CN113574386A - 用于增强癌症患者的cd8+t细胞依赖性免疫应答的方法和药物组合物 - Google Patents

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Abstract

通过释放耗尽的CD8+T细胞从而恢复抗肿瘤免疫应答，靶向免疫检查点如程序性细胞死亡1(PD1)改进了癌症患者的生存率。然而，大多数患者复发或对免疫检查点阻断疗法无效。在本文中，发明人展示了NRP1在PD1+CD8+T细胞的溶细胞突触中被募集，相互作用并增强PD‑1活性。在小鼠中，Nrp1的CD8+T细胞特异性缺失改进自发的和抗PD1抗体的抗肿瘤免疫应答。同样，在人转移性黑色素瘤中，肿瘤浸润性CD8+T细胞中的NRP1表达预示用抗PD1(例如派姆单抗)治疗的患者的预后不佳。最后，抗NRP1和抗PD1抗体的组合在人中具有协同作用，特别是在CD8+T细胞抗肿瘤应答中。因此，单独的NRP1，或与免疫检查点抑制剂(例如抗PD1抗体)结合的治疗性抑制可以有效抑制人癌症中的肿瘤生长。本发明还涉及包含至少一个特异性结合免疫检查点分子(例如PD‑1)的结合位点和至少一个特异性结合NRP‑1的结合位点的多特异性抗体。本发明还涉及工程化以表达嵌合抗原受体(CAR)的细胞群，并且其中所述细胞中NRP‑1的表达被抑制。

Description

用于增强癌症患者的CD8+T细胞依赖性免疫应答的方法和药 物组合物
技术领域
本发明涉及用于增强癌症患者的CD8+T细胞依赖性免疫应答的方法和药物组合物。
背景技术
免疫系统检测和消除癌症的能力在100多年前首次被提出。从那时起，在患有许多不同类型癌症的患者的血液中检测到了对肿瘤相关抗原具有反应性的T细胞，表明免疫系统在抗击癌症中的作用。先天免疫和适应性免疫维持效应细胞，如淋巴细胞和自然杀伤细胞，所述效应细胞将正常细胞与如肿瘤细胞的“修饰”细胞区分开来。然而，大多数情况下，肿瘤细胞能够逃避免疫识别和破坏。肿瘤逃逸的机制有很多，但共抑制分子的免疫抑制作用在过去十年中已经成为反映最具吸引力的一种新的癌症治疗。淋巴细胞的激活实际通过属于B7/CD28超家族(也称为免疫球蛋白(Ig)超家族)和TNF/TNFR超家族的共刺激和共抑制分子来调节。这些信号之间的平衡决定淋巴细胞的激活，从而调节免疫应答。这些共刺激和共抑制分子被称为“免疫检查点”。最近最受关注的免疫检查点是程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)。抑制PD-1的单克隆抗体如纳武单抗和派姆单抗确实显示出显著的功效并且已经获得批准，并有望在未来引起轰动。然而，尽管这些药物推动了相当大的进步，但一些患者仍未能响应，因此需要鉴定所述抗性的机制以提供新的治疗选择。
神经毡蛋白-1(NRP-1)是一种跨膜糖蛋白，其作为血管内皮生长因子(VEGF)家族各种成员的共同受体。它结合或调节许多其他细胞外配体(如3类信号素、TGF-β、HGF、FGF和PDGF)活性的能力表明NRP-1参与多种生理和病理过程。实际上，这种共同受体与轴突引导、血管生成、肿瘤进展有关。我们和其他人已经证明Nrp1参与先天免疫和适应性免疫两者，但是从未研究过NRP-1在抗肿瘤细胞毒性T细胞中的影响。
发明概述
如权利要求所定义，本发明涉及用于增强癌症患者的CD8+T细胞依赖性免疫应答的方法和药物组合物。
发明详述
发明人现已证明，NRP-1由细胞毒性T细胞(CD8+T细胞或CTL)表达，共定位并与所述细胞上的PD-1形成复合物。CTL中NRP-1表达的缺失导致动物的抗肿瘤应答更明显。此外，结合CD8+T细胞上的NRP1缺失和动物中的抗PD1抑制剂产生协同的抗肿瘤作用。最后，计算机分析表明，在用抗PD1抑制剂治疗的患者中，患者中NRP-1的下调表达有更好的应答。
主要定义：
如本文所用，术语“T细胞”具有其在本领域的一般含义并且代表在细胞介导的免疫中起核心作用的免疫系统的重要组分。T细胞被称为常规淋巴细胞，因为它们通过主要组织相容性复合物分子的呈递或限制其TCR(抗原的T细胞受体)来识别抗原。存在几个各自具有不同功能的T细胞亚群，诸如CD8+T细胞、CD4+T细胞、γδT细胞和Treg。
如本文所用，术语“CD8+T细胞”具有其在本领域的一般含义并且是指在其表面表达CD8的T细胞的亚群。它们是MHC I类限制性的，并且作为细胞毒性T细胞发挥作用。“CD8+T细胞”也称为细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、T杀伤细胞、溶细胞性T细胞或杀伤性T细胞。CD8抗原是免疫球蛋白超基因家族的成员，是主要组织相容性复合体I类限制性相互作用中的缔合识别元件。如本文所用，术语“肿瘤浸润性CD8+T细胞”是指患者的CD8+T细胞库，所述细胞已经离开血流并迁移到肿瘤中。
如本文所用，术语“CD4+T细胞”(也称为T辅助细胞或TH细胞)是指在其表面表达CD4糖蛋白并在免疫过程中辅助其他白细胞的T细胞，包括B细胞成熟为浆细胞和记忆B细胞，以及细胞毒性T细胞和巨噬细胞的激活。CD4+T细胞在被肽抗原通过MHC II类分子呈递时被激活，所述MHC II类分子在抗原呈递细胞(APC)表面表达。一旦被激活，它们迅速分裂并分泌调节或协助主动免疫应答的细胞因子。这些细胞可以分化为几种亚型之一，包括TH1、TH2、TH3、TH17、TH9、TFH或Treg，它们分泌不同的细胞因子以促进不同类型的免疫应答。来自APC的信号传导引导T细胞成为特定的亚型。除CD4外，本领域已知的TH细胞表面生物标志物包括CXCR3(Th1)、CCR4、Crth2(Th2)、CCR6(Th17)、CXCR5(Tfh)以及细胞因子和转录因子的亚型特异性表达，包括T-bet、GATA3、EOMES、RORγT、BCL6和FoxP3。
如本文所用，术语“γδT细胞”具有其在本领域的一般含义。γδT细胞通常在健康个体(人、猴)的外周血淋巴细胞中占1％-5％。它们参与产生保护性免疫应答，并且已经表明它们通过与抗原的直接相互作用识别它们的抗原配体，而没有由抗原呈递细胞的MHC分子的任何呈递。γ9δ2T细胞(有时也称为γ2δ2T细胞)是携带具有可变结构域Vγ9和Vδ2的TCR受体的γδT细胞。它们形成人血液中的大部分γδT细胞。当被激活时，γδT细胞发挥有效的、非MHC限制的细胞毒活性，尤其能有效杀死各种类型的细胞，特别是致病细胞。这些可能是被病毒(Poccia et al.,J.Leukocyte Biology,1997,62:1-5)或被其他细胞内寄生虫如分枝杆菌(Constant et al.,Infection and Immunity,December 1995,vol.63,no.12:4628-4633)或原生动物(Behr et al.,Infection and Immunity,1996,vol.64,no.8:2892-2896)感染的细胞。它们也可能是癌细胞(Poccia et al.,J.Immunol.,159:6009-6015；Fournie and Bonneville,Res.Immunol.,66th Forum in Immunology,147:338-347)。因此，在体外、离体或体内调节所述细胞活性的可能性将在治疗各种病理中提供新的有效的治疗方法，如感染性疾病(特别是病毒或寄生虫)、癌症、过敏以及甚至自身免疫和/或炎症性疾病。
如本文所用，术语“CAR-T细胞”是指经基因工程化以表达CAR的T淋巴细胞。CAR T细胞的定义涵盖T淋巴细胞的所有类别和亚类，包括CD4+、CD8+T细胞、γδT细胞以及效应T细胞、记忆T细胞、调节性T细胞等。经基因修饰的T淋巴细胞可以从将接受使用基因修饰的T细胞治疗的受试者“衍生”或“获得”，或者它们可以从不同受试者“衍生”或“获得”。
如本文所用，术语“嵌合抗原受体”或“CAR”是指当在免疫效应细胞中时，为细胞提供对靶细胞(通常为癌细胞)的特异性，并产生细胞内信号的一组多肽，在最简单的实施方案中通常为两个多肽。在一些实施方案中，CAR至少包含细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞质信号传导结构域(本文也称为“细胞内信号传导结构域”)，其包含源自如下文所定义的刺激分子和/或共刺激分子的功能性信号传导结构域。在一些方面，该组多肽彼此连续。在一些实施方案中，该组多肽包括二聚化开关，其在二聚化分子存在时可将多肽彼此偶联，例如可将抗原结合结构域偶联至细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，刺激分子是与T细胞受体复合物相关的ζ链。在一些实施方案中，细胞质信号传导结构域进一步包含一个或多个源自至少一种如下定义的共刺激分子的功能性信号传导结构域。在一些实施方案中，共刺激分子选自本文所述的共刺激分子，例如4-1BB(即CD137)、CD27和/或CD28。在一些实施方案中，CAR包含嵌合融合蛋白，所述嵌合融合蛋白包含细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和包含源自刺激分子的功能性信号传导结构域的细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，CAR包含嵌合融合蛋白，所述嵌合融合蛋白包含细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和包含源自共刺激分子的功能性信号传导结构域和源自刺激分子的功能性信号传导结构域的细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，CAR包含嵌合融合蛋白，所述嵌合融合蛋白包含细胞外抗原结合域、跨膜结构域和包含源自一个或多个共刺激分子的两个功能性信号传导结构域和源自刺激性分子的功能性信号传导结构域的胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，CAR包含嵌合融合蛋白，所述嵌合融合蛋白包含细胞外抗原结合域、跨膜结构域和包含源自一个或多个共刺激分子的至少两个功能性信号传导结构域和源自刺激性分子的功能性信号传导结构域的胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，CAR在CAR融合蛋白的氨基末端(N-端)包含任选的前导序列。在一些实施方案中，CAR进一步包含在细胞外抗原结合域的N末端的前导序列，其中在将CAR细胞加工和定位至细胞膜期间，将前导序列任选地从抗原结合结构域(例如，scFv)切割。在特定方面，CAR包含源自单克隆抗体的单链可变片段(scFv)的融合体，融合至CD3-ζ跨膜结构域和内域。在一些实施方案中，CAR包含用于其他共刺激信号传导的结构域，如CD3-ζ、FcR、CD27、CD28、CD137、DAP10和/或OX40。在一些实施方案中，分子可以与CAR共表达，包括共刺激分子、用于成像(例如用于正电子发射断层扫描)的报告基因、在添加前药后有条件地消融T细胞的基因产物、归巢受体、趋化因子、趋化因子受体、细胞因子和细胞因子受体。
如本文所用，术语“NRP-1”具有其在本领域的一般含义并是指神经毡蛋白-1。NRP-1的示例性人核酸序列由NCBI参考序列NM_001024628.2表示，且人氨基酸序列由NCBI参考序列NP_001019799.1表示。特别地，NRP-1的人氨基酸序列由SEQ ID NO：1表示。NRP-1的基本结构包含5个结构域：三个胞外结构域(a1 a2、b1、b2和c)、一个跨膜结构域和一个细胞质结构域(SEQ ID NO：1)。结合Sema3A的a1 a2结构域的范围从SEQ ID NO：1中第1位的氨基酸残基到第280位的氨基酸残基。
SEQ ID NO:1
MERGLPLLCAVLALVLAPAGAFRNDKCGDTIKIESPGYLTSPGYPHSYHPSEKCEWLIQAPDPYQRIMI NFNPHFDLEDRDCKYDYVEVFDGENENGHFRGKFCGKIAPPPVVSSGPFLFIKFVSDYETHGAGFSIRYEIFKRGPE CSQNYTTPSGVIKSPGFPEKYPNSLECTYIVFAPKMSEIILEFESFDLEPDSNPPGGMFCRYDRLEIWDGFPDVGPH IGRYCGQKTPGRIRSSSGILSMVFYTDSAIAKEGFSANYSVLQSSVSEDFKCMEALGMESGEIHSDQITASSQYSTNWSAERSRLNYPENGWTPGEDSYREWIQVDLGLLRFVTAVGTQGAISKETKKKYYVKTYKIDVSSNGEDWITIKEGNKPVLFQGNTNPTDVVVAVFPKPLITRFVRIKPATWETGISMRFEVYGCKITDYPCSGMLGMVSGLISDSQITSSNQGDRNWMPENIRLVTSRSGWALPPAPHSYINEWLQIDLGEEKIVRGIIIQGGKHRENKVFMRKFKIGYSNNGSDWKMIMDDSKRKAKSFEGNNNYDTPELRTFPALSTRFIRIYPERATHGGLGLRMELLGCEVEAPTAGPTTPNGNLVDECDDDQANCHSGTGDDFQLTGGTTVLATEKPTVIDSTIQSEFPTYGFNCEFGWGSHKTFCHWEHDNHVQLKWSVLTSKTGPIQDHTGDGNFIYSQADENQKGKVARLVSPVVYSQNSAHCMTFWYHMSGSHVGTLRVKLRYQKPEEYDQLVWMAIGHQGDHWKEGRVLLHKSLKLYQVIFEGEIGKGNLGGIAVDDISINNHISQEDCAKPADLDKKNPEIKIDETGSTPGYEGEGEGDKNISRKPGNVLKTLDPILITIIAMSALGVLLGAVCGVVLYCACWHNGMSERNLSALENYNFELVDGVKLKKDKLNTQSTYSEA
如本文所用，“NRP-1的功能等价物”是能够结合信号素3A从而阻止其与NRP-1相互作用的多肽。术语“功能等价物”包括NRP-1的片段、突变体和突变蛋白。因此，术语“功能等价物”包括通过改变氨基酸序列获得的NRP-1的任何等价物，例如通过一个或多个氨基酸缺失、取代或添加，使得蛋白质类似物保留例如结合信号素3A的能力。例如，可以通过编码氨基酸序列的DNA的点突变来进行氨基酸取代。如本文所用，术语“功能等价片段”也可指NRP-1的任何片段或片段的组装。
如本文所用，术语“NRP-1抑制剂”是指可以抑制NRP-1的功能和/或表达的化合物、物质或组合物。例如，抑制剂可以抑制NRP-1的表达或活性，调节或阻断NRP-1或阻断信号传导通路。特别地，NRP-1抑制剂抑制NRP-1与其配偶体，尤其是信号素-3A之间的相互作用。特别地，NRP-1抑制剂不抑制NRP-1和VEGF(血管内皮生长因子)之间的相互作用。
如本文所用，术语“信号素-3A”具有其在本领域的一般含义并且是指信号素-3A是在人中由SEMA3A基因编码的蛋白质。该术语也称为COLL1、HH16、Hsema-I、Hsema-III、SEMA1、SEMAD、SEMAIII、SEMAL、SemD和coll-1。SEMA3A基因是信号素家族的成员并且编码具有Ig样C2型(免疫球蛋白样)结构域、PSI结构域和Sema结构域的蛋白质。NRP-1的示例性人核酸序列由NCBI参考序NM_006080.2表示，且人氨基酸序列由NCBI参考序列NP_006071.1表示。特别地，信号素3A的人氨基酸序列由SEQ ID NO：2表示。
SEQ ID NO:2.
MGWLTRIVCLFWGVLLTARANYQNGKNNVPRLKLSYKEMLESNNVITFNGLANSSSYHTFLLDEERSRLYVGAKDHIFSFDLVNIKDFQKIVWPVSYTRRDECKWAGKDILKECANFIKVLKAYNQTHLYACGTGAFHPICTYIEIGHHPEDNIFKLENSHFENGRGKSPYDPKLLTASLLIDGELYSGTAADFMGRDFAIFRTLGHHHPIRTEQHDSRWLNDPKFISAHLISESDNPEDDKVYFFFRENAIDGEHSGKATHARIGQICKNDFGGHRSLVNKWTTFLKARLICSVPGPNGIDTHFDELQDVFLMNFKDPKNPVVYGVFTTSSNIFKGSAVCMYSMSDVRRVFLGPYAHRDGPNYQWVPYQGRVPYPRPGTCPSKTFGGFDSTKDLPDDVITFARSHPAMYNPVFPMNNRPIVIKTDVNYQFTQIVVDRVDAEDGQYDVMFIGTDVGTVLKVVSIPKETWYDLEEVLLEEMTVFREPTAISAMELSTKQQQLYIGSTAGVAQLPLHRCDIYGKACAECCLARDPYCAWDGSACSRYFPTAKRRTRRQDIRNGDPLTHCSDLHHDNHHGHSPEERIIYGVENSSTFLECSPKSQRALVYWQFQRRNEERKEEIRVDDHIIRTDQGLLLRSLQQKDSGNYLCHAVEHGFIQTLLKVTLEVIDTEHLEELLHKDDDGDGSKTKEMSNSMTPSQKVWYRDFMQLINHPNLNTMDEFCEQVWKRDRKQRRQRPGHTPGNSNKWKHLQENKKGRNRRTHEFERAPRSV
如本文所用，术语“接头(linker)”是指连接本发明的多肽和免疫球蛋白序列部分的至少一个氨基酸的序列。这种接头可用于防止空间位阻。在一些实施方案中，接头具有4；5；6；7；8；9；10；11；12；13；14；15；16；17；18；19；20；21；22；23；24；25；26；27；28；29；30个氨基酸残基。一组有用的接头序列是源自重链抗体铰链区的接头，如WO96/34103和WO 94/04678中所述。其他实例是聚丙氨酸接头序列。
如本文所用，术语“免疫检查点蛋白”具有其在本领域的一般含义并且是指由T细胞表达的分子，在细胞中上调信号(刺激性检查点分子)或下调信号(抑制性检查点分子)。免疫检查点分子在本领域中被认为构成类似于CTLA-4和PD-1依赖性途径的免疫检查点途径(参见例如Pardoll,2012.Nature Rev Cancer 12:252-264；Mellman et al.,2011.Nature 480:480-489)。抑制性检查点分子的实例包括A2AR、B7-H3、B7-H4、BTLA、CTLA-4、CD277、IDO、KIR、PD-1、LAG-3、TIM-3和VISTA。腺苷A2A受体(A2AR)被认为是癌症治疗的重要检查点，因为肿瘤微环境具有相对较高的腺苷水平，这通过激活A2AR导致免疫负反馈回路。B7-H3，也称为CD276，最初被认为是一种共刺激分子，但现在被认为是共抑制分子。B7-H4，也称为VTCN1，由肿瘤细胞和肿瘤相关巨噬细胞表达并在肿瘤逃逸中发挥作用。B和T淋巴细胞衰减子(BTLA)，也称为CD272，是HVEM(疱疹病毒侵入介质)的配体。BTLA的细胞表面表达在人CD8+T细胞从初始细胞表型到效应细胞表型的分化过程期间逐渐下调，但肿瘤特异性人CD8+T细胞表达高水平的BTLA。CTLA-4，细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4，也称为CD152，在Treg细胞上过表达以控制T细胞增殖。IDO，吲哚胺2,3-加双氧酶，是色氨酸分解代谢酶，一种相关的免疫抑制酶。另一个重要的分子是TDO，色氨酸2,3-双加氧酶。已知IDO抑制T和NK细胞，生成和激活Treg和髓源性抑制细胞，并促进肿瘤血管生成。KIR，杀伤细胞免疫球蛋白样受体，是自然杀伤细胞上MHC I类分子的受体。LAG3，淋巴细胞激活基因3，通过对Treg的作用以及对CD8+T细胞的直接作用来抑制免疫应答。TIM-3是T细胞免疫球蛋白域和粘蛋白结构域3的缩写，在活化的人CD4+T细胞上表达并调节Th1和Th17细胞因子。TIM-3通过与其配体半乳凝素-9相互作用触发细胞死亡，充当Th1/Tc1功能的负调节剂。VISTA是T细胞激活的V结构域Ig抑制子的缩写，主要在造血细胞上表达，因此在肿瘤内白细胞上的一致表达VISTA可使得VISTA阻断在广泛的实体瘤中有效。如本文所用，术语“PD-1”具有其在本领域的一般含义并且是指程序性细胞死亡蛋白1(也称为CD279)。PD-1充当免疫检查点，在与其配体之一PD-L1或PD-L2结合后，抑制T细胞的活化。
如本文所用，术语“免疫检查点抑制剂”具有其在本领域的一般含义并且是指抑制免疫抑制性检查点蛋白功能的任何化合物。抑制包括功能降低和完全阻断。优选的免疫检查点抑制剂是特异性识别免疫检查点蛋白的抗体。许多免疫检查点抑制剂是已知的，并且类似于这些已知的免疫检查点蛋白抑制剂，在(不久的)将来可能会开发替代性免疫检查点抑制剂。免疫检查点抑制剂包括肽、抗体、核酸分子和小分子。特别地，施用本发明的免疫检查点抑制剂以增强患者CD8+T细胞的增殖、迁移、持久性和/或细胞毒活性，特别是患者CD8+T细胞的肿瘤浸润。免疫检查点抑制剂增强T CD8细胞杀伤活性的能力可以通过本领域公知的任何测定方法来确定。通常，所述测定是体外测定，其中使CD8+T细胞与靶细胞(例如被CD8+T细胞识别和/或裂解的靶细胞)接触。例如，可以选择本发明的免疫检查点抑制剂，其能够使得，利用与本发明的免疫检查点抑制剂接触的CD8+T细胞或CD8T细胞系，在相同的效应子:靶细胞比率获得的通过CD8+T细胞的特异性裂解增加大于约20％，优选至少约30％、至少约40％、至少约50％或更高。经典细胞毒性测定的方案的实例是常规的。因此，表述“增强免疫检查点的效力”是指NRP-1抑制剂能够增加免疫检查点抑制剂以增强CD8+T细胞的增殖、迁移、持久性和/或细胞毒活性的能力。
因此，如本文所用，术语“抗体”用于指具有抗原结合区的任何抗体样分子，并且该术语包括抗体片段，该抗体片段包含抗原结合结构域，诸如Fab'、Fab、F(ab')2、单域抗体(DAB)、TandAbs二聚体、Fv、scFv(单链Fv)、dsFv、ds-scFv、Fd、线性抗体、微型抗体、双抗体、双特异性抗体片段、二抗体、三抗体(scFv-Fab融合蛋白，分别是双特异性或三特异性)、sc-双抗体、κ(λ)体(scFv-CL融合体)、BiTE(双特异性T细胞衔接、吸引T细胞的scFv-scFv串联)、DVD-Ig(双可变结构域抗体，双特异性形式)、SIP(小免疫蛋白，一种微型抗体)、SMIP(“小型模块化免疫药物”scFv-Fc二聚体、DART(ds稳定(ds-stabilized)的双抗体“DualAffinity ReTargeting”)；包含一个或多个CDR的小抗体模拟物等。制备和使用各种基于抗体的构建体和片段的技术是本领域众所周知的(参见Kabat et al.,1991,其具体地通过引用并入本文)。特别地，双抗体进一步描述于EP 404,097和WO 93/1 1 161中；而线性抗体进一步描述于Zapata et al.(1995)中。可以使用常规技术将抗体片段化。例如，可以通过用胃蛋白酶处理抗体来产生F(ab')2片段。可以处理所得的F(ab')2片段以还原二硫键以产生Fab'片段。木瓜蛋白酶消化可使得Fab片段的形成。Fab、Fab'和F(ab')2、scFv、Fv、dsFv、Fd、dAbs、TandAbs、ds-scFv、二聚体、微型抗体、双抗体、双特异性抗体片段和其他片段也可以通过重组技术合成或可以化学合成。产生抗体片段的技术是众所周知的，并且描述于本领域中。例如Beckman et al.,2006；Holliger&Hudson,2005；Le Gall et al.,2004；Reff&Heard,2001；Reiter et al.,1996；和Young et al.,1995中的每一个进一步描述并使有效抗体片段的产生成为可能。在一些实施方案中，本发明的抗体是单链抗体。如本文所用，术语“单域抗体”具有其在本领域中的一般含义，并且是指可以在骆驼属哺乳动物中发现的天然缺失轻链的单重链可变结构域抗体类型。这种单域抗体也是“纳米抗体
Figure BDA0003148874070000101
”。对于(单)结构域抗体的一般描述，还参考以上引用的现有技术，以及EP 0 368 684,Wardet al.(Nature 1989Oct 12；341(6242):544-6),Holt et al.,Trends Biotechnol.,2003,21(11):484-490；和WO 06/030220、WO 06/003388。
在啮齿动物和灵长类动物的天然抗体中，两条重链通过二硫键相互连接，并且每条重链通过二硫键与轻链连接。存在两种类型的轻链，lambda(1)和kappa(κ)。存在五个主要的重链类别(或同种型)，其决定抗体分子的功能活性：IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。每条链含有不同的序列结构域。在典型的IgG抗体中，轻链包括两个结构域，可变结构域(VL)和恒定结构域(CL)。重链包括四个结构域，可变结构域(VH)和三个恒定结构域(CH1、CH2和CH3，统称为CH)。轻链(VL)和重链(VH)的可变区决定了对抗原的结合识别和特异性。轻链(CL)和重链(CH)的恒定区结构域赋予重要的生物学性能，诸如抗体链缔合、分泌、经胎盘移动、补体结合和与Fc受体(FcR)的结合。Fv片段是免疫球蛋白的Fab片段的N-末端部分，并且由一条轻链和一条重链的可变部分组成。抗体的特异性在于抗体结合位点和抗原决定簇之间的结构互补性。抗体结合位点由主要来自高变区或互补决定区(CDR)的残基组成。偶尔，来自非高变区或框架区(FR)的残基可参与抗体结合位点或影响整个结构域的结构并因此影响结合位点。互补决定区或CDR是指一起定义天然免疫球蛋白结合位点的天然Fv区的结合亲和力和特异性的氨基酸序列。免疫球蛋白的轻链和重链各自具有三个CDR，分别称为L-CDR1、L-CDR2、L-CDR3和H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3。因而，抗原结合位点典型地包括六个CDR，其包含来自重链和轻链V区的每一个的CDR组。框架区(FR)是指插入CDR之间的氨基酸序列。因此，轻链和重链的可变区通常包含以下序列的4个框架区和3个CDR：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。抗体可变结构域中的残基通常根据Kabat等设计的系统编号。该系统列于Kabatet al.,1987的Sequences of Proteins of Immunological Interest,US Department ofHealth and Human Services,NIH,USA(Kabat et al.,1992，以下称为“Kabat等”)中。Kabat残基的名称并不总是直接与SEQ ID序列中氨基酸残基的线性编号相对应。实际的线性氨基酸序列可以含有比在严格的Kabat编号中更少或额外的氨基酸，其对应于基本可变结构域结构的结构成分(无论框架或互补决定区(CDR))的缩短或插入。可以通过将抗体序列中的同源残基与“标准”Kabat编号序列进行比对，来确定给定抗体的残基的正确Kabat编号。根据Kabat编号系统，重链可变结构域的CDR位于残基31-35(H-CDR1)、残基50-65(H-CDR2)和残基95-102(H-CDR3)。根据Kabat编号系统，轻链可变结构域的CDR位于残基24-34(L-CDR1)、残基50-56(L-CDR2)和残基89-97(L-CDR3)。对于下文描述的抗体，CDR已使用来自www.bioinf.org.uk的CDR查找算法确定-参见抗体页面中名为“如何通过查看序列来鉴定CDR”的部分。
如本文所用，术语“单域抗体”具有其在本领域的一般含义并且是指可以在骆驼属哺乳动物中发现的天然缺失轻链的单重链可变结构域的抗体类型。这种单域抗体也是“纳米抗体”。
如本文所用，术语“scFv”是指包含至少一种包含轻链可变区的抗体片段和至少一种包含重链可变区的抗体片段的融合蛋白，其中轻链和重链可变区例如通过合成接头(例如短的柔性多肽接头)连续连接，并且能够表达为单链多肽，并且其中scFv保留其来源的完整抗体的特异性。除非另有说明，如本文所用，scFv可具有以任一顺序的VL和VH可变区，例如，相对于多肽的N端和C端，scFv可包含VL-接头-VH或可包含VH-接头-VL。
如本文所用，术语“双特异性抗体”是指对两种靶分子具有特异性的抗体，即对至少两种不同表位(通常非重叠表位)具有特异性的抗体。如本文所用，术语“完全人(fullyhuman)”是指免疫球蛋白，诸如抗体或抗体片段，其中整个分子是人来源或由与抗体或免疫球蛋白的人形式相同的氨基酸序列组成。
如本文所用，“人源化”描述了其中CDR区外的一些、大部分或全部氨基酸被衍生自人免疫球蛋白分子的相应氨基酸替代的抗体。
如本文所用，术语“交叉竞争”是指共享结合抗原的特定区域的能力的单克隆抗体。在本公开中，“交叉竞争”的单克隆抗体在标准竞争性结合测定中具有干扰另一单克隆抗体与抗原结合的能力。根据非限制性理论，这种单克隆抗体可以结合与其竞争的抗体相同或相关或附近(例如，结构相似或空间上接近)的表位。与缺少所述抗体之一的阳性对照相比，如果抗体A将抗体B的结合降低至少60％，具体是至少70％并且更具体地至少为80％，则存在交叉竞争，反之亦然。正如技术人员所理解，可以在不同的测定设置中评估竞争。一种合适的测定涉及使用Biacore技术(例如，通过使用BIAcore 3000仪器(Biacore，Uppsala，Sweden))，其可以使用表面等离子体共振技术测量相互作用的程度。另一种测量交叉竞争的测定使用基于ELISA的方法。此外，国际专利申请号WO2003/48731描述了基于抗体的交叉竞争“装箱(binning)”抗体的高通量方法。
“表达抑制剂”是指具有抑制基因表达的生物学效应的天然或合成化合物。
术语“核酸内切酶”是指在多核苷酸链内切割磷酸二酯键的酶。一些，诸如脱氧核糖核酸酶I，相对非特异性地切割DNA(不考虑序列)，而许多典型地称为限制性核酸内切酶或限制性酶，并且仅在非常特定的核苷酸序列处切割。基于核酸内切酶的基因组失活背后的机制通常需要第一步DNA单链或双链断裂，然后其能够触发DNA修复的两种不同细胞机制，这些机制可以用于DNA失活：易于出错的非同源末端连接(NHEJ)和高保真同源介导的修复(HDR)。靶向DNA的核酸内切酶可以是天然存在的核酸内切酶(例如细菌大范围核酸酶)，也可以人工生成(例如，工程化大范围核酸酶、TALEN或ZFN等)。
在一些实施方案中，本发明的靶向DNA的核酸内切酶是TALEN。如本文所用，术语“TALEN”具有其在本领域的一般含义并且是指转录激活因子样效应核酸酶，可用于编辑靶基因的人工核酸酶。通过将TAL效应子(“TALE”)DNA结合结构域(例如一个或多个TALE，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个TALE)与DNA-修饰结构域(例如FokI核酸酶结构域)融合来人工产生TALEN。转录激活因子样效应(TALE)可以设计为结合任何所需的DNA序列(Zhang(2011),Nature Biotech.29:149-153)。通过将工程化的TALE与DNA切割结构域结合，可以产生对任何所需DNA序列特异性的限制性内切酶。然后可以将这些酶引入细胞，其中它们可以用于基因组编辑(Boch(2011)Nature Biotech.29:135-6；和Boch et al.(2009)Science326:1509-12；Moscou et al.(2009)Science 326:3501)。TALE是由黄单胞菌属细菌分泌的蛋白质。DNA结合结构域包含重复的、高度保守的33-34个氨基酸的序列，其中第12个和第13个氨基酸除外。这两个位置高度变化，显示与特定核苷酸识别的强相关性。因此，可以将它们工程化以结合所需的DNA序列(Zhang(2011),Nature Biotech.29:149-153)。为了产生TALEN，将TALE蛋白与核酸酶(N)(例如野生型或突变的FokI核酸内切酶)融合。已经对FokI进行若干突变以将其用于TALEN；例如，这些提高切割特异性或活性(Cermak et al.(2011)Nucl.Acids Res.39:e82；Miller et al.(2011)Nature Biotech.29:143-8；Hockemeyeret al.(2011)Nature Biotech.29:731-734；Wood et al.(2011)Science 333:307；Doyonet al.(2010)Nature Methods 8:74-79；Szczepek et al.(2007)Nature Biotech.25:786-793；and Guo et al.(2010)J.Mol.Biol.200:96)。FokI结构域作为二聚体发挥作用，需要两个具有独特DNA结合结构域的构建体，用于目标基因组中具有适当方向和间距的位点。TALE DNA结合结构域和FokI切割结构域之间的氨基酸残基数量以及两个单独的TALEN结合位点之间的碱基数量似乎都是实现高水平活性的重要参数(Miller et al.(2011)Nature Biotech.29:143-8)。TALEN可用于细胞内以在靶核酸(例如基因内的位点)中产生双链断裂。如果修复机制通过非同源末端连接不当修复断裂，则会在断裂位点处引入突变(Huertas,P.,Nat.Struct.Mol.Biol.(2010)17:11-16)。例如，不当修复可引入移码突变。或者，可以将外源DNA与TALEN一起引入细胞；根据外源DNA的序列和染色体序列，该过程可用于通过同源直接修复途径修饰靶基因，例如纠正靶基因中的缺陷，从而引起修复的靶基因的表达，或例如，将这种缺陷引入wt基因，从而降低靶基因的表达。
在一些实施方案中，本发明的靶向DNA的核酸内切酶是ZFN。如本文所用，术语“ZFN”或“锌指核酸酶”具有其在本领域的一般含义并且是指锌指核酸酶，一种可用于编辑靶基因的人工核酸酶。与TALEN一样，ZFN包含与DNA结合结构域融合的DNA修饰结构域，例如核酸酶结构域，例如FokI核酸酶结构域(或其衍生物)。在ZFN的情况下，DNA结合结构域包含一个或多个锌指，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个锌指(Carroll et al.(2011)GeneticsSociety of America 188:773-782；和Kim et al.(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:1156-1160)。锌指是由一个或多个锌离子稳定的小蛋白质结构模体。锌指可以包含例如Cys2His2，并且可以识别约3-bp的序列。可组合各种已知特异性的锌指以产生识别约6、9、12、15或18-bp序列的多指多肽。各种选择和模块组装技术可用于生成识别特定序列的锌指(及其组合)，包括噬菌体展示、酵母单杂交系统、细菌单杂交和双杂交系统以及哺乳动物细胞。可以工程化锌指以结合预定的核酸序列。工程化锌指以结合预定核酸序列的标准是本领域已知的(Sera(2002),Biochemistry,41:7074-7081；Liu(2008)Bioinformatics,24:1850-1857)。使用FokI核酸酶结构域或其他二聚核酸酶结构域的ZFN作为二聚体发挥作用。因此，需要一对ZFN来靶向非回文DNA位点。两个单独的ZFN必须结合DNA的相反链，其中它们的核酸酶适当间隔开(Bitinaite et al.(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95:10570-5)。同样如TALEN，ZFN可以在DNA中产生DSB，如果修复不当，例如通过非同源末端连接，其能够产生移码突变，导致细胞中靶基因的表达降低。
在一些实施方案中，本发明的靶向DNA的核酸内切酶是CRISPR相关的核酸内切酶。如本文所用，术语“CRISPR-相关的核酸内切酶”具有其在本领域的一般含义，并且是指簇状规则间隔的短回文重复序列，其是含有短重复碱基序列的原核DNA片段。在细菌中，CRISPR/Cas基因座编码针对移动遗传元件(病毒、转座元件和接合质粒)的RNA引导的适应性免疫系统。已经鉴定了三种类型(I-VI)的CRISPR系统。CRISPR簇包含间隔区，即与之前移动元件互补的序列。CRISPR簇被转录并加工成成熟的CRISPR(聚集的规则间隔短回文重复序列)RNA(crRNA)。CRISPR相关的核酸内切酶Cas9和Cpf1属于II型和V型CRISPR/Cas系统并且具有很强的核酸内切酶活性来切割靶DNA。Cas9由成熟的crRNA引导，该crRNA包含约20个核苷酸的独特靶序列(称为间隔区)和作为核糖核酸酶Ill辅助的pre-crRNA的加工过程的向导的反式激活的小RNA(tracrRNA)。crRNA:tracrRNA双链体通过crRNA上的间隔区和靶DNA上的互补序列(称为前间隔子(protospacer))之间的互补碱基配对引导Cas9靶向DNA。Cas9识别三核苷酸(NGG)原间隔区相邻基序(PAM)以指定切割位点(PAM起的第3个或第4个核苷酸)。crRNA和tracrRNA可以单独表达或通过合成茎环工程化为人工融合小向导RNA(sgRNA)以模拟天然crRNA/tracrRNA双链体。此类sgRNA，如shRNA，可以合成或体外转录用于引导RNA转染或从U6或H1促进的RNA表达载体表达。
在一些实施方案中，CRISPR相关的核酸内切酶是Cas9核酸酶。Cas9核酸酶可以具有与野生型化脓性链球菌(Streptococcus pyrogenes)序列相同的核苷酸序列。在一些实施方案中，CRISPR相关的核酸内切酶可以是来自其他物种，例如其他链球菌(Streptococcus)物种，例如嗜热菌(thermophilus)；铜绿假单胞菌(Pseudomonaaeruginosa)；大肠杆菌(Escherichia coli)或其他已测序的细菌基因组和古细菌或其他原核微生物的序列。或者，可以修饰野生型化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)Cas9序列。可以对核酸序列进行密码子优化以在哺乳动物细胞中有效表达，即“人源化”。人源化的Cas9核酸酶序列可以是例如由Genbank登录号KM099231.1GL669193757；KM099232.1GL669193761；或KM099233.1GL669193765中所列的任何表达载体编码的Cas9核酸酶序列。或者，Cas9核酸酶序列可以是例如来自Addgene(Cambridge,MA)的可商购载体诸如pX330、pX260或pMJ920中包含的序列。在一些实施方案中，Cas9核酸内切酶可以具有作为Genbank登录号KM099231.1GL669193757；KM099232.1；GL669193761；或KM099233.1GL669193765的Cas9核酸内切酶序列或pX330、pX260或pMJ920的Cas9氨基酸序列(Addgene，Cambridge，MA)的的任一的变体或片段的氨基酸序列。
在一些实施方案中，CRISPR相关核酸内切酶是Cpf1核酸酶。如本文所用，术语“Cpf1蛋白”是指源自V型CRISPR-Cpf1系统的Cpf1野生型蛋白、Cpf1蛋白的修饰形式、Cpf1蛋白的变体、Cpf1直系同源物及其组合。cpf1基因编码蛋白质Cpf1，其具有与Cas9的相应结构域同源的RuvC样核酸酶结构域，但缺乏Cas9蛋白中存在的HNH核酸酶结构域。已经在几种细菌中鉴定了V型系统，包括Parcubacteria细菌GWC2011_GWC2_44_17(PbCpf1)、毛螺科(Lachnospiraceae)细菌MC2017(Lb3 Cpf1)、Butyrivibrio proteoclastus(BpCpf1)、Peregrinibacteria细菌GW2011_GWA 33_10(PeCpf1)、氨基酸球菌属(Acidaminococcusspp.)BV3L6(AsCpf1)、Porphyromonas macacae(PmCpf1)、毛螺科细菌ND2006(LbCpf1)、Porphyromonas crevioricanis(PcCpf1)、解糖胨普雷沃菌(Prevotella disiens)(PdCpf1)、Moraxella bovoculi 237(MbCpf1)、Smithella属SC_K08D17(SsCpf1)、Leptospira inadai(LiCpf1)、毛螺科细菌MA2020(Lb2Cpf1)、Franciscella novicidaU112(FnCpf1)、Candidatus methanoplasma termitum(CMtCpf1)和挑剔真杆菌(Eubacterium eligens)(EeCpf1)。最近已经证明Cpf1也具有RNase活性并且负责pre-crRNA加工(Fonfara,I.,et al.,“The CRISPR-associated DNA-cleaving enzyme Cpf1also processes precursor CRISPR RNA,”Nature 28；532(7600):517-21(2016))。
如本文所用，术语“治疗(treatment)”或“治疗(treat)”是指预防性或防治性治疗以及治愈性或疾病改善性治疗，包括治疗有感染疾病风险或怀疑已经感染疾病的患者，以及患病或被诊断为患有疾病或医学病症的患者，包括抑制临床复发。可以向患有医学疾病或最终可能患有疾病的患者施用治疗，以便预防、治愈、延迟疾病或复发疾病的一种或多种症状的发作，降低疾病或复发疾病的一种或多种症状的严重程度，或缓解疾病或复发疾病的一种或多种症状，或为了将患者的存活率延长至超过在没有这种治疗的情况下的预期。“治疗方案”是指疾病的治疗模式，例如治疗期间使用的剂量模式。治疗方案可包括诱导方案和维持方案。短语“诱导方案”或“诱导期”是指用于疾病初始治疗的治疗方案(或治疗方案的一部分)。诱导方案的总体目标是在治疗方案的初始阶段向患者提供高水平的药物。诱导方案可以采用(部分或全部)“加载方案(loading regimen)”，其可以包括施用比医生在维持方案期间使用的剂量更大的药物，比医生在维持方案期间施用更频繁地施用药物，或两者兼有。短语“维持方案”或“维持期”是指用于在治疗疾病期间维持患者，例如使患者长期保持缓解(数月或数年)的治疗方案(或治疗方案的一部分)。维持方案可以采用连续治疗(例如，以规律的间隔，例如每周、每月、每年等施用药物)或间歇治疗(例如，中断治疗、间歇治疗、复发时的治疗或实现特定预定标准的治疗[例如，疼痛、疾病表现等]。
如本文所用，术语“癌症”具有其在本领域的一般含义并且包括但不限于实体瘤和血源性肿瘤。术语癌症包括皮肤、组织、器官、骨骼、软骨、血液和血管的疾病。术语“癌症”还包括原发性和转移性癌症。可以通过本发明的方法和组合物治疗的癌症的实例包括但不限于来自膀胱、血液、骨骼、骨髓、脑、乳房、结肠、食道、胃肠道、牙龈、头、肾、肝、肺、鼻咽、颈、卵巢、前列腺、皮肤、胃、睾丸、舌头或子宫的癌细胞。此外，癌症可以具体为以下组织学类型，但不限于这些：肿瘤，恶性；癌；癌，未分化的；巨细胞和梭形细胞癌；小细胞癌；乳头状癌；鳞状细胞癌；淋巴上皮癌；基底细胞癌；毛母基质癌；移行细胞癌；乳头状移行细胞癌；腺癌；胃泌素瘤，恶性；胆管癌；肝细胞癌；合并肝细胞癌和胆管癌；小梁腺癌；腺样囊性癌；腺瘤性息肉中的腺癌；腺癌，家族性结肠息肉病；实体癌；类癌瘤，恶性；支气管肺泡腺癌；乳头状腺癌；嫌色细胞癌；嗜酸细胞癌；嗜酸性腺癌；嗜碱细胞癌；透明细胞腺癌；颗粒细胞癌；滤泡性腺癌；乳头状和滤泡状腺癌；非包膜硬化性癌；肾上腺皮质癌；子宫内膜癌；皮肤附件癌；大汗腺癌；皮脂腺癌；耵聍腺癌；粘液表皮样癌；囊腺癌；乳头状囊腺癌；乳头状浆液性囊腺癌；粘液性囊腺癌；粘液腺癌；印戒细胞癌；浸润性导管癌；髓样癌；小叶癌；炎性癌；佩吉特氏病，乳腺；腺泡细胞癌；腺鳞癌；腺癌伴鳞状上皮化生；胸腺瘤，恶性；卵巢间质瘤，恶性；泡膜细胞瘤，恶性；颗粒细胞瘤，恶性；和肉母细胞瘤，恶性；塞尔托利氏细胞癌；间质细胞瘤，恶性；脂质细胞瘤，恶性；副神经节瘤，恶性；乳腺外副神经节瘤，恶性；嗜铬细胞瘤；肾血管肉瘤；恶性黑色素瘤；无色素黑色素瘤；浅表扩散黑色素瘤；巨大色素痣中的恶性黑色素瘤；上皮样细胞黑色素瘤；蓝痣，恶性；肉瘤；纤维肉瘤；纤维组织细胞瘤，恶性；粘液肉瘤；脂肪肉瘤；平滑肌肉瘤；横纹肌肉瘤；胚胎横纹肌肉瘤；肺泡横纹肌肉瘤；间质肉瘤；混合瘤，恶性；缪氏混合瘤；肾母细胞瘤；肝母细胞瘤；癌肉瘤；间充质瘤，恶性；布伦纳瘤，恶性；叶状肿瘤，恶性；滑膜肉瘤；间皮瘤，恶性；无性细胞瘤；胚胎癌；畸胎瘤，恶性；卵巢瘤，恶性；绒癌；中肾瘤，恶性；血管肉瘤；血管内皮瘤，恶性；卡波西肉瘤；血管外皮细胞瘤，恶性；淋巴管肉瘤；骨肉瘤；近皮质骨肉瘤；软骨肉瘤；软骨母细胞瘤，恶性；间充质软骨肉瘤；骨巨细胞瘤；尤因氏肉瘤；牙源性肿瘤，恶性；成釉细胞性牙肉瘤；成釉细胞瘤，恶性；成釉细胞纤维肉瘤；松果体瘤，恶性；脊索瘤；胶质瘤，恶性；室管膜瘤；星形细胞瘤；原生质星形细胞瘤；纤维状星形细胞瘤；星形母细胞瘤；胶质母细胞瘤；少突胶质细胞瘤；少突胶质细胞瘤；原始神经外胚层；小脑肉瘤；神经节神经母细胞瘤；成神经细胞瘤；视网膜母细胞瘤；嗅神经源性肿瘤；脑膜瘤，恶性；神经纤维肉瘤；神经鞘瘤，恶性；颗粒细胞瘤，恶性；恶性淋巴瘤；霍奇金病；霍奇金淋巴瘤；副肉芽肿；恶性淋巴瘤；小淋巴细胞恶性淋巴瘤；大细胞，弥漫性；恶性淋巴瘤，滤泡性；真菌病；其他特定的非霍奇金淋巴瘤；恶性组织细胞增生症；多发性骨髓瘤；肥大细胞肉瘤；免疫增殖性小肠疾病；白血病；淋巴细胞白血病；浆细胞白血病；红白血病；淋巴肉瘤细胞白血病；髓系白血病；嗜碱性白血病；嗜酸性粒细胞白血病；单核细胞白血病；肥大细胞白血病；巨核细胞白血病；髓系肉瘤和毛细胞白血病。
如本文所用，术语“肿瘤组织样品”是指源自患者的任何组织肿瘤样品。获得所述组织样品是为了体外评价的目的。在一些实施方案中，肿瘤样品可以源自从患者切除的肿瘤。在一些实施方案中，肿瘤样品可以源自在患者的原发性肿瘤中进行的活检或在远离患者的原发性肿瘤的转移性样品中进行的活检。例如，在患结肠直肠癌的患者的肠道中进行内窥镜活检。在一些实施方案中，肿瘤组织样品包括(i)整体原发肿瘤(作为整体)，(ii)来自肿瘤中心的组织样品，(iii)来自直接围绕肿瘤组织的组织样品，该组织可以更具体地命名为肿瘤的“侵袭性边缘”，(iv)靠近肿瘤的淋巴胰岛，(v)位于最靠近肿瘤的淋巴结，(vi)之前手术收集的肿瘤组织样品(例如用于治疗后患者的随访)，以及(vii)远处转移。如本文所用，“侵袭性边缘”具有其在本领域的一般含义并且是指围绕肿瘤的细胞环境。在一些实施方案中，无论其是否来自肿瘤中心、来自肿瘤的侵袭性边缘或来自最近的淋巴结，肿瘤组织样品涵盖已从肿瘤中心或围绕肿瘤的侵袭性边缘切除的组织碎片或切片，包括在手术肿瘤切除后或收集组织样品用于活检后，以用于进一步定量一个或多个生物标志物，特别是通过组织学或免疫组织化学方法，通过流式细胞术方法和通过基因或蛋白质表达分析的方法，包括基因组和蛋白质组学分析。当然，肿瘤组织样品可以接受各种众所周知的收集后制备和储存技术(例如，固定、储存、冷冻等)。样品可以是新鲜的、冷冻的、固定的(例如福尔马林固定的)或包埋的(例如石蜡包埋的)。
如本文所用，相对于癌症，表述“增强的治疗功效”是指癌细胞或实体瘤的生长减慢或减少，或癌细胞总数或总肿瘤负荷的减少。因此，“改进的治疗结果”或“增强的治疗功效”是指根据任何临床可接受的标准的患者病症的改善，包括例如肿瘤大小减小、肿瘤进展时间增加、无进展生存期增加、总生存时间增加、预期寿命增加或生活质量提高。特别地，“改进”或“增强”是指任何临床上可接受的治疗结果或功效的指标改进或增强1％、5％、10％、25％、50％、75％、100％或大于100％。如本文所用，当在上下文中使用时，所述上下文比较包含免疫检查点抑制剂和NRP-1抑制剂的组合组合物的活性和/或功效与单独的免疫检查点抑制剂的活性和/或功效，表述“相对于”是指使用根据本领域技术人员已知可比较的量的比较。
如本文所用，本文所用的术语“共施用”是指向同一患者施用NRP-1抑制剂和免疫检查点抑制剂的组合的过程。NRP-1抑制剂和免疫检查点抑制剂可以同时、基本上同时或依次施用。如果依次施用，则NRP-1抑制剂在免疫检查点抑制剂之前施用。NRP-1抑制剂和免疫检查点抑制剂不需要通过相同的载体施用。NRP-1抑制剂和免疫检查点抑制剂可以一次或多次施用，并且组合的每种组分的施用次数可以相同或不同。此外，NRP-1抑制剂和免疫检查点抑制剂不需要在同一部位施用。
如所使用，术语“组合”和“组合疗法”是可互换的并且是指包括施用同时、分别或依次施用的至少两种化合物的治疗。如本文所用，术语“共施用”是指向同一患者施用至少两种化合物的组合的过程。至少两种化合物可以同时、基本上同时或依次施用。至少两种化合物可以通过不同的载体或组合物分别施用。至少两种化合物也可以以相同的载体或组合物(例如药物组合物)施用。至少两种化合物可以一次或多次施用并且组合的每种组分的施用次数可以相同或不同。
如本文所用，术语“治疗有效量”是指在必要的剂量和时间段内实现所需治疗结果的有效量。治疗有效量的活性剂可根据诸如以下因素而变化：个体的疾病状态、年龄、性别和体重，以及活性剂在个体中引发所需应答的能力。治疗有效量也是其中治疗有益效果超过抗体或抗体部分的任何毒性或有害作用的量。活性剂的有效剂量和剂量方案取决于待治疗的疾病或病症，并且可由本领域技术人员确定。具有本领域普通技术知识的医生可以容易地确定和开出所需药物组合物的有效量。例如，医生可以以低于实现所需治疗效果所需的水平开始药物组合物中采用的活性剂的剂量，并逐渐增加剂量直至达到所需效果。通常，本发明组合物的合适剂量是化合物的量，其根据特定剂量方案产生有效治疗效果的最低剂量。这种有效剂量通常取决于上述因素。例如，用于治疗用途的治疗有效量可以通过其稳定疾病进展的能力来测量。典型地，例如，可以在预测在人肿瘤中的功效的动物模型系统中评估化合物抑制癌症的能力。治疗有效量的治疗化合物可以减少肿瘤大小，或减轻患者的症状。本领域普通技术人员将能够基于诸如以下因素来确定所述量：患者的体型、患者症状的严重程度和所选择的特定组合物或施用途径。本发明抑制剂的治疗有效量的示例性、非限制性范围是约0.1-100mg/kg、诸如约0.1-50mg/kg、例如约0.1-20mg/kg、诸如约0.1-10mg/kg、例如约0.5、诸如约0.3、约1、约3mg/kg、约5mg/kg或约8mg/kg。本发明抑制剂的治疗有效量的示例性、非限制性范围是0.02-100mg/kg、诸如约0.02-30mg/kg、诸如约0.05-10mg/kg或0.1-3mg/kg，例如约0.5-2mg/kg。可以例如静脉内、肌肉内、腹膜内或皮下施用，例如在靶标位点附近施用。调整上述治疗方法和用途中的剂量方案以提供最佳的所需响应(例如治疗响应)。例如，可以施用单次推注，可以随时间数次施用分开的剂量，或者可以根据治疗情况的紧急程度按比例减少或增加剂量。在一些实施方案中，在治疗期间监测治疗功效，例如在预定的时间点。在一些实施方案中，可通过疾病区域的可视化或通过本文进一步描述的其他诊断方法监测功效，例如，通过使用例如本发明的标记抑制剂、衍生自本发明抑制剂的片段或小抗体进行一次或多次PET-CT扫描。如果需要，药物组合物的有效每日剂量可以作为两个、三个、四个、五个、六个或更多个亚剂量(任选地，以单位剂型)，在一天中以适当的间隔分开施用。在一些实施方案中，本发明的人单克隆抗体通过长时间(诸如超过24小时)的缓慢连续输注施用，以使任何不希望的副作用最小化。还可以使用每周、每两周或每三周一次的给药期来施用有效剂量的本发明抑制剂。给药期可以限制在例如8周、12周或直到建立临床进展。作为非限制性实例，根据本发明的治疗可以如下提供本发明抑制剂的每日剂量：每天约0.1-100mg/kg，诸如0.2、0.5、0.9、1.0、1.1、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、40、45、50、60、70、80、90或100mg/kg，在治疗开始后的第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40天的至少一天，或在第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20周的至少一周，或其任意组合提供，每24、12、8、6、4或2小时使用单次或分次剂量，或其任何组合提供。
如本文所用，术语“癌症疫苗”具有其在本领域的一般含义并且是指能够诱导针对至少一种癌症抗原的主动免疫的组合物。癌症疫苗可导致抗体的产生或仅导致某些细胞，特别是抗原呈递细胞、T淋巴细胞(特别是T-CD8+细胞)和B淋巴细胞的激活。癌症疫苗可以是用于预防目的或治疗目的或两者的组合物。
如本文所用，术语“抗原”是指，当由MHC分子加工并呈递时，能够被抗体或被T细胞受体(TCR)特异性结合的分子。如本文所用，术语“抗原”还涵盖T细胞表位。抗原另外能够被免疫系统识别和/或能够诱导体液免疫应答和/或细胞免疫应答，从而导致B-和/或T-淋巴细胞的激活。抗原可以具有一个或多个表位或抗原位点(B-和T-表位)。如本文所用，术语“癌症抗原”是指具有肿瘤组织特征的抗原。癌症抗原的实例包括但不限于CEA、前列腺特异性抗原(PSA)、HER-2/neu、BAGE、GAGE、MAGE 1-4、6和12、MUC相关蛋白(Mucin)(MUC-1、MUC-2等)、GM2和GD2神经节苷脂、ras、myc、酪氨酸酶、MART(黑色素瘤抗原)、MARCO-MART、细胞周期蛋白Bl、细胞周期蛋白D、Pmel 17(gpl00)、GnT-V内含子V序列(N-乙酰葡糖胺基转移酶V内含子V序列)、前列腺Ca psm、前列腺血清抗原(PSA)、PRAME(黑色素瘤抗原)、β-连环蛋白、MUM-1B(黑色素瘤遍在的突变基因产物)、GAGE(黑色素瘤抗原)1、BAGE(黑色素瘤抗原)2-10、C-ERB2(Her2/neu)、EBNA(爱泼斯坦-巴尔病毒核抗原)1-6、gp75、人乳头瘤病毒(HPV)E6和E7、p53、肺阻力蛋白(LRP)、Bcl-2和Ki-67。在一些实施方案中，抗原选自肿瘤相关抗原，包括来自以下的抗原：白血病和淋巴瘤、神经系统肿瘤诸如星形细胞瘤或胶质母细胞瘤、黑色素瘤、乳腺癌、肺癌、头颈癌、胃肠道肿瘤、胃癌、结肠癌、肝癌、胰腺癌、泌尿生殖系统肿瘤诸如宫颈癌、子宫癌、卵巢癌、阴道癌、睾丸癌、前列腺癌或阴茎癌、骨肿瘤、血管肿瘤或唇、鼻咽、咽和口腔、食道、直肠、胆囊、胆道树、喉、肺和支气管、膀胱、肾、脑和其他神经系统部位、甲状腺的癌症、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤和白血病。
如本文所用，术语“免疫佐剂”是指当向受试者或动物施用时可诱导和/或增强针对抗原的免疫应答的化合物。它还旨在表示通常用于加速、延长或增强针对特异性抗原的特异性免疫应答的质量的物质。
如本文所用，在本公开的上下文中，术语“响应者(responser)”是指将实现响应的患者，即癌症被根除、减少或改善的患者。根据本发明，术语“非响应者”还包括患有稳定癌症的患者。
增加肿瘤浸润CD8+T细胞的量的方法：
本发明的第一个目的涉及增加患有癌症的患者中肿瘤浸润CD8+T细胞的量的方法，包括向患者施用治疗有效量的NRP-1抑制剂。
在一些实施方案中，NRP-1抑制剂是对NRP-1具有结合亲和力的抗体。
在一些实施方案中，NRP-1抑制剂是针对NRP-1细胞外结构域的抗体。
在一些实施方案中，抗体导致细胞毒性T细胞中的NRRP-1内化。
在一些实施方案中，抗体结合NRP-1的结构域c。在一些实施方案中，本发明的抗体能够抑制NRP-1与信号素3A的结合。
在一些实施方案中，NRP-1抑制剂是对结合信号素3A的NRP-1区域具有结合亲和力的抗体。
在一些实施方案中，NRP-1抑制剂是对SEQ ID NO：1中第1位氨基酸残基至第280位氨基酸残基范围内的氨基酸序列具有结合亲和力的抗体。
在一些实施方案中，抗体不抑制VEGF与NRP-1的结合。
在一些实施方案中，NRP-1抑制剂是对信号素3A具有结合亲和力的抗体。
在一些实施方案中，NRP-1抑制剂是对结合NRP-1的信号素3A结构域具有结合亲和力的抗体。
在一些实施方案中，抗体是人源化抗体。人源化的方法包括但不限于描述于美国专利第4,816,567、5,225,539、5,585,089、5,693,761、5,693,762和5,859,205号中的那些，其通过引用并入本文。
在一些实施方案中，抗体是全人抗体。也可以通过对大部分人免疫球蛋白重链和轻链基因座转基因的小鼠进行免疫来制备全人单克隆抗体。参见，例如，美国专利第5,591,669、5,598,369、5,545,806、5,545,807、6,150,584号和其中引用的文献，其内容通过引用并入本文。
在一些实施方案中，本发明的抗体是单链抗体。
在一些实施方案中，该抗体源自描述于Mol.Biol.(2007)366,815-829和US8378080B1的抗NRP1 YW64.3抗体。特别地，根据本发明的抗NRP-1抗体包含：
-包含以下互补决定区(CDR)氨基酸序列的轻链可变结构域：VL-CDR1(RASQSISSYLA；SEQ ID NO:3)、VL-CDR2(GASSRAS；SEQ ID NO:4)和VL-CDR3(QQYMSVPIT；SEQID NO:5)和
-包含以下CDR氨基酸序列的重链可变结构域：VH-CDR1(GFSFSSEPIS；SEQ ID NO:6),VH-CDR2(SSITGKNGYTYYADSVKG；SEQ ID NO:7)和VH-CDR3(WGKKVYGMDV；SEQ ID NO:8)。
在一些实施方案中，抗NRP-1抗体包含SEQ ID NO:9的轻链可变结构域序列。在一些实施方案中，抗NRP-1抗体包含SEQ ID NO:10的重链可变结构域序列。在一些实施方案中，抗NRP-1抗体包含SEQ ID NO:9的轻链可变结构域序列和SEQ ID NO:10的重链可变结构域序列。
SEQ ID NO:9
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLAWYQQKPGKAPKLLIYGASSRASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYMSVPITFGQGTKVEIKR
SEQ ID NO:10
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSFSSEPISWVRQAPGKGLEWVSSITGKNGYTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARWGKKVYGMDVWGQGTLVTVSS
在一些实施方案中，本发明的抗NRP-1抗体与包含以下的抗体交叉竞争结合NRP-1同源异构体：
-包含以下互补决定区(CDR)氨基酸序列的轻链可变结构域：VL-CDR1(RASQSISSYLA；SEQ ID NO:3)、VL-CDR2(GASSRAS；SEQ ID NO:4)和VL-CDR3(QQYMSVPIT；SEQID NO:5)和
-包含以下CDR氨基酸序列的重链可变结构域：VH-CDR1(GFSFSSEPIS；SEQ ID NO:6),VH-CDR2(SSITGKNGYTYYADSVKG；SEQ ID NO:7)和VH-CDR3(WGKKVYGMDV；SEQ ID NO:8)。
在一些实施方案中，抗体包含人重链恒定区序列但不会诱导抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。在一些实施方案中，本发明的抗体不包含能够基本上结合FcgRIIIA(CD16)多肽的Fc结构域。在一些实施方案中，本发明的抗体缺乏Fc结构域(例如缺乏CH2和/或CH3结构域)或包含IgG2或IgG4同种型的Fc结构域。在一些实施方案中，本发明的抗体包含Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2、Fv、双抗体、单链抗体片段或包含多个不同抗体片段的多特异性抗体或由其组成。在一些实施方案中，本发明的抗体不与毒性部分连接。在一些实施方案中，选自氨基酸残基的一个或多个氨基酸可以被不同的氨基酸残基替换，使得抗体具有改变的C2q结合和/或降低或消除的补体依赖性细胞毒性(CDC)。这种方法在ldusogie等人的美国专利第6,194,551号中有更详细的描述。
在一些实施方案中，NRP-1抑制剂是分别包含NRFP-1的功能等价物的多肽。例如，功能等价物包括结合信号素3A并包含NRP-1的全部或部分细胞外结构域以形成能够捕获信号素3A的可溶性受体的分子。通常，功能等价物与相应的蛋白质至少80％同源。
在一些实施方案中，如通过任何常规分析算法所评估，功能等价物是至少90％同源的。因此，本发明提供了一种能够抑制NRP-1与信号素3A结合的多肽，该多肽包含具有对应于NRP-1细胞外结构域的至少一部分序列的连续氨基酸序列，该部分结合信号素3A。
在一些实施方案中，多肽包含NRP-1的细胞外结构域。在一些实施方案中，多肽含有包含NRP-1的结构域c的氨基酸序列。
在一些实施方案中，多肽含有包含NRP-1跨膜结构域的氨基酸序列。
在一些实施方案中，多肽包含从SEQ ID NO：1的第1位氨基酸残基至第280位氨基酸残基的氨基酸序列。
在一些实施方案中，多肽不包含结合VEGF的部分。
在一些实施方案中，多肽包含与免疫球蛋白恒定结构域(Fc区)融合以形成免疫粘附素的NRP-1的功能等价物。免疫粘附素可以具有许多人抗体的有价值的化学和生物学特性。由于免疫粘附素可以由与合适的人免疫球蛋白铰链和恒定结构域(Fc)序列连接的具有所需特异性的人蛋白质序列构建，可以使用完全人组分来实现目标结合特异性。免疫球蛋白序列通常是但不一定是免疫球蛋白恒定结构域。本发明嵌合体中的免疫球蛋白部分可以从IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亚型、IgA、IgE、IgD或IgM获得，但通常从IgG1或IgG3获得。在一些实施方案中，PD-1或NRP-1的功能等价物和免疫粘附素的免疫球蛋白序列部分通过最小接头连接。
在一些实施方案中，NRP-1抑制剂是NRP-1表达的抑制剂。
在一些实施方案中，所述基因表达抑制剂是siRNA、反义寡核苷酸或核酶。例如，反义寡核苷酸，包括反义RNA分子和反义DNA分子，会通过与其结合而直接阻断NRP-1mRNA的翻译，从而阻止蛋白质翻译或增加mRNA降解，从而降低细胞中的NRP-1的水平和活性。例如，可以例如通过常规磷酸二酯技术合成至少约15个碱基并与编码NRP-1的mRNA转录物序列的独特区域互补的反义寡核苷酸。使用反义技术特异性抑制其序列已知的基因的基因表达的方法是本领域公知的(例如参见美国专利第6,566,135；6,566,131；6,365,354；6,410,323；6,107,091；6,046,321；和5,981,732号)。小抑制性RNA(siRNA)也可用作本发明中使用的表达抑制剂。NRP-1基因表达可以通过将患者或细胞与小双链RNA(dsRNA)或导致产生小双链RNA的载体或构建体接触来降低，从而特异性抑制NRP-1基因表达(即RNA干扰或RNAi)。本发明的反义寡核苷酸、siRNA、shRNA和核酶可以单独或与载体一起在体内递送。在最广泛的意义上，“载体”是能够促进反义寡核苷酸、siRNA、shRNA或核酶核酸转移到细胞(且通常表达NRP-1的细胞)的任何载体。通常，相对于降解程度，载体以将导致载体不存在的降低的降解将核酸转运至细胞。通常，可用于本发明的载体包括但不限于质粒、噬菌粒、病毒、源自病毒或细菌来源的其他载体，这些载体已通过插入或掺入反义寡核苷酸、siRNA、shRNA或核酶核酸序列而操作。病毒载体是优选的载体类型并且包括但不限于来自以下病毒的核酸序列：逆转录病毒，诸如莫洛尼鼠白血病病毒、哈维鼠肉瘤病毒、鼠乳腺肿瘤病毒和劳斯肉瘤病毒；腺病毒，腺相关病毒；SV40型病毒；多瘤病毒；爱泼斯坦-巴尔病毒；乳头状瘤病毒；疱疹病毒；牛痘病毒；脊髓灰质炎病毒；和RNA病毒，诸如逆转录病毒。可以容易地使用本领域未命名但已知的其他载体。
在一些实施方案中，表达抑制剂是核酸内切酶。
在具体的实施方案中，核酸内切酶是CRISPR-cas。
在一些实施方案中，核酸内切酶是来自化脓性链球菌的CRISPR-cas9。CRISPR/Cas9系统已描述于US 8697359 B1和US 2014/0068797中。在一些实施方案中，核酸内切酶是CRISPR-Cpf1，其是最近在Zetsche et al.(“Cpf1 is a Single RNA-guidedEndonuclease of a Class 2 CRISPR-Cas System(2015)；Cell；163,1-13)中表征的来自普罗沃氏菌和弗朗西斯氏菌1(Cpf1)的CRISPR。
在有需要的患者中治疗癌症的方法，包括向患者施用治疗有效量的NRP-1抑制剂：
本发明的另一个目的涉及在有需要的患者中治疗癌症的方法，包括向患者施用治疗有效量的NRP-1抑制剂。
在一些实施方案中，NRP-1抑制剂是源自描述于Mol.Biol.(2007)366,815-829和US8378080B1的抗NRP1 YW64.3的抗NRP-1抗体。
特别地，抗NRP-1抗体包含：
-包含以下互补决定区(CDR)氨基酸序列的轻链可变结构域：VL-CDR1(RASQSISSYLA；SEQ ID NO:3)、VL-CDR2(GASSRAS；SEQ ID NO:4)和VL-CDR3(QQYMSVPIT；SEQID NO:5)和
-包含以下CDR氨基酸序列的重链可变结构域：VH-CDR1(GFSFSSEPIS；SEQ ID NO:6),VH-CDR2(SSITGKNGYTYYADSVKG；SEQ ID NO:7)和VH-CDR3(WGKKVYGMDV；SEQ ID NO:8)。
在一些实施方案中，抗NRP-1抗体包含SEQ ID NO:9的轻链可变结构域序列。在一些实施方案中，抗NRP-1抗体包含SEQ ID NO:10的重链可变结构域序列。在一些实施方案中，抗NRP-1抗体包含SEQ ID NO:9的轻链可变结构域序列和SEQ ID NO:10的重链可变结构域序列。
在一些实施方案中，NRP-1抑制剂是与包含以下的抗体交叉竞争结合NRP-1同源异构体的抗NRP-1抗体：
-包含以下互补决定区(CDR)氨基酸序列的轻链可变结构域：VL-CDR1(RASQSISSYLA；SEQ ID NO:3)、VL-CDR2(GASSRAS；SEQ ID NO:4)和VL-CDR3(QQYMSVPIT；SEQID NO:5)和
-包含以下CDR氨基酸序列的重链可变结构域：VH-CDR1(GFSFSSEPIS；SEQ ID NO:6),VH-CDR2(SSITGKNGYTYYADSVKG；SEQ ID NO:7)和VH-CDR3(WGKKVYGMDV；SEQ ID NO:8)。
特别地，本发明的方法特别适用于治疗以CD8+T细胞的低肿瘤浸润为特征的癌症。通常，所述CD8+T细胞的肿瘤浸润通过本领域的任何常规方法测定。例如，所述测定包括定量从患者获得的肿瘤样品中CD8+T细胞的密度。
在一些实施方案中，CD8+T细胞密度的定量通过免疫组织化学(IHC)测定。例如，CD8+T细胞密度的定量通过将组织肿瘤组织样品与对所述细胞的细胞表面标志物特异性的结合配偶体(例如抗体)接触来进行。通常，CD8+T细胞密度的定量通过将组织肿瘤组织样品与对CD8特异性的结合配偶体(例如抗体)接触来进行。通常，CD8+T细胞的密度表示为组织样品的表面积的每一个单位计数的细胞数，例如肿瘤组织样品的表面积的每cm2或mm2计数的细胞数。在一些实施方案中，细胞密度也可以表示为样品的每一个体积单位的细胞数，例如为肿瘤组织样品的每cm3的细胞数。在一些实施方案中，细胞密度还可以由特定细胞/总细胞的百分比(设置为100％)组成。免疫组织化学通常包括以下步骤i)用福尔马林固定肿瘤组织样品，ii)将所述肿瘤组织样品包埋在石蜡中，iii)将所述肿瘤组织样品切成切片进行染色，iv)将所述切片与标志物特异性结合的配偶体一起孵育，v)冲洗所述切片，vi)将所述切片与通常生物素化的二抗一起孵育和vii)显示通常具有抗生物素蛋白-生物素-过氧化物酶复合物的抗原-抗体复合物。因此，肿瘤组织样品首先与结合配偶体一起孵育。洗涤后，根据标记抗体携带的标志物种类，例如，放射性、荧光或酶标记，结合目标标志物的标记抗体通过适当的技术显示。可以同时进行多个标记。或者，本发明的方法可以使用与扩增系统(以增强染色信号)和酶促分子偶联的二抗。这种偶联的二抗可商购，例如购自Dako，EnVision系统。可以使用复染，例如H&E、DAPI、Hoechst。其他染色方法可以使用本领域技术人员显而易见的任何合适的方法或系统来完成，包括自动、半自动或手动系统。例如，可以将一种或多种标记连接到抗体上，从而允许检测靶蛋白(即标志物)。示例性标记包括放射性同位素、荧光团、配体、化学发光剂、酶及其组合。在一些实施方案中，标签是量子点。可与一级和/或二级亲和配体缀合的标记的非限制性实例包括荧光染料或金属(例如荧光素、罗丹明、藻红蛋白、荧光胺)、发色染料(例如视紫红质)、化学发光化合物(例如鲁米那、咪唑)和生物发光蛋白(例如萤光素、萤光素酶)、半抗原(例如生物素)。多种其他有用的荧光剂和发色团描述于Stryer L(1968)Science 162:526-533和Brand L and Gohlke J R(1972)Annu.Rev.Biochem.41:843-868。亲和配体也可以用酶(例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-内酰胺酶)、放射性同位素(例如3H、14C、32P、35S或125I)和颗粒(例如金)标记。可以使用各种化学方法将不同类型的标记与亲和配体缀合，例如胺反应或硫醇反应。然而，可以使用除胺和硫醇之外的其他反应性基团，例如醛、羧酸和谷氨酰胺。用于检测目标蛋白质的各种酶促染色方法是本领域已知的。例如，可以使用不同的酶(诸如过氧化物酶、碱性磷酸酶)或不同的色原(诸如DAB、AEC或固红)来可视化酶促相互作用。在其他实例中，抗体可与可以通过标记的结合配偶体或抗体来检测的肽或蛋白质缀合。在间接IHC测定中，二抗或第二结合配偶体对于检测第一结合配偶体的结合是必要的，因为它没有被标记。使用用于查看可检测信号并获取图像(诸如染色的数字图像)的系统对所得染色样本的每一个进行成像。用于图像获取的方法是本领域技术人员公知的。例如，一旦样品被染色，任何光学或非光学成像装置可用于检测染色或生物标志物标记，诸如，例如直立或倒置光学显微镜、扫描共聚焦显微镜、照相机、扫描或隧道电子显微镜、罐头探针显微镜和成像红外探测器。在一些实例中，可以数字方式捕获图像。然后可以将获得的图像用于定量或半定量地测定样品中标记物的量。适用于免疫组织化学的各种自动化样品处理、扫描和分析系统在本领域中是可用的。此类系统可以包括自动染色和显微扫描、计算机图像分析、连续切片比较(以控制样品方向和大小的变化)、数字报告生成以及样品的归档和跟踪(诸如放置组织切片的载玻片)。细胞成像系统是可商购的，它将传统光学显微镜与数字图像处理系统相结合以对细胞和组织(包括免疫染色样品)进行定量分析。参见例如CAS-200系统(Becton,Dickinson&Co.)。特别地，可以手动或通过涉及计算机处理器和软件的图像处理技术进行检测。使用这种软件，例如，可以基于包括例如染色质量或染色强度的因素，使用本领域技术人员已知的程序来设置、校准、标准化和/或验证图像(参见例如公开的美国专利公开号US20100136549)。可以基于样品的染色强度对图像进行定量或半定量分析和评分。定量或半定量组织化学是指对经过组织化学处理的样品进行扫描和评分的方法，以鉴定和定量特定生物标志物(即标志物)的存在。定量或半定量方法可以使用成像软件来检测染色密度或染色量或通过人眼检测染色的方法，其中受过训练的操作者以数字方式对结果进行排序。例如，可以使用像素计数算法(例如，Aperio Spectrum软件、自动定量分析平台(
Figure BDA0003148874070000321
平台)以及测量或定量或半定量染色程度的其他标准方法来定量分析图像；参见例如，美国专利号8,023,714；美国专利号7,257,268；美国专利号7,219,016；美国专利号7,646,905；公开的美国专利公开号US20100136549和20110111435；Camp et al.(2002)Nature Medicine,8:1323-1327；Bacuset al.(1997)Analyt Quant Cytol Histol,19:316-328)。可以计算强阳性染色(诸如棕色染色)与总染色面积之和的比率并进行评分。检测到的生物标志物(即标志物)的量被定量并以阳性像素的百分比和/或评分得分给出。例如，该量可以定量为阳性像素的百分比。在一些实例中，该量被定量为染色区域的百分比，例如阳性像素的百分比。例如，与总染色面积相比，样品可以具有至少或约至少或约0、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更高的阳性像素。在一些实施方案中，对样品给予得分，该得分是样品的组织化学染色的强度或量的数字表示，并且代表样品中存在的靶生物标志物(例如，标志物)的量。光密度或面积百分比值可以例如在整数量表上的量表得分给出。因此，在一些实施方案中，本发明的方法包括以下步骤：i)通过使用能够选择性地与标记物相互作用的结合配偶体(例如，如上所述的抗体)来提供通过自动载玻片染色系统获得的组织切片的一个或多个免疫染色切片，ii)通过高分辨率扫描捕获进行步骤a的载玻片的数字化，iii)检测数字图片上的组织切片的载玻片，iv)提供具有相同表面的均匀分布单元的尺寸参考网格，所述网格适合待分析的组织切片的尺寸，和v)检测、定量和测量每个单元中染色细胞的强度，由此评估每个单元的染色细胞的数量或密度。
在一些实施方案中，CD8+T细胞的细胞密度在整个肿瘤组织样品中测定，在肿瘤组织样品的侵袭性边缘或中心测定，或在肿瘤组织样品的中心和侵袭性边缘两者均测定。
因此，本发明的另一个目的涉及在有需要的患者中治疗癌症的方法，包括i)定量从患者获得的肿瘤组织样品中CD8+T细胞的密度，ii)将步骤i)定量的密度与预定的参考值比较，和iii)向患者施用治疗有效量的NRP-1抑制剂。
通常，预定的参考值与患者的生存时间相关。本领域技术人员将认识到，OS生存时间通常基于并表示为从某种类型的癌症存活特定的时间的人的百分比。癌症统计数据通常使用总体五年生存率。通常，OS率不指定癌症幸存者在五年时是否仍进行治疗，或者他们是否已经无癌(达到缓解)。DSF提供更具体的信息并且是获得缓解的患有特定癌症的人数。此外，无进展生存(PFS)率(仍然患有癌症但疾病没有进展的人数)包括可能治疗获得一些成功，但癌症尚未完全消失的人。如本文所用，表述“短生存时间”表示患者的生存时间将低于在患有所述癌症的患者的一般人群中观察到的中值(或平均值)。当患者具有短生存时间时，意味着患者将“预后不良”。相反，表述“长生存时间”表示患者的生存时间将高于在患有所述癌症的患者的一般人群中观察到的中值(或平均值)。当患者具有长生存时间时，意味着患者“预后良好”。
在一些实施方案中，预定值是阈值或截止值。典型地，可以通过实验、经验或理论上测定“阈值”或“截止值”。如本领域普通技术人员将认识到的，阈值也可以基于现有的实验和/或临床条件而任意选择。例如，在适当存储的历史患者样本中细胞密度的回顾性测量可以用于建立预定参考值。需测定阈值以根据测试功能和益处/风险平衡(假阳性和假阴性的临床后果)获得最佳灵敏度和特异性。典型地，可以使用基于实验数据的接受者操作特征(ROC)曲线测定最佳灵敏度和特异性(以及阈值)。例如，在定量一组参照中的CD8+T细胞密度后，可以使用算法分析对待测样品中测量的密度进行统计处理，从而获得对样品分类具有重要意义的分类标准。ROC曲线的全称是接受者操作者特性曲线，也称为接受者操作特性曲线。它主要用于临床生化诊断测试。ROC曲线是反映真阳性率(灵敏度(sensitivity))和假阳性率(1-特异性(1-specificity))的连续变量的综合指标。其通过图像合成方法揭示灵敏度和特异性之间的关系。将一系列不同的截止值(阈值或临界值，诊断测试的正常结果与异常结果之间的边界值)设置为连续变量，以计算出一系列敏感性和特异性值。然后，将灵敏度用作垂直坐标，将特异性用作水平坐标以绘制曲线。曲线下面积(AUC)越高，诊断的准确性越高。在ROC曲线上，最接近坐标图左上角的点是同时具有高灵敏度和高特异性值的临界点。ROC曲线的AUC值介于1.0-0.5。当AUC>0.5时，随着AUC接近1，诊断结果会越来越好。当AUC为0.5-0.7时，准确性较低。当AUC为0.7-0.9时，准确性中等。当AUC高于0.9时，准确性非常高。该算法方法优选由计算机完成。可以使用现有技术中的现有软件或系统来绘制ROC曲线，诸如：MedCalc 9.2.0.1医疗统计软件、SPSS 9.0、ROCPOWER.SAS、DESIGNROC.FOR、MULTIREADER POWER.SAS、CREATE-ROC.SAS、GB STAT VI0.0(Dynamic Microsystems,Inc.Silver Spring,Md.,USA)等。
在一些实施方案中，通过进行包括以下步骤的方法来确定预定参考值：a)提供来自患有目标癌症的患者的肿瘤组织样品的集合；b)对于在步骤a)中提供的每个肿瘤组织样品，提供与相应患者的实际临床结果相关的信息(即无病生存期(DFS)和/或总生存期(OS))；c)提供一系列任意定量值；d)定量步骤a)中提供的集合中包含的每个肿瘤组织样品的CD8+T细胞密度；e)将所述肿瘤组织样品分为两组，分别用于步骤c)中提供的特定的任意定量值：(i)包含肿瘤组织样品的第一组，所述肿瘤组织样品的水平的定量值低于所述系列定量值中包含的所述任意定量值；(ii)包含肿瘤组织样品的第二组，所述肿瘤组织样品的所述水平的定量值高于所述系列定量值中包含的所述任意定量值；从而针对所述特定定量值获得两组肿瘤组织样品，其中对每组肿瘤组织样品分别计算；f)计算(i)步骤e)获得的定量值和(ii)步骤f)定义的第一组和第二组中包含的肿瘤组织样品所源自的患者的实际临床结果之间的统计显著性；g)重复步骤f)和g)，直到测试步骤d)提供的每个任意定量值；h)将所述预定参考值设置为由在步g)计算的最高统计显著性(最显著)的任意定量值组成。例如，已经针对100名患者的100个肿瘤组织样品评估了CD8+T细胞的密度。根据CD8+T细胞的密度对100个样品进行排序。样品1具有最高密度和样品100具有最低密度。第一次分组提供两个亚组：一组的样品Nr 1和另一组的99个其他样品。下一次分组一组提供样品1和2和另一组提供98个剩余样品等，直到最后一次分组：一组的样品1-99和另一组的样品Nr 100。根据涉及相应癌症患者的实际临床结果的信息，为两个亚组的99组中的每一组制作KaplanMeier曲线。同样对于99组中的每一组，计算了两个亚组之间的p值。然后选择预定参考值，如基于最小p值标准的区分是最强的。换言之，对应于p值最小的两个亚组之间的边界的CD8+T细胞的密度被认为是预定参考值。应注意预定参考值不一定是细胞密度的中位数。因此，在一些实施方案中，预定参考值因此可以区分关于患者的DFS和OS的不良预后和良好预后。实际上，高统计显著性值(例如低P值)通常针对一系列连续的任意定量值获得，而不仅仅针对单个任意定量值获得。因此，在本发明的一个可选实施方案中，不使用确定的预定参考值，而提供数值范围。因此，任意设置最小统计显著性值(显著性的最小阈值，例如最大阈值P值)，并且保留在步骤g)计算的统计显著性值更高(更显著，例如更低的P值)的多个任意定量值的范围，以提供定量值范围。该定量值范围包括如上所述的“截止”值。例如，根据“截止”值的这个特定实施方案，可以通过将CD8+T细胞的密度与所鉴定的值的范围进行比较来确定结果。在一些实施方案中，截止值因此由定量值范围组成，例如找到最高统计显著性值的定量值的中心值(例如，通常为找到的最小p值)。
用于增强作为治疗方案的一部分的向患者施用的免疫检查点抑制剂的效力的方 法：
本发明的另一个目的涉及一种用于增强作为治疗方案的一部分的向患者施用的免疫检查点抑制剂的效力的方法，该方法包括向患者联合施用药学有效量的NRP-1抑制剂与免疫检查点抑制剂。
在一些实施方案中，NRP-1抑制剂是源自描述于Mol.Biol.(2007)366,815-829和US8378080B1的抗NRP1 YW64.3的抗NRP-1抗体。
特别地，抗NRP-1抗体包含：
-包含以下互补决定区(CDR)氨基酸序列的轻链可变结构域：VL-CDR1(RASQSISSYLA；SEQ ID NO:3)、VL-CDR2(GASSRAS；SEQ ID NO:4)和VL-CDR3(QQYMSVPIT；SEQID NO:5)和
-包含以下CDR氨基酸序列的重链可变结构域：VH-CDR1(GFSFSSEPIS；SEQ ID NO:6),VH-CDR2(SSITGKNGYTYYADSVKG；SEQ ID NO:7)和VH-CDR3(WGKKVYGMDV；SEQ ID NO:8)。
在一些实施方案中，抗NRP-1抗体包含SEQ ID NO:9的轻链可变结构域序列。在一些实施方案中，抗NRP-1抗体包含SEQ ID NO:10的重链可变结构域序列。在一些实施方案中，抗NRP-1抗体包含SEQ ID NO:9的轻链可变结构域序列和SEQ ID NO:10的重链可变结构域序列。
在一些实施方案中，NRP-1抑制剂是与包含以下的抗体交叉竞争结合NRP-1同源异构体的抗NRP-1抗体：
-包含以下互补决定区(CDR)氨基酸序列的轻链可变结构域：VL-CDR1(RASQSISSYLA；SEQ ID NO:3)、VL-CDR2(GASSRAS；SEQ ID NO:4)和VL-CDR3(QQYMSVPIT；SEQID NO:5)和
-包含以下CDR氨基酸序列的重链可变结构域：VH-CDR1(GFSFSSEPIS；SEQ ID NO:6),VH-CDR2(SSITGKNGYTYYADSVKG；SEQ ID NO:7)和VH-CDR3(WGKKVYGMDV；SEQ ID NO:8)。
在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是选自以下的抗体：抗CTLA4抗体、抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗PD-L2抗体、抗TIM-3抗体、抗LAG3抗体、抗B7H3抗体、抗B7H4抗体、抗BTLA抗体和抗B7H6抗体。
抗CTLA4抗体的实例描述于美国专利号5,811,097；5,811,097；5,855,887；6,051,227；6,207,157；6,682,736；6,984,720；和7,605,238中。一种抗CTLA-4抗体是替西木单抗，(ticilimumab，CP-675,206)。在一些实施方案中，抗CTLA-4抗体是伊匹单抗(也称为10D1、MDX-D010)，一种结合CTLA-4的全人单克隆IgG抗体。
其他免疫检查点抑制剂包括淋巴细胞活化基因3(LAG-3)抑制剂，例如IMP321，一种可溶性Ig融合蛋白(Brignone et al.,2007,J.Immunol.179:4202-4211)。其他免疫检查点抑制剂包括B7抑制剂，诸如B7-H3和B7-H4抑制剂。特别是抗B7-H3抗体MGA271(Loo etal.,2012,Clin.Cancer Res.July 15(18)3834)。还包括TIM3(T细胞免疫球蛋白结构域和粘蛋白结构域3)抑制剂(Fourcade et al.,2010,J.Exp.Med.207:2175-86and Sakuishiet al.,2010,J.Exp.Med.207:2187-94)。如本文所用，术语“TIM-3”具有其在本领域的一般含义并且是指包含T细胞免疫球蛋白和粘蛋白结构域的分子3。TIM-3的天然配体是半乳糖凝集素9(Gal9)。因此，本文使用的术语“TIM-3抑制剂”是指可以抑制TIM-3功能的化合物、物质或组合物。例如，抑制剂可以抑制TIM-3的表达或活性、调节或阻断TIM-3信号传导通路和/或阻断TIM-3与半乳糖凝集素9的结合。具有对TIM-3特异性的抗体是本领域众所周知的，且典型地描述于WO2011155607、WO2013006490和WO2010117057中。
在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是IDO抑制剂。IDO抑制剂的实例描述于WO2014150677中。IDO抑制剂的实例包括但不限于1-甲基-色氨酸(IMT)、β-(3-苯并呋喃基)-丙氨酸、β-(3-苯并(b)噻吩基)-丙氨酸)、6-硝基色氨酸、6-氟色氨酸、4-甲基色氨酸、5-甲基色氨酸、6-甲基色氨酸、5-甲氧基色氨酸、5-羟基色氨酸、吲哚3-甲醇、3,3'-二吲哚甲烷、表没食子儿茶素没食子酸酯、5-Br-4-Cl-吲哚1,3-二乙酸酯、9-乙烯基咔唑、阿西美辛、5-溴-色氨酸、5-溴吲哚二乙酸酯、3-氨基萘甲酸、吡咯烷二硫代氨基甲酸、4-苯基咪唑芸苔素衍生物、乙内酰脲衍生物、β-咔啉衍生物或brassilexin衍生物。优选地，IDO抑制剂选自1-甲基-色氨酸、β-(3-苯并呋喃基)-丙氨酸、6-硝基-L-色氨酸、3-氨基-萘甲酸和β-[3-苯并(b)噻吩基]-丙氨酸或其衍生物或前药。
在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是PD-1抑制剂。因此，本文所用的术语“PD-1抑制剂”是指能够抑制PD-1功能的化合物、物质或组合物。例如，抑制剂可以抑制PD-1的表达或活性、调节或阻断PD-1信号传导通路和/或阻断PD-1与PD-L1或PD-L2的结合。
在一些实施方案中，PD-1抑制剂是针对PD-1细胞外结构域的抗体。在一些实施方案中，PD-1抑制剂是针对PD-L1细胞外结构域的抗体。PD-1和PD-L1抗体的实例描述于美国专利号7,488,802；7,943,743；8,008,449；8,168,757；8,217,149和PCT公开专利申请号：WO03042402、WO2008156712、WO2010089411、WO2010036959、WO2011066342、WO2011159877、WO2011082400和WO2011161699中。在一些实施方案中，PD-1阻断剂包括抗PD-L1抗体。在一些实施方案中，PD-1阻断剂包括抗PD-1抗体和类似的结合蛋白，诸如纳武单抗(MDX 1106、BMS 936558、ONO 4538)，通过其配体PD-Ll和PD-L2结合并阻断PD-1活化的全人IgG4抗体；派姆单抗(MK-3475或SCH 900475)，针对PD-1的人源化单克隆IgG4抗体；CT-011，结合PD-1的人源化抗体；AMP-224是B7-DC的融合蛋白；抗体Fc部分；用于PD-Ll(B7-H1)阻断的BMS-936559(MDX-1105-01)。在一些实施方案中，抗PD-1抗体是WO2016020856和Fenwick,Craig,et al."Tumor suppression of novel anti–PD-1antibodies mediated through CD28costimulatory pathway."Journal of Experimental Medicine(2019):jem-20182359中公开的抗PD1Gepi 135c。
在一些实施方案中，抗PD-1抗体包含派姆单抗的VH和VL结构域。在一些实施方案中，抗PD-1抗体包含SEQ ID NO：11的VH结构域和SEQ ID NO：12的VL结构域。在一些实施方案中，抗PD-1抗体包含SEQ ID NO：13的重链和/或SEQ ID NO:14的轻链。
SEQ ID NO:11>派姆单抗的VH结构域
QVQLVQSGVEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYYMYWVRQAPGQGLEWMGGINPSNGGTNFNEKFKNRVTLTTDSSTTTAYMELKSLQFDDTAVYYCARRDYRFDMGFDYWGQGTTVTVSS
SEQ ID NO 12>派姆单抗的VL结构域
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASKGVSTSGYSYLHWYQQKPGQAPRLLIYLASYLESGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHSRDLPLTFGGGTKVEIK
SEQ ID NO:13>派姆单抗的重链
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLDCKASGITFSNSGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSKRYYADSVKGRFTISRDNSKNTLFLQMNSLRAEDTAVYYCATNDDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
SEQ ID NO:14>派姆单抗的轻链
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASKGVSTSGYSYLHWYQQKPGQAPRLLIYLASYLESGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHSRDLPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
在一些实施方案中，抗PD-1抗体包含纳武单抗的VH和VL结构域。在一些实施方案中，抗PD-1抗体包含SEQ ID NO：15的VH结构域和SEQ ID NO：16的VL结构域。在一些实施方案中，抗PD-1抗体包含SEQ ID NO：17的重链和/或SEQ ID NO:18的轻链。
SEQ ID NO:15>纳武单抗的VH结构域
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLDCKASGITFSNSGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSKRYYADSVKGRFTISRDNSKNTLFLQMNSLRAEDTAVYYCATNDDYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:16>纳武单抗的VL结构域
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQSSNWPRTFGQGTKVEIK
SEQ ID NO:17>纳武单抗的重链
QVQLVQSGVEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYYMYWVRQAPGQGLEWMGGINPSNGGTNFNEKFKNRVTLTTDSSTTTAYMELKSLQFDDTAVYYCARRDYRFDMGFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
SEQ ID NO:18>纳武单抗的轻链
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQSSNWPRTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
在一些实施方案中，PD-1抑制剂是小分子或肽，或肽衍生物，诸如美国专利号8,907,05；9,096,642；和9,044,442和美国专利申请公开号2015/0087581中描述的那些；1,2,4恶二唑化合物和衍生物，诸如美国专利申请公开号2015/0073024中描述的那些；环状拟肽化合物和衍生物，诸如美国专利申请公开号2015/0073042中描述的那些；环状化合物和衍生物，诸如美国专利申请公开号2015/0125491中描述的那些；1,3,4恶二唑和1,3,4噻二唑化合物和衍生物，诸如国际专利申请公开号WO 2015/033301中描述的那些；基于肽的化合物和衍生物，诸如在国际专利申请公开号WO 2015/036927和WO 2015/04490中描述的那些，或基于大环肽的化合物和衍生物，诸如在美国专利申请公开号2014/0294898中描述的那些；其各自的公开通过引用整体并入本文。
在有需要的患者中治疗癌症的方法，包括向患者施用NRP-1抑制剂与免疫检查点 抑制剂的治疗有效组合：
本发明的另一个目的涉及一种在有需要的患者中治疗癌症的方法，包括向患者施用NRP-1抑制剂与免疫检查点抑制剂的治疗有效组合，其中相对于单独施用免疫检查点抑制剂，组合的施用导致治疗功效的增强。
包含至少一个特异性结合免疫检查点分子的结合位点和至少一个特异性结合 NRP-1的结合位点的多特异性抗体：
本发明的另一目的涉及包含至少一个特异性结合免疫检查点分子的结合位点和至少一个特异性结合NRP-1的结合位点的多特异性抗体。
多特异性抗体典型地描述于WO2011159877中。根据本发明，本发明的多特异性抗体结合免疫检查点分子(例如PD-1)的细胞外结构域和NRP-1的细胞外结构域。本发明的多特异性抗体分子的示例性形式包括但不限于(i)通过化学异源偶联交联的两种抗体，一种对PD-1具有特异性，另一种对NRP-1具有特异性；(ii)包含两个不同抗原结合区的单个抗体；(iii)包含两个不同抗原结合区的单链抗体，例如，通过额外的肽接头串联连接的两个scFv；(iv)双可变结构域抗体(DVD-Ig)，其中每个轻链和重链含有通过短肽连接串联的两个可变结构域(Wu等Generation and Characterization of a Dual Variable DomainImmunoglobulin(DVD-IgTM)Molecule,In:Antibody Engineering,Springer BerlinHeidelberg(2010))；(v)化学连接的双特异性(Fab')2片段；(vi)Tandab，其是两个单链双抗体的融合物，产生对于每种靶抗原具有两个结合位点的四价双特异性抗体；(vii)flexibody，其是产生多价分子的scFv与双抗体的组合；(viii)基于蛋白激酶A中的“二聚化和对接结构域”的所谓的“对接和锁定”分子，当应用于Fab时，可以产生由与不同的Fab片段连接的两个相同的Fab片段组成的三价双特异性结合蛋白；(ix)所谓的Scorpion分子，其包含例如与人Fab臂的两个末端融合的两个scFv；和(x)双抗体。双特异性抗体的另一种示例性形式是具有互补CH3结构域的IgG样分子，以推动异源二聚化。这些分子可以使用已知技术制备，诸如，例如称为Triomab/Quadroma(Trion Pharma/Fresenius Biotech)、Knob-into-Hole(Genentech)、CrossMAb(Roche)和静电匹配(Amgen)、LUZ-Y(Genentech)、链交换工程化结构域体(SEEDbody)(EMD Serono)、Biclonic(Merus)和DuoBody(Genmab A/S)技术。在一些实施方案中，双特异性抗体典型地使用DuoBody技术通过受控的Fab臂交换获得或可获得。通过受控的Fab臂交换产生双特异性抗体的体外方法已描述于WO2008119353和WO2011317746(均由Genmab A/S)中。在WO 2008119353中描述的一种示例性方法中，在还原条件下孵育时，通过两种单特异性抗体之间的“Fab-臂”或“半分子”交换(交换重链和连接的轻链)形成双特异性抗体，所述两种单特异性抗体均包含IgG4样CH3区。所得产物是具有两个Fab臂的双特异性抗体，其可包含不同的序列。在WO 2011131746中描述的另一种示例性方法中，通过包括以下步骤的方法制备本发明的双特异性抗体，其中第一和第二抗体中的至少一种是本发明的抗体：a)提供包含免疫球蛋白的Fc区的第一抗体，所述Fc区包含第一CH3区；b)提供包含免疫球蛋白的Fc区的第二抗体，所述Fc区包含第二CH3区；其中所述第一和第二CH3区的序列不同，并且所述第一和第二CH3区之间的异源二聚体相互作用比所述第一和第二CH3区之间的同源二聚体相互作用强；c)在还原条件下孵育所述第一抗体和所述第二抗体；和d)获得所述双特异性抗体，其中所述第一抗体是本发明的抗体，所述第二抗体具有不同的结合特异性，或相反。例如，还原条件可以通过添加例如选自2-巯基乙胺、二硫苏糖醇和三(2-羧乙基)膦的还原剂来提供。步骤d)可以进一步包括将条件恢复为变成非还原或较少还原，例如通过去除还原剂，例如通过脱盐。优选地，第一和第二CH3区的序列不同，仅包含少数相当保守的不对称突变，使得所述第一和第二CH3区之间的异源二聚体相互作用比所述第一和第二CH3区的每个同源二聚体相互作用强。通过引用整体并入本文的WO2011131746提供了关于这些相互作用及其如何实现的更多细节。在一些其他实施方案中，本发明的双特异性抗体是IgG4类对称双特异性抗体，其包含两条重链，每条重链包含可变结构域、CHl结构域和铰链区，其中在每条重链中：与轻链中的半胱氨酸形成链间二硫键的CHl结构域中的半胱氨酸被另一个氨基酸取代；并且任选地，位于上部铰链区的一个或多个氨基酸被半胱氨酸取代，其中每条重链的恒定区序列相似或相同，并且每条重链的可变区不同。所述双特异性形式抗体描述于国际专利申请WO2013124450中。在一些实施方案中，本发明的双特异性抗体是包含两条重链或重链片段的不对称抗体，每条重链或重链片段包含至少一个可变区、铰链区和CHl结构域，其中第一重链或其片段是IgG4类并且具有a)在根据Kabat编号系统编号的在CHI结构域中的第127位的链间半胱氨酸，被另一个氨基酸取代；和b)任选地，位于上部铰链区中的一个或多个氨基酸被半胱氨酸取代，并且其中第二重链或其片段的特征在于该链的部分或全部与所述第一重链在至少可变区之外的区域(例如恒定区)具有不同的氨基酸序列。所述双特异性形式抗体描述于国际专利申请WO 2013124451中。
在一些实施方案中，本发明的多特异性抗体(例如双特异性抗体)包含特异性结合NRP-1并且包含轻链可变结构域和重链可变结构域的第一结合位点，所述轻链可变结构域包含以下互补决定区(CDR)氨基酸序列：VL-CDR1(RASQSISSYLA；SEQ ID NO:3)、VL-CDR2(GASSRAS；SEQ ID NO:4)和VL-CDR3(QQYMSVPIT；SEQ ID NO:5)，所述重链可变结构域包含以下CDR氨基酸序列：VH-CDR1(GFSFSSEPIS；SEQ ID NO:6)、VH-CDR2(SSITGKNGYTYYADSVKG；SEQ ID NO:7)和VH-CDR3(WGKKVYGMDV；SEQ ID NO:8)。
在一些实施方案中，本发明的多特异性抗体(例如双特异性抗体)包含特异性结合NRP-1并且包含SEQ ID NO:9的轻链可变结构域(VL)序列和SEQ ID NO：10的重链可变结构域(VH)序列的第一结合位点。
在一些实施方案中，本发明的多特异性抗体(例如双特异性抗体)包含与特异性结合PD-1且包含SEQ ID NO:11的VH结构域和SEQ ID NO:12的VL结构域的第二结合位点。
在一些实施方案中，本发明的多特异性抗体(例如双特异性抗体)包含特异性结合PD-1并且包含SEQ ID NO:15的VH结构域和SEQ ID NO:16的VL结构域的第二结合位点。
在一些实施方案中，本发明的多特异性抗体(例如双特异性抗体)包含：
-特异性结合NRP-1并且包含SEQ ID NO:9的轻链可变结构域(VL)序列和SEQ IDNO:10的重链可变结构域(VH)序列的第一结合位点，和
-特异性结合PD-1并且包含SEQ ID NO:11的VH结构域和SEQ ID NO:12的VL结构域的第二结合位点。
在一些实施方案中，本发明的多特异性抗体(例如双特异性抗体)包含：
-特异性结合NRP-1并且包含SEQ ID NO:9的轻链可变结构域(VL)序列和SEQ IDNO:10的重链可变结构域(VH)序列的第一结合位点，和
-特异性结合PD-1并且包含SEQ ID NO:15的VH结构域和SEQ ID NO:16的VL结构域的第二结合位点。
本发明的另一个目的涉及一种在有需要的患者中治疗癌症的方法，包括向患者施用治疗有效量的本发明的多特异性抗体，所述多特异性抗体包含至少一个特异性结合免疫检查点分子的结合位点，以及至少一个特异性结合NRP-1的结合位点。
CAR-T细胞，其中NRP-1的表达被抑制：
本发明的另一个目的涉及工程化以表达嵌合抗原受体(CAR)的细胞群，其中所述细胞中NRP-1的表达被抑制。
在一些实施方案中，细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和其他血细胞亚群，诸如但不限于T细胞，诸如肿瘤浸润细胞(TILS)、CD4+T细胞或CD8+T细胞。合适的细胞还包括干细胞，诸如，例如胚胎干细胞、诱导多能干细胞、造血干细胞、神经元干细胞和间充质干细胞。在一些实施方案中，干细胞用于离体的细胞转染和基因治疗的过程中。使用干细胞的优势在于它们可以在体外分裂为其他细胞类型，或者可以引入哺乳动物(诸如细胞的供体)，其中它们将移植到骨髓中。使用细胞因子诸如GM-CSF、IFN-γ和TNF-α在体外将CD34+细胞分化为临床上重要的免疫细胞类型的方法是已知的(参见Inaba et al.,J.Exp.Med.176:1693-1702(1992))。
在一些实施方案中，包含抗体或其抗体片段的本发明的CAR的部分可以多种形式存在，其中抗原结合结构域表达为连续多肽链的一部分，包括例如单域抗体片段(sdAb)、单链抗体(scFv)、人源化抗体或双特异性抗体(Harlow et al.,1999,In:Using Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,NY；Harlow et al.,1989,In:Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor,N.Y.；Houston etal.,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883；Bird et al.,1988,Science 242:423-426)。在一些实施方案中，本发明的CAR组合物的抗原结合结构域包含抗体片段。在进一步的方面，CAR包含含有scFv的抗体片段。
在一些实施方案中，本发明提供许多嵌合抗原受体(CAR)，其包含工程化用于特异性结合肿瘤抗原(例如本文所述的肿瘤抗原)的抗原结合结构域(例如，抗体或抗体片段、TCR或TCR片段)。
在一些实施方案中，用编码CAR的病毒载体转导细胞(例如，T细胞)。在一些实施方案中，病毒载体是逆转录病毒载体。在一些实施方案中，病毒载体是慢病毒载体。在一些实施方案中，细胞可稳定表达CAR。在一些实施方案中，用编码CAR的核酸，例如mRNA、cDNA、DNA转染细胞(例如，T细胞)。
在一些实施方案中，本发明的CAR的抗原结合结构域(例如，scFv)由核酸分子编码，所述核酸分子序列已密码子优化以在哺乳动物细胞中表达。在一些实施方案中，本发明的完整CAR构建体由核酸分子编码，所述核酸分子的完整序列已密码子优化以在哺乳动物细胞中表达。密码子优化是指发现编码DNA中同义密码子(即编码相同氨基酸的密码子)的出现频率在不同物种中存在偏差。这种密码子简并性使得通过多种核苷酸序列编码相同的多肽。多种密码子优化方法是本领域已知的，并且包括，例如，至少在美国专利第5,786,464和6,114,148号中公开的方法。
在一些实施方案中，通过使用内切核酸酶抑制NRP-1的表达。在一些实施方案中，通过使用CRISPR相关核酸内切酶抑制NRP-1的表达。用于真核细胞中基因编辑的CRISPR/Cas系统通常涉及(1)包含靶序列(能够与基因组DNA靶序列杂交)的向导RNA分子(gRNA)，和能够结合Cas的序列，例如，Cas9酶，和(2)Cas，例如Cas9蛋白质。靶序列和能够结合Cas(例如Cas9酶)的序列可以设置在相同或不同的分子上。如果设置在不同的分子上，则每个都包括使得分子(例如通过杂交)结合的杂交结构域。可以使用本领域已知的技术，例如在美国公开号20140068797、WO2015/048577和Cong(2013)Science339:819-823中描述的技术，产生抑制NRP-1的人工CRISPR/Cas系统。也可以产生抑制NRP-1的本领域已知的其他人工CRISPR/Cas系统，例如，Tsai(2014)Nature Biotechnol.,32:6 569-576,美国专利号8,871,445；8,865,406；8,795,965；8,771,945；和8,697,359描述的那些，其内容通过引用整体并入本文。可以通过，例如，将CRISPR/Cas系统工程化以包括gRNA分子产生抑制NRP-1的此类系统，所述gRNA分子包含与NRP-1基因的序列杂交的靶序列。在一些实施方案中，gRNA包含与NRP-1基因的15-25个核苷酸(例如20个核苷酸)完全互补的靶序列。在一些实施方案中，NRP-1基因的15-25个核苷酸(例如20个核苷酸)紧邻由CRISPR/Cas系统的Cas蛋白识别的原间隔区相邻基序(PAM)序列的5’设置(例如，其中系统包含化脓性链球菌Cas9蛋白，PAM序列包含NGG，其中N可以是A、T、G或C中的任一个)。
在一些实施方案中，外源DNA(例如，编码CAR的DNA)可以与CRISPR/Cas系统一起引入细胞。
在一些实施方案中，细胞与核酸内切酶系统的接触离体进行。在实施方案中，接触在所述细胞被修饰以表达CAR(例如本文所述的CAR)之前、同时或之后进行。
在一些实施方案中，至少一种免疫检查点蛋白(例如PD-1、CTLA-4)的表达也在细胞中被抑制。
本发明的另一个目的涉及制备表达CAR的细胞的方法，包括由以下组成的步骤：i)将编码CAR的核酸引入细胞和ii)使细胞与核酸内切酶系统接触以抑制NRP-1的表达。
在一些实施方案中，该方法包括由以下组成的步骤：i)将编码CAR的核酸引入细胞和ii)使细胞与Cas蛋白和至少一种向导RNA分子(gRNA)接触，所述向导RNA分子包含靶向NRP-1基因的序列以及能够结合Cas蛋白的序列。在一些实施方案中，细胞还与至少一种包含靶向编码免疫检查点蛋白(例如PD-1、CTLA-4……)的基因的序列的向导RNA分子接触。
一旦获得T细胞群，可以根据任何标准方法评估细胞的功能，通常包括细胞毒性测定。也可以确认具有适合的结合配偶体的细胞的细胞表面表型。也可以对各种细胞因子的分泌进行定量。定量样品中细胞因子分泌的方法是本领域公知的。例如，任何免疫学方法诸如但不限于ELISA、多重策略、ELISPOT、免疫层析技术、蛋白质组学方法、Westernblotting、FACS或放射免疫测定法可应用于本发明。
通过本发明的方法获得的T细胞群可以有多种应用。更特别地，T细胞群适用于过继免疫疗法。过继免疫疗法是针对任何疾病或疾病病症的适当治疗，其中已证明通过特定的T细胞群实现了感染或转化的细胞的消除。可以用根据本发明制备的T细胞群治疗的示例性疾病、失调或病症包括例如感染，诸如病毒感染、细菌感染、支原体感染、真菌感染和寄生虫感染；和癌症。
本发明的另一个目的涉及在有需要的患者中治疗癌症的方法，包括向患者施用治疗有效量的工程化以表达嵌合抗原受体(CAR)的T细胞群，并且其中所述细胞中NRP-1的表达被抑制。
在有需要的患者中治疗癌症的方法，包括向患者联合施用治疗有效量的NRP-1抑 制剂和癌症疫苗：
本发明的另一个目的涉及在有需要的患者中治疗癌症的方法，包括向患者联合施用治疗有效量的NRP-1抑制剂和癌症疫苗。
在一些实施方案中，NRP-1抑制剂是源自描述于Mol.Biol.(2007)366,815-829和US8378080B1的抗NRP1 YW64.3的抗NRP-1抗体。
特别地，抗NRP-1抗体包含：
-包含以下互补决定区(CDR)氨基酸序列的轻链可变结构域：VL-CDR1(RASQSISSYLA；SEQ ID NO:3)、VL-CDR2(GASSRAS；SEQ ID NO:4)和VL-CDR3(QQYMSVPIT；SEQID NO:5)和
-包含以下CDR氨基酸序列的重链可变结构域：VH-CDR1(GFSFSSEPIS；SEQ ID NO:6),VH-CDR2(SSITGKNGYTYYADSVKG；SEQ ID NO:7)和VH-CDR3(WGKKVYGMDV；SEQ ID NO:8)。
在一些实施方案中，抗NRP-1抗体包含SEQ ID NO:9的轻链可变结构域序列。在一些实施方案中，抗NRP-1抗体包含SEQ ID NO:10的重链可变结构域序列。在一些实施方案中，抗NRP-1抗体包含SEQ ID NO:9的轻链可变结构域序列和SEQ ID NO:10的重链可变结构域序列。
在一些实施方案中，NRP-1抑制剂是与包含以下的抗体交叉竞争结合NRP-1同源异构体的抗NRP-1抗体：
-包含以下互补决定区(CDR)氨基酸序列的轻链可变结构域：VL-CDR1(RASQSISSYLA；SEQ ID NO:3)、VL-CDR2(GASSRAS；SEQ ID NO:4)和VL-CDR3(QQYMSVPIT；SEQID NO:5)和
-包含以下CDR氨基酸序列的重链可变结构域：VH-CDR1(GFSFSSEPIS；SEQ ID NO:6),VH-CDR2(SSITGKNGYTYYADSVKG；SEQ ID NO:7)和VH-CDR3(WGKKVYGMDV；SEQ ID NO:8)。
多种物质可用作免疫原性或疫苗类型的化合物或制剂中的抗原。例如，减毒和灭活的病毒和细菌病原体、纯化的大分子、多糖、类毒素、重组抗原、含有来自病原体的外源基因的生物体、合成肽、多聚核酸、抗体和肿瘤细胞可用于制备本发明的癌症疫苗。在一些实施方案中，抗原是由已通过转染、慢病毒或逆转录病毒转导、微基因转移或其他合适的过程引入细胞中的DNA或其他合适的核酸序列编码的蛋白质或肽。在一些实施方案中，所述抗原是可以通过重组DNA技术或通过从不同组织或细胞来源纯化获得的蛋白质。通常，所述蛋白质的长度大于10个氨基酸，优选大于15个氨基酸，甚至更优选大于20个氨基酸，没有理论上限。此类蛋白质不限于天然蛋白质，还包括修饰的蛋白质或嵌合构建体，例如通过改变所选的氨基酸序列或通过融合不同蛋白质的部分而获得。在一些实施方案中，所述抗原是合成肽。通常，所述合成肽3-40个氨基长酸，优选5-30个氨基酸长，甚至更优选8-20个氨基酸长。合成肽可以通过Fmoc生化过程、大规模多肽合成、重组DNA技术或其他合适的过程获得。此类肽不限于天然肽，还包括修饰肽、翻译后修饰肽或嵌合肽，例如通过改变或修饰所选的氨基酸序列或通过融合不同蛋白质的部分而获得。
在一些实施方案中，疫苗组合物包含呈递所选抗原的至少一个抗原呈递细胞群。抗原呈递细胞(或刺激细胞)通常在其表面上具有MHC I类或II类分子，并且在一些实施方案中，其自身基本上不能用所选抗原装载MHC I类或II类分子。优选地，抗原呈递细胞是树突细胞。合适地，树突细胞是用目标抗原(例如肽)脉冲的自体树突细胞。使用来自肿瘤相关抗原的肽脉冲的自体树突状细胞的T细胞疗法公开于Murphy et al.(1996)The Prostate29,371-380and Tjua et al.(1997)The Prostate 32,272-278。因此，在一些实施方案中，用一种或多种抗原肽脉冲或装载含有至少一种抗原呈递细胞的疫苗组合物。作为替代方案，抗原呈递细胞包含编码抗原肽的表达构建体。多核苷酸可以是任何合适的多核苷酸，并且优选能够转导树突细胞，从而导致肽的呈递和免疫应答的诱导。
本发明的另一个目的涉及包含免疫佐剂和一种或多种癌症抗原的癌症疫苗，用于诱导针对所述一种或多种癌症抗原的免疫应答，其中免疫佐剂是NRP-1抑制剂。
药物组合物
根据本发明，活性剂以药物组合物的形式向患者施用，所述药物组合物包含药学上可接受的载体。可用于这些组合物的药学上可接受的载体包括但不限于：离子交换剂、氧化铝、硬脂酸铝、卵磷脂、血清蛋白(诸如人血清白蛋白)、缓冲物质(诸如磷酸盐)、甘氨酸、山梨酸、山梨酸钾、饱和植物脂肪酸的部分甘油酯混合物、水、盐或电解质(诸如硫酸鱼精蛋白)、磷酸氢二钠、磷酸氢钾、氯化钠、锌盐、胶体二氧化硅、三硅酸镁、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素基物质、聚乙烯乙二醇、羧甲基纤维素钠、聚丙烯酸酯、蜡、聚乙烯-聚氧丙烯-嵌段聚合物、聚乙二醇和羊毛脂。为了用于向患者施用，将组合物配制成用于向患者施用。本发明的组合物可以通过以下施用：口服、胃肠外、通过吸入喷雾、局部、直肠、经鼻、经颊、阴道或通过植入型储存。本文使用的包括皮下、静脉内、肌肉内、关节内、滑膜内、胸骨内、鞘内、肝内、病灶内和颅内注射或输注技术。本发明组合物的无菌可注射形式可以是水性或油性悬浮液。可以根据本领域已知的技术使用合适的分散剂或润湿剂和悬浮剂配制这些悬浮液。无菌可注射制剂还可以是在无毒的肠胃外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液或悬浮液，例如作为1,3-丁二醇溶液。可以采用的可接受载体和溶剂包括水、林格氏溶液和等渗氯化钠溶液。另外，无菌的固定油通常用作溶剂或悬浮介质。为此目的，可以采用任何温和的固定油，包括合成的甘油单酯或甘油二酯。与天然的药学上可接受的油，诸如橄榄油或蓖麻油，尤其是它们的聚氧乙基化形式一样，脂肪酸，诸如油酸及其甘油酯衍生物可用于制备注射剂。这些油溶液或悬浮液还可含有长链醇类稀释剂或分散剂，诸如羧甲基纤维素或通常用于配制药学上可接受的剂型(包括乳剂和混悬剂)的类似分散剂。通常用于制备药学上可接受的固体、液体或其它剂型的其他常用的表面活性剂，诸如Tween、Span和其他乳化剂或生物利用度增强剂也可用于配制目的。本发明的组合物可以以任何口服可接受的剂型口服施用，包括但不限于胶囊、片剂、水性悬浮液或溶液。在口服用片剂的情况下，常用的载体包括乳糖和玉米淀粉。典型地，还添加润滑剂，诸如硬脂酸镁。对于胶囊形式的口服施用，有用的稀释剂包括例如乳糖。当口服使用需要水性悬浮液时，将活性成分与乳化剂和悬浮剂组合。如果需要，还可以添加某些甜味剂、调味剂或着色剂。或者，本发明的组合物可以用于直肠施用的栓剂的形式施用。这些可以通过将试剂与合适的无刺激性赋形剂混合来制备，所述赋形剂在室温下为固体但在直肠温度下为液体，因此将在直肠中融化以释放药物。这种材料包括可可脂、蜂蜡和聚乙二醇。本发明的组合物也可局部施用，尤其是当治疗靶标包括局部施用易于接近的区域或器官时，包括眼、皮肤或下肠道疾病。对于这些区域或器官中的每一个，容易制备合适的局部制剂。对于局部应用，组合物可以配制成合适的软膏，其含有悬浮或溶解在一种或多种载体中的活性组分。用于局部施用本发明化合物的载体包括但不限于矿物油、液体凡士林、白凡士林、丙二醇、聚氧乙烯、聚氧丙烯化合物、乳化蜡和水。或者，可以将组合物配制成合适的乳液或乳膏，其含有悬浮或溶解在一种或多种药学上可接受的载体中的活性组分。合适的载体包括但不限于矿物油、脱水山梨糖醇单硬脂酸酯、聚山梨醇酯60、十六烷基酯蜡、鲸蜡硬脂醇、2-辛基十二烷醇、苯甲醇和水。用于下肠道的局部应用可以以直肠栓剂制剂(参见上文)或以合适的灌肠制剂实现。也可以使用贴剂。本发明的组合物还可以通过鼻气雾剂或吸入施用。这种组合物根据药物制剂领域公知的技术制备，并且可以使用苯甲醇或其他合适的防腐剂、提高生物利用度的吸收促进剂、碳氟化合物和/或其他常规的增溶剂或分散剂制备为盐水溶液。例如，存在于本发明药物组合物中的抗体可以在100mg(10mL)或500mg(50mL)一次性使用小瓶中以10mg/mL的浓度提供。该产品配制为用于静脉内施用：9.0mg/mL氯化钠、7.35mg/mL柠檬酸钠二水合物、0.7mg/mL聚山梨醇酯80和无菌注射用水。将pH调节至6.5。本发明药物组合物中抗体的示例性合适剂量范围可为约1mg/m2-500mg/m2。但是，应当理解，这些安排是示例性的，并且考虑到必须在临床试验中测定的药物组合物中特定抗体的亲和力和耐受性，可以调整最佳安排和方案。可以制备用于注射(例如，肌肉内，静脉内)的本发明的药物组合物以含有无菌缓冲水(例如对于肌肉内，1ml)和约1ng-约100mg，例如约50ng-约30mg或更优选约5mg-约25mg的本发明抑制剂。
预测癌症患者是否将对免疫检查点抑制剂产生应答的方法：
本发明的另一个目的涉及一种预测癌症患者是否会对免疫检查点抑制剂产生应答的方法，包括i)测定来自患者的肿瘤样品中NRP-1或信号素3A的表达水平，和ii)将在步骤i)中测定的表达水平与预定参考值比较，和iii)当在步骤i)中测定的表达水平低于预定参考值时，得出结论患者会对免疫检查点抑制剂产生应答，或当在步骤i)中测定的表达水平高于预定参考值时，得出结论患者不会对免疫检查点抑制剂产生应答。
因此，该方法特别适用于区分响应者和非响应者。根据本发明，响应者具有客观应答，因此该术语不涵盖癌症稳定以致在用免疫检查点抑制剂治疗后疾病没有进展的患者。非响应者或难治性患者包括在用免疫检查点抑制剂治疗后癌症没有显示减轻或改善的患者。通常，可以通过参考标准或训练集将患者表征为响应者或非响应者。标准可以是已知为响应者或非响应者的患者的概况，或者可以是数值。这种预定标准可以任何合适的形式提供，例如打印的列表或图表、计算机软件程序或其他介质。
在一些实施方案中，肿瘤组织样品中NRP-1或信号素3A的表达水平通过免疫组织化学测定。例如，通过将肿瘤组织样品与结合配偶体(例如抗体)特异性NRP-1或信号素3A接触来进行测定。
免疫组织化学通常包括以下步骤i)用福尔马林固定肿瘤组织样品，ii)将所述肿瘤组织样品包埋在石蜡中，iii)将所述肿瘤组织样品切成切片进行染色，iv)将所述切片与NRP-1蛋白特异性的结合配偶体一起孵育，v)冲洗所述切片，vi)将所述切片与典型地生物素化的二抗一起孵育和vii)显示通常具有抗生物素蛋白-生物素-过氧化物酶复合物的抗原-抗体复合物。因此，肿瘤组织样品首先与对NRP-1蛋白特异性的结合配偶体一起孵育。洗涤后，根据标记抗体携带的标志物种类，例如，放射性、荧光或酶标记，结合NRP-1蛋白的标记抗体通过适当的技术显示。可以同时进行多个标记。或者，本发明的方法可以使用与扩增系统(以增强染色信号)和酶促分子偶联的二抗。这种偶联的二抗可商购自，例如Dako，EnVision系统。可以使用复染，例如Hematoxylin&Eosin、DAPI、Hoechst。可以使用本领域技术人员显而易见的任何合适的方法或系统来完成其他染色方法，包括自动、半自动或手动系统。
因此，在一些实施方案中，本发明的方法包括以下步骤：i)通过使用能够选择性地与NRP-1相互作用的结合配偶体(例如，如上所述的抗体)来提供通过自动载玻片染色系统获得的组织切片的一个或多个免疫染色切片，ii)通过高分辨率扫描捕获进行步骤i)的载玻片的数字化，iii)检测数字图片上的组织切片的载玻片，iv)提供具有相同表面的均匀分布单元的尺寸参考网格，所述网格适合待分析的组织切片的尺寸，和v)检测、定量和测量每个单元中染色细胞的强度和绝对数量。
在一些实施方案中，该方法进一步包括测定CD8的表达水平。在一些实施方案中，该方法包括测定肿瘤组织样品CD8+NRP-1+细胞的密度。
多重组织分析技术对于定量肿瘤组织样品中的几种蛋白质(例如NRP-1和CD8)特别有用。此类技术应允许从单个肿瘤组织样品中测量至少五个，或至少十个或更多个生物标志物。此外，该技术有利于保留生物标志物的定位并能够区分癌细胞和非癌细胞中生物标志物的存在。此类方法包括分层免疫组织化学(L-IHC)、分层表达扫描(LES)或多重组织免疫印迹(MTI)，例如教导于美国专利第6,602,661、6,969,615、7,214,477和7,838,222号；美国专利公开第2011/0306514号(通过引用并入本文)；和于Chung&Hewitt,Meth MolBiol,Prot Blotting Detect,Kurlen&Scofield,eds.536:139-148,2009中，每个文献教导在分层和印迹的膜、纸、过滤器等上制作多达8个、多达9个、多达10个、多达11个或更多的组织切片图像。用于进行L-IHC/MTI方法的涂层膜可从20/20GeneSystems,Inc.(Rockville,MD)获得。
在一些实施方案中，L-IHC方法可以在无论是新鲜的还是保存的多种组织样品中的任一种上进行。样品包括常规固定在10％标准缓冲福尔马林中并在病理科处理的核心针活检。从组织块上将标准的5μm厚的组织切片切割到用于L-IHC的带电载玻片上。因此，L-IHC能够通过获得从组织切片转移到多个生物亲和涂层膜上的分子拷贝来测试组织切片中的多个标记物，从而基本上产生组织“图像”的拷贝。在石蜡切片的情况下，如本领域已知将组织切片脱石蜡，例如，将切片暴露于二甲苯或二甲苯替代物诸如
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和分级乙醇溶液。切片可用蛋白酶处理，诸如，木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、蛋白酶K等。然后，将膜基材的叠层放置在组织切片上，该叠层包括例如具有0.4μm直径孔以引导组织分子诸如蛋白质通过叠层的多片10μm厚的涂层聚合物主链。将流体和组织分子的移动配置为基本上垂直于膜表面。可将该部分的夹层、膜、隔离纸、吸水纸、重物等暴露加热以促进分子从组织移动到膜叠层中。将组织的一部分蛋白质捕获在叠层的每个生物亲和涂层膜上(可从20/20GeneSystems,Inc.,Rockville,MD获得)。因此，每个膜包含组织的一个拷贝，并且可以使用标准免疫印迹技术探测不同的生物标志物，这使得在单个组织切片上进行的标志物谱的开放式扩展成为可能。由于在离组织更远的叠层膜上蛋白质的量可能较低，例如，这可能出现在组织样品中不同数量的分子、从组织样品中释放的分子的不同迁移率、分子与膜的不同的结合亲和力、转移的长度等上；可以在程序中包括值的标准化、运行控制、评估组织分子的转移水平等以校正膜内、膜间和膜中发生的变化，并启动膜内、膜间和膜中信息的直接比较。因此，可以使用例如任何用于定量蛋白质的方法来测定每个膜的总蛋白质，诸如使用标准试剂和方法生物素化可用分子，诸如蛋白质，然后通过将膜暴露于标记的亲和素或链霉亲和素；如本领域已知的蛋白质染色剂，诸如Blot fastStain、丽春红、亮蓝染色剂等来显示结合的生物素。
在一些实施方案中，本方法利用多重组织印迹(MTI)技术来测量生物标志物，其中该方法通过使用多种生物标志物，在一些情况下至少六个生物标志物来保存宝贵的活检组织。
在一些实施方案中，存在也可用作本发明的一部分的替代多重组织分析系统。一种这样的技术是基于质谱的选择反应监测(SRM)测定系统("Liquid Tissue"，可从OncoPlexDx(Rockville,MD获得)。美国专利号7,473,532描述了该技术。
在一些实施方案中，本发明的方法利用由GE Global Research(Niskayuna,NY)开发的多重IHC技术。该技术描述于美国公开号2008/0118916和2008/0118934。其中，对含有多个靶标的生物样品进行顺序分析，包括以下步骤：将荧光探针与样品结合，然后进行信号检测，然后使探针失活，然后将探针与另一个靶标结合，检测和失活，并继续该过程直到检测到所有靶标。
在一些实施方案中，当使用荧光(例如荧光团或量子点)时可以进行多重组织成像，其中可以用多光谱成像系统测量信号。多光谱成像是其中收集图像的每个像素的光谱信息，并使用光谱图像处理软件分析所得数据的技术。例如，该系统可以拍摄一系列不同波长的图像，可将其通过电子方式连续选择，然后与设计用于处理此类数据的分析程序一起使用。因此，只要光谱曲线不同，该系统能够同时从多种染料中获取定量信息，即使染料的光谱高度重叠或它们共定位，或出现在样品中的同一点。当被高能光激发时，许多生物材料自动发出荧光或发出低能光。该信号会导致对比度较低的图像和数据。没有多光谱成像功能的高灵敏度相机仅随着荧光信号而增加自发荧光信号。多光谱成像可以从组织中分出或分离自发荧光，从而增加可实现的信噪比。简言之，可以通过以下步骤进行定量：i)提供从患者获得的肿瘤组织微阵列(TMA)，ii)然后用具有目标NRP-1蛋白特异性的抗抗体对TMA样品进行染色，iii)用上皮细胞标记物进一步染色TMA载玻片，以帮助自动分割肿瘤和基质，iv)然后使用多光谱成像系统扫描TMA载玻片，v)使用自动图像分析软件处理扫描图像(例如Perkin Elmer Technology)，其允许通过强大的模式识别算法检测、定量和分割特定组织。机器学习算法之前通常经过训练，以从基质中分割肿瘤并鉴定标记的细胞。
在一些实施方案中，NRP-1的表达水平通过测定编码NRP-1的mRNA的量来测定。测定mRNA量的方法是本领域公知的。例如，首先根据标准方法提取样品(例如从患者制备的细胞或组织)中包含的核酸，例如使用裂解酶或化学溶液或按照制造商的说明通过核酸结合树脂提取。然后通过杂交(例如Northern blot分析、原位杂交)和/或扩增(例如RT-PCR)检测提取的mRNA。其他扩增方法包括连接酶链反应(LCR)、转录介导扩增(TMA)、链置换扩增(SDA)和基于核酸序列的扩增(NASBA)。
具有至少10个核苷酸并表现出与本文目标mRNA的序列互补性或同源性的核酸可用作杂交探针或扩增引物。应理解此类核酸不必相同，但通常与相当大小的同源区至少约80％一致，更优选85％一致，甚至更优选90-95％一致。在一些实施方案中，将核酸与合适的手段(诸如可检测标记)组合用于检测杂交将是有利的。
通常，核酸探针包括一种或多种标记，例如使用所公开的探针以允许检测靶核酸分子。在各种应用中，诸如原位杂交过程中，核酸探针包括标记(例如，可检测标记)。“可检测标记”是可用于产生指示样品中探针(特别是结合或杂交的探针)的存在或浓度的可检测信号的分子或材料。因此，标记的核酸分子提供样品中靶核酸序列(例如，基因组靶核酸序列)(标记的独特特异性核酸分子与之结合或杂交)的存在或浓度的指示。可以直接或间接检测与一种或多种核酸分子(诸如由所公开的方法产生的探针)相关的标记。标记可以通过任何已知的或有待发现的机制来检测，包括光子(包括射频、微波频率、红外频率、可见光频率和紫外频率光子)的吸收、发射和/或散射。可检测标记包括有色、荧光、磷光和发光分子和材料、将一种物质转化为另一种物质以提供可检测差异的催化剂(诸如酶)(诸如通过将无色物质转化为有色物质，或相反，或通过产生沉淀或增加样品浊度)、可通过抗体结合相互作用检测的半抗原以及顺磁性和磁性分子或材料。
可检测标记的具体实例包括荧光分子(或荧光染料)。许多荧光染料是本领域技术人员已知的，并且可以选自例如Life Technologies(以前称为Invitrogen)，例如，参见TheHandbook-A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies。可连接(例如，化学偶联)至核酸分子(诸如独特的特异性结合区)的特定荧光团的实例提供于Nazarenkoet al.的美国专利号5,866,366，诸如4-乙酰氨基-4'-异硫氰酸-2,2'二磺酸、吖啶及其衍生物诸如吖啶和异硫氰酸吖啶、5-(2'-氨基乙基)氨基萘-1-磺酸(EDANS)、4-氨基-N-[3乙烯基磺酰基)苯基]萘二甲酰亚胺-3,5二磺酸盐(Lucifer Yellow VS),N-(4-苯胺-1-萘基)马来酰亚胺、antl1ranilamide、亮黄、香豆素及其衍生物如香豆素、7-氨基-4-甲基香豆素(AMC、香豆素120)、7-氨基-4-三氟甲基香豆素(香豆素151)；cyanosine；4',6-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI)；5',5"二溴焦没酚-砜酞(溴化焦酚红)；7-二乙氨基-3-(4'-异硫氰酸根合苯基)-4-甲基香豆素；二亚乙基三胺五乙酸酯；4,4'-二异硫氰酸根合二氢-芪-2,2'-二磺酸；4,4'-二异硫氰基芪-2,2'-二磺酸；5-[二甲氨基]萘-1-磺酰氯(DNS，丹磺酰氯)；4-(4'-二甲氨基苯基偶氮)苯甲酸(DABCYL)；4-二甲氨基苯基偶氮苯基-4'-异硫氰酸酯(DABITC)；曙红及其衍生物如曙红和异硫氰酸曙红；赤藓红及其衍生物如赤藓红B和赤藓红异硫氰酸酯；乙啡啶；荧光素和衍生物诸如5-羧基荧光素(FAM)、5-(4,6dicl1lorotriazin-2-yDarninofluorescein(DTAF)、2'7'-二甲氧基-4'5'-二氯-6-羧基荧光素(JOE)、荧光素、异硫代氰基荧光素(FITC)和QFITC Q(RITC)；2',7'-二氟荧光素(OREGON
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)；荧光胺；IR144；IR1446；孔雀石绿异硫氰酸酯；4-甲基伞形酮；邻甲酚酞；硝基酪氨酸；副玫瑰苯胺；酚红；B-藻红蛋白；邻苯二甲醛；芘和衍生物如芘、芘丁酸酯、丁酸琥珀酰亚胺基1-芘丁酸酯；活性红4(Cibacron Brilliant Red 3B-A)；罗丹明和衍生物诸如6-羧基-X-罗丹明(ROX)、6-羧基罗丹明(R6G)、丽丝明罗丹明B磺酰氯、罗丹明(Rhod)、罗丹明B、罗丹明123、罗丹明X异硫氰酸酯、罗丹明绿、磺基罗丹明B、磺基罗丹明101和磺基罗丹明101的磺酰氯衍生物(德克萨斯红)；N,N,N',N'-四甲基-6-羧基罗丹明(TAMRA)；四甲基罗丹明；四甲基罗丹明异硫氰酸酯(TRITC)；核黄素；蔷薇酸和铽螯合物衍生物。其他合适的荧光团包括硫醇反应性铕螯合物，其在约617mn处发射(Heyduk and Heyduk,Analyt.Biochem.248:216-27,1997；J.Biol.Chem.274:3315-22,1999)，以及GFP、LissamineTM、二乙基氨基香豆素、氯三嗪基荧光素、萘基荧光素、4,7-二氯罗丹明和呫吨(如Lee等人的美国专利第5,800,996号所述)及其衍生物。也可以使用本领域技术人员已知的其他荧光团，例如可从LifeTechnologies(Invitrogen；Molecular Probes(Eugene,Oreg.))获得的那些并包括ALEXA
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系列染料(例如，如美国专利号5,696,157,6,130,101和6,716,979所述)，BODIPY系列染料(二吡咯亚甲基二氟化硼染料，例如，如美国专利号4,774,339,5,187,288,5,248,782,5,274,113,5,338,854,5,451,663和5,433,896所述)，Cascade Blue(美国专利第5,132,432号中描述的磺化芘的胺活性衍生物)和Marina Blue(美国专利第5,830,912号)。
除了上述荧光染料之外，荧光标记物可以是荧光纳米颗粒，诸如半导体纳米晶体，例如QUANTUM DOTTM(例如从Life Technologies(QuantumDot Corp,InvitrogenNanocrystal Technologies,Eugene,Oreg.)获得；还参见美国专利号6,815,064、6,682,596和6,649,138)。半导体纳米晶体是具有尺寸依赖性光学和/或电学特性的微观颗粒。当用初级能源照射半导体纳米晶体时，会发生二次能量发射，其频率对应于半导体纳米晶体中使用的半导体材料的手隙。这种发射可以检测为特定波长的有色光或荧光。具有不同光谱特性的半导体纳米晶体描述于例如美国专利第6,602,671号中。可以通过例如Bruchezet al.,Science 281:20132016,1998；Chan et al.,Science 281:2016-2018,1998；和美国专利号No.6,274,323中描述的技术将半导体纳米晶体与多种生物分子(包括dNTP和/或核酸)或底物偶联。各种组成的半导体纳米晶体的形成公开于，例如，美国专利号6,927,069；6,914,256；6,855,202；6,709,929；6,689,338；6,500,622；6,306,736；6,225,198；6,207,392；6,114,038；6,048,616；5,990,479；5,690,807；5,571,018；5,505,928；5,262,357和美国专利公开号2003/0165951以及PCT公开号99/26299(1999年5月27日公布)中。可以产生可基于它们不同光谱特征识别的单独的半导体纳米晶体群。例如，可以生产半导体纳米晶体，其根据其组成、尺寸或尺寸和组成在不同波长发射。例如，适合作为本文公开的探针中的荧光标记物的基于尺寸(565mn,655mn,705mn,或800mn发射波长)发射不同波长的光的量子点可从Life Technologies(Carlshad,Calif.)商购。其他标记包括，例如，放射性同位素(诸如3H)、金属螯合物，例如放射性或顺磁性金属离子(如Gd3+)的DOTA和DPTA螯合物，以及脂质体。可与核酸分子一起使用的可检测标记还包括酶，例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、酸性磷酸酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、β-葡萄糖醛酸酶或β-内酰胺酶。或者，可以在金相检测方案中使用酶。例如，银原位杂交(SISH)程序涉及用于鉴定和定位杂交基因组靶核酸序列的金相检测方案。金相检测方法包括使用酶，诸如碱性磷酸酶，结合水溶性金属离子和酶的无氧化还原活性底物。底物被酶转化为氧化还原活性剂，并且氧化还原活性剂还原金属离子，使其形成可检测的沉淀物。(参见，例如，美国专利申请公开号2005/0100976、PCT公开号2005/003777和美国专利申请公开号2004/0265922)。金相检测方法还包括使用氧化还原酶(诸如辣根过氧化物酶)以及水溶性金属离子、氧化剂和还原剂，以再次形成可检测的沉淀物。(例如，参见美国专利第6,670,113号)。
使用所公开的方法制成的探针可用于核酸检测，诸如ISH程序(例如，荧光原位杂交(FISH)、显色原位杂交(CISH)和银原位杂交(SISH))或比较基因组杂交(CGH)。
原位杂交(ISH)涉及在中期或间期染色体制备(诸如固定在载玻片上的细胞或组织样品)的上下文中，将含有靶核酸序列(例如，基因组靶核酸序列)的样品与可与靶核酸序列(例如，基因组靶核酸序列)特异性杂交或对靶核酸序列(例如，基因组靶核酸序列)特异性的标记探针接触。载玻片任选进行预处理，例如去除石蜡或其他可能干扰均匀杂交的材料。样品和探针都进行处理，例如通过加热使双链核酸变性。探针(在合适的杂交缓冲液中配制)和样品在允许杂交发生(通常达到平衡)的条件和足够的时间下组合。洗涤染色体制备物以去除多余的探针，并使用标准技术进行染色体靶标的特异性标记的检测。
例如，可以使用荧光素标记的亲和素或亲和素-碱性磷酸酶检测生物素化探针。对于荧光染料检测，可以直接检测荧光染料，或者可以将样品与例如异硫氰酸荧光素(FITC)-缀合的亲和素一起孵育。如果需要，可以通过与生物素缀合的山羊抗生物素蛋白抗体一起孵育、洗涤并与FITC缀合的亲和素进行第二次孵育来实现FITC信号的扩增。为了通过酶活性进行检测，可以将样品与例如链霉亲和素一起孵育、洗涤、与生物素缀合的碱性磷酸酶一起孵育、再次洗涤并预平衡(例如，在碱性磷酸酶(AP)缓冲液中)。对于原位杂交过程的一般描述，参见例如，美国专利第4,888,278号。
FISH、CISH和SISH的多种过程是本领域已知的。例如，用于进行FISH的过程描述于美国专利号5,447,841；5,472,842；和5,427,932中；和例如，Pir1kel et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.83:2934-2938,1986；Pinkel et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.85:9138-9142,1988；和Lichter et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.85:9664-9668,1988中。CISH描述于例如Tanner et al.,Am..1.Pathol.157:1467-1472,2000和美国专利号U.S.6,942,970中。其他检测方法提供于美国专利号6,280,929中。
许多试剂和检测方案可以与FISH、CISH和SISH过程结合使用，以提高灵敏度、分辨率或其他所需的特性。如上述讨论，用荧光团(包括荧光染料和QUANTUM
Figure BDA0003148874070000611
)标记的探针在进行FISH时可以直接进行光学检测。或者，探针可以用非荧光分子标记，诸如半抗原(如以下非限制性实例：生物素、地高辛、DNP和各种恶唑、吡唑、噻唑、硝基芳基、苯并呋喃、三萜、尿素、硫脲、鱼藤酮、香豆素、基于香豆素的化合物、鬼臼毒素、基于鬼臼毒素的化合物及其组合)、配体或其他间接检测的部分。然后可以通过将样品(例如，探针所结合的细胞或组织样品)与标记的检测试剂接触来检测用此类非荧光分子(以及它们结合的靶核酸序列)标记的探针，所述检测试剂为例如对所选半抗原或配体具有特异性的抗体(或受体或其他特异性结合配偶体)。检测试剂可以用荧光团(例如，QUANTUM
Figure BDA0003148874070000621
)或另一种可间接检测的部分标记，或者可以与一种或多种可以用荧光团标记的额外的特异性结合剂(例如，二抗或特异性抗体)接触。
在其他实例中，将探针或特异性结合剂(诸如抗体，例如一抗、受体或其他结合剂)用能够将荧光或显色组合物转化为可检测的荧光、有色的组合物或其他可检测信号(例如，SISH中可检测金属颗粒的沉积)的酶标记。如上所述，酶可以通过接头直接或间接连接到相关探针或检测试剂。合适的试剂(例如，结合试剂)和化学(例如，接头和连接化学)的实例描述于美国专利申请公开号2006/0246524；2006/0246523和2007/01 17153中。
本领域技术人员将理解，通过适当选择标记的探针特异性结合剂对，可以产生多重检测方案以促进在单个测定(例如，在单个细胞或组织样品上或在一个以上的细胞或组织样品上)中检测多个靶核酸序列(例如，基因组靶核酸序列)。例如，对应于第一靶序列的第一探针可用第一半抗原诸如生物素标记，而对应于第二靶序列的第二探针可用第二半抗原诸如DNP。在将样品暴露于探针后，可以通过将样品与第一特异性结合剂(在这种情况下用第一荧光团标记的亲和素，例如第一光谱不同的QUANTUM
Figure BDA0003148874070000622
例如，在585mn发射)和第二个特异性结合剂(在这种情况下用第二个荧光团标记(例如，第二光谱不同的QUANTUM
Figure BDA0003148874070000623
例如，在705mn发射)的抗DNP抗体或抗体片段)。可以使用其他光谱不同的荧光团将其他的探针/结合剂对添加到多重检测方案中。可以预期直接和间接(一步、两步或更多)的多种变化，所有这些都适用于公开的探针和测定的上下文。
探针通常包含长度为10-1000个核苷酸(例如10-800，更优选15-700，通常20-500)的单链核酸。引物通常是长度为10-25个核苷酸的较短的单链核酸，设计为完全或几乎完全匹配目标核酸，以进行扩增。探针和引物对它们杂交的核酸是“特异性的”，即它们优选在高严格杂交条件下杂交(对应于最高解链温度Tm，例如50％甲酰胺、5x或6x SCC。SCC是0.15MNaCl，0.015M柠檬酸钠)。
上述扩增和检测方法中使用的核酸引物或探针可以组装成试剂盒。这种试剂盒包括共有引物和分子探针。优选的试剂盒还包括确定是否发生扩增所必需的组件。该试剂盒还可以包括，例如，PCR缓冲液和酶；阳性对照序列、反应对照引物；以及扩增和检测特定序列的指引。
在一些实施方案中，本发明的方法包括以下步骤：提供从卵丘细胞提取的总RNA，并将RNA扩增和杂交到特定探针，更具体地通过定量或半定量RT-PCR。
在一些实施方案中，所述水平由DNA芯片分析测定。这种DNA芯片或核酸微阵列由化学连接到底物的不同核酸探针组成，底物可以是微芯片、载玻片或微球大小的珠子。微芯片可由聚合物、塑料、树脂、多糖、二氧化硅或二氧化硅基材料、碳、金属、无机玻璃或硝化纤维构成。探针包含核酸，诸如可以是约10至约60个碱基对的cDNA或寡核苷酸。为了测定所述水平，将来自测试患者的样品任选首先进行逆转录，标记并在杂交条件下与微阵列接触，导致在靶核酸之间形成复合物，所述复合物与附着在微阵列表面的探针序列互补。然后将标记的杂交复合物进行检测并且可以定量或半定量。标记可以通过各种方法实现，例如通过使用放射性或荧光标记。本领域技术人员可获得微阵列杂交技术的许多变体(例如参见Hoheisel,Nature Reviews,Genetics,2006,7:200-210的综述)。
在一些实施例中，
Figure BDA0003148874070000632
分析系统用于检测内在基因表达。
Figure BDA0003148874070000631
分析系统的基础是分配给每个待测定核酸靶标的唯一代码(国际专利申请公开号WO 08/124847、美国专利号8,415,102和Geiss et al.Nature Biotechnology.2008.26(3):317-325；其内容均通过引用以其整体并入本文)。该代码由一系列有序的彩色荧光点组成，其为每个待检测的目标创建独特的条形码。为每个DNA或RNA靶标设计了一对探针，即一个生物素化捕获探针和一个携带荧光条形码的报告探针。该系统在本文中也称为纳米报告基因编码系统。为每个靶标合成特定的报告基因和捕获探针。报告基因探针可以包含至少一个第一标记连接区，其连接有一个或多个发出构成第一信号的光的标记单体；至少一个第二标记连接区，其与第一标记连接区不重叠，其连接有一个或多个发出构成第二信号的光的标记单体；和第一靶标特异性序列。优选地，每个序列特异性报告基因探针包含能够与不超过一个基因杂交的靶特异性序列并且任选包含至少三个或至少四个标记连接区，所述连接区包含一个或多个发出分别构成至少第三信号或至少第四信号的光的标记单体。捕获探针可以包含第二靶特异性序列；和第一亲和标签。在一些实施方案中，捕获探针还可包含一个或多个标记连接区。优选地，报告基因探针的第一靶特异性序列和捕获探针的第二靶特异性序列与待检测的相同基因的不同区域杂交。报告基因探针和捕获探针都汇集到单个杂交混合物中，即“探针库”。在单个多重杂交反应中测量每个靶标的相对丰度。该方法包括将肿瘤组织样品与探针库接触，使得样品中靶标的存在产生探针对-靶标复合物。然后纯化复合物。更具体地，将样品与探针库混合，并且在溶液中发生杂交。杂交后，将三方杂交复合物(探针对和靶标)在两步过程中使用磁珠进行纯化，该磁珠与捕获和报告基因探针上存在的通用序列互补的寡核苷酸相连。这种双重纯化过程使得使用大量过量的靶特异性探针完成杂交反应，它们最终被去除，因此不会干扰样品的结合和成像。所有后杂交步骤都在定制的液体处理机器人(Prep Station,NanoString Technologies)上自动处理。纯化的反应通常由Prep Station沉积到样品盒的单个流动池中，通过捕获探针与链霉亲和素包被的表面结合，进行电泳以延长报告基因探针，并固定。处理后，将样品盒转移到全自动成像和数据收集设备(Digital Analyzer,NanoString Technologies)。通过对每个样本进行成像并计数检测到该靶标代码的次数来测量靶标的水平。对于每个样品，通常成像600个视场(FOV)(1376X 1024像素)，代表约10mm2的结合表面。根据多路复用程度、样本输入量和总体目标丰度，典型的成像密度是每个视场100-1200个计数报告基因。数据以简单的电子表格格式输出，列出每个靶标、每个样本的计数。该系统可与纳米报告基因一起使用。关于纳米报告基因的其他公开可以在国际公开WO 07/076129和WO07/076132以及美国专利公开号2010/0015607和2010/0261026中找到，其内容以其整体并入本文。此外，术语核酸探针和纳米报告基因可以包括在国际公开号WO 2010/019826和美国专利公开号2010/0047924(其通过引用整体并入本文)中描述的合理设计的(例如合成序列)。
基因的表达水平可以表示为绝对水平或标准化水平。通常，通过将基因的表达和与确定患者癌症分期无关的基因(例如，组成型表达的管家基因)的表达进行比较来校正基因的绝对水平，以将水平标准化。用于标准化的合适基因包括管家基因，诸如肌动蛋白基因ACTB、核糖体18S基因、GUSB、PGK1和TFRC。这种标准化允许将一个样品(例如患者样品)的水平与另一个样品，或来自不同来源的样品之间的水平进行比较。
本发明的另一个目的涉及在有需要的患者中治疗癌症的方法，包括i)测定从患者获得的肿瘤组织样品中NRP-1或信号素3A的表达水平，ii)将步骤i)测定的表达水平与预定参考值比较和iii)当步骤i)测定的表达水平低于预定参考水平时，向患者施用免疫检查点抑制剂。
通过以下附图和实施例进一步说明本发明。但是，这些实施例和附图不应以任何方式解释为限制本发明的范围。
附图说明
图1：肿瘤浸润四聚体H2kb/SIINFEKL小鼠CD8+T细胞中的Nrp1表达。将B16F10-OVA肿瘤细胞皮下注射到WT C57BL/6小鼠的右翼。注射肿瘤后第7天和第14天，用组合的Poly-IC/卵清蛋白皮下免疫小鼠。注射后21天收获肿瘤，使用四聚体H2kb-SIINFEKL、抗CD8和抗Nrp1染色肿瘤浸润CD8+T细胞，并通过流式细胞术分析。流式细胞术图显示使用抗CD8抗体和四聚体H2kb-OVA的数据。四聚体H2kb-OVA阳性群体呈现在归一化模式的Nrp1表达的柱状图中。数据代表3个独立实验。
图2：根据在第6、8、15和30天用LCMV Armstrong(n＝16)、LCMV克隆13(n＝16)或来自对照的初始CD44低CD8+T细胞(n＝4)在小鼠体内感染，H2-Db GP33特异性CD8+T细胞中的NRP1表达谱。转录组学分析的数据可从Doering et al.Immunity,2012获得。P值由双向ANOVA确定(p＝0.0008)。
图3：抗肿瘤免疫应答模型中B16F10肿瘤体积随访。CD8+Nrp1KO(KO)小鼠或CD8CRE(WT)小鼠在第0天在右翼接受100万个B16F10，然后在第7天和第14天以40μg PolyIC和400μg卵清蛋白/小鼠皮下注射Poly-IC/卵清蛋白来免疫。数据表示为注射后第0、8、11、14、18、21天的肿瘤体积平均值+/-SEM。数据代表3个独立实验。
图4：在免疫后第14天通过流式细胞术评估来自用卵清蛋白和poly-IC免疫或未免疫(对照)的CD8Nrp1KO(KO)和对照(WT)小鼠四个不同小鼠组的B16-OVA肿瘤中四聚体/PE-H-2Kb OVA CD8+TIL的百分比。数据表示为CD8+TIL四聚体阳性±SEM的平均百分比。P值由StudentT检验确定**p<0.01，*p<0.05。数据代表3个独立实验。
图5：活化的CD8+T细胞和细胞示踪紫标记的A20细胞之间的同种异体突触模型中NRP1表达(平均像素强度/MPI)的图像流的定量。在突触连接处(高的鬼笔环肽标记区)的活化的CD8+T细胞中分析NRP1表达。数据表示为平均值MPI±SEM。P值(p<0.0001)由Wilcoxon配对检验确定。数据是来自2个突触模型的4个独立实验的代表。
图6：PD1被募集入活化的CD8+T细胞和肿瘤细胞之间的突触内。在活化的CD8+T细胞和同种异体A20肿瘤细胞之间的突触模型中通过图像流分析PD1表达(平均像素强度/MPI)：在活化的CD8+T细胞和肿瘤细胞(A20)之间的鬼笔环肽高区域中分析PD1表达。数据表示为平均值MPI±SEM。P值由Student T检验确定。数据代表5次实验。
图7：人CD8+TIL中NRP1和PD1表达的流式细胞术分析。数据代表人子宫内膜癌、肾癌和卵巢癌的3个独立实验。
图8：来自CD8Nrp1KO小鼠(KO)或对照(WT)的活化的CD8+T细胞和同种异体A20肿瘤细胞之间突触连接处(高的鬼笔环肽标记区)中PD1表达(MPI)的图像流的定量。数据表示为平均值MPI±SEM。P值(p<0.0001)由Mann Whitney检验确定。数据代表2个独立实验。
图9：来自CD8Nrp1KO小鼠(KO)或对照(WT)的活化的CD8+T细胞和细胞示踪紫标记的A20肿瘤细胞之间的突触连接处(高的鬼笔环肽标记区)中磷酸-ZAP70量(平均像素强度/MPI)的图像流的定量。数据表示为平均值MPI±SEM。P值(p<0.0001)由Mann Whitney检验确定。数据代表3个独立实验。
图10：根据NRP1表达对人PD1+CD8+TIL中的磷酸-ZAP70进行流式细胞术分析。数据代表人子宫内膜癌的一个实验。
图11：来自携带NRP1单倍体不足的患者(患者)或来自对照(N＝5)的CD8+T细胞中CD25表达的流式细胞术分析，对应于存在或不存在抗PD1抗体的情况下SEB超抗原浓度(0、1、10或100ng/mL)。在72小时期间进行活化。数据表示为CD25表达的平均值％±SEM。人抗PD1抗体(派姆单抗，Merck)。
图12：来自携带NRP1单倍体不足的患者(患者)或来自对照(N＝5)的分裂CD8+T细胞百分比的流式细胞术分析，对应于存在或不存在抗PD1抗体的情况下SEB超抗原浓度(0、1、10或100ng/mL)。在72小时期间进行活化。数据表示为平均值±SEM。人抗PD1抗体(派姆单抗，Merck)。
图13：CD8Nrp1KO(KO)和对照(WT)小鼠用卵清蛋白和poly-IC进行预免疫，并用抗PD1抗体体内处理或不处理。评估总生存活率直至免疫后50天。数据表示为平均值±SEM和Kaplan Meyer曲线。P值通过Log rank检验确定。数据代表5次实验。来自Bio X Cell(J43克隆)的小鼠抗PD1抗体。
图14：根据抗PD1治疗前在肿瘤中评估的RNA NRP1表达(低或高表达)，用抗PD1治疗的转移性黑色素瘤患者的总生存率。转移性黑色素瘤的转录组学分析数据可从Hugo etal.Cell,2016得到。数据显示为Kaplan Meyer曲线。P值(p＝0.03)通过Log rank秩检验(n＝25名患者)确定。
图15：根据开始治疗前通过免疫组织化学评估的CD8+TIL中的NRP1表达(NRP1-/低与NRP1+/高相比)，用抗PD1治疗并至少达到部分响应的转移性黑色素瘤患者的无复发生存率的分析。已进行盲法分析以评估NRP1表达。数据表示为Kaplan Meyer曲线。P值(p＝0.042)通过Log rank秩检验(n＝15名患者)确定。
图16：具有肿瘤细胞(Raji)的突触中的人活化的CD8+T细胞中磷酸-ZAP70量(平均像素强度/MPI)的图像流的定量。数据表示为平均值MPI±SEM。P值由Mann Whitney检验确定。人抗NRP1抗体(AF3870，R&D systems)，人抗PD1抗体(派姆单抗，Merck)。
具体实施方式
概述：
通过释放耗尽的CD8+T细胞从而恢复抗肿瘤免疫应答，靶向免疫检查点诸如程序性细胞死亡1(PD1)改进了癌症患者的生存率1,2。然而，大多数患者复发或对免疫检查点阻断疗法无效。神经毡蛋白-1(NRP1)是神经系统和血管生成胚胎发育所需的跨膜糖蛋白3,4。NRP1也在几种类型的免疫细胞中表达并参与免疫突触的形成、激活和终止5-7。NRP1通过调节巨噬细胞和Treg活性来削弱抗肿瘤免疫应答8-10。在本文，我们表明NRP1在PD1+CD8+T细胞的溶细胞突触中被募集，相互作用并增强PD-1活性。在小鼠中，CD8+T细胞的Nrp1特异性缺失改进自发性和抗PD1抗体抗肿瘤免疫应答。同样，在人转移性黑色素瘤中，肿瘤浸润性CD8+T细胞中的NRP1表达预示用抗PD1治疗的患者的预后不好。最后，通过增加肿瘤细胞的突触中CD8+T细胞中的TCR信号传导，抗NRP1和抗PD1抗体的组合在人中具有协同作用，特别是在CD8+T细胞抗肿瘤响应中。
结果：
尽管PD1是耗尽的关键因素，但其表达不足以诱导CD8+T细胞中的耗尽。例如，在小鼠LCMV克隆13感染模型中，大多数抗原特异性CD8+T细胞已被诱导，同时在抗原撤除后保持PD1表达，一旦新LCMV抗原挑战，这些CD8+T细胞的一部分保留了它们产生细胞因子的能力11。这一观察表明潜在的其他配偶体的参与。由于NRP1无法自主发出信号12，并且还在突触水平，活化的T细胞中表达，我们假设NRP1可能参与PD1抑制活性。体外NRP1在OVA肽驱动激活后在鼠CD8+T细胞上表达，并且其表达强度与抗原可用性呈正相关。为了在体内研究NRP1在CD8+T细胞上的表达，我们研究了3种急性或持续性抗原特异性免疫模型。如之前所报道13,14，NRP1未在初始CD8+T细胞上表达(数据未显示)。相比之下，活化的特异性CD8+T细胞在腺相关病毒-OVA肌内免疫(AAV-OVA)后表达NRP1，其中表达峰值在免疫后第21天。与LCMV Armstrong感染相比(图2)，NRP1在B16-OVA肿瘤进展模型中的小鼠特异性抗OVA257CD8+TIL(图1)和LCMV克隆13病毒感染耗尽模型中的特异性CD8+T细胞中高度表达。
为了进一步研究NRP1表达在体内CD8+T细胞中的作用，通过用CD8CreTg小鼠培育Nrp1flox/flox小鼠，我们得到了小鼠模型，其中CD8+T细胞对Nrp1特异性无效(CD8Nrp1KO)。在稳定状态下，CD8Nrp1KO小鼠没有免疫表型，并且如所预期，CD8+T细胞在激活时不表达NRP1。在抗原特异性抗肿瘤免疫应答中，与对照相比，CD8Nrp1KO小鼠中肿瘤生长显著降低(图3)。因此，对CD8Nrp1KO和对照小鼠的肿瘤免疫微环境的分析表明CD8Nrp1KO小鼠中CD8+TIL频率增加(图4)。这些结果表明CD8+TIL上NRP1表达可能参与了抗肿瘤免疫应答的负调控。
由于我们之前报道NRP1参与了T细胞和树突细胞之间的免疫突触5，我们随后研究了NRP1是否可以定位在T细胞和肿瘤细胞之间的突触中，从而参与在此特定上下文中的CD8+TIL的效应子功能。为了解决该问题，我们开发了转基因TCR OT1 T细胞和携带同源抗原(OVA257)的肿瘤细胞(EL4-CFP细胞)之间以及来自CD8Nrp1KO小鼠或同窝出生的，和同种异体肿瘤细胞(A20细胞)的活化CD8+T细胞之间的突触模型。在这些模型中，细胞缀合物的成像流式细胞术分析显示NRP1和PD1一起被募集到活化的CD8+T细胞和肿瘤细胞之间的突触(图5-6)。
由于之前报道PD1和TCR的聚集和共定位对于响应PD-L1与PD-1的结合(这表征了耗尽突触)在突触连接处诱导低水平的磷酸-ZAP70至关重要15,16，然后我们研究了NRP1是否参与突触的PD1募集和功能。首先，通过免疫荧光，我们发现在体内PD1和NRP1共定位于来自小鼠的CD8+TIL(数据未显示)，并且NRP1在人PD1+CD8+TIL上特异性表达(图7)。NRP1和PD1之间的相互作用在体外通过邻位连接测定(Duolink)在活化的小鼠CD8+T细胞上得到证实(数据未显示)。在进行免疫共沉淀实验时，我们为蛋白质复合物中的这种相互作用提供了其他的证据(数据未显示)。在CD8Nrp1KO CD8+T细胞中，虽然表达了PD1，但与来自WT小鼠的CD8+T细胞相比，其在具有肿瘤细胞的突触中的定位显著降低(图8)。因此，与对照相比，肿瘤细胞的突触中来自CD8Nrp1KO的CD8+T细胞中的磷酸-ZAP70增加(图9)。总之，我们的数据表明NRP1是PD1的配偶体，增强了其在CD8+T细胞和肿瘤细胞之间的突触中的募集和活性。
我们接下来研究了小鼠中NRP1耗尽的作用在人CD8+T细胞中是否适用。在人肿瘤微环境中，在CD8+TIL，特别是在PD1+CD8+T细胞上发现了NRP1表达，并鉴定了具有低磷酸-ZAP70表达的PD1+CD8+TIL亚群(磷酸-ZAP70低NRP1+PD1+CD8+TIL)(图10)。迄今为止，尚未报道携带纯合NRP1突变的患者，可能是由于纯合NRP1缺失在子宫内的致死性17。然而，我们可以鉴定独特的患者具有由包括NRP1基因的染色体区域(10p11.22)的杂合缺失引起的NRP1单倍体不足。在体外被葡萄球菌肠毒素b(SEB)超抗原激活后，来自NRP1+/-患者的CD8+T细胞增殖和表达CD25的能力增强(图11-12)。此外，患者CD8+T细胞活化的增加与抗PD1抗体相结合具有协同作用。
为了解决PD1和NRP1之间的这种协同效应，我们评估了抗PD1抗体在B16-OVA肿瘤生长小鼠模型中的体内功效。如之前在该模型中所报道，抗PD1处理对WT小鼠的总生存率没有影响。相比之下，在CD8Nrp1KO中观察到小鼠生存率显著增加，这在抗PD1处理后更为明显，表明具有强协同作用(图13)。
为了评估NRP1在人癌症中的作用，我们接下来进行计算机分析研究，分析在临床试验中用抗PD1疗法治疗的转移性黑色素瘤癌症的微阵列数据19(图14)。根据我们的假设，治疗前肿瘤中NRP1的低表达与患者总生存率的改善有关(p＝0.040)。由于NRP1可能在CD8+T细胞以外的其他细胞中表达，根据开始治疗前NRP1在CD8+TIL中的表达，我们随后研究了28名用抗PD1治疗的转移性黑色素瘤患者的结果。根据我们的假设，我们发现与NRP1+/高CD8+TIL相比，NRP1-/低CD8+TIL患者的完全缓解率最高(数据未显示)和无复发生存率显著增加的趋势(p＝0.042，图15)。综上所述，我们的数据表明NRP1应视为通过增强CD8+TIL上的PD1活性而导致耗尽的新作用物。
最后，我们证明抗NRP1和抗PD1抗体的组合在人抗肿瘤免疫应答中具有协同作用。事实上，在人活化的CD8+T细胞和肿瘤细胞(Raji)之间的体内突触模型中，与单独的抗PD1抗体相比，该组合诱导了CD8+T细胞中磷酸-ZAP70表达的增加(以及因此TCR信号传导)(图 16)。
讨论：
通过作为先天免疫和适应性免疫的中断，NRP1已经参与了针对肿瘤的免疫应答8-10。免疫检查点疗法已在癌症患者中获得多项成功1,2。不幸的是，即使联合免疫检查点抑制剂，大多数患者仍复发或难以治疗20。我们在人中的观察数据表明，抑制NRP1可能是改进抗PD1疗效的潜在治疗策略。关于安全性，在评估与抗PD1治疗相关性的小鼠实验中没有副作用报道(数据未显示)。此外，用抗PD1治愈B16-OVA肿瘤细胞的CD8Nrp1KO小鼠没有表现出任何自身免疫或炎症表型。这一观察结果证明了使用能够降低NRP1表达的药物或阻断CD8+T细胞上NRP1和PD1的抗体的潜在安全性。
本文，我们报告了CD8+T细胞上Nrp1的特异性缺失显著增强了携带B16-OVA肿瘤的小鼠的生存率，其中通过增加抗PD1疗法有可能治愈。此外，我们发现抗NRP1和抗PD1抗体的组合在人CD8+T细胞抗肿瘤免疫应答中具有协同作用。因此，我们的数据表明，单独使用NRP1缺失的CD8+CAR-T细胞或与免疫检查点抑制剂(例如抗PD1抗体)组合使用的策略可能是提高CAR-T细胞功效的一种方式。此外，我们的数据表明，双特异性抗NRP1/PD1抗体可能是提高免疫检查点抑制剂(例如抗PD1抗体)功效的一种方式。
总之，我们已经鉴定NRP1为新的免疫检查点，它通过在突触水平增强PD-1抑制作用，通过原始机制起作用，并且我们的数据强烈表明NRP1单独的治疗抑制作用，或与免疫检查点抑制剂(例如抗PD1抗体)组合可以有效抑制人癌症中的肿瘤生长。
参考文献：
在本申请中，各种参考文献描述了本发明所属领域的现状。这些参考文献的公开在此通过引用并入本公开。
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Claims (36)

1.一种增加患有癌症的患者中肿瘤浸润CD8+T细胞的量的方法，包括向所述患者施用治疗有效量的NRP-1抑制剂。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述NRP-1抑制剂是对NRP-1具有结合亲和力的抗体，特别是结合NRP-1的结构域c的抗体、对结合信号素3A的NRP-1区域具有结合亲和力的抗体或对SEQ ID NO：1中第1位氨基酸残基至第280位氨基酸残基范围内的氨基酸序列具有结合亲和力的抗体。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述抗体不抑制VEGF与NRP-1的结合。
4.根据权利要求2所述的方法，其中所述抗NRP-1抗体包含：
-包含以下互补决定区(CDR)氨基酸序列的轻链可变结构域：VL-CDR1(RASQSISSYLA；SEQ ID NO:3)、VL-CDR2(GASSRAS；SEQ ID NO:4)和VL-CDR3(QQYMSVPIT；SEQ ID NO:5)和
-包含以下CDR氨基酸序列的重链可变结构域：VH-CDR1(GFSFSSEPIS；SEQ ID NO:6),VH-CDR2(SSITGKNGYTYYADSVKG；SEQ ID NO:7)和VH-CDR3(WGKKVYGMDV；SEQ ID NO:8)。
5.根据权利要求2所述的方法，其中所述抗NRP-1抗体包含SEQ ID NO:9的轻链可变结构域序列和/或SEQ ID NO:10的重链可变结构域序列。
6.根据权利要求2所述的方法，其中所述抗NRP-1抗体与包含以下的抗体交叉竞争结合NRP-1同源异构体：
-包含以下互补决定区(CDR)氨基酸序列的轻链可变结构域：VL-CDR1(RASQSISSYLA；SEQ ID NO:3)、VL-CDR2(GASSRAS；SEQ ID NO:4)和VL-CDR3(QQYMSVPIT；SEQ ID NO:5)和
-包含以下CDR氨基酸序列的重链可变结构域：VH-CDR1(GFSFSSEPIS；SEQ ID NO:6),VH-CDR2(SSITGKNGYTYYADSVKG；SEQ ID NO:7)和VH-CDR3(WGKKVYGMDV；SEQ ID NO:8)。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述NRP-1抑制剂由包含NRP-1的结构域c的多肽；包含NRP-1跨膜结构域的多肽或包含SEQ ID NO：1中第1位氨基酸残基至第280位氨基酸残基范围内的氨基酸序列的多肽组成。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述NRP-1抑制剂是NRP-1表达的抑制剂。
9.一种在有需要的患者中治疗癌症的方法，包括向患者施用治疗有效量的NRP-1抑制剂。
10.根据权利要求6所述方法，包括i)定量从所述患者获得的肿瘤组织样品中CD8+T细胞的密度，ii)将步骤i)定量的密度与预定的参考值比较，和iii)向患者施用治疗有效量的NRP-1抑制剂。
11.一种用于增强向患者施用的免疫检查点抑制剂的效力的方法，所述免疫检查点抑制剂作为治疗方案的一部分，所述方法包括向患者联合施用药学有效量的NRP-1抑制剂与免疫检查点抑制剂。
12.一种在有需要的患者中治疗癌症的方法，包括向患者施用免疫检查点抑制剂与NRP-1抑制剂的治疗有效的组合，其中相对于单独施用免疫检查点抑制剂，组合的施用导致增强的治疗功效。
13.根据权利要求9所述方法，其中所述免疫检查点抑制剂是选自以下的抗体：抗CTLA4抗体、抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗PD-L2抗体、抗TIM-3抗体、抗LAG3抗体、抗B7H3抗体、抗B7H4抗体、抗BTLA抗体和抗B7H6抗体。
14.根据权利要求13所述方法，其中所述抗PD-1抗体是纳武单抗或派姆单抗。
15.一种在有需要的患者中治疗癌症的方法，包括向患者施用治疗有效量的多特异性抗体，所述多特异性抗体包含至少一个特异性结合PD-1的结合位点和至少一个特异性结合NRP-1的结合位点。
16.根据权利要求11所述方法，其中所述多特异性抗体是双特异性抗体。
17.一种在有需要的患者中治疗癌症的方法，包括向患者联合施用治疗有效量的NRP-1抑制剂和癌症疫苗。
18.一种预测癌症患者是否会对免疫检查点抑制剂产生应答的方法，包括i)测定来自患者的肿瘤样品中NRP-1或信号素3A的表达水平，和ii)将在步骤i)中测定的表达水平与预定参考值比较，和iii)当在步骤i)中测定的表达水平低于预定参考值时，得出结论患者会对免疫检查点抑制剂产生应答，或当在步骤i)中测定的表达水平高于预定参考值时，得出结论患者不会对免疫检查点抑制剂产生应答。
19.根据权利要求13所述的方法，进一步包括测定CD8的表达水平。
20.一种在有需要的患者中治疗癌症的方法，包括i)测定从患者获得的肿瘤组织样品中NRP-1或信号素3A的表达水平，ii)将步骤i)测定的表达水平与预定参考值比较和iii)当步骤i)测定的表达水平低于预定参考水平时，向患者施用免疫检查点抑制剂。
21.一种多特异性抗体，包含至少一个特异性结合PD-1的结合位点和至少一个特异性结合NRP-1的结合位点。
22.根据权利要求17所述的多特异性抗体，其为双特异性抗体。
23.根据权利要求17所述的多特异性抗体，包含特异性结合NRP-1并且包含轻链可变结构域和重链可变结构域的第一结合位点，所述轻链可变结构域包含以下互补决定区(CDR)氨基酸序列：VL-CDR1(RASQSISSYLA；SEQ ID NO:3)、VL-CDR2(GASSRAS；SEQ ID NO:4)和VL-CDR3(QQYMSVPIT；SEQ ID NO:5)，所述重链可变结构域包含以下CDR氨基酸序列：VH-CDR1(GFSFSSEPIS；SEQ ID NO:6)、VH-CDR2(SSITGKNGYTYYADSVKG；SEQ ID NO:7)和VH-CDR3(WGKKVYGMDV；SEQ ID NO:8)。
24.根据权利要求17所述的多特异性抗体，包含特异性结合NRP-1并且包含SEQ ID NO:9的轻链可变结构域(VL)序列和SEQ ID NO：10的重链可变结构域(VH)序列的第一结合位点。
25.根据权利要求17所述的多特异性抗体，包含特异性结合PD-1且包含SEQ ID NO:11的VH结构域和SEQ ID NO:12的VL结构域的第二结合位点。
26.根据权利要求17所述的多特异性抗体，包含特异性结合PD-1并且包含SEQ ID NO:15的VH结构域和SEQ ID NO:16的VL结构域的第二结合位点。
27.根据权利要求17所述的多特异性抗体，包含：
-特异性结合NRP-1并且包含SEQ ID NO:9的轻链可变结构域(VL)序列和SEQ ID NO:10的重链可变结构域(VH)序列的第一结合位点，和
-特异性结合PD-1并且包含SEQ ID NO:11的VH结构域和SEQ ID NO:12的VL结构域的第二结合位点。
28.根据权利要求17所述的多特异性抗体，包含：
-特异性结合NRP-1并且包含SEQ ID NO:9的轻链可变结构域(VL)序列和SEQ ID NO:10的重链可变结构域(VH)序列的第一结合位点，和
-特异性结合PD-1并且包含SEQ ID NO:15的VH结构域和SEQ ID NO:16的VL结构域的第二结合位点。
29.根据权利要求17所述的多特异性抗体，其用于治疗癌症。
30.工程化以表达嵌合抗原受体(CAR)的细胞群，其中所述细胞中NRP-1的表达被抑制。
31.根据权利要求21所述的细胞群，其中所述细胞选自T细胞如肿瘤浸润细胞(TILS)、CD4+T细胞或CD8+T细胞和干细胞。
32.根据权利要求21所述的细胞群，其中所述至少一种免疫检查点蛋白的表达被抑制。
33.一种制备表达CAR的细胞的方法，包括由以下组成的步骤：i)将编码CAR的核酸引入细胞和ii)使细胞与核酸内切酶系统接触以抑制NRP-1的表达。
34.根据权利要求24所述的方法，包括由以下组成的步骤：i)将编码CAR的核酸引入细胞和ii)使细胞与Cas蛋白和至少一种向导RNA分子(gRNA)接触，所述向导RNA分子包含靶向NRP-1基因的序列和能够结合Cas蛋白的序列。
35.根据权利要求25所述的方法，进一步包括将所述细胞与至少一种向导RNA分子接触，所述向导RNA分子包含靶向编码免疫检查点蛋白(例如PD-1、CTLA-4……)的基因的序列。
36.一种在有需要的患者中治疗癌症的方法，包括向患者施用治疗有效量的权利要求21所述的T细胞群。
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