KR20200099215A - Pd1 및 tim3에 특이적인 이중특이성 항체 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 PD1에 특이적으로 결합하는 제1 항원-결합 부위 및 TIM3에 특이적으로 결합하는 제2 항원-결합 부위를 포함하는 이중특이성 항체, 특히 PD1에의 결합에 비해 보다 낮은 결합 친화성으로 TIM3에 결합하는 이중특이성 항체에 관한 것이다. 본 발명은 또한 이들 분자의 제조 방법 및 상기 분자의 사용 방법에 관한 것이다.

Description

PD1 및 TIM3에 특이적인 이중특이성 항체{BISPECIFIC ANTIBODIES SPECIFIC FOR PD1 AND TIM3}
본 발명은 PD1(예정세포사 단백질 1)에 특이적으로 결합하는 제1 항원-결합 부위 및 TIM3(T 세포 면역글로불린- 및 뮤신 도메인-함유 분자 3)에 특이적으로 결합하는 제2 항원-결합 부위를 포함하는 이중특이성 항체, 특히 PD1에의 결합에 비해 보다 낮은 결합 친화성으로 TIM3에 결합하는 이중특이성 항체에 관한 것이다. 본 발명은 또한 이들 분자의 제조 방법 및 상기 분자의 사용 방법에 관한 것이다.
암에 대한 방어에서 면역계의 중요성은 병적인 세포를 검출하고 파괴하는 그의 능력에 기반한다. 그러나, 일부 종양 세포는 면역억제 상태를 일으킴으로써 상기 면역계를 탈출할 수 있다(문헌[Zitvogel et al., Nature Reviews Immunology 6 (2006), 715-727]). 종양-함유 숙주 중에 존재하는 면역억제 기전의 일례는 T 세포 기능장애 또는 기능소실의 촉진이다. T 세포는 모든 세포 구획 중의 단백질로부터 유래된 펩타이드의 선택적인 인식에 대한 그의 능력; 항원-발현 세포를 직접적으로 인식하고 살해하는(CD8+ 효과기 T 세포에 의해; 또한 세포독성 T 림프구(CTL)로서 공지됨) 그의 능력; 및 다양한 면역 응답을 조정하는(CD4+ 헬퍼 T 세포에 의해) 그의 능력(적합하고 내재적인 효과기 기전들을 통합시킨다) 때문에 내인성 항종양 면역성을 치료학적으로 조작하고자 하는 노력의 주요 초점이었다. 기능소실된 T 세포는 증식하지 못하고 항원 자극에 응답하여 세포독성 및 사이토킨 분비와 같은 효과기 기능을 발휘하지 못한다. 추가의 연구는 기능소실된 T 세포가 억제 분자 PD-1(예정세포사 단백질 1)의 지속적인 발현을 특징으로 하고 PD-1 및 PD-L1(PD-1 리간드) 상호작용의 봉쇄가 LCMV-감염된 마우스에서 T 세포 기능소실을 역전시키고 항원-특이성 T 세포 응답을 복원시킴을 확인하였다(문헌[Barber et al., Nature 439 (2006), 682-687]). 그러나, 상기 PD-1-PD-L1 경로를 단독으로 표적화하는 것이 항상 T 세포 기능소실의 역전을 생성시키는 것은 아니며(문헌[Gehring et al., Gastroenterology 137 (2009), 682-690]), 이는 다른 분자들이 T 세포 기능소실에 관련되는 듯함을 암시한다(문헌[Sakuishi, J. Experimental Med. 207 (2010), 2187-2194]).
TIM-3은 IFN-γ-분비 Th1 및 Tc1 세포상에서 선택적으로 발현되는 것으로서 최초로 확인된 분자이다(문헌[Monney et al., Nature 415 (2002), 536-541]). TIM-3과 그의 리간드, 갈렉틴-9와의 상호작용은 TIM-3+ T 세포에서 세포사를 촉발한다. 따라서, TIM-3 및 PD-1은 모두 T 세포 응답의 음성 조절인자로서 기능할 수 있다. TIM-3은 고형 및 혈액 암 모두의 전임상 모델에서 CD8+ T 세포의 가장 억제되거나 기능이상인 집단을 표시하는 것으로 입증되었다(문헌[Sakuishi, J. Experimental Med. 207 (2010), 2187-2194]; 문헌[Zhou, Blood 117 (2011), 4501-4510]; 문헌[Majeti R et al., PNAS, 106 (2009), 3396-3401]). 이들 모델에서, 상기 CD8+ TIM-3+ T 세포는 모두 PD1을 공발현하고, 이들 이중-발현 세포는 세포-주기 진행 및 효과기 사이토킨 생산[인터류킨(IL)-2, TNF, 및 IFN-γ] 모두에서 PD1을 단독으로 발현하는 세포보다 더 큰 결함을 나타낸다. 따라서, 상기 TIM-3 경로는 PD-1 경로와 협력하여 암에서 CD8+ T 세포에서의 심한 기능이상 표현형의 발생을 촉진할 수 있다. 따라서 상기 TIM-3 및 PD1 경로의 병행된 표적화는 종양 성장의 억제에서 대단히 유효할 것으로 예상된다.
TIM3는 면역글로불린 상과, 및 단백질의 TIM 과에 속하는 인간 단백질이다. 인간에서, 마우스와 유사하게, TIM-3은 T 세포뿐만 아니라 식세포, 예를 들어 대식세포 및 수지상 세포상에서 발현된다. 단백질 리간드(예를 들어 갈렉틴-9)에의 TIM3의 결합은 세포사멸 유도의 기전을 통해 Th1 응답을 억제할 수 있으며, 따라서 말초 면역관용의 유도를 이끌어낼 수 있다. siRNA에 의한 인간 TIM3의 발현의 감소 또는 차단-항체에 의한 인간 TIM3의 억제는 CD4 양성 T-세포로부터 인터페론 알파의 분비를 증가시켰으며, 이는 인간 T 세포에서 TIM3의 억제 역할을 지지한다. 식세포에서, TIM3은 또한 세포사멸 세포를 인식하기 위한 수용체로서 기능한다. 자가면역 질병 환자로부터의 임상 샘플의 분석은 CD4 양성 세포에서 TIM3의 발현이 없음을 보였다. 특히, 다발성 경화증이 있는 환자의 뇌척수액으로부터 유래된 T 세포 클론에서, TIM3의 발현 수준은 보통의 건강한 사람으로부터 유래된 클론의 경우보다 더 낮고 IFN-감마의 분비 수준은 더 높았다(문헌[Koguchi K et al., J Exp Med. 203 (2006) 1413-1418]). TIM-3과 알러지성 질병 또는 천식과의 관계에 대한 보고서들이 존재한다(WO 96/27603 및 WO2003/063792).
상기 항-TIM-3 단클론 항체의 예는 항-인간 TIM-3 래트 단클론 항체(클론 344823, R&D 시스템스에 의해 제조됨) 및 항-인간 TIM-3 마우스 단클론 항체(클론 F38-2E2, R&D 시스템스에 의해 제조됨)를 포함한다. WO2013/06490은 암을 치료하고 염증을 감소시키기 위한, 빠른 내면화를 나타내는 항-TIM-3 항체 및 그의 면역접합체에 관한 것이다. US2012/189617은 인간 TIM-3 발현 세포와 관련된 질병에 대해 보다 높은 효과기 활성, 예를 들어 항체-의존적인 세포 세포독성(ADCC 활성)을 나타내는 항-TIM3 항체에 관한 것이다.
예정세포사 단백질 1(PD-1 또는 CD279)은 CD28, CTLA-4, ICOS 및 BTLA를 또한 포함하는 수용체의 CD28과의 억제성 일원이다. PD-1은 세포 표면 수용체이며 활성화된 B 세포, T 세포 및 골수세포상에서 발현된다(문헌[Okazaki et al (2002) Curr. Opin. Immunol. 14: 391779-82]; 문헌[Bennett et al. (2003) J Immunol 170:711-8]). PD-1의 구조는 단량체성 1형 막관통 단백질로, 하나의 면역글로불린 가변-형 세포외 도메인 및 면역수용체 타이로신-기재 억제성 동기(ITIM) 및 면역수용체 타이로신-기재 전환 동기(ITSM)를 함유하는 세포질 도메인으로 이루어진다. 활성화된 T 세포는 PD1을 일시적으로 발현하나, PD1 및 그의 리간드 PDL1의 지속적인 과발현은 면역 기능소실을 촉진하여, 바이러스성 감염의 지속, 종양 회피, 증가된 감염 및 사망률에 이르게 한다. PD1 발현은 T-세포 수용체를 통한 항원 인식에 의해 유도되며 그의 발현은 주로 연속적인 T-세포 수용체 신호전달을 통해 유지된다. 연장된 항원 노출 후에, 상기 PD1 유전자좌는 재메틸화되지 못하며, 이는 연속적인 과발현을 촉진한다. 상기 PD1 경로의 차단은 암 및 만성 바이러스성 감염에서 기능소실된 T-세포 기능을 복원시킬 수 있다(문헌[Sheridan, Nature Biotechnology 30 (2012), 729-730]). PD-1에 대한 단클론 항체는 예를 들어 WO 2003/042402, WO 2004/004771, WO 2004/056875, WO 2004/072286, WO 2004/087196, WO 2006/121168, WO 2006/133396, WO 2007/005874, WO 2008/083174, WO 2008/156712, WO 2009/024531, WO 2009/014708, WO 2009/101611, WO 2009/114335, WO 2009/154335, WO 2010/027828, WO 2010/027423, WO 2010/029434, WO 2010/029435, WO 2010/036959, WO 2010/063011, WO 2010/089411, WO 2011/066342, WO 2011/110604, WO 2011/110621, WO 2012/145493, WO 2013/014668, WO 2014/179664, 및 WO 2015/112900에 기재되어 있다.
또한, PD1 및 TIM3을 모두 차단하는 것은, 예를 들어 급성 알콜성 간염(AAH)이 있는 환자에서 항세균성 면역 응답을 복원시킬 수 있는 것으로 나타났다. 상기 환자로부터의 림프구는 높은 수준의 면역 억제성 수용체를 발현하고, 보다 낮은 수준의 인터페론 감마를 생산하며, 만성 내독소 노출로 인해 증가된 IL10 생산을 갖는다. 이러한 효과는 PD1 및 TIM3를 차단함으로써 역전될 수 있으며, 이는 T 세포 및 호중구의 항균 활성을 증가시킨다(문헌[Markwick et al, Gastroenterology 148 (2015), 590-602]).
만성 면역 상태에서 면역요법을 위한 TIM3 및 PD1에 대한 이중특이성 항체는 이미 WO 2011/159877에 기재되었다. 그러나, PD1 및 TIM3에 동시에 결합하고 따라서 PD1 및 TIM3을 모두 발현하는 표적 T 세포를 선택적으로 표적화할 뿐만 아니라, 내재적인 면역 세포와 같은 다른 세포, 예를 들어 미경험 수지상 세포(DC) 및 단핵세포상의 TIM3의 차단을 피하는 신규의 이중특이성 항체를 제공할 필요가 있다. 본 발명의 이중특이성 항체는 PD1 및 TIM3을 모두 과발현하는 T 세포상에서 PD1 및 Tim3을 유효하게 차단할 뿐만 아니라, 상기 세포에 대해 매우 선택성이며, 이에 의해 매우 활성인 TIM3 항체를 투여함에 의한 부작용을 피할 수 있다.
하나의 태양에서, 본 발명은 PD1에 특이적으로 결합하는 제1 항원-결합 부위 및 TIM3에 특이적으로 결합하는 제2 항원-결합 부위를 포함하는 이중특이성 항체를 제공하며, 여기에서
상기 PD1에 특이적으로 결합하는 제1 항원-결합 부위는
(i) 서열번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1,
(ii) 서열번호 38의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및
(iii) 서열번호 39의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3
을 포함하는 VH 도메인; 및
(i) 서열번호 40의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1,
(ii) 서열번호 41의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및
(iii) 서열번호 42의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3
을 포함하는 VL 도메인
을 포함하고;
상기 TIM3에 특이적으로 결합하는 제2 항원-결합 부위는
(a) (i) 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1,
(ii) 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및
(iii) 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3
을 포함하는 VH 도메인; 및
(i) 서열번호 4 또는 서열번호 11 또는 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1,
(ii) 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및
(iii) 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3
을 포함하는 VL 도메인; 또는
(b) (i) 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1,
(ii) 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및
(iii) 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3
을 포함하는 VH 도메인; 및
(i) 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1,
(ii) 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및
(iii) 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3
을 포함하는 VL 도메인; 또는
(c) (i) 서열번호 29의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1,
(ii) 서열번호 30의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및
(iii) 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3
을 포함하는 VH 도메인; 및
(i) 서열번호 32의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1,
(ii) 서열번호 33의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및
(iii) 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3
을 포함하는 VL 도메인
을 포함한다.
하나의 태양에서, PD1에 특이적으로 결합하는 제1 항원-결합 부위 및 TIM3에 특이적으로 결합하는 제2 항원-결합 부위를 포함하는 이중특이성 항체는 2가이다.
또 다른 태양에서, PD1에 특이적으로 결합하는 제1 항원-결합 부위 및 TIM3에 특이적으로 결합하는 제2 항원-결합 부위를 포함하는 이중특이성 항체를 제공하며, 여기에서 상기 이중특이성 항체는 TIM3에 낮은 친화성으로 결합하고 PD1에 높은 친화성으로 결합한다. 특정한 태양에서, 본 발명은 PD1에 특이적으로 결합하는 제1 항원-결합 부위 및 TIM3에 특이적으로 결합하는 제2 항원-결합 부위를 포함하는 이중특이성 항체를 제공하며, 여기에서 상기 이중특이성 항체는 TIM3에, PD1에의 결합과 비교할 때 적어도 50배 더 낮은 결합 친화성으로, 보다 특히 PD1에의 결합과 비교할 때 적어도 100배 더 낮은 결합 친화성으로 결합한다. 하나의 바람직한 실시태양에서 상기 결합 친화성(KD)을 표면 플라스몬 공명 분석으로 측정한다(예를 들어 실시예 12에 기재된 바와 같이).
추가의 태양에서, PD1에 특이적으로 결합하는 제1 항원-결합 부위 및 TIM3에 특이적으로 결합하는 제2 항원-결합 부위를 포함하는 이중특이성 항체를 제공하며, 여기에서
상기 PD1에 특이적으로 결합하는 제1 항원-결합 부위는
(a) 서열번호 43의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열번호 44의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인, 또는
(b) 서열번호 45의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열번호 46의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인, 또는
(c) 서열번호 45의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열번호 47의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인, 또는
(d) 서열번호 45의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열번호 48의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인, 또는
(e) 서열번호 45의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열번호 49의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인
을 포함하고,
상기 TIM3에 특이적으로 결합하는 제2 항원-결합 부위는
(a) 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인, 또는
(b) 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인, 또는
(c) 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인, 또는
(d) 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인, 또는
(e) 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인, 또는
(f) 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인, 또는
(g) 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인, 또는
(h) 서열번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인
을 포함한다.
특정한 태양에서, PD1에 특이적으로 결합하는 제1 항원-결합 부위 및 TIM3에 특이적으로 결합하는 제2 항원-결합 부위를 포함하는 이중특이성 항체를 제공하며, 여기에서
상기 PD1에 특이적으로 결합하는 제1 항원-결합 부위는 서열번호 45의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열번호 46의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하고,
상기 TIM3에 특이적으로 결합하는 제2 항원-결합 부위는 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인, 또는 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함한다.
특히, 본 발명은 PD1에 특이적으로 결합하는 제1 항원-결합 부위 및 TIM3에 특이적으로 결합하는 제2 항원-결합 부위를 포함하는 이중특이성 항체를 제공하며, 여기에서
상기 PD1에 특이적으로 결합하는 제1 항원-결합 부위는
(i) 서열번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1,
(ii) 서열번호 38의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및
(iii) 서열번호 39의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3
을 포함하는 VH 도메인; 및
(i) 서열번호 40의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1,
(ii) 서열번호 41의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및
(iii) 서열번호 42의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3
을 포함하는 VL 도메인
을 포함하고;
상기 TIM3에 특이적으로 결합하는 제2 항원-결합 부위는
(a) (i) 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1,
(ii) 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및
(iii) 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3
을 포함하는 VH 도메인; 및
(i) 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1,
(ii) 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및
(iii) 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3
을 포함하는 VL 도메인
을 포함한다.
보다 특히, PD1에 특이적으로 결합하는 제1 항원-결합 부위 및 TIM3에 특이적으로 결합하는 제2 항원-결합 부위를 포함하는 이중특이성 항체를 제공하며, 여기에서 상기 PD1에 특이적으로 결합하는 제1 항원-결합 부위는 서열번호 45의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열번호 46의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하고, 상기 TIM3에 특이적으로 결합하는 제2 항원-결합 부위는 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함한다.
특정한 태양에서, 본 발명은 PD1에 특이적으로 결합하는 제1 항원-결합 부위 및 TIM3에 특이적으로 결합하는 제2 항원-결합 부위를 포함하는 이중특이성 항체를 제공하며, 여기에서 상기 이중특이성 항체는 TIM3에, PD1에의 결합과 비교할 때 적어도 50배 더 낮은 결합 친화성으로, 보다 특히 PD1에의 결합과 비교할 때 적어도 100배 더 낮은 결합 친화성으로 결합한다.
추가의 태양에서, 상기 PD1에 특이적으로 결합하는 제1 항원-결합 부위 및 TIM3에 특이적으로 결합하는 제2 항원-결합 부위를 포함하는 이중특이성 항체는 인간, 인간화된 또는 키메릭 항체이다. 특히, 상기는 인간화된 또는 키메릭 항체이다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 PD1에 특이적으로 결합하는 제1 항원-결합 부위 및 TIM3에 특이적으로 결합하는 제2 항원-결합 부위를 포함하는 이중특이성 항체에 관한 것이며, 여기에서 상기 이중특이성 항체는 Fc 도메인, PD1에 특이적으로 결합하는 항원-결합 부위를 포함하는 제1 Fab 단편 및 TIM3에 특이적으로 결합하는 항원-결합 부위를 포함하는 제2 Fab 단편을 포함한다.
특히, 상기 Fc 도메인은 IgG 도메인, 보다 특히 IgG1 Fc 도메인 또는 IgG4 Fc 도메인이다.
하나의 태양에서, 본 발명은 PD1에 특이적으로 결합하는 제1 항원-결합 부위 및 TIM3에 특이적으로 결합하는 제2 항원-결합 부위를 포함하는 이중특이성 항체에 관한 것이며, 여기에서 상기 Fc 도메인은 Fc 수용체, 특히 Fcγ 수용체에 대한 결합을 감소시키는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다. 특히, 상기 Fc 도메인은 아미노산 돌연변이 L234A, L235A 및 P329G(카밧 EU 지수에 따른 넘버링)를 갖는 인간 IgG1 하위부류의 것이다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 PD1에 특이적으로 결합하는 제1 항원-결합 부위 및 TIM3에 특이적으로 결합하는 제2 항원-결합 부위를 포함하는 이중특이성 항체에 관한 것이며, 여기에서 상기 Fc 도메인은 상기 Fc 도메인의 제1 및 제2 서브유닛의 결합을 촉진하는 변형을 포함한다.
하나의 태양에서, 본 발명은 PD1에 특이적으로 결합하는 제1 항원-결합 부위 및 TIM3에 특이적으로 결합하는 제2 항원-결합 부위를 포함하는 이중특이성 항체에 관한 것이며, 여기에서 상기 Fc 도메인의 제1 서브유닛은 놉을 포함하고 상기 Fc 도메인의 제2 서브유닛은 놉-인투-홀 방법에 따른 홀을 포함한다. 특정한 태양에서, 상기 Fc 도메인의 제1 서브유닛은 아미노산 치환 S354C 및 T366W(EU 넘버링)를 포함하고 상기 Fc 도메인의 제2 서브유닛은 아미노산 치환 Y349C, T366S 및 Y407V(카밧 EU 지수에 따른 넘버링)를 포함한다.
추가의 태양에서, 본 발명은 PD1에 특이적으로 결합하는 제1 항원-결합 부위 및 TIM3에 특이적으로 결합하는 제2 항원-결합 부위를 포함하는 이중특이성 항체에 관한 것이며, 여기에서 상기 Fab 단편 중 하나에서 가변 도메인 VL 및 VH는 상기 VH 도메인이 경쇄의 부분이고 상기 VL 도메인은 중쇄의 부분이도록 서로에 의해 교체된다. 특정한 태양에서, 상기 이중특이성 항체는 상기 PD1에 특이적으로 결합하는 항원-결합 부위를 포함하는 제1 Fab 단편에서 가변 도메인 VL 및 VH가 서로에 의해 교체되는 것이다.
추가의 태양에서, 본 발명은 PD1에 특이적으로 결합하는 제1 항원-결합 부위 및 TIM3에 특이적으로 결합하는 제2 항원-결합 부위를 포함하는 이중특이성 항체와 관련되며, 여기에서 상기 Fab 단편 중 하나에서 불변 도메인 CL 중 124번 위치의 아미노산이 리신(K), 아르기닌(R) 또는 히스티딘(H)(카밧 EU 지수에 따른 넘버링)에 의해 독립적으로 치환되고, 불변 도메인 CH1 중 147번 및 213번 위치의 아미노산이 글루탐산(E) 또는 아스파트산(D)(카밧 EU 지수에 따른 넘버링)에 의해 독립적으로 치환된다. 특정한 태양에서, 상기 이중특이성 항체는, TIM3에 특이적으로 결합하는 항원-결합 부위를 포함하는 제2 Fab 단편에서 불변 도메인 CL 124번 위치의 아미노산이 리신(K), 아르기닌(R) 또는 히스티딘(H)(카밧 EU 지수에 따른 넘버링)에 의해 독립적으로 치환되고, 불변 도메인 CH1 중 147번 및 213번 위치의 아미노산이 글루탐산(E) 또는 아스파트산(D)(카밧 EU 지수에 따른 넘버링)에 의해 독립적으로 치환되는 것이다.
또 다른 태양에서, 본 발명은
(a) 서열번호 50의 서열에 적어도 95% 서열 일치성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄, 서열번호 52의 서열에 적어도 95% 서열 일치성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 제1 경쇄,
서열번호 51의 서열에 적어도 95% 서열 일치성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄, 및 서열번호 53의 서열에 적어도 95% 서열 일치성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 제2 경쇄, 또는
(b) 서열번호 54의 서열에 적어도 95% 서열 일치성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄, 서열번호 56의 서열에 적어도 95% 서열 일치성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 제1 경쇄,
서열번호 55의 서열에 적어도 95% 서열 일치성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄, 및 서열번호 57의 서열에 적어도 95% 서열 일치성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 제2 경쇄, 또는
(c) 서열번호 58의 서열에 적어도 95% 서열 일치성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄, 서열번호 60의 서열에 적어도 95% 서열 일치성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 제1 경쇄,
서열번호 59의 서열에 적어도 95% 서열 일치성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄, 및 서열번호 61의 서열에 적어도 95% 서열 일치성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 제2 경쇄, 또는
(d) 서열번호 62의 서열에 적어도 95% 서열 일치성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄, 서열번호 64의 서열에 적어도 95% 서열 일치성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 제1 경쇄,
서열번호 63의 서열에 적어도 95% 서열 일치성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄, 및 서열번호 65의 서열에 적어도 95% 서열 일치성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 제2 경쇄, 또는
(e) 서열번호 66의 서열에 적어도 95% 서열 일치성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄, 서열번호 68의 서열에 적어도 95% 서열 일치성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 제1 경쇄,
서열번호 67의 서열에 적어도 95% 서열 일치성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄, 및 서열번호 69의 서열에 적어도 95% 서열 일치성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 제2 경쇄
를 포함하는, PD1에 특이적으로 결합하는 제1 항원-결합 부위 및 TIM3에 특이적으로 결합하는 제2 항원-결합 부위를 포함하는 이중특이성 항체를 제공한다.
특정한 태양에서, 본 발명은
(a) 서열번호 50의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄, 서열번호 52의 아미노산 서열을 포함하는 제1 경쇄,
서열번호 51의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄, 및 서열번호 53의 아미노산 서열을 포함하는 제2 경쇄, 또는
(b) 서열번호 54의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄, 서열번호 56의 아미노산 서열을 포함하는 제1 경쇄,
서열번호 55의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄, 및 서열번호 57의 아미노산 서열을 포함하는 제2 경쇄, 또는
(c) 서열번호 58의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄, 서열번호 60의 아미노산 서열을 포함하는 제1 경쇄,
서열번호 59의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄, 및 서열번호 61의 아미노산 서열을 포함하는 제2 경쇄, 또는
(d) 서열번호 62의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄, 서열번호 64의 아미노산 서열을 포함하는 제1 경쇄,
서열번호 63의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄, 및 서열번호 65의 아미노산 서열을 포함하는 제2 경쇄, 또는
(e) 서열번호 66의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄, 서열번호 68의 아미노산 서열을 포함하는 제1 경쇄,
서열번호 67의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄, 및 서열번호 69의 아미노산 서열을 포함하는 제2 경쇄
를 포함하는, PD1에 특이적으로 결합하는 제1 항원-결합 부위 및 TIM3에 특이적으로 결합하는 제2 항원-결합 부위를 포함하는 이중특이성 항체를 제공한다.
본 발명의 또 다른 태양에 따라, 본 명세서에서 이전에 기재한 바와 같은 이중특이성 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다. 본 발명은 본 발명의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터, 특히 발현 벡터 및 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 또는 벡터를 포함하는 원핵생물 또는 진핵생물 숙주 세포를 추가로 제공한다. 일부 실시태양에서 상기 숙주 세포는 진핵생물 세포, 특히 포유동물 세포이다.
또 다른 태양에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 PD1에 특이적으로 결합하는 제1 항원-결합 부위 및 TIM3에 특이적으로 결합하는 제2 항원-결합 부위를 포함하는 이중특이성 항체의 생산 방법을 제공하며, 상기 방법은 a) 숙주 세포를 상기 이중특이성 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터로 형질전환시키고, b) 상기 숙주 세포를 상기 이중특이성 항체의 발현에 적합한 조건하에 따라 배양하고, c) 상기 이중특이성 항체를 상기 배양물로부터 회수하는 단계들을 포함한다. 본 발명은 또한 본 발명의 방법에 의해 생산된 이중특이성 항체를 포함한다.
본 발명은 본 명세서에 기재된 바와 같은 PD1에 특이적으로 결합하는 제1 항원-결합 부위 및 TIM3에 특이적으로 결합하는 제2 항원-결합 부위를 포함하는 이중특이성 항체, 및 적어도 하나의 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 약학 조성물을 추가로 제공한다.
또한 본 발명은 약제로서 사용하기 위한, 본 명세서에 기재된 바와 같은 PD1에 특이적으로 결합하는 제1 항원-결합 부위 및 TIM3에 특이적으로 결합하는 제2 항원-결합 부위를 포함하는 이중특이성 항체, 또는 상기 이중특이성 항체를 포함하는 약학 조성물을 포함한다.
또 다른 태양에서, 본 발명은
i) 면역 응답의 조절, 예를 들어 T 세포 활성의 복원에,
ii) 면역 응답 또는 기능의 자극에,
iii) 감염의 치료에,
iv) 암의 치료에,
v) 암의 진행의 지연에,
vi) 암을 앓고 있는 환자의 생존의 연장에
사용하기 위한, 본 명세서에 기재된 바와 같은 PD1에 특이적으로 결합하는 제1 항원-결합 부위 및 TIM3에 특이적으로 결합하는 제2 항원-결합 부위를 포함하는 이중특이성 항체, 또는 상기 이중특이성 항체를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
하나의 태양에서, 질병의 치료가 필요한 개체에서 상기 질병의 치료에 사용하기 위한, 본 명세서에 기재된 바와 같은 PD1에 특이적으로 결합하는 제1 항원-결합 부위 및 TIM3에 특이적으로 결합하는 제2 항원-결합 부위를 포함하는 이중특이성 항체, 또는 상기 이중특이성 항체를 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 특정한 태양에서, 본 발명은 암의 치료에 사용하기 위한, PD1에 특이적으로 결합하는 제1 항원-결합 부위 및 TIM3에 특이적으로 결합하는 제2 항원-결합 부위를 포함하는 이중특이성 항체, 또는 상기 이중특이성 항체를 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 추가의 특정한 태양에서, 면역 응답의 조절에 사용하기 위한, PD1에 특이적으로 결합하는 제1 항원-결합 부위 및 TIM3에 특이적으로 결합하는 제2 항원-결합 부위를 포함하는 이중특이성 항체, 또는 상기 이중특이성 항체를 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 또 다른 태양에서, 만성 바이러스성 감염의 치료에 사용하기 위한, PD1에 특이적으로 결합하는 제1 항원-결합 부위 및 TIM3에 특이적으로 결합하는 제2 항원-결합 부위를 포함하는 이중특이성 항체, 또는 상기 이중특이성 항체를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
또한 질병의 치료가 필요한 개체에서 상기 질병의 치료를 위한 약제의 제조를 위한, 특히 암의 치료를 위한 약제의 제조를 위한 본 명세서에 기재된 바와 같은 PD1에 특이적으로 결합하는 제1 항원-결합 부위 및 TIM3에 특이적으로 결합하는 제2 항원-결합 부위를 포함하는 이중특이성 항체의 용도뿐만 아니라, 상기 개체에게 치료 유효량의, 약학적으로 허용 가능한 형태의 본 명세서에 기재된 바와 같은 PD1에 특이적으로 결합하는 제1 항원-결합 부위 및 TIM3에 특이적으로 결합하는 제2 항원-결합 부위를 포함하는 이중특이성 항체를 포함하는 조성물을 투여함을 포함하는, 상기 개체에서 질병을 치료하는 방법을 제공한다. 특정한 태양에서, 상기 질병은 암이다. 또 다른 특정한 태양에서, 상기 질병은 만성 바이러스성 감염이다. 또 다른 태양에서, 개체에게 치료 유효량의, 약학적으로 허용 가능한 형태의 본 명세서에 기재된 바와 같은 PD1에 특이적으로 결합하는 제1 항원-결합 부위 및 TIM3에 특이적으로 결합하는 제2 항원-결합 부위를 포함하는 이중특이성 항체를 포함하는 조성물을 투여함을 포함하는, 상기 개체에서 면역 응답을 조절하는 방법을 제공한다. 상기 태양들 중 어느 하나에서, 상기 개체는 바람직하게는 포유동물, 특히 인간이다.
본 발명은 또한 암의 예방 또는 치료에 사용하기 위한, 본 명세서에 기재된 바와 같은 PD1에 특이적으로 결합하는 제1 항원-결합 부위 및 TIM3에 특이적으로 결합하는 제2 항원-결합 부위를 포함하는 이중특이성 항체, 또는 상기 이중특이성 항체를 포함하는 약학 조성물을 제공하며, 여기에서 상기 이중특이성 항체를 화학요법제, 방사선 및/또는 암 면역요법에 사용하기 위한 다른 작용제와 함께 투여한다.
더욱 또한, 종양 세포의 성장을 억제하기 위해 개체에게 유효량의 본 명세서에 기재된 바와 같은 PD1에 특이적으로 결합하는 제1 항원-결합 부위 및 TIM3에 특이적으로 결합하는 제2 항원-결합 부위를 포함하는 이중특이성 항체를 투여함을 포함하는, 상기 개체에서 상기 종양 세포의 성장을 억제하는 방법을 제공한다. 상기 개체는 바람직하게는 포유동물, 특히 인간이다.
도 1: 키메릭 PD1-0103에 의한 PD1의 봉쇄는 동종이계 자극된 1차 인간 T 세포에 의한 IFN-감마 분비를 강하게 증대시킨다.
도 2: 키메릭 PD1-0103에 의한 PD1의 봉쇄는 동종이계 자극된 1차 인간 T 세포에 의한 인터페론 감마(IFN-γ) 분비를 강하게 증가시킨다.
도 3: 키메릭 PD1-0103에 의한 PD1의 봉쇄는 동종이계 자극된 1차 인간 T 세포에 의한 종양 괴사인자 알파(TNF) 분비를 강하게 증가시킨다.
도 4: 증가하는 농도의 상이한 항-PD-1 항체의 존재하에서 MLR 상등액 중의 4a) 그랜자임 B를 생산하는 CD4 T 세포의 빈도 및 4b) 흡광도(광학 밀도, O.D.)에 의해 검출되는 IFN-γ의 양.
도 5: 5a) 상이한 항-PD-1 항체의 존재하에서 억제된 T 세포 수용체 신호전달의 재활성화에 대한 PD1/PD-L1 봉쇄의 영향, 5b) 상이한 항-PD-1 항체의 존재하에서 억제된 T 세포 수용체 신호전달의 재활성화에 대한 PD1/PD-L1 봉쇄의 영향.
도 6: 재조합 세포에 대한 항-PD1/Tim3 이중특이성 항체의 동시 결합에 대한 FRET 분석의 도해.
도 7: PD1 및 TIM3 발현 세포에 대한 상이한 이중특이성 PD1TIM3 항체의 처리/결합시 FRET의 유도: PD1 SNAP Tim3 CLIP로 이중 형질감염된 HEK293 세포를 태그 라이트(Tag-Lite) 완충제(시스바이오(Cisbio)) 중에서 37 ℃에서 1h 동안 100 nM SNAP-Lumi4-Tb(시스바이오) 및 100 nM 클립 레드(Clip-Red)(시스바이오)로 염색하였다. 세척 후에, 표지된 세포를, 시간분해 형광을 BMG 페라스타(Pherastar) 판독기로 665/620 ㎚에서 측정하기 전에(상기 FRET 신호의 평균 +/-SD를 나타낸다[비 665/620 ㎚ * 10,000], n=3) 4 ℃에서 1h 동안 표시된 이중특이성 항-PD1/Tim3 항체[0 내지 10 nM](도 7b)에 도시된 인간화된 이중특이성 변체)와 배양하였다. 7a: 2+2 구조체(PD1TIM3_0358 + PD1TIM3_0349)와 비교된 1+1 포맷(항체 PD1TIM3_0389 및 PD1TIM3_0168) 7b: 인간화된 이중특이성 변체(PD1TIM3_0476 및 PD1TIM3_477).
도 8: 항-PD1/TIM3 이중특이성 항체 1+1 PD1TIM3-0168의 동시 결합에 대한 FRET 분석: SNAP-태그된 PD1 및 CLIP-태그된 TIM3 세포(앞서 기재된 바와 같다)를 100 nM SNAP-Lumi4-Tb 및 100 nM 클립-레드로 표지하였다. 세척 후에, 표지된 세포를, 시간분해 형광을 BMG 페라스타 판독기로 665/620 ㎚에서 측정하기 전에(검은색 선) 4 ℃에서 1h 동안 [표시된 농도에서] 이중특이성 항-PD1/TIM3 항체 #0168과 배양하였다. 상기 이중특이성 항체 유도된 FRET 신호의 특이성을 강조하기 위해서, 항-PD1 단클론 항체(#0165; 도 8a) 또는 항-TIM3-차단 항체(#0018, 도 8b)를 경쟁을 위해 첨가하여 상기 FRET 신호의 거의 완전한 방지를 생성시켰다(회색 곡선). 항-PD1 항체 단독 처리는 FRET 유도를 생성시키지 않았다(점선, 오직 좌측 도해).
도 9a: 이중특이성 1+1 PD1TIM3-0389는 양성 CD4+ T-세포(PD1+, TIM3+)에 대해 키메릭 TIM3_0028(chi0028) 및 인간화된 TIM3-0438(0438)과 동일한 결합비를 나타내지만, 단핵세포, NK 세포 및 CD3+ T-세포에는 보다 적은 결합을 나타낸다.
도 9b: 이중특이성 1+1 PD1TIM3-0389는 양성 CD4+ T-세포(PD1+, TIM3+)에의 결합에 대해 키메릭 TIM3_0028(chi0028) 및 인간화된 Tim3-0438(0438)보다 현저하게 증가된 MFI를 나타낸다.
도 9c: 이중특이성 1+1 PD1TIM3-0168은 양성 CD4+ T-세포(PD1+, TIM3+)에의 결합에 관하여 키메릭 TIM3_0018(Tim3-chi0018) 및 인간화된 TIM3-0434(0434)와 차이가 없다.
도 9d: 이중특이성 1+1 PD1TIM3-0168은 양성 CD4+ T-세포(PD1+, Tim3+)에의 결합에 대해 단지 약간의 증가된 MFI를 나타낸다.
도 9e 및 도 9f: 항-TIM3 항체 TIM3-0038은 단핵세포 및 CD4+ T-세포 모두에 대해 결합을 나타낸다.
도 9g 및 도 9h: 이중특이성 1+1 PD1TIM3-0166(키메릭 PD1-0103//Tim3-0038을 기본으로 한다)은 CD4+ T 세포에는 강한 결합을 유지하면서 단핵세포에 대해 강하게 감소된 결합을 나타낸다(모 항-TIM3 항체 TIM3_0038에 비해, 도 9e 및 9f 참조).
도 10a 내지 10d: 이중특이성 1+1 PD1TIM3-0166(키메릭 PD1-0103//TIM3-0038을 기본으로 한다)은 이중특이성 2+2 PD1TIM3-0321(또한 키메릭 PD1-0103//TIM3-0038을 기본으로 하나, PD에 대한 2개의 항원 결합 부위 및 TIM3에 대한 2개를 갖는다)에 비해서 및 활성화된 CD4+ T-세포 및 활성화된 NK 세포상의 모 TIM3-0038 항체에 비해서 감소된 내면화를 나타내었다.
도 11a: 시간에 따른 분석은 TIM3 항체의 세포내 클러스터링과 비교시 이중특이성 및 PD1 항체 모두에서 보다 높은 막 국소화를 나타낸다.
도면의 항체 표시들 TIM3(chi18-A647 = AlexaA647로 표지된 키메릭 TIM3_0018), a-TIM3(chi28-A647 = AlexaA647로 표지된 키메릭 TIM3_0028), Bispec(0168-A647 = AlexaA647로 표지된 1+1 PD1TIM3_0168(키메릭 PD1-0103/TIM3-0018을 기본으로 한다) Bispec(0389-A647= AlexaA647로 표지된 1+1 PD1TIM3_0389(키메릭 PD1-0103 / TIM3-0028을 기본으로 한다) 및 a-PD1(0165-A488 = AlexaA488로 표지된 키메릭 PD1-0103).
상기 항-PD1 및 이중특이성 1+1 PD1TIM3_0389(Bispec 0389)는 3h 후에조차 단지 매우 느린 내면화를 보이는 반면, 다른 이중특이성 1+1 PD1TIM3_0168(Bispec 0168)에 대한 내면화는 더 강하다. aTIM3 Ab 0028이 더 강한 내면화를 보이며, aTIM3-0018에 의해 가장 큰 내면화가 나타난다.
도 11b: 키메릭 PD1-0103(aPD1-0165)은 단지 불충분한 내면화를 보이는 반면, 고 친화성 키메릭 TIM3_0018(aTim3-chi18)은 15분 후에조차 TIM3-결합시 강하게 내면화된다. 저 친화성 결합제 키메릭 TIM3_0028(aTIM3-chi28)에 대한 내면화는 약간 감소된다. 이중특이성 1+1 AB 0168(고 친화성 결합제 aPD1-0165 및 고 친화성 aTIM3-0018로 구성됨)은 보다 감소된 내면화를 나타낸다. 이중특이성 1+1 AB 0389(고 친화성 결합제 키메릭 PD1-0103(aPD1-0165) 및 저 친화성 키메릭 TIM3_0028(aTIM3-0028)로 구성됨)는 매우 강하게 감소된 내면화를 나타낸다. 이는 PD1 및 TIM3에 대한 2가 결합에 기인할 수 있으며, 이때 PD1에 대한 고 친화성 결합은 상기 항체를 세포 표면에서 유지시킨다.
도 12a: 키메릭 PD1-0103(=PD1-0165) 및 키메릭 TIM3_0018(=TIM3-chi18) 및 이들의 조합과 비교된 PD1-TIM3 이중특이성 항체 1+1 PD1TIM3_0168(키메릭 PD1-0103/TIM3-0018(=AB 0168)을 기본으로 한다)의 효능.
도 12b: 키메릭 PD1-0103(=PD1-0165) 및 키메릭 TIM3_0028(=TIM3-chi28) 및 이들의 조합과 비교된 PD1-TIM3 이중특이성 항체 1+1 PD1TIM3_0389(키메릭 PD1-0103/TIM3-0028(=Bispec AB 0389)를 기본으로 한다)의 효능.
도 12c: 키메릭 PD1-0103(=PD1-0165) 및 항-TIM3_Ky8213(US2012/0189617(항체 8213 참조), 예를 들어 실시예 33으로부터) 및 이들의 조합과 비교된 PD1-TIM3 이중특이성 항체 1+1 PD1-0103/Ky8213(키메릭 PD1-0103/및 항-TIM3 Ky8213(US2012/0189617(항체 8213 참조), 예를 들어 실시예 33으로부터)(실시예 1에서 1+1 CrossMab와 유사하게 생성됨)을 기본으로 한다)의 효능.
도 12d: 키메릭 PD1-0103/TIM3-0028(=Bispec AB 0358(2+2)), 및 키메릭 PD1-0103(=PD1-0165) 및 키메릭 TIM3_0028(=TIM3-chi28) 및 이들의 조합을 기본으로 하는 PD1-TIM3 이중특이성 항체 2+2 PD1TIM3_0358과 비교된 PD1-TIM3 이중특이성 항체 1+1 PD1TIM3_0389(키메릭 PD1-0103/TIM3-0028(=Bispec AB 0389(1+1))를 기본으로 한다)의 효능.
도 13: PD1-TIM3 이중특이성 항체 1+1 PD1TIM3_0476에 의한 처리는 PD1 또는 TIM3 항체 단독 처리에 비해서 및 심지어 모 항체 PD1_0376 및 항체 TIM3_0438의 조합에 의한 처리에 비해서 IFN-감마를 방출시키는 CD4 T 세포의 능력을 현저하게 증가시켰다. CD4 T 세포를 MHCII-발현 종양 세포주와 공-배양하였다. PD1-Tim3 이중특이성 항체 1+1 PD1TIM3_0476을 PD1 항체 aPD1_0376, MDX-1106(니보루맵) 및 MK-3475(펨브로리주맵)에 대해서, TIM3 항체 aTIM3_0438 및 쿄와(Kyowa)-8213(WO 2011/155697에 개시된 바와 같다)에 대해서, 및 항-PD1 항체 aPD1-0376 및 항-TIM3 항체 aTIM3_0438의 조합에 대해서 시험하였다.
도 14a 및 14b: MKN45 세포로 공격되고 건강한 인간 공여자로부터의 PBMC가 제공된 면역 억제된 암컷 마우스(NOG)에서 PD1-TIM3 이중특이성 항체 1+1(0476)과 PD1 또는 TIM3 항체 단독을 비교하는 효능 실험의 결과를 도 14a 및 14b에 나타낸다. 플롯은 30일의 기간에 걸친 종양 크기 평균의 표준 오차를 포함한 종양 크기(처리 그룹내의)의 측정 평균을 나타낸다. 메워진 원을 갖는 곡선은 처리가 없는(비히클) 종양 크기 성장에 상응한다. 도 14a에서 보다 낮은 용량 처리에 의한 종양 성장을 나타내고(1.5 ㎎/㎏ 항체 PD1_0376, 1.5 ㎎/㎏ 니보루맵, 1.5 ㎎/㎏ 항체 TIM3_0438 또는 3 ㎎/㎏ 이중특이성 항체 1+1 PD1TIM3_0476), 도 14b에서 보다 높은 용량에서의 종양 성장을 나타낸다(5 ㎎/㎏ 항체 PD1_0376, 5 ㎎/㎏ 니보루맵, 5 ㎎/㎏ 항체 Tim3_0438 또는 10 ㎎/㎏ 이중특이성 항체 1+1 PD1TIM3_0476).
정의
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에 사용된 기술과학 용어들은 본 발명이 속하는 분야에 일반적으로 사용되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본 명세서를 해석하기 위해서, 하기의 정의들을 적용하며 적합한 경우에는 언제나 단수로 사용된 용어가 복수를 또한 포함할 것이며 이와 역도 마찬가지이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "항원 결합 분자"란 용어는 그의 가장 넓은 의미로, 항원 결정인자에 특이적으로 결합하는 분자를 지칭한다. 항원 결합 분자의 예는 항체, 항체 단편 및 스캐폴드 항원 결합 단백질이다.
본 명세서에서 "항체"란 용어는 가장 넓은 의미로 사용되며 다양한 항체 구조물들, 예를 들어 비제한적으로 단클론 항체, 다클론 항체, 단일특이성 및 다중특이성 항체(예를 들어 이중특이성 항체), 및 항체 단편(목적하는 항원-결합 활성을 나타내는 한)을 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 "단클론 항체"란 용어는 실질적으로 동종인 항체의 집단으로부터 수득되는 항체를 지칭한다, 즉 상기 집단을 포함하는 개별적인 항체가, 가능한 변형 항체, 예를 들어 천연 돌연변이를 함유하거나 또는 단클론 항체 제제의 생산 동안 발생하는 항체(상기와 같은 변체는 일반적으로 소량으로 존재한다)를 제외하고, 동일하고/하거나 동일한 에피토프에 결합한다. 전형적으로 상이한 결정인자(에피토프)에 대한 상이한 항체를 포함하는 다클론 항체 제제와 대조적으로, 단클론 항체 제제의 각각의 단클론 항체는 항원상의 단일의 결정인자에 대한 것이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 "단일특이성" 항체란 용어는 각각의 결합 부위가 동일한 항원의 동일한 에피토프에 결합하는 하나 이상의 상기 결합 부위를 갖는 항체를 나타낸다. "이중특이성"이란 용어는 항체가 적어도 2개의 별개의 항원 결정인자, 예를 들어 각각 상이한 항원 또는 동일한 항원상의 상이한 에피토프에 결합하는 항체 중쇄 가변 도메인(VH) 및 항체 경쇄 가변 도메인(VL)의 쌍에 의해 형성되는 2개의 결합 부위에 특이적으로 결합할 수 있음을 의미한다. 상기와 같은 이중특이성 항체는 1+1 포맷이다. 다른 이중특이성 항체 포맷은 2+1 포맷(제1 항원 또는 에피토프에 대한 2개의 결합 부위 및 제2 항원 또는 에피토프에 대한 하나의 결합 부위를 포함한다) 또는 2+2 포맷(제1 항원 또는 에피토프에 대한 2개의 결합 부위 및 제2 항원 또는 에피토프에 대한 2개의 결합 부위를 포함한다)이다. 전형적으로, 이중특이성 항체는 2개의 항원 결합 부위를 포함하며, 이들은 각각 상이한 항원 결정인자에 특이적이다.
본 출원내에 사용되는 바와 같은 "결합가"란 용어는 항원 결합 분자 중의 명시된 수의 결합 부위의 존재를 나타낸다. 이와 같이, "2가", "4가" 및 "6가"란 용어들은 항원 결합 분자 중에 각각 2개의 결합 부위, 4개의 결합 부위 및 6개의 결합 부위의 존재를 나타낸다. 본 발명에 따른 이중특이성 항체는 적어도 "2가"이며 "3가" 또는 "다가"(예를 들어 "4가" 또는 "6가")일 수 있다. 특정한 태양에서, 본 발명의 항체는 2개 이상의 결합 부위를 가지며 이중특이성이다. 즉, 상기 항체는 2개 초과의 결합 부위가 존재하는 경우에조차(즉 항체가 3가 또는 다가인 경우에조차) 이중특이성일 수 있다. 특히, 본 발명은 항체들이 특이적으로 결합하는 각각의 항원에 하나의 결합 부위를 갖는 이중특이성 2가 항체에 관한 것이다.
"완전 길이 항체", "완전 항체" 및 "전체 항체"란 용어들은 본 명세서에서 고유 항체 구조와 실질적으로 유사한 구조를 갖는 항체를 지칭하는데 호환적으로 사용된다. "고유 항체"는 다양한 구조를 갖는 천연 면역글로불린 분자를 지칭한다. 예를 들어 고유 IgG-부류 항체는 다이설파이드-결합되는 2개의 경쇄 및 2개의 중쇄로 구성된, 약 150,000 달톤의 이종사량체성 당단백질이다. N-에서부터 C-말단까지, 각각의 중쇄는 가변 영역(VH)(또한 가변 중쇄 도메인 또는 중쇄 가변 도메인이라 칭한다)에 이어서 3개의 불변 도메인(CH1, CH2 및 CH3)(또한 중쇄 불변 영역이라 칭한다)을 갖는다. 유사하게, N-에서부터 C-말단까지, 각각의 경쇄는 가변 영역(VL)(또한 가변 경쇄 도메인 또는 경쇄 가변 도메인이라 칭한다)에 이어서 경쇄 불변 도메인(CL)(또한 경쇄 불변 영역이라 칭한다)을 갖는다. 항체의 중쇄는 α(IgA), δ(IgD), ε(IgE), γ(IgG), 또는 μ(IgM)라 칭하는 5가지 유형 중 하나로 할당될 수 있으며, 이들 중 일부는 하위 유형, 예를 들어 γ1(IgG1), γ2(IgG2), γ3(IgG3), γ4(IgG4), α1(IgA1) 및 α2(IgA2)로 추가로 분류될 수 있다. 항체의 경쇄를 그의 불변 도메인의 아미노산 서열을 근거로, 카파(κ) 및 람다(λ)라 칭하는 2가지 유형 중 하나로 할당할 수 있다.
"항체 단편"은 완전 항체가 결합하는 항원에 결합하는 상기 완전 항체의 일부를 포함하는 상기 완전 항체 이외의 분자를 지칭한다. 항체 단편의 예는 비제한적으로 Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2; 다이아바디, 트라이아바디, 테트라바디, 크로스-Fab 단편; 선형 항체; 단쇄 항체 분자(예를 들어 scFv); 항체 단편으로부터 형성되는 다중특이성 항체 및 단일 도메인 항체를 포함한다. 몇몇 항체 단편의 리뷰를 위해서, 문헌[Hudson et al., Nat Med 9, 129-134 (2003)]을 참조하시오. scFv 단편의 리뷰를 위해서, 예를 들어 문헌[Pluckthun, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)]을 참조하시오; 또한 WO 93/16185; 및 미국특허 제 5,571,894 호 및 미국특허 제 5,587,458 호를 참조하시오. 구조 수용체 결합 에피토프 잔기를 포함하고 증가된 생체내 반감기를 갖는 Fab 및 F(ab')2 단편에 대한 논의에 대해서, 미국특허 제 5,869,046 호를 참조하시오. 다이아바디는 2가 또는 이중특이성일 수 있는 2개의 항원-결합 부위를 갖는 항체 단편이다. 예를 들어 EP 0 404 097; WO 1993/01161; 문헌[Hudson et al., Nat Med 9, 129-134 (2003)]; 및 문헌[Hollinger et al., Proc Natl Acad Sci USA 90, 6444-6448 (1993)]을 참조하시오. 트라이아바디 및 테트라바디가 또한 문헌[Hudson et al., Nat. Med. 9, 129-134(2003)]에 개시되어 있다. 단일-도메인 항체는 항체의 중쇄 가변 도메인의 일부 또는 전부 또는 경쇄 가변 도메인의 일부 또는 전부를 포함하는 항체 단편이다. 몇몇 실시태양에서, 단일-도메인 항체는 인간 단일-도메인 항체이다(문헌[Domantis, Inc., Waltham, MA]; 예를 들어 미국특허 제 6,248,516 B1 호를 참조하시오). 또한, 항체 단편은 기능성 항원 결합 부위에 대해, VH 도메인의 특징을 갖는, 즉 VL 도메인과 함께 조립될 수 있는, 또는 VL 도메인의 특징을 갖는, 즉 VH 도메인과 함께 조립될 수 있는, 이에 의해 완전길이 항체의 항원 결합 성질을 제공할 수 있는 단쇄 폴리펩타이드를 포함한다. 항체 단편을 본 발명에 개시된 바와 같은 다양한 기법들, 예를 들어 비제한적으로 완전 항체의 단백질분해 절단뿐만 아니라 재조합 숙주 세포(예를 들어 에스케리키아 콜라이 또는 파지)에 의한 생산에 의해 제조할 수 있다.
완전 항체의 파파인 절단은, 각각 중쇄 및 경쇄 가변 도메인 및 또한 상기 경쇄의 불변 도메인 및 상기 중쇄의 제1 불변 도메인(CH1)을 함유하는, "Fab" 단편이라 칭하는 2개의 동일한 항원-결합 단편을 생산한다. 따라서, 본 명세서에 사용되는 바와같이, "Fab 단편"이란 용어는 경쇄의 VL 도메인 및 불변 도메인(CL), 및 중쇄의 VH 도메인 및 제1 불변 도메인(CH1)을 포함하는 경쇄 단편을 포함하는 항체 단편을 지칭한다. Fab' 단편은 중쇄 CH1 도메인의 카복시 말단에 항체 힌지 영역으로부터의 하나 이상의 시스테인을 포함하는 소수의 잔기의 첨가에 의해 Fab 단편과 상이하다. Fab'-SH는 불변 도메인의 시스테인 잔기가 유리 티올기를 갖는 Fab' 단편이다. 펩신 처리는 2개의 항원-결합 부위(2개의 Fab 단편) 및 Fc 영역의 일부를 갖는 F(ab')2 단편을 제공한다.
"크로스-Fab 단편" 또는 "xFab 단편" 또는 "교차 Fab 단편"이란 용어는 중쇄 및 경쇄의 가변 영역 또는 불변 영역이 교환되는 Fab 단편을 지칭한다. 교차 Fab 분자의 2개의 상이한 쇄 조성이 가능하며 이는 본 발명의 이중특이성 항체에 포함된다: 한편으로, 상기 Fab 중쇄 및 경쇄의 가변 영역들이 교환된다, 즉 상기 교차 Fab 분자는 경쇄 가변 영역(VL) 및 중쇄 불변 영역(CH1)으로 구성된 펩타이드 쇄, 및 중쇄 가변 영역(VH) 및 경쇄 불변 영역(CL)으로 구성된 펩타이드 쇄를 포함한다. 상기 교차 Fab 분자를 또한 크로스Fab(VLVH)라 칭한다. 다른 한편으로, 상기 Fab 중쇄 및 경쇄의 불변 영역이 교환될 때, 상기 교차 Fab 분자는 중쇄 가변 영역(VH) 및 경쇄 불변 영역(CL)으로 구성된 펩타이드 쇄, 및 경쇄 가변 영역(VL) 및 중쇄 불변 영역(CH1)으로 구성된 펩타이드 쇄를 포함한다. 상기 교차 Fab 분자를 또한 크로스Fab(CLCH1)라 칭한다.
"단쇄 Fab 단편" 또는 "scFab"는 항체 중쇄 가변 도메인(VH), 항체 불변 도메인 1(CH1), 항체 경쇄 가변 도메인(VL), 항체 경쇄 불변 도메인(CL) 및 링커로 이루어지는 폴리펩타이드이며, 여기에서 상기 항체 도메인 및 상기 링커는 N-말단에서 C-말단 방향으로 하기의 순서 중 하나를 가지며: a) VH-CH1-링커-VL-CL, b) VL-CL-링커-VH-CH1, c) VH-CL-링커-VL-CH1 또는 d) VL-CH1-링커-VH-CL; 여기에서 상기 링커는 적어도 30 아미노산, 바람직하게는 32 내지 50 아미노산의 폴리펩타이드이다. 상기 단쇄 Fab 단편은 상기 CL 도메인과 CH1 도메인간의 천연 다이설파이드 결합을 통해 안정화된다. 또한, 이들 단쇄 Fab 분자는 시스테인 잔기들의 삽입(예를 들어 카밧 넘버링에 따른 상기 가변 중쇄 중의 44번 위치 및 상기 가변 경쇄 중의 100번 위치)을 통해 쇄간 다이설파이드 결합의 생성에 의해 추가로 안정화될 수도 있다.
"교차 단쇄 Fab 단편" 또는 "x-scFab"는 항체 중쇄 가변 도메인(VH), 항체 불변 도메인 1(CH1), 항체 경쇄 가변 도메인(VL), 항체 경쇄 불변 도메인(CL) 및 링커로 이루어지는 폴리펩타이드이며, 여기에서 상기 항체 도메인 및 상기 링커는 N-말단에서 C-말단 방향으로 하기의 순서 중 하나를 가지며: a) VH-CL-링커-VL-CH1, 및 b) VL-CH1-링커-VH-CL; 여기에서 VH 및 VL은 함께 항원에 특이적으로 결합하는 항원-결합 부위를 형성하고, 여기에서 상기 링커는 적어도 30 아미노산의 폴리펩타이드이다. 또한, 이들 x-scFab 분자는 시스테인 잔기들의 삽입(예를 들어 카밧 넘버링에 따른 상기 가변 중쇄 중의 44번 위치 및 상기 가변 경쇄 중의 100번 위치)을 통해 쇄간 다이설파이드 결합의 생성에 의해 추가로 안정화될 수도 있다.
"단쇄 가변 단편(scFv)"은 10 내지 약 25 아미노산의 짧은 링커 펩타이드와 연결된, 항체의 중(VH) 및 경쇄(VL)의 가변 영역의 융합 단백질이다. 상기 링커는 대개 가요성을 위해 글리신이 풍부할 뿐만 아니라, 용해도를 위해서 세린 또는 쓰레오닌이 풍부하며, 상기 VH의 N-말단을 상기 VL의 C-말단과 연결시키거나, 또는 이와 역으로 연결시킬 수 있다. 상기 단백질은 불변 영역의 제거 및 링커의 도입에도 불구하고, 원래 항체의 특이성을 유지한다. scFv 항체는 예를 들어 문헌[Houston, J.S., Methods in Enzymol. 203 (1991) 46-96]에 기재되어 있다. 또한, 항체 단편은 기능성 항원 결합 부위에 대해, VH 도메인의 특징을 갖는, 즉 VL 도메인과 함께 조립될 수 있는, 또는 VL 도메인의 특징을 갖는, 즉 VH 도메인과 함께 조립될 수 있는, 이에 의해 완전길이 항체의 항원 결합 성질을 제공할 수 있는 단쇄 폴리펩타이드를 포함한다.
"스캐폴드 항원 결합 단백질"은 당해 분야에 공지되어 있으며, 예를 들어 피브로넥틴 및 설계된 안키린 반복 단백질(DARPin)이 항원-결합 도메인에 대한 대체 스캐폴드로서 사용되었다, 예를 들어 문헌[Gebauer and Skerra, Engineered protein scaffolds as next-generation antibody therapeutics. Curr Opin Chem Biol 13:245-255 (2009)] 및 문헌[Stumpp et al., Darpins: A new generation of protein therapeutics. Drug Discovery Today 13: 695-701 (2008)]을 참조하시오. 본 발명의 하나의 태양에서, 스캐폴드 항원 결합 단백질은 CTLA-4(에비바디(Evibody)), 리포칼린(안티칼린(Anticalin)), 단백질 A-유래된 분자, 예를 들어 단백질 A의 Z-도메인(애피바디(Affibody)), A-도메인(애비머(Avimer)/맥시바디(Maxibody)), 혈청 트랜스페린(트랜스-바디); 설계된 안키린 반복 단백질(DARPin), 항체 경쇄 또는 중쇄의 가변 도메인(단일-도메인 항체, sdAb), 항체 중쇄의 가변 도메인(나노바디, VH), VNAR 단편, 피브로넥틴(애드넥틴(AdNectin)), C-유형 렉틴 도메인(테트라넥틴(Tetranectin)); 신규의 항원 수용체 베타-락타마제의 가변 도메인(VNAR 단편), 인간 감마-크리스탈린 또는 유비퀴틴(애필린(Affilin) 분자); 인간 프로테아제 억제제의 쿠니츠 유형 도메인, 마이크로바디, 예를 들어 크노틴과로부터의 단백질, 펩타이드 앱타머 및 피브로넥틴(애드넥틴)으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다.
CTLA-4(세포독성 T 림프구-관련 항원 4)는 주로 CD4+ T-세포상에서 발현되는 CD28-과 수용체이다. 그의 세포외 도메인은 가변 도메인-유사 Ig 폴드를 갖는다. 항체의 CDR에 상응하는 고리를 이종 서열로 치환시켜 상이한 결합 성질을 부여할 수 있다. 상이한 결합 특이성을 갖도록 조작된 CTLA-4 분자는 또한 에비바디로서 공지되어 있다(예를 들어 US7,166,697B1). 에비바디는 항체(예를 들어 도메인 항체)의 단리된 가변 영역과 대략 동일한 크기이다. 더욱 상세한 내용에 대해서 문헌[Journal of Immunological Methods 248 (1-2), 31-45 (2001)]을 참조하시오. 리포칼린은 작은 소수성 분자, 예를 들어 스테로이드, 빌린, 레티노이드 및 지질을 수송하는 세포외 단백질의 한 과이다. 상기는 상이한 표적 항원에 결합하도록 조작될 수 있는 원추형 구조의 개방 단부에 다수의 고리를 갖는 강성의 베타-시트 2차 구조를 갖는다. 안티칼린은 160 내지 180 아미노산 크기이며 리포칼린으로부터 유래된다. 추가의 상세한 내용에 대해서 문헌[Biochim Biophys Acta 1482: 337-350 (2000)], US7,250,297B1 및 US2007/0224633을 참조하시오. 애피바디는 항원에 결합하도록 조작될 수 있는 스타필로코커스 아우레우스의 단백질 A로부터 유래된 스캐폴드이다. 상기 도메인은 대략 58 아미노산의 3-나선 다발로 이루어진다. 표면 잔기의 무작위화에 의해 라이브러리가 생성되었다. 추가의 상세한 내용에 대해서 문헌[Protein Eng. Des. Sel. 2004, 17, 455-462] 및 EP 1641818A1을 참조하시오. 애비머는 A-도메인 스캐폴드 과로부터 유래된 다중도메인 단백질이다. 대략 35 아미노산의 고유 도메인은 한정된 다이설파이드 결합된 구조를 채용한다. A-도메인 과에 의해 나타난 자연 변화의 셔플링에 의해 다양성이 생성된다. 추가의 상세한 내용에 대해서 문헌[Nature Biotechnology 23(12), 1556 - 1561 (2005)] 및 문헌[Expert Opinion on Investigational Drugs 16(6), 909-917 (June 2007)]을 참조하시오. 트랜스페린은 단량체성 혈청 수송 당단백질이다. 트랜스페린을 허용성 표면 고리 중의 펩타이드 서열의 삽입에 의해 상이한 표적 항원에 결합하도록 조작할 수 있다. 조작된 트랜스페린 스캐폴드의 예는 트랜스-바디를 포함한다. 추가의 상세한 내용에 대해서 문헌[J. Biol. Chem 274, 24066-24073 (1999)]을 참조하시오. 설계된 안키린 반복 단백질(DARPin)은 내재 막 단백질의 세포골격에의 부착을 매개하는 단백질의 한 과인 안키린으로부터 유래된다. 단일 안키린 반복부는 2개의 알파-나선 및 베타-회전으로 이루어지는 33 잔기 동기이다. 상기를 각 반복부의 제1 알파-나선 및 베타-회전 중의 잔기들을 무작위화함으로써 상이한 표적 항원에 결합하도록 조작할 수 있다. 이들의 결합 접촉면은 모듈의 수를 증가시킴으로써 증가될 수 있다(친화성 성숙화 방법). 추가의 상세한 내용에 대해서 문헌[J. Mol. Biol. 332, 489-503 (2003), PNAS 100(4), 1700-1705 (2003)] 및 문헌[J. Mol. Biol. 369, 1015-1028 (2007)] 및 US2004/0132028A1을 참조하시오.
단일-도메인 항체는 단일 단량체성 가변 항체 도메인으로 이루어지는 항체 단편이다. 제1 단일 도메인은 카멜리드로부터의 항체 중쇄의 가변 도메인으로부터 유래되었다(나노바디 또는 VHH 단편). 더욱 또한, 단일-도메인 항체란 용어는 자율적인 인간 중쇄 가변 도메인(aVH) 또는 상어로부터 유래된 VNAR 단편을 포함한다. 피브로넥틴은 항원에 결합하도록 조작될 수 있는 스캐폴드이다. 애드넥틴은 인간 피브로넥틴 유형 III(FN3)의 15 반복 단위의 10번째 도메인의 천연 아미노산 서열의 주쇄로 이루어진다. .베타.-샌드위치의 한 쪽 단부의 3개 고리를 애드넥틴이 관심 치료 표적을 특이적으로 인식할 수 있도록 조작할 수 있다. 추가의 상세한 내용에 대해서 문헌[Protein Eng. Des. Sel. 18, 435- 444 (2005), US2008/0139791], WO2005/056764 및 US6,818,418B1을 참조하시오. 펩타이드 앱타머는 활성 부위에 삽입된 한정된 가변 펩타이드 고리를 함유하는 불변 스캐폴드 단백질, 전형적으로 티오레독신(TrxA)으로 이루어지는 조합적 인식 분자이다. 추가의 상세한 내용에 대해서 문헌[Expert Opin. Biol. Ther. 5, 783-797 (2005)]을 참조하시오. 마이크로바디는 3 내지 4 시스테인 가교를 함유하는 25 내지 50 아미노산 길이의 천연 미세단백질로부터 유래되며 - 미세단백질의 예는 KalataBI 및 코노톡신 및 크노틴을 포함한다. 상기 미세단백질은 상기 미세단백질의 전체적인 폴드에 영향을 미치지 않으면서 25 이하의 아미노산을 포함하도록 조작될 수 있는 고리를 갖는다. 조작된 크노틴 도메인에 대한 추가의 상세한 내용에 대해서, WO2008/098796을 참조하시오.
참조 분자로서 "동일한 에피토프에 결합하는 항원 결합 분자"는 경쟁 분석에서 그의 항원에 대한 상기 참조 분자의 결합을 50% 이상까지 차단하는 항원 결합 분자를 지칭한다, 환언하면 상기 참조 분자는 경쟁 분석에서 그의 항원에 대한 상기 항원 결합 분자의 결합을 50% 이상까지 차단한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "항원-결합 부위"란 용어는 항원 결정인자에 특이적으로 결합하는 항원 결합 분자의 부분을 지칭한다. 보다 특히, "항원-결합 부위"란 용어는 항원의 일부 또는 전부에 특이적으로 결합하고 상기에 상보성인 영역을 포함하는 항체의 부분을 지칭한다. 항원이 큰 경우, 항원 결합 분자는 단지 상기 항원의 특정 부분에만 결합할 수 있으며, 상기 부분을 에피토프라 칭한다. 항원-결합 부위는 예를 들어 하나 이상의 가변 도메인(또한 가변 영역이라 칭한다)에 의해 제공될 수 있다. 바람직하게, 항원-결합 부위는 항체 경쇄 가변 영역(VL) 및 항체 중쇄 가변 영역(VH)을 포함한다. 하나의 태양에서, 상기 항원-결합 부위는 그의 항원에 결합할 수 있고 그의 기능을 차단하거나 부분적으로 차단할 수 있다. PD1 또는 TIM-3에 특이적으로 결합하는 항원-결합 부위는 본 명세서에 추가로 정의된 바와 같은 항체 및 그의 단편을 포함한다. 또한, 항원-결합 부위는 스캐폴드 항원 결합 단백질, 예를 들어 설계된 반복 단백질 또는 설계된 반복 도메인을 기본으로 하는 결합 도메인을 포함할 수 있다(예를 들어 WO 2002/020565를 참조하시오).
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "항원 결정인자"란 용어는 "항원" 및 "에피토프"와 유의어이며, 항원 결합 부분이 결합하여, 항원 결합 부분-항원 복합체를 형성하는 폴리펩타이드 거대분자상의 부위(예를 들어 아미노산의 연속적인 신장부 또는 비-연속적인 아미노산의 상이한 영역들로 구성된 입체형태적 배열)를 지칭한다. 유용한 항원 결정인자는 예를 들어 종양 세포의 표면상에서, 바이러스-감염된 세포의 표면상에서, 다른 병든 세포의 표면상에서, 면역 세포의 표면상에서, 혈청 및/또는 세포외 기질(ECM) 중에서 자유롭게 발견될 수 있다. 본 명세서에서 항원으로서 유용한 단백질은 달리 표시되지 않는 한, 임의의 척추동물 공급원, 예를 들어 포유동물, 예를 들어 영장류(예를 들어 인간) 및 설치류(예를 들어 마우스 및 래트)로부터의 임의의 고유 형태의 단백질일 수 있다. 특정한 실시태양에서 상기 항원은 인간 단백질이다. 본 명세서에서 특정한 단백질을 참조하는 경우, 상기 용어는 "완전길이"의 가공되지 않은 단백질뿐만 아니라, 세포 중에서의 가공으로부터 생성되는 임의의 형태의 단백질을 포함한다. 상기 용어는 또한 상기 단백질의 천연 변체, 예를 들어 이어맞추기 변체 또는 대립유전자 변체를 포함한다.
"특이적 결합"은 상기 결합이 항원에 대해 선택성이며 불필요하거나 비-특이적인 상호작용과 구별될 수 있음을 의미한다. 특정한 항원에 결합하는 항원 결합 분자의 능력은 효소-결합된 면역흡수 분석(ELISA) 또는 당해 분야의 숙련가에게 친숙한 다른 기법, 예를 들어 표면 플라스몬 공명(SPR) 기법(BIAcore 장비상에서 분석된다)(문헌[Liljeblad et al., Glyco J 17, 323-329 (2000)]), 및 전통적인 결합 분석(문헌[Heeley, Endocr Res 28, 217-229 (2002)])을 통해 측정될 수 있다. 하나의 실시태양에서, 관련되지 않은 단백질에 대한 항원 결합 분자의 결합 정도는 예를 들어 SPR에 의해 측정되는 바와 같이 항원에 대한 항원 결합 분자의 결합의 약 10% 미만이다. 몇몇 실시태양에서, 상기 항원에 결합하는 분자는 ≤1 μM, ≤100 nM, ≤10 nM, ≤1 nM, ≤0.1 nM, ≤0.01 nM, 또는 ≤0.001 nM(예를 들어 10-7 M 이하, 예를 들어 10-7 M 내지 10-13 M, 예를 들어 10-9 M 내지 10-13 M)의 해리 상수(Kd)를 갖는다.
"친화성" 또는 "결합 친화성"은 분자(예를 들어 항체)의 단일 결합 부위와 그의 결합 짝(예를 들어 항원)간의 비-공유 상호작용의 총 합의 강도를 지칭한다. 달리 표시되지 않는 한, 본 명세서에 사용되는 바와 같이, "결합 친화성"은 결합 쌍의 구성원들(예를 들어 항체와 항원)간의 1:1 상호작용을 반영하는 본래의 결합 친화성을 지칭한다. 분자 X의 그의 짝 Y에 대한 친화성을 일반적으로 해리 상수(Kd)에 의해 나타낼 수 있으며, 상기 상수는 해리 및 결합속도 상수(각각 koff 및 kon)의 비이다. 따라서, 균등한 친화성은 상기 속도 상수들의 비가 동일하게 남아있는 한 상이한 속도 상수를 포함할 수도 있다. 친화성을 본 명세서에 기재된 것들을 포함하여 당해 분야에 공지된 통상적인 방법에 의해 측정할 수 있다. 친화성의 특정한 측정 방법은 표면 플라스몬 공명(SPR)이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 항체의 "높은 친화성"이란 용어는 표적 항원에 대해 10-9 M 이하 및 훨씬 더 특히 10-10 M 이하의 Kd를 갖는 항체를 지칭한다. 항체의 "낮은 친화성"이란 용어는 10-8 이상의 Kd를 갖는 항체를 지칭한다.
"친화성 성숙된" 항체는 하나 이상의 고가변 영역(HVR) 중에 하나 이상의 변경을 갖지 않는 모 항체에 비해, 상기 변경을 갖는 항체를 지칭하며, 상기와 같은 변경은 항원에 대한 항체의 친화성을 개선시킨다.
"PD1에 특이적으로 결합하는 제1 항원-결합 부위 및 TIM-3에 특이적으로 결합하는 제2 항원-결합 부위를 포함하는 이중특이성 항체", "PD1 및 TIM-3와 특이적으로 결합하는 이중특이성 항체", "PD1 및 TIM-3에 특이적인 이중특이성 항원 결합 분자"란 용어는 본 명세서에서 호환적으로 사용되며 상기 항체가 PD1 및 TIM-3을 표적화함에 있어서 진단 및/또는 치료제로서 유용하기에 충분한 친화성으로 PD1 및 TIM-3와 결합할 수 있는 이중특이성 항체를 지칭한다.
"PD1"(또한 예정세포사 단백질 1으로서 공지됨)이란 용어는 1992년에 처음으로 기재된 288 아미노산의 I형 막 단백질이다(문헌[Ishida et al., EMBO J., 11 (1992), 3887-3895]). PD-1은 T 세포 조절인자의 연장된 CD28/CTLA-4 과의 구성원이며 2개의 리간드 PD-L1 (B7-H1, CD274) 및 PD-L2 (B7-DC, CD273)을 갖는다. 상기 단백질의 구조는 세포외 IgV 도메인에 이어서 막관통 영역 및 세포내 꼬리를 포함한다. 상기 세포내 꼬리는 면역수용체 타이로신-기재 억제 동기 및 면역수용체 타이로신-기재 전환 동기 중에 위치한 2개의 인산화 부위를 함유하며, 이는 PD-1이 TCR 신호를 음으로 조절함을 암시한다. 이는 리간드 결합시 PD-1의 세포질 꼬리에의 SHP-1 및 SHP-2 포스파타제의 결합과 일치한다. PD-1은 미경험 T 세포상에서 발현되지 않는 반면, T 세포 수용체(TCR)-매개된 활성화에 이어서 상향조절되며 활성화된 및 기능소실된 T 세포 모두상에서 관찰된다(문헌[Agata et al., Int. Immunology 8 (1996), 765-772]). 이들 기능소실된 T-세포는 기능이상 표현형을 가지며 적합하게 응답할 수 없다. PD-1은 비교적 광범위한 발현 패턴을 갖지만 그의 가장 중요한 역할은 T 세포상에서의 보조억제성 수용체로서인 듯하다(문헌[Chinai et al, Trends in Pharmacological Sciences 36 (2015), 587-595]). 따라서 현행 치료학적 접근법은 PD-1과 그의 리간드와의 상호작용을 차단하여 T 세포 응답을 증대시키는 것에 초점을 둔다. "예정사 1", "예정세포사 1", "단백질 PD-1", "PD-1", "PD1", "PDCD1", "hPD-1" 및 "hPD-I"란 용어들은 호환적으로 사용될 수 있으며, 인간 PD-1의 변체, 동형, 종 동족체, 및 PD-1과 적어도 하나의 공통 에피토프를 갖는 유사체를 포함한다. 인간 PD1의 아미노산 서열은 유니프롯(UniProt)(www.uniprot.org) 수납 번호 Q15116(서열번호 89)에 나타나있다.
"항-PD1 항체" 및 "PD1에 결합하는 항원-결합 부위를 포함하는 항체"란 용어는 상기 항체가 PD1의 표적화에서 진단 및/또는 치료제로서 유용하기에 충분한 친화성으로, 세포 표면상에서 발현된 PD1, 특히 PD1 폴리펩타이드와 결합할 수 있는 항체를 지칭한다. 하나의 실시태양에서, 관련되지 않은, 비-PD1 단백질에의 항-PD1 항체의 결합 정도는 예를 들어 방사성면역분석(RIA) 또는 유식 세포측정(FACS)에 의해 또는 Biacore(등록상표) 시스템과 같은 바이오센서 시스템을 사용하는 표면 플라스몬 공명 분석에 의해 측정되는 바와 같이 PD1에의 상기 항체의 결합의 약 10% 미만이다. 몇몇 실시태양에서, 인간 PD1에 결합하는 항원 결합 단백질은 ≤1 μM, ≤100 nM, ≤10 nM, ≤1 nM, ≤0.1 nM, ≤0.01 nM, 또는 ≤0.001 nM(예를 들어 10-8 M 이하, 예를 들어 10-8 M 내지 10-13 M, 예를 들어 10-9 M 내지 10-13 M)의 인간 PD1에의 결합에 대한 결합 친화성의 KD 값을 갖는다. 하나의 바람직한 실시태양에서, 상기 결합 친화성의 각 KD 값을 상기 PD1 결합 친화성에 대한 인간 PD1의 세포외 도메인(ECD)(PD1-ECD)을 사용하여 표면 플라스몬 공명 분석에서 측정한다. "항-PD1 항체"란 용어는 또한 PD1 및 제2 항원에 결합할 수 있는 이중특이성 항체를 포함한다.
"TIM3"("T 세포 면역글로불린- 및 뮤신 도메인-함유 분자 3"에 대한 약어, 또한 TIM-3, HAVCR2, KIM-3, TIMD3, 및 FLJ14428로서 공지됨)이란 용어는 대식세포 활성화 및 염증 상태의 중증도를 조절하는 T 헬퍼 세포 1형-특이성 세포 표면 단백질을 지칭한다. TIM3은 또한 암, 특히 암 줄기세포와 관련된다. TIM3의 뉴클레오타이드 및 단백질 서열은 다수의 종들에 대해 공지되어 있다. 예를 들어, 인간 아미노산 서열은 유니프롯 수납 번호 Q8TDQ0(서열번호 93)하에서 찾을 수 있다. 상기 인간 단백질은 대략 아미노산 22-202를 포함하는 Ig 유사 도메인 및 뮤신 도메인(O-결합된 및 N-결합된 글리코실화 부위를 추가로 포함한다)을 포함하는 세포외 도메인, 막관통 도메인(아미노산 203-223), 및 세포내(세포질) 도메인(아미노산 224-301)을 특징으로 한다. 서열번호 93에 나타낸 바와 같은 인간 TIM3 단백질에 대해서, 상기 세포외 도메인은 대략 아미노산 22-202를 포함하고, 상기 막관통 도메인은 대략 아미노산 203-223을 포함하고, 상기 세포질 도메인은 대략 아미노산 224-301을 포함한다. 상기 "TIM3"란 용어는 인간 TIM3의 변체, 동형, 종 동족체, 및 TIM3과 적어도 하나의 공통 에피토프를 갖는 유사체를 포함한다.
"항-TIM3 항체" 및 "TIM3에 결합하는 항원-결합 부위를 포함하는 항체"란 용어는 상기 항체가 TIM3의 표적화에서 진단 및/또는 치료제로서 유용하기에 충분한 친화성으로, 세포 표면상에서 발현된 TIM3, 특히 TIM3 폴리펩타이드와 결합할 수 있는 항체를 지칭한다. 하나의 실시태양에서, 관련되지 않은, 비-TIM3 단백질에의 항-TIM3 항체의 결합 정도는 예를 들어 방사성면역분석(RIA) 또는 유식 세포측정(FACS)에 의해 또는 Biacore(등록상표) 시스템과 같은 바이오센서 시스템을 사용하는 표면 플라스몬 공명 분석에 의해 측정되는 바와 같이 TIM3에의 상기 항체의 결합의 약 10% 미만이다. 몇몇 실시태양에서, 인간 TIM3에 결합하는 항원 결합 단백질은 ≤1 μM, ≤100 nM, ≤10 nM, ≤1 nM, ≤0.1 nM, ≤0.01 nM, 또는 ≤0.001 nM(예를 들어 10-8 M 이하, 예를 들어 10-7 M 내지 10-13 M, 예를 들어 10-9 M 내지 10-13 M)의 인간 TIM3에의 결합에 대한 결합 친화성의 KD 값을 갖는다. 하나의 바람직한 실시태양에서, 상기 결합 친화성의 각 KD 값을 상기 TIM3 결합 친화성에 대한 인간 TIM3의 세포외 도메인(ECD)(TIM3-ECD)을 사용하여 표면 플라스몬 공명 분석에서 측정한다. "항-TIM3 항체"란 용어는 또한 TIM3 및 제2 항원에 결합할 수 있는 이중특이성 항체를 포함한다.
"차단" 항체 또는 "길항물질" 항체는 상기 항체가 결합하는 항원의 생물학적 활성을 억제하거나 감소시키는 것이다. 일부 실시태양에서, 차단 항체 또는 길항물질 항체는 상기 항원의 생물학적 활성을 실질적으로 또는 완전히 억제한다. 예를 들어, 본 발명의 이중특이성 항체는 기능이상 상태에서부터 항원 자극까지 T 세포에 의한 기능성 응답(예를 들어 증식, 사이토킨 생성, 표적 세포 살해)을 복원시키기 위해 PD-1 및 TIM-3을 통한 신호전달을 차단한다.
"가변 영역" 또는 "가변 도메인"이란 용어는 항원에 대한 항원 결합 분자의 결합에 관련된 항체 중쇄 또는 경쇄의 도메인을 지칭한다. 고유 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인(각각 VH 및 VL)은 일반적으로 유사한 구조들을 가지며, 이때 각 도메인은 4개의 보존된 프레임워크 영역(FR) 및 3개의 고가변 영역(HVR)을 포함한다. 예를 들어 문헌[Kindt et al. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., page 91(2007)]을 참조하시오. 단일의 VH 또는 VL 도메인이면 항원-결합 특이성을 부여하기에 충분할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 "고가변 영역" 또는 "HVR"이란 용어는 서열이 고가변성이고/이거나 구조적으로 한정된 고리("고가변 고리")를 형성하는 항체 가변 도메인의 각 영역들을 지칭한다. 일반적으로, 고유의 4-쇄 항체는 6개의 HVR; VH 중 3개(H1, H2, H3) 및 VL 중 3개(L1, L2, L3)를 포함한다. HVR은 일반적으로 상기 고가변 고리로부터 및/또는 "상보성 결정 영역"(CDR)으로부터의 아미노산 잔기를 포함하며, 후자는 최고의 서열 가변성을 갖고/갖거나 항원 인식에 관련된다. 예시적인 고가변 고리는 아미노산 잔기 26-32 (L1), 50-52 (L2), 91-96 (L3), 26-32 (H1), 53-55 (H2), 및 96-101 (H3)에 존재한다. (문헌[Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)].) 예시적인 CDR (CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3, CDR-H1, CDR-H2, 및 CDR-H3)은 L1의 24-34, L2의 50-56, L3의 89-97, H1의 31-35B, H2의 50-65, 및 H3의 95-102의 아미노산 잔기들에 존재한다. (문헌[Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)].) 고가변 영역(HVR)은 또한 상보성 결정 영역(CDR)을 지칭하며, 이들 용어는 상기 항원 결합 영역을 형성하는 가변 영역의 부분들을 참조하여 본 명세서에서 호환적으로 사용된다. 상기 특정한 영역은 문헌[Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequences of Proteins of Immunological Interest" (1983)] 및 문헌[Chothia et al., J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)]에 기재되었으며, 여기에서 정의들은 서로에 대해 비교될 때 아미노산 잔기의 중복 또는 부분집합들을 포함한다. 그럼에도 불구하고, 항체 또는 그의 변체의 CDR을 지칭하기 위한 어느 한 정의의 적용은 본 명세서에서 정의되고 사용되는 용어의 범위내에 있도록 되어있다. 상기 인용된 각각의 참고문헌들에 의해 정의되는 바와 같은 CDR을 포함하는 적합한 아미노산 잔기를 비교로서 하기 표 A에 제시한다. 특정한 CDR을 포함하는 정확한 잔기 숫자는 상기 CDR의 서열 및 크기에 따라 변할 것이다. 당해 분야의 숙련가들은 어느 잔기가 상기 항체의 가변 영역 아미노산 서열을 제공한 특정한 CDR을 포함하는지를 통상적으로 결정할 수 있다.
[표 A]
Figure pat00001
카밧 등은 또한 임의의 항체에 적용할 수 있는 가변 영역 서열에 대한 넘버링 시스템을 한정한다. 당해 분야의 통상적인 숙련가는 상기 "카밧 넘버링" 시스템을 상기 서열 자체에서 벗어난 임의의 실험 데이터에 의존하지 않으면서 임의의 가변 영역 서열에 명확하게 할당할 수 있다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, "카밧 넘버링"은 문헌[Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequence of Proteins of Immunological Interest" (1983)]에 제시된 넘버링 시스템을 지칭한다. 달리 명시되지 않는 한, 항체 가변 영역 중의 특정한 아미노산 잔기 위치의 넘버링에 대한 참조는 상기 카밧 넘버링 시스템에 따른다.
VH 중의 CDR1을 제외하고, CDR은 일반적으로 고가변 고리를 형성하는 아미노산 잔기를 포함한다. CDR은 또한 항원과 접촉하는 잔기들인 "특이성 결정 잔기" 또는 "SDR"을 포함한다. SDR은 약기된 CDR, 또는 a-CDR이라 칭하는 CDR들의 영역내에 함유된다. 예시적인 a-CDRs(a-CDR-L1, a-CDR-L2, a-CDR-L3, a-CDR-H1, a-CDR-H2, 및 a-CDR-H3)은 L1의 31-34, L2의 50-55, L3의 89-96, H1의 31-35B, H2의 50-58, 및 H3의 95-102 아미노산 잔기에 존재한다. (문헌[Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)]을 참조하시오.) 달리 표시하지 않는 한, 가변 도메인 중의 HVR 잔기 및 다른 잔기(예를 들어 FR 잔기)를 본 발명에서 상기 카밧 등에 따라 넘버링한다.
"프레임워크" 또는 "FR"은 고가변 영역(HVR) 잔기 이외의 가변 도메인 잔기를 지칭한다. 가변 도메인의 FR은 일반적으로 4개의 FR 도메인, 즉 FR1, FR2, FR3 및 FR4로 이루어진다. 상응하게, 상기 HVR 및 FR 서열은 일반적으로 VH(또는 VL)에서 하기의 순서로 존재한다: FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.
본 명세서의 목적을 위한 "수용체 인간 프레임워크"는 하기에 정의되는 바와 같은, 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 공통 프레임워크로부터 유래된 경쇄 가변 도메인(VL) 프레임워크 또는 중쇄 가변 도메인(VH) 프레임워크의 아미노산 서열을 포함하는 프레임워크이다. 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 공통 프레임워크"로 부터 유래된" 수용체 인간 프레임워크는 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있거나, 또는 아미노산 서열 변화를 함유할 수 있다. 일부 실시태양에서, 상기 아미노산 변화의 수는 10 이하, 9 이하, 8 이하, 7 이하, 6 이하, 5 이하, 4 이하, 3 이하, 또는 2 이하이다. 일부 실시태양에서, 상기 VL 수용체 인간 프레임워크는 상기 VL 인간 면역글로불린 프레임워크 서열 또는 인간 공통 프레임워크 서열과 서일이 일치한다.
"키메릭" 항체란 용어는 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정 출처 또는 종으로부터 유래하는 반면 상기 중쇄 및/또는 경쇄의 나머지는 상이한 출처 또는 종으로부터 유래하는 항체를 지칭한다.
항체의 "부류"는 상기 항체의 중쇄가 갖는 불변 도메인 또는 불변 영역의 유형을 지칭한다. 항체의 5개의 주요 부류, 즉 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM이 존재하며, 이들 중 다수는 하위부류(아이소타입)들, 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2로 추가로 세분될 수 있다. 면역글로불린의 상이한 부류들에 상응하는 중쇄 불변 도메인을 각각 α, δ, ε, γ 및 μ라 칭한다.
"인간화된" 항체는 비-인간 HVR로부터의 아미노산 잔기 및 인간 FR로부터의 아미노산 잔기를 포함하는 키메릭 항체를 지칭한다. 몇몇 실시태양에서, 인간화된 항체는 적어도 하나, 및 전형적으로는 2개의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함할 것이며, 여기에서 상기 HVR(예를 들어 CDR)의 모두 또는 실질적으로 모두는 비-인간 항체의 것들에 상응하며, 상기 FR의 모두 또는 실질적으로 모두는 인간 항체의 것들에 상응한다. 인간화된 항체는 임의로 인간 항체로부터 유래된 항체 불변 영역의 적어도 일부를 포함할 수 있다. 항체, 예를 들어 비-인간 항체의 "인간화된 형태"는 인간화를 겪은 항체를 지칭한다. 본 발명에 의해 포함되는 "인간화된 항체"의 다른 형태는 불변 영역이 원래 항체의 경우로부터 추가로 변형되거나 또는 변화되어, 특히 Clq 결합 및/또는 Fc 수용체(FcR) 결합에 관하여 본 발명에 따른 성질을 생성시키는 것들이다.
"인간" 항체는 인간 또는 인간 세포에 의해 생산되거나 또는 인간 항체 레퍼토리 또는 다른 인간 항체-암호화 서열을 사용하는 비-인간 공급원으로부터 유래된 항체의 아미노산 서열에 상응하는 아미노산 서열을 갖는 것이다. 인간 항체의 이러한 정의는 비-인간 항원-결합 잔기를 포함하는 인간화된 항체를 특별히 제외시킨다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 "단클론 항체"란 용어는 실질적으로 동종인 항체들의 집단으로부터 획득되는 항체를 지칭한다, 즉 상기 집단을 포함하는 개별적인 항체들은 동일하고/하거나, 상기 단클론 항체의 생산 중 발생할 수 있는 가능한 변체(상기와 같은 변체는 일반적으로 소량으로 존재한다)를 제외하고 동일한 에피토프에 결합한다. 전형적으로 상이한 결정인자(에피토프)에 대한 상이한 항체를 포함하는 다클론 항체 제제와 대조적으로, 단클론 항체 제제의 각각의 단클론 항체는 상기 항원상의 단일 결정인자에 대한 것이다. 따라서, "단클론"이라는 수식어구는 실질적으로 동종인 항체 집단으로부터 획득된다는 항체의 특징을 가리키며, 임의의 특정한 방법에 의한 상기 항체의 생산을 요구하는 것으로서 해석해서는 안 된다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용되는 단클론 항체를 다양한 기법들, 예를 들어 비제한적으로 하이브리도마 방법, 재조합 DNA 방법, 파지-디스플레이 방법, 및 상기 인간 면역글로불린 유전자좌의 전부 또는 부분을 함유하는 트랜스제닉 동물을 사용하는 방법에 의해 제조할 수 있으며, 상기와 같은 방법 및 단클론 항체의 다른 예시적인 제조 방법들은 본 발명에 개시되어 있다.
본 명세서에서 "Fc 도메인" 또는 "Fc-영역"이란 용어는 불변 영역의 적어도 일부를 함유하는 항체 중쇄의 C-말단 영역을 한정하는데 사용된다. 상기 용어는 고유 서열 Fc 영역 및 변형 Fc 영역을 포함한다. 특히, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 Cys226 또는 Pro230으로부터 상기 중쇄의 카복시-말단까지 연장된다. 그러나, 상기 Fc 영역의 C-말단 리신(Lys447)은 존재할 수도, 존재하지 않을 수도 있다. 상기 중쇄의 아미노산 서열은 항상 C-말단 리신과 함께 존재하지만, 상기 C-말단 리신이 없는 변체도 본 발명에 포함된다.
IgG Fc 영역은 IgG CH2 및 IgG CH3 도메인을 포함한다. 인간 IgG Fc 영역의 "CH2 도메인"은 대개 약 231번 위치의 아미노산 잔기로부터 약 340번 위치의 아미노산 잔기까지 연장된다. 하나의 실시태양에서, 탄수화물 쇄가 상기 CH2 도메인에 부착된다. 본 명세서에서 상기 CH2 도메인은 고유 서열 CH2 도메인 또는 변형 CH2 도메인일 수 있다. 상기 "CH3 도메인"은 Fc 영역 중의 CH2 도메인에 C-말단인 잔기의 신장부(즉 IgG의 약 341번 위치의 아미노산 잔기로부터 약 447번 위치의 아미노산 잔기까지)를 포함한다. 본 명세서에서 상기 CH3 영역은 고유 서열 CH3 도메인 또는 변형 CH3 도메인(예를 들어 그의 하나의 쇄 중에 도입된 "돌기"("놉") 및 그의 다른 쇄 중에 도입된 상응하는 "공동"("홀")을 갖는 CH3 도메인; 명백히 본 발명에 참고로 인용된 미국특허 제 5,821,333 호를 참조하시오). 상기와 같은 변형 CH3 도메인을 사용하여 본 명세서에 기재된 바와 같은 2개의 일치하지 않는 항체 중쇄의 이종이량체화를 촉진할 수 있다. 본 명세서에 달리 명시되지 않는 한, 상기 Fc 영역 또는 불변 영역 중의 아미노산 잔기의 넘버링은 문헌[Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991]에 기재된 바와 같은 EU 넘버링 시스템(또한 EU 지수라 칭한다)에 따른다.
상기 "놉-인투-홀" 기술은 예를 들어 미국특허 제 5,731,168 호; 미국특허 제 7,695,936 호; 문헌[Ridgway et al., Prot Eng 9, 617-621 (1996)] 및 문헌[Carter, J Immunol Meth 248, 7-15 (2001)]에 기재되어 있다. 일반적으로, 상기 방법은 돌기가 이종이량체 형성을 촉진하고 동종이량체 형성을 방해하도록 공동내에 위치할 수 있게 상기 돌기("놉")를 제1 폴리펩타이드의 접촉면에 도입시키고 상응하는 공동("홀")을 제2 폴리펩타이드의 접촉면에 도입시킴을 수반한다. 돌기는 상기 제1 폴리펩타이드의 접촉면으로부터의 작은 아미노산 측쇄를 보다 큰 측쇄(예를 들어 타이로신 또는 트립토판)로 교체시킴으로써 구축된다. 상기 돌기와 동일하거나 유사한 크기의 보상 공동이, 큰 아미노산 측쇄를 보다 작은 것(예를 들어 알라닌 또는 쓰레오닌)으로 교체시킴으로써 상기 제2 폴리펩타이드의 접촉면에 생성된다. 상기 돌기 및 공동을, 상기 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을, 예를 들어 부위-특이적 돌연변이유발에 의해 또는 펩타이드 합성에 의해 변경시킴으로써 제조할 수 있다. 특정한 실시태양에서, 놉 변형은 Fc 도메인의 2개 서브유닛 중 하나에 아미노산 치환 T366W를 포함하며, 홀 변형은 상기 Fc 도메인의 2개 서브유닛 중 다른 하나에 아미노산 치환 T366S, L368A 및 Y407V를 포함한다. 추가의 특정한 실시태양에서, 상기 놉 변형을 포함하는 Fc 도메인의 서브유닛은 아미노산 치환 S354C를 추가로 포함하고, 상기 홀 변형을 포함하는 Fc 도메인의 서브유닛은 아미노산 치환 Y349C를 추가로 포함한다. 이들 2개의 시스테인 잔기의 도입은 상기 Fc 영역의 2개 서브유닛 사이에 다이설파이드 가교를 형성시키고, 따라서 상기 이량체를 더욱 안정화시킨다(문헌[Carter, J Immunol Methods 248, 7-15 (2001)]).
"면역글로불린의 Fc 영역과 균등한 영역"은 면역글로불린의 Fc 영역의 천연 대립유전자 변체뿐만 아니라, 치환, 부가 또는 결실을 생성시키지만 효과기 기능(예를 들어 항체-의존적인 세포 세포독성)을 매개하는 상기 면역글로불린의 능력을 실질적으로 감소시키지 않는 변경을 갖는 변체를 포함하도록 되어 있다. 예를 들어, 하나 이상의 아미노산을 생물학적 기능의 실질적인 상실 없이 면역글로불린의 Fc 영역의 N-말단 또는 C-말단으로부터 결실시킬 수 있다. 상기와 같은 변체를 활성에 대해 최소의 영향을 미치도록 당해 분야에 공지된 일반적인 법칙에 따라 선택할 수 있다(예를 들어 문헌[Bowie, J. U. et al., Science 247:1306-10 (1990)]을 참조하시오).
"효과기 기능"이란 용어는, 항체 아이소타입에 따라 변하는 항체의 Fc 영역에 기인할 수 있는 생물학적 활성들을 지칭한다. 항체 효과기 기능의 예는 하기를 포함한다: C1q 결합 및 보체 의존적인 세포독성(CDC), Fc 수용체 결합, 항체-의존적인 세포-매개된 세포독성(ADCC), 항체-의존적인 세포 식작용(ADCP), 사이토킨 분비, 항원 제공 세포에 의한 면역 복합체-매개된 항원 흡수, 세포 표면 수용체(예를 들어 B 세포 수용체)의 하향 조절, 및 B 세포 활성화.
"활성화 Fc 수용체"는 항체의 Fc 영역에 의한 관여에 이어서 효과기 기능을 수행하도록 수용체-함유 세포를 자극하는 신호전달 사건을 이끌어 내는 Fc 수용체이다. 활성화 Fc 수용체는 FcγRIIIa (CD16a), FcγRI (CD64), FcγRIIa (CD32), 및 FcαRI (CD89)를 포함한다. 특정한 활성화 Fc 수용체는 인간 FcγRIIIa이다 (유니프롯 수납 번호 P08637, 버전 141을 참조하시오).
"펩타이드 링커"란 용어는 하나 이상의 아미노산, 전형적으로 약 2 내지 20 아미노산을 포함하는 펩타이드를 지칭한다. 펩타이드 링커는 당해 분야에 공지되어 있거나 또는 본 명세서에 기재되어 있다. 적합한, 비-면역원성 링커 펩타이드는 예를 들어 (G4S)n, (SG4)n 또는 G4(SG4)n 펩타이드 링커이며, 여기에서 "n"은 일반적으로 1 내지 10, 전형적으로 2 내지 4, 특히 2의 수이다.
"융합된" 또는 "연결된"은 성분들(예를 들어 항원-결합 부위 및 FC 도메인)이 펩타이드 결합에 의해, 직접적으로 또는 하나 이상의 펩타이드 링커를 통해 연결됨을 의미한다.
본 출원내에 사용된 바와 같은 "아미노산"이란 용어는 알라닌(3문자 코드: ala, 1문자 코드: A), 아르기닌(arg, R), 아스파라진(asn, N), 아스파트산(asp, D), 시스테인(cys, C), 글루타민(gln, Q), 글루탐산(glu, E), 글리신(gly, G), 히스티딘(his, H), 아이소류신(ile, I), 류신(leu, L), 리신(lys, K), 메티오닌(met, M), 페닐알라닌(phe, F), 프롤린(pro, P), 세린(ser, S), 쓰레오닌(thr, T), 트립토판(trp, W), 타이로신(tyr, Y), 및 발린(val, V)을 포함하는 천연 카복시 α-아미노산의 그룹을 나타낸다.
참조 폴리펩타이드(단백질) 서열에 관한 "아미노산 서열 일치성 퍼센트(%)"는, 필요한 경우 최대의 서열 일치성 퍼센트를 성취하기 위해서, 및 상기 서열 일치성의 부분으로서 어떠한 보존적인 치환도 고려하지 않고, 서열과 도입 틈을 정렬시킨 후에, 기준 폴리펩타이드 서열 중의 아미노산 잔기들과 일치하는 후보 서열 중의 아미노산 잔기들의 백분율로서 정의된다. 아미노산 서열 일치성 퍼센트를 측정하기 위한 정렬은 당해 분야의 기술 내에 있는 다양한 방식들로, 예를 들어 공개적으로 입수할 수 있는 컴퓨터 소프트웨어, 예를 들어 BLAST, BLAST-2, ALGN. SAWI 또는 메그얼라인(Megalign)(DNASTAR) 소프트웨어를 사용하여 성취될 수 있다. 당해 분야의 숙련가들은 서열들을 정렬시키기에 적합한 매개변수들, 예를 들어 비교하는 서열들의 전체길이에 대해 최대의 정렬을 성취하기 위해 필요한 임의의 연산을 결정할 수 있다. 그러나, 본 발명의 목적을 위해서, 아미노산 서열 일치성%를 서열 비교 컴퓨터 프로그램 ALIGN-2를 사용하여 생성시킨다. 상기 ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램은 제넨테크 인코포레이티드(Genentech, Inc.)에 의해 저술되었으며, 소스 암호는 미국 저작권 관청(미국 워싱톤 D.C. 20559 소재)에 사용자 문서와 함께 제출되었다(이때 상기 코드는 미국 저작권 등록 번호 TXU510087로 등록되어 있다). 상기 ALIGN-2 프로그램은 미국 캘리포니아주 사우스 샌프란시스코 소재의 제넨테크 인코포레이티드로부터 공개적으로 입수할 수 있거나, 또는 상기 소스 암호로부터 편집될 수 있다. 상기 ALIGN-2 프로그램을, 디지털 UNIX V4.0D를 포함하여, UNIX 실행 시스템상에서 사용하기 위해 편집해야 한다. 모든 서열 비교 매개변수들은 상기 ALIGN-2 프로그램에 의해 설정되며 변하지 않는다. ALIGN-2를 아미노산 서열 비교를 위해 사용하는 경우에, 주어진 아미노산 서열 A의 주어진 아미노산 서열 B에의, 상기 B와의, 또는 상기 B에 대한 아미노산 서열 일치성%(이는 한편으로 주어진 아미노산 서열 B에, 상기 B와, 또는 상기 B에 대해 일정한 아미노산 서열 일치성%를 갖거나 포함하는 주어진 아미노산 서열 A로서 표현될 수 있다)를 하기와 같이 계산한다:
100 x X/Y 분수
상기에서, X는 A 및 B의 서열 정렬 프로그램 ALIGN-2의 정렬에서 상기 프로그램에 의해 일치성 합치로서 채점되는 아미노산 잔기의 수이고, Y는 B 중 아미노산 잔기의 총수이다. 아미노산 서열 A의 길이가 아미노산 서열 B의 길이와 동일하지 않은 경우, A 대 B의 아미노산 서열 일치성%는 B 대 A의 아미노산 서열 일치성%와 동일하지 않음을 알 것이다. 달리 구체적으로 서술되지 않는 한, 본 발명에 사용된 모든 아미노산 서열 일치성% 값들은 상기 ALIGN-2 컴퓨터 프로그램을 사용하여 바로 앞의 단락에 개시된 바와 같이 획득된다.
몇몇 실시태양에서, 본 명세서에 제공된 본 발명의 이중특이성 항체의 아미노산 서열 변체를 고려한다. 예를 들어, 상기 이중특이성 항체의 결합 친화성 및/또는 다른 생물학적 성질들을 개선시키는 것이 바람직할 수 있다. 상기 이중특이성 항체의 아미노산 서열 변체를, 상기 분자를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에 적합한 변형을 도입시키거나, 또는 펩타이드 합성에 의해 제조할 수 있다. 상기와 같은 변형은 예를 들어 상기 항체의 아미노산 서열로부터의 잔기들의 결실, 및/또는 상기 서열내로의 잔기들의 삽입 및/또는 상기 서열내에서 잔기들의 치환을 포함한다. 결실, 삽입 및 치환의 임의의 조합을 최종 구축물에 도달하도록 수행할 수 있으나, 단 최종 구축물은 목적하는 특성, 예를 들어 항원-결합성을 가져야 한다. 치환 돌연변이유발을 위한 관심 부위는 HVR 및 프레임워크(FR)를 포함한다. 보존적 치환을 표 B에서 "바람직한 치환"의 제목하에 제공하고 아미노산 측쇄 부류(1) 내지 (6)을 참조하여 하기에 추가로 기재한다. 아미노산 치환을 관심 분자에 도입시키고 생성물을 목적하는 활성, 예를 들어 유지된/개선된 항원 결합, 감소된 면역원성, 또는 개선된 ADCC 또는 CDC에 대해 선별할 수 있다.
[표 B]
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아미노산들을 공통 측쇄 성질에 따라 분류할 수도 있다:
(1) 소수성: 노르류신, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
(2) 중성 친수성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
(3) 산성: Asp, Glu;
(4) 염기성: His, Lys, Arg;
(5) 쇄 배향에 영향을 미치는 잔기: Gly, Pro;
(6) 방향족: Trp, Tyr, Phe.
비-보존적인 치환은 이들 부류 중 하나의 구성원을 또 다른 부류에 대해 교환함을 수반할 것이다.
"아미노산 서열 변체"란 용어는 모 항원 결합 분자(예를 들어 인간화된 또는 인간 항체)의 하나 이상의 고가변 영역 잔기 중에 아미노산 치환이 존재하는 실질적인 변체를 포함한다. 일반적으로, 추가의 연구를 위해 선택되는 상기 생산되는 변체는 모 항원 결합 분자에 비해 몇몇 생물학적 성질들(예를 들어 증가된 친화성, 감소된 면역원성)의 변형(예를 들어 개선)을 갖고/갖거나, 상기 모 항원 결합 분자의 몇몇 생물학적 성질들을 실질적으로 유지할 것이다. 예시적인 치환 변체는 친화성 성숙된 항체이며, 상기 항체를 편의상, 예를 들어 파지 디스플레이-기재 친화성 성숙 기법, 예를 들어 본 발명에 개시된 것들을 사용하여 생산할 수 있다. 간단히, 하나 이상의 HVR 잔기를 돌연변이시키고 변체 항원 결합 분자를 파지상에 표시하고 특정한 생물학적 활성(예를 들어 결합 친화성)에 대해 선별한다. 몇몇 실시태양에서, 치환, 삽입 또는 결실이, 상기와 같은 변경이 항원에 결합하는 항원 결합 분자의 능력을 실질적으로 감소시키지 않는 한, 하나 이상의 HVR 내에서 발생할 수 있다. 예를 들어, 결합 친화성을 실질적으로 감소시키지 않는 보존적 변경(예를 들어 본 발명에 제공되는 바와 같은 보존적 치환)를 HVR에서 수행할 수 있다. 돌연변이유발을 위해 표적화될 수 있는 항체의 잔기 또는 영역의 확인에 유용한 방법을 문헌[Cunningham and Wells(1989) Science 244: 1081-1085]에 기재된 바와 같이 "알라닌 주사 돌연변이유발"이라 칭한다. 상기 방법에서, 표적 잔기들(예를 들어 하전된 잔기, 예를 들어 Arg, Asp, His, Lys 및 Glu)의 잔기 또는 그룹이 확인되며 이들을, 상기 항원과 항체와의 상호작용이 영향을 받는지를 측정하기 위해 중성 또는 음으로 하전된 아미노산(예를 들어 알라닌 또는 폴리알라닌)에 의해 치환시킨다. 추가의 치환을 상기 아미노산 위치들에 도입시켜 초기 치환에 대한 기능적 민감성을 입증할 수 있다. 한편으로, 또는 추가로, 항체와 항원간의 접촉 지점들을 확인하기 위한 상기 항원-항원 결합 분자 복합체의 결정 구조. 상기와 같은 접촉 잔기 및 이웃하는 잔기들을 치환용 후보로서 표적화하거나 제거할 수 있다. 변체를, 상기 변체가 목적하는 성질을 함유하는지를 측정하기 위해서 선별할 수도 있다.
아미노산 서열 삽입은 하나의 잔기에서부터 100개 이상의 잔기를 함유하는 폴리펩타이드까지의 길이 범위에 이르는 아미노- 및/또는 카복시-말단 융합뿐만 아니라 단일 또는 다수 아미노산 잔기들의 서열내 삽입을 포함한다. 말단 삽입의 예는 N-말단 메티오닐 잔기를 갖는 이중특이성 항체를 포함한다. 상기 분자의 다른 삽입 변체는 이중특이성 항체의 혈청 반감기를 증가시키는 폴리펩타이드에 대한 N- 또는 C-말단에의 융합을 포함한다.
몇몇 태양에서, 본 명세서에 제공된 이중특이성 항체를 상기 항체가 글리코실화되는 정도가 증가하거나 또는 감소하도록 변경시킨다. 상기 분자의 글리코실화 변체를 편의상, 하나 이상의 글리코실화 부위가 생성되거나 제거되도록 아미노산 서열을 변경시킴으로써 획득할 수 있다, 예를 들어 Fc 도메인에 부착된 탄수화물을 변경시킬 수 있다. 포유동물 세포에 의해 생산된 고유 항체는 전형적으로 상기 Fc 영역의 CH2 도메인의 Asn297에 N-결합에 의해 일반적으로 부착되는 분지된, 이중촉각 올리고사카라이드를 포함한다. 예를 들어 문헌[Wright et al. TIBTECH 15:26-32 (1997)]을 참조하시오. 상기 올리고사카라이드는 다양한 탄수화물들, 예를 들어 만노스, N-아세틸 글루코스아민(GlcNAc), 갈락토스, 및 시알산뿐만 아니라 상기 이중촉각 올리고사카라이드 구조의 "줄기" 중 GlcNAc에 부착된 퓨코스를 포함할 수 있다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 이중특이성 항체에서 상기 올리고사카라이드의 변형을 몇몇 개선된 성질들을 갖는 변체를 생산하기 위해 수행할 수도 있다. 하나의 태양에서, Fc 영역에 부착된(직접 또는 간접적으로) 퓨코스가 없는 탄수화물 구조를 갖는 이중특이성 항체의 변체를 제공한다. 상기와 같은 퓨코실화 변체는 개선된 ADCC 기능을 가질 수 있다. 예를 들어 미국 특허 공보 제 US 2003/0157108(Presta, L.) 또는 US 2004/0093621(쿄와 학코 코교 캄파니 리미티드(Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd))를 참조하시오. 본 발명의 이중특이성 항체의 추가의 변체는 이등분된 올리고사카라이드, 예를 들어 Fc 영역에 부착된 이중촉각 올리고사카라이드가 GlcNAc에 의해 이등분된 것들을 포함한다. 상기와 같은 항체 변체는 감소된 퓨코실화 및/또는 개선된 ADCC 기능을 가질 수 있다., 예를 들어 WO 2003/011878(Jean-Mairet et al.); 미국특허 제 6,602,684 호(Umana et al.); 및 US 2005/0123546(Umana et al.)을 참조하시오. 상기 Fc 영역에 부착된 올리고사카라이드 중에 하나 이상의 갈락토스 잔기를 갖는 변체를 또한 제공한다. 상기와 같은 항체 변체는 개선된 CDC 기능을 가질 수 있으며, 예를 들어 WO 1997/30087(Patel et al.); WO 1998/58964(Raju, S.); 및 WO 1999/22764(Raju, S.)에 개시되어 있다.
몇몇 실시태양에서, 본 발명의 이중특이성 항체의 시스테인 조작된 변체, 예를 들어 상기 분자의 하나 이상의 잔기가 시스테인 잔기로 치환된 "티오MAb"를 생성시키는 것이 바람직할 수 있다. 특정한 실시태양에서, 상기 치환된 잔기는 상기 분자의 접근 가능한 부위에 존재한다. 상기 잔기를 시스테인으로 치환시킴으로써, 반응성 티올기가 상기 항체의 접근 가능한 부위에 위치되며 이를 사용하여 본 발명에 추가로 개시된 바와 같이 상기 항체를 다른 부분, 예를 들어 약물 부분 또는 링커-약물 부분에 접합시켜 면역접합체를 생산할 수 있다. 몇몇 실시태양에서, 하기의 잔기들 중 임의의 하나 이상을 시스테인으로 치환시킬 수도 있다: 경쇄의 V205(카밧 넘버링); 중쇄의 A118(EU 넘버링); 및 중쇄 Fc 영역의 S400(EU 넘버링). 시스테인 조작된 항원 결합 분자를 예를 들어 미국특허 제 7,521,541 호에 기재된 바와 같이 생성시킬 수 있다.
몇몇 태양에서, 본 명세서에 제공된 이중특이성 항체를 당해 분야에 공지되고 쉽게 입수할 수 있는 추가적인 비단백질성 부분을 함유하도록 추가로 변형시킬 수 있다. 상기 항체의 유도체화에 적합한 부분은 비제한적으로 수용성 중합체를 포함한다. 수용성 중합체의 비제한적인 예는 비제한적으로 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 에틸렌 글리콜/프로필렌 글리콜의 공중합체, 카복시메틸셀룰로스, 덱스트란, 폴리비닐 알콜, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리-1,3-다이옥솔란, 폴리-1,3,6-트라이옥산, 에틸렌/말레산 무수물 공중합체, 폴리아미노산(단독중합체 또는 랜덤 공중합체), 및 덱스트란 또는 폴리(n-비닐 피롤리돈)폴리에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜 단독중합체, 폴리프로필렌 옥사이드/에틸렌 옥사이드 공중합체, 폴리옥시에틸화된 폴리올(예를 들어 글리세롤), 폴리비닐 알콜, 및 이들의 혼합물을 포함한다. 폴리에틸렌 글리콜 프로피온알데하이드는 그의 수 중 안정성으로 인해 제조에 이점을 가질 수 있다. 상기 중합체는 임의의 분자량을 가질 수 있으며 분지되거나 분지되지 않을 수도 있다. 상기 항체에 부착된 중합체들의 수는 변할 수 있으며, 하나보다 많은 중합체가 부착되는 경우, 이들 중합체는 동일하거나 상이한 분자일 수 있다. 일반적으로, 상기 유도체화에 사용되는 중합체의 수 및/또는 유형을 비제한적으로, 개선시키고자 하는 상기 항체의 특정한 성질 또는 기능, 상기 이중특이성 항체 유도체를 한정된 조건하에서 치료법에 사용할 것인지의 여부 등을 포함한 고려사항을 기준으로 결정할 수 있다.
또 다른 태양에서, 방사선에의 노출에 의해 선택적으로 가열될 수 있는 항체 및 비단백질성 부분의 접합체를 제공한다. 하나의 실시태양에서, 상기 비단백질성 부분은 탄소 나노튜브이다(문헌[Kam, N.W. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 11600-11605 (2005)]). 상기 방사선은 임의의 파장을 가질 수 있으며, 비제한적으로 통상적인 세포에는 해롭지 않지만 상기 비단백질성 부분을 상기 항체-비단백질성 부분에 근접한 세포를 죽이는 온도로 가열하는 파장을 포함한다.
"면역접합체"는 비제한적으로 세포독성제를 포함하여, 하나 이상의 이종 분자에 접합된 항체이다.
"폴리뉴클레오타이드"란 용어는 단리된 핵산 분자 또는 구축물, 예를 들어 전령 RNA(mRNA), 바이러스-유래된 RNA, 또는 플라스미드 DNA(pDNA)를 지칭한다. 폴리뉴클레오타이드는 통상적인 포스포다이에스터 결합 또는 비-통상적인 결합(예를 들어 아미드 결합, 예를 들어 펩타이드 핵산(PNA) 중에서 발견되는 결합을 포함할 수 있다. "핵산 분자"란 용어는 폴리뉴클레오타이드 중에 존재하는 임의의 하나 이상의 핵산 분절, 예를 들어 DNA 또는 RNA 단편을 지칭한다.
"단리된" 핵산 분자 또는 폴리뉴클레오타이드는 그의 고유 환경으로부터 제거된 핵산 분자, DNA 또는 RNA를 의미한다. 예를 들어, 본 발명의 목적을 위해 단리된 벡터 중에 함유된 폴리펩타이드를 암호화하는 재조합 폴리뉴클레오타이드가 고려된다. 단리된 폴리뉴클레오타이드의 추가의 예는 이종 숙주 세포 중에서 유지된 재조합 폴리뉴클레오타이드 또는 용액 중 정제된(부분적으로 또는 실질적으로) 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 단리된 폴리뉴클레오타이드는 상기 폴리뉴클레오타이드 분자를 통상적으로 함유하는 세포 중에 함유된 폴리뉴클레오타이드 분자를 포함하지만, 상기 폴리뉴클레오타이드 분자는 염색체외에 존재하거나 또는 그의 자연적인 염색체 위치와 상이한 염색체 위치에 존재한다. 단리된 RNA 분자는 본 발명의 생체내 또는 시험관내 RNA 전사물뿐만 아니라 양성 및 음성 가닥 형태, 및 이중-가닥 형태를 포함한다. 본 발명에 따른 단리된 폴리뉴클레오타이드 또는 핵산은 합성적으로 생성된 상기와 같은 분자를 추가로 포함한다. 또한, 폴리뉴클레오타이드 또는 핵산은 프로모터, 리보솜 결합 부위 또는 전사 종결자와 같은 조절 요소이거나 또는 상기를 포함할 수 있다.
본 발명의 참조 뉴클레오타이드 서열에 적어도, 예를 들어 95% "일치하는" 뉴클레오타이드 서열을 갖는 핵산 또는 폴리뉴클레오타이드는, 상기 폴리뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드 서열이, 상기 폴리뉴클레오타이드 서열이 상기 참조 뉴클레오타이드 서열의 각 100 뉴클레오타이드당 5개 이하의 점 돌연변이를 포함할 수 있음을 제외하고, 상기 참조 서열과 일치함을 의미한다. 즉, 참조 뉴클레오타이드 서열에 적어도 95% 일치하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드를 수득하기 위해서, 상기 참조 서열 중 뉴클레오타이드의 5% 이하를 결실시키거나 또는 또 다른 뉴클레오타이드로 치환하거나, 또는 상기 참조 서열 중 전체 뉴클레오타이드의 5% 이하의 뉴클레오타이드의 수를 상기 참조 서열내에 삽입할 수 있다. 상기 참조 서열의 이러한 변경은 상기 참조 서열 중 잔기들간에 개별적으로 또는 상기 참조 서열내 하나 이상의 연속적인 그룹 중에 산재된, 상기 참조 뉴클레오타이드 서열의 5' 또는 3' 말단 위치 또는 상기 말단 위치들 사이의 어디에서나 발생할 수 있다. 실용적인 문제로서, 임의의 특정한 폴리뉴클레오타이드 서열이 본 발명의 뉴클레오타이드 서열에 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 일치하는지의 여부는 통상적으로 공지된 컴퓨터 프로그램, 예를 들어 폴리펩타이드에 대해 상기 논의된 것들(예를 들어 ALIGN-2)을 사용하여 측정할 수 있다.
"발현 카세트"란 용어는 표적 세포에서 특정 핵산의 전사를 허용하는 일련의 명시된 핵산 요소와 함께 재조합적으로 또는 합성적으로 생성되는 폴리뉴클레오타이드를 지칭한다. 상기 재조합 발현 카세트를 플라스미드, 염색체, 미토콘드리아 DNA, 플라스미드 DNA, 바이러스 또는 핵산 단편에 통합시킬 수 있다. 전형적으로, 발현 벡터의 재조합 발현 카세트 부분은 다른 서열들 중에서도 전사되는 핵산 서열 및 프로모터를 포함한다. 몇몇 실시태양에서, 본 발명의 발현 카세트는 본 발명의 이중특이성 항원 결합 분자 또는 그의 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
"벡터" 또는 "발현 벡터"란 용어는 "발현 구축물"과 유의어이며 특정한 유전자를 상기가 표적 세포와 작동적으로 관련되도록 도입시키고 그의 발현을 지시하는데 사용되는 DNA 분자를 지칭한다. 상기 용어는 자기-복제 핵산 구조물로서 벡터뿐만 아니라 상기 벡터가 도입된 숙주 세포의 게놈내에 통합된 벡터를 포함한다. 본 발명의 발현 벡터는 발현 카세트를 포함한다. 발현 벡터는 다량의 안정한 mRNA의 전사를 허용한다. 일단 상기 발현 벡터가 표적 세포내에 있으면, 상기 유전자에 의해 암호화되는 리보핵산 분자 또는 단백질이 상기 세포 전사 및/또는 번역 기구에 의해 생성된다. 하나의 실시태양에서, 본 발명의 발현 벡터는 본 발명의 이중특이성 항원 결합 분자 또는 그의 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 발현 카세트를 포함한다.
"숙주 세포", "숙주 세포주" 및 "숙주 세포 배양물"이란 용어는 호환적으로 사용되며 상기와 같은 세포의 자손을 포함하여, 외인성 핵산이 도입된 세포를 지칭한다. 숙주 세포는 "형질전환체" 및 "형질전환된 세포"를 포함하며, 이들은 계대의 수와 상관 없이 1차 형질전환된 세포 및 그로부터 유래된 자손을 포함한다. 자손은 모 세포와 핵산 함량이 완전히 동일할 필요는 없으며, 돌연변이를 함유할 수도 있다. 원래 형질전환된 세포에 대해 선별되거나 선택된 바와 동일한 기능 또는 생물 활성을 갖는 돌연변이 자손은 본 발명에 포함된다. 숙주 세포는 본 발명의 이중특이성 항원 결합 분자를 생성시키는데 사용될 수 있는 임의의 유형의 세포 시스템이다. 특히, 상기 숙주 세포는 원핵생물 또는 진핵생물 숙주 세포이다. 숙주 세포는 배양된 세포, 예를 들어 몇가지 언급하자면, 포유동물 배양된 세포, 예를 들어 CHO 세포, BHK 세포, NS0 세포, SP2/0 세포, YO 골수종 세포, P3X63 마우스 골수종 세포, PER 세포, PER.C6 세포 또는 하이브리도마 세포, 효모 세포, 곤충 세포, 및 식물 세포를 포함하나, 또한 트랜스제닉 동물, 트랜스제닉 식물 또는 배양된 식물 또는 동물 조직내에 포함된 세포를 포함한다.
작용제의 "유효량"은 상기 작용제가 투여되는 세포 또는 조직에서 생리학적 변화를 생성시키기에 필요한 양을 지칭한다.
작용제, 예를 들어 약학 조성물의 "치료 유효량"은 필요한 투여량 및 기간 동안 목적하는 치료학적 또는 예방학적 결과를 성취하기에 유효한 양을 지칭한다. 작용제의 치료 유효량은 예를 들어 질병의 부작용을 제거하거나, 감소시키거나, 지연시키거나, 최소화하거나 또는 방지한다.
"개체" 또는 "피실험자"는 포유동물이다. 포유동물은 비제한적으로 가축(예를 들어 소, 양, 고양이, 개 및 말), 영장류(예를 들어 인간 및 비인간 영장류, 예를 들어 원숭이), 토끼, 및 설치류(예를 들어 마우스 및 래트)를 포함한다. 특히, 상기 개체 또는 피실험자는 인간이다.
"약학 조성물"이란 용어는, 함유된 활성 성분의 생물학적 활성을 유효하게 하는 형태이고 제형이 투여되는 피실험자에게 허용 가능하지 않게 독성인 추가적인 성분은 함유하지 않는 제제를 지칭한다.
"약학적으로 허용 가능한 부형제"는 활성 성분 외에, 피실험자에게 무독성인 약학 조성물 중의 성분을 지칭한다. 약학적으로 허용 가능한 부형제는 비제한적으로 완충제, 안정화제 또는 보존제를 포함한다.
"패키지 삽입지"는 치료 제품의 사용에 관한 적응증, 용법, 투여량, 투여, 복합 요법, 금기 및/또는 경고에 관한 정보를 함유하는, 상기와 같인 치료 제품의 상업적인 패키지 중에 통상적으로 포함되는 설명서를 지칭하는데 사용된다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "치료"(및 "치료하다" 및 "치료하는"과 같은 그의 문법상 어미변화)는 치료 중인 개체의 자연적인 과정을 변경시키고자 하는 임상적 중재를 지칭하며, 예방을 위해서 또는 임상적 병리 과정 동안 수행될 수 있다. 치료의 바람직한 효과는 비제한적으로 질병의 발생 또는 재발 방지, 증상의 완화, 상기 질병의 임의의 직접적인 또는 간접적인 병리학적 결과의 감소, 전이 방지, 질병 진행속도의 감소, 질병 상태의 개선 또는 완화, 및 진정 또는 개선된 예후를 포함한다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 분자를 사용하여 질병의 발생을 지연시키거나 또는 질병의 진행을 늦춘다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 "암"이란 용어는 증식성 질병, 예를 들어 림프종, 림프구성 백혈병, 폐암, 비-소세포 폐(NSCL)암, 기관지폐포성 세포 폐암, 골암, 췌장암, 피부암, 두경부암, 피부 또는 안내 흑색종, 자궁암, 난소암, 직장암, 항문부위암, 위암, 위장암, 결장암, 유방암, 자궁암, 나팔관암종, 자궁내막 암종, 자궁경부 암종, 질 암종, 음문 암종, 호지킨병, 식도암, 소장암, 내분비계암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 방광암, 신장 또는 여관암, 신세포 암종, 신우암종, 중피종, 간세포암, 담낭암, 중추신경계(CNS) 종양, 척추 종양, 뇌간 신경교종, 다형성 교모세포종, 성상세포종, 슈반종, 상의세포종, 수모세포종, 뇌수막종, 편평세포 암종, 뇌하수체 선종 및 유잉 육종, 및 상기 암들 중 어느 하나의 난치성 버전, 또는 상기 암들 중 하나 이상의 조합을 지칭한다.
본 발명의 이중특이성 항체
본 발명은 특히 유리한 성질, 예를 들어 재현성, 안정성, 결합 친화성, 생물학적 활성, 몇몇 T 세포의 특정한 표적화, 표적화 효율 및 감소된 독성을 갖는, PD1에 특이적으로 결합하는 제1 항원-결합 부위 및 TIM-3에 특이적으로 결합하는 제2 항원-결합 부위를 포함하는 신규의 이중특이성 항체를 제공한다. 특히, 상기는 이중특이성 항체이며, 여기에서 상기 이중특이성 항체는 PD1에 높은 친화성으로, TIM3에 낮은 친화성으로 결합한다.
A. PD1 및 TIM-3에 결합하는 예시적인 이중특이성 항체
하나의 태양에서, 본 발명은 PD1에 특이적으로 결합하는 제1 항원-결합 부위 및 TIM-3에 특이적으로 결합하는 제2 항원-결합 부위를 포함하는 이중특이성 항체를 제공하며, 여기에서
상기 PD1에 특이적으로 결합하는 제1 항원-결합 부위는
(i) 서열번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1,
(ii) 서열번호 38의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및
(iii) 서열번호 39의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3
을 포함하는 VH 도메인; 및
(i) 서열번호 40의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1,
(ii) 서열번호 41의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및
(iii) 서열번호 42의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3
을 포함하는 VL 도메인
을 포함하고;
상기 TIM3에 특이적으로 결합하는 제2 항원-결합 부위는
(a) (i) 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1,
(ii) 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및
(iii) 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3
을 포함하는 VH 도메인; 및
(i) 서열번호 4 또는 서열번호 11 또는 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1,
(ii) 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및
(iii) 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3
을 포함하는 VL 도메인; 또는
(b) (i) 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1,
(ii) 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및
(iii) 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3
을 포함하는 VH 도메인; 및
(i) 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1,
(ii) 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및
(iii) 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3
을 포함하는 VL 도메인; 또는
(c) (i) 서열번호 29의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1,
(ii) 서열번호 30의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및
(iii) 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3
을 포함하는 VH 도메인; 및
(i) 서열번호 32의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1,
(ii) 서열번호 33의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및
(iii) 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3
을 포함하는 VL 도메인
을 포함한다.
특정한 태양에서, PD1에 특이적으로 결합하는 제1 항원-결합 부위 및 TIM-3에 특이적으로 결합하는 제2 항원-결합 부위를 포함하는 이중특이성 항체를 제공하며, 여기에서
상기 PD1에 특이적으로 결합하는 제1 항원-결합 부위는
(i) 서열번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1,
(ii) 서열번호 38의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및
(iii) 서열번호 39의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3
을 포함하는 VH 도메인; 및
(i) 서열번호 40의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1,
(ii) 서열번호 41의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및
(iii) 서열번호 42의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3
을 포함하는 VL 도메인
을 포함하고;
상기 TIM3에 특이적으로 결합하는 제2 항원-결합 부위는
(i) 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1,
(ii) 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및
(iii) 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3
을 포함하는 VH 도메인; 및
(i) 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1,
(ii) 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및
(iii) 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3
을 포함하는 VL 도메인
을 포함한다.
특정한 태양에서, PD1에 특이적으로 결합하는 제1 항원-결합 부위 및 TIM-3에 특이적으로 결합하는 제2 항원-결합 부위를 포함하는 이중특이성 항체를 제공하며, 여기에서
상기 PD1에 특이적으로 결합하는 제1 항원-결합 부위는
(i) 서열번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1,
(ii) 서열번호 38의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및
(iii) 서열번호 39의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3
을 포함하는 VH 도메인; 및
(i) 서열번호 40의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1,
(ii) 서열번호 41의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및
(iii) 서열번호 42의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3
을 포함하는 VL 도메인
을 포함하고;
상기 TIM3에 특이적으로 결합하는 제2 항원-결합 부위는
(i) 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1,
(ii) 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및
(iii) 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3
을 포함하는 VH 도메인; 및
(i) 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1,
(ii) 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및
(iii) 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3
을 포함하는 VL 도메인
을 포함한다.
추가의 태양에서, PD1에 특이적으로 결합하는 제1 항원-결합 부위 및 TIM3에 특이적으로 결합하는 제2 항원-결합 부위를 포함하는 이중특이성 항체를 제공하며, 여기에서
상기 PD1에 특이적으로 결합하는 제1 항원-결합 부위는
(a) 서열번호 43의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열번호 44의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인, 또는
(b) 서열번호 45의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열번호 46의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인, 또는
(c) 서열번호 45의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열번호 47의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인, 또는
(d) 서열번호 45의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열번호 48의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인, 또는
(e) 서열번호 45의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열번호 49의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인
을 포함하고,
상기 TIM3에 특이적으로 결합하는 제2 항원-결합 부위는
(a) 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인, 또는
(b) 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인, 또는
(c) 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인, 또는
(d) 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인, 또는
(e) 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인, 또는
(f) 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인, 또는
(g) 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인, 또는
(h) 서열번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인
을 포함한다.
추가의 태양에서, PD1에 특이적으로 결합하는 제1 항원-결합 부위 및 TIM3에 특이적으로 결합하는 제2 항원-결합 부위를 포함하는 이중특이성 항체는 인간, 인간화된 또는 키메릭 항체이다. 특히, 상기는 인간화된 항체이다.
하나의 태양에서, PD1에 특이적으로 결합하는 제1 항원-결합 부위 및 TIM3에 특이적으로 결합하는 제2 항원-결합 부위를 포함하는 인간화된 이중특이성 항체를 제공하며, 여기에서
상기 PD1에 특이적으로 결합하는 제1 항원-결합 부위는
(a) 서열번호 45의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열번호 46의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인, 또는
(b) 서열번호 45의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열번호 47의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인, 또는
(c) 서열번호 45의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열번호 48의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인, 또는
(d) 서열번호 45의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열번호 49의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인
을 포함하고,
상기 TIM3에 특이적으로 결합하는 제2 항원-결합 부위는
(a) 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인, 또는
(b) 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인, 또는
(c) 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인, 또는
(d) 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인
을 포함한다.
특정한 태양에서, PD1에 특이적으로 결합하는 제1 항원-결합 부위 및 TIM3에 특이적으로 결합하는 제2 항원-결합 부위를 포함하는 이중특이성 항체를 제공하며, 여기에서
상기 PD1에 특이적으로 결합하는 제1 항원-결합 부위는 서열번호 45의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열번호 46의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하고,
상기 TIM3에 특이적으로 결합하는 제2 항원-결합 부위는 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인, 또는 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함한다.
특히, 본 발명은 PD1에 특이적으로 결합하는 제1 항원-결합 부위 및 TIM3에 특이적으로 결합하는 제2 항원-결합 부위를 포함하는 이중특이성 항체를 제공하며, 여기에서
상기 PD1에 특이적으로 결합하는 제1 항원-결합 부위는
(i) 서열번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1,
(ii) 서열번호 38의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및
(iii) 서열번호 39의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3
을 포함하는 VH 도메인; 및
(i) 서열번호 40의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1,
(ii) 서열번호 41의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및
(iii) 서열번호 42의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3
을 포함하는 VL 도메인
을 포함하고;
상기 TIM3에 특이적으로 결합하는 제2 항원-결합 부위는
(a) (i) 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1,
(ii) 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및
(iii) 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3
을 포함하는 VH 도메인; 및
(i) 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1,
(ii) 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및
(iii) 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3
을 포함하는 VL 도메인
을 포함한다.
보다 특히, PD1에 특이적으로 결합하는 제1 항원-결합 부위 및 TIM3에 특이적으로 결합하는 제2 항원-결합 부위를 포함하는 이중특이성 항체를 제공하며, 여기에서 상기 PD1에 특이적으로 결합하는 제1 항원-결합 부위는 서열번호 45의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열번호 46, 서열번호 47, 서열번호 48 및 서열번호 49로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하고, 상기 TIM3에 특이적으로 결합하는 제2 항원-결합 부위는 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함한다.
보다 구체적으로, PD1에 특이적으로 결합하는 제1 항원-결합 부위 및 TIM3에 특이적으로 결합하는 제2 항원-결합 부위를 포함하는 이중특이성 항체를 제공하며, 여기에서 상기 PD1에 특이적으로 결합하는 제1 항원-결합 부위는 서열번호 45의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열번호 46의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하고, 상기 TIM3에 특이적으로 결합하는 제2 항원-결합 부위는 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함한다.
추가의 태양에서, PD1에 특이적으로 결합하는 제1 항원-결합 부위 및 TIM3에 특이적으로 결합하는 제2 항원-결합 부위를 포함하는 이중특이성 항체를 제공하며, 여기에서 상기 PD1에 특이적으로 결합하는 제1 항원-결합 부위는 서열번호 45의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열번호 46, 서열번호 47, 서열번호 48 및 서열번호 49로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하고, 상기 TIM3에 특이적으로 결합하는 제2 항원-결합 부위는 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함한다.
하나의 태양에서, PD1에 특이적으로 결합하는 제1 항원-결합 부위 및 TIM3에 특이적으로 결합하는 제2 항원-결합 부위를 포함하는 이중특이성 항체는 2가이다. 이는 상기 이중특이성 항체가 PD1에 특이적으로 결합하는 하나의 항원-결합 부위 및 TIM3에 특이적으로 결합하는 하나의 항원-결합 부위를 포함함(1+1 포맷)을 의미한다.
또 다른 태양에서, PD1에 특이적으로 결합하는 제1 항원-결합 부위 및 TIM3에 특이적으로 결합하는 제2 항원-결합 부위를 포함하는 이중특이성 항체를 제공하며, 여기에서 상기 이중특이성 항체는 TIM3에 낮은 친화성으로 결합하고 PD1에 높은 친화성으로 결합한다. 특정한 태양에서, 본 발명은 PD1에 특이적으로 결합하는 제1 항원-결합 부위 및 TIM3에 특이적으로 결합하는 제2 항원-결합 부위를 포함하는 이중특이성 항체를 제공하며, 여기에서 상기 이중특이성 항체는 TIM3에, PD1에의 결합과 비교할 때 적어도 50배 더 낮은 결합 친화성으로, 보다 특히 PD1에의 결합과 비교할 때 적어도 100배 더 낮은 결합 친화성으로 결합한다. 하나의 바람직한 실시태양에서 상기 결합 친화성(KD)을 표면 플라스몬 공명 분석으로 측정한다(예를 들어 실시예 12에 기재된 바와 같이).
하나의 태양에서, PD1에 특이적으로 결합하는 제1 항원-결합 부위 및 TIM3에 특이적으로 결합하는 제2 항원-결합 부위를 포함하는 이중특이성 항체를 제공하며, 여기에서
상기 PD1에 높은 친화성으로 특이적으로 결합하는 제1 항원-결합 부위는
(a) 서열번호 43의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열번호 44의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인, 또는
(b) 서열번호 45의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열번호 46의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인, 또는
(c) 서열번호 45의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열번호 47의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인, 또는
(d) 서열번호 45의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열번호 48의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인, 또는
(d) 서열번호 45의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열번호 49의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인
을 포함하고,
상기 TIM3에 낮은 친화성으로 특이적으로 결합하는 제2 항원-결합 부위는
(a) 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인, 또는
(c) 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인, 또는
(d) 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인
을 포함한다.
특정한 태양에서, PD1에 특이적으로 결합하는 제1 항원-결합 부위 및 TIM3에 특이적으로 결합하는 제2 항원-결합 부위를 포함하는 이중특이성 항체를 제공하며, 여기에서 상기 PD1에 높은 친화성으로 특이적으로 결합하는 제1 항원-결합 부위는 서열번호 45의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열번호 46의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하고, 상기 TIM3에 낮은 친화성으로 특이적으로 결합하는 제2 항원-결합 부위는 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함한다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 PD1에 특이적으로 결합하는 제1 항원-결합 부위 및 TIM3에 특이적으로 결합하는 제2 항원-결합 부위를 포함하는 이중특이성 항체에 관한 것이며, 여기에서 상기 이중특이성 항체는 Fc 도메인, PD1에 특이적으로 결합하는 항원-결합 부위를 포함하는 제1 Fab 단편 및 TIM3에 특이적으로 결합하는 항원-결합 부위를 포함하는 제2 Fab 단편을 포함한다.
특히, 상기 Fc 도메인은 IgG 도메인, 보다 특히 IgG1 Fc 도메인 또는 IgG4 Fc 도메인이다.
또 다른 태양에서, 본 발명은
(a) 서열번호 50의 서열에 적어도 95% 서열 일치성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄, 서열번호 52의 서열에 적어도 95% 서열 일치성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 제1 경쇄,
서열번호 51의 서열에 적어도 95% 서열 일치성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄, 및 서열번호 53의 서열에 적어도 95% 서열 일치성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 제2 경쇄, 또는
(b) 서열번호 54의 서열에 적어도 95% 서열 일치성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄, 서열번호 56의 서열에 적어도 95% 서열 일치성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 제1 경쇄,
서열번호 55의 서열에 적어도 95% 서열 일치성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄, 및 서열번호 57의 서열에 적어도 95% 서열 일치성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 제2 경쇄, 또는
(c) 서열번호 58의 서열에 적어도 95% 서열 일치성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄, 서열번호 60의 서열에 적어도 95% 서열 일치성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 제1 경쇄,
서열번호 59의 서열에 적어도 95% 서열 일치성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄, 및 서열번호 61의 서열에 적어도 95% 서열 일치성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 제2 경쇄, 또는
(d) 서열번호 62의 서열에 적어도 95% 서열 일치성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄, 서열번호 64의 서열에 적어도 95% 서열 일치성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 제1 경쇄,
서열번호 63의 서열에 적어도 95% 서열 일치성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄, 및 서열번호 65의 서열에 적어도 95% 서열 일치성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 제2 경쇄, 또는
(e) 서열번호 66의 서열에 적어도 95% 서열 일치성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄, 서열번호 68의 서열에 적어도 95% 서열 일치성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 제1 경쇄,
서열번호 67의 서열에 적어도 95% 서열 일치성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄, 및 서열번호 69의 서열에 적어도 95% 서열 일치성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 제2 경쇄
를 포함하는, PD1에 특이적으로 결합하는 제1 항원-결합 부위 및 TIM3에 특이적으로 결합하는 제2 항원-결합 부위를 포함하는 이중특이성 항체를 제공한다.
특정한 태양에서, 본 발명은
(a) 서열번호 50의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄, 서열번호 52의 아미노산 서열을 포함하는 제1 경쇄,
서열번호 51의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄, 및 서열번호 53의 아미노산 서열을 포함하는 제2 경쇄, 또는
(b) 서열번호 54의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄, 서열번호 56의 아미노산 서열을 포함하는 제1 경쇄,
서열번호 55의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄, 및 서열번호 57의 아미노산 서열을 포함하는 제2 경쇄, 또는
(c) 서열번호 58의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄, 서열번호 60의 아미노산 서열을 포함하는 제1 경쇄,
서열번호 59의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄, 및 서열번호 61의 아미노산 서열을 포함하는 제2 경쇄, 또는
(d) 서열번호 62의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄, 서열번호 64의 아미노산 서열을 포함하는 제1 경쇄,
서열번호 63의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄, 및 서열번호 65의 아미노산 서열을 포함하는 제2 경쇄, 또는
(e) 서열번호 66의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄, 서열번호 68의 아미노산 서열을 포함하는 제1 경쇄,
서열번호 67의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄, 및 서열번호 69의 아미노산 서열을 포함하는 제2 경쇄
를 포함하는, PD1에 특이적으로 결합하는 제1 항원-결합 부위 및 TIM3에 특이적으로 결합하는 제2 항원-결합 부위를 포함하는 이중특이성 항체를 제공한다.
보다 특히, 본 발명은 서열번호 62의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄, 서열번호 64의 아미노산 서열을 포함하는 제1 경쇄, 서열번호 63의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄, 및 서열번호 65의 아미노산 서열을 포함하는 제2 경쇄를 포함하는, PD1에 특이적으로 결합하는 제1 항원-결합 부위 및 TIM3에 특이적으로 결합하는 제2 항원-결합 부위를 포함하는 이중특이성 항체를 제공한다.
또 다른 특정한 태양에서, PD1에 특이적으로 결합하는 제1 항원-결합 부위 및 TIM3에 특이적으로 결합하는 제2 항원-결합 부위, 서열번호 66의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄, 서열번호 68의 아미노산 서열을 포함하는 제1 경쇄, 서열번호 67의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄, 및 서열번호 69의 아미노산 서열을 포함하는 제2 경쇄를 포함하는 이중특이성 항체를 제공한다.
또 다른 태양에서, PD1에 특이적으로 결합하는 제1 항원-결합 부위 및 TIM3에 특이적으로 결합하는 제2 항원-결합 부위를 포함하는 이중특이성 항체는 4가이다. 하나의 태양에서, 상기 이중특이성 항체는 PD1에 특이적으로 결합하는 2개의 항원-결합 부위 및 TIM3에 특이적으로 결합하는 2개의 항원-결합 부위를 포함한다(2+2 포맷).
하나의 태양에서, 본 발명의 이중특이성 항체는
(a) TIM3에 특이적으로 결합하는 항원-결합 부위를 포함하는 2개의 Fab 단편을 포함하는 항체의 2개의 경쇄 및 2개의 중쇄, 및
(b) PD1에 특이적으로 결합하는 항원-결합 부위를 포함하는 2개의 추가적인 Fab 단편
을 포함하고, 여기에서 상기 추가적인 Fab 단편은 각각 (a)의 중쇄의 C-말단에 펩타이드 링커를 통해 연결된다.
특정한 태양에서, 상기 펩타이드 링커는 (G4S)4이다. 또 다른 태양에서, 상기 PD1에 특이적으로 결합하는 항원-결합 부위를 포함하는 2개의 추가적인 Fab 단편은 교차 Fab 단편이며, 여기에서 가변 도메인 VL 및 VH는 서로에 의해 교체되고 VL-CH 쇄는 각각 펩타이드 링커를 통해 (a)의 중쇄의 C-말단에 연결된다.
특정한 태양에서, 본 발명은
(a) 각각 서열번호 70의 아미노산 서열을 포함하는 2개의 중쇄, 서열번호 71의 아미노산 서열을 포함하는 제1 경쇄, 및 서열번호 72의 아미노산 서열을 포함하는 제2 경쇄, 또는
(b) 각각 서열번호 73의 아미노산 서열을 포함하는 2개의 중쇄, 서열번호 74의 아미노산 서열을 포함하는 제1 경쇄, 및 서열번호 75의 아미노산 서열을 포함하는 제2 경쇄, 또는
(c) 각각 서열번호 76의 아미노산 서열을 포함하는 2개의 중쇄, 서열번호 77의 아미노산 서열을 포함하는 제1 경쇄, 및 서열번호 78의 아미노산 서열을 포함하는 제2 경쇄
를 포함하는, PD1에 특이적으로 결합하는 제1 항원-결합 부위 및 TIM3에 특이적으로 결합하는 제2 항원-결합 부위를 포함하는 이중특이성 항체를 제공한다.
Fc 수용체 결합 및/또는 효과기 기능을 감소시키는 Fc 도메인 변형
몇몇 태양에서, 하나 이상의 아미노산 변형을 본 발명에 제공된 항체의 Fc 영역에 도입시켜 Fc 영역 변체를 생산할 수 있다. 상기 Fc 영역 변체는 하나 이상의 아미노산 위치에서 아미노산 변형(예를 들어 치환)을 포함하는 인간 Fc 영역 서열(예를 들어 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 Fc 영역)을 포함할 수 있다.
하기의 섹션은 Fc 수용체 결합 및/또는 효과기 기능을 감소시키는 Fc 도메인 변형을 포함하는 본 발명의 이중특이성 항원 결합 분자의 바람직한 태양을 기재한다. 하나의 태양에서, 본 발명은 PD1에 특이적으로 결합하는 제1 항원-결합 부위 및 TIM3에 특이적으로 결합하는 제2 항원-결합 부위를 포함하는 이중특이성 항체에 관한 것이며, 여기에서 상기 Fc 도메인은 Fc 수용체, 특히 Fcγ 수용체에 대한 결합을 감소시키는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다. 특히, 상기 Fc 도메인은 아미노산 돌연변이 L234A, L235A 및 P329G(카밧 EU 지수에 따른 넘버링)를 갖는 인간 IgG1 하위부류의 것이다.
상기 Fc 도메인은 표적 조직 중의 양호한 축적 및 유리한 조직-혈액 분배비에 기여하는 긴 혈청 반감기를 포함하여, 본 발명의 이중특이성 항체에 유리한 약동학적 성질을 부여한다. 그러나, 동시에 상기는 본 발명의 이중특이성 항체의, 바람직한 항원-함유 세포에 대해서보다는 Fc 수용체를 발현하는 세포에 대한 바람직하지 못한 표적화를 유도할 수 있다. 상응하게, 특정한 실시태양에서, 본 발명의 이중특이성 항체의 Fc 도메인은 고유 IgG Fc 도메인, 특히 IgG1 Fc 도메인 또는 IgG4 Fc 도메인에 비해, Fc 수용체에 대해 감소된 결합 친화성 및/또는 감소된 효과기 기능을 나타낸다. 보다 특히, 상기 Fc 도메인은 IgG1 FC 도메인이다.
하나의 상기와 같은 태양에서 상기 Fc 도메인(또는 상기 Fc 도메인을 포함하는 본 발명의 이중특이성 항원 결합 분자)은 고유 IgG1 Fc 도메인(또는 고유 IgG1 Fc 도메인을 포함하는 본 발명의 이중특이성 항원 결합 분자)에 비해, Fc 수용체에 대해 50% 미만, 바람직하게는 20% 미만, 보다 바람직하게는 10% 미만 및 가장 바람직하게는 5% 미만의 결합 친화성, 및/또는 고유 IgG1 Fc 도메인(또는 고유 IgG1 Fc 도메인을 포함하는 본 발명의 이중특이성 항원 결합 분자)에 비해, 50% 미만, 바람직하게는 20% 미만, 보다 바람직하게는 10% 미만 및 가장 바람직하게는 5% 미만의 효과기 기능을 나타낸다. 하나의 태양에서, 상기 Fc 도메인(또는 상기 Fc 도메인을 포함하는 본 발명의 이중특이성 항원 결합 분자)은 실질적으로 Fc 수용체에 결합하고/하거나 효과기 기능을 유도하지 못한다. 특정한 태양에서 상기 Fc 수용체는 Fcγ 수용체이다. 하나의 태양에서, 상기 Fc 수용체는 인간 Fc 수용체이다. 하나의 태양에서, 상기 Fc 수용체는 활성화 Fc 수용체이다. 특정한 태양에서, 상기 Fc 수용체는 활성화 인간 Fcγ 수용체, 보다 구체적으로 인간 FcγIIIa, FcγRI 또는 FcγRIIa, 가장 구체적으로 인간 FcγRIIa이다. 하나의 태양에서, 상기 Fc 수용체는 억제성 Fc 수용체이다. 특정한 태양에서, 상기 Fc 수용체는 억제성 인간 Fcγ 수용체, 보다 구체적으로 인간 FcγRIIB이다. 하나의 태양에서 상기 효과기 기능은 CDC, ADCC, ADCP 및 사이토킨 분비 중 하나 이상이다. 특정한 태양에서, 상기 효과기 기능은 ADCC이다. 하나의 태양에서, 상기 Fc 도메인 도메인은 고유 IgG1 Fc 도메인에 비해, 신생아 Fc 수용체(FcRn)에 실질적으로 유사한 결합 친화성을 나타낸다. FcRn에 대한 실질적으로 유사한 결합은 상기 Fc 도메인(또는 상기 Fc 도메인을 포함하는 본 발명의 이중특이성 항원 결합 분자)이 FcRn에 대한 고유 IgG1 Fc 도메인(또는 고유 IgG1 Fc 도메인을 포함하는 본 발명의 이중특이성 항원 결합 분자)의 약 70% 초과, 특히 약 80% 초과, 보다 특히 약 90% 초과의 결합 친화성을 나타낼 때 성취된다.
특정한 태양에서, 상기 Fc 도메인을, 조작되지 않은 Fc 도메인에 비해, Fc 수용체에 대해 감소된 결합 친화성 및/또는 감소된 효과기 기능을 갖도록 조작한다. 특정한 태양에서, 본 발명의 이중특이성 항원 결합 분자의 Fc 도메인은 Fc 수용체에 대한 상기 Fc 도메인의 결합 친화성 및/또는 효과기 기능을 감소시키는 하나 이상의 아미노산 돌연변이를 포함한다. 전형적으로, 동일한 하나 이상의 아미노산 돌연변이는 상기 Fc 도메인의 2개의 서브유닛 각각에 존재한다. 하나의 태양에서, 상기 아미노산 돌연변이는 Fc 수용체에 대한 Fc 도메인의 결합 친화성을 감소시킨다. 또 다른 태양에서, 상기 아미노산 돌연변이는 Fc 수용체에 대한 상기 Fc 도메인의 결합 친화성을 적어도 2배, 적어도 5배, 또는 적어도 10배까지 감소시킨다. 하나의 태양에서, 조작된 Fc 도메인을 포함하는 본 발명의 이중특이성 항원 결합 분자는 조작되지 않은 Fc 도메인을 포함하는 본 발명의 이중특이성 항체에 비해 Fc 수용체에 대해 20% 미만, 특히 10% 미만, 보다 특히 5% 미만의 결합 친화성을 나타낸다. 특정한 태양에서, 상기 Fc 수용체는 Fcγ 수용체이다. 다른 태양에서, 상기 Fc 수용체는 인간 Fc 수용체이다. 하나의 태양에서, 상기 Fc 수용체는 억제성 Fc 수용체이다. 특정한 태양에서, 상기 Fc 수용체는 억제성 인간 Fcγ 수용체, 보다 구체적으로 인간 FcγRIIB이다. 일부 태양에서 상기 Fc 수용체는 활성화 Fc 수용체이다. 특정한 태양에서, 상기 Fc 수용체는 활성화 인간 Fcγ 수용체, 보다 구체적으로 인간 FcγRIIIa, FcγRI 또는 FcγRIIa, 가장 구체적으로 인간 FcγRIIIa이다. 바람직하게, 이들 수용체 각각에의 결합이 감소된다. 일부 태양에서, 보체 성분에 대한 결합 친화성, 구체적으로 C1q에 대한 결합 친화성이 또한 감소된다. 하나의 태양에서, 신생아 Fc 수용체(FcRn)에 대한 결합 친화성이 감소된다. FcRn에 대한 실질적으로 유사한 결합, 즉 상기 수용체에 대한 Fc 도메인의 결합 친화성의 보존은 상기 Fc 도메인(또는 상기 Fc 도메인을 포함하는 본 발명의 이중특이성 항원 결합 분자)이 FcRn에 대한 상기 Fc 도메인(또는 상기 Fc 도메인의 조작되지 않은 형태를 포함하는 본 발명의 이중특이성 항원 결합 분자)의 조작되지 않은 형태의 약 70% 초과의 결합 친화성을 나타낼 때 성취된다. 상기 Fc 도메인, 또는 상기 Fc 도메인을 포함하는 본 발명의 이중특이성 항원 결합 분자는 약 80% 초과 및 약 90% 훨씬 더 초과의 상기와 같은 친화성을 나타낼 수 있다. 몇몇 실시태양에서 본 발명의 이중특이성 항원 결합 분자의 Fc 도메인은 조작되지 않은 Fc 도메인에 비해 감소된 효과기 기능을 갖도록 조작된다. 상기 감소된 효과기 기능은 비제한적으로 하기 중 하나 이상을 포함할 수 있다: 감소된 보체 의존적인 세포독성(CDC), 감소된 항체-의존적인 세포-매개된 세포독성(ADCC), 감소된 항체-의존적인 세포 식작용(ADCP), 감소된 사이토킨 분비, 항원-제공 세포에 의한 감소된 면역 복합체-매개된 항원 흡수, NK 세포에 대한 감소된 결합, 대식세포에 대한 감소된 결합, 단핵세포에 대한 감소된 결합, 다형핵세포에 대한 감소된 결합, 감소된 직접적인 신호전달 유도 세포사멸, 감소된 수지상세포 성숙화, 또는 감소된 T 세포 프라이밍.
감소된 효과기 기능을 갖는 항체들은 Fc 영역 잔기 238, 265, 269, 270, 297, 327 및 329 중 하나 이상의 치환을 갖는 것들을 포함한다(미국특허 제 6,737,056 호). 상기와 같은 Fc 돌연변이체는 아미노산 위치 265, 269, 270, 297 및 327 중 2개 이상에서 치환을 갖는 Fc 돌연변이체(알라닌으로의 잔기 265 및 297의 치환을 갖는 소위 "DANA" Fc 돌연변이체 포함(미국특허 제 7,332,581 호))를 포함한다. FcR에 대한 개선된 또는 감소된 결합을 갖는 몇몇 항체 변체들이 기재되어 있다(예를 들어 미국특허 제 6,737,056 호; WO 2004/056312, 및 문헌[Shields, R.L. et al., J. Biol. Chem. 276(2001) 6591-6604]을 참조하시오).
본 발명의 하나의 태양에서, 상기 Fc 도메인은 E233, L234, L235, N297, P331 및 P329의 위치에 아미노산 치환을 포함한다. 일부 태양에서, 상기 Fc 도메인은 아미노산 치환 L234A 및 L235A("LALA")를 포함한다. 하나의 상기와 같은 실시태양에서, 상기 Fc 도메인은 IgG1 Fc 도메인, 특히 인간 IgG1 Fc 도메인이다. 하나의 태양에서, 상기 Fc 도메인은 P329번 위치에 아미노산 치환을 포함한다. 보다 구체적인 태양에서, 상기 아미노산 치환은 P329A 또는 P329G, 특히 P329G이다. 하나의 태양에서, 상기 Fc 도메인은 P329 위치에 아미노산 치환 및 E233P, L234A, L235A, L235E, N297A, N297D 또는 P331S로 이루어지는 그룹 중에서 선택되는 추가의 아미노산 치환을 포함한다. 보다 특정한 실시태양에서 상기 Fc 도메인은 아미노산 돌연변이 L234A, L235A 및 P329G("P329G LALA")를 포함한다. 상기 아미노산 치환들의 "P329G LALA" 조합은 PCT 특허 출원 WO 2012/130831 A1에 기재된 바와 같이, 인간 IgG1 Fc 도메인의 Fcγ 수용체 결합을 거의 완전하게 없앤다. 상기 문서는 또한 상기와 같은 돌연변이체 Fc 도메인의 제조 방법 및 Fc 수용체 결합 또는 효과기 기능과 같은 그의 성질의 측정 방법을 기재한다. 상기와 같은 항체는 돌연변이 L234A 및 L235A 또는 돌연변이 L234A, L235A 및 P329G(카밧 등의 EU 지수에 따른 넘버링, 문헌[Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991])를 갖는 IgG1이다.
하나의 태양에서, 본 발명의 이중특이성 항체는 (i) 돌연변이 P329G, L234A 및 L235A를 임의로 갖는 인간 IgG1 하위부류의 동종이량체성 Fc-영역, 또는 (ii) 돌연변이 P329G, S228P 및 L235E를 임의로 갖는 인간 IgG4 하위부류의 동종이량체성 Fc-영역, 또는 (iii) 돌연변이 P329G, L234A, L235A, I253A, H310A, 및 H435A, 또는 돌연변이 P329G, L234A, L235A, H310A, H433A, 및 Y436A를 임의로 갖는 인간 IgG1 하위부류의 동종이량체성 Fc-영역, 또는 (iv) 하나의 Fc-영역 폴리펩타이드가 돌연변이 T366W를 포함하고 다른 Fc-영역 폴리펩타이드가 돌연변이 T366S, L368A 및 Y407V를 포함하거나, 또는 하나의 Fc-영역 폴리펩타이드가 돌연변이 T366W 및 Y349C를 포함하고 다른 Fc-영역 폴리펩타이드가 돌연변이 T366S, L368A, Y407V, 및 S354C를 포함하거나, 또는 하나의 Fc-영역 폴리펩타이드가 돌연변이 T366W 및 S354C를 포함하고 다른 Fc-영역 폴리펩타이드가 돌연변이 T366S, L368A, Y407V 및 Y349C를 포함하는 이종이량체성 Fc-영역, 또는 (v) 2개의 Fc-영역 폴리펩타이드가 모두 돌연변이 P329G, L234A 및 L235A를 포함하고 하나의 Fc-영역 폴리펩타이드가 돌연변이 T366W를 포함하고 다른 Fc-영역 폴리펩타이드가 돌연변이 T366S, L368A 및 Y407V를 포함하거나, 또는 하나의 Fc-영역 폴리펩타이드가 돌연변이 T366W 및 Y349C를 포함하고 다른 Fc-영역 폴리펩타이드가 돌연변이 T366S, L368A, Y407V, 및 S354C를 포함하거나, 또는 하나의 Fc-영역 폴리펩타이드가 돌연변이 T366W 및 S354C를 포함하고 다른 Fc-영역 폴리펩타이드가 돌연변이 T366S, L368A, Y407V 및 Y349C를 포함하는 인간 IgG1 하위부류의 이종이량체성 Fc-영역(모든 위치는 카밧의 EU 지수에 따른다)을 포함한다.
하나의 태양에서, 상기 Fc 도메인은 IgG4 Fc 도메인이다. 보다 구체적인 실시태양에서, 상기 Fc 도메인은 S228 위치에 아미노산 치환(카밧 넘버링), 특히 아미노산 치환 S228P를 포함하는 IgG4 Fc 도메인이다. 보다 구체적인 실시태양에서, 상기 Fc 도메인은 아미노산 치환 L235E 및 S228P 및 P329G를 포함하는 IgG4 Fc 도메인이다. 상기 아미노산 치환은 IgG4 항체의 생체내 Fab 가지 교환을 감소시킨다(문헌[Stubenrauch et al., Drug Metabolism and Disposition 38, 84-91 (2010)]을 참조하시오). 따라서, 하나의 태양에서, 2개의 Fc-영역 폴리펩타이드가 모두 돌연변이 P329G, S228P 및 L235E를 포함하고 하나의 Fc-영역 폴리펩타이드가 돌연변이 T366W를 포함하고 다른 Fc-영역 폴리펩타이드가 돌연변이 T366S, L368A 및 Y407V를 포함하거나, 또는 하나의 Fc-영역 폴리펩타이드가 돌연변이 T366W 및 Y349C를 포함하고 다른 Fc-영역 폴리펩타이드가 돌연변이 T366S, L368A, Y407V, 및 S354C를 포함하거나, 또는 하나의 Fc-영역 폴리펩타이드가 돌연변이 T366W 및 S354C를 포함하고 다른 Fc-영역 폴리펩타이드가 돌연변이 T366S, L368A, Y407V 및 Y349C를 포함하는 인간 IgG4 하위부류의 이종이량체성 Fc-영역(모든 위치는 카밧의 EU 지수에 따른다)을 포함하는 이중특이성 항체를 제공한다.
증가된 반감기 및 신생아 Fc 수용체(RcRn)(모 IgG의 태아로의 전달을 맡고 있다)(문헌[Guyer, R.L. et al., J. Immunol. 117:587-593 (1976)] 및 문헌[Kim J.K. et al., J. Immunol. 24:2429-2434 (1994)])에의 개선된 결합을 갖는 항체들이 US2005/0014934에 개시되어 있다. 상기 항체들은 FcRn에 대한 Fc 영역의 결합을 개선시키는 하나 이상의 치환을 갖는 상기 Fc 영역을 포함한다. 상기와 같은 Fc 변체들은 Fc 영역 잔기: 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 및 434 중 하나 이상에서의 치환, 예를 들어 Fc 영역 잔기 434에서의 치환(미국특허 제 7,371,826 호)을 갖는 것들을 포함한다. 또한 Fc 영역 변체의 다른 예들에 관한 문헌[Duncan, A.R. and Winter, G., Nature 322:738-740 (1988)]; 미국특허 제 5,648,260 호; 미국특허 제 5,624,821 호; 및 WO 94/29351을 참조하시오.
Fc 수용체에의 결합을 예를 들어 ELISA에 의해서 또는 BIAcore 장비(GE 헬쓰케어)와 같은 표준 장비를 사용하는 표면 플라스몬 공명(SPR)에 의해서 쉽게 측정할 수 있으며 Fc 수용체 자체를 재조합 발현에 의해 수득할 수 있다. 적합한 상기와 같은 결합 분석은 본 명세서에 기재되어 있다. 한편으로, Fc 수용체에 대한 Fc 도메인 또는 Fc 도메인을 포함하는 세포 활성화 이중특이성 항원 결합 분자의 결합 친화성을 특정한 Fc 수용체, 예를 들어 인간 NK 세포 발현 FcγIIIa 수용체를 발현하는 것으로 공지된 세포주를 사용하여 평가할 수 있다. Fc 도메인, 또는 Fc 도메인을 포함하는 본 발명의 이중특이성 항체의 효과기 기능을 당해 분야에 공지된 방법에 의해 측정할 수 있다. ADCC를 측정하기에 적합한 분석은 본 명세서에 기재되어 있다. 관심 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위한 시험관내 분석의 다른 예들은 미국특허 제 5,500,362 호; 문헌[Hellstrom et al. Proc Natl Acad Sci USA 83, 7059-7063 (1986)] 및 문헌[Hellstrom et al., Proc Natl Acad Sci USA 82, 1499-1502 (1985)]; 미국특허 제 5,821,337 호; 문헌[Bruggemann et al., J Exp Med 166, 1351-1361 (1987)]에 기재되어 있다. 한편으로, 비-방사성 분석 방법이 사용될 수 있다(예를 들어 유식 세포측정을 위한 ACTI(상표) 비-방사성 세포독성 분석(셀테크놀로지 인코포레이티드(CellTechnology, Inc.) 미국 캘리포니아주 마운틴뷰 소재); 및 사이토톡스(CytoTox) 96(등록상표) 비-방사성 세포독성 분석(프로메가(Promega), 미국 위스콘신주 매디슨 소재)을 참조하시오). 상기와 같은 분석에 유용한 효과기 세포는 말초 혈액 단핵세포(PBMC) 및 천연 살해(NK) 세포를 포함한다. 한편으로, 또는 추가로, 상기 관심 분자의 ADCC 활성을 생체내에서, 예를 들어 문헌[Clynes et al., Proc Natl Acad Sci USA 95, 652-656 (1998)]에 개시된 바와 같은 동물 모델에서 평가할 수 있다.
이종이량체화를 촉진하는 Fc 도메인 변형
본 발명의 이중특이성 항원 결합 분자는 상기 Fc 도메인의 2개의 서브유닛 중 하나 또는 다른 하나에 융합된 상이한 항원-결합 부위를 포함하며, 따라서, 상기 Fc 도메인의 2개의 서브유닛은 2개의 동일하지 않은 폴리펩타이드 쇄 중에 포함될 수 있다. 이들 폴리펩타이드의 재조합 공-발현 및 후속 이량체화는 상기 두 폴리펩타이드의 다수의 가능한 조합을 도출한다. 따라서, 재조합체 생산에서 본 발명의 이중특이성 항체의 수율 및 순도를 개선시키기 위해서, 본 발명의 이중특이성 항원 결합 분자의 Fc 도메인에 목적하는 폴리펩타이드의 결합을 촉진하는 변형을 도입시키는 것이 유리할 것이다.
상응하게, 특정한 태양에서 본 발명은 PD1에 특이적으로 결합하는 제1 항원-결합 부위 및 TIM3에 특이적으로 결합하는 제2 항원-결합 부위를 포함하는 이중특이성 항체에 관한 것이며, 여기에서 상기 Fc 도메인은 상기 Fc 도메인의 제1 및 제2 서브유닛의 결합을 촉진하는 변형을 포함한다. 인간 IgG Fc 도메인의 2개 서브유닛간의 가장 광범위한 단백질-단백질 상호작용 부위는 Fc 도메인의 CH3 도메인 중에 있다. 따라서, 하나의 태양에서 상기 변형은 상기 Fc 도메인의 CH3 도메인 중에 있다.
특정한 태양에서 상기 변형은 소위 "놉-인투-홀" 변형으로, 상기 Fc 도메인의 2개의 서브유닛 중 하나에 "놉" 변형 및 상기 Fc 도메인의 2개의 서브유닛 중 다른 하나에 "홀" 변형을 포함한다. 따라서, 본 발명은 PD1에 특이적으로 결합하는 제1 항원-결합 부위 및 TIM3에 특이적으로 결합하는 제2 항원-결합 부위를 포함하는 이중특이성 항체에 관한 것이며, 여기에서 상기 Fc 도메인의 제1 서브유닛은 놉을 포함하고 상기 Fc 도메인의 제2 서브유닛은 상기 놉-인투-홀 방법에 따른 홀을 포함한다. 특정한 태양에서, 상기 Fc 도메인의 제1 서브유닛은 아미노산 치환 S354C 및 T366W(EU 넘버링)를 포함하고 상기 Fc 도메인의 제2 서브유닛은 아미노산 치환 Y349C, T366S 및 Y407V(카밧 EU 지수에 따른 넘버링)를 포함한다.
상기 놉-인투-홀 기술은 예를 들어 미국특허 제 5,731,168 호; 미국특허 제 7,695,936 호; 문헌[Ridgway et al., Prot Eng 9, 617-621 (1996)] 및 문헌[Carter, J Immunol Meth 248, 7-15 (2001)]에 기재되어 있다. 일반적으로, 상기 방법은 돌기("놉")가 이종이량체 형성을 촉진하고 동종이량체 형성을 방해하게 하기 위해서 공동("홀")내에 위치할 수 있도록 상기 돌기를 제1 폴리펩타이드의 접촉면에 도입시키고 제2 폴리펩타이드의 접촉면 중에 상응하는 공동을 도입시킴을 수반한다. 돌기는 상기 제1 폴리펩타이드의 접촉면으로부터의 작은 아미노산 측쇄를 보다 큰 측쇄(예를 들어 타이로신 또는 트립토판)로 교체시킴으로써 구축된다. 상기 돌기와 동일하거나 유사한 크기의 보상 공동이, 큰 아미노산 측쇄를 보다 작은 것(예를 들어 알라닌 또는 쓰레오닌)으로 교체시킴으로써 상기 제2 폴리펩타이드의 접촉면 중에 생성된다.
상응하게, 하나의 태양에서, 본 발명의 이중특이성 항원 결합 분자의 Fc 도메인의 제1 서브유닛의 CH3 도메인에서 아미노산 잔기를 보다 큰 측쇄 부피를 갖는 아미노산 잔기로 교체시키고, 이에 의해 제2 서브유닛의 CH3 도메인내의 공동에 위치할 수 있는 제1 서브유닛의 CH3 도메인내에 돌기를 생성시키고, 상기 Fc 도메인의 제2 서브유닛의 CH3 도메인에서 아미노산 잔기를 보다 작은 측쇄 부피를 갖는 아미노산 잔기로 교체시키고, 이에 의해 제1 서브유닛의 CH3 도메인내의 돌기가 위치할 수 있는 제2 서브유닛의 CH3 도메인내에 공동을 생성시킨다. 상기 돌기 및 공동을, 예를 들어 부위-특이적 돌연변이유발에 의해서, 또는 펩타이드 합성에 의해서 상기 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 변경시킴으로써 생성시킬 수 있다. 특정한 태양에서, 상기 Fc 도메인의 제1 서브유닛의 CH3 도메인에서 366번 위치의 쓰레오닌 잔기를 트립토판 잔기로 교체시키고(T366W), 상기 Fc 도메인의 제2 서브유닛의 CH3 도메인에서 407번 위치의 타이로신 잔기를 발린 잔기로 교체시킨다(Y407V). 하나의 태양에서, 상기 Fc 도메인의 제2 서브유닛에서, 추가로 366번 위치의 쓰레오닌 잔기를 세린 잔기로 교체시키고(T366S) 368번 위치의 류신 잔기를 알라닌 잔기로 교체시킨다(L368A).
더욱 추가의 태양에서, 상기 Fc 도메인의 제1 서브유닛에서 추가로 354번 위치의 세린 잔기를 시스테인 잔기로 교체시키고(S354C), 상기 Fc 도메인의 제2 서브유닛에서 추가로 349번 위치의 타이로신 잔기를 시스테인 잔기로 교체시킨다(Y349C). 이들 두 시스테인 잔기의 도입은 상기 Fc 도메인의 2개 서브유닛간에 다이설파이드 가교를 형성시키며, 이는 상기 이량체를 추가로 안정화시킨다(문헌[Carter (2001), J Immunol Methods 248, 7-15]). 특정한 태양에서, 상기 Fc 도메인의 제1 서브유닛은 아미노산 치환 S354C 및 T366S(EU 넘버링)를 포함하고 상기 Fc 도메인의 제2 서브유닛은 아미노산 치환 Y349C, T366S 및 Y407V(카밧 EU 지수에 따른 넘버링)를 포함한다.
그러나 또한 EP 1 870 459에 기재된 바와 같은 다른 놉-인투-홀 기술들을 대신하여 또는 추가로 사용할 수 있다. 하나의 실시태양에서 상기 다중특이성 항체는 상기 "놉 쇄"의 CH3 도메인에 돌연변이 R409D 및 K370E 및 상기 "홀-쇄"의 CH3 도메인 중에 돌연변이 D399K 및 E357K를 포함한다(카밧 EU 지수에 따른 넘버링).
하나의 태양에서, 상기 이중특이성 항체는 "놉 쇄"의 CH3 도메인에 T366W 돌연변이 및 "홀 쇄"의 CH3 도메인에 돌연변이 T366S, L368A 및 Y407V, 및 추가로 상기 "놉 쇄"의 CH3 도메인에 돌연변이 R409D 및 K370E 및 상기 "홀 쇄"의 CH3 도메인에 돌연변이 D399K 및 E357K를 포함한다(카밧 EU 지수에 따른 넘버링).
하나의 태양에서, 상기 이중특이성 항체는 2개의 CH3 도메인 중 하나에 돌연변이 Y349C 및 T366W 및 상기 2개의 CH3 도메인 중 다른 하나에 돌연변이 S354C, T366S, L368A 및 Y407V를 포함하거나, 또는 상기 다중특이성 항체는 2개의 CH3 도메인 중 하나에 돌연변이 Y349C 및 T366W 및 상기 2개의 CH3 도메인 중 다른 하나에 돌연변이 S354C, T366S, L368A 및 Y407V 및 추가로 상기 "놉 쇄"의 CH3 도메인 중에 돌연변이 R409D 및 K370E 및 상기 "홀 쇄"의 CH3 도메인 중에 돌연변이 D399K 및 E347K(카밧 EU 지수에 따른 넘버링)를 포함한다.
또 다른 태양에서, 상기 Fc 도메인의 제1 및 제2 서브유닛의 결합을 촉진하는 변형은 예를 들어 PCT 공보 WO 2009/089004에 기재된 바와 같은 정전기적 조타 효과를 매개하는 변형을 포함한다. 일반적으로, 상기 방법은 상기 2개의 Fc 도메인 서브유닛의 접촉면에서, 하나 이상의 아미노산 잔기를 동종이량체 형성은 정전기적으로 불리하게 되지만 이종이량체화는 정전기적으로 유리하게 되도록 하전된 아미노산 잔기에 의해 교체시킴을 수반한다.
상기 "놉-인투-홀 기술"과 별개로 이종이량체화를 실행하기 위해 다중특이성 항체의 중쇄의 CH3 도메인을 변형시키기 위한 다른 기법들이 당해 분야에 공지되어 있다. 이들 기술, 특히 WO 96/27011, WO 98/050431, EP 1870459, WO 2007/110205, WO 2007/147901, WO 2009/089004, WO 2010/129304, WO 2011/90754, WO 2011/143545, WO 2012/058768, WO 2013/157954 및 WO 2013/096291에 기재된 것들이 본 명세서에서 이중특이성 항체와 함께 상기 "놉-인투-홀 기술"에 대한 대안으로서 간주된다.
하나의 태양에서, 상기 이중특이성 항체에서 EP 1870459에 기재된 접근법을 사용하여 상기 다중특이성 항체의 제1 중쇄 및 제2 중쇄의 이종이량체화를 지지한다. 이러한 접근법은 상기 제1 및 제2 중쇄 둘 다의 사이의 CH3/CH3-도메인-접촉면 중의 특이적인 아미노산 위치에 반대 전하를 갖는 하전된 아미노산을 도입시킴을 기본으로 한다.
상응하게, 상기 태양에서 상기 다중특이성 항체의 3차 구조에서 상기 제1 중쇄의 CH3 도메인 및 상기 제2 중쇄의 CH3 도메인은 각 항체 CH3 도메인 사이에 위치하는 접촉면을 형성시키며, 여기에서 상기 제1 중쇄의 CH3 도메인의 각 아미노산 서열 및 상기 제2 중쇄의 CH3 도메인의 아미노산 서열은 각각 상기 항체의 3차 구조 중의 상기 접촉면내에 위치하는 일련의 아미노산을 포함하고, 여기에서 하나의 중쇄의 CH3 도메인 중의 접촉면 중에 위치하는 아미노산 세트로부터 제 1 아미노산이 양으로 하전된 아미노산에 의해 치환되고 상기 다른 중쇄의 CH3 도메인 중의 접촉면 중에 위치하는 아미노산 세트로부터 제 2 아미노산이 음으로 하전된 아미노산에 의해 치환된다. 상기 태양에 따른 이중특이성 항체를 본 명세서에서 또한 "CH3(+/-)-조작된 이중특이성 항체"(여기에서 약어 "+/-"는 각 CH3 도메인 중에 도입된 반대로 하전된 아미노산들을 나타낸다)라 칭한다.
하나의 태양에서, 상기 CH3(+/-)-조작된 이중특이성 항체에서 양으로 하전된 아미노산은 K, R 및 H 중에서 선택되고, 음으로 하전된 아미노산은 E 또는 D 중에서 선택된다.
하나의 태양에서, 상기 CH3(+/-)-조작된 이중특이성 항체에서 양으로 하전된 아미노산은 K 및 R 중에서 선택되고, 음으로 하전된 아미노산은 E 또는 D 중에서 선택된다.
하나의 태양에서, 상기 CH3(+/-)-조작된 이중특이성 항체에서 양으로 하전된 아미노산은 K이고, 음으로 하전된 아미노산은 E이다.
하나의 태양에서, 상기 하나의 중쇄의 CH3 도메인 중의 CH3(+/-)-조작된 이중특이성 항체에서 409번 위치의 아미노산 R은 D에 의해 치환되고 위치의 아미노산 K는 E에 의해 치환되며, 다른 중쇄의 CH3 도메인에서 399번 위치의 아미노산 D는 K에 의해 치환되고 357번 위치의 아미노산 E는 K에 의해 치환된다(카밧 EU 지수에 따른 넘버링).
하나의 태양에서, WO 2013/157953에 기재된 접근법을 사용하여 상기 다중특이성 항체의 제1 중쇄 및 제2 중쇄의 이종이량체화를 지지한다. 하나의 실시태양에서 하나의 중쇄의 CH3 도메인에서 366번 위치의 아미노산 T는 K에 의해 치환되고, 다른 중쇄의 CH3 도메인에서 351번 위치의 아미노산 L은 D에 의해 치환된다(카밧 EU 지수에 따른 넘버링). 또 다른 실시태양에서 하나의 중쇄의 CH3 도메인에서 366번 위치의 아미노산 T는 K에 의해 치환되고 351번 위치의 아미노산 L은 K에 의해 치환되며, 다른 중쇄의 CH3 도메인에서 351번 위치의 아미노산 L은 D에 의해 치환된다(카밧 EU 지수에 따른 넘버링).
또 다른 실시태양에서 하나의 중쇄의 CH3 도메인에서 366번 위치의 아미노산 T는 K에 의해 치환되고 351번 위치의 아미노산 L은 K에 의해 치환되며, 다른 중쇄의 CH3 도메인에서 351번 위치의 아미노산 L은 D에 의해 치환된다(카밧 EU 지수에 따른 넘버링). 추가로 하기의 치환들 중 적어도 하나가 다른 중쇄의 CH3 도메인 중에 포함된다: 349번 위치의 아미노산 Y는 E에 의해 치환되고, 349번 위치의 아미노산 Y는 D에 의해 치환되고, 368번 위치의 아미노산 L은 E에 의해 치환된다(카밧 EU 지수에 따른 넘버링). 하나의 실시태양에서 368번 위치의 아미노산 L은 E에 의해 치환된다(카밧 EU 지수에 따른 넘버링).
하나의 태양에서, WO 2012/058768에 기재된 접근법을 사용하여 상기 다중특이성 항체의 제1 중쇄 및 제2 중쇄의 이종이량체화를 지지한다. 하나의 태양에서 하나의 중쇄의 CH3 도메인에서 351번 위치의 아미노산 L은 Y에 의해 치환되고 407번 위치의 아미노산 Y는 A에 의해 치환되며, 다른 중쇄의 CH3 도메인에서 366번 위치의 아미노산 T는 A에 의해 치환되고 409번 위치의 아미노산 K는 F에 의해 치환된다(카밧 EU 지수에 따른 넘버링). 또 다른 실시태양에서 상기 언급한 치환들 외에, 상기 다른 중쇄의 CH3 도메인에서 411번 위치(원래 T), 399번 위치(원래 D), 400번 위치(원래 S), 405번 위치(원래 F), 390번 위치(원래 N), 및 392번 위치(원래 K)의 아미노산들 중 적어도 하나가 치환된다(카밧 EU 지수에 따른 넘버링). 바람직한 치환은 하기와 같다:
- 411번 위치의 아미노산 T의, N, R, Q, K, D, E 및 W(카밧 EU 지수에 따른 넘버링) 중에서 선택된 아미노산에 의한 치환,
- 399번 위치의 아미노산 D의, R, W, Y 및 K(카밧 EU 지수에 따른 넘버링) 중에서 선택된 아미노산에 의한 치환,
- 400번 위치의 아미노산 S의, E, D, R 및 K(카밧 EU 지수에 따른 넘버링) 중에서 선택된 아미노산에 의한 치환,
- 405번 위치의 아미노산 F의, I, M, T, S, V 및 W(카밧 EU 지수에 따른 넘버링) 중에서 선택된 아미노산에 의한 치환,
- 390번 위치의 아미노산 N의, R, K 및 D(카밧 EU 지수에 따른 넘버링) 중에서 선택된 아미노산에 의한 치환,
- 392번 위치의 아미노산 K의, V, M, R, L, F 및 E(카밧 EU 지수에 따른 넘버링) 중에서 선택된 아미노산에 의한 치환.
또 다른 태양에서, 상기 이중특이성 항체를 WO 2012/058768에 따라 조작한다, 즉 하나의 중쇄의 CH3 도메인에서 351번 위치의 아미노산 L을 Y에 의해 치환시키고 407번 위치의 아미노산 Y를 A에 의해 치환시키며, 다른 중쇄의 CH3 도메인에서 366번 위치의 아미노산 T를 V에 의해 치환시키고 409번 위치의 아미노산 K를 F에 의해 치환시킨다(카밧 EU 지수에 따른 넘버링). 상기 다중특이성 항체의 또 다른 실시태양에서 하나의 중쇄의 CH3 도메인에서 407번 위치의 아미노산 Y를 A에 의해 치환시키고, 다른 중쇄의 CH3 도메인에서 366번 위치의 아미노산 T를 A에 의해 치환시키고 409번 위치의 아미노산 K를 F에 의해 치환시킨다(카밧 EU 지수에 따른 넘버링). 최종의 상기 언급한 실시태양에서, 상기 다른 중쇄의 CH3 도메인에서 392번 위치의 아미노산 K를 E에 의해 치환시키고, 411번 위치의 아미노산 T를 E에 의해 치환시키고, 399번 위치의 아미노산 D를 R에 의해 치환시키고, 400번 위치의 아미노산 S를 R에 의해 치환시킨다(카밧 EU 지수에 따른 넘버링).
하나의 태양에서, WO 2011/143545에 기재된 접근법을 사용하여 상기 다중특이성 항체의 제1 중쇄 및 제2 중쇄의 이종이량체화를 지지한다. 하나의 태양에서, 상기 2개의 중쇄 모두의 CH3 도메인에서 아미노산 변형을 368번 및/또는 409번 위치에 도입시킨다(카밧 EU 지수에 따른 넘버링).
하나의 태양에서, WO 2011/090762에 기재된 접근법을 사용하여 상기 이중특이성 항체의 제1 중쇄 및 제2 중쇄의 이종이량체화를 지지한다. WO 2011/090762는 "놉-인투-홀"(KiH) 기술에 따른 아미노산 변형에 관한 것이다. 하나의 실시태양에서 하나의 중쇄의 CH3 도메인에서 366번 위치의 아미노산 T는 W에 의해 치환되고, 다른 중쇄의 CH3 도메인에서 407번 위치의 아미노산 Y는 A에 의해 치환된다(카밧 EU 지수에 따른 넘버링). 또 다른 실시태양에서 하나의 중쇄의 CH3 도메인에서 366번 위치의 아미노산 T는 Y에 의해 치환되고, 다른 중쇄의 CH3 도메인에서 407번 위치의 아미노산 Y는 T에 의해 치환된다(카밧 EU 지수에 따른 넘버링).
하나의 태양에서, WO 2009/089004에 기재된 접근법을 사용하여 상기 이중특이성 항체의 제1 중쇄 및 제2 중쇄의 이종이량체화를 지지한다. 하나의 실시태양에서 하나의 중쇄의 CH3 도메인에서 392번 위치의 아미노산 K 또는 N은 음으로 하전된 아미노산(하나의 실시태양에서 E 또는 D에 의해, 하나의 바람직한 실시태양에서 D에 의해)에 의해 치환되고, 다른 중쇄의 CH3 도메인에서 399번 위치의 아미노산 D, 356번 위치의 아미노산 E 또는 D 또는 357번 위치의 아미노산 E는 양으로 하전된 아미노산(하나의 실시태양에서 K 또는 R, 하나의 바람직한 실시태양에서 K에 의해, 하나의 바람직한 실시태양에서 399 또는 356번 위치의 아미노산은 K에 의해 치환된다)에 의해 치환된다(카밧 EU 지수에 따른 넘버링). 하나의 추가의 실시태양에서, 상기 언급한 치환 외에, 하나의 중쇄의 CH3 도메인에서 409번 위치의 아미노산 K 또는 R은 음으로 하전된 아미노산(하나의 실시태양에서 E 또는 D에 의해, 하나의 바람직한 실시태양에서 D에 의해)에 의해 치환된다(카밧 EU 지수에 따른 넘버링). 하나의 훨씬 추가의 태양에서, 상기 언급한 치환 외에 또는 상기에 대신하여, 하나의 중쇄의 CH3 도메인에서 439번 위치의 아미노산 K 및/또는 370번 위치의 아미노산 K는 독립적으로 음으로 하전된 아미노산(하나의 실시태양에서 E 또는 D에 의해, 하나의 바람직한 실시태양에서 D에 의해)에 의해 서로 치환된다(카밧 EU 지수에 따른 넘버링).
하나의 태양에서, WO 2007/147901에 기재된 접근법을 사용하여 상기 다중특이성 항체의 제1 중쇄 및 제2 중쇄의 이종이량체화를 지지한다. 하나의 실시태양에서 하나의 중쇄의 CH3 도메인에서 253번 위치의 아미노산 K는 E에 의해 치환되고, 282번 위치의 아미노산 D는 K에 의해 치환되고, 322번 위치의 아미노산 K는 D에 의해 치환되고, 다른 중쇄의 CH3 도메인에서 239번 위치의 아미노산 D는 K에 의해 치환되고, 240번 위치의 아미노산 E는 K에 의해 치환되고, 292번 위치의 아미노산 K는 D에 의해 치환된다(카밧 EU 지수에 따른 넘버링).
본 명세서에 보고된 바와 같은 이중특이성 항체의 중쇄의 C-말단은 아미노산 잔기 PGK로 종결되는 완전한 C-말단일 수 있다. 상기 중쇄의 C-말단은 상기 C 말단 아미노산 잔기 중 하나 또는 2개가 제거된 단축된 C-말단일 수 있다. 하나의 바람직한 태양에서, 상기 중쇄의 C-말단은 PG로 종결되는 단축된 C-말단이다.
본 명세서에 보고된 바와 같은 모든 태양 중 하나의 태양에서, 본 명세서에 명시된 바와 같은 C-말단 CH3 도메인을 포함하는 중쇄를 포함하는 이중특이성 항체는 C-말단 글리신-리신 다이펩타이드(G446 및 K447, 카밧 EU 지수에 따른 넘버링)를 포함한다. 본 명세서에 보고된 바와 같은 모든 태양 중 하나의 실시태양에서, 본 명세서에 명시된 바와 같은 C-말단 CH3 도메인을 포함하는 중쇄를 포함하는 이중특이성 항체는 C-말단 글리신 잔기(G446, 카밧 EU 지수에 따른 넘버링)를 포함한다.
Fab 도메인의 변형
하나의 태양에서, 본 발명은 PD1에 특이적으로 결합하는 제1 Fab 단편 및 TIM3에 특이적으로 결합하는 제2 Fab 단편에 관한 것이며, 여기에서 상기 Fab 단편들 중 하나에서 가변 도메인 VH 및 VL 또는 불변 도메인 CH1 및 CL이 교환된다. 상기 이중특이성 항체를 크로스맵(Crossmab) 기술에 따라 제조한다.
하나의 결합 가지에 도메인 교체/교환을 갖는 다중특이성 항체(CrossMabVH-VL 또는 CrossMabCH-CL)가 WO2009/080252 및 문헌[Schaefer, W. et al, PNAS, 108 (2011) 11187-1191]에 상세히 기재되어 있다. 상기는 제1 항원에 대한 경쇄와 제2 항원에 대한 틀린 중쇄와의 오합치에 의해 야기되는 부산물을 명백히 감소시킨다(상기와 같은 도메인 교환이 없는 접근법에 비해).
특정한 태양에서, 본 발명은 PD1에 특이적으로 결합하는 제1 Fab 단편 및 TIM3에 특이적으로 결합하는 제2 Fab 단편을 포함하는 이중특이성 항체에 관한 것이며, 여기에서 상기 Fab 단편들 중 하나에서 가변 도메인 VL 및 VH는, 상기 VH 도메인이 경쇄의 부분이고 상기 VL 도메인이 중쇄의 부분이도록 서로에 의해 교체된다. 특정한 태양에서, 상기 이중특이성 항체는 PD1에 특이적으로 결합하는 항원-결합 부위를 포함하는 제1 Fab 단편에서 상기 가변 도메인 VL 및 VH가 서로에 의해 교체된 것이다.
또 다른 태양에서, 및 올바른 짝짓기를 추가로 개선시키기 위해서, PD1에 특이적으로 결합하는 제1 Fab 단편 및 TIM3에 특이적으로 결합하는 제2 Fab 단편을 포함하는 이중특이성 항체는 상이한 하전된 아미노산 치환을 함유할 수 있다(소위 "하전된 잔기"). 이러한 변형을 교차된 또는 교차되지 않은 CH1 및 CL 도메인에 도입시킨다.
특정한 태양에서, 본 발명은 PD1에 특이적으로 결합하는 제1 Fab 단편 및 TIM3에 특이적으로 결합하는 제2 Fab 단편을 포함하는 이중특이성 항체와 관련되며, 여기에서 상기 Fab 단편 중 하나에서 불변 도메인 CL 중 124번 위치의 아미노산이 리신(K), 아르기닌(R) 또는 히스티딘(H)(카밧 EU 지수에 따른 넘버링)에 의해 독립적으로 치환되고, 불변 도메인 CH1 중 147번 및 213번 위치의 아미노산이 글루탐산(E) 또는 아스파트산(D)(카밧 EU 지수에 따른 넘버링)에 의해 독립적으로 치환된다. 특정한 태양에서, 상기 이중특이성 항체는, TIM3에 특이적으로 결합하는 항원-결합 부위를 포함하는 제2 Fab 단편에서 불변 도메인 CL 중 124번 위치의 아미노산이 리신(K), 아르기닌(R) 또는 히스티딘(H)(카밧 EU 지수에 따른 넘버링)에 의해 독립적으로 치환되고, 불변 도메인 CH1 중 147번 및 213번 위치의 아미노산이 글루탐산(E) 또는 아스파트산(D)(카밧 EU 지수에 따른 넘버링)에 의해 독립적으로 치환되는 것이다.
특정한 태양에서, 본 발명은 PD1에 특이적으로 결합하는 제1 Fab 단편 및 TIM3에 특이적으로 결합하는 제2 Fab 단편을 포함하는 이중특이성 항체에 관한 것이며, 여기에서 CL 도메인 중 하나에서 123번 위치(EU 넘버링)의 아미노산은 아르기닌(R)에 의해 교체되었고 124번 위치(EU 넘버링)의 아미노산은 리신(K)으로 치환되었으며, 여기에서 CH1 도메인 중 하나에서 147번 위치(EU 넘버링) 및 213번 위치(EU 넘버링)의 아미노산들은 글루탐산(E)에 의해 치환되었다. 특정한 태양에서, 상기 이중특이성 항체는 TIM3에 특이적으로 결합하는 항원-결합 부위를 포함하는 제2 Fab 단편에서 123번 위치(EU 넘버링)의 아미노산이 아르기닌(R)에 의해 교체되었고 124번 위치(EU 넘버링)의 아미노산이 리신(K)으로 치환되었으며, 여기에서 CH1 도메인 중 하나에서 147번 위치(EU 넘버링) 및 213번 위치(EU 넘버링)의 아미노산들이 글루탐산(E)에 의해 치환된 것이다.
추가의 태양에서, 상기 이중특이성 항체는
a) 제1 항원에 특이적으로 결합하는 항체의 제1 경쇄 및 제1 중쇄, 및
b) 제2 항원에 특이적으로 결합하는 항체의 제2 경쇄 및 제2 중쇄
를 포함하는 2가 항체이며, 여기에서 상기 제2 경쇄 및 상기 제2 중쇄의 불변 도메인 VL 및 VH는 서로에 의해 교체된다.
상기 a) 하의 항체는 b) 하에 보고된 바와 같은 변형을 함유하지 않으며 상기 a) 하의 중쇄 및 경쇄는 단리된 쇄들이다.
상기 b) 하의 항체에서 상기 경쇄 내에서 가변 경쇄 도메인 VL은 상기 항체의 가변 중쇄 도메인 VH에 의해 교체되고, 상기 중쇄 내에서 가변 중쇄 도메인 VH는 상기 항체의 가변 경쇄 도메인 VL에 의해 교체된다.
하나의 태양에서, (i) a) 하의 제1 경쇄의 불변 도메인 CL에서 124번 위치(카밧에 따른 넘버링)의 아미노산은 양으로 하전된 아미노산에 의해 치환되고, 여기에서 상기 a) 하의 제1 중쇄의 불변 도메인 CH1에서 147번 위치의 아미노산 또는 213번 위치(카밧 EU 지수에 따른 넘버링)의 아미노산은 음으로 하전된 아미노산에 의해 치환되거나, 또는 (ii) b) 하의 제2 경쇄의 불변 도메인 CL에서 124번 위치(카밧에 따른 넘버링)의 아미노산은 양으로 하전된 아미노산에 의해 치환되고, 여기에서 상기 b) 하의 제2 중쇄의 불변 도메인 CH1에서 147번 위치의 아미노산 또는 213번 위치(카밧 EU 지수에 따른 넘버링)의 아미노산은 음으로 하전된 아미노산에 의해 치환된다.
또 다른 태양에서, (i) a) 하의 제1 경쇄의 불변 도메인 CL에서 124번 위치의 아미노산은 리신(K), 아르기닌(R) 또는 히스티딘(H)(카밧 EU 지수에 따른 넘버링)(하나의 바람직한 실시태양에서 독립적으로 리신(K) 또는 아르기닌(R)에 의해)에 의해 독립적으로 치환되고, 여기에서 a) 하의 제1 중쇄의 불변 도메인 CH1에서 147번 위치의 아미노산 또는 213번 위치의 아미노산은 글루탐산(E) 또는 아스파트산(D)(카밧 EU 지수에 따른 넘버링)에 의해 독립적으로 치환되거나, 또는 (ii) b) 하의 제2 경쇄의 불변 도메인 CL에서 124번 위치의 아미노산은 리신(K), 아르기닌(R) 또는 히스티딘(H)(카밧 EU 지수에 따른 넘버링)(하나의 바람직한 실시태양에서 독립적으로 리신(K) 또는 아르기닌(R)에 의해)에 의해 독립적으로 치환되고, 여기에서 b) 하의 제2 중쇄의 불변 도메인 CH1에서 147번 위치의 아미노산 또는 213번 위치의 아미노산은 글루탐산(E) 또는 아스파트산(D)(카밧 EU 지수에 따른 넘버링)에 의해 독립적으로 치환된다.
하나의 태양에서, 상기 제2 중쇄의 불변 도메인 CL에서 124번 및 123번 위치의 아미노산들은 K에 의해 치환된다(카밧 EU 지수에 따른 넘버링).
하나의 태양에서, 상기 제2 중쇄의 불변 도메인 CL에서 123번 위치의 아미노산은 R에 의해 치환되고 124번 위치의 아미노산은 K에 의해 치환된다(카밧 EU 지수에 따른 넘버링).
하나의 태양에서, 상기 제2 경쇄의 불변 도메인 CH1에서 147번 및 213번 위치의 아미노산들은 E에 의해 치환된다(카밧 EU 지수에 따른 넘버링).
하나의 태양에서, 상기 제1 경쇄의 불변 도메인 CL에서 124 및 123번 위치의 아미노산들은 K에 의해 치환되고, 상기 제1 중쇄의 불변 도메인 CH1에서 147번 및 213번 위치의 아미노산들은 E에 의해 치환된다(카밧 EU 지수에 따른 넘버링).
하나의 태양에서, 상기 제1 경쇄의 불변 도메인 CL에서 123번 위치의 아미노산은 R에 의해 치환되고 124번 위치의 아미노산은 K에 의해 치환되며, 상기 제1 중쇄의 불변 도메인 CH1에서 147번 및 213번 위치의 아미노산들은 모두 E에 의해 치환된다(카밧 EU 지수에 따른 넘버링).
하나의 태양에서, 상기 제2 중쇄의 불변 도메인 CL에서 124번 및 123번 위치의 아미노산들은 K에 의해 치환되고, 여기에서 상기 제2 경쇄의 불변 도메인 CH1에서 147번 및 213번 위치의 아미노산들은 E에 의해 치환되며, 상기 제1 경쇄의 가변 도메인 VL에서 38번 위치의 아미노산은 K에 의해 치환되고, 상기 제1 중쇄의 가변 도메인 VH에서 39번 위치의 아미노산은 E에 의해 치환되고, 상기 제2 중쇄의 가변 도메인 VL에서 38번 위치의 아미노산은 K에 의해 치환되며, 상기 제2 경쇄의 가변 도메인 VH에서 39번 위치의 아미노산은 E에 의해 치환된다(카밧 EU 지수에 따른 넘버링).
하나의 태양에서, 상기 이중특이성 항체는
a) 제1 항원에 특이적으로 결합하는 항체의 제1 경쇄 및 제1 중쇄, 및
b) 제2 항원에 특이적으로 결합하는 항체의 제2 경쇄 및 제2 중쇄
를 포함하는 2가 항체이며, 여기에서 상기 제2 경쇄 및 상기 제2 중쇄의 불변 도메인 VL 및 VH는 서로에 의해 교체되고, 상기 제2 경쇄 및 상기 제2 중쇄의 불변 도메인 CL 및 CH1은 서로에 의해 교체된다.
상기 a) 하의 항체는 b) 하에 보고된 바와 같은 변형을 함유하지 않으며 상기 a) 하의 중쇄 및 경쇄는 단리된 쇄들이다. 상기 b) 하의 항체에서 상기 경쇄 내에서 가변 경쇄 도메인 VL은 상기 항체의 가변 중쇄 도메인 VH에 의해 교체되고, 상기 불변 경쇄 도메인 CL은 상기 항체의 불변 중쇄 도메인 CH1에 의해 교체되며; 상기 중쇄 내에서 가변 중쇄 도메인 VH는 상기 항체의 가변 경쇄 도메인 VL에 의해 교체되고, 상기 불변 중쇄 도메인 CH1은 상기 항체의 불변 경쇄 도메인 CL에 의해 교체된다.
하나의 태양에서, 상기 이중특이성 항체는
a) 제1 항원에 특이적으로 결합하는 항체의 제1 경쇄 및 제1 중쇄, 및
b) 제2 항원에 특이적으로 결합하는 항체의 제2 경쇄 및 제2 중쇄
를 포함하는 2가 항체이며, 여기에서 상기 제2 경쇄 및 상기 제2 중쇄의 불변 도메인 CL 및 CH1은 서로에 의해 교체된다.
상기 a) 하의 항체는 b) 하에 보고된 바와 같은 변형을 함유하지 않으며 상기 a) 하의 중쇄 및 경쇄는 단리된 쇄들이다. 상기 b) 하의 항체에서 상기 경쇄 내에서 불변 경쇄 도메인 CL은 상기 항체의 불변 중쇄 도메인 CH1에 의해 교체되고; 상기 중쇄 내에서 불변 중쇄 도메인 CH1은 상기 항체의 불변 경쇄 도메인 CL에 의해 교체된다.
하나의 태양에서, 상기 다중특이성 항체는
a) 제1 항원에 특이적으로 결합하고 2개의 항체 중쇄 및 2개의 항체 경쇄로 이루어지는 완전길이 항체, 및
b) 1 내지 4개의 추가의 항원에 특이적으로 결합하는(즉 제2 및/또는 제3 및/또는 제4 및/또는 제5 항원, 바람직하게는 하나의 추가의 항원, 즉 제2 항원에 특이적으로 결합하는) 1, 2, 3 또는 4개의 단쇄 Fab 단편
을 포함하는 다중특이성 항체이며, 여기에서 상기 b) 하의 단쇄 Fab 단편은 상기 완전길이 항체의 중쇄 또는 경쇄의 C- 또는 N-말단에서 펩타이드 링커를 통해 상기 a) 하의 완전길이 항체에 융합된다.
하나의 태양에서, 제2 항원에 결합하는 1 또는 2개의 동일한 단쇄 Fab 단편은 상기 완전길이 항체의 중쇄 또는 경쇄의 C 말단에서 펩타이드 링커를 통해 상기 완전길이 항체에 융합된다.
하나의 태양에서, 제2 항원에 결합하는 1 또는 2개의 동일한 단쇄 Fab 단편은 상기 완전길이 항체의 중쇄의 C 말단에서 펩타이드 링커를 통해 상기 완전길이 항체에 융합된다.
하나의 태양에서, 제2 항원에 결합하는 1 또는 2개의 동일한 단쇄 Fab 단편은 상기 완전길이 항체의 경쇄의 C 말단에서 펩타이드 링커를 통해 상기 완전길이 항체에 융합된다.
하나의 태양에서, 제2 항원에 결합하는 2개의 동일한 단쇄 Fab 단편은 상기 완전길이 항체의 각 중쇄 또는 경쇄의 C 말단에서 펩타이드 링커를 통해 상기 완전길이 항체에 융합된다.
하나의 태양에서, 제2 항원에 결합하는 2개의 동일한 단쇄 Fab 단편은 상기 완전길이 항체의 각 중쇄의 C 말단에서 펩타이드 링커를 통해 상기 완전길이 항체에 융합된다.
하나의 태양에서, 제2 항원에 결합하는 2개의 동일한 단쇄 Fab 단편은 상기 완전길이 항체의 각 경쇄의 C 말단에서 펩타이드 링커를 통해 상기 완전길이 항체에 융합된다.
하나의 태양에서, 상기 이중특이성 항체는
a) 제1 항원에 특이적으로 결합하고 2개의 항체 중쇄 및 2개의 항체 경쇄로 이루어지는 완전길이 항체, 및
b) ba) 항체 중쇄 가변 도메인(VH), 또는
bb) 항체 중쇄 가변 도메인(VH) 및 항체 불변 도메인 1(CH1)
으로 이루어지는 제1 폴리펩타이드(여기에서 상기 제1 폴리펩타이드는 상기 완전길이 항체의 2개의 중쇄 중 하나의 C-말단에 펩타이드 링커를 통해 그의 VH 도메인의 N-말단과 융합된다)
c) ca) 항체 경쇄 가변 도메인(VL), 또는
cb) 항체 경쇄 가변 도메인(VL) 및 항체 경쇄 불변 도메인(CL)
으로 이루어지는 제2 폴리펩타이드(여기에서 상기 제2 폴리펩타이드는 상기 완전길이 항체의 2개의 중쇄 중 다른 하나의 C-말단에 펩타이드 링커를 통해 VL 도메인의 N-말단과 융합된다)
를 포함하는 3가 항체이며, 여기에서 상기 제1 폴리펩타이드의 항체 중쇄 가변 도메인(VH) 및 상기 제2 폴리펩타이드의 항체 경쇄 가변 도메인(VL)은 함께 제2 항원에 특이적으로 결합하는 항원-결합 부위를 형성한다.
하나의 태양에서, b) 하의 폴리펩타이드의 항체 중쇄 가변 도메인(VH) 및 c) 하의 폴리펩타이드의 항체 경쇄 가변 도메인(VL)은 하기 위치들 사이에 다이설파이드 결합의 도입에 의해 쇄간 다이설파이드 가교를 통해 연결되고 안정화된다:
(i) 중쇄 가변 도메인 44번 위치 내지 경쇄 가변 도메인 100번 위치, 또는
(ii) 중쇄 가변 도메인 105번 위치 내지 경쇄 가변 도메인 43번 위치, 또는
(iii) 중쇄 가변 도메인 101번 위치 내지 경쇄 가변 도메인 100번 위치(항상 카밧 EU 지수에 따른 넘버링).
안정화를 위해 비천연 다이설파이드 가교를 도입시키는 기법은 예를 들어 WO 94/029350, 문헌[Rajagopal, V., et al., Prot. Eng. (1997) 1453-1459]; 문헌[Kobayashi, H., et al., Nucl. Med. Biol. 25 (1998) 387-393]; 및 문헌[Schmidt, M., et al., Oncogene 18 (1999) 1711-1721]에 기재되어 있다. 하나의 실시태양에서 상기 b) 및 c) 하의 폴리펩타이드의 가변 도메인들 사이의 임의의 다이설파이드 결합은 중쇄 가변 도메인 44번 위치와 경쇄 가변 도메인 100번 위치 사이이다. 하나의 실시태양에서 상기 b) 및 c) 하의 폴리펩타이드의 가변 도메인들 사이의 임의의 다이설파이드 결합은 중쇄 가변 도메인 105번 위치와 경쇄 가변 도메인 43번 위치 사이이다(항상 카밧에 따른 넘버링). 하나의 실시태양에서 상기 단쇄 Fab 단편의 가변 도메인 VH 및 VL 사이에 상기 임의의 다이설파이드 안정화가 없는 4가의 이중특이성 항체가 바람직하다.
하나의 태양에서, 상기 이중특이성 항체는
a) 제1 항원에 특이적으로 결합하는 완전길이 항체의 제1 경쇄 및 제1 중쇄, 및
b) 제2 항원에 특이적으로 결합하는 완전길이 항체의 제2(변형된) 경쇄 및 제2(변형된) 중쇄(여기에서 상기 가변 도메인 VL 및 VH는 서로에 의해 교체되고/되거나 상기 불변 도메인 CL 및 CH1은 서로에 의해 교체된다)
를 포함하고,
c) 하나 또는 2개의 추가의 항원(즉 제3 및/또는 제4 항원)에 특이적으로 결합하는 1 내지 4개의 항원 결합 펩타이드가 a) 및/또는 b)의 경쇄 또는 중쇄의 C- 또는 N-말단에 펩타이드 링커를 통해 융합되는
삼중 특이성 또는 사중특이성 항체이다.
상기 a) 하의 항체는 b) 하에 보고된 바와 같은 변형을 함유하지 않고 상기 a) 하의 중쇄 및 경쇄는 단리된 쇄들이다.
하나의 태양에서, 상기 삼중특이성 또는 사중특이성 항체는 c) 하에서 하나 또는 2개의 추가의 항원에 특이적으로 결합하는 하나 또는 2개의 항원 결합 펩타이드를 포함한다.
하나의 태양에서, 상기 항원 결합 펩타이드는 scFv 단편 및 scFab 단편의 그룹 중에서 선택된다.
하나의 태양에서, 상기 항원 결합 펩타이드는 scFv 단편이다.
하나의 태양에서, 상기 항원 결합 펩타이드는 scFab 단편이다.
하나의 태양에서, 상기 항원 결합 펩타이드는 a) 및/또는 b)의 중쇄의 C-말단에 융합된다.
하나의 태양에서, 상기 삼중특이성 또는 사중특이성 항체는 c) 하에서 하나의 추가의 항원에 특이적으로 결합하는 하나 또는 2개의 항원 결합 펩타이드를 포함한다.
하나의 태양에서, 상기 삼중특이성 또는 사중특이성 항체는 c) 하에서 제3 항원에 특이적으로 결합하는 2개의 동일한 항원 결합 펩타이드를 포함한다. 하나의 바람직한 실시태양에서 상기와 같은 2개의 동일한 항원 결합 펩타이드는 둘 다 a) 및 b)의 중쇄의 C-말단에 동일한 펩타이드 링커를 통해 융합된다. 하나의 바람직한 실시태양에서 상기 2개의 동일한 항원 결합 펩타이드는 scFv 단편 또는 scFab 단편이다.
하나의 태양에서, 상기 삼중특이성 또는 사중특이성 항체는 c) 하에서 제3 및 제4 항원에 특이적으로 결합하는 2개의 항원 결합 펩타이드를 포함한다. 하나의 실시태양에서 상기 2개의 항원 결합 펩타이드는 둘 다 a) 및 b)의 중쇄의 C-말단에 동일한 펩타이드 연결자를 통해 융합된다. 하나의 바람직한 실시태양에서 상기 2개의 항원 결합 펩타이드는 scFv 단편 또는 scFab 단편이다.
하나의 태양에서, 상기 이중특이성 항체는
a) 제1 항원에 특이적으로 결합하는(및 2개의 Fab 단편을 포함하는) 항체의 2개의 경쇄 및 2개의 중쇄,
b) 제2 항원에 특이적으로 결합하는 항체의 2개의 추가적인 Fab 단편(여기에서 상기 추가적인 Fab 단편들은 둘 다 a)의 중쇄의 C- 또는 N-말단에 펩타이드 링커를 통해 융합된다)
을 포함하고, 여기에서 상기 Fab 단편에서 하기의 변형들이 수행된 이중특이성, 4가 항체이다:
(i) a)의 2개의 Fab 단편 모두에서, 또는 b)의 2개의 Fab 단편 모두에서, 가변 도메인 VL 및 VH가 서로에 의해 교체되고/되거나 불변 도메인 CL 및 CH1이 서로에 의해 교체되거나, 또는
(ii) a)의 2개의 Fab 단편 모두에서 가변 도메인 VL 및 VH가 서로에 의해 교체되고, 불변 도메인 CL 및 CH1이 서로에 의해 교체되며, b)의 2개의 Fab 단편 모두에서 가변 도메인 VL 및 VH가 서로에 의해 교체되거나, 또는 불변 도메인 CL 및 CH1이 서로에 의해 교체되거나, 또는
(iii) a)의 2개의 Fab 단편 모두에서 가변 도메인 VL 및 VH가 서로에 의해 교체되거나, 또는 불변 도메인 CL 및 CH1이 서로에 의해 교체되고, b)의 2개의 Fab 단편 모두에서 가변 도메인 VL 및 VH가 서로에 의해 교체되고, 불변 도메인 CL 및 CH1이 서로에 의해 교체되거나, 또는
(iv) a)의 2개의 Fab 단편 모두에서, 가변 도메인 VL 및 VH가 서로에 의해 교체되고 b)의 2개의 Fab 단편 모두에서, 불변 도메인 CL 및 CH1이 서로에 의해 교체되거나, 또는
(v) a)의 2개의 Fab 단편 모두에서, 불변 도메인 CL 및 CH1이 서로에 의해 교체되고 b)의 2개의 Fab 단편 모두에서, 가변 도메인 VL 및 VH가 서로에 의해 교체된다.
하나의 태양에서, 상기 추가적인 Fab 단편들을 모두 펩타이드 링커를 통해 상기 a)의 중쇄의 C-말단 또는 상기 a)의 중쇄의 N-말단에 융합시킨다.
하나의 태양에서, 상기 추가적인 Fab 단편들을 모두 펩타이드 링커를 통해 상기 a)의 중쇄의 C-말단에 융합시킨다.
하나의 태양에서, 상기 추가적인 Fab 단편들을 모두 펩타이드 링커를 통해 상기 a)의 중쇄의 N-말단에 융합시킨다.
하나의 태양에서, Fab 단편에서, 하기의 변형을 수행한다: a)의 2개의 Fab 단편 모두에서, 또는 b)의 2개의 Fab 단편 모두에서, 가변 도메인 VL 및 VH를 서로에 의해 교체시키고/시키거나 불변 도메인 CL 및 CH1을 서로에 의해 교체시킨다.
하나의 태양에서, 상기 이중특이성 항체는
a) 제1 항원에 특이적으로 결합하고 제1 VH-CH1 도메인 쌍을 포함하는 제1 항체의 (변형된) 중쇄(여기에서 상기 중쇄의 C 말단에 상기 제1 항체의 제2 VH-CH1 도메인 쌍의 N-말단을 펩타이드 링커를 통해 융합시킨다),
b) 상기 a)의 제1 항체의 2개의 경쇄,
c) 제2 항원에 특이적으로 결합하고 제1 VH-CL 도메인 쌍을 포함하는 제2 항체의 (변형된) 중쇄(여기에서 상기 중쇄의 C 말단에 상기 제2 항체의 제2 VH-CL 도메인 쌍의 N-말단을 펩타이드 링커를 통해 융합시킨다), 및
d) 상기 c)의 제2 항체의 2개의 (변형된) 경쇄(각각 CL-CH1 도메인 쌍을 포함한다)
를 포함하는 4가 항체이다.
하나의 태양에서, 상기 이중특이성 항체는
a) 제1 항원에 특이적으로 결합하는 제1 완전길이 항체의 중쇄 및 경쇄, 및
b) 제2 항원에 특이적으로 결합하는 제2 완전길이 항체의 중쇄 및 경쇄(여기에서 상기 중쇄의 N-말단은 펩타이드 링커를 통해 상기 경쇄의 C-말단에 연결된다)
를 포함한다.
상기 a) 하의 항체는 b) 하에 보고된 바와 같은 변형을 함유하지 않으며 상기 중쇄 및 경쇄는 단리된 쇄들이다.
하나의 태양에서, 상기 이중특이성 항체는
a) 제1 항원에 특이적으로 결합하고 2개의 항체 중쇄 및 2개의 항체 경쇄로 이루어지는 완전길이 항체, 및
b) VH2 도메인 및 VL2 도메인을 포함하는 제2 항원에 특이적으로 결합하는 Fv 단편(여기에서 상기 두 도메인은 모두 다이설파이드 가교를 통해 서로에 연결된다)
을 포함하고, 여기에서 오직 VH2 도메인 또는 VL2 도메인만이 펩타이드 링커를 통해, 제1 항원에 특이적으로 결합하는 완전길이 항체의 중쇄 또는 경쇄에 융합된다.
상기 이중특이성 항체에서 상기 a) 하의 중쇄 및 경쇄는 단리된 쇄들이다.
하나의 태양에서, 상기 VH2 도메인 또는 VL2 도메인의 다른 하나는 펩타이드 링커를 통해, 제1 항원에 특이적으로 결합하는 완전길이 항체의 중쇄 또는 경쇄에 융합되지 않는다.
본 명세서에 보고된 바와 같은 모든 태양에서 상기 제1 경쇄는 VL 도메인 및 CL 도메인을 포함하고 상기 제1 중쇄는 VH 도메인, CH1 도메인, 힌지 영역, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함한다.
하나의 태양에서, 상기 이중특이성 항체는
a) 제1 항원에 특이적으로 결합하는 2개의 Fab 단편,
b) CH1 및 CL 도메인이 서로에 대해 교환되는 제2 항원에 특이적으로 결합하는 하나의 CrossFab 단편,
c) 제1 Fc-영역 중쇄 및 제2 Fc 영역 중쇄를 포함하는 하나의 Fc-영역
을 포함하는 3가 항체이며, 여기에서 상기 2개의 Fab 단편의 CH1 도메인의 C-말단은 중쇄 Fc-영역 폴리펩타이드의 N-말단에 연결되고, 상기 CrossFab 단편의 CL 도메인의 C-말단은 상기 Fab 단편 중 하나의 VH 도메인의 N-말단에 연결된다.
하나의 태양에서, 상기 이중특이성 항체는
a) 제1 항원에 특이적으로 결합하는 2개의 Fab 단편,
b) CH1 및 CL 도메인이 서로에 대해 교환되는 제2 항원에 특이적으로 결합하는 하나의 CrossFab 단편,
c) 제1 Fc-영역 중쇄 및 제2 Fc 영역 중쇄를 포함하는 하나의 Fc-영역
을 포함하는 3가 항체이며, 여기에서 상기 제1 Fab 단편의 CH1 도메인의 C-말단은 중쇄 Fc-영역 폴리펩타이드 중 하나의 N-말단에 연결되고, 상기 CrossFab 단편의 CL 도메인의 C-말단은 다른 중쇄 Fc-영역 폴리펩타이드의 N-말단에 연결되며, 상기 제2 Fab 단편의 CH1 도메인의 C-말단은 제1 Fab 단편의 VH 도메인의 N-말단 또는 상기 CrossFab 단편의 VH 도메인의 N-말단에 연결된다.
하나의 태양에서, 상기 이중특이성 항체는
a) 제1 항원에 특이적으로 결합하고 2개의 항체 중쇄 및 2개의 항체 경쇄로 이루어지는 완전길이 항체, 및
b) 중쇄 단편 및 경쇄 단편을 포함하는 VH2 도메인 및 VL2 도메인을 포함하는 제2 항원에 특이적으로 결합하는 Fab 단편(여기에서 상기 경쇄 단편내에서 상기 가변 경쇄 도메인 VL2는 상기 항체의 가변 중쇄 도메인 VH2에 의해 교체되고, 상기 중쇄 단편내에서 상기 가변 중쇄 도메인 VH2는 상기 항체의 가변 경쇄 도메인 VL2에 의해 교체된다)
을 포함하고, 여기에서 상기 중쇄 Fab 단편은 상기 완전길이 항체의 중쇄 중 하나의 CH1 도메인과 상기 완전길이 항체의 각 Fc-영역 사이에 삽입되고, 상기 경쇄 Fab 단편의 N 말단은 상기 중쇄 Fab 단편이 삽입된 완전길이 항체의 중쇄와 짝을 이루는 상기 완전길이 항체의 경쇄의 C-말단에 접합된다.
하나의 태양에서, 상기 이중특이성 항체는
a) 제1 항원에 특이적으로 결합하고 2개의 항체 중쇄 및 2개의 항체 경쇄로 이루어지는 완전길이 항체, 및
b) 중쇄 단편 및 경쇄 단편을 포함하는 VH2 도메인 및 VL2 도메인을 포함하는 제2 항원에 특이적으로 결합하는 Fab 단편(여기에서 상기 경쇄 단편내에서 상기 가변 경쇄 도메인 VL2는 상기 항체의 가변 중쇄 도메인 VH2에 의해 교체되고, 상기 중쇄 단편내에서 상기 가변 중쇄 도메인 VH2는 상기 항체의 가변 경쇄 도메인 VL2에 의해 교체되고, 여기에서 상기 Fab 단편의 중쇄 단편의 C-말단은 상기 완전길이 항체의 중쇄 중 하나의 N-말단에 접합되고 상기 Fab 단편의 경쇄 단편의 C-말단은 상기 Fab 단편의 중쇄 단편이 접합되는 완전길이 항체의 중쇄와 짝을 이루는 상기 완전길이 항체의 경쇄의 C-말단에 접합된다)
을 포함한다.
폴리펩타이드
본 발명은 본 명세서에 기재된 바와 같은 이중특이성 항체 또는 그의 단편을 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오타이드를 추가로 제공한다.
몇몇 실시태양에서 상기 폴리뉴클레오타이드 또는 핵산은 DNA이다. 다른 실시태양에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 예를 들어 전령 RNA(mRNA) 형태의 RNA이다. 본 발명의 RNA는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다.
B. 재조합 방법
본 명세서에 제공된 이중특이성 항체를 예를 들어 미국특허 제 4,816,567 호에 개시된 바와 같이 재조합 방법 및 조성물을 사용하여 생산할 수 있다. 하나의 태양에서, 본 명세에 개시된 이중특이성 항체를 암호화하는 단리된 핵산을 제공한다. 상기와 같은 핵산은 각각 PD1 및 TIM-3에 특이적으로 결합하는 항원-결합 부위의 VH을 포함하는 아미노산 서열 및/또는 VL을 포함하는 아미노산 서열을 암호화할 수 있다(예를 들어 항체의 경쇄 및/또는 중쇄 중의). 추가의 태양에서, 상기와 같은 핵산을 포함하는 하나 이상의 벡터(예를 들어 발현 벡터)를 제공한다. 추가의 태양에서, 상기와 같은 핵산을 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 하나의 상기와 같은 태양에서, 숙주 세포는 (1) 항체의 VL을 포함하는 아미노산 서열 및 상기 항체의 VH를 포함하는 아미노산 서열을 암호화하는 핵산을 포함하는 벡터, 또는 (2) 상기 항체의 VL을 포함하는 아미노산 서열을 암호화하는 핵산을 포함하는 제1 벡터 및 상기 항체의 VH를 포함하는 아미노산 서열을 암호화하는 핵산을 포함하는 제2 벡터를 포함한다(예를 들어 이들 벡터로 형질전환되었다). 하나의 태양에서, 상기 숙주 세포는 진핵생물, 예를 들어 중국 햄스터 난소(CHO) 세포 또는 림프양 세포(예를 들어 Y0, NS0, Sp20 세포)이다. 하나의 태양에서, 이중특이성 항체의 제조 방법을 제공하며, 여기에서 상기 방법은 항체의 발현에 적합한 조건하에서, 상기에 제공된 바와 같은, 상기 항체를 암호화하는 핵산을 포함하는 숙주 세포를 배양하고, 임의로 상기 숙주 세포(또는 숙주 세포 배양 배지)로부터 상기 항체를 회수함을 포함한다.
본 명세서에 기재된 바와 같은 PD1에 특이적으로 결합하는 제1 항원-결합 부위 및 TIM-3에 특이적으로 결합하는 제2 항원-결합 부위를 포함하는 이중특이성 항체의 재조합 생성을 위해서, 예를 들어 상술한 바와 같은, 이중특이성 항체를 암호화하는 핵산을 단리하고 추가의 클로닝 및/또는 숙주 세포에서의 발현을 위해 하나 이상의 벡터 내로 삽입한다. 상기와 같은 핵산을 통상적인 과정을 사용하여(예를 들어 상기 항체의 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오타이드 탐침을 사용함으로써) 쉽게 단리하고 서열분석할 수 있다.
항체-암호화 벡터의 클로닝 또는 발현에 적합한 숙주 세포는 본 명세서에 개시된 원핵생물 또는 진핵생물 세포를 포함한다. 예를 들어, 항체를, 특히 글리코실화 및 Fc 효과기 기능이 필요하지 않은 경우, 세균에서 생산할 수 있다. 세균에서의 항체 단편 및 폴리펩타이드의 발현에 대해서, 예를 들어 미국특허 제 5,648,237 호, 미국특허 제 5,789,199 호 및 미국특허 제 5,840,523 호를 참조하시오. (또한 에스케리키아 콜라이에서의 항체 단편의 발현을 개시하는 문헌[Charlton, K.A., In: Methods in Molecular Biology, Vol. 248, Lo, B.K.C. (ed.), Humana Press, Totowa, NJ (2003), pp. 245-254]을 참조하시오). 발현 후에, 상기 항체를 용액 분획 중 세균 세포 페이스트로부터 단리하고 추가로 정제할 수 있다.
원핵생물 외에, 진핵 미생물, 예를 들어 섬유상 진균 또는 효모, 예를 들어 글리코실화 경로가 "인간화되어" 부분적인 또는 완전한 인간 글리코실화 패턴을 갖는 항체를 생산하는 진균 및 효모 균주가 항체-암호화 벡터에 적합한 클로닝 또는 발현 숙주이다. 문헌[Gerngross, T.U., Nat. Biotech. 22 (2004) 1409-1414]; 및 문헌[Li, H. et al., Nat. Biotech. 24 (2006) 210-215]을 참조하시오.
글리코실화된 항체의 발현에 적합한 숙주 세포는 또한 다세포 유기체(무척추동물 및 척추동물)로부터 유래된다. 무척추동물 세포의 예는 식물 및 곤충 세포이다. 특히 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) 세포의 형질감염을 위해, 곤충 세포와 함께 사용될 수 있는 다수의 바큘로바이러스 균주가 동정되었다.
식물 세포 배양물을 또한 숙주로서 사용할 수 있다. 예를 들어 미국특허 제 5,959,177 호, 미국특허 제　6,040,498 호, 미국특허 제 6,420,548 호, 미국특허 제 7,125,978 호 및 미국특허 제　6,417,429 호(트랜스제닉 식물에서 항체를 생산하기 위한 플랜티바디스(PLANTIBODIES)(상표) 기술을 개시한다)를 참조하시오.
척추동물 세포를 또한 숙주로서 사용할 수 있다. 예를 들어 현탁액에서 증식시키기에 적합한 포유동물 세포주가 유용할 수 있다. 유용한 포유동물 숙주 세포주의 다른 예는 SV40(COS-7)에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 계통; 인간 배아 신장 계통(예를 들어 문헌[Graham, F.L. et al., J. Gen Virol. 36 (1977) 59-74]에 개시된 바와 같은 293 또는 293 세포); 아기 햄스터 신장 세포(BHK); 마우스 세르톨리 세포(예를 들어 문헌[Mather, J.P., Biol. Reprod. 23 (1980) 243-252]에 개시된 바와 같은 TM4 세포); 원숭이 신장 세포(CV1); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포(VERO-76); 인간 자궁경부 암종 세포(HELA); 개 신장 세포(MDCK; 버팔로 래트 간세포(BRL 3A); 인간 폐세포(W138); 인간 간세포(Hep G2); 마우스 유방 종양(MMT 060562); 예를 들어 문헌[Mather, J.P. et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383 (1982) 44-68]에 개시된 바와 같은 TRI 세포; MRC 5 세포; 및 FS4 세포이다. 다른 유용한 포유동물 숙주 세포주는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포, 예를 들어 DHFR- CHO 세포(문헌[Urlaub, G. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 (1980) 4216-4220]); 및 골수종 세포주, 예를 들어 Y0, NS0 및 Sp2/0를 포함한다. 항체 생산에 적합한 몇몇 포유동물 숙주 세포주에 대한 리뷰에 대해서, 예를 들어 문헌[Yazaki, P. and Wu, A.M., Methods in Molecular Biology, Vol. 248, Lo, B.K.C. (ed.), Humana Press, Totowa, NJ (2004), pp. 255-268]을 참조하시오.
C. 분석
본 명세서에 제공된 PD1에 특이적으로 결합하는 제1 항원-결합 부위 및 TIM-3에 특이적으로 결합하는 제2 항원-결합 부위를 포함하는 이중특이성 항체를 당해 분야에 공지된 다양한 분석에 의해 그의 물리/화학적 성질 및/또는 생물학적 활성에 대해 확인하거나, 선별하거나 특성화할 수 있다.
1. 친화성 분석
상응하는 항원에 대한 본 명세서에 제공된 이중특이성 항원 결합 분자, 항체 및 항체 단편의 친화성을 실시예에 제시된 방법들에 따라서 표준 장비, 예를 들어 Biacore(등록상표) 장비(GE 헬쓰케어), 및 재조합 발현에 의해 수득될 수 있는 바와 같은 수용체 또는 표적 단백질을 사용하여 표면 플라스몬 공명(SPR)에 의해 측정할 수 있다. 결합 친화성의 측정에 대한 구체적인 예시 및 예시적인 실시태양은 실시예 1b, 5 또는 12에 기재되어 있다. 하나의 태양에 따라, KD를 25 ℃에서 BIACORE(등록상표) T100 기계(GE 헬쓰케어)를 사용하여 표면 플라스몬 공명에 의해 측정한다.
2. 결합 분석 및 다른 분석
하나의 태양에서, 본 발명의 항체를 예를 들어 공지된 방법, 예를 들어 ELISA, 웨스턴 블럿 등에 의해 그의 항원 결합 활성에 대해 시험한다. 본 명세서에 제공된 이중특이성 항체의, 상응하는 재조합 항원 또는 항원-발현 세포에의 결합을 실시예 12에 기재된 바와 같이 ELISA에 의해 평가할 수 있다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 하나의 세포상에 존재하는 2개의 상이한 수용체에 대한 이중특이성 항체 포맷의 동시 결합을 측정하기 위한 세포-기재 TR-FRET 분석을 제공한다. 선택된 태그-라이트(Tag-lite) 기술은 고전적인 TR-FRET(시간-분해 형광 공명 에너지 전달) 및 SNAP-태그 기술(예를 들어 뉴잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs), 시스바이오)의 조합이며, 이는 상기 세포 표면상에 존재하는 항원을 형광 공여체 또는 수용체 염료로 표지되게 한다. 상기 분석은 실시예 13에 기재되어 있다.
추가의 태양에서, 신선한 말초 혈액 단핵세포(PBMC)를, 단핵세포, NK 세포 및 T 세포와 같은 상이한 말초 혈액 단핵세포(PBMC)에 대한 결합을 나타내기 위해 결합 분석에 사용한다.
또 다른 태양에서, 경쟁 분석을 사용하여 각각 상기 표적에의 결합에 대한 특이적인 항체 또는 항원 결합 부위와 경쟁하는 항체를 확인할 수 있다. 몇몇 실시태양에서, 상기와 같은 경쟁 항체는 본 발명에 따른 PD1에 특이적으로 결합하는 제1 항원-결합 부위 및 TIM-3에 특이적으로 결합하는 제2 항원-결합 부위를 포함하는 이중특이성 항체에 의해 결합되는 동일한 에피토프(예를 들어 선형 또는 입체구조 에피토프)에 결합한다. 항체가 결합하는 에피토프의 맵핑에 대한 상세한 예시적인 방법들이 문헌[Morris (1996) "Epitope Mapping Protocols," Methods in Molecular Biology vol. 66 (Humana Press, Totowa, NJ)]에 제공되어 있다.
예시적인 경쟁 분석에서, 고정화된 PD1 또는 TIM3을, PD1 또는 TIM3에 결합하는 제1 표지된 항체, 및 PD1 또는 TIM3에의 결합에 대해 상기 제1 항체와 경쟁하는 능력에 대해 시험하고자 하는 표지되지 않은 제2 항체를 포함하는 용액 중에서 배양한다. 상기 제2 항체는 하이브리도마 상등액 중에 존재할 수 있다. 대조용으로서, 고정화된 PD1 또는 TIM3를, 상기 표지된 제1 항체는 포함하지만 상기 표지되지 않은 제2 항체는 포함하지 않는 용액 중에서 배양한다. 상기 제1 항체의 PD1 또는 TIM3에의 결합을 허용하는 조건하에서 배양 후에 과잉의 결합되지 않은 항체를 제거하고, 고정화된 PD1 또는 TIM3와 결합된 표지의 양을 측정한다. 고정화된 PD1 또는 TIM3와 결합된 표지의 양이 대조용 샘플에 비해 시험 샘플에서 실질적으로 감소하는 경우, 이는 상기 제2 항체가 PD1 또는 TIM3에의 결합에 대해서 상기 제1 항체와 경쟁함을 암시한다(예를 들어 문헌[Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual ch.14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY]을 참조하시오).
3. 활성 분석
하나의 태양에서, 생물학적 활성을 갖는 PD1에 특이적으로 결합하는 제1 항원-결합 부위 및 TIM-3에 특이적으로 결합하는 제2 항원-결합 부위를 포함하는 이중특이성 항체의 확인을 위한 분석을 제공한다. 생물학적 활성은 예를 들어 상이한 면역세포, 특히 T-세포의 활성화 및/또는 증식, 면역-조절성 사이토킨, 예를 들어 IFNγ 또는 TNF-알파의 분비, PD1 경로의 차단, TIM3 경로의 차단, 종양 세포의 살해를 증대시키는 능력을 포함할 수 있다. 생체내 및/또는 시험관내에서 상기와 같은 생물학적 활성을 갖는 항체를 또한 제공한다.
몇몇 태양에서, 본 발명의 항체를 상기와 같은 생물학적 활성에 대해 시험한다. 하나의 태양에서, 하나의 개체(공여자 X)로부터의 림프구의 또 다른 개체(공여자 Y)로부터의 림프구로의 활성화를 측정하는 면역세포 분석을 제공한다. 상기 혼합 림프구 반응(MLR)은 림프구 효과기 세포로의 PD1 경로의 차단 효과를 입증할 수 있다. 상기 분석에서 T 세포를 본 발명의 이중특이성 항체의 존재 또는 부재하에서의 활성화 및 그의 IFN-감마 분비에 대해 시험하였다. 상기 분석을 실시예 16에 보다 상세히 기재한다.
D. 면역접합체
본 발명은 또한 하나 이상의 세포독성제, 예를 들어 화학요법제 또는 약물, 성장 억제제, 독소(예를 들어 단백질 독소, 세균, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소 활성 독소, 또는 그의 단편), 또는 방사성 동위원소에 접합된 본 발명의 이중특이성 항체를 포함하는 면역접합체를 제공한다.
하나의 태양에서, 면역접합체는, 항체가 하나 이상의 약물, 예를 들어 비제한적으로 메이탄시노이드(미국특허 제　5,208,020 호, 미국특허 제 5,416,064 호 및 유럽 특허 EP 0 425 235 B1를 참조하시오); 아우리스타틴, 예를 들어 모노메틸아우리스타틴 약물 부분 DE 및 DF(MMAE 및 MMAF)(미국특허 제 5,635,483 호, 미국특허 제 5,780,588 호, 및 미국특허 제 7,498,298 호); 돌라스타틴; 칼리케아미신 또는 그의 유도체(미국특허 제 5,712,374 호, 미국특허 제 5,714,586 호, 미국특허 제 5,739,116 호, 미국특허 제 5,767,285 호, 미국특허 제 5,770,701 호, 미국특허 제 5,770,710 호, 미국특허 제 5,773,001 호, 및 미국특허 제 5,877,296 호; 문헌[Hinman et al., Cancer Res. 53:3336-3342(1993)]; 및 문헌[Lode et al., Cancer Res. 58:2925-2928(1998)]을 참조하시오); 안트라사이클린, 예를 들어 다우노마이신 또는 독소루비신(문헌[Kratz et al., Curr. Med. Chem. 13:477-523(2006)]; 문헌[Jeffrey et al., Bioorganic & Med. Chem. Letts 16:358-362(2006)]; 문헌[Torgov et al., Bioconjug. Chem. 16:717-721(2005)]; 문헌[Nagy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:829-834(2000)]; 문헌[Dubowchik et al., Bioorg. & Med. Chem. Letters 12:1529-1532(2002)]; 문헌[King et al., J. Med. Chem. 45:4336-4343(2002)]; 및 미국특허 제 6,630,579 호를 참조하시오); 메토트렉세이트; 빈데신; 탁산, 예를 들어 도세탁셀, 패클리탁셀, 라로탁셀, 테세탁셀, 및 오르타탁셀; 트라이코테센; 및 CC1065를 포함하는 약물에 접합된 항체-약물 접합체(ADC)이다.
또 다른 실시태양에서, 면역접합체는 효소 활성 독소 또는 그의 단편, 예를 들어 비제한적으로 디프테리아-A 쇄, 디프테리아 독소의 비-결합 활성 단편, 외독소 A 쇄(슈도모나스 아에루기노사로부터), 리신 A 쇄, 아브린 A 쇄, 모데신 A 쇄, 알파-사르신, 알류라이테스 포르디이 단백질, 다이안틴 단백질, 피토라카 아메리카나 단백질(PAPI, PAPII 및 PAP-S), 모모르디카 카란티아 억제제, 쿠르신, 크로틴, 사파오나리아 오피시날리스 억제제, 젤로닌, 미토젤린, 레스트릭토신, 페노마이신, 에노마이신 및 트라이코테센에 접합된 본 발명에 개시된 바와 같은 항체를 포함한다.
또 다른 실시태양에서, 면역접합체는 방사성 원자에 접합되어 방사성접합체를 형성하는 본 발명에 개시된 바와 같은 항체를 포함한다. 다양한 방사성 동위원소들을 방사성접합체의 생산에 이용할 수 있다. 예를 들어 At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212, 및 Lu의 방사성 동위원소를 포함한다. 상기 방사성접합체가 검출에 사용되는 경우 상기 접합체는 섬광조영술 연구를 위한 방사성 원자, 예를 들어 tc99m 또는 I123, 또는 핵자기 공명(NMR) 영상화(또한 자기공명 영상화, mri로서 공지됨)용 스핀 표지, 예를 들어 다시 요오드-123, 요오드-131, 인듐-111, 불소-19, 탄소-13, 질소-15, 산소-17, 가돌리늄, 망간 또는 철을 포함할 수 있다.
항체 및 세포독성제의 접합체를 다양한 이중기능성 단백질 커플링제, 예를 들어 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜다이티오)프로피오네이트(SPDP), 숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸) 사이클로헥산-1-카복실레이트(SMCC), 이미노티올란(IT), 이미도에스터의 이중작용성 유도체(예를 들어 다이메틸 아디프이미데이트 HCl), 활성 에스터(예를 들어 다이숙신이미딜 수베레이트), 알데하이드(예를 들어 글루타르알데하이드), 비스-아지도 화합물(예를 들어 비스(p-아지도벤조일) 헥산다이아민), 비스-다이아조늄 유도체(예를 들어 비스-(p-다이아조늄벤조일)-에틸렌다이아민), 다이아이소시아네이트(예를 들어 톨루엔 2,6-다이아이소시아네이트), 및 비스-활성 불소 화합물(예를 들어 1,5-다이플루오로-2,4-다이나이트로벤젠)을 사용하여 제조할 수 있다. 예를 들어, 리신 면역독소를 문헌[Vitetta et al., Science 238:1098(1987)]에 기재된 바와 같이 제조할 수 있다. 탄소-14-표지된 1-아이소티오시아네이토벤질-3-메틸다이에틸렌 트라이아민 펜타아세트산(MX-DTPA)은 상기 항체에의 방사성핵종의 접합을 위한 예시적인 킬레이트화제이다. WO 94/11026을 참조하시오. 상기 링커는 세포 중의 세포독성 약물의 방출을 촉진하는 "절단성 링커"일 수 있다. 예를 들어, 산-불안정성 링커, 펩티다제-민감성 링커, 광불안정성 링커, 다이메틸 링커 또는 다이설파이드-함유 링커(문헌[Chari et al., Cancer Res. 52:127-131(1992)]; 미국특허 제 5,208,020 호)를 사용할 수 있다.
상기 면역접합체 또는 ADC는 가교결합제 시약, 예를 들어 비제한적으로 BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, 설포-EMCS, 설포-GMBS, 설포-KMUS, 설포-MBS, 설포-SIAB, 설포-SMCC, 및 설포-SMPB, 및 SVSB(숙신이미딜-4-(비닐설폰)벤조에이트)(이들은 예를 들어 피어스 바이오테크놀로지 인코포레이티드(Pierce Biotechnology, Inc.), 미국 일리노이주 록빌 소재)로부터 상업적으로 입수할 수 있다)로 제조된 상기와 같은 접합체가 본 발명에서 명백히 고려된다.
E. 진단 및 검출을 위한 방법 및 조성물
몇몇 태양에서, 본 명세서에서 제공된 PD1에 특이적으로 결합하는 제1 항원-결합 부위 및 TIM-3에 특이적으로 결합하는 제2 항원-결합 부위를 포함하는 이중특이성 항체 중 어느 하나는 생물학적 샘플 중의 PD1 및 TIM3 모두의 존재를 검출하기에 유용하다. 본 발명에 사용되는 바와 같은 "검출하는"이란 용어는 정량적인 또는 정성적인 검출을 포함한다. 몇몇 실시태양에서, 생물학적 샘플은 세포 또는 조직, 예를 들어 AML 줄기 암세포를 포함한다.
하나의 태양에서, 진단 또는 검출 방법에 사용하기 위한 이중특이성 항체를 제공한다. 추가의 태양에서, 생물학적 샘플 중의 PD1 및 TIM3 모두의 존재를 검출하는 방법을 제공한다. 몇몇 실시태양에서, 상기 방법은 상기 생물학적 샘플을, 본 명세서에 기재된 바와 같은 이중특이성 항체의 상기 PD1 및 TIM3 모두에의 결합을 허용하는 조건하에서 상기 이중특이성 항체와 접촉시키고, 상기 이중특이성 항체 및 상기 두 항원 모두 간에 복합체가 형성되는 지를 검출함을 포함한다. 상기와 같은 방법은 시험관내 또는 생체내 방법일 수 있다. 하나의 실시태양에서, 상기 이중특이성 항체를 사용하여, 예를 들어 PD1 및 TIM3이 환자의 선택을 위한 생물마커인 경우, PD1에 특이적으로 결합하는 제1 항원-결합 부위 및 TIM-3에 특이적으로 결합하는 제2 항원-결합 부위를 포함하는 이중특이성 항체에 의한 요법에 적격인 피실험자를 선택한다.
몇몇 태양에서, 표지된 이중특이성 항체를 제공한다. 표지는 비제한적으로 직접 검출되는 표지 또는 부분(예를 들어 형광성, 발색성, 전자-밀집성, 화학발광성 및 방사성 표지)뿐만 아니라, 예를 들어 효소 반응 또는 분자 상호작용을 통해 간접적으로 검출되는 부분들, 예를 들어 효소 또는 리간드를 포함한다. 예시적인 표지는 비제한적으로 방사성동위원소 32P, 14C, 125I, 3H 및 131I, 형광단, 예를 들어 희토 킬레이트 또는 플루오레세인 및 그의 유도체, 로다민 및 그의 유도체, 단실, 움벨리페론, 루세리페라제, 예를 들어 개똥벌레 루시페라제 및 세균 루시페라제(미국특허 제 4,737,456 호), 루시페린, 2,3-다이하이드로프탈라진디온, 양고추냉이 퍼옥시다제(HRP), 알칼리성 포스파타제, β-갈락토시다제, 글루코아밀라제, 라이소자임, 사카라이드 옥시다제, 예를 들어 글루코스 옥시다제, 갈락토스 옥시다제, 및 글루코스-6-포스페이트 데하이드로게나제, 헤테로사이클릭 옥시다제, 예를 들어 유리카제 및 잔틴 옥시다제(과산화 수소를 사용하여 염료 전구체, 예를 들어 HRP를 산화시키는 효소와 결합된), 락토퍼옥시다제, 또는 미세퍼옥시다제, 비오틴/아비딘, 회전 표지, 박테리오파지 표지, 안정한 유리 라디칼 등을 포함한다.
F. 약학 조성물, 제형 및 투여 경로
추가의 태양에서, 본 발명은 예를 들어 하기의 치료 방법들 중 어느 하나에 사용하기 위한, 본 명세서에 제공된 PD1에 특이적으로 결합하는 제1 항원-결합 부위 및 TIM3에 특이적으로 결합하는 제2 항원-결합 부위를 포함하는 이중특이성 항체 중 어느 하나를 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 하나의 실시태양에서, 약학 조성물은 본 명세서에 제공된 이중특이성 항체 중 어느 하나 및 적어도 하나의 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함한다. 또 다른 실시태양에서, 약학 조성물은 본 명세서에 제공된 이중특이성 항체 중 어느 하나 및 예를 들어 하기에 기재된 바와 같은 적어도 하나의 추가적인 치료제를 포함한다.
본 발명의 약학 조성물은 치료 유효량의, 약학적으로 허용 가능한 부형제 중에 용해되거나 분산된 하나 이상의 이중특이성 항체를 포함한다. "약학적으로 또는 약물학적으로 허용 가능한"이란 어구는 사용되는 투여량 및 농도에서 수용자에게 일반적으로 무독성인, 즉 적합한 대로 동물, 예를 들어 인간에게 투여시 불리하거나, 알러지성이거나 또는 다른 부적합한 반응을 생성시키지 않는 분자 존재 및 조성물을 지칭한다. 적어도 하나의 이중특이성 항체 및 임의로 추가적인 활성 성분을 함유하는 약학 조성물의 제제는 본 발명에 참고로 인용된 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. Mack Printing Company, 1990]에 예시된 바와 같이, 본 명세에 비추어 당해 분야의 숙련가들에게 공지될 것이다. 특히, 상기 조성물은 동결건조된 제형 또는 수용액이다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, "약학적으로 허용 가능한 부형제"는 당해 분야의 통상적인 숙련가에게 공지된 바와 같은 모든 용매, 완충제, 분산 매질, 코팅제, 계면활성제, 산화방지제, 보존제(예를 들어 항균제, 항진균제), 등장성제, 염, 안정화제 및 이들의 조합을 포함한다.
비경구 조성물은 주사에 의해, 예를 들어 피하, 피내, 병변내, 정맥내, 동맥내 근육내, 경막내 또는 복강내 주사에 의해 투여하기 위해 설계된 것들을 포함한다. 주사용으로, 본 발명의 이중특이성 항체를 수용액 중에, 바람직하게는 생리학적으로 적합한 완충제, 예를 들어 행크 용액, 링거액, 또는 생리식염수 완충제 중에서 제형화할 수 있다. 상기 용액은 제형화제, 예를 들어 현탁, 안정화 및/또는 분산제를 함유할 수 있다. 한편으로, 상기 이중특이성 항체는 사용전에 적합한 비히클, 예를 들어 멸균 발열성 물질 제거수로 조성되는 분말 형태 중에 존재할 수 있다. 멸균 주사액은 본 발명의 융합 단백질을 필요에 따라, 하기에 열거되는 다양한 다른 성분들과 함께 적합한 용매 중에 필요한 양으로 혼입시킴으로써 제조된다. 멸균은 예를 들어 멸균 여과 멤브레인을 통한 여과에 의해 쉽게 수행될 수 있다. 일반적으로, 분산액은 다양한 멸균된 활성 성분을 기본 분산 매질 및/또는 다른 성분을 함유하는 멸균 비히클 중에 혼입시킴으로써 제조된다. 멸균 주사액, 현탁액 또는 유화액의 제조에 사용하기 위한 멸균 분말의 경우에, 바람직한 제조 방법은 앞서 멸균-여과된 액체 매질로부터 활성 성분 + 임의의 추가적인 목적하는 성분의 분말을 제공하는 진공-건조 또는 동결-건조이다. 상기 액체 매질을 필요한 경우 적합하게 완충시켜야 하며 상기 액체 희석제를 주사전에 먼저 충분한 염수 또는 글루코스로 등장성으로 만들어야 한다. 상기 조성물은 제조 및 보관 조건하에서 안정해야 하며, 미생물, 예를 들어 세균 및 진균의 오염 작용에 대해 보존되어야 한다. 내독소 오염을, 예를 들어 0.5 ng/㎎ 단백질 미만의 안전 수준에서 최소로 유지시켜야 함을 알 것이다. 적합한 약학적으로 허용 가능한 희석제는 비제한적으로 완충제, 예를 들어 포스페이트, 시트레이트 및 다른 유기산; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함한 산화방지제; 보존제(예를 들어 옥타데실다이메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드; 벤즈에토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜; 알킬 파라벤, 예를 들어 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레소르시놀; 사이클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레졸); 저분자량(약 10 잔기 미만) 폴리펩타이드; 단백질, 예를 들어 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예를 들어 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예를 들어 글리신, 글루타민, 아스파라진, 히스티딘, 아르기닌, 또는 리신; 모노사카라이드, 다이사카라이드, 및 다른 탄수화물, 예를 들어 글루코스, 만노스, 또는 덱스트린; 킬레이트화제, 예를 들어 EDTA; 당, 예를 들어 슈크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 솔비톨; 염-형성 대이온, 예를 들어 나트륨; 금속 착체(예를 들어 Zn-단백질 착체); 및/또는 비-이온성 계면활성제, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 포함한다. 수성 주사 현탁액은 상기 현탁액의 점도를 개선시키는 화합물, 예를 들어 나트륨 카복시메틸 셀룰로스, 솔비톨, 덱스트란 등을 함유할 수 있다. 임의로, 상기 현탁액은 또한 적합한 안정화제 또는 고도로 농축된 용액의 제조를 허용하도록 상기 화합물의 용해도를 증가시키는 작용제를 함유할 수 있다. 추가로, 상기 활성 화합물의 현탁액을 적합한 대로 유성 주사 현탁액으로서 제조할 수 있다. 적합한 친지성 용매 또는 비히클은 지방 오일, 예를 들어 참깨 오일, 또는 합성 지방산 에스터, 예를 들어 에틸 클리에이트 또는 트라이글리세라이드, 또는 리포솜을 포함한다.
활성 성분을 예를 들어 코아세르베이션 기법에 의해서 또는 계면 중합에 의해서 제조된 미세캡슐, 예를 들어 콜로이드 약물 전달 시스템(예를 들어 리포솜, 알부민 미소구, 미세유화액, 나노-입자 및 나노캡슐) 중의 또는 거대유화액 중의 각각의 하이드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-미세캡슐 및 폴리-(메틸메트아크릴레이트) 미세캡슐 중에 포집할 수 있다. 상기와 같은 기법들은 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences(18th Ed. Mack Printing Company, 1990)]에 개시되어 있다. 서방성 제제를 제조할 수도 있다. 서방성 제제의 적합한 예는 상기 폴리펩타이드를 함유하는 고체 소수성 중합체의 반투과성 기질(상기 기질은 성형품, 예를 들어 필름 또는 미세캡슐의 형태이다)을 포함한다. 특정한 실시태양에서, 주사성 조성물의 연장된 흡수는 상기 조성물 중에 흡수를 지연시키는 작용제, 예를 들어 알루미늄 모노스테아레이트, 젤라틴 또는 이들의 조합의 사용에 의해 발생될 수 있다.
본 명세서에서 예시적인 약학적으로 허용 가능한 부형제는 간질성 약물 분산제, 예를 들어 용해성 중성-활성 하이아루로니다제 당단백질(sHASEGP), 예를 들어 인간 용해성 PH-20 하이아루로니다제 당단백질, 예를 들어 rHuPH20(하이레넥스(HYLENEX)(등록상표), 박스터 인터내셔널 인코포레이티드(Baxter International, Inc.)를 추가로 포함한다. rHuPH20을 포함한 몇몇 예시적인 sHASEGP 및 사용 방법이 미국 특허 공보 제 2005/0260186 및 2006/0104968에 개시되어 있다. 하나의 태양에서, sHASEGP를 하나 이상의 추가적인 글리코스아미노글리카나제, 예를 들어 콘드로이티나제와 병용한다.
예시적인 동결건조된 제형들이 미국특허 제 6,267,958 호에 개시되어 있다. 수성 항체 제형은 미국특허 제 6,171,586 호 및 WO2006/044908에 개시된 것들을 포함하며, 후자의 제형은 히스티딘-아세테이트 완충제를 포함한다.
앞서 기재된 조성물들 외에, 상기 이중특이성 항체를 또한 데포 제제로서 제형화할 수 있다. 상기와 같은 장기간 작용하는 제형은 이식(예를 들어 피하 또는 근육내)에 의해 또는 근육내 주사에 의해 투여될 수 있다. 따라서, 예를 들어 상기 이중특이성 항체를 적합한 중합체성 또는 소수성 물질(예를 들어 허용 가능한 오일 중의 유화액으로서) 또는 이온 교환 수지와, 또는 드물게 용해성인 유도체, 예를 들어 드물게 용해성인 염으로서 제형화할 수 있다.
본 발명의 이중특이성 항체를 포함하는 약학 조성물을 통상적인 혼합, 용해, 유화, 캡슐화, 포집 또는 동결건조 공정에 의해 제조할 수 있다. 약학 조성물을 하나 이상의 생리학적으로 허용 가능한 담체, 희석제, 부형제, 또는 상기 단백질의, 약학적으로 사용될 수 있는 제제로의 가공을 용이하게 하는 보조제를 사용하여 통상적인 방식으로 제형화할 수 있다. 적합한 제형화는 선택된 투여 경로에 따라 변한다.
상기 이중특이성 항체를 유리산 또는 염기, 중성 또는 염 형태의 조성물로 제형화할 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 염은 상기 유리산 또는 염기의 생물학적 활성을 실질적으로 유지시키는 염이다. 상기는 산 부가염, 예를 들어 단백질성 조성물의 유리 아미노기와 형성되거나 무기산, 예를 들어 염산 또는 인산, 또는 아세트산, 옥살산, 타타르산 또는 만델산과 같은 유기산과 형성되는 것들을 포함한다. 유리 카복실기와 형성된 염은 또한 무기 염기, 예를 들어 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘 또는 철 수산화물; 또는 아이소프로필아민, 트라이메틸아민, 히스티딘 또는 프로카인과 같은 유기염기로부터 유도될 수 있다. 약학적 염은 상응하는 유리 염기 형태보다 수성 및 다른 양성자성 용매 중에서 더 용해성으로 되는 성향이 있다.
본 명세서의 조성물은 또한 치료되는 특정한 적응증에 필요한 바와 같은 하나 초과의 활성 성분, 바람직하게는 서로 불리한 영향을 미치지 않는 상보성 활성을 갖는 것들을 함유할 수 있다. 상기와 같은 활성 성분들은 적합하게는 의도하는 목적에 유효한 양으로 함께 존재한다.
생체내 투여에 사용되는 제형은 일반적으로 멸균성이다. 멸균은 예를 들어 멸균 여과 멤브레인을 통한 여과에 의해 쉽게 수행될 수 있다.
G. 치료 방법 및 조성물
본 명세서에 제공된 PD1에 특이적으로 결합하는 제1 항원-결합 부위 및 TIM3에 특이적으로 결합하는 제2 항원-결합 부위를 포함하는 이중특이성 항체들 중 어느 하나를 치료 방법에 사용할 수 있다.
치료 방법에 사용하기 위해, 이전에 본 명세서에서 정의된 바와 같은 PD1에 특이적으로 결합하는 제1 항원-결합 부위 및 TIM3에 특이적으로 결합하는 제2 항원-결합 부위를 포함하는 이중특이성 항체를 양호한 의학적 실행과 일관되는 방식으로 제형화하고, 복용시키고, 투여할 수 있다. 이와 관련하여 고려되는 인자들은 치료되는 특정 질환, 치료되는 특정 포유동물, 개인 환자의 임상적 조건, 질환의 원인, 작용제의 전달 부위, 투여 방법, 투여 스케줄, 및 의료 종사자에게 공지된 다른 인자들을 포함한다.
하나의 태양에서, 약제로서 사용하기 위한 본 명세서에서 정의된 바와 같은 PD1에 특이적으로 결합하는 제1 항원-결합 부위 및 TIM3에 특이적으로 결합하는 제2 항원-결합 부위를 포함하는 이중특이성 항체를 제공한다. 추가의 태양에서, 질병의 치료에 사용하기 위한, 특히 암의 치료에 사용하기 위한 본 명세서에서 정의된 바와 같은 PD1에 특이적으로 결합하는 제1 항원-결합 부위 및 TIM3에 특이적으로 결합하는 제2 항원-결합 부위를 포함하는 이중특이성 항체를 제공한다. 몇몇 실시태양에서, 치료 방법에 사용하기 위한 PD1에 특이적으로 결합하는 제1 항원-결합 부위 및 TIM3에 특이적으로 결합하는 제2 항원-결합 부위를 포함하는 이중특이성 항체를 제공한다. 하나의 실시태양에서, 본 발명은 질병의 치료가 필요한 개체에서 상기 질병의 치료에 사용하기 위한 본 명세서에 기재된 바와 같은 PD1에 특이적으로 결합하는 제1 항원-결합 부위 및 TIM3에 특이적으로 결합하는 제2 항원-결합 부위를 포함하는 이중특이성 항체를 제공한다. 몇몇 실시태양에서, 본 발명은 질병이 있는 개체에게 치료 유효량의, PD1에 특이적으로 결합하는 제1 항원-결합 부위 및 TIM3에 특이적으로 결합하는 제2 항원-결합 부위를 포함하는 이중특이성 항체를 투여함을 포함하는 상기 개체의 치료 방법에 사용하기 위한 상기 이중특이성 항체를 제공한다. 몇몇 실시태양에서, 상기 치료되는 질병은 암이다. 또 다른 태양에서, 상기 치료되는 질병은 HIV, HBV, HCV, HSV1, CMV, LCMV 또는 EBV와 같은 만성 바이러스성 감염이다. 치료가 필요한 피실험자, 환자 또는 "개체"는 전형적으로는 포유동물, 보다 특히 인간이다.
추가의 태양에서, 본 발명은 질병의 치료가 필요한 개체에서 상기 질병을 치료하기 위한 약제의 제조 또는 조제에서 이전에 본 명세서에서 정의된 바와 같은 PD1에 특이적으로 결합하는 제1 항원-결합 부위 및 TIM3에 특이적으로 결합하는 제2 항원-결합 부위를 포함하는 이중특이성 항체의 용도를 제공한다. 하나의 실시태양에서, 상기 약제는 질병이 있는 개체에게 치료 유효량의 상기 약제를 투여함을 포함하는 상기 질병의 치료 방법에 사용하기 위한 것이다.
몇몇 태양에서, 상기 치료되는 질병은 증식성 질환, 특히 암이다. 암의 예는 방광암, 뇌암, 두경부암, 췌장암, 폐암, 유방암, 난소암, 자궁암, 자궁경부암, 자궁내막암, 식도암, 결장암, 결장직장암, 직장암, 위암, 전립선암, 혈액암, 피부암, 편평상피세포 암종, 골암, 및 신장암을 포함한다. 본 발명에 따른 PD1에 특이적으로 결합하는 제1 항원-결합 부위 및 TIM3에 특이적으로 결합하는 제2 항원-결합 부위를 포함하는 이중특이성 항체를 사용하여 치료될 수 있는 다른 세포 증식 질환은 비제한적으로 복부, 골, 유방, 소화계, 간, 췌장, 복막, 내분비선(부신, 부갑상선, 뇌하수체, 고환, 난소, 흉선, 갑상선), 눈, 두경부, 신경계(중추 및 말초), 림프계, 골반, 피부, 연조직, 비장, 흉부 영역 및 비뇨생식계 중에 위치한 종양을 포함한다. 또한 전암성 상태 또는 병변 및 암 전이가 포함된다. 몇몇 태양에서, 상기 암은 신세포암, 피부암, 폐암, 결장직장암, 유방암, 뇌암, 두경부암으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다. 추가의 태양에서, 상기 암은 암종, 림프종(예를 들어 호지킨 및 비-호지킨 림프종), 모세포종, 육종 및 백혈병 중에서 선택된다. 또 다른 태양에서, 상기 암은 편평상피세포암, 소-세포 폐암, 비-소세포 폐암, 폐의 선암종, 폐의 편평상피 암종, 복막암, 간세포암, 위장암, 췌장암, 신경교종, 자궁경부암, 난소암, 간암, 방광암, 간종양, 유방암, 결장암, 결장직장암, 자궁내막 또는 자궁암종, 침샘 암종, 신장암, 간암, 전립선암, 음문암, 갑상선암, 간 암종, 백혈병 및 다른 림프증식성 질환, 및 다양한 유형의 두경부암 중에서 선택된다.
추가의 태양에서, 상기 치료되는 질병은 만성 바이러스성 감염이다. "만성 바이러스성 감염"이란 용어는 만성 바이러스로 감염되거나 상기로 고통받는 피실험자를 지칭한다. 만성 바이러스성 감염의 예는 인간 면역결핍 바이러스(HIV), B형 간염 바이러스 감염(HBV), C형 간염 바이러스 감염(HCV), 헤르페스 단순 바이러스 1(HSV1), 거대세포바이러스(CMV), 림프구성 맥락수막염 바이러스(LCMV) 또는 엡스타인-바 바이러스(EBV)이다.
숙련가는 다수의 경우에 상기 이중특이성 분자가 치유를 제공하는 것이 아니라 단지 부분적인 이점을 제공할 수 있음을 안다. 일부 실시태양에서, 일부 이점을 갖는 생리학적 변화도 또한 치료학적으로 이로운 것으로 간주된다. 따라서, 일부 실시태양에서, 생리학적 변화를 제공하는 이중특이성 항체의 양은 "유효량" 또는 "치료 유효량"으로 간주된다.
추가의 태양에서, 본 발명은 개체에게 치료 유효량의 본 발명의 PD1에 특이적으로 결합하는 제1 항원-결합 부위 및 TIM3에 특이적으로 결합하는 제2 항원-결합 부위를 포함하는 이중특이성 항체를 투여함을 포함하는, 상기 개체에서 질병을 치료하는 방법을 제공한다. 하나의 실시태양에서, 본 발명의 이중특이성 항체를 약학적으로 허용 가능한 형태로 포함하는 조성물을 상기 개체에게 투여한다. 몇몇 실시태양에서, 상기 치료되는 질병은 증식성 질환이다. 특정한 실시태양에서 상기 질병은 암이다. 몇몇 실시태양에서 상기 방법은 상기 개체에게 치료 유효량의 적어도 하나의 추가적인 치료제, 예를 들어 상기 치료되는 질병이 암인 경우 항암제를 투여함을 추가로 포함한다. 또 다른 태양에서, 상기 질병은 만성 바이러스성 감염이다. 상기 실시태양 중 어느 하나에 따른 "개체"는 포유동물, 바람직하게는 인간일 수 있다.
질병의 예방 또는 치료를 위해서, 본 발명의 PD1에 특이적으로 결합하는 제1 항원-결합 부위 및 TIM3에 특이적으로 결합하는 제2 항원-결합 부위를 포함하는 이중특이성 항체의 적합한 투여량(단독으로 또는 하나 이상의 다른 추가적인 치료제와 함께 사용될 때)은 치료되는 질병의 유형, 투여 경로, 환자의 체중, 융합 단백질의 유형, 상기 질병의 중증도 및 과정, 상기 이중특이성 항체가 예방 또는 치료 목적으로 사용되는지의 여부, 선행하는 또는 동반되는 치료학적 중재, 환자의 임상 병력 및 상기 융합 단백질에 대한 반응, 및 주치의의 판단에 따라 변할 것이다. 상기 투여를 담당하는 의사는 어쨌든 조성물 중의 활성 성분의 농도 및 개인적인 피실험자의 적합한 용량을 결정할 것이다. 본 발명에서 비제한적으로 다양한 시점들에 걸친 단일 또는 수회 투여, 일시 투여, 및 펄스 주입을 포함한 다양한 투여 스케줄이 고려된다.
본 명세서에서 정의되는 바와 같은 PD1에 특이적으로 결합하는 제1 항원-결합 부위 및 TIM3에 특이적으로 결합하는 제2 항원-결합 부위를 포함하는 이중특이성 항체를 한번에 또는 일련의 치료에 걸쳐 환자에게 적합하게 투여한다. 상기 질병의 유형 및 중증도에 따라, 약 1 ㎍/㎏ 내지 15 ㎎/㎏(예를 들어 0.1 ㎎/㎏ 내지 10 ㎎/㎏)의 항체가, 예를 들어 1회 이상의 분리 투여에 의한 것이든 또는 연속 주입에 의한 것이든 간에, 상기 환자에게 투여하기 위한 초기 후보 투여량일 수 있다. 임의의 전형적인 1일 투여량은 상기 언급한 인자들에 따라 약 1 ㎍/㎏ 내지 100 ㎎/㎏ 또는 그 이상의 범위일 수 있다. 수일 이상에 걸쳐 반복된 투여를 위해서, 상기 조건에 따라, 상기 치료를 일반적으로는 질병 증상의 목적하는 억제가 발생할 때까지 지속할 수 있다. 상기 이중특이성 항체의 하나의 예시적인 투여량은 약 0.005 ㎎/㎏ 내지 약 10 ㎎/㎏의 범위일 것이다. 다른 예에서, 하나의 용량은 또한 투여당 약 1 ㎍/㎏ 체중, 약 5 ㎍/㎏ 체중, 약 10 ㎍/㎏ 체중, 약 50 ㎍/㎏ 체중, 약 100 ㎍/㎏ 체중, 약 200 ㎍/㎏ 체중, 약 350 ㎍/㎏ 체중, 약 500 ㎍/㎏ 체중, 약 1 ㎎/㎏ 체중, 약 5 ㎎/㎏ 체중, 약 10 ㎎/㎏ 체중, 약 50 ㎎/㎏ 체중, 약 100 ㎎/㎏ 체중, 약 200 ㎎/㎏ 체중, 약 350 ㎎/㎏ 체중, 약 500 ㎎/㎏ 체중 내지 약 1000 ㎎/㎏ 체중 이상 및 상기 범위 중에서 유도될 수 있는 임의의 범위를 포함할 수 있다. 여기에서 나열된 숫자들로부터 유도될 수 있는 범위의 예에서, 상술한 숫자를 기준으로 약 5 ㎎/㎏ 체중 내지 약 100 ㎎/㎏ 체중, 약 5 ㎍/㎏ 체중 내지 약 500 ㎎/㎏ 체중 등의 범위를 투여할 수 있다. 따라서, 약 0.5 ㎎/㎏, 2.0 ㎎/㎏, 5.0 ㎎/㎏ 또는 10 ㎎/㎏(또는 이들의 임의의 조합)의 1회 이상의 용량을 상기 환자에게 투여할 수 있다. 상기와 같은 용량을 간헐적으로, 예를 들어 매주 또는 3주마다(예를 들어 상기 환자가 약 2 내지 약 20회, 또는 예를 들어 약 6회 용량의 상기 융합 단백질을 수령하도록) 투여할 수 있다. 초기의 보다 높은 부하 용량에 이어서 하나 이상의 보다 낮은 용량을 투여할 수도 있다. 그러나, 다른 복용 섭생이 유용할 수도 있다. 상기 치료법의 진행을 통상적인 기법 및 분석에 의해 용이하게 모니터한다.
본 명세서에서 정의된 바와 같은 PD1에 특이적으로 결합하는 제1 항원-결합 부위 및 TIM3에 특이적으로 결합하는 제2 항원-결합 부위를 포함하는 이중특이성 항체를 일반적으로는 의도하는 목적을 성취하기에 유효한 양으로 사용할 것이다. 질병 상태의 치료 또는 예방에 사용하기 위해서, 본 발명의 이중특이성 항체, 또는 그의 약학 조성물을 치료 유효량으로 투여하거나 적용시킨다. 치료 유효량의 측정은 특히 본 명세서에 제공된 상세한 명세에 비추어 충분히 당해 분야의 숙련가들의 능력내에 있다.
전신 투여를 위해서, 치료 유효 용량을 초기에 시험관내 분석, 예를 들어 세포 배양 분석으로부터 추정할 수 있다. 이어서 1회 용량을 동물 모델에서 제형화하여 세포 배양물에서 측정된 바와 같은 IC50을 포함하는 순환 농도 범위를 성취할 수 있다. 상기와 같은 정보를 사용하여 인간에서 유용한 용량을 보다 정확하게 측정할 수 있다.
초기 투여량을 또한 생체내 데이터, 예를 들어 동물 모델로부터, 당해 분야에 주지된 기법을 사용하여 추정할 수 있다. 당해 분야의 통상적인 숙련가는 동물 데이터를 기준으로 인간에 대한 투여를 쉽게 최적화할 수 있다.
투여량 및 투여 간격을, 치료 효과를 유지시키기에 충분한 상기 이중특이성 항체의 혈장 수준을 제공하도록 개별적으로 조절할 수 있다. 주사에 의한 투여에 유용한 환자 투여량은 약 0.1 내지 50 ㎎/㎏/일, 전형적으로 약 0.5 내지 1 ㎎/㎏/일의 범위이다. 치료학적으로 유효한 혈장 수준은 매일 수회 용량의 투여에 의해 성취될 수 있다. 혈장 중 수준을 예를 들어 HPLC에 의해 측정할 수 있다.
국소 투여 또는 선택적인 흡수의 경우에, 상기 이중특이성 항체의 유효 국소 농도는 혈장 농도와 관련될 수 없다. 당해 분야의 숙련가는 과도한 실험 없이 치료학적으로 유효한 국소 투여량을 최적화할 수 있을 것이다.
본 명세서에 기재된 이중특이성 항체의 치료 유효량은 일반적으로, 실질적인 독성을 유발시키지 않으면서 치료학적 이점을 제공할 것이다. 융합 단백질의 독성 및 치료 효능을 세포 배양물 또는 실험 동물에서 표준 약학적 과정에 의해 측정할 수 있다. 세포 배양 분석 및 동물 연구를 사용하여 LD50(집단의 50%에 치명적인 용량) 및 ED50(집단의 50%에서 치료학적으로 유효한 용량)을 측정할 수 있다. 독성 및 치료 효과 사이의 용량비는 치료 지수이며, 이를 LD50/ED50 비로서 나타낼 수 있다. 큰 치료 지수를 나타내는 이중특이성 항체가 바람직하다. 하나의 실시태양에서, 본 발명에 따른 이중특이성 항체는 높은 치료 지수를 나타낸다. 세포 배양 분석 및 동물 연구로부터 획득된 데이터를 인간에 사용하기에 적합한 투여량 범위를 공식화하는데 사용할 수 있다. 상기 투여량은 바람직하게는 독성이 거의 또는 전혀 없이 ED50을 포함하는 순환 농도 범위내에 있다. 상기 투여량은 다양한 인자들, 예를 들어 사용되는 투여형, 사용되는 투여 경로, 피실험자의 조건 등에 따라 상기 범위내에서 변할 수 있다. 정확한 제형, 투여 경로 및 투여량은 환자의 조건에 비추어 개인 의사가 선택할 수 있다(예를 들어 문헌[Fingl et al., 1975, in: The Pharmacological Basis of Therapeutics, Ch. 1, p. 1](내용 전체가 본 발명에 참고로 인용된다)을 참조하시오).
본 발명의 이중특이성 항체로 치료되는 환자의 주치의는 독성, 기관 기능이상 등으로 인해 언제, 어떻게 투여를 종료, 중단 또는 조절해야 하는지를 알 것이다. 환언하면, 상기 주치의는 임상 반응이 적합하지 않은 경우 치료를 보다 높은 수준으로 조절해야 함을 또한 알 것이다(독성 제외). 관심 질환의 관리에서 투여되는 용량의 크기는 치료되는 상태의 중증도, 투여 경로 등에 따라 변할 것이다. 상기 상태의 중증도를 예를 들어 부분적으로 표준 예후 평가 방법에 의해 평가할 수 있다. 더욱이, 용량 및 추정상 용량 빈도가 또한 개별적인 환자의 연령, 체중, 및 응답에 따라 변할 것이다.
다른 작용제 및 치료
이전에 본 명세서에 기재된 바와 같은 PD1에 특이적으로 결합하는 제1 항원-결합 부위 및 TIM3에 특이적으로 결합하는 제2 항원-결합 부위를 포함하는 이중특이성 항체를 치료법에서 하나 이상의 다른 작용제와 함께 투여할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 융합 단백질을 적어도 하나의 추가적인 치료제와 공-투여할 수 있다. "치료제"란 용어는 치료가 필요한 개체에서 증상 또는 질병을 치료하기 위해 투여될 수 있는 임의의 작용제를 포함한다. 상기와 같은 추가적인 치료제는 치료되는 특정한 적응증에 적합한 임의의 활성 성분, 바람직하게는 서로 불리하게 영향을 미치지 않는 상보성 활성을 갖는 것을 포함할 수 있다. 몇몇 실시태양에서, 추가적인 치료제는 또 다른 항암제이다.
상기와 같은 다른 작용제들은 적합하게는 의도된 목적에 유효한 양으로 함께 존재한다. 상기와 같은 다른 작용제의 유효량은 사용되는 융합 단백질의 양, 질환 또는 치료의 유형 및 상기 논의된 다른 인자들에 따라 다르다. 상기 TNF과 리간드 삼량체-함유 항원 결합 분자를 일반적으로는 동일한 투여량으로, 본 명세서에 기재된 투여 경로로, 또는 본 명세서에 기재된 투여량의 약 1 내지 99%로, 또는 경험상/임상적으로 적합한 것으로 판정되는 임의의 경로에 의해 사용한다.
상기에 나타낸 상기와 같은 복합 요법은 병행 투여(2개 이상의 치료제가 동일한 또는 별도의 조성물 중에 포함되는 경우) 및 분리된 투여(이 경우 상기 이중특이성 항체의 투여는 상기 추가적인 치료제 및/또는 보조제의 투여 전, 상기 투여와 동시에, 및/또는 상기 투여에 이어서 발생할 수 있다)를 포함한다.
H. 제조 물품
본 발명의 또 다른 태양에서, 상술한 질환의 치료, 예방 및/또는 진단에 유용한 물질을 함유하는 제조 물품을 제공한다. 상기 제조 물품은 용기 및 상기 용기 상의 또는 상기 용기와 결합된 표지 또는 패키지 삽입물을 포함한다. 적합한 용기는 예를 들어 병, 바이알, 주사기, IV 용액 주머니 등을 포함한다. 상기 용기는 다양한 물질들, 예를 들어 유리 또는 플라스틱으로부터 형성될 수 있다. 상기 용기는 조성물을 단독으로, 또는 상태의 치료, 예방 및/또는 진단에 유효한 또 다른 조성물과 함께 유지하며 멸균 출입구를 가질 수 있다(예를 들어 상기 용기는 정맥내 용액 주머니 또는 피하주사 바늘에 의해 관통될 수 있는 마개를 갖는 바이알일 수 있다). 상기 조성물 중의 적어도 하나의 활성제는 이전에 본 명세서에서 정의된 바와 같은 PD1에 특이적으로 결합하는 제1 항원-결합 부위 및 TIM3에 특이적으로 결합하는 제2 항원-결합 부위를 포함하는 이중특이성 항체이다.
상기 표지 또는 패키지 삽입물은 상기 조성물이 선택 상태의 치료에 사용됨을 가리킨다. 더욱이, 상기 제조 물품은 (a) 조성물이 함유된 제1 용기(여기에서 상기 조성물은 본 발명의 이중특이성 항체를 포함한다); 및 (b) 조성물이 함유된 제2 용기(여기에서 상기 조성물은 추가의 세포독성제 또는 다른 치료제를 포함한다)를 포함할 수 있다. 본 발명의 상기 실시태양에서 제조 물품은 상기 조성물을 사용하여 특정 상태를 치료할 수 있음을 가리키는 패키지 삽입물을 추가로 포함할 수 있다.
한편으로, 또는 추가로, 상기 제조 물품은 약학적으로 허용 가능한 완충제, 예를 들어 주사용 정균수(BWFI), 포스페이트-완충된 염수, 링거액 및 덱스트로스 용액을 포함하는 제2(또는 제3) 용기를 추가로 포함할 수 있다. 상기 물품은 상업적 및 사용자 관점에서 바람직할 수 있는 다른 물질, 예를 들어 다른 완충제, 희석제, 필터, 바늘 및 주사기를 추가로 포함할 수도 있다.
[표 C]
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Figure pat00013
Figure pat00014
Figure pat00015
하기에서 본 발명의 구체적인 실시태양을 나열한다:
1. PD1에 특이적으로 결합하는 제1 항원-결합 부위 및 TIM3에 특이적으로 결합하는 제2 항원-결합 부위를 포함하는 이중특이성 항체로서,
상기 PD1에 특이적으로 결합하는 제1 항원-결합 부위는
(i) 서열번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1,
(ii) 서열번호 38의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및
(iii) 서열번호 39의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3
을 포함하는 VH 도메인; 및
(i) 서열번호 40의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1,
(ii) 서열번호 41의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및
(iii) 서열번호 42의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3
을 포함하는 VL 도메인
을 포함하고;
상기 TIM3에 특이적으로 결합하는 제2 항원-결합 부위는
(a) (i) 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1,
(ii) 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및
(iii) 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3
을 포함하는 VH 도메인; 및
(i) 서열번호 4 또는 서열번호 11 또는 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1,
(ii) 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및
(iii) 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3
을 포함하는 VL 도메인; 또는
(b) (i) 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1,
(ii) 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및
(iii) 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3
을 포함하는 VH 도메인; 및
(i) 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1,
(ii) 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및
(iii) 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3
을 포함하는 VL 도메인; 또는
(c) (i) 서열번호 29의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1,
(ii) 서열번호 30의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및
(iii) 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3
을 포함하는 VH 도메인; 및
(i) 서열번호 32의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1,
(ii) 서열번호 33의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및
(iii) 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3
을 포함하는 VL 도메인
을 포함한다.
2. PD1에 특이적으로 결합하는 제1 항원-결합 부위 및 TIM3에 특이적으로 결합하는 제2 항원-결합 부위를 포함하는 이중특이성 항체로서, 상기 이중특이성 항체는 상기 TIM3에, 상기 PD1에의 결합과 비교할 때 적어도 50배 더 낮은 결합 친화성으로, 보다 특히 상기 PD1에의 결합과 비교할 때 적어도 100배 더 낮은 결합 친화성으로 결합한다.
3. 이전에 본 명세서에서 정의된 바와 같은 이중특이성 항체로서,
상기 PD1에 특이적으로 결합하는 제1 항원-결합 부위는
(a) 서열번호 43의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열번호 44의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인, 또는
(b) 서열번호 45의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열번호 46의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인, 또는
(c) 서열번호 45의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열번호 47의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인, 또는
(d) 서열번호 45의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열번호 48의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인, 또는
(e) 서열번호 45의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열번호 49의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인
을 포함하고,
상기 TIM3에 특이적으로 결합하는 제2 항원-결합 부위는
(a) 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인, 또는
(b) 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인, 또는
(c) 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인, 또는
(d) 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인, 또는
(e) 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인, 또는
(f) 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인, 또는
(g) 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인, 또는
(h) 서열번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인
을 포함한다.
4. 이전에 본 명세서에서 정의된 바와 같은 이중특이성 항체로서,
PD1에 특이적으로 결합하는 제1 항원-결합 부위는 서열번호 45의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열번호 46의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하고,
TIM3에 특이적으로 결합하는 제2 항원-결합 부위는 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인, 또는 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함한다.
5. 이전에 본 명세서에서 정의된 바와 같은 이중특이성 항체로서,
PD1에 특이적으로 결합하는 제1 항원-결합 부위는 서열번호 45의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열번호 46의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하고,
TIM3에 특이적으로 결합하는 제2 항원-결합 부위는 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함한다.
6. 이전에 본 명세서에서 정의된 바와 같은 이중특이성 항체로서,
이중특이성 항체는 인간, 인간화된 또는 키메릭 항체이다.
7. 이전에 본 명세서에서 정의된 바와 같은 이중특이성 항체로서,
상기 이중특이성 항체는 Fc 도메인, PD1에 특이적으로 결합하는 항원-결합 부위를 포함하는 제1 Fab 단편 및 TIM3에 특이적으로 결합하는 항원-결합 부위를 포함하는 제2 Fab 단편을 포함한다.
8. 이전에 본 명세서에서 정의된 바와 같은 이중특이성 항체로서,
Fc 도메인은 IgG, 특히 IgG1 Fc 도메인 또는 IgG4 Fc 도메인이다.
9. 이전에 본 명세서에서 정의된 바와 같은 이중특이성 항체로서,
Fc 도메인은 Fc 수용체, 특히 Fcγ 수용체에 대한 결합을 감소시키는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다.
10. 이전에 본 명세서에서 정의된 바와 같은 이중특이성 항체로서,
Fc 도메인은 아미노산 돌연변이 L234A, L235A 및 P329G(카밧 EU 지수에 따른 넘버링)를 갖는 인간 IgG1 하위부류의 것이다.
11. 이전에 본 명세서에서 정의된 바와 같은 이중특이성 항체로서,
Fc 도메인은 상기 Fc 도메인의 제1 및 제2 서브유닛의 결합을 촉진하는 변형을 포함한다.
12. 이전에 본 명세서에서 정의된 바와 같은 이중특이성 항체로서,
Fc 도메인의 제1 서브유닛은 놉을 포함하고 Fc 도메인의 제2 서브유닛은 놉-인투-홀 방법에 따른 홀을 포함한다.
13. 이전에 본 명세서에서 정의된 바와 같은 이중특이성 항체로서,
Fc 도메인의 제1 서브유닛은 아미노산 치환 S354C 및 T366W(EU 넘버링)를 포함하고 상기 Fc 도메인의 제2 서브유닛은 아미노산 치환 Y349C, T366S 및 Y407V(카밧 EU 지수에 따른 넘버링)를 포함한다.
14. 이전에 본 명세서에서 정의된 바와 같은 이중특이성 항체로서,
Fab 단편 중 하나에서 가변 도메인 VL 및 VH는 상기 VH 도메인이 경쇄의 부분이고 상기 VL 도메인은 중쇄의 부분이도록 서로에 의해 교체된다.
15. 이전에 본 명세서에서 정의된 바와 같은 이중특이성 항체로서,
PD1에 특이적으로 결합하는 항원-결합 부위를 포함하는 제1 Fab 단편에서 가변 도메인 VL 및 VH는 서로에 의해 교체된다.
16. 이전에 본 명세서에서 정의된 바와 같은 이중특이성 항체로서,
Fab 단편 중 하나에서 불변 도메인 CL 중 124번 위치의 아미노산은 리신(K), 아르기닌(R) 또는 히스티딘(H)(카밧 EU 지수에 따른 넘버링)에 의해 독립적으로 치환되고, 불변 도메인 CH1 중 147번 및 213번 위치의 아미노산은 글루탐산(E) 또는 아스파트산(D)(카밧 EU 지수에 따른 넘버링)에 의해 독립적으로 치환된다.
17. 이전에 본 명세서에서 정의된 바와 같은 이중특이성 항체로서,
TIM3에 특이적으로 결합하는 항원-결합 부위를 포함하는 제2 Fab 단편에서 불변 도메인 CL 124번 위치의 아미노산은 리신(K), 아르기닌(R) 또는 히스티딘(H)(카밧 EU 지수에 따른 넘버링)에 의해 독립적으로 치환되고, 불변 도메인 CH1 중 147번 및 213번 위치의 아미노산은 글루탐산(E) 또는 아스파트산(D)(카밧 EU 지수에 따른 넘버링)에 의해 독립적으로 치환된다.
18. 이전에 본 명세서에서 정의된 바와 같은 이중특이성 항체로서,
(a) 서열번호 50의 서열에 적어도 95% 서열 일치성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄, 서열번호 52의 서열에 적어도 95% 서열 일치성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 제1 경쇄,
서열번호 51의 서열에 적어도 95% 서열 일치성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄, 및 서열번호 53의 서열에 적어도 95% 서열 일치성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 제2 경쇄, 또는
(b) 서열번호 54의 서열에 적어도 95% 서열 일치성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄, 서열번호 56의 서열에 적어도 95% 서열 일치성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 제1 경쇄,
서열번호 55의 서열에 적어도 95% 서열 일치성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄, 및 서열번호 57의 서열에 적어도 95% 서열 일치성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 제2 경쇄, 또는
(c) 서열번호 58의 서열에 적어도 95% 서열 일치성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄, 서열번호 60의 서열에 적어도 95% 서열 일치성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 제1 경쇄,
서열번호 59의 서열에 적어도 95% 서열 일치성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄, 및 서열번호 61의 서열에 적어도 95% 서열 일치성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 제2 경쇄, 또는
(d) 서열번호 62의 서열에 적어도 95% 서열 일치성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄, 서열번호 64의 서열에 적어도 95% 서열 일치성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 제1 경쇄,
서열번호 63의 서열에 적어도 95% 서열 일치성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄, 및 서열번호 65의 서열에 적어도 95% 서열 일치성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 제2 경쇄, 또는
(e) 서열번호 66의 서열에 적어도 95% 서열 일치성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄, 서열번호 68의 서열에 적어도 95% 서열 일치성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 제1 경쇄,
서열번호 67의 서열에 적어도 95% 서열 일치성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄, 및 서열번호 69의 서열에 적어도 95% 서열 일치성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 제2 경쇄
를 포함한다.
19. 이전에 본 명세서에서 정의된 바와 같은 이중특이성 항체로서,
(a) 서열번호 50의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄, 서열번호 52의 아미노산 서열을 포함하는 제1 경쇄,
서열번호 51의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄, 및 서열번호 53의 아미노산 서열을 포함하는 제2 경쇄, 또는
(b) 서열번호 54의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄, 서열번호 56의 아미노산 서열을 포함하는 제1 경쇄,
서열번호 55의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄, 및 서열번호 57의 아미노산 서열을 포함하는 제2 경쇄, 또는
(c) 서열번호 58의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄, 서열번호 60의 아미노산 서열을 포함하는 제1 경쇄,
서열번호 59의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄, 및 서열번호 61의 아미노산 서열을 포함하는 제2 경쇄, 또는
(d) 서열번호 62의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄, 서열번호 64의 아미노산 서열을 포함하는 제1 경쇄,
서열번호 63의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄, 및 서열번호 65의 아미노산 서열을 포함하는 제2 경쇄, 또는
(e) 서열번호 66의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄, 서열번호 68의 아미노산 서열을 포함하는 제1 경쇄,
서열번호 67의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄, 및 서열번호 69의 아미노산 서열을 포함하는 제2 경쇄
를 포함한다.
20. 이전에 본 명세서에서 정의된 바와 같은 이중특이성 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드.
21. 이전에 본 명세서에서 정의된 바와 같은 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터, 특히 발현 벡터.
22. 이전에 본 명세서에서 정의된 바와 같은 폴리뉴클레오타이드 또는 이전에 본 명세서에서 정의된 바와 같은 벡터를 포함하는 원핵생물 또는 진핵생물 숙주 세포.
23. a) 숙주 세포를, 이전에 본 명세서에서 정의된 바와 같은 이중특이성 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터로 형질전환시키고, b) 상기 숙주 세포를 상기 이중특이성 항체의 발현에 적합한 조건하에 따라 배양하고, c) 상기 이중특이성 항체를 상기 배양물로부터 회수하는 단계들을 포함하는, 상기 이중특이성 항체의 생산 방법.
24. 이전에 본 명세서에서 정의된 바와 같은 이중특이성 항체 및 적어도 하나의 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 약학 조성물.
25. 약제로서 사용하기 위한 이전에 본 명세서에서 정의된 바와 같은 이중특이성 항체 또는 이전에 본 명세서에서 정의된 바와 같은 약학 조성물.
26. i) 면역 응답의 조절, 예를 들어 T 세포 활성의 복원에,
ii) 면역 응답 또는 기능의 자극에,
iii) 감염의 치료에,
iv) 암의 치료에,
v) 암의 진행의 지연에,
vi) 암을 앓고 있는 환자의 생존의 연장에
사용하기 위한, 이전에 본 명세서에서 정의된 바와 같은 이중특이성 항체 또는 이전에 본 명세서에서 정의된 바와 같은 약학 조성물.
27. 암의 예방 또는 치료에 사용하기 위한, 이전에 본 명세서에서 정의된 바와 같은 이중특이성 항체 또는 이전에 본 명세서에서 정의된 바와 같은 약학 조성물.
28. 만성 바이러스성 감염의 치료에 사용하기 위한, 이전에 본 명세서에서 정의된 바와 같은 이중특이성 항체 또는 이전에 본 명세서에서 정의된 바와 같은 약학 조성물.
29. 암의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 이전에 본 명세서에서 정의된 바와 같은 이중특이성 항체 또는 이전에 본 명세서에서 정의된 바와 같은 약학 조성물로, 상기 이중특이성 항체가 화학요법제, 방사선 및/또는 암 면역요법에 사용하기 위한 다른 작용제와 함께 투여된다.
30. 개체에게 종양 세포의 성장을 억제시키기에 유효한 양의 이전에 본 명세서에서 정의된 바와 같은 이중특이성 항체를 투여함을 포함하는, 상기 개체에서 상기 종양 세포의 성장을 억제시키는 방법.
실시예
하기는 본 발명의 방법 및 조성물의 실시예이다. 다양한 다른 실시태양들을 실행하여, 상기에 제공된 일반적인 설명을 제공할 수 있음을 알 것이다.
물질 및 일반적인 방법
인간 면역글로불린 경쇄 및 중쇄의 뉴클레오타이드 서열에 관한 일반적인 정보를 문헌[Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)]에 제공한다. 항체 쇄의 아미노산들을 상기에서 정의된 바와 같은 카밧에 따른 넘버링 시스템에 따라 열거하고 지칭한다(문헌[Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)]).
재조합 DNA 기법
문헌[Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989]에 개시된 바와 같은 표준 방법을 사용하여 DNA를 조작하였다. 분자 생물학 시약들은 제조사의 설명서에 따라 사용하였다.
유전자 합성
목적하는 유전자 분절들을 화학 합성에 의해 제조된 올리고뉴클레오타이드로부터 제조하였다. 단일 제한 엔도뉴클레아제 절단 부위들이 측면에 인접해 있는 600 내지 1800 bp 길이 유전자 분절들을 PCR 증폭을 포함하여 올리고뉴클레오타이드의 어닐링 및 이어맞추기에 의해 조립하고 후속으로 지시된 제한 부위, 예를 들어 KpnI/SacI 또는 AscI/PacI를 통해 pPCRScript(스트라타진(Stratagene) 기재 pGA4 클로닝 벡터내로 클로닝시켰다. 서브클로닝된 유전자 단편의 DNA 서열을 DNA 서열분석에 의해 확인하였다. 유전자 합성 단편들을 진아트(Geneart)(독일 레겐스부르크 소재)에서 제공된 명세서에 따라 정렬시켰다.
DNA 서열 측정
DNA 서열을 메디게노믹스(MediGenomix) GmbH(독일 마르틴스트리드 소재) 또는 세퀴서브(Sequiserve) GmbH(독일 바테르스테텐 소재)에서 수행된 이중가닥 서열분석에 의해 측정하였다.
DNA 및 단백질 서열 분석 및 서열 데이터 처리
GCG(제네틱스 컴퓨터 그룹(Genetics Computer Group), 미국 위스콘신주 매디슨 소재) 소프트웨어 패키지 버전 10.2 및 인포맥스의 벡터 NT1 어드밴스 스위트 버전(Infomax's Vector NT1 Advance suite version) 8.0을 서열 생성, 맵핑, 분석, 주석 및 예시에 사용하였다.
발현 벡터
상기 개시된 항체의 발현을 위해서, CMV-인트론 A 프로모터가 있거나 없는 cDNA 기구 또는 CMV 프로모터를 갖는 게놈 기구를 기본으로 하는 일시 발현(예를 들어 HEK293) 세포용 발현 플라스미드의 변체들을 적용하였다.
항체 발현 카세트 외에 상기 벡터는
- 에스케리키아 콜라이에서 상기 플라스미드의 복제를 허용하는 복제 기원, 및
- 에스케리키아 콜라이에서 암피실린 내성을 부여하는 β-락타마제
를 함유하였다.
상기 항체 유전자의 전사 단위는 하기의 요소들로 구성되었다:
- 5' 단부에 독특한 제한 부위(들)
- 인간 거대세포바이러스로부터의 급초기 인헨서 및 프로모터,
- cDNA 기구의 경우에, 이어서 인트론 A 서열,
- 인간 항체 유전자의 5'-비번역 영역,
- 면역글로불린 중쇄 신호 서열,
- cDNA로서 또는 면역글로불린 엑손-인트론 기구를 갖는 게놈 기구로서 인간 항체 쇄(야생형이거나 또는 도메인 교환이 있는),
- 폴리아데닐화 신호 서열을 갖는 3' 비번역 영역, 및
- 3' 단부에 독특한 제한 부위(들).
하기에 개시하는 바와 같은 항체 쇄를 포함하는 융합 유전자를 PCR 및/또는 유전자 합성에 의해 생성시키고 공지된 재조합 방법 및 기법에 의해, 예를 들어 각각의 벡터 중의 독특한 제한 부위들을 사용하여 상응하는 핵산 분절들의 연결에 의해 조립하였다. 상기 서브클로닝된 핵산 서열들을 DNA 서열분석에 의해 확인하였다. 일시적인 형질감염을 위해서 보다 많은 양의 플라스미드를 형질전환된 에스케리키아 콜라이 배양물로부터의 플라스미드 제제에 의해 제조하였다(뉴클레오본드(Nucleobond) AX, 마슈레이-나겔(Macherey-Nagel)).
세포 배양 기법
표준 세포 배양 기법을 문헌[Current Protocols in Cell Biology (2000), Bonifacino, J.S., Dasso, M., Harford, J.B., Lippincott-Schwartz, J. and Yamada, K.M. (eds.), John Wiley & Sons, Inc.]에 개시된 바와 같이 사용하였다.
다중특이성 항체를 하기에 기재하는 바와 같이 부착 생육하는 HEK293-EBNA 또는 현탁액 중에서 생육하는 HEK29-F 세포 중의 각각의 발현 플라스미드의 일시적인 동시-형질감염에 의해 발현시켰다.
HEK293 시스템에서 일시적인 형질감염
모든 항체 및 이중특이성 항체를 프리스타일(Freestyle) 시스템(써모피셔(ThermoFisher))을 사용하여 293F 세포의 일시적인 형질감염에 의해 생산하였다. 여기에서 상기 293F 세포를 F17 배지에서 배양하고, 293프리(노바겐(Novagene))로 형질감염시키고, 4시간 후에 VPA 4 mM을 공급하고 16h 후에 공급물 7 및 0.6% 글루코스를 공급하였다. 추가로 Expi293F(상표) 발현 시스템 키트(써모피셔)를 사용하였다. 여기에서 상기 Expi293F(상표) 세포를 Expi293(상표) 발현 배지에서 배양하고 제조사의 설명에 따라 엑스피펙타민(ExpiFectamine)(상표) 293 형질감염 키트를 사용하여 형질감염시켰다. CH1/CL 접촉면(추가의 상세한 내용에 대해서 각 서열 중의 위치를 참조하시오) 중의 추가로 도입된 하전된 아미노산의 쌍을 갖는 CrossMabVh-VL 이중특이성 항체의 개선된 안정성 및 순도 및 감소된 응집 성향으로 인해 플라스미드 비의 조절을 사용하지 않았다. 따라서, 1+1 CrossMab의 경우 1:1:1:1 또는 2+2 CrossMab의 경우 1:1:1의 상대적인 플라스미드 비를 LC, HC, 교차된 LC 및 교차된 HC 플라스미드의 동시-형질감염에 사용하였다. 세포 상등액을 7일 후에 수확하고 표준 방법에 의해 정제시켰다.
단백질 측정
정제된 항체 및 유도체의 단백질 농도를 문헌[Pace, et al., Protein Science, 1995, 4, 2411-1423]에 따른 아미노산 서열을 토대로 계산된 몰 소광 계수를 사용하여, 280 ㎚에서 광학밀도(OD)를 측정함으로써 측정하였다.
상등액 중의 항체 농도 측정
세포 배양 상등액 중의 항체 및 유도체의 농도를 단백질 A 아가로스-비드(롯슈(Roche))에 의한 면역침전에 의해 추정하였다. 60 ㎕의 단백질 A 아가로스 비드를 TBS-NP40(50 mM 트리스, pH 7.5, 150 mM NaCl, 1% 노니뎃(Nonidet)-P40) 중에서 3회 세척하였다. 후속으로, 1 내지 15 ㎖ 세포 배양 상등액을 TBS-NP40에서 예비-평형화시킨 단백질 A 아가로스 비드에 적용하였다. 실온에서 1시간 배양 후에, 상기 비드를 울트라프리(Ultrafree)-MC-필터 컬럼(아미콘(Amicon))상에서 0.5 ㎖ TBS-NP40으로 1회, 0.5 ㎖ 2x 포스페이트 완충 염수로 2회(2xPBS, 롯슈) 및 0.5 ㎖ 100 mM Na-시트레이트 pH 5.0으로 간단히 4회 세척하였다. 결합된 항체를 35 ㎕ NuPAGE(등록상표) LDS 샘플 완충제(인비트로젠)의 첨가에 의해 용출시켰다. 상기 샘플의 절반을 각각 NuPAGE(등록상표) 샘플 환원제와 합하거나 또는 환원시키지 않고 두고, 70 ℃에서 10분 동안 가열하였다. 결과적으로, 5 내지 30 ㎕를 4 내지 12% NuPAGE(등록상표) 비스-트리스 SDS-PAGE(인비트로젠)(환원되지 않은 SDS-PAGE의 경우 MOPS 완충제로, 환원된 SDS-PAGE의 경우 NuPAGE(등록상표) 산화방지성 실행 완충제 첨가제(인비트로젠)와 함께 MES 완충제로)에 적용시키고 쿠마씨 블루로 염색하였다.
세포 배양 상등액 중의 항체 및 유도체의 농도를 친화성 HPLC 크로마토그래피에 의해 정량적으로 측정하였다. 간단히, 단백질 A에 결합하는 항체 및 유도체를 함유하는 세포 배양 상등액을 200 mM KH2PO4, 100 mM 나트륨 시트레이트, pH 7.4 중의 어플라이드 바이오시스템스 포로스(Applied Biosystems Poros) A/20 컬럼에 적용시키고, 에이질런트(Agilent) HPLC 1100 시스템상에서 200 mM NaCl, 100 mM 시트르산, pH 2.5로 상기 기질로부터 용출시켰다. 상기 용출된 단백질을 UV 흡광도 및 피크 면적의 적분에 의해 정량분석하였다. 정제된 표준 IgG1 항체는 표준으로서 작용하였다.
한편으로, 세포 배양 상등액 중의 항체 및 유도체의 농도를 샌드위치-IgG-ELISA에 의해 측정하였다. 간단히, 스트렙타웰 하이 바인드 스트렙파타비딘(StreptaWell High Bind Strepatavidin) A-96 웰 미세적정 플레이트(롯슈)를 실온에서 1시간 동안 또는 한편으로 4 ℃에서 밤새 100 ㎕/웰 비오틴화된 항-인간 IgG 포착 분자 F(ab')2<h-Fcγ>BI(다이아노바(Dianova)) 0.1 ㎍/㎖로 코팅하고 후속으로 200 ㎕/웰 PBS, 0.05% 트윈(PBST, 시그마)으로 3회 세척하였다. 각각의 항체 함유 세포 배양 상등액의 PBS(시그마) 중의 연속 희석물 100 ㎕/웰을 상기 웰에 가하고 실온에서 미세적정플레이트 진탕기상에서 1 내지 2시간 동안 배양하였다. 상기 웰을 200 ㎕/웰 PBST로 3회 세척하고 결합된 항체를 실온에서 미세적정플레이트 진탕기상에서 1 내지 2시간 동안 검출 항체로서 100 ㎕ F(ab')2<hFcγ>POD(다이아노바) 0.1 ㎍/㎖로 검출하였다. 결합되지 않은 검출 항체를 200 ㎕/웰 PBST로 3회 세척하고 결합된 검출 항체를 100 ㎕ ABTS/웰의 첨가에 의해 검출하였다. 흡광도의 측정을 405 ㎚(참조 파장 492 ㎚)의 측정 파장에서 테칸 플루오르(Tecan Fluor) 분광계상에서 수행하였다.
단백질 정제
단백질을 표준 프로토콜을 참조하여 여과된 세포 배양 상등액으로부터 정제하였다. 간단히, 항체를 단백질 A 세파로스 컬럼(GE 헬쓰케어)에 적용시키고 PBS로 세척하였다. 항체의 용출을 pH 2.8에서 성취한 다음 샘플을 즉시 중화시켰다. 응집된 단백질을 PBS 중에서 또는 20 mM 히스티딘, 150 mM NaCl pH 6.0 중에서 크기 배제 크로마토그래피(슈퍼덱스(Superdex) 200, GE 헬쓰케어)에 의해 단량체성 항체로부터 분리시켰다. 단량체성 항체 분획들을 모으고, 예를 들어 밀리포어 아미콘 울트라(MILLIPORE Amicon Ultra)(30 MWCO) 원심분리 농축기를 사용하여 농축시키고(필요한 경우), 동결시키고 -20 ℃ 또는 -80 ℃에서 보관하였다. 상기 샘플의 부분을 예를 들어 SDS-PAGE, 크기 배제 크로마토그래피(SEC) 또는 질량 분광분석법에 의한 후속의 단백질 분석 및 분석학적 특성화를 위해 제공하였다.
SDS-PAGE
NuPAGE(등록상표) Pre-Cast 젤 시스템(인비트로젠)을 제조사의 설명에 따라 사용하였다. 특히, 10% 또는 4 내지 12% NuPAGE(등록상표) 노벡스(Novex)(등록상표) 비스-트리스 Pre-Cast 젤(pH 6.4) 및 NuPAGE(등록상표) MES(환원된 젤, NuPAGE(등록상표) 산화방지제 실행 완충제 첨가제와 함께) 또는 MOPS(환원되지 않은 젤) 실행 완충제를 사용하였다.
분석학적 크기 배제 크로마토그래피
항체의 응집 및 올리고머성 상태의 측정을 위한 크기 배제 크로마토그래피(SEC)를 HPLC 크로마토그래피에 의해 수행하였다. 간단히, 단백질 A 정제된 항체를 에이질런트 HPLC 1100 시스템상에서 300 mM NaCl, 50 mM KH2PO4/K2HPO4, pH 7.5 중의 토소(Tosoh) TSKgel G3000SW 컬럼에 또는 다이오넥스(Dionex) HPLC-시스템상에서 2xPBS 중의 슈퍼덱스(Superdex) 200 컬럼(GE 헬쓰케어)에 적용시켰다. 상기 용출된 단백질을 UV 흡광도 및 피크 면적의 적분에 의해 정량분석하였다. 바이오래드(BioRad) 젤 여과 표준 151-1901은 표준으로서 작용하였다.
질량 분광분석법
본 섹션은 올바른 조립체를 강조하면서 VH/VL 교환을 갖는 다중특이성 항체(VH/VL CrossMab)를 기재한다. 예상되는 1차 구조물을 탈글리코실화된 완전한 CrossMab 및 탈글리코실화된/플라스민 절단된 또는 한편으로 탈글리코실화된/제한된 LysC 절단된 CrossMab의 전기분무 이온화 질량 분광분석법(ESI-MS)에 의해 분석하였다.
상기 VH/VL CrossMab를 1 ㎎/㎖의 단백질 농도에서 17h 이하 동안 37 ℃에서 포스페이트 또는 트리스 완충제 중의 N-글리코시다제로 탈글리코실화시켰다. 상기 플라스민 또는 제한된 LysC(롯슈) 절단을 각각 실온에서 120 시간 동안 37 ℃에서 40분 동안 트리스 완충제 pH 8 중의 100 ㎍ 탈글리코실화된 VH/VL CrossMab로 수행하였다. 질량 분광분석에 앞서, 상기 샘플을 세파덱스(Sephadex) G25 컬럼(GE 헬쓰케어)상에서 HPLC를 통해 탈염시켰다. 총 질량을 트라이벌사 나노메이트(TriVersa NanoMate) 소스(애드비온(Advion))가 구비된 maXis 4G UHR-QTOF MS 시스템(브룩커 달토닉(Bruker Daltonik))상에서 ESI-MS를 통해 측정하였다.
표면 플라스몬 공명(SPR)(BIACORE)을 사용하는 각 항원에 대한 다중특이성 항체의 결합 및 결합 친화성의 측정
각 항원에 대해 생산된 항체의 결합을 BIACORE 장비(GE 헬쓰케어 바이오사이언시즈 AB, 스웨덴 웁살라 소재)를 사용하여 표면 플라스몬 공명에 의해 조사한다. 간단히, 친화성 측정을 위해서 염소-항-인간 IgG, JIR 109-005-098 항체를 각 항원에 대한 항체의 제공을 위해 아민 커플링을 통해 CM5 칩상에 고정화시킨다. 결합을 HBS 완충제(HBS-P(10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 0.005% 트윈 20, ph 7.4), 25 ℃(또는 한편으로 37 ℃)에서 측정한다. 항원(R&D 시스템스 또는 사내 정제된)을 용액 중에서 다양한 농도로 가하였다. 결합을 80초 내지 3분의 항원 주입에 의해 측정하고; 해리를 3 내지 10분 동안 HBS 완충제로 상기 칩 표면을 세척함으로써 측정하고 KD 값을 1:1 랭뮤어 결합 모델을 사용하여 평가하였따. 음성 대조용 데이터(예를 들어 완충제 곡선)를 시스템 고유 기준선 드리프트의 보정 및 소음 신호 감소를 위해 샘플 곡선으로부터 공제한다. 각각의 Biacore 평가 소프트웨어를 센서그램의 분석 및 친화성 데이터의 계산을 위해 사용한다.
TIM3 항체
실시예 1a: 항-TIM3 항체의 생산
마우스의 면역화
NMRI 마우스를, 100 ug 벡터 DNA의 피내 적용에 이어서 일렉트로포레이션(2 제곱 펄스의 1000 V/㎝, 지속시간 0.1 ms, 간격 0.125 s; 이어서 4 제곱 펄스의 287.5 V/㎝, 지속시간 10 ms, 간격 0.125 s. 마우스에게 0, 14, 28, 42, 56, 70 및 84일째에 6회 연속적인 면역화를 제공하였다. 36, 78 및 92일째에 채혈하고 혈청을 제조하였으며, 이를 ELISA에 의한 역가 측정(하기 참조)에 사용하였다)에 의해 완전길이 인간 Tim-3를 암호화하는 플라스미드 발현 벡터(플라스미드 15304_hTIM3-fl)를 사용하여 유전학적으로 면역시켰다. 가장 높은 역가를 갖는 동물을 96일째에 50 ug의 재조합 인간 Tim-3 인간 Fc 키메라의 정맥내 주사에 의한 추가접종을 위해 선택하고, 단클론 항체를 추가접종 후 3일째에 골수종 세포주에의 비장세포의 융합에 의한 하이브리도마 기술에 의해 단리하였다.
혈청 역가의 측정(ELISA)
인간 재조합 Tim-3 인간 Fc 키메라를 PBS 중의 0.3 ug/㎖, 100 ㎕/웰로 96-웰 NUNC 맥시솝(Maxisorp) 플레이트상에 고정화시킨 다음; 상기 플레이트를 PBS 중 2% 크로테인 C, 200 ㎕/웰로 차단시키고; PBS 중 0.5% 크로테인 C, 100 ㎕/웰에서 항혈청을 중복해서 연속 희석하고; HRP-접합된 염소 항-마우스 항체(잭슨 임뮤노리써치/다이아노바(Jackson Immunoresearch/Dianova) 115-036-071; 1/16 000)로 검출하였다. 모든 단계에 대해서, 플레이트를 37 ℃에서 1시간 동안 배양시켰다. 모든 단계들 사이에서, 플레이트를 PBS 중의 0.05% 트윈 20으로 3회 세척하였다. 용해성 BM 블루 POD 기질(롯슈), 100 ul/웰의 첨가에 의해 신호를 발생시켰으며; 1M HCl, 100 ul/웰의 첨가에 의해 정지시켰다. 흡광도를, 참조로서 690 ㎚에 대해, 450 ㎚에서 판독하였다. 역가는 최대-절반 신호를 생성시키는 항혈청의 희석으로서 정의되었다.
실시예 1b: 항-TIM3 항체 특성화
TIM3에 대한 ELISA
Nunc-맥시솝 스트렙트아비딘 플레이트(마이크로코트(MicroCoat) #11974998/MC1099)를 Tim3-ECD-His-비오틴(BirA 리가제에 의해 비오틴화됨)이 있는 25 ㎕/웰에 의해 코팅하고 400 rpm 회전으로 진탕시키면서 RT에서 1시간 동안 배양시켰다. 세척(PBST-완충제에 의해 3x90 ㎕/웰) 후에 25 ㎕ aTim3 샘플 또는 희석된(1:2 단계) 참조 항체 aTim3 F38-2E2(바이오레전드(Biolegend))를 가하고 RT에서 1시간 배양하였다. 세척(PBST-완충제에 의해 3x90 ㎕/웰) 후에 25 ㎕/웰 양-항-마우스-POD(GE NA9310V)를 1:9000 희석으로 가하고 400 rpm 회전으로 진탕시키면서 RT에서 1시간 동안 배양시켰다. 세척(PBST-완충제에 의해 3x90 ㎕/웰) 후에 25 ㎕/웰 TMB 기질(칼바이오켐(Calbiochem), #CL07)을 가하고 OD 1.5-2.5까지 배양시켰다. 이어서 상기 반응을 25 ㎕/웰 1N HCL-용액의 첨가에 의해 정지시켰다. 측정을 370/492 ㎚에서 수행하였다.
ELISA 결과를 하기 요약 표 1에서 EC50-값[ng/㎖]으로서 나열한다.
TIM3에 대한 세포 ELISA
완전길이 인간 Tim3을 암호화하는 플라스미드 15312_hTIM3-fl_pUC_Neo로 안정하게 형질감염되고 G418(플라스미드상의 네오마이신 내성 마커)로 선택된 부착성 CHO-K1 세포주를 384-웰 편평 바닥 플레이트에 1.2x10E6 세포/㎖의 농도로 시딩하고 밤새 증식시켰다.
다음날 25 ㎕/웰 Tim3 샘플 또는 aTim3 참조 항체 F38-2E2 무 아지드(바이오레전드, 354004)를 가하고 4 ℃에서 2시간 동안 배양시켰다(내면화를 피하기 위해서). 세척(3x90 ㎕/웰 PBST(BIOTEK 세척제: Prog. 29, 1x90) 후에 세포를, 잔류 완충제를 튀겨 날리고 50 ㎕/웰 0.05% 글루타르알데하이드: 1:500의 1xPBS-완충제 중의 25% 글루타르알데하이드(시그마 Cat.No: G5882)를 가하여 고정시키고 RT에서 1시간 동안 배양시켰다. 세척(3x90 ㎕/웰 PBST(BIOTEK 세척제: Prog. 21, 3x90 그레인리신(GreinLysin)) 후에 25 ㎕/웰 2차 항체를 검출(양-항-마우스-POD; 양고추냉이 PDO 결합된 F(ab')2 단편; GE NA9310)을 위해 가한 다음 400 rpm에서 진탕시키면서 RT에서 2시간 배양시켰다. 세척(3x90 ㎕/웰 PBST(BIOTEK 세척제: Prog. 21, 3x90 그레인리신) 후에 25 ㎕/웰 TMB 기질 용액(롯슈 11835033001)을 가하고 OD 1.5-2.5까지 배양시켰다. 이어서 상기 반응을 25 ㎕/웰 1N HCL-용액의 첨가에 의해 정지시켰다. 측정을 370/492 ㎚에서 수행하였다.
세포 ELISA 결과를 하기 요약 표 1에서 "EC50 CHO-Tim3" 값[ng/㎖]으로서 나열한다.
[표 1]
Figure pat00016
TIM3 항체의 BIAcore 특성화
표면 플라스몬 공명(SPR) 기재 분석을 사용하여 다수의 쥐 Tim3 결합제들뿐만 아니라 상업적인 인간 Tim3 결합 참조들간의 결합의 동역학적 매개변수들을 측정하였다. 따라서, 항-마우스 IgG를 아민 커플링에 의해 (BIAcore) CM5 센서 칩의 표면에 고정화시켰다. 이어서 상기 샘플을 포획하고 단량체성 hu/cy Tim3-ECD뿐만 아니라 Fc-태그된 인간 Tim3-ECD 이량체를 상기에 결합시켰다. 상기 센서 칩 표면을 각 분석 주기 후에 재생시켰다. 상기 데이터를 1:1 랭뮤어 상호작용 모델에 적합시켜 최종적으로 평형 상수 KD를 획득하였다.
약 12000 응답 단위(RU)의 30 ㎍/㎖ 항-마우스 IgG(GE 헬쓰케어 #BR-1008-38)를, GE 헬쓰케어에 의해 공급된 아민 커플링 키트를 사용하여 pH 5.0에서 BIAcore B4000에서 CM5 센서 칩의 유동 셀 1-4의 1, 2, 4 및 5 스폿(스폿 1, 5는 활성이고 스폿 2, 4는 참조 스폿이다)상에 커플링시켰다.
상기 샘플 및 실행 완충제는 HBS-EP+(0.01 M HEPES, 0.15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0.05% v/v 계면활성제 P20, pH 7.4)였다. 유동 셀 온도를 25 ℃로 설정하고 샘플 구획 온도를 12 ℃로 설정하였다. 상기 시스템을 실행 완충제로 초회 자극하였다.
상기 샘플을 30초 동안 200 ㎍/㎖의 농도로 주입하고 각 유동 셀의 스폿 1 및 5에 결합시켜, 8개의 샘플이 나란히 측정되게 하였다. 이어서 상이한(단량체성 시노, 단량체성 인간 및 huFc 융합된 이량체성 인간 Tim3-ECD) 농도의 완전한 세트를 각 샘플에 대해 240s에 이어서 30/1800s의 해리 시간 동안 주입하였다. 이어서 각 분석 주기(샘플 포획, 스폿 1 및 5 - Tim3 ECD 주입)를 글리신-HCl pH 1.7의 30초 길이 주입에 의해 재생시켰다. 유량은 전체 실행 동안 30 ㎕/분으로 설정하였다.
최종적으로 상기 이중 참조 데이터를 BIAcore B4000 평가 소프트웨어로 1:1 랭뮤어 상호작용 모델에 적합시켰다. 단량체성 인간, 시노 Tim3 및 huFc 융합된 이량체성 인간 Tim3에 대해 생성되는 친화성을 표 2a에 나타낸다. 상기 hu Tim3 이량체에 대한 친화성은 가장 있음직하게는 결합활성에 의해 영향을 받는 듯하며 따라서 상기 친화성은 단량체성 huTim3에 대한 친화성보다 명백히 더 강하다.
[표 2a]
Figure pat00017
SPR을 통한 Tim3에 대한 친화성의 측정(키메릭 TIM3-0016 변체(0018) 및 인간화된 버전)
단백질 A를 (Biacore) CM5 센서 칩의 표면에 아민 커플링에 의해 고정화시켰다. 이어서 상기 샘플을 포획하고 hu Tim3-ECD를 상기에 결합시켰다. 상기 센서 칩 표면을 각 분석 주기 후에 재생시켰다. 평형 상수 및 동역학적 속도 상수를 최종적으로, 상기 데이터를 1:1 랭뮤어 상호작용 모델에 적합시킴으로써 획득하였다.
약 2000 응답 단위(RU)의 20 ㎍/㎖ 단백질 A를, GE 헬쓰케어에 의해 공급된 아민 커플링 키트를 사용하여 Biacore B4000 장비에서 CM5 센서 칩의 모든 유동 셀의 1, 2, 4 및 5 스폿상에 커플링시켰다.
상기 샘플 및 실행 완충제는 HBS-EP+(0.01 M HEPES, 0.15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0.05% v/v 계면활성제 P20, pH 7.4)였다. 유동 셀 온도를 25 ℃로 설정하고 샘플 구획 온도를 12 ℃로 설정하였다. 상기 시스템을 실행 완충제로 초회 자극하였다.
상이한 샘플들을 30초 동안 10 nM의 농도로 주입하고 모든 유동 셀 중의 스폿 1 및 5에 연속적으로 결합시켰다. 이어서 단량체성 인간 Tim3-ECD 희석물의 완전한 세트(600 nM, 200 nM, 66.7 nM, 2x22.2 nM, 7.4 nM, 2.5 nM 및 2x0 nM)를 300s 동안 각 샘플 상에 연속적으로 주입하였다. 각 항원 주입에 이어서 12s/1000s의 해리 시간 및 2회의 30s 재생 단계(글리신-HCl pH 1.5 용액에 의해)를 수행하였으며, 이중 마지막 하나는 20초의 주입 후 안정화 기간을 함유하였다.
최종적으로 상기 이중 참조 데이터를 Biacore B4000 평가 소프트웨어를 사용하여 1:1 랭뮤어 상호작용 모델에 적합시켰다. 생성되는 KD 값을 표 2b에 나타낸다.
SPR을 통한 Tim3에 대한 친화성의 측정((키메릭 TIM3-0028 및 인간화된 버전))
항-인간 Fc IgG를 (Biacore) CM5 센서 칩의 표면에 아민 커플링에 의해 고정화시켰다. 이어서 상기 샘플을 포획하고 hu Tim3-ECD를 상기에 결합시켰다. 상기 센서 칩 표면을 각 분석 주기 후에 재생시켰다. 평형 상수 및 동역학적 속도 상수를 최종적으로, 상기 데이터를 1:1 랭뮤어 상호작용 모델에 적합시킴으로써 획득하였다.
약 2500 응답 단위(RU)의 10 ㎍/㎖ 항-인간 Fc IgG(GE 헬쓰케어 #BR-1008-39)를, GE 헬쓰케어에 의해 공급된 아민 커플링 키트를 사용하여 Biacore B4000 장비에서 CM5 센서 칩의 모든 유동 셀의 1, 2, 4 및 5 스폿상에 커플링시켰다.
상기 샘플 및 실행 완충제는 HBS-EP+(0.01 M HEPES, 0.15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0.05% v/v 계면활성제 P20, pH 7.4)였다. 유동 셀 온도를 25 ℃로 설정하고 샘플 구획 온도를 12 ℃로 설정하였다. 상기 시스템을 실행 완충제로 초회 자극하였다.
상이한 샘플들을 30초 동안 10 nM의 농도로 주입하고 모든 유동 셀의 스폿 1 및 5에 연속적으로 결합시켰다. 이어서 단량체성 인간 Tim3-ECD 희석물의 완전한 세트(600 nM, 200 nM, 66.7 nM, 2x22.2 nM, 7.4 nM, 2.5 nM 및 2x0 nM)를 300s 동안 각 샘플 상에 연속적으로 주입하였다. 각 항원 주입에 이어서 12s/700s의 해리 시간 및 2회의 30s 재생 단계(3 M MgCl2 용액에 의해)를 수행하였으며, 이중 마지막 하나는 실행 완충제에 의한 "주입 후 여분의 세척"을 함유하였다.
최종적으로 상기 이중 참조 데이터를 Biacore B4000 평가 소프트웨어를 사용하여 1:1 랭뮤어 상호작용 모델에 적합시켰다. 생성되는 KD 값을 표 2b에 나타낸다.
[표 2b]
Figure pat00018
실시예 2: 항-TIM3 항체 유도체의 생산
키메릭 항체 유도체
키메릭 Tim3 항체를, PCR을 통해 항-TIM3 마우스 항체 Tim3-0016, Tim3-0016 변체(0018), Tim3-0021, Tim3-0022, Tim3-0026, Tim3-0028, Tim3-0030, 및 Tim3-0033, Tim3-0038의 가변 중쇄 및 경쇄 영역을 증폭시키고 이들을 효과기 기능을 없애는 LALA 및 PG 돌연변이(류신 234에서 알라닌으로, 류신 235에서 알라닌으로, 프롤린 329에서 글리신으로)를 갖는 인간 IgG1 주쇄/인간 CH1-힌지-CH2-CH3와의 융합 단백질로서 중쇄 발현 벡터내에 및 인간 C-카파에 대한 융합 단백질로서 경쇄 발현 벡터내에 클로닝시킴으로써 생산하였다. 이어서 LC 및 HC 플라스미드를 HEK293내에 동시형질감염시키고 7일 후에 항체 정제에 대한 표준 방법에 의해 상등액으로부터 정제시켰다.
글리코실화 부위 NYT의 제거: Q 또는 S에 의한 N의 치환에 의한 Tim3-0016, Tim3_0016 변체(0018 또는 Tim_0018이라 명명함) 중의 1 HVR-L1 위치의 변형
Tim3_0016 및 Tim3_0016 변체(0018)의 가변 경쇄 영역내 돌연변이를, 제조사의 설명에 따라 에이질런트(Agilent) "퀵 체인지 라이트닝(Quick Change Lightning) 부위-지향된 변이도입 키트"를 사용하여 시험관내 변이도입에 의해 생성시켰다. 상기 방법에 의해 경쇄 HVR-L1(서열번호 4) 중의 글리코실화 부위 동기 NYT의 아스파라진(N)을 글루타민(Q)에 의해 치환시키거나(서열번호 11 = Tim3_0016_HVR-L1 변체 1_ NQ가 생성된다), 또는 한편으로 상기 아스파라진(N)을 세린(S)에 의해 치환시켰다(서열번호 12 = Tim3_0016_HVR-L1 변체 2_ NS가 생성된다). 상기 둘 모두에서, 글리코실화 부위 동기 NYT가 성공적으로 변형되었다. 이어서 상기 변체들을 암호화하는 LC 및 HC 플라스미드를 HEK293내로 동시형질감염시키고 7일 후에 항체 정제에 대한 표준 방법에 의해 상등액으로부터 정제시켰다.
상기 생성된 돌연변이체를, 인간 Tim3상에서 ELISA, 시노몰구스 Tim3상에서 ELISA 및 완전길이 인간 Tim3을 발현하는 부착성 CHO-K1 세포상에서 세포성 ELISA에 의해 시험하였다.
[표 3]
Figure pat00019
생성된 모든 돌연변이체는 각각 모 항체 Tim3_0016 또는 Tim3_0016 항체 변체 Tim3_0018보다 인간 TIM3(인간), 시노 TIM3(시노) 또는 인간 TIMR에 훨씬 더 큰 기능적인 결합을 나타내는 것으로 밝혀졌다.
인간화된 항체 유도체
쥐 항-Tim3-0016 변체(0018) 및 항-Tim3_0028의 VH 및 VL 도메인의 인간화
a) 항-Tim3 항체 Tim3_0016 변체(0018)(6개 HVR의 아미노산 서열을 가지며, 여기에서 경쇄에서 HVR-L1 변체 2_NS(N에서 S로의 돌연변이에 의한 글리코실화 부위의 제거)가 사용되었다)의 VH 및 VL 도메인의 아미노산 서열을 기본으로 인간화된 항-Tim3 항체 변체 Tim3-0433 및 Tim3-0434를 생성시키고 b) 항-Tim3 항체 Tim3_0028의 VH 및 VL 도메인의 아미노산 서열을 기본으로 인간화된 항-Tim3 항체 변체 Tim3-0438 및 Tim3-0443을 생성시켰다.
상기 중쇄 및 경쇄 가변 영역에 대한 인간화된 아미노산 서열을 DNA로 역번역하고 생성되는 cDNA를 합성하고(GenArt) 이어서 효과기 기능을 없애는 LALA 및 PG 돌연변이(류신 234에서 알라닌으로, 류신 235에서 알라닌으로, 프롤린 329에서 글리신으로)를 갖는 인간 IgG1 주쇄/인간 CH1-힌지-CH2-CH3와의 융합 단백질로서 중쇄 발현 벡터내에 또는 인간 C-카파에 대한 융합 단백질로서 경쇄 발현 벡터내에 클로닝시켰다. 이어서 LC 및 HC 플라스미드를 HEK293내에 동시형질감염시키고 7일 후에 항체 정제에 대한 표준 방법에 의해 상등액으로부터 정제시켰다. 상기 생산되는 인간화된 Tim3-항체를 하기와 같이 명명한다:
[표 4]
Figure pat00020
[표 5]
Figure pat00021
실시예 3: 혼합 림프구 반응(MLR)에서 사이토킨 생성에 대한 인간 항-TIM-3 항체의 효과
혼합 림프구 반응을 사용하여 림프구 효과기 세포에 대한 TIM-3 경로의 차단 효과를 설명하였다. 상기 분석에서 T 세포를 항-TIM-3 mAb의 존재 또는 부재하에서 활성화 및 IFN-감마 분비에 대해 시험하였다.
인간 림프구를 류코셉(Leukosep)(그라이너 바이오 원(Greiner Bio One, 227 288))을 사용하여 밀도 구배 원심분리에 의해 건강한 공여자의 말초 혈액으로부터 단리하였다. 간단히, 헤파린 처리된 혈액을 3배 부피의 PBS로 희석하고 상기 희석된 혈액 중 25 ㎖ 분액들을 50 ㎖ 류코셉 튜브 중에 층상화하였다. 실온에서 15분 동안 800xg에서 원심분리(중단 없이) 후에 상기 림프구 함유 분획들을 수확하고, PBS에서 세척하고, 기능 분석에 바로 사용하거나 1.0E+07 세포/㎖로 동결 매질(10% DMSO, 90% FCS)에 재현탁시키고 액체 질소에서 보관하였다. 1:1 표적/응답 세포 비를 MLR 분석에 사용하였다(즉 각각의 MLR 배양물은 각 공여자로부터 -2.0E+0.5 PBMC를 총 200 ㎕의 부피로 함유하였다. 항-TIM3 단클론 항체 Tim3_0016, Tim3_0016 변체(Tim3_0018), Tim3_0021, Tim3_0022, Tim3_0026, Tim3_0028, Tim3_0030, Tim3_0033, Tim3_0038 및 F38-2E2(바이오레전드)를 상이한 항체 농도로 각 배양물에 가하였다. 항체가 없거나 또는 아이소타입 대조용 항체를 음성 대조용으로서 사용하였으며 rec hu IL-2(20 EU/㎖)를 양성 대조용으로서 사용하였다. 상기 세포를 37 ℃에서 6일 동안 배양하였다. 6일 후에 100 ㎕의 배지를 사이토킨 측정을 위해 각 배양물로부터 채취하였다. IFN-감마의 수준을 OptEIA ELISA 키트(BD 바이오사이언시즈)를 사용하여 측정하였다.
상기 결과를 표 6(IFN-g 분비/방출)에 나타낸다. 상기 항-TIM-3 단클론 항체는 T 세포 활성화 및 IFN-감마 분비를 농도 의존적인 방식으로 촉진하였다. 상기 항-TIM3 항체 Tim3_0021, Tim3_0022, Tim3_0028, 및 Tim3_0038은 상기 F38-2E2 항체보다 더 많이 염증성 사이토킨 IFN-감마)의 방출을 감소시킨다. Tim3_0016, Tim3_0016 변체(Tim3_0018), Tim3_0033 및 Tim3_0038은 상기 F38-2E2 항체에 비해 유사한 방출을 나타내었다. 대조적으로, 상기 아이소타입 대조용 항체를 함유하는 배양물은 IFN-감마 분비에서 증가를 나타내지 않았다.
[표 6a]
Figure pat00022
추가의 실험에서 0.1 ㎍/㎖ 항-PD1 mAb와 함께 하기의 키메릭 및 인간화된 항체(상술한 바와 같이 생성됨)의 EC50 값을 측정하였다: 키메릭 chi_Tim3_018 항체 및 그의 인간화된 버전 Tim3-433 및 Tim3-434, 키메릭 chi_Tim3_028 항체 및 그의 인간화된 버전 Tim3-438 및 Tim3-443을 상이한 림프구 공여자 혼합물(각각 D2 및 D3, 또는 D1 및 D5)에 대해 측정하였다. 결과를 표 6b에 나타낸다.
[표 6b]
Figure pat00023
PD1 항체
실시예 4: 항-PD-1 항체의 생산
마우스의 면역화
NMRI 마우스를, 100 ug 벡터 DNA(플라스미드 15300_hPD1-fl)의 피내 적용에 이어서 일렉트로포레이션(2 제곱 펄스의 1000 V/㎝, 지속시간 0.1 ms, 간격 0.125 s; 이어서 4 제곱 펄스의 287.5 V/㎝, 지속시간 10 ms, 간격 0.125 s)에 의해 완전길이 인간 PD-1을 암호화하는 플라스미드 발현 벡터(플라스미드 15300_hPD1-fl)를 사용하여 유전학적으로 면역시켰다. 마우스에게 0, 14, 28, 42, 56, 70 및 84일째에 6회 연속적인 면역화를 제공하였다. 36, 78 및 92일째에 채혈하고 혈청을 제조하였으며, 이를 ELISA에 의한 역가 측정(하기 참조)에 사용하였다). 가장 높은 역가를 갖는 동물을 96일째에 50 ug의 재조합 인간 PD1 인간 Fc 키메라의 정맥내 주사에 의한 추가접종을 위해 선택하고, 단클론 항체를 추가접종 후 3일째에 골수종 세포주에의 비장세포의 융합에 의한 하이브리도마 기술에 의해 단리하였다.
혈청 역가의 측정(ELISA)
인간 재조합 PD1 인간 Fc 키메라를 PBS 중의 0.3 ug/㎖, 100 ㎕/웰로 96-웰 NUNC 맥시솝 플레이트상에 고정화시킨 다음; 상기 플레이트를 PBS 중 2% 크로테인 C, 200 ㎕/웰로 차단시키고; PBS 중 0.5% 크로테인 C, 100 ㎕/웰에서 항혈청의 연속 희석물을 중복 적용하고; HRP-접합된 염소 항-마우스 항체(잭슨 임뮤노리써치/다이아노바 115-036-071; 1/16 000)로 검출하였다. 모든 단계에 대해서, 플레이트를 37 ℃에서 1시간 동안 배양시켰다. 모든 단계들 사이에서, 플레이트를 PBS 중의 0.05% 트윈 20으로 3회 세척하였다. 용해성 BM 블루 POD 기질(롯슈), 100 ul/웰의 첨가에 의해 신호를 발생시켰으며; 1M HCl, 100 ul/웰의 첨가에 의해 정지시켰다. 흡광도를, 참조로서 690 ㎚에 대해, 450 ㎚에서 판독하였다. 역가는 최대-절반 신호를 생성시키는 항혈청의 희석으로서 정의되었다.
실시예 5: 항-PD1 항체의 특성화/인간 PD1에 대한 항-PD1 항체의 결합
hu PD1에 대한 ELISA
Nunc 맥시솝 스트렙트아비딘 코팅된 플레이트(마이크로코트 #11974998001)를 비오틴화된 PD1-ECD-AviHis 25 ㎕/웰로 코팅하고 4 ℃에서 밤새 배양하였다. 세척(PBST-완충제에 의해 3x90 ㎕/웰) 후에 25 ㎕ 항 PD1 샘플 또는 참조 항체(인간 항 PD1; 롯슈/마우스 항 PD1/바이오레전드; cat.:329912)를 가하고 RT에서 1h 배양하였다. 세척(PBST-완충제에 의해 3x90 ㎕/웰) 후에 25 ㎕/웰 염소-항-인간 H+L-POD(JIR, JIR 109-036-088)/양-항-마우스-POD(GE 헬쓰케어; NA9310)를 1:2000/1:1000 희석으로 가하고 진탕기상에서 RT에서 1h 동안 배양시켰다. 세척(PBST-완충제에 의해 3x90 ㎕/웰) 후에 25 ㎕/웰 TMB 기질(롯슈 카탈로그 번호 11835033001)을 가하고 OD 2-3까지 배양시켰다. 측정을 370/492 ㎚에서 수행하였다.
ELISA 결과를 하기 요약 표 7 및 8에서 EC50-값[ng/㎖]으로서 나열한다.
PD1에 대한 세포 ELISA
완전길이 인간 PD1을 암호화하는 플라스미드 15311_hPD1-fl_pUC_Neo로 안정하게 형질감염되고 G418(플라스미드상의 네오마이신 내성 마커)로 선택된 부착성 CHO-K1 세포주를 384-웰 편평 바닥 플레이트에 0.01x10E6 세포/㎖의 농도로 시딩하고 밤새 증식시켰다.
다음날 25 ㎕/웰 PD1 샘플 또는 인간 항 PD1(롯슈)/마우스 항 PD1(바이오레전드(Biolegend); cat.:329912) 참조 항체를 가하고 4 ℃에서 2h 동안 배양시켰다(내면화를 피하기 위해서). 조심스럽게 세척(1x90 ㎕/웰 PBST) 후에 세포를, 1xPBS-완충제 중에서 희석된 30 ㎕/웰 0.05% 글루타르알데하이드(시그마, Cat.No: G5882, 25%))를 가하여 고정시키고 RT에서 10분 동안 배양시켰다. 세척(3x90 ㎕/웰 PBST) 후에 25 ㎕/웰 2차 항체를 검출: 염소-항-인간 H+L-POD(JIR, JIR 109-036-088)/양-항-마우스-POD(GE NA9310))을 위해 가한 다음 진탕기상에서 RT에서 1h 배양시켰다. 세척(3x90 ㎕/웰 PBST) 후에 25 ㎕/웰 TMB 기질 용액(롯슈 11835033001)을 가하고 OD 1.0-2.0까지 배양시켰다. 플레이트를 370/492 ㎚에서 판독하였다.
세포 ELISA 결과를 하기 요약 표 8에서 "EC50 CHO-PD1" 값[ng/㎖]으로서 나열한다.
시노 PD1에 대한 ELISA
Nunc 맥시솝 스트렙트아비딘 코팅된 플레이트(마이크로코트 #11974998001)를 비오틴화된 시노PD1-ECD-비오틴 25 ㎕/웰로 코팅하고 4 ℃에서 밤새 배양하였다. 세척(PBST-완충제에 의해 3x90 ㎕/웰) 후에 25 ㎕ 항 PD1 샘플 또는 참조 항체(인간 항 PD1; 롯슈)를 가하고 진탕기상에서 RT에서 1h 배양하였다. 세척(PBST-완충제에 의해 3x90 ㎕/웰) 후에 25 ㎕/웰 염소-항-인간 H+L-POD(JIR, JIR 109-036-088)를 1:1000 희석으로 가하고 진탕기상에서 RT에서 1h 동안 배양시켰다. 세척(PBST-완충제에 의해 3x90 ㎕/웰) 후에 25 ㎕/웰 TMB 기질(롯슈, 11835033001)을 가하고 OD 2-3까지 배양시켰다. 측정을 370/492 ㎚에서 수행하였다.
ELISA 결과를 하기 요약 표 7 및 8에서 EC50-값[ng/㎖]으로서 나열한다.
PD 리간드 1 교체 분석
Nunc 맥시솝 스트렙트아비딘 코팅된 플레이트(마이크로코트 #11974998001)를 비오틴화된 PD1-ECD-AviHis 25 ㎕/웰로 코팅하고 4 ℃에서 밤새 배양하였다. 세척(PBST-완충제에 의해 3x90 ㎕/웰) 후에 25 ㎕ 항 PD1 샘플 또는 참조 항체(마우스 항 PD1; 바이오레전드; cat.:329912)를 가하고 진탕기상에서 RT에서 1h 배양하였다. 세척(PBST-완충제에 의해 3x90 ㎕/웰) 후에 25 ㎕/웰 PD-L1(재조합 인간 B7-H1/PD-L1 Fc 키메라; 156-B7, R&D)를 가하고 진탕기상에서 RT에서 1h 동안 배양시켰다. 세척(PBST-완충제에 의해 3x90 ㎕/웰) 후에 25 ㎕/웰 염소-항-인간 H+L-POD(JIR, 109-036-088)를 1:1000 희석으로 가하고 진탕기상에서 1h 동안 RT에서 배양시켰다. 세척(PBST-완충제에 의해 3x90 ㎕/웰) 후에 25 ㎕/웰 TMB 기질(롯슈, 11835033001)을 가하고 OD 2-3까지 배양시켰다. 측정을 370/492 ㎚에서 수행하였다.
ELISA 결과를 하기 요약 표 7에서 IC50-값[ng/㎖]으로서 나열한다.
PD 리간드 2 교체 분석
Nunc 맥시솝 스트렙트아비딘 코팅된 플레이트(마이크로코트 #11974998001)를 비오틴화된 PD1-ECD-AviHis 25 ㎕/웰로 코팅하고 4 ℃에서 밤새 배양하였다. 세척(PBST-완충제에 의해 3x90 ㎕/웰) 후에 25 ㎕ 항 PD1 샘플 또는 참조 항체(마우스 항 PD1; 롯슈)를 가하고 진탕기상에서 RT에서 1h 배양하였다. 세척(PBST-완충제에 의해 3x90 ㎕/웰) 후에 25 ㎕/웰 PD-L2(재조합 인간 B7-DC/PD-L2 Fc 키메라; 1224-PL-100, R&D)를 가하고 진탕기상에서 RT에서 1h 동안 배양시켰다. 세척(PBST-완충제에 의해 3x90 ㎕/웰) 후에 25 ㎕/웰 염소-항-인간 H+L-POD(JIR, 109-036-088)를 1:2000 희석으로 가하고 진탕기상에서 1h 동안 RT에서 배양시켰다. 세척(PBST-완충제로 3x90 ㎕/웰) 후에 25 ㎕/웰 TMB 기질(롯슈, 11835033001)을 가하고 OD 2-3까지 배양시켰다. 측정을 370/492 ㎚에서 수행하였다.
ELISA 결과를 하기 요약 표 7에서 IC50-값[ng/㎖]으로서 나열한다.
에피토프 맵핑 ELISA/결합 경쟁 분석
Nunc 맵시솝 플레이트(Nunc #464718)를 25 ㎕/웰 포획 항체(염소 항 마우스 IgG; JIR; 115-006-071)로 코팅하고 진탕기상에서 RT에서 1h 동안 배양하였다. 세척(PBST-완충제에 의해 3x90 ㎕웰) 후에 플레이트를 진탕기상에서 RT에서 2% BSA 함유 PBS 완충제로 1h 동안 차단시켰다. 세척(PBST-완충제에 의해 3x90 ㎕/웰) 후에 25 ㎕ 마우스 항 PD1 샘플을 가하고 진탕기상에서 RT에서 1h 배양시켰다. 세척(PBST-완충제에 의해 3x90 ㎕웰) 후에 포획 항체를 진탕기상에서 RT에서 30 ㎕/웰 마우스 IgG(JIR; 015-000-003)에 의해 1h 동안 차단시켰다. 동시에 비오틴화된 PD1-ECD-AviHis를 진탕기상에서 RT에서 1h 동안 2차 샘플 항체와 예비배양시켰다. 분석 플레이트 세척(PBST-완충제에 의해 3x90 ㎕/웰) 후에 PD1 항체 믹스를 분석 플레이트로 옮기고 진탕기상에서 RT에서 1h 동안 배양시켰다. 세척(PBST-완충제에 의해 3x90 ㎕/웰) 후에 25 ㎕/웰 스트렙트아비딘 POD(롯슈, #11089153001)를 1:4000 희석으로 가하고 진탕기상에서 1h 동안 RT에서 배양시켰다. 세척(PBST-완충제로 3x90 ㎕/웰) 후에 25 ㎕/웰 TMB 기질(롯슈, #11089153001)을 가하고 OD 1.5-2.5까지 배양시켰다. 측정을 370/492 ㎚에서 수행하였다. 에피토프 그룹은 참조 항체에 대한 계층적 클러스터링에 의해 한정되었다.
[표 7]
Figure pat00024
[표 8]
Figure pat00025
인간화된 항-PD-1 항체의 Biacore 특성화
표면 플라스몬 공명(SPR) 기재 분석을 사용하여 다수의 쥐 lPD1 결합제들뿐만 아니라 상업적인 인간 PD1 결합 참조들간의 결합의 동역학적 매개변수를 측정하였다. 따라서, 항-인간 IgG를 (Biacore) CM5 센서 칩 표면에의 아민 커플링에 의해 고정화시켰다. 이어서 상기 샘플을 포획하고 hu PD1-ECD를 상기에 결합시켰다. 상기 센서 칩 표면을 각 분석 주기후에 재생시켰다. 상기 데이터를 1:1 랭뮤어 상호작용 모델에 적합시킴으로써 평형 상수 및 동역학적 속도 상수를 최종적으로 획득하였다.
약 2000 응답 단위(RU)의 20 ㎍/㎖ 항-인간 IgG(GE 헬쓰케어 #BR-1008-39)를 GE 헬쓰케어에 의해 공급된 아민 커플링 키트를 사용하여 pH 5.0에서 Biacore T200 장비에서 CM5 센서 칩의 모든 유동 셀 1 및 2(선택적으로: 3 및 4)상에 커플링시켰다.
상기 샘플 및 실행 완충제는 HBS-EP+(0.01 M HEPES, 0.15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0.05% v/v 계면활성제 P20, pH 7.4)였다. 유동 셀 온도를 25 ℃로 설정하고 샘플 구획 온도를 12 ℃로 설정하였다. 상기 시스템을 실행 완충제로 초회 자극하였다.
상기 샘플들을 20초 동안 10 nM의 농도로 주입하고 두 번째 유동 셀에 결합시켰다. 이어서 인간 PD1-ECD 농도의 완전한 세트(144 nM, 48 nM, 16 nM, 5.33 nM, 1.78 nM, 0.59 nM, 2.0 nM 및 0 nM)를 120s 동안 각 샘플 상에 주입한 다음 30/300s의 해리 시간 및 2회의 20s 재생 단계(3 M MgCl2에 의해)를 수행하였으며, 이중 마지막 하나는 실행 완충제에 의한 "주입 후 여분의 세척"을 함유하였다.
최종적으로 상기 이중 참조 데이터를 Biacore T200 평가 소프트웨어를 사용하여 1:1 랭뮤어 상호작용 모델에 적합시켰다. 생성되는 KD, ka 및 kd 값을 표 9에 나타낸다.
[표 9]
Figure pat00026
표 9에 나타낸 바와 같이, 키메릭 PD1-0103의 모든 인간화된 버전(생성을 실시예 6을 참조하시오)은 모 항체(키메릭 PD1-0103)와 유사한 동역학적 성질들을 나타낸다.
동역학
CM5 센서 시리즈 S를 Biacore 4000 시스템상에 올려놓고 검출 스폿을 제조사의 설명에 따라 유체역학적으로 어드레스하였다.
다클론 토끼 IgG 항체<IgGFCγM>R(잭슨 임뮤노리써치 레보라토리즈 인코포레이티드)을 유동 셀 1, 2, 3 및 4 중의 검출 스폿 1 및 5상에 10 000 Ru로 고정화시켰다. 커플링은 제조사의 설명에 따라 EDC/NHS 화학을 통해 수행되었다. 상기 유동 셀 중의 남은 스폿은 참조로서 제공되었다. 상기 샘플 완충제는 1 ㎎/㎖ 카복시메틸덱스트란이 보충된 시스템 완충제였다.
하나의 실시태양에서 상기 분석을 25 ℃에서 구동시켰다. 또 다른 실시태양에서 상기 분석을 37 ℃에서 구동시켰다. 50 nM의 각 쥐 단클론 항체를 10 ㎕/분의 1 분 주입에 의해 상기 센서 표면상에 포획하였다. 후속으로 상기 각 항원을 100 nM, 2x33 nM, 11 nM, 4 nM, 1 nM 및 시스템 완충제 0 nM의 일련의 농도로 30 ㎕/분으로 4분 결합 단계 시간 동안 주입하였다. 해리를 추가로 4분 동안 모니터하였다. 상기 포획 시스템을 10 mM 글리신 pH 1.5의 3분 주입을 사용하여 30 ㎕/분으로 재생시켰다. 상대적인 동역학적 데이터를 제조사의 설명에 따라 Biacore 평가 소프트웨어를 사용하여 계산하였다.
에피토프 맵핑
Biacore 4000 장비를 Biacore CAP 센서와 함께 올려놓고 제조사에 의해 권장되는 바와 같이 준비하였다. 상기 장비 완충제는 HBS-ET(10 mM HEPES pH 7.4, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, 0.005% w/v 트윈 20)이었다. 상기 장비를 25 ℃에서 실행시켰다.
모든 샘플을 시스템 완충제로 희석하였다. 35 kDa 비오틴화된 항원 PD1-ECD-AviHis를 상기 유동 셀 1, 2, 3 및 4에서 스폿 1 및 5에서 30 ㎕/분의 1분 주입에 의해 상기 CAP 센서 표면상에 200 RU로 포획하였다. 또 다른 실시태양에서, 35 kDa 비오틴화된 항원 PD1-ECD-AviHis를 동일한 방식으로 상기 CAP 센서상에 200 RU로 포획하였다.
후속으로 1차 항체를 100 nM에서 3분 동안 30 ㎕/분으로 주입한 다음 2차 항체를 100 nM에서 3분 동안 30 ㎕/분으로 주입하였다. 상기 1차 항체를 표면 제공된 항원이 완전히 포화될 때까지 주입하였다. 상기 1차 및 2차 항체 주입 단계의 끝에서 리포트 포인트 "결합률"(BL)을 각 항체의 결합 응답의 모니터를 위해 설정하였다. 상기 2차 항체 결합 응답 "BL"과 상기 1차 항체 응답 "BL1"간의 몫인 몰비를 계산하였다. 상기 몰비를, 상기 항원이 이미 1차 항체에 의해 복합체화되었을 때, 상기 2차 항체의 항원 접근성의 지표로서 사용하였다.
상기 복합체를 제조사에 의해 권장된 바와 같이 30 ㎕/분 2M 구아니딘-HCL 250 mM NaOH 재생 완충제로 2분 동안 주입한 다음 30 ㎕/분의 시스템 완충제의 1분 주입에 의해 상기 센서 표면으로부터 완전히 제거하였다.
실시예 6: 혼합 림프구 반응(MLR)에서 사이토킨 생성에 대한 상이한 항-PD-1 항체의 효과
3A) 상기 혼합 림프구 반응(MLR)은 하나의 개체(공여자 X)로부터의 림프구의, 또 다른 개체(공여자 Y)로부터의 림프구에 대한 활성화를 측정하는 면역세포 분석이다. 혼합 림프구 반응을 사용하여 림프구 효과기 세포에 대한 PD1 경로의 차단 효과를 설명하였다. 상기 분석에서 T 세포를 항-PD1 mAb의 존재 또는 부재하에서 활성화 및 그의 IFN-감마 분비에 대해 시험하였다.
동종이계 MLR을 수행하기 위해서, 미지의 HLA 유형의 적어도 4명의 건강한 공여자로부터 말초 혈액 단핵세포(PBMC)를 류코셉(그라이너 바이오 원, 227 288)을 사용하여 밀도 구배 원심분리에 의해 단리하였다. 간단히, 헤파린 처리된 혈액을 3배 부피의 PBS로 희석하고 상기 희석된 혈액 중 25 ㎖ 분액들을 50 ㎖ 류코셉 튜브 중에 층상화하였다. 실온에서 15분 동안 800xg에서 원심분리(중단 없이) 후에 상기 림프구 함유 분획들을 수확하고, PBS에서 세척하고, 기능 분석에 바로 사용하거나 1.0E+07 세포/㎖로 동결 매질(10% DMSO, 90% FCS)에 재현탁시키고 액체 질소에서 보관하였다. 개별적인 2-원 MLR 반응을, 2명의 상이한 공여자로부터의 PBMC를 1:1 표적/응답 세포 비로 혼합함으로써 셋업하고 공-배양을 상이한 농도 범위의 정제된 항-PD1 단클론 항체 PD1-0050, PD1-0069, PD1-0073, PD1-0078, PD1-0098, PD1-0102, PD1-0103의 존재 또는 부재하에서 37 ℃, 5% CO2에서 6일 동안 편평바닥 96-웰 플레이트에서 적어도 중복 수행하였다. 참조 항-PD1 항체로서, 니보루맵(또한 MDX-5C4 또는 MDX-1106으로서 공지됨) 또는 펨브로리주맵(또한 MK-3475 또는 Org 1.09A로서 공지됨)의 VH 및 VL 도메인을 포함하는 항체를 합성하고 인간 IgG1(돌연변이 L234A, L235A 및 P329G(카밧의 EU 지수)를 갖는다)의 주쇄와 함께 클로닝시켰다. 항체가 없거나 또는 아이소타입 대조용 항체를 음성 대조용으로서 사용하였으며 rec hu IL-2(20 EU/㎖)를 양성 대조용으로서 사용하였다. 6일 후에 100 ㎕의 배지를 사이토킨 측정을 위해 각 배양물로부터 채취하였다. IFN-감마의 수준을 OptEIA ELISA 키트(BD 바이오사이언시즈)를 사용하여 측정하였다.
상기 결과를 표 10(IFN-g 분비/방출)에 나타낸다. 상기 항-PD1 단클론 항체는 T 세포 활성화 및 IFN-감마 분비를 농도 의존적인 방식으로 촉진하였다. 상기 IFNg 분비의 증가%의 값을 임의의 차단 mAb의 첨가 부재하의 MLR의 IFN-g(E-c로서 기본 동종이계 자극 유도된 IFNg) 및 20 EU/㎖ rec hu IL-2의 첨가와 함께 MLR의 IFNg(양성 대조용 = E+c로서 100% IFNg 값) 생성과 관련하여 계산하였으며 식: 상대적인 자극[%] = ((실시예 - E-c)/(E+c - E-c) * 100에 따라 계산하였다.
[표 10]
Figure pat00027
다수의 PD1 차단 항체 PD1-0050, PD1-0069, PD1-0073, PD1-0078, PD1-0098, PD1-0102, PD1-0103은 인터페론 감마(IFN-g)의 분비를 증대시킴으로써 강한 면역 조절 활성을 나타내었다(데이터가 모든 항체에 대해서 도시되지는 않았다).
3B) 추가의 실험에서 키메릭 PD1-0103(돌연변이 L234A, L235A 및 P329G(카밧의 EU 지수)를 갖는 인간 IgG1 아이소타입)을 평가하였다. 키메릭 PD1-0103에 의한 PD1의 봉쇄는 동종이계 자극된 1차 인간 T 세포에 의한 IFN-감마 분비를 강하게 증대시킨다. 키메릭 PD1-0103은 참조 항-PD1 항체보다 더 효능이 있다(도 1을 참조하시오).
비교를 위해서 니보루맵(또한 MDX5C4 또는 MDX-1106으로서 공지됨) 또는 펨브로리주맵(또한 MK-3475 또는 Org 1.09A로서 공지됨)의 VH 및 VL 도메인을 포함하는 참조 항-PD1 항체를 합성하고 인간 IgG1(돌연변이 L234A, L235A 및 P329G(카밧의 EU 지수)를 갖는다)의 주쇄와 함께 클로닝시켰다.
3C) 추가적인 실험에서 상기 항-PD-1 항체 PD1-0103(도 2 및 3에서 인간화된 항체 PD1-0103-0312, PD1-0103-0314, 하기 실시예 9를 또한 참조하시오)의 인간화된 변체의 면역 조절 활성 a) IFN 방출(분비) b) TNF-알파 방출(분비)을 상술한 바와 같이 MLR에서 평가하였다. 상기 키메릭 PD1-0103 항체 및 그의 인간화된 버전의 효과를 인간 IgG1(돌연변이 L234A, L235A 및 P329G(카밧의 EU 지수)를 갖는다)의 주쇄를 갖는 니보루맵(또한 MDX5C4 또는 MDX-1106으로서 공지됨) 또는 펨브로리주맵(또한 MK-3475 또는 Org 1.09A로서 공지됨)의 VH 및 VL 도메인을 포함하는 참조 항-PD1 항체와 비교하였다. MLR 배양 6일 후에, 50 ㎕의 상등액을 취하고 다중 사이토킨을 Bio-Plex Pro(상표) 인간 사이토킨 Th1/Th2 분석(바이오-래드 레보라토리즈 인코포레이티드)을 사용하여 단일 배양물에서 측정하였다(데이터를 모든 사이토킨에 대해서 나타내지는 않는다).
상기 키메릭 PD1-0103 항체 및 그의 인간화된 버전(PD1-0103_0312 및 PD1-0103_0314)은 T 세포 활성화 및 TNF-감마 분비의 증대에 있어서 상기 참조 항-PD1 항체에 비해 더 효능이 있었다(도 2를 참조하시오).
더욱 또한, 상기 키메릭 PD1-0103 항체 및 그의 인간화 변체는 항원 제공 세포에 의한 종양 괴사 인자 알파(TNF 알파)(도 3을 참조하시오) 및 IL-12(데이터 도시 안 됨) 분비를 증가시키고 T 세포를 자극하는 단핵세포/대식세포 또는 항원 제공 세포의 능력을 증대시킨다.
실시예 7: 동종이계 성숙한 수지상 세포와 공배양된 인간 CD4 T 세포에 의한 세포독성 그랜자임 B 방출 및 IFN-γ 분비에 대한 항-PD-1 봉쇄의 효과
동종이계 상황에서 항-PD-1 처리의 효과를 추가로 조사하기 위해서 우리는 새로 정제된 CD4 T 세포를 단핵세포-유래된 동종이계 성술한 수지상 세포(mDC)의 존재하에서 5일 동안 공배양하는 분석을 개발하였다. 단핵세포를 플라스틱 부착을 통해 1주일 전에 신선한 PBMC로부터 단리한 다음 비-부착 세포를 제거하였다. 이어서 우리는 상기 단핵세포를 GM-CSF(50 ng/㎖) 및 IL-4(100 ng/㎖)를 함유하는 배지에서 5일 동안 배양시킴으로써 상기 단핵세포로부터 미성숙 DC를 생성시켰다. iDC 성숙화를 유도하기 위해서 우리는 상기 배양 배지에 추가로 2일 동안 TNF-α, IL-1β 및 IL-6(각각 50 ng/㎖)을 가하였다. 이어서 우리는 주조직적합성 복합체 부류 II(MHCII), CD80, CD83 및 CD86의 표면 발현을 유식 세포측정(LSRFortessa, BD 바이오사이언시즈)을 통해 측정함으로써 DC 성숙화를 평가하였다.
최소 혼합 림프구 반응(mMLR) 당일에, CD4 T 세포를 관련없는 공여자로부터 수득한 108 PBMC로부터 미세비드 키트(밀테니 바이오텍(Miltenyi Biotec))를 통해 농축시켰다. 배양 전에, CD4 T 세포를 5 μM의 카복시-플루오레세인-숙신이미딜 에스터(CFSE)로 표지하였다. 이어서 105 CD4 T 세포를 차단 항-PD1 항체(PD1-0103, 키메릭 PD1-0103, 또는 인간화된 항체 PD1-0103-0312, PD1-0103-0313, PD1-0103-0314, PD1-0103-0315, 도 4a 및 4b에서 약어 0312, 0313, 0314, 0315)의 존재 또는 부재하에서 성숙한 알로-DC(5:1)와 함께 96 웰 플레이트에, 도면에 상이하게 표시되지 않는다면, 10 ㎍/㎖의 농도로 도말하였다.
5일 후에 우리는 상기 세포-배양 상등액을 수집하고, 이를 나중에 ELISA(R&D 시스템스)에 의해 IFN-γ 수준을 측정하는데 사용하며, 상기 세포를 골지 플러그(Golgi Plug)(브레펠딘(Brefeldin) A) 및 골지 스탑(Golgi Stop)(모넨신(Monensin))의 존재하에 37 ℃에서 추가로 5시간 동안 방치하였다. 이어서 상기 세포를 세척하고, 항-인간 CD4 항체 및 생/사 고정성 염료 아쿠아(인비트로젠)로 상기 표면상에서 염색한 후에 Fix/Perm 완충제(BD 바이오사이언스)로 고정/투과시켰다. 우리는 그랜자임 B(BD 바이오사이언스), IFN-γ 및 IL-2(둘 다 e바이오사이언스로부터)에 대한 세포내 염색을 수행하였다.
우리는 또한 상이한 농도의 상기 인간화된 변체 PD1-103(인간화된 항체 PD1-0103-0312, PD1-0103-0313, PD1-0103-0314, PD1-0103-0315, 도면에서 0312, 0313, 0314, 0315로서 약기됨, 또한 하기 실시예 9를 참조하시오)을 시험하였으며 이들이 그랜자임 B 및 인터페론 감마의 증대에 균등하게 양호함을 발견하였다. DP47은 FcγR에 의한 인식을 피하기 위해서 상기 Fc 부분에 LALA 돌연변이를 갖는 결합되지 않은 인간 IgG이며 이는 음성 대조용으로서 사용되었다. 결과를 도 4a 및 4b에 나타낸다.
실시예 8: 키메릭 항체 유도체
키메릭 PD1 항체를, 항-PD1 마우스 항체 PD1-0098, PD1-0103의 가변 중쇄 및 경쇄 영역을 PCR을 통해 증폭시키고 이들을 효과기 기능을 없애는 돌연변이 L234A, L235A 및 P329G(카밧의 EU 지수)(류신 234를 알라닌으로, 류신 235를 알라닌으로, 프롤린 329를 글리신으로)를 갖는 인간 IgG1 주쇄/인간 CH1-힌지-CH2-CH3와의 융합 단백질로서 중쇄 발현 벡터내에, 및 인간 C-카파에의 융합 단백질로서 경쇄 발현 벡터내에 클로닝시킴으로써 생산하였다. 이어서 LC 및 HC 플라스미드를 HEK293내로 동시 형질감염시키고 7일 후에 표준 항체 정제 방법에 의해 상등액으로부터 정제시켰다. 상기 키메릭 PD1-항체를 키메릭 chiPD1-0098(chiPD1-0098) 및 키메릭 PD1-0103(chiPD1-0103)이라 다시 명명하였다. 비교를 위해서 니보루맵(또한 MDX-5C4 또는 MDX-1106으로서 공지됨) 또는 펨브로리주맵(또한 MK-3475 또는 Org 1.09A로서 공지됨)의 VH 및 VL 도메인을 포함하는 참조 항-PD1 항체를 합성하고 인간 IgG1(돌연변이 L234A, L235A 및 P329G(카밧의 EU 지수)를 갖는다)의 주쇄와 함께 클로닝시켰다.
실시예 9: 항-PD1 항체 PD-0103(huMab PD-0103)의 인간화된 변체의 생산, 발현 및 정제, 및 특성화
쥐 항-PD1 항체 0103의 VH 및 VL 도메인의 인간화
쥐 항-PD1 항체 PD1-0103(서열번호 43 및 44)의 쥐 VH 및 VL 도메인의 아미노산 서열을 기본으로, 인간화된 항- 항-PD1 항체 변체를 생산하였다.
상기 인간화된 VH-변체는 다수의 돌연변이(서열번호 45를 생성시킨다)를 갖는 인간 J-요소 생식세포 계열 IGHJ5-01과 함께 인간 생식세포 계열 IMGT_hVH_3_23을 기본으로 한다.
VL의 인간화된 변체는 인간 J-요소 생식세포 계열 IGKJ1-01과 함께 인간 생식세포 계열 IMGT_hVK_4_1, IMGT_hVK_2_30, IMGT_hVK_3_11 및 IMGT_hVK_1_39를 기본으로 한다. 상이한 돌연변이들은 서열번호 46 내지 서열번호 49의 인간화된 변체를 생산하였다.
PD1-0103의 중쇄 및 경쇄 가변 영역에 대한 인간화된 아미노산 서열을 DNA로 번역시키고 생성되는 cNDA를 합성하고(GenArt) 이어서 효과기 기능을 없애는 LALA 및 PG 돌연변이(류신 234에서 알라닌으로, 류신 235에서 알라닌으로, 프롤린 329에서 글리신으로)를 갖는 인간 IgG1 주쇄/인간 CH1-힌지-CH2-CH3와의 융합 단백질로서 중쇄 발현 벡터내로, 또는 인간 C-카파에의 융합 단백질로서 경쇄 발현 벡터내로 클로닝시켰다. 이어서 LC 및 HC 플라스미드를 HEK293내로 동시 형질감염시키고 항체 정제를 위한 표준 방법에 의해 상등액으로부터 7일 후에 정제시켰다. 생산되는 인간화된 PD1-항체를 하기와 같이 명명하였다:
[표 11]
Figure pat00028
[표 12]
Figure pat00029
인간화된 PD1-0103 항체 변체 및 모 키메릭 PD1-0103을 상술한 바와 같이 특성화하였다. 결과를 표 13에 나타낸다.
[표 13]
Figure pat00030
실시예 10: PD-1 항체의 중화 효능
시험관내에서 억제된 T 세포 응답의 복원을 모방함에 있어서 사내 생산된 PD-1 항체의 중화 효능을 시험하기 위해서 상업적으로 입수할 수 있는 PD1/PD-L1 리포터 분석(프로메가(Promega))을 사용하였다. 상기 시스템은 PD1+NFAT 주르캣(Jurkat) 세포 및 PD-L1+CHO 대응부분으로 이루어지며, 상기 부분은 또한 활성화 신호를 제공한다. 원칙적으로, 상기 리포터 시스템은 3개의 단계를 기본으로 한다: (1) TCR-매개된 NFAT 활성화, (2) PD-1/PD-L1 축에 의한 활성화시 NFAT 신호의 억제, 및 (3) PD-1 차단 항체에 의한 NFAT 신호의 회수.
물질 및 방법:
·PD-L1 배지: PAN 바이오테크(#P04-03609); FBS (10%) 및 L-Gln (4 mM)
·분석 배지: RPMI 1640(#31870; 인비트로젠), 25 mM HEPES, 2 mM L-Gln, FBS (2%)
·상기 분석에 사용된 세포(두 세포 모두 프로메가에 의해 구입):
PD-L1 + CHO 세포(배치 번호 #139147): 2-3x104 세포/96 웰
PD-1 + NFAT 주르캣 세포(배치 번호 #133024: 3.5x104 세포/웰
1일째에, PD-L1 + 세포를 해동시키고, 상기 언급한 배지에서 지시된 세포 농도로 시딩하고 37 ℃ 및 5% CO2에서 밤새 배양하였다. 다음날, 배지를 제거하고 PD-L1 + 세포를 상기 제조된 항체와 지시된 농도(분석 매질 중에서)로 배양하였다. 병행하여, PD-1 + NFAT 주르캣 세포를 해동시키고 상기 언급한 세포수를 상기 PD-L1 + 세포로 옮기고 상기와 공-배양하였다. 37 ℃ 및 5% CO2에서 6시간의 배양 후에, Bio-Glo 기질을 실온으로 가온하였다(첨가 1 내지 2시간 전). 상기 세포 배양 플레이트를 상기 배양기로부터 제거하고 실온으로 조절한 후에(10분) 웰당 80 ㎕의 Bio-Glo 용액을 가하고, 5 내지 10분 동안 배양한 후에 발광을 상기 키트 제조사의 권장에 따라 테칸 인피니트(Tecan Infinite) 판독기에서 측정하였다. 결과를 도 5a 및 5b에서 찾을 수 있으며 여기에서 TCR 자극시 상이한 PD-1 항체에 의한 상기 NFAT 신호의 PD-1/PD-L1 매개된 억제의 복원을 나타낸다: 도 5a: 키메릭 PD1_0103은 참조 항체에 비해 재현가능한 우수한 효과를 보였다. 참조로서 VH 및 VL 도메인을 포함하는 항-PD1 항체 니보루맵(또한 MDX-5C4 또는 MDX-1106으로서 공지됨)을 합성하고 인간 IgG1(돌연변이 L234A, L235A 및 P329G(카밧의 EU 지수)를 갖는다)의 주쇄와 함께 클로닝하였다. 도 5b: PD1_0103의 4개의 인간화된 변체는 상기 리드 항체에 대해 유사한 시험관내 효능을 나타내었으며 또한 상기 참조 항체보다 약간 더 우수하였다.
이중특이성 PD1/TIM3 항체
실시예 11A: 하나의 결합 가지에 VH/VL 도메인 교환/교체(CrossMab Vh-Vl )를 갖고 CH1/CL 접촉면에 단일의 하전된 아미노산 치환을 갖는 PD1 및 TIM3에 결합하는 다중특이성 항체의 생산 및 발현
일례로 인간 PD1 및 인간 TIM3에 결합하는 다중특이성 항체를 고전적인 분자 생물학 기법에 의해 일반적인 방법 섹션에 기재된 바와 같이 생산하고 상술한 바와 같이 Expi293F 세포의 293F에서 일시적으로 발현시켰다. 상기 다중특이성 1+1 CrossMabVh-Vl 항체가 또한 WO 2009/080242에 기재되어 있다. 상기 다중특이성 항체를 표 14a에 묘사된 아미노산 서열을 암호화하는 핵산을 함유하는 발현 플라스미드를 사용하여 발현시켰다.
[표 14a]
Figure pat00031
모든 구축물에 대해서 첫 번째 CH3 도메인에 전형적인 놉(T366W) 치환 및 두 번째 CH3 도메인에 상응하는 홀 치환(T366S, L368A 및 Y410V)(뿐만 아니라 2개의 추가적인 도입된 시스테인 잔기 S354C/Y349'C)(상기 묘사된 각각의 상응하는 중쇄(HC) 서열 중에 함유됨)을 갖는 놉-인투-홀 이종이량체화 기술이 사용되었다.
실시예 11B: 2개의 결합 가지에 VH/VL 도메인 교환/교체(2+2 CrossMab Vh-VL )를 갖고 CH1/CL 접촉면에 단일의 하전된 아미노산 치환을 갖는 PD1 및 TIM3에 결합하는 다중특이성 항체의 생산 및 발현
일례로 인간 PD1 및 인간 TIM3에 결합하는 다중특이성 항체를 고전적인 분자 생물학 기법에 의해 일반적인 방법 섹션에 기재된 바와 같이 생산하고 상술한 바와 같이 Expi293F 세포의 293F에서 일시적으로 발현시켰다. 상기 다중특이성 2+2 CrossMabVH-VL 항체가 또한 WO 2010/145792에 기재되어 있다. 상기 다중특이성 항체를 표 14b에 묘사된 아미노산 서열을 암호화하는 핵산을 함유하는 발현 플라스미드를 사용하여 발현시켰다.
[표 14b]
Figure pat00032
실시예 11C: PD1 및 TIM3에 결합하는 다중특이성 항체의 정제 및 특성화
상기 발현된 다중특이성 항체를 단백질 A 친화성 크로마토그래피 및 크기 배제 크로마토그래피의 조합에 의해 상등액으로부터 정제하였다. 모든 다중특이성 항체를 양호한 수율로 생산할 수 있으며 상기 항체는 안정성이다. 상기 수득된 생성물을 질량 분광분석법에 의해 정체에 대해 특성화하였으며 순도와 같은 분석학적 성질을 SDS-PAGE, 단량체 함량 및 안정성에 의해 특성화하였다.
질량 분광분석법
예상되는 1차 구조를 탈글리코실화된 완전한 CrossMab 및 탈글리코실화된/플라스민 절단된 또는 선택적으로 탈글리코실화된/제한된 LysC 절단된 CrossMab의 전기분무 이온화 질량 분광분석법(ESI-MS)에 의해 분석하였다.
상기 VH/VL CrossMab를 1 ㎎/㎖의 단백질 농도로 37 ℃에서 17h 이하 동안 포스페이트 또는 트리스 완충제 중의 N-글리코시다제 F로 탈글리코실화시켰다. 상기 플라스민 또는 제한된 LysC(롯슈) 절단을 각각 실온에서 120시간 동안 및 37 ℃에서 40분 동안 트리스 완충제 pH 8에서 100 ㎍ 탈글리코실화된 VH/VL CrossMab로 수행하였다. 질량 분광분석에 앞서, 상기 샘플을 세파덱스 G25 컬럼(GE 헬쓰케어)상에서 HPLC를 통해 탈염시켰다. 총 질량을 트라이벌사 나노메이트 소스(애드비온)가 구비된 maXis 4G UHR-QTOF MS 시스템(브룩커 달토닉)상에서 ESI-MS를 통해 측정하였다.
다중특이성 항체의 안정성
상기 항체 구축물의 안정성을 평가하기 위해서, 열 안정성뿐만 아니라 응집 개시 온도를 하기의 과정에 따라 평가하였다. 지시된 항체의 샘플을 20 mM 히스티딘/히스티딘 클로라이드, 140 mM NaCl, pH 6.0 중에서 1 ㎎/㎖의 농도로 제조하고, 10 ㎕ 마이크로-큐벳 배열내로 옮기고 정적인 광산란 데이터뿐만 아니라 266 ㎚ 레이저로 여기시의 형광 데이터를, 상기 샘플을 25 ℃에서부터 90 ℃까지 0.1 ℃/분의 속도로 가열하면서 옵팀(Optim) 1000 장비(아박타 인코포레이티드(Avacta Inc.))로 기록하였다.
상기 응집 개시 온도(Tagg)는 상기 산란된 빛의 강도가 증가하기 시작하는 온도로서 정의된다. 용융 온도(Tm)는 형광 강도 대 파장 그래프에서 변곡점으로서 정의된다. 결과를 표 15에 나타낸다.
[표 15]
Figure pat00033
실시예 12
항-PD1-TIM3 다중특이성 항체의 특성화
결합 Elisa
·hu PD1에 대한 ELISA
Nunc 맥시솝 스트렙트아비딘 코팅된 플레이트(마이크로코트 #11974998001)를 비오틴화된 PD1-ECD-AviHis 25 ㎕/웰로 500 ng/㎖의 농도에서 코팅하고 4 ℃에서 밤새 배양하였다. 세척(PBST-완충제에 의해 3x90 ㎕/웰) 후에 25 ㎕ 항 PD1 항체 샘플을 증가하는 농도로 가하고 RT에서 1h 배양하였다. 세척(PBST-완충제에 의해 3x90 ㎕/웰) 후에 25 ㎕/웰 염소-항-인간 H+L-POD(JIR, JIR 109-036-098)을 1:5000 희석으로 가하고 진탕기상에서 RT에서 1h 동안 배양시켰다. 세척(PBST-완충제에 의해 3x90 ㎕/웰) 후에 25 ㎕/웰의 TMB 기질(롯슈, 11835033001)을 가하고 OD 2-3까지 배양시켰다. 측정을 370/492 ㎚에서 수행하였다.
·hu TIM3에 대한 ELISA
Nunc 맥시솝 스트렙트아비딘 코팅된 플레이트(마이크로코트 #11974998001)를 비오틴화된 TIM3-ECD-AviHis 25 ㎕/웰로 60 ng/㎖의 농도에서 코팅하고 4 ℃에서 밤새 배양하였다. 세척(PBST-완충제에 의해 3x90 ㎕/웰) 후에 25 ㎕ 항 PD1 항체 샘플을 증가하는 농도로 가하고 RT에서 1h 배양하였다. 세척(PBST-완충제에 의해 3x90 ㎕/웰) 후에 25 ㎕/웰 염소-항-인간 H+L-POD(JIR, JIR 109-036-098)을 1:5000 희석으로 가하고 진탕기상에서 RT에서 1h 동안 배양시켰다. 세척(PBST-완충제에 의해 3x90 ㎕/웰) 후에 25 ㎕/웰의 TMB 기질(롯슈, 11835033001)을 가하고 OD 2-3까지 배양시켰다. 측정을 370/492 ㎚에서 수행하였다.
ELISA 결과를 표 16에 EC50 값[nM]으로서 나열한다.
[표 16]
Figure pat00034
아비드(Avid) 결합(즉 2개의 가지 모두와의 결합)을 Tim3에 대해 2가인 항체들에 대해 검출할 수 있다(키메릭 TIM3-0018, 2+2 PD1TIM3-0359, 키메릭 TIM3-0028, 2+2 PD1TIM3-0358). 상기 1+1 CrossMab에 대해 보다 높은 EC50 값은 상기 코팅된 항원에 대한 1가(Tim3에 대해), 비-아비드 결합으로부터 생성된다. 결합활성 효과는 PD1-결합에 대해서 검출되지 않았다. EC50 값은 2가 및 4가 포맷에 필적할만하다.
결합 Biacore: PD1 및 TIM3에 결합하는 다중특이성 항체의 항원 결합 성질
각각의 표적 항원, 즉 PD1 및 TIM3에 대한 다중특이성 항체의 결합을 Biacore(등록상표)에 의해 평가하였다.
·PD1 결합을 하기 과정에 따라 평가하였다:
항-인간 Fc IgG를 (Biacore) CM5 센서 칩의 표면에 아민 커플링에 의해 고정화시켰다. 이어서 상기 샘플을 포획하고 hu PD1-ECD를 상기에 결합시켰다. 상기 센서 칩 표면을 각 분석 주기후에 재생시켰다. 상기 데이터를 1:1 랭뮤어 상호작용 모델에 적합시킴으로써 평형 상수 및 동역학적 속도 상수를 최종적으로 획득하였다.
약 10,000 응답 단위(RU)의 20 ㎍/㎖ 항-인간 IgG(GE 헬쓰케어 #BR-1008-39)를 GE 헬쓰케어에 의해 공급된 아민 커플링 키트를 사용하여 Biacore T200 장비에서 CM5 센서 칩의 모든 유동 셀상에 커플링시켰다. 상기 샘플 및 실행 완충제는 HBS-EP+(0.01 M HEPES, 0.15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0.05% v/v 계면활성제 P20, pH 7.4)였다. 유동 셀 온도를 25 ℃로 설정하고 샘플 구획 온도를 12 ℃로 설정하였다. 상기 시스템을 실행 완충제로 초회 자극하였다.
상이한 샘플들을 15초 동안 10 nM의 농도로 주입하고 상기 유동 셀 2, 3 및 4에 연속적으로 결합시켰다. 이어서 인간 PD1-ECD 농도의 완전한 세트(300 nM, 100 nM, 2x33.3 nM, 11.1 nM, 3.7 nM, 1.2 nM 및 2x0 nM)를 300s 동안 각 샘플 상에 주입한 다음 10/600s의 해리 시간 및 2회의 30s 재생 단계(3 M MgCl2에 의해)를 수행하였으며, 이중 마지막 하나는 실행 완충제에 의한 "주입 후 여분의 세척"을 함유하였다. 최종적으로 상기 이중 참조 데이터를 Biacore T200 평가 소프트웨어를 사용하여 1:1 랭뮤어 상호작용 모델에 적합시켰다. 생성되는 KD, ka 및 kd 값을 표 17에 나타낸다.
·TIM3 결합을 하기 과정에 따라 평가하였다:
항-인간 Fab IgG를 (Biacore) CM5 센서 칩의 표면에 아민 커플링에 의해 고정화시켰다. 이어서 상기 샘플을 포획하고 hu Tim3-ECD를 상기에 결합시켰다. 상기 센서 칩 표면을 각 분석 주기후에 재생시켰다. 상기 데이터를 1:1 랭뮤어 상호작용 모델에 적합시킴으로써 평형 상수 및 동역학적 속도 상수를 최종적으로 획득하였다.
약 10,000 응답 단위(RU)의 20 ㎍/㎖ 항-인간 Fab IgG(GE 헬쓰케어 #28-9583-25)를 GE 헬쓰케어에 의해 공급된 아민 커플링 키트를 사용하여 Biacore T200에서 CM5 센서 칩의 모든 유동 셀상에 커플링시켰다. 상기 샘플 및 실행 완충제는 HBS-EP+(0.01 M HEPES, 0.15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0.05% v/v 계면활성제 P20, pH 7.4)였다. 유동 셀 온도를 25 ℃로 설정하고 샘플 구획 온도를 12 ℃로 설정하였다. 상기 시스템을 실행 완충제로 초회 자극하였다.
상이한 샘플들을 30초 동안 10 nM의 농도로 주입하고 상기 유동 셀 2, 3 및 4에 연속적으로 결합시켰다. 이어서 인간 Tim3-ECD 농도의 완전한 세트(600 nM, 200 nM, 2x66.7 nM, 22.2 nM, 7.4 nM 및 2x0 nM)를 200s 동안 각 샘플 상에 주입한 다음 10/600s의 해리 시간 및 2회의 30s 재생 단계(글리신 HCl pH 2.1에 의해)를 수행하였으며, 이중 마지막 하나는 실행 완충제에 의한 "주입 후 여분의 세척"을 함유하였다. 최종적으로 상기 이중 참조 데이터를 Biacore T200 평가 소프트웨어를 사용하여 1:1 랭뮤어 상호작용 모델에 적합시켰다. 생성되는 KD, ka 및 kd 값을 표 17에 나타낸다.
결과를 표 17에 나타낸다.
[표 17]
Figure pat00035
모든 시험된 항체는 2개의 표적, PD1 및 TIM3 모두에 특이적으로 결합하며, 나노몰 범위에서 항원 친화성을 나타낸다.
실시예 13: 재조합 세포에 대한 항-PD1/TIM3 이중특이성 항체의 동시 결합에 대한 FRET 분석
본 실시예는 이중특이성 항체 포맷이 하나의 세포상에 존재하는 2개의 상이한 수용체에 동시에 결합함을 측정하기 위한 세포-기재 TR-FRET 분석의 개발을 기재한다. 선택된 태그-라이트 기술은 고전적인 TR-FRET(시간-분해 형광 공명 에너지 전달) 및 SNAP-태그 기술(예를 들어 뉴잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs), 시스바이오)의 조합이며, 이는 상기 세포 표면상에 존재하는 항원을 형광 공여체 또는 수용체 염료로 표지되게 한다.
본 기술 평가의 목적
본 분석은 주어진 수용체 및 태그(여기에 형광 염료가 결합할 수 있다)의 세포외 도메인(ECD)으로 이루어지는 재조합 융합 단백질로서 PD1 및 Tim3 수용체를 모두 발현하는 세포에 대한 항-PD1/Tim3 이중특이성 항체의 동시 결합을 입증하고자 한다. PD1-Tim3 이중특이성 항체(2개의 표지된 수용체 모두와 결합할 수 있다)의 존재하에서, 상기 단백질들은 가깝게 되어 상기 2개의 FRET 염료들간에 에너지 전달을 허용할 것이다(도 6을 참조하시오).
재조합 PD1 + TIM3 + HEK 세포의 생산
표준 방법을 사용하여 문헌[Sambrook et al., Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989]에 기재된 바와 같이 DNA를 생성시켰다. PD1 및 TIM3 변체의 클로닝을 위해서, SNAP 또는 CLIP를 상기 수용체의 TM-영역 가까이에 삽입하고 세포질 도메인을 7aa를 제외하고 제거하고 플래그-태그에 의해 교체하였다.
일시적인 형질감염
HEK293 세포를 15 ㎍의 DNA의 총량으로 한 번에 2개의 플라스미드를 사용하여 30 ㎖ 배양 부피 중의 형질감염 시약 293프리(노바겐) 및 옵티-MEM(등록상표) I 환원된 혈청 매질(라이프 테크놀로지스)로 동시-형질감염시켰다. 간단히, HEK293 세포를 PD1 또는 Tim3 ECD 및 달리 어딘가에 기재된 바와 같은 SNAP 또는 CLIP 태그로 이루어지는 융합 단백질을 암호화하는 하기의 플라스미드로 일시적으로 형질감염시켰다:
플라스미드 ID 및 참조, 예를 들어 PD1-SNAP, Tim3-CLIP(조합 PD1-CLIP 및 Tim3-SNAP가 또한 구축되고 발현되었으나, 단지 낮은 FRET 신호만을 생성시켰다).
플라스미드:
a) PD1-SNAP(5'에서 3' 방향으로):
- 신호 펩타이드를 포함하는 인간 PD1-세포외 도메인을 암호화하는 핵산(서열번호 89(30)의 잔기 1-170),
- GGGGS 이격자를 암호화하는 핵산(서열번호 90),
- O6-알킬구아닌-DNA-알킬트랜스퍼라제(hAGT)에 대한 인간 유전자의 돌연변이 형태인 pSNAP-태그(T7)2(N-말단 메티오닌 잔기 없음)로부터 SNAP를 암호화하는 핵산. (야생형 hAGT에 비해, 상기 SNAP-태그 단백질은 돌연변이 C26A, K125A, A127T, R128A, G131K, G132T, M134L, R135S, C150S, N157G, S159E를 함유하며, G182 후에 절두된다)(서열번호 91),
- GGGGS 이격자를 암호화하는 핵산(서열번호 90),
- 인간 PD1-막관통 및 세포질 도메인을 암호화하는 핵산(서열번호 89의 잔기 171-191),
- GGGGS 이격자를 암호화하는 핵산(서열번호 90),
- 플래그-태그를 암호화하는 핵산(DYKDDDDK; 서열번호 92).
b) Tim3-CLIP(5'에서 3' 방향으로):
- 신호 펩타이드를 포함하는 인간 Tim3-세포외 도메인을 암호화하는 핵산(서열번호 93의 잔기 1-202),
- GGGGS 이격자를 암호화하는 핵산(서열번호 90),
- O6-알킬구아닌-DNA-알킬트랜스퍼라제(hAGT)에 대한 인간 유전자의 돌연변이 형태인 pCLIPf(N-말단 메티오닌 잔기 없음)로부터 CLIP를 암호화하는 핵산(서열번호 94),
- GGGGS 이격자를 암호화하는 핵산(서열번호 90),
- 인간 Tim3 막관통 및 세포질 도메인을 암호화하는 핵산(서열번호 93의 잔기 203-230),
- GGGGS 이격자를 암호화하는 핵산(서열번호 90),
- 플래그-태그를 암호화하는 핵산(DYKDDDDK; 서열번호 92).
형질감염시, 세포를 FACS(형질감염 후 24-48 시간) 또는 FRET 실험(48시간 후)에 최종 사용시까지 진탕기 플라스크 중에서 배양하였다.
일시적으로 형질감염된 HEK293 세포상에서 PD1 및 Tim3 발현의 확인(FACS)
Hek293 세포의 일시적인 형질감염 후 24 내지 48시간째에, 세포를 PD1 및 Tim3 발현에 대해 분석하였다: 대개, 1-3x105 단일 또는 이중 형질감염된 세포를 10 ㎍/㎖로 얼음상에서 30분 염색하고, PBS/2% FCS로 2회 세척하고 하기를 사용하여 FacsCanto II상에서 분석하였다:
· PD1-FITC 바이오레전드 329904, 클론 EH12.2H7) 또는 PD1-PE(R&D #FAB1086P) 및/또는
· Tim3-PE(R&D FAB2365P 클론 344823) 및/또는
항-PD1/TIM3 이중특이성 항체에 대한 세포 표지화 및 FRET 분석 설명
항-PD1/TIM3 이중특이성 항체에 대한 세포 표지화 및 FRET 분석 설명:
형질감염된 세포를 침강시키고 태그-라이트 완충제(시스바이오(Cisbio)) 중에 1x106 세포/㎖의 밀도로 재현탁시켰다. 이어서, 세포를 태그-라이트 완충제(시스바이오) 중에서 37 ℃에서 1h 동안 100 nM SNAP-Lumi4-Tb(시스바이오) 및 100 nM 클립-레드(시스바이오)로 염색하였다. 세척 및 PBS/2% FCS 중에 재현탁 후에, 약 50.000 세포(50 ㎕ 부피 중에)를 96-웰 편평 바닥 백색 플레이트(코스타(Costar)) 내에 시딩한 후에 대조용(예를 들어 단일 특이성, 아이소타입 참조) 또는 이중특이성 항체를 상기 세포에 0.001 내지 10 nM의 최종 농도로 가하였다. 일부 실험에서, 모 단클론 항체를 염소 항 인간 Fc(20 nM 최종 농도, 데이터는 도시 안 됨)를 통해 교차-결합시켰다. 4 ℃ 또는 실온에서 1h 동안 배양 후에, 시간-분해 형광을 판매자에 의해 제공된 표준 설정을 사용하여 BMG 페라스타(Pherastar) 판독기 또는 테칸 인피니트 M1000 프로로 665/620 ㎚의 비로서 측정하였다. 임의로, SNAP-Lumi4-Tb 및 100 nM 클립-레드 표지된 세포를 -80 ℃에서 또는 액체 질소 중에서 보관하고 FRET 실험을 위해 새로 해동시켰다.
결과
·FRET 유도에 의해 입증된 바와 같은 동시적인 수용체 결합 및 교차-결합에 대한 상이한 이중특이성 항체 및 항체 포맷의 특성화
PD1 및 TIM3 발현 HEK 세포를 상술한 바와 같이 처리하여 적정된 양의 상이한 이중특이성 항체(0.12 내지 10 nM)와의 배양을 통해 동시 수용체 결합시 FRET 신호를 측정하였다.
모든 이중특이성 항체는 용량-의존적인 방식으로 PD-1-TIM3-발현 세포에서 FRET 신호를 유도하였다. 도 7a에서 볼 수 있는 바와 같이 2+2 구축물(358+359)에 비해 1+1 포맷(항체 #389 및 168)간의 극적인 차이는 존재하지 않았다.
또한, 인간화된 PD1 TIM3 항체(#476 및 477)를 기본으로 하는 2개의 이중특이성 포맷을 또한 처리시 세포에서 FRET를 유도하는 그들의 능력에 대해 평가하였다. 도 7B에서 입증된 바와 같이, 상기 두 구축물은 모두 PD1+TIM3+HEK에서 현저한 FRET 신호를 유도하였으며, 이는 기능적인 방식의 동시 결합을 강조한다.
·이중특이성 항체의 동시 결합에 의해 유도된 FRET 신호의 특이성을 나타내기 위해서, 단지 하나의 특이성의 단클론 IgG를 경쟁을 위해 첨가하였다.
SNAP-태그된 PD1 및 CLIP-태그된 TIM3(이전에 기재된 바와 같이)을 100 nM SNAP-Lumi4-Tb 및 100 nM 클립-레드로 표지하였다. 세척 후에, 표지된 세포를 4 ℃에서 1h 동안 이중특이성 항-PD1/TIM3 항체 #0168[지시된 농도에서]과 배양 후에 시간-분해 형광을 BMG 페라스타 판독기로 665/620 ㎚에서 측정하였다(검은색 선). 이중특이성 항체 처리후 FRET 신호의 특이성을 강조하기 위해서, 항-PD1 단클론 항체(#0165, 도 8a, 회색 곡선) 또는 항 Tim-3 단클론 항체(#0018, 도 8b, 회색 곡선)를 경쟁을 위해 첨가하여 상기 FRET 신호의 거의 완전한 방지를 생성시켰다. 모(단일특이성) 항-PD-1 항체는 단독으로는 FRET를 유도하지 않았다(점선).
상기 FRET 신호의 유도는 또한 상기 이중특이성 항체에 나란히 첨가된 TIM3 모 항체(0018; 회색 곡선)의 존재하에서 방지되었다.
실시예 14: 상이한 말초 혈액 단핵세포(PBMC)에 대한 항체의 결합
결합 분석
새로 단리된 PBMC 또는 3일 다클론 활성화된(플레이트 결합된 항-CD3 및 용해성 항-CD28 항체, 각각 1 ug/㎖, 모두 BD 파밍겐(Pharmingen)으로부터) CD4 T 세포를, 4 ℃에서 1시간 동안 Alexa 647-직접 접합된 항-TIM-3 또는 항-TIM-3/항-PD-1 이중특이성 항체로 염색하였다. 이어서 상기 세포들을 세척하여 결합되지 않은 항체를 제거하고 표면 마커를 4 ℃에서 30분 동안 염색하여, BD 셀 픽스(Cell Fix)로 고정시키기 전에 단핵세포(CD14+(BD 파밍겐)), NK 세포(CD16+(e바이오사이언스)), CD56+(바이오레전드) 및 CD3-) 및 T 세포(CD3+(e바이오사이언스))를 구별하였다. 상기 세포를 LSRFortessa(BD 바이오사이언시즈)에서 획득하였다. 항-Tim3 항체와 비교된 상기 이중특이성 항체에 대한 결과를 도 9a 내지 9h에 나타낸다.
실시예 15: 내면화
실시예 15A) 앞서 1 ㎎/㎖의 플레이트 결합된 항-CD3 및 1 ㎎/㎖의 용해성 항-CD28 항체와 배양된, 3일 다클론식으로 활성화된 CD4 T 세포를 4 ℃에서 30분 동안 항-TIM-3 또는 항-TIM-3/항-PD-1 이중특이성 항체의 존재하에서 배양하였다(중복하여). 이어서 상기 세포를 세척하고, 2개의 그룹으로 분할하였으며, 이중 하나를 37 ℃에서 추가로 3시간 동안 배양하고 다른 것은 상기 BD 셀 픽스로 고정하기 전에 표지된 2차 항체(e바이오사이언스)로 즉시 염색하였다. 3시간 배양후에 또한 상기 세포의 두 번째 그룹을 상기 고정 전에 상기 표지된 2차 항체로 염색하였다.
상기 세포를 LSRFortessa(BD 바이오사이언스)에서 획득하고 세포 표면상의 검출 가능한 항체의 발현 수준을 상기 두 그룹들간에 비교하였다. 결과를 도 10a 내지 10d에 나타낸다. 이중특이성 1+1 PD1TIM3-0166(키메릭 PD1-0103/TIM3-0038을 기본으로 한다)은 이중특이성 2+2 PD1TIM3-0321(또한 키메릭 PD1-0103/TIM3-0038을 기본으로 하나, PD에 대한 2개의 항원 결합 부위 및 TIM3에 대한 2개를 갖는다)와 비교된 및 활성화된 CD4+ T-세포 및 활성화된 NK 세포상의 모 TIM3-0038 항체와 비교된 감소된 내면화를 나타내었다.
실시예 15B) 형광 공초점 현미경검사에 의한 항체 국소화 및 내면화의 시각화
활성화된 CD4-양성 세포를, a-PD1 항체로 염색하는 경우를 제외하고 CMFDA(몰레큘러 프로브스(Molecular Probes), 라이프 테크놀로지스)로 염색하고 폴리-L-리신(시그마)으로 처리된 둥근 커버슬립상에 도말하였다. 세포를 형광-태그된 항체(1 ug/㎖: a-TIM3(chi18-A647 = AlexaA647로 표지된 키메릭 TIM3_0018), a-TIM3(chi28-A647 = AlexaA647로 표지된 키메릭 TIM3_0028), Bispec(0168-A647 = AlexaA647로 표지된 1+1 PD1TIM3_0168(키메릭 PD1-0103/TIM3-0018을 기본으로 한다) 및 Bispec(0389-A647= AlexaA647로 표지된 1+1 PD1TIM3_0389 (키메릭 PD1-0103 / TIM3-0028을 기본으로 한다)) 및 a-PD1 (0165-A488 = AlexaA488로 표지된 키메릭 PD1-0103)를 상이한 지속기간(15분, 1시간, 2시간, 3시간) 동안 생육 배지에 직접 가하기 전에 37 ℃에서 30분 부착되게 하였따. 저온 PBS(론자(Lonza))를 사용하여 상기 반응을 급냉시키고 결합되지 않은 항체를 세척하였다. 이어서 세포를 20분 동안 고정시키고(BD 사이토픽스(Cytofix)) 세척 완충제(BD 염색 완충제)로 2회 세척하였다. 상기 커버슬립을 건조한 표면으로 옮긴 후에, 이어서 상기를 봉입제(플루오로마운트(Fluoromount) G, e바이오사이언스)로 유리 슬라이드상에 올려놓고 영상화전에 4 ℃에서 암실에서 유지시켰다. 고도로 표적화된 세포의, 상기 막 ROI로부터의 형광 신호의 강도를 같은 세포의 세포질 ROI로부터의 형광 신호의 강도로 나누어 박스 차트에 나타낸 비를 생성시켰다. 샘플들을 비교하기 위해서 일원 ANOVA 분석을 사용하였다(* = p<0.05; ** = p<0.001). 형광 공초점 현미경검사를 60x 오일 대물렌즈를 갖는 자이스(Zeiss)로부터의 도립 LSM 700으로 수행하였다. 상을 상기 현미경에 커플링된 젠(Zen) 소프트웨어(Zeiss)를 사용하여 수집하였다. 상기 상의 분석을 이마리스 소프트웨어(Imaris Software)(비트플레인(Bitplane); 옥스포드 인스트루먼트(Oxford Instrument))로 수행하였으며 통계학적 분석을 그래프패드 프리즘(그래프패드 소프트웨어)에 의해 수행하였다. TIM3 항체들의 세포내 클러스터링에 비교시 이중특이성 및 PD1 항체 모두에서 보다 높은 막 국소화를 나타내는 시간에 따른 분석을 도 11a 및 11b에 나타낸다. 상기 항-PD1 및 Bispec 0389는 3h 후에조차 단지 매우 느린 내면화를 보이는 반면, 다른 Bispec 0168에 대한 내면화는 더 강하다. 더 강한 내면화는 aTim3 Ab 0028에 의해 나타나며, 가장 강한 내면화는 aTim3-0018에 의해 나타난다.
실시예 16: 혼합 림프구 반응(MLR) 분석을 통한 T 세포 활성화
상기 혼합 림프구 반응(MLR)은 하나의 개체(공여자 X)로부터의 림프구의, 또 다른 개체(공여자 Y)로부터의 림프구에 대한 활성화를 측정하는 면역세포 분석이다. 혼합 림프구 반응을 사용하여 림프구 효과기 세포에 대한 PD1 경로의 차단 효과를 설명하였다. 상기 분석에서 T 세포를 항-PD1/TIM3 이중특이성 mAb의 존재 또는 부재하에서의 활성화 및 이들의 IFN-감마 분비에 대해 시험하였다.
동종이계 MLR을 수행하기 위해서, 미지의 HLA 유형의 적어도 4명의 건강한 공여자로부터 말초 혈액 단핵세포(PBMC)를 류코셉(그라이너 바이오 원, 227 288)을 사용하여 밀도 구배 원심분리에 의해 단리하였다. 간단히, 헤파린 처리된 혈액 샘플을 3배 부피의 PBS로 희석하고 상기 희석된 혈액 중 25 ㎖ 분액들을 50 ㎖ 류코셉 튜브 중에 층상화하였다. 실온에서 15분 동안 800xg에서 원심분리(중단 없이) 후에 상기 림프구 함유 분획들을 수확하고, PBS에서 세척하고, 기능 분석에 바로 사용하거나 1.0E+07 세포/㎖로 동결 매질(10% DMSO, 90% FCS)에 재현탁시키고 액체 질소에서 보관하였다. 개별적인 2-원 MLR 반응을, 2명의 상이한 공여자로부터의 PBMC를 1:1 자극/응답 세포 비로 혼합함으로써 셋업하고 상이한 농도 범위의 정제된 이중특이성 PD1-TIM3 항체 또는 이들의 모 단일특이성 항체(단독으로 또는 함께)의 존재 또는 부재하에서 37 ℃, 5% CO2에서 6일 동안 편평바닥 96-웰 플레이트에서 적어도 중복 수행하였다. 항체가 없거나 또는 아이소타입 대조용 항체를 음성 대조용으로서 사용하였으며 rec hu IL-2(20 EU/㎖)를 양성 대조용으로서 사용하였다. 6일 후에 100 ㎕의 배지를 사이토킨 측정을 위해 각 배양물로부터 채취하였다. IFN-감마의 수준을 OptEIA ELISA 키트(BD 바이오사이언시즈)를 사용하여 측정하였다.
상기 결과를 표 18A 내지 18D(IFN-γ 분비/방출)에 나타낸다. 상기 이중특이성 PD1TIM3 항체는 T 세포 활성화 및 IFN-감마 분비를 농도 의존적인 방식으로 촉진하였다. 상기 IFNγ 분비의 증가%의 값을 임의의 차단 mAb의 첨가 부재하의 MLR의 IFN-γ(E-c로서 기본 동종이계 자극 유도된 IFNγ) 및 20 EU/㎖ rec hu IL-2의 첨가와 함께 MLR의 IFNγ(양성 대조용 = E+c로서 100% IFNγ 값)의 생성과 관련하여 계산하였으며 식: 상대적인 자극[%] = ((실시예 - E-c)/(E+c - E-c) * 100에 따라 계산하였다.
4개의 별도의 실험을 수행하였다:
실험 1에서 키메릭 PD1-0103(=PD1-0165) 및 키메릭 TIM3_0018(=Tim3-chi18) 및 이들의 조합과 비교된 PD1-TIM3 이중특이성 항체 1+1 PD1TIM3_0168(키메릭 PD1-0103/TIM3-0018(=AB 0168)을 기본으로 한다)의 효능을 평가하였다. 결과를 도 12a 및 표 18A에 나타낸다.
[표 18A]
Figure pat00036
실험 2에서 키메릭 PD1-0103(=PD1-0165) 및 키메릭 TIM3_0028(=TIM3-chi28) 및 이들의 조합과 비교된 PD1-TIM3 이중특이성 항체 1+1 PD1TIM3_0389(키메릭 PD1-0103/TIM3-0028(=Bispec AB 0389)을 기본으로 한다)의 효능을 평가하였다. 결과를 도 12B 및 표 18B에 나타낸다.
[표 18B]
Figure pat00037
실험 3에서 키메릭 키메릭 PD1-0103(=PD1-0165) 및 항-TIM3-Ky8213(US 2012/0189617(항체 8213 참조), 예를 들어 실시예 33으로부터) 및 이들의 조합과 비교된 PD1-TIM3 이중특이성 항체 1+1 PD1-0103/Ky8213(실시예 1에 기재된 바와 유사하게 생산된 키메릭 PD1-0103/및 항-TIM3 Ky8213(US 2012/0189617(항체 8213 참조), 예를 들어 실시예 33으로부터)을 기본으로 한다)의 효능을 평가하였다. 결과를 도 12C 및 표 18C에 나타낸다.
[표 18C]
Figure pat00038
실험 4에서 키메릭 PD1-0103/TIM3-0028을 기본으로 하는 PD1-TIM3 이중특이성 항체 2+2 PD1TIM3_0358(=Bispec AB 0358(2+2)) 및 키메릭 PD1-0103(=PD1-0165) 및 키메릭 TIM3_0028(=TIM3-chi28) 및 이들의 조합과 비교된 PD1-TIM3 이중특이성 항체 1+1 PD1TIM3_0389(키메릭 PD1-0103/TIM3-0028을 기본으로 한다(=Bispec AB 0389(1+1))의 효능을 평가하였다. 결과를 도 12D 및 표 18D에 나타낸다.
[표 18D]
Figure pat00039
[표 19]
Figure pat00040
실시예 17:항원-특이성 CD4 T 세포와 B 세포-림프모구성 세포주 ARH77과의 공-배양
MHCII-발현 종양 세포주의 존재하에서 CD4 T 세포상의 항-PD-1 봉쇄의 효과를 조사하기 위해서, 우리는 새로 정제된 CD4 T 세포를 EBV-불멸화된 B 세포 림프모구성 세포주(ARH77)의 존재하에서 5일 동안 공배양하는 분석을 개발하였다. 최소 혼합 림프구 반응(mMLR) 당일에, CD4 T 세포를 건강한 공여자로부터 수득된 108 PBMC로부터 미세비드 키트(밀테니 바이오텍(Miltenyi Biotec))를 통해 농축시켰다. 선행 배양물, CD4 T 세포를 5 mM의 카복시-플루오레세인-숙신이미딜 에스터(CFSE)로 표지하였다. 이어서 105 CD4 T 세포를 차단 항-PD1 항체(인간화된 PD-1 0376, 니보루맵 또는 펨브로리주맵), 항-TIM3 항체(인간화된 항-TIM3 0438 또는 쿄와(Kyowa)-8213) 또는 항-PD-1/TIM3 이중특이성 항체(인간화된 0476)의 존재 또는 부재하에서 B 세포주(5:1)와 함께 96 웰 플레이트에 10 ㎍/㎖의 농도로 도말하였다. 5일 후에 우리는 상기 세포-배양 상등액을 수집하고, 이를 ELISA(R&D 시스템스)에 의해 IFN-γ 수준을 측정하는데 사용하였다.
도 13에 도시된 바와 같이, 우리는 흥미롭게도 항-PD-1 처리가, 처리되지 않은 CD4 T 세포에 비해 IFN-γ를 생산하는 CD4 T 세포의 능력을 현저하게 증가시킴을 관찰하였다(파선). 상기 분석에서 상기 항-PD-1 항체 0376은 CD4 T 세포에 의한 IFN-γ의 분비를 유도함에 있어서 벤치 마크 항체와 균등하게 가능했던 반면, 항-TIM3 항체 0438 단독은 상기 벤치마크 항체 쿄와-8213보다 더 강하다 하더라도 단지 약간의 효과만을 갖는다.
놀랍게도, 상기 이중특이성 항체 0476은 CD4 T 세포에 의한 IFN-γ 분비의 구동에 있어서 모 항체, 항-PD1 항체 0376 단독 및 상기 벤치마크 항체의 조합보다 더 양호하였다(P<0.01, 일원 ANOVA).
실시예 18: 생체내에서 PD1-TIM3 이중특이성 항체의 증대된 효능
실험의 출발시에 6 내지 8주된, 면역억제된 암컷 마우스(NOG)를 1:1 비의 매트리젤의 존재하에서 0일째에 106 MNK45 세포(높은 수준의 CEA를 발현하는, 인간 위암종 세포주)로 피하 공격하였다. 7일째에, 건강한 인간 공여자로부터의 PBMC를 단리하였다: 인간 헤파린처리된 혈액을 포스페이트 완충제 염수(PBS)(깁코(Gibco)) 중에서 약 2:1 희석하고 준비된 50 ㎖ 류코셉 튜브로 옮겼으며, 상기 튜브는 각각 15 ㎖ 히스토파크(Histopaque)-1077(시그마 알드리치)을 함유하였다. 원심분리(30분, 450g, RT, 제동 없음) 후에, 상기 PBMC 밴드를 5 ㎖ 피펫으로 수집하였다. 세포를 50 ㎖ 튜브로 옮기고 PBS(350xg에서 10분 원심분리)로 세척하였다. 상기 세척 단계를 반복하였다(300xg에서 10분 원심분리). 원심분리(10분, 350xg) 후에, 세포를 RPMI 배지에 재-현탁하였다. 107 PBMC를 NOG 마우스에 정맥내 주사하여 마우스-인간 키메릭 모델을 생성시켰다. 10일째에, 매주 스케줄 치료법(비히클 또는 항-PD1(0376), 니보루맵, 항-TIM3(0438) 또는 항 PD1-TIM3(0476) 중에서 선택된 화합물로 처리)을 시작하였으며 이를 복강-내 주사에 의해 제공하였다. 상기 PD1-Tim3 이중특이성 항체(3 또는 10 ㎎/㎏; 빈 삼각형)에 의한 처리를 동몰(1.5 또는 5 ㎎/㎏) 농도의 단일 작용제 PD1 항체(0376), 니보루맵 및 Tim3 항체(0438)와 비교하였다. 종양 크기를 30일의 기간에 걸쳐 매 2 내지 3일마다 캘리퍼스에 의해 ㎚로 측정하였다. 도 14a 및 14b에서, 상기 종양 부피의 측정을 상기 마우스의 그룹내에서 평균 부피로서 나타낸다.
상기 모든 처리는 비히클 처리된 그룹과 비교할 때 종양 성장을 억제하는 능력을 나타내었다. 단지 PD1(PD1 항체(0376) 또는 벤치마크 니보루맵) 및 단지 TIM3 항체(0438)의 억제는 상기 종양 성장의 억제에서 유사한 효능을 도출한다. 이는 PD1 또는 TIM3의 차단에 의해 항-종양 응답을 증대시키는 것이 가능함을 나타낸다. 그러나, 종양 성장 억제의 증가는 PD1 및 TIM3 모두가 상기 PD1-TIM3 이중특이성 항체에 의해 결합될 때 관찰될 수 있다. 낮은 농도에서 이중특이성 항체와 다른 처리간의 종양 성장의 차이는 관찰될 수 없는 반면, 보다 높은 용량에서는 상기 PD1-TIM3 이중특이성 항체에 의한 처리에 의한 PD1 및 TIM3 모두의 억제가 종양 성장의 강한 억제를 생성시킨다.
SEQUENCE LISTING <110> F. Hoffmann-La Roche AG <120> Bispecific Antibodies specific for PD1 and TIM3 <130> P33115-WO <140> PCT/EP2016/073192 <141> 2016-09-29 <150> EP 15188036.6 <151> 2015-10-02 <150> EP 15188065.5 <151> 2015-10-02 <160> 94 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 1 Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser Gly Met 1 5 <210> 2 <211> 3 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 2 Leu Asn Asp 1 <210> 3 <211> 8 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 3 Asn Gly Tyr Leu Tyr Ala Leu Asp 1 5 <210> 4 <211> 6 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 4 Ser Ser Ser Val Asn Tyr 1 5 <210> 5 <211> 3 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 5 Asp Ala Phe 1 <210> 6 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 6 Trp Ser Ser Tyr Pro Trp Thr 1 5 <210> 7 <211> 120 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 7 Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Ile Leu Gln Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Arg Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser 20 25 30 Gly Met Ser Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 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Pro 100 105 110 Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 115 120 125 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 130 135 140 Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp 145 150 155 160 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe 165 170 175 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 180 185 190 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu 195 200 205 Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 210 215 220 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys 225 230 235 240 Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 245 250 255 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 260 265 270 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 275 280 285 Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser 290 295 300 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 305 310 315 320 Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 325 <210> 85 <211> 280 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 85 Ser Glu Val Glu Tyr Arg Ala Glu Val Gly Gln Asn Ala Tyr Leu Pro 1 5 10 15 Cys Phe Tyr Thr Pro Ala Ala Pro Gly Asn Leu Val Pro Val Cys Trp 20 25 30 Gly Lys Gly Ala Cys Pro Val Phe Glu Cys Gly Asn Val Val Leu Arg 35 40 45 Thr Asp Glu Arg Asp Val Asn Tyr Trp Thr Ser Arg Tyr Trp Leu Asn 50 55 60 Gly Asp Phe Arg Lys Gly Asp Val Ser Leu Thr Ile Glu Asn Val Thr 65 70 75 80 Leu Ala Asp Ser Gly Ile Tyr Cys Cys Arg Ile Gln Ile Pro Gly Ile 85 90 95 Met Asn Asp Glu Lys Phe Asn Leu Lys Leu Val Ile Lys Pro Ala Lys 100 105 110 Val Thr Pro Ala Pro Thr Arg Gln Arg Asp Phe Thr Ala Ala Phe Pro 115 120 125 Arg Met Leu Thr Thr Arg Gly His Gly Pro Ala Glu Thr Gln Thr Leu 130 135 140 Gly Ser Leu Pro Asp Ile Asn Leu Thr Gln Ile Ser Thr Leu Ala Asn 145 150 155 160 Glu Leu Arg Asp Ser Arg Leu Ala Asn Asp Leu Arg Asp Ser Gly Ala 165 170 175 Thr Ile Arg Ile Gly Ile Tyr Ile Gly Ala Gly Ile Cys Ala Gly Leu 180 185 190 Ala Leu Ala Leu Ile Phe Gly Ala Leu Ile Phe Lys Trp Tyr Ser His 195 200 205 Ser Lys Glu Lys Ile Gln Asn Leu Ser Leu Ile Ser Leu Ala Asn Leu 210 215 220 Pro Pro Ser Gly Leu Ala Asn Ala Val Ala Glu Gly Ile Arg Ser Glu 225 230 235 240 Glu Asn Ile Tyr Thr Ile Glu Glu Asn Val Tyr Glu Val Glu Glu Pro 245 250 255 Asn Glu Tyr Tyr Cys Tyr Val Ser Ser Arg Gln Gln Pro Ser Gln Pro 260 265 270 Leu Gly Cys Arg Phe Ala Met Pro 275 280 <210> 86 <211> 181 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 86 Ser Glu Val Glu Tyr Arg Ala Glu Val Gly Gln Asn Ala Tyr Leu Pro 1 5 10 15 Cys Phe Tyr Thr Pro Ala Ala Pro Gly Asn Leu Val Pro Val Cys Trp 20 25 30 Gly Lys Gly Ala Cys Pro Val Phe Glu Cys Gly Asn Val Val Leu Arg 35 40 45 Thr Asp Glu Arg Asp Val Asn Tyr Trp Thr Ser Arg Tyr Trp Leu Asn 50 55 60 Gly Asp Phe Arg Lys Gly Asp Val Ser Leu Thr Ile Glu Asn Val Thr 65 70 75 80 Leu Ala Asp Ser Gly Ile Tyr Cys Cys Arg Ile Gln Ile Pro Gly Ile 85 90 95 Met Asn Asp Glu Lys Phe Asn Leu Lys Leu Val Ile Lys Pro Ala Lys 100 105 110 Val Thr Pro Ala Pro Thr Arg Gln Arg Asp Phe Thr Ala Ala Phe Pro 115 120 125 Arg Met Leu Thr Thr Arg Gly His Gly Pro Ala Glu Thr Gln Thr Leu 130 135 140 Gly Ser Leu Pro Asp Ile Asn Leu Thr Gln Ile Ser Thr Leu Ala Asn 145 150 155 160 Glu Leu Arg Asp Ser Arg Leu Ala Asn Asp Leu Arg Asp Ser Gly Ala 165 170 175 Thr Ile Arg Ile Gly 180 <210> 87 <211> 268 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 87 Pro Gly Trp Phe Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp Asn Pro Pro Thr 1 5 10 15 Phe Ser Pro Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp Asn Ala Thr Phe 20 25 30 Thr Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val Leu Asn Trp Tyr 35 40 45 Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala Ala Phe Pro Glu 50 55 60 Asp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asp Cys Arg Phe Arg Val Thr Gln Leu 65 70 75 80 Pro Asn Gly Arg Asp Phe His Met Ser Val Val Arg Ala Arg Arg Asn 85 90 95 Asp Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu Ala Pro Lys Ala 100 105 110 Gln Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val Thr Glu Arg Arg 115 120 125 Ala Glu Val Pro Thr Ala His Pro Ser Pro Ser Pro Arg Pro Ala Gly 130 135 140 Gln Phe Gln Thr Leu Val Val Gly Val Val Gly Gly Leu Leu Gly Ser 145 150 155 160 Leu Val Leu Leu Val Trp Val Leu Ala Val Ile Cys Ser Arg Ala Ala 165 170 175 Arg Gly Thr Ile Gly Ala Arg Arg Thr Gly Gln Pro Leu Lys Glu Asp 180 185 190 Pro Ser Ala Val Pro Val Phe Ser Val Asp Tyr Gly Glu Leu Asp Phe 195 200 205 Gln Trp Arg Glu Lys Thr Pro Glu Pro Pro Val Pro Cys Val Pro Glu 210 215 220 Gln Thr Glu Tyr Ala Thr Ile Val Phe Pro Ser Gly Met Gly Thr Ser 225 230 235 240 Ser Pro Ala Arg Arg Gly Ser Ala Asp Gly Pro Arg Ser Ala Gln Pro 245 250 255 Leu Arg Pro Glu Asp Gly His Cys Ser Trp Pro Leu 260 265 <210> 88 <211> 150 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 88 Pro Gly Trp Phe Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp Asn Pro Pro Thr 1 5 10 15 Phe Ser Pro Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp Asn Ala Thr Phe 20 25 30 Thr Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val Leu Asn Trp Tyr 35 40 45 Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala Ala Phe Pro Glu 50 55 60 Asp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asp Cys Arg Phe Arg Val Thr Gln Leu 65 70 75 80 Pro Asn Gly Arg Asp Phe His Met Ser Val Val Arg Ala Arg Arg Asn 85 90 95 Asp Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu Ala Pro Lys Ala 100 105 110 Gln Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val Thr Glu Arg Arg 115 120 125 Ala Glu Val Pro Thr Ala His Pro Ser Pro Ser Pro Arg Pro Ala Gly 130 135 140 Gln Phe Gln Thr Leu Val 145 150 <210> 89 <211> 288 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 89 Met Gln Ile Pro Gln Ala Pro Trp Pro Val Val Trp Ala Val Leu Gln 1 5 10 15 Leu Gly Trp Arg Pro Gly Trp Phe Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp 20 25 30 Asn Pro Pro Thr Phe Ser Pro Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp 35 40 45 Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val 50 55 60 Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala 65 70 75 80 Ala Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asp Cys Arg Phe Arg 85 90 95 Val Thr Gln Leu Pro Asn Gly Arg Asp Phe His Met Ser Val Val Arg 100 105 110 Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu 115 120 125 Ala Pro Lys Ala Gln Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val 130 135 140 Thr Glu Arg Arg Ala Glu Val Pro Thr Ala His Pro Ser Pro Ser Pro 145 150 155 160 Arg Pro Ala Gly Gln Phe Gln Thr Leu Val Val Gly Val Val Gly Gly 165 170 175 Leu Leu Gly Ser Leu Val Leu Leu Val Trp Val Leu Ala Val Ile Cys 180 185 190 Ser Arg Ala Ala Arg Gly Thr Ile Gly Ala Arg Arg Thr Gly Gln Pro 195 200 205 Leu Lys Glu Asp Pro Ser Ala Val Pro Val Phe Ser Val Asp Tyr Gly 210 215 220 Glu Leu Asp Phe Gln Trp Arg Glu Lys Thr Pro Glu Pro Pro Val Pro 225 230 235 240 Cys Val Pro Glu Gln Thr Glu Tyr Ala Thr Ile Val Phe Pro Ser Gly 245 250 255 Met Gly Thr Ser Ser Pro Ala Arg Arg Gly Ser Ala Asp Gly Pro Arg 260 265 270 Ser Ala Gln Pro Leu Arg Pro Glu Asp Gly His Cys Ser Trp Pro Leu 275 280 285 <210> 90 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GGGGS spacer <400> 90 Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 91 <211> 192 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SNAP-tag <400> 91 Asp Lys Asp Cys Glu Met Lys Arg Thr Thr Leu Asp Ser Pro Leu Gly 1 5 10 15 Lys Leu Glu Leu Ser Gly Cys Glu Gln Gly Leu His Glu Ile Lys Leu 20 25 30 Leu Gly Lys Gly Thr Ser Ala Ala Asp Ala Val Glu Val Pro Ala Pro 35 40 45 Ala Ala Val Leu Gly Gly Pro Glu Pro Leu Met Gln Ala Thr Ala Trp 50 55 60 Leu Asn Ala Tyr Phe His Gln Pro Glu Ala Ile Glu Glu Phe Pro Val 65 70 75 80 Pro Ala Leu His His Pro Val Phe Gln Gln Glu Ser Phe Thr Arg Gln 85 90 95 Val Leu Trp Lys Leu Leu Lys Val Val Lys Phe Gly Glu Val Ile Ser 100 105 110 Tyr Gln Gln Leu Ala Ala Leu Ala Gly Asn Pro Ala Ala Thr Ala Ala 115 120 125 Val Lys Thr Ala Leu Ser Gly Asn Pro Val Pro Ile Leu Ile Pro Cys 130 135 140 His Arg Val Val Ser Ser Ser Gly Ala Val Gly Gly Tyr Glu Gly Gly 145 150 155 160 Leu Ala Val Lys Glu Trp Leu Leu Ala His Glu Gly His Arg Leu Gly 165 170 175 Lys Pro Gly Leu Gly Pro Ala Gly Gly Ser Pro Gly Leu Glu Val Asn 180 185 190 <210> 92 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Flag-tag <400> 92 Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys 1 5 <210> 93 <211> 300 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 93 Met Phe Ser His Leu Pro Phe Asp Cys Val Leu Leu Leu Leu Leu Leu 1 5 10 15 Leu Leu Thr Arg Ser Ser Glu Val Glu Tyr Arg Ala Glu Val Gly Gln 20 25 30 Asn Ala Tyr Leu Pro Cys Phe Tyr Thr Pro Ala Ala Pro Gly Asn Leu 35 40 45 Val Pro Val Cys Trp Gly Lys Gly Ala Cys Pro Val Phe Glu Cys Gly 50 55 60 Asn Val Val Leu Arg Thr Asp Glu Arg Asp Val Asn Tyr Trp Thr Ser 65 70 75 80 Arg Tyr Trp Leu Asn Gly Asp Phe Arg Lys Gly Asp Val Ser Leu Thr 85 90 95 Ile Glu Asn Val Thr Leu Ala Asp Ser Gly Ile Tyr Cys Cys Arg Ile 100 105 110 Gln Ile Pro Gly Ile Met Asn Asp Glu Lys Phe Asn Leu Lys Leu Val 115 120 125 Ile Lys Pro Ala Lys Val Thr Pro Ala Pro Thr Arg Gln Arg Asp Phe 130 135 140 Thr Ala Ala Phe Pro Arg Met Leu Thr Thr Arg Gly His Gly Pro Ala 145 150 155 160 Glu Thr Gln Thr Leu Gly Ser Leu Pro Asp Ile Asn Leu Thr Gln Ile 165 170 175 Ser Thr Leu Ala Asn Glu Leu Arg Asp Ser Arg Leu Ala Asn Asp Leu 180 185 190 Arg Asp Ser Gly Ala Thr Ile Arg Ile Gly Ile Tyr Ile Gly Ala Gly 195 200 205 Ile Cys Ala Gly Leu Ala Leu Ala Leu Ile Phe Gly Ala Leu Ile Phe 210 215 220 Lys Trp Tyr Ser His Ser Lys Glu Lys Ile Gln Asn Leu Ser Leu Ile 225 230 235 240 Ser Leu Ala Asn Leu Pro Pro Ser Gly Leu Ala Asn Ala Val Ala Glu 245 250 255 Gly Ile Arg Ser Glu Glu Asn Ile Tyr Thr Ile Glu Glu Asn Val Tyr 260 265 270 Glu Val Glu Glu Pro Asn Glu Tyr Tyr Cys Tyr Val Ser Ser Arg Gln 275 280 285 Gln Pro Ser Gln Pro Leu Gly Cys Arg Phe Ala Met 290 295 300 <210> 94 <211> 181 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Clip-tag <400> 94 Asp Lys Asp Cys Glu Met Lys Arg Thr Thr Leu Asp Ser Pro Leu Gly 1 5 10 15 Lys Leu Glu Leu Ser Gly Cys Glu Gln Gly Leu His Arg Ile Ile Phe 20 25 30 Leu Gly Lys Gly Thr Ser Ala Ala Asp Ala Val Glu Val Pro Ala Pro 35 40 45 Ala Ala Val Leu Gly Gly Pro Glu Pro Leu Ile Gln Ala Thr Ala Trp 50 55 60 Leu Asn Ala Tyr Phe His Gln Pro Glu Ala Ile Glu Glu Phe Pro Val 65 70 75 80 Pro Ala Leu His His Pro Val Phe Gln Gln Glu Ser Phe Thr Arg Gln 85 90 95 Val Leu Trp Lys Leu Leu Lys Val Val Lys Phe Gly Glu Val Ile Ser 100 105 110 Glu Ser His Leu Ala Ala Leu Val Gly Asn Pro Ala Ala Thr Ala Ala 115 120 125 Val Asn Thr Ala Leu Asp Gly Asn Pro Val Pro Ile Leu Ile Pro Cys 130 135 140 His Arg Val Val Gln Gly Asp Ser Asp Val Gly Pro Tyr Leu Gly Gly 145 150 155 160 Leu Ala Val Lys Glu Trp Leu Leu Ala His Glu Gly His Arg Leu Gly 165 170 175 Lys Pro Gly Leu Gly 180

Claims (30)

  1. PD1에 특이적으로 결합하는 제1 항원-결합 부위 및 TIM3에 특이적으로 결합하는 제2 항원-결합 부위를 포함하는 이중특이성 항체로서,
    상기 PD1에 특이적으로 결합하는 제1 항원-결합 부위가
    (i) 서열번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1,
    (ii) 서열번호 38의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및
    (iii) 서열번호 39의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3
    을 포함하는 VH 도메인; 및
    (i) 서열번호 40의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1,
    (ii) 서열번호 41의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및
    (iii) 서열번호 42의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3
    을 포함하는 VL 도메인
    을 포함하고;
    상기 TIM3에 특이적으로 결합하는 제2 항원-결합 부위가
    (a) (i) 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1,
    (ii) 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및
    (iii) 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3
    을 포함하는 VH 도메인; 및
    (i) 서열번호 4 또는 서열번호 11 또는 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1,
    (ii) 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및
    (iii) 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3
    을 포함하는 VL 도메인; 또는
    (b) (i) 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1,
    (ii) 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및
    (iii) 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3
    을 포함하는 VH 도메인; 및
    (i) 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1,
    (ii) 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및
    (iii) 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3
    을 포함하는 VL 도메인; 또는
    (c) (i) 서열번호 29의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1,
    (ii) 서열번호 30의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및
    (iii) 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3
    을 포함하는 VH 도메인; 및
    (i) 서열번호 32의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1,
    (ii) 서열번호 33의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및
    (iii) 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3
    을 포함하는 VL 도메인
    을 포함하는 이중특이성 항체.
  2. 제 1 항에 있어서,
    PD1에 특이적으로 결합하는 제1 항원-결합 부위 및 TIM3에 특이적으로 결합하는 제2 항원-결합 부위를 포함하며, 상기 TIM3에, 상기 PD1에의 결합과 비교할 때 50배 이상 더 낮은 결합 친화성으로, 보다 특히 상기 PD1에의 결합과 비교할 때 100배 이상 더 낮은 결합 친화성으로 결합하는 이중특이성 항체.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    PD1에 특이적으로 결합하는 제1 항원-결합 부위가
    (a) 서열번호 43의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열번호 44의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인, 또는
    (b) 서열번호 45의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열번호 46의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인, 또는
    (c) 서열번호 45의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열번호 47의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인, 또는
    (d) 서열번호 45의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열번호 48의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인, 또는
    (e) 서열번호 45의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열번호 49의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인
    을 포함하고,
    TIM3에 특이적으로 결합하는 제2 항원-결합 부위가
    (a) 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인, 또는
    (b) 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인, 또는
    (c) 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인, 또는
    (d) 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인, 또는
    (e) 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인, 또는
    (f) 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인, 또는
    (g) 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인, 또는
    (h) 서열번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인
    을 포함하는 이중특이성 항체.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    PD1에 특이적으로 결합하는 제1 항원-결합 부위가 서열번호 45의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열번호 46의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하고,
    TIM3에 특이적으로 결합하는 제2 항원-결합 부위가 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인, 또는 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하는 이중특이성 항체.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
    PD1에 특이적으로 결합하는 제1 항원-결합 부위가 서열번호 45의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열번호 46의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하고,
    TIM3에 특이적으로 결합하는 제2 항원-결합 부위가 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하는 이중특이성 항체.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
    인간, 인간화된 또는 키메릭 항체인 이중특이성 항체.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
    Fc 도메인, PD1에 특이적으로 결합하는 항원-결합 부위를 포함하는 제1 Fab 단편 및 TIM3에 특이적으로 결합하는 항원-결합 부위를 포함하는 제2 Fab 단편을 포함하는 이중특이성 항체.
  8. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,
    Fc 도메인이 IgG, 특히 IgG1 Fc 도메인 또는 IgG4 Fc 도메인인 이중특이성 항체.
  9. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서,
    Fc 도메인이 Fc 수용체, 특히 Fcγ 수용체에 대한 결합을 감소시키는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 이중특이성 항체.
  10. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서,
    Fc 도메인이 아미노산 돌연변이 L234A, L235A 및 P329G(카밧 EU 지수에 따른 넘버링)를 갖는 인간 IgG1 하위부류의 것인 이중특이성 항체.
  11. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서,
    Fc 도메인이 상기 Fc 도메인의 제1 및 제2 서브유닛의 결합을 촉진하는 변형을 포함하는 이중특이성 항체.
  12. 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서,
    Fc 도메인의 제1 서브유닛이 놉을 포함하고 Fc 도메인의 제2 서브유닛이 놉-인투-홀 방법에 따른 홀을 포함하는 이중특이성 항체.
  13. 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서,
    Fc 도메인의 제1 서브유닛이 아미노산 치환 S354C 및 T366W(EU 넘버링)를 포함하고 Fc 도메인의 제2 서브유닛이 아미노산 치환 Y349C, T366S 및 Y407V(카밧 EU 지수에 따른 넘버링)를 포함하는 이중특이성 항체.
  14. 제 1 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서,
    Fab 단편 중 하나에서 가변 도메인 VL 및 VH가, 상기 VH 도메인이 경쇄의 부분이고 상기 VL 도메인이 중쇄의 부분이도록 서로에 의해 교체되는 이중특이성 항체.
  15. 제 14 항에 있어서,
    PD1에 특이적으로 결합하는 항원-결합 부위를 포함하는 제1 Fab 단편에서 가변 도메인 VL 및 VH가 서로에 의해 교체되는 이중특이성 항체.
  16. 제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서,
    Fab 단편 중 하나에서 불변 도메인 CL 중 124번 위치의 아미노산이 리신(K), 아르기닌(R) 또는 히스티딘(H)(카밧 EU 지수에 따른 넘버링)에 의해 독립적으로 치환되고, 불변 도메인 CH1 중 147번 및 213번 위치의 아미노산이 글루탐산(E) 또는 아스파트산(D)(카밧 EU 지수에 따른 넘버링)에 의해 독립적으로 치환되는 이중특이성 항체.
  17. 제 16 항에 있어서,
    TIM3에 특이적으로 결합하는 항원-결합 부위를 포함하는 제2 Fab 단편에서 불변 도메인 CL 중 124번 위치의 아미노산이 리신(K), 아르기닌(R) 또는 히스티딘(H)(카밧 EU 지수에 따른 넘버링)에 의해 독립적으로 치환되고, 불변 도메인 CH1 중 147번 및 213번 위치의 아미노산이 글루탐산(E) 또는 아스파트산(D)(카밧 EU 지수에 따른 넘버링)에 의해 독립적으로 치환되는 이중특이성 항체.
  18. 제 1 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 있어서,
    (a) 서열번호 50의 서열에 95% 이상 서열 일치성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄, 서열번호 52의 서열에 95% 이상 서열 일치성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 제1 경쇄,
    서열번호 51의 서열에 95% 이상 서열 일치성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄, 및 서열번호 53의 서열에 95% 이상 서열 일치성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 제2 경쇄, 또는
    (b) 서열번호 54의 서열에 95% 이상 서열 일치성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄, 서열번호 56의 서열에 95% 이상 서열 일치성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 제1 경쇄,
    서열번호 55의 서열에 95% 이상 서열 일치성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄, 및 서열번호 57의 서열에 95% 이상 서열 일치성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 제2 경쇄, 또는
    (c) 서열번호 58의 서열에 95% 이상 서열 일치성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄, 서열번호 60의 서열에 95% 이상 서열 일치성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 제1 경쇄,
    서열번호 59의 서열에 95% 이상 서열 일치성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄, 및 서열번호 61의 서열에 95% 이상 서열 일치성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 제2 경쇄, 또는
    (d) 서열번호 62의 서열에 95% 이상 서열 일치성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄, 서열번호 64의 서열에 95% 이상 서열 일치성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 제1 경쇄,
    서열번호 63의 서열에 95% 이상 서열 일치성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄, 및 서열번호 65의 서열에 95% 이상 서열 일치성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 제2 경쇄, 또는
    (e) 서열번호 66의 서열에 95% 이상 서열 일치성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄, 서열번호 68의 서열에 95% 이상 서열 일치성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 제1 경쇄,
    서열번호 67의 서열에 95% 이상 서열 일치성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄, 및 서열번호 69의 서열에 95% 이상 서열 일치성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 제2 경쇄
    를 포함하는 이중특이성 항체.
  19. 제 1 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항에 있어서,
    (a) 서열번호 50의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄, 서열번호 52의 아미노산 서열을 포함하는 제1 경쇄,
    서열번호 51의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄, 및 서열번호 53의 아미노산 서열을 포함하는 제2 경쇄, 또는
    (b) 서열번호 54의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄, 서열번호 56의 아미노산 서열을 포함하는 제1 경쇄,
    서열번호 55의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄, 및 서열번호 57의 아미노산 서열을 포함하는 제2 경쇄, 또는
    (c) 서열번호 58의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄, 서열번호 60의 아미노산 서열을 포함하는 제1 경쇄,
    서열번호 59의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄, 및 서열번호 61의 아미노산 서열을 포함하는 제2 경쇄, 또는
    (d) 서열번호 62의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄, 서열번호 64의 아미노산 서열을 포함하는 제1 경쇄,
    서열번호 63의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄, 및 서열번호 65의 아미노산 서열을 포함하는 제2 경쇄, 또는
    (e) 서열번호 66의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄, 서열번호 68의 아미노산 서열을 포함하는 제1 경쇄,
    서열번호 67의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄, 및 서열번호 69의 아미노산 서열을 포함하는 제2 경쇄
    를 포함하는 이중특이성 항체.
  20. 제 1 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 따른 이중특이성 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드.
  21. 제 20 항에 따른 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터, 특히 발현 벡터.
  22. 제 20 항에 따른 폴리뉴클레오타이드 또는 제 21 항에 따른 벡터를 포함하는 원핵생물 또는 진핵생물 숙주 세포.
  23. a) 숙주 세포를, 제 1 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 따른 이중특이성 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터로 형질전환시키는 단계,
    b) 상기 숙주 세포를 상기 이중특이성 항체의 발현에 적합한 조건하에 배양하는 단계, 및
    c) 상기 이중특이성 항체를 상기 배양물로부터 회수하는 단계
    를 포함하는, 상기 이중특이성 항체의 생산 방법.
  24. 제 1 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 따른 이중특이성 항체 및 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 약학 조성물.
  25. 약제로서 사용하기 위한 제 1 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 따른 이중특이성 항체 또는 제 24 항에 따른 약학 조성물.
  26. i) 면역 응답의 조절, 예를 들어 T 세포 활성의 복원에,
    ii) 면역 응답 또는 기능의 자극에,
    iii) 감염의 치료에,
    iv) 암의 치료에,
    v) 암의 진행의 지연에,
    vi) 암을 앓고 있는 환자의 생존의 연장에
    사용하기 위한, 제 1 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 따른 이중특이성 항체 또는 제 24 항에 따른 약학 조성물.
  27. 암의 예방 또는 치료에 사용하기 위한, 제 1 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 따른 이중특이성 항체 또는 제 24 항에 따른 약학 조성물.
  28. 만성 바이러스성 감염의 치료에 사용하기 위한, 제 1 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 따른 이중특이성 항체 또는 제 24 항에 따른 약학 조성물.
  29. 암의 예방 또는 치료에 사용하기 위한, 제 1 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 따른 이중특이성 항체 또는 제 24 항에 따른 약학 조성물로서, 상기 이중특이성 항체가 화학요법제, 방사선 및/또는 암 면역요법에 사용하기 위한 다른 작용제와 함께 투여되는 이중특이성 항체 또는 조성물.
  30. 개체에게 종양 세포의 성장을 억제시키기에 유효한 양의 제 1 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 따른 이중특이성 항체를 투여함을 포함하는, 상기 개체에서 상기 종양 세포의 성장을 억제시키는 방법.
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