ES2886569T3 - Anticuerpos biespecíficos específicos para PD1 y TIM3 - Google Patents

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Pablo Umana
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Abstract

Un anticuerpo biespecífico que comprende un primer sitio de unión a antígeno que se une específicamente a PD1 y un segundo sitio de unión a antígeno que se une específicamente a TIM3, en el que dicho primer sitio de unión a antígeno que se une específicamente a PD1 comprende (a) un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 43 y un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 44, o (b) un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 45 y un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 46, o (c) un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 45 y un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 47, o (d) un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 45 y un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 48, o (e) un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 45 y un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 49; y dicho segundo sitio de unión a antígeno que se une específicamente a TIM3 comprende (a) un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 23 y un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 24, o (b) un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 25 y un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 26, o (c) un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 27 y un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 28.

Description

DESCRIPCIÓN
Anticuerpos biespecíficos específicos para PD1 y TIM3
Campo de la invención
La invención se refiere a anticuerpos biespecíficos que comprenden un primer sitio de unión a antígeno que se une específicamente a PD1 y un segundo sitio de unión a antígeno que se une específicamente a TIM3, en particular a anticuerpos biespecíficos, en los que el anticuerpo biespecífico se une a TIM3 con una afinidad de unión menor cuando se compara con la unión a PD1. La invención se refiere además a procedimientos de producción de estas moléculas y a procedimientos de uso de las mismas.
Antecedentes
La importancia del sistema inmunitario en la protección frente al cáncer se basa en su capacidad para detectar y destruir células anómalas. Sin embargo, algunas células tumorales pueden escapar del sistema inmunitario generando un estado de inmunosupresión (Zitvogel et al., Nature Reviews Immunology 6 (2006), 715-727). Un ejemplo de un mecanismo de inmunosupresión presente en huéspedes que portan tumores es la promoción de disfunción o agotamiento de linfocitos T. Los linfocitos T han sido el foco principal de los esfuerzos para manipular terapéuticamente la inmunidad antitumoral endógena debido a su capacidad para el reconocimiento selectivo de péptidos derivados de proteínas en todos los compartimentos celulares; su capacidad para reconocer y destruir directamente las células que expresan antígenos (por linfocitos T efectores CD8+; también conocidos como linfocitos T citotóxicos (CTL)) y su capacidad para orquestar diversas respuestas inmunitarias (por linfocitos T cooperadores CD4+), lo que integra mecanismos efectores adaptativos e innatos. Los linfocitos T agotados no proliferan ni ejercen funciones efectoras tales como citotoxicidad y secreción de citocinas en respuesta a la estimulación antigénica. Otros estudios identificaron que los linfocitos T agotados se caracterizan por la expresión mantenida de la molécula inhibidora PD-1 (proteína de muerte celular programada 1) y que el bloqueo de las interacciones de PD-1 y PD-L1 (ligando de PD-1) puede invertir el agotamiento de linfocitos T y restaurar las respuestas de linfocitos T específicas de antígeno en ratones infectados con LCMV (Barber et al., Nature 439 (2006), 682-687). Sin embargo, seleccionar la vía PD-1-PD-L1 sola no siempre da como resultado la inversión del agotamiento de linfocitos T (Gehring et al., Gastroenterology 137 (2009), 682-690), lo que indica que es probable que otras moléculas estén implicadas en el agotamiento de linfocitos T (Sakuishi, J. Experimental Med.207 (2010), 2187-2194).
TIM-3 es una molécula identificada originalmente como expresada selectivamente en linfocitos Th1 y Tc1 que secretan IFN-y (Monney et al., Nature 415 (2002), 536-541). La interacción de TIM-3 con su ligando, galectina-9, desencadena la muerte celular en linfocitos T TIM-3+. Por tanto, tanto TIM-3 como PD-1 pueden funcionar como reguladores negativos de respuestas de linfocitos T. Se ha demostrado que TIM-3 DK/25.08.2016 marca la población más suprimida o disfuncional de linfocitos T CD8+ en modelos preclínicos de neoplasia maligna tanto sólida como hematológica (Sakuishi, J. Experimental Med. 207 (2010), 2187-2194; Zhou, Blood 117 (2011), 4501­ 4510; Majeti R et al., PnAs , 106 (2009), 3396-3401). En estos modelos, todos los linfocitos T Cd 8+ TIM-3+ coexpresan PD1, y estas células de expresión doble presentan mayores defectos tanto en progresión del ciclo celular como en producción de citocinas efectoras [interleucina (IL)-2, TNF e IFN-y] que las células que expresan PD1 sola. Por tanto, la vía TIM-3 puede cooperar con la vía PD-1 para promover el desarrollo de un fenotipo disfuncional grave en linfocitos T CD8+ en cáncer. Por tanto, se espera que la selección combinada de las vías TIM-3 y PD1 sea altamente eficaz para controlar el crecimiento tumoral.
TIM3 es una proteína humana que pertenece a la superfamilia de inmunoglobulinas y a la familia de proteínas TIM. En seres humanos, al igual que en ratones, TIM-3 se expresa en linfocitos T así como en células fagocíticas tales como macrófagos y células dendríticas. La unión de TIM3 a un ligando proteico (por ejemplo, galectina-9) puede inhibir la respuesta Th1 por medio del mecanismo de inducción de apoptosis, y por lo tanto dar lugar a inducción de tolerancia periférica. La reducción en la expresión de TIM3 humana con ARNip o la inhibición de TIM3 humana por anticuerpo de bloqueo incrementó la secreción de interferón alfa de linfocitos T CD4 positivos, lo que apoya el papel inhibidor de TIM3 en linfocitos T humanos. En fagocitos, TIM3 también funciona como receptor para reconocer las células apoptóticas. El análisis de muestras clínicas de pacientes con enfermedades autoinmunitarias no mostró expresión de TIM3 en células CD4 positivas. En particular, en clones de linfocitos T derivados del líquido cefalorraquídeo de pacientes con esclerosis múltiple, el nivel de expresión de TIM3 fue menor y el nivel de secreción de IFN-gamma fue mayor que el de los clones derivados de personas sanas normales (Koguchi K et al., J Exp Med. 203 (2006), 1413-1418). Existen informes sobre la relación de TIM-3 con enfermedades alérgicas o asma (documentos WO 96/27603 y WO2003/063792).
Los ejemplos de anticuerpos monoclonales anti-TIM3 incluyen anticuerpo monoclonal de rata anti-TIM3 humana (clon 344823, fabricado por R&D Systems) y anticuerpo monoclonal de ratón anti-TIM-3 humana (clon F38-2E2, fabricado por R&D Systems). El documento WO2013/06490 se refiere a anticuerpos anti-TIM3 que muestran una rápida internalización e inmunoconjugados de los mismos para tratar cáncer y reducir la inflamación. El documento US2012/189617 se refiere a anticuerpos anti-TIM-3 que presentan mayor actividad efectora tal como una citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (actividad ADCC) para enfermedades relacionadas con una célula que expresa TIM-3 humana.
La proteína de muerte celular programada 1 (PD-1 o CD279) es un miembro inhibidor de la familia de receptores CD28, que también incluye c D28, CTLA-4, ICOS y BTLA. PD-1 es un receptor de superficie celular y se expresa en células mieloides, linfocitos T y linfocitos B activados (Okazaki et al (2002) Curr. Opin. Immunol. 14: 391779­ 82; Bennett et al. (2003) J Immunol 170:711-8). La estructura de PD-1 es una proteína transmembranaria de tipo 1 monomérica, que consiste en un dominio extracelular de tipo variable de inmunoglobulina y un dominio citoplásmico que contiene un motivo inhibidor basado en tirosina del inmunorreceptor (ITIM) y un motivo de intercambio basado en tirosina del inmunorreceptor (ITSM). Los linfocitos T activados expresan de forma transitoria PD1, pero la hiperexpresión mantenida de PD1 y su ligando PDL1 promueven el agotamiento inmunitario, dando lugar a persistencia de infecciones víricas, evasión tumoral, incremento de infecciones y mortalidad. La expresión de PD1 se induce por el reconocimiento de antígenos por medio del receptor de linfocitos T y su expresión se mantiene principalmente a través de la señalización del receptor de linfocitos T continua. Después de una exposición a antígenos prolongada, el locus de PD1 no se remetila, lo que promueve una hiperexpresión continua. El bloqueo de la vía PD1 puede restaurar la funcionalidad de linfocitos T agotada en cáncer e infecciones víricas crónicas (Sheridan, Nature Biotechnology 30 (2012), 729-730). Se han descrito anticuerpos monoclonales frente a PD-1, por ejemplo, en los documentos WO 2003/042402, WO 2004/004771, WO 2004/056875, WO 2004/072286, WO 2004/087196, WO 2006/121168, WO 2006/133396, WO 2007/005874, WO 2008/083174, WO 2008/156712, WO 2009/024531, WO 2009/014708, WO 2009/101611, WO 2009/114335, WO 2009/154335, WO 2010/027828, WO 2010/027423, WO 2010/029434, WO 2010/029435, WO 2010/036959, WO 2010/063011, WO 2010/089411, WO 2011/066342, WO 2011/110604, WO 2011/110621, WO 2012/145493, WO 2013/014668, WO 2014/179664 y WO 2015/112900.
También se ha demostrado que el bloqueo tanto de PD1 como TIM3 puede restaurar las respuestas inmunitarias antibacterianas, por ejemplo en pacientes con hepatitis alcohólica aguda (AAH). Los linfocitos de estos pacientes expresan niveles altos de receptores inhibidores inmunitarios, producen niveles menores de interferón gamma y tienen un incremento en la producción de IL10 debido a la exposición a endotoxinas crónica. Estos efectos se pueden invertir bloqueando PD1 y TIM3, lo que incrementa las actividades antimicrobianas de linfocitos T y neutrófilos (Markwick et al, Gastroenterology 148 (2015), 590-602).
Los anticuerpos biespecíficos frente a TIM3 y PD1 para inmunoterapia en afecciones inmunitarias crónicas ya se han descrito en el documento WO 2011/159877. Sin embargo, existe la necesidad de proporcionar nuevos anticuerpos biespecíficos que no solo se unan simultáneamente a PD1 y TIM3 y por tanto seleccionen selectivamente linfocitos T que expresan tanto PD1 como TIM3, sino que también eviten el bloqueo de TIM3 en otras células tales como células inmunitarias innatas, por ejemplo, monocitos y células dendríticas (DC) indiferenciadas. Los anticuerpos biespecíficos de la presente invención no solo bloquean eficazmente PD1 y Tim3 en linfocitos T que sobreexpresan tanto PD1 como TIM3, son muy selectivos para estas células y de este modo se pueden evitar los efectos secundarios administrando anticuerpos frente a TIM3 altamente activos.
Sumario de la invención
En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo biespecífico que comprende un primer sitio de unión a antígeno que se une específicamente a PD1 y un segundo sitio de unión a antígeno que se une específicamente a TIM3, en el que
dicho primer sitio de unión a antígeno que se une específicamente a PD1 comprende
(a) un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 43 y un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 44, o
(b) un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 45 y un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 46, o
(c) un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 45 y un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 47, o
(d) un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 45 y un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 48, o
(e) un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 45 y un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 49,
y dicho segundo sitio de unión a antígeno que se une específicamente a TIM3 comprende
(a) un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 23 y un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 24, o
(b) un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 25 y un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 26, o
(c) un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 27 y un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 28.
En un aspecto, el anticuerpo biespecífico que comprende un primer sitio de unión a antígeno que se une específicamente a PD1 y un segundo sitio de unión a antígeno que se une específicamente a TIM3 es bivalente.
En otro aspecto, se proporciona un anticuerpo biespecífico que comprende un primer sitio de unión a antígeno que se une específicamente a PD1 y un segundo sitio de unión a antígeno que se une específicamente a TIM3, en el que el anticuerpo biespecífico se une a TIM3 con baja afinidad y se une a PD1 con alta afinidad. En un aspecto particular, la invención proporciona un anticuerpo biespecífico que comprende un primer sitio de unión a antígeno que se une específicamente a PD1 y un segundo sitio de unión a antígeno que se une específicamente a TIM3, en el que el anticuerpo biespecífico se une a TIM3 con una afinidad de unión al menos 50 veces menor cuando se compara con la unión a PD1, más en particular con una afinidad de unión al menos 100 veces menor cuando se compara con la unión a PD1. En un modo de realización preferente, la afinidad de unión (KD) se determina con el ensayo de resonancia de plasmón superficial (como se describe, por ejemplo, en el ejemplo 12).
Más en particular, se proporciona un anticuerpo biespecífico que comprende un primer sitio de unión a antígeno que se une específicamente a PD1 y un segundo sitio de unión a antígeno que se une específicamente a TIM3, en el que dicho primer sitio de unión a antígeno que se une específicamente a PD1 comprende un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 45 y un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 46, y dicho segundo sitio de unión a antígeno que se une específicamente a TIM3 comprende un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 25 y un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 26.
En un aspecto particular, la invención proporciona un anticuerpo biespecífico que comprende un primer sitio de unión a antígeno que se une específicamente a PD1 y un segundo sitio de unión a antígeno que se une específicamente a TIM3, en el que el anticuerpo biespecífico se une a TIM3 con una afinidad de unión al menos 50 veces menor cuando se compara con la unión a PD1, más en particular con una afinidad de unión al menos 100 veces menor cuando se compara con la unión a PD1.
En otro aspecto, el anticuerpo biespecífico que comprende un primer sitio de unión a antígeno que se une específicamente a PD1 y un segundo sitio de unión a antígeno que se une específicamente a TIM3 es un anticuerpo humano, humanizado o quimérico. En particular, es un anticuerpo humanizado o quimérico.
En otro aspecto, la invención se refiere a un anticuerpo biespecífico que comprende un primer sitio de unión a antígeno que se une específicamente a PD1 y un segundo sitio de unión a antígeno que se une específicamente a TIM3, en el que el anticuerpo biespecífico comprende un dominio Fc, un primer fragmento Fab que comprende el sitio de unión a antígeno que se une específicamente a PD1 y un segundo fragmento Fab que comprende el sitio de unión a antígeno que se une específicamente a TIM3.
En particular, el dominio Fc es un dominio de IgG, más en particular un dominio Fc de IgG1 o un dominio Fc de IgG4.
En un aspecto, la invención se refiere a un anticuerpo biespecífico que comprende un primer sitio de unión a antígeno que se une específicamente a PD1 y un segundo sitio de unión a antígeno que se une específicamente a TIM3, en el que el dominio Fc comprende una o más sustituciones aminoacídicas que reducen la unión a un receptor de Fc, en particular hacia el receptor de Fcy. En particular, el dominio Fc es de la subclase IgG1 humana con las mutaciones aminoacídicas L234A, L235A y P329G (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat).
En otro aspecto, la invención se refiere a un anticuerpo biespecífico que comprende un primer sitio de unión a antígeno que se une específicamente a PD1 y un segundo sitio de unión a antígeno que se une específicamente a TIM3, en el que el dominio Fc comprende una modificación que promueve la asociación de la primera y segunda subunidad del dominio Fc.
En un aspecto, la invención se refiere a un anticuerpo biespecífico que comprende un primer sitio de unión a antígeno que se une específicamente a PD1 y un segundo sitio de unión a antígeno que se une específicamente a TIM3, en el que la primera subunidad del dominio Fc comprende botones y la segunda subunidad del dominio Fc comprende ojales de acuerdo con el procedimiento de botones en ojales. En un aspecto particular, la primera subunidad del dominio Fc comprende las sustituciones aminoacídicas S354C y T366W (numeración EU) y la segunda subunidad del dominio Fc comprende las sustituciones aminoacídicas Y349C, T366S e Y407V (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat).
En un aspecto adicional, la invención se refiere a un anticuerpo biespecífico que comprende un primer sitio de unión a antígeno que se une específicamente a PD1 y un segundo sitio de unión a antígeno que se une específicamente a TIM3, en el que en uno de los fragmentos Fab los dominios variables VL y VH se reemplazan entre sí de modo que el dominio VH es parte de la cadena ligera y el dominio VL es parte de la cadena pesada. En un aspecto particular, el anticuerpo biespecífico es uno, en el que en el primer fragmento Fab que comprende el sitio de unión a antígeno que se une específicamente a PD1 los dominios variables VL y VH se reemplazan entre sí.
En otro aspecto, la invención se refiere a un anticuerpo biespecífico que comprende un primer sitio de unión a antígeno que se une específicamente a PD1 y un segundo sitio de unión a antígeno que se une específicamente a TIM3, en el que en uno de los fragmentos Fab en el dominio constante CL el aminoácido en la posición 124 se sustituye independientemente por lisina (K), arginina (R) o histidina (H) (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat), y en el dominio constante CH1 los aminoácidos en las posiciones 147 y 213 se sustituyen independientemente por ácido glutámico (E) o ácido aspártico (D) (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat). En un aspecto particular, el anticuerpo biespecífico es uno, en el que en el segundo fragmento Fab que comprende el sitio de unión a antígeno que se une específicamente a TIM3 en el dominio constante CL el aminoácido en la posición 124 se sustituye independientemente por lisina (K), arginina (R) o histidina (H) (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat), y en el dominio constante CH1 los aminoácidos en las posiciones 147 y 213 se sustituyen independientemente por ácido glutámico (E) o ácido aspártico (D) (numeración de acuerdo con índice EU de Kabat).
En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo biespecífico que comprende un primer sitio de unión a antígeno que se une específicamente a PD1 y un segundo sitio de unión a antígeno que se une específicamente a TIM3, que comprende
(a) una primera cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 95 % de identidad de secuencia con la secuencia de SEQ ID NO: 50, una primera cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 95 % de identidad de secuencia con la secuencia de SEQ ID NO: 52,
una segunda cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 95 % de identidad de secuencia con la secuencia de SEQ ID NO: 51, y una segunda cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 95 % de identidad de secuencia con la secuencia de SEQ ID NO:53, o
(b) una primera cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 95 % de identidad de secuencia con la secuencia de SEQ ID NO: 62, una primera cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 95 % de identidad de secuencia con la secuencia de SEQ ID NO: 64,
una segunda cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 95 % de identidad de secuencia con la secuencia de SEQ ID NO: 63, y una segunda cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 95 % de identidad de secuencia con la secuencia de SEQ ID NO:65.
En un aspecto particular, la invención proporciona un anticuerpo biespecífico que comprende un primer sitio de unión a antígeno que se une específicamente a PD1 y un segundo sitio de unión a antígeno que se une específicamente a TIM3, que comprende
(a) una primera cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 50, una primera cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 52,
una segunda cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 51, y una segunda cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:53, o
(b) una primera cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 62, una primera cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 64,
una segunda cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 63, y una segunda cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:65.
De acuerdo con otro aspecto de la invención, se proporciona un polinucleótido que codifica el anticuerpo biespecífico como se describe en el presente documento anteriormente. La invención proporciona además un vector, en particular un vector de expresión, que comprende un polinucleótido de la invención y una célula huésped procariota o eucariota que comprende el polinucleótido o el vector de la invención. En algunos modos de realización, la célula huésped es una célula eucariota, en particular una célula de mamífero.
En otro aspecto, se proporciona un procedimiento para producir un anticuerpo biespecífico que comprende un primer sitio de unión a antígeno que se une específicamente a PD1 y un segundo sitio de unión a antígeno que se une específicamente a TIM3 como se describe en el presente documento, que comprende las etapas de a) transformar una célula huésped con vectores que comprenden polinucleótidos que codifican dicho anticuerpo biespecífico, b) cultivar la célula huésped de acuerdo con condiciones adecuadas para la expresión del anticuerpo biespecífico y c) recuperar el anticuerpo biespecífico del cultivo. La invención también engloba un anticuerpo biespecífico producido por el procedimiento de la invención.
La invención proporciona además una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo biespecífico que comprende un primer sitio de unión a antígeno que se une específicamente a PD1 y un segundo sitio de unión a antígeno que se une específicamente a TIM3 como se describe en el presente documento, y al menos un excipiente farmacéuticamente aceptable.
También se engloba por la invención el anticuerpo biespecífico que comprende un primer sitio de unión a antígeno que se une específicamente a PD1 y un segundo sitio de unión a antígeno que se une específicamente a TIM3 como se describe en el presente documento, o la composición farmacéutica que comprende el anticuerpo biespecífico, para su uso como medicamento.
En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo biespecífico que comprende un primer sitio de unión a antígeno que se une específicamente a PD1 y un segundo sitio de unión a antígeno que se une específicamente a TIM3 como se describe en el presente documento, o la composición farmacéutica que comprende el anticuerpo biespecífico, para su uso
i) en la modulación de respuestas inmunitarias, tales como restaurar la actividad de linfocitos T,
ii) en estimular de una función o respuesta inmunitaria,
iii) en el tratamiento de infecciones,
iv) en el tratamiento de cáncer,
v) en retrasar la progresión de cáncer,
vi) en prolongar la supervivencia de un paciente que padece cáncer.
En un aspecto, se proporciona el anticuerpo biespecífico que comprende un primer sitio de unión a antígeno que se une específicamente a PD1 y un segundo sitio de unión a antígeno que se une específicamente a TIM3 como se describe en el presente documento, o la composición farmacéutica que comprende el anticuerpo biespecífico, para su uso en el tratamiento de una enfermedad en un individuo que lo necesita. En un aspecto específico, la invención proporciona un anticuerpo biespecífico que comprende un primer sitio de unión a antígeno que se une específicamente a PD1 y un segundo sitio de unión a antígeno que se une específicamente a TIM3, o la composición farmacéutica que comprende el anticuerpo biespecífico, para su uso en el tratamiento de cáncer. En otro aspecto específico, se proporciona un anticuerpo biespecífico que comprende un primer sitio de unión a antígeno que se une específicamente a PD1 y un segundo sitio de unión a antígeno que se une específicamente a TIM3, o la composición farmacéutica que comprende el anticuerpo biespecífico, para su uso en la modulación de respuestas inmunitarias. En otro aspecto, se proporciona un anticuerpo biespecífico que comprende un primer sitio de unión a antígeno que se une específicamente a PD1 y un segundo sitio de unión a antígeno que se une específicamente a TIM3, o una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo biespecífico para su uso en el tratamiento de una infección vírica crónica.
También se proporciona el uso del anticuerpo biespecífico que comprende un primer sitio de unión a antígeno que se une específicamente a PD1 y un segundo sitio de unión a antígeno que se une específicamente a TIM3 como se describe en el presente documento para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad en un individuo que lo necesita, en particular para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de cáncer, así como un procedimiento de tratamiento de una enfermedad en un individuo, que comprende administrar a dicho individuo una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición que comprende el anticuerpo biespecífico que comprende un primer sitio de unión a antígeno que se une específicamente a PD1 y un segundo sitio de unión a antígeno que se une específicamente a TIM3 como se describe en el presente documento en una forma farmacéuticamente aceptable. En un aspecto específico, la enfermedad es cáncer. En otro aspecto específico, la enfermedad es una infección vírica crónica. En otro aspecto, se proporciona un procedimiento de modulación de respuestas inmunitarias en un individuo, que comprende administrar a dicho individuo una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición que comprende el anticuerpo biespecífico que comprende un primer sitio de unión a antígeno que se une específicamente a PD1 y un segundo sitio de unión a antígeno que se une específicamente a TIM3 como se describe en el presente documento en una forma farmacéuticamente aceptable. En cualquiera de los aspectos anteriores, el individuo es preferentemente un mamífero, en particular un ser humano.
La invención también proporciona un anticuerpo biespecífico que comprende un primer sitio de unión a antígeno que se une específicamente a PD1 y un segundo sitio de unión a antígeno que se une específicamente a TIM3 como se describe en el presente documento, o una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo biespecífico para su uso en la prevención o tratamiento de cáncer, en el que el anticuerpo biespecífico se administra en combinación con un agente quimioterápico, radiación y/u otros agentes para uso en inmunoterapia contra el cáncer.
Además, se proporciona un procedimiento de inhibición del crecimiento de células tumorales en un individuo que comprende administrar al individuo una cantidad eficaz de un anticuerpo biespecífico que comprende un primer sitio de unión a antígeno que se une específicamente a PD1 y un segundo sitio de unión a antígeno que se une específicamente a TIM3 como se describe en el presente documento para inhibir el crecimiento de las células tumorales. El individuo es preferentemente un mamífero, en particular un ser humano.
Breve descripción de los dibujos
Figura 1: el bloqueo de PD1 con PD1-0103 quimérico potencia fuertemente la secreción de IFN-gamma por linfocitos T humanos primarios estimulados alogénicos.
Figura 2: el bloqueo de PD1 con PD1-0103 quimérico incrementa fuertemente la secreción de interferón-gamma (TFN-y) por linfocitos T humanos primarios estimulados alogénicos.
Figura 3: el bloqueo de PD1 con PD1-0103 quimérico incrementa fuertemente la secreción del factor de necrosis tumoral alfa (TNF) por linfocitos T humanos primarios estimulados alogénicos.
Figura 4: 4A) frecuencia de linfocitos T CD4 que producen granzima B y 4B) cantidad de IFN-y detectado por absorbancia (densidad óptica, D.O.) en el sobrenadante de la MLR en presencia de concentraciones crecientes de diferentes anticuerpos anti-PD-1
Figura 5: 5A) impacto del bloqueo de PD1/PD-L1 sobre la reactivación de la señalización del receptor de linfocitos T suprimido en presencia de diferentes anticuerpos anti-PD-1 5B) impacto del bloqueo de PD1/PD-L1 sobre la reactivación de la señalización del receptor de linfocitos T suprimido en presencia de diferentes anticuerpos anti-PD-1
Figura 6: esquema del ensayo FRET para unión simultánea de anticuerpos biespecíficos anti-PD1/Tim3 a células recombinantes
Figura 7: inducción de FRET tras tratamiento/unión de diferentes anticuerpos frente a PD1TIM3 biespecíficos en células que expresan PD1 y TIM3: se tiñeron células HEK293, doblemente transfectadas con p D1-SNAP Tim3-CLIP, con SNAP-Lumi4-Tb (Cisbio) 100 nM y Clip-Red (Cisbio) 100 nM durante 1 h a 37 °C en tampón Tag-Lite (Cisbio). Después del lavado, se incubaron las células marcadas con los anticuerpos anti-PD1/Tim3 biespecíficos indicados [0-10 nM] (variantes biespecíficas humanizadas mostradas en la figura 7B) durante 1 h a 4 °C antes de que se midiera la fluorescencia con resolución temporal a 665/620 nm con un lector BMG Pherastar (se representa la media /- D.E. de la señal FRET [proporción 665/620 nm * 10.000], n=3).7A: formatos 1 1 (anticuerpos PD1TIM3_0389 y PD1TIM3_0168) en comparación con construcciones 2+2 (PD1TIM3_0358+PD1TIM3_0359) 7B: variantes biespecíficas humanizadas (PD1TIM3_0476 y PD1TIM3_477)
Figura 8: ensayo FRET para unión simultánea del anticuerpo biespecífico anti-PD1/TIM3 1 1
PD1TIM3-0168: Se marcaron células PD1 marcadas con SNAP y TIM3 marcadas con CLIP (como se describe anteriormente) con SNAP-Lumi4-Tb 100 nM y Clip-Red 100 nM. Después del lavado, se incubaron las células marcadas con el anticuerpo anti-PD1/TIM3 biespecífico n.° 0168 [a las concentraciones indicadas] durante 1 h a 4 °C antes de que se midiera la fluorescencia con resolución temporal a 665/620 nm con un lector BMG Pherastar (líneas negras). Para destacar la especificidad de la señal FRET inducida por anticuerpo biespecífico, se añadieron un anticuerpo monoclonal anti-PD1 (n.° 0165; figura 8A) o bien un anticuerpo de bloqueo anti-TIM3 (n.° 0018, figura 8B) para competencia dando como resultado una prevención casi completa de la señal FRET (curvas grises). El tratamiento con un anticuerpo anti-PD1 solo no dio como resultado la inducción de FRET (líneas discontinuas, solo diagrama izquierdo).
Figura 9A: AB biespecífico 1 1 PD1TIM3-0389 muestra la misma proporción de unión a linfocitos T CD4+ positivos (PD1+, TIM3+) que TIM3_0028 quimérico (chi0028) y TIM3-0438 humanizado (0438), pero menos unión a monocitos, linfocitos NK y linfocitos T CD3+.
Figura 9B: AB biespecífico 1 1 PD1TIM3-0389 muestra un incremento significativo en MFI para la unión a linfocitos T CD4+ positivos (PD1+, TIM3+) que TIM3_0028 quimérico (chi0028) y Tim3-0438 humanizado (0438).
Figura 9C: AB biespecífico 1 1 PD1TIM3-0168 sin diferencias con respecto a la unión a linfocitos T CD4+ positivos (PD1+, TIM3+) que TIM3_0018 quimérico (Tim3-chi0018) y TIM3-0434 humanizado (0434).
Figura 9D: AB biespecífico 1 1 PD1TIM3-0168 muestra solo un ligero incremento en MFI para la unión a linfocitos T CD4+ positivos (PD1+, Tim3+).
Figura 9E y figura 9F: anticuerpo anti-TIM3 TIM3-0038 muestra la unión tanto a monocitos como a linfocitos T CD4+.
Figura 9G y figura 9H: AB biespecífico 1+1 PD1TIM3-0166 (en base a PD1-0103//Tim3-0038 quimérico) muestra una fuerte reducción en la unión a monocitos (en comparación con anticuerpo anti-TIM3 original TIM3_0038, véanse las figuras 4E y 4F) mientras conserva una unión fuerte a linfocitos T CD4+.
Figuras 10A a 10D: AB biespecífico 1 1 PD1TIM3-0166 (en base a PD1-0103//TIM3-0038 quimérico) mostró una reducción en la internalización en comparación con biespecífico 2+2 PD1TIM3-0321 (también en base al PD1-0103//TIM3-0038 quimérico, pero teniendo dos sitios de unión a antígeno para PD y dos para TIM3) y en comparación con anticuerpo TIM3-0038 original en linfocitos T CD4+ activados y en linfocitos NK activados
Figura 11A: el análisis con el tiempo muestra mayor localización de membrana en ambos anticuerpos biespecíficos y frente a PD1 cuando se compara con la agrupación intracelular de anticuerpos frente a TIM3. Designaciones de anticuerpos en la figura TIM3 (chil8-A647 = TIM3_o018 quimérico marcado con AlexaA647), a-TIM3 (chi28-A647 = TIM3_0028 quimérico marcado con AlexaA647), biespec. (0168-A647 =1 1 PD1TIM3_0168 (en base a PD1-0103 / TIM3-0018 quimérico) marcado con AlexaA647) biespec. (0389-A647= 1+1 PD1TIM3_0389 (en base a PD1-0103 / TIM3-0028 quimérico) marcado con Alexa 647) y a-PD1 (0165-A488 = PD1-0103 quimérico marcado con Alexa488). El anti-PD1 y biespecífico 1 1 PD1TIM3_0389 (biespec. 0389) muestran solo internalización muy lenta, incluso después de 3 h, mientras que la internalización para el otro biespecífico 1 1 PD1TIM3_0168 (biespec. 0168) es más fuerte. La internalización más fuerte se muestra por Ab aTIM3-0028, la mayor internalización se muestra por aTIM3-0018.
Figura 11B: PD1-0103 quimérico (aPD1-0165) muestra solo internalización débil, mientras que TIM3_0018 quimérico (aTim3-chi18) de alta afinidad se internaliza fuertemente tras la unión de TIM3, incluso después de 15 minutos. La internalización para la proteína fijadora de baja afinidad TIM3_o028 quimérico (aTIM3-chi28) se reduce ligeramente. El AB biespecífico 1 1 AB 0168 (compuesto de proteína fijadora de alta afinidad aPD1-0165 y aTIM3-0018 de alta afinidad) muestra una internalización más reducida. El a B biespecífico 1 1 AB 0389 (compuesto de proteína fijadora de alta afinidad PD1-0103 quimérico (aPD1-0165) y TIM3_0028 quimérico de baja afinidad (aTIM3-0028) muestra una internalización reducida muy fuerte. Esto se podría deber a la unión bivalente a PD1 y TIM3, donde la unión con alta afinidad a PD1 conserva el anticuerpo en la superficie celular.
Figura 12A: potencia del anticuerpo biespecífico frente a PD1-TIM3 1 1 PD1TIM3_0168 (en base a PD1-0103/TIM3-0018 quimérico (= AB 0168) en comparación con PD1-0103 quimérico (=PD1-0165) y TIM3_0018 quimérico (=TIM3-chi18) y combinaciones de los mismos
Figura 12B: potencia del anticuerpo biespecífico frente a PD1-TIM3 1 1 PD1TIM3_0389 (en base a PD1-0103/TIM3-0028 quimérico (= AB biespec. 0389) en comparación con PD1-0103 quimérico (=PD1-0165) y TIM3_0028 quimérico (=TIM3-chi28) y combinaciones de los mismos
Figura 12C: potencia del anticuerpo biespecífico frente a PD1-TIM3 1 1 PD1-0103 /Ky8213 (en base a PD1-0103 quimérico / y anti-TIM3 Ky8213 quimérico del documento US20120189617 (véase anticuerpo 8213, por ejemplo, ejemplo 33) que se produjo de forma análoga como se describe en el ejemplo 1 como un 1 1 CrossMab) en comparación con PD1-0103 quimérico (=PD1-0165) y anti-TIM3-Ky8213 (del documento US20120189617 (véase anticuerpo 8213), por ejemplo, ejemplo 33) y combinaciones de los mismos
Figura 12D: potencia del anticuerpo biespecífico frente a PD1-TIM3 1 1 PD1TIM3_0389 (en base a PD1-0103/TIM3-0028 quimérico (= AB biespec. 0389 (1+1)) en comparación con el anticuerpo biespecífico frente a PD1-TIM3 2+2 PD1TIm 3_0358 en base a PD1-0103/TIM3-0028 quimérico (= AB biespec. 0358 (2+2)), y PD1-0103 quimérico (=PD1-0165) y TIM3_0028 quimérico (=TIM3-chi28) y combinaciones de los mismos
Figura 13: el tratamiento con anticuerpo biespecífico frente a PD1-TIM3 1 1 PD1TIM3_0476 incrementó significativamente la capacidad de los linfocitos T CD4 para liberar IFN-gamma en comparación con el tratamiento con anticuerpos frente a PD1 o TIM3 solos e incluso en comparación con el tratamiento con una combinación del anticuerpo PD1_0376 y anticuerpo TIM3_0438 original. Se cocultivaron linfocitos T CD4 con una línea celular tumoral que expresa MHCII. Se sometió a prueba el anticuerpo biespecífico frente a PD1-Tim31 1 PD1T iM3_0476 frente a los anticuerpos frente a p D1 aPD1_0376, MDX-1106 (nivolumab) y MK-3475 (pembrolizumab), frente a los anticuerpos frente a TIM3 aTIM3_0438 y Kyowa-8213 (como se divulga en el documento WO 2011/155697) y frente a la combinación de anticuerpo anti-PD1 aPD1_0376 y anticuerpo anti-TIM3 aTIM3_0438.
Figuras 14A y 14B: los resultados de un experimento de eficacia que compara el anticuerpo biespecífico frente a PD1-TIM3 1+1 (0476) con los anticuerpos frente a PD1 o TIM3 solos en ratones hembra inmunodeprimidos (NOG) expuestos a células MKN45 y provistos con PBMC de un donante humano sano se muestran en las figuras 14A y 14B. Los gráficos representan la media de medición de tamaño tumoral (dentro de un grupo de tratamiento), incluyendo el error estándar de la media de tamaño tumoral durante el período de 30 días. Las curvas con el círculo relleno corresponden al crecimiento de tamaño tumoral sin tratamiento (vehículo). En la fig.14A se muestra el crecimiento tumoral con tratamiento con dosis menores (1,5 mg/kg de anticuerpo PD1_0376, 1,5 mg/kg de nivolumab, 1,5 mg/kg de anticuerpo TIM3_0438 o 3 mg/kg de anticuerpo biespecífico 1 1 PD1TIM3_0476), en la fig. 14B se muestra el crecimiento tumoral a dosis mayores(5 mg/kg de anticuerpo PD1_0376, 5 mg/kg de nivolumab, 5 mg/kg de anticuerpo Tim3_0438 o 10 mg/kg de anticuerpo biespecífico 1+1 PD1TIM3_0476).
Descripción detallada de la invención
Definiciones
A menos que se defina de otro modo, los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que se usa en general en la técnica a la que la presente invención pertenece. Para los propósitos de interpretación de la presente memoria descriptiva, se aplicarán las siguientes definiciones y, cuando se apropiado, los términos usados en singular también incluirán el plural y viceversa.
Como se usa en el presente documento, el término "molécula de unión a antígeno" se refiere en su sentido más amplio a una molécula que se une específicamente a un determinante antigénico. Los ejemplos de moléculas de unión a antígeno son anticuerpos, fragmentos de anticuerpo y proteínas de unión a antígeno del andamio.
El término "anticuerpo" en el presente documento se usa en el sentido más amplio y engloba diversas estructuras de anticuerpos, incluyendo pero sin limitarse a anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, anticuerpos monoespecíficos y multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos) y fragmentos de anticuerpo siempre que presenten la actividad de unión a antígeno deseada.
El término "anticuerpo monoclonal" como se usa en el presente documento se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos y/o se unen al mismo epítopo, excepto por posibles anticuerpos variantes, por ejemplo, que contienen mutaciones naturales o que surgen durante la producción de una preparación de anticuerpos monoclonales, estando presentes en general dichas variantes en cantidades escasas. En contraste con las preparaciones de anticuerpos policlonales, que típicamente incluyen anticuerpos diferentes dirigidos frente a diferentes determinantes (epítopos), cada anticuerpo monoclonal de una preparación de anticuerpos monoclonales se dirige frente a un único determinante en un antígeno.
El término anticuerpo "monoespecífico" como se usa en el presente documento indica un anticuerpo que tiene uno o más sitios de unión de los que cada uno se une al mismo epítopo del mismo antígeno. El término "biespecífico" quiere decir que el anticuerpo se puede unir específicamente a al menos dos determinantes antigénicos distintos, por ejemplo, dos sitios de unión formados cada uno por un par de un dominio variable de la cadena pesada (VH) de anticuerpo y un dominio variable de la cadena ligera (VL) de anticuerpo que se unen a diferentes antígenos o a diferentes epítopos en el mismo antígeno. Un anticuerpo biespecífico de este tipo tiene un formato 1 1. Otros formatos de anticuerpo biespecífico son los formatos 2+1 (que comprenden dos sitios de unión para un primer antígeno o epítopo y un sitio de unión para un segundo antígeno o epítopo) o formatos 2+2 (que comprenden dos sitios de unión para un primer antígeno o epítopo y dos sitios para un segundo antígeno o epítopo). Típicamente, un anticuerpo biespecífico comprende dos sitios de unión a antígeno, de los que cada uno es específico para un determinante antigénico diferente.
El término "valente" como se usa en la solicitud actual indica la presencia de un número específico de sitios de unión en una molécula de unión a antígeno. Como tales, los términos "bivalente", "tetravalente" y "hexavalente" indican la presencia de dos sitios de unión, cuatro sitios de unión y seis sitios de unión, respectivamente, en una molécula de unión a antígeno. Los anticuerpos biespecíficos de acuerdo con la invención son al menos "bivalentes" y pueden ser "trivalentes" o "multivalentes" (por ejemplo, "tetravalentes" o "hexavalentes"). En un aspecto particular, los anticuerpos de la presente invención tienen dos o más sitios de unión y son biespecíficos. Es decir, los anticuerpos pueden ser biespecíficos incluso en casos donde existen más de dos sitios de unión (es decir, que el anticuerpo es trivalente o multivalente). En particular, la invención se refiere a anticuerpos bivalentes biespecíficos, que tienen un sitio de unión para cada antígeno al que se unen específicamente.
Los términos "anticuerpo de longitud completa", "anticuerpo intacto" y "anticuerpo completo" se usan en el presente documento de manera intercambiable para referirse a un anticuerpo que tiene una estructura sustancialmente similar a una estructura de anticuerpo natural. "Anticuerpos naturales" se refiere a moléculas de inmunoglobulina naturales con estructuras variables. Por ejemplo, los anticuerpos de clase IgG naturales son glucoproteínas heterotetraméricas de aproximadamente 150.000 daltons, compuestas de dos cadenas ligeras y dos cadenas pesadas que se unen con disulfuro. Desde el extremo N al C, cada cadena pesada tiene una región variable (VH), también llamada dominio pesado variable o dominio variable de la cadena pesada, seguida de tres dominios constantes (CH1, CH2 y CH3), también llamados región constante de la cadena pesada. De forma similar, del extremo N al C, cada cadena ligera tiene una región variable (VL), también llamada dominio ligero variable o dominio variable de la cadena ligera, seguida de un dominio constante de la cadena ligera (CL), también llamado región constante de la cadena ligera. La cadena pesada de un anticuerpo se puede asignar a uno de cinco tipos, llamados a (IgA), 8 (IgD), s (IgE), y (IgG) o |i (IgM), de los que algunos se pueden dividir además en subtipos, por ejemplo, y1 (IgG1), y2 (IgG2), y3 (IgG3), y4 (IgG4), a1 (IgA1) y a2 (IgA2). La cadena ligera de un anticuerpo se puede asignar a uno de dos tipos, llamados kappa ( k ) y lambda (X), en base a la secuencia de aminoácidos de su dominio constante.
Un "fragmento de anticuerpo" se refiere a una molécula distinta de un anticuerpo intacto que comprende una porción de un anticuerpo intacto que se une al antígeno al que se une el anticuerpo intacto. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen pero no se limitan a Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2 ; diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos, fragmentos Fab cruzados; anticuerpos lineales; moléculas de anticuerpo monocatenarias (por ejemplo, scFv); anticuerpos multiespecíficos formados de fragmentos de anticuerpo y anticuerpos de dominio único. Para una revisión de determinados fragmentos de anticuerpo, véase Hudson et al., Nat Med 9, 129-134 (2003). Para una revisión de los fragmentos scFv, véase, por ejemplo, Plückthun, en The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, p. 269-315 (1994); véanse también el documento WO 93/16185; y las patentes de EE. UU. n.° 5.571.894 y 5.587.458. Para un análisis de los fragmentos Fab y F(ab')2 que comprenden residuos del epítopo de unión al receptor de rescate y que tienen un incremento en la semivida in vivo, véase la patente de EE. Uu . n.° 5.869.046. Los diacuerpos son fragmentos de anticuerpo con dos sitios de unión a antígeno que pueden ser bivalentes o biespecíficos, véanse, por ejemplo, los documentos EP 404,097; WO 1993/01161; Hudson et al., Nat Med 9, 129-134 (2003); y Hollinger et al., Proc Natl Acad Sci USA 90, 6444-6448 (1993). También se describen triacuerpos y tetracuerpos en Hudson et al., Nat Med 9, 129-134 (2003). Los anticuerpos de dominio único son fragmentos de anticuerpo que comprenden todo o una porción del dominio variable de la cadena pesada o todo o una porción del dominio variable de la cadena ligera de un anticuerpo. En determinados modos de realización, un anticuerpo de dominio único es un anticuerpo de dominio único humano (Domantis, Inc., Waltham, MA; véase por ejemplo, la patente de EE. UU. n.° 6.248.516 B1). Además, los fragmentos de anticuerpo comprenden polipéptidos monocatenarios que tienen las características de un dominio VH, a saber, que se pueden ensamblar conjuntamente con un dominio VL, o de un dominio VL, a saber, que se pueden ensamblar conjuntamente con un dominio VH a un sitio de unión a antígeno funcional y proporcionar de este modo la propiedad de unión a antígeno de los anticuerpos de longitud completa. Se pueden preparar fragmentos de anticuerpo por diversas técnicas, incluyendo pero sin limitarse a, digestión proteolítica de un anticuerpo intacto, así como la producción por células huésped recombinantes (por ejemplo, E. coli o fago), como se describe en el presente documento.
La digestión con papaína de anticuerpos intactos produce dos fragmentos de unión a antígeno idénticos, llamados fragmentos "Fab" que contienen cada uno los dominios variables de la cadena pesada y ligera y también el dominio constante de la cadena ligera y el primer dominio constante (CH1) de la cadena pesada. Como se usa en el presente documento, por tanto, el término "fragmento Fab" se refiere a un fragmento de anticuerpo que comprende un fragmento de la cadena ligera que comprende un dominio VL y un dominio constante de una cadena ligera (CL), y un dominio VH y un primer dominio constante (CH1) de una cadena pesada. Los fragmentos Fab' difieren de los fragmentos Fab en la adición de unos pocos residuos en el extremo carboxílico del dominio CH1 de la cadena pesada incluyendo una o más cisteínas de la región bisagra de anticuerpo. Fab'-SH son fragmentos Fab' en los que el/los residuo(s) de cisteína de los dominios constantes portan un grupo tiol libre. El tratamiento con pepsina proporciona un fragmento F(ab')2 que tiene dos sitios de combinación con antígeno (dos fragmentos Fab) y una parte de la región Fc.
El término "fragmento cross-Fab" o "fragmento xFab" o "fragmento Fab de entrecruzamiento" se refiere a un fragmento Fab, en el que las regiones variables o bien las regiones constantes de la cadena pesada y ligera se intercambian. Son posibles dos composiciones de cadena diferentes de una molécula Fab de entrecruzamiento y están comprendidas en los anticuerpos biespecíficos de la invención: por un lado, las regiones variables de la cadena pesada y ligera de Fab se intercambian, es decir, la molécula Fab de entrecruzamiento comprende una cadena peptídica compuesta por la región variable de la cadena ligera (VL) y la región constante de la cadena pesada (CH1), y una cadena peptídica compuesta por la región variable de la cadena pesada (VH) y la región constante de la cadena ligera (CL). Esta molécula Fab de entrecruzamiento también se denomina CrossFab (vlvh). Por otro lado, cuando las regiones constantes de la cadena pesada y ligera de Fab se intercambian, la molécula Fab de entrecruzamiento comprende una cadena peptídica compuesta por la región variable de la cadena pesada (VH) y la región constante de la cadena ligera (CL), y una cadena peptídica compuesta por la región variable de la cadena ligera (VL) y la región constante de la cadena pesada (CH1). Esta molécula Fab de entrecruzamiento también se denomina CrossFab (clch1).
Un "fragmento Fab monocatenario" o "scFab" es un polipéptido que consiste en un dominio variable de la cadena pesada (VH) de anticuerpo, un dominio constante 1 (CH1) de anticuerpo, un dominio variable de la cadena ligera (VL) de anticuerpo, un dominio constante de la cadena ligera (CL) de anticuerpo y un conector, en el que dichos dominios de anticuerpo y dicho conector tienen uno de los siguientes órdenes en sentido de N terminal a C terminal: a) VH-CH1-conector-VL-CL, b) VL-CL-conector-VH-CH1, c) VH-CL-conector-VL-CH1 o d) VL-CH1 -conector-VH-CL; y en el que dicho conector es un polipéptido de al menos 30 aminoácidos, preferentemente de entre 32 y 50 aminoácidos. Dichos fragmentos Fab monocatenarios se estabilizan por medio del enlace disulfuro natural entre el dominio CL y el dominio CH1. Además, estas moléculas Fab monocatenarias se podrían estabilizar además por generación de enlaces disulfuro intercatenarios por medio de la inserción de residuos de cisteína (por ejemplo, la posición 44 en la cadena pesada variable y la posición 100 en la cadena ligera variable de acuerdo con la numeración de Kabat).
Un "fragmento Fab monocatenario de entrecruzamiento" o "x-scFab" es un polipéptido que consiste en un dominio variable de la cadena pesada (VH) de anticuerpo, un dominio constante 1 (CH1) de anticuerpo, un dominio variable de la cadena ligera (VL) de anticuerpo, un dominio constante de la cadena ligera (CL) de anticuerpo y un conector, en el que dichos dominios de anticuerpo y dicho conector tienen uno de los siguientes órdenes en sentido de N terminal a C terminal: a) VH-CL-conector-VL-CH1 y b) VL-CH1-conector-VH-CL; en el que VH y VL forman juntos un sitio de unión a antígeno que se une específicamente a un antígeno y en el que dicho conector es un polipéptido de al menos 30 aminoácidos. Además, estas moléculas x-scFab se podrían estabilizar además por generación de enlaces disulfuro intercatenarios por medio de la inserción de residuos de cisteína (por ejemplo, la posición 44 en la cadena pesada variable y la posición 100 en la cadena ligera variable de acuerdo con la numeración de Kabat).
Un "fragmento variable monocatenario (scFv)" es una proteína de fusión de las regiones variables de las cadenas pesada (Vh) y ligera (Vl) de un anticuerpo, conectada con un péptido conector corto de diez a aproximadamente 25 aminoácidos. Normalmente el conector es rico en glicina para su flexibilidad, así como en serina o treonina para su solubilidad, y puede conectar el extremo N de Vh con el extremo C de Vl, o bien viceversa. Esta proteína conserva la especificidad del anticuerpo original, a pesar de la retirada de las regiones constantes y la introducción del conector. Los anticuerpos scFv se describen, por ejemplo, en Houston, J.S., Methods in Enzymol. 203 (1991) 46-96). Además, los fragmentos de anticuerpo comprenden polipéptidos monocatenarios que tienen las características de un dominio VH, a saber, que se pueden ensamblar conjuntamente con un dominio VL, o de un dominio VL, a saber, que se pueden ensamblar conjuntamente con un dominio VH a un sitio de unión a antígeno funcional y proporcionar de este modo la propiedad de unión a antígeno de los anticuerpos de longitud completa.
Las "proteínas de unión a antígeno del andamio" son conocidas en la técnica, por ejemplo, la fibronectina y proteínas con repeticiones de anquirina diseñadas (DARPins) se han usado como andamios alternativos para los dominios de unión a antígeno, véase, por ejemplo, Gebauer y Skerra, Engineered protein scaffolds as nextgeneration antibody therapeutics. Curr Opin Chem Biol 13:245-255 (2009) y Stumpp et al., Darpins: A new generation of protein therapeutics. Drug Discovery Today 13: 695-701 (2008). En un aspecto de la invención, una proteína de unión a antígeno del andamio se selecciona del grupo que consiste en CTLA-4 (Evibody), lipocalinas (anticalina), una molécula derivada de proteína A tal como dominio Z de proteína A (Affibody), n dominio A (Avimer/Maxibody), una transferrina sérica (trans-body); una proteína con repeticiones de anquirina diseñadas (DARPin), un dominio variable de la cadena ligera o cadena pesada de anticuerpo (anticuerpo de dominio único, sdAb), un dominio variable de la cadena pesada de anticuerpo (nanobody, aVH), fragmentos Vnar, una fibronectina (AdNectin), un dominio de lectina de tipo C (tetranectina); un dominio variable de un nuevo receptor de antígeno de beta-lactamasa (fragmentos Vnar), a ubiquitina o cristalina gamma humana (moléculas Affilin); un dominio de tipo kunitz de inhibidores de proteasas humanas, microcuerpos tales como las proteínas de la familia knottin, aptámeros peptídicos y fibronectina (adnectina).
CTLA-4 (antígeno asociado a linfocitos T citotóxicos 4) es un receptor de la familia de CD28 expresado principalmente en linfocitos T CD4+. Su dominio extracelular tiene un pliegue de Ig como un dominio variable. Los bucles correspondientes a CDR de anticuerpos se pueden sustituir con secuencia heteróloga para conferir diferentes propiedades de unión. Las moléculas CTLA-4 genomanipuladas para tener diferentes especificidades de unión también son conocidas como Evibodies (por ejemplo, documento US7166697B1). Los Evibodies tienen aproximadamente el mismo tamaño que la región variable aislada de un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo de dominio). Para detalles adicionales, véase Journal of Immunological Methods 248 (1-2), 31-45 (2001). Las lipocalinas son una familia de proteínas extracelulares que transportan moléculas hidrófobas pequeñas tales como esteroides, bilinas, retinoides y lípidos. Tienen un estructura secundaria de lámina beta rígida con un número de bucles en el extremo abierto de la estructura cónica que se pueden genomanipular para unirse a diferentes antígenos diana. Las anticalinas tienen entre 160-180 aminoácidos de tamaño, y se derivan de lipocalinas. Para detalles adicionales, véanse Biochim Biophys Acta 1482: 337-350 (2000), documentos US7250297B1 y US20070224633. Un Affibody es un andamio derivado de la proteína A de Staphylococcus aureus que se puede genomanipular para unirse al antígeno. El dominio consiste en un haz de tres hélices de aproximadamente 58 aminoácidos. Se han generado colecciones por aleatorización de residuos de superficie. Para detalles adicionales, véanse Protein Eng. Des. Sel. 2004, 17, 455-462 y el documento EP 1641818A1. Las Avimers son proteínas multidominio derivadas de la familia de andamio de dominio A. Los dominios naturales de aproximadamente 35 aminoácidos adoptan una estructura unida a disulfuro definida. La diversidad se genera reordenando la variación natural presentada por la familia de dominios A. Para detalles adicionales, véanse Nature Biotechnology 23(12), 1556 - 1561 (2005) y Expert Opinion on Investigational Drugs 16(6), 909-917 (junio 2007). Una transferrina es una glucoproteína de transporte sérico monomérica. Las transferrinas se pueden genomanipular para unirse a diferentes antígenos diana por inserción de secuencias peptídicas en un bucle de superficie permisivo. Los ejemplos de andamios de transferrina genomanipulados incluyen el Trans-body. Para detalles adicionales, véase J. Biol. Chem 274, 24066-24073 (1999). Las proteínas con repeticiones de anquirina diseñadas (DARPins) se derivan de anquirina que es una familia de proteínas que median en la unión de proteínas integrales de la membrana al citoesqueleto. Una repetición de anquirina individual es un motivo de 33 residuos que consiste en dos hélices alfa y una vuelta beta. Se pueden genomanipular para unirse a diferentes antígenos diana aleatorizando residuos en la primera hélice alfa y una vuelta beta de cada repetición. Su interfase de unión se puede incrementar incrementando el número de modules (un procedimiento de maduración de la afinidad). Para detalles adicionales, véanse J. Mol. Biol. 332, 489-503 (2003), PNAS 100(4), 1700-1705 (2003) y J. Mol. Biol. 369, 1015-1028 (2007) y el documento US20040132028A1.
Un anticuerpo de dominio único es un fragmento de anticuerpo que consiste en un dominio de anticuerpo variable monomérico único. Los primeros dominios únicos se derivaron del dominio variable de la cadena pesada de anticuerpo de camélidos (nanocuerpos o fragmentos VhH). Además, el término anticuerpo de dominio único incluye un dominio variable de la cadena pesada humano autónomo (aVH) o fragmentos Vnar derivados de tiburones. La fibronectina es un andamio que se puede genomanipular para unirse a un antígeno. La adnectina consiste en una cadena principal de la secuencia de aminoácidos natural del 10.° dominio de las 15 unidades de repetición de fibronectina humana tipo III (FN3). Se pueden genomanipular tres bucles en un extremo del sándwich beta para permitir que una adnectina reconozca específicamente una diana terapéutica de interés. Para detalles adicionales, véanse Protein Eng. Des. Sel. 18, 435-444 (2005), documentos US20080139791, WO2005056764 y US6818418B1. Los aptámeros peptídicos son moléculas de reconocimiento combinatorias que consisten en una proteína de andamio constante, típicamente tiorredoxina (TrxA) que contiene un bucle peptídico variable restringido insertado en el sitio activo. Para detalles adicionales, véase Expert Opin. Biol. Ther. 5, 783-797 (2005). Los microcuerpos se derivan de microproteínas naturales de 25-50 aminoácidos de longitud que contienen 3-4 puentes de cisteína (los ejemplos de microproteínas incluyen KalataBI y conotoxina y knottins). Las microproteínas tienen un bucle que se puede genomanipular para incluir hasta 25 aminoácidos sin afectar al pliegue total de la microproteína. Para detalles adicionales de dominios knottin genomanipulados, véase el documento WO2008098796.
Una "molécula de unión a antígeno que se une al mismo epítopo" como molécula de referencia se refiere a una molécula de unión a antígeno que bloquea la unión de la molécula de referencia a su antígeno en un ensayo de competencia en un 50 % o más, y a la inversa, la molécula de referencia bloquea la unión de la molécula de unión a antígeno a su antígeno en un ensayo de competencia en un 50 % o más.
Como se usa en el presente documento, el término "sitio de unión a antígeno" se refiere a la parte de la molécula de unión a antígeno que se une específicamente a un determinante antigénico. Más en particular, el término "sitio de unión a antígeno" se refiere a la parte de un anticuerpo que comprende el área que se une específicamente a y es complementaria de parte o la totalidad de un antígeno. Cuando un antígeno es grande, una molécula de unión a antígeno solo se puede unir a una parte particular del antígeno, parte que se denomina epítopo. Un sitio de unión a antígeno se puede proporcionar por, por ejemplo, uno o más dominios variables (también llamados regiones variables). Preferentemente, un sitio de unión a antígeno comprende una región variable de la cadena ligera (VL) de anticuerpo y una región variable de la cadena pesada (VH) de anticuerpo. En un aspecto, el sitio de unión a antígeno se puede unir a su antígeno y bloquear o bloquear parcialmente su función. Los sitios de unión a antígeno que se unen específicamente a PD1 o a TIM-3 incluyen anticuerpos y fragmentos de los mismos como se define además en el presente documento. Además, los sitios de unión a antígeno pueden incluir proteínas de unión a antígeno del andamio, por ejemplo, dominios de unión que se basan en proteínas de repetición diseñadas o dominios de repetición diseñados (véase, por ejemplo, documento WO2002/020565).
Como se usa en el presente documento, el término "determinante antigénico" es sinónimo de "antígeno" y "epítopo" y se refiere a un sitio (por ejemplo, un tramo contiguo de aminoácidos o una configuración conformacional compuesta por diferentes regiones de aminoácidos no contiguos) en una macromolécula polipeptídica a la que se une un resto de unión a antígeno, formando un complejo de resto de unión a antígeno-antígeno. Los determinantes antigénicos útiles se pueden encontrar, por ejemplo, en las superficies de células tumorales, en las superficies de células infectadas por virus, en las superficies de otras células afectadas, en la superficie de células inmunitarias, libres en suero sanguíneo y/o en la matriz extracelular (ECM). Las proteínas útiles como antígenos en el presente documento pueden ser cualquier forma natural de cualquier fuente de vertebrado, incluyendo mamíferos tales como primates (por ejemplo, seres humanos) y roedores (por ejemplo, ratones y ratas), a menos que se indique de otro modo. En un modo de realización particular, el antígeno es una proteína humana. Cuando se hace referencia a una proteína específica en el presente documento, el término engloba la proteína no procesada "de longitud completa" así como cualquier forma de la proteína que resulte del procesamiento en la célula. El término también engloba variantes naturales de la proteína, por ejemplo, variantes de empalme o variantes alélicas.
Por "unión específica" se quiere decir que la unión es selectiva para el antígeno y se puede discriminar de las interacciones no deseadas o inespecíficas. La capacidad de una molécula de unión a antígeno para unirse a un antígeno específico se puede medir a través de un ensayo de inmunoadsorción enzimática (ELISA) o bien otras técnicas familiares para un experto en la técnica, por ejemplo, técnica de resonancia de plasmón superficial (RPS) (analizado en un instrumento de BIAcore) (Liljeblad et al., Glyco J 17, 323-329 (2000)), y ensayos de unión tradicionales (Heeley, Endocr Res 28, 217-229 (2002)). En un modo de realización, el grado de unión de una molécula de unión a antígeno a una proteína no relacionada es menor que aproximadamente un 10 % de la unión de la molécula de unión a antígeno al antígeno como se mide, por ejemplo, por RPS. En determinados modos de realización, una molécula que se une al antígeno tiene una constante de disociación (Kd) de < 1 |iM, < 100 nM, < 10 nM, < 1 nM, < 0,1 nM, < 0,01 nM, o < 0,001 nM (por ejemplo, 10-7 M o menos, por ejemplo, de 10-7 M a 10-13 M, por ejemplo, de 10-9 M a 10-13 M).
"Afinidad" o "afinidad de unión" se refiere a la fuerza de la suma total de interacciones no covalentes entre un único sitio de unión de una molécula (por ejemplo, un anticuerpo) y su compañero de unión (por ejemplo, un antígeno). A menos que se indique de otro modo, como se usa en el presente documento, "afinidad de unión" se refiere a afinidad de unión intrínseca que refleja una interacción 1:1 entre miembros de un par de unión (por ejemplo, anticuerpo y antígeno). La afinidad de una molécula X por su compañero Y se puede representar en general por la constante de disociación (Kd), que es la proporción de las constantes de velocidad de disociación y asociación (kdis y kas, respectivamente). Por tanto, las afinidades equivalentes pueden comprender diferentes constantes de velocidad, siempre que la proporción de las constantes de velocidad permanezca igual. Se puede medir la afinidad por procedimientos comunes conocidos en la técnica, incluyendo los descritos en el presente documento. Un procedimiento particular para medir la afinidad es la resonancia de plasmón superficial (RPS).
Como se usa en el presente documento, el término "alta afinidad" de un anticuerpo se refiere a un anticuerpo que tiene una Kd de 10-9 M o menos e incluso más en particular 10-10 M o menos para un antígeno diana. El término "baja afinidad" de un anticuerpo se refiere a un anticuerpo que tiene una Kd de 10-8 o mayor.
Un anticuerpo "madurado en afinidad" se refiere a un anticuerpo con una o más alteraciones en una o más regiones hipervariables (HVR), en comparación con un anticuerpo original que no posee dichas alteraciones, dando como resultado dichas alteraciones una mejora en la afinidad del anticuerpo por el antígeno.
El término "un anticuerpo biespecífico que comprende un primer sitio de unión a antígeno que se une específicamente a PD1 y un segundo sitio de unión a antígeno que se une específicamente a TIM-3", "un anticuerpo biespecífico que se une específicamente a PD1 y TIM-3", "molécula de unión a antígeno biespecífica específica para PD1 y TIM-3" se usan de manera intercambiable en el presente documento y se refieren a un anticuerpo biespecífico que se puede unir a PD1 y TIM-3 con suficiente afinidad de modo que el anticuerpo es útil como agente de diagnóstico y/o terapéutico para seleccionar PD1 y TIM-3.
El término "PD1", también conocido como proteína de muerte celular programada 1, es una proteína de membrana de tipo 1 de 288 aminoácidos que se describió por primera vez en 1992 (Ishida et al., EMBO J., 11 (1992), 3887­ 3895). PD-1 es un miembro de la familia CD28/CTLA-4 extendida de reguladores de linfocitos T y tiene dos ligandos, PD-L1 (B7-H1, CD274) y PD-L2 (B7-DC, CD273). La estructura de la proteína incluye un dominio IgV extracelular seguido de una región transmembranaria y una cola intracelular. La cola intracelular contiene dos sitios de fosforilación localizados en un motivo inhibidor basado en tirosina inmunorreceptor y un motivo de intercambio basado en tirosina inmunorreceptor, lo que sugiere que PD-1 regula negativamente las señales de TCR. Esto es consecuente con la unión de las fosfatasas SHP-1 y SHP-2 a la cola citoplásmica de PD-1 tras la unión del ligando. Aunque PD-1 no se expresa en linfocitos T indiferenciados, se regula por incremento después de la activación mediada por el receptor de linfocitos T (TCR) y se observa tanto en linfocitos T activados como agotados (Agata et al., Int. Immunology 8 (1996), 765-772). Estos linfocitos T agotados tienen un fenotipo disfuncional y no pueden responder apropiadamente. Aunque PD-1 tiene un patrón de expresión relativamente amplio, es probable que su papel más importante sea como receptor coinhibidor en linfocitos T (Chinai et al, Trends in Pharmacological Sciences 36 (2015), 587-595). Por tanto, los enfoques terapéuticos actuales se centran en bloquear la interacción de PD-1 con sus ligandos para potenciar la respuesta de linfocitos T. Los términos "muerte programada 1", "muerte celular programada 1", "proteína PD-1", "PD-1", "PD1", "PDCD1", "hPD-1" y "hPD-1" se pueden usar de manera intercambiable, e incluyen variantes, isoformas, especies homólogas de PD-1 humana y análogos que tienen al menos un epítopo común con PD-1. La secuencia de aminoácidos de PD1 humana se muestra en UniProt (www.uniprot.org), con número de acceso Q15116 (SEQ ID NO:89).
Los términos "anticuerpo anti-PD1" y "un anticuerpo que comprende un sitio de unión a antígeno que se une a PD1" se refieren a un anticuerpo que se puede unir a PD1, en especial un polipéptido de PD1 expresado en una superficie celular, con suficiente afinidad de modo que el anticuerpo es útil como agente de diagnóstico y/o terapéutico para seleccionar PD1. En un modo de realización, el grado de unión de un anticuerpo anti-PD1 a una proteína distinta de PD1 no relacionada es menos de aproximadamente un 10 % de la unión del anticuerpo a PD1 como se mide, por ejemplo, por radioinmunoanálisis (RIA) o citometría de flujo (FACS) o por un ensayo de resonancia de plasmón superficial usando un sistema biosensor tal como un sistema Biacore®. En determinados modos de realización, una proteína de unión a antígeno que se une a la PD1 humana tiene un valor de KD de la afinidad de unión por la unión a PD1 humana de < 1 |iM, < 100 nM, < 10 nM, < 1 nM, < 0,1 nM, < 0,01 nM o < 0,001 nM (por ejemplo, 10-8 M o menos, por ejemplo, de 10-8 M a 10-13 M, por ejemplo, de 10-9 M a 10-13 M). En un modo de realización preferente, el valor de KD respectivo de las afinidades de unión se determina en un ensayo de resonancia de plasmón superficial usando el dominio extracelular (ECD) de PD1 humana (PD1-ECD) para la afinidad de unión a PD1. El término "anticuerpo anti-PD1" también engloba anticuerpos biespecíficos que se pueden unir a PD1 y un segundo antígeno.
El término "TIM3", la abreviatura de "molécula que contiene dominios de inmunoglobulina y mucina de linfocitos T 3", también conocida como TIM-3, HAVCR2, KIM-3, TIMD3 y FLJ14428, se refiere a una proteína de la superficie celular específica de linfocitos T cooperadores de tipo 1 que regula la activación de macrófagos y la gravedad de afecciones inflamatorias. TIM3 también se asocia con cáncer, en particular, con células madre cancerosas. Las secuencias de nucleótidos y proteínas de TIM3 son conocidas para muchas especies. Por ejemplo, la secuencia de aminoácidos humana se puede encontrar en Uniprot con el número de acceso Q8TDQ0 (SEQ ID NO:93). La proteína humana se caracteriza por un dominio extracelular que comprende un dominio similar a Ig y un dominio de mucina (que comprende además sitios de glucosilación unidos a O y unidos a N) que comprende aproximadamente los aminoácidos 22-202, un dominio transmembranario (aminoácidos 203-223) y un dominio intracelular (citoplásmico) (aminoácidos 224-301). Para la proteína TIM3 humana mostrada como SEQ ID NO: 93, el dominio extracelular comprende aproximadamente los aminoácidos 22-202, el dominio transmembranario comprende aproximadamente los aminoácidos 203-223 y el dominio citoplásmico comprende aproximadamente los aminoácidos 224-301. El término "TIM3" incluye variantes, isoformas, especies homólogas de TIM3 humana y análogos que tienen al menos un epítopo común con TIM3.
Los términos "anticuerpo anti-TIM3" y "un anticuerpo que comprende un sitio de unión a antígeno que se une a TIM3" se refieren a un anticuerpo que se puede unir a TIM3, en especial un polipéptido de TIM3 expresado en una superficie celular, con suficiente afinidad de modo que el anticuerpo es útil como agente de diagnóstico y/o terapéutico para seleccionar TIM3. En un modo de realización, el grado de unión de un anticuerpo anti-TIM3 a una proteína distinta de TIM3 no relacionada es menos de aproximadamente un 10 % de la unión del anticuerpo a TIM3 como se mide, por ejemplo, por radioinmunoanálisis (RIA) o citometría de flujo (FACS) o por un ensayo de resonancia de plasmón superficial usando un sistema biosensor tal como un sistema Biacore®. En determinados modos de realización, una proteína de unión a antígeno que se une a la TIM3 humana tiene un valor de KD de la afinidad de unión por la unión a TIM3 humana de < 1 |iM, < 100 nM, < 10 nM, < 1 nM, < 0,1 nM, < 0,01 nM o < 0,001 nM (por ejemplo, 10-8 M o menos, por ejemplo, de 10-7 M a 10-13 M, por ejemplo, de 10-9 M a 10-13 M). En un modo de realización preferente, el valor de KD respectivo de las afinidades de unión se determina en un ensayo de resonancia de plasmón superficial usando el dominio extracelular (ECD) de TIM3 humana (TIM3-ECD) para la afinidad de unión a TIM3. El término "anticuerpo anti-TIM3" también engloba anticuerpos biespecíficos que se pueden unir a TIM3 y un segundo antígeno.
Un anticuerpo "de bloqueo" o un anticuerpo "antagonista" es uno que inhibe o reduce la actividad biológica del antígeno al que se une. En algunos modos de realización, los anticuerpos de bloqueo o anticuerpos antagonistas inhiben sustancial o completamente la actividad biológica del antígeno.
Por ejemplo, los anticuerpos biespecíficos de la invención bloquean la señalización a través de PD-1 y TIM-3 para restaurar una respuesta funcional por los linfocitos T (por ejemplo, proliferación, producción de citocinas, destrucción de células diana) de un estado disfuncional a la estimulación antigénica.
El término "región variable" o "dominio variable" se refiere al dominio de una cadena pesada o ligera de anticuerpo que está implicado en unir la molécula de unión a antígeno al antígeno. Los dominios variables de la cadena pesada y cadena ligera (VH y VL, respectivamente) de un anticuerpo natural en general tienen estructuras similares, comprendiendo cada dominio cuatro regiones estructurales conservadas (FR) y tres regiones hipervariables (HVR). Véase, por ejemplo, Kindt et al., Kuby Immunology, 6.a ed., W.H. Freeman and Co., página 91 (2007). Un dominio VH o VL único puede ser suficiente para conferir especificidad de unión a antígeno.
El término "región hipervariable" o "HVR," como se usa en el presente documento, se refiere a cada una de las regiones de un dominio variable de anticuerpo que son hipervariables en secuencia y/o forman bucles estructuralmente definidos ("bucles hipervariables"). En general, los anticuerpos tetracatenarios naturales comprenden seis HVR; tres en el VH (H1, H2, H3) y tres en el VL (L1, L2, L3). Las HVR comprenden en general residuos aminoacídicos de los bucles hipervariables y/o de las "regiones determinantes de la complementariedad" (CDR), siendo las últimas las de la mayor variabilidad de secuencia y/o estando implicadas en el reconocimiento antigénico. Los bucles hipervariables ejemplares se producen en los residuos aminoacídicos 26-32 (L1), 50-52 (L2), 91-96 (L3), 26-32 (H1), 53-55 (H2) y 96-101 (H3). (Chothia y Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987).) Las CDR ejemplares (CDR-L1, CDR-L2, CDr -L3, c Dr -H1, CDR-H2 y CDR-H3) se producen en los residuos aminoacídicos 24-34 de L1, 50-56 de L2, 89-97 de L3, 31-35B de H1, 50-65 de H2, y 95-102 de H3. (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5.a ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991).) Las regiones hipervariables (HVR) también se denominan regiones determinantes de la complementariedad (CDR), y estos términos se usan en el presente documento de manera intercambiable en referencia a porciones de la región variable que forman las regiones de unión a antígeno. Esta región particular se ha descrito por Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequences of Proteins of Immunological Interest" (1983) y por Chothia et al., J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987), donde las definiciones incluyen la superposición o subconjuntos de residuos aminoacídicos cuando se comparan entre sí. No obstante, se pretende que la aplicación de cualquier definición para referirse a una CDR de un anticuerpo o variantes del mismo esté dentro del alcance del término como se define y se usa en el presente documento. Los residuos aminoacídicos apropiados que engloban las CDR como se define por cada una de las referencias citadas anteriormente se exponen a continuación en la tabla A como comparación. Los números de residuos exactos que engloba una CDR particular variarán dependiendo de la secuencia y tamaño de la CDR. Los expertos en la técnica pueden determinar de forma rutinaria qué residuos comprenden una CDR particular dada la secuencia de aminoácidos de la región variable del anticuerpo.
Tabla A. Definiciones de CDR1
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1 La numeración de todas las definiciones de CDR en la tabla A está de acuerdo con las convenciones de numeración expuestas por Kabat et al. (véase a continuación).
2 "AbM" con una "b" minúscula como se usa en la tabla A se refiere a las CDR como se define por el programa informático de modelado de anticuerpos "AbM" de Oxford Molecular.
Kabat et al. también definieron un sistema de numeración para las secuencias de la región variable que es aplicable a cualquier anticuerpo. Un experto en la técnica puede asignar inequívocamente este sistema de "numeración de Kabat" a cualquier secuencia de la región variable, sin depender de ningún dato experimental más allá de la propia secuencia. Como se usa en el presente documento, "numeración de Kabat" se refiere al sistema de numeración expuesto por Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequence of Proteins of Immunological Interest" (1983). A menos que se especifique de otro modo, las referencias a la numeración de posiciones de residuos aminoacídicos específicas en una región variable de anticuerpo son de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat.
Con la excepción de CDR1 en VH, las CDR comprenden en general los residuos aminoacídicos que forman los bucles hipervariables. Las CDR también comprenden "residuos determinantes de la especificidad" o "SDR", que son los residuos que entran en contacto con el antígeno. Los SDR están contenidos dentro de regiones de las CDR llamadas CDR abreviadas o a-CDR. Las a-CDR ejemplares (a-CDR-L1, a-CDR-L2, a-CDR-L3, a-CDR-H1, a-CDR-H2 y a-CDR-H3) se producen en los residuos aminoacídicos 31-34 de L1, 50-55 de L2, 89-96 de L3, 31-35B de H1, 50-58 de H2 y 95-102 de H3. (Véase Almagro y Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008).) A menos que se indique de otro modo, los residuos de HVR y otros residuos del dominio variable (por ejemplo, residuos de FR) se numeran en el presente documento de acuerdo con Kabat et al.
"Región estructural" o "FR" se refiere a residuos del dominio variable distintos de los residuos de la región hipervariable (HVR). La FR de un dominio variable consiste en general en cuatro dominios de FR: FR1, FR2, FR3 y FR4. En consecuencia, las secuencias de HVR y FR aparecen en general en la siguiente secuencia en VH (o VL): FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.
Una "región estructural humana aceptora" para los propósitos en el presente documento es una región estructural que comprende la secuencia de aminoácidos de una región estructural del dominio variable de la cadena ligera (VL) o una región estructural del dominio variable de la cadena pesada (VH) derivada de una región estructural de inmunoglobulina humana o una región estructural consenso humana, como se define a continuación. Una región estructural humana aceptora "derivada de" una región estructural de inmunoglobulina humana o una región estructural consenso humana puede comprender la misma secuencia de aminoácidos de la misma, o puede contener cambios en la secuencia de aminoácidos. En algunos modos de realización, el número de cambios aminoacídicos es de 10 o menos, 9 o menos, 8 o menos, 7 o menos, 6 o menos, 5 o menos, 4 o menos, 3 o menos o 2 o menos. En algunos modos de realización, la región estructural humana aceptora de VL es idéntica en secuencia a la secuencia de la región estructural de inmunoglobulina humana de VL o la secuencia de la región estructural consenso humana.
El término anticuerpo "quimérico" se refiere a un anticuerpo en el que una porción de la cadena pesada y/o ligera se deriva de una fuente o especie particular, mientras que el resto de la cadena pesada y/o ligera se deriva de una fuente o especie diferente.
La "clase" de un anticuerpo se refiere al tipo de dominio constante o región constante poseído por su cadena pesada. Existen cinco clases principales de anticuerpos: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, y varios de estos se pueden dividir además en subclases (isotipos), por ejemplo, IgG1, IgG2 , IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2. Los dominios constantes de la cadena pesada que corresponden a las diferentes clases de inmunoglobulinas se llaman a, 8, e, y y |i respectivamente.
Un anticuerpo "humanizado" se refiere a un anticuerpo quimérico que comprende residuos aminoacídicos de HVR no humanas y residuos aminoacídicos de FR humanas. En determinados modos de realización, un anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todos de al menos uno, y típicamente dos, dominios variables, en los que todas o sustancialmente todas las HVR (por ejemplo, CDR) corresponden a las de un anticuerpo no humano, y todas o sustancialmente todas las FR corresponden a las de un anticuerpo humano. Un anticuerpo humanizado opcionalmente puede comprender al menos una porción de una región constante de anticuerpo derivada de un anticuerpo humano. Una "forma humanizada" de un anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo no humano, se refiere a un anticuerpo que se ha sometido a humanización. Otras formas de "anticuerpos humanizados" englobadas por la presente invención son aquellas en las que la región constante se ha modificado o cambiado adicionalmente con respecto a la del anticuerpo original para generar las propiedades de acuerdo con la invención, en especial con respecto a la unión a C1q y/o unión al receptor de Fc (FcR).
Un anticuerpo "humano" es uno que posee una secuencia de aminoácidos que corresponde a la de un anticuerpo producido por un humano o una célula humana o derivado de una fuente no humana que utiliza repertorios de anticuerpos humanos u otras secuencias que codifican anticuerpos humanos. Esta definición de un anticuerpo humano excluye específicamente un anticuerpo humanizado que comprende residuos de unión a antígeno no humanos.
El término "anticuerpo monoclonal" como se usa en el presente documento se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos y/o se unen al mismo epítopo, excepto por posibles anticuerpos variantes, por ejemplo, que contienen mutaciones naturales o que surgen durante la producción de una preparación de anticuerpos monoclonales, estando presentes en general dichas variantes en cantidades escasas. En contraste con las preparaciones de anticuerpos policlonales, que típicamente incluyen anticuerpos diferentes dirigidos frente a diferentes determinantes (epítopos), cada anticuerpo monoclonal de una preparación de anticuerpos monoclonales se dirige frente a un único determinante en un antígeno. Por tanto, el modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo como que se ha obtenido de una población sustancialmente homogénea de anticuerpos, y no se debe interpretar que requiera la producción del anticuerpo por ningún procedimiento particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales que se van a usar de acuerdo con la presente invención se pueden preparar por una variedad de técnicas, incluyendo, pero sin limitarse al procedimiento de hibridoma, procedimientos de ADN recombinante, procedimientos de presentación en fagos y procedimientos que utilizan animales transgénicos que contienen todos o parte de los locus de inmunoglobulina humana, describiéndose en el presente documento dichos procedimientos y otros procedimientos ejemplares para preparar anticuerpos monoclonales.
El término "dominio Fc" o "región Fc" en el presente documento se usa para definir una región C terminal de una cadena pesada de inmunoglobulina que contiene al menos una porción de la región constante. El término incluye regiones Fc de secuencia natural y regiones Fc variantes. En particular, una región Fc de la cadena pesada de IgG humana se extiende de Cys226, o de Pro230, al extremo carboxílico de la cadena pesada. Sin embargo, la lisina C terminal (Lys447) de la región Fc puede o no estar presente. Las secuencias de aminoácidos de las cadenas pesadas siempre se presentan con la lisina C terminal, sin embargo las variantes sin lisina C terminal se incluyen en la invención.
Una región Fc de IgG comprende un dominio CH2 de IgG y un dominio CH3 de IgG. El "dominio CH2" de una región Fc de IgG humana normalmente se extiende de un residuo aminoacídico aproximadamente en la posición 231 a un residuo aminoacídico aproximadamente en la posición 340. En un modo de realización, una cadena glucídica se une al dominio CH2. El dominio CH2 en el presente documento puede ser un dominio CH2 de secuencia natural o un dominio CH2 variante. El "dominio CH3" comprende el tramo de residuos C terminales a un dominio CH2 en una región Fc (es decir, de un residuo aminoacídico aproximadamente en la posición 341 a un residuo aminoacídico aproximadamente en la posición 447 de una IgG). La región CH3 en el presente documento puede ser un dominio CH3 de secuencia natural o un dominio CH3 variante (por ejemplo, un dominio CH3 con una "protuberancia" ("botón") introducida en una cadena del mismo y una "cavidad" ("ojal") introducida correspondiente en la otra cadena del mismo; véase la patente de EE. UU. n.° 5.821.333). Dichos dominios CH3 variantes se pueden usar para promover la heterodimerización de dos cadenas pesadas de anticuerpo no idénticas como se describe en el presente documento. A menos que se especifique de otro modo en el presente documento, la numeración de residuos aminoacídicos en la región Fc o región constante es de acuerdo con el sistema de numeración EU, también llamado índice EU, como se describe en Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5.a ed. Public Health Service, National Institutes de Health, Bethesda, MD, 1991.
La tecnología de "botón en ojal" se describe, por ejemplo, en los documentos US 5.731.168; US 7.695.936; Ridgway et al., Prot Eng 9, 617-621 (1996) y Carter, J Immunol Meth 248, 7-15 (2001). En general, el procedimiento implica introducir una protuberancia ("botón") en la interfase de un primer polipéptido y una correspondiente cavidad ("ojal") en la interfase de un segundo polipéptido, de modo que la protuberancia se puede situar en la cavidad para promover la formación de heterodímeros y dificultar la formación de homodímeros. Las protuberancias se construyen reemplazando cadenas laterales de aminoácidos pequeñas de la interfase del primer polipéptido por cadenas laterales más grandes (por ejemplo, tirosina o triptófano). Se crean cavidades compensadoras de tamaño idéntico o similar a las protuberancias en la interfase del segundo polipéptido reemplazando cadenas laterales de aminoácido grandes por otras más pequeñas (por ejemplo, alanina o treonina). La protuberancia y la cavidad se pueden realizar alterando el ácido nucleico que codifica los polipéptidos, por ejemplo, por mutagénesis específica de sitio o por síntesis peptídica. En un modo de realización específico, una modificación de botón comprende la sustitución aminoacídica T366W en una de las dos subunidades del dominio Fc, y la modificación de ojal comprende las sustituciones aminoacídicas T366S, L368A y Y407V en la otra de las dos subunidades del dominio Fc. En otro modo de realización específico, la subunidad del dominio Fc que comprende la modificación de botón adicionalmente comprende la sustitución aminoacídica S354C, y la subunidad del dominio Fc que comprende la modificación de ojal adicionalmente comprende la sustitución aminoacídica Y349C. La introducción de estos dos residuos de cisteína da como resultado la formación de un puente disulfuro entre las dos subunidades de la región Fc, estabilizando así además el dímero (Carter, J Immunol Methods 248, 7-15 (2001)).
Una "región equivalente a la región Fc de una inmunoglobulina" pretende incluir variantes alélicas naturales de la región Fc de una inmunoglobulina así como variantes que tienen alteraciones que producen sustituciones, adiciones o deleciones pero que no disminuyen sustancialmente la capacidad de la inmunoglobulina para mediar en las funciones efectoras (tales como la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos). Por ejemplo, se pueden delecionar uno o más aminoácidos del extremo N o extremo C de la región Fc de una inmunoglobulina sin pérdida sustancial de la función biológica. Dichas variantes se pueden seleccionar de acuerdo con reglas generales conocidas en la técnica para tener un efecto mínimo sobre la actividad (véase, por ejemplo, Bowie, J. U. et al., Science 247:1306-10 (1990)).
El término "funciones efectoras" se refiere a las actividades biológicas atribuibles a la región Fc de un anticuerpo, que varían con el isotipo del anticuerpo. Los ejemplos de funciones efectoras de anticuerpos incluyen: unión a C1q y citotoxicidad dependiente del complemento (CDC), unión a receptor de Fc, citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC), fagocitosis celular dependiente de anticuerpos (ADCP), secreción de citocinas, captación de antígenos mediada por complejo inmunitario por células presentadoras de antígenos, regulación por disminución de receptores de superficie celular (por ejemplo, receptor de linfocitos B) y activación de linfocitos B.
Un "receptor de Fc activador" es un receptor de Fc que después del acoplamiento por una región Fc de un anticuerpo provoca acontecimientos de señalización que estimulan a la célula que porta el receptor para realizar funciones efectoras. Los receptores de Fc de activación incluyen FcyRNIa (CD16a), FcyRI (CD64), FcyRIIa (CD32) y FcaRI (CD89). Un receptor de Fc activador particular es FcyRIlIa humano (véase UniProt con n.° de acceso P08637 (versión 141)).
El término "conector peptídico" se refiere a un péptido que comprende uno o más aminoácidos, típicamente de aproximadamente 2 a 20 aminoácidos. Los conectores peptídicos son conocidos en la técnica o se describen en el presente documento. Los péptidos conectores no inmunógenos adecuados son, por ejemplo, los conectores peptídicos (G4S)n, (SG4)n o G4(SG4)n, en los que "n" es en general un número entre 1 y 10, típicamente entre 2 y 4, en particular 2.
Por "fusionado" o "conectado" se quiere decir que los componentes (por ejemplo, un sitio de unión a antígeno y un dominio FC) se unen por enlaces peptídicos, directamente o bien por medio de uno o más conectores peptídicos.
El término "aminoácido" como se usa dentro de la presente solicitud indica el grupo de carboxi-a-aminoácidos naturales que comprenden alanina (código de tres letras: ala, código de una letra: A), arginina (arg, R), asparagina (asn, N), ácido aspártico (asp, D), cisteína (cys, C), glutamina (gln, Q), ácido glutámico (glu, E), glicina (gly, G), histidina (his, H), isoleucina (ile, I), leucina (leu, L), lisina (lys, K), metionina (met, M), fenilalanina (phe, F), prolina (pro, P), serina (ser, S), treonina (thr, T), triptófano (trp, W), tirosina (tyr, Y) y valina (val, V).
"Porcentaje (%) de identidad de secuencia de aminoácidos" con respecto a una secuencia polipeptídica (proteica) de referencia se define como el porcentaje de residuos aminoacídicos en una secuencia candidata que son idénticos a los residuos aminoacídicos en la secuencia polipeptídica de referencia, después de alinear las secuencias e introducir huecos, en caso necesario, para lograr el porcentaje máximo de identidad de secuencia, y sin considerar ninguna sustitución conservadora como parte de la identidad de secuencia. La alineación para propósitos de determinación del porcentaje de identidad de secuencia de aminoácidos se puede lograr de diversas formas que están dentro de la habilidad en la técnica, por ejemplo, usando un programa informático públicamente disponible tal como el programa informático BLAST, BLAST-2, ALIGN, SAWI o Megalign (DNASTAR). Los expertos en la técnica pueden determinar parámetros apropiados para alinear secuencias, incluyendo cualquier algoritmo necesario para lograr la alineación máxima sobre la longitud completa de las secuencias que se comparan. Sin embargo, para los propósitos en el presente documento, los valores de % de identidad de secuencia de aminoácidos se generan usando el programa informático de comparación de secuencias ALIGN-2. El programa informático de comparación de secuencias ALIGN-2 se creó por Genentech, Inc., y el código fuente se ha presentado con la documentación de usuario en la Oficina de Derechos de Autor de EE. UU., Washington D.C., 20559, donde está registrado con el n.° de registro de derechos de autor de EE. UU. TXU510087. El programa ALIGN-2 está disponible públicamente de Genentech, Inc., South San Francisco, California, o se puede compilar a partir del código fuente. El programa ALIGN-2 se debe compilar para su uso en un sistema operativo UNIX, incluyendo UNIX V4.0D digital. Todos los parámetros de comparación de secuencias se establecen por el programa ALIGN-2 y no varían. En situaciones donde se emplea ALIGN-2 para las comparaciones de secuencias de aminoácidos, el % de identidad de secuencia de aminoácidos de una secuencia de aminoácidos dada A con respecto a, con o frente a una secuencia de aminoácidos dada B (que se puede parafrasear de forma alternativa como una secuencia de aminoácidos dada A que tiene o comprende un determinado % de identidad de secuencia de aminoácidos con respecto a, con o frente a una secuencia de aminoácidos dada B) se calcula como sigue:
100 veces la fracción X/Y
donde X es el número de residuos aminoacídicos puntuados como coincidencias idénticas por el programa de alineación de secuencias ALIGN-2 en esa alineación del programa de A y B, y donde Y es el número total de residuos aminoacídicos en B. Se apreciará que si la longitud de la secuencia de aminoácidos A no es igual a la longitud de la secuencia de aminoácidos B, el % de identidad de secuencia de aminoácidos de A con respecto a B no igualará el % de identidad de secuencia de aminoácidos de B con respecto a A. A menos que se establezca específicamente de otro modo, todos los valores de % de identidad de secuencia de aminoácidos usados en el presente documento se obtienen como se describe en el párrafo inmediatamente precedente usando el programa de ordenador ALIGN-2.
En determinados aspectos, se contemplan variantes de secuencia de aminoácidos de los anticuerpos biespecíficos de la invención proporcionados en el presente documento. Por ejemplo, puede ser deseable mejorar la afinidad de unión y/u otras propiedades biológicas de los anticuerpos biespecíficos. Se pueden preparar variantes de secuencia de aminoácidos de los anticuerpos biespecíficos introduciendo modificaciones apropiadas en la secuencia de nucleótidos que codifica las moléculas o por síntesis peptídica.
Dichas modificaciones incluyen, por ejemplo, deleciones de, y/o inserciones en y/o sustituciones de residuos dentro de las secuencias de aminoácidos del anticuerpo. Se puede realizar cualquier combinación de deleción, inserción y sustitución para llegar a la construcción final, siempre que la construcción final posea las características deseadas, por ejemplo, unión a antígeno. Los sitios de interés para mutagénesis de sustitución incluyen las HVR y regiones estructurales (FR). Se proporcionan sustituciones conservadoras en la tabla B bajo el encabezado "sustituciones preferentes" y se describen además a continuación en referencia a las clases de cadenas laterales de aminoácidos (1) a (6). Se pueden introducir sustituciones aminoacídicas en la molécula de interés y cribar los productos para determinar una actividad deseada, por ejemplo, conservación/mejora de unión a antígeno, disminución en inmunogenicidad, o mejora en ADCC o CDC.
Tabla B
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Los aminoácidos se pueden agrupar de acuerdo con propiedades de cadena lateral comunes:
(1) hidrófobos: norleucina, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
(2) hidrófilos neutros: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
(3) ácidos: Asp, Glu;
(4) básicos: His, Lys, Arg;
(5) residuos que influyen en la orientación de la cadena: Gly, Pro;
(6) aromáticos: Trp, Tyr, Phe.
Las sustituciones no conservadoras conllevarán intercambiar un miembro de una de estas clases por otra clase.
El término "variantes de secuencia de aminoácidos" incluye variantes sustanciales en las que existen sustituciones aminoacídicas en uno o más residuos de la región hipervariable de una molécula de unión a antígeno original (por ejemplo, un anticuerpo humanizado o humano). En general, la(s) variante(s) resultante(s) seleccionada(s) para estudio adicional tendrán modificaciones (por ejemplo, mejoras) en determinadas propiedades biológicas (por ejemplo, incremento en afinidad, reducción en inmunogenicidad) con relación a la molécula de unión a antígeno original y/o tendrán determinadas propiedades biológicas sustancialmente conservadas de la molécula de unión a antígeno original. Una variante de sustitución ejemplar es un anticuerpo madurado en afinidad, que se puede generar convenientemente, por ejemplo, usando técnicas de maduración de la afinidad basadasen presentación en fagos, tales como las descritas en el presente documento. En resumen, uno o más residuos de HVR se mutan y las moléculas de unión a antígeno variantes se presentan en fagos y se criban para determinar una actividad biológica particular (por ejemplo, afinidad de unión). En determinados modos de realización, se pueden producir sustituciones, inserciones o deleciones dentro de una o más HVR siempre que dichas alteraciones no reduzcan sustancialmente la capacidad de la molécula de unión a antígeno para unirse al antígeno. Por ejemplo, se pueden realizar alteraciones conservadoras (por ejemplo, sustituciones conservadoras como se proporciona en el presente documento) que no reduzcan sustancialmente la afinidad de unión en HVR. Un procedimiento útil para la identificación de residuos o regiones de un anticuerpo que se pueden dirigir para la mutagénesis se llama "mutagénesis por barrido de alanina" como se describe por Cunningham y Wells (1989) Science, 244:1081-1085. En este procedimiento, un residuo o grupo de residuos diana (por ejemplo, residuos cargados tales como Arg, Asp, His, Lys, y Glu) se identifican y se reemplazan por un aminoácido neutro o cargado negativamente (por ejemplo, alanina o polialanina) para determinar si la interacción del anticuerpo con antígeno se ve afectada. Se pueden introducir otras sustituciones en las localizaciones de aminoácidos que demuestren sensibilidad funcional a las sustituciones iniciales. De forma alternativa, o adicionalmente, una estructura cristalina de un complejo antígeno-molécula de unión a antígeno para identificar puntos de contacto entre el anticuerpo y antígeno. Dichos residuos de contacto y residuos adyacentes se pueden seleccionar o eliminar como candidatos para sustitución. Se pueden cribar variantes para determinar si contienen las propiedades deseadas.
Las inserciones en la secuencia de aminoácidos incluyen fusiones amino y/o carboxiterminales que varían en longitud de un residuo a polipéptidos que contienen cien o más residuos, así como inserciones intrasecuenciales de residuos aminoacídicos individuales o múltiples. Los ejemplos de inserciones terminales incluyen anticuerpos biespecíficos con un residuo de metionilo N terminal. Otras variantes de inserción de la molécula incluyen la fusión al extremo N o C a un polipéptido lo que incrementa la semivida en suero del anticuerpo biespecífico.
En determinados aspectos, los anticuerpos biespecíficos proporcionados en el presente documento se alteran para incrementar o disminuir el grado al que se glucosila el anticuerpo. Las variantes de glucosilación de las moléculas se pueden obtener convenientemente alterando la secuencia de aminoácidos de modo que se crean o se retiran uno o más sitios de glucosilación, por ejemplo, se pueden alterar los carbohidratos unidos al dominio Fc. Los anticuerpos naturales producidos por células de mamífero típicamente comprenden un oligosacárido biantenario ramificado que se une en general por un enlace N a Asn297 del dominio CH2 de la región Fc. Véase, por ejemplo, Wright et al. TIBTECH 15:26-32 (1997). El oligosacárido puede incluir diversos carbohidratos, por ejemplo, manosa, N-acetilglucosamina (GlcNAc), galactosa y ácido siálico, así como una fucosa unida a un GlcNAc en el "tallo" de la estructura de oligosacárido biantenario. En algunos modos de realización, se pueden realizar modificaciones del oligosacárido en los anticuerpos biespecíficos de la invención para crear variantes con una mejora en determinadas propiedades. En un aspecto, se proporcionan variantes de anticuerpos biespecíficos que tienen una estructura de carbohidrato que carece de fucosa unida (directa o indirectamente) a una región Fc. Dichas variantes de fucosilación pueden tener una mejora en la función de ADCC, véase por ejemplo, la publicación de patente de EE. UU. n.° US 2003/0157108 (Presta, L.) o el documento US 2004/009362l (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd). Otras variantes de los anticuerpos biespecíficos de la invención incluyen aquellas con oligosacáridos bisectados, por ejemplo, en las que un oligosacárido biantenario unido a la región Fc se biseca por GlcNAc. Dichas variantes pueden tener una reducción en la fucosilación y/o una mejora en la función ADCC, véase por ejemplo el documento WO 2003/011878 (Jean-Mairet et al.); patente de EE. u U. n.° 6.602.684 (Umana et al.); y el documento US 2005/0123546 (Umana et al.). También se proporcionan variantes con al menos un residuo de galactosa en el oligosacárido unido a la región Fc. Dichas variantes de anticuerpo pueden tener una mejora en la función CDC y se describen, por ejemplo, en los documentos WO 1997/30087 (Patel et al.); WO 1998/58964 (Raju, S.); y WO 1999/22764 (Raju, S.).
En determinados aspectos, puede ser deseable crear variantes genomanipuladas con cisteína de los anticuerpos biespecíficos de la invención, por ejemplo, "tioMAb", en los que uno o más residuos de la molécula se sustituyen con residuos de cisteína. En modos de realización particulares, los residuos sustituidos se producen en sitios accesibles de la molécula. Al sustituir esos residuos con cisteína, los grupos tiol reactivos se posicionan de este modo en sitios accesibles del anticuerpo y se pueden usar para conjugar el anticuerpo a otros restos, tales como restos de fármaco o restos de conector-fármaco, para crear un inmunoconjugado. En determinados modos de realización, uno cualquiera o más de los siguientes residuos se pueden sustituir con cisteína: V205 (numeración de Kabat) de la cadena ligera; A118 (numeración EU) de la cadena pesada; y S400 (numeración EU) de la región Fc de la cadena pesada. Se pueden generar moléculas de unión a antígeno genomanipuladas con cisteína como se describe, por ejemplo, en la patente de EE. UU. n.° 7.521.541.
En determinados aspectos, los anticuerpos biespecíficos proporcionados en el presente documento se pueden modificar además para contener restos no proteínicos adicionales que son conocidos en la técnica y están fácilmente disponibles. Los restos adecuados para la derivatización del anticuerpo incluyen, pero no se limitan a, polímeros hidrosolubles. Los ejemplos no limitantes de polímeros hidrosolubles incluyen, pero no se limitan a, polietilenglicol (PEG), copolímeros de etilenglicol/propilenglicol, carboximetilcelulosa, dextrano, poli(alcohol vinílico), polivinilpirrolidona, poli-1,3-dioxolano, poli-1,3,6-trioxano, copolímero de etileno/anhídrido maleico, poliaminoácidos (homopolímeros o bien copolímeros aleatorios) y dextrano o poli(n-vinilpirrolidona)/polietilenglicol, homopolímeros de propropilenglicol, copolímeros de óxido de prolipropileno/óxido de etileno, polioles polioxietilados (por ejemplo, glicerol), poli(alcohol vinílico) y mezclas de los mismos. El polietilenglicolpropionaldehído puede tener ventajas en la fabricación debido a su estabilidad en agua. El polímero puede ser de cualquier peso molecular y puede estar ramificado o no ramificado. El número de polímeros unidos al anticuerpo puede variar y, si se une más de un polímero, pueden ser moléculas iguales o diferentes. En general, el número y/o tipo de polímeros usados para la derivatización se puede determinar en base a consideraciones incluyendo, pero sin limitarse a, las propiedades o funciones particulares del anticuerpo que se van a mejorar, ya sea si el derivado de anticuerpo biespecífico se usará en un tratamiento en condiciones definidas, etc.
En otro aspecto, se proporcionan conjugados de un anticuerpo y un resto no proteínico que se pueden calentar selectivamente por exposición a radiación. En un modo de realización, el resto no proteínico es un nanotubo de carbono (Kam, N.W. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA102 (2005) 11600-11605). La radiación puede ser de cualquier longitud de onda, e incluye, pero no se limita a, longitudes de onda que no dañan células normales, pero que calientan el resto no proteínico hasta una temperatura a la que las células próximas al anticuerpo-resto no proteínico se destruyen.
Un " inmunoconjugado" es un anticuerpo conjugado a una o más moléculas heterólogas, incluyendo pero sin limitarse a un agente citotóxico.
El término "polinudeótido" se refiere a una molécula o construcción de ácido nucleico, por ejemplo, ARN mensajero (ARNm), ADN derivado de virus o ADN de plásmido (ADNp). Un polinucleótido puede comprender un enlace fosfodiéster convencional o un enlace no convencional (por ejemplo, un enlace amida, tal como se encuentra en los ácidos peptidonucleicos (APN)). El término "molécula de ácido nucleico" se refiere a cualquiera de uno o más segmentos de ácido nucleico, por ejemplo, fragmentos de ADN o ARN, presentes en un polinucleótido.
Por molécula de ácido nucleico o polinucleótido "aislado" que entiende una molécula de ácido nucleico, ADN o ARN, que se ha retirado de su entorno natural. Por ejemplo, un polinucleótido recombinante que codifica un polipéptido contenido en un vector se considera aislado para los propósitos de la presente invención. Otros ejemplos de un polinucleótido aislado incluyen polinucleótidos recombinantes mantenidos en células huésped heterólogas o polinucleótidos (parcial o sustancialmente) purificados en solución. Un polinucleótido aislado incluye una molécula polinucleotídica contenida en células que contienen normalmente la molécula polinucleotídica, pero la molécula polinucleotídica está presente de forma extracromosómica o en una localización cromosómica que es diferente de su localización cromosómica natural. Las moléculas de ARN aisladas incluyen transcritos de ARN in vivo o in vitro de la presente invención, así como formas de hebras positivas y negativas y formas bicatenarias. Los polinucleótidos o ácidos nucleicos aislados de acuerdo con la presente invención incluyen además dichas moléculas producidas sintéticamente. Además, un polinucleótido o un ácido nucleico puede ser o puede incluir un elemento regulador tal como un promotor, sitio de unión a ribosoma o un finalizador de la transcripción.
Por un ácido nucleico o polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos al menos, por ejemplo, un 95 % "idéntica" a una secuencia de nucleótidos de referencia de la presente invención, se entiende que la secuencia de nucleótidos del polinucleótido es idéntica a la secuencia de referencia excepto en que la secuencia polinucleotídica puede incluir hasta cinco mutaciones puntuales por cada 100 nucleótidos de la secuencia de nucleótidos de referencia. En otras palabras, para obtener un polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos al menos un 95 % idéntica a una secuencia de nucleótidos de referencia, hasta un 5 % de los nucleótidos en la secuencia de referencia se puede delecionar o sustituir con otro nucleótido, o un número de nucleótidos hasta un 5 % de los nucleótidos totales en la secuencia de referencia se puede insertar en la secuencia de referencia. Estas alteraciones de la secuencia de referencia se pueden producir en las posiciones terminales 5' o 3' de la secuencia de nucleótidos de referencia o en cualquier parte entre esas posiciones terminales, intercaladas individualmente entre residuos en la secuencia de referencia o bien en uno o más grupos contiguos dentro de la secuencia de referencia. Como cuestión práctica, si cualquier secuencia polinucleotídica particular es al menos un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a una secuencia de nucleótidos de la presente invención, se puede determinar convencionalmente usando programas de ordenador conocidos, tales como los analizados anteriormente para polipéptidos (por ejemplo, ALIGN-2).
El término "casete de expresión" se refiere a un polinucleótido generado de forma recombinante o sintética, con una serie de elementos de ácido nucleico especificados que permiten la transcripción de un ácido nucleico particular en una célula diana. El casete de expresión recombinante se puede incorporar en un plásmido, cromosoma, ADN mitocondrial, ADN de plástido, virus o fragmento de ácido nucleico. Típicamente, la porción de casete de expresión recombinante de un vector de expresión incluye, entre otras secuencias, una secuencia de ácido nucleico que se va a transcribir y un promotor. En determinados modos de realización, el casete de expresión de la invención comprende secuencias polinucleotídicas que codifican moléculas de unión a antígeno biespecíficas de la invención o fragmentos de las mismas.
El término "vector" o "vector de expresión" es sinónimo de "construcción de expresión" y se refiere a una molécula de ADN que se usa para introducir y dirigir la expresión de un gen específico al que se asocia de forma funcional en una célula diana. El término incluye el vector como una estructura de ácido nucleico autorreplicante así como el vector incorporado en el genoma de una célula huésped en la que se ha introducido. El vector de expresión de la presente invención comprende un casete de expresión. Los vectores de expresión permiten la transcripción de grandes cantidades de ARNm estable. Una vez que el vector de expresión está dentro de la célula diana, la molécula de ácido ribonucleico o proteína que se codifica por el gen se produce por el mecanismo de transcripción y/o traducción celular. En un modo de realización, el vector de expresión de la invención comprende un casete de expresión que comprende secuencias polinucleotídicas que codifican moléculas de unión a antígeno biespecíficas de la invención o fragmentos de las mismas.
Los términos "célula huésped", "línea de células huésped" y "cultivo de células huésped" se usan de manera intercambiable y se refieren a células en las que se ha introducido ácido nucleico exógeno, incluyendo la descendencia de dichas células. Las células huésped incluyen "transformantes" y "células transformadas" que incluyen la célula transformada primaria y la descendencia derivada de la misma independientemente del número de pases. La descendencia puede no ser completamente idéntica en contenido de ácido nucleico a una célula original, sino que puede contener mutaciones. La descendencia mutante que tiene la misma función o actividad biológica que la cribada o seleccionada en la célula transformada originalmente se incluye en el presente documento. Una célula huésped es cualquier tipo de sistema celular que se puede usar para generar las moléculas de unión a antígeno biespecíficas de la presente invención. En particular, la célula huésped es una célula huésped procariota o eucariota. Las células huésped incluyen células cultivadas, por ejemplo, células cultivadas de mamífero, tales como células CHO, células BHK, células NS0, células SP2/0, células de mieloma YO, células de mieloma de ratón P3X63, células PER, células PER.C6 o células de hibridoma, células de levadura, células de insecto y células vegetales, por nombras algunas, pero también células comprendidas dentro de un animal transgénico, planta transgénica o planta cultivada o tejido animal o vegetal cultivado.
Una "cantidad eficaz" de un agente se refiere a la cantidad que es necesaria para dar como resultado un cambio fisiológico en la célula o tejido al que se administra.
Una "cantidad terapéuticamente eficaz" de un agente, por ejemplo, una composición farmacéutica, se refiere a una cantidad eficaz, en dosificaciones y durante periodos de tiempo necesarios, para lograr el resultado terapéutico o profiláctico deseado. Una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente, por ejemplo, elimina, disminuye, retrasa, minimiza o previene efectos adversos de una enfermedad.
Un "individuo" o "sujeto" es un mamífero. Los mamíferos incluyen, pero no se limitan a, animales domésticos (por ejemplo, vacas, ovejas, gatos, perros y caballos), primates (por ejemplo, seres humanos y primates no humanos, tales como monos), conejos y roedores (por ejemplo, ratones y ratas). En particular, el individuo o sujeto es un ser humano.
El término "composición farmacéutica" se refiere a una preparación que está en tal forma que permite que la actividad biológica de un ingrediente activo contenido en la misma sea eficaz, y que no contiene componentes adicionales que sean inaceptablemente tóxicos para un sujeto al que se le administraría la formulación.
Un "excipiente farmacéuticamente aceptable" se refiere a un ingrediente en una composición farmacéutica, distinto de un ingrediente activo, que no es tóxico para un sujeto. Un excipiente farmacéuticamente aceptable incluye, pero no se limita a, un tampón, un estabilizante o un conservante.
El término "prospecto del envase" se usa para referirse a las instrucciones incluidas habitualmente en envases comerciales de productos terapéuticos, que contienen información sobre las indicaciones, uso, dosificación, administración, politerapia, contraindicaciones y/o advertencias sobre el uso de dichos productos terapéuticos.
Como se usa en el presente documento, "tratamiento" (y variaciones gramaticales del mismo, tales como "tratar" o "que trata") se refiere a la intervención clínica en un intento de alterar la evolución natural del individuo que se está tratando, y que se puede realizar para la profilaxis o bien durante la evolución de una patología clínica. Los efectos deseables del tratamiento incluyen, pero no se limitan a, prevención de la aparición o recidiva de la enfermedad, alivio de los síntomas, disminución de cualquier consecuencia patológica directa o indirecta de la enfermedad, prevención de metástasis, disminución de la tasa de progresión de la enfermedad, mejora o atenuación del estado de la enfermedad y remisión o mejora del pronóstico. En algunos modos de realización, se usan las moléculas de la invención para retrasar el desarrollo de una enfermedad o para ralentizar la progresión de una enfermedad.
El término "cáncer" como se usa en el presente documento se refiere a enfermedades proliferativas, tales como linfomas, leucemias linfocíticas, cáncer de pulmón, cáncer de pulmón no microcítico (CPNM), cáncer de pulmón bronquioloalveolar, cáncer de huesos, cáncer pancreático, cáncer de piel, cáncer de cabeza o cuello, melanoma cutáneo o intraocular, cáncer uterino, cáncer ovárico, cáncer rectal, cáncer de la región anal, cáncer de estómago, cáncer gástrico, cáncer de colon, cáncer de mama, cáncer uterino, carcinoma de las trompas de Falopio, carcinoma de endometrio, carcinoma de cuello uterino, carcinoma de la vagina, carcinoma de la vulva, enfermedad de Hodgkin, cáncer de esófago, cáncer del intestino delgado, cáncer del sistema endocrino, cáncer de la glándula tiroidea, cáncer de la glándula paratiroidea, cáncer de la glándula suprarrenal, sarcoma de partes blandas, cáncer de uretra, cáncer de pene, cáncer de próstata, cáncer de vejiga, cáncer de riñón o uréter, carcinoma de células renales, carcinoma de la pelvis renal, mesotelioma, cáncer hepatocelular, cáncer biliar, neoplasias del sistema nervioso central (SNC), tumores de la médula espinal, glioma del tronco encefálico, glioblastoma multiforme, astrocitomas, schwanomas, ependimomas, meduloblastomas, meningiomas, carcinomas de células escamosas, adenoma hipofisario y sarcoma de Ewing, incluyendo las versiones resistentes al tratamiento de cualquiera de los cánceres anteriores o una combinación de uno o más de los cánceres anteriores.
Anticuerpos biespecíficos de la invención
La invención proporciona anticuerpos biespecíficos novedosos que comprenden un primer sitio de unión a antígeno que se une específicamente a PD1 y un segundo sitio de unión a antígeno que se une específicamente a TIM-3, con propiedades en particular ventajosas tales como producibilidad, estabilidad, afinidad de unión, actividad biológica, selección específica de determinados linfocitos T, eficacia de selección y reducción en la toxicidad. En particular, estos son anticuerpos biespecíficos, en los que el anticuerpo biespecífico se une a PD1 con alta afinidad y a TIM3 con baja afinidad.
A. Anticuerpos biespecíficos ejemplares que se unen a PD1 y TIM-3
En un aspecto, la divulgación proporciona un anticuerpo biespecífico que comprende un primer sitio de unión a antígeno que se une específicamente a PD1 y un segundo sitio de unión a antígeno que se une específicamente a TIM3, en el que
dicho primer sitio de unión a antígeno que se une específicamente a PD1 comprende
un dominio VH que comprende
(i) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:37,
(ii) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:38, y
(iii) HVR-H3 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:39; y
un dominio VL que comprende
(i) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:40;
(ii) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:41, y
(iii) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:42; y
dicho segundo sitio de unión a antígeno que se une específicamente a TIM3 comprende
(a) un dominio VH que comprende
(i) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:1,
(ii) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2, y
(iii) HVR-H3 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:3; y
un dominio VL que comprende
(i) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 11 o SEQ ID NO: 12, (ii) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:5, y
(iii) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:6; o
(b) un dominio VH que comprende
(i) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:17,
(ii) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:18, y
(iii) HVR-H3 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:19; y
un dominio VL que comprende
(i) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:20,
(ii) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:21, y
(iii) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:22; o
(c) un dominio VH que comprende
(i) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:29,
(ii) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:30, y
(iii) HVR-H3 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:31; y
un dominio VL que comprende
(i) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:32,
(ii) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:33, y
(iii) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:34.
En un aspecto particular, se proporciona un anticuerpo biespecífico que comprende un primer sitio de unión a antígeno que se une específicamente a PD1 y un segundo sitio de unión a antígeno que se une específicamente a TIM3, en el que
dicho primer sitio de unión a antígeno que se une específicamente a PD1 comprende
un dominio VH que comprende
(i) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:37,
(ii) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:38, y
(iii) HVR-H3 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:39; y
un dominio VL que comprende
(i) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:40;
(ii) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:41, y
(iii) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:42; y
dicho segundo sitio de unión a antígeno que se une específicamente a TIM3 comprende
un dominio VH que comprende
(i) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:1,
(ii) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2, y
(iii) HVR-H3 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:3; y
un dominio VL que comprende
(i) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:12,
(ii) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:5, y
(iii) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:6.
En otro aspecto particular, se proporciona un anticuerpo biespecífico que comprende un primer sitio de unión a antígeno que se une específicamente a PD1 y un segundo sitio de unión a antígeno que se une específicamente a TIM3, en el que
dicho primer sitio de unión a antígeno que se une específicamente a PD1 comprende
un dominio VH que comprende
(i) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:37,
(ii) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:38, y
(iii) HVR-H3 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:39; y
un dominio VL que comprende
(i) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:40;
(ii) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:41, y
(iii) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:42; y
dicho segundo sitio de unión a antígeno que se une específicamente a TIM3 comprende
un dominio VH que comprende
(i) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:17,
(ii) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:18, y
(iii) HVR-H3 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:19; y
un dominio VL que comprende
(i) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:20,
(ii) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:21, y
(iii) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:22.
En otro aspecto, se proporciona un anticuerpo biespecífico que comprende un primer sitio de unión a antígeno que se une específicamente a PD1 y un segundo sitio de unión a antígeno que se une específicamente a TIM3, en el que
dicho primer sitio de unión a antígeno que se une específicamente a PD1 comprende
(a) un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 43 y un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 44, o
(b) un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 45 y un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 46, o
(c) un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 45 y un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 47, o
(d) un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 45 y un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 48, o
(e) un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 45 y un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 49,
y dicho segundo sitio de unión a antígeno que se une específicamente a TIM3 comprende
(a) un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 y un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8, o
(b) un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9 y un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10, o
(c) un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 13 y un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14, o
(d) un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 15 y un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 16, o
(e) un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 23 y un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 24, o
(f) un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 25 y un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 26, o
(g) un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 27 y un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 28, o
(h) un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 35 y un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 36.
En otro aspecto, el anticuerpo biespecífico que comprende un primer sitio de unión a antígeno que se une específicamente a PD1 y un segundo sitio de unión a antígeno que se une específicamente a TIM3 es un anticuerpo humano, humanizado o quimérico. En particular, es un anticuerpo humanizado.
En un aspecto, se proporciona un anticuerpo biespecífico humanizado que comprende un primer sitio de unión a antígeno que se une específicamente a PD1 y un segundo sitio de unión a antígeno que se une específicamente a TIM3, en el que
dicho primer sitio de unión a antígeno que se une específicamente a PD1 comprende
(a) un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 45 y un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 46, o
(b) un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 45 y un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 47, o
(c) un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 45 y un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 48, o
(d) un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 45 y un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 49,
y dicho segundo sitio de unión a antígeno que se une específicamente a TIM3 comprende
(a) un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 13 y un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14, o
(b) un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 15 y un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 16, o
(c) un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 25 y un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 26, o
(d) un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 27 y un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 28.
En un aspecto particular, se proporciona un anticuerpo biespecífico que comprende un primer sitio de unión a antígeno que se une específicamente a PD1 y un segundo sitio de unión a antígeno que se une específicamente a TIM3, en el que
dicho primer sitio de unión a antígeno que se une específicamente a PD1 comprende un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 45 y un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 46,
y dicho segundo sitio de unión a antígeno que se une específicamente a TIM3 comprende un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 15 y un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 16 o un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 25 y un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 26.
En particular, la invención proporciona un anticuerpo biespecífico que comprende un primer sitio de unión a antígeno que se une específicamente a PD1 y un segundo sitio de unión a antígeno que se une específicamente a TIM3, en el que
dicho primer sitio de unión a antígeno que se une específicamente a PD1 comprende
un dominio VH que comprende
(i) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:37,
(ii) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:38, y
(iii) HVR-H3 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:39; y
un dominio VL que comprende
(i) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:40;
(ii) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:41, y
(iii) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:42; y
dicho segundo sitio de unión a antígeno que se une específicamente a TIM3 comprende un dominio VH que comprende
(i) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:17,
(ii) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:18, y
(iii) HVR-H3 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:19; y
un dominio VL que comprende
(i) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:20,
(ii) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:21, y
(iii) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:22.
Más en particular, se proporciona un anticuerpo biespecífico que comprende un primer sitio de unión a antígeno que se une específicamente a PD1 y un segundo sitio de unión a antígeno que se une específicamente a TIM3, en el que dicho primer sitio de unión a antígeno que se une específicamente a PD1 comprende un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 45 y un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48 y SEQ ID NO: 49, y dicho segundo sitio de unión a antígeno que se une específicamente a TIM3 comprende un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 25 y un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 26.
Más específicamente, se proporciona un anticuerpo biespecífico que comprende un primer sitio de unión a antígeno que se une específicamente a PD1 y un segundo sitio de unión a antígeno que se une específicamente a TIM3, en el que dicho primer sitio de unión a antígeno que se une específicamente a PD1 comprende un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 45 y un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 46, y dicho segundo sitio de unión a antígeno que se une específicamente a TIM3 comprende un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 25 y un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 26.
En otro aspecto, se proporciona un anticuerpo biespecífico que comprende un primer sitio de unión a antígeno que se une específicamente a PD1 y un segundo sitio de unión a antígeno que se une específicamente a TIM3, en el que dicho primer sitio de unión a antígeno que se une específicamente a PD1 comprende un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 45 y un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID No : 46, SEQ ID n O: 47, s Eq ID NO: 48 y SEQ ID NO: 49, y dicho segundo sitio de unión a antígeno que se une específicamente a TIM3 comprende un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 27 y un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 28.
En un aspecto, el anticuerpo biespecífico que comprende un primer sitio de unión a antígeno que se une específicamente a PD1 y un segundo sitio de unión a antígeno que se une específicamente a TIM3 es bivalente. Esto quiere decir que el anticuerpo biespecífico comprende un sitio de unión a antígeno que se une específicamente a p D1 y un sitio de unión a antígeno que se une específicamente a TIM3 (formato 1 1).
En otro aspecto, se proporciona un anticuerpo biespecífico que comprende un primer sitio de unión a antígeno que se une específicamente a PD1 y un segundo sitio de unión a antígeno que se une específicamente a TIM3, en el que el anticuerpo biespecífico se une a TIM3 con baja afinidad y se une a PD1 con alta afinidad. En un aspecto particular, la invención proporciona un anticuerpo biespecífico que comprende un primer sitio de unión a antígeno que se une específicamente a PD1 y un segundo sitio de unión a antígeno que se une específicamente a TIM3, en el que el anticuerpo biespecífico se une a TIM3 con una afinidad de unión al menos 50 veces menor cuando se compara con la unión a PD1, más en particular con una afinidad de unión al menos 50 veces menor cuando se compara con la unión a PD1. En un modo de realización preferente, la afinidad de unión (KD) se determina con el ensayo de resonancia de plasmón superficial (como se describe, por ejemplo, en el ejemplo 12).
En un aspecto, se proporciona por tanto un anticuerpo biespecífico que comprende un primer sitio de unión a antígeno que se une específicamente a PD1 y un segundo sitio de unión a antígeno que se une específicamente a TIM3, en el que
dicho primer sitio de unión a antígeno que se une específicamente a PD1 con alta afinidad comprende (a) un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 43 y un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 44, o
(b) un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 45 y un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 46, o
(c) un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 45 y un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 47, o
(d) un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 45 y un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 48, o
(d) un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 45 y un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 49,
y dicho segundo sitio de unión a antígeno que se une específicamente a TIM3 con baja afinidad comprende
(a) un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 23 y un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 24, o
(c) un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 25 y un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 26, o
(d) un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 27 y un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 28.
En un aspecto específico, se proporciona un anticuerpo biespecífico que comprende un primer sitio de unión a antígeno que se une específicamente a PD1 y un segundo sitio de unión a antígeno que se une específicamente a TIM3, en el que dicho primer sitio de unión a antígeno que se une específicamente a PD1 con alta afinidad comprende un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 45 y un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 46, y dicho segundo sitio de unión a antígeno que se une específicamente a TIM3 con baja afinidad comprende un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 25 y un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 26.
En otro aspecto, la divulgación se refiere a un anticuerpo biespecífico que comprende un primer sitio de unión a antígeno que se une específicamente a PD1 y un segundo sitio de unión a antígeno que se une específicamente a TIM3, en el que el anticuerpo biespecífico comprende un dominio Fc, un primer fragmento Fab que comprende el sitio de unión a antígeno que se une específicamente a PD1 y un segundo fragmento Fab que comprende el sitio de unión a antígeno que se une específicamente a TIM3.
En particular, el dominio Fc es un dominio de IgG, más en particular un dominio Fc de IgG1 o un dominio Fc de IgG4.
En otro aspecto, se divulga un anticuerpo biespecífico que comprende un primer sitio de unión a antígeno que se une específicamente a PD1 y un segundo sitio de unión a antígeno que se une específicamente a TIM3, que comprende
(a) una primera cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 95 % de identidad de secuencia con la secuencia de SEQ ID NO: 50, una primera cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 95 % de identidad de secuencia con la secuencia de SEQ ID NO: 52,
una segunda cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 95 % de identidad de secuencia con la secuencia de SEQ ID NO: 51, y una segunda cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 95 % de identidad de secuencia con la secuencia de SEQ ID NO:53, o
(b) una primera cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 95 % de identidad de secuencia con la secuencia de SEQ ID NO: 54, una primera cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 95 % de identidad de secuencia con la secuencia de SEQ ID NO: 56,
una segunda cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 95 % de identidad de secuencia con la secuencia de SEQ ID NO: 55, y una segunda cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 95 % de identidad de secuencia con la secuencia de SEQ ID NO:57, o
(c) una primera cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 95 % de identidad de secuencia con la secuencia de SEQ ID NO: 58, una primera cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 95 % de identidad de secuencia con la secuencia de SEQ ID NO: 60,
una segunda cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 95 % de identidad de secuencia con la secuencia de SEQ ID NO: 59, y una segunda cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 95 % de identidad de secuencia con la secuencia de SEQ ID NO:61, o
(d) una primera cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 95 % de identidad de secuencia con la secuencia de SEQ ID NO: 62, una primera cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 95 % de identidad de secuencia con la secuencia de SEQ ID NO: 64,
una segunda cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 95 % de identidad de secuencia con la secuencia de SEQ ID NO: 63, y una segunda cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 95 % de identidad de secuencia con la secuencia de SEQ ID NO:65, o
(e) una primera cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 95 % de identidad de secuencia con la secuencia de SEQ ID NO: 66, una primera cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 95 % de identidad de secuencia con la secuencia de SEQ ID NO: 68,
una segunda cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 95 % de identidad de secuencia con la secuencia de SEQ ID NO: 67, y una segunda cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 95 % de identidad de secuencia con la secuencia de SEQ ID NO:69.
En un aspecto particular, se divulga un anticuerpo biespecífico que comprende un primer sitio de unión a antígeno que se une específicamente a PD1 y un segundo sitio de unión a antígeno que se une específicamente a TIM3, que comprende
(a) una primera cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 50, una primera cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 52,
una segunda cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 51, y una segunda cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:53, o
(b) una primera cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 54, una primera cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 56,
una segunda cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 55, y una segunda cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:57, o
(c) una primera cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 58, una primera cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 60,
una segunda cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 59, y una segunda cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:61, o
(d) una primera cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 62, una primera cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 64,
una segunda cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 63, y una segunda cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:65, o
(e) una primera cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 66, una primera cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 68,
una segunda cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 67, y una segunda cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:69.
Más en particular, se proporciona un anticuerpo biespecífico que comprende un primer sitio de unión a antígeno que se une específicamente a PD1 y un segundo sitio de unión a antígeno que se une específicamente a TIM3, que comprende una primera cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 62, una primera cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 64, una segunda cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 63 y una segunda cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 65.
En otro aspecto particular, se proporciona un anticuerpo biespecífico que comprende un primer sitio de unión a antígeno que se une específicamente a PD1 y un segundo sitio de unión a antígeno que se une específicamente a TIM3, una primera cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 66, una primera cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 68, una segunda cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 67 y una segunda cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 69.
En otro aspecto, el anticuerpo biespecífico que comprende un primer sitio de unión a antígeno que se une específicamente a PD1 y un segundo sitio de unión a antígeno que se une específicamente a TIM3 es tetravalente. En un aspecto, el anticuerpo biespecífico comprende dos sitios de unión a antígeno que se unen específicamente a PD1 y dos sitios de unión a antígeno que se unen específicamente a TIM3 (formato 2+2).
En un aspecto, el anticuerpo biespecífico de la invención comprende
(a) dos cadenas ligeras y dos cadenas pesadas de un anticuerpo que comprende dos fragmentos Fab que comprenden los sitios de unión a antígeno que se unen específicamente a TIM3, y
(b) dos fragmentos Fab adicionales que comprenden los sitios de unión a antígeno que se unen específicamente a PD1, en el que dichos fragmentos Fab adicionales se conectan cada uno por medio de un conector peptídico al extremo C de las cadenas pesadas de (a).
En un aspecto particular, el conector peptídico es (G4S)4. En otro aspecto, los dos fragmentos Fab adicionales que comprenden los sitios de unión a antígeno que se unen específicamente a PD1 son fragmentos Fab de entrecruzamiento en los que los dominios variables VL y VH se reemplazan entre sí y las cadenas VL-CH se conectan cada una por medio de un conector peptídico al extremo C de las cadenas pesadas de (a).
En un aspecto particular, se proporciona un anticuerpo biespecífico que comprende un primer sitio de unión a antígeno que se une específicamente a PD1 y un segundo sitio de unión a antígeno que se une específicamente a TIM3, que comprende
(a) dos cadenas pesadas, que comprenden cada una la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 70, una primera cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 71, y una segunda cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 72, o
(b) dos cadenas pesadas, que comprenden cada una la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 73, una primera cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 74, y una segunda cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 75, o
(c) dos cadenas pesadas, que comprenden cada una la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 76, una primera cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 77, y una segunda cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 78.
Modificaciones en el dominio Fc que reducen la unión al receptor de Fc y/o la función efectora
En determinados aspectos, se pueden introducir una o más modificaciones aminoacídicas en la región Fc de un anticuerpo proporcionado en el presente documento, generando de este modo una variante de la región Fc. La variante de la región Fc puede comprender una secuencia de la región Fc humana (por ejemplo, una región Fc de IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4 humana) que comprende una modificación aminoacídica (por ejemplo, una sustitución) en una o más posiciones aminoacídicas.
La siguiente sección describe aspectos preferentes de las moléculas de unión a antígeno biespecíficas que comprenden modificaciones de dominio Fc que reducen la unión al receptor de Fc y/o la función efectora. En un aspecto, la divulgación se refiere a un anticuerpo biespecífico que comprende un primer sitio de unión a antígeno que se une específicamente a PD1 y un segundo sitio de unión a antígeno que se une específicamente a TIM3, en el que el dominio Fc comprende una o más sustituciones aminoacídicas que reducen la unión a un receptor de Fc, en particular hacia el receptor de Fcy. En particular, el dominio Fc es de la subclase IgG1 humana con las mutaciones aminoacídicas L234A, L235A y P329G (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat).
El dominio Fc confiere propiedades farmacocinéticas favorables a los anticuerpos biespecíficos de la invención, incluyendo una semivida en suero larga lo que contribuye a una acumulación buena en el tejido diana y una proporción de distribución en tejido-sangre favorable. Al mismo tiempo, sin embargo, puede dar lugar a una selección indeseable de los anticuerpos biespecíficos de la invención para células que expresan receptores de Fc en lugar de para las células que portan antígenos preferentes. En consecuencia, en modos de realización particulares, el dominio Fc de los anticuerpos biespecíficos presenta una reducción en la afinidad de unión por un receptor de Fc y/o reducción en la función efectora, en comparación con un dominio Fc de IgG natural, en particular un dominio Fc de IgG1 o un dominio Fc de IgG4. Más en particular, el dominio Fc es un dominio Fc de IgG1.
En un aspecto de este tipo, el dominio Fc (o la molécula de unión a antígeno biespecífica de la invención que comprende dicho dominio Fc) presenta menos de un 50 %, preferentemente menos de un 20 %, más preferentemente menos de un 10 % y lo más preferentemente menos de un 5 % de la afinidad de unión por un receptor de Fc, en comparación con un dominio Fc de IgG1 natural (o la molécula de unión a antígeno biespecífica de la invención que comprende un dominio Fc de IgG1 natural), y/o menos de un 50 %, preferentemente menos de un 20 %, más preferentemente menos de un 10 % y lo más preferentemente menos de un 5 % de la función efectora, en comparación con un dominio Fc de IgG1 natural (o la molécula de unión a antígeno biespecífica de la invención que comprende un dominio Fc de IgG1 natural). En un aspecto, el dominio Fc (o la molécula de unión a antígeno biespecífica de la invención que comprende dicho dominio Fc) no se une sustancialmente a un receptor de Fc y/o induce la función efectora. En un aspecto particular, el receptor de Fc es un receptor de Fcy. En un aspecto, el receptor de Fc es un receptor de Fc humano. En un aspecto, el receptor de Fc es un receptor de Fc activador. En un aspecto específico, el receptor de Fc es un receptor de Fcy humano activador, más específicamente FcyRIIIa, FcyRI o FcyRIIa humano, lo más específicamente FcyRIIIa humano. En un aspecto, el receptor de Fc es un receptor de Fc inhibidor. En un aspecto específico, el receptor de Fc es un receptor de Fcy humano inhibidor, más específicamente FcyRIIB humano. En un aspecto, la función efectora es una o más de CDC, ADCC, ADCP y secreción de citocinas. En un aspecto particular, la función efectora es ADCC. En un aspecto, el dominio Fc presenta una afinidad de unión sustancialmente similar por el receptor de Fc neonatal (FcRn), en comparación con un dominio Fc de IgG1 natural. Se logra una unión sustancialmente similar a FcRn cuando el dominio Fc (o la molécula de unión a antígeno biespecífica de la invención que comprende dicho dominio Fc) presenta más de aproximadamente un 70 %, en particular más de aproximadamente un 80 %, más en particular más de aproximadamente un 90 % de la afinidad de unión por un dominio Fc de IgG1 natural (o la molécula de unión a antígeno biespecífica de la invención que comprende un dominio Fc de IgG1 natural) por FcRn.
En un aspecto particular, el dominio Fc se genomanipula para tener una reducción en la afinidad de unión por un receptor de Fc y/o reducción en la función efectora, en comparación con un dominio Fc no genomanipulado. En un aspecto particular, el dominio Fc de la molécula de unión a antígeno biespecífica de la invención comprende una o más mutaciones aminoacídicas que reducen la afinidad de unión del dominio Fc por un receptor de Fc y/o función efectora. Típicamente, la misma una o más mutaciones aminoacídicas están presentes en cada una de las dos subunidades del dominio Fc. En un aspecto, la mutación aminoacídica reduce la afinidad de unión del dominio Fc por un receptor de Fc. En otro aspecto, la mutación aminoacídica reduce la afinidad de unión del dominio Fc por un receptor de Fc en al menos 2 veces, al menos 5 veces, o al menos 10 veces. En un aspecto, la molécula de unión a antígeno biespecífica de la invención que comprende un dominio Fc genomanipulado presenta menos de un 20 %, en particular menos de un 10 %, más en particular menos de un 5 % de la afinidad de unión por un receptor de Fc en comparación con los anticuerpos biespecíficos de la invención que comprende un dominio Fc no genomanipulado. En un aspecto particular, el receptor de Fc es un receptor de Fcy. En otros aspectos, el receptor de Fc es un receptor de Fc humano. En un aspecto, el receptor de Fc es un receptor de Fc inhibidor. En un aspecto específico, el receptor de Fc es un receptor de Fcy humano inhibidor, más específicamente FcyRIIB humano. En algunos aspectos, el receptor de Fc es un receptor de Fc activador. En un aspecto específico, el receptor de Fc es un receptor de Fcy humano activador, más específicamente FcyRIIIa, FcyRI o FcyRIIa humano, lo más específicamente FcyRIIIa humano. Preferentemente, se reduce la unión a cada uno de estos receptores. En algunos aspectos, también se reduce la afinidad de unión por un componente del complemento, específicamente la afinidad de unión por C1q. En un aspecto, no se reduce la afinidad de unión por el receptor de Fc neonatal (FcRn). La unión sustancialmente similar a FcRn, es decir, la conservación de la afinidad de unión del dominio Fc a dicho receptor, se logra cuando el dominio Fc (o la molécula de unión a antígeno biespecífica de la invención que comprende dicho dominio Fc) presenta más de aproximadamente un 70 % de la afinidad de unión de una forma no genomanipulada del dominio Fc (o la molécula de unión a antígeno biespecífica de la invención que comprende dicha forma no genomanipulada del dominio Fc) por FcRn. El dominio Fc, o la molécula de unión a antígeno biespecífica de la invención que comprende dicho dominio Fc, puede presentar más de aproximadamente un 80 % e incluso más de aproximadamente un 90 % de dicha afinidad. En determinados modos de realización, el dominio Fc de la molécula de unión a antígeno biespecífica de la invención se genomanipula para tener una reducción en la función efectora, en comparación con un dominio Fc no genomanipulado. La reducción en la función efectora puede incluir, pero no se limita a, uno o más de los siguientes: reducción en la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC), reducción en la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC), reducción en la fagocitosis celular dependiente de anticuerpos (ADCP), reducción en la secreción de citocinas, reducción en la captación de antígenos mediada por inmunocomplejos por células presentadoras de antígenos, reducción en la unión a linfocitos NK, reducción en la unión a macrófagos, reducción en la unión a monocitos, reducción en la unión a células polimorfonucleares, reducción en la señalización directa que induce apoptosis, reducción en la maduración de células dendríticas o reducción en el cebado de linfocitos.
Los anticuerpos con una reducción en la función efectora incluyen aquellos con sustitución de uno o más de los residuos de la región Fc 238, 265, 269, 270, 297, 327 y 329 (patente de EE. UU. n.° 6.737.056). Dichos mutantes Fc incluyen mutantes Fc con sustituciones en dos o más de las posiciones aminoacídicas 265, 269, 270, 297 y 327, incluyendo el llamado mutante Fc "DANA" con sustitución de los residuos 265 y 297 con alanina (patente de EE. UU. n.° 7.332.581). Se describen determinadas variantes de anticuerpo con una mejora o disminución en la unión a FcR (por ejemplo, patente de EE. UU. n.° 6.737.056; documento WO 2004/056312 y Shields, R.L. et al., J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604).
En un aspecto, el dominio Fc comprende una sustitución aminoacídica en una posición de E233, L234, L235, N297, P331 y P329. En algunos aspectos, el dominio Fc comprende las sustituciones aminoacídicas L234A y L235A ("LALA"). En un aspecto de este tipo, el dominio Fc es un dominio Fc de IgG1, en particular un dominio Fc de IgG1 humana. En un aspecto, el dominio Fc comprende una sustitución aminoacídica en la posición P329. En un aspecto más específico, la sustitución aminoacídica es P329A o P329G, en particular, P329G. En un modo de realización, el dominio Fc comprende una sustitución aminoacídica en la posición P329 y otra sustitución aminoacídica seleccionada del grupo que consiste en E233P, L234A, L235A, l235E, N297A, n 297D o P331S. En modos de realización más particulares, el dominio Fc comprende las mutaciones aminoacídicas L234A, L235A y P329G ("P329G LALA"). La combinación "P329G LALA" de sustituciones aminoacídicas elimina casi por completo la unión al receptor de Fcy de un dominio Fc de IgG1 humana, como se describe en la solicitud de patente PCT n.° WO 2012/130831 A1. Dicho documento también describe procedimientos de preparación de dichos dominios Fc mutantes y procedimientos para determinar sus propiedades tales como la unión al receptor de Fc o funciones efectoras. dicho anticuerpo es una IgG1 con las mutaciones L234A y L235A o con las mutaciones L234A, L235A y P329G (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat et al, Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5.a ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991).
En un aspecto, el anticuerpo biespecífico comprende (todas las posiciones de acuerdo con el índice EU de Kabat) (i) una región Fc homodimérica de la subclase IgG1 humana opcionalmente con las mutaciones P329G, L234A y L235A, o (ii) una región Fc homodimérica de la subclase IgG4 humana opcionalmente con las mutaciones P329G, S228P y L235E, o (iii) una región Fc homodimérica de la subclase IgG1 humana opcionalmente con las mutaciones P329G, L234A, L235A, 1253A, H310A y H435A, u opcionalmente con la mutaciones P329G, L234A, L235A, H310A, H433A e Y436A, o (iv) una región Fc heterodimérica en la que un polipéptido de la región Fc comprende la mutación T366W y el otro polipéptido de la región Fc comprende las mutaciones T366S, L368A e Y407V, o en la que un polipéptido de la región Fc comprende las mutaciones T366W e Y349C, y el otro polipéptido de la región Fc comprende las mutaciones T366S, L368A, Y407V y S354C, o en la que un polipéptido de la región Fc comprende las mutaciones T366W y S354C, y el otro polipéptido c de la región Fc incluye las mutaciones T366S, L368A, Y407V e Y349C, o (v) una región Fc heterodimérica de la subclase IgG1 humana en la que ambos polipéptidos de la región Fc comprenden las mutaciones P329G, L234A y L235A y un polipéptido de la región Fc comprende la mutación T366W, y el otro polipéptido de la región Fc comprende las mutaciones T366S, L368A e Y407v , o en la que un polipéptido de la región Fc comprende las mutaciones T366W e Y349C, y el otro polipéptido de la región Fc comprende las mutaciones T366S, L368A, Y407V y S354C, o en la que un polipéptido de la región Fc comprende las mutaciones T366W y S354C, y el otro polipéptido de la región Fc comprende las mutaciones T366S, L368A, Y407V e Y349C.
En un aspecto, el dominio Fc es un dominio Fc de IgG4. En un modo de realización más específico, el dominio Fc es un dominio Fc de IgG4 que comprende una sustitución aminoacídica en la posición S228 (numeración de Kabat), en particular la sustitución aminoacídica S228P. En un modo de realización más específico, el dominio Fc es un dominio Fc de IgG4 que comprende las sustituciones aminoacídicas L235E y S228P y P329G. Esta sustitución aminoacídica reduce el intercambio en el brazo Fab in vivo de los anticuerpos IgG4 (véase Stubenrauch et al., Drug Metabolism and Disposition 38, 84-91 (2010)). Por tanto, en un aspecto, se proporciona un anticuerpo biespecífico, que comprende (todas las posiciones de acuerdo con el índice EU de Kabat) una región Fc heterodimérica de la subclase IgG4 humana en la que ambos polipéptidos de la región Fc comprenden las mutaciones P329G, S228P y L235E y un polipéptido de la región Fc comprende la mutación T366W, y el otro polipéptido de la región Fc comprende las mutaciones T366S, L368A e Y407V, o en la que un polipéptido de la región Fc comprende las mutaciones T366W e Y349C, y el otro polipéptido de la región Fc comprende las mutaciones T366S, L368A, Y407V y S354C, o en la que un polipéptido de la región Fc comprende las mutaciones T366W y S354C, y el otro polipéptido de la región Fc comprende las mutaciones T366S, L368A, Y407V e Y349C.
Se describen anticuerpos con un incremento en las semividas y una mejora en la unión al receptor de Fc neonatal (FcRn), que es responsable de la transferencia de IgG maternas al feto (Guyer, R.L., et al., J. Immunol. 117 (1976) 587-593, y Kim, J.K., et al., J. Immunol. 24 (1994) 2429-2434) en el documento US2005/0014934. Estos anticuerpos comprenden una región Fc con una o más sustituciones en la misma que mejoran la unión de la región Fc a FcRn. Dichas variantes de Fc incluyen aquellas con sustituciones en uno o más de los residuos de la región Fc: 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 o 434, por ejemplo, la sustitución del residuo 434 de la región Fc (patente de EE. UU. n.° 7.371.826). Véanse también Duncan, A.R. y Winter, G., Nature 322 (1988) 738-740; los documentos US 5.648.260; US 5.624.821; y WO 94/29351 con respecto a otros ejemplos de variantes de la región Fc.
La unión a receptores de Fc se puede determinar fácilmente, por ejemplo, por ELISA, o por resonancia de plasmón superficial (SPR) usando instrumentación estándar tal como un instrumento BIAcore (GE Healthcare), y receptores de Fc tales como los que se pueden obtener por expresión recombinante. Un ensayo de unión de este tipo adecuado se describe en el presente documento. De forma alternativa, se puede evaluar la afinidad de unión de dominios Fc o moléculas de unión a antígeno biespecíficas activadoras de linfocitos que comprenden un dominio Fc por los receptores de Fc usando líneas celulares conocidas por expresar receptores de Fc particulares, tales como linfocitos NK humanos que expresan el receptor de FcyINa. La función efectora de un dominio Fc, o anticuerpos biespecíficos de la invención que comprenden un dominio Fc, se puede medir por procedimientos conocidos en la técnica. Un ensayo adecuado para medir la ADCC se describe en el presente documento. Otros ejemplos de ensayos in vitro para evaluar la actividad de ADCC de una molécula de interés se describen en la patente de EE. UU. n.° 5.500.362; Hellstrom et al. Proc Natl Acad Sci USA83, 7059-7063 (1986) y Hellstrom et al., Proc Natl Acad Sci USA82, 1499-1502 (1985); patente de EE. UU. n.° 5.821.337; Bruggemann et al., J Exp Med 166, 1351-1361 (1987). De forma alternativa, se pueden emplear procedimientos de ensayo no radioactivos (véase, por ejemplo, el ensayo de citotoxicidad no radioactivo ACTI” para citometría de flujo (CellTechnology, Inc. Mountain View, CA); y el ensayo de citotoxicidad no radioactivo CytoTox 96® (Promega, Madison, WI)). Las células efectoras útiles para dichos ensayos incluyen células mononucleares de sangre periférica (PBMC) y linfocitos citolíticos (NK). De forma alternativa, o adicionalmente, se puede evaluarla actividad de ADCC de la molécula de interés in vivo, por ejemplo, en un modelo animal tal como el divulgado en Clynes et al., Proc Natl Acad Sci USA95, 652-656 (1998).
Modificaciones en el dominio Fc que promueven la heterodimerización
Las moléculas de unión a antígeno biespecíficas comprenden diferentes sitios de unión a antígeno, fusionados a una o la otra de las dos subunidades del dominio Fc, por tanto las dos subunidades del dominio Fc pueden estar comprendidas en dos cadenas polipeptídicas no idénticas. La coexpresión recombinante de estos polipéptidos y la posterior dimerización dan lugar a varias combinaciones posibles de los dos polipéptidos. Para mejorar el rendimiento y la pureza de los anticuerpos biespecíficos de la invención en la producción recombinante, será ventajoso por tanto introducir en el dominio Fc de las moléculas de unión a antígeno biespecíficas una modificación que promueve la asociación de los polipéptidos deseados.
En consecuencia, en aspectos particulares, la divulgación se refiere a un anticuerpo biespecífico que comprende un primer sitio de unión a antígeno que se une específicamente a PD1 y un segundo sitio de unión a antígeno que se une específicamente a TIM3, en el que el dominio Fc comprende una modificación que promueve la asociación de la primera y segunda subunidad del dominio Fc. El sitio de interacción proteína-proteína más extensa entre las dos subunidades de un dominio Fc de IgG humana es en el dominio CH3 del dominio Fc. Por tanto, en un aspecto, dicha modificación está en el dominio CH3 del dominio Fc.
En un aspecto específico, dicha modificación es una modificación llamada "botón en ojal", que comprende una modificación de "botón" en una de las dos subunidades del dominio Fc y una modificación de "ojal" en la otra de las dos subunidades del dominio Fc. Por tanto, la divulgación se refiere a un anticuerpo biespecífico que comprende un primer sitio de unión a antígeno que se une específicamente a PD1 y un segundo sitio de unión a antígeno que se une específicamente a TIM3, en el que la primera subunidad del dominio Fc comprende botones y la segunda subunidad del dominio Fc comprende ojales de acuerdo con el procedimiento de botones en ojales. En un aspecto particular, la primera subunidad del dominio Fc comprende las sustituciones aminoacídicas S354C y T366W (numeración EU) y la segunda subunidad del dominio Fc comprende las sustituciones aminoacídicas Y349C, T366S e Y407V (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat).
La tecnología de "botón-en-ojal" se describe, por ejemplo, en los documentos US 5.731.168; US 7.695.936; Ridgway et al., Prot Eng 9, 617-621 (1996) y Carter, J Immunol Meth 248, 7-15 (2001). En general, el procedimiento implica introducir una protuberancia ("botón") en la interfase de un primer polipéptido y una correspondiente cavidad ("ojal") en la interfase de un segundo polipéptido, de modo que la protuberancia se puede situar en la cavidad para promover la formación de heterodímeros y dificultar la formación de homodímeros. Las protuberancias se construyen reemplazando cadenas laterales de aminoácidos pequeñas de la interfase del primer polipéptido por cadenas laterales más grandes (por ejemplo, tirosina o triptófano). Se crean cavidades compensadoras de tamaño idéntico o similar a las protuberancias en la interfase del segundo polipéptido reemplazando cadenas laterales de aminoácido grandes por otras más pequeñas (por ejemplo, alanina o treonina).
En consecuencia, en un aspecto, en el dominio CH3 de la primera subunidad del dominio Fc de las moléculas de unión a antígeno biespecíficas un residuo aminoacídico se reemplaza por un residuo aminoacídico que tiene un volumen de cadena lateral más grande, generando de este modo una protuberancia dentro del dominio CH3 de la primera subunidad que es posicionable en una cavidad dentro del dominio CH3 de la segunda subunidad, y en el dominio CH3 de la segunda subunidad del dominio Fc un residuo aminoacídico se reemplaza por un residuo aminoacídico que tiene un volumen de cadena lateral más pequeño, generando de este modo una cavidad dentro del dominio c H3 de la segunda subunidad dentro del que la protuberancia dentro del dominio CH3 de la primera subunidad es posicionable. La protuberancia y la cavidad se pueden realizar alterando el ácido nucleico que codifica los polipéptidos, por ejemplo, por mutagénesis específica de sitio o por síntesis peptídica. En un aspecto específico, en el dominio CH3 de la primera subunidad del dominio Fc el residuo de treonina en la posición 366 se reemplaza con un residuo de triptófano (T366W), y en el dominio CH3 de la segunda subunidad del dominio Fc el residuo de tirosina en la posición 407 se reemplaza con un residuo de valina (Y407V). En un aspecto, en la segunda subunidad del dominio Fc adicionalmente el residuo de treonina en la posición 366 se reemplaza por un residuo de serina (T366S) y el residuo de leucina en la posición 368 se reemplaza por un residuo de alanina (L368A).
Aún en otro aspecto, en la primera subunidad del dominio Fc adicionalmente el residuo de serina en la posición 354 se reemplaza por un residuo de cisteína (S354C), y en la segunda subunidad del dominio Fc adicionalmente el residuo de tirosina en la posición 349 se reemplaza por un residuo de cisteína (Y349C). La introducción de estos dos residuos de cisteína da como resultado la formación de un puente disulfuro entre las dos subunidades del dominio Fc, estabilizando adicionalmente el dímero (Carter (2001), J Immunol Methods 248, 7-15). En un aspecto particular, la primera subunidad del dominio Fc comprende las sustituciones aminoacídicas S354C y T366W (numeración EU) y la segunda subunidad del dominio Fc comprende las sustituciones aminoacídicas Y349C, T366S e Y407V (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat).
Pero también se pueden usar otras tecnologías de botón en ojal como se describe por el documento EP1 870459 A1 forma alternativa o adicionalmente. En un modo de realización, el anticuerpo multiespecífico comprende las mutaciones R409D y K370E en el dominio CH3 de la "cadena de botones" y las mutaciones D399K y E357K en el dominio CH3 de la "cadena de ojales" (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat).
En un aspecto, el anticuerpo biespecífico comprende una mutación T366W en el dominio CH3 de la "cadena de botones" y las mutaciones T366S, L368A e Y407V en el dominio CH3 de la "cadena de ojales" y adicionalmente las mutaciones R409D y K370E en el dominio CH3, de la "cadena de botones" y las mutaciones D399K y E357K en el dominio CH3 de la "cadena de ojales" (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat).
En un aspecto, el anticuerpo biespecífico comprende las mutaciones Y349C y T366W en uno de los dos dominios CH3 y las mutaciones s 354C, T366S, L368A e Y407V en el otro de los dos dominios CH3, o el anticuerpo multiespecífico comprende las mutaciones Y349C y T366W en uno de los dos dominios CH3 y las mutaciones S354C, T366S, L368A e Y407V en el otro de los dos dominios CH3 y adicionalmente las mutaciones R409D y K370E en el dominio CH3 de la "cadena de botones" y las mutaciones D399K y E357K en el CH3 dominio de la "cadena de ojales" (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat).
En un aspecto alternativo, una modificación que promueve la asociación de la primera y la segunda subunidad del dominio Fc comprende una modificación que media en los efectos de conducción electrostática, por ejemplo, como se describe en la publicación PCT WO 2009/089004. En general, este procedimiento implica el reemplazo de uno o más residuos aminoacídicos en la interfase de las dos subunidades del dominio Fc por residuos aminoacídicos cargados de modo que la formación de homodímeros se vuelve electrostáticamente desfavorable pero la heterodimerización electrostáticamente favorable.
Además de la "tecnología de botón en ojal", otras técnicas para modificar los dominios CH3 de las cadenas pesadas de un anticuerpo multiespecífico para forzar la heterodimerización son conocidas en la técnica. Estas tecnologías, en especial las descritas en los documentos WO 96/27011, WO 98/050431, EP 1870459, WO 2007/110205, WO 2007/147901, WO 2009/089004, WO 2010/129304, WO 2011/90754, WO 2011/143545, WO 2012/058768, WO 2013/157954 and WO 2013/096291 se contemplan en el presente documento como alternativas a la "tecnología de botón en ojal" en combinación con un anticuerpo biespecífico.
En un aspecto, en el anticuerpo biespecífico se usa el enfoque descrito en el documento EP 1870459 para apoyar la heterodimerización de la primera cadena pesada y la segunda cadena pesada del anticuerpo multiespecífico. Este enfoque se basa en la introducción de aminoácidos cargados con cargas opuestas en posiciones aminoacídicas específicas en la interfase de dominio CH3/CH3 entre ambas, la primera y la segunda cadena pesada.
En consecuencia, en este aspecto en la estructura terciaria del anticuerpo multiespecífico el dominio CH3 de la primera cadena pesada y el dominio CH3 de la segunda cadena pesada forman una interfase que se localiza entre los respectivos dominios CH3 del anticuerpo, en los que las respectivas secuencias de aminoácidos del dominio CH3 de la primera cadena pesada y la secuencia de aminoácidos del dominio CH3 de la segunda cadena pesada comprenden cada uno un conjunto de aminoácidos que se localiza dentro de dicha interfase en la estructura terciaria del anticuerpo, en los que del conjunto de aminoácidos que se localiza en la interfase en el dominio CH3 de una cadena pesada, un primer aminoácido se sustituye por un aminoácido cargado positivamente y del conjunto de aminoácidos que se localiza en la interfase en el dominio CH3 de la otra cadena pesada, un segundo aminoácido se sustituye por un aminoácido cargado negativamente. El anticuerpo biespecífico de acuerdo con este aspecto también se denomina en el presente documento "anticuerpo biespecífico con CH3 genomanipulado (+/-)" (en el que la abreviatura "+/-" representa los aminoácidos con carga opuesta que se introdujeron en los respectivos dominios CH3).
En un aspecto, en el anticuerpo biespecífico con CH3 genomanipulado CH3 (+/-) el aminoácido cargado positivamente se selecciona de K, R y H, y el aminoácido cargado negativamente se selecciona de E o D.
En un aspecto, en el anticuerpo biespecífico con CH3 genomanipulado CH3 (+/-) el aminoácido cargado positivamente se selecciona de K y R, y el aminoácido cargado negativamente se selecciona de E o D.
En un aspecto, en el anticuerpo biespecífico con CH3 genomanipulado (+/-) el aminoácido cargado positivamente es K, y el aminoácido cargado negativamente es E.
En un aspecto, en el anticuerpo biespecífico con CH3 genomanipulado (+/-) en el dominio CH3 de una cadena pesada el aminoácido R en la posición 409 se sustituye por D y el aminoácido K en la posición se sustituye por E, y en el dominio CH3 de la otra cadena pesada el aminoácido D en la posición 399 se sustituye por K y el aminoácido E en la posición 357 se sustituye por K (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat).
En un aspecto, el enfoque descrito en el documento WO 2013/157953 se usa para apoyar la heterodimerización de la primera cadena pesada y la segunda cadena pesada del anticuerpo multiespecífico. En un modo de realización, en el dominio CH3 de una cadena pesada el aminoácido T en la posición 366 se sustituye por K, y en el dominio CH3 de la otra cadena pesada, el aminoácido L en la posición 351 se sustituye por D (numeración de acuerdo con índice EU de Kabat). En otro modo de realización, en el dominio CH3 de una cadena pesada el aminoácido T en la posición 366 se sustituye por K y el aminoácido L en la posición 351 se sustituye por K, y en el dominio CH3 de la otra cadena pesada el aminoácido L en la posición 351 se sustituye por D (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat).
En otro aspecto, en el dominio CH3 de una cadena pesada el aminoácido T en la posición 366 se sustituye por K y el aminoácido L en la posición 351 se sustituye por K, y en el dominio CH3 de la otra cadena pesada el aminoácido L en la posición 351 se sustituye por D (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat). Adicionalmente, al menos una de las siguientes sustituciones está comprendida en el dominio CH3 de la otra cadena pesada: el aminoácido Y en la posición 349 se sustituye por E, el aminoácido Y en la posición 349 se sustituye por D y el aminoácido L en la posición 368 se sustituye por E (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat). En un modo de realización, el aminoácido L en la posición 368 se sustituye por E (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat).
En un aspecto, el enfoque descrito en el documento WO 2012/058768 se usa para apoyar la heterodimerización de la primera cadena pesada y la segunda cadena pesada del anticuerpo multiespecífico. En un aspecto, en el dominio CH3 de una cadena pesada el aminoácido L en la posición 351 se sustituye por Y y el aminoácido Y en la posición 407 se sustituye por A, y en el dominio CH3 de la otra cadena pesada el aminoácido T en la posición 366 se sustituye por A y el aminoácido K en la posición 409 se sustituye por F (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat). En otro modo de realización, además de las sustituciones mencionadas anteriormente, en el dominio CH3 de la otra cadena pesada se sustituye al menos uno de los aminoácidos en las posiciones 411 (originalmente T), 399 (originalmente D), 400 (originalmente S), 405 (originalmente F), 390 (originalmente N) y 392 (originalmente K; numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat). Las sustituciones preferentes son:
- sustitución del aminoácido T en la posición 411 por un aminoácido seleccionado de N, R, Q, K, D, E y W (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat),
- sustitución del aminoácido D en la posición 399 por un aminoácido seleccionado de R, W, Y y K (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat),
- sustitución del aminoácido S en la posición 400 por un aminoácido seleccionado de E, D, R y K (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat),
- sustitución del aminoácido F en la posición 405 por un aminoácido seleccionado de I, M, T, S, V y W (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat);
- sustitución del aminoácido N en la posición 390 por un aminoácido seleccionado de R, K y D (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat), y
- sustitución del aminoácido K en la posición 392 por un aminoácido seleccionado de V, M, R, L, F y E (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat).
En otro aspecto, el anticuerpo biespecífico se genomanipula de acuerdo con el documento WO 2012/058768), es decir, en el dominio CH3 de una cadena pesada el aminoácido L en la posición 351 se sustituye por Y y el aminoácido Y en la posición 407 se sustituye por A, y en el dominio CH3 de la otra cadena pesada el aminoácido T en la posición 366 se sustituye por V y el aminoácido K en la posición 409 se sustituye por F (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat). En otro modo de realización del anticuerpo multiespecífico, en el dominio CH3 de una cadena pesada, el aminoácido Y en la posición 407 se sustituye por A, y en el dominio CH3 de la otra cadena pesada, el aminoácido T en la posición 366 se sustituye por A y el aminoácido K en la posición 409 se sustituye por F (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat). En el último modo de realización mencionado anteriormente, en el dominio CH3 de la otra cadena pesada el aminoácido K en la posición 392 se sustituye por E, el aminoácido T en la posición 411 se sustituye por E, el aminoácido D en la posición 399 se sustituye por R y el aminoácido S en la posición 400 se sustituye por R (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat).
En un aspecto, el enfoque descrito en el documento WO 2011/143545 se usa para apoyar la heterodimerización de la primera cadena pesada y la segunda cadena pesada del anticuerpo multiespecífico. En un aspecto, las modificaciones aminoacídicas en los dominios CH3 de ambas cadenas pesadas se introducen en las posiciones 368 y/o 409 (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat).
En un aspecto, el enfoque descrito en el documento WO 2011/090762 se usa para apoyar la heterodimerización de la primera cadena pesada y la segunda cadena pesada del anticuerpo biespecífico. El documento WO 2011/090762 se refiere a modificaciones aminoacídicas de acuerdo con la tecnología "botón en ojal" (KiH). En un modo de realización, en el dominio CH3 de una cadena pesada el aminoácido T en la posición 366 se sustituye por W, y en el dominio CH3 de la otra cadena pesada, el aminoácido Y en la posición 407 se sustituye por A (numeración de acuerdo con índice EU de Kabat). En otro modo de realización, en el dominio CH3 de una cadena pesada el aminoácido T en la posición 366 se sustituye por Y, y en el dominio CH3 de la otra cadena pesada, el aminoácido Y en la posición 407 se sustituye por T (numeración de acuerdo con índice EU de Kabat).
En un aspecto, el enfoque descrito en el documento WO 2009/089004 se usa para apoyar la heterodimerización de la primera cadena pesada y la segunda cadena pesada del anticuerpo biespecífico. En un modo de realización en el dominio CH3 de una cadena pesada el aminoácido K o N en la posición 392 se sustituye por un aminoácido cargado negativamente (en un modo de realización por E o D, en un modo de realización preferente por D), y en el dominio CH3 de la otra cadena pesada el aminoácido D en la posición 399, el aminoácido E o D en la posición 356 o el aminoácido E en la posición 357 se sustituye por un aminoácido cargado positivamente (en un modo de realización K o R, en un modo de realización preferente por K, en un modo de realización preferente, los aminoácidos en las posiciones 399 o 356 se sustituyen por K) (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat). En otro modo de realización, además de las sustituciones mencionadas anteriormente, en el dominio CH3 de una cadena pesada el aminoácido K o R en la posición 409 se sustituye por un aminoácido cargado negativamente (en un modo de realización por E o D, en un modo de realización preferente por D) (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat). Incluso en otro aspecto, además de o de forma alternativa a las sustituciones mencionadas anteriormente, en el dominio CH3 de una cadena pesada el aminoácido K en la posición 439 y/o el aminoácido K en la posición 370 se sustituye independientemente entre sí por un aminoácido cargado negativamente (en un modo de realización por E o D, en un modo de realización preferente por D) (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat).
En un aspecto, el enfoque descrito en el documento WO 2007/147901 se usa para apoyar la heterodimerización de la primera cadena pesada y la segunda cadena pesada del anticuerpo multiespecífico. En un modo de realización en el dominio CH3 de una cadena pesada, el aminoácido K en la posición 253 se sustituye por E, el aminoácido D en la posición 282 se sustituye por K y el aminoácido K en la posición 322 se sustituye por D, y en el dominio CH3 de la otra cadena pesada, el aminoácido D en la posición 239 se sustituye por K, el aminoácido E en la posición 240 se sustituye por K y el aminoácido K en la posición 292 se sustituye por D (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat).
El extremo C de la cadena pesada del anticuerpo biespecífico como se informa en el presente documento puede ser un extremo C completo que termina con los residuos aminoacídicos PGK. El extremo C de la cadena pesada puede ser un extremo C acortado en el que se han retirado uno o dos de los residuos aminoacídicos C terminales. En un aspecto preferente, el extremo C de la cadena pesada es un extremo C acortado que termina en PG.
En un aspecto de todos los aspectos como se informa en el presente documento, un anticuerpo biespecífico que comprende una cadena pesada que incluye un dominio CH3 C terminal como se especifica en el presente documento, comprende el dipéptido glicina-lisina C terminal (G446 y K447, numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat). En un modo de realización de todos los aspectos como se informa en el presente documento, un anticuerpo biespecífico que comprende una cadena pesada que incluye un dominio CH3 C terminal, como se especifica en el presente documento, comprende un residuo de glicina C terminal (G446, numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat).
Modificaciones en los dominios Fab
En un aspecto, la divulgación se refiere a un anticuerpo biespecífico que comprende un primer fragmento Fab que se une específicamente a PD1 y un segundo fragmento Fab que se une específicamente a TIM3, en el que en uno de los fragmentos Fab los dominios variables VH y VL o bien los dominios constantes CH1 y CL se intercambian. Los anticuerpos biespecíficos se preparan de acuerdo con la tecnología Crossmab.
Los anticuerpos multiespecíficos con un reemplazo/intercambio de dominio en un brazo de unión (CrossMabVH-VL o CrossMabCH-CL) se describen en detalle en el documento WO2009/080252 y Schaefer, W. et al, PNAS, 108 (2011) 11187-1191. Reducen claramente los subproductos provocados por el emparejamiento erróneo de una cadena ligera frente a un primer antígeno con la cadena pesada equivocada frente al segundo antígeno (en comparación con enfoques sin dicho intercambio de dominio).
En un aspecto particular, la divulgación se refiere a un anticuerpo biespecífico que comprende un primer fragmento Fab que se une específicamente a PD1 y un segundo fragmento Fab que se une específicamente a TIM3, en el que en uno de los fragmentos Fab los dominios variables VL y VH se reemplazan entre sí de modo que el dominio VH es parte de la cadena ligera y el dominio VL es parte de la cadena pesada. En un aspecto particular, el anticuerpo biespecífico es uno, en el que en el primer fragmento Fab que comprende el sitio de unión a antígeno que se une específicamente a PD1 los dominios variables VL y VH se reemplazan entre sí.
En otro aspecto, y para mejorar además el emparejamiento correcto, el anticuerpo biespecífico que comprende un primer fragmento Fab que se une específicamente a PD1 y un segundo fragmento Fab que se une específicamente a TIM3, puede contener diferentes sustituciones aminoacídicas cargadas (llamadas "residuos cargados"). Estas modificaciones se introducen en los dominios CH1 y CL cruzados o no cruzados.
En un aspecto particular, la divulgación se refiere a un anticuerpo biespecífico que comprende un primer fragmento Fab que se une específicamente a PD1 y un segundo fragmento Fab que se une específicamente a TIM3, en el que en uno de los fragmentos Fab en el dominio constante CL, el aminoácido en la posición 124 se sustituye independientemente por lisina (K), arginina (R) o histidina (H) (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat), y en el dominio constante CH1 los aminoácidos en las posiciones 147 y 213 se sustituyen independientemente por ácido glutámico (E) o ácido aspártico (D) (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat). En un aspecto particular, el anticuerpo biespecífico es uno, en el que en el segundo fragmento Fab que comprende el sitio de unión a antígeno que se une específicamente a TIM3 en el dominio constante CL el aminoácido en la posición 124 se sustituye independientemente por lisina (K), arginina (R) o histidina (H) (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat), y en el dominio constante CH1 los aminoácidos en las posiciones 147 y 213 se sustituyen independientemente por ácido glutámico (E) o ácido aspártico (D) (numeración de acuerdo con índice EU de Kabat).
En un aspecto particular, la divulgación se refiere a un anticuerpo biespecífico que comprende un primer fragmento Fab que se une específicamente a PD1 y un segundo fragmento Fab que se une específicamente a TIM3, en el que en uno de los dominios CL el aminoácido en la posición 123 (numeración EU) se ha reemplazado por arginina (R) y el aminoácido en la posición 124 (numeración EU) se ha sustituido por lisina (K) y en el que en uno de los dominios CH1 los aminoácidos en la posición 147 (numeración EU) y en la posición 213 (numeración EU) se han sustituido por ácido glutámico (E). En un aspecto particular, el anticuerpo biespecífico es uno, en el que en el segundo fragmento Fab que comprende el sitio de unión a antígeno que se une específicamente a TIM3 el aminoácido en la posición 123 (numeración EU) se ha reemplazado por arginina (R) y el aminoácido en la posición 124 (numeración EU) se ha sustituido por lisina (K) y en el que en uno de los dominios CH1 los aminoácidos en la posición 147 (numeración EU) y en la posición 213 (numeración EU) se han sustituido por ácido glutámico (E).
En otro aspecto, el anticuerpo biespecífico es un anticuerpo bivalente que comprende
a) una primera cadena ligera y una primera cadena pesada de un anticuerpo que se unen específicamente a un primer antígeno, y
b) una segunda cadena ligera y una segunda cadena pesada de un anticuerpo que se unen específicamente a un segundo antígeno, en el que los dominios variables VL y VH de la segunda cadena ligera y la segunda cadena pesada se reemplazan entre sí.
El anticuerpo en a) no contiene una modificación como se informa en b) y la cadena pesada y la cadena ligera en a) son cadenas aisladas.
En el anticuerpo en b) dentro de la cadena ligera el dominio variable de la cadena ligera VL se reemplaza por el dominio variable de la cadena pesada VH de dicho anticuerpo, y dentro de la cadena pesada el dominio variable de la cadena pesada VH se reemplaza por el dominio variable de la cadena ligera VL de dicho anticuerpo.
En un aspecto, (i) en el dominio constante CL de la primera cadena ligera en a) el aminoácido en la posición 124 (numeración de acuerdo con Kabat) se sustituye por un aminoácido cargado positivamente, y en el que en el dominio constante CH1 de la primera cadena pesada en a) el aminoácido en la posición 147 o el aminoácido en la posición 213 (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat) se sustituye por un aminoácido cargado negativamente, o (ii) en el dominio constante CL de la segunda cadena ligera en b) el aminoácido en la posición 124 (numeración de acuerdo con Kabat) se sustituye por un aminoácido cargado positivamente, y en el que en el dominio constante CH1 de la segunda cadena pesada en b) el aminoácido en la posición 147 o el aminoácido en la posición 213 (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat) se sustituye por un aminoácido cargado negativamente.
En otro aspecto, (i) en el dominio constante CL de la primera cadena ligera en a) el aminoácido en la posición 124 se sustituye independientemente por lisina (K), arginina (R) o histidina (H) (numeración de acuerdo con Kabat) (en un modo de realización preferente independientemente por lisina (K) o arginina (R)), y en el que en el dominio constante CH1 de la primera cadena pesada en a) el aminoácido en la posición 147 o el aminoácido en la posición 213 se sustituye independientemente por ácido glutámico (E) o ácido aspártico (D) (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat), o (ii) en el dominio constante CL de la segunda cadena ligera en b) el aminoácido en la posición 124 se sustituye independientemente por lisina (K), arginina (R) o histidina (H) (numeración de acuerdo con Kabat) (en un modo de realización preferente independientemente por lisina (K) o arginina (R)), y en el que en el dominio constante CH1 de la segunda cadena pesada en b) el aminoácido en la posición 147 o el aminoácido en la posición 213 se sustituye independientemente por ácido glutámico (E) o ácido aspártico (D) (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat).
En un aspecto, en el dominio constante CL de la segunda cadena pesada los aminoácidos en la posición 124 y 123 se sustituyen por K (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat).
En un aspecto, en el dominio constante CL de la segunda cadena pesada, el aminoácido en la posición 123 se sustituye por R y el aminoácido de la posición 124 se sustituye por K (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat).
En un aspecto, en el dominio constante CH1 de la segunda cadena ligera los aminoácidos en la posición 147 y 213 se sustituyen por E (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat).
En un aspecto, en el dominio constante CL de la primera cadena ligera los aminoácidos en la posición 124 y 123 se sustituyen por K, y en el dominio constante CH1 de la primera cadena pesada los aminoácidos en la posición 147 y 213 se sustituyen por E (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat).
En un aspecto, en el dominio constante CL de la primera cadena ligera el aminoácido en la posición 123 se sustituye por R y el aminoácido en la posición 124 se sustituye por K, y en el dominio constante CH1 de la primera cadena pesada los aminoácidos en la posición 147 y 213 se sustituyen ambos por E (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat).
En un aspecto, en el dominio constante CL de la segunda cadena pesada los aminoácidos en la posición 124 y 123 se sustituyen por K, y en el que en el dominio constante CH1 de la segunda cadena ligera los aminoácidos en la posición 147 y 213 se sustituyen por E, y en el dominio variable VL de la primera cadena ligera el aminoácido en la posición 38 se sustituye por K, en el dominio variable VH de la primera cadena pesada el aminoácido en la posición 39 se sustituye por E, en el dominio variable VL de la segunda cadena pesada el aminoácido en la posición 38 se sustituye por K, y en el dominio variable VH de la segunda cadena ligera el aminoácido en la posición 39 se sustituye por E (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat).
En un aspecto, el anticuerpo biespecífico es un anticuerpo bivalente que comprende
a) una primera cadena ligera y una primera cadena pesada de un anticuerpo que se unen específicamente a un primer antígeno, y
b) una segunda cadena ligera y una segunda cadena pesada de un anticuerpo que se unen específicamente a un segundo antígeno, en el que los dominios variables VL y VH de la segunda cadena ligera y la segunda cadena pesada se reemplazan entre sí, y en el que los dominios constantes CL y CH1 de la segunda cadena ligera y la segunda cadena pesada se reemplazan entre sí.
El anticuerpo en a) no contiene una modificación como se informa en b) y la cadena pesada y la cadena ligera en a) son cadenas aisladas. En el anticuerpo en b) dentro de la cadena ligera el dominio variable de la cadena ligera VL se reemplaza por el dominio variable de la cadena pesada VH de dicho anticuerpo, y el dominio constante de la cadena ligera CL se reemplaza por el dominio constante de la cadena pesada CH1 de dicho anticuerpo; y dentro de la cadena pesada, el dominio variable de la cadena pesada VH se reemplaza por el dominio variable de la cadena ligera VL de dicho anticuerpo, y el dominio constante de la cadena pesada CH1 se reemplaza por el dominio constante de la cadena ligera CL de dicho anticuerpo.
En un aspecto, el anticuerpo biespecífico es un anticuerpo bivalente que comprende
a) una primera cadena ligera y una primera cadena pesada de un anticuerpo que se unen específicamente a un primer antígeno, y
b) una segunda cadena ligera y una segunda cadena pesada de un anticuerpo que se unen específicamente a un segundo antígeno, en el que los dominios constantes CL y CH1 de la segunda cadena ligera y la segunda cadena pesada se reemplazan entre sí.
El anticuerpo en a) no contiene una modificación como se informa en b) y la cadena pesada y la cadena ligera en a) son cadenas aisladas. En el anticuerpo en b) dentro de la cadena ligera el dominio constante de la cadena ligera CL se reemplaza por el dominio constante de la cadena pesada CH1 de dicho anticuerpo; y dentro de la cadena pesada el dominio constante de la cadena pesada CH1 se reemplaza por el dominio constante de la cadena ligera CL de dicho anticuerpo.
En un aspecto, el anticuerpo multiespecífico es un anticuerpo multiespecífico que comprende
a) un anticuerpo de longitud completa que se une específicamente a un primer antígeno y que consiste en dos cadenas pesadas de anticuerpo y dos cadenas ligeras de anticuerpo, y
b) uno, dos, tres o cuatro fragmentos Fab monocatenarios que se unen específicamente a de uno a cuatro de otros antígenos (es decir, un segundo y/o tercer y/o cuarto y/o quinto antígeno, preferentemente que se unen específicamente a otro antígeno, es decir, un segundo antígeno),
en el que dichos fragmentos Fab monocatenarios en b) se fusionan a dicho anticuerpo de longitud completa en a) por medio de un conector peptídico en el extremo C o N de la cadena pesada o ligera de dicho anticuerpo de longitud completa.
En un aspecto, uno o dos fragmentos Fab monocatenarios idénticos que se unen a un segundo antígeno se fusionan al anticuerpo de longitud completa por medio de un conector peptídico en el extremo C de las cadenas pesadas o ligeras de dicho anticuerpo de longitud completa.
En un aspecto, uno o dos fragmentos Fab monocatenarios idénticos que se unen a un segundo antígeno se fusionan al anticuerpo de longitud completa por medio de un conector peptídico en el extremo C de las cadenas pesadas de dicho anticuerpo de longitud completa.
En un aspecto, uno o dos fragmentos Fab monocatenarios idénticos que se unen a un segundo antígeno se fusionan al anticuerpo de longitud completa por medio de un conector peptídico en el extremo C de las cadenas ligeras de dicho anticuerpo de longitud completa.
En un aspecto, dos fragmentos Fab monocatenarios idénticos que se unen a un segundo antígeno se fusionan al anticuerpo de longitud completa por medio de un conector peptídico en el extremo C de cada cadena pesada o ligera de dicho anticuerpo de longitud completa.
En un aspecto, dos fragmentos Fab monocatenarios idénticos que se unen a un segundo antígeno se fusionan al anticuerpo de longitud completa por medio de un conector peptídico en el extremo C de cada cadena pesada de dicho anticuerpo de longitud completa.
En un aspecto, dos fragmentos Fab monocatenarios idénticos que se unen a un segundo antígeno se fusionan al anticuerpo de longitud completa por medio de un conector peptídico en el extremo C de cada cadena ligera de dicho anticuerpo de longitud completa.
En un aspecto, el anticuerpo biespecífico es un anticuerpo trivalente que comprende
a) un anticuerpo de longitud completa que se une específicamente a un primer antígeno y que consiste en dos cadenas pesadas de anticuerpo y dos cadenas ligeras de anticuerpo,
b) un primer polipéptido que consiste en
ba) un dominio variable de la cadena pesada (VH) de anticuerpo, o
bb) un dominio variable de la cadena pesada (VH) de anticuerpo y un dominio constante 1 (CH1) de anticuerpo, en el que dicho primer polipéptido se fusiona con el extremo N de su dominio VH por medio de un conector peptídico al extremo C de una de las dos cadenas pesadas de dicho anticuerpo de longitud completa, c) un segundo polipéptido que consiste en
ca) un dominio variable de la cadena ligera de anticuerpo (VL), o
cb) un dominio variable de la cadena ligera (VL) de anticuerpo y un dominio constante de la cadena ligera (CL) de anticuerpo,
en el que dicho segundo polipéptido se fusiona con el extremo N del dominio VL por medio de un conector peptídico al extremo C de la otra de las dos cadenas pesadas de dicho anticuerpo de longitud completa, y
en el que el dominio variable de la cadena pesada (VH) de anticuerpo del primer polipéptido y el dominio variable de la cadena ligera (VL) de anticuerpo del segundo polipéptido juntos forman un sitio de unión a antígeno que se une específicamente a un segundo antígeno.
En un aspecto, el dominio variable de la cadena pesada (VH) de anticuerpo del polipéptido en b) y el dominio variable de la cadena ligera (VL) de anticuerpo del polipéptido en c) se enlazan y se estabilizan por medio de un puente disulfuro intercatenario por introducción de un enlace disulfuro entre las siguientes posiciones:
(i) posición 44 del dominio variable de la cadena pesada a posición 100 del dominio variable de la cadena ligera, o
(ii) posición 105 del dominio variable de la cadena pesada a posición 43 del dominio variable de la cadena ligera, o
(iii) posición 101 del dominio variable de la cadena pesada a posición 100 del dominio variable de la cadena ligera (numeración siempre de acuerdo con el índice EU de Kabat).
Las técnicas para introducir puentes disulfuro no naturales para la estabilización se describen, por ejemplo, en el documento WO 94/029350, Rajagopal, V., et al., Prot. Eng. (1997) 1453-1459; Kobayashi, H., et al., Nucl. Med. Biol. 25 (1998) 387-393; y Schmidt, M., et al., Oncogene 18 (1999) 1711-1721. En un modo de realización, el enlace disulfuro opcional entre los dominios variables de los polipéptidos en b) y c) está entre la posición 44 del dominio variable de la cadena pesada y la posición 100 del dominio variable de la cadena ligera. En un modo de realización, el enlace disulfuro opcional entre los dominios variables de los polipéptidos en b) y c) está entre la posición 105 del dominio variable de la cadena pesada y la posición 43 del dominio variable de la cadena ligera (numeración siempre de acuerdo con Kabat). En un modo de realización, es preferente un anticuerpo biespecífico trivalente sin dicha estabilización con disulfuro opcional entre los dominios variables VH y VL de los fragmentos Fab monocatenarios.
En un aspecto, el anticuerpo biespecífico es un anticuerpo triespecífico o tetraespecífico, que comprende a) una primera cadena ligera y una primera cadena pesada de un anticuerpo de longitud completa que se une específicamente a un primer antígeno, y
b) una segunda cadena ligera (modificada) y una segunda cadena pesada (modificada) de un anticuerpo de longitud completa que se une específicamente a un segundo antígeno, en el que los dominios variables VL y VH se reemplazan entre sí, y/o en el que los dominios constantes CL y CH1 se reemplazan entre sí, y
c) en el que de uno a cuatro péptidos de unión a antígeno que se unen específicamente a uno o dos de otros antígenos (es decir, a un tercer y/o cuarto antígeno) se fusionan por medio de un conector peptídico al extremo C o N de las cadenas ligeras o cadenas pesadas de a) y/o b).
El anticuerpo en a) no contiene una modificación como se informa en b) y la cadena pesada y la cadena ligera en a) son cadenas aisladas.
En un aspecto, el anticuerpo triespecífico o tetraespecífico comprende en c) uno o dos péptidos de unión a antígeno que se unen específicamente a uno o dos de otros antígenos.
En un aspecto, los péptidos de unión a antígeno se seleccionan del grupo de un fragmento scFv y un fragmento scFab.
En un aspecto, los péptidos de unión a antígeno son fragmentos scFv.
En un aspecto, los péptidos de unión a antígeno son fragmentos scFab.
En un aspecto, los péptidos de unión a antígeno se fusionan al extremo C de las cadenas pesadas de a) y/o b). En un aspecto, el anticuerpo triespecífico o tetraespecífico comprende en c) uno o dos péptidos de unión a antígeno que se unen específicamente a otro antígeno.
En un aspecto, el anticuerpo triespecífico o tetraespecífico comprende en c) dos péptidos de unión a antígeno idénticos que se unen específicamente a un tercer antígeno. En un modo de realización preferente, dichos dos péptidos de unión a antígeno idénticos se fusionan ambos por medio del mismo conector peptídico al extremo C de las cadenas pesadas de a) y b). En un modo de realización preferente, los dos péptidos de unión a antígeno idénticos son un fragmento scFv o bien un fragmento scFab.
En un aspecto, el anticuerpo triespecífico o tetraespecífico comprende en c) dos péptidos de unión a antígeno que se unen específicamente a un tercer y un cuarto antígeno. En un modo de realización, dichos dos péptidos de unión a antígeno se fusionan ambos por medio del mismo conector peptídico al extremo C de las cadenas pesadas de a) y b). En un modo de realización preferente, dichos dos péptidos de unión a antígeno son un fragmento scFv o bien un fragmento scFab.
En un aspecto, el anticuerpo biespecífico es un anticuerpo tetravalente biespecífico que comprende
(a) dos cadenas ligeras y dos cadenas pesadas de un anticuerpo, que se unen específicamente a un primer antígeno (y comprenden dos fragmentos Fab),
(b) dos fragmentos Fab adicionales de un anticuerpo, que se unen específicamente a un segundo antígeno, en el que dichos fragmentos Fab adicionales se fusionan ambos por medio de un conector peptídico a los extremos C o bien N de las cadenas pesadas de a), y
en el que en los fragmentos Fab se realizaron las siguientes modificaciones
(i) en ambos fragmentos Fab de a), o en ambos fragmentos Fab de b), los dominios variables VL y VH se reemplazan entre sí, y/o los dominios constantes CL y CH1 se reemplazan entre sí, o
(ii) en ambos fragmentos Fab de a) los dominios variables VL y VH se reemplazan entre sí, y los dominios constantes CL y CH1 se reemplazan entre sí, y en ambos fragmentos Fab de b) los dominios variables VL y VH se reemplazan entre sí, o los dominios constantes CL y CH1 se reemplazan entre sí, o
(iii) en ambos fragmentos Fab de a) los dominios variables VL y VH se reemplazan entre sí, o los dominios constantes CL y CH1 se reemplazan entre sí, y en ambos fragmentos Fab de b) los dominios variables VL y VH se reemplazan entre sí, y los dominios constantes CL y CH1 se reemplazan entre sí, o
(iv) en ambos fragmentos Fab de a) los dominios variables VL y VH se reemplazan entre sí, y en ambos fragmentos Fab de b) los dominios constantes CL y CH1 se reemplazan entre sí, o
(v) en ambos fragmentos Fab de a) los dominios constantes CL y CH1 se reemplazan entre sí, y en ambos fragmentos Fab de b) los dominios variables VL y VH se reemplazan entre sí.
En un aspecto, dichos fragmentos Fab adicionales se fusionan ambos por medio de un conector peptídico a los extremos C de las cadenas pesadas de a), o bien con los extremos N de las cadenas pesadas de a).
En un aspecto, dichos fragmentos Fab adicionales se fusionan ambos por medio de un conector peptídico a cualquiera de los extremos C de las cadenas pesadas de a).
En un aspecto, dichos fragmentos Fab adicionales se fusionan ambos por medio de un conector peptídico a los extremos N de las cadenas pesadas de a).
En un aspecto, en los fragmentos Fab se realizan las siguientes modificaciones: en ambos fragmentos Fab de a), o en ambos fragmentos Fab de b), los dominios variables VL y VH se reemplazan entre sí, y/o los dominios constantes CL y CH1 se reemplazan entre sí.
En un aspecto, el anticuerpo biespecífico es un anticuerpo tetravalente que comprende:
a) una cadena pesada (modificada) de un primer anticuerpo, que se une específicamente a un primer antígeno y comprende un primer par de dominios VH-CH1, en el que al extremo C de dicha cadena pesada el extremo N de un segundo par de dominios VH-CH1 de dicho primer anticuerpo se fusiona por medio de un conector peptídico, b) dos cadenas ligeras de dicho primer anticuerpo de a),
c) una cadena pesada (modificada) de un segundo anticuerpo, que se une específicamente a un segundo antígeno y comprende un primer par de dominios VH-CL, en el que al extremo C de dicha cadena pesada se fusiona el extremo N de un segundo par de dominios VH-CL de dicho segundo anticuerpo por medio de un conector peptídico, y
d) dos cadenas ligeras (modificadas) de dicho segundo anticuerpo de c), comprendiendo cada una un par de dominios CL-CH1.
En un aspecto, el anticuerpo biespecífico comprende
a) la cadena pesada y la cadena ligera de un primer anticuerpo de longitud completa que se une específicamente a un primer antígeno, y
b) la cadena pesada y la cadena ligera de un segundo anticuerpo de longitud completa que se une específicamente a un segundo antígeno, en el que el extremo N de la cadena pesada se conecta al extremo C de la cadena ligera por medio de un conector peptídico.
El anticuerpo en a) no contiene una modificación como se informa en b) y la cadena pesada y la cadena ligera son cadenas aisladas.
En un aspecto, el anticuerpo biespecífico comprende
a) un anticuerpo de longitud completa que se une específicamente a un primer antígeno y que consiste en dos cadenas pesadas de anticuerpo y dos cadenas ligeras de anticuerpo, y
b) un fragmento Fv que se une específicamente a un segundo antígeno que comprende un dominio VH2 y un dominio VL2, en el que ambos dominios se conectan entre sí por medio de un puente disulfuro, en el que solo el dominio VH2 o bien el dominio VL2 se fusiona por medio de un conector peptídico a la cadena pesada o ligera del anticuerpo de longitud completa que se une específicamente a un primer antígeno.
En el anticuerpo biespecífico, las cadenas pesadas y las cadenas ligeras de a) son cadenas aisladas.
En un aspecto, el otro del dominio VH2 o el dominio VL2 no se fusiona por medio de un conector peptídico a la cadena pesada o ligera del anticuerpo de longitud completa que se une específicamente a un primer antígeno. En todos los aspectos como se informa en el presente documento, la primera cadena ligera comprende un dominio VL y un dominio CL y la primera cadena pesada comprende un dominio VH, un dominio CH1, una región bisagra, un dominio CH2 y un dominio CH3.
En un aspecto, el anticuerpo biespecífico es un anticuerpo trivalente que comprende
a) dos fragmentos Fab que se unen específicamente a un primer antígeno,
b) un fragmento CrossFab que se une específicamente a un segundo antígeno en el que el dominio CH1 y el CL se intercambian entre sí,
c) una región Fc que comprende una primera cadena pesada de región Fc y una segunda cadena pesada de región Fc,
en el que el extremo C de los dominios CH1 de los dos fragmentos Fab se conecta al extremo N de los polipéptidos de la región Fc de la cadena pesada, y en el que el extremo C del dominio CL del fragmento CrossFab se conecta al extremo N del dominio VH de uno de los fragmentos Fab.
En un aspecto, el anticuerpo biespecífico es un anticuerpo trivalente que comprende
a) dos fragmentos Fab que se unen específicamente a un primer antígeno,
b) un fragmento CrossFab que se une específicamente a un segundo antígeno en el que el dominio CH1 y el CL se intercambian entre sí,
c) una región Fc que comprende una primera cadena pesada de región Fc y una segunda cadena pesada de región Fc,
en el que el extremo C del dominio CH1 del primer fragmento Fab se conecta al extremo N de uno de los polipéptidos de la región Fc de la cadena pesada y el extremo C del dominio CL del fragmento CrossFab se conecta al extremo N del otro polipéptido de la región Fc de la cadena pesada, y en el que el extremo C del dominio CH1 del segundo fragmento Fab se conecta al extremo N del dominio VH del primer fragmento Fab o al extremo N del dominio VH del fragmento CrossFab.
En un aspecto, el anticuerpo biespecífico comprende
a) un anticuerpo de longitud completa que se une específicamente a un primer antígeno y que consiste en dos cadenas pesadas de anticuerpo y dos cadenas ligeras de anticuerpo, y
b) un fragmento Fab que se une específicamente a un segundo antígeno que comprende un dominio VH2 y un dominio VL2 que comprende un fragmento de la cadena pesada y un fragmento de la cadena ligera, en el que dentro del fragmento de la cadena ligera el dominio variable de la cadena ligera VL2 se reemplaza por el dominio variable de la cadena pesada VH2 dicho anticuerpo, y dentro del fragmento de la cadena pesada, el dominio variable de la cadena pesada VH2 se reemplaza por el dominio variable de la cadena ligera VL2 de dicho anticuerpo
en el que el fragmento Fab de la cadena pesada se inserta entre el dominio CH1 de una de las cadenas pesadas del anticuerpo de longitud completa y la respectiva región Fc del anticuerpo de longitud completa, y el extremo N del fragmento Fab de la cadena ligera se conjuga con el extremo C de la cadena ligera del anticuerpo de longitud completa que se empareja con la cadena pesada del anticuerpo de longitud completa en el que se ha insertado el fragmento Fab de la cadena pesada.
En un aspecto, el anticuerpo biespecífico comprende
a) un anticuerpo de longitud completa que se une específicamente a un primer antígeno y que consiste en dos cadenas pesadas de anticuerpo y dos cadenas ligeras de anticuerpo, y
b) un fragmento Fab que se une específicamente a un segundo antígeno que comprende un dominio VH2 y un dominio VL2 que comprende un fragmento de la cadena pesada y un fragmento de la cadena ligera, en el que dentro del fragmento de la cadena ligera el dominio variable de la cadena ligera VL2 se reemplaza por el dominio variable de la cadena pesada VH2 de dicho anticuerpo, y dentro del fragmento de la cadena pesada el dominio variable de la cadena pesada VH2 se reemplaza por el dominio variable de la cadena ligera VL2 de dicho anticuerpo y en el que el extremo C del fragmento de la cadena pesada del fragmento Fab se conjuga al extremo N de una de las cadenas pesadas del anticuerpo de longitud completa y el extremo C del fragmento de la cadena ligera del fragmento Fab se conjuga al extremo N de la cadena ligera del anticuerpo de longitud completa que se empareja con la cadena pesada del anticuerpo de longitud completa al que se conjuga el fragmento de la cadena pesada del fragmento Fab.
Polinucleótidos
La divulgación proporciona además polinucleótidos aislados que codifican un anticuerpo biespecífico como se describe en el presente documento o un fragmento del mismo.
En determinados modos de realización, el polinucleótido o ácido nucleico es ADN. En otros modos de realización, un polinucleótido de la presente invención es ARN, por ejemplo, en forma de ARN mensajero (ARNm). El ARN de la presente invención puede ser monocatenario o bicatenario.
B. Procedimientos recombinantes
Los anticuerpos biespecíficos proporcionados en el presente documento se pueden producir usando procedimientos y composiciones recombinantes, por ejemplo, como se describe en la patente de EE. UU. n.° 4.816.567. En un aspecto, se proporciona un ácido nucleico aislado que codifica un anticuerpo biespecífico descrito en el presente documento. Dicho ácido nucleico puede codificar una secuencia de aminoácidos que comprende VL y/o una secuencia de aminoácidos que comprende VH de los sitios de unión a antígeno que se unen específicamente a PD1 y TIM-3, respectivamente (por ejemplo, en las cadenas ligera y/o pesada del anticuerpo). En otro aspecto, se proporcionan uno o más vectores (por ejemplo, vectores de expresión) que comprenden dicho ácido nucleico. En otro aspecto, se proporciona una célula huésped que comprende dicho ácido nucleico. En un aspecto de este tipo, una célula huésped comprende (por ejemplo, se ha transformado con): (1 ) un vector que comprende un ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos que comprende el VL del anticuerpo y una secuencia de aminoácidos que comprende el VH del anticuerpo, o (2) un primer vector que comprende un ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos que comprende el VL del anticuerpo y un segundo vector que comprende un ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos que comprende el VH del anticuerpo. En un aspecto, la célula huésped es eucariota, por ejemplo, una célula de ovario de hámster chino (CHO) o una célula linfocítica (por ejemplo, célula Y0, NS0, Sp20). En un aspecto, se proporciona un procedimiento de preparación de un anticuerpo biespecífico, en el que el procedimiento comprende cultivar una célula huésped que comprende un ácido nucleico que codifica el anticuerpo, como se proporciona anteriormente, en condiciones adecuadas para la expresión del anticuerpo, y opcionalmente recuperar el anticuerpo de la célula huésped (o medio de cultivo de células huésped).
Para la producción recombinante de los anticuerpos biespecíficos que comprenden un primer sitio de unión a antígeno que se une específicamente a PD1 y un segundo sitio de unión a antígeno que se une específicamente a TIM-3 como se describe en el presente documento, el ácido nucleico que codifica los anticuerpos biespecíficos, por ejemplo, como se describe anteriormente, se aísla y se inserta en uno o más vectores para clonación y/o expresión adicional en una célula huésped. Dicho ácido nucleico se puede aislar y secuenciar fácilmente usando procedimientos convencionales (por ejemplo, usando sondas oligonucleotídicas que se pueden unir específicamente a genes que codifican las cadenas pesada y ligera del anticuerpo).
Las células huésped adecuadas para la clonación o expresión de vectores que codifican el anticuerpo incluyen las células procariotas o eucariotas descritas en el presente documento. Por ejemplo, se pueden producir anticuerpos en bacterias, en particular, cuando no se necesitan la glucosilación ni la función efectora de Fc. Para la expresión de fragmentos de anticuerpo y polipéptidos en bacterias, véanse, por ejemplo, los documentos US 5.648.237, US 5.789.199 y US 5.840.523. (Véase también Charlton, K.A., en: Methods in Molecular Biology, Vol. 248, Lo, B.K.C. (ed.), Humana Press, Totowa, NJ (2003), pp. 245-254, que describe la expresión de fragmentos de anticuerpo en E. coli.) Después de la expresión, se puede aislar el anticuerpo de la pasta de células bacterianas en una fracción soluble y se puede purificar adicionalmente.
Además de procariotas, los microbios eucariotas tales como los hongos filamentosos o levaduras son huéspedes de clonación o expresión adecuados para vectores que codifican anticuerpos, incluyendo cepas de hongos y levaduras con vías de glucosilación que se han "humanizado", dando como resultado la producción de un anticuerpo con un patrón de glucosilación parcial o completamente humano. Véanse Gerngross, T.U., Nat. Biotech.
22 (2004) 1409-1414; y Li, H. et al., Nat. Biotech. 24 (2006) 210-215.
Las células huésped adecuadas para la expresión de anticuerpos glucosilados también se derivan de organismos pluricelulares (invertebrados y vertebrados). Los ejemplos de células de invertebrado incluyen células vegetales y de insecto. Se han identificado numerosas cepas de baculovirus que se pueden usar conjuntamente con células de insecto, en particular para la transfección de células de Spodoptera frugiperda.
También se pueden utilizar cultivos de células vegetales como huéspedes. Véanse, por ejemplo, las patentes de EE. UU. n.° 5.959.177, 6.040.498, 6.420.548, 7.125.978 y 6.417.429 (que describen la tecnología PLANTIBODIES™ para producir anticuerpos en plantas transgénicas).
También se pueden usar células de vertebrado como huéspedes. Por ejemplo, pueden ser útiles líneas celulares de mamífero que se adaptan para cultivar en suspensión. Otros ejemplos de líneas de células huésped de mamífero útiles son línea CV1 de riñón de mono transformada por SV40 (COS-7); línea de riñón embrionario humano (células HEK293 o 293 como se describe, por ejemplo, en Graham, F.L. et al., J. Gen Virol. 36 (1977) 59­ 74); células de riñón de cría de hámster (BHK); células de Sertoli de ratón (células TM4 como se describe, por ejemplo, en Mather, J.P., Biol. Reprod. 23 (1980) 243-252); células de riñón de mono (CV1); células de riñón de mono verde africano (VERO-76); células de carcinoma de cuello uterino humano (HELA); células de riñón canino (MDCK); células de hígado de rata búfalo (BRL3A); células de pulmón humano (W138); células de hígado humano (Hep G2); células de tumor mamario de ratón (MMT060562); células TRI, como se describe, por ejemplo, en Mather, J.P. et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383 (1982) 44-68; células MRC5; y células FS4. Otras líneas de células huésped de mamífero útiles incluyen células de ovario de hámster chino (CHO), incluyendo células CHO DHFR-(Urlaub, G. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA77 (1980) 4216-4220); y líneas celulares de mieloma, tales como Y0, NS0 y Sp2/0. Para una revisión de determinadas líneas de células huésped de mamífero adecuadas para la producción de anticuerpos, véase, por ejemplo, Yazaki, P. y Wu, A.M., Methods in Molecular Biology, Vol. 248, Lo, B. K.C. (ed.), Humana Press, Totowa, nJ (2004), pp. 255-268.
C. Ensayos
Los anticuerpos biespecíficos que comprenden un primer sitio de unión a antígeno que se une específicamente a PD1 y un segundo sitio de unión a antígeno que se une específicamente a TIM-3 proporcionados en el presente documento se pueden identificar, cribar o caracterizar por sus propiedades físicas/químicas y/o actividades biológicas por diversos ensayos conocidos en la técnica.
1. Ensayos de afinidad
La afinidad de las moléculas de unión a antígeno biespecíficas, anticuerpos y fragmentos de anticuerpo proporcionados en el presente documento para los correspondientes antígenos se puede determinar de acuerdo con los procedimientos expuestos en los ejemplos por resonancia de plasmón superficial (SPR), usando instrumentación estándar tal como un instrumento Biacore® (GE Healthcare) y receptores o proteínas diana tales como las que se pueden obtener por expresión recombinante. Un modo de realización específico ilustrativo y ejemplar para medir la afinidad de unión se describe en los ejemplos 1b, 5 o 12. De acuerdo con un aspecto, se mide Kd por resonancia de plasmón superficial usando una máquina BIACORE® T100 (GE Healthcare) a 25 °C.
2. Ensayos de unión y otros ensayos
En un aspecto, se somete a prueba un anticuerpo para determinar su actividad de unión a antígeno, por ejemplo, por procedimientos conocidos tales como ELISA, inmunoelectrotransferencia, etc. Se puede evaluar la unión de los anticuerpos biespecíficos proporcionados en el presente documento al correspondiente antígeno recombinante o a células que expresan antígenos por ELISA como se describe en el ejemplo 12.
En otro aspecto, la divulgación proporciona un ensayo TR-FRET basado en células para determinar la unión simultánea de formatos de anticuerpos biespecíficos a dos receptores diferentes presentes en una célula. La tecnología Tag-lite elegida es una combinación de TR-FRET (transferencia de energía de resonancia de fluorescencia con resolución temporal) clásica y tecnología de marca SNAP (por ejemplo, New England Biolabs, CISBIO), lo que permite que los antígenos presentes en la superficie celular se marquen con un tinte donante o aceptor fluorescente. El ensayo se describe en el ejemplo 13.
En otro aspecto, se usan células mononucleares de sangre periférica (PBMC) recién obtenidas en ensayos de unión para mostrar la unión a diferentes células mononucleares de sangre periférica (PBMC) tales como monocitos, linfocitos NK y linfocitos T.
En otro aspecto, se pueden usar ensayos de competencia para identificar un anticuerpo que compite con un anticuerpo específico o sitio de unión a antígeno por unirse a la diana, respectivamente. En determinados modos de realización, dicho anticuerpo competidor se une al mismo epítopo (por ejemplo, un epítopo lineal o conformacional) que se une por un anticuerpo biespecífico que comprende un primer sitio de unión a antígeno que se une específicamente a PD1 y un segundo sitio de unión a antígeno que se une específicamente a TIM3 de acuerdo con la invención. Se proporcionan procedimientos ejemplares detallados para cartografiar un epítopo al que se une un anticuerpo en Morris (1996) "Epitope Mapping Protocols", en Methods in Molecular Biology vol. 66 (Humana Press, Totowa, NJ).
En un ensayo de competencia ejemplar, se incuba PD1 o TIM3 inmovilizada en una solución que comprende un primer anticuerpo marcado que se une a PD1 o TIM3 y un segundo anticuerpo no marcado que se somete a prueba para determinar su capacidad para competir con el primer anticuerpo por su unión a PD1 o TIM3. El segundo anticuerpo puede estar presente en un sobrenadante de hibridoma. Como control, se incuba PD1 o TIM3 inmovilizada en una solución que comprende el primer anticuerpo marcado pero no el segundo anticuerpo no marcado. Después de la incubación en condiciones permisivas para la unión del primer anticuerpo a PD1 o TIM3, se retira el exceso de anticuerpo no unido y se mide la cantidad de marcador asociado con PD1 o TIM3 inmovilizada. Si la cantidad de marcador asociado con PD1 o TIM3 inmovilizada se reduce sustancialmente en la muestra de prueba en relación con la muestra de control, entonces eso indica que el segundo anticuerpo está compitiendo con el primer anticuerpo por la unión a PD1 o TIM3. Véase Harlow y Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual cap.14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY).
3. Ensayos de actividad
En un aspecto, se proporcionan ensayos para identificar un anticuerpo biespecífico que comprende un primer sitio de unión a antígeno que se une específicamente a PD1 y un segundo sitio de unión a antígeno que se une específicamente a TIM3 que tiene actividad biológica. La actividad biológica puede incluir, por ejemplo, la capacidad para potenciar la activación y/o proliferación de diferentes células inmunitarias, en especial linfocitos T, secreción de citocinas inmunomoduladoras tales como IFNy o TNF-alfa, bloquear la vía PD1, bloquear la vía TIM3, destrucción de células tumorales. También se proporcionan anticuerpos que tienen dicha actividad biológica in vivo y/o in vitro.
En determinados aspectos, se somete a prueba un anticuerpo de la invención para determinar dicha actividad biológica. En un aspecto, se proporciona un ensayo de células inmunitarias que mide la activación de linfocitos de un individuo (donante X) a linfocitos de otro individuo (donante Y). La reacción de linfocitos mixtos (MLR) puede demostrar el efecto de bloquear la vía PD1 en células efectoras linfocíticas. Se sometieron a prueba linfocitos T en el ensayo para determinar la activación y su secreción de IFN-gamma en presencia o ausencia de anticuerpos biespecíficos de la invención. El ensayo se describe con más detalle en el ejemplo 16.
D. Inmunoconjugados
La divulgación también proporciona inmunoconjugados que comprenden un anticuerpo biespecífico de la invención conjugado a uno o más agentes citotóxicos, tales como agentes o fármacos quimioterápicos, agentes inhibidores del crecimiento, toxinas (por ejemplo, toxinas proteicas, toxinas enzimáticamente activas de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal) o fragmentos de las mismas), o isótopos radiactivos.
En un aspecto, un inmunoconjugado es un conjugado anticuerpo-fármaco (ADC) en el que un anticuerpo se conjuga a uno o más fármacos, incluyendo pero sin limitarse a un maitansinoide (véanse las patentes de e E. UU. n.os 5.208.020, 5.416.064, y la patente europea EP 0425 235 B1); una auristatina tal como restos de fármaco monometilauristatina DE and d F (MMAE y MMAF) (véanse las patentes de EE. UU. n.os 5.635.483 y 5.780.588, y 7.498.298); una dolastatina; una caliqueamicina o derivado de la misma (véanse las patentes de EE. UU. n.os 5.712.374, 5.714.586, 5.739.116, 5.767.285, 5.770.701, 5.770.710, 5.773.001, y 5.877.296; Hinman et al. Cancer Res. 53:3336-3342, (1993); y Lode et al. Cancer Res. 58:2925-2928, (1998)); una antraciclina tal como daunomicina o doxorrubicina (véanse Kratz et al. Current Med. Chem. 13:477-523, (2006); Jeffrey et al. Bioorganic & Med. Chem. Letters 16:358-362, (2006); Torgov et al. Bioconj. Chem. 16:717-721, (2005); Nagy et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:829-834, (2000); Dubowchik et al. Bioorg. & Med. Chem. Letters 12:1529-1532, (2002); King et al. J. Med. Chem. 45:4336-4343, (2002); y la patente de EE. UU. n.° 6.630.579); metotrexato; vindesina; un taxano tal como docetaxel, paclitaxel, larotaxel, tesetaxel y ortataxel; un tricoteceno; y CC1065.
En otro modo de realización, un inmunoconjugado comprende un anticuerpo como se describe en el presente documento conjugado con una toxina enzimáticamente activa o fragmento de la misma, incluyendo pero sin limitarse a cadena A de difteria, fragmentos activos que no se unen de la toxina diftérica, la cadena A de exotoxina (de Pseudomonas aeruginosa), cadena A de ricina, cadena A de abrina, cadena A de modeccina, alfa-sarcina, proteínas de Aleurites fordii, proteínas de diantina, proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII y PAP-S), inhibidor de Momordica charantia, curcina, crotina, inhibidor de Saponaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina y los tricotecenos.
En otro modo de realización, un inmunoconjugado comprende un anticuerpo como se describe en el presente documento conjugado a un átomo radioactivo para formar un radioconjugado. Una variedad de isótopos radiactivos están disponibles para la producción de radioconjugados. Los ejemplos incluyen At211, I131, 1125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 e isótopos radioactivos de Lu. Cuando se usa el radioconjugado para la detección, puede comprender un átomo radioactivo para estudios gammagráficos, por ejemplo, tc99m o I123, o un marcador de espín para tomografía por resonancia magnética nuclear (RMN) (también conocida como resonancia magnética, RM), tal como yodo-123 de nuevo, yodo-131, indio-111, flúor-19, carbono-13, nitrógeno-15, oxígeno-17, gadolinio, manganeso o hierro.
Los conjugados de un anticuerpo y un agente citotóxico se pueden preparar usando una variedad de agentes de acoplamiento de proteínas bifuncionales tales como N-succinimidil-3-(2-piridilditio)propionato (SPDP), ciclohexano-1-carboxilato de succinimidil-4-(N-maleimidometilo) (SMCC), iminotiolano (IT), derivados bifuncionales de imidoésteres (tales como adipimidato de dimetilo HCl), ésteres activos (tales como suberato de disuccinimidilo), aldehídos (tales como glutaraldehído), compuestos bis-azido (tales como bis-(pazidobenzoil)hexanodiamina), derivados de bis-diazonio (tales como bis-(p-diazoniobenzoil)etilendiamina), diisocianatos (tales como tolueno-2,6-diisocianato) y compuestos de flúor bis-activos (tales como 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenceno). Por ejemplo, se puede preparar una inmunotoxina de ricina como se describe en Vitetta et al., Science 238:1098 (1987). El ácido 1-isotiocianatobencil-3-metildietilentriaminopentaacético (MX-DTPA) marcado con carbono 14 es un agente quelante ejemplar para la conjugación del radionúclido al anticuerpo. Véase el documento WO94/11026. El conector puede ser un "conector escindible" que facilita la liberación de un fármaco citotóxico en la célula. Por ejemplo, se puede usar un conector lábil en ácido, conector sensible a peptidasa, conector fotolábil, conector de dimetilo o conector que contiene disulfuro (Chari et al., Cancer Res. 52:127-131 (1992); patente de EE. UU. n.° 5.208.020).
Los inmunoconjugados o CAF en el presente documento contemplan expresamente, pero no se limitan a, dichos conjugados preparados con reactivos de reticulación, incluyendo BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, sulfo-EMCS, sulfo-GMBS, sulfo-KMUS, sulfo-MBS, sulfo-SlAB, sulfo-SMCC y sulfo-SMPB, y SVSB ((4-vinilsulfona)benzoato de succinimidilo), que están disponibles comercialmente (por ejemplo, de Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL., EE. UU.).
E. Procedimientos y composiciones para diagnóstico y detección
En determinados aspectos, cualquiera de los anticuerpos biespecíficos que comprenden un primer sitio de unión a antígeno que se une específicamente a PD1 y un segundo sitio de unión a antígeno que se une específicamente a TIM-3 proporcionados en el presente documento puede ser útil para detectar la presencia de tanto PD1 como TIM3 en una muestra biológica. El término "detectar" como se usa en el presente documento engloba la detección cuantitativa o cualitativa. En determinados modos de realización, una muestra biológica comprende una célula o tejido, tal como células madre cancerosas de LMA.
En un aspecto, se proporciona un anticuerpo biespecífico para su uso en un procedimiento de diagnóstico o detección. En otro aspecto, se proporciona un procedimiento de detección de la presencia de tanto PD1 como TIM3 en una muestra biológica. En determinados modos de realización, el procedimiento comprende poner en contacto la muestra biológica con un anticuerpo biespecífico como se describe en el presente documento en condiciones permisivas para la unión del anticuerpo biespecífico a tanto PD1 como TIM3, y detectar si se forma un complejo entre el anticuerpo biespecífico y ambos antígenos. Dicho procedimiento puede ser un procedimiento in vitro o in vivo. En un modo de realización, el anticuerpo biespecífico se usa para seleccionar sujetos elegibles para tratamiento con un anticuerpo biespecífico que comprende un primer sitio de unión a antígeno que se une específicamente a PD1 y un segundo sitio de unión a antígeno que se une específicamente al anticuerpo frente a TIM-3, por ejemplo, cuando PD1 y TIM3 son biomarcadores para la selección de pacientes.
En determinados aspectos, se proporcionan anticuerpos biespecíficos marcados. Los marcadores incluyen, pero no se limitan a, marcadores o restos que se detectan directamente (tales como marcadores fluorescentes, cromóforos, electrodensos, quimioluminiscentes y radioactivos), así como restos, tales como enzimas o ligandos, que se detectan indirectamente, por ejemplo, a través de una reacción enzimática o interacción molecular. Los marcadores ejemplares incluyen, pero no se limitan a, los radioisótopos 32P, 14C, 125I, 3H y 131I, fluoróforos tales como quelatos de tierras raras o fluoresceína y sus derivados, rodamina y sus derivados, dansilo, umbeliferona, luceriferasas, por ejemplo, luciferasa de luciérnaga y luciferasa bacteriana (patente de EE. UU. n.° 4.737.456), luciferina, 2,3-dihidroftalacindionas, peroxidasa de rábano picante (HRP), fosfatasa alcalina, pgalactosidasa, glucoamilasa, lisozima, oxidasas de sacáridos, por ejemplo, glucosa oxidasa, galactosa oxidasa y glucosa-6 -fosfato deshidrogenasa, oxidasas heterocíclicas tales como uricasa y xantina oxidasa, acopladas con una enzima que emplea peróxido de hidrógeno para oxidar un precursor de tinte tal como HRP, lactoperoxidasa o microperoxidasa, biotina/avidina, marcadores de espín, marcadores de bacteriófagos o radicales libres estables.
F. Composiciones farmacéuticas, formulaciones y vías de administración
En otro aspecto, se proporcionan composiciones farmacéuticas que comprenden cualquiera de los anticuerpos biespecíficos que comprenden un primer sitio de unión a antígeno que se une específicamente a PD1 y un segundo sitio de unión a antígeno que se une específicamente a TIM-3 proporcionados en el presente documento, por ejemplo, para su uso en cualquiera de los procedimientos terapéuticos a continuación. En un modo de realización, una composición farmacéutica comprende cualquiera de los anticuerpos biespecíficos proporcionados en el presente documento y al menos un excipiente farmacéuticamente aceptable. En otro modo de realización, una composición farmacéutica comprende cualquiera de los anticuerpos biespecíficos proporcionados en el presente documento y al menos un agente terapéutico adicional, por ejemplo, como se describe a continuación.
Las composiciones farmacéuticas de la presente divulgación comprenden una cantidad terapéuticamente eficaz de uno o más anticuerpos biespecíficos disueltos o dispersados en un excipiente farmacéuticamente aceptable. La expresión "farmacéutica o farmacológicamente aceptable" se refiere a entidades moleculares y composiciones que son en general no tóxicas para los receptores en las dosificaciones y concentraciones empleadas, es decir no producen una reacción adversa, alérgica u otra reacción indeseable cuando se administran a un animal, tal como, por ejemplo, un ser humano, según sea apropiado. La preparación de una composición farmacéutica que contiene al menos un anticuerpo biespecífico y opcionalmente un ingrediente activo adicional será conocida para los expertos en la técnica en vista de la presente divulgación, como se ejemplifica por Remington's Pharmaceutical Sciences, 18.a ed. Mack Printing Company, 1990. En particular, las composiciones son formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas. Como se usa en el presente documento, "excipiente farmacéuticamente aceptable " incluye cualquiera y todos los disolventes, tampones, medios de dispersión, recubrimientos, tensioactivos, antioxidantes, conservantes (por ejemplo, agentes antibacterianos, agentes antifúngicos), agentes isotónicos, sales, estabilizantes y combinaciones de los mismos, como será conocido para un experto en la técnica.
Las composiciones parenterales incluyen las diseñadas para administración por inyección, por ejemplo, inyección subcutánea, intradérmica, intralesional, intravenosa, intraarterial, intramuscular, intratecal o intraperitoneal. Para inyección, los anticuerpos biespecíficos de la invención se pueden formular en soluciones acuosas, preferentemente en tampones fisiológicamente compatibles tales como solución de Hank, solución de Ringer o tampón salino fisiológico. La solución puede contener agentes de formulación tales como agentes de suspensión, estabilización y/o dispersión. De forma alternativa, los anticuerpos biespecíficos pueden estar en forma de polvo para su constitución con un vehículo adecuado, por ejemplo, agua sin pirógenos estéril, antes de su uso. Las soluciones inyectables estériles se preparan incorporando las proteínas de fusión de la invención en la cantidad requerida en el disolvente apropiado con diversos de los otros ingredientes enumerados a continuación, según se requiera. La esterilidad se puede lograr fácilmente, por ejemplo, por filtración a través de membranas de filtración estériles. En general, se preparan dispersiones incorporando los diversos ingredientes activos esterilizados en un vehículo estéril que contiene el medio de dispersión básico y/o los otros ingredientes. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones, suspensiones o emulsiones inyectables estériles, los procedimientos preferentes de preparación son técnicas de secado al vacío o liofilización que proporcionan un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente deseado adicional de un medio líquido previamente filtrado estéril del mismo. El medio líquido se debe tamponar adecuadamente si es necesario y el diluyente líquido se debe volver isotónico en primer lugar antes de la inyección con solución salina o glucosa suficiente. La composición debe ser estable en las condiciones de fabricación y almacenamiento, y conservarse frente a la acción contaminante de microorganismos, tales como bacterias y hongos. Se apreciará que la contaminación por endotoxinas se debe mantener al mínimo hasta un nivel seguro, por ejemplo, menos de 0,5 ng/mg de proteína. Los excipientes farmacéuticamente aceptables adecuados incluyen, pero no se limitan a: tampones tales como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes incluyendo ácido ascórbico y metionina; conservantes (tales como cloruro de octadecildimetilbencilamonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio; cloruro de bencetonio; fenol, alcohol butílico o bencílico; alquilparabenos tales como metil o propilparabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; y m-cresol); polipéptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 residuos); proteínas, tales como seroalbúmina, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros carbohidratos incluyendo glucosa, manosa o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; glúcidos tales como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; contraiones formadores de sales tales como sodio; complejos metálicos (por ejemplo, complejos Zn-proteína); y/o tensioactivos no iónicos tales como polietilenglicol (PEG). Las suspensiones inyectables acuosas pueden contener compuestos que incrementan la viscosidad de la suspensión, tales como carboximetilcelulosa de sodio, sorbitol, dextrano, o similares. Opcionalmente, la suspensión también puede contener estabilizantes o agentes adecuados que incrementan la solubilidad de los compuestos para permitir la preparación de soluciones altamente concentradas. Adicionalmente, se pueden preparar suspensiones de los compuestos activos como suspensiones inyectables oleosas apropiadas. Los disolventes o vehículos lipófilos adecuados incluyen aceites grasos tales como aceite de sésamo, o ésteres de ácidos grasos sintéticos, tales como oleatos de etilo o triglicéridos, o liposomas.
Se pueden atrapar ingredientes activos en microcápsulas preparadas, por ejemplo, por técnicas de coacervación o por polimerización interfacial, por ejemplo, microcápsulas de hidroximetilcelulosa o gelatina y microcápsulas de poli(metilmetacrilato), respectivamente, en sistemas de suministro de fármaco coloidales (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas) o en macroemulsiones. Dichas técnicas se divulgan en Remington's Pharmaceutical Sciences (18.a ed. Mack Printing Company, 1990). Se pueden preparar preparaciones de liberación mantenida. Los ejemplos adecuados de preparaciones de liberación mantenida incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrófobos sólidos que contienen el polipéptido, matrices que están en forma de artículos conformados, por ejemplo, películas o microcápsulas. En modos de realización particulares, la absorción prolongada de una composición inyectable se puede conseguir por el uso en las composiciones de agentes retardantes de la absorción, tales como, por ejemplo, monoestearato de aluminio, gelatina o combinaciones de los mismos.
Los excipientes farmacéuticamente aceptables ejemplares en el presente documento incluyen además agentes de dispersión de fármacos intersticiales tales como glucoproteínas hialuronidasas activas a pH neutro solubles (sHASEGP), por ejemplo, glucoproteínas hialuronidasas a pH-20 solubles humanas, tales como rHuPH20 (HYLENEX®, Baxter International, Inc.). Determinadas sHASEGP ejemplares y procedimientos de uso, incluyendo rHuPH20, se describen en las publicaciones de patente de EE. UU. n.° 2005/0260186 y 2006/0104968. En un aspecto, una sHASEGP se combina con una o más glucosaminoglucanasas adicionales tales como condroitinasas.
Se describen formulaciones de anticuerpos liofilizadas ejemplares en la patente de EE. UU. n.° 6.267.958. Las formulaciones de anticuerpos acuosas incluyen las descritas en la patente de EE. UU. n.° 6.171.586 y documento WO 2006/044908, incluyendo estas últimas formulaciones un tampón acetato-histidina.
Además de las composiciones descritas previamente, los anticuerpos biespecíficos también se pueden formular como preparación de liberación lenta. Dichas formulaciones de acción prolongada se pueden administrar por implantación (por ejemplo, por vía subcutánea o intramuscular) o por inyección intramuscular. Por tanto, por ejemplo, los anticuerpos biespecíficos se pueden formular con materiales poliméricos o hidrófobos adecuados (por ejemplo como emulsión en un aceite aceptable) o resinas de intercambio iónico, o como derivados escasamente solubles, por ejemplo, como sal escasamente soluble.
Las composiciones farmacéuticas que comprenden los anticuerpos biespecíficos de la invención se pueden fabricar por medio de procedimientos convencionales de mezclado, disolución, emulsión, encapsulación, atrapamiento o liofilización. Las composiciones farmacéuticas se pueden formular de manera convencional usando uno o más vehículos, diluyentes, excipientes o coadyuvantes fisiológicamente aceptables que facilitan el procesamiento de las proteínas en preparaciones que se pueden usar farmacéuticamente. La formulación apropiada depende de la vía de administración elegida.
Los anticuerpos biespecíficos se pueden formular en una composición en forma de ácido o base libre, neutra o sal. Las sales farmacéuticamente aceptables son sales que conservan sustancialmente la actividad biológica del ácido o base libre. Estas incluyen las sales de adición de ácido, por ejemplo, las formadas con los grupos amino libres de una composición proteica, o que se forman con ácidos inorgánicos tales como, por ejemplo, ácidos clorhídrico o fosfórico, o dichos ácidos orgánicos como ácido acético, oxálico, tartárico o mandélico. Las sales formadas con los grupos carboxilo libres también se pueden derivar de bases inorgánicas tales como, por ejemplo, hidróxidos de sodio, potasio, amonio, calcio o férrico; o dichas bases orgánicas como isopropilamina, trimetilamina, histidina o procaína. Las sales farmacéuticas tienden a ser más solubles en disolventes acuosos y otros disolventes próticos que las correspondientes formas de base libre.
La composición en el presente documento también puede contener más de un ingrediente activo según sea necesario para la indicación particular que se está tratando, preferentemente aquellos con actividades complementarias que no se vean afectadas de forma adversa entre sí. Dichos ingredientes activos están presentes adecuadamente en combinación en cantidades que son eficaces para el propósito pretendido.
Las formulaciones que se van a usar para la administración in vivo son en general estériles. La esterilidad se puede lograr fácilmente, por ejemplo, por filtración a través de membranas de filtración estériles.
G. Procedimientos y composiciones terapéuticos
Cualquiera de los anticuerpos biespecíficos que comprenden un primer sitio de unión a antígeno que se une específicamente a PD1 y un segundo sitio de unión a antígeno que se une específicamente a TIM-3 proporcionados en el presente documento se pueden usar en procedimientos terapéuticos.
Para su uso en procedimientos terapéuticos, los anticuerpos biespecíficos que comprenden un primer sitio de unión a antígeno que se une específicamente a PD1 y un segundo sitio de unión a antígeno que se une específicamente a TIM-3 como se define en el presente documento anteriormente se pueden formular, dosificar y administrar de forma consecuente con la buena práctica médica. Los factores que se deben tener en consideración en este contexto incluyen el trastorno particular que se está tratando, el mamífero particular que se está tratando, el estado clínico del paciente individual, la causa del trastorno, el sitio de administración del agente, el procedimiento de administración, la programación de la administración y otros factores conocidos por los médicos.
En un aspecto, se proporcionan anticuerpos biespecíficos que comprenden un primer sitio de unión a antígeno que se une específicamente a PD1 y un segundo sitio de unión a antígeno que se une específicamente a TIM-3 como se define en el presente documento para su uso como medicamento. En otros aspectos, se proporcionan anticuerpos biespecíficos que comprenden un primer sitio de unión a antígeno que se une específicamente a PD1 y un segundo sitio de unión a antígeno que se une específicamente a TIM-3 como se define en el presente documento para su uso en el tratamiento de una enfermedad, en particular para su uso en el tratamiento de cáncer. En determinados modos de realización, se proporcionan anticuerpos biespecíficos que comprenden un primer sitio de unión a antígeno que se une específicamente a PD1 y un segundo sitio de unión a antígeno que se une específicamente a TIM-3 para su uso en un procedimiento de tratamiento. En un modo de realización, la invención proporciona anticuerpos biespecíficos que comprenden un primer sitio de unión a antígeno que se une específicamente a p D1 y un segundo sitio de unión a antígeno que se une específicamente a TIM-3 como se describe en el presente documento para su uso en el tratamiento de una enfermedad en un individuo que lo necesita. En determinados modos de realización, la invención proporciona anticuerpos biespecíficos que comprenden un primer sitio de unión a antígeno que se une específicamente a PD1 y un segundo sitio de unión a antígeno que se une específicamente a TIM-3 para su uso en un procedimiento de tratamiento de un individuo que tiene una enfermedad que comprende administrar al individuo una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo biespecífico. En determinados modos de realización, la enfermedad que se va a tratar es cáncer. En otro aspecto, la enfermedad que se va a tratar es una infección vírica crónica como VIH, VHB, VHC, VHS1, CMV, LCMV o VEB. El sujeto, paciente o "individuo" que necesita tratamiento es típicamente un mamífero, más específicamente un ser humano.
En otro aspecto, la divulgación proporciona el uso de anticuerpos biespecíficos que comprenden un primer sitio de unión a antígeno que se une específicamente a PD1 y un segundo sitio de unión a antígeno que se une específicamente a TIM-3 como se define en el presente documento anteriormente en la fabricación o preparación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad en un individuo que lo necesita. En un modo de realización, el medicamento es para su uso en un procedimiento de tratamiento de una enfermedad que comprende administrar a un individuo que tiene la enfermedad una cantidad terapéuticamente eficaz del medicamento.
En determinados aspectos, la enfermedad que se va a tratar es un trastorno proliferativo, en particular cáncer. Los ejemplos de cánceres incluyen cáncer de vejiga, cáncer de cerebro, cáncer de cabeza y cuello, cáncer pancreático, cáncer de pulmón, cáncer de mama, cáncer ovárico, cáncer uterino, cáncer de cuello uterino, cáncer endometrial, cáncer esofágico, cáncer de colon, cáncer colorrectal, cáncer rectal, cáncer gástrico, cáncer de próstata, neoplasia hemática, cáncer de piel, carcinoma de células escamosas, cáncer de huesos y cáncer de riñón. Otros trastornos de proliferación celular que se pueden tratar usando anticuerpos biespecíficos que comprenden un primer sitio de unión a antígeno que se une específicamente a PD1 y un segundo sitio de unión a antígeno que se une específicamente a TIM-3 de acuerdo con la invención incluyen, pero no se limitan a, neoplasias localizadas en el abdomen, hueso, mama, aparato digestivo, hígado, páncreas, peritoneo, glándulas endocrinas (suprarrenal, paratiroidea, pituitaria, testículos, ovario, timo, tiroides), ojos, cabeza y cuello, sistema nervioso (central y periférico), sistema linfático, pélvico, piel, tejido blando, bazo, región torácica y sistema urogenital. También se incluyen afecciones o lesiones precancerosas y metástasis de cáncer. En determinados aspectos, el cáncer se elige del grupo que consiste en cáncer de células renales, cáncer de piel, cáncer de pulmón, cáncer colorrectal, cáncer de mama, cáncer de cerebro, cáncer de cabeza y cuello. En otros aspectos, el cáncer se elige de carcinoma, linfoma (por ejemplo, linfoma de Hodgkin y no hodgkiniano), blastoma, sarcoma y leucemia. En otro aspecto, el cáncer que se va a tratar se selecciona entre cáncer de células escamosas, carcinoma pulmonar microcítico, carcinoma pulmonar no microcítico, adenocarcinoma de pulmón, carcinoma pulmonar de células escamoso, cáncer de peritoneo, cáncer hepatocelular, cáncer gastrointestinal, cáncer de páncreas, glioma, cáncer de cuello uterino, cáncer de ovario, cáncer de hígado, cáncer de vejiga, hepatoma, cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer colorrectal, carcinoma endometrial o uterino, carcinoma de glándulas salivales, cáncer de riñón, cáncer de hígado, cáncer de próstata, cáncer de vulva, cáncer de tiroides, carcinoma hepático, leucemia y otros trastornos linfoproliferativos y diversos tipos de cáncer de cabeza y cuello.
En otro aspecto, la enfermedad que se va a tratar es una infección vírica crónica. El término "infección vírica crónica" se refiere a un sujeto afectado o infectado con un virus crónico. Los ejemplos de infecciones víricas crónicas son virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), infección vírica por hepatitis B (VHB), infección vírica por hepatitis C (VHC), virus del herpes simple 1 (VHS1), citomegalovirus (CMV), virus de la coriomeningitis linfocítica (LCMV) o virus de Epstein Barr (VEB).
Un experto en la técnica reconoce fácilmente que en muchos casos la molécula biespecífica puede no proporcionar una cura, sino que solo puede proporcionar un beneficio parcial. En algunos modos de realización, un cambio fisiológico que tiene algún beneficio también se considera terapéuticamente beneficioso. Por tanto, en algunos modos de realización, una cantidad del anticuerpo biespecífico que proporciona un cambio fisiológico se considera una "cantidad eficaz" o una "cantidad terapéuticamente eficaz".
En otro aspecto, la invención proporciona un procedimiento para tratar una enfermedad en un individuo, que comprende administrar a dicho individuo una cantidad terapéuticamente eficaz de anticuerpos biespecíficos que comprenden un primer sitio de unión a antígeno que se une específicamente a PD1 y un segundo sitio de unión a antígeno que se une específicamente a TIM-3 de la divulgación. En un modo de realización, se administra una composición a dicho individuo, que comprende un anticuerpo biespecífico de la invención en una forma farmacéuticamente aceptable. En determinados modos de realización, la enfermedad que se va a tratar es un trastorno proliferativo. En un modo de realización particular, la enfermedad es cáncer. En determinados modos de realización, el procedimiento comprende además administrar al individuo una cantidad terapéuticamente eficaz de al menos un agente terapéutico adicional, por ejemplo, un agente antineoplásico si la enfermedad que se va a tratar es cáncer. En otro aspecto, la enfermedad es una infección vírica crónica. Un "individuo" de acuerdo con cualquiera de los modos de realización anteriores puede ser un mamífero, preferentemente un ser humano.
Para la prevención o tratamiento de enfermedad, la dosificación apropiada de un anticuerpo biespecífico que comprende un primer sitio de unión a antígeno que se une específicamente a PD1 y un segundo sitio de unión a antígeno que se une específicamente a TIM-3 de la invención (cuando se usa solo o en combinación con uno o más de otros agentes terapéuticos adicionales) dependerá del tipo de enfermedad que se va a tratar, la vía de administración, el peso corporal del paciente, el tipo de proteína de fusión, la gravedad y evolución de la enfermedad, si el anticuerpo biespecífico se administra con propósitos preventivos o terapéuticos, intervenciones terapéuticas previas o simultáneas, la anamnesis del paciente y la respuesta a la proteína de fusión, y el criterio del médico especialista. El profesional responsable para su administración determinará, en cualquier caso, la concentración del/de los ingrediente(s) activo(s) en una composición y la(s) dosis apropiada(s) para el sujeto individual. En el presente documento se contemplan diversas pautas de dosificación incluyendo, pero sin limitarse a, administraciones individuales o múltiples durante diversos puntos temporales, administración en bolo e infusión pulsada.
El anticuerpo biespecífico que comprende un primer sitio de unión a antígeno que se une específicamente a PD1 y un segundo sitio de unión a antígeno que se une específicamente a TIM-3 como se define en el presente documento se administra adecuadamente al paciente de una vez o durante una serie de tratamientos. Dependiendo del tipo y gravedad de la enfermedad, de aproximadamente 1 |jg/kg a 15 mg/kg (por ejemplo, 0 , 1 mg/kg - 10 mg/kg) del anticuerpo biespecífico puede ser una dosificación candidata inicial para la administración al paciente, ya sea, por ejemplo, por una o más administraciones separadas o por infusión continua. Una dosificación diaria típica puede variar de aproximadamente 1 jg/kg a 100 mg/kg o más, dependiendo de los factores mencionados anteriormente. Para administraciones repetidas durante varios días o más, dependiendo de la afección, el tratamiento en general se mantendría hasta que se produzca una supresión deseada de los síntomas de enfermedad. Una dosificación ejemplar del anticuerpo biespecífico estaría en el intervalo de aproximadamente 0,005 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg. En otros ejemplos, una dosis también puede comprender de aproximadamente 1 jg/kg de peso corporal, aproximadamente 5 jg/kg de peso corporal, aproximadamente 10 jg/kg de peso corporal, aproximadamente 50 jg/kg de peso corporal, aproximadamente 10 0 jg/kg de peso corporal, aproximadamente 200 jg/kg de peso corporal, aproximadamente 350 jg/kg de peso corporal, aproximadamente 500 jg/kg de peso corporal, aproximadamente 1 mg/kg de peso corporal, aproximadamente 5 mg/kg de peso corporal, aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal, aproximadamente 50 mg/kg de peso corporal, aproximadamente 10 0 mg/kg de peso corporal, aproximadamente 2 0 0 mg/kg de peso corporal, aproximadamente 350 mg/kg de peso corporal, aproximadamente 500 mg/kg de peso corporal, a aproximadamente 1 00 0 mg/kg de peso corporal o más por administración y cualquier intervalo derivable en los mismos. En ejemplos de un intervalo derivable de los números enumerados en el presente documento, se puede administrar un intervalo de aproximadamente 5 mg/kg de peso corporal a aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal, de aproximadamente 5 |jg/kg de peso corporal a aproximadamente 500 mg/kg de peso corporal etc., en base a los números descritos anteriormente. Por tanto, se pueden administrar al paciente una o más dosis de aproximadamente 0,5 mg/kg, 2,0 mg/kg, 5,0 mg/kg o 10 mg/kg (o cualquier combinación de las mismas). Dichas dosis se pueden administrar de forma intermitente, por ejemplo, cada semana o cada tres semanas (por ejemplo, de modo que el paciente recibe de aproximadamente dos a aproximadamente veinte, o por ejemplo, aproximadamente seis dosis de la proteína de fusión). Se puede administrar una dosis de carga mayor inicial, seguido de una o más dosis menores. Sin embargo, otras pautas posológicas pueden ser útiles. La progresión de este tratamiento se sigue fácilmente por técnicas y ensayos convencionales.
Los anticuerpos biespecíficos que comprenden un primer sitio de unión a antígeno que se une específicamente a PD1 y un segundo sitio de unión a antígeno que se une específicamente a TIM-3 como se define en el presente documento se usarán en general en una cantidad eficaz para lograr el propósito pretendido. Para su uso para tratar o prevenir una enfermedad, los anticuerpos biespecíficos de la invención, o composiciones farmacéuticas de los mismos, se administran o aplican en una cantidad terapéuticamente eficaz. La determinación de una cantidad terapéuticamente eficaz está dentro de las capacidades de los expertos en la técnica, en especial en vista de la divulgación detallada proporcionada en el presente documento.
Para la administración sistémica, se puede estimar inicialmente una dosis terapéuticamente eficaz a partir de ensayos in vitro, tales como ensayos de cultivo celular. A continuación, se puede formular una dosis en modelos animales para lograr un intervalo de concentración en circulación que incluye la CI50 como se determina en cultivo celular. Se puede usar dicha información para determinar con más exactitud dosis útiles en seres humanos.
También se pueden estimar dosificaciones iniciales a partir de datos in vivo, por ejemplo, modelos animales, usando técnicas que son bien conocidas en la técnica. Un experto en la técnica podría optimizar fácilmente la administración a seres humanos en base a los datos en animales.
La cantidad e intervalo de dosificación se pueden ajustar individualmente para proporcionar niveles plasmáticos del anticuerpo biespecífico que sean suficientes para mantener el efecto terapéutico. Las dosificaciones de paciente habituales para administración por inyección varían de aproximadamente 0,1 a 50 mg/kg/día, típicamente de aproximadamente 0,5 a 1 mg/kg/día. Se pueden lograr niveles plasmáticos terapéuticamente eficaces administrando dosis múltiples cada día. Los niveles en plasma se pueden medir, por ejemplo, por HPLC.
En casos de administración local o captación selectiva, la concentración local eficaz del anticuerpo biespecífico puede no estar relacionada con la concentración plasmática. Un experto en la técnica podrá optimizar dosificaciones locales terapéuticamente eficaces sin experimentación excesiva.
Una dosis terapéuticamente eficaz de los anticuerpos biespecíficos descritos en el presente documento proporcionará en general beneficio terapéutico sin provocar toxicidad sustancial. La toxicidad y eficacia terapéutica de una proteína de fusión se pueden determinar por procedimientos farmacéuticos estándar en cultivo celular o animales de experimentación. Se pueden usar ensayos de cultivo celular y estudios en animales para determinar la DL50 (la dosis letal para un 50 % de una población) y la DE50 (la dosis terapéuticamente eficaz en un 50 % de una población). La proporción de dosis entre los efectos tóxicos y terapéuticos es el índice terapéutico, que se puede expresar como la proporción DL50/DE50. Los anticuerpos biespecíficos que presentan grandes índices terapéuticos son preferentes. En un modo de realización, el anticuerpo biespecífico de acuerdo con la presente invención presenta un alto índice terapéutico. Los datos obtenidos a partir de ensayos de cultivo celular y estudios en animales se pueden usar en la formulación de un intervalo de dosificaciones adecuadas para su uso en seres humanos. La dosificación se encuentra preferentemente dentro de un intervalo de concentraciones en circulación que incluyen la DE50 con poca o ninguna toxicidad. La dosificación puede variar dentro de este intervalo dependiendo de una variedad de factores, por ejemplo, la forma de dosificación empleada, la vía de administración utilizada, la afección del sujeto, y similares. La formulación exacta, vía de administración y dosificación se pueden elegir por el médico individual en vista de la afección del paciente (véase, por ejemplo, Fingl et al., 1975, en: The Pharmacological Basis of Therapeutics, Ch. 1, p. 1.
El médico especialista para pacientes tratados con anticuerpos biespecíficos de la invención sabrá cómo y cuándo finalizar, interrumpir o ajustar la administración debido a toxicidad, disfunción orgánica y similares. A la inversa, el médico especialista también sabrá ajustar el tratamiento a niveles mayores si la respuesta clínica no fuera adecuada (excluyendo la toxicidad). La magnitud de una dosis administrada en el abordaje del trastorno de interés variará con la gravedad de la afección que se va a tratar, con la vía de administración, y similares. La gravedad de la afección, por ejemplo, se puede evaluar, en parte, por procedimientos de evaluación de pronóstico estándar. Además, la dosis y quizás la frecuencia de dosis también variarán de acuerdo con la edad, peso corporal, y respuesta del paciente individual.
Otros agentes y tratamientos
Los anticuerpos biespecíficos que comprenden un primer sitio de unión a antígeno que se une específicamente a PD1 y un segundo sitio de unión a antígeno que se une específicamente a TIM-3 como se describe en el presente documento anteriormente se pueden administrar en combinación con uno o más de otros agentes en tratamiento. Por ejemplo, se pueden coadministrar con al menos un agente terapéutico adicional. El término "agente terapéutico" engloba cualquier agente que se puede administrar para tratar un síntoma o enfermedad en un individuo que necesita dicho tratamiento. Dicho agente terapéutico adicional puede comprender cualquier ingrediente activo adecuado para la indicación particular que se está tratando, preferentemente el que tiene actividades complementarias que no se ven afectadas de manera adversa entre sí. En determinados modos de realización, un agente terapéutico adicional es otro agente antineoplásico.
Dichos otros agentes están presentes de forma adecuada en combinación en cantidades que son eficaces para el propósito pretendido. La cantidad eficaz de dichos otros agentes depende de la cantidad de proteína de fusión usada, el tipo de trastorno o tratamiento y otros factores analizados anteriormente. Las moléculas de unión a antígeno que contienen un trímero de ligando de la familia de TNF se usan en general en las mismas dosificaciones y con vías de administración como se describe en el presente documento, o aproximadamente de un 1 a un 99 % de las dosificaciones descritas en el presente documento, o en cualquier dosificación y por cualquier vía que se determina empírica/clínicamente que es apropiada.
Dichas politerapias indicadas anteriormente engloban la administración combinada (donde se incluyen dos o más agentes terapéuticos en la misma o en composiciones separadas) y la administración separada, caso en el que la administración del anticuerpo biespecífico se puede producir antes de, simultáneamente y/o después de, la administración del adyuvante y/o agente terapéutico adicional.
H. Artículos de fabricación
En otro aspecto, se proporciona un artículo de fabricación que contiene materiales útiles para el tratamiento, prevención y/o diagnóstico de los trastornos descritos anteriormente. El artículo de fabricación comprende un recipiente y una ficha técnica o prospecto del envase en o asociado con el recipiente. Los recipientes adecuados incluyen, por ejemplo, frascos, viales, jeringuillas, bolsas de solución i.v., etc. Los recipientes se pueden formar de una variedad de materiales tales como vidrio o plástico. El recipiente contiene una composición que es por sí misma o combinada con otra composición eficaz para tratar, prevenir y/o diagnosticar la afección y puede tener una vía de acceso estéril (por ejemplo, el recipiente puede ser una bolsa con solución intravenosa o un vial que tiene un tapón que es perforable por una aguja de inyección hipodérmica). Al menos un agente activo en la composición es un anticuerpo biespecífico que comprende un primer sitio de unión a antígeno que se une específicamente a PD1 y un segundo sitio de unión a antígeno que se une específicamente a TIM-3 como se define en el presente documento anteriormente.
La ficha técnica o prospecto del envase indica que la composición se usa para tratar la afección de elección. Además, el artículo de fabricación puede comprender (a) un primer recipiente con una composición contenida en el mismo, en el que la composición comprende el anticuerpo biespecífico e la divulgación; y (b) un segundo recipiente con una composición contenida en el mismo, en el que la composición comprende otro agente citotóxico o terapéutico de otro modo. El artículo de fabricación en este modo de realización de la invención puede comprender además un prospecto del envase que indique que las composiciones se pueden usar para tratar una afección particular.
De forma alternativa, o adicionalmente, el artículo de fabricación puede comprender además un segundo (o tercer) recipiente que comprende un tampón farmacéuticamente aceptable, tal como agua bacteriostática para inyectables (BWFI), solución salina tamponada con fosfato, solución de Ringer y solución de dextrosa. Puede incluir además otros materiales deseables desde un punto de vista comercial y de usuario, incluyendo otros tampones, diluyentes, filtros, agujas y jeringuillas.
Tabla C (secuencias):
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Ejemplos
Los siguientes son ejemplos de procedimientos y composiciones de la invención.
Materiales y procedimientos generales
La información general con respecto a las secuencias de nucleótidos de las cadenas ligera y pesada de inmunoglobulinas humanas se da en: Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5.a ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991). Los aminoácidos de las cadenas de anticuerpos se numeran y denominan de acuerdo con los sistemas de numeración de acuerdo con Kabat (Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5.a ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)) como se define anteriormente.
Técnicas de ADN recombinante
Se usaron procedimientos estándar para manipular ADN como se describe en Sambrook et al., Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989. Se usaron los reactivos biológicos moleculares de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Síntesis génica
Se prepararon segmentos génicos deseados a partir de oligonucleótidos preparados por síntesis química. Los segmentos génicos de 600 - 1800 pb de longitud, que se flanquearon por sitios de escisión de endonucleasas de restricción singulares, se ensamblaron por hibridación y unión de oligonucleótidos incluyendo amplificación por PCR y posteriormente se clonaron por medio de los sitios de restricción indicados, por ejemplo, KpnI/SacI o AscI/PacI en un vector de clonación pGA4 basado en pPCRScript (Stratagene). Se confirmaron las secuencias de ADN de los fragmentos de genes subclonados por secuenciación de ADN. Se ordenaron fragmentos de síntesis génica de acuerdo con las especificaciones dadas en Geneart (Regensburg, Alemania).
Determinación de la secuencia de ADN
Se determinaron secuencias de ADN por secuenciación bicatenaria realizada en MediGenomix GmbH (Martinsried, Alemania) o Sequiserve GmbH (Vaterstetten, Alemania).
Análisis de secuencia de ADN y proteínas y gestión de datos de secuencia
Se usó el paquete de programa informático de GCG (Genetics Computer Group, Madison, Wisconsin), versión 10.2 y el paquete Vector NT1 Advance, versión 8.0 de Infomax para la creación, mapeo, análisis, anotación e ilustración de secuencia.
Vectores de expresión
Para la expresión de los anticuerpos descritos, se aplicaron variantes de plásmidos de expresión para células de expresión transitoria (por ejemplo, en HEK293) en base a una organización de ADNc con o sin un promotor de cMV-intrón A o bien en una organización genómica con un promotor de CMV.
Además del casete de expresión de anticuerpo los vectores contenían:
- un origen de replicación que permite la replicación de este plásmido en E. coli, y
- un gen de p-talactamasa que confiere resistencia a la ampicilina en E. coli.
La unidad de transcripción del gen de anticuerpo se compuso de los siguientes elementos:
- sitio(s) de restricción único(s) en el extremo 5'
- el potenciador y promotor temprano inmediato de citomegalovirus humano,
- seguido de la secuencia de intrón A en el caso de la organización de ADNc,
- una región no traducida en 5' de un gen de anticuerpo humano,
- una secuencia señal de la cadena pesada de inmunoglobulina,
- la cadena de anticuerpo humano (natural o con intercambio de dominios) como ADNc o bien como organización genómica con la organización exón-intrón de inmunoglobulina
- una región no traducida en 3' con una secuencia señal de poliadenilación, y
- sitio(s) de restricción único(s) en el extremo 3'.
Los genes de fusión que comprenden las cadenas de anticuerpo como se describe a continuación se generaron por PCR y/o síntesis génica y se ensamblaron por procedimientos y técnicas recombinantes conocidos por conexión de los segmentos de ácido nucleico correspondientes, por ejemplo, usando sitios de restricción únicos en los respectivos vectores. Se verificaron las secuencias de ácido nucleico subclonadas por secuenciación de ADN. Para transfecciones transitorias se prepararon cantidades más grandes de los plásmidos por preparación de plásmidos a partir de cultivos de E. co litransformados (Nucleobond AX, Macherey-Nagel).
Técnicas de cultivo celular
Se usaron técnicas de cultivo celular estándar como se describe en Current Protocols in Cell Biology (2000), Bonifacino, J.S., Dasso, M., Harford, J.B., Lippincott-Schwartz, J. y Yamada, K.M. (eds.), John Wiley & Sons, Inc.
Se expresaron anticuerpos multiespecíficos por cotransfección transitoria de los respectivos plásmidos de expresión en HEK293-EBNA de crecimiento adherente o en células HEK29-F que crecen en suspensión como se describe a continuación.
Transfecciones transitorias en el sistema HEK293
Se generaron todos los anticuerpos y anticuerpos biespecíficos por transfección transitoria de células 293F usando el sistema Freestyle (ThermoFisher). Aquí, se cultivaron células 293F en medio F17, se transfectaron con 293Free (Novagene) y se alimentaron después de 4 horas con VPA 4 mM y Feed 7 y glucosa al 0,6 % después de 16 h. Además, se usó el kit del sistema de expresión Expi293F™ (ThermoFisher). Aquí, se cultivaron células Expi293F™ en medio de expresión Expi293™ y se transfectaron usando el kit de transfección ExpiFectamine™ 293 de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Debido a la mejora en la estabilidad y pureza y reducción en la tendencia a agregación de los anticuerpos biespecíficos C rossM A b Vh-VL con pares de aminoácidos cargados introducidos adicionalmente en la interfase CH1/CL (véanse las posiciones en las respectivas secuencias para más detalle), no se han empleado ajustes de proporción de plásmidos. Por lo tanto, se usó la proporción de plásmido relativa de 1:1:1:1 para 1 1 CrossMab o 1:1:1 para 2+2 CrossMab para la cotransfección de plásmidos LC, HC, LC cruzado y HC cruzado. Se recogieron sobrenadantes celulares después de 7 días y se purificaron por procedimientos estándar.
Determinación de proteínas
Se determinó la concentración de proteínas de anticuerpos purificados y derivados determinando la densidad óptica (DO) a 280 nm, usando el coeficiente de extinción molar calculado en base a la secuencia de aminoácidos de acuerdo con Pace, et al., Protein Science, 1995, 4, 2411-1423.
Determinación de la concentración de anticuerpos en sobrenadantes
Se estimó la concentración de anticuerpos y derivados en sobrenadantes de cultivo celular por inmunoprecipitación con microesferas de agarosa de proteína A (Roche). Se lavaron 60 |jl de microesferas de proteína A agarosa tres veces en TBS-NP40 (Tris 50 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM, Nonidet-P40 al 1 %). Posteriormente, se aplicaron 1­ 15 ml de sobrenadante de cultivo celular a las microesferas de proteína A agarosa preequilibradas en TBS-NP40. Después de la incubación durante 1 hora a temperatura ambiente, se lavaron las microesferas en una columna de filtro Ultrafree-MC (Amicon) una vez con 0,5 ml de TBS-NP40, dos veces con 0,5 ml de solución salina tamponada con fosfato 2x (PBS2x, Roche) y brevemente cuatro veces con 0,5 ml de citrato de Na 100 mM, pH 5,0. Se eluyó el anticuerpo unido por adición de 35 j l de tampón de muestra NuPAGE® LDS (Invitrogen). Se combinó la mitad de la muestra con el agente reductor de muestras NuPAGE® o se dejó sin reducir, respectivamente, y se calentó durante 10 min a 70 °C. En consecuencia, se aplicaron 5-30 j l a un 4-12 % de NupAg E® Bis-Tris SDS-PAGE (Invitrogen) (con tampón MOPS para SDS-PAGE no reducido y tampón MES con aditivo de tampón de migración NuPAGE® Antioxidant (Invitrogen) para SDS-PAGE reducido) y se tiñó con azul de Coomassie.
Se midió la concentración de anticuerpos y derivados en sobrenadantes de cultivo celular cuantitativamente por cromatografía HPLC de afinidad. En resumen, se aplicaron sobrenadantes de cultivo celular que contenían anticuerpos y derivados que se unen a la proteína A a una columna Applied Biosystems Poros A/20 en KH2PO4 200 mM, citrato de sodio 100 mM, pH 7,4 y se eluyó de la matriz con NaCl 200 mM, ácido cítrico 100 mM, pH 2,5 en un sistema Agilent HPLC 1100. Se cuantificó la proteína eluida por absorbancia UV e integración de áreas de picos. Un anticuerpo IgG1 estándar purificado sirvió como patrón.
De forma alternativa, se midió la concentración de anticuerpos y derivados en sobrenadantes de cultivo celular por ELISA no competitivo de IgG. En resumen, se recubren placas de microvaloración de 96 pocillos StreptaWel1High Bind Streptavidin A (Roche) con 100 |jl/pocillo de molécula de captura anti-IgG humana biotinilada F(ab')2<h-Fcy> BI (Dianova) a 0,1 jg/m l durante 1 hora a temperatura ambiente o de forma alternativa durante la noche a 4 °C y posteriormente se lava tres veces con 200 jl/pocillo de PBS, Tween al 0,05 % (PBST, Sigma). Se añadieron 100 jl/pocillo de una serie de dilución en p Bs (Sigma) de los respectivos sobrenadantes de cultivo celular que contenían anticuerpos a los pocillos y se incubó durante 1-2 horas en un agitador de placas de microvaloración a temperatura ambiente. Se lavaron los pocillos tres veces con 200 jl/pocillo PBST y se detectó el anticuerpo unido con 100 j l de F(ab')2<hFcy>POD (Dianova) a 0,1 jg/m l como anticuerpo de detección durante 1 a 2 horas en un agitador de microplacas de valoración a temperatura ambiente. Se lavó anticuerpo de detección no unido tres veces con 200 jl/pocillo de PBST y se detectó el anticuerpo de detección unido por adición de 100 j l de ABTS/pocillo. Se realizó la determinación de la absorbancia en un espectrómetro Fluor Tecan a una longitud de onda de medición de 405 nm (longitud de onda de referencia 492 nm).
Purificación de proteínas
Se purificaron proteínas a partir de sobrenadantes de cultivo celular filtrados en referencia a protocolos estándar. En resumen, se aplicaron anticuerpos a una columna Sepharose de proteína A (GE Healthcare) y se lavaron con PBS. Se logró la elución de anticuerpos a pH 2,8 seguido de neutralización inmediata de la muestra. Se separó la proteína agregada de los anticuerpos monoméricos por cromatografía de exclusión por tamaño (Superdex 200; GE Healthcare) en PBS o en histidina 20 mM, NaCl 150 mM, pH 6,0. Se combinaron las fracciones de anticuerpos monoméricos, se concentró (si se requirió) usando, por ejemplo, un concentrador centrífugo MILLIPORE Amicon Ultra (30 MWCO), se congeló y almacenó a -20 °C o -80 °C. Parte de las muestras se proporcionaron para posterior análisis de proteínas y caracterización analítica, por ejemplo, por SDS-PAGE, cromatografía de exclusión por tamaño (CET) o espectrometría de masas.
SDS-PAGE
Se usó el sistema de gel NuPAGE® Pre-Cast (Invitrogen Corp.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En particular, se usó un 10 % o un 4-12 % de geles NuPAGE® Novex® Bis-TRIS Pre-Cast (pH 6,4) y un MES NuPAGE® (geles reducidos, con aditivo de tampón de migración NuPAGE® Antioxidant) o tampón de migración MOPS (geles no reducidos).
Cromatografía de exclusión por tamaño analítica
Se realizó una cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) para la determinación de la agregación y del estado oligomérico de los anticuerpos por cromatografía HPLC. En resumen, se aplicaron anticuerpos purificados con proteína A a una columna Tosoh TSKgel G3000SW en NaCl 300 mM, KH2PO4/K2 HPO4 50 mM, pH 7,5 en un sistema Agilent HPLC 1100 o a una columna Superdex 200 (GE Healthcare) en 2 x PBS en un sistema Dionex HPLC. Se cuantificó la proteína eluida por absorbancia UV e integración de áreas de picos. BioRad Gel Filtration Standard 151-1901 sirvió como patrón.
Espectrometría de masas
Esta sección describe la caracterización de los anticuerpos multiespecíficos con intercambio de VH/VL (VH/VL CrossMabs) con hincapié en su correcto ensamblaje. Se analizaron las estructuras primarias esperadas por espectrometría de masas con ionización por electronebulización (ESI-EM) de los CrossMab intactos desglucosilados y CrossMab desglucosilados/digeridos con plasmina o de forma alternativa desglucosilados/digeridos con LysC limitada.
Se desglucosilaron los CrossMab VH/VL con N-glucosidasa F en un tampón fosfato o Tris a 37 °C durante hasta 17 h a una concentración de proteína de 1 mg/ml. Se realizaron las digestiones con plasmina o LysC limitada (Roche) con 100 jg de CrossMab VH/VL desglucosilados en un tampón Tris pH 8 a temperatura ambiente durante 120 horas y a 37 °C durante 40 min, respectivamente. Antes de la espectrometría de masas, se desalaron las muestras por medio de HPLC en una columna Sephadex G25 (GE Healthcare). Se determinó la masa total por medio de EM-IEN en un sistema de EM maXis 4G UHR-QTOF (Bruker Daltonik) equipado con una fuente TriVersa NanoMate (Advion).
Determinación de unión y afinidad de unión de anticuerpos multiespecíficos a los respectivos antígenos usando resonancia de plasmón superficial (RPS) (BIACORE)
Se investiga la unión de los anticuerpos generados a los respectivos antígenos por resonancia de plasmón superficial usando un instrumento BIACORE (GE Healthcare Biosciences AB, Uppsala, Suecia). En resumen, para las mediciones de la afinidad se inmovilizan anticuerpos de cabra contra IgG humana, JIR 109-005-098, en un chip CM5 por medio de acoplamiento de aminas para la presentación de los anticuerpos contra el antígeno respectivo. Se mide la unión en un tampón HBS (HBS-P (He Pe S 10 mM, NaCl 150 mM, Tween 20 al 0,005 %, pH 7,4), 25 °C (o de forma alternativa a 37 °C). Se añadió antígeno (R&D Systems o purificado internamente) en diversas concentraciones en solución. Se midió la asociación por una inyección de antígeno de 80 segundos a 3 minutos; se midió la disociación lavando la superficie del chip con tampón HBS durante 3-10 minutos y se estimó el valor de KD usando un modelo de unión 1:1 de Langmuir. Se restan los datos de control negativo (por ejemplo, curvas de tampón) de las curvas de muestra para la corrección de la desviación de referencia intrínseca del sistema y para la reducción de la señal de ruido. Se usa el respectivo programa informático de evaluación de Biacore para el análisis de sensogramas y para el cálculo de datos de afinidad.
Anticuerpos frente a TIM3
Ejemplo 1a: generación de anticuerpos anti-TIM3
Inmunización de ratones
Se inmunizaron genéticamente ratones NMRI, usando un vector de expresión de plásmido que codifica Tim-3 humana de longitud completa por aplicación intradérmica de 100 ug de ADN de vector (plásmido 15304_hTIM3-fl), seguido de electroporación (2 pulsos cuadrados de 1000 V/cm, duración 0,1 ms, intervalo 0,125 s; seguido de 4 pulsos cuadrados de 287,5 V/cm, duración 10 ms, intervalo 0,125 s. Los ratones recibieron 6 inmunizaciones consecutivas los días 0, 14, 28, 42, 56, 70 y 84. Se extrajo sangre los días 36, 78 y 92 y se preparó suero, que se usó para la determinación de valores por ELISA (véase a continuación). Se seleccionaron los animales con los mayores valores para el refuerzo el día 96, por inyección intravenosa de 50 ug de quimera de Fc humana de Tim-3 humana recombinante, y se aislaron los anticuerpos monoclonales por tecnología de hibridoma, por fusión de esplenocitos a la línea celular de mieloma 3 días después del refuerzo.
Determinación de valores séricos (ELISA)
Se inmovilizó la quimera de Fc humana frente a Tim-3 recombinante humana en una placa NUNC Maxisorp de 96 pocillos a 0,3 ug/ml, 100 |jl/pocillo, en PBS, seguido de: bloqueo de la placa con croteína C al 2 % en PBS, 200 jl/pocillo; aplicación de diluciones en serie de antisueros, por duplicado, en croteína C al 0,5 % en PBS, 100 jl/pocillo; detección con anticuerpo anti-IgG murina de cabra conjugado con HRP (Jackson Immunoresearch/Dianova 115-036-071; 1/16000). Para todas las etapas, se incubaron placas durante 1 h a 37 °C. Entre todas las etapas, se lavaron las placas 3 veces con Tween 20 al 0,05 % en PBS. Se desarrolló la señal por adición de BM Blue POD Substrate soluble (Roche), 100 jl/pocillo; y se detuvo por adición de HCl 1 M, 100 jl/pocillo. Se leyó la absorbancia a 450 nm, frente a 690 nm como referencia. Se definió el valor como la dilución de antisueros dando como resultado una señal semimáxima.
Ejemplo 1b: caracterización de anticuerpos anti-TIM3
ELISA para TIM3
Se recubrieron las placas de estreptavidina Nunc-Maxi Sorp (MicroCoat n.° 11974998/MC1099) con 25 jl/pocillo de ECD-Tim3-His-Biotina (biotinilado con BirA ligasa) y se incubó a TA durante 1 h mientras se agitaba a 400 rpm. Después del lavado (3x90 jl/pocillo con tampón PBST), se añadieron 25 j l de muestras de aTim3 o anticuerpo de referencia diluido (1:2 etapas) aTIM3 F38-2E2 (Biolegend) y se incubó durante 1 h a TA. Después del lavado (3x90 jl/pocillo con tampón PBST) se añadieron 25 jl/pocillo de anti-POD murino de oveja (GE NA9310V) en una dilución 1:9000 y se incubó a TA durante 1 h mientras se agitaba a una rotación de 400 rpm. Después del lavado (4x90 jl/pocillo con tampón PBST), se añadieron 25 jl/pocillo de sustrato TMB (Calbiochem, n.° c L07) y se incubó hasta DO 1,5 - 2,5. A continuación, se detuvo la reacción por adición de 25 jl/pocillo de solución de HCl 1 N. La medición tuvo lugar a 370/492 nm.
Se muestran los resultados de ELISA como valores de CE50 [ng/ml] en la tabla 1 de sumario a continuación.
ELISA celular para TIM3
Se sembró la línea celular CHO-K1 adherida transfectada de manera estable con el plásmido 153 12_hTIM3-fl_pUC_Neo que codifica Tim3 humana de longitud completa y la selección con G418 (marcador de resistencia a la neomicina en el plásmido) a una concentración de 1,2x10E6 células/ml en placas de fondo plano de 384 pocilios y se cultivó durante la noche.
Al día siguiente, se añadieron 25 |jl/pocillo de muestra de Tim3 o anticuerpo de referencia aTim3 F38-2E2 sin acida (Biolegend, 354004) y se incubó durante 2 h a 4 °C (para evitar la internalización). Después del lavado (3x90 jl/pocillo de PBST (BIOTEK Washer: Prog. 29, 1 x 90) se fijaron células separando el tampón residual y añadiendo 50 jl/pocillo de glutaraldehído al 0,05 %: dilución 1:500 de glutaraldehído al 25 % (Sigma, n.° cat.: G5882) en tampón 1xPBS y se incubó durante 1 h a TA. Después del lavado (3x90 jl/pocillo de PBST (BIOTEK Washer: Prog. 21, 3x90 GreinLysin), se añadieron 25 jl/pocillo de anticuerpo secundario para la detección (anti-POD murino de oveja; fragmento F(ab')2 unido a p Od de rábano picante; GE NA9310), seguido de 2 h de incubación a TA mientras se agitaba a 400 rpm. Después del lavado (3x90 jl/pocillo de PBST (BIOTEK Washer: Prog. 21, 3x90 GreinLysin), se añadieron 25 jl/pocillo de solución de sustrato TMB (Roche 11835033001) y se incubó hasta DO 1,5 - 2,5. A continuación, se detuvo la reacción por adición de 25 jl/pocillo de solución de HCl 1 N. La medición tuvo lugar a 370/492 nm.
Se enumeran los resultados de ELISA celular como valores "CHO-Tim3 CE50" [ng/ml] en la tabla 1 de sumario a continuación.
Tabla 1: afinidades de unión de anticuerpos ejemplares (ELISA y BIACORE)
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Caracterización con BIAcore de los anticuerpos frente a TIM3
Se ha usado un ensayo basado en resonancia de plasmón superficial (SPR) para determinar los parámetros cinéticos de la unión entre varias proteínas fijadoras de Tim3 murinas así como referencias de unión a Tim3 humana. Por lo tanto, se inmovilizó un anticuerpo anti-IgG murina por acoplamiento con amina a la superficie de un chip sensor CM5 (BIAcore). A continuación se capturaron las muestras y se les unió hu/cyTim3-ECD monomérica así como un dímero de Tim3-ECD humana marcado con Fc. Se regeneró la superficie del chip sensor después de cada ciclo de análisis. Finalmente se obtuvo la constante de equilibrio Kd ajustando los datos a un modelo de interacción de Langmuir 1:1.
Se acoplaron aproximadamente 12000 unidades de respuesta (UR) de 30 jg/m l de anti-IgG murina (GE Healthcare n.° BR-1008-38) sobre los puntos 1, 2, 4 y 5 de las cubetas de lectura 1-4 (los puntos 1, 5 son activos y los puntos 2, 4 son puntos de referencia) de un chip sensor CM5 en un BIAcore B4000 a pH 5,0 usando un kit de acoplamiento de amina suministrado por GE Healthcare.
La muestra y el tampón de migración fueron HBS-EP (HEPES 0,01 M, NaCl 0,15 M, EDTA 3 mM, tensioactivo P20 al 0,05 % v/v, pH 7,4). Se fijó la temperatura de la cubeta de lectura a 25 °C y la temperatura del compartimento de muestra a 12 °C. Se cebó el sistema con tampón de migración.
Se inyectaron las muestras durante 30 segundos con una concentración de 200 jg/m l y se unieron a los puntos 1 y 5 de cada cubeta de lectura, permitiendo la medición de ocho muestras en paralelo. A continuación, se inyectó un conjunto completo de concentraciones diferentes (monomérica de macaco cangrejero ("cyno"), monomérica humana y Tim3-ECD humana dimérica fusionado con huFc) sobre cada muestra durante 240 s seguido de un tiempo de disociación de 30/1800 s. A continuación se regeneró cada ciclo de análisis (captura de muestra, punto 1 y 5 - inyección de Tim3 ECD) con una inyección de 30 segundos de duración de Glicina-HCl pH 1,7. Se fijó el caudal a 30 jl/m in para todo el ciclo.
Finalmente, se ajustaron los datos referenciados doblemente a un modelo de interacción de Langmuir 1:1 con el programa informático de evaluación BIAcore B4000. Las afinidades resultantes por Tim3 monomérica humana, cyno y Tim3 humana dimérica fusionada con huFc se muestran en la tabla 2a. La afinidad por el dímero de huTim3 se ve afectada lo más probablemente por la avidez y por lo tanto es aparentemente más fuerte que la afinidad por huTim3 monomérica.
Tabla 2a: afinidades de unión determinadas por valores KD de BIAcore obtenidos por una medición de SPR cinética. -n.f. quiere decir sin ajuste posible, lo más probablemente debido a unión nula débil.
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Determinación de la afinidad por Tim3 por medio de SPR (variante de TIM3-0016 quimérico (0018) y versiones humanizadas)
Se inmovilizó la proteína A por acoplamiento con amina a la superficie de un chip sensor CM5 (Biacore). A continuación, se capturaron las muestras y se unió huTim3-ECD a ellas. Se regeneró la superficie del chip sensor después de cada ciclo de análisis. Finalmente se obtuvieron la constante de equilibrio y las constantes de velocidad cinéticas ajustando los datos a un modelo de interacción de Langmuir 1:1.
Se acoplaron aproximadamente 2000 unidades de respuesta (UR) de 20 |jg/ml de proteína A sobre los puntos 1, 2, 4 y 5 de todas las cubetas de lectura de un chip sensor CM5 en un instrumento Biacore B4000 usando un kit de acoplamiento de amina suministrado por GE Healthcare.
La muestra y el tampón de migración fueron HBS-EP (HEPES 0,01 M, NaCl 0,15 M, EDTA 3 mM, tensioactivo P20 al 0,05 % v/v, pH 7,4). Se fijó la temperatura de la cubeta de lectura a 25 °C y la temperatura del compartimento de muestra a 12 °C. Se cebó el sistema con tampón de migración.
Se inyectaron diferentes muestras durante 30 segundos con una concentración de 10 nM y se unieron consecutivamente a los puntos 1 y 5 en todas las cubetas de lectura. A continuación, se inyectó consecutivamente un conjunto completo de diluciones de ECD-Tim3 humana monomérica (600 nM, 200 nM, 66,7 nM, 2 x 22,2 nM, 7,4 nM, 2,5 nM y 2 x 0 nM) sobre cada muestra durante 300 s. Cada inyección de antígeno se siguió de un tiempo de disociación de 12 s/1000 s y dos etapas de regeneración de 30 s con una solución de glicina-HCl pH 1,5, de las que la última contenía un período de estabilización después de la inyección de 20 segundos.
Finalmente, se ajustaron los datos referenciados doblemente a un modelo de interacción de Langmuir 1:1 usando el programa informático de evaluación Biacore B4000. Los valores de Kd resultantes se muestran en la tabla 2b.
Determinación de la afinidad por Tim3 por medio SPR (TIM3-0028 quimérico y versiones humanizadas)
Se inmovilizó Fc anti-IgG humana por acoplamiento con amina a la superficie de un chip sensor CM5 (Biacore). A continuación, se capturaron las muestras y se unió huTim3-ECD a ellas. Se regeneró la superficie del chip sensor después de cada ciclo de análisis. Finalmente se obtuvieron la constante de equilibrio y las constantes de velocidad cinéticas ajustando los datos a un modelo de interacción de Langmuir 1:1.
Se acoplaron aproximadamente 2500 unidades de respuesta (UR) de 10 jg/m l de Fc anti-IgG humana (GE Healthcare n.° BR-1008-39) sobre los puntos 1,2, 4 y 5 de todas las cubetas de lectura de un chip sensor CM5 en un instrumento Biacore B4000 usando un kit de acoplamiento de amina suministrado por GE Healthcare.
La muestra y el tampón de migración fueron HBS-EP (HEPES 0,01 M, NaCl 0,15 M, EDTA 3 mM, tensioactivo P20 al 0,05 % v/v, pH 7,4). Se fijó la temperatura de la cubeta de lectura a 25 °C y la temperatura del compartimento de muestra a 12 °C. Se cebó el sistema con tampón de migración.
Se inyectaron diferentes muestras durante 30 segundos con una concentración de 10 nM y se unieron consecutivamente a los puntos 1 y 5 en todas las cubetas de lectura. A continuación, se inyectó consecutivamente un conjunto completo de diluciones de ECD-Tim3 humana monomérica (600 nM, 200 nM, 66,7 nM, 2 x 22,2 nM, 7,4 nM, 2,5 nM y 2 x 0 nM) sobre cada muestra durante 300 s. Cada inyección de antígeno se siguió de un tiempo de disociación de 12 s/700 s y dos etapas de regeneración de 30 s con una solución de MgCh 3 M, de las que la última contenía un "lavado adicional después de la inyección" con tampón de migración.
Finalmente, se ajustaron los datos referenciados doblemente a un modelo de interacción de Langmuir 1:1 usando el programa informático de evaluación Biacore B4000. Los valores de Kd resultantes se muestran en la tabla 2b.
Tabla 2b: afinidades de unión determinadas por BIAcore (valores de KD obtenidos por una medición por SPR cinética)
Figure imgf000072_0002
Ejemplo 2: generación de derivados de anticuerpos anti-TIM3
Derivados de anticuerpos quiméricos
Se generaron anticuerpos anti-Tim3 quiméricos amplificando las regiones variables de la cadena pesada y ligera de los anticuerpos de ratón anti-TIM3 Tim3-0016, variante de Tim3-0016 (0018), Tim3-0021, Tim3-0022, Tim3-0026, Tim3-0028, Tim3-0030 y Tim3-0033, Tim3-0038 por medio de PCR y clonándolos en vectores de expresión de la cadena pesada como proteínas de fusión con cadenas principales de IgG1 humana / CH1-bisagra-CH2-CH3 humana con mutaciones LALA y PG (leucina 234 a alanina, leucina 235 a alanina, prolina 329 a glicina) anulando funciones efectoras y vectores de expresión de la cadena ligera como proteínas de fusión para C-kappa humana. A continuación se cotransfectaron los plásmidos de LC y HC en HEK293 y se purificaron después de 7 días de los sobrenadantes por procedimientos estándar para purificación de anticuerpos.
Retirada del sitio de glucosilación NYT: modificación de la posición 1 de HVR-L1 en Tim3-0016, variante de Tim3_0016 (llamada 0018 o Tim3_0018) por sustitución de N por Q o S
Se generaron mutaciones dentro de la región variable de la cadena ligera de Tim3_0016 y variante de Tim3_0016 (0018) por mutagénesis in vitro usando el "kit de mutagénesis dirigida a sitio QuikChange Lightning" de Agilent de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Por este procedimiento, se reemplazó la asparagina (N) del motivo NYT del sitio de glucosilación en la cadena ligera HVR-L1 (SEQ ID NO: 4) por glutamina (Q) (dando como resultado SEQ ID NO: 11 = Tim3_0016_HVR-L1 variante 1_NQ) o, de forma alternativa, se reemplazó la asparagina (N) por serina (S) (dando como resultado SEQ ID NO: 12 = Tim3_0016_HVR-L1 variante 2_ n S). En ambos, el motivo del sitio de glucosilación NYT se modificó con éxito. A continuación se cotransfectaron los plásmidos de LC y HC que codifican las variantes en HEK293 y se purificaron después de 7 días de los sobrenadantes por procedimientos estándar para purificación de anticuerpos.
Se sometieron a prueba los mutantes generados por ELISA en Tim3 humana, ELISA en Tim3 de macaco cangrejero y ELISA celular en células CHO-K1 adheridas que expresan Tim3 humana de longitud completa.
Tabla 3:
Figure imgf000072_0001
Se descubrió que los mutantes generados mostraron incluso más unión funcional a TIM3 humana (hu), TIM3 de macaco cangrejero (cyno) o TIM3 humana en células CHO que los anticuerpos originales Tim3_0016 o la variante de anticuerpo Tim3_0016 Tim3_0018, respectivamente.
Derivados de anticuerpos humanizados
Humanización de los dominios VH y VL de la variante de anti-Tim3-0016 murina (0018) y anti-Tim3_0028
En base a la secuencia de aminoácidos de los dominios VH y VL de a) anticuerpo anti-Tim3 variante de Tim3_0016 (0018) (con las secuencias de aminoácidos de las 6 HVR en las que en se usó la cadena ligera la HVR-L1 variante 2_NS (retirada del sitio de glucosilación por mutación N a S)) se generaron variantes de anticuerpo anti-Tim3 humanizado Tim3-0433 y Tim3-0434 y en base a la secuencia de aminoácidos de los dominios VH y VL de b) anticuerpo anti-Tim3 Tim3_0028 se generaron variantes de anticuerpo anti-Tim3 humanizado Tim3-0438 y Tim3-0443.
Se tradujeron las secuencias de aminoácidos humanizadas para las regiones variables de la cadena pesada y ligera en ADN y se sintetizó el ADNc resultante (GenArt) y a continuación se clonó en vectores de expresión de la cadena pesada como proteínas de fusión con cadenas principales de IgG1 humana/CH1-bisagra-CH2-CH3 humana con mutaciones LALA y PG (leucina 234 a alanina, leucina 235 a alanina, prolina 329 a glicina) anulando funciones efectoras o en vectores de expresión de la cadena ligera como proteínas de fusión a C-kappa humana. A continuación se cotransfectaron los plásmidos de LC y HC en HEK293 y se purificaron después de 7 días de los sobrenadantes por procedimientos estándar para purificación de anticuerpos. Los anticuerpos frente a Tim3 humanizados resultantes se nombran como sigue:
Tabla 4: secuencias de VH y VL de anticuerpos humanizados
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Tabla 5: secuencias de HVR de anticuerpos humanizados
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Ejemplo 3: efecto de los anticuerpos anti-TIM3 humanos sobre la producción de citocinas en una reacción de linfocitos mixtos (MLR)
Se usó una reacción de linfocitos mixtos para demostrar el efecto de bloquear la vía de TIM-3 sobre células efectoras linfocíticas. Se sometieron a prueba linfocitos T en el ensayo para determinar la activación y secreción de IFN-gamma en presencia o ausencia de un mAb anti-TIM-3.
Se aislaron linfocitos humanos de sangre periférica de un donante sano por centrifugación por gradiente de densidad usando Leukosep (Greiner Bio One, 227 288). En resumen, se diluyó la sangre heparinizada con tres volúmenes de PBS y se colocaron en capa alícuotas de 25 ml de la sangre diluida en tubos Leukosep de 50 ml. Después de la centrifugación a 800 x g durante 15 min a temperatura ambiente (sin rotura), se recogieron las fracciones que contenían linfocitos, se lavaron en PBS y se usaron directamente en un ensayo funcional o se resuspendieron en medio de congelación (DMSO al 10 %, FCS al 90 %) a 1,0E+07 células/ml y se almacenaron en nitrógeno líquido. Se usó la proporción 1:1 de células diana/respondedoras en el ensayo m Lr (es decir, cada cultivo de MLR contenía ~2,0E+05 PBMC de cada donante en un volumen total de 200 |jl). Se añadieron los anticuerpos monoclonales anti-TIM3 Tim3_0016, variante de Tim3_0016 (Tim3_0018), Tim3_0021, Tim3_0022, Tim3_0026, Tim3_0028, Tim3_0030, Tim3_0033, Tim3_0038 y F38-2E2 (BioLegend) a cada cultivo a diferentes concentraciones de anticuerpos. No se usó ningún anticuerpo ni anticuerpo de control de isotipo como control negativo y se usó IL-2 hu rec (20 EU/ml) como control positivo. Se cultivaron las células durante 6 días a 37 °C.
Después del día 6, se tomaron 100 |jl de medio de cada cultivo para la medición de citocinas. Se midieron los niveles de IFN-gamma usando el kit de ELISA OptEIA (BD Biosciences).
Los resultados se muestran en la tabla 6 (secreción/liberación de IFN-g). Los anticuerpos monoclonales anti-TIM3 promovieron la activación de linfocitos T y la secreción de IFN-gamma de manera dependiente de la concentración. Los anticuerpos anti-TIM3 Tim3_0021, Tim3_0022, Tim3_0028 y Tim3_0038 reducen la liberación de la citocina inflamatoria (IFN-gamma) más que el anticuerpo F38-2E2. Tim3_0016, variante de Tim3_0016 (Tim3_0018), Tim3_0033 y Tim3_0038 mostraron una liberación similar cuando se compara con el anticuerpo F38-2E2. Por el contrario, los cultivos que contenían el anticuerpo de control de isotipo no mostraron un incremento en la secreción de IFN-gamma.
Tabla 6a: porcentaje de liberación de IFN-gamma inducida por anticuerpos anti-Tim3 en comparación con IL-2 rec hu (20 EU/ml) (= 100 %) como control positivo y sin anticuerpo como control negativo
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En otros experimentos, se midieron los valores de CE50 de los siguientes anticuerpos quiméricos y humanizados (generados como se describe anteriormente) en combinación con 0,1 jg/m l de mAb anti-PD1: anticuerpo quimérico chi_Tim3_018 y sus versiones humanizadas Tim3-433 y Tim3-434, anticuerpo quimérico chi_Tim3_028 y sus versiones humanizadas Tim3-438 y Tim3-443 se midieron con diferentes mezclas de donantes de linfocitos (D2 y D3, o D1 y D5, respectivamente). Los resultados se muestran en la tabla 6b.
Tabla 6b: CE 50 de anticuerpo anti-Tim3 inducido (secreción/liberación de IFN-g)
Figure imgf000074_0002
Anticuerpos frente a PD1
Ejemplo 4: generación de anticuerpos anti-PD-1
Inmunización de ratones
Se inmunizaron genéticamente ratones NMRI, usando un vector de expresión de plásmido que codifica PD-1 humana de longitud completa por aplicación intradérmica de 100 ug de ADN de vector (plasmid15300_hPD1-fl), seguido de electroporación (2 pulsos cuadrados de 1000 V/cm, duración 0,1 ms, intervalo 0,125 s; seguido de 4 pulsos cuadrados de 287,5 V/cm, duración 10 ms, intervalo 0,125 s. Los ratones recibieron 6 inmunizaciones consecutivas los días 0, 14, 28, 42, 56, 70 y 84. Se extrajo sangre los días 36, 78 y 92 y se preparó suero, que se usó para la determinación de valores por ELISA (véase a continuación). Se seleccionaron los animales con los mayores valores para el refuerzo el día 96, por inyección intravenosa de 50 ug de quimera de Fc humana de PD1 humana recombinante, y se aislaron los anticuerpos monoclonales por tecnología de hibridoma, por fusión de esplenocitos a la línea celular de mieloma 3 días después del refuerzo.
Determinación de valores séricos (ELISA)
Se inmovilizó la quimera de Fc humana frente a PD1 recombinante humana en una placa NUNC Maxisorp de 96 pocillos a 0,3 ug/ml, 100 ul/pocillo, en PBS, seguido de: bloqueo de la placa con croteína C al 2 % en PBS, 200 ul/pocillo; aplicación de diluciones en serie de antisueros, por duplicado, en croteína C al 0,5 % en PBS, 100 ul/pocillo; detección con anticuerpo anti-IgG murina de cabra conjugado con HRP (Jackson Immunoresearch/Dianova 115-036-071; 1/16 000). Para todas las etapas, se incubaron las placas durante 1 h a 37 °C. Entre todas las etapas, se lavaron las placas 3 veces con Tween 20 al 0,05 % en PBS. Se desarrolló la señal por adición de BM Blue POD Substrate soluble (Roche), 100 jl/pocillo; y se detuvo por adición de HCl 1 M, 100 ul/pocillo. Se leyó la absorbancia a 450 nm, frente a 690 nm como referencia. Se definió el valor como la dilución de antisueros dando como resultado una señal semimáxima.
Ejemplo 5: caracterización de anticuerpos anti-PD1/ Unión de anticuerpos anti-PD1 a PD1 humana
ELISA para huPD1
Se recubrieron placas recubiertas con estreptavidina Nunc maxisorp (MicroCoat n.° 11974998001) con 25 |jl/pociMo de PD1-ECD-AviHis biotinilado y se incubó a 4 °C durante la noche. Después del lavado (3x90 jl/pocillo con tampón PBST) se añadieron 25 j l de muestras anti-PD1 o anticuerpos de referencia (anti-PD1 humano; Roche/anti-PDl de ratón; Biolegend; cat.:329912) y se incubó 1 h a TA. Después del lavado (3x90 jl/pocillo con tampón PBST) se añadieron 25 jl/pocillo de anti-H+L-POD humano de cabra (JIR, JIR109-036-o88)/anti-POD murino de cabra (GE Healthcare; Na 9310) en dilución 1:2000/1:1000 y se incubó a TA durante 1 h en un agitador. Después del lavado (3x90 jl/pocillo con tampón PBST) se añadieron 25 jl/pocillo de sustrato TMB (Roche, n.° catálogo 11835033001) y se incubó hasta una DO 2-3. La medición tuvo lugar a 370/492 nm.
Se enumeran los resultados de ELISA como valores de CE50 [ng/ml] en las tablas 7 y 8 de sumario a continuación.
ELISA celular para PD1
Se sembró la línea celular CHO-K1 adherida transfectada de manera estable con el plásmido 15311 hPD1-fl_pUC_Neo que codifica PD1 humana de longitud completa y la selección con G418 (marcador de resistencia a la neomicina en el plásmido) a una concentración de 0,01x10E6 células/pocillo en placas de fondo plano de 384 pocillos y se cultivó durante la noche.
Al día siguiente, se añadieron 25 jl/pocillo de muestra de PD1 o anticuerpo de referencia anti-PD1 humano (Roche)/anti-PD1 de ratón (Biolegend; cat.:329912) y se incubó durante 2 h a 4 °C (para evitar la internalización). Después del lavado cuidadosamente (1x90 jl/pocillo de PBST), se fijaron las células añadiendo 30 jl/pocillo de glutaraldehído al 0,05 % (Sigma, n.° cat.: G5882, 25 %) diluido en tampón 1xPBS y se incubó durante 10 min a TA. Después del lavado (3x90 jl/pocillo de PBST) se añadieron 25 jl/pocillo de anticuerpo secundario para la detección: anti-H+L-POD humano de cabra (JIR, JIR109-036-088)/anti-POD murino de oveja (GE nA9310) seguido de 1 h de incubación a TA en un agitador. Después del lavado (3x90 jl/pocillo de PBST), se añadieron 25 jl/pocillo de solución de sustrato TMB (Roche 11835033001) y se incubó hasta DO 1,0-2,0. Se midieron las placas a 370/492 nm.
Se enumeran los resultados de ELISA celular como valores "CHO-PD1 CE50" [ng/ml] en la tabla 8 de sumario a continuación.
ELISA para cynoPD1
Se recubrieron placas recubiertas con estreptavidina Nunc maxisorp (MicroCoat n.° 11974998001) con 25 jl/pocillo de cynoPD1-ECD-Biotina biotinilado y se incubó a 4 °C durante la noche. Después del lavado (3x90 jl/pocillo con tampón PBST) se añadieron 25 j l de muestras anti-PD1 o anticuerpos de referencia (anti-PD1 humano; Roche) y se incubó 1 h a TA en un agitador. Después del lavado (3x90 jl/pocillo con tampón PBST) se añadieron 25 jl/pocillo de anti-H+L-POD humano de cabra (JIR, JIR109-036-088) en una dilución 1:1000 y se incubó a TA durante 1 h en un agitador. Después del lavado (3x90 jl/pocillo con tampón PBST), se añadieron 25 jl/pocillo de sustrato TMB (Roche, 11835033001) y se incubó hasta DO 2 - 3. La medición tuvo lugar a 370/492 nm.
Se enumeran los resultados de ELISA como valores de CE50 [ng/ml] en la tabla 7 y 8 de sumario a continuación.
Ensayo de reemplazo del ligando de PD 1
Se recubrieron placas recubiertas con estreptavidina Nunc maxisorp (MicroCoat n.° 11974998001) con 25 jl/pocillo de PD1-ECD-AviHis biotinilado y se incubó a 4 °C durante la noche. Después del lavado (3x90 jl/pocillo con tampón PBST) se añadieron 25 j l de muestras anti-PD1 o anticuerpos de referencia (anti-PD1 de ratón; Biolegend; cat.:329912) y se incubó 1 h a TA en un agitador. Después del lavado (3x90 jl/pocillo con tampón PBST) se añadieron 25 jl/pocillo de PD-L1 (quimera de Fc B7-H1/PD-L1 humano recombinante; 156-B7, R&D) y se incubó 1 h a TA en un agitador. Después del lavado (3x90 jl/pocillo con tampón PBST) se añadieron 25 jl/pocillo de anti-H+L-POD humano de cabra (JIR, 109-036-088) en una dilución 1:1000 y se incubó a TA durante 1 h en un agitador. Después del lavado (3x90 jl/pocillo con tampón PBST), se añadieron 25 jl/pocillo de sustrato TMB (Roche, 11835033001) y se incubó hasta DO 2 - 3. La medición tuvo lugar a 370/492 nm.
Se muestran los resultados de ELISA como valores de CE50 [ng/ml] en la tabla 7 de sumario a continuación.
Ensayo de reemplazo del ligando de PD 2
Se recubrieron placas recubiertas con estreptavidina Nunc maxisorp (MicroCoat n.° 11974998001) con 25 |jl/podMo de PD1-ECD-AviHis biotinilado y se incubó a 4 °C durante la noche. Después del lavado (3x90 jl/pocillo con tampón PBST) se añadieron 25 j l de muestras anti-PD1 o anticuerpos de referencia (antihuPDI de ratón; Roche) y se incubó 1 h a TA en un agitador. Después del lavado (3x90 jl/pocillo con tampón PBST) se añadieron 25 jl/pocillo de PD-L2 (quimera de Fc B7-DC/PD-L2 humano recombinante; 1224-PL-100, R&D) y se incubó 1 h a Ta en un agitador. Después del lavado (3x90 jl/pocillo con tampón PBST) se añadieron 25 jl/pocillo de anti-H+L-POD humano de cabra (JIR, 109-036-088) en una dilución 1:2000 y se incubó a TA durante 1 h en un agitador. Después del lavado (3x90 jl/pocillo con tampón PBST), se añadieron 25 jl/pocillo de sustrato TMB (Roche, 11835033001) y se incubó hasta DO 2 - 3. La medición tuvo lugar a 370/492 nm.
Se muestran los resultados de ELISA como valores de CE50 [ng/ml] en la tabla 7 de sumario a continuación.
ELISA de mapeo de epítopos/ensayo de competencia de unión
Se recubrieron placas Nunc maxisorp (Nunc n.° 464718) con 25 jl/pocillo de anticuerpo de captura (anti-IgG murina de cabra; JIR; 115-006-071) y se incubó durante 1 h a TA en un agitador. Después del lavado (3x90 jl/pocillo con tampón PBST), se bloquearon las placas durante 1 h con tampón PBS que contenía BSA al 2 % a TA en un agitador. Después del lavado (3x90 jl/pocillo con tampón PBST), se añadieron 25 j l de muestras anti-PD1 de ratón y se incubó 1 h a TA en un agitador. Después del lavado (3x90 jl/pocillo con tampón PBST), se bloqueó el anticuerpo de captura con 30 jl/pocillo de IgG de ratón (JIR; 015-000-003) durante 1 h a TA en un agitador. Al mismo tiempo, se preincubó PD1-ECD-AviHis biotinilado con una segunda muestra de anticuerpo durante 1 h a TA en un agitador. Después del lavado de la placa de ensayo (3x90 jl/pocillo con tampón PBST), se transfirió la mezcla de anticuerpos frente a PD1 a la placa de ensayo y se incubó a TA durante 1 h en un agitador. Después del lavado (3x90 jl/pocillo con tampón PBST) se añadieron 25 jl/pocillo de estreptavidina POD (Roche, n.° 11089153001) en una dilución 1:4000 y se incubó a TA durante 1 h en un agitador. Después del lavado (3x90 jl/pocillo con tampón PBST), se añadieron 25 jl/pocillo de sustrato TMB (Roche, n.° 11089153001) y se incubó hasta DO 1,5 - 2,5. La medición tuvo lugar a 370/492 nm. Se definieron grupos de epítopos por agrupamiento jerárquico frente a anticuerpos de referencia.
Tabla 7: unión, inhibición de PD-L1 y grupos de regiones de epítopos de anticuerpos ejemplares (ELISA)
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Tabla 8: unión bioquímica y celular de anticuerpos frente a PD1 humanizados derivados del anticuerpo de ratón original PD1-0103 (ELISA).
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Caracterización con Biacore de los anticuerpos anti-PD-1 humanizados
Se ha usado un ensayo basado en resonancia de plasmón superficial (SPR) para determinar los parámetros cinéticos de la unión entre varias proteínas fijadoras de PD1 murinas así como referencias de unión a PD1 humana. Por lo tanto, se inmovilizó anti-IgG humana por acoplamiento con amina a la superficie de un chip sensor CM5 (Biacore). A continuación, se capturaron las muestras y se unió huPD1-ECD a ellas. Se regeneró la superficie del chip sensor después de cada ciclo de análisis. Finalmente se obtuvieron la constante de equilibrio y las constantes de velocidad cinéticas ajustando los datos a un modelo de interacción de Langmuir 1:1.
Se acoplaron aproximadamente 2000 unidades de respuesta (UR) de 20 jg/m l de anti-IgG humana (GE Healthcare n.° b R-1008-39) sobre las cubetas de lectura 1 y 2 (alternativamente: 3 y 4) de un chip sensor CM5 en un Biacore T200 a pH 5,0 usando un kit de acoplamiento de amina suministrado por GE Healthcare.
La muestra y el tampón de migración fueron HBS-EP (HEPES 0,01 M, NaCl 0,15 M, EDTA 3 mM, tensioactivo P20 al 0,05 % v/v, pH 7,4). Se fijó la temperatura de la cubeta de lectura a 25 °C y la temperatura del compartimento de muestra a 12 °C. Se cebó el sistema con tampón de migración.
Se inyectaron las muestras durante 20 segundos con una concentración de 10 nM y se unieron a la segunda cubeta de lectura. A continuación, se inyectó un conjunto completo de concentraciones de PD1-ECD humana (144 nM, 48 nM, 16 nM, 5,33 nM, 1,78 nM, 0,59 nM, 0,20 nM y 0 nM) sobre cada muestra durante 120 s seguido de un tiempo de disociación de 30/300 s y dos etapas de regeneración de 20 s con MgCh 3 M, de las que la última contenía un "lavado adicional después de la inyección" con tampón de migración.
Finalmente, se ajustaron los datos referenciados doblemente a un modelo de interacción de Langmuir 1:1 con el programa informático de evaluación BIAcore T200. Los valores de Kd , ka y kd resultantes se muestran en la tabla 9.
Tabla 9: constantes de velocidad cinética y constante de equilibrio para AB PD1-0103 quimérico y anti-PD1 humanizado determinadas por Biacore.
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Como se muestra en la tabla 9, todas las versiones humanizadas de PD1-0103 quimérico (generación, véase el ejemplo 6) presentan propiedades cinéticas similares al anticuerpo original (PD1-0103 quimérico).
Cinética
Se montó un sensor CM5 serie S en el sistema Biacore 4000 y se trataron hidrodinámicamente los puntos de detección de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Se inmovilizó el anticuerpo anti-IgG de conejo policlonal <IgGFCyM>R (Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.) a 10000 UR en los puntos de detección 1 y 5 en las cubetas de lectura 1,2, 3 y 4. Se realizó el acoplamiento por medio de química de EDC/NHS de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los puntos restantes en las cubetas de lectura sirvieron como referencia. El tampón de muestra fue el tampón del sistema complementado con 1 mg/ml de carboximetildextrano.
En un modo de realización, se llevó a cabo el ensayo a 25 °C. En otro modo de realización, se llevó a cabo el ensayo a 37 °C. Se capturaron 50 nM de cada anticuerpo monoclonal murino en la superficie del sensor por una inyección de 1 min a 10 |jl/min. Posteriormente, se inyectaron los respectivos antígenos en una serie de concentraciones de 100 nM, 2x 33 nM, 11 nM, 4 nM, 1 nM y tampón del sistema 0 nM a 30 jl/m in durante 4 min de tiempo de fase de asociación. Se siguió la disociación durante otros 4 min. Se regeneró el sistema de captura usando una inyección de 3 min de glicina 10 mM pH 1,5 a 30 jl/min. Se calcularon los datos cinéticos pertinentes usando el programa informático de evaluación Biacore de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Mapeo de epítopos
Se montó un instrumento Biacore 4000 con un sensor CAP de Biacore y se preparó de acuerdo con lo recomendado por el fabricante. El tampón del instrumento fue HBS-ET (HEPES 10 mM pH 7,4, NaCl 150 mM, EDTA 3 mM, Tween 20 al 0,005 % p/v). El instrumento funcionaba a 25 °C.
Se diluyeron todas las muestras en tampón del sistema. Se capturó un antígeno biotinilado de 35 kDa PD1-ECD-AviHis a 200 UR en la superficie del sensor CAP por una inyección de 1 min a 30 jl/m in en las cubetas de lectura 1, 2, 3 y 4 en los puntos 1 y 5. Los puntos 2, 3 y 4 sirvieron como referencia. En otro modo de realización, se capturó un antígeno biotinilado de 35 kDa PD1-ECD-AviHis a 200 UR en el sensor CAP de la misma manera.
Posteriormente, se inyectó un anticuerpo primario a 100 nM durante 3 min a 30 jl/m in seguido de la inyección de un anticuerpo secundario a 100 nM durante 3 min a 30 jl/min. Se inyectó el anticuerpo primario hasta que la saturación total de la superficie presentó antígeno. Al final de las fases de inyección de anticuerpo primario y secundario, se fijaron los puntos de informe "unión tardía" (BL) para seguir la respuesta de unión de los respectivos anticuerpos. Se calculó la proporción molar, un cociente entre la respuesta de unión a anticuerpo secundario "BL2" y la respuesta de anticuerpo primario "BL1". Se usó la proporción molar como indicador de la accesibilidad a antígeno del anticuerpo secundario, cuando el antígeno ya estaba complejado por el anticuerpo primario.
Se retiraron por completo los complejos de la superficie del sensor por una inyección durante 2 min a 30 |jl/min de tampón de regeneración de guanidina-HCl 2 M NaOH 250 mM como se recomienda por el fabricante, seguido de una inyección de 1 min a 30 jl/m in de tampón de sistema.
Ejemplo 6: efecto de diferentes anticuerpos anti-PD-1 sobre la producción de citocinas en una reacción de linfocitos mixtos (MLR)
3A) La reacción de linfocitos mixtos (MLR) es un ensayo de células inmunitarias que mide la activación de linfocitos de un individuo (donante X) con respecto a linfocitos de otro individuo (donante Y). Se usó una reacción de linfocitos mixtos para demostrar el efecto de bloquear la vía de PD1 sobre células efectoras linfocíticas. Se sometieron a prueba linfocitos T en el ensayo para determinar la activación y la secreción de IFN-gamma en presencia o ausencia de un mAb anti-PD1.
Para realizar una MLR alogénica, se aislaron células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de al menos cuatro donantes sanos de tipo HLA desconocido por centrifugación por gradiente de densidad utilizando Leukosep (Greiner Bio One, 227 288). En resumen, se diluyeron muestras de sangre heparinizada con tres volúmenes de PBS y se colocaron en capa alícuotas de 25 ml de la sangre diluida en tubos Leukosep de 50 ml. Después de la centrifugación a 800 x g durante 15 min a temperatura ambiente (sin rotura), se recogieron las fracciones que contenían linfocitos, se lavaron en PBS y se usaron directamente en un ensayo funcional o se resuspendieron en medio de congelación (DMSO al 10 %, FCS al 90 %) a 1,0E+07 células/ml y se almacenaron en nitrógeno líquido. Se prepararon reacciones MLR de 2 vías individuales mezclando PBMC de dos donantes diferentes en una proporción 1:1 de células estimuladoras/respondedoras y se realizaron cocultivos al menos por duplicado en placas de 96 pocillos de fondo plano durante 6 días a 37 °C, CO2 al 5 %, en presencia o sin un intervalo de concentraciones diferentes de anticuerpos monoclonales anti-PD1 purificados PD1-0050, PD1-0069, PD1-0073, PD1-0078, PD1-0098, PD1-0102, p D1-0103. Como anticuerpos anti-PD1 de referencia, se sintetizaron anticuerpos que comprenden los dominios VH y VL de nivolumab (también conocido como MDX-5C4 o MDX-1106) 0 bien pembrolizumab (también conocido como MK-3475 u Org 1.09A) y se clonaron con cadenas principales de IgG1 humana (con mutaciones L234A, L235A y P329G (índice EU de Kabat)). No se usó ningún anticuerpo ni anticuerpo de control de isotipo como control negativo y se usó IL-2 hu rec (20 EU/ml) como control positivo. Después del día 6, se tomaron 100 j l de medio de cada cultivo para la medición de citocinas. Se midieron los niveles de IFN-gamma usando el kit de ELISA OptEIA (BD Biosciences).
Los resultados se muestran en la tabla 10 (secreción/liberación de IFN-g). Los anticuerpos monoclonales anti-PD-1 promovieron la activación de linfocitos T y la secreción de IFN-gamma de manera dependiente de la concentración. Se calculó el valor del % de incremento de secreción de IFNg en relación con la producción de IFN-g de MLR sin adición de ningún mAb de bloqueo (valor de IFNg inducido por estimulación alogénica basal como E-c) y MLR con adición de 20 UE/ml rhuIL-2 (control positivo = valor de IFNg de un 100 % como E+c) y se calculó de acuerdo con la fórmula: Estimulación rel. [%] = ((Emuestra - E-c)/(E+c - E-c)* 100
Tabla 10: porcentaje de secreción de IFN gamma después de estimulación alogénica y tratamiento con anticuerpo anti-PD-1 en comparación con el efecto del tratamiento con IL-2 humana recombinante (20 EU/ml) (= incremento de un 100 %) como control positivo
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Varios anticuerpos de bloqueo de PD1 PD1-0050, PD1-0069, PD1-0073, PD1-0078, PD1-0098, PD1-0102, PD1-0103 demostraron una fuerte actividad inmunomoduladora potenciando la secreción de interferón gamma (IFN-g) (datos no mostrados para todos los anticuerpos).
3B) En otro experimento, se evaluó PD1-0103 quimérico (isotipo IgG1 humana con mutaciones L234A, L235A y P329G (índice EU de Kabat)). el bloqueo de PD1 con PD1-0103 quimérico potencia fuertemente la secreción de IFN-gamma por linfocitos T humanos primarios estimulados alogénicos. PD1-0103 quimérico es más potente que los anticuerpos anti-PD1 de referencia (véase la figura 1).
Para su comparación, se usaron los anticuerpos anti-PD1 de referencia que comprenden los dominios VH y VL de nivolumab (también conocido como MDX5C4 o MDX-1106) y pembrolizumab (también conocido como MK-3475 u Org 1.09A) se sintetizaron y se clonaron con cadenas principales de IgG1 humana (con mutaciones L234A, L235A y P329G (índice EU de Kabat)).
3C) En experimentos adicionales, se evaluó la actividad inmunomoduladora de las variantes humanizadas del anticuerpo anti-PD-1 PD1-0103 (anticuerpos humanizados PD1-0103-0312, PD1-0103-0314, en las figuras 2 y 3, véase también el ejemplo 9 a continuación) a) la liberación (secreción) de IFN b) la liberación (secreción) de TNF-alfa en MLR como se describe anteriormente. Se comparó el efecto del anticuerpo PD1-0103 quimérico y sus versiones humanizadas con los anticuerpos anti-PD1 de referencia que comprenden los dominios VH y Vl de nivolumab (también conocido como MDX5C4 o MDX-1106) y pembrolizumab (también conocido como MK-3475 u Org 1.09A) con cadenas principales de IgG1 humana (con mutaciones L234A, L235A y P329G (índice EU de Kabat)). Después de 6 días de cultivo MLR, se tomaron 50 |jl de sobrenadante y se midieron múltiples citocinas en un solo cultivo usando el ensayo Bio-Plex Pro™ Human Cytokine Th1/Th2 (Bio-Rad Laboratories Inc.) (datos no mostrados para todas las citocinas).
El anticuerpo PD1-0103 quimérico y sus versiones humanizadas (PD1-0103_0312 y PD1-0103_0314) fueron más potentes en comparación con los anticuerpos anti-PD1 de referencia en potenciar la activación de linfocitos T y la secreción de IFN-gamma (véase la figura 2).
Además, el anticuerpo PD1-0103 quimérico y sus variantes de humanización incrementan la secreción del factor de necrosis tumoral alfa (TNF alfa) (véase la figura 3) e IL-12 (datos no mostrados) por las células presentadoras de antígenos y potencian la capacidad de monocitos/macrófagos o células presentadoras de antígenos para estimular un linfocito T.
Ejemplo 7: efecto del bloqueo anti-PD-1 sobre la liberación de granzima B citotóxica y la secreción de IFN-y por linfocitos T CD4 humanos cocultivados con células dendríticas maduras alogénicas
Para investigar además el efecto del tratamiento anti-PD-1 en un entorno alogénico, se desarrolló un ensayo en el que se cocultivan linfocitos T CD4 recién purificados durante 5 días en presencia de células dendríticas maduras (CDm) alogénicas derivadas de monocitos. Se aislaron monocitos a partir de PBMC recién obtenidas una semana antes a través de adherencia plástica seguido de la retirada de las células no adherentes. A continuación se generaron CD inmaduras a partir de los monocitos cultivándolos durante 5 días en medio que contenía GM-CSF (50 ng/ml) e IL-4 (100 ng/ml). Para inducir la maduración de iDC, se añadió TNF-a, IL-1p e IL-6 (50 ng/ml cada uno) al medio de cultivo durante 2 días adicionales. A continuación se evaluó la maduración de CD midiendo su expresión en superficie del complejo principal de histocompatibilidad clase II (MHCII), CD80, CD83 y CD86 a través de citometría de flujo (LSRFortessa, BD Biosciences).
El día de la reacción de linfocitos mixtos mínimos (mMLR), se enriquecieron linfocitos T CD4 por medio de un kit de microesferas (Miltenyi Biotec) a partir de 108 PBMC obtenidas de un donante no relacionado. Antes del cultivo, se marcaron linfocitos T CD4 con 5 jM de carboxifluoresceína-éster succinimidílico (CFSE). A continuación se plaquearon 105 linfocitos T CD4 en una placa de 96 pocillos conjuntamente con alo-DC maduras (5:1) en presencia o ausencia de anticuerpo de bloqueo anti-PD1 (PD1-0103, PD1-0103 quimérico o bien anticuerpos humanizados PD1-0103-0312, PD1-0103-0313, PD1-0103-0314, PD1-0103-0315, abreviado como 0312, 0313, 0314, 0315 en las figuras 4A y 4 B), a la concentración de 10 jg/m l si no se indica de forma diferente en las figuras.
Cinco días después, se recogieron los sobrenadantes de cultivo celular, usados después para medir los niveles de IFN-y por ELISA (R&D Systems), y se dejaron las células a 37 °C durante 5 horas adicionales en presencia de Golgi Plug (brefeldina A) y Golgi Stop (monensina). A continuación, se lavaron las células, se tiñeron en la superficie con anticuerpo anti-CD4 humano y el tinte Live/Dead Fixable Dye Aqua (Invitrogen) antes de fijarse/permeabilizarse con tampón Fix/Perm (BD Bioscience). Se realizó tinción intracelular para granzima B (BD Bioscience), IFN-y e IL-2 (ambos de eBioscience).
También se sometieron a prueba diferentes concentraciones de las variantes humanizadas de PD1-0103 (anticuerpos humanizados PD1-0103-0312, PD1-0103-0313, PD1-0103-0314, PD1-0103-0315, abreviados como 0312, 0313, 0314, 0315 en las figuras, véase también el ejemplo 9 a continuación) y se descubrió que eran igualmente buenas para potenciar granzima B e interferón gamma. DP47 es una IgG humana no unida con una mutación LALA en la porción Fc para evitar el reconocimiento por FcyR y se usó como control negativo. Los resultados se muestran en las figuras 4A y 4 B.
Ejemplo 8: derivados de anticuerpos quiméricos
Se generaron anticuerpos frente a PD1 quiméricos amplificando las regiones variables de la cadena pesada y ligera de los anticuerpos de ratón anti-PD1 PD1-0098, PD1-0103 por medio de PCR y clonándolos en vectores de expresión de la cadena pesada como proteínas de fusión con cadenas principales de IgG1 humana / CH1-bisagra-CH2-CH3 humana con mutaciones l234A, L235A y P329G (índice EU de Kabat)) (leucina 234 a alanina, leucina 235 a alanina, prolina 329 a glicina) anulando funciones efectoras y vectores de expresión de la cadena ligera como proteínas de fusión para C-kappa humana. A continuación se cotransfectaron los plásmidos de LC y HC en HEK293 y se purificaron después de 7 días de los sobrenadantes por procedimientos estándar para purificación de anticuerpos. Se renombraron los anticuerpos frente a PD1 quiméricos como PD1-0098 quimérico (chiPD1-0098) y PDl-0103 quimérico (chiPD1-0103). Para su comparación, se usaron los anticuerpos anti-PD1 de referencia que comprenden los dominios VH y VL de nivolumab (también conocido como MDX-5C4 o MDX-1106) y pembrolizumab (también conocido como MK-3475 u Org 1.09A) se sintetizaron y se clonaron con cadenas principales de IgG1 humana (con mutaciones L234A, L235A y P329G (índice EU de Kabat)).
Ejemplo 9: generación, expresión y purificación de variantes humanizadas del anticuerpo anti-PD1 PD-0103 (huMab PD-0103) y caracterización
Humanización de los dominios VH y VL del anticuerpo anti-PD1 murino 0103
En base a la secuencia de aminoácidos de los dominios VH y VL murinos del anticuerpo anti-PD1 murino PD1-0103 (SEQ ID NO: 43 y 44), se generaron variantes del anticuerpo anti-PD1 humanizadas.
La variante VH humanizada se basa en la línea germinal humana IMGT_hVH_3_23 en combinación con la línea germinal del elemento J humano IGHJ5-01 con varias mutaciones. (dando como resultado SEQ ID NO: 45). Las variantes humanizadas de VL se basan en las líneas germinales humanas IMGT_hVK_4_1, IMGT_hVK_2_30, IMGT_hVK_3_11 e IMGT_hVK_1_39 en combinación con la línea germinal del elemento J humano IGKJ1-01. Diferentes mutaciones dieron como resultado variantes humanizadas de SEQ ID NO: 46 a SEQ ID NO: 49. Se tradujeron las secuencias de aminoácidos humanizadas para las regiones variables de la cadena pesada y ligera de PD1-0103 en ADN y se sintetizó el ADNc resultante (GenArt) y a continuación se clonó en vectores de expresión de la cadena pesada como proteínas de fusión con cadenas principales de IgG1 humana/CH1-bisagra-CH2-CH3 humana con mutaciones LALA y PG (leucina 234 a alanina, leucina 235 a alanina, prolina 329 a glicina) anulando funciones efectoras o en vectores de expresión de la cadena ligera como proteínas de fusión a C-kappa humana. A continuación se cotransfectaron los plásmidos de LC y HC en HEK293 y se purificaron después de 7 días de los sobrenadantes por procedimientos estándar para purificación de anticuerpos. Los anticuerpos frente a PD1 humanizados resultantes se nombran como sigue:
Tabla 11: secuencias de VH y VL de anticuerpos variantes humanizados de PD1-0103
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Tabla 12: secuencias de HVR de anticuerpos variantes humanizados de PD1-0103
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Las variantes del anticuerpo PD1-0103 humanizado y PD1-0103 quimérico original se caracterizaron como se describe anteriormente. Los resultados se muestran en la tabla 13.
Tabla 13: resumen de resultados para variantes de anticuerpo PD1-0103 humanizado y PD1-0103 quimérico original
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Ejemplo 10: potencia neutralizante de anticuerpos PD-1
Para someter a prueba la potencia neutralizante de los anticuerpos frente a PD-1 generados internamente para imitar un restablecimiento de una respuesta de linfocitos T suprimida in vitro, se usó un ensayo indicador PD1/PD-L1 disponible comercialmente (Promega). Este sistema consiste en células Jurkat NFAT PD1+ y un homólogo CHO PD-L1+, que también emite la señal de activación. En principio, el sistema indicador se basa en tres etapas: (1) activación de NFAT mediada por TCR, (2) inhibición de la señal de NFAT tras activación por el eje PD-1/PD-L1 y (3) recuperación de la señal de NFAT por anticuerpos de bloqueo de PD-1.
Material y procedimientos:
• Medio PD-L1: PAN Biotech (n.° P04-03609); FBS (10 %) y L-Gln (4 mM)
• Medio de ensayo: RPMI 1640 (n.° 31870; Invitrogen), HEPES 25 mM, L-Gln 2 mM, FBS (2 %)
• Células usadas para este ensayo (ambos tipos celulares adquiridos por Promega):
células CHO PD-L1+ (n.° lote 139147): 2-3x104 células/96pocillos
células Jurkat NFAT PD-1+ (n.° lote 133024: 3.5x104 células/pocillo
El día 1, se descongelaron células PD-L1+, se sembraron a la concentración celular indicada en el medio mencionado anteriormente y se cultivaron durante la noche a 37 °C y CO2 al 5 %. Al día siguiente, se retiró el medio y se incubaron las células PD-L1+ con los anticuerpos preparados a las concentraciones indicadas (en medio de ensayo). En paralelo, se descongelaron células Jurkat NFAT PD-1+ y se transfirieron números celulares mencionados anteriormente y se cocultivaron con las células PD-L1+. Después de una incubación de 6 h a 37 °C y CO2 al 5 %, se calentó el sustrato Bio-Glo hasta temperatura ambiente (1-2 h antes de la adición). Se retiró la placa de cultivo celular de la incubadora y se ajustó hasta temperatura ambiente (10 min) antes de añadir 80 |jl de solución Bio-Glo por pocillo, se incubó durante 5-10 min antes de medir la luminiscencia en un lector Tecan Infinite de acuerdo con la recomendación del fabricante del kit. Los resultados se pueden ver en las figuras 5A y 5B donde se muestra el restablecimiento de una supresión mediada por PD-1/PD-L1 de la señal NFAT por diferentes anticuerpos PD-1 tras la estimulación con TCR: Figura 5 A : PD1_0103 quimérico mostró un efecto reproduciblemente superior cuando se compara con un anticuerpo de referencia. Como referencia, se sintetizó un anticuerpo anti-PD1 que comprende los dominios VH y VL de nivolumab (también conocido como MDX-5C4 o MDX-1106) y se clonó con cadenas principales de IgG1 humana (con mutaciones L234A, L235A y P329G (índice EU de Kabat)). Figura 5B: las cuatro variantes humanizadas de PD1_0103 demostraron una potencia in vitro similar al anticuerpo principal y también fueron ligeramente superiores al anticuerpo de referencia.
Anticuerpos frente a PD1/TIM3 biespecíficos
Ejemplo 11A
Producción y expresión de anticuerpos multiespecíficos que se unen a PD1 y TIM3 con intercambio/reemplazo de dominio VH/VL (C rossM A bVH-VL) en un brazo de unión y con sustituciones aminoacídicas con carga única en la interfase CH1/CL
En un ejemplo, se generaron anticuerpos multiespecíficos que se unen a PD1 humana y TIM3 humana como se describe en la sección de procedimientos generales por técnicas de biología molecular clásicas y se expresaron de forma transitoria en células 293F o Expi293F como se describe anteriormente. Los anticuerpos multiespecíficos 1 1 CrossMAbVh_Vl se describen también en el documento WO 2009/080252. Se expresaron los anticuerpos multiespecíficos usando plásmidos de expresión que contenían los ácidos nucleicos que codifican las secuencias de aminoácidos representadas en la tabla 14a.
Tabla 14a: secuencias de aminoácidos de cadenas ligeras (LC) y cadenas pesadas (HC), con intercambio/reem lazo de dominio VH/VL 1+1 C rossM A bVh-V
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Para todas las construcciones, se usó la tecnología de heterodimerización de botones en ojales con una sustitución de botón típica (T366W) en el primer dominio CH3 y las correspondientes sustituciones de ojal (T366S, L368A e Y410V) en el segundo dominio CH3 (así como dos residuos de cisteína introducidos adicionales S354C/Y349'C) (contenido en las respectivas secuencias de la cadena pesada (HC) correspondiente representadas anteriormente).
Ejemplo 11B
Producción y expresión de anticuerpos multiespecíficos que se unen a PD1 y TIM3 con intercambio/reemplazo de dominio VH/VL (2+2 CrossM AbVh-VL) en dos brazos de unión y con sustituciones aminoacídicas con carga única en las interfases CH1/CL
En un ejemplo, se generaron anticuerpos multiespecíficos que se unen a PD1 humana y TIM3 humana como se describe en la sección de procedimientos generales por técnicas de biología molecular clásicas y se expresaron de forma transitoria en células 293F o Expi293F como se describe anteriormente. Los anticuerpos multiespecíficos 2+2 CrossMAbVH-VL se describen también en el documento WO 2010/145792. Se expresaron los anticuerpos multiespecíficos usando plásmidos de expresión que contenían los ácidos nucleicos que codifican las secuencias de aminoácidos representadas en la tabla 14b.
Tabla 14b: secuencias de aminoácidos de cadenas ligeras (LC) y cadenas pesadas (HC), con intercambio/reemplazo de dominio VH/VL (2+2 CrossM AbVh-VL)
Figure imgf000082_0002
Ejemplo 11C
Purificación y caracterización de anticuerpos multiespecíficos que se unen a PD1 y TIM3
Se purificaron los anticuerpos multiespecíficos expresados anteriormente del sobrenadante por una combinación de cromatografía de afinidad de proteína A y cromatografía de exclusión por tamaño. Todos los anticuerpos multiespecíficos se pueden producir con buenos rendimientos y son estables. Se caracterizaron los productos obtenidos por su identidad por espectrometría de masas y propiedades analíticas tales como pureza por SDS-PAGE, contenido en monómero y estabilidad.
Espectrometría de masas
Se analizaron las estructuras primarias esperadas por espectrometría de masas con ionización por electronebulización (ESI-EM) de los CrossMab intactos desglucosilados y CrossMab desglucosilados/digeridos con plasmina o de forma alternativa desglucosilados/digeridos con LysC limitada.
Se desglucosilaron los CrossMab VH/VL con N-glucosidasa F en un tampón fosfato o Tris a 37 °C durante hasta 17 h a una concentración de proteína de 1 mg/ml. Se realizaron las digestiones con plasmina o LysC limitada (Roche) con 100 |jg de CrossMab VH/VL desglucosilados en un tampón Tris pH 8 a temperatura ambiente durante 120 horas y a 37 °C durante 40 min, respectivamente. Antes de la espectrometría de masas, se desalaron las muestras por medio de HPLC en una columna Sephadex G25 (GE Healthcare). Se determinó la masa total por medio de EM-IEN en un sistema de EM maXis 4G UHR-QTOF (Bruker Daltonik) equipado con una fuente TriVersa NanoMate (Advion).
Estabilidad de anticuerpos multiespecíficos
Para evaluar la estabilidad de las construcciones de anticuerpos, se evaluaron la estabilidad térmica así como las temperaturas de inicio de agregación de acuerdo con el siguiente procedimiento. Se prepararon muestras de los anticuerpos indicados a una concentración de 1 mg/ml en histidina/cloruro de histidina 20 mM, NaCl 140 mM, pH 6,0, se transfirieron a una matriz de microcubetas de 10 j l y se registraron datos de dispersión de luz estática así como datos de fluorescencia tras excitación con un láser de 266 nm con un instrumento Optim1000 (Avacta Inc.), mientras se calentaron las muestras a una tasa de 0,1 °C/min de 25 °C a 90 °C.
La temperatura de inicio de la agregación (Tag) se define como la temperatura a la que la intensidad de luz dispersada comienza a incrementar. La temperatura de fusión (Tf) se define como el punto de inflexión en un gráfico de intensidad de fluorescencia frente a longitud de onda. Los resultados se muestran en la tabla 15.
Tabla 15
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Ejemplo 12
Caracterización de anticuerpos multiespecíficos anti-PD 1-T IM 3
Elisa de unión
ELISA para huPD1
Se recubrieron placas recubiertas con estreptavidina Nunc maxisorp (MicroCoat n.° 11974998001) con 25 |jl/pociMo de PD1-ECD-AviHis biotinilado a una concentración de 500 ng/ml y se incubó a 4 °C durante la noche. Después del lavado (3x90 jl/pocillo con tampón PBST), se añadieron 25 j l de muestras de anticuerpo anti-PD1 en concentraciones crecientes y se incubó 1 h a TA. Después del lavado (3x90 jl/pocillo con tampón PBST) se añadieron 25 jl/pocillo de anti-H+L-POD humano de cabra (JIR, JIR109-036-098) en una dilución 1:5000 y se incubó a TA durante 1 h en un agitador. Después del lavado (3x90 jl/pocillo con tampón PBST), se añadieron 25 jl/pocillo de sustrato TMB (Roche, 11835033001) y se incubó hasta DO 2-3. La medición tuvo lugar a 370/492 nm.
ELISA para huTim3
Se recubrieron placas recubiertas con estreptavidina Nunc maxisorp (MicroCoat n.° 11974998001) con 25 jl/pocillo de Tim3-ECD-AviHis biotinilado a una concentración de 60 ng/ml y se incubó a 4 °C durante la noche. Después del lavado (3x90 jl/pocillo con tampón PBST), se añadieron 25 j l de muestras de anticuerpo anti-PD1 en concentraciones crecientes y se incubó 1 h a TA. Después del lavado (3x90 jl/pocillo con tampón PBST) se añadieron 25 jl/pocillo de anti-H+L-POD humano de cabra (JIR, JIR109-036-098) en una dilución 1:5000 y se incubó a TA durante 1 h en un agitador. Después del lavado (3x90 jl/pocillo con tampón PBST), se añadieron 25 jl/pocillo de sustrato TMB (Roche, 11835033001) y se incubó hasta DO 2 - 3. La medición tuvo lugar a 370/492 nm.
Se muestran los resultados de ELISA como valores de CE50 [nM] en la tabla 16.
Tabla 16: unión bioquímica y celular de anticuerpos biespecíficos anti-PD1-TIM3 (ELISA)
Figure imgf000083_0002
Se puede detectar la unión ávida (es decir, unión con ambos brazos) para anticuerpos que son bivalentes para Tim3 (TIM3-0018 quimérico, 2+2 PD1TIM3-0359, TIM3-0028 quimérico, 2+2 PD1TIM3-0358). Los valores de CE50 mayores para los CrossMabs 1 1 resultan de la unión monovalente (hacia Tim3), no ávida, al antígeno recubierto. No se detectaron efectos de avidez para la unión a PD1. Los valores de CE50 son comparables para los formatos bivalente y tetravalente.
Biacore de unión
Propiedades de unión a antígeno de anticuerpos multiespecíficos que se unen a PD1 y TIM3
Se evaluó la unión de los anticuerpos multiespecíficos a sus respectivos antígenos diana, es decir, PD1 y TIM3 por Biacore®.
Se evaluó la unión a PD1 de acuerdo con el siguiente procedimiento:
Se inmovilizó Fc anti-IgG humana por acoplamiento con amina a la superficie de un chip sensor CM5 (Biacore). A continuación, se capturaron las muestras y se unió huPD1-ECD a ellas. Se regeneró la superficie del chip sensor después de cada ciclo de análisis. Finalmente se obtuvieron la constante de equilibrio y las constantes de velocidad cinéticas ajustando los datos a un modelo de interacción de Langmuir 1:1.
Se acoplaron aproximadamente 10.000 unidades de respuesta (UR) de 20 |jg/ml de anti-IgG humana (GE Healthcare n.° BR-1008-39) sobre todas las cubetas de lectura de un chip sensor CM5 en un Biacore T200 usando un kit de acoplamiento de amina suministrado por GE Healthcare. La muestra y el tampón de migración fueron HBS-EP (HEPES 0,01 M, NaCl 0,15 M, EDTA 3 mM, tensioactivo P20 al 0,05 % v/v, pH 7,4). Se fijó la temperatura de la cubeta de lectura a 25 °C y la temperatura del compartimento de muestra a 12 °C. Se cebó el sistema con tampón de migración.
Se inyectaron diferentes muestras durante 15 segundos con una concentración de 10 nM y se unieron consecutivamente a las cubetas de lectura 2, 3 y 4. A continuación, se inyectó un conjunto completo de concentraciones de PD1-ECD humana (300 nM, 100 nM, 2 x 33,3 nM, 11,1 nM, 3,7 nM, 1,2 nM y 2x0 nM) sobre cada muestra durante 300 s seguido de un tiempo de disociación de 10/600 s y dos etapas de regeneración de 30 s con MgCl2 3 M, de las que la última contenía un "lavado adicional después de la inyección" con tampón de migración. Finalmente, se ajustaron los datos referenciados doblemente a un modelo de interacción de Langmuir 1:1 con el programa informático de evaluación BIAcore T200. Los valores de Kd , ka y kd resultantes se muestran en la tabla 17.
Se evaluó la unión a TIM3 de acuerdo con el siguiente procedimiento:
Se inmovilizó Fab anti-IgG humana por acoplamiento con amina a la superficie de un chip sensor CM5 (Biacore). A continuación, se capturaron las muestras y se unió huTim3-ECD a ellas. Se regeneró la superficie del chip sensor después de cada ciclo de análisis. Finalmente se obtuvieron la constante de equilibrio y las constantes de velocidad cinéticas ajustando los datos a un modelo de interacción de Langmuir 1:1.
Se acoplaron aproximadamente 10.000 unidades de respuesta (UR) de 20 jg/m l de Fab anti-IgG humana (GE Healthcare n.° 28-9583-25) sobre todas las cubetas de lectura de un chip sensor CM5 en un Biacore T200 usando un kit de acoplamiento de amina suministrado por GE Healthcare. La muestra y el tampón de migración fueron HBS-EP (HEPES 0,01 M, NaCl 0,15 M, EDTA 3 mM, tensioactivo P20 al 0,05 % v/v, pH 7,4). Se fijó la temperatura de la cubeta de lectura a 25 °C y la temperatura del compartimento de muestra a 12 °C. Se cebó el sistema con tampón de migración.
Se inyectaron diferentes muestras durante 30 segundos con una concentración de 10 nM y se unieron consecutivamente a las cubetas de lectura 2, 3 y 4. A continuación, se inyectó un conjunto completo de concentraciones de Tim3-ECD humana (600 nM, 200 nM, 2 x 66,7 nM, 22,2 nM, 7,4 nM y 2x0 nM) sobre cada muestra durante 200 s seguido de un tiempo de disociación de 10/600 s y dos etapas de regeneración de 30 s con glicina HCl pH 2,1, de las que la última contenía un "lavado adicional después de la inyección" con tampón de migración. Finalmente, se ajustaron los datos referenciados doblemente a un modelo de interacción de Langmuir 1:1 con el programa informático de evaluación BIAcore T200. Los valores de Kd , ka y kd resultantes se muestran en la tabla 17.
Los resultados se indican en la tabla 17.
Tabla 17: afinidad por anticuerpos biespecíficos frente a PD1-Tim3
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Todos los anticuerpos sometidos a prueba se unen específicamente a ambas dianas, PD1 y TIM3, y presentan una afinidad antigénica en el intervalo nanomolar.
Ejemplo 13: ensayo FRET para unión simultánea de anticuerpos biespecíficos anti-PD1/Tim3 a células recombinantes
Este ejemplo describe el desarrollo de un ensayo TR-FRET basado en células para determinar la unión simultánea de formatos de anticuerpos biespecíficos a dos receptores diferentes presentes en una célula. La tecnología Taglite elegida es una combinación de TR-FRET (transferencia de energía de resonancia de fluorescencia con resolución temporal) clásica y tecnología de marca SNAP (por ejemplo, New England Biolabs, CISBIO), lo que permite que los antígenos presentes en la superficie celular se marquen con un tinte donante o aceptor fluorescente.
Objetivo de esta evaluación de tecnología
Este ensayo está destinado a demostrar la unión simultánea de anticuerpos biespecíficos anti-PD1/Tim3 a células que expresan receptores tanto PD1 como Tim3 como proteínas de fusión recombinantes que consisten en los dominios extracelulares (ECD) del receptor dado y una marca, a la que se puede unir un tinte de fluorescencia. En presencia de un anticuerpo biespecífico frente a PD1-Tim3, que se puede unir a ambos receptores marcados, las proteínas entrarán en estrecha proximidad para permitir la transferencia de energía entre los dos tintes FRET (véase la figura 6).
Generación de células HEK PD1+Tim3+ recombinantes
Se usaron procedimientos estándar para la generación de ADN como se describe en Sambrook et al., Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989. Para la clonación de variantes de PD1 y TIM3, se insertó SNAP o CLIP próxima a la región TM del receptor y se retiró el dominio citoplásmico excepto para 7 aa y se reemplazó por la marca Flag.
Transfección transitoria
Se cotransfectaron células HEK293 con reactivo de transfección 293free (Novagen) y medio de suero reducido Opti-MEM® I (Life Technologies) en un volumen de cultivo de 30 ml usando dos plásmidos a la vez con una cantidad total de ADN de 15 |jg. En resumen, se transfectaron de forma transitoria células HEK293 con los siguientes plásmidos que codifican una proteína de fusión que consiste en los ECD de PD1 o Tim3 y una marca SNAP o CLIP como se describe en otra parte:
ID de plásmido y referencia, por ejemplo, PD1-SNAP, Tim3-CLIP (la combinación PD1-CLIP y Tim3-SNAP también se construyó y se expresó, pero solo dio como resultado señales FRET bajas).
Plásmidos:
a) PD1-SNAP (en sentido 5' a 3'):
- ácido nucleico que codifica el dominio extracelular de PD1 humana incluyendo el péptido señal (residuo 1­ 170 de SEQ ID NO: 89 (30),
- ácido nucleico que codifica el espaciador GGGGS (SEQ ID NO: 90),
- ácido nucleico que codifica SNAP a partir de pSNAP-tag(T7)2 (sin residuo de metionina N terminal) que es una forma mutante del gen humano para O6-alquilguanina-ADN-alquiltransferasa (hAGT). (En comparación con hAGT natural, la proteína con marca SNAP contiene las mutaciones C26A, K125A, A127T, R128A, G131K, G132T, M134L, R135S, C150S, N157G, S159E, y está truncada después de G182) (SEQ ID NO: 91),
- ácido nucleico que codifica el espaciador GGGGS (SEQ ID NO: 90),
- ácido nucleico que codifica el dominio transmembranario y citoplásmico de PD1 humana (residuo 171-191 de SEQ ID NO: 89),
- ácido nucleico que codifica el espaciador GGGGS (SEQ ID NO: 90),
- ácido nucleico que codifica la marca Flag (DYKDDDDK; SEQ ID NO: 92).
b) Tim3-CLIP (en sentido 5' a 3'):
- ácido nucleico que codifica el dominio extracelular de Tim3 humana incluyendo el péptido señal (residuo 1­ 202 de SEQ ID NO: 93)
- ácido nucleico que codifica el espaciador GGGGS (SEQ ID NO: 90),
- ácido nucleico que codifica CLIP a partir de pCLIPf (sin residuo de metionina N terminal), que es una forma mutante del gen humano para O6-alquilguanina-ADN-alquiltransferasa (hAGT) (SEQ ID NO: 94),
- ácido nucleico que codifica el espaciador GGGGS (SEQ ID NO: 90),
- ácido nucleico que codifica el dominio transmembranario y citoplásmico de Tim3 humana (residuo 203-230 de SEQ ID NO: 93)
- ácido nucleico que codifica el espaciador GGGGS (SEQ ID NO: 90),
- ácido nucleico que codifica la marca Flag (DYKDDDDK; SEQ ID NO: 92).
Tras la transfección, se incubaron las células en matraces agitadores hasta su uso final para experimentos FACS (24-48 h después de la transfección) o FRET (después de 48 h).
Confirmación de la expresión de PD1 y Tim3 en células HEK293 transfectadas de forma transitoria (FACS) 24-48 h después de la transfección transitoria de células Hek293, se analizaron las células para determinar la expresión de PD1 y Tim3: normalmente, se tiñeron 1-3x105 células transfectadas de forma simple o doble 30 min en hielo a 10 |jg/ml, se lavaron dos veces con PBS/FCS al 2 % y se analizaron en un FacsCanto II usando • PD1-FITC Biolegend 329904, clon EH12.2H7) o PD1-PE (R&D n.° FAB1086P) y/o
• Tim3-PE (R&D FAB2365P clon 344823) y/o
Descripción de marcado celular y ensayo FRET con anticuerpos biespecíficos anti-PD1/Tim3 Descripción de marcado celular y ensayo FRET con anticuerpos biespecíficos anti-PD1/Tim3:
Se sedimentaron células transfectadas y se resuspendieron a una densidad de 1x106 células/ml en tampón Taglite (Cisbio). A continuación, se tiñeron células con SNAP-Lumi4-Tb 100 nM (Cisbio) y Clip-Red 100 nM (Cisbio) durante 1 h a 37 °C en tampón Tag-Lite (Cisbio). Después del lavado y la resuspensión en PBS/FCS al 2 %, se sembraron aproximadamente 50.000 células (en un volumen de 50 j l) en placas blancas de fondo plano de 96 pocillos (Costar) antes del control (por ejemplo, especificidad individual, referencia de isotipo) se añadieron anticuerpos biespecíficos a las células a una concentración final de 0,001-10 nM. En algunos experimentos, se reticularon anticuerpos monoclonales originales por medio de Fc anti-IgG humana de cabra (concentración final 20 nM, datos no mostrados). Después de una incubación de 1 h a 4 °C o temperatura ambiente, se midió la fluorescencia con resolución temporal como una proporción de 665/620 nm con un lector BMG Pherastar o Tecan Infinite M1000 Pro usando ajustes estándar proporcionados por el proveedor. Opcionalmente, se almacenaron células marcadas con SNAP-Lumi4-Tb y Clip-Red 100 nM a -80 °C o en nitrógeno líquido y se recién descongelaron para experimentos FRET.
Resultados:
Caracterización de diferentes anticuerpos biespecíficos y formatos de anticuerpo para la unión y entrecruzamiento de receptor simultáneos como se demuestra por inducción de FRET
Se trataron las células HEK que expresan PD1 y Tim como se describe anteriormente para medir la señal FRET tras la unión a receptor simultánea por medio de incubación con cantidades valoradas de diferentes anticuerpos biespecíficos (0,12-10 nM).
Todos los anticuerpos biespecíficos indujeron una señal FRET en células que expresan PD-1Tim3 de manera dependiente de la dosis. No existió diferencia drástica entre los formatos 1 1 (anticuerpos n.° 389 y 168) en comparación con las construcciones 2+2 (358+359) como se puede observar en la fig. 7A.
Además, también se evaluaron dos formatos biespecíficos en base a anticuerpos frente a PD1 Tim3 humanizados (n.° 476 y 477) para determinar su capacidad para inducir FRET en células tras el tratamiento. Como se demuestra en la fig. 7B, ambas construcciones indujeron una señal FRET significativa en células HEK PD1+Tim3+ subrayando la unión simulada de manera funcional.
Para mostrar la especificidad de la señal FRET inducida por la unión simulada del anticuerpo biespecífico, se añadieron IgG monoclonales de una sola especificidad para la competencia
Se marcaron células PD1 marcadas con SNAP y Tim3 marcadas con CLIP (como se describe anteriormente) con SNAP-Lumi4-Tb 100 nM y Clip-Red 100 nM. Después del lavado, se incubaron las células marcadas con el anticuerpo anti-PD1/Tim3 biespecífico n.° 0168 [a las concentraciones indicadas] durante 1 h a 4 °C antes de que se midiera la fluorescencia con resolución temporal a 665/620 nm con un lector BMG Pherastar (líneas negras). Para subrayar la especificidad de la señal FRET después del tratamiento con anticuerpo biespecífico, se añadió un anticuerpo monoclonal anti-PD1 (n.° 0165, figura 8A, curva gris) o un anticuerpo monoclonal anti-Tim-3 (n.° 0018, figura 8B, curva gris) para la competencia dando como resultado una prevención casi completa de la señal FRET. El anticuerpo anti-PD-1 original (monoespecífico) solo no indujo FRET (de puntos).
También se evitó la inducción de la señal FRET en presencia de un anticuerpo parental frente a Tim3 (0018; curvas grises) añadido en paralelo al anticuerpo biespecífico (fig. 8B).
Ejemplo 14: unión de anticuerpos a diferentes células mononucleares de sangre periférica (PBMC)
Ensayo de unión
Se tiñeron PBMC recién aisladas o linfocitos T CD4 policlonalmente activados de 3 días (anticuerpos anti-CD3 y anti-CD28 solubles unidos a placa, 1 ug/ml cada uno, ambos de BD Pharmingen) con anticuerpos biespecíficos anti-TIM-3 o anti-TIM-3/anti-PD-1 conjugados directamente a Alexa 647 durante 1 hora a 4 °C. A continuación, se lavaron las células para eliminar el anticuerpo no unido y se tiñeron con marcadores de superficie durante 30 minutos a 4 °C para discriminar monocitos (CD14+ (BD Pharmingen)), linfocitos NK (CD16+ (eBioscience), CD56+ (BioLegend) y CD3-) y linfocitos T (CD3+ (eBioscience)) antes de fijarse con BD Cell Fix. Se adquirieron las células a LSRFortessa, BD Biosciences. Los resultados para los anticuerpos biespecíficos en comparación con anticuerpos anti-Tim3 se muestran en las figuras 9A a 9H.
Ejemplo 15: internalización
ejemplo 15A) Se incubaron tres días linfocitos T CD4 activados policlonalmente, previamente cultivados con 1 mg/ml de anti-CD3 unido a placa y 1 mg/ml de anticuerpos anti-CD28 solubles, en presencia de anticuerpos anti-TIM-3 o biespecíficos anti-TIM-3/anti-PD-1 (por duplicado) durante 30 minutos a 4 °C. A continuación, se lavaron las células, se dividieron en dos grupos, de los que uno se incubó durante 3 horas adicionales a 37 °C y el otro se tiñó de inmediato con un anticuerpo secundario marcado (eBioscience) antes de fijarse con BD Cell Fix. Después de incubaciones de 3 horas, también se tiñó el segundo grupo de las células con el anticuerpo secundario marcado antes de la fijación.
Se adquirieron las células en LSRFortessa (BD Biosciences) y se compararon los niveles de expresión del anticuerpo detectable en la superficie celular entre los dos grupos. Los resultados se muestran en las figuras 10A a 10D. Ab biespecífico 1 1 p D1TIM3-0166 (en base a PD1-0103//Tim3-0038 quimérico) mostró una reducción en la internalización en comparación con AB biespecífico 2+2 PD1TIM3-0321 (también en base a PD1-0103/Tim3-0038 quimérico, pero teniendo dos sitios de unión a antígeno para PD y dos para TIM3) y en comparación con el anticuerpo Tim3-0038 original en linfocitos T CD4+ activados y en linfocitos NK activados.
Ejemplo 15B) Visualización de la localización e internalización de anticuerpos por microscopía confocal de fluorescencia
Se tiñeron las células positivas para CD4 activadas con CMFDA (Molecular Probes, Life Technologies), excepto cuando se tiñeron con anticuerpo a-PD1, y se plaquearon en cubreobjetos redondos tratados con poli-L-Lisina (Sigma). Se dejó que se adhirieran las células 30 minutos a 37 °C antes que los anticuerpos marcados con fluorescencia (1 ug/ml: a-TIM3 (chi18-A647 = Tim3_0018 quimérico marcado con AlexaA647), a-TIM3 (chi28-A647 = Tim3_0028 quimérico marcado con AlexaA647), biespec. (0168-A647 = 1 1 PD1TIM30168 (en base a PD1-0103 / Tim3-0018 quimérico) marcado con AlexaA647) y biespec. (0389-A647 = 1 1 PD1TIM3_0389 (en base a PD1-0103 / Tim3-0028 quimérico) marcado con Alexa 647) y a-PD1 (0165-A488 = PD1-0103 quimérico marcado con Alexa488) se añadieran directamente a los medios de crecimiento durante diferentes duraciones (15 min, 1 h, 2 h, 3 h). Se usó PBS frío (Lonza) para desactivar la reacción y para separar por lavado los anticuerpos no unidos. A continuación, se fijaron las células (BD Cytofix) durante 20 minutos y se lavaron dos veces con tampón de lavado (tampón de tinción Bd ). Después de transferir los cubreobjetos a una superficie seca, a continuación se montaron en portaobjetos de vidrio con medio de montaje (Fluoromount G, eBioscience) y se mantuvieron en la oscuridad a 4 °C antes de la obtención de imágenes. Se dividió la intensidad de la señal fluorescente de la ROI de membrana, de células altamente seleccionadas, entre la intensidad de la señal fluorescente de la ROI de citoplasma de las mismas células, dando como resultado una proporción presentada en los gráficos de recuadros. Para la comparación de muestras se usó el análisis A n Ov A de una vía (* = p <0,05;** = p <0,001). Se realizó la microscopía confocal de fluorescencia con un LSM700 invertido de Zeiss con un objetivo de aceite de 60x. Se obtuvieron imágenes usando el programa informático Zen (Zeiss) acoplado al microscopio. Se realizó el análisis de las imágenes con el programa informático Imaris (Bitplane; Oxford Instrument) y se realizó el análisis estadístico con GraphPad Prism (Graphpad Software). El análisis con el tiempo que muestra mayor localización de membrana en ambos anticuerpos biespecíficos y frente a PD1 cuando se compara con la agrupación intracelular de anticuerpos frente a TIM3 se muestra en las figuras 11A y 11B. El anti-PD1 y biespec. 0389 muestran solo una internalización muy lenta, incluso después de 3 h, mientras que la internalización para el otro biespec. 0168 es más fuerte. La internalización más fuerte se muestra por Ab aTim3-0028, la mayor internalización se muestra por aTim3-0018.
Ejemplo 16: activación de linfocitos T por medio de ensayo de reacción de linfocitos mixtos (MLR)
La reacción de linfocitos mixtos (MLR) es un ensayo de células inmunitarias que mide la activación de linfocitos de un individuo (donante X) con respecto a linfocitos de otro individuo (donante Y). Se usó una reacción de linfocitos mixtos para demostrar el efecto de bloquear la vía de PD1 sobre células efectoras linfocíticas. Se sometieron a prueba linfocitos T en el ensayo para determinar la activación y su secreción de IFN-gamma en presencia o ausencia de mAb biespecíficos anti-PD1/anti-TIM3.
Para realizar una MLR alogénica, se aislaron células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de al menos cuatro donantes sanos de tipo HLA desconocido por centrifugación por gradiente de densidad utilizando Leukosep (Greiner Bio One, 227 288). En resumen, se diluyeron muestras de sangre heparinizada con tres volúmenes de PBS y se colocaron en capa alícuotas de 25 ml de la sangre diluida en tubos Leukosep de 50 ml. Después de la centrifugación a 800 x g durante 15 min a temperatura ambiente (sin rotura), se recogieron las fracciones que contenían linfocitos, se lavaron en PBS y se usaron directamente en un ensayo funcional o se resuspendieron en medio de congelación (DMSO al 10 %, FCS al 90 %) a 1,0E+07 células/ml y se almacenaron en nitrógeno líquido. Se prepararon reacciones de MLR de 2 vías individuales mezclando PBMC de dos donantes diferentes en una proporción 1:1 de células estimuladoras/respondedoras y se realizaron cocultivos al menos por duplicado en placas de 96 pocillos de fondo plano durante 6 días a 37 °C, CO2 al 5 %, en presencia o sin un intervalo de concentraciones diferentes de anticuerpos frente a PD1-TIM3 biespecíficos purificados o sus anticuerpos monoespecíficos originales (solos o bien en combinación). No se usó ningún anticuerpo ni anticuerpo de control de isotipo como control negativo y se usó IL-2 hu rec (20 EU/ml) como control positivo. Después del día 6, se tomaron 100 |jl de medio de cada cultivo para la medición de citocinas. Se midieron los niveles de IFN-gamma usando el kit de ELISA OptEIA (BD Biosciences).
Los resultados se muestran en la tabla 18A a 18D (secreción/liberación de IFN-y). Los anticuerpos frente a PD1TIM3 biespecíficos promovieron la activación de linfocitos T y la secreción de IFN-gamma de manera dependiente de la concentración. Se calculó el valor del % de incremento de secreción de IFNy en relación con la producción de IFNy de MLR sin adición de ningún mAb de bloqueo (valor de IFNy inducido por estimulación alogénica basal como E-c) y MLR con adición de 20 UE/ml rhuIL-2 (control positivo = valor de y de un 100 % como E+c) y se calculó de acuerdo con la fórmula: Estimulación rel. [%] = ((Ejemplo - E-c)/(E+c - E-c)* 100.
Se realizaron cuatro experimentos separados:
En el experimento 1, se evaluó la potencia del anticuerpo biespecífico frente a PD1-Tim3 1 1 PD1TIM3_0168 (en base a PD1-0103 / Tim3-0018 quimérico (= AB 0168) en comparación con PD1-0103 quimérico (=PD1-0165) y Tim3_0018 quimérico (=Tim3-chi18) y combinaciones de los mismos. Los resultados se muestran en la figura 12A y tabla 18A.
Tabla 18A
Figure imgf000088_0001
En el experimento 2, se evaluó la potencia del anticuerpo biespecífico frente a PD1-Tim3 1 1 PD1TIM3_0389 (en base a PD1-0103 / Tim3-0028 quimérico (=AB biespec. 0389) en comparación con PD1-0103 quimérico (=p D1-0165) y Tim3_0028 quimérico (=Tim3-chi28) y combinaciones de los mismos. Los resultados se muestran en la figura 12B y tabla 18B.
Tabla 18B
Figure imgf000089_0003
En el experimento 3, se evaluó la potencia del anticuerpo biespecífico frente a PD1-Tim3 1 1 PD1-0103 / Ky8213 (en base a PD1-0103 quimérico / y antiTim3 Ky8213 del documento US 2012/0189617 (véase anticuerpo 8213, por ejemplo, ejemplo 33) que se produjo de forma análoga como se describe en el ejemplo 1 como 1 1 CrossMab) en comparación con p D1-0103 quimérico (=PD1-0165) y anti-Tim3-Ky8213 (del documento US 2012/0189617 (véase anticuerpo 8213), por ejemplo, ejemplo 33) y combinaciones de los mismos. Los resultados se muestran en la figura 12C y tabla 18C.
Tabla 18C
Figure imgf000089_0004
En el experimento 4, se evaluó la potencia del anticuerpo biespecífico frente a PD1-Tim3 1 1 PD1TIM3_0389 (en base a PD1-0103 / Tim3-0028 quimérico (= AB biespec. 0389 (1+1))) en comparación con el anticuerpo biespecífico frente a PD1-TIM3 2+2 PD1TIm 3_0358 en base a PD1-0103 / Tim3-0028 quimérico (= AB biespec.
0358 (2+2)), y PD1-0103 quimérico (= PD1-0165) y Tim3_0028 quimérico (= Tim3-chi28) y combinaciones de los mismos. Los resultados se muestran en la figura 12D y tabla 18D.
Tabla 18D:
Figure imgf000089_0002
Tabla 19: sumario de propiedades observadas/resultados:
Figure imgf000089_0001
Figure imgf000090_0001
Ejemplo 17: cocultivo de linfocitos T CD4 específicos de antígeno con la línea celular de linfocitos B-linfoblastoides ARH77
Para investigar el efecto del bloqueo anti-PD-1 sobre linfocitos T CD4 en presencia de una línea celular tumoral que expresa MHCII, se desarrolló un ensayo en el que se cocultivan linfocitos T CD4 recién purificados durante 5 días en presencia de una línea celular linfoblástica de linfocitos B inmortalizados por EBV (ARH77). El día de la reacción de linfocitos mixtos mínimos (mMLR), se enriquecieron linfocitos T CD4 por medio de un kit de microesferas (Miltenyi Biotec) a partir de 108 PBMC obtenidas de un donante sano. Antes del cultivo, se marcaron linfocitos T CD4 con 5 mM de carboxifluoresceína-éster succinimidílico (CFSE). A continuación, se plaquearon 105 linfocitos T CD4 en una placa de 96 pocillos conjuntamente con la línea de linfocitos B (5:1) en presencia o ausencia de anticuerpos de bloqueo anti-PD1 (PD1-0376 humanizado, nivolumab o bien pembrolizumab), anticuerpos anti-TIM3 (anti-TIM30438 humanizado o Kyowa-8213) o anticuerpo biespecífico anti-PD-1/TIM3 (0476 humanizado) a la concentración de 10 |jg/ml. Cinco días después, se recogieron los sobrenadantes de cultivo celular usados para medir los niveles de IFN-y por ELISA (R&D Systems).
Como se muestra en la fig.13, se observó de forma interesante que el tratamiento anti-PD-1 incrementó significativamente la capacidad de los linfocitos T CD4 para producir IFN-y cuando se comparó con linfocitos T CD4 no tratados (línea discontinua). En este ensayo, el anticuerpo anti-PD-1 0376 ha podido igualmente que los anticuerpos de referencia inducir la secreción de IFN-y por linfocitos T CD4, mientras que el anticuerpo anti-TIM3 0438 solo tiene solo un efecto insignificante incluso si es más fuerte que el anticuerpo de referencia Kyowa-8213.
Sorprendentemente, el anticuerpo biespecífico 0476 fue mejor que la combinación de anticuerpos originales, anticuerpo anti-PD1 0376 solo y los anticuerpos de referencia en impulsar la secreción de IFN-y por linfocitos T CD4 (P <0,01, ANOVA unidireccional).
Ejemplo 18: potenciación en la eficacia del anticuerpo biespecífico frente a PD1-TIM3 in vivo
Se expusieron ratones hembra inmunodeprimidos (NOG), de 6-8 semanas de edad al inicio de los experimentos, por vía subcutánea con 106 células MKN45 (línea celular de carcinoma gástrico humano, que expresan nivel alto de CEA) el día 0 en presencia de Matrigel en proporción 1:1. El día 7, se aislaron PBMC de un donante humano sano: se diluyó sangre heparinizada humana ~ 2:1 en solución salina tamponada con fosfato (PBS) (Gibco) y se transfirió a tubos Leucosep de 50 ml preparados, conteniendo cada uno 15 ml de Histopaque-1077 (Sigma Aldrich). Después de la centrifugación (30 minutos, 450xg, TA, sin freno), se recogieron las bandas de PBMC con una pipeta de 5 ml. Se transfirieron las células a tubos de 50 ml y se lavaron con PBS (centrifugación a 350xg, 10 min). Se repitió la etapa de lavado (centrifugación a 300xg, 10 min). Después de la centrifugación (10 min, 350xg), se resuspendieron las células en medio RPMI. Se inyectaron 107 PBMC por vía intravenosa en los ratones NOG creando un modelo quimérico murino-humano. El día 10, se inició un tratamiento pautado semanalmente (vehículo o tratamiento con un compuesto seleccionado de anti-PD1 (0376), Nivolumab, anti-TIM3 (0438) o anti PD1-TIM3 (0476)) y se administró por inyección intraperitoneal. Se comparó el tratamiento con el anticuerpo biespecífico frente a PD1-Tim3 (3 o 10 mg/kg; triángulo abierto) con la concentración equimolar (1,5 o 5 mg/kg) del anticuerpo frente a PD1 como agente único (0376), de Nivolumab y del anticuerpo frente a Tim3 (0438). Se midió el tamaño tumoral con compás calibrador en mm durante un período de 30 días cada 2-3 días. En las figuras 14A y 14B, las medidas de volumen tumoral se muestran como volumen medio dentro del grupo de ratones.
Todos los tratamientos mostraron la capacidad para controlar el crecimiento tumoral cuando se compararon con el grupo tratado con vehículo. La inhibición de solo PD1 (por anticuerpo frente a PD1 (0376) o Nivolumab de referencia) y de solo anticuerpo frente a TIM3 (0438), da lugar a una eficacia similar en el control del crecimiento tumoral. Esto muestra que bloqueando PD1 o bien TIM3 es posible potenciar la respuesta antitumoral. Sin embargo, se puede observar un incremento en la inhibición del crecimiento tumoral cuando tanto PD1 como TIM3 se unen por el anticuerpo biespecífico frente a PD1-TIM3. Mientras que a concentraciones bajas no se puede observar una diferencia en el crecimiento tumoral entre el anticuerpo biespecífico y el otro tratamiento, a dosis mayores, la inhibición de tanto PD1 como TIM3 por el tratamiento con el anticuerpo biespecífico frente a PD1-TIM3 da como resultado una fuerte inhibición del crecimiento tumoral.

Claims (25)

REIVINDICACIONES
1. Un anticuerpo biespecífico que comprende un primer sitio de unión a antígeno que se une específicamente a PD1 y un segundo sitio de unión a antígeno que se une específicamente a TIM3, en el que
dicho primer sitio de unión a antígeno que se une específicamente a PD1 comprende
(a) un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 43 y un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 44, o
(b) un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 45 y un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 46, o
(c) un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 45 y un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 47, o
(d) un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 45 y un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 48, o
(e) un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 45 y un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 49; y
dicho segundo sitio de unión a antígeno que se une específicamente a TIM3 comprende
(a) un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 23 y un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 24, o
(b) un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 25 y un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 26, o
(c) un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 27 y un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 28.
2. El anticuerpo biespecífico de acuerdo con la reivindicación 1, en el que
dicho primer sitio de unión a antígeno que se une específicamente a PD1 comprende un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 45 y un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 46,
y dicho segundo sitio de unión a antígeno que se une específicamente a TIM3 comprende un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 25 y un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 26.
3. El anticuerpo biespecífico de acuerdo con las reivindicaciones 1 o 2, en el que el anticuerpo biespecífico es un anticuerpo humanizado.
4. El anticuerpo biespecífico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el anticuerpo biespecífico comprende un dominio Fc, un primer fragmento Fab que comprende el sitio de unión a antígeno que se une específicamente a PD1 y un segundo fragmento Fab que comprende el sitio de unión a antígeno que se une específicamente a TIM3.
5. El anticuerpo biespecífico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el dominio Fc es un dominio Fc de IgG, en particular, uno de IgG1 o un dominio Fc de IgG4.
6. El anticuerpo biespecífico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el dominio Fc comprende una o más sustituciones aminoacídicas que reducen la unión a un receptor de Fc, en particular hacia el receptor de Fcy.
7. El anticuerpo biespecífico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el dominio Fc es de la subclase IgG1 humana con las mutaciones aminoacídicas L234A, L235A y P329G de acuerdo con la numeración EU de Kabat.
8. El anticuerpo biespecífico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que el dominio Fc comprende una modificación que promueve la asociación de la primera y segunda subunidad del dominio Fc.
9. El anticuerpo biespecífico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que la primera subunidad del dominio Fc comprende botones y la segunda subunidad del dominio Fc comprende ojales de acuerdo con el procedimiento de botones en ojales.
10. El anticuerpo biespecífico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que la primera subunidad del dominio Fc comprende las sustituciones aminoacídicas S354C y T366W (numeración EU) y la segunda subunidad del dominio Fc comprende las sustituciones aminoacídicas Y349C, T366S e Y407V de acuerdo con la numeración EU de Kabat.
11. El anticuerpo biespecífico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que en uno de los fragmentos Fab los dominios variables VL y VH se reemplazan entre sí de modo que el dominio VH es parte de la cadena ligera y el dominio VL es parte de la cadena pesada.
12. El anticuerpo biespecífico de la reivindicación 11, en el que en el primer fragmento Fab que comprende el sitio de unión a antígeno que se une específicamente a PD1, los dominios variables VL y VH se reemplazan entre sí.
13. El anticuerpo biespecífico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el que en uno de los fragmentos Fab en el dominio constante CL, el aminoácido en la posición 124 se sustituye independientemente por lisina (K), arginina (R) o histidina (H) de acuerdo con el índice de numeración EU de Kabat, y en el dominio constante CH1 los aminoácidos en las posiciones 147 y 213 se sustituyen independientemente por ácido glutámico (E) o ácido aspártico (D) de acuerdo con el índice de numeración EU de Kabat.
14. El anticuerpo biespecífico de la reivindicación 13, en el que en el segundo fragmento Fab que comprende el sitio de unión a antígeno que se une específicamente a TIM3 en el dominio constante CL el aminoácido en la posición 124 se sustituye independientemente por lisina (K), arginina (R) o histidina (H) (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat), y en el dominio constante CH1 los aminoácidos en las posiciones 147 y 213 se sustituyen independientemente por ácido glutámico (E) o ácido aspártico (D) de acuerdo con la numeración EU de Kabat.
15. El anticuerpo biespecífico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, que comprende
una primera cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 95 % de identidad de secuencia con la secuencia de SEQ ID NO: 62, una primera cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 95 % de identidad de secuencia con la secuencia de SEQ ID NO: 64, y una segunda cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 95 % de identidad de secuencia con la secuencia de SEQ ID NO: 63, y una segunda cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 95 % de identidad de secuencia con la secuencia de SEQ ID NO:65.
16. El anticuerpo biespecífico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, que comprende
una primera cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 62, una primera cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 64, y
una segunda cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 63, y una segunda cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:65.
17. Un polinucleótido que codifica el anticuerpo biespecífico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16.
18. Un vector, en particular un vector de expresión, que comprende el polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 17.
19. Una célula huésped procariota o eucariota que comprende el polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 17 o el vector de acuerdo con la reivindicación 18.
20. Un procedimiento de producción del anticuerpo biespecífico de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 16, que comprende las etapas de a) transformar una célula huésped con vectores que comprenden polinucleótidos que codifican dicho anticuerpo biespecífico, b) cultivar la célula huésped de acuerdo con condiciones adecuadas para la expresión del anticuerpo biespecífico y c) recuperar el anticuerpo biespecífico del cultivo.
21. Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo biespecífico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16 y al menos un excipiente farmacéuticamente aceptable.
22. El anticuerpo biespecífico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16 o la composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 21 para su uso como medicamento.
23. El anticuerpo biespecífico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16 o la composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 21 para su uso en la prevención o tratamiento de cáncer.
24. El anticuerpo biespecífico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16 o la composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 21 para su uso en el tratamiento de una infección vírica crónica.
25. El anticuerpo biespecífico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16 o la composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 21 para su uso en la prevención o tratamiento de cáncer, en el que el anticuerpo biespecífico se administra en combinación con un agente quimioterápico, radiación y/u otros agentes para su uso en inmunoterapia contra el cáncer.
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