度の定量を実施した。 BIAcore3000(BIACORE)を使 用し、 Sensor Chip CM5(BIACORE)に ProteinAを固定化した。具体的にはメーカーの プロトコールに従い、活性化したセンサーチップに 10 mM酢酸ナトリウム水溶液 (pH 4 .0, BIACORE)で 50 μ g/mLに希釈した ProteinA溶液を 5 μ L/分で 30分間反応させ、 その後ブロッキング操作を実施して ProteinA固定ィ匕センサーチップを作製した。この センサーチップを用いて、 BIAcore Qを使用して培養上清および精製品の濃度を測 定した。センサーチップの固定および濃度測定には HBS-EP Buffer(BIACORE)を使 用した。また、濃度測定時の標準品として 2000 ng/mLから 2倍系列で HBS-EP Buffer にて 6段階希釈したヒ HgG4 (ヒト型化抗 TF抗体、 WO 99/51743参照）を使用した。
[0279] 14-4.ヒトイヒ二重特異性抗体の活性評価および抗体配列の改変
調製したヒト化二重特異性抗体およびキメラ二重特異性抗体 (A69/B26/BBA)の血 漿凝固能を評価するために、実施例 5の方法に従って、 F. VIII欠乏血漿を用いて AP TTに対する抗体の影響を検討した。血液凝固能が低下したヒト化二重特異性抗体 について、活性上昇を目指してヒト抗体 FRのアミノ酸を改変した。また、発現分泌時 にはヒト化 A69/ヒト化 BBA抗体、ヒト化 B26/ヒト化 BBA抗体、ヒト化 A69/ヒト化 B26/ヒト 化 BBA二重特異性抗体の 3種類の抗体が発現するが、この 3種類の抗体を分離し、 二重特異性抗体のみ精製することを目的として、ヒト化 A69 H鎖可変領域の等電点を 下降させ、ヒト化 B26 H鎖可変領域の等電点を上昇させるアミノ酸改変を行った。具 体的には、 QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene)を用いて、添付 説明書記載の方法でヒト化抗体可変領域に変異を導入した。 目的のヒト化抗体可変 領域遺伝子配列であることが確認された H鎖可変領域断片挿入プラスミドを Xholおよ び Sfilで、 L鎖可変領域断片挿入プラスミドを EcoRIで消化した後に、反応液を 1%ァガ ローズゲル電気泳動に供した。 目的のサイズ (約 400bp)の DNA断片を QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN)を用いて、添付説明書記載の方法で精製し、滅菌水 30 μ 1 で溶出した。その後、実施例 14— 2に示す方法で、動物細胞用発現ベクターを作製 した。実施例 14— 3に示す方法でヒト化二重特異性抗体を調製し、実施例 5に示す 方法で血液凝固活性を評価した。
[0280] FR配列のアミノ酸改変および血液凝固能の評価を繰り返すことでキメラ二重特異 性抗体 (A69/B26/BBA)と同等の活性を有するヒト化二重特異性抗体 (ヒト化 A69 (hA6 9-PFL) /ヒト化 B26 (hB26-PF)/ヒト化 BBA (hAL-AQ) )を取得した（図 26)。各抗体可 変領域配列を以下の配列番号に示した。
(1)ヒトイ匕 A69抗体 VH (hA69-PFL) 配列番号： 19 (塩基配列）、配列番号： 20 (ァミノ 酸配列）
(2)ヒト化 B26抗体 VH (hB26-PF) 配列番号： 21 (塩基配列）、配列番号： 22 (アミノ酸 配列）
(3)ヒト化 BBA抗体 VL (hAL-AQ) 配列番号： 23 (塩基配列）、配列番号： 24 (ァミノ 酸配列）
[0281] 〔実施例 15〕二重特異性抗体の形成効率向上に向けた定常領域のアミノ酸改変箇 所の選定
定常領域 CH3界面に存在するアミノ酸を改変し、電荷的反発を利用してヘテロダイ マーである二重特異性抗体の形成効率の上昇を目指して検討を行った。はじめにじ H3領域の結晶構造 (Protein Data bank, PDB code 10QX)より、 CH3ホモダイマー开 成時に静電的相互作用を形成しているペアのアミノ酸を探索した。その結果、 CH3ホ モダイマー形成時の界面においては、 H鎖 356番目と 439番目、 357番目と 370番目、 3 99番目と 409番目の 3つのペア（番号は EUナンバーリング（Kabat EA et al. 1991. Se quences of Proteins of Immunological Interest. NIH) )力 それぞれ正電荷と負電荷 を有し静電的相互作用をしていることが見出され、改変箇所として選択された。改変 方法としては、ペアとなっている正電荷と負電荷のアミノ酸の電荷を入れ替える改変 を施すことによって、ヘテロダイマーの形成が促進されると考えた。本制御の原理に ついて図 27に示した。また、同時に CH3界面にジスルフイド結合を導入する改変も試 みた。改変したアミノ酸の箇所にっ 、て表 1にまとめた。
[0282] 〔実施例 16〕ヒト化二重特異性抗体の定常領域 CH3界面のアミノ酸改変
実施例 15で選定された H鎖定常領域 CH3界面のアミノ酸を改変するために、以下 のような操作を行った。ヒ HgGlおよびヒ HgG4の H鎖定常領域遺伝子を铸型にして H 鎖定常領域の N末端側の 2アミノ酸 (Ala-Ser)をコードする塩基配列が Nhel認識配列（ GCTAGC)になるように設計した 5，末端プライマーと 3，末端にアニーリングし、かつ No tl認識部位を持つように設計したプライマーを用いて各 H鎖定常領域を PCR増幅し、 pBluescriptKS+ベクター（東洋紡）を Nhel, Notl (ともに宝酒造)で消化したベクターと連 結した pBCH(IgGl定常領域遺伝子を含む)および pBCH4(IgG4定常領域遺伝子を含 む)を作製した。ヒト化 A69抗体およびヒト化 B26抗体の H鎖可変領域の 5 '末端塩基配 列に相補的でコザック配列 (CCACC)および EcoRI認識配列を有するプライマーと Nhe I認識配列を有する 3'末端塩基配列にプライマーを用いて PCRを行い、得られた PCR 産物を EcoRI, Nhel (ともに宝酒造)で消化した pBCHまたは pBCH4に挿入して可変領 域と定常領域を連結した。つづ 、て H鎖定常領域の CH3界面に存在するアミノ酸を 変するために、 QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene) 用いて、 添付説明書記載の方法で H鎖定常領域に変異を導入した。 目的の H鎖定常領域遺 伝子配列であることが確認された H鎖遺伝子断片挿入プラスミドを EcoRIおよび NotI( ともに宝酒造)で消化した後に、反応液を 1 %ァガローズゲル電気泳動に供した。 目的 のサイズ（約 1400 bp)の H鎖遺伝子断片を QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN)を 用いて、添付説明書記載の方法で精製し、滅菌水 30 1で溶出した。その後、 EcoRI および Notlで消化した pCAGGSに挿入し、発現プラスミドを作製した。ヒト化二重特異 性抗体の調製については、実施例 14— 3に示す方法に従った。改変したアミノ酸の 箇所について表 1にまとめた。表 1の中の改変箇所番号については、 EUナンバーリン グ (Kaoat EA et al. 1991. Sequences of Proteins of Immunological Interest. NIH) 採用した。改変箇所番号の前のアルファベットは改変前のアミノ酸の一文字表記であ り、改変箇所番号の後ろのアルファベットは改変後のアミノ酸の一文字表記を示して いる。
[表 1] Name ヒト化 A69抗体 H鎖定常領域 ヒト化 B26抗体 H鎖定常領域
改変箇所 アミノ酸配列番号 改変箇所 アミノ酸配列番号 wild type 一 25 一 25
KiH Y349C.T366W 9 E356C.T366S, L368AtY407V 1 1 s1 R409D 26 D399K 27 s2 K370E 28 E357K 29
S3 K439E 30 E356K 31 w1 R409D.K370E 32 D399K,E357K 33
(D
cn w2 R409D.K439E 34 D399K,E356K 35
w3 K370E.K439E 36 E357K,E356K 37
S1 C 409D.Y349C 38 D399K,S354C 39 s2C K370E.Y349C 40 E357K.S354C 41 s3C K439E.Y349C 42 E356K.S354C 43 w3C K370E,K439E,Y349C 44 E357K,E356K,S354C 45
W3C2 K370E,K439E,S354C 46 E357K,E356K,Y349C 47 wild type 一 48 一 48
KiH Y349C.T366W 49 D356C,T366S,L368A,Y407V 50
O w1 R409D.K370E 51 D399K,E357K 52
w2 R409D.K439E 53 D399K,E356K 54 w3 K370E.K439E 55 E357K,E356K 56
[0284] 上記表中、 KiHは非特許文献 3に記載の Knobs-into-holes技術を用いた改変体を 示す。
[0285] 〔実施例 17〕 CH3界面を改変した二重特異性抗体 (IgG4型）の形成効率および安定 性の評価
IgG4型の Wild type, KiH, si, s2, s3, wl, w2, w3, slC, s2C, s3C, w3C, w3C2に関 して、陽イオン交換クロマトグラフィー (IEX)により分析を行 、二重特異性抗体 (以下、 BiAb)の形成効率の評価を行った。陽イオン交換クロマトグラフィー分析条件は以下 のとおりであり、ヒト化 A69抗体のホモダイマーである A- Homo、ヒト化 A69抗体とヒト化 B26抗体のへテロダイマーである BiAb、ヒト化 B26抗体のホモダイマーである B- Homo のピーク面積比を算出した。
[0286] カラム： ProPac WCX— 10, 4 X 250 mm, (Dionex)
移動相： A: 10 mmol/L NaH PO /Na HPO , pH 6.25
2 4 2 4
B: 10 mmol/L NaH PO /Na HPO , 500 mmol/L NaCl, pH 6.25
2 4 2 4
流速： 1.0 mL/min
グラジェント：10%B(5 min)→(40 min)→60%B→(5 min)→100%B (5 min)
検出： 220nm
[0287] Wild type, KiH, s2, s3, slC, s2C, s3C, w3C, w3C2に関して、上述の IEX分析の際 に BiAbピークを分取することで、 BiAbを精製した。 BiAb画分を Amicon Ultra, MWCO 10000 (Millipore)による濃縮後、 20 mM sodium acetate, 150 mM NaCl, pH 6.0に対し て一晩冷所で透析を行い、その後回収し、 BiAb濃度を 0.1 mg/mLに統一し、ィ -シャ ルと 60°C-1週間として、各々 2本ずつのバイアルに分注し、 60°C-1週間の安定性試 験を行った。ゲルろ過クロマトグラフィー (SEC)により分析を行い、モノマーピークの残 存率（60°C-1週間サンプルのモノマーピーク面積 Iイニシャルサンプルのモノマーピ ーク面積 X 100)を算出した。ゲルろ過クロマトグラフィー分析条件は以下のとおりで ある。
[0288] カラム： Super3000 (TOSOH)
移動相： 50 mM sodium phosphate, 300 mM KC1, pH 7.0
流速： 0.2 ml/min
検出： 220 nm
[0289] IgG4型の Wild type, si, s2, s3, wlの IEXのクロマトグラムについて図 28に、 Wild ty pe, KiH, si, s2, s3, wl, w2, w3, slC, s2C, s3C, w3C, w3C2の A- Homo, BiAb, B— H omoの形成比率を図 29に示した。また、 60°C_1週間後のモノマー残存率を図 30に 示した。
[0290] 本実施例において見出された CH3界面改変体は、図 28、図 29に示したように、い ずれも wild typeと比較して、目的の BiAb形成効率が大きく向上した。 CH3は定常領 域にあたるため、天然のアミノ酸力 改変する場合、抗原性の点から改変箇所は少な いほう力 S望ましい。 KiHは、 knobと holeを導入するための両 H鎖計 4箇所の改変に加え て、ジスルフイド結合導入の 2箇所、合計 6箇所の改変が施されている。そのため、図 29に示したように高い BiAb形成効率を得ている。しかし、図 30に示した安定性試験 の結果から、熱安定性は wild typeと比較してジスルフイド結合を導入しているにも関 わらず大きく低下している。抗体を医療用医薬品として開発するにためには、安定な 製剤が必要であることから熱安定性は高 、ほうが望ま 、。
[0291] 一方で本実施例にお!ヽて見出された CH3界面改変体は、 Vヽずれも wild typeと比較 して、目的の BiAb形成効率を大きく向上させることに成功した。これらの改変体のうち 、例えば、 s2, s3, wl, w2, w3, slCは、 KiH (6箇所改変）よりも少ない合計 2箇所あるい は 4箇所の改変により、 90%以上の高い BiAb形成効率を得ており、抗原性のリスクは より小さいと考えられる。また、図 30に示した安定性試験の結果から、改変体のうち、 例えば、 s2, s3, w3, w3C, w3C2は、 90%以上の高い BiAb形成効率、かつ、 KiHよりも 高い熱安定性（モノマー残存率が高い）を有しており、 s3, s2c, s3C, w3C, w3C2は、 w ild typeよりもさらに高い熱安定性を有しており、安定な医薬品製剤を開発するには 有用である。
[0292] 本実施例において、 CH3界面における H鎖 356番目、 357番目、 370番目、 399番目 、 409番目、 439番目のアミノ酸を改変して電荷による分子反発を導入することによつ て、目的の BiAb形成効率が大きく向上できることを見出した。また、これらの単独、組 み合わせ、およびジスルフイド結合を導入することによって、 KiHよりも少ない改変で B iAb形成効率が大きく向上できること、および、 KiHより高い安定性、さらには wild type よりも高い熱安定性で BiAb形成効率が大きく向上できることを見出した。
[0293] 〔実施例 18〕 CH3界面を改変した二重特異性抗体の凝固活性の評価
実施例 16において精製された CH3界面を改変した IgG4型の二重特異性抗体 (si , s2, s3, wl, w2, w3)を用いて、実施例 5に示す方法に従って凝固活性を評価した。図 31に示すとおり定常領域 CH3界面のアミノ酸を改変しても凝固活性は変化しないこと から、 CH3界面のアミノ酸改変は抗原との反応に関与する可変領域の構造に影響を 与えないことが示された。
[0294] 〔実施例 19〕 CH3界面を改変した二重特異性抗体 (IgGl型）の形成効率の評価
IgGl型の Wild type, KiH, wl, w2, w3に関して、陽イオン交換クロマトグラフィー (IEX )により分析を行 、BiAb形成効率の評価を行った。陽イオン交換クロマトグラフィー分 析条件は以下のとおりであり、ヒト化 A69抗体のホモダイマーである A-Homo、ヒト化 A 69抗体とヒト化 B26抗体のへテロダイマーである BiAb、ヒト化 B26抗体のホモダイマー である B- Homoのピーク面積比を算出した。
[0295] カラム： ProPac WCX- 10, 4 X 250 mm, (Dionex)
移動相： A: 10 mmol/L NaH PO /Na HPO , pH 6.25
2 4 2 4
B: 10 mmol/L NaH PO /Na HPO , 500 mmol/L NaCl, pH 6.25
2 4 2 4
流速： 1.0 mL/min グラジェント：10%B(5 min)→(40 min)→60%B→(5 min)→100%B (5 min) 検出： 220nm
[0296] IgGl型の Wild type, KiH, wl, w2, w3の A- Homo, BiAb, B- Homoの形成比率を図 3 2に示した。 IgG4型と同様に、いずれも wild typeと比較して、目的の BiAb形成効率が 大きく向上した。 IgG4型と同様に、 KiHよりも少ない 4箇所の改変により、 90%以上の 高い BiAb形成効率を得ており、抗原性のリスクはより小さいと考えられる。本実施例 において、 CH3界面における H鎖 356番目、 357番目、 370番目、 399番目、 409番目、 439番目のアミノ酸を改変する方法は、抗体定常領域のサブクラスが IgG4だけでなく I gGlにも適用可能であり、 IgG抗体全般に応用できることが見出された。
産業上の利用可能性
[0297] 本発明の方法においては、アミノ酸の置換数が少数でよいことから、元のポリぺプ チドの構造'機能 (活性)を変化させることなぐ会合を制御させることが可能であり、 非常に有用性が高い。また、抗原性への影響も少ない。
本発明の方法を用いることにより、実際に活性を保持する二重特異性抗体の効率 的な取得が可能である。

Claims

請求の範囲
[I] ポリペプチドの会合が制御されるようにポリペプチド内の界面を形成するアミノ酸残 基に変異を有するポリペプチドの製造方法であって、 (a)ポリペプチド内の界面を形 成するアミノ酸残基をコードする核酸を、ポリペプチド内の会合が阻害されるように元 の核酸から改変し、（b)宿主細胞を該核酸が発現するように培養し、（c)宿主細胞培 養物から該ポリペプチドを回収することを含むポリペプチド変異体の製造方法。
[2] 異種多量体の会合が制御されるようにポリペプチド間の界面を形成するアミノ酸残 基に変異を有する異種多量体の製造方法であって、 (a)ポリペプチド間の界面を形 成するアミノ酸残基をコードする核酸を、ポリペプチド間の会合が阻害されるように元 の核酸から改変し、（b)宿主細胞を該核酸が発現するように培養し、（c)宿主細胞培 養物から該異種多量体を回収することを含む異種多量体の製造方法。
[3] 2種以上の構造異性体を形成し得るポリペプチドにおいて、 1種以上の構造異性体 を形成するポリペプチドの会合が阻害されるように、ポリペプチド内の界面を形成す るアミノ酸残基をコードする核酸を元の核酸から改変する請求項 1に記載の方法。
[4] 2種以上の多量体を形成し得る異種多量体において、 1種以上の多量体を形成す るポリペプチド間の会合が阻害されるように、ポリペプチド間の界面を形成するァミノ 酸残基をコードする核酸を元の核酸から改変する請求項 2に記載の方法。
[5] 工程 (a)の改変が、界面を形成する 2残基以上のアミノ酸残基が同種の電荷となる ように該界面にアミノ酸残基の変異が導入されるように、元の核酸を改変することであ る、請求項 1または 2に記載の方法。
[6] 導入されるアミノ酸残基がグルタミン酸 (E)である請求項 5に記載の方法。
[7] 導入されるアミノ酸残基がァスパラギン酸 (D)である請求項 5に記載の方法。
[8] 導入されるアミノ酸残基がリジン (K)である請求項 5に記載の方法。
[9] 導入されるアミノ酸残基がアルギニン (R)である請求項 5に記載の方法。
[10] 導入されるアミノ酸残基がヒスチジン (H)である請求項 5に記載の方法。
[II] 工程 (a)の改変が、界面に存在する疎水性コアを形成するアミノ酸残基が電荷を有 するアミノ酸残基となるように該界面にアミノ酸残基の変異が導入されるように、元の 核酸を改変することである、請求項 1または 2に記載の方法。
[12] 導入されるアミノ酸残基がグルタミン酸 (E)である請求項 11に記載の方法。
[13] 導入されるアミノ酸残基がァスパラギン酸 (D)である請求項 11に記載の方法。
[14] 導入されるアミノ酸残基がリジン (K)である請求項 11に記載の方法。
[15] 導入されるアミノ酸残基がアルギニン (R)である請求項 11に記載の方法。
[16] 導入されるアミノ酸残基がヒスチジン (H)である請求項 11に記載の方法。
[17] ポリペプチドの界面が、抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域により形成され る請求項 1または 2に記載の方法。
[18] ポリペプチドの界面が、 2種以上の重鎖可変領域により形成される請求項 1または 2 に記載の方法。
[19] ポリペプチドの界面が、抗体の重鎖定常領域および軽鎖定常領域により形成され る請求項 1または 2に記載の方法。
[20] ポリペプチドの界面が、 2種以上の重鎖定常領域により形成される請求項 1または 2 に記載の方法。
[21] ポリペプチドが、 2つ以上の重鎖可変領域と 2つ以上の軽鎖可変領域をリンカ一で 結合した一本鎖ポリペプチドである請求項 1に記載の方法。
[22] 異種多量体が、 2種以上の重鎖可変領域と 2種以上の軽鎖可変領域を含む多重 特異性抗体である請求項 2に記載の方法。
[23] 異種多量体が、二重特異性抗体である請求項 22に記載の方法。
[24] 請求項 1または 2に記載の方法により製造されるポリペプチド変異体または異種多 量体。
[25] ポリペプチド変異体であって、元のポリペプチド内の会合が阻害されるように、該ポ リペプチド内の界面を形成するアミノ酸残基の改変を有するポリペプチド変異体。
[26] 異種多量体であって、元のポリペプチド間の会合が阻害されるように、該ポリべプチ ド間の界面を形成するアミノ酸残基の改変を有する異種多量体。
[27] 元のポリペプチドが 2種以上の構造異性体を形成し得る、請求項 25に記載のポリ ペプチド変異体。
[28] 元のポリペプチドが 2種以上の多量体を形成し得る、請求項 26に記載の異種多量 体。
[29] 前記ポリペプチドの界面を形成するアミノ酸残基の改変が、界面を形成する 2残基 以上のアミノ酸残基が同種の電荷となるように該界面にアミノ酸残基の変異を導入す ることである、請求項 25に記載のポリペプチド変異体または請求項 26に記載の異種 多量体。
[30] 導入されるアミノ酸残基がグルタミン酸 (E)である請求項 29に記載のポリペプチド変 異体または異種多量体。
[31] 導入されるアミノ酸残基がァスパラギン酸 (D)である請求項 29に記載のポリべプチ ド変異体または異種多量体。
[32] 導入されるアミノ酸残基がリジン (K)である請求項 29に記載のポリペプチド変異体 または異種多量体。
[33] 導入されるアミノ酸残基がアルギニン (R)である請求項 29に記載のポリペプチド変 異体または異種多量体。
[34] 導入されるアミノ酸残基がヒスチジン (H)である請求項 29に記載のポリペプチド変 異体または異種多量体。
[35] 前記ポリペプチドの界面を形成するアミノ酸残基の改変力 界面に存在する疎水性 コアを形成するアミノ酸残基が電荷を有するアミノ酸残基となるように該界面にァミノ 酸残基の変異を導入することである請求項 25に記載のポリペプチド変異体または請 求項 26に記載の異種多量体。
[36] 導入されるアミノ酸残基がグルタミン酸 (E)である請求項 35に記載のポリペプチド変 異体または異種多量体。
[37] 導入されるアミノ酸残基がァスパラギン酸 (D)である請求項 35に記載のポリべプチ ド変異体または異種多量体。
[38] 導入されるアミノ酸残基がリジン (K)である請求項 35に記載のポリペプチド変異体 または異種多量体。
[39] 導入されるアミノ酸残基がアルギニン (R)である請求項 35に記載のポリペプチド変 異体または異種多量体。
[40] 導入されるアミノ酸残基がヒスチジン (H)である請求項 35に記載のポリペプチド変 異体または異種多量体。
[41] ポリペプチドの界面が、抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域により形成され る請求項 25に記載のポリペプチド変異体または請求項 26に記載の異種多量体。
[42] ポリペプチドの界面が、 2種以上の重鎖可変領域により形成される請求項 25に記 載のポリペプチド変異体または請求項 26に記載の異種多量体。
[43] ポリペプチドの界面が、抗体の重鎖定常領域および軽鎖定常領域により形成され る請求項 25に記載のポリペプチド変異体または請求項 26に記載の異種多量体。
[44] ポリペプチドの界面が、 2種以上の重鎖定常領域により形成される請求項 25に記 載のポリペプチド変異体または請求項 26に記載の異種多量体。
[45] ポリペプチドが、 2つ以上の重鎖可変領域と 2つ以上の軽鎖可変領域をリンカ一で 結合した一本鎖ポリペプチドである請求項 25に記載のポリペプチド変異体。
[46] 異種多量体が、 2種以上の重鎖可変領域と 2種以上の軽鎖可変領域を含む多重 特異性抗体である請求項 26に記載の異種多量体。
[47] 異種多量体が、二重特異性抗体である請求項 46に記載の異種多量体。
[48] 請求項 25に記載のポリペプチド変異体または請求項 26に記載の異種多量体、お よび医薬的に許容される担体を含む組成物。
[49] 請求項 25に記載のポリペプチド変異体または請求項 26に記載の異種多量体をコ ードする核酸。
[50] 請求項 49に記載の核酸を有する宿主細胞。
[51] 請求項 50に記載の宿主細胞を培養する工程、細胞培養物からポリペプチドを回収 する工程を含む請求項 25に記載のポリペプチド変異体または請求項 26に記載の異 種多量体の製造方法。
[52] ポリペプチドの会合制御方法であって、ポリペプチド内の会合が阻害されるように、 元のポリペプチド内の界面を形成するアミノ酸残基を改変することを含むポリべプチ ドの会合制御方法。
[53] 異種多量体の会合制御方法であって、ポリペプチド間の会合が阻害されるように、 元のポリペプチド間の界面を形成するアミノ酸残基を改変することを含む異種多量体 の会合制御方法。
[54] 2種以上の構造異性体を形成し得るポリペプチドにおいて、 1種以上の構造異性体 を形成するポリペプチドの会合が阻害されるように、ポリペプチド内の界面を形成す るアミノ酸残基を改変する請求項 52に記載の方法。
[55] 2種以上の多量体を形成し得る異種多量体において、 1種以上の多量体を形成す るポリペプチド間の会合が阻害されるように、ポリペプチド間の界面を形成するァミノ 酸残基を改変する請求項 53に記載の方法。
[56] 前記ポリペプチドの界面を形成するアミノ酸残基の改変が、界面を形成する 2残基 以上のアミノ酸残基が同種の電荷となるように該界面にアミノ酸残基の変異を導入す ることである、請求項 52または 53に記載の方法。
[57] 導入されるアミノ酸残基がグルタミン酸 (E)である請求項 56に記載の方法。
[58] 導入されるアミノ酸残基がァスパラギン酸 (D)である請求項 56に記載の方法。
[59] 導入されるアミノ酸残基がリジン (K)である請求項 56に記載の方法。
[60] 導入されるアミノ酸残基がアルギニン (R)である請求項 56に記載の方法。
[61] 導入されるアミノ酸残基がヒスチジン (H)である請求項 56に記載の方法。
[62] 前記ポリペプチドの界面を形成するアミノ酸残基の改変力 界面に存在する疎水性 コアを形成するアミノ酸残基が電荷を有するアミノ酸残基となるように該界面にァミノ 酸残基の変異を導入することである、請求項 52または 53に記載の方法。
[63] 導入されるアミノ酸残基がグルタミン酸 (E)である請求項 62に記載の方法。
[64] 導入されるアミノ酸残基がァスパラギン酸 (D)である請求項 62に記載の方法。
[65] 導入されるアミノ酸残基がリジン (K)である請求項 62に記載の方法。
[66] 導入されるアミノ酸残基がアルギニン (R)である請求項 62に記載の方法。
[67] 導入されるアミノ酸残基がヒスチジン (H)である請求項 62に記載の方法。
[68] ポリペプチドの界面が、抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域により形成され る請求項 52または 53に記載の方法。
[69] ポリペプチドの界面が、 2種以上の重鎖可変領域により形成される請求項 52または
53に記載の方法。
[70] ポリペプチドの界面が、抗体の重鎖定常領域および軽鎖定常領域により形成され る請求項 52または 53に記載の方法。
[71] ポリペプチドの界面が、 2種以上の重鎖定常領域により形成される請求項 52または 53に記載の方法。
[72] ポリペプチドが、 2つ以上の重鎖可変領域と 2つ以上の軽鎖可変領域をリンカ一で 結合した一本鎖ポリペプチドである請求項 52に記載の方法。
[73] 異種多量体が、 2種以上の重鎖可変領域と 2種以上の軽鎖可変領域を含む多重 特異性抗体である請求項 53に記載の方法。
[74] 異種多量体が、二重特異性抗体である請求項 73に記載の方法。
[75] 重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む抗体であって、以下の（1)および (2)の アミノ酸残基が同種の電荷を有するアミノ酸残基である抗体。
(1)重鎖可変領域に含まれるアミノ酸残基であって、配列番号: 6に記載のアミノ酸 配列における 39位に相当するアミノ酸残基
(2)軽鎖可変領域に含まれるアミノ酸残基であって、配列番号： 8に記載のアミノ酸 配列における 44位に相当するアミノ酸残基
[76] 重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む抗体であって、以下の（1)および (2)の アミノ酸残基が同種の電荷を有するアミノ酸残基である抗体。
(1)重鎖可変領域に含まれるアミノ酸残基であって、配列番号: 6に記載のアミノ酸 配列における 45位に相当するアミノ酸残基
(2)軽鎖可変領域に含まれるアミノ酸残基であって、配列番号： 8に記載のアミノ酸 配列における 50位に相当するアミノ酸残基
[77] 重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む抗体であって、以下の（1)または（2)の V、ずれか一方が電荷を有するアミノ酸残基である抗体。
(1)重鎖可変領域に含まれるアミノ酸残基であって、配列番号: 6に記載のアミノ酸 配列における 45位に相当するアミノ酸残基
(2)軽鎖可変領域に含まれるアミノ酸残基であって、配列番号： 8に記載のアミノ酸 配列における 50位に相当するアミノ酸残基
[78] 前記同種の電荷を有するアミノ酸残基が、以下の（a)または (b) V、ずれかの群に含 まれるアミノ酸残基から選択される請求項 75または 76に記載の抗体：
(a)グルタミン酸 (E)、ァスパラギン酸 (D)；
(b)リジン（K)、ァノレギニン（R)、ヒスチジン（H)。
[79] 前記電荷を有するアミノ酸残基が、グルタミン酸 (E)、ァスパラギン酸 (D)、リジン (K
)、アルギニン (R)またはヒスチジン (H)である請求項 77に記載の抗体。
[80] ポリペプチドが、 2つ以上の重鎖可変領域と 2つ以上の軽鎖可変領域をリンカ一で 結合した一本鎖ポリペプチドである請求項 75〜77のいずれか 1項に記載の抗体。
[81] ポリペプチドが、 2種以上の重鎖可変領域と 2種以上の軽鎖可変領域を含む多重 特異性抗体である請求項 75〜77のいずれか 1項に記載の抗体。
[82] ポリペプチドが、二重特異性抗体である請求項 81に記載の抗体。
[83] 請求項 75〜77のいずれか 1項に記載の抗体および医薬的に許容される担体を含 む糸且成物。
[84] 請求項 75〜77のいずれか 1項に記載の抗体を構成するポリペプチドをコードする 核酸。
[85] 請求項 84に記載の核酸を有する宿主細胞。
[86] 請求項 85に記載の宿主細胞を培養する工程、細胞培養物からポリペプチドを回収 する工程を含む請求項 75〜77のいずれか 1項に記載の抗体の製造方法。
[87] 2種以上の重鎖 CH3領域を含む抗体であって、第 1の重鎖 CH3領域における以 下の（1)〜（3)に示すアミノ酸残基の組から選択される 1組ないし 3組のアミノ酸残基 が同種の電荷を有する抗体。
(1)重鎖 CH3領域に含まれるアミノ酸残基であって、 EUナンバーリングによる 356 位および 439位のアミノ酸残基
(2)重鎖 CH3領域に含まれるアミノ酸残基であって、 EUナンバーリングによる 357 位および 370位のアミノ酸残基
(3)重鎖 CH3領域に含まれるアミノ酸残基であって、 EUナンバーリングによる 399 位および 409位のアミノ酸残基
[88] 第 2の重鎖 CH3領域における前記（1)〜（3)に示すアミノ酸残基の組から選択され るアミノ酸残基の組であって、前記第 1の重鎖 CH3領域において同種の電荷を有す る前記（1)〜（3)に示すアミノ酸残基の組に対応する 1組ないし 3組のアミノ酸残基が 、前記第 1の重鎖 CH3領域における対応するアミノ酸残基とは反対の電荷を有する 請求項 87に記載の抗体。
[89] 前記同種の電荷を有するアミノ酸残基が、以下の（a)または (b) V、ずれかの群に含 まれるアミノ酸残基から選択される請求項 87に記載の抗体：
(a)グルタミン酸 (E)、ァスパラギン酸 (D)；
(b)リジン（K)、ァノレギニン（R)、ヒスチジン（H)。
[90] 前記第 1の重鎖 CH3領域と第 2の重鎖 CH3領域がジスルフイド結合により架橋して
V、る請求項 87に記載の抗体。
[91] 2種以上の重鎖定常領域を有する抗体である請求項 87に記載の抗体。
[92] 2種以上の重鎖可変領域と 2種以上の軽鎖可変領域を含む多重特異性抗体であ る請求項 87に記載の抗体。
[93] 二重特異性抗体である請求項 92に記載の抗体。
[94] 請求項 87に記載の抗体および医薬的に許容される担体を含む組成物。
[95] 請求項 87に記載の抗体を構成するポリペプチドをコードする核酸。
[96] 請求項 95に記載の核酸を有する宿主細胞。
[97] 請求項 96に記載の宿主細胞を培養する工程、細胞培養物からポリペプチドを回収 する工程を含む請求項 87に記載の抗体の製造方法。
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Cited By (291)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007114325A1 (ja) * 2006-03-31 2007-10-11 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha 二重特異性抗体を精製するための抗体改変方法
US20100015133A1 (en) * 2005-03-31 2010-01-21 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Methods for Producing Polypeptides by Regulating Polypeptide Association
JP2011508604A (ja) * 2008-01-07 2011-03-17 アムジェン インコーポレイテッド 静電的ステアリング（ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃｓｔｅｅｒｉｎｇ）効果を用いた抗体Ｆｃヘテロ二量体分子を作製するための方法
WO2011078332A1 (ja) * 2009-12-25 2011-06-30 中外製薬株式会社 ポリペプチド多量体を精製するためのポリペプチドの改変方法
WO2011092989A1 (ja) 2010-01-29 2011-08-04 東レ株式会社 ポリ乳酸系樹脂シート
US8062635B2 (en) 2003-10-10 2011-11-22 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Bispecific antibody substituting for functional proteins
WO2012067176A1 (ja) 2010-11-17 2012-05-24 中外製薬株式会社 血液凝固第viii因子の機能を代替する機能を有する多重特異性抗原結合分子
WO2012073985A1 (ja) 2010-11-30 2012-06-07 中外製薬株式会社 細胞傷害誘導治療剤
WO2012133782A1 (ja) 2011-03-30 2012-10-04 中外製薬株式会社 抗原結合分子の血漿中滞留性と免疫原性を改変する方法
JP2012525149A (ja) * 2009-04-27 2012-10-22 オンコメッド ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド ヘテロ多量体分子を作製するための方法
WO2013002362A1 (ja) 2011-06-30 2013-01-03 中外製薬株式会社 ヘテロ二量化ポリペプチド
US20130039913A1 (en) * 2010-04-20 2013-02-14 Genmab A/S Heterodimeric antibody fc-containing proteins and methods for production thereof
KR101249607B1 (ko) 2007-12-21 2013-04-02 에프. 호프만-라 로슈 아게 2가, 이중특이적 항체
US8409577B2 (en) 2006-06-12 2013-04-02 Emergent Product Development Seattle, Llc Single chain multivalent binding proteins with effector function
JP2013511281A (ja) * 2009-11-23 2013-04-04 アムジェン インコーポレイテッド 単量体抗体Ｆｃ
WO2013065708A1 (ja) 2011-10-31 2013-05-10 中外製薬株式会社 重鎖と軽鎖の会合が制御された抗原結合分子
KR101265912B1 (ko) 2007-12-21 2013-05-20 에프. 호프만-라 로슈 아게 ２가, 이중특이적 항체
KR101266659B1 (ko) * 2007-12-21 2013-05-29 에프. 호프만-라 로슈 아게 ２가, 이중특이적 항체
KR101265855B1 (ko) 2007-12-21 2013-05-31 에프. 호프만-라 로슈 아게 2가, 이중특이적 항체
WO2013081143A1 (ja) 2011-11-30 2013-06-06 中外製薬株式会社 免疫複合体を形成する細胞内への運搬体（キャリア）を含む医薬
EP2604625A1 (en) 2011-09-26 2013-06-19 Merus B.V. Generation of binding molecules
WO2013125667A1 (ja) 2012-02-24 2013-08-29 中外製薬株式会社 FcγRIIBを介して抗原の消失を促進する抗原結合分子
US8597911B2 (en) 2003-06-11 2013-12-03 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Process for producing antibodies
WO2013180200A1 (ja) 2012-05-30 2013-12-05 中外製薬株式会社 標的組織特異的抗原結合分子
WO2013187495A1 (ja) 2012-06-14 2013-12-19 中外製薬株式会社 改変されたFc領域を含む抗原結合分子
WO2014030728A1 (ja) 2012-08-24 2014-02-27 中外製薬株式会社 FcγRIIb特異的Fc領域改変体
WO2014069647A1 (ja) * 2012-11-05 2014-05-08 全薬工業株式会社 抗体又は抗体組成物の製造方法
WO2014082179A1 (en) * 2012-11-28 2014-06-05 Zymeworks Inc. Engineered immunoglobulin heavy chain-light chain pairs and uses thereof
JP2014122226A (ja) * 2007-05-31 2014-07-03 Genmab As 安定なＩｇＧ４抗体
WO2014104165A1 (ja) 2012-12-27 2014-07-03 中外製薬株式会社 ヘテロ二量化ポリペプチド
US8853366B2 (en) 2001-01-17 2014-10-07 Emergent Product Development Seattle, Llc Binding domain-immunoglobulin fusion proteins
WO2014163101A1 (ja) 2013-04-02 2014-10-09 中外製薬株式会社 Ｆｃ領域改変体
US8858941B2 (en) 2011-09-23 2014-10-14 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. VEGF/DLL4 binding agents and uses thereof
WO2015046467A1 (ja) 2013-09-27 2015-04-02 中外製薬株式会社 ポリペプチド異種多量体の製造方法
WO2015046554A1 (ja) 2013-09-30 2015-04-02 中外製薬株式会社 改変されたヘルパーファージを用いて抗原結合分子を作製する方法
WO2015068847A1 (ja) 2013-11-11 2015-05-14 中外製薬株式会社 改変された抗体可変領域を含む抗原結合分子
WO2015083764A1 (ja) 2013-12-04 2015-06-11 中外製薬株式会社 化合物の濃度に応じて抗原結合能の変化する抗原結合分子及びそのライブラリ
WO2015107026A1 (en) 2014-01-15 2015-07-23 F. Hoffmann-La Roche Ag Fc-region variants with modified fcrn- and maintained protein a-binding properties
US9096651B2 (en) 2007-09-26 2015-08-04 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method of modifying isoelectric point of antibody via amino acid substitution in CDR
JP2015522295A (ja) * 2012-07-25 2015-08-06 スーチョウ アルファマブ カンパニー リミテッド 電荷の斥力相互作用を使用することによりホモダイマータンパク質の混合物を調製するための方法
US9101609B2 (en) 2008-04-11 2015-08-11 Emergent Product Development Seattle, Llc CD37 immunotherapeutic and combination with bifunctional chemotherapeutic thereof
WO2015138920A1 (en) 2014-03-14 2015-09-17 Novartis Ag Antibody molecules to lag-3 and uses thereof
WO2015142675A2 (en) 2014-03-15 2015-09-24 Novartis Ag Treatment of cancer using chimeric antigen receptor
WO2015187779A1 (en) 2014-06-03 2015-12-10 Xbiotech, Inc. Compositions and methods for treating and preventing staphylococcus aureus infections
US9212230B2 (en) 2007-03-29 2015-12-15 Genmab A/S Bispecific antibodies and methods for production thereof
JP2015536349A (ja) * 2012-11-21 2015-12-21 アムジエン・インコーポレーテツド ヘテロ二量体免疫グロブリン
US9228020B2 (en) 2006-09-29 2016-01-05 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for diagnosing and treating cancer
US9228017B2 (en) 2009-03-19 2016-01-05 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antibody constant region variant
WO2016014530A1 (en) 2014-07-21 2016-01-28 Novartis Ag Combinations of low, immune enhancing. doses of mtor inhibitors and cars
WO2016014565A2 (en) 2014-07-21 2016-01-28 Novartis Ag Treatment of cancer using humanized anti-bcma chimeric antigen receptor
WO2016014553A1 (en) 2014-07-21 2016-01-28 Novartis Ag Sortase synthesized chimeric antigen receptors
US9248182B2 (en) 2012-04-20 2016-02-02 Merus B.V. Methods and means for the production of Ig-like molecules
WO2016025880A1 (en) 2014-08-14 2016-02-18 Novartis Ag Treatment of cancer using gfr alpha-4 chimeric antigen receptor
WO2016044605A1 (en) 2014-09-17 2016-03-24 Beatty, Gregory Targeting cytotoxic cells with chimeric receptors for adoptive immunotherapy
WO2016061142A1 (en) 2014-10-14 2016-04-21 Novartis Ag Antibody molecules to pd-l1 and uses thereof
WO2016090034A2 (en) 2014-12-03 2016-06-09 Novartis Ag Methods for b cell preconditioning in car therapy
US9399680B2 (en) 2007-12-05 2016-07-26 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Nucleic acids encoding anti-NR10 antibodies
JP2016522168A (ja) * 2013-04-05 2016-07-28 ジェネンテック， インコーポレイテッド 抗ｉｌ−４抗体及び二重特異性抗体及びその使用
WO2016159213A1 (ja) * 2015-04-01 2016-10-06 中外製薬株式会社 ポリペプチド異種多量体の製造方法
WO2016164731A2 (en) 2015-04-08 2016-10-13 Novartis Ag Cd20 therapies, cd22 therapies, and combination therapies with a cd19 chimeric antigen receptor (car) - expressing cell
WO2016166014A1 (en) 2015-04-17 2016-10-20 F. Hoffmann-La Roche Ag Combination therapy with coagulation factors and multispecific antibodies
WO2016172583A1 (en) 2015-04-23 2016-10-27 Novartis Ag Treatment of cancer using chimeric antigen receptor and protein kinase a blocker
US9480744B2 (en) 2010-09-10 2016-11-01 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Methods for treating melanoma
US9493578B2 (en) 2009-09-02 2016-11-15 Xencor, Inc. Compositions and methods for simultaneous bivalent and monovalent co-engagement of antigens
US9499605B2 (en) 2011-03-03 2016-11-22 Zymeworks Inc. Multivalent heteromultimer scaffold design and constructs
US9511139B2 (en) 2009-10-16 2016-12-06 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Therapeutic combination and methods of treatment with a DLL4 antagonist and an anti-hypertensive agent
WO2017019894A1 (en) 2015-07-29 2017-02-02 Novartis Ag Combination therapies comprising antibody molecules to lag-3
WO2017019897A1 (en) 2015-07-29 2017-02-02 Novartis Ag Combination therapies comprising antibody molecules to tim-3
US9599620B2 (en) 2012-10-31 2017-03-21 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Methods and monitoring of treatment with a DLL4 antagonist
US9605084B2 (en) 2013-03-15 2017-03-28 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
US9605061B2 (en) 2010-07-29 2017-03-28 Xencor, Inc. Antibodies with modified isoelectric points
WO2017070608A1 (en) 2015-10-23 2017-04-27 Eureka Therapeutics, Inc. Antibody/t-cell receptor chimeric constructs and uses thereof
US9650446B2 (en) 2013-01-14 2017-05-16 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
WO2017086419A1 (ja) 2015-11-18 2017-05-26 中外製薬株式会社 液性免疫応答の増強方法
WO2017086367A1 (ja) 2015-11-18 2017-05-26 中外製薬株式会社 免疫抑制機能を有する細胞に対するｔ細胞リダイレクト抗原結合分子を用いた併用療法
US9676845B2 (en) 2009-06-16 2017-06-13 Hoffmann-La Roche, Inc. Bispecific antigen binding proteins
WO2017106810A2 (en) 2015-12-17 2017-06-22 Novartis Ag Combination of c-met inhibitor with antibody molecule to pd-1 and uses thereof
WO2017106656A1 (en) 2015-12-17 2017-06-22 Novartis Ag Antibody molecules to pd-1 and uses thereof
US9688762B2 (en) 2007-09-26 2017-06-27 Chugai Sciyaku Kabushiki Kaisha Modified antibody constant region
WO2017110980A1 (ja) 2015-12-25 2017-06-29 中外製薬株式会社 増強された活性を有する抗体及びその改変方法
US9701759B2 (en) 2013-01-14 2017-07-11 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
WO2017125897A1 (en) 2016-01-21 2017-07-27 Novartis Ag Multispecific molecules targeting cll-1
US9738722B2 (en) 2013-01-15 2017-08-22 Xencor, Inc. Rapid clearance of antigen complexes using novel antibodies
WO2017149515A1 (en) 2016-03-04 2017-09-08 Novartis Ag Cells expressing multiple chimeric antigen receptor (car) molecules and uses therefore
KR20170104635A (ko) 2014-09-26 2017-09-15 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 세포상해 유도 치료제
WO2017159287A1 (ja) 2016-03-14 2017-09-21 中外製薬株式会社 癌の治療に用いるための細胞傷害誘導治療剤
US9771573B2 (en) 2012-10-03 2017-09-26 Zymeworks Inc. Methods of quantitating heavy and light chain polypeptide pairs
WO2017165683A1 (en) 2016-03-23 2017-09-28 Novartis Ag Cell secreted minibodies and uses thereof
WO2017181119A2 (en) 2016-04-15 2017-10-19 Novartis Ag Compositions and methods for selective protein expression
US9822186B2 (en) 2014-03-28 2017-11-21 Xencor, Inc. Bispecific antibodies that bind to CD38 and CD3
WO2017210617A2 (en) 2016-06-02 2017-12-07 Porter, David, L. Therapeutic regimens for chimeric antigen receptor (car)- expressing cells
US9850320B2 (en) 2014-11-26 2017-12-26 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies to CD3 X CD20
US9856327B2 (en) 2014-11-26 2018-01-02 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies to CD3 X CD123
US9868948B2 (en) 2008-04-11 2018-01-16 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antigen-binding molecule capable of binding to two or more antigen molecules repeatedly
WO2018013918A2 (en) 2016-07-15 2018-01-18 Novartis Ag Treatment and prevention of cytokine release syndrome using a chimeric antigen receptor in combination with a kinase inhibitor
WO2018023025A1 (en) 2016-07-28 2018-02-01 Novartis Ag Combination therapies of chimeric antigen receptors adn pd-1 inhibitors
WO2018026819A2 (en) 2016-08-01 2018-02-08 Novartis Ag Treatment of cancer using a chimeric antigen receptor in combination with an inhibitor of a pro-m2 macrophage molecule
US9914777B2 (en) 2015-07-10 2018-03-13 Merus N.V. Human CD3 binding antibody
US9914785B2 (en) 2012-11-28 2018-03-13 Zymeworks Inc. Engineered immunoglobulin heavy chain-light chain pairs and uses thereof
WO2018067992A1 (en) 2016-10-07 2018-04-12 Novartis Ag Chimeric antigen receptors for the treatment of cancer
US9969800B2 (en) 2015-02-05 2018-05-15 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha IL-8 antibodies
US9982036B2 (en) 2011-02-28 2018-05-29 Hoffmann-La Roche Inc. Dual FC antigen binding proteins
US10000560B2 (en) 2014-12-19 2018-06-19 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Anti-myostatin antibodies, polypeptides containing variant Fc regions, and methods of use
US10047163B2 (en) 2013-02-08 2018-08-14 Abbvie Stemcentrx Llc Multispecific constructs
WO2018155611A1 (ja) 2017-02-24 2018-08-30 中外製薬株式会社 薬学的組成物、抗原結合分子、治療方法、およびスクリーニング方法
WO2018158719A1 (en) 2017-03-02 2018-09-07 Novartis Ag Engineered heterodimeric proteins
WO2018181870A1 (ja) 2017-03-31 2018-10-04 公立大学法人奈良県立医科大学 血液凝固第ｖｉｉｉ因子の機能を代替する多重特異性抗原結合分子を含有する、血液凝固第ｉｘ因子異常症の予防および／または治療に用いられる医薬組成物
WO2018187227A1 (en) 2017-04-03 2018-10-11 Concologie, Inc. Methods for treating cancer using ps-targeting antibodies with immuno-oncology agents
US10106624B2 (en) 2013-03-15 2018-10-23 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
WO2018201051A1 (en) 2017-04-28 2018-11-01 Novartis Ag Bcma-targeting agent, and combination therapy with a gamma secretase inhibitor
WO2018201056A1 (en) 2017-04-28 2018-11-01 Novartis Ag Cells expressing a bcma-targeting chimeric antigen receptor, and combination therapy with a gamma secretase inhibitor
WO2018200583A1 (en) 2017-04-26 2018-11-01 Eureka Therapeutics, Inc. Cells expressing chimeric activating receptors and chimeric stimulating receptors and uses thereof
US10131710B2 (en) 2013-01-14 2018-11-20 Xencor, Inc. Optimized antibody variable regions
US10143748B2 (en) 2005-07-25 2018-12-04 Aptevo Research And Development Llc B-cell reduction using CD37-specific and CD20-specific binding molecules
US10150808B2 (en) 2009-09-24 2018-12-11 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Modified antibody constant regions
WO2018229612A1 (en) 2017-06-12 2018-12-20 Novartis Ag Method of manufacturing bispecific antibodies, bispecific antibodies and therapeutic use of such antibodies
WO2018234575A1 (en) 2017-06-22 2018-12-27 Kymab Limited BISPECIFIC ANTIBODIES OF FACTOR IX AND FACTOR X
WO2018237157A1 (en) 2017-06-22 2018-12-27 Novartis Ag CD73 BINDING ANTIBODY MOLECULES AND USES THEREOF
WO2019006007A1 (en) 2017-06-27 2019-01-03 Novartis Ag POSOLOGICAL REGIMES FOR ANTI-TIM3 ANTIBODIES AND USES THEREOF
WO2019018730A1 (en) 2017-07-20 2019-01-24 Novartis Ag DOSAGE REGIMES FOR ANTI-LAG3 ANTIBODIES AND USES THEREOF
KR20190015583A (ko) * 2010-11-05 2019-02-13 자임워크스 인코포레이티드 Fc 도메인 내의 돌연변이를 갖는 안정한 이종이량체 항체 디자인
US10227411B2 (en) 2015-03-05 2019-03-12 Xencor, Inc. Modulation of T cells with bispecific antibodies and FC fusions
US10227410B2 (en) 2015-12-07 2019-03-12 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind CD3 and PSMA
JP2019048814A (ja) * 2010-04-20 2019-03-28 ゲンマブ エー／エス ヘテロ二量体抗体Ｆｃ含有タンパク質およびその産生方法
JP6496095B1 (ja) * 2017-09-29 2019-04-03 中外製薬株式会社 血液凝固第ｖｉｉｉ因子（ｆｖｉｉｉ）補因子機能代替活性を有する多重特異性抗原結合分子および当該分子を有効成分として含有する薬学的製剤
US10253091B2 (en) 2009-03-19 2019-04-09 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antibody constant region variant
US10253100B2 (en) 2011-09-30 2019-04-09 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Therapeutic antigen-binding molecule with a FcRn-binding domain that promotes antigen clearance
WO2019077092A1 (en) 2017-10-20 2019-04-25 F. Hoffmann-La Roche Ag METHOD FOR GENERATING MULTISPECIFIC ANTIBODIES FROM MONOSPECIFIC ANTIBODIES
WO2019086362A1 (en) 2017-10-30 2019-05-09 F. Hoffmann-La Roche Ag Method for in vivo generation of multispecific antibodies from monospecific antibodies
WO2019099838A1 (en) 2017-11-16 2019-05-23 Novartis Ag Combination therapies
US10316088B2 (en) 2016-06-28 2019-06-11 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind somatostatin receptor 2
US10323099B2 (en) 2013-10-11 2019-06-18 Hoffmann-La Roche Inc. Multispecific domain exchanged common variable light chain antibodies
WO2019131988A1 (en) 2017-12-28 2019-07-04 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Cytotoxicity-inducing therapeutic agent
US10344050B2 (en) 2011-10-27 2019-07-09 Genmab A/S Production of heterodimeric proteins
US10358479B2 (en) 2012-07-13 2019-07-23 Zymeworks Inc. Multivalent heteromultimer scaffold design and constructs
EP3514179A1 (en) 2014-01-24 2019-07-24 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Antibody molecules to pd-1 and uses thereof
WO2019152660A1 (en) 2018-01-31 2019-08-08 Novartis Ag Combination therapy using a chimeric antigen receptor
US10385122B2 (en) 2014-12-19 2019-08-20 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Nucleic acids encoding anti-C5 antibodies
WO2019160007A1 (ja) 2018-02-14 2019-08-22 中外製薬株式会社 抗原結合分子および組合せ
US10428155B2 (en) 2014-12-22 2019-10-01 Xencor, Inc. Trispecific antibodies
US10435458B2 (en) 2010-03-04 2019-10-08 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antibody constant region variants with reduced Fcgammar binding
WO2019200229A1 (en) 2018-04-13 2019-10-17 Novartis Ag Dosage regimens for anti-pd-l1 antibodies and uses thereof
WO2019210153A1 (en) 2018-04-27 2019-10-31 Novartis Ag Car t cell therapies with enhanced efficacy
US10487155B2 (en) 2013-01-14 2019-11-26 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
WO2019226658A1 (en) 2018-05-21 2019-11-28 Compass Therapeutics Llc Multispecific antigen-binding compositions and methods of use
WO2019226617A1 (en) 2018-05-21 2019-11-28 Compass Therapeutics Llc Compositions and methods for enhancing the killing of target cells by nk cells
WO2019227003A1 (en) 2018-05-25 2019-11-28 Novartis Ag Combination therapy with chimeric antigen receptor (car) therapies
WO2019232244A2 (en) 2018-05-31 2019-12-05 Novartis Ag Antibody molecules to cd73 and uses thereof
WO2019229701A2 (en) 2018-06-01 2019-12-05 Novartis Ag Binding molecules against bcma and uses thereof
WO2019232484A1 (en) 2018-06-01 2019-12-05 Compugen Ltd Anti-pvrig/anti-tigit bispecific antibodies and methods of use
US10501543B2 (en) 2016-10-14 2019-12-10 Xencor, Inc. IL15/IL15Rα heterodimeric Fc-fusion proteins
WO2019235420A1 (ja) 2018-06-04 2019-12-12 中外製薬株式会社 複合体を検出する方法
USRE47770E1 (en) 2002-07-18 2019-12-17 Merus N.V. Recombinant production of mixtures of antibodies
WO2019241426A1 (en) 2018-06-13 2019-12-19 Novartis Ag Bcma chimeric antigen receptors and uses thereof
WO2019246293A2 (en) 2018-06-19 2019-12-26 Atarga, Llc Antibody molecules to complement component 5 and uses thereof
WO2019244973A1 (ja) 2018-06-20 2019-12-26 中外製薬株式会社 標的細胞に対する免疫反応を活性化する方法およびその組成物
US10519242B2 (en) 2013-03-15 2019-12-31 Xencor, Inc. Targeting regulatory T cells with heterodimeric proteins
US10526417B2 (en) 2014-11-26 2020-01-07 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind CD3 and CD38
WO2020012337A1 (en) 2018-07-10 2020-01-16 Novartis Ag 3-(5-amino-1-oxoisoindolin-2-yl)piperidine-2,6-dione derivatives and their use in the treatment of i karos family zinc finger 2 (ikzf2)-dependent diseases
US10544187B2 (en) 2013-03-15 2020-01-28 Xencor, Inc. Targeting regulatory T cells with heterodimeric proteins
WO2020021465A1 (en) 2018-07-25 2020-01-30 Advanced Accelerator Applications (Italy) S.R.L. Method of treatment of neuroendocrine tumors
WO2020045545A1 (ja) 2018-08-29 2020-03-05 中外製薬株式会社 抗体半分子、および抗体半分子のホモ二量体形成を抑制する方法
WO2020049128A1 (en) 2018-09-06 2020-03-12 Kymab Limited Antigen-binding molecules comprising unpaired variable domains
US10611825B2 (en) 2011-02-28 2020-04-07 Hoffmann La-Roche Inc. Monovalent antigen binding proteins
US10618965B2 (en) 2011-02-25 2020-04-14 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method for altering plasma retention and immunogenicity of antigen-binding molecule
US10662245B2 (en) 2008-09-26 2020-05-26 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Methods of reducing IL-6 activity for disease treatment
EP3660042A1 (en) 2014-07-31 2020-06-03 Novartis AG Subset-optimized chimeric antigen receptor-containing t-cells
WO2020128972A1 (en) 2018-12-20 2020-06-25 Novartis Ag Dosing regimen and pharmaceutical combination comprising 3-(1-oxoisoindolin-2-yl)piperidine-2,6-dione derivatives
WO2020128898A1 (en) 2018-12-20 2020-06-25 Novartis Ag Pharmaceutical combinations
WO2020128467A2 (en) 2018-12-19 2020-06-25 Kymab Limited Antagonists
WO2020128049A1 (en) 2018-12-21 2020-06-25 Kymab Limited Fixaxfx bispecific antibody with common light chain
WO2020165868A1 (en) 2019-02-15 2020-08-20 Perkinelmer Cellular Technologies Germany Gmbh Low-power microscope-objective pre-scan and high-power microscope-objective scan in x,y and z-direction for imaging objects such as cells using a microscope
WO2020165833A1 (en) 2019-02-15 2020-08-20 Novartis Ag 3-(1-oxo-5-(piperidin-4-yl)isoindolin-2-yl)piperidine-2,6-dione derivatives and uses thereof
WO2020165834A1 (en) 2019-02-15 2020-08-20 Novartis Ag Substituted 3-(1-oxoisoindolin-2-yl)piperidine-2,6-dione derivatives and uses thereof
WO2020172553A1 (en) 2019-02-22 2020-08-27 Novartis Ag Combination therapies of egfrviii chimeric antigen receptors and pd-1 inhibitors
US10774148B2 (en) 2015-02-27 2020-09-15 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Composition for treating IL-6-related diseases
EP3712171A1 (en) 2014-08-19 2020-09-23 Novartis AG Treatment of cancer using a cd123 chimeric antigen receptor
WO2020189748A1 (ja) 2019-03-19 2020-09-24 中外製薬株式会社 Ｍｔａ依存的に抗原に対する結合活性が変化する抗原結合ドメインを含む抗原結合分子及び当該抗原結合ドメイン取得用ライブラリ
US10787518B2 (en) 2016-06-14 2020-09-29 Xencor, Inc. Bispecific checkpoint inhibitor antibodies
US10793632B2 (en) 2016-08-30 2020-10-06 Xencor, Inc. Bispecific immunomodulatory antibodies that bind costimulatory and checkpoint receptors
WO2020205523A1 (en) 2019-03-29 2020-10-08 Atarga, Llc Anti fgf23 antibody
EP3722316A1 (en) 2014-07-21 2020-10-14 Novartis AG Treatment of cancer using a cd33 chimeric antigen receptor
US10844127B2 (en) 2014-02-28 2020-11-24 Merus N.V. Antibodies that bind EGFR and ErbB3
WO2020236795A2 (en) 2019-05-21 2020-11-26 Novartis Ag Trispecific binding molecules against bcma and uses thereof
WO2020236797A1 (en) 2019-05-21 2020-11-26 Novartis Ag Variant cd58 domains and uses thereof
WO2020236792A1 (en) 2019-05-21 2020-11-26 Novartis Ag Cd19 binding molecules and uses thereof
US10851178B2 (en) 2011-10-10 2020-12-01 Xencor, Inc. Heterodimeric human IgG1 polypeptides with isoelectric point modifications
US10858417B2 (en) 2013-03-15 2020-12-08 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
WO2020246563A1 (ja) 2019-06-05 2020-12-10 中外製薬株式会社 抗体切断部位結合分子
US10865253B2 (en) 2014-12-19 2020-12-15 Genmab A/S Rodent bispecific heterodimeric proteins
WO2021006328A1 (en) 2019-07-10 2021-01-14 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Claudin-6 binding molecules and uses thereof
US10899846B2 (en) 2014-11-06 2021-01-26 Hoffmann-La Roche Inc. Fc-region variants with modified FcRn- and protein A-binding properties
US10934571B2 (en) 2002-07-18 2021-03-02 Merus N.V. Recombinant production of mixtures of antibodies
US10968276B2 (en) 2013-03-12 2021-04-06 Xencor, Inc. Optimized anti-CD3 variable regions
US10981992B2 (en) 2017-11-08 2021-04-20 Xencor, Inc. Bispecific immunomodulatory antibodies that bind costimulatory and checkpoint receptors
US10982006B2 (en) 2018-04-04 2021-04-20 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind fibroblast activation protein
WO2021079188A1 (en) 2019-10-21 2021-04-29 Novartis Ag Combination therapies with venetoclax and tim-3 inhibitors
WO2021079195A1 (en) 2019-10-21 2021-04-29 Novartis Ag Tim-3 inhibitors and uses thereof
WO2021108661A2 (en) 2019-11-26 2021-06-03 Novartis Ag Chimeric antigen receptors and uses thereof
WO2021123902A1 (en) 2019-12-20 2021-06-24 Novartis Ag Combination of anti tim-3 antibody mbg453 and anti tgf-beta antibody nis793, with or without decitabine or the anti pd-1 antibody spartalizumab, for treating myelofibrosis and myelodysplastic syndrome
US11046769B2 (en) 2018-11-13 2021-06-29 Compass Therapeutics Llc Multispecific binding constructs against checkpoint molecules and uses thereof
US11046760B2 (en) 2014-10-31 2021-06-29 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Combination therapy for treatment of disease
US11046784B2 (en) 2006-03-31 2021-06-29 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Methods for controlling blood pharmacokinetics of antibodies
WO2021131021A1 (ja) 2019-12-27 2021-07-01 中外製薬株式会社 抗ｃｔｌａ－４抗体およびその使用
US11053294B2 (en) 2018-09-27 2021-07-06 Xilio Development, Inc. Masked cytokine polypeptides
US11053308B2 (en) 2016-08-05 2021-07-06 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method for treating IL-8-related diseases
US11053316B2 (en) 2013-01-14 2021-07-06 Xencor, Inc. Optimized antibody variable regions
WO2021144657A1 (en) 2020-01-17 2021-07-22 Novartis Ag Combination comprising a tim-3 inhibitor and a hypomethylating agent for use in treating myelodysplastic syndrome or chronic myelomonocytic leukemia
WO2021146636A1 (en) 2020-01-17 2021-07-22 Becton, Dickinson And Company Methods and compositions for single cell secretomics
US11084863B2 (en) 2017-06-30 2021-08-10 Xencor, Inc. Targeted heterodimeric Fc fusion proteins containing IL-15 IL-15alpha and antigen binding domains
US11091541B2 (en) 2013-04-29 2021-08-17 Hoffmann-La Roche Inc. Human FcRn-binding modified antibodies and methods of use
US11104745B2 (en) 2015-12-16 2021-08-31 Amgen Inc. Anti-TL1A/anti-TNF-alpha bispecific antigen binding proteins and uses thereof
WO2021173995A2 (en) 2020-02-27 2021-09-02 Novartis Ag Methods of making chimeric antigen receptor-expressing cells
US11124573B2 (en) 2014-05-02 2021-09-21 Janssen Biotech, Inc. Compositions and methods related to engineered Fc constructs
WO2021195513A1 (en) 2020-03-27 2021-09-30 Novartis Ag Bispecific combination therapy for treating proliferative diseases and autoimmune disorders
WO2021190980A1 (en) 2020-03-22 2021-09-30 Quadrucept Bio Limited Multimers for viral strain evolution
WO2021200857A1 (ja) 2020-03-30 2021-10-07 国立大学法人三重大学 二重特異的抗体
WO2021201087A1 (en) 2020-03-31 2021-10-07 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method for producing multispecific antigen-binding molecules
US11150254B2 (en) 2014-09-26 2021-10-19 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method for measuring reactivity of FVIII
WO2021211753A1 (en) 2020-04-15 2021-10-21 Voyager Therapeutics, Inc. Tau binding compounds
US11155640B2 (en) 2016-05-23 2021-10-26 Janssen Biotech, Inc. Compositions and methods related to engineered Fc constructs
US11154615B2 (en) 2014-11-11 2021-10-26 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Library of antigen-binding molecules including modified antibody variable region
WO2021214460A1 (en) 2020-04-22 2021-10-28 Petmedix Ltd Heterodimeric proteins
WO2021220215A1 (en) 2020-05-01 2021-11-04 Novartis Ag Engineered immunoglobulins
WO2021235537A1 (ja) 2020-05-22 2021-11-25 中外製薬株式会社 凝固第ｖｉｉｉ因子（ｆ．ｖｉｉｉ）機能代替活性を有する物質を中和する抗体
WO2021260528A1 (en) 2020-06-23 2021-12-30 Novartis Ag Dosing regimen comprising 3-(1-oxoisoindolin-2-yl)piperidine-2,6-dione derivatives
US11214623B2 (en) 2014-09-26 2022-01-04 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antibody capable of neutralizing substance having activity alternative to function of coagulation factor VIII (FVIII)
US11220531B2 (en) 2017-01-06 2022-01-11 Janssen Biotech, Inc. Engineered Fc constructs
WO2022013787A1 (en) 2020-07-16 2022-01-20 Novartis Ag Anti-betacellulin antibodies, fragments thereof, and multi-specific binding molecules
WO2022026592A2 (en) 2020-07-28 2022-02-03 Celltas Bio, Inc. Antibody molecules to coronavirus and uses thereof
WO2022025220A1 (ja) 2020-07-31 2022-02-03 中外製薬株式会社 キメラ受容体を発現する細胞を含む医薬組成物
WO2022029573A1 (en) 2020-08-03 2022-02-10 Novartis Ag Heteroaryl substituted 3-(1-oxoisoindolin-2-yl)piperidine-2,6-dione derivatives and uses thereof
WO2022043558A1 (en) 2020-08-31 2022-03-03 Advanced Accelerator Applications International Sa Method of treating psma-expressing cancers
WO2022045276A1 (ja) 2020-08-28 2022-03-03 中外製薬株式会社 ヘテロ二量体Ｆｃポリペプチド
WO2022043557A1 (en) 2020-08-31 2022-03-03 Advanced Accelerator Applications International Sa Method of treating psma-expressing cancers
US11274151B2 (en) 2020-03-31 2022-03-15 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha CD3-targeting and DLL3-targeting multispecific antigen-binding molecules and uses thereof
US11279770B2 (en) 2014-02-28 2022-03-22 Merus N.V. Antibody that binds ErbB-2 and ErbB-3
US11306156B2 (en) 2014-05-28 2022-04-19 Zymeworks Inc. Modified antigen binding polypeptide constructs and uses thereof
US11312770B2 (en) 2017-11-08 2022-04-26 Xencor, Inc. Bispecific and monospecific antibodies using novel anti-PD-1 sequences
US11319355B2 (en) 2017-12-19 2022-05-03 Xencor, Inc. Engineered IL-2 Fc fusion proteins
WO2022097060A1 (en) 2020-11-06 2022-05-12 Novartis Ag Cd19 binding molecules and uses thereof
WO2022097061A1 (en) 2020-11-06 2022-05-12 Novartis Ag Anti-cd19 agent and b cell targeting agent combination therapy for treating b cell malignancies
WO2022104061A1 (en) 2020-11-13 2022-05-19 Novartis Ag Combination therapies with chimeric antigen receptor (car)-expressing cells
US11339213B2 (en) 2015-09-23 2022-05-24 Mereo Biopharma 5, Inc. Methods and compositions for treatment of cancer
US11352403B2 (en) 2018-05-14 2022-06-07 Werewolf Therapeutics, Inc. Activatable interleukin-2 polypeptides and methods of use thereof
US11352438B2 (en) 2016-09-06 2022-06-07 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Methods of using a bispecific antibody that recognizes coagulation factor IX and/or activated coagulation factor IX and coagulation factor X and/or activated coagulation factor X
US11352426B2 (en) 2015-09-21 2022-06-07 Aptevo Research And Development Llc CD3 binding polypeptides
US11359009B2 (en) 2015-12-25 2022-06-14 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Anti-myostatin antibodies and methods of use
US11358999B2 (en) 2018-10-03 2022-06-14 Xencor, Inc. IL-12 heterodimeric Fc-fusion proteins
WO2022162569A1 (en) 2021-01-29 2022-08-04 Novartis Ag Dosage regimes for anti-cd73 and anti-entpd2 antibodies and uses thereof
EP4043485A1 (en) 2017-01-26 2022-08-17 Novartis AG Cd28 compositions and methods for chimeric antigen receptor therapy
WO2022184659A1 (en) 2021-03-01 2022-09-09 Quadrucept Bio Limited Antibody domains & multimers
US11453710B2 (en) 2018-05-14 2022-09-27 Werewolf Therapeutics, Inc. Activatable interleukin 12 polypeptides and methods of use thereof
WO2022215011A1 (en) 2021-04-07 2022-10-13 Novartis Ag USES OF ANTI-TGFβ ANTIBODIES AND OTHER THERAPEUTIC AGENTS FOR THE TREATMENT OF PROLIFERATIVE DISEASES
US11472890B2 (en) 2019-03-01 2022-10-18 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind ENPP3 and CD3
WO2022223001A1 (zh) 2021-04-22 2022-10-27 广东菲鹏制药股份有限公司 双特异性多功能融合多肽
US11485790B2 (en) 2014-04-07 2022-11-01 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Immunoactivating antigen-binding molecule
US11505595B2 (en) 2018-04-18 2022-11-22 Xencor, Inc. TIM-3 targeted heterodimeric fusion proteins containing IL-15/IL-15RA Fc-fusion proteins and TIM-3 antigen binding domains
US11505605B2 (en) 2014-05-13 2022-11-22 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha T cell-redirected antigen-binding molecule for cells having immunosuppression function
WO2022243846A1 (en) 2021-05-18 2022-11-24 Novartis Ag Combination therapies
US11524991B2 (en) 2018-04-18 2022-12-13 Xencor, Inc. PD-1 targeted heterodimeric fusion proteins containing IL-15/IL-15Ra Fc-fusion proteins and PD-1 antigen binding domains and uses thereof
WO2022270611A1 (ja) 2021-06-25 2022-12-29 中外製薬株式会社 抗ｃｔｌａ－４抗体
WO2022270612A1 (ja) 2021-06-25 2022-12-29 中外製薬株式会社 抗ｃｔｌａ－４抗体の使用
US11555067B2 (en) 2014-01-15 2023-01-17 Hoffmann-La Roche Inc. Fc-region variants with improved protein A-binding
US11591401B2 (en) 2020-08-19 2023-02-28 Xencor, Inc. Anti-CD28 compositions
WO2023044483A2 (en) 2021-09-20 2023-03-23 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for the treatment of her2 positive cancer
US11649262B2 (en) 2015-12-28 2023-05-16 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method for promoting efficiency of purification of Fc region-containing polypeptide
WO2023092004A1 (en) 2021-11-17 2023-05-25 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for the treatment of tau-related disorders
US11718679B2 (en) 2017-10-31 2023-08-08 Compass Therapeutics Llc CD137 antibodies and PD-1 antagonists and uses thereof
WO2023150778A1 (en) 2022-02-07 2023-08-10 Visterra, Inc. Anti-idiotype antibody molecules and uses thereof
US11739132B2 (en) 2019-05-14 2023-08-29 Werewolf Therapeutics, Inc. Separation moieties and methods of use thereof
US11739144B2 (en) 2021-03-09 2023-08-29 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind CD3 and CLDN6
US11752207B2 (en) 2017-07-11 2023-09-12 Compass Therapeutics Llc Agonist antibodies that bind human CD137 and uses thereof
US11773170B2 (en) 2017-08-09 2023-10-03 Merus N.V. Antibodies that bind EGFR and cMET
US11780925B2 (en) 2017-03-31 2023-10-10 Merus N.V. ErbB-2 and ErbB3 binding bispecific antibodies for use in the treatment of cells that have an NRG1 fusion gene
WO2023209568A1 (en) 2022-04-26 2023-11-02 Novartis Ag Multispecific antibodies targeting il-13 and il-18
WO2023220695A2 (en) 2022-05-13 2023-11-16 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for the treatment of her2 positive cancer
US11827699B2 (en) 2011-09-30 2023-11-28 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Methods for producing antibodies promoting disappearance of antigens having plurality of biological activities
US11851497B2 (en) 2017-11-20 2023-12-26 Compass Therapeutics Llc CD137 antibodies and tumor antigen-targeting antibodies and uses thereof
US11851486B2 (en) 2017-05-02 2023-12-26 National Center Of Neurology And Psychiatry Method for predicting and evaluating therapeutic effect in diseases related to IL-6 and neutrophils
US11859012B2 (en) 2021-03-10 2024-01-02 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind CD3 and GPC3
WO2024020429A1 (en) 2022-07-22 2024-01-25 Lyell Immunopharma, Inc. Immune cell therapy
US11891434B2 (en) 2010-11-30 2024-02-06 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antigen-binding molecule capable of binding to plurality of antigen molecules repeatedly
WO2024030976A2 (en) 2022-08-03 2024-02-08 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for crossing the blood brain barrier
EP4324518A2 (en) 2014-01-31 2024-02-21 Novartis AG Antibody molecules to tim-3 and uses thereof
US11919956B2 (en) 2020-05-14 2024-03-05 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind prostate specific membrane antigen (PSMA) and CD3
WO2024059739A1 (en) 2022-09-15 2024-03-21 Voyager Therapeutics, Inc. Tau binding compounds
US11939394B2 (en) 2015-10-23 2024-03-26 Merus N.V. Binding molecules that inhibit cancer growth
US11952422B2 (en) 2017-12-05 2024-04-09 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antigen-binding molecule comprising altered antibody variable region binding CD3 and CD137
US11965030B2 (en) 2018-12-24 2024-04-23 Sanofi Multispecific binding proteins with mutant fab domains
US11970538B2 (en) 2021-05-20 2024-04-30 Compass Therapeutics Llc Multispecific binding constructs against checkpoint molecules and uses thereof

Families Citing this family (413)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPWO2005056605A1 (ja) * 2003-12-12 2007-12-06 中外製薬株式会社 ３量体以上の受容体を認識する改変抗体
TW200530269A (en) * 2003-12-12 2005-09-16 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anti-Mpl antibodies
JPWO2005056602A1 (ja) * 2003-12-12 2008-03-06 中外製薬株式会社 アゴニスト活性を有する改変抗体のスクリーニング方法
EP1870458B1 (en) * 2005-03-31 2018-05-09 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha sc(Fv)2 STRUCTURAL ISOMERS
EP1876236B9 (en) * 2005-04-08 2015-02-25 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antibody substituting for function of blood coagulation factor viii
KR101367544B1 (ko) * 2005-06-10 2014-02-26 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 메글루민을 함유하는 단백질 제제의 안정화제, 및 그의이용
CN101262885B (zh) 2005-06-10 2015-04-01 中外制药株式会社 含有sc(Fv)2的药物组合物
ES2395969T3 (es) * 2006-03-24 2013-02-18 Merck Patent Gmbh Dominios de proteínas heterodiméricas genéticamente modificados
US8268314B2 (en) 2008-10-08 2012-09-18 Hoffmann-La Roche Inc. Bispecific anti-VEGF/anti-ANG-2 antibodies
AU2010230563A1 (en) 2009-04-02 2011-09-22 Roche Glycart Ag Multispecific antibodies comprising full length antibodies and single chain Fab fragments
WO2010112194A1 (en) 2009-04-02 2010-10-07 F. Hoffmann-La Roche Ag Antigen-binding polypeptides and multispecific antibodies comprising them
EP2417159A1 (en) 2009-04-07 2012-02-15 Roche Glycart AG Bispecific anti-erbb-3/anti-c-met antibodies
US20100256340A1 (en) 2009-04-07 2010-10-07 Ulrich Brinkmann Trivalent, bispecific antibodies
BRPI1014449A2 (pt) 2009-04-07 2017-06-27 Roche Glycart Ag anticorpos biespecíficos anti-erbb-2/ anti-c-met.
MX2011011925A (es) * 2009-05-27 2011-12-06 Hoffmann La Roche Anticuerpos triespecificos o tetraespecificos.
US8703132B2 (en) * 2009-06-18 2014-04-22 Hoffmann-La Roche, Inc. Bispecific, tetravalent antigen binding proteins
NZ701769A (en) 2009-09-16 2016-06-24 Genentech Inc Coiled coil and/or tether containing protein complexes and uses thereof
EP2483310B1 (en) 2009-09-29 2014-08-13 Roche Glycart AG Bispecific death receptor agonistic antibodies
TWI426920B (zh) 2010-03-26 2014-02-21 Hoffmann La Roche 雙專一性、雙價抗－ｖｅｇｆ／抗－ａｎｇ－２抗體
TW201138821A (en) 2010-03-26 2011-11-16 Roche Glycart Ag Bispecific antibodies
AU2013203221B2 (en) * 2010-04-20 2016-06-02 Genmab A/S Heterodimeric antibody FC-containing proteins and methods for production thereof
AU2016219622A1 (en) * 2010-04-20 2016-09-15 Genmab A/S Heterodimeric antibody FC-containing proteins and methods for production thereof
WO2011143545A1 (en) 2010-05-14 2011-11-17 Rinat Neuroscience Corporation Heterodimeric proteins and methods for producing and purifying them
CA2800785C (en) 2010-05-27 2019-09-24 Genmab A/S Monoclonal antibodies against her2
CN103068846B9 (zh) 2010-08-24 2016-09-28 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 包含二硫键稳定性Fv片段的双特异性抗体
KR101612999B1 (ko) 2010-08-24 2016-04-15 로슈 글리카트 아게 활성화가능 이중특이적 항체
EP2643353A1 (en) 2010-11-24 2013-10-02 Novartis AG Multispecific molecules
EP2655413B1 (en) 2010-12-23 2019-01-16 F.Hoffmann-La Roche Ag Polypeptide-polynucleotide-complex and its use in targeted effector moiety delivery
US20140170149A1 (en) 2011-04-20 2014-06-19 Genmab A/S Bispecific antibodies against her2 and cd3
CA2837169C (en) 2011-05-24 2021-11-09 Zyngenia, Inc. Multispecific complexes comprising angiopoietin-2-binding peptide and their uses
UA117901C2 (uk) 2011-07-06 2018-10-25 Ґенмаб Б.В. Спосіб посилення ефекторної функції вихідного поліпептиду, його варіанти та їх застосування
WO2013026839A1 (en) 2011-08-23 2013-02-28 Roche Glycart Ag Bispecific antibodies specific for t-cell activating antigens and a tumor antigen and methods of use
GB201116092D0 (en) 2011-09-16 2011-11-02 Bioceros B V Antibodies and uses thereof
BR112014006537A2 (pt) 2011-09-23 2017-11-28 Roche Glycart Ag anticorpos biespecíficos, formulação farmacêutica, usos de um anticorpo biespecífico, método de tratamento, ácido nucleico, vetores de expressão, célula hospedeira e método para a produção de um anticorpo biespecífico
KR102052774B1 (ko) 2011-11-04 2019-12-04 자임워크스 인코포레이티드 Ｆｃ 도메인 내의 돌연변이를 갖는 안정한 이종이합체 항체 설계
US10633451B2 (en) 2012-02-03 2020-04-28 Hoffmann-La Roche Inc. Bispecific antibody molecules with antigen-transfected T-cells and their use in medicine
MX2014009565A (es) 2012-02-10 2014-11-10 Genentech Inc Anticuerpos monocatenarios y otros heteromultimeros.
SG11201406238UA (en) 2012-04-05 2014-10-30 Hoffmann La Roche Bispecific antibodies against human tweak and human il17 and uses thereof
US9212227B2 (en) 2012-04-30 2015-12-15 Janssen Biotech, Inc. ST2L antibody antagonists for the treatment of ST2L-mediated inflammatory pulmonary conditions
EP3553089A1 (en) 2012-05-10 2019-10-16 Bioatla, LLC Multi-specific monoclonal antibodies
RU2014149681A (ru) 2012-05-24 2016-07-20 Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг Антитела с множественной специфичностью
US9499634B2 (en) 2012-06-25 2016-11-22 Zymeworks Inc. Process and methods for efficient manufacturing of highly pure asymmetric antibodies in mammalian cells
KR20150023889A (ko) 2012-06-27 2015-03-05 에프. 호프만-라 로슈 아게 2 개 이상의 상이한 결합 단위를 함유하는 맞춤-제작된 고도로 선별적이고 다중-특이적인 표적화 단위의 선별 및 제조 방법 및 이의 용도
RU2015100656A (ru) 2012-06-27 2016-08-20 Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг Способ получения конъюгатов fc-фрагмента антитела, включающих по меньшей мере одну связывающую группировку, которая специфически связывается с мишенью, и их применения
RU2630296C2 (ru) 2012-07-04 2017-09-06 Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг Антитела к биотину и способы их применения
RU2630664C2 (ru) 2012-07-04 2017-09-11 Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг Антитела к теофиллину и способы их применения
SG11201407420RA (en) 2012-07-04 2015-02-27 Hoffmann La Roche Covalently linked antigen-antibody conjugates
AU2013285355A1 (en) 2012-07-06 2015-01-29 Genmab B.V. Dimeric protein with triple mutations
EP3632462A1 (en) 2012-07-06 2020-04-08 Genmab B.V. Dimeric protein with triple mutations
WO2014009465A1 (en) 2012-07-13 2014-01-16 Roche Glycart Ag Bispecific anti-vegf/anti-ang-2 antibodies and their use in the treatment of ocular vascular diseases
KR101963231B1 (ko) 2012-09-11 2019-03-28 삼성전자주식회사 이중특이 항체의 제작을 위한 단백질 복합체 및 이를 이용한 이중특이 항체 제조 방법
HUE042040T2 (hu) 2012-09-27 2019-06-28 Merus Nv Bispecifikus IGG antitestek mint T-sejt kapcsolók
EP2904016B1 (en) 2012-10-08 2018-11-14 Roche Glycart AG Fc-free antibodies comprising two fab-fragments and methods of use
SI3447069T1 (sl) 2012-11-21 2021-02-26 Janssen Biotech, Inc. Bispecifična protitelesa EGFR/C-MET
KR20220156667A (ko) 2013-01-10 2022-11-25 젠맵 비. 브이 인간 IgG1 Fc 영역 변이체 및 그의 용도
EP2762496A1 (en) 2013-02-05 2014-08-06 EngMab AG Method for the selection of antibodies against BCMA
EP2762497A1 (en) 2013-02-05 2014-08-06 EngMab AG Bispecific antibodies against CD3epsilon and BCMA
JP2016507523A (ja) 2013-02-05 2016-03-10 エンクマフ アーゲー ＣＤ３εおよびＢＣＭＡに対する二重特異的抗体
WO2014131694A1 (en) 2013-02-26 2014-09-04 Roche Glycart Ag Bispecific t cell activating antigen binding molecules
EP2961771B1 (en) 2013-02-26 2020-01-01 Roche Glycart AG Bispecific t cell activating antigen binding molecules specific to cd3 and cea
EP2975061A4 (en) * 2013-03-13 2017-03-01 Ibentrus Inc. Protein in which electrical interaction is introduced within hydrophobic interaction site and preparation method therefor
US9168300B2 (en) 2013-03-14 2015-10-27 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. MET-binding agents and uses thereof
EP2970435B1 (en) 2013-03-15 2020-08-12 Eli Lilly and Company Methods for producing fabs and bi-specific antibodies
JP6466904B2 (ja) 2013-03-15 2019-02-06 ヤンセン バイオテツク，インコーポレーテツド インターフェロンアルファ及びオメガ抗体アンタゴニスト
BR112015023752B1 (pt) 2013-03-15 2023-11-14 Zyngenia, Inc. Domínio de reconhecimento modular (mrd), complexo compreendendo mrd e cetuximabe, usos do complexo para inibir a angiogênese e tratar câncer e composição farmacêutica compreendendo o dito complexo
ES2687282T3 (es) 2013-03-18 2018-10-24 Biocerox Products B.V. Anticuerpos humanizados ANTI-CD134 (OX40) y sus usos
UA118028C2 (uk) 2013-04-03 2018-11-12 Рош Глікарт Аг Біспецифічне антитіло, специфічне щодо fap і dr5, антитіло, специфічне щодо dr5, і спосіб їх застосування
EP2789630A1 (en) 2013-04-09 2014-10-15 EngMab AG Bispecific antibodies against CD3e and ROR1
CN105164158A (zh) 2013-04-29 2015-12-16 豪夫迈·罗氏有限公司 消除对FcRn-结合的抗-IGF-1R抗体及其在血管性眼病治疗中的用途
RU2019108429A (ru) 2013-04-29 2019-05-06 Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг Модифицированные асимметричные антитела, связывающие fc-рецептор, и способы их применения
US9879081B2 (en) 2013-06-25 2018-01-30 Samsung Electronics Co., Ltd. Protein complex, bispecific antibody including the protein complex, and method of preparation thereof
BR122023002590B1 (pt) 2013-07-05 2023-12-05 Genmab A/S Anticorpo humanizado ou quimérico de ligação ao cd3 humano, anticorpo biespecífico, microrganismo, composição, composição farmacêutica, uso dos mesmos, método para produzir um anticorpo, composição de diagnóstico, método in vitro para detectar a presença de antígeno cd3, ou uma célula expressando cd3, em uma amostra, kit para detectar a presença de antígeno cd3, ou uma célula que expressa cd3, em uma amostra e anticorpo anti-idiotípico
KR102331054B1 (ko) 2013-11-06 2021-11-24 얀센 바이오테크 인코포레이티드 항-ccl17 항체
PE20210107A1 (es) 2013-12-17 2021-01-19 Genentech Inc Anticuerpos anti-cd3 y metodos de uso
AU2014368696A1 (en) 2013-12-20 2016-06-02 F. Hoffmann-La Roche Ag Humanized anti-Tau(pS422) antibodies and methods of use
CN105873615B (zh) 2014-01-03 2020-12-25 豪夫迈·罗氏有限公司 共价连接的helicar-抗helicar抗体缀合物及其用途
KR102278429B1 (ko) 2014-01-03 2021-07-16 에프. 호프만-라 로슈 아게 공유 연결된 폴리펩티드 독소-항체 콘쥬게이트
KR20160104628A (ko) 2014-01-03 2016-09-05 에프. 호프만-라 로슈 아게 이중특이성 항-합텐/항-혈액뇌장벽 수용체 항체, 그의 복합체 및 혈액뇌장벽 셔틀로서 그의 용도
CA2932547C (en) 2014-01-06 2023-05-23 F. Hoffmann-La Roche Ag Monovalent blood brain barrier shuttle modules
US9732154B2 (en) 2014-02-28 2017-08-15 Janssen Biotech, Inc. Anti-CD38 antibodies for treatment of acute lymphoblastic leukemia
UA117289C2 (uk) 2014-04-02 2018-07-10 Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг Мультиспецифічне антитіло
CN113092788A (zh) 2014-04-02 2021-07-09 豪夫迈·罗氏有限公司 检测多特异性抗体轻链错配的方法
TWI713453B (zh) 2014-06-23 2020-12-21 美商健生生物科技公司 干擾素α及ω抗體拮抗劑
AR100978A1 (es) 2014-06-26 2016-11-16 Hoffmann La Roche LANZADERAS CEREBRALES DE ANTICUERPO HUMANIZADO ANTI-Tau(pS422) Y USOS DE LAS MISMAS
EP3164419A1 (en) 2014-06-26 2017-05-10 F. Hoffmann-La Roche AG Anti-brdu antibodies and methods of use
UA127198C2 (uk) 2014-07-11 2023-06-07 Ґенмаб А/С Антитіло, яке зв'язує axl
NZ766556A (en) 2014-08-04 2024-02-23 Hoffmann La Roche Bispecific t cell activating antigen binding molecules
EP2982692A1 (en) 2014-08-04 2016-02-10 EngMab AG Bispecific antibodies against CD3epsilon and BCMA
JP6805130B2 (ja) 2014-09-05 2020-12-23 ヤンセン ファーマシューティカ エヌ．ベー． Ｃｄ１２３結合剤及びその使用
CN108064182B (zh) 2014-09-09 2021-09-03 詹森生物科技公司 采用抗cd38抗体的联合疗法
AU2015314744A1 (en) 2014-09-12 2017-03-02 Genentech, Inc. Anti-CLL-1 antibodies and immunoconjugates
MX2017003247A (es) 2014-09-15 2017-11-30 Amgen Inc Proteina de union a antigenos, bi-especificos del receptor anti-cgrp/receptor pac1 y usos de las mismas.
ES2850325T3 (es) 2014-10-09 2021-08-27 Engmab Sarl Anticuerpos biespecíficos contra CD3epsilon y ROR1
EP3215528B1 (en) 2014-11-06 2019-08-07 F.Hoffmann-La Roche Ag Fc-region variants with modified fcrn-binding and methods of use
SI3789402T1 (sl) 2014-11-20 2022-10-28 F. Hoffmann-La Roche Ag Kombinirano zdravljenje z bispecifičnimi molekulami, ki vežejo antigen in aktivirajo celice T, ter antagonisti za vezavo osi PD-1
EP3023437A1 (en) 2014-11-20 2016-05-25 EngMab AG Bispecific antibodies against CD3epsilon and BCMA
WO2016087416A1 (en) 2014-12-03 2016-06-09 F. Hoffmann-La Roche Ag Multispecific antibodies
MA41375A (fr) 2015-01-22 2017-11-28 Lilly Co Eli Anticorps igg bispécifiques et leurs procédés de préparation
JP7019423B2 (ja) 2015-05-06 2022-02-15 ヤンセン バイオテツク，インコーポレーテツド 前立腺特異的膜抗原（ｐｓｍａ）二重特異性結合剤及びその使用
CA2986594A1 (en) 2015-05-20 2016-11-24 Tufts Medical Center, Inc. Anti-cd38 antibodies for treatment of light chain amyloidosis and other cd38-positive hematological malignancies
CN107847568B (zh) 2015-06-16 2022-12-20 豪夫迈·罗氏有限公司 抗cll-1抗体和使用方法
PE20180330A1 (es) 2015-06-16 2018-02-13 Genentech Inc Anticuerpos madurados por afinidad y humanizados para fcrh5 y metodos para su uso
EA036789B1 (ru) 2015-06-22 2020-12-22 Янссен Байотек, Инк. Комбинированная терапия гемобластозов антителами к cd38 и ингибиторами сурвивина
MA42270A (fr) 2015-06-24 2018-05-02 Janssen Biotech Inc Modulation immunitaire et traitement de tumeurs solides avec des anticorps se liant spécifiquement à cd38
EP3313877B1 (en) 2015-06-24 2020-06-03 H. Hoffnabb-La Roche Ag Humanized anti-tau(ps422) antibodies and methods of use
EP3319996B1 (en) 2015-07-09 2024-01-03 Genmab A/S Bispecific and multispecific antibodies and method for isolation of such
CN108368171A (zh) 2015-07-10 2018-08-03 根马布股份公司 用于癌症治疗的axl特异性抗体-药物缀合物
KR20180030635A (ko) 2015-07-15 2018-03-23 젠맵 에이/에스 인간화 또는 키메라 cd3 항체
EP3670535A1 (en) 2015-08-03 2020-06-24 EngMab Sàrl Monoclonal antibodies against bcma
US10669343B2 (en) 2015-08-05 2020-06-02 Janssen Biotech, Inc. Anti-CD154 antibodies and methods of using them
ES2814550T3 (es) 2015-08-17 2021-03-29 Janssen Pharmaceutica Nv Anticuerpos anti-BCMA, moléculas que se unen a antígeno biespecífico que se unen a BCMA y CD3, y usos de los mismos
AU2016329057A1 (en) 2015-09-30 2018-04-12 Janssen Biotech, Inc. Antagonistic antibodies specifically binding human CD40 and methods of use
AR106188A1 (es) 2015-10-01 2017-12-20 Hoffmann La Roche Anticuerpos anti-cd19 humano humanizados y métodos de utilización
WO2017055392A1 (en) 2015-10-02 2017-04-06 F. Hoffmann-La Roche Ag Anti-cd3xcd44v6 bispecific t cell activating antigen binding molecules
EP3150636A1 (en) 2015-10-02 2017-04-05 F. Hoffmann-La Roche AG Tetravalent multispecific antibodies
KR102146319B1 (ko) 2015-10-02 2020-08-25 에프. 호프만-라 로슈 아게 Pd1 및 tim3에 특이적인 이중특이성 항체
AR106199A1 (es) 2015-10-02 2017-12-20 Hoffmann La Roche Moléculas de unión a antígeno biespecíficas activadoras de células t
CN108026179A (zh) 2015-10-02 2018-05-11 豪夫迈·罗氏有限公司 结合间皮素和cd3的双特异性t细胞活化性抗原结合分子
CR20180162A (es) 2015-10-02 2018-05-25 Hoffmann La Roche Moléculas biespecíficas de unión a antígeno activadoras de células t
US20180282410A1 (en) 2015-10-02 2018-10-04 Hoffmann-La Roche Inc. Anti-cd3xrob04 bispecific t cell activating antigen binding molecules
WO2017055385A1 (en) 2015-10-02 2017-04-06 F. Hoffmann-La Roche Ag Anti-cd3xgd2 bispecific t cell activating antigen binding molecules
WO2017055399A1 (en) 2015-10-02 2017-04-06 F. Hoffmann-La Roche Ag Cellular based fret assay for the determination of simultaneous binding
EP3150637A1 (en) 2015-10-02 2017-04-05 F. Hoffmann-La Roche AG Multispecific antibodies
WO2017055393A1 (en) 2015-10-02 2017-04-06 F. Hoffmann-La Roche Ag Anti-cd3xtim-3 bispecific t cell activating antigen binding molecules
EP3356407B1 (en) 2015-10-02 2021-11-03 F. Hoffmann-La Roche AG Bispecific anti-cd19xcd3 t cell activating antigen binding molecules
RU2018116846A (ru) 2015-10-08 2019-11-08 Займворкс Инк. Антигенсвязывающие полипептидные конструкции, содержащие легкие цепи каппа и лямбда, и их применения
WO2017072210A1 (en) 2015-10-29 2017-05-04 F. Hoffmann-La Roche Ag Anti-variant fc-region antibodies and methods of use
KR20180072820A (ko) 2015-11-02 2018-06-29 얀센 파마슈티카 엔.브이. 항-il1rap 항체, il1rap 및 cd3과 결합하는 이중특이성 항원 결합 분자, 및 그의 용도
RS63125B1 (sr) 2015-11-03 2022-05-31 Janssen Biotech Inc Antitela koja se specifično vezuju za pd-1 i njihova upotreba
TWI724048B (zh) 2015-11-03 2021-04-11 美商健生生物科技公司 抗ｃｄ３８抗體之皮下調配物及其用途
EP3178848A1 (en) 2015-12-09 2017-06-14 F. Hoffmann-La Roche AG Type ii anti-cd20 antibody for reducing formation of anti-drug antibodies
AU2016368469B2 (en) 2015-12-09 2023-11-02 F. Hoffmann-La Roche Ag Type II anti-CD20 antibody for reducing formation of anti-drug antibodies
KR20180087430A (ko) 2015-12-17 2018-08-01 얀센 바이오테크 인코포레이티드 Hla-dr에 특이적으로 결합하는 항체 및 이의 용도
WO2017113181A1 (zh) * 2015-12-30 2017-07-06 深圳先进技术研究院 IgG杂合型抗TNFα和IL-17A双特异性抗体
EP3862365A1 (en) 2016-01-08 2021-08-11 F. Hoffmann-La Roche AG Methods of treating cea-positive cancers using pd-1 axis binding antagonists and anti-cea/anti-cd3 bispecific antibodies
JP7082604B2 (ja) 2016-03-21 2022-06-08 マレンゴ・セラピューティクス，インコーポレーテッド 多重特異性および多機能性分子ならびにその使用
JP7015244B2 (ja) 2016-03-22 2022-02-02 エフ・ホフマン－ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト プロテアーゼ活性化ｔ細胞二重特異性分子
WO2017181148A2 (en) 2016-04-15 2017-10-19 Alpine Immune Sciences, Inc. Icos ligand variant immunomodulatory proteins and uses thereof
SG11201808783XA (en) 2016-04-15 2018-11-29 Alpine Immune Sciences Inc Cd80 variant immunomodulatory proteins and uses thereof
BR112018071285A2 (pt) 2016-04-20 2019-02-12 Regeneron Pharma célula, conjunto de vetores, vetor, sistema, e, método
CA3015389A1 (en) 2016-04-20 2017-10-26 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for making antibodies based on use of expression-enhancing loci
AU2017259869A1 (en) 2016-05-02 2018-09-27 F. Hoffmann-La Roche Ag The contorsbody - a single chain target binder
EP3252078A1 (en) 2016-06-02 2017-12-06 F. Hoffmann-La Roche AG Type ii anti-cd20 antibody and anti-cd20/cd3 bispecific antibody for treatment of cancer
CN110603266A (zh) 2016-06-02 2019-12-20 豪夫迈·罗氏有限公司 用于治疗癌症的ii型抗cd20抗体和抗cd20/cd3双特异性抗体
WO2018002181A1 (en) 2016-06-28 2018-01-04 Umc Utrecht Holding B.V. TREATMENT OF IgE-MEDIATED DISEASES WITH ANTIBODIES THAT SPECIFICALLY BIND CD38
JP6983824B2 (ja) 2016-07-04 2021-12-17 エフ.ホフマン−ラ ロシュ アーゲーF. Hoffmann−La Roche Aktiengesellschaft 新規抗体フォーマット
EP3484922A1 (en) 2016-07-14 2019-05-22 Genmab A/S Multispecific antibodies against cd40 and cd137
TWI781108B (zh) 2016-07-20 2022-10-21 比利時商健生藥品公司 抗ｇｐｒｃ５ｄ抗體、結合ｇｐｒｃ５ｄ與ｃｄ３之雙特異性抗原結合分子及其用途
CN110088127A (zh) 2016-07-28 2019-08-02 高山免疫科学股份有限公司 Cd155变体免疫调节蛋白及其用途
US11834490B2 (en) 2016-07-28 2023-12-05 Alpine Immune Sciences, Inc. CD112 variant immunomodulatory proteins and uses thereof
JP7009448B2 (ja) 2016-08-12 2022-02-10 ヤンセン バイオテツク，インコーポレーテツド 強化されたアゴニスト活性を有する、Ｆｃが遺伝子操作を受けた抗ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバー抗体及びその使用方法
CA3033661A1 (en) 2016-08-12 2018-02-15 Janssen Biotech, Inc. Engineered antibodies and other fc-domain containing molecules with enhanced agonism and effector functions
CN109843926B (zh) 2016-09-30 2023-01-20 豪夫迈·罗氏有限公司 针对cd3的双特异性抗体
EP3519820B1 (en) 2016-09-30 2020-12-09 H. Hoffnabb-La Roche Ag Spr-based dual-binding assay for the functional analysis of multispecific molecules
JOP20190097A1 (ar) 2016-10-27 2019-04-28 Janssen Pharmaceutica Nv الجلوبولينات المناعية واستخداماتها
US20190276549A1 (en) 2016-11-01 2019-09-12 Genmab B.V. Polypeptide variants and uses thereof
MX2019004621A (es) 2016-11-02 2019-11-28 Engmab Sarl Anticuerpo biespecifico contra bcma y cd3 y un farmaco inmunologico para uso combinado en el tratamiento del mieloma multiple.
CA3042435A1 (en) 2016-11-15 2018-05-24 Genentech, Inc. Dosing for treatment with anti-cd20/anti-cd3 bispecific antibodies
MA46893A (fr) 2016-11-23 2019-10-02 Bioverativ Therapeutics Inc Anticorps bispécifiques se liant au facteur ix de coagulation et au facteur x de coagulation
CN110494565A (zh) 2016-12-02 2019-11-22 朱诺治疗学股份有限公司 工程化b细胞及相关组合物和方法
US11129906B1 (en) 2016-12-07 2021-09-28 David Gordon Bermudes Chimeric protein toxins for expression by therapeutic bacteria
WO2018122053A1 (en) 2016-12-29 2018-07-05 F. Hoffmann-La Roche Ag Anti-angiopoietin-2 antibody formulation
EP3580233A1 (en) 2017-02-10 2019-12-18 Genmab B.V. Polypeptide variants and uses thereof
US20200291089A1 (en) 2017-02-16 2020-09-17 Elstar Therapeutics, Inc. Multifunctional molecules comprising a trimeric ligand and uses thereof
SG11201908088RA (en) 2017-03-09 2019-10-30 Genmab As Antibodies against pd-l1
PE20191360A1 (es) 2017-03-10 2019-10-01 Hoffmann La Roche Metodo para producir anticuerpos multiespecificos
ES2963638T3 (es) 2017-03-16 2024-04-01 Alpine Immune Sciences Inc Proteínas inmunomoduladoras de variantes de PD-L1 y usos de las mismas
NZ756395A (en) 2017-03-16 2024-01-26 Alpine Immune Sciences Inc Cd80 variant immunomodulatory proteins and uses thereof
WO2018170023A1 (en) 2017-03-16 2018-09-20 Alpine Immune Sciences, Inc. Pd-l2 variant immunomodulatory proteins and uses thereof
SG11201908772TA (en) 2017-03-31 2019-10-30 Genmab Holding B V Bispecific anti-cd37 antibodies, monoclonal anti-cd37 antibodies and methods of use thereof
JP7247101B2 (ja) 2017-04-03 2023-03-28 エフ・ホフマン－ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト Ｓｔｅａｐ－１に結合する抗体
CN110382525B (zh) 2017-04-03 2023-10-20 豪夫迈·罗氏有限公司 免疫缀合物
CA3053357A1 (en) 2017-04-03 2018-10-11 F. Hoffmann-La Roche Ag Immunoconjugates of an anti-pd-1 antibody with a mutant il-2 or with il-15
MX2019012187A (es) 2017-04-13 2019-11-25 Hoffmann La Roche Un inmunoconjugado de interleuquina-2, un agonista de cd40 y opcionalmente un antagonista de union al eje pd-1 para uso en metodos para tratar cancer.
US20210246227A1 (en) 2017-05-31 2021-08-12 Elstar Therapeutics, Inc. Multispecific molecules that bind to myeloproliferative leukemia (mpl) protein and uses thereof
EP3634486A4 (en) 2017-06-05 2021-03-31 Janssen Biotech, Inc. GENETICALLY PRODUCED MULTISPECIFIC ANTIBODIES AND OTHER MULTIMERIC PROTEINS WITH ASYMMETRIC MUTATIONS OF THE CH2-CH3 REGION
BR112019025574A2 (pt) 2017-06-05 2020-06-23 Janssen Biotech, Inc. Anticorpos que se ligam especificamente ao pd-1 e métodos de uso
TW201919692A (zh) 2017-06-07 2019-06-01 荷蘭商珍美寶公司 包含抗體之醫藥組成物和其使用方法
AR112603A1 (es) 2017-07-10 2019-11-20 Lilly Co Eli Anticuerpos biespecíficos inhibidores de punto de control
AU2018309339A1 (en) 2017-08-04 2020-02-20 BioNTech SE Binding agents binding to PD-L1 and CD137 and use thereof
WO2019035938A1 (en) 2017-08-16 2019-02-21 Elstar Therapeutics, Inc. MULTISPECIFIC MOLECULES BINDING TO BCMA AND USES THEREOF
CA3198255A1 (en) 2017-10-10 2019-04-18 Alpine Immune Sciences, Inc. Ctla-4 variant immunomodulatory proteins and uses thereof
WO2019079520A2 (en) 2017-10-18 2019-04-25 Alpine Immune Sciences, Inc. ICOS VARIANT LIGAND IMMUNOMODULATORY IMMUNOMODULATORY PROTEINS, COMPOSITIONS AND METHODS THEREOF
JP2021500930A (ja) 2017-11-01 2021-01-14 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ Ｃｏｍｐボディ−多価標的結合物質
KR20200079492A (ko) 2017-11-01 2020-07-03 에프. 호프만-라 로슈 아게 이중특이성 2+1 컨터체
AU2018358904A1 (en) 2017-11-01 2020-04-16 F. Hoffmann-La Roche Ag TriFab-contorsbody
WO2019086499A1 (en) 2017-11-01 2019-05-09 F. Hoffmann-La Roche Ag Novel tnf family ligand trimer-containing antigen binding molecules
CN111527107A (zh) 2017-12-21 2020-08-11 豪夫迈·罗氏有限公司 结合hla-a2/wt1的抗体
CN109957026A (zh) * 2017-12-22 2019-07-02 成都恩沐生物科技有限公司 共价多特异性抗体
CN111491951A (zh) 2017-12-22 2020-08-04 豪夫迈·罗氏有限公司 通过疏水相互作用色谱法耗尽轻链错配的抗体变体
CA3087149A1 (en) 2018-01-03 2019-07-11 Alpine Immune Sciences, Inc. Multi-domain immunomodulatory proteins and methods of use thereof
US20210107988A1 (en) 2018-01-24 2021-04-15 Genmab B.V. Polypeptide variants and uses thereof
TWI786265B (zh) * 2018-02-02 2022-12-11 美商再生元醫藥公司 用於表徵蛋白質二聚合之系統及方法
EP3749359A1 (en) 2018-02-06 2020-12-16 F. Hoffmann-La Roche AG Treatment of ophthalmologic diseases
MA51793A (fr) 2018-02-08 2020-12-16 Hoffmann La Roche Molécules bispécifiques de liaison à l'antigène et procédés d'utilisation
TWI829667B (zh) 2018-02-09 2024-01-21 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 結合gprc5d之抗體
CA3115461A1 (en) 2018-03-09 2019-09-12 AskGene Pharma, Inc. Novel cytokine prodrugs
CN111971298A (zh) 2018-03-12 2020-11-20 健玛保 抗体
US20210238280A1 (en) 2018-03-14 2021-08-05 Elstar Therapeutics, Inc. Multifunctional molecules that bind to calreticulin and uses thereof
EP3765516A2 (en) 2018-03-14 2021-01-20 Elstar Therapeutics, Inc. Multifunctional molecules and uses thereof
AR115052A1 (es) 2018-04-18 2020-11-25 Hoffmann La Roche Anticuerpos multiespecíficos y utilización de los mismos
KR20210008380A (ko) 2018-05-03 2021-01-21 젠맵 비. 브이 항체 변이체 조합물 및 그의 용도
JP7444790B2 (ja) 2018-05-16 2024-03-06 ヤンセン バイオテツク，インコーポレーテツド 癌を治療する方法及びｔ細胞リダイレクト治療薬の有効性を向上させる方法
WO2019226761A1 (en) 2018-05-23 2019-11-28 Celgene Corporation Antiproliferative compounds and bispecific antibody against bcma and cd3 for combined use
WO2019224718A2 (en) 2018-05-24 2019-11-28 Janssen Biotech, Inc. Psma binding agents and uses thereof
JP2021524249A (ja) 2018-05-24 2021-09-13 ヤンセン バイオテツク，インコーポレーテツド 抗ｃｄ３抗体及びその使用
CR20200564A (es) 2018-05-24 2021-06-21 Janssen Biotech Inc Anticuerpos anti-tmeff2 monoespecificos y multiespecificos y sus usos
JOP20190116A1 (ar) 2018-05-24 2019-11-24 Janssen Biotech Inc الأجسام المضادة لتكتل التمايز 33 (cd33)، والأجسام المضادة ثنائية النوعية لتكتل التمايز 33 (cd33)/تكتل التمايز 3 (cd3) واستخداماتها
US20210363219A1 (en) 2018-06-15 2021-11-25 Alpine Immune Sciences, Inc. Pd-1 variant immunomodulatory proteins and uses thereof
EP3810194A1 (en) 2018-06-22 2021-04-28 Genmab Holding B.V. Anti-cd37 antibodies and anti-cd20 antibodies, compositions and methods of use thereof
CA3105448A1 (en) 2018-07-03 2020-01-09 Elstar Therapeutics, Inc. Anti-tcr antibody molecules and uses thereof
MA53123A (fr) 2018-07-13 2021-05-19 Genmab As Thérapie à médiation par trogocytose utilisant des anticorps cd38
TW202019518A (zh) 2018-07-13 2020-06-01 丹麥商珍美寶股份有限公司 Ｃｄ３８抗體之變體及其用途
US20210163562A1 (en) 2018-07-25 2021-06-03 AskGene Pharma, Inc. Novel IL-21 Prodrugs and Methods of Use Thereof
EP3856778A1 (en) 2018-09-24 2021-08-04 The Medical College of Wisconsin, Inc. System and method for the development of cd30 bispecific antibodies for immunotherapy of cd30+ malignancies
KR20210116429A (ko) 2018-10-04 2021-09-27 젠맵 홀딩 비.브이. 이중특이적 항-cd37 항체를 포함하는 제약 조성물
MA53862A (fr) 2018-10-12 2022-01-19 Xencor Inc Protéines de fusion fc d'il-15/il-15ralpha ciblant pd-1 et utilisations dans des polythérapies faisant intervenir celles-ci
CR20210200A (es) 2018-10-29 2021-05-25 Hoffmann La Roche Formulación de anticuerpos
CN113454111A (zh) 2018-11-06 2021-09-28 健玛保 抗体配制剂
JP2022510276A (ja) 2018-11-30 2022-01-26 アルパイン イミューン サイエンシズ インコーポレイテッド Ｃｄ８６バリアント免疫調節タンパク質およびその使用
CA3121699A1 (en) 2018-12-05 2020-06-11 Morphosys Ag Multispecific antigen-binding molecules
WO2020132646A1 (en) 2018-12-20 2020-06-25 Xencor, Inc. Targeted heterodimeric fc fusion proteins containing il-15/il-15ra and nkg2d antigen binding domains
PE20211603A1 (es) 2018-12-21 2021-08-18 Hoffmann La Roche Anticuerpos que se unen a cd3
EP3902560A1 (en) 2018-12-28 2021-11-03 F. Hoffmann-La Roche AG A peptide-mhc-i-antibody fusion protein for therapeutic use in a patient with amplified immune response
TW202043256A (zh) 2019-01-10 2020-12-01 美商健生生物科技公司 前列腺新抗原及其用途
WO2020148651A1 (en) 2019-01-15 2020-07-23 Janssen Biotech, Inc. Anti-tnf antibody compositions and methods for the treatment of juvenile idiopathic arthritis
SG11202107708XA (en) 2019-01-18 2021-08-30 Janssen Biotech Inc Gprc5d chimeric antigen receptors and cells expressing the same
MX2021008871A (es) 2019-01-23 2021-08-19 Janssen Biotech Inc Composiciones de anticuerpos anti-tnf para usarse en metodos para el tratamiento de la artritis psoriasica.
AU2020224154A1 (en) 2019-02-21 2021-09-16 Marengo Therapeutics, Inc. Multifunctional molecules that bind to calreticulin and uses thereof
GB2599227B (en) 2019-02-21 2024-05-01 Marengo Therapeutics Inc Multifunctional molecules that bind to T cells and uses thereof to treat autoimmune disorders
GB2597851A (en) 2019-02-21 2022-02-09 Marengo Therapeutics Inc Antibody molecules that bind to NKP30 and uses thereof
AU2020226904A1 (en) 2019-02-21 2021-09-16 Marengo Therapeutics, Inc. Anti-TCR antibody molecules and uses thereof
EP3927744A1 (en) 2019-02-21 2021-12-29 Marengo Therapeutics, Inc. Multifunctional molecules that bind to t cell related cancer cells and uses thereof
CA3131654A1 (en) 2019-02-26 2020-09-03 Janssen Biotech, Inc. Combination therapies and patient stratification with bispecific anti-egfr/c-met antibodies
MA55305A (fr) 2019-03-11 2022-01-19 Janssen Biotech Inc Anticorps bispécifiques anti-v béta 17/anti-cd123
KR20210142002A (ko) 2019-03-14 2021-11-23 얀센 바이오테크 인코포레이티드 항-tnf 항체 조성물을 생성하기 위한 제조 방법
KR20210141990A (ko) 2019-03-14 2021-11-23 얀센 바이오테크 인코포레이티드 항-il12/il23 항체 조성물을 생성하기 위한 제조 방법
WO2020183270A1 (en) 2019-03-14 2020-09-17 Janssen Biotech, Inc. Methods for producing anti-tnf antibody compositions
CA3133388A1 (en) 2019-03-14 2020-09-17 Janssen Biotech, Inc. Methods for producing anti-tnf antibody compositions
WO2020200941A1 (en) 2019-03-29 2020-10-08 F. Hoffmann-La Roche Ag Spr-based binding assay for the functional analysis of multivalent molecules
WO2020200944A1 (en) 2019-03-29 2020-10-08 F. Hoffmann-La Roche Ag Method for generating avid-binding multispecific antibodies
AR118720A1 (es) 2019-04-19 2021-10-27 Janssen Biotech Inc Métodos para tratar el cáncer de próstata con un anticuerpo anti-psma / cd3
AU2020261250A1 (en) 2019-04-25 2021-10-14 F. Hoffmann-La Roche Ag Generation of antibody-derived polypeptides by polypeptide chain exchange
MX2021012931A (es) 2019-04-25 2021-11-17 Hoffmann La Roche Polipeptidos multiespecificos activables y terapeuticos con semivida extendida.
CA3132494A1 (en) 2019-04-25 2020-10-29 Ulrich Brinkmann Therapeutic multispecific polypeptides activated by polypeptide chain exchange
BR112021022089A2 (pt) 2019-05-08 2022-02-08 Janssen Biotech Inc Materiais e métodos para modulação da imunidade mediada por células t
US20220315661A1 (en) 2019-05-09 2022-10-06 Genmab B.V. Dosage regimens for a combination of anti-dr5 antibodies for use in treating cancer
WO2020229378A1 (en) 2019-05-13 2020-11-19 F. Hoffmann-La Roche Ag Interference-suppressed pharmacokinetic immunoassay
JOP20210304A1 (ar) 2019-05-14 2023-01-30 Janssen Biotech Inc علاجات مركبة باستخدام الأجسام المضادة ثنائية النوعية المضادة لمستقبل عامل نمو البشرة (EGFR)/ مستقبل عامل نمو خلايا الكبد (c-Met) ومثبطات كيناز التيروسين الخاصة بمستقبل عامل نمو البشرة (EGFR) من الجيل الثالث
MA56015A (fr) 2019-06-03 2022-04-06 Janssen Biotech Inc Compositions d'anticorps anti-tnf et méthodes pour le traitement de l'arthrite psoriasique
JP2022536898A (ja) 2019-06-12 2022-08-22 アスクジーン・ファーマ・インコーポレイテッド 新規ｉｌ－１５プロドラッグおよびその使用方法
CN114080451B (zh) 2019-06-19 2024-03-22 豪夫迈·罗氏有限公司 通过使用Cre mRNA进行的靶向整合来产生蛋白质表达细胞的方法
CN114026224B (zh) 2019-06-26 2024-03-15 豪夫迈·罗氏有限公司 具有sirt-1基因敲除的哺乳动物细胞系
TW202115115A (zh) 2019-07-02 2021-04-16 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 免疫結合物
JP2022540843A (ja) 2019-07-12 2022-09-20 ヤンセン ファーマシューティカ エヌ．ベー． 結合剤及びその使用
AR119393A1 (es) 2019-07-15 2021-12-15 Hoffmann La Roche Anticuerpos que se unen a nkg2d
EP3999532A2 (en) 2019-07-16 2022-05-25 Sanofi Neutralizing anti-amyloid beta antibodies for the treatment of alzheimer's disease
AU2020322222A1 (en) 2019-07-26 2022-03-24 Janssen Biotech, Inc. Proteins comprising kallikrein related peptidase 2 antigen binding domains and their uses
GB201910900D0 (en) 2019-07-31 2019-09-11 Scancell Ltd Modified fc-regions to enhance functional affinity of antibodies and antigen binding fragments thereof
JP2022543551A (ja) 2019-07-31 2022-10-13 エフ・ホフマン－ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト Ｇｐｒｃ５ｄに結合する抗体
CR20220019A (es) 2019-07-31 2022-02-11 Hoffmann La Roche Anticuerpos que se fijan a gprc5d
AU2020327000A1 (en) 2019-08-08 2022-03-31 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Novel antigen binding molecule formats
JP2022544771A (ja) 2019-08-12 2022-10-21 アスクジーン・ファーマ・インコーポレイテッド 優先的にｉｌ－２ｒアルファに結合するｉｌ－２融合タンパク質
JP2022544760A (ja) 2019-08-15 2022-10-21 ヤンセン バイオテツク，インコーポレーテツド 改善された単鎖可変断片のための材料及び方法
WO2021035188A1 (en) 2019-08-21 2021-02-25 AskGene Pharma, Inc. Novel il-21 prodrugs and methods of use thereof
AU2020353235A1 (en) 2019-09-28 2022-03-31 AskGene Pharma, Inc. Cytokine prodrugs and dual-prodrugs
TW202128757A (zh) 2019-10-11 2021-08-01 美商建南德克公司 具有改善之特性的 PD-1 標靶 IL-15/IL-15Rα FC 融合蛋白
WO2021091953A1 (en) 2019-11-05 2021-05-14 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. N-terminal scfv multispecific binding molecules
JP2023500701A (ja) 2019-11-06 2023-01-10 ジェンマブ ビー．ブイ． 抗体変種の組み合わせおよびその使用
JP2023502652A (ja) 2019-11-18 2023-01-25 ヤンセン バイオテツク，インコーポレーテツド 抗ｃｄ７９キメラ抗原受容体、ｃａｒ－ｔ細胞、及びそれらの使用
EP4073111A1 (en) 2019-12-11 2022-10-19 Cilag GmbH International Multispecific binding molecules comprising ltbr and edb binding domains and uses thereof
US20210230278A1 (en) 2019-12-18 2021-07-29 Hoffmann-La Roche Inc. Antibodies binding to HLA-A2/MAGE-A4
KR20220113791A (ko) 2019-12-18 2022-08-16 에프. 호프만-라 로슈 아게 이중특이적 항-ccl2 항체
CN115023444A (zh) 2019-12-20 2022-09-06 再生元制药公司 新型il2激动剂及其使用方法
JP2023508596A (ja) 2020-01-02 2023-03-02 エフ． ホフマン－ラ ロシュ アーゲー 脳内の治療用抗体の量を決定するための方法
WO2021138407A2 (en) 2020-01-03 2021-07-08 Marengo Therapeutics, Inc. Multifunctional molecules that bind to cd33 and uses thereof
AU2021205981A1 (en) 2020-01-11 2022-07-14 AskGene Pharma, Inc. Novel masked cytokines and methods of use thereof
MX2022008050A (es) 2020-01-16 2022-07-27 Genmab As Formulaciones de anticuerpos anti cumulo de diferenciacion 38 (cd38) y usos de las mismas.
IL272194A (en) 2020-01-22 2021-07-29 Yeda Res & Dev Multi-target antibodies for use in the treatment of diseases
IL272389A (en) 2020-01-30 2021-08-31 Yeda Res & Dev Kits containing antibodies to PD-L1 and their uses in therapy
IL295129A (en) 2020-01-30 2022-09-01 Umoja Biopharma Inc Bispecific transduction enhancer
WO2021155916A1 (en) 2020-02-04 2021-08-12 BioNTech SE Treatment involving antigen vaccination and binding agents binding to pd-l1 and cd137
TW202144388A (zh) 2020-02-14 2021-12-01 美商健生生物科技公司 在卵巢癌中表現之新抗原及其用途
TW202144389A (zh) 2020-02-14 2021-12-01 美商健生生物科技公司 在多發性骨髓瘤中表現之新抗原及其用途
MX2022011320A (es) 2020-03-13 2022-12-08 Janssen Biotech Inc Materiales y métodos para la unión de lectina tipo ig de unión a ácido siálico.
AR121599A1 (es) 2020-03-18 2022-06-22 Genmab As Anticuerpos
US20230192795A1 (en) 2020-04-15 2023-06-22 Hoffmann-La Roche Inc. Immunoconjugates
CN115916840A (zh) 2020-04-16 2023-04-04 詹森生物科技公司 用于监测多特异性分子的形成物的反相高效液相色谱（rp-hplc）的系统、材料和方法
EP4139363A1 (en) 2020-04-24 2023-03-01 Marengo Therapeutics, Inc. Multifunctional molecules that bind to t cell related cancer cells and uses thereof
CN113563473A (zh) 2020-04-29 2021-10-29 三生国健药业（上海）股份有限公司 四价双特异性抗体、其制备方法和用途
EP4142722A1 (en) 2020-04-30 2023-03-08 Bristol-Myers Squibb Company Methods of treating cytokine-related adverse events
WO2021226551A1 (en) 2020-05-08 2021-11-11 Alpine Immune Sciences, Inc. April and baff inhibitory immunomodulatory proteins and methods of use thereof
US20210371538A1 (en) 2020-05-08 2021-12-02 Genmab A/S Bispecific antibodies against cd3 and cd20
CR20220576A (es) 2020-05-11 2022-12-07 Hoffmann La Roche Tratamiento conjunto con pbmc modificadas y un inmunoconjugado
IL298046A (en) 2020-05-11 2023-01-01 Janssen Biotech Inc Treatment methods for multiple myeloma
JP2023525555A (ja) 2020-05-12 2023-06-16 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド 新規なｉｌ１０アゴニストおよびその使用方法
CR20220594A (es) 2020-05-27 2023-01-17 Janssen Biotech Inc Proteins comprising cd3 antigen binding domains and uses thereof
GB202008860D0 (en) 2020-06-11 2020-07-29 Univ Oxford Innovation Ltd BTLA antibodies
WO2021255146A1 (en) 2020-06-19 2021-12-23 F. Hoffmann-La Roche Ag Antibodies binding to cd3 and cea
CR20220629A (es) 2020-06-19 2023-02-17 Hoffmann La Roche Moléculas de unión al dominio fc de activación inmunitaria
WO2021255143A1 (en) 2020-06-19 2021-12-23 F. Hoffmann-La Roche Ag Antibodies binding to cd3 and folr1
TW202216766A (zh) 2020-06-19 2022-05-01 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 與ｃｄ３結合之抗體
AU2021291011A1 (en) 2020-06-19 2023-01-05 F. Hoffmann-La Roche Ag Antibodies binding to CD3 and CD19
WO2022018294A1 (en) 2020-07-23 2022-01-27 Genmab B.V. A combination of anti-dr5 antibodies and an immunomodulatory imide drug for use in treating multiple myeloma
AR123083A1 (es) 2020-07-29 2022-10-26 Janssen Biotech Inc Proteínas que comprenden dominios de unión al antígeno hla-g y sus usos
US20230287088A1 (en) 2020-08-06 2023-09-14 BioNTech SE Binding agents for coronavirus s protein
EP4204458A1 (en) 2020-08-26 2023-07-05 Marengo Therapeutics, Inc. Methods of detecting trbc1 or trbc2
AU2021331076A1 (en) 2020-08-26 2023-04-06 Marengo Therapeutics, Inc. Antibody molecules that bind to NKp30 and uses thereof
JP2023542080A (ja) 2020-08-26 2023-10-05 マレンゴ・セラピューティクス，インコーポレーテッド カルレティキュリンに結合する多機能性分子およびその使用
WO2022049220A2 (en) 2020-09-02 2022-03-10 Genmab A/S Antibody therapy
US20230357440A1 (en) 2020-09-10 2023-11-09 Genmab A/S Bispecific antibody against cd3 and cd20 in combination therapy for treating follicular lymphoma
AU2021342342A1 (en) 2020-09-10 2023-04-13 Genmab A/S Bispecific antibodies against CD3 and CD20 for treating chronic lymphocytic leukemia
MX2023002540A (es) 2020-09-10 2023-03-14 Genmab As Anticuerpo biespecifico contra el cumulo de diferenciacion 3 (cd3) y el cumulo de diferenciacion 20 (cd20) en terapia combinada para el tratamiento del linfoma folicular.
KR20230066583A (ko) 2020-09-10 2023-05-16 젠맵 에이/에스 미만성 대 b-세포 림프종을 치료하기 위한 조합 요법에서의 cd3 및 cd20에 대한 이중특이적 항체
WO2022053658A1 (en) 2020-09-10 2022-03-17 Genmab A/S Bispecific antibody against cd3 and cd20 in combination therapy for treating diffuse large b-cell lymphoma
JP2023542291A (ja) 2020-09-10 2023-10-06 ジェンマブ エー／エス びまん性大細胞型ｂ細胞リンパ腫を治療するための併用療法におけるｃｄ３及びｃｄ２０に対する二重特異性抗体
MX2023002948A (es) 2020-09-11 2023-05-22 Janssen Biotech Inc Métodos y composiciones para modular la inmunidad mediada por cadena beta.
AU2021342284A1 (en) 2020-09-14 2023-04-20 Sutro Biopharma, Inc. Method for large scale production of antibodies using a cell-free protein synthesis system
CA3195257A1 (en) 2020-09-24 2022-03-31 F. Hoffmann-La Roche Ag Mammalian cell lines with gene knockout
AU2021351187A1 (en) 2020-10-02 2023-04-20 Genmab A/S Antibodies capable of binding to ROR2 and bispecific antibodies binding to ROR2 and CD3
AR123767A1 (es) 2020-10-13 2023-01-11 Janssen Biotech Inc Inmunidad mediada por células t mediante bioingeniería, materiales y otros métodos para modular el cúmulo de diferenciación iv y/o viii
TW202233672A (zh) 2020-10-22 2022-09-01 美商健生生物科技公司 包括類δ配體３（ＤＬＬ３）抗原結合區之蛋白質及其用途
JP2023550287A (ja) 2020-11-02 2023-12-01 アトララス・インコーポレイテッド Ｓａｐ ｆｃ融合タンパク質及び使用方法
WO2022100613A1 (zh) 2020-11-10 2022-05-19 上海齐鲁制药研究中心有限公司 针对密蛋白18a2和cd3的双特异性抗体及其应用
JP7326584B2 (ja) 2020-12-17 2023-08-15 エフ・ホフマン－ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト 抗ｈｌａ－ｇ抗体及びその使用
CN116601175A (zh) 2020-12-18 2023-08-15 豪夫迈·罗氏有限公司 用于靶向疗法的前体蛋白和试剂盒
EP4267734A1 (en) 2020-12-22 2023-11-01 F. Hoffmann-La Roche AG Oligonucleotides targeting xbp1
CN116829598A (zh) 2021-01-06 2023-09-29 豪夫迈·罗氏有限公司 采用pd1-lag3双特异性抗体和cd20 t细胞双特异性抗体的组合疗法
WO2022148853A1 (en) 2021-01-11 2022-07-14 F. Hoffmann-La Roche Ag Immunoconjugates
US20240076355A1 (en) 2021-01-14 2024-03-07 AskGene Pharma, Inc. Interferon Prodrugs and Methods of Making and Using the Same
US20240059789A1 (en) 2021-01-28 2024-02-22 Janssen Biotech, Inc. Psma binding proteins and uses thereof
EP4284819A1 (en) 2021-02-01 2023-12-06 Askgene Pharma, Inc. Chimeric molecules comprising an il-10 or tgf-beta agonist polypeptide
JP2024506694A (ja) 2021-02-16 2024-02-14 ヤンセン バイオテツク，インコーポレーテツド 増強されたリンカー標的化のための材料及び方法
BR112023016121A2 (pt) 2021-02-16 2023-11-28 Janssen Pharmaceutica Nv Anticorpo triespecífico que direciona bcma, gprc5d e cd3
WO2022178103A1 (en) 2021-02-17 2022-08-25 AskGene Pharma, Inc. Il-2 receptor beta subunit mutants
EP4295154A1 (en) 2021-02-18 2023-12-27 F. Hoffmann-La Roche AG Method for resolving complex, multistep antibody interactions
JP2024509920A (ja) 2021-03-09 2024-03-05 ヤンセン バイオテツク，インコーポレーテツド Ｅｇｆｒ活性化変異を欠くがんの治療
CN116964085A (zh) 2021-03-12 2023-10-27 根马布股份公司 非激活抗体变体
EP4314056A1 (en) 2021-03-24 2024-02-07 Janssen Biotech, Inc. Proteins comprising cd3 antigen binding domains and uses thereof
AU2022244453A1 (en) 2021-03-24 2023-11-09 Janssen Biotech, Inc. Antibody targeting cd22 and cd79b
CA3214594A1 (en) 2021-03-24 2022-09-29 Janssen Biotech, Inc. Trispecific antibody targeting cd79b, cd20, and cd3
EP4317175A1 (en) 2021-03-31 2024-02-07 Jiangsu Hengrui Pharmaceuticals Co., Ltd. Truncated taci polypeptide and fusion protein and use thereof
CA3214757A1 (en) 2021-04-08 2022-10-13 Andreas Loew Multifuntional molecules binding to tcr and uses thereof
AU2021443863A1 (en) 2021-04-30 2023-10-26 F. Hoffmann-La Roche Ag Dosing for treatment with anti-cd20/anti-cd3 bispecific antibody
KR20240005691A (ko) 2021-04-30 2024-01-12 에프. 호프만-라 로슈 아게 항-cd20/항-cd3 이중특이적 항체 및 항-cd79b 항체 약물 접합체를 이용한 병용 치료를 위한 투약
CN117597365A (zh) 2021-05-04 2024-02-23 再生元制药公司 多特异性fgf21受体激动剂及其应用
AU2022270075A1 (en) 2021-05-04 2023-11-09 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Multispecific fgf21 receptor agonists and their uses
IL308336A (en) 2021-05-07 2024-01-01 Alpine Immune Sciences Inc Methods of dosing and treatment with TACI-FC modulatory fusion protein
EP4334359A1 (en) 2021-05-07 2024-03-13 Genmab A/S Pharmaceutical compositions comprising bispecific antibodies binding to b7h4 and cd3
TW202306990A (zh) 2021-05-12 2023-02-16 大陸商江蘇恆瑞醫藥股份有限公司 特異性結合ｒａｎｋｌ和ｎｇｆ的抗原結合分子及其醫藥用途
WO2022237882A1 (zh) 2021-05-14 2022-11-17 江苏恒瑞医药股份有限公司 一种抗原结合分子
TW202309094A (zh) 2021-05-18 2023-03-01 美商健生生物科技公司 用於識別癌症患者以進行組合治療之方法
CA3221735A1 (en) 2021-06-18 2022-12-22 F. Hoffmann-La Roche Ag Bispecific anti-ccl2 antibodies
WO2022268740A1 (en) 2021-06-21 2022-12-29 Genmab A/S Combination dosage regime of cd137 and pd-l1 binding agents
IL308134A (en) 2021-06-22 2023-12-01 Novartis Ag BISPECIFIC ANTIBODIES FOR USE IN THE TREATMENT OF HIDRADENITIS SUPPURATIVA
TW202309078A (zh) 2021-07-02 2023-03-01 美商建南德克公司 治療癌症之方法及組成物
KR20240032991A (ko) 2021-07-09 2024-03-12 얀센 바이오테크 인코포레이티드 항-tnf 항체 조성물의 생성을 위한 제조 방법
AU2022306973A1 (en) 2021-07-09 2024-02-22 Janssen Biotech, Inc. Manufacturing methods for producing anti-il12/il23 antibody compositions
IL309997A (en) 2021-07-09 2024-03-01 Janssen Biotech Inc Production methods for the production of anti-TNF antibody compositions
AU2022309554A1 (en) 2021-07-14 2024-02-22 Jiangsu Hengrui Pharmaceuticals Co., Ltd. Antigen-binding molecule specifically binding to hgfr and egfr, and pharmaceutical use thereof
WO2023002952A1 (en) * 2021-07-19 2023-01-26 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Protease-mediated target specific cytokine delivery using fusion polypeptide
KR20240035845A (ko) 2021-07-19 2024-03-18 리제너론 파아마슈티컬스, 인크. Il12 수용체 효능제 및 그의 사용 방법
WO2023001884A1 (en) 2021-07-22 2023-01-26 F. Hoffmann-La Roche Ag Heterodimeric fc domain antibodies
AU2022318255A1 (en) 2021-07-27 2024-01-18 Morphosys Ag Combinations of antigen binding molecules
CN117715936A (zh) 2021-07-28 2024-03-15 豪夫迈·罗氏有限公司 用于治疗癌症的方法和组合物
CA3226428A1 (en) 2021-08-02 2023-02-09 Hangzhou Unogen Biotech, Ltd Anti-cd38 antibodies, anti-cd3 antibodies, and bispecific antibodies, and uses thereof
WO2023015169A1 (en) 2021-08-02 2023-02-09 Tavotek Biotech (Suzhou) Ltd Anti-cdh17 monoclonal and bispecific antibodies and uses thereof
AU2022331241A1 (en) 2021-08-16 2024-03-28 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Novel il27 receptor agonists and methods of use thereof
CA3231003A1 (en) 2021-09-06 2023-03-09 Genmab A/S Antibodies capable of binding to cd27, variants thereof and uses thereof
TW202328193A (zh) 2021-09-13 2023-07-16 美商健生生物科技公司 用於治療癌症的CD33 x Vδ2多特異性抗體
IL286430A (en) 2021-09-14 2023-04-01 Yeda Res & Dev Multispecific antibodies for use in the treatment of diseases
CA3232472A1 (en) 2021-09-23 2023-03-30 Jiangsu Hengrui Pharmaceuticals Co., Ltd. Anti-klb antibodies and uses
WO2023046322A1 (en) 2021-09-24 2023-03-30 Janssen Pharmaceutica Nv Proteins comprising cd20 binding domains, and uses thereof
US20230203199A1 (en) * 2021-09-29 2023-06-29 Modex Therapeutics Antigen binding polypeptides, antigen binding polypeptide complexes and methods of use thereof
CA3233261A1 (en) 2021-09-30 2023-04-06 Langyong MAO Anti-il23 antibody fusion protein and uses thereof
TW202330610A (zh) 2021-10-08 2023-08-01 丹麥商珍美寶股份有限公司 結合至ｃｄ３０及ｃｄ３之抗體
WO2023062050A1 (en) 2021-10-14 2023-04-20 F. Hoffmann-La Roche Ag New interleukin-7 immunoconjugates
WO2023062048A1 (en) 2021-10-14 2023-04-20 F. Hoffmann-La Roche Ag Alternative pd1-il7v immunoconjugates for the treatment of cancer
CA3232216A1 (en) 2021-10-18 2023-04-27 Tavotek Biotherapeutics (Hong Kong) Limited Anti-egfr antibodies, anti-cmet antibodies, anti-vegf antibodies, multispecific antibodies, and uses thereof
WO2023073599A1 (en) 2021-10-28 2023-05-04 Novartis Ag Engineered fc variants
WO2023077155A1 (en) 2021-11-01 2023-05-04 Janssen Biotech, Inc. Compositions and methods for the modulation of beta chain-mediated immunity
TW202334223A (zh) 2021-11-11 2023-09-01 美商再生元醫藥公司 Ｃｄ２０－ｐｄ１結合分子及其使用方法
WO2023089587A1 (en) 2021-11-22 2023-05-25 Janssen Biotech, Inc. Compositions comprising enhanced multispecific binding agents for an immune response
WO2023094282A1 (en) 2021-11-25 2023-06-01 F. Hoffmann-La Roche Ag Quantification of low amounts of antibody sideproducts
US20230183360A1 (en) 2021-12-09 2023-06-15 Janssen Biotech, Inc. Use of Amivantamab to Treat Colorectal Cancer
AR127887A1 (es) 2021-12-10 2024-03-06 Hoffmann La Roche Anticuerpos que se unen a cd3 y plap
WO2023129974A1 (en) 2021-12-29 2023-07-06 Bristol-Myers Squibb Company Generation of landing pad cell lines
US20230295348A1 (en) 2022-01-24 2023-09-21 Novimmune Sa Composition and methods for the selective activation of cytokine signaling pathways
WO2023144290A1 (en) 2022-01-28 2023-08-03 Genmab A/S Bispecific antibody against cd3 and cd20 in combination therapy for treating diffuse large b-cell lymphoma
WO2023144306A1 (en) 2022-01-28 2023-08-03 Genmab A/S Bispecific antibody against cd3 and cd20 in combination therapy for treating diffuse large b-cell lymphoma
TW202342057A (zh) 2022-02-07 2023-11-01 美商健生生物科技公司 用於減少用ｅｇｆｒ／ｍｅｔ雙特異性抗體治療之患者的輸注相關反應之方法
US20240002544A1 (en) 2022-03-07 2024-01-04 Novimmune Sa Cd28 bispecific antibodies for targeted t cell activation
US20230287146A1 (en) 2022-03-14 2023-09-14 LamKap Bio gamma AG BISPECIFIC GPC3xCD28 AND GPC3xCD3 ANTIBODIES AND THEIR COMBINATION FOR TARGETED KILLING OF GPC3 POSITIVE MALIGNANT CELLS
WO2023174521A1 (en) 2022-03-15 2023-09-21 Genmab A/S Binding agents binding to epcam and cd137
TW202346365A (zh) 2022-03-23 2023-12-01 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 抗ｃｄ２０／抗ｃｄ３雙特異性抗體及化學療法之組合治療
TW202346337A (zh) 2022-03-29 2023-12-01 美商恩格姆生物製藥公司 Ilt3及cd3結合劑以及其使用方法
WO2023198727A1 (en) 2022-04-13 2023-10-19 F. Hoffmann-La Roche Ag Pharmaceutical compositions of anti-cd20/anti-cd3 bispecific antibodies and methods of use
WO2023198839A2 (en) 2022-04-13 2023-10-19 Genmab A/S Bispecific antibodies against cd3 and cd20
WO2023202967A1 (en) 2022-04-19 2023-10-26 F. Hoffmann-La Roche Ag Improved production cells
WO2023220647A1 (en) 2022-05-11 2023-11-16 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Multispecific binding molecule proproteins and uses thereof
WO2023218046A1 (en) 2022-05-12 2023-11-16 Genmab A/S Binding agents capable of binding to cd27 in combination therapy
WO2023218051A1 (en) 2022-05-12 2023-11-16 Genmab A/S Binding agents capable of binding to cd27 in combination therapy
US20230382969A1 (en) 2022-05-27 2023-11-30 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Interleukin-2 proproteins and uses thereof
WO2023232961A1 (en) 2022-06-03 2023-12-07 F. Hoffmann-La Roche Ag Improved production cells
WO2023235848A1 (en) 2022-06-04 2023-12-07 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Interleukin-2 proproteins and uses thereof
WO2024003837A1 (en) 2022-06-30 2024-01-04 Janssen Biotech, Inc. Use of anti-egfr/anti-met antibody to treat gastric or esophageal cancer
WO2024040247A1 (en) 2022-08-18 2024-02-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Interferon proproteins and uses thereof
US20240067691A1 (en) 2022-08-18 2024-02-29 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Interferon receptor agonists and uses thereof
WO2024077018A2 (en) 2022-10-04 2024-04-11 Alpine Immune Sciences, Inc. Methods and uses of taci-fc fusion immunomodulatory protein
WO2024079009A1 (en) 2022-10-10 2024-04-18 F. Hoffmann-La Roche Ag Combination therapy of a gprc5d tcb and proteasome inhibitors
WO2024079010A1 (en) 2022-10-10 2024-04-18 F. Hoffmann-La Roche Ag Combination therapy of a gprc5d tcb and cd38 antibodies
WO2024079015A1 (en) 2022-10-10 2024-04-18 F. Hoffmann-La Roche Ag Combination therapy of a gprc5d tcb and imids
WO2024079069A1 (en) 2022-10-12 2024-04-18 F. Hoffmann-La Roche Ag Method for classifying cells

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH08500979A (ja) * 1992-09-09 1996-02-06 スミスクライン・ビーチヤム・コーポレーシヨン ヒトにおいて病原体による感染に対する受動免疫を付与するための新規の抗体
WO1997010354A1 (en) * 1995-09-11 1997-03-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. ANTIBODY AGAINTS α-CHAIN OF HUMAN INTERLEUKIN 5 RECEPTOR
JPH11500916A (ja) * 1995-02-28 1999-01-26 ザ プロクター アンド ギャンブル カンパニー 優れた微生物安定性を有する無炭酸飲料製品の製造
JP2004086862A (ja) * 2002-05-31 2004-03-18 Celestar Lexico-Sciences Inc タンパク質相互作用情報処理装置、タンパク質相互作用情報処理方法、プログラム、および、記録媒体

Family Cites Families (349)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SE370449B (ja) 1970-08-29 1974-10-14 Philips Nv
JPS5334319B2 (ja) 1971-12-28 1978-09-20
JPS5717624B2 (ja) 1974-04-17 1982-04-12
JPS59878B2 (ja) 1975-09-04 1984-01-09 松下電工株式会社 感知器
US4208479A (en) 1977-07-14 1980-06-17 Syva Company Label modified immunoassays
JPS5912436B2 (ja) 1980-08-05 1984-03-23 ファナック株式会社 工業用ロボットの安全機構
US4474893A (en) 1981-07-01 1984-10-02 The University of Texas System Cancer Center Recombinant monoclonal antibodies
US4444878A (en) 1981-12-21 1984-04-24 Boston Biomedical Research Institute, Inc. Bispecific antibody determinants
JPS58201994A (ja) 1982-05-21 1983-11-25 Hideaki Hagiwara 抗原特異的ヒト免疫グロブリンの生産方法
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
GB8607679D0 (en) 1986-03-27 1986-04-30 Winter G P Recombinant dna product
JPH0234615Y2 (ja) 1986-08-08 1990-09-18
JPH06104071B2 (ja) 1986-08-24 1994-12-21 財団法人化学及血清療法研究所 第▲ｉｘ▼因子コンホメ−シヨン特異性モノクロ−ナル抗体
US5004697A (en) 1987-08-17 1991-04-02 Univ. Of Ca Cationized antibodies for delivery through the blood-brain barrier
US5670373A (en) 1988-01-22 1997-09-23 Kishimoto; Tadamitsu Antibody to human interleukin-6 receptor
US5322678A (en) 1988-02-17 1994-06-21 Neorx Corporation Alteration of pharmacokinetics of proteins by charge modification
US6010902A (en) 1988-04-04 2000-01-04 Bristol-Meyers Squibb Company Antibody heteroconjugates and bispecific antibodies for use in regulation of lymphocyte activity
US5126250A (en) 1988-09-28 1992-06-30 Eli Lilly And Company Method for the reduction of heterogeneity of monoclonal antibodies
IL89491A0 (en) 1988-11-17 1989-09-10 Hybritech Inc Bifunctional chimeric antibodies
DE3920358A1 (de) 1989-06-22 1991-01-17 Behringwerke Ag Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung
JPH0341033A (ja) 1989-07-07 1991-02-21 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd 安定なモチリン類含有製剤
GB8916400D0 (en) 1989-07-18 1989-09-06 Dynal As Modified igg3
KR100236375B1 (ko) 1989-12-11 1999-12-15 오트리브 데이비스 더블유 진단제 또는 치료제를 목표부위에 타게팅하기 위한 제제 및 키트
US5859205A (en) 1989-12-21 1999-01-12 Celltech Limited Humanised antibodies
TW212184B (ja) 1990-04-02 1993-09-01 Takeda Pharm Industry Co Ltd
JPH05184383A (ja) 1990-06-19 1993-07-27 Dainabotsuto Kk 二重特異性抗体
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
ATE185601T1 (de) 1990-07-10 1999-10-15 Cambridge Antibody Tech Verfahren zur herstellung von spezifischen bindungspaargliedern
JPH05199894A (ja) 1990-08-20 1993-08-10 Takeda Chem Ind Ltd 二重特異性抗体および抗体含有薬剤
ATE158021T1 (de) 1990-08-29 1997-09-15 Genpharm Int Produktion und nützung nicht-menschliche transgentiere zur produktion heterologe antikörper
WO1992019759A1 (en) 1991-04-25 1992-11-12 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Reconstituted human antibody against human interleukin 6 receptor
JPH05304992A (ja) 1991-06-20 1993-11-19 Takeda Chem Ind Ltd ハイブリッド・モノクローナル抗体および抗体含有薬剤
US5637481A (en) 1993-02-01 1997-06-10 Bristol-Myers Squibb Company Expression vectors encoding bispecific fusion proteins and methods of producing biologically active bispecific fusion proteins in a mammalian cell
US6136310A (en) 1991-07-25 2000-10-24 Idec Pharmaceuticals Corporation Recombinant anti-CD4 antibodies for human therapy
DE69229477T2 (de) 1991-09-23 1999-12-09 Cambridge Antibody Tech Methoden zur Herstellung humanisierter Antikörper
ES2241710T3 (es) 1991-11-25 2005-11-01 Enzon, Inc. Procedimiento para producir proteinas multivalentes de union a antigeno.
US5885793A (en) 1991-12-02 1999-03-23 Medical Research Council Production of anti-self antibodies from antibody segment repertoires and displayed on phage
CA2124967C (en) 1991-12-17 2008-04-08 Nils Lonberg Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5667988A (en) 1992-01-27 1997-09-16 The Scripps Research Institute Methods for producing antibody libraries using universal or randomized immunoglobulin light chains
JPH05203652A (ja) 1992-01-28 1993-08-10 Fuji Photo Film Co Ltd 抗体酵素免疫分析法
JPH05213775A (ja) 1992-02-05 1993-08-24 Otsuka Pharmaceut Co Ltd Ｂｆａ抗体
US6749853B1 (en) 1992-03-05 2004-06-15 Board Of Regents, The University Of Texas System Combined methods and compositions for coagulation and tumor treatment
EP0656941B1 (en) 1992-03-24 2005-06-01 Cambridge Antibody Technology Limited Methods for producing members of specific binding pairs
US6129914A (en) 1992-03-27 2000-10-10 Protein Design Labs, Inc. Bispecific antibody effective to treat B-cell lymphoma and cell line
US5744446A (en) 1992-04-07 1998-04-28 Emory University Hybrid human/animal factor VIII
ES2301158T3 (es) 1992-07-24 2008-06-16 Amgen Fremont Inc. Produccion de anticuerpos xenogenicos.
US5639641A (en) 1992-09-09 1997-06-17 Immunogen Inc. Resurfacing of rodent antibodies
CA2126967A1 (en) 1992-11-04 1994-05-11 Anna M. Wu Novel antibody construct
AU690528B2 (en) 1992-12-04 1998-04-30 Medical Research Council Multivalent and multispecific binding proteins, their manufacture and use
JPH06175590A (ja) 1992-12-09 1994-06-24 Ricoh Res Inst Of Gen Electron カード型ディスプレイ装置
DE69327229T2 (de) 1992-12-11 2000-03-30 Dow Chemical Co Multivalente einkettige Antikörper
GB9313509D0 (en) 1993-06-30 1993-08-11 Medical Res Council Chemisynthetic libraries
AU7214294A (en) 1993-07-01 1995-01-24 Dade International Inc. Process for the preparation of factor x depleted plasma
UA40577C2 (uk) 1993-08-02 2001-08-15 Мерк Патент Гмбх Біспецифічна молекула, що використовується для лізису пухлинних клітин, спосіб її одержання, моноклональне антитіло (варіанти), фармацевтичний препарат, фармацевтичний набір (варіанти), спосіб видалення пухлинних клітин
IL107742A0 (en) 1993-11-24 1994-02-27 Yeda Res & Dev Chemically-modified binding proteins
EP0732404A4 (en) 1993-12-03 1997-07-30 Asahi Chemical Ind NEW EXPRESSION DETECTION VECTOR
CA2177367A1 (en) 1993-12-03 1995-06-08 Andrew David Griffiths Recombinant binding proteins and peptides
DE4419399C1 (de) 1994-06-03 1995-03-09 Gsf Forschungszentrum Umwelt Verfahren zur Herstellung von heterologen bispezifischen Antikörpern
US5945311A (en) 1994-06-03 1999-08-31 GSF--Forschungszentrumfur Umweltund Gesundheit Method for producing heterologous bi-specific antibodies
US8017121B2 (en) 1994-06-30 2011-09-13 Chugai Seiyaku Kabushika Kaisha Chronic rheumatoid arthritis therapy containing IL-6 antagonist as effective component
HU220347B (hu) 1994-07-11 2001-12-28 Board Of Regents The University Of Texas System Készítmény az érrendszer specifikus koagulálásához
KR100261941B1 (ko) 1994-07-13 2000-07-15 나가야마 오사무 사람의 인터루킨-8에 대한 재구성 사람항체
WO1996004925A1 (en) 1994-08-12 1996-02-22 Immunomedics, Inc. Immunoconjugates and humanized antibodies specific for b-cell lymphoma and leukemia cells
US6451523B1 (en) 1994-09-14 2002-09-17 Interneuron Pharmaceuticals, Inc. Detection of a leptin receptor variant and methods for regulating obesity
US6309636B1 (en) 1995-09-14 2001-10-30 Cancer Research Institute Of Contra Costa Recombinant peptides derived from the Mc3 anti-BA46 antibody, methods of use thereof, and methods of humanizing antibody peptides
AU700819B2 (en) 1994-10-07 1999-01-14 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Rheumatoid arthritis remedy containing IL-6 antagonist as effective component
CN101829325A (zh) 1994-10-21 2010-09-15 岸本忠三 Il-6受体的抗体在制备药物组合物中的用途
EP0794792A1 (en) 1994-12-02 1997-09-17 Chiron Corporation Method of promoting an immune response with a bispecific antibody
US6485943B2 (en) 1995-01-17 2002-11-26 The University Of Chicago Method for altering antibody light chain interactions
US5731168A (en) * 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
CA2761116A1 (en) 1995-04-27 1996-10-31 Amgen Fremont Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
CA2219486A1 (en) 1995-04-28 1996-10-31 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
EP0871673B1 (en) 1995-05-03 2006-04-05 Bioenhancementsments Ltd. Bispecific antibodies in which the binding capability is reversibly inhibited by a photocleavable moiety
IL125073A0 (en) 1996-01-08 1999-01-26 Genentech Inc Wsx receptor and ligands
MA24512A1 (fr) 1996-01-17 1998-12-31 Univ Vermont And State Agrienl Procede pour la preparation d'agents anticoagulants utiles dans le traitement de la thrombose
FR2745008A1 (fr) 1996-02-20 1997-08-22 Ass Pour Le Dev De La Rech En Recepteur nucleaire de glucocorticoides modifie, fragments d'adn codant pour ledit recepteur et procedes dans lesquels ils sont mis en oeuvre
JP3032287U (ja) 1996-06-10 1996-12-17 幸喜 高橋 人 形
US20020147326A1 (en) 1996-06-14 2002-10-10 Smithkline Beecham Corporation Hexameric fusion proteins and uses therefor
EP0938499A1 (en) 1996-07-19 1999-09-01 Amgen Inc. Analogs of cationic proteins
IL129164A (en) 1996-09-26 2007-05-15 Chugai Pharmaceutical Co Ltd An antibody against peptides associated with human parathyroid hormone
JPH10165184A (ja) 1996-12-16 1998-06-23 Tosoh Corp 抗体、遺伝子及びキメラ抗体の製法
US5990286A (en) 1996-12-18 1999-11-23 Techniclone, Inc. Antibodies with reduced net positive charge
US6323000B2 (en) 1996-12-20 2001-11-27 Clark A. Briggs Variant human α7 acetylcholine receptor subunit, and methods of production and uses thereof
AU740904B2 (en) 1997-03-20 2001-11-15 Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services, The Recombinant antibodies and immunoconjugates targeted to CD-22 bearing cells and tumors
US6306393B1 (en) 1997-03-24 2001-10-23 Immunomedics, Inc. Immunotherapy of B-cell malignancies using anti-CD22 antibodies
US6183744B1 (en) 1997-03-24 2001-02-06 Immunomedics, Inc. Immunotherapy of B-cell malignancies using anti-CD22 antibodies
US6884879B1 (en) 1997-04-07 2005-04-26 Genentech, Inc. Anti-VEGF antibodies
US20070059302A1 (en) 1997-04-07 2007-03-15 Genentech, Inc. Anti-vegf antibodies
FR2761994B1 (fr) 1997-04-11 1999-06-18 Centre Nat Rech Scient Preparation de recepteurs membranaires a partir de baculovirus extracellulaires
JP4213224B2 (ja) 1997-05-02 2009-01-21 ジェネンテック，インコーポレーテッド ヘテロマルチマー及び共通成分を有する多重特異性抗体の製造方法
US20030207346A1 (en) 1997-05-02 2003-11-06 William R. Arathoon Method for making multispecific antibodies having heteromultimeric and common components
US20020062010A1 (en) 1997-05-02 2002-05-23 Genentech, Inc. Method for making multispecific antibodies having heteromultimeric and common components
WO2001036486A2 (en) 1999-11-18 2001-05-25 Oxford Biomedica (Uk) Limited Scfv antibodies against disease associated molecules
DE19725586C2 (de) 1997-06-17 1999-06-24 Gsf Forschungszentrum Umwelt Verfahren zur Herstellung von Zellpräparaten zur Immunisierung mittels heterologer intakter bispezifischer und/oder trispezifischer Antikörper
AU8296098A (en) 1997-07-08 1999-02-08 Board Of Regents, The University Of Texas System Compositions and methods for homoconjugates of antibodies which induce growth arrest or apoptosis of tumor cells
US5980893A (en) 1997-07-17 1999-11-09 Beth Israel Deaconess Medical Center, Inc. Agonist murine monoclonal antibody as a stimulant for megakaryocytopoiesis
US6207805B1 (en) 1997-07-18 2001-03-27 University Of Iowa Research Foundation Prostate cell surface antigen-specific antibodies
US20020187150A1 (en) 1997-08-15 2002-12-12 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Preventive and/or therapeutic agent for systemic lupus erythematosus comprising anti-IL-6 receptor antibody as an active ingredient
US6342220B1 (en) 1997-08-25 2002-01-29 Genentech, Inc. Agonist antibodies
RU2221809C2 (ru) 1997-10-03 2004-01-20 Тугаи Сейяку Кабусики Кайся Способ получения природного гуманизированного антитела
DK1074268T3 (da) 1998-03-17 2008-04-28 Chugai Pharmaceutical Co Ltd IL-6-receptorantagonistantistofholdige forebyggende eller terapeutiske midler mod inflammatoriske tarmsygdomme
CN1303431A (zh) 1998-04-03 2001-07-11 中外制药株式会社 抗人组织因子和人源化抗体以及人源化抗体的制作方法
DE19819846B4 (de) 1998-05-05 2016-11-24 Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung des öffentlichen Rechts Multivalente Antikörper-Konstrukte
GB9809951D0 (en) 1998-05-08 1998-07-08 Univ Cambridge Tech Binding molecules
US7081360B2 (en) 1998-07-28 2006-07-25 Cadus Technologies, Inc. Expression of G protein-coupled receptors with altered ligand binding and/or coupling properties
CA2341029A1 (en) 1998-08-17 2000-02-24 Abgenix, Inc. Generation of modified molecules with increased serum half-lives
KR100483494B1 (ko) 1998-12-01 2005-04-15 프로테인 디자인 랩스 인코포레이티드 감마 인터페론에 대한 인간화 항체
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
US6897044B1 (en) 1999-01-28 2005-05-24 Biogen Idec, Inc. Production of tetravalent antibodies
US6972125B2 (en) 1999-02-12 2005-12-06 Genetics Institute, Llc Humanized immunoglobulin reactive with B7-2 and methods of treatment therewith
CO5280147A1 (es) 1999-05-18 2003-05-30 Smithkline Beecham Corp Anticuerpo humano monoclonal
SK782002A3 (en) 1999-07-21 2003-08-05 Lexigen Pharm Corp FC fusion proteins for enhancing the immunogenicity of protein and peptide antigens
AT411997B (de) 1999-09-14 2004-08-26 Baxter Ag Faktor ix/faktor ixa aktivierende antikörper und antikörper-derivate
SE9903895D0 (sv) 1999-10-28 1999-10-28 Active Biotech Ab Novel compounds
US20020028178A1 (en) 2000-07-12 2002-03-07 Nabil Hanna Treatment of B cell malignancies using combination of B cell depleting antibody and immune modulating antibody related applications
WO2001044282A2 (en) 1999-12-14 2001-06-21 The Burnham Institute Bcl-g polypeptides, encoding nucleic acids and methods of use
AU2001256174A1 (en) 2000-03-01 2001-09-12 Christoph Gasche Mammalian interleukin-10 (il-10) receptor variants
TWI241345B (en) 2000-03-10 2005-10-11 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Apoptosis inducing polypeptide
EP1265914B1 (en) 2000-03-22 2007-12-26 Curagen Corporation Wnt-1 related polypeptides, and nucleic acids encoding the same
WO2001074388A1 (en) 2000-03-31 2001-10-11 Idec Pharmaceuticals Corporation Combined use of anti-cytokine antibodies or antagonists and anti-cd20 for the treatment of b cell lymphoma
EP1325338A2 (en) 2000-04-03 2003-07-09 Oxford GlycoSciences (UK) Limited Diagnosis and treatment of alzheimer's disease
AU2001246934A1 (en) 2000-04-17 2001-10-30 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Agonist antibodies
AU6627201A (en) 2000-05-03 2001-11-12 Mbt Munich Biotechnology Gmbh Cationic diagnostic, imaging and therapeutic agents associated with activated vascular sites
JP2004511430A (ja) 2000-05-24 2004-04-15 イムクローン　システムズ　インコーポレイティド 二重特異性免疫グロブリン様抗原結合蛋白および製造方法
CA2411102A1 (en) 2000-06-20 2001-12-27 Idec Pharmaceutical Corporation Cold anti-cd20 antibody/radiolabeled anti-cd22 antibody combination
CA2415100A1 (en) 2000-07-12 2002-01-17 Idec Pharmaceutical Corporation Treatment of b cell malignancies using combination of b cell depleting antibody and immune modulating antibody related applications
US7732133B2 (en) 2000-07-17 2010-06-08 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Screening methods for biologically active ligands
CA2422076A1 (en) 2000-09-18 2002-03-21 Idec Pharmaceutical Corporation Combination therapy for treatment of autoimmune diseases using b cell depleting/immunoregulatory antibody combination
EP1324776B2 (en) 2000-10-12 2018-03-21 Genentech, Inc. Reduced-viscosity concentrated protein formulations
CA2424364A1 (en) 2000-10-20 2003-04-01 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Degraded tpo agonist antibody
CA2424371A1 (en) 2000-10-20 2003-04-01 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Agonistic monoclonal antibody fragments
KR100870123B1 (ko) 2000-10-20 2008-11-25 츄가이 세이야꾸 가부시키가이샤 저분자화 아고니스트 항체
ATE391174T1 (de) 2000-10-20 2008-04-15 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Modifizierter tpo-agonisten antikörper
JP4889187B2 (ja) 2000-10-27 2012-03-07 中外製薬株式会社 Ｉｌ−６アンタゴニストを有効成分として含有する血中ｍｍｐ−３濃度低下剤
EP2341060B1 (en) 2000-12-12 2019-02-20 MedImmune, LLC Molecules with extended half-lives, compositions and uses thereof
CA2440221C (en) 2001-03-07 2013-02-05 Merck Patent Gesellschaft Mit Beschraenkter Haftung Expression technology for proteins containing a hybrid isotype antibody moiety
UA80091C2 (en) 2001-04-02 2007-08-27 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Remedies for infant chronic arthritis-relating diseases and still's disease which contain an interleukin-6 (il-6) antagonist
WO2002078612A2 (en) 2001-04-02 2002-10-10 Euro-Celtique S.A. Thrombopoietin (tpo) synthebody for stimulation of platelet production
WO2002083854A2 (en) 2001-04-13 2002-10-24 Biogen, Inc. Antibodies to vla-1
EP2208784B1 (en) 2001-06-22 2013-01-02 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Cell proliferation inhibitors containing anti-glypican 3 antibody
ATE477280T1 (de) 2001-06-28 2010-08-15 Domantis Ltd Doppelspezifischer ligand und dessen verwendung
US6833441B2 (en) 2001-08-01 2004-12-21 Abmaxis, Inc. Compositions and methods for generating chimeric heteromultimers
US20030049203A1 (en) 2001-08-31 2003-03-13 Elmaleh David R. Targeted nucleic acid constructs and uses related thereto
CA2463672A1 (en) 2001-10-15 2003-04-24 Immunomedics, Inc. Direct targeting binding proteins
WO2003035835A2 (en) 2001-10-25 2003-05-01 Genentech, Inc. Glycoprotein compositions
US20030190705A1 (en) 2001-10-29 2003-10-09 Sunol Molecular Corporation Method of humanizing immune system molecules
DE10156482A1 (de) 2001-11-12 2003-05-28 Gundram Jung Bispezifisches Antikörper-Molekül
AU2003216250A1 (en) * 2002-02-11 2003-09-04 Genentech, Inc. Antibody variants with faster antigen association rates
AU2003217912A1 (en) 2002-03-01 2003-09-16 Xencor Antibody optimization
US8188231B2 (en) 2002-09-27 2012-05-29 Xencor, Inc. Optimized FC variants
US7736652B2 (en) 2002-03-21 2010-06-15 The Regents Of The University Of California Antibody fusion proteins: effective adjuvants of protein vaccination
JP4386741B2 (ja) 2002-04-15 2009-12-16 中外製薬株式会社 ｓｃＤｂライブラリーの作成方法
JP4518941B2 (ja) 2002-04-26 2010-08-04 中外製薬株式会社 アゴニスト抗体のスクリーニング方法
US20050130224A1 (en) 2002-05-31 2005-06-16 Celestar Lexico- Sciences, Inc. Interaction predicting device
WO2003104425A2 (en) 2002-06-07 2003-12-18 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Novel stable anti-cd22 antibodies
WO2003105757A2 (en) 2002-06-12 2003-12-24 Genencor International, Inc. Methods and compositions for milieu-dependent binding of a targeted agent to a target
SI1523496T1 (sl) 2002-07-18 2011-11-30 Merus B V Rekombinantno proizvajanje zmesi protiteles
US20040086979A1 (en) 2002-08-15 2004-05-06 Dongxiao Zhang Humanized rabbit antibodies
EP1541165A4 (en) 2002-08-27 2009-06-24 Chugai Pharmaceutical Co Ltd METHOD FOR STABILIZING PROTEIN PREPARATION
JP2004086682A (ja) 2002-08-28 2004-03-18 Fujitsu Ltd 機能ブロック設計方法および機能ブロック設計装置
EP1561759B9 (en) 2002-10-11 2009-08-26 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Cell death-inducing agent
US7217797B2 (en) 2002-10-15 2007-05-15 Pdl Biopharma, Inc. Alteration of FcRn binding affinities or serum half-lives of antibodies by mutagenesis
GB0224082D0 (en) 2002-10-16 2002-11-27 Celltech R&D Ltd Biological products
US7098189B2 (en) * 2002-12-16 2006-08-29 Kimberly-Clark Worldwide, Inc. Wound and skin care compositions
CA2921578C (en) 2002-12-24 2017-02-14 Rinat Neuroscience Corp. Anti-ngf antibodies and methods using same
JPWO2004060919A1 (ja) 2002-12-26 2006-05-11 中外製薬株式会社 ヘテロ受容体に対するアゴニスト抗体
WO2004065611A1 (ja) 2003-01-21 2004-08-05 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha 抗体の軽鎖スクリーニング方法
EP1608684A2 (en) 2003-02-07 2005-12-28 Protein Design Labs, Inc. Amphiregulin antibodies and their use to treat cancer and psoriasis
WO2004081048A1 (ja) 2003-03-13 2004-09-23 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha 変異受容体に対するアゴニスト活性を有するリガンド
JP2004279086A (ja) 2003-03-13 2004-10-07 Konica Minolta Holdings Inc 放射線画像変換パネル及び放射線画像変換パネルの製造方法
JPWO2004087763A1 (ja) 2003-03-31 2006-07-27 中外製薬株式会社 Ｃｄ２２に対する改変抗体およびその利用
GB2400851B (en) 2003-04-25 2004-12-15 Bioinvent Int Ab Identifying binding of a polypeptide to a polypeptide target
JP2004321100A (ja) 2003-04-25 2004-11-18 Rikogaku Shinkokai ＩｇＧのＦｃ領域を含むタンパク質の変異体
GB2401040A (en) 2003-04-28 2004-11-03 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Method for treating interleukin-6 related diseases
CA2766627C (en) 2003-05-02 2019-12-03 Xencor, Inc. Optimized fc variants and methods for their generation
RU2005136988A (ru) 2003-05-30 2006-06-10 Дженентек, Инк. (Us) Лечение антителами против vegf
WO2004106375A1 (en) 2003-05-30 2004-12-09 Merus Biopharmaceuticals B.V. I.O. Fab library for the preparation of anti vegf and anti rabies virus fabs
CA2526402A1 (en) 2003-06-05 2005-01-20 Genentech, Inc. Blys antagonists and uses thereof
WO2004111233A1 (ja) 2003-06-11 2004-12-23 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha 抗体の製造方法
WO2004113387A2 (en) 2003-06-24 2004-12-29 Merck Patent Gmbh Tumour necrosis factor receptor molecules with reduced immunogenicity
CA2531482A1 (en) 2003-06-30 2005-01-20 Centocor, Inc. Engineered anti-target immunoglobulin derived proteins, compositions, methods and uses
US7297336B2 (en) 2003-09-12 2007-11-20 Baxter International Inc. Factor IXa specific antibodies displaying factor VIIIa like activity
JP2005101105A (ja) 2003-09-22 2005-04-14 Canon Inc 位置決め装置、露光装置、デバイス製造方法
US20060134105A1 (en) 2004-10-21 2006-06-22 Xencor, Inc. IgG immunoglobulin variants with optimized effector function
JP2005112514A (ja) 2003-10-06 2005-04-28 Tadano Ltd 伸縮ブーム
AU2003271174A1 (en) 2003-10-10 2005-04-27 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Double specific antibodies substituting for functional protein
AU2003271186A1 (en) 2003-10-14 2005-04-27 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Double specific antibodies substituting for functional protein
WO2005047327A2 (en) 2003-11-12 2005-05-26 Biogen Idec Ma Inc. NEONATAL Fc RECEPTOR (FcRn)-BINDING POLYPEPTIDE VARIANTS, DIMERIC Fc BINDING PROTEINS AND METHODS RELATED THERETO
EP1701979A2 (en) 2003-12-03 2006-09-20 Xencor, Inc. Optimized antibodies that target the epidermal growth factor receptor
US7741449B2 (en) 2003-12-10 2010-06-22 Medarex, Inc. Anti-interferon alpha antibodies
CN102838675B (zh) 2003-12-10 2014-07-30 梅达雷克斯有限责任公司 Ip-10抗体及其用途
TW200530266A (en) 2003-12-12 2005-09-16 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Method of reinforcing antibody activity
JPWO2005056605A1 (ja) 2003-12-12 2007-12-06 中外製薬株式会社 ３量体以上の受容体を認識する改変抗体
TW200530269A (en) 2003-12-12 2005-09-16 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anti-Mpl antibodies
JPWO2005056602A1 (ja) 2003-12-12 2008-03-06 中外製薬株式会社 アゴニスト活性を有する改変抗体のスクリーニング方法
KR20060130606A (ko) 2003-12-12 2006-12-19 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 세포사 유도제
AR048210A1 (es) 2003-12-19 2006-04-12 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Un agente preventivo para la vasculitis.
EP1697748A4 (en) 2003-12-22 2007-07-04 Centocor Inc METHODS FOR GENERATING MULTIMEDIA MOLECULES
PL1707627T3 (pl) 2003-12-25 2013-04-30 Kyowa Hakko Kirin Co Ltd Mutant antagonistycznego przeciwciała anty-CD40
WO2005063820A2 (en) 2003-12-30 2005-07-14 Merck Patent Gmbh Il-7 fusion proteins
US20050266425A1 (en) 2003-12-31 2005-12-01 Vaccinex, Inc. Methods for producing and identifying multispecific antibodies
AP2006003689A0 (en) 2004-01-09 2006-08-31 Pfizer Antibodies to MAdCAM
AR048335A1 (es) 2004-03-24 2006-04-19 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Agentes terapeuticos para trastornos del oido interno que contienen un antagonista de il- 6 como un ingrediente activo
AU2005227326B2 (en) 2004-03-24 2009-12-03 Xencor, Inc. Immunoglobulin variants outside the Fc region
JP4799405B2 (ja) 2004-04-09 2011-10-26 中外製薬株式会社 細胞死誘導剤
WO2005112564A2 (en) 2004-04-15 2005-12-01 The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Germline and sequence variants of humanized antibodies and methods of making and using them
TW200605906A (en) 2004-05-11 2006-02-16 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Remedy for thrombopenia
KR100620554B1 (ko) 2004-06-05 2006-09-06 한국생명공학연구원 Ｔａｇ-72에 대한 인간화 항체
AR049390A1 (es) 2004-06-09 2006-07-26 Wyeth Corp Anticuerpos contra la interleuquina-13 humana y usos de los mismos
EP1773391A4 (en) 2004-06-25 2009-01-21 Medimmune Inc INCREASING THE PRODUCTION OF RECOMBINANT ANTIBODIES IN MAMMALIAN CELLS BY MUTAGENESIS ON THE SITE
DE102004032634A1 (de) 2004-07-06 2006-02-16 Sms Demag Ag Verfahren und Einrichtung zum Messen und Regeln der Planheit und/oder der Bandspannungen eines Edelstahlbandes oder einer Edelstahlfolie beim Kaltwalzen in einem Vielwalzengerüst, insbesondere in einem 20-Walzen-Sendizimir-Walzwerk
RU2427588C2 (ru) 2004-07-09 2011-08-27 Чугаи Сейяку Кабусики Кайся Антитело против глипикана 3
BRPI0510674A (pt) 2004-07-15 2007-12-26 Xencor Inc variantes fc otimizadas
EP1789446A2 (en) 2004-09-02 2007-05-30 Genentech, Inc. Heteromultimeric molecules
US7572456B2 (en) 2004-09-13 2009-08-11 Macrogenics, Inc. Humanized antibodies against West Nile Virus and therapeutic and prophylactic uses thereof
US20060074225A1 (en) 2004-09-14 2006-04-06 Xencor, Inc. Monomeric immunoglobulin Fc domains
US20080233131A1 (en) 2004-09-14 2008-09-25 Richard John Stebbings Vaccine
TWI309240B (en) 2004-09-17 2009-05-01 Hoffmann La Roche Anti-ox40l antibodies
US7563443B2 (en) 2004-09-17 2009-07-21 Domantis Limited Monovalent anti-CD40L antibody polypeptides and compositions thereof
CA2580981C (en) 2004-09-22 2013-10-22 Kirin Beer Kabushiki Kaisha Stabilized human igg4 antibodies
WO2006047350A2 (en) 2004-10-21 2006-05-04 Xencor, Inc. IgG IMMUNOGLOBULIN VARIANTS WITH OPTIMIZED EFFECTOR FUNCTION
AU2005299716B2 (en) 2004-10-22 2012-09-06 Amgen Inc. Methods for refolding of recombinant antibodies
US7462697B2 (en) 2004-11-08 2008-12-09 Epitomics, Inc. Methods for antibody engineering
US7632497B2 (en) 2004-11-10 2009-12-15 Macrogenics, Inc. Engineering Fc Antibody regions to confer effector function
AU2005317279C1 (en) 2004-12-14 2014-07-17 Cytiva Bioprocess R&D Ab Purification of immunoglobulins
US8728828B2 (en) 2004-12-22 2014-05-20 Ge Healthcare Bio-Sciences Ab Purification of immunoglobulins
JPWO2006067847A1 (ja) 2004-12-22 2008-06-12 中外製薬株式会社 フコーストランスポーターの機能が阻害された細胞を用いた抗体の作製方法
US20090087478A1 (en) 2004-12-27 2009-04-02 Progenics Pharmaceuticals (Nevada), Inc. Orally Deliverable and Anti-Toxin Antibodies and Methods for Making and Using Them
HUE026107T2 (en) 2004-12-28 2016-05-30 Innate Pharma Monoclonal antibody to NKG2A
EP1858925A2 (en) 2005-01-12 2007-11-28 Xencor, Inc. Antibodies and fc fusion proteins with altered immunogenicity
JP4986633B2 (ja) 2005-01-12 2012-07-25 協和発酵キリン株式会社 安定化されたヒトＩｇＧ２およびＩｇＧ３抗体
US7700099B2 (en) 2005-02-14 2010-04-20 Merck & Co., Inc. Non-immunostimulatory antibody and compositions containing the same
US20060263357A1 (en) 2005-05-05 2006-11-23 Tedder Thomas F Anti-CD19 antibody therapy for autoimmune disease
EP1870458B1 (en) * 2005-03-31 2018-05-09 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha sc(Fv)2 STRUCTURAL ISOMERS
ES2592271T3 (es) * 2005-03-31 2016-11-29 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Métodos de producción de polipéptidos mediante la regulación de la asociación de los polipéptidos
EP1876236B9 (en) 2005-04-08 2015-02-25 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antibody substituting for function of blood coagulation factor viii
BRPI0611464A2 (pt) 2005-04-15 2010-09-08 Genentech Inc molécula antagonista de hgf/c-met, métodos de modulação, método para tratar uma condição patológica associada com ativação de c-met, ácido nucléico, célula hospedeira, artigo de fabricação, método para fabricar a molécula antagonista de hgf/c-met e usos de uma molécula antagonista de hgf/c-met
WO2006116260A2 (en) 2005-04-26 2006-11-02 Medimmune, Inc. Modulation of antibody effector function by hinge domain engineering
CN101262885B (zh) 2005-06-10 2015-04-01 中外制药株式会社 含有sc(Fv)2的药物组合物
TW200718780A (en) * 2005-06-10 2007-05-16 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Sc(Fv)2 site-directed mutant
KR101367544B1 (ko) 2005-06-10 2014-02-26 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 메글루민을 함유하는 단백질 제제의 안정화제, 및 그의이용
US20070110757A1 (en) 2005-06-23 2007-05-17 Ziping Wei Antibody formulations having optimized aggregation and fragmentation profiles
CN101627054A (zh) 2005-07-11 2010-01-13 马克罗基因公司 用人源化抗cd16a抗体治疗自身免疫疾病的方法
DK1919503T3 (en) 2005-08-10 2014-12-15 Macrogenics Inc Identification and preparation of antibodies with variant fc regions and methods of use thereof
PT1915397E (pt) 2005-08-19 2015-04-30 Univ Pennsylvania Anticorpos antagonistas contra gdf-8 e utilizações no tratamento de ela e outros distúrbios associados a gdf-8
US20070134234A1 (en) 2005-09-29 2007-06-14 Viral Logic Systems Technology Corp. Immunomodulatory compositions and uses therefor
CA2625773C (en) 2005-10-14 2015-05-12 Fukuoka University Inhibition of interleukin-6 (il-6) receptor promotes pancreatic islet transplantation
AR058135A1 (es) 2005-10-21 2008-01-23 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Agentes para el tratamiento de cardiopatias
WO2007060411A1 (en) 2005-11-24 2007-05-31 Ucb Pharma S.A. Anti-tnf alpha antibodies which selectively inhibit tnf alpha signalling through the p55r
AU2007227963A1 (en) 2006-03-23 2007-09-27 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Agonist antibody to human thrombopoietin receptor
ES2395969T3 (es) 2006-03-24 2013-02-18 Merck Patent Gmbh Dominios de proteínas heterodiméricas genéticamente modificados
WO2007114325A1 (ja) 2006-03-31 2007-10-11 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha 二重特異性抗体を精製するための抗体改変方法
EP4001409A1 (en) 2006-03-31 2022-05-25 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Methods for controlling blood pharmacokinetics of antibodies
US9260516B2 (en) 2006-04-07 2016-02-16 Osaka University Method for promoting muscle regeneration by administering an antibody to the IL-6 receptor
CL2007001665A1 (es) 2006-06-08 2008-01-18 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anticuerpo o fragmento del mismo con actividad neutralizante de la proteina nr 10; agente que lo comprende; y su uso para prevenir o tratar una enfermedad inflamatoria.
JP2009541275A (ja) 2006-06-22 2009-11-26 ノボ・ノルデイスク・エー／エス 二重特異性抗体の生産
US20100034194A1 (en) 2006-10-11 2010-02-11 Siemens Communications Inc. Eliminating unreachable subscribers in voice-over-ip networks
WO2008090960A1 (ja) 2007-01-24 2008-07-31 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. ガングリオシドgm2に特異的に結合する遺伝子組換え抗体組成物
WO2008092117A2 (en) 2007-01-25 2008-07-31 Xencor, Inc. Immunoglobulins with modifications in the fcr binding region
CA2680237C (en) 2007-03-27 2018-11-06 Sea Lane Biotechnologies, Llc Constructs and libraries comprising antibody surrogate light chain sequences
NZ614857A (en) 2007-03-29 2015-04-24 Genmab As Bispecific antibodies and methods for production thereof
US20100267934A1 (en) 2007-05-31 2010-10-21 Genmab A/S Stable igg4 antibodies
EP2155790A1 (en) 2007-05-31 2010-02-24 Genmab A/S Method for extending the half-life of exogenous or endogenous soluble molecules
KR101570252B1 (ko) 2007-07-17 2015-11-19 메다렉스, 엘.엘.시. 글리피칸-3에 대한 단클론 항체
EP2031064A1 (de) 2007-08-29 2009-03-04 Boehringer Ingelheim Pharma GmbH & Co. KG Verfahren zur Steigerung von Proteintitern
JP5963341B2 (ja) 2007-09-14 2016-08-10 アムジエン・インコーポレーテツド 均質な抗体集団
CN101874042B9 (zh) 2007-09-26 2019-01-01 中外制药株式会社 利用cdr的氨基酸取代来改变抗体等电点的方法
BRPI0817250A2 (pt) 2007-09-26 2014-06-17 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anticorpo anti-receptor da il-6.
MX342551B (es) 2007-09-26 2016-10-04 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Region constante de anticuerpo modificada.
WO2009041734A1 (ja) 2007-09-26 2009-04-02 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. ヒトトロンボポエチン受容体に対するアゴニスト抗体
WO2009041062A1 (ja) 2007-09-28 2009-04-02 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha 血漿中動態が改善されたグリピカン３抗体
JO3076B1 (ar) 2007-10-17 2017-03-15 Janssen Alzheimer Immunotherap نظم العلاج المناعي المعتمد على حالة apoe
EP2203180B1 (en) 2007-10-22 2012-11-21 Merck Serono S.A. Single ifn-beta fused to a mutated igg fc fragment
US20110129459A1 (en) 2007-12-05 2011-06-02 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Anti-nr10 antibody and use thereof
SG186669A1 (en) 2007-12-18 2013-01-30 Bioalliance Cv Antibodies recognizing a carbohydrate containing epitope on cd-43 and cea expressed on cancer cells and methods using same
PE20091174A1 (es) 2007-12-27 2009-08-03 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Formulacion liquida con contenido de alta concentracion de anticuerpo
ES2774337T3 (es) * 2008-01-07 2020-07-20 Amgen Inc Método para fabricación de moléculas heterodímeras Fc de anticuerpos utilizando efectos de conducción electrostática
AU2009212273B2 (en) 2008-02-08 2014-07-31 Astrazeneca Ab Anti-IFNAR1 antibodies with reduced Fc ligand affinity
NZ602884A (en) 2008-04-11 2014-08-29 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Antigen-binding molecule capable of binding to two or more antigen molecules repeatedly
US9315577B2 (en) 2008-05-01 2016-04-19 Amgen Inc. Anti-hepcidin antibodies and methods of use
TWI440469B (zh) 2008-09-26 2014-06-11 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Improved antibody molecules
EA032828B1 (ru) 2008-10-10 2019-07-31 Аптево Рисёрч Энд Девелопмент Ллс Иммунотерапевтические средства против комплекса tcr
WO2010064090A1 (en) 2008-12-02 2010-06-10 Pierre Fabre Medicament Process for the modulation of the antagonistic activity of a monoclonal antibody
AR074438A1 (es) 2008-12-02 2011-01-19 Pf Medicament Proceso para la modulacion de la actividad antagonista de un anticuerpo monoclonal
KR20110102897A (ko) 2008-12-23 2011-09-19 스미또모 가가꾸 가부시키가이샤 광학 필름 및 이를 포함하는 액정 표시 장치
EP2389386A4 (en) 2009-01-12 2013-11-06 Ge Healthcare Bio Sciences Ab affinity chromatography
JP5787446B2 (ja) 2009-03-19 2015-09-30 中外製薬株式会社 抗体定常領域改変体
JP5717624B2 (ja) 2009-03-19 2015-05-13 中外製薬株式会社 抗体定常領域改変体
EP2233500A1 (en) 2009-03-20 2010-09-29 LFB Biotechnologies Optimized Fc variants
US20100256340A1 (en) 2009-04-07 2010-10-07 Ulrich Brinkmann Trivalent, bispecific antibodies
JP2012525149A (ja) 2009-04-27 2012-10-22 オンコメッド ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド ヘテロ多量体分子を作製するための方法
CN102471378B (zh) 2009-06-26 2014-04-02 瑞泽恩制药公司 容易地分离的具有天然免疫球蛋白形式的双特异性抗体
CN105131112A (zh) 2009-08-29 2015-12-09 Abbvie公司 治疗用dll4结合蛋白
EP2481752B1 (en) 2009-09-24 2016-11-09 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Modified antibody constant regions
PL2522724T3 (pl) 2009-12-25 2020-07-13 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Sposób modyfikowania polipetydów do oczyszczania multimerów polipeptydowych
CN105693861A (zh) 2009-12-29 2016-06-22 新兴产品开发西雅图有限公司 异二聚体结合蛋白及其应用
TWI505838B (zh) 2010-01-20 2015-11-01 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Stabilized antibody solution containing
JP5947727B2 (ja) 2010-01-20 2016-07-06 メルク・シャープ・アンド・ドーム・コーポレーションＭｅｒｃｋ Ｓｈａｒｐ ＆ Ｄｏｈｍｅ Ｃｏｒｐ． 抗ｉｌｔ５抗体およびｉｌｔ５結合抗体断片による免疫調節
CA2787783A1 (en) 2010-01-20 2011-07-28 Tolerx, Inc. Anti-ilt5 antibodies and ilt5-binding antibody fragments
WO2011108502A1 (ja) 2010-03-02 2011-09-09 協和発酵キリン株式会社 改変抗体組成物
WO2011108714A1 (ja) 2010-03-04 2011-09-09 中外製薬株式会社 抗体定常領域改変体
JP5932670B2 (ja) 2010-03-11 2016-06-08 ライナット ニューロサイエンス コーポレイション ｐＨ依存性の抗原結合を有する抗体
KR20130018256A (ko) 2010-03-31 2013-02-20 제이에스알 가부시끼가이샤 친화성 크로마토그래피용 충전제
AU2011244282A1 (en) 2010-04-20 2012-11-15 Genmab A/S Heterodimeric antibody Fc-containing proteins and methods for production thereof
TWI586806B (zh) 2010-04-23 2017-06-11 建南德克公司 異多聚體蛋白質之製造
WO2011143545A1 (en) 2010-05-14 2011-11-17 Rinat Neuroscience Corporation Heterodimeric proteins and methods for producing and purifying them
EP3029066B1 (en) 2010-07-29 2019-02-20 Xencor, Inc. Antibodies with modified isoelectric points
AU2011288412A1 (en) 2010-08-13 2013-02-21 Medimmune Limited Monomeric polypeptides comprising variant Fc regions and methods of use
AU2011325833C1 (en) 2010-11-05 2017-07-13 Zymeworks Bc Inc. Stable heterodimeric antibody design with mutations in the Fc domain
PT2644698T (pt) 2010-11-17 2018-01-31 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Molécula multiespecífica de ligação ao antigénio com uma função alternativa à função do fator viii de coagulação do sangue
CN103429737B (zh) 2010-11-30 2020-07-14 中外制药株式会社 细胞毒诱导治疗剂
NZ608724A (en) 2011-03-25 2015-12-24 Glenmark Pharmaceuticals Sa Hetero-dimeric immunoglobulins
EP2699263A4 (en) 2011-04-20 2014-12-24 Liquidating Trust METHOD FOR REDUCING AN UNWANTED IMMUNE RESPONSE TO A FOREIGN-LIKE IN A HUMAN PATIENT WITH ANTI-CD4 ANTIBODIES OR CD4-BINDING FRAGMENTS THEREOF OR CD4-BINDING MOLECULES
US9098611B2 (en) 2012-11-26 2015-08-04 Intouch Technologies, Inc. Enhanced video interaction for a user interface of a telepresence network
SG10201805291TA (en) 2011-10-27 2018-08-30 Genmab As Production of heterodimeric proteins
CN104011207B (zh) 2011-10-31 2018-09-18 中外制药株式会社 控制了重链与轻链的缔合的抗原结合分子
KR102052774B1 (ko) 2011-11-04 2019-12-04 자임워크스 인코포레이티드 Ｆｃ 도메인 내의 돌연변이를 갖는 안정한 이종이합체 항체 설계
GB201203051D0 (en) 2012-02-22 2012-04-04 Ucb Pharma Sa Biological products
HUE028440T2 (en) 2012-03-08 2016-12-28 Hoffmann La Roche Abeta antibody preparation
WO2013136186A2 (en) 2012-03-13 2013-09-19 Novimmune S.A. Readily isolated bispecific antibodies with native immunoglobulin format
JP6280031B2 (ja) 2012-03-29 2018-02-14 中外製薬株式会社 抗ｌａｍｐ５抗体およびその利用
EA035344B1 (ru) 2012-04-20 2020-05-29 Мерюс Н.В. Способ получения двух антител из одной клетки-хозяина
SG10201608307WA (en) 2012-04-20 2016-11-29 Emergent Product Dev Seattle Cd3 binding polypeptides
US20140154270A1 (en) 2012-05-21 2014-06-05 Chen Wang Purification of non-human antibodies using kosmotropic salt enhanced protein a affinity chromatography
JP6494507B2 (ja) 2012-06-01 2019-04-03 ザ ユナイテッド ステイツ オブ アメリカ， アズ リプレゼンテッド バイ ザ セクレタリー， デパートメント オブ ヘルス アンド ヒューマン サービシーズ グリピカン−３に対する高親和性モノクローナル抗体およびその使用
TWI596115B (zh) 2012-08-13 2017-08-21 再生元醫藥公司 具有ｐＨ－依賴性結合特性之抗－ＰＣＳＫ９抗體
HUE042040T2 (hu) 2012-09-27 2019-06-28 Merus Nv Bispecifikus IGG antitestek mint T-sejt kapcsolók
JP6273205B2 (ja) 2012-10-05 2018-01-31 協和発酵キリン株式会社 ヘテロダイマータンパク質組成物
AU2013337578C1 (en) 2012-11-02 2018-04-12 Zymeworks Inc. Crystal structures of heterodimeric Fc domains
CN103833852A (zh) 2012-11-23 2014-06-04 上海市肿瘤研究所 针对磷脂酰肌醇蛋白多糖-3和t细胞抗原的双特异性抗体
US20140377253A1 (en) 2013-03-15 2014-12-25 Abbvie Biotherapeutics Inc. Fc variants
SG11201602261VA (en) 2013-09-27 2016-04-28 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Method for producing polypeptide heteromultimer
WO2015046554A1 (ja) 2013-09-30 2015-04-02 中外製薬株式会社 改変されたヘルパーファージを用いて抗原結合分子を作製する方法
EP3066133A1 (en) 2013-11-04 2016-09-14 Glenmark Pharmaceuticals S.A. Production of t cell retargeting hetero-dimeric immunoglobulins
TWI726842B (zh) 2014-04-07 2021-05-11 日商中外製藥股份有限公司 免疫活化抗原結合分子
EP3144388B1 (en) 2014-05-13 2020-07-01 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha T cell-redirecting antigen-binding molecule for cells having immunosuppression function
TW201625299A (zh) 2014-06-20 2016-07-16 Chugai Pharmaceutical Co Ltd 用於因第ｖｉｉｉ凝血因子及／或活化的第ｖｉｉｉ凝血因子的活性降低或欠缺而發病及／或進展的疾病之預防及／或治療之醫藥組成物
AR101262A1 (es) 2014-07-26 2016-12-07 Regeneron Pharma Plataforma de purificación para anticuerpos biespecíficos
MA40764A (fr) 2014-09-26 2017-08-01 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Agent thérapeutique induisant une cytotoxicité
JP6630036B2 (ja) 2014-09-30 2020-01-15 Jsr株式会社 標的物の精製方法、及び、ミックスモード用担体
WO2016159213A1 (ja) 2015-04-01 2016-10-06 中外製薬株式会社 ポリペプチド異種多量体の製造方法
MX2017010734A (es) 2015-04-17 2017-12-04 Hoffmann La Roche Terapia de combinacion con factores de coagulacion y anticuepos multiespecificos.
JP2018123055A (ja) 2015-04-24 2018-08-09 公立大学法人奈良県立医科大学 血液凝固第ｖｉｉｉ因子（ｆｖｉｉｉ）の機能を代替する多重特異性抗原結合分子を含有する、血液凝固第ｘｉ因子（ｆｘｉ）異常症の予防および／または治療に用いられる医薬組成物
CA3004288A1 (en) 2015-12-28 2017-07-06 Nobuyuki Tanaka Method for promoting efficiency of purification of fc region-containing polypeptide
JOP20170017B1 (ar) 2016-01-25 2021-08-17 Amgen Res Munich Gmbh تركيب صيدلي يتضمن تركيبات جسم مضاد ثنائي الاختصاص
CN117205314A (zh) 2016-03-14 2023-12-12 中外制药株式会社 用于癌症治疗的诱导细胞损伤的治疗药物
RU2746754C2 (ru) 2016-03-14 2021-04-20 Чугаи Сейяку Кабусики Кайся Индуцирующее повреждение клеток терапевтическое лекарственное средство, предназначенное для противораковой терапии
PE20181889A1 (es) 2016-04-28 2018-12-11 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Preparaciones que contienen anticuerpos
EP3603670A4 (en) 2017-03-31 2021-03-10 Public University Corporation Nara Medical University MEDICAL COMPOSITION FOR THE PREVENTION AND / OR TREATMENT OF BLOOD CLOG FACTOR IX ANOMALY WITH A MULTI-SPECIFIC ANTIGIBINDING MOLECULAR FUNCTION OF BLOOD CLOTHING FACTOR VIII

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH08500979A (ja) * 1992-09-09 1996-02-06 スミスクライン・ビーチヤム・コーポレーシヨン ヒトにおいて病原体による感染に対する受動免疫を付与するための新規の抗体
JPH11500916A (ja) * 1995-02-28 1999-01-26 ザ プロクター アンド ギャンブル カンパニー 優れた微生物安定性を有する無炭酸飲料製品の製造
WO1997010354A1 (en) * 1995-09-11 1997-03-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. ANTIBODY AGAINTS α-CHAIN OF HUMAN INTERLEUKIN 5 RECEPTOR
JP2004086862A (ja) * 2002-05-31 2004-03-18 Celestar Lexico-Sciences Inc タンパク質相互作用情報処理装置、タンパク質相互作用情報処理方法、プログラム、および、記録媒体

Non-Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ALT M ET AL., FEBS LETTERS, vol. 454, 1999, pages 90 - 94
BLOOD, vol. 105, 2005, pages 562 - 566
KABAT EA ET AL.: "Sequences of Proteins of Immunological Interest", 1991, NIH
KUMAR R. ET AL.: "The second PDZ domain of INAD is a type I domain involved in binding to eye protein kinase C. Mutational analysis and naturally occurring variants", J. BIOL. CHEM., vol. 276, no. 27, 2001, pages 24971 - 24977, XP003005869 *
LIU X.Y. ET AL.: "Functional interactions between arginine-133 and aspartate-88 in the human reduced folate carrier: evidence for a charge-pair association", BIOCHEM. J., vol. 358, no. PART, 2001, pages 511 - 516, XP003005870 *
MAITY H. ET AL.: "Equilibrium unfolding of dimeric and engineered monomeric forms of lambda Cro (F58W) repressor and the effect of added salts: evidence for the formation of folded monomer induced by sodium perchlorate", ARCH. BIOCHEM. BIOPHYS., vol. 434, no. 1, 1 February 2005 (2005-02-01), pages 93 - 107, XP004699355 *
SAL-MAN N. ET AL.: "Arginine mutations within a transmembrane domain of Tar, an Escherichia coli aspartate receptor, can drive homodimer dissociation and heterodimer association in vivo", BIOCHEM. J., vol. 385, no. PART 1, January 2005 (2005-01-01), pages 29 - 36, XP003005868 *
See also references of EP1870459A4

Cited By (500)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8853366B2 (en) 2001-01-17 2014-10-07 Emergent Product Development Seattle, Llc Binding domain-immunoglobulin fusion proteins
USRE47770E1 (en) 2002-07-18 2019-12-17 Merus N.V. Recombinant production of mixtures of antibodies
US10934571B2 (en) 2002-07-18 2021-03-02 Merus N.V. Recombinant production of mixtures of antibodies
US8597911B2 (en) 2003-06-11 2013-12-03 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Process for producing antibodies
US8062635B2 (en) 2003-10-10 2011-11-22 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Bispecific antibody substituting for functional proteins
US10011858B2 (en) 2005-03-31 2018-07-03 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Methods for producing polypeptides by regulating polypeptide association
US11168344B2 (en) 2005-03-31 2021-11-09 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Methods for producing polypeptides by regulating polypeptide association
US20100015133A1 (en) * 2005-03-31 2010-01-21 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Methods for Producing Polypeptides by Regulating Polypeptide Association
US10143748B2 (en) 2005-07-25 2018-12-04 Aptevo Research And Development Llc B-cell reduction using CD37-specific and CD20-specific binding molecules
US10307481B2 (en) 2005-07-25 2019-06-04 Aptevo Research And Development Llc CD37 immunotherapeutics and uses thereof
US9670269B2 (en) 2006-03-31 2017-06-06 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Methods of modifying antibodies for purification of bispecific antibodies
US11046784B2 (en) 2006-03-31 2021-06-29 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Methods for controlling blood pharmacokinetics of antibodies
WO2007114325A1 (ja) * 2006-03-31 2007-10-11 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha 二重特異性抗体を精製するための抗体改変方法
US10934344B2 (en) 2006-03-31 2021-03-02 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Methods of modifying antibodies for purification of bispecific antibodies
US8409577B2 (en) 2006-06-12 2013-04-02 Emergent Product Development Seattle, Llc Single chain multivalent binding proteins with effector function
US9228020B2 (en) 2006-09-29 2016-01-05 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for diagnosing and treating cancer
US9376497B2 (en) 2006-09-29 2016-06-28 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for diagnosing and treating cancer
US10906991B2 (en) 2007-03-29 2021-02-02 Genmab A/S Bispecific antibodies and methods for production thereof
US9212230B2 (en) 2007-03-29 2015-12-15 Genmab A/S Bispecific antibodies and methods for production thereof
JP2017071606A (ja) * 2007-05-31 2017-04-13 ゲンマブ エー／エス 安定なＩｇＧ４抗体
JP2014122226A (ja) * 2007-05-31 2014-07-03 Genmab As 安定なＩｇＧ４抗体
US10752695B2 (en) 2007-05-31 2020-08-25 Genmab A/S Stable IgG4 antibodies
EP4119579A1 (en) * 2007-05-31 2023-01-18 Genmab A/S Stable igg4 antibodies
US9688762B2 (en) 2007-09-26 2017-06-27 Chugai Sciyaku Kabushiki Kaisha Modified antibody constant region
US11332533B2 (en) 2007-09-26 2022-05-17 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Modified antibody constant region
US9096651B2 (en) 2007-09-26 2015-08-04 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method of modifying isoelectric point of antibody via amino acid substitution in CDR
US9828429B2 (en) 2007-09-26 2017-11-28 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method of modifying isoelectric point of antibody via amino acid substitution in CDR
US11248053B2 (en) 2007-09-26 2022-02-15 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method of modifying isoelectric point of antibody via amino acid substitution in CDR
EP2202245B1 (en) 2007-09-26 2016-08-24 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method of modifying isoelectric point of antibody via amino acid substitution in cdr
US9399680B2 (en) 2007-12-05 2016-07-26 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Nucleic acids encoding anti-NR10 antibodies
KR101265855B1 (ko) 2007-12-21 2013-05-31 에프. 호프만-라 로슈 아게 2가, 이중특이적 항체
KR101266659B1 (ko) * 2007-12-21 2013-05-29 에프. 호프만-라 로슈 아게 ２가, 이중특이적 항체
KR101265912B1 (ko) 2007-12-21 2013-05-20 에프. 호프만-라 로슈 아게 ２가, 이중특이적 항체
US10138293B2 (en) 2007-12-21 2018-11-27 Hoffmann-La Roche, Inc. Bivalent, bispecific antibodies
US10927163B2 (en) 2007-12-21 2021-02-23 Hoffmann-La Roche, Inc. Bivalent, bispecific antibodies
KR101249607B1 (ko) 2007-12-21 2013-04-02 에프. 호프만-라 로슈 아게 2가, 이중특이적 항체
JP2018138035A (ja) * 2008-01-07 2018-09-06 アムジェン インコーポレイテッド 静電的ステアリング（ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃ ｓｔｅｅｒｉｎｇ）効果を用いた抗体Ｆｃヘテロ二量体分子を作製するための方法
US8592562B2 (en) 2008-01-07 2013-11-26 Amgen Inc. Method for making antibody Fc-heterodimeric molecules using electrostatic steering effects
JP2016093175A (ja) * 2008-01-07 2016-05-26 アムジェン インコーポレイテッド 静電的ステアリング（ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃｓｔｅｅｒｉｎｇ）効果を用いた抗体Ｆｃヘテロ二量体分子を作製するための方法
JP2011508604A (ja) * 2008-01-07 2011-03-17 アムジェン インコーポレイテッド 静電的ステアリング（ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃｓｔｅｅｒｉｎｇ）効果を用いた抗体Ｆｃヘテロ二量体分子を作製するための方法
US11359194B2 (en) 2008-04-11 2022-06-14 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antigen-binding molecule capable of binding two or more antigen molecules repeatedly
US9101609B2 (en) 2008-04-11 2015-08-11 Emergent Product Development Seattle, Llc CD37 immunotherapeutic and combination with bifunctional chemotherapeutic thereof
US10472623B2 (en) 2008-04-11 2019-11-12 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antigen-binding molecule capable of binding two or more antigen molecules repeatedly
US11371039B2 (en) 2008-04-11 2022-06-28 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antigen-binding molecule capable of binding to two or more antigen molecules repeatedly
US9868948B2 (en) 2008-04-11 2018-01-16 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antigen-binding molecule capable of binding to two or more antigen molecules repeatedly
US9890377B2 (en) 2008-04-11 2018-02-13 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antigen-binding molecule capable of binding to two or more antigen molecules repeatedly
US10662245B2 (en) 2008-09-26 2020-05-26 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Methods of reducing IL-6 activity for disease treatment
US9228017B2 (en) 2009-03-19 2016-01-05 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antibody constant region variant
US10253091B2 (en) 2009-03-19 2019-04-09 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antibody constant region variant
US10066018B2 (en) 2009-03-19 2018-09-04 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antibody constant region variant
JP2016116522A (ja) * 2009-04-27 2016-06-30 オンコメッド ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド ヘテロ多量体分子を作製するための方法
US9067986B2 (en) 2009-04-27 2015-06-30 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Method for making heteromultimeric molecules
JP2018161141A (ja) * 2009-04-27 2018-10-18 オンコメッド ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド ヘテロ多量体分子を作製するための方法
JP2017158569A (ja) * 2009-04-27 2017-09-14 オンコメッド ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド ヘテロ多量体分子を作製するための方法
US9309311B2 (en) 2009-04-27 2016-04-12 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Method for making Heteromultimeric molecules
JP2012525149A (ja) * 2009-04-27 2012-10-22 オンコメッド ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド ヘテロ多量体分子を作製するための方法
US9914771B2 (en) 2009-04-27 2018-03-13 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Method for making heteromultimeric molecules
US10640555B2 (en) 2009-06-16 2020-05-05 Hoffmann-La Roche Inc. Bispecific antigen binding proteins
US11673945B2 (en) 2009-06-16 2023-06-13 Hoffmann-La Roche Inc. Bispecific antigen binding proteins
US9676845B2 (en) 2009-06-16 2017-06-13 Hoffmann-La Roche, Inc. Bispecific antigen binding proteins
US9493578B2 (en) 2009-09-02 2016-11-15 Xencor, Inc. Compositions and methods for simultaneous bivalent and monovalent co-engagement of antigens
US10150808B2 (en) 2009-09-24 2018-12-11 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Modified antibody constant regions
US9982042B2 (en) 2009-10-16 2018-05-29 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Therapeutic combination and methods of treatment with a DLL4 antagonist and an anti-hypertensive agent
US9511139B2 (en) 2009-10-16 2016-12-06 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Therapeutic combination and methods of treatment with a DLL4 antagonist and an anti-hypertensive agent
US10870693B2 (en) 2009-10-16 2020-12-22 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Therapeutic combination and methods of treatment with a DLL4 antagonist and an anti-hypertensive agent
JP2016190844A (ja) * 2009-11-23 2016-11-10 アムジェン インコーポレイテッド 単量体抗体Ｆｃ
JP2013511281A (ja) * 2009-11-23 2013-04-04 アムジェン インコーポレイテッド 単量体抗体Ｆｃ
JPWO2011078332A1 (ja) * 2009-12-25 2013-05-09 中外製薬株式会社 ポリペプチド多量体を精製するためのポリペプチドの改変方法
US20130018174A1 (en) * 2009-12-25 2013-01-17 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Polypeptide modification method for purifying polypeptide multimers
JP6087054B2 (ja) * 2009-12-25 2017-03-01 中外製薬株式会社 ポリペプチド多量体を精製するためのポリペプチドの改変方法
KR20200038319A (ko) 2009-12-25 2020-04-10 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 폴리펩티드 다량체를 정제하기 위한 폴리펩티드의 개변방법
KR20180049249A (ko) 2009-12-25 2018-05-10 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 폴리펩티드 다량체를 정제하기 위한 폴리펩티드의 개변방법
WO2011078332A1 (ja) * 2009-12-25 2011-06-30 中外製薬株式会社 ポリペプチド多量体を精製するためのポリペプチドの改変方法
WO2011092989A1 (ja) 2010-01-29 2011-08-04 東レ株式会社 ポリ乳酸系樹脂シート
US10435458B2 (en) 2010-03-04 2019-10-08 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antibody constant region variants with reduced Fcgammar binding
JP2019048814A (ja) * 2010-04-20 2019-03-28 ゲンマブ エー／エス ヘテロ二量体抗体Ｆｃ含有タンパク質およびその産生方法
JP2020114832A (ja) * 2010-04-20 2020-07-30 ゲンマブ エー／エス ヘテロ二量体抗体Ｆｃ含有タンパク質およびその産生方法
JP2017043621A (ja) * 2010-04-20 2017-03-02 ゲンマブ エー／エス ヘテロ二量体抗体Ｆｃ含有タンパク質およびその産生方法
US9150663B2 (en) * 2010-04-20 2015-10-06 Genmab A/S Heterodimeric antibody Fc-containing proteins and methods for production thereof
US11866514B2 (en) 2010-04-20 2024-01-09 Genmab A/S Heterodimeric antibody Fc-containing proteins and methods for production thereof
JP2013531470A (ja) * 2010-04-20 2013-08-08 ゲンマブ エー／エス ヘテロ二量体抗体Ｆｃ含有タンパク質およびその産生方法
US20130039913A1 (en) * 2010-04-20 2013-02-14 Genmab A/S Heterodimeric antibody fc-containing proteins and methods for production thereof
US10597464B2 (en) 2010-04-20 2020-03-24 Genmab A/S Heterodimeric antibody Fc-containing proteins and methods for production thereof
US9605061B2 (en) 2010-07-29 2017-03-28 Xencor, Inc. Antibodies with modified isoelectric points
US9480744B2 (en) 2010-09-10 2016-11-01 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Methods for treating melanoma
KR101973930B1 (ko) 2010-11-05 2019-04-29 자임워크스 인코포레이티드 Fc 도메인 내의 돌연변이를 갖는 안정한 이종이량체 항체 디자인
KR20190015583A (ko) * 2010-11-05 2019-02-13 자임워크스 인코포레이티드 Fc 도메인 내의 돌연변이를 갖는 안정한 이종이량체 항체 디자인
EP3318633A1 (en) 2010-11-17 2018-05-09 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Multi-specific antigen-binding molecule having alternative function to function of blood coagulation factor viii
US9334331B2 (en) 2010-11-17 2016-05-10 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Bispecific antibodies
WO2012067176A1 (ja) 2010-11-17 2012-05-24 中外製薬株式会社 血液凝固第viii因子の機能を代替する機能を有する多重特異性抗原結合分子
US10450381B2 (en) 2010-11-17 2019-10-22 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Methods of treatment that include the administration of bispecific antibodies
JPWO2012073985A1 (ja) * 2010-11-30 2014-05-19 中外製薬株式会社 細胞傷害誘導治療剤
EP2647707B1 (en) 2010-11-30 2018-09-12 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Cytotoxicity-inducing therapeutic agent
US11891434B2 (en) 2010-11-30 2024-02-06 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antigen-binding molecule capable of binding to plurality of antigen molecules repeatedly
EP4303236A2 (en) 2010-11-30 2024-01-10 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Cytotoxicity-inducing therapeutic agent
CN109160951A (zh) * 2010-11-30 2019-01-08 中外制药株式会社 细胞毒诱导治疗剂
EP4303237A2 (en) 2010-11-30 2024-01-10 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Cytotoxicity-inducing therapeutic agent
JP2020078335A (ja) * 2010-11-30 2020-05-28 中外製薬株式会社 細胞傷害誘導治療剤
JP2018093879A (ja) * 2010-11-30 2018-06-21 中外製薬株式会社 細胞傷害誘導治療剤
EP4279512A2 (en) 2010-11-30 2023-11-22 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Cytotoxicity-inducing therapeutic agent
EP3434767A1 (en) 2010-11-30 2019-01-30 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Cytotoxicity-inducing therapeutic agent
EP4279513A2 (en) 2010-11-30 2023-11-22 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Cytotoxicity-inducing therapeutic agent
WO2012073985A1 (ja) 2010-11-30 2012-06-07 中外製薬株式会社 細胞傷害誘導治療剤
JP2020202879A (ja) * 2010-11-30 2020-12-24 中外製薬株式会社 細胞傷害誘導治療剤
EP4279511A2 (en) 2010-11-30 2023-11-22 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Cytotoxicity-inducing therapeutic agent
JP2022023133A (ja) * 2010-11-30 2022-02-07 中外製薬株式会社 細胞傷害誘導治療剤
US11066483B2 (en) 2010-11-30 2021-07-20 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Cytotoxicity-inducing therapeutic agent
US11718678B2 (en) 2011-02-25 2023-08-08 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method for altering plasma retention and immunogenicity of antigen-binding molecule
US10618965B2 (en) 2011-02-25 2020-04-14 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method for altering plasma retention and immunogenicity of antigen-binding molecule
US10793621B2 (en) 2011-02-28 2020-10-06 Hoffmann-La Roche Inc. Nucleic acid encoding dual Fc antigen binding proteins
US10611825B2 (en) 2011-02-28 2020-04-07 Hoffmann La-Roche Inc. Monovalent antigen binding proteins
US9982036B2 (en) 2011-02-28 2018-05-29 Hoffmann-La Roche Inc. Dual FC antigen binding proteins
US10155803B2 (en) 2011-03-03 2018-12-18 Zymeworks Inc. Multivalent heteromultimer scaffold design and constructs
US10711051B2 (en) 2011-03-03 2020-07-14 Zymeworks Inc. Multivalent heteromultimer scaffold design and constructs
US9499605B2 (en) 2011-03-03 2016-11-22 Zymeworks Inc. Multivalent heteromultimer scaffold design and constructs
WO2012133782A1 (ja) 2011-03-30 2012-10-04 中外製薬株式会社 抗原結合分子の血漿中滞留性と免疫原性を改変する方法
EP3825325A2 (en) 2011-03-30 2021-05-26 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Retention of antigen-binding molecules in blood plasma and method for modifying immunogenicity
US9890218B2 (en) 2011-06-30 2018-02-13 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Heterodimerized polypeptide
EP4011913A1 (en) 2011-06-30 2022-06-15 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Heterodimerized polypeptide
WO2013002362A1 (ja) 2011-06-30 2013-01-03 中外製薬株式会社 ヘテロ二量化ポリペプチド
KR20140041787A (ko) 2011-06-30 2014-04-04 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 헤테로이량화 폴리펩티드
US11512128B2 (en) 2011-09-23 2022-11-29 Mereo Biopharma 5, Inc. VEGF/DLL4 binding agents and uses thereof
US10730940B2 (en) 2011-09-23 2020-08-04 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. VEGF/DLL4 binding agents and uses thereof
US9879084B2 (en) 2011-09-23 2018-01-30 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Modified immunoglobulin molecules that specifically bind human VEGF and DLL4
US9376488B2 (en) 2011-09-23 2016-06-28 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. VEGF binding antibodies
US9574009B2 (en) 2011-09-23 2017-02-21 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Polynucleotides encoding VEGF/DLL4 binding agents
US8858941B2 (en) 2011-09-23 2014-10-14 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. VEGF/DLL4 binding agents and uses thereof
EP2604625A1 (en) 2011-09-26 2013-06-19 Merus B.V. Generation of binding molecules
EP4086282A1 (en) 2011-09-26 2022-11-09 Merus N.V. Generation of binding molecules
EP3263597A1 (en) 2011-09-26 2018-01-03 Merus N.V. Generation of binding molecules
US11827699B2 (en) 2011-09-30 2023-11-28 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Methods for producing antibodies promoting disappearance of antigens having plurality of biological activities
US10253100B2 (en) 2011-09-30 2019-04-09 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Therapeutic antigen-binding molecule with a FcRn-binding domain that promotes antigen clearance
US10851178B2 (en) 2011-10-10 2020-12-01 Xencor, Inc. Heterodimeric human IgG1 polypeptides with isoelectric point modifications
US11492371B2 (en) 2011-10-27 2022-11-08 Genmab A/S Production of heterodimeric proteins
US10344050B2 (en) 2011-10-27 2019-07-09 Genmab A/S Production of heterodimeric proteins
JP2017212981A (ja) * 2011-10-31 2017-12-07 中外製薬株式会社 重鎖と軽鎖の会合が制御された抗原結合分子
JPWO2013065708A1 (ja) * 2011-10-31 2015-04-02 中外製薬株式会社 重鎖と軽鎖の会合が制御された抗原結合分子
CN104011207A (zh) * 2011-10-31 2014-08-27 中外制药株式会社 控制了重链与轻链的缔合的抗原结合分子
CN109134658A (zh) * 2011-10-31 2019-01-04 中外制药株式会社 控制了重链与轻链的缔合的抗原结合分子
CN109134658B (zh) * 2011-10-31 2022-10-14 中外制药株式会社 控制了重链与轻链的缔合的抗原结合分子
KR20140084249A (ko) 2011-10-31 2014-07-04 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 중쇄와 경쇄의 회합이 제어된 항원 결합 분자
KR20200123842A (ko) 2011-10-31 2020-10-30 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 중쇄와 경쇄의 회합이 제어된 항원 결합 분자
EP2787078B1 (en) 2011-10-31 2019-05-22 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antigen-binding molecule having regulated conjugation between heavy-chain and light-chain
US11851476B2 (en) 2011-10-31 2023-12-26 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antigen-binding molecule having regulated conjugation between heavy-chain and light-chain
WO2013065708A1 (ja) 2011-10-31 2013-05-10 中外製薬株式会社 重鎖と軽鎖の会合が制御された抗原結合分子
EP3517550A1 (en) 2011-11-30 2019-07-31 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Drug containing carrier into cell for forming immune complex
WO2013081143A1 (ja) 2011-11-30 2013-06-06 中外製薬株式会社 免疫複合体を形成する細胞内への運搬体（キャリア）を含む医薬
WO2013125667A1 (ja) 2012-02-24 2013-08-29 中外製薬株式会社 FcγRIIBを介して抗原の消失を促進する抗原結合分子
EP3738980A1 (en) 2012-02-24 2020-11-18 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antigen-binding molecule for promoting disappearance of antigen via fc gamma riib
US9248182B2 (en) 2012-04-20 2016-02-02 Merus B.V. Methods and means for the production of Ig-like molecules
US9358286B2 (en) 2012-04-20 2016-06-07 Merus B.V. Methods and means for the production of IG-like molecules
US9248181B2 (en) 2012-04-20 2016-02-02 Merus B.V. Methods and means for the production of Ig-like molecules
US10337045B2 (en) 2012-04-20 2019-07-02 Merus N.V. Methods and means for the production of Ig-like molecules
US9758805B2 (en) 2012-04-20 2017-09-12 Merus N.V. Methods and means for the production of Ig-like molecules
US10329596B2 (en) 2012-04-20 2019-06-25 Merus N.V. Methods and means for the production of Ig-like molecules
US11926859B2 (en) 2012-04-20 2024-03-12 Merus N.V. Methods and means for the production of Ig-like molecules
US10752929B2 (en) 2012-04-20 2020-08-25 Merus N.V. Methods and means for the production of ig-like molecules
EP3795215A1 (en) 2012-05-30 2021-03-24 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Target tissue-specific antigen-binding molecule
WO2013180200A1 (ja) 2012-05-30 2013-12-05 中外製薬株式会社 標的組織特異的抗原結合分子
WO2013187495A1 (ja) 2012-06-14 2013-12-19 中外製薬株式会社 改変されたFc領域を含む抗原結合分子
JPWO2013187495A1 (ja) * 2012-06-14 2016-02-08 中外製薬株式会社 改変されたＦｃ領域を含む抗原結合分子
EP4310191A2 (en) 2012-06-14 2024-01-24 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antigen-binding molecule containing modified fc region
US11142563B2 (en) 2012-06-14 2021-10-12 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antigen-binding molecule containing modified Fc region
US11248037B2 (en) 2012-07-13 2022-02-15 Zymeworks Inc. Multivalent heteromultimer scaffold design and constructs
US10358479B2 (en) 2012-07-13 2019-07-23 Zymeworks Inc. Multivalent heteromultimer scaffold design and constructs
JP2015522295A (ja) * 2012-07-25 2015-08-06 スーチョウ アルファマブ カンパニー リミテッド 電荷の斥力相互作用を使用することによりホモダイマータンパク質の混合物を調製するための方法
EP3721900A1 (en) 2012-08-24 2020-10-14 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Fcgammariib-specific fc region variant
WO2014030728A1 (ja) 2012-08-24 2014-02-27 中外製薬株式会社 FcγRIIb特異的Fc領域改変体
US10919953B2 (en) 2012-08-24 2021-02-16 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha FcgammaRIIB-specific Fc region variant
US9771573B2 (en) 2012-10-03 2017-09-26 Zymeworks Inc. Methods of quantitating heavy and light chain polypeptide pairs
US9599620B2 (en) 2012-10-31 2017-03-21 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Methods and monitoring of treatment with a DLL4 antagonist
WO2014069647A1 (ja) * 2012-11-05 2014-05-08 全薬工業株式会社 抗体又は抗体組成物の製造方法
JPWO2014069647A1 (ja) * 2012-11-05 2016-09-08 全薬工業株式会社 抗体又は抗体組成物の製造方法
US10344099B2 (en) 2012-11-05 2019-07-09 Zenyaku Kogyo Kabushikikaisha Antibody and antibody composition production method
JP2015536349A (ja) * 2012-11-21 2015-12-21 アムジエン・インコーポレーテツド ヘテロ二量体免疫グロブリン
US11466078B2 (en) 2012-11-21 2022-10-11 Amgen Inc. Heterodimeric immunoglobulins
US10233237B2 (en) 2012-11-21 2019-03-19 Amgen Inc. Heterodimeric immunoglobulins
US11078296B2 (en) 2012-11-28 2021-08-03 Zymeworks Inc. Engineered immunoglobulin heavy chain-light chain pairs and uses thereof
US10077298B2 (en) 2012-11-28 2018-09-18 Zymeworks Inc. Engineered immunoglobulin heavy chain-light chain pairs and uses thereof
US9914785B2 (en) 2012-11-28 2018-03-13 Zymeworks Inc. Engineered immunoglobulin heavy chain-light chain pairs and uses thereof
WO2014082179A1 (en) * 2012-11-28 2014-06-05 Zymeworks Inc. Engineered immunoglobulin heavy chain-light chain pairs and uses thereof
US11286293B2 (en) 2012-11-28 2022-03-29 Zymeworks, Inc. Engineered immunoglobulin heavy chain-light chain pairs and uses thereof
KR20150097786A (ko) 2012-12-27 2015-08-26 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 헤테로이량화 폴리펩티드
US10766960B2 (en) 2012-12-27 2020-09-08 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Heterodimerized polypeptide
WO2014104165A1 (ja) 2012-12-27 2014-07-03 中外製薬株式会社 ヘテロ二量化ポリペプチド
US9701759B2 (en) 2013-01-14 2017-07-11 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
US11634506B2 (en) 2013-01-14 2023-04-25 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
US11053316B2 (en) 2013-01-14 2021-07-06 Xencor, Inc. Optimized antibody variable regions
US10131710B2 (en) 2013-01-14 2018-11-20 Xencor, Inc. Optimized antibody variable regions
US11718667B2 (en) 2013-01-14 2023-08-08 Xencor, Inc. Optimized antibody variable regions
US10472427B2 (en) 2013-01-14 2019-11-12 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
US9650446B2 (en) 2013-01-14 2017-05-16 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
US10738133B2 (en) 2013-01-14 2020-08-11 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
US10738132B2 (en) 2013-01-14 2020-08-11 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
US10487155B2 (en) 2013-01-14 2019-11-26 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
US9738722B2 (en) 2013-01-15 2017-08-22 Xencor, Inc. Rapid clearance of antigen complexes using novel antibodies
US10047163B2 (en) 2013-02-08 2018-08-14 Abbvie Stemcentrx Llc Multispecific constructs
US10968276B2 (en) 2013-03-12 2021-04-06 Xencor, Inc. Optimized anti-CD3 variable regions
US10519242B2 (en) 2013-03-15 2019-12-31 Xencor, Inc. Targeting regulatory T cells with heterodimeric proteins
US11299554B2 (en) 2013-03-15 2022-04-12 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
US11814423B2 (en) 2013-03-15 2023-11-14 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
US9605084B2 (en) 2013-03-15 2017-03-28 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
US10287364B2 (en) 2013-03-15 2019-05-14 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
US10544187B2 (en) 2013-03-15 2020-01-28 Xencor, Inc. Targeting regulatory T cells with heterodimeric proteins
US10858417B2 (en) 2013-03-15 2020-12-08 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
US10106624B2 (en) 2013-03-15 2018-10-23 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
WO2014163101A1 (ja) 2013-04-02 2014-10-09 中外製薬株式会社 Ｆｃ領域改変体
US11267868B2 (en) 2013-04-02 2022-03-08 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Fc region variant
EP3783017A1 (en) 2013-04-02 2021-02-24 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Fc region variant
JP2016522168A (ja) * 2013-04-05 2016-07-28 ジェネンテック， インコーポレイテッド 抗ｉｌ−４抗体及び二重特異性抗体及びその使用
US11091541B2 (en) 2013-04-29 2021-08-17 Hoffmann-La Roche Inc. Human FcRn-binding modified antibodies and methods of use
US11124576B2 (en) 2013-09-27 2021-09-21 Chungai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method for producing polypeptide heteromultimer
KR102441231B1 (ko) 2013-09-27 2022-09-06 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 폴리펩티드 이종 다량체의 제조방법
JP2019167343A (ja) * 2013-09-27 2019-10-03 中外製薬株式会社 ポリペプチド異種多量体の製造方法
WO2015046467A1 (ja) 2013-09-27 2015-04-02 中外製薬株式会社 ポリペプチド異種多量体の製造方法
JPWO2015046467A1 (ja) * 2013-09-27 2017-03-09 中外製薬株式会社 ポリペプチド異種多量体の製造方法
KR20160056940A (ko) 2013-09-27 2016-05-20 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 폴리펩티드 이종 다량체의 제조방법
EP3940065A1 (en) 2013-09-30 2022-01-19 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method for producing antigen-binding molecule using modified helper phage
US10501737B2 (en) 2013-09-30 2019-12-10 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method for producing antigen-binding molecule using modified helper phage
KR20160062050A (ko) 2013-09-30 2016-06-01 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 개변된 헬퍼 파지를 사용하여 항원 결합 분자를 제작하는 방법
WO2015046554A1 (ja) 2013-09-30 2015-04-02 中外製薬株式会社 改変されたヘルパーファージを用いて抗原結合分子を作製する方法
US10323099B2 (en) 2013-10-11 2019-06-18 Hoffmann-La Roche Inc. Multispecific domain exchanged common variable light chain antibodies
US11739149B2 (en) 2013-11-11 2023-08-29 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antigen-binding molecule containing modified antibody variable region
WO2015068847A1 (ja) 2013-11-11 2015-05-14 中外製薬株式会社 改変された抗体可変領域を含む抗原結合分子
EP3763813A1 (en) 2013-12-04 2021-01-13 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antigen-binding molecules, the antigen-binding activity of which varies according to the concentration of compounds, and libraries of said molecules
WO2015083764A1 (ja) 2013-12-04 2015-06-11 中外製薬株式会社 化合物の濃度に応じて抗原結合能の変化する抗原結合分子及びそのライブラリ
EP3835318A1 (en) 2014-01-15 2021-06-16 F. Hoffmann-La Roche AG Fc-region variants with modified fcrn- and maintained protein a-binding properties
US11555067B2 (en) 2014-01-15 2023-01-17 Hoffmann-La Roche Inc. Fc-region variants with improved protein A-binding
WO2015107026A1 (en) 2014-01-15 2015-07-23 F. Hoffmann-La Roche Ag Fc-region variants with modified fcrn- and maintained protein a-binding properties
EP3514179A1 (en) 2014-01-24 2019-07-24 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Antibody molecules to pd-1 and uses thereof
EP4324518A2 (en) 2014-01-31 2024-02-21 Novartis AG Antibody molecules to tim-3 and uses thereof
US11820825B2 (en) 2014-02-28 2023-11-21 Merus N.V. Methods of treating a subject having an EGFR-positive and/or ErbB-3-positive tumor
US11279770B2 (en) 2014-02-28 2022-03-22 Merus N.V. Antibody that binds ErbB-2 and ErbB-3
US10844127B2 (en) 2014-02-28 2020-11-24 Merus N.V. Antibodies that bind EGFR and ErbB3
WO2015138920A1 (en) 2014-03-14 2015-09-17 Novartis Ag Antibody molecules to lag-3 and uses thereof
EP3660050A1 (en) 2014-03-14 2020-06-03 Novartis AG Antibody molecules to lag-3 and uses thereof
WO2015142675A2 (en) 2014-03-15 2015-09-24 Novartis Ag Treatment of cancer using chimeric antigen receptor
US10858451B2 (en) 2014-03-28 2020-12-08 Xencor, Inc. Bispecific antibodies that bind to CD38 and CD3
US9822186B2 (en) 2014-03-28 2017-11-21 Xencor, Inc. Bispecific antibodies that bind to CD38 and CD3
US11840579B2 (en) 2014-03-28 2023-12-12 Xencor, Inc. Bispecific antibodies that bind to CD38 and CD3
US11485790B2 (en) 2014-04-07 2022-11-01 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Immunoactivating antigen-binding molecule
US11124573B2 (en) 2014-05-02 2021-09-21 Janssen Biotech, Inc. Compositions and methods related to engineered Fc constructs
US11505605B2 (en) 2014-05-13 2022-11-22 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha T cell-redirected antigen-binding molecule for cells having immunosuppression function
US11306156B2 (en) 2014-05-28 2022-04-19 Zymeworks Inc. Modified antigen binding polypeptide constructs and uses thereof
EP3970747A2 (en) 2014-06-03 2022-03-23 XBiotech Inc. Compositions and methods for treating and preventing staphylococcus aureus infections
WO2015187779A1 (en) 2014-06-03 2015-12-10 Xbiotech, Inc. Compositions and methods for treating and preventing staphylococcus aureus infections
EP3722316A1 (en) 2014-07-21 2020-10-14 Novartis AG Treatment of cancer using a cd33 chimeric antigen receptor
WO2016014565A2 (en) 2014-07-21 2016-01-28 Novartis Ag Treatment of cancer using humanized anti-bcma chimeric antigen receptor
WO2016014530A1 (en) 2014-07-21 2016-01-28 Novartis Ag Combinations of low, immune enhancing. doses of mtor inhibitors and cars
WO2016014553A1 (en) 2014-07-21 2016-01-28 Novartis Ag Sortase synthesized chimeric antigen receptors
EP4205749A1 (en) 2014-07-31 2023-07-05 Novartis AG Subset-optimized chimeric antigen receptor-containing cells
EP3660042A1 (en) 2014-07-31 2020-06-03 Novartis AG Subset-optimized chimeric antigen receptor-containing t-cells
WO2016025880A1 (en) 2014-08-14 2016-02-18 Novartis Ag Treatment of cancer using gfr alpha-4 chimeric antigen receptor
EP3712171A1 (en) 2014-08-19 2020-09-23 Novartis AG Treatment of cancer using a cd123 chimeric antigen receptor
EP3967709A1 (en) 2014-09-17 2022-03-16 Novartis AG Targeting cytotoxic cells with chimeric receptors for adoptive immunotherapy
WO2016044605A1 (en) 2014-09-17 2016-03-24 Beatty, Gregory Targeting cytotoxic cells with chimeric receptors for adoptive immunotherapy
US11150254B2 (en) 2014-09-26 2021-10-19 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method for measuring reactivity of FVIII
KR20230101934A (ko) 2014-09-26 2023-07-06 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 세포상해 유도 치료제
US11001643B2 (en) 2014-09-26 2021-05-11 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Cytotoxicity-inducing therapeutic agent
KR20210121268A (ko) 2014-09-26 2021-10-07 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 세포상해 유도 치료제
KR20170104635A (ko) 2014-09-26 2017-09-15 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 세포상해 유도 치료제
US9975966B2 (en) 2014-09-26 2018-05-22 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Cytotoxicity-inducing theraputic agent
US11214623B2 (en) 2014-09-26 2022-01-04 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antibody capable of neutralizing substance having activity alternative to function of coagulation factor VIII (FVIII)
WO2016061142A1 (en) 2014-10-14 2016-04-21 Novartis Ag Antibody molecules to pd-l1 and uses thereof
EP4245376A2 (en) 2014-10-14 2023-09-20 Novartis AG Antibody molecules to pd-l1 and uses thereof
US11046760B2 (en) 2014-10-31 2021-06-29 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Combination therapy for treatment of disease
EP3842453A1 (en) 2014-11-06 2021-06-30 F. Hoffmann-La Roche AG Fc-region variants with modified fcrn- and protein a-binding properties
US10899846B2 (en) 2014-11-06 2021-01-26 Hoffmann-La Roche Inc. Fc-region variants with modified FcRn- and protein A-binding properties
US11154615B2 (en) 2014-11-11 2021-10-26 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Library of antigen-binding molecules including modified antibody variable region
US10259887B2 (en) 2014-11-26 2019-04-16 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind CD3 and tumor antigens
US11225528B2 (en) 2014-11-26 2022-01-18 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind CD3 and tumor antigens
US10913803B2 (en) 2014-11-26 2021-02-09 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind CD3 and tumor antigens
US10889653B2 (en) 2014-11-26 2021-01-12 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind CD3 and tumor antigens
US11945880B2 (en) 2014-11-26 2024-04-02 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind CD3 and tumor antigens
US11111315B2 (en) 2014-11-26 2021-09-07 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind CD3 and tumor antigens
US11352442B2 (en) 2014-11-26 2022-06-07 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind CD3 and CD38
US10526417B2 (en) 2014-11-26 2020-01-07 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind CD3 and CD38
US9850320B2 (en) 2014-11-26 2017-12-26 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies to CD3 X CD20
US9856327B2 (en) 2014-11-26 2018-01-02 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies to CD3 X CD123
US11673972B2 (en) 2014-11-26 2023-06-13 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind CD3 and tumor antigens
US11859011B2 (en) 2014-11-26 2024-01-02 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind CD3 and tumor antigens
WO2016090034A2 (en) 2014-12-03 2016-06-09 Novartis Ag Methods for b cell preconditioning in car therapy
US11597760B2 (en) 2014-12-19 2023-03-07 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method of detecting the presence of complement C5
US11454633B2 (en) 2014-12-19 2022-09-27 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Anti-myostatin antibodies, polypeptides containing variant Fc regions, and methods of use
US10000560B2 (en) 2014-12-19 2018-06-19 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Anti-myostatin antibodies, polypeptides containing variant Fc regions, and methods of use
US10385122B2 (en) 2014-12-19 2019-08-20 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Nucleic acids encoding anti-C5 antibodies
US10865253B2 (en) 2014-12-19 2020-12-15 Genmab A/S Rodent bispecific heterodimeric proteins
US10738111B2 (en) 2014-12-19 2020-08-11 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Anti-myostatin antibodies, polypeptides containing variant Fc regions, and methods of use
US10428155B2 (en) 2014-12-22 2019-10-01 Xencor, Inc. Trispecific antibodies
US9969800B2 (en) 2015-02-05 2018-05-15 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha IL-8 antibodies
US10519229B2 (en) 2015-02-05 2019-12-31 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Nucleic acids encoding IL-8 antibodies
US11180548B2 (en) 2015-02-05 2021-11-23 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Methods of neutralizing IL-8 biological activity
US10774148B2 (en) 2015-02-27 2020-09-15 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Composition for treating IL-6-related diseases
US10227411B2 (en) 2015-03-05 2019-03-12 Xencor, Inc. Modulation of T cells with bispecific antibodies and FC fusions
US11091548B2 (en) 2015-03-05 2021-08-17 Xencor, Inc. Modulation of T cells with bispecific antibodies and Fc fusions
US11142587B2 (en) 2015-04-01 2021-10-12 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method for producing polypeptide hetero-oligomer
JPWO2016159213A1 (ja) * 2015-04-01 2018-02-15 中外製薬株式会社 ポリペプチド異種多量体の製造方法
JP2021080260A (ja) * 2015-04-01 2021-05-27 中外製薬株式会社 ポリペプチド異種多量体の製造方法
WO2016159213A1 (ja) * 2015-04-01 2016-10-06 中外製薬株式会社 ポリペプチド異種多量体の製造方法
WO2016164731A2 (en) 2015-04-08 2016-10-13 Novartis Ag Cd20 therapies, cd22 therapies, and combination therapies with a cd19 chimeric antigen receptor (car) - expressing cell
EP4056588A1 (en) 2015-04-08 2022-09-14 Novartis AG Cd20 therapies, cd22 therapies, and combination therapies with a cd19 chimeric antigen receptor (car)- expressing cell
WO2016166014A1 (en) 2015-04-17 2016-10-20 F. Hoffmann-La Roche Ag Combination therapy with coagulation factors and multispecific antibodies
WO2016172583A1 (en) 2015-04-23 2016-10-27 Novartis Ag Treatment of cancer using chimeric antigen receptor and protein kinase a blocker
US11739148B2 (en) 2015-07-10 2023-08-29 Merus N.V. Human CD3 binding antibody
US10266593B2 (en) 2015-07-10 2019-04-23 Merus N.V. Human CD3 binding antibody
US9914777B2 (en) 2015-07-10 2018-03-13 Merus N.V. Human CD3 binding antibody
WO2017019894A1 (en) 2015-07-29 2017-02-02 Novartis Ag Combination therapies comprising antibody molecules to lag-3
WO2017019897A1 (en) 2015-07-29 2017-02-02 Novartis Ag Combination therapies comprising antibody molecules to tim-3
EP3964528A1 (en) 2015-07-29 2022-03-09 Novartis AG Combination therapies comprising antibody molecules to lag-3
EP3878465A1 (en) 2015-07-29 2021-09-15 Novartis AG Combination therapies comprising antibody molecules to tim-3
US11352426B2 (en) 2015-09-21 2022-06-07 Aptevo Research And Development Llc CD3 binding polypeptides
US11339213B2 (en) 2015-09-23 2022-05-24 Mereo Biopharma 5, Inc. Methods and compositions for treatment of cancer
WO2017070608A1 (en) 2015-10-23 2017-04-27 Eureka Therapeutics, Inc. Antibody/t-cell receptor chimeric constructs and uses thereof
US10098951B2 (en) 2015-10-23 2018-10-16 Eureka Therapeutics, Inc. Antibody/T-cell receptor chimeric constructs and uses thereof
US11421013B2 (en) 2015-10-23 2022-08-23 Eureka Therapeutics, Inc. Antibody/T-cell receptor chimeric constructs and uses thereof
US10464988B2 (en) 2015-10-23 2019-11-05 Eureka Therapeutics, Inc. Antibody/T-cell receptor chimeric constructs and uses thereof
US11939394B2 (en) 2015-10-23 2024-03-26 Merus N.V. Binding molecules that inhibit cancer growth
EP3842450A1 (en) 2015-10-23 2021-06-30 Eureka Therapeutics, Inc. Antibody/t-cell receptor chimeric constructs and uses thereof
US10822389B2 (en) 2015-10-23 2020-11-03 Eureka Therapeutics, Inc. Antibody/T-cell receptor chimeric constructs and uses thereof
WO2017086419A1 (ja) 2015-11-18 2017-05-26 中外製薬株式会社 液性免疫応答の増強方法
US11649293B2 (en) 2015-11-18 2023-05-16 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method for enhancing humoral immune response
US11660340B2 (en) 2015-11-18 2023-05-30 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Combination therapy using T cell redirection antigen binding molecule against cell having immunosuppressing function
WO2017086367A1 (ja) 2015-11-18 2017-05-26 中外製薬株式会社 免疫抑制機能を有する細胞に対するｔ細胞リダイレクト抗原結合分子を用いた併用療法
US11623957B2 (en) 2015-12-07 2023-04-11 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind CD3 and PSMA
US10227410B2 (en) 2015-12-07 2019-03-12 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind CD3 and PSMA
US11104745B2 (en) 2015-12-16 2021-08-31 Amgen Inc. Anti-TL1A/anti-TNF-alpha bispecific antigen binding proteins and uses thereof
WO2017106656A1 (en) 2015-12-17 2017-06-22 Novartis Ag Antibody molecules to pd-1 and uses thereof
WO2017106810A2 (en) 2015-12-17 2017-06-22 Novartis Ag Combination of c-met inhibitor with antibody molecule to pd-1 and uses thereof
US11359009B2 (en) 2015-12-25 2022-06-14 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Anti-myostatin antibodies and methods of use
WO2017110980A1 (ja) 2015-12-25 2017-06-29 中外製薬株式会社 増強された活性を有する抗体及びその改変方法
US11649262B2 (en) 2015-12-28 2023-05-16 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method for promoting efficiency of purification of Fc region-containing polypeptide
EP3851457A1 (en) 2016-01-21 2021-07-21 Novartis AG Multispecific molecules targeting cll-1
WO2017125897A1 (en) 2016-01-21 2017-07-27 Novartis Ag Multispecific molecules targeting cll-1
WO2017149515A1 (en) 2016-03-04 2017-09-08 Novartis Ag Cells expressing multiple chimeric antigen receptor (car) molecules and uses therefore
WO2017159287A1 (ja) 2016-03-14 2017-09-21 中外製薬株式会社 癌の治療に用いるための細胞傷害誘導治療剤
US11072666B2 (en) 2016-03-14 2021-07-27 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Cell injury inducing therapeutic drug for use in cancer therapy
WO2017165683A1 (en) 2016-03-23 2017-09-28 Novartis Ag Cell secreted minibodies and uses thereof
EP4219721A2 (en) 2016-04-15 2023-08-02 Novartis AG Compositions and methods for selective protein expression
WO2017181119A2 (en) 2016-04-15 2017-10-19 Novartis Ag Compositions and methods for selective protein expression
US11155640B2 (en) 2016-05-23 2021-10-26 Janssen Biotech, Inc. Compositions and methods related to engineered Fc constructs
US11623964B2 (en) 2016-05-23 2023-04-11 Momenta Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods related to engineered Fc constructs
WO2017210617A2 (en) 2016-06-02 2017-12-07 Porter, David, L. Therapeutic regimens for chimeric antigen receptor (car)- expressing cells
US10787518B2 (en) 2016-06-14 2020-09-29 Xencor, Inc. Bispecific checkpoint inhibitor antibodies
US11492407B2 (en) 2016-06-14 2022-11-08 Xencor, Inc. Bispecific checkpoint inhibitor antibodies
US11236170B2 (en) 2016-06-14 2022-02-01 Xencor, Inc. Bispecific checkpoint inhibitor antibodies
US10316088B2 (en) 2016-06-28 2019-06-11 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind somatostatin receptor 2
US11225521B2 (en) 2016-06-28 2022-01-18 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind somatostatin receptor 2
WO2018013918A2 (en) 2016-07-15 2018-01-18 Novartis Ag Treatment and prevention of cytokine release syndrome using a chimeric antigen receptor in combination with a kinase inhibitor
WO2018023025A1 (en) 2016-07-28 2018-02-01 Novartis Ag Combination therapies of chimeric antigen receptors adn pd-1 inhibitors
WO2018026819A2 (en) 2016-08-01 2018-02-08 Novartis Ag Treatment of cancer using a chimeric antigen receptor in combination with an inhibitor of a pro-m2 macrophage molecule
US11780912B2 (en) 2016-08-05 2023-10-10 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Composition for prophylaxis or treatment of IL-8 related diseases
US11053308B2 (en) 2016-08-05 2021-07-06 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method for treating IL-8-related diseases
US10793632B2 (en) 2016-08-30 2020-10-06 Xencor, Inc. Bispecific immunomodulatory antibodies that bind costimulatory and checkpoint receptors
US11352438B2 (en) 2016-09-06 2022-06-07 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Methods of using a bispecific antibody that recognizes coagulation factor IX and/or activated coagulation factor IX and coagulation factor X and/or activated coagulation factor X
WO2018067992A1 (en) 2016-10-07 2018-04-12 Novartis Ag Chimeric antigen receptors for the treatment of cancer
US10501543B2 (en) 2016-10-14 2019-12-10 Xencor, Inc. IL15/IL15Rα heterodimeric Fc-fusion proteins
US10550185B2 (en) 2016-10-14 2020-02-04 Xencor, Inc. Bispecific heterodimeric fusion proteins containing IL-15-IL-15Rα Fc-fusion proteins and PD-1 antibody fragments
US11827682B2 (en) 2017-01-06 2023-11-28 Momenta Pharmaceuticals, Inc. Engineered Fc constructs
US11220531B2 (en) 2017-01-06 2022-01-11 Janssen Biotech, Inc. Engineered Fc constructs
EP4043485A1 (en) 2017-01-26 2022-08-17 Novartis AG Cd28 compositions and methods for chimeric antigen receptor therapy
WO2018155611A1 (ja) 2017-02-24 2018-08-30 中外製薬株式会社 薬学的組成物、抗原結合分子、治療方法、およびスクリーニング方法
WO2018158719A1 (en) 2017-03-02 2018-09-07 Novartis Ag Engineered heterodimeric proteins
WO2018181870A1 (ja) 2017-03-31 2018-10-04 公立大学法人奈良県立医科大学 血液凝固第ｖｉｉｉ因子の機能を代替する多重特異性抗原結合分子を含有する、血液凝固第ｉｘ因子異常症の予防および／または治療に用いられる医薬組成物
US11780925B2 (en) 2017-03-31 2023-10-10 Merus N.V. ErbB-2 and ErbB3 binding bispecific antibodies for use in the treatment of cells that have an NRG1 fusion gene
WO2018187227A1 (en) 2017-04-03 2018-10-11 Concologie, Inc. Methods for treating cancer using ps-targeting antibodies with immuno-oncology agents
US11965021B2 (en) 2017-04-26 2024-04-23 Eureka Therapeutics, Inc. Cells expressing chimeric activating receptors and chimeric stimulating receptors and uses thereof
US11613573B2 (en) 2017-04-26 2023-03-28 Eureka Therapeutics, Inc. Chimeric antibody/T-cell receptor constructs and uses thereof
US10822413B2 (en) 2017-04-26 2020-11-03 Eureka Therapeutics, Inc. Cells expressing chimeric activating receptors and chimeric stimulating receptors and uses thereof
WO2018200583A1 (en) 2017-04-26 2018-11-01 Eureka Therapeutics, Inc. Cells expressing chimeric activating receptors and chimeric stimulating receptors and uses thereof
WO2018201056A1 (en) 2017-04-28 2018-11-01 Novartis Ag Cells expressing a bcma-targeting chimeric antigen receptor, and combination therapy with a gamma secretase inhibitor
WO2018201051A1 (en) 2017-04-28 2018-11-01 Novartis Ag Bcma-targeting agent, and combination therapy with a gamma secretase inhibitor
US11851486B2 (en) 2017-05-02 2023-12-26 National Center Of Neurology And Psychiatry Method for predicting and evaluating therapeutic effect in diseases related to IL-6 and neutrophils
WO2018229612A1 (en) 2017-06-12 2018-12-20 Novartis Ag Method of manufacturing bispecific antibodies, bispecific antibodies and therapeutic use of such antibodies
US11919969B2 (en) 2017-06-22 2024-03-05 Kymab Limited Bispecific antibodies for factor IX and factor X
WO2018234575A1 (en) 2017-06-22 2018-12-27 Kymab Limited BISPECIFIC ANTIBODIES OF FACTOR IX AND FACTOR X
WO2018237157A1 (en) 2017-06-22 2018-12-27 Novartis Ag CD73 BINDING ANTIBODY MOLECULES AND USES THEREOF
WO2019006007A1 (en) 2017-06-27 2019-01-03 Novartis Ag POSOLOGICAL REGIMES FOR ANTI-TIM3 ANTIBODIES AND USES THEREOF
US11084863B2 (en) 2017-06-30 2021-08-10 Xencor, Inc. Targeted heterodimeric Fc fusion proteins containing IL-15 IL-15alpha and antigen binding domains
US11752207B2 (en) 2017-07-11 2023-09-12 Compass Therapeutics Llc Agonist antibodies that bind human CD137 and uses thereof
WO2019018730A1 (en) 2017-07-20 2019-01-24 Novartis Ag DOSAGE REGIMES FOR ANTI-LAG3 ANTIBODIES AND USES THEREOF
US11773170B2 (en) 2017-08-09 2023-10-03 Merus N.V. Antibodies that bind EGFR and cMET
JP6496095B1 (ja) * 2017-09-29 2019-04-03 中外製薬株式会社 血液凝固第ｖｉｉｉ因子（ｆｖｉｉｉ）補因子機能代替活性を有する多重特異性抗原結合分子および当該分子を有効成分として含有する薬学的製剤
US10759870B2 (en) 2017-09-29 2020-09-01 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Multispecific antigen-binding molecules having blood coagulation factor VIII (FVIII) cofactor function-substituting activity and pharmaceutical formulations containing such a molecule as an active ingredient
KR20190039020A (ko) 2017-09-29 2019-04-10 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 혈액 응고 제 viii 인자(fviii) 보인자 기능 대체 활성을 갖는 다중특이성 항원 결합 분자 및 당해 분자를 유효 성분으로서 함유하는 약학적 제제
KR20200049764A (ko) 2017-09-29 2020-05-08 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 혈액 응고 제 viii 인자(fviii) 보인자 기능 대체 활성을 갖는 다중특이성 항원 결합 분자 및 당해 분자를 유효 성분으로서 함유하는 약학적 제제
WO2019065795A1 (ja) 2017-09-29 2019-04-04 中外製薬株式会社 血液凝固第ｖｉｉｉ因子（ｆｖｉｉｉ）補因子機能代替活性を有する多重特異性抗原結合分子および当該分子を有効成分として含有する薬学的製剤
WO2019077092A1 (en) 2017-10-20 2019-04-25 F. Hoffmann-La Roche Ag METHOD FOR GENERATING MULTISPECIFIC ANTIBODIES FROM MONOSPECIFIC ANTIBODIES
WO2019086362A1 (en) 2017-10-30 2019-05-09 F. Hoffmann-La Roche Ag Method for in vivo generation of multispecific antibodies from monospecific antibodies
US11718679B2 (en) 2017-10-31 2023-08-08 Compass Therapeutics Llc CD137 antibodies and PD-1 antagonists and uses thereof
US11312770B2 (en) 2017-11-08 2022-04-26 Xencor, Inc. Bispecific and monospecific antibodies using novel anti-PD-1 sequences
US10981992B2 (en) 2017-11-08 2021-04-20 Xencor, Inc. Bispecific immunomodulatory antibodies that bind costimulatory and checkpoint receptors
WO2019099838A1 (en) 2017-11-16 2019-05-23 Novartis Ag Combination therapies
US11851497B2 (en) 2017-11-20 2023-12-26 Compass Therapeutics Llc CD137 antibodies and tumor antigen-targeting antibodies and uses thereof
US11952422B2 (en) 2017-12-05 2024-04-09 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antigen-binding molecule comprising altered antibody variable region binding CD3 and CD137
US11319355B2 (en) 2017-12-19 2022-05-03 Xencor, Inc. Engineered IL-2 Fc fusion proteins
WO2019131988A1 (en) 2017-12-28 2019-07-04 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Cytotoxicity-inducing therapeutic agent
WO2019152660A1 (en) 2018-01-31 2019-08-08 Novartis Ag Combination therapy using a chimeric antigen receptor
WO2019160007A1 (ja) 2018-02-14 2019-08-22 中外製薬株式会社 抗原結合分子および組合せ
US10982006B2 (en) 2018-04-04 2021-04-20 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind fibroblast activation protein
WO2019200229A1 (en) 2018-04-13 2019-10-17 Novartis Ag Dosage regimens for anti-pd-l1 antibodies and uses thereof
US11524991B2 (en) 2018-04-18 2022-12-13 Xencor, Inc. PD-1 targeted heterodimeric fusion proteins containing IL-15/IL-15Ra Fc-fusion proteins and PD-1 antigen binding domains and uses thereof
US11505595B2 (en) 2018-04-18 2022-11-22 Xencor, Inc. TIM-3 targeted heterodimeric fusion proteins containing IL-15/IL-15RA Fc-fusion proteins and TIM-3 antigen binding domains
WO2019210153A1 (en) 2018-04-27 2019-10-31 Novartis Ag Car t cell therapies with enhanced efficacy
US11453710B2 (en) 2018-05-14 2022-09-27 Werewolf Therapeutics, Inc. Activatable interleukin 12 polypeptides and methods of use thereof
US11352403B2 (en) 2018-05-14 2022-06-07 Werewolf Therapeutics, Inc. Activatable interleukin-2 polypeptides and methods of use thereof
US11535658B2 (en) 2018-05-14 2022-12-27 Werewolf Therapeutics, Inc. Activatable interleukin-2 polypeptides and methods of use thereof
WO2019226658A1 (en) 2018-05-21 2019-11-28 Compass Therapeutics Llc Multispecific antigen-binding compositions and methods of use
WO2019226617A1 (en) 2018-05-21 2019-11-28 Compass Therapeutics Llc Compositions and methods for enhancing the killing of target cells by nk cells
WO2019227003A1 (en) 2018-05-25 2019-11-28 Novartis Ag Combination therapy with chimeric antigen receptor (car) therapies
WO2019232244A2 (en) 2018-05-31 2019-12-05 Novartis Ag Antibody molecules to cd73 and uses thereof
WO2019232484A1 (en) 2018-06-01 2019-12-05 Compugen Ltd Anti-pvrig/anti-tigit bispecific antibodies and methods of use
WO2019229701A2 (en) 2018-06-01 2019-12-05 Novartis Ag Binding molecules against bcma and uses thereof
WO2019235420A1 (ja) 2018-06-04 2019-12-12 中外製薬株式会社 複合体を検出する方法
WO2019241426A1 (en) 2018-06-13 2019-12-19 Novartis Ag Bcma chimeric antigen receptors and uses thereof
WO2019246293A2 (en) 2018-06-19 2019-12-26 Atarga, Llc Antibody molecules to complement component 5 and uses thereof
WO2019244973A1 (ja) 2018-06-20 2019-12-26 中外製薬株式会社 標的細胞に対する免疫反応を活性化する方法およびその組成物
WO2020012337A1 (en) 2018-07-10 2020-01-16 Novartis Ag 3-(5-amino-1-oxoisoindolin-2-yl)piperidine-2,6-dione derivatives and their use in the treatment of i karos family zinc finger 2 (ikzf2)-dependent diseases
WO2020021465A1 (en) 2018-07-25 2020-01-30 Advanced Accelerator Applications (Italy) S.R.L. Method of treatment of neuroendocrine tumors
WO2020045545A1 (ja) 2018-08-29 2020-03-05 中外製薬株式会社 抗体半分子、および抗体半分子のホモ二量体形成を抑制する方法
WO2020049128A1 (en) 2018-09-06 2020-03-12 Kymab Limited Antigen-binding molecules comprising unpaired variable domains
US11866476B2 (en) 2018-09-27 2024-01-09 Xilio Development, Inc. Masked IL-2-Fc fusion polypeptides
US11718655B2 (en) 2018-09-27 2023-08-08 Xilio Development, Inc. Masked interleukin-12 polypeptides
US11827685B2 (en) 2018-09-27 2023-11-28 Xilio Development, Inc. Masked cytokine polypeptides
EP4321530A2 (en) 2018-09-27 2024-02-14 Xilio Development, Inc. Masked cytokine polypeptides
US11053294B2 (en) 2018-09-27 2021-07-06 Xilio Development, Inc. Masked cytokine polypeptides
US11827686B2 (en) 2018-09-27 2023-11-28 Xilio Development, Inc. Masked cytokine polypeptides
US11358999B2 (en) 2018-10-03 2022-06-14 Xencor, Inc. IL-12 heterodimeric Fc-fusion proteins
US11046769B2 (en) 2018-11-13 2021-06-29 Compass Therapeutics Llc Multispecific binding constructs against checkpoint molecules and uses thereof
WO2020128467A2 (en) 2018-12-19 2020-06-25 Kymab Limited Antagonists
WO2020128972A1 (en) 2018-12-20 2020-06-25 Novartis Ag Dosing regimen and pharmaceutical combination comprising 3-(1-oxoisoindolin-2-yl)piperidine-2,6-dione derivatives
WO2020128898A1 (en) 2018-12-20 2020-06-25 Novartis Ag Pharmaceutical combinations
EP4015538A1 (en) 2018-12-21 2022-06-22 Kymab Limited Fixaxfx bispecific antibody with common light chain
WO2020128049A1 (en) 2018-12-21 2020-06-25 Kymab Limited Fixaxfx bispecific antibody with common light chain
US11965030B2 (en) 2018-12-24 2024-04-23 Sanofi Multispecific binding proteins with mutant fab domains
WO2020165834A1 (en) 2019-02-15 2020-08-20 Novartis Ag Substituted 3-(1-oxoisoindolin-2-yl)piperidine-2,6-dione derivatives and uses thereof
WO2020165833A1 (en) 2019-02-15 2020-08-20 Novartis Ag 3-(1-oxo-5-(piperidin-4-yl)isoindolin-2-yl)piperidine-2,6-dione derivatives and uses thereof
WO2020165868A1 (en) 2019-02-15 2020-08-20 Perkinelmer Cellular Technologies Germany Gmbh Low-power microscope-objective pre-scan and high-power microscope-objective scan in x,y and z-direction for imaging objects such as cells using a microscope
WO2020172553A1 (en) 2019-02-22 2020-08-27 Novartis Ag Combination therapies of egfrviii chimeric antigen receptors and pd-1 inhibitors
US11472890B2 (en) 2019-03-01 2022-10-18 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind ENPP3 and CD3
WO2020189748A1 (ja) 2019-03-19 2020-09-24 中外製薬株式会社 Ｍｔａ依存的に抗原に対する結合活性が変化する抗原結合ドメインを含む抗原結合分子及び当該抗原結合ドメイン取得用ライブラリ
WO2020205523A1 (en) 2019-03-29 2020-10-08 Atarga, Llc Anti fgf23 antibody
US11739132B2 (en) 2019-05-14 2023-08-29 Werewolf Therapeutics, Inc. Separation moieties and methods of use thereof
WO2020236797A1 (en) 2019-05-21 2020-11-26 Novartis Ag Variant cd58 domains and uses thereof
WO2020236792A1 (en) 2019-05-21 2020-11-26 Novartis Ag Cd19 binding molecules and uses thereof
WO2020236795A2 (en) 2019-05-21 2020-11-26 Novartis Ag Trispecific binding molecules against bcma and uses thereof
WO2020246563A1 (ja) 2019-06-05 2020-12-10 中外製薬株式会社 抗体切断部位結合分子
WO2021006328A1 (en) 2019-07-10 2021-01-14 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Claudin-6 binding molecules and uses thereof
WO2021079188A1 (en) 2019-10-21 2021-04-29 Novartis Ag Combination therapies with venetoclax and tim-3 inhibitors
WO2021079195A1 (en) 2019-10-21 2021-04-29 Novartis Ag Tim-3 inhibitors and uses thereof
WO2021108661A2 (en) 2019-11-26 2021-06-03 Novartis Ag Chimeric antigen receptors and uses thereof
WO2021123996A1 (en) 2019-12-20 2021-06-24 Novartis Ag Uses of anti-tgf-beta antibodies and checkpoint inhibitors for the treatment of proliferative diseases
WO2021123902A1 (en) 2019-12-20 2021-06-24 Novartis Ag Combination of anti tim-3 antibody mbg453 and anti tgf-beta antibody nis793, with or without decitabine or the anti pd-1 antibody spartalizumab, for treating myelofibrosis and myelodysplastic syndrome
WO2021131021A1 (ja) 2019-12-27 2021-07-01 中外製薬株式会社 抗ｃｔｌａ－４抗体およびその使用
WO2021144657A1 (en) 2020-01-17 2021-07-22 Novartis Ag Combination comprising a tim-3 inhibitor and a hypomethylating agent for use in treating myelodysplastic syndrome or chronic myelomonocytic leukemia
WO2021146636A1 (en) 2020-01-17 2021-07-22 Becton, Dickinson And Company Methods and compositions for single cell secretomics
WO2021173995A2 (en) 2020-02-27 2021-09-02 Novartis Ag Methods of making chimeric antigen receptor-expressing cells
WO2021190980A1 (en) 2020-03-22 2021-09-30 Quadrucept Bio Limited Multimers for viral strain evolution
WO2021195513A1 (en) 2020-03-27 2021-09-30 Novartis Ag Bispecific combination therapy for treating proliferative diseases and autoimmune disorders
WO2021200857A1 (ja) 2020-03-30 2021-10-07 国立大学法人三重大学 二重特異的抗体
KR20220160598A (ko) 2020-03-30 2022-12-06 고쿠리츠다이가쿠호진 미에다이가쿠 이중 특이적 항체
US11952423B2 (en) 2020-03-30 2024-04-09 Mie University Bispecific antibody
WO2021201087A1 (en) 2020-03-31 2021-10-07 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method for producing multispecific antigen-binding molecules
US11718672B2 (en) 2020-03-31 2023-08-08 Chugai Seiyaki Kabushiki Kaisha CD137- and DLL3-targeting multispecific antigen-binding molecules
US11274151B2 (en) 2020-03-31 2022-03-15 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha CD3-targeting and DLL3-targeting multispecific antigen-binding molecules and uses thereof
WO2021211753A1 (en) 2020-04-15 2021-10-21 Voyager Therapeutics, Inc. Tau binding compounds
WO2021214460A1 (en) 2020-04-22 2021-10-28 Petmedix Ltd Heterodimeric proteins
WO2021220215A1 (en) 2020-05-01 2021-11-04 Novartis Ag Engineered immunoglobulins
US11919956B2 (en) 2020-05-14 2024-03-05 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind prostate specific membrane antigen (PSMA) and CD3
WO2021235537A1 (ja) 2020-05-22 2021-11-25 中外製薬株式会社 凝固第ｖｉｉｉ因子（ｆ．ｖｉｉｉ）機能代替活性を有する物質を中和する抗体
WO2021260528A1 (en) 2020-06-23 2021-12-30 Novartis Ag Dosing regimen comprising 3-(1-oxoisoindolin-2-yl)piperidine-2,6-dione derivatives
WO2022013787A1 (en) 2020-07-16 2022-01-20 Novartis Ag Anti-betacellulin antibodies, fragments thereof, and multi-specific binding molecules
WO2022026592A2 (en) 2020-07-28 2022-02-03 Celltas Bio, Inc. Antibody molecules to coronavirus and uses thereof
WO2022025220A1 (ja) 2020-07-31 2022-02-03 中外製薬株式会社 キメラ受容体を発現する細胞を含む医薬組成物
WO2022029573A1 (en) 2020-08-03 2022-02-10 Novartis Ag Heteroaryl substituted 3-(1-oxoisoindolin-2-yl)piperidine-2,6-dione derivatives and uses thereof
US11591401B2 (en) 2020-08-19 2023-02-28 Xencor, Inc. Anti-CD28 compositions
US11919958B2 (en) 2020-08-19 2024-03-05 Xencor, Inc. Anti-CD28 compositions
WO2022045276A1 (ja) 2020-08-28 2022-03-03 中外製薬株式会社 ヘテロ二量体Ｆｃポリペプチド
WO2022043558A1 (en) 2020-08-31 2022-03-03 Advanced Accelerator Applications International Sa Method of treating psma-expressing cancers
WO2022043557A1 (en) 2020-08-31 2022-03-03 Advanced Accelerator Applications International Sa Method of treating psma-expressing cancers
WO2022097060A1 (en) 2020-11-06 2022-05-12 Novartis Ag Cd19 binding molecules and uses thereof
WO2022097061A1 (en) 2020-11-06 2022-05-12 Novartis Ag Anti-cd19 agent and b cell targeting agent combination therapy for treating b cell malignancies
WO2022104061A1 (en) 2020-11-13 2022-05-19 Novartis Ag Combination therapies with chimeric antigen receptor (car)-expressing cells
WO2022162569A1 (en) 2021-01-29 2022-08-04 Novartis Ag Dosage regimes for anti-cd73 and anti-entpd2 antibodies and uses thereof
WO2022184659A1 (en) 2021-03-01 2022-09-09 Quadrucept Bio Limited Antibody domains & multimers
US11739144B2 (en) 2021-03-09 2023-08-29 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind CD3 and CLDN6
US11859012B2 (en) 2021-03-10 2024-01-02 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind CD3 and GPC3
WO2022215011A1 (en) 2021-04-07 2022-10-13 Novartis Ag USES OF ANTI-TGFβ ANTIBODIES AND OTHER THERAPEUTIC AGENTS FOR THE TREATMENT OF PROLIFERATIVE DISEASES
WO2022223001A1 (zh) 2021-04-22 2022-10-27 广东菲鹏制药股份有限公司 双特异性多功能融合多肽
WO2022243846A1 (en) 2021-05-18 2022-11-24 Novartis Ag Combination therapies
US11970538B2 (en) 2021-05-20 2024-04-30 Compass Therapeutics Llc Multispecific binding constructs against checkpoint molecules and uses thereof
WO2022270611A1 (ja) 2021-06-25 2022-12-29 中外製薬株式会社 抗ｃｔｌａ－４抗体
WO2022270612A1 (ja) 2021-06-25 2022-12-29 中外製薬株式会社 抗ｃｔｌａ－４抗体の使用
WO2023044483A2 (en) 2021-09-20 2023-03-23 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for the treatment of her2 positive cancer
WO2023092004A1 (en) 2021-11-17 2023-05-25 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for the treatment of tau-related disorders
WO2023150778A1 (en) 2022-02-07 2023-08-10 Visterra, Inc. Anti-idiotype antibody molecules and uses thereof
WO2023209568A1 (en) 2022-04-26 2023-11-02 Novartis Ag Multispecific antibodies targeting il-13 and il-18
WO2023220695A2 (en) 2022-05-13 2023-11-16 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for the treatment of her2 positive cancer
WO2024020429A1 (en) 2022-07-22 2024-01-25 Lyell Immunopharma, Inc. Immune cell therapy
WO2024030976A2 (en) 2022-08-03 2024-02-08 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for crossing the blood brain barrier
WO2024059739A1 (en) 2022-09-15 2024-03-21 Voyager Therapeutics, Inc. Tau binding compounds

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