CN101326196A - 神经纤毛蛋白拮抗剂 - Google Patents

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Abstract

本发明披露了具有独特结构和功能特征的新的抗NRP1抗体及其变体。本发明还提供了所述抗体在研究、诊断和治疗应用中的用途。

Description

神经纤毛蛋白拮抗剂
本申请是2005年11月8日提交的临时申请No.60/734,798和2006年7月27日提交的临时申请No.60/820,561的非临时申请，依据35 USC 119(e)要求这两项临时申请的优先权，并通过参照将这两项临时申请的完整内容收入本文。
发明领域
一般而言，本发明涉及与神经纤毛蛋白/神经菌毛素(neuropilin，NRP)活性有关的组合物和方法。更具体的说，本发明关于调控神经纤毛蛋白-1(NRP1)受体介导的血管形成和维持的组合物和方法。本发明进一步涉及筛选治疗上可用于预防或治疗与血管发生有关的疾患和疾病的物质的方法。
发明背景
血管系统的发育是许多生理性和病理性过程的基本要求。活跃生长中的组织诸如胚胎和肿瘤要求充足的血液供应。它们通过生成促血管发生因子来满足这一需要，所述促血管发生因子经由一般称为血管发生(angiogenesis)的过程促进新血管形成和维持。血管形成是复杂但有序的生物学事件，牵涉所有或许多以下步骤：a)自已有的内皮细胞(EC)增殖出EC或自祖细胞分化出EC；b)EC迁移并接合以形成索样结构；c)血管索然后发生管发生(tubulogenesis)以形成具有中央内腔的血管；d)已有的索或血管伸出芽以形成次生血管；e)初级血管丛发生进一步重塑(remodeling)和整形(reshaping)；及f)内皮周细胞(peri-endothelial cell)被募集来包围内皮管，为血管提供维持和调节功能，此类细胞包括用于小毛细血管的周细胞、用于大血管的平滑肌细胞、和心脏中的心肌细胞。Hanahan，D.Science 277：48-50(1997)；Hogan，B.L.& Kolodziej，P.A.Nature Reviews Genetics.3：513-23(2002)；Lubarsky，B.&Krasnow，M.A.Cell.112：19-28(2003)。
现在完全确立了血管发生牵涉多种病症的发病机理。这些包括实体瘤和转移、动脉粥样硬化、晶状体后纤维组织增生、血管瘤、慢性炎症、眼内新血管疾病诸如增殖性视网膜病变例如糖尿病性视网膜病、年龄相关黄斑变性(AMD)、新生血管性青光眼、移植角膜组织和其它组织的免疫排斥、类风湿性关节炎、和银屑病。Folkman等，J.Biol.Chem.，267：10931-10934(1992)；Klagsbrun等，Annu.Rev.Physiol.53：217-239(1991)；Garner A.，″Vasculardiseases″，在Garner A和Klintworth GK编的《Pathobiology of Ocular Disease.A Dynamic Approach》第2版(Marcel Dekker，NY，1994)中，pp 1625-1710。
在肿瘤生长的情况中，血管发生对于自增生至瘤形成的转换，及为肿瘤的生长和转移提供营养似乎是至关重要的。Folkman等，Nature 339：58(1989)。新血管形成(neovascularization)让肿瘤细胞获得了与正常细胞相比的生长优势和增殖自治。肿瘤通常开始于单个异常细胞，由于与可利用毛细管床的距离，该细胞只能增殖至几立方毫米的尺寸，而且它能在较长的一段时间里保持“休眠”状态而不进一步生长和传播。有些肿瘤细胞然后转向血管发生表型以激活内皮细胞，所述内皮细胞增殖并成熟成新的毛细血管。这些新形成的血管不仅让原发性肿瘤继续生长，而且让转移性肿瘤细胞传播并再建群(recolonization)。因而，在肿瘤切片中的微血管密度与乳腺癌及数种其它肿瘤的患者存活之间观察到了相关性。Weidner等，N.Engl.J.Med324：1-6(1991)；Horak等，Lancet 340：1120-1124(1992)；Macchiarini等，Lancet340：145-146(1992)。尚未完全了解控制血管发生转换的精确机制，但是认为肿瘤块的新血管形成源自众多血管发生刺激物与抑制物的净平衡(Folkman，Nat Med 1(1)：27-31(1995))。
血管发育的过程受到紧密调节。迄今为止，多种分子，多为由周围细胞生成的分泌性因子，已显示出调节EC分化、增殖、迁移和接合成索样结构。例如，血管内皮生长因子(VEGF)已鉴定为牵涉刺激血管发生和诱导血管通透性的关键因子。Ferrara等，Endocr.Rev.18：4-25(1997)。甚至单个VEGF等位基因的遗失导致胚胎致死的发现指向此因子在血管系统的发育和分化中所发挥的不可代替的作用。此外，VEGF已显示为与肿瘤和眼内病症有关的新血管形成的关键介导物。Ferrara等，Endocr.Rev.见上文。VEGF mRNA在多数所检查的人肿瘤中过表达。Berkman等，J.Clin.Invest.91：153-159(1993)；Brown等，Human Pathol.26：86-91(1995)；Brown等，Cancer Res.53：4727-4735(1993)；Mattern等，Brit.J.Cancer 73：931-934(1996)；Dvorak等，Am.J.Pathol.146：1029-1039(1995)。
同样，眼部液体中VEGF的浓度水平与糖尿病性和其它缺血相关视网膜病患者中的活泼血管增殖的存在高度相关。Aiello等，N.Engl.J.Med.331：1480-1487(1994)。此外，研究证明了VEGF在AMD患者脉络膜新血管膜中的定位。Lopez等，Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.37：855-868(1996)。
抗VEGF中和性抗体在裸鼠中遏制多种人肿瘤细胞系的生长(Kim等，Nature 362：841-844(1993)；Warren等，J.Clin.Invest.95：1789-1797(1995)；
Figure A20068004583900061
等，Cancer Res.56：4032-4039(1996)；Melnyk等，Cancer Res.56：921-924(1996))，而且在缺血性视网膜病症模型中还抑制眼内血管发生。Adamis等，Arch.Ophthalmol.114：66-71(1996)。因此，抗VEGF单克隆抗体或其它VEGF作用抑制剂是有希望用于治疗肿瘤和多种眼内新血管病症的候选物。此类抗体记载于例如1998年1月14日公开的EP 817,648和1998年10月15日公开的WO98/45331和WO98/45332。抗VEGF抗体之一，贝伐单抗已获FDA批准与化疗方案联合用于治疗转移性结肠直肠癌(CRC)和非小细胞肺癌(NSCLC)。而且，贝伐单抗正在许多进行中的治疗各种癌症适应证的临床试验中进行调查。
在神经系统的发育过程中，神经元伸出缆样轴突，所述轴突迁移长距离以到达它们的靶点。见综述Carmeliet and Tessier-Lavigne(2005)Nature436：193-200。生长中的轴突的领先尖端是高度能动的感觉结构，称为生长锥。通过丝足伸展(filopodial extension)的伸展和收缩的动态循环，生长锥不断感觉和评估其空间环境中的众多提示，并精确选择正确航迹来延伸向其最终靶点。
在过去的十年里，在了解轴突导向机制方面取得了可观的进展。见综述Dickson(2002)Science 298：1959-64。导向提示来自四种：引诱物和驱除物；可以作用于近程(即细胞或基质相关的)或远程(即可扩散的)。迄今为止，已鉴定了四大族轴突导向分子：netrins(神经生长因子)、semaphorins(信号素)、ephrins和slits。见综述Huber et al(2003)Annu Rev Neurosci 26：509-63。
信号素(Sema)，也称作脑衰蛋白(collapsin)，属于一大族在系统发生上保守的分泌性和膜结合性蛋白质。信号素家族的成员能够在神经发育过程中介导驱除性和引诱性轴突导向事件。Raper(2000)Curr Opin Neurobiol10：88-94。迄今为止鉴定的超过三十种信号素都享有大约500个氨基酸的保守N-末端Sema结构域。信号素成员根据它们的结构相似性和物种起源归入八个亚家族。关于信号素统一命名法的更多详情见Semaphorin NomenclatureCommittee(1999)Cell 97：551-552。
神经纤毛蛋白/神经菌毛素(neuropilin，NRP)家族由两种同源蛋白质构成，神经纤毛蛋白-1(NRP1)和神经纤毛蛋白-2(NRP2)。NRP1首先鉴定为在生长中的轴突的生长锥中表达的I型130kDa跨膜糖蛋白。NRP2随后通过表达克隆得到鉴定。Fujisawa and Kitsukawa(1998)Curr Opin Neurobiol8：587-592。发现NRP是信号素的一个子集(即3类信号素)的受体。有人提出NRP与另一个信号素受体家族(即神经丛素(plexin))一起发挥非信号传导性共同受体的功能。
尽管最初描述为轴突导向的介导物，已发现NRP在血管发育中发挥至关重要的作用。Carmeliet and Tessier-Lavigne(2005)。它被鉴定为在肿瘤和内皮细胞上表达的同等型特异性VEGF受体，大大促进了对NRP在血管和肿瘤生物学中的作用的了解。Soker et al(1998)Cell 92：735-745；Klagsbrun et al(2002)Adv Exp MedBiol 515：33-48。遗传研究提供了有力的证据来证明Nrp1是血管形态发生所要求的。Nrp1功能的丧失导致血管重塑和分支缺陷，这种表型可以因Nrp2功能丧失而进一步增强。Kawasaki等(1999)Development126：4895-4902；Takashima等(2002)Proc Natl Acad Sci USA 99：3657-3662。这些结果说明在发育早期Nrp1和Nrp2可能具有重叠的功能。然而，每一种Nrp的表达在发育晚期隔开，Nrp1主要在动脉中表达，而Nrp2主要在静脉和淋巴管中表达。Yuan et al(2002)Development 129：4797-4806；Herzog等(2001)Mech Dev 109：115-119。注意，仅仅Nrp2功能的丧失特异性的削弱淋巴发育。
因为Nrp1在发育过程中在许多其它细胞类型中表达，所以通过生成EC特异性敲除(其导致与无效等位基因中所看到的类似的血管缺陷)得出了血管Nrp1的作用。Gu等(2003)Dev Cell 5：45-57。有趣的是，此研究还显示出Sema3A与NRP1结合不是血管发育所要求的。在另一项研究中，在Nrp1敲除胚胎的发育中的后脑的内皮顶端细胞的导向中观察到缺陷。Gerhardt等(2004)Dev Dyn 231：503-509。
尽管对NRP1在血管发育中的作用进行了广泛研究，仍然不清楚NRP1是否是专门通过VEGF-VEGF受体2(VEGFR2)途径(作为VEGF结合VEGFR2的增强剂并由此作为VEGFR2信号传导的增强剂)或通过不依赖VEGFR2的信号传导途径或二者的组合来发挥其血管功能的。
单克隆抗体可以使用重组DNA技术来制备。单克隆抗体得到了广泛使用，特别是那些衍生自啮齿类的单克隆抗体，然而非人抗体在人体中常常是抗原性的。本领域试图通过构建“嵌合”抗体来克服这个问题，在嵌合抗体中非人抗原结合结构域与人恒定域偶联(Cabilly等，美国专利No.4,816,567)。人恒定域的同种型可以选择成适合嵌合抗体参与抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)和补体依赖性细胞毒性的。在试图解决抗体的抗原结合功能和将人抗体中异源序列的使用最小化的另一项努力中，对多种抗原生成了人源化抗体，其中基本上小于整个人可变域被来自非人物种的相应序列替代。例如，将啮齿类残基用于替代人抗体的相应区段。在实践中，人源化抗体通常是这样的人抗体，其中一些互补决定区(CDR)残基及可能的一些框架区(FR)残基用啮齿类抗体中类似位点的残基替代。Jones等(1986)Nature321：522-525；Riechmann等(1988)Nature 332：323-327；Verhoeyen等(1988)Science 239：1534-1536。
在对人施用治疗性抗体之前，一般需要在非人哺乳动物中进行临床前研究以评估抗体的疗效和/或毒性。理想的是，进行这些研究的抗体能够识别靶抗原并以高效力与靶抗原起作用，其中所述靶抗原对于宿主动物诸如小鼠或非人灵长类是内源的。
噬菌体展示技术提供了用于生成和选择能与配体诸如抗原结合的新蛋白质的有力工具。使用噬菌体展示技术，可以生成蛋白质变体的大型文库并快速分拣那些能以高亲和力与靶抗原结合的序列。将编码变异多肽的核酸与编码病毒外壳蛋白诸如基因III蛋白或基因VIII蛋白的核酸序列融合。已经开发了单价噬菌体展示系统，其中将编码蛋白质或多肽的核酸序列与编码基因III蛋白一部分的核酸序列融合。(Bass，S.(1990)Proteins 8：309；Lowmanand Wells(1991)Methods：ACompanion to Methods in Enzymology 3：205)。在单价噬菌体展示系统中，基因融合物以低水平表达，而野生型基因III蛋白也表达，使得(病毒)颗粒的感染性得到保留。生成肽文库和筛选那些文库的方法已经公开于许多专利(例如美国专利No.5,723,286、美国专利No.5,432,018、美国专利No.5,580,717、美国专利No.5,427,908和美国专利No.5,498,530)。
证明肽在丝状噬菌体表面上表达和功能性抗体片段在大肠杆菌周质中表达对于开发噬菌体展示抗体文库是重要的。(Smith等(1985)Science228：1315；Skerra and Pluckthun(1988)Science 240：1038)。已经以多种方式制备了抗体或抗原结合多肽的文库，包括通过插入随机DNA序列来改变单一基因或者通过克隆一族相关基因。使用噬菌体展示来展示抗体或抗原结合片段的方法已经记载于美国专利No.5,750,373、5,733,743、5,837,242、5,969,108、6,172,197、5,580,717和5,658,727。然后对文库筛选具有期望特征的抗体或抗原结合蛋白的表达。
噬菌体展示技术在制备具有期望特征的抗体方面相对于常规杂交瘤和重组方法具有数项优势。此技术容许以较少的时间、无需使用动物就开发出具有多样序列的大型抗体文库。杂交瘤的制备或人源化抗体的制备动则就需要数月制备。另外，由于不需要进行免疫，可以对有毒的或具有低抗原性的抗原生成噬菌体抗体文库(Hogenboom(1988)Immunotechniques 4：1-20)。噬菌体抗体文库还可用于生成和鉴定新的治疗性抗体。
噬菌体展示文库已经用于自经免疫的、未免疫的人、种系序列、或未接触抗原的B细胞Ig全集生成人抗体(Barbas&Burton(1996)Trends Biotech14：230；Griffiths等(1994)EMBO J.13：3245；Vaughan等(1996)Nat.Biotech.14：309；Winter EP 0368684B1)。已经使用多种淋巴样组织生成了未接触抗原的或非免疫性抗原结合文库。这些文库中的一些可以通过商业途径购买，诸如那些由Cambridge Antibody Technology和Morphosys开发的文库(Vaughan等(1996)Nature Biotech 14：309；Knappik等(1999)J.Mol.Biol.296：57)。然而，这些文库中的许多具有有限的多样性。
自噬菌体展示文库中鉴定和分离高亲和力抗体的能力在分离用于治疗用途的新抗体中是重要的。自文库中分离高亲和力抗体依赖于文库的容量、细菌细胞的生产效率、和文库的多样性。参见例如Knappik等(1999)J.Mol.Biol.296：57。由于抗体或抗原结合蛋白的不正确折叠和终止密码子的存在，文库的容量会因低效生产而缩小。如果抗体或抗原结合结构域没有得到正确折叠，那么在细菌细胞中的表达会受到抑制。可以通过突变可变/恒定界面的表面转角中的残基或选定的CDR残基来提高表达。(Deng等(1994)J.Biol.Chem.269：9533；Ulrich等(1995)PNAS，92：11907-11911；Forsberg等(1997)J.Biol.Chem.272：12430)。在细菌细胞中生成噬菌体抗体文库时，框架区的序列是提供正确折叠的一个因素。
生成抗体或抗原结合蛋白的多样性文库对于分离高亲和力抗体也是重要的。已经使用多种方法生成了在有限CDR中具有多样性的文库。参见例如Tomlinson (2000)Nature Biotech.18：989-994。CDR3区是受关注的，部分因为常常发现它们参与抗原结合。重链上的CDR3区的长度、序列和结构构象变化极大。
其他人也已经通过在每个位置使用所有20种氨基酸来随机化重链和轻链可变域CDR区而产生了多样性。认为使用所有20种氨基酸会产生变异抗体序列的大大多样性并增加鉴定到新抗体的机会。(Barbas(1994)PNAS91：3809；Yelton，DE(1995)J.Immunology 155：1994；Jackson，J.R.(1995)J.Immunology 154：3310；Hawkins，RE(1992)J.Mol.Biology 226：889)。
发明概述
本发明提供了新的抗NRP1抗体，其能够调控至少一种神经纤毛蛋白介导的生物学活性。优选的是，所述抗NRP1抗体是能够抑制至少一种神经纤毛蛋白介导的生物学活性的拮抗性抗体。更具体的说，本发明提供了自设计的人合成抗体噬菌体文库生成抗NRP1抗体的方法，及阻断其所生成的抗NRP1抗体的新功能。本发明的抗NRP1抗体根据它们所结合的NRP1上的部位分成两类：抗NRP1A抗体(包括YW64.3及其变体)，它们结合NRP1的CUB结构域(a1a2)；和抗NRP1B抗体(包括YW107.4及其变体)，它们结合NRP1的凝结因子V/VIII结构域(b1b2)。
一方面，本发明的抗NRP1A抗体可选自表III所示“YW64”抗体克隆，它们具有经鉴定的部分CDR序列和对鼠和人NRP1的结合亲和力。本发明的抗NRP1A抗体优选包含下述轻链可变域，所述轻链可变域包含以下CDR氨基酸序列：CDRL1(RASQSISSYLA；SEQ ID NO：123)、CDRL2(GASSRAS；SEQ ID NO：124)和CDRL3(QQYMSVPIT；SEQ ID NO：125)。例如，抗NRP1A抗体包含SEQ ID NO：3的轻链可变域序列。本发明的抗NRP1A抗体优选包含下述重链可变域，所述重链可变域包含以下CDR氨基酸序列：CDRH1(GFSFSSEPIS；SEQ ID NO：126)、CDRH2(SSITGKNGYTYYADSVKG；SEQID NO：127)和CDRH3(WGKKVYGMDV；SEQ ID NO：128)。例如，抗NRP1A抗体包含SEQ ID NO：4的重链可变域序列。更优选的是，本发明的抗NRP1A抗体是包含SEQ ID NO：3的轻链可变域序列和SEQ ID NO：4的重链可变域序列的YW64.3抗体。
另一方面，本发明的抗NRP1B抗体可选自表IV所示“YW107.4”抗体克隆，它们具有经鉴定的部分CDR序列和对鼠和人NRP1的结合亲和力。本发明的抗NRP1B抗体优选包含下述轻链可变域，所述轻链可变域包含以下CDR氨基酸序列：CDRL 1(RASQYFSSYLA；SEQ ID NO：129)、CDRL2(GASSRAS；SEQ ID NO：130)和CDRL3(QQYLGSPPT；SEQ ID NO：131)。例如，抗NRP1B抗体包含SEQ ID NO：5的轻链可变域序列。本发明的抗NRP1B抗体优选包含下述重链可变域，所述重链可变域包含以下CDR氨基酸序列：CDRH1(GFTFSSYAMS；SEQ ID NO：132)、CDRH2(SQISPAGGYTNYADSVKG；SEQ ID NO：133)和CDRH3(ELPYYRMSKVMDV；SEQ ID NO：134)。例如，抗NRP1B抗体包含SEQ IDNO：6的重链可变域序列。更优选的是，本发明的抗NRP1B抗体是包含SEQID NO：5的轻链可变域序列和SEQ ID NO：6的重链可变域序列的YW107.4.87抗体。
本发明还提供了抗NRP1抗体用于治疗血管发生相关病症诸如癌症的用途。在一个优选的实施方案中，本发明的抗NRP1抗体与抗VEGF抗体联合使用。优选的是，所述抗VEGF抗体能够与抗体A4.6.1结合相同的VEGF表位。更优选的是，所述抗VEGF抗体是bevacizumab(贝伐单抗)或ranibizumab(兰尼单抗)。
附图简述
图1图示了抗NRP1抗体的结合特异性。(1A)抗NRP1抗体特异性结合人和鼠NRP1。通过测试与hNRP1、mNRP1、hNRP2、mNRP2、ErbB2-ECD、或BSA包被的孔的结合来评估抗NRP1抗体YW64.3和YW107.4IgG(10ug/ml)的结合特异性，并通过抗人IgG HRP偶联物来检测所结合的IgG。(1B)抗NRP1抗体YW64.3和YW107.4IgG的FACS分析，显示了抗体对细胞表面NRP1蛋白(HUVEC)的结合能力。
图2图示了抗NRP1抗体YW107.4及其亲和力成熟变体YW107.4.87(抗NRP1B)的结合特性。(2A)亲和力成熟的YW107.4.87变体的BIAcore动力学分析。(2B)YW107.4和YW107.4.87IgG的FACS分析，显示了亲和力成熟变体YW107.4.87对细胞表面NRP1蛋白(HUVEC)改进的结合。
图3显示了YW 64.3(抗NRP1A)和YW107.4.87(抗NRP1B)的可变区序列，列出了h4D5的序列作为参照。编号方式基于Kabat数据库。CDR序列在框区中。(3A)h4D5(SEQ ID NO：1)、YW 64.3(SEQ ID NO：3)和YW107.4.87(SEQ ID NO：5)的轻链可变区序列。(3B)h4D5(SEQ ID NO：2)、YW 64.3(SEQID NO：4)和YW107.4.87(SEQ ID NO：6)的重链可变区序列。
图4描绘了抗NRP1抗体对VEGF165结合NRP1的阻断。
图5描绘了Sema3A诱导的DRG塌陷(5A)和Sema3F诱导的海马塌陷测定法(5B)的定量。抗NRP1A显示出特异性阻断Sema3A诱导的DRG神经元生长锥塌陷，而非Sema3F诱导的海马神经元生长锥塌陷。
图6图示了抗NRP1抗体能够在体外抑制VEGF诱导的HUVEC迁移和发芽。(6A)迁移测定法的定量(每种条件的n＝6)。*p＝0.00003；**p＝9.9×10-11；Student氏t检验。(6B)珠发芽测定法的定量，每种条件n＝12-14粒珠。
图7图示了抗NRP1抗体对发育中小鼠视网膜中的血管重塑的体内抑制效果。(7A)出生后第5天(P5)至P8的血管发育的图示。血管以同中心模式向视网膜边缘延伸。视神经乳头(ONH)位于视网膜的中央；(7B)ONH附近的血管重塑发生于P5与P8之间；(7C)进入视网膜更深层的血管发芽的图示。血管向外网层(OPL)发芽延伸并形成丛。稍晚的发芽发生在NFL和OPL之间，最终产生内网层(IPL)；(7D)血管密度的定量；每种条件4个受处理视网膜的12幅代表性图像的总像素计数。*p＝0.006；**p＜0.0001；Student氏t检验；(7E)血管延伸的定量，通过自ONH至血管系统边缘的距离相对于自ONH至视盘凹陷的距离的比率来测量。自4只受处理视网膜采集12次代表性测量。
图8描绘了抗NRP1抗体对VEGF诱导的血管通透性、HUVEC增殖、VEGFR2磷酸化和VEGFR2下游信号传导的影响。(8A)小鼠皮肤血管通透性测定法的定量。所示数值是6次独立实验的平均值(抗NRP1A为p＝0.69，抗NRP1B为p＝0.989)；(8B)有或无VEGF时HUVEC增殖的定量(每种条件为n＝5)；(8C)HUVEC中使用识别总VEGFR2或酪氨酸磷酸化VEGFR2的抗体通过ELISA测定法检测出的VEGFR2磷酸化水平。抗NRP1A处理细胞中的VEGFR2磷酸化水平与对照组没有显著差异(p＝0.133)。*p＝0.00017；Student氏t检验；(8D)HUVEC溶胞物的免疫印迹分析。将细胞用指定抗体处理，接着与VEGF一起温育。
图9图示了抗NRP1抗体(单独的或联合抗VEGF的)在多种异种移植物肿瘤模型中的肿瘤生长抑制效果。(9A-C)分别为SK-MES-1、H1299和Fo5肿瘤模型的平均肿瘤体积图。(9D)SK-MES-1肿瘤模型的Kaplan-Meier图。
图10显示了抗NRP1抗体(单独的或联合抗VEGF的)在Fo5肿瘤模型中的血管效应。(10A)平均血管密度(通过凝集素灌注来测量)；每种条件3-4个受处理肿瘤的总像素计数。(10B)平均周细胞密度(通过PDGFRβ染色来测量)。(10C)周细胞/血管比率，测量相对周细胞覆盖。
图11图示了NRP1和VEGF抑制对血管重塑的叠加效应。11A呈现了这样一种模型，其中在新形成的血管中阻断NRP1功能抑制血管发生重塑和后续成熟，使得血管的存活依赖于VEGF。11B显示了存在抗NRP1B、抗VEGF或其组合时新生小鼠视网膜中的平均血管密度变化。
发明详述
本发明涉及用于调控NRP介导的生物学活性的新组合物和方法。
定义
“神经纤毛蛋白/神经菌毛素(neuropilin)”或NRP指神经纤毛蛋白-1(NRP1)、神经纤毛蛋白-2(NRP2)及其同等型(isoform)和变体全体，如Rossignol等(2000)Genomics 70：211-222中所述。神经纤毛蛋白是120-130kDa非酪氨酸激酶受体。有多种NRP-1和NRP-2剪接变体和可溶性同等型。神经纤毛蛋白的基本结构包含五个结构域：三个胞外结构域(a1a2、b1b2和c)、一个跨膜结构域、和一个胞质结构域。a1a2结构域与补体成分C1r和C1s (CUB)同源，其一般包含四个半胱氨酸残基，形成两个二硫键。b1b2结构域与凝结因子V和VIII同源。c结构域的中央部分称为MAM，因为它与跨膜肽酶(meprin)、A5和受体酪氨酸磷酸酶μ蛋白同源。a1a2和b1b2结构域负责配体结合，而c结构域对于同型二聚化或异型二聚化是至关重要的。Gu等(2002)J.Biol.Chem.277：18069-76；He and Tessier-Lavigne(1997)Cell90：739-51。
“神经纤毛蛋白介导的生物学活性”一般指其中神经纤毛蛋白-1和/或神经纤毛蛋白-2发挥重大作用的生理性或病理性事件。此类活性的非限制性例子有胚胎神经系统发育或神经元再生、血管发生(包括血管造型)、肿瘤发生和肿瘤转移过程中的轴突导向。
术语“抗体”以最广义使用，明确覆盖单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、及抗体片段，只要它们展现出期望的生物学活性。
术语“单克隆抗体”在用于本文时指从一群基本上同质的抗体获得的抗体，即构成群体的各抗体个体是相同的，除了可以以极小量存在的可能的天然存在突变形式外。单克隆抗体是高度特异性的，针对单一抗原性位点。此外，与典型的包含针对不同决定簇(表位)的不同抗体的常规(多克隆)抗体制备物不同，每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。修饰语“单克隆”指示抗体从基本上同质的抗体群获得的特征，不应解释为要求通过任何特定方法来生成抗体。例如，将依照本发明使用的单克隆抗体可通过最初由Kohler等(1975)Nature 256：495记载的杂交瘤方法来制备，或者可通过重组DNA方法来制备(参见例如美国专利No.4,816,567)。“单克隆抗体”还可使用例如Clackson等(1991)Nature 352：624-628和Marks等(1991)J.Mol.Biol.222：581-597中记载的技术从噬菌体抗体库分离。
单克隆抗体在本文中明确包括“嵌合”抗体(免疫球蛋白)，其中重链和/或轻链的一部分与衍生自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而链的剩余部分与衍生自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，以及此类抗体的片段，只要它们展现出期望的生物学活性(美国专利No.4,816,567；Morrison等(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：6851-6855)。
非人(例如鼠)抗体的“人源化”形式指最低限度包含衍生自非人免疫球蛋白的序列的嵌合抗体。在极大程度上，人源化抗体指人免疫球蛋白(受体抗体)中的高变区残基用具有期望特异性、亲和力和能力的非人物种(供体抗体)诸如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类动物的高变区残基替换的免疫球蛋白。在有些情况中，将人免疫球蛋白的Fv框架区(FR)残基用相应的非人残基替换。此外，人源化抗体可包含在受体抗体中或在供体抗体中没有找到的残基。进行这些修饰是为了进一步改进抗体的性能。一般而言，人源化抗体将包含至少一个、通常两个基本上整个如下的可变域，其中所有或基本上所有高变环对应于非人免疫球蛋白的高变环，且所有或基本上所有FR是人免疫球蛋白序列的FR。人源化抗体任选还将包含至少部分免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常是人免疫球蛋白的恒定区。更多细节参见Jones等(1986)Nature 321：522-525；Riechmann等(1988)Nature 332：323-329；Presta(1992)Curr.Op.Struct.Biol.2：593-596。
“物种依赖性抗体”指对来自第一哺乳动物物种的抗原的结合亲和力强于对来自第二哺乳动物物种的该抗原同系物的亲和力的抗体。通常，物种依赖性抗体“特异性结合”人抗原(即结合亲和力(Kd)数值不超过大约1×10-7M，优选不超过大约1×10-8M，且最优选不超过大约1×10-9M)，但是对来自第二非人哺乳动物物种的该抗原同系物的结合亲和力比对人抗原的结合亲和力弱至少大约50倍、或至少大约500倍、或至少大约1000倍。物种依赖性抗体可以是上文所定义的各种类型抗体中的任一种，但是优选人源化抗体或人抗体。
在用于本文时，“抗体突变体”或“抗体变体”指物种依赖性抗体的氨基酸序列变体，其中物种依赖性抗体的一个或多个氨基酸残基发生了修饰。此类突变体与物种依赖性抗体必然具有小于100％的序列同一性或相似性。在一个优选的实施方案中，抗体突变体所具有的氨基酸序列与物种依赖性抗体的重链或轻链可变域的氨基酸序列具有至少75％、更优选至少80％、更优选至少85％、更优选至少90％、最优选至少95％的氨基酸序列同一性或相似性。关于此序列的同一性或相似性在本文中定义为在比对序列并在必要时引入缺口以实现最大百分比序列同一性后，候选序列中与物种依赖性抗体残基相同(即相同残基)或相似(即根据共同侧链特性来自同一组的氨基酸残基，见下文)的氨基酸残基的百分比。N-末端、C-末端、或内部的延伸、删除、或插入可变域以外的抗体序列都不应视为影响序列同一性或相似性。
“分离的”抗体指已经鉴定且自其天然环境的一种成分分开和/或回收的抗体。其天然环境的污染性成分指将会干扰该抗体的诊断或治疗用途的物质，可包括酶、激素、和其它蛋白质性质或非蛋白质性质的溶质。在优选的实施方案中，将抗体纯化至(1)根据Lowry法的测定，抗体重量超过95％，最优选重量超过99％，(2)足以通过使用转杯式测序仪获得至少15个残基的N-末端或内部氨基酸序列的程度，或(3)根据还原性或非还原性条件下的SDS-PAGE及使用考马斯蓝或优选的银染色，达到同质。既然抗体天然环境的至少一种成分不会存在，那么分离的抗体包括重组细胞内的原位抗体。然而，分离的抗体通常将通过至少一个纯化步骤来制备。
在用于本文时，“抗体可变域”指抗体分子的轻链和重链中包含互补决定区(CDR；即CDR1、CDR2、和CDR3)和框架区(FR)氨基酸序列的那部分。VH指重链可变域。VL指轻链可变域。依照本发明所使用的方法，归为CDR和FR的氨基酸位置可以依照Kabat(Sequences ofProteins ofImmunologicalInterest(National Institutes ofHealth，Bethesda，Md.，1987和1991))来限定。。抗体或抗原结合片段的氨基酸编号方式也依照Kabat。
在用于本文时，术语“互补决定区(CDR；即CDR1、CDR2、和CDR3)指抗体可变域中其存在是抗原结合所必需的氨基酸残基。每个可变域通常具有三个CDR，鉴定为CDR1、CDR2和CDR3。每个互补决定区可以包含来自如Kabat定义的“互补决定区”的氨基酸残基(即大约是轻链可变域的残基24-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3)及重链可变域的残基31-35(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)；Kabat等，Sequences of Proteins ofImmunologicalInterest，5th Ed.Public Health Service，NationalInstitutes of Health，Bethesda，MD.(1991))和/或来自“高变环”的残基(即大约是轻链可变域的残基26-32(L1)、50-52(L2)和91-96(L3)及重链可变域的残基26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)；Chothia and Lesk(1987)J.Mol.Biol.196：901-917)。在有些情况中，互补决定区可以包含来自Kabat定义的CDR和高变环二者的氨基酸。例如，抗体4D5重链的CDRH1包含氨基酸26-35。
“框架区”(以下的FR)指可变域中CDR残基以外的残基。每个可变域通常具有四个FR，鉴定为FR1、FR2、FR3和FR4。如果CDR是依照Kabat定义的，那么轻链FR残基位于大约轻链残基1-23(LCFR1)、35-49(LCFR2)、57-88(LCFR3)、和98-107(LCFR4)，而重链FR残基位于大约重链残基1-30(HCFR1)、36-49(HCFR2)、66-94(HCFR3)、和103-113(HCFR4)。如果CDR包含来自高变环的氨基酸残基，那么轻链FR残基位于大约轻链残基1-25(LCFR1)、33-49(LCFR2)、53-90(LCFR3)、和97-107(LCFR4)，而重链FR残基位于大约重链残基1-25(HCFR1)、33-52(HCFR2)、56-95(HCFR3)、和102-113(HCFR4)。在有些情况中，在CDR包含来自Kabat定义的CDR和高变环二者的氨基酸时，FR残基将做相应的调整。例如，当CDRH1包含氨基酸H26-H35时，重链FR1残基位于1-25位，而FR2残基位于36-49位。
在用于本文时，“密码子集”指用于编码期望变异氨基酸的一套不同核苷酸三联体序列。可以通过例如固相合成来合成一套寡核苷酸，其包括呈现密码子集所提供的核苷酸三联体的所有可能组合并编码期望氨基酸组的序列。一种标准形式的密码子命名是IUB代码，其是本领域已知的且在本文中有记载。密码子集通常以3个斜体大写字母表示，例如NNK、NNS、XYZ、DVK等等。如此，“非随机密码子集”在用于本文时指编码部分、优选完全满足本文所述氨基酸选择标准的选定氨基酸的密码子集。在某些位置具有选定核苷酸“简并性”的寡核苷酸的合成是本领域众所周知的，例如TRIM法(Knappek等(1999)J.Mol.Biol.296：57-86)；Garrard&Henner(1993)Gene128：103)。此类具有某些密码子集的寡核苷酸集可以使用商品化核酸合成仪来合成(可购自例如Applied Biosystems，Foster City，CA)，或者可以通过商业途径获得(例如购自Life Technologies，Rockville，MD)。因此，一套具有特定密码子集的合成寡核苷酸通常包括具有不同序列(在整个序列中由密码子集所建立的差异)的多种寡核苷酸。寡核苷酸，在依照本发明使用时，具有容许与可变域核酸模板杂交的序列，而且还可以但非必须包含可用于例如克隆目的的限制酶位点。
“Fv”片段是包含完整抗原识别和结合位点的抗体片段。此区由紧密结合(该结合的本质可以是共价的，例如在scFv中)的一个重链可变域和一个轻链可变域的二聚体组成。正是在这种构造中，每个可变域的三个CDR相互作用而在VH-VL二聚体表面上确定了一个抗原结合位点。六个CDR或其子集共同赋予抗体以抗原结合特异性。然而，即使是单个可变域(或只包含对抗原特异性的三个CDR的半个Fv)也具有识别和结合抗原的能力，只是通常亲和力低于完整结合位点。
“Fab”片段包含轻链的可变域和恒定域及重链的可变域和第一恒定域(CH1)。F(ab′)2抗体片段包含一对Fab片段，这对Fab片段一般通过它们之间的铰链半胱氨酸在它们羧基末端附近共价连接。本领域还知道抗体片段的其它化学偶联形式。
“单链Fv”或“scFv”抗体片段包含抗体的VH和VL结构域，其中这些结构域存在于一条多肽链上。一般而言，Fv多肽在VH与VL结构域之间还包含多肽接头，使得scFv能够形成结合抗原所需的结构。关于scFv的综述参见Pluckthun，在Rosenburg and Moore编的《The Pharmacology of MonoclonalAntibodies》第113卷中，Springer-Verlag，New York，pp.269-315(1994)。
术语“双抗体”指具有两个抗原结合位点的小型抗体片段，该片段在同一条多肽链(VH及VL)中包含相连的重链可变域(VH)和轻链可变域(VL)。通过使用过短的接头使得同一条链上的两个结构域之间不能配对，迫使这些结构域与另一条链的互补结构域配对，从而产生两个抗原结合位点。双抗体更完整的记载于例如EP 404,097；WO 93/11161；Hollinger等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448。
表述“线性抗体”指Zapata等(1995)Protein Eng，8(10)：1057-1062中所描述的抗体。简言之，这些抗体包含一对串联的Fd区段(VH-CH1-VH-CH1)，该区段与互补的轻链多肽一起形成一对抗原结合区。线性抗体可以是双特异性的，或者是单特异性的。
在用于本文时，“文库”或“库”指众多抗体或抗体片段序列(例如本发明的多肽)，或者编码这些序列的核酸，这些序列在根据本发明方法导入这些序列的变异氨基酸组合方面是不同的。
“噬菌体展示”是一种将变异多肽作为与外壳蛋白至少一部分的融合蛋白展示在噬菌体(例如丝状噬菌体)颗粒表面上的技术。噬菌体展示的效用在于能够对随机化蛋白质变体的大型文库快速且高效分选那些能以高亲和力与靶抗原结合的序列的实情。肽和蛋白质文库在噬菌体上的展示已经用于对数以百万计的多肽筛选那些具有特异性结合特性的多肽。多价噬菌体展示法已经用于展示小随机肽和小蛋白，其通过与丝状噬菌体的基因III或基因VIII融合来实现。Wells and Lowman(1992)Curr.Opin.Struct.Biol.3：355-362，及其中引用的参考文献。在单价噬菌体展示中，将蛋白质或肽文库与基因III或其一部分融合，并在存在野生型基因III蛋白时以低水平表达，使得噬菌体颗粒展示一个拷贝的融合蛋白或者不展示融合蛋白。亲合效应(avidityeffct)相对于多价噬菌体得到了降低，使得分选基于内在的配体亲和力，而且使用噬菌粒载体，这简化了DNA操作。Lowman and Wells(1991)Methods：Acompanion to Methods in Enzymology 3：205-0216。
“噬菌粒”是具有细菌复制起点(例如Co1E1)和一个拷贝的噬菌体基因区间的质粒载体。噬菌粒可利用任何已知噬菌体，包括丝状噬菌体和λ类噬菌体。质粒一般也包含抗生素抗性的可选择标志物。克隆入这些载体的DNA区段可以像质粒一起而扩增。在给容纳这些载体的细胞提供生成噬菌体颗粒所必需的所有基因时，质粒的复制模式变成滚环复制，以生成质粒DNA的一条链的拷贝，并包装噬菌体颗粒。噬菌粒可形成感染性或非感染性噬菌体颗粒。此术语包括这样的噬菌粒，它们包含与异源多肽基因连接成基因融合物的噬菌体外壳蛋白基因或其片段，使得异源多肽展示在噬菌体颗粒的表面上。
术语“噬菌体载体”指包含异源基因且能够复制的双链复制型噬菌体。噬菌体载体具有容许噬菌体复制和噬菌体颗粒形成的噬菌体复制起点。噬菌体优选是丝状噬菌体，诸如M13、f1、fd、Pf3噬菌体或其衍生物，或者是λ类噬菌体，诸如λ、21、
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82、424、434等或其衍生物。
在用于本文时，“溶剂可及位置”指源抗体或抗原结合片段重链和轻链可变区中根据抗体或抗原结合片段的结构、结构系综(ensemble)和/或建模结构确定为潜在触及溶剂和/或接触分子(诸如抗体特异性抗原)的氨基酸残基位置。这些位置通常发现于CDR中和蛋白质外部上。如本文所定义的抗体或抗原结合片段的溶剂可及位置可使用本领域已知的多种算法来确定。优选的是，溶剂可及位置是使用来自抗体三维模型的坐标而确定的，优选使用计算法程序，诸如InsightII程序(Accelrys，San Diego，CA)。溶剂可及位置还可以使用本领域已知的算法来确定(例如Lee and Richards(1971)J.Mol.Biol.55，379和Connolly(1983)J.Appl.Cryst.16，548)。溶剂可及位置的确定可使用适于蛋白质建模的软件和自抗体得到的三维结构信息来进行。可用于这些目的的软件包括SYBYL Biopolymer Module软件(Tripos Associates)。一般和优选的是，若算法(程序)要求用户输入大小参数，计算中所使用的探针的“大小”设为半径大约1.4埃或更小。另外，Pacios(1994)Comput.Chem.18(4)：377-386记载了使用供个人计算机用的软件确定溶剂可及区域和面积的方法。
“血管发生因子”或“血管发生剂”指刺激血管发育，例如促进血管发生(angiogenesis)、内皮细胞生长、血管稳定性和/或血管生成(vasculogenesis)等的生长因子。例如，血管发生因子包括但不限于例如VEGF和VEGF家族的成员、PlGF、PDGF家族、成纤维细胞生长因子家族(FGF)、TIE配体(血管生成素)、ephrin、Del-1、酸性(aFGF)和碱性(bFGF)成纤维细胞生长因子、卵泡抑素(Follistatin)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、肝细胞生长因子(HGF)/散射因子(SF)、白介素-8(IL-8)、Leptin、Midkine、神经纤毛蛋白、胎盘生长因子、血小板衍生内皮细胞生长因子(PD-ECGF)、血小板衍生生长因子尤其是PDGF-BB或PDGFR-β、Pleiotrophin(PTN)、Progranulin、Proliferin、转化生长因子-α(TGF-α)、转化生长因子-β(TGF-β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)等。它还包括加速伤口愈合的因子，诸如生长激素、胰岛素样生长因子-I(IGF-I)、VIGF、表皮生长因子(EGF)、CTGF及其家族的成员、及TGF-α和TGF-β。参见例如Klagsbrun and D’Amore(1991)Annu.Rev.Physiol.53：217-39；Streit andDetmar(2003)Oncogene 22：3172-3179；Ferrara & Alitalo(1999)NatureMedicine 5(12)：1359-1364；Tonini等(2003)Oncogene 22：6549-6556(例如列举已知血管发生因子的表1)；Sato(2003)Int.J.Clin.Oncol.8：200-206。
“抗血管发生剂”或“血管发生抑制剂”指或直接或间接抑制血管发生(angiogenesis)、血管生成(vasculogenesis)、或不想要的血管通透性的小分子量物质、多核苷酸、多肽、分离的蛋白质、重组蛋白、抗体、或其偶联物或融合蛋白。应当理解，抗血管发生剂包括那些结合并阻断血管发生因子或其受体的血管发生活性的药剂。例如，抗血管发生剂是上文定义的血管发生剂的抗体或其它拮抗剂，例如VEGF-A的抗体、VEGF-A受体(例如KDR受体或Flt-1受体)的抗体、抗PDGFR抑制剂诸如GleevecTM(ImatinibMesylate)。抗血管发生剂还包括天然血管发生抑制剂，例如血管他丁(angiostatin)、内皮他丁(endostatin)等。参见例如Klagsbrun and D’Amore(1991)Annu.Rev.Physiol.53：217-39；Streit and Detmar(2003)Oncogene22：3172-3179(例如列举恶性黑素瘤中抗血管发生疗法的表3)；Ferrara&Alitalo(1999)Nature Medicine 5(12)：1359-1364；Tonini等(2003)Oncogene22：6549-6556(例如列举已知抗血管发生因子的表2)；Sato(2003)Int.J.Clin.Oncol.8：200-206(例如列举临床试验中所使用的抗血管发生剂的表1)。
术语“VEGF”和“VEGF-A”在用于本文时指165个氨基酸的人血管内皮细胞生长因子及相关的121个、189个和206个氨基酸的人血管内皮细胞生长因子，如Leung等(1989)Science 246：1306和Houck等(1991)Mol.Endocrin，5：1806所述，及其天然存在等位基因形式和加工形式。术语“VEGF”还指来自非人物种诸如小鼠、大鼠或灵长类动物的VEGF。有时，来自特定物种的VEGF表示如下，hVEGF表示人VEGF，mVEGF表示鼠VEGF，等等。术语“VEGF”还用于指包含165个氨基酸的人血管内皮细胞生长因子的氨基酸第8-109位或第1-109位的截短形式多肽。本申请中可能通过例如“VEGF(8-109)”、“VEGF(1-109)”或“VEGF165”来鉴别任何此类形式VEGF。“截短的”天然VEGF的氨基酸位置如天然VEGF序列中所示编号。例如，截短的天然VEGF中的第17位氨基酸(甲硫氨酸)也是天然VEGF中的第17位(甲硫氨酸)。截短的天然VEGF具有与天然VEGF相当的对KDR和Flt-1受体的结合亲和力。
“VEGF抗体”指以足够亲和力和特异性结合VEGF的抗体。优选的是，本发明的抗VEGF抗体可在靶向和干预其中牵涉VEGF活性的疾病或疾患时用作治疗剂。抗VEGF抗体通常不会结合其它VEGF同系物，诸如VEGF-B或VEGF-C，也不会结合其它生长因子，诸如PlGF、PDGF或bFGF。一种优选的抗VEGF抗体是与杂交瘤ATCC HB 10709所生成的单克隆抗VEGF抗体A4.6.1结合相同表位的单克隆抗体。更优选的是，抗VEGF抗体是依照Presta等，Cancer Res.57：4593-4599(1997)生成的重组人源化抗VEGF单克隆抗体，包括但不限于称为bevacizumab(贝伐单抗；BV；AvastinTM)的抗体。
抗VEGF抗体“Bevacizumab(贝伐单抗，BV)”，也称为“rhuMAb VEGF”或
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是依照Presta等，Cancer Res.57：4593-4599(1997)生成的重组人源化抗VEGF单克隆抗体。它包含突变的人IgG1框架区和来自阻断人VEGF结合其受体的鼠抗hVEGF单克隆抗体A4.6.1的抗原结合互补决定区。贝伐单抗(Bevacizumab)大约93％的氨基酸序列，包括大部分框架区，衍生自人IgG1，而大约7％的序列衍生自鼠抗体A4.6.1。贝伐单抗(Bevacizumab)具有约149,000道尔顿的分子量且是糖基化的。
“VEGF拮抗剂”指能够中和、阻断、抑制、消除、降低或干扰VEGF活性，包括其与一种或多种VEGF受体的结合的分子。VEGF拮抗剂包括抗VEGF抗体及其抗原结合片段、特异性结合VEGF由此使其隔绝与一种或多种受体结合的受体分子及衍生物、抗VEGF受体抗体和VEGF受体拮抗剂诸如VEGFR酪氨酸激酶的小分子抑制剂。
“治疗”指治疗性处理和预防性或防范性措施二者。需要治疗的受试者包括早就患有病症的受试者以及要预防病症的受试者。
“病症”指任何会受益于抗体治疗的疾患。例如，患有或需要预防异常血管发生(过度的、不当的或失控的血管发生)或血管通透性的哺乳动物。这包括慢性和急性病症或疾病，包括那些使哺乳动物倾向于所讨论病症的病理状况。本文中待治疗的病症的非限制性例子包括恶性和良性肿瘤；非白血病和淋巴样恶性肿瘤；神经元、神经胶质、星细胞、下丘脑和其它腺体、巨噬细胞、上皮、基质和囊胚腔病症；及炎性、血管发生性和免疫学病症。
异常血管发生发生于病情中的或引起病情的新血管生长过度、不足或不当(例如从医学观点看不良的血管发生位置、时间或启动)时。过度的、不当的或失控的血管发生发生于有促成病情恶化或引起病情的新血管生长时，诸如癌症尤其是血管化实体瘤和转移瘤(包括结肠癌、肺癌(尤其是小细胞肺癌、或前列腺癌)，由眼部新血管形成引起的疾病尤其是糖尿病性失明、视网膜病变、原发性糖尿病性视网膜病变(primarily diabetic retinopathy)或年龄相关黄斑变性(AMD)，银屑病、银屑病关节炎、成血管细胞瘤诸如血管瘤；炎性肾病，诸如肾小球肾炎，尤其是膜增生性肾小球肾炎、溶血性尿毒综合征(haemolytic uremic syndrome)、糖尿病肾病或高血压肾硬化；各种炎性疾病，诸如关节炎，尤其是类风湿性关节炎、炎性肠病、银屑病、结节病、动脉硬化和移植后发生的疾病、子宫内膜异位症或慢性哮喘，及超过70种其它疾患。新血管可供应患病组织，破坏正常组织，而且，在癌症的情况中，新血管可容许肿瘤细胞逃入循环并停留在其它器官中(肿瘤转移)。不足的血管发生发生于有不当血管生长促成病情恶化时，例如在诸如冠状动脉疾病、中风和伤口愈合迟缓的疾病中。此外，溃疡、中风和心脏病发作可源自没有自然愈合通常要求的血管发生。本发明设想了治疗那些有风险发生上述疾病的患者。
作为接受本发明抗体或多肽的候选者的其他患者具有或者有风险发生维管组织异常增殖、酒渣鼻(红斑痤疮)、获得性免疫缺陷综合征、动脉阻塞、特应性角膜炎、细菌性溃疡、贝切特氏病(Bechets disease)、血液传播的肿瘤(blood borne tumor)、颈动脉阻塞性疾病、脉络膜新血管形成、慢性炎症、慢性视网膜剥离、慢性葡萄膜炎、慢性玻璃体炎、接触镜佩戴过度、角膜移植物排斥、角膜新血管形成、角膜移植物新血管形成、克罗恩氏病(Crohn′sdisease)、伊尔斯病(Eales disease)、流行性角膜结膜炎、真菌性溃疡、单纯疱疹感染、带状疱疹感染、高粘滞综合征、卡波西氏肉瘤(Kaposi′s sarcoma)、白血病、脂质变性、莱姆氏病(Lyme′s disease)、边缘角质层分离(marginalkeratolysis)、莫伦溃疡(Mooren ulcer)、除麻风以外的分枝杆菌感染、近视、眼部新血管疾病、眼窝、奥-韦二氏综合征(Osler-Weber syndrome)(奥斯勒-韦伯-朗迪(Osler-Weber-Rendu)病)、骨关节炎、佩吉特氏病(Pagets disease)、扁平部睫状体炎(pars planitis)、类天疱疮、phylectenulosis、多动脉炎、激光后并发症(post-laser complication)、原生动物感染、弹性假黄色瘤、翼状胬肉(pterygium)、干燥性角膜炎、放射状角膜切开术、视网膜新血管形成、早产儿视网膜病、晶状体后纤维组织增生、类肉瘤/结节病(sarcoid)、巩膜炎、镰状细胞贫血、斯耶格伦氏综合征(Sogrens syndrome)、实体瘤、斯塔加特病(Stargarts disease)、约-斯病(Steven′s Johnson disease)、上缘角膜炎(superiorlimbic keratitis)、梅毒、全身性狼疮、特里昂氏边缘变性(Terrien′s marginaldegeneration)、弓形虫病、外伤、尤因肉瘤(Ewing sarcoma)的肿瘤、成神经细胞瘤的肿瘤、骨肉瘤的肿瘤、视网膜母细胞瘤的肿瘤、横纹肌肉瘤的肿瘤、溃疡性结肠炎、静脉阻塞、维生素A缺乏和韦格纳结节病(Wegenerssarcoidosis)、与糖尿病有关的不良血管发生、寄生虫病、异常伤口愈合、外伤、损伤或手术后肥大、毛发生长抑制、排卵和黄体形成抑制、子宫中胚胎发育抑制和植入抑制。
抗血管发生疗法可用于以下各项的一般治疗：移植物排斥、肺部炎症、肾病综合征、先兆子痫、心包积液(诸如与心包炎有关的)和胸腔积液、特征为不良血管通透性的疾病和病症，例如与脑瘤有关的水肿、与恶性肿瘤有关的腹水、梅格斯氏(Meigs)综合征、肺部炎症、肾病综合征、心包积液、胸腔积液、与心血管疾病有关的通透性，诸如心肌梗死和中风后的疾患，诸如此类。
依照本发明的其它血管发生依赖性疾病包括血管纤维瘤(倾向于出血的异常血管)、新生血管性青光眼(眼中的血管生长)、动静脉畸形(动脉与静脉之间的异常联络)、不连接的骨折(不会愈合的骨折)、动脉粥样硬化斑块(动脉的硬化)、脓性肉芽肿(由血管构成的普通皮肤损伤)、硬皮病(结缔组织疾病的一种形式)、血管瘤(由血管构成的肿瘤)、沙眼(第三世界失明的第一位原因)、血友病性关节、血管粘连和肥厚性瘢痕(异常瘢痕形成)。
术语“癌症”和“癌性”指或描述哺乳动物中特征通常为细胞生长不受调控的生理疾患。癌症的例子包括但不限于癌、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤、和白血病。此类癌症的更具体例子包括鳞状细胞癌、肺癌(包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺的腺癌、和肺的鳞癌)、腹膜癌、肝细胞癌、胃癌(gastric orstomach cancer)(包括胃肠癌)、胰腺癌、成胶质细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌(liver cancer or hepatic carcinoma)、膀胱癌、肝瘤(hepatoma)、乳腺癌、结肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾癌(kidney or renalcancer)、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、及各种类型的头和颈癌，以及B细胞淋巴瘤(包括低级/滤泡性非何杰金氏淋巴瘤(NHL)、小淋巴细胞性(SL)NHL、中级/滤泡性NHL、中级弥漫性NHL、高级成免疫细胞性NHL、高级成淋巴细胞性NHL、高级小无核裂细胞性NHL、贮积病(bulky disease)NHL、套细胞淋巴瘤、AIDS相关淋巴瘤、和瓦尔登斯特伦氏(Waldenstrom)巨球蛋白血症)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、毛细胞性白血病、慢性成髓细胞性白血病、和移植后淋巴增殖性病症(PTLD)、以及与瘢痣病(phakomatoses)、水肿(诸如与脑瘤有关的)和梅格斯氏(Meigs)综合征有关的异常血管增殖。
术语“抗肿瘤组合物”指可用于治疗癌症的组合物，其包含至少一种活性治疗剂，例如“抗癌剂”。治疗剂(抗癌剂)的例子包括但不限于例如化疗剂、生长抑制剂、细胞毒剂、放射疗法中所使用的药剂、抗血管发生剂、凋亡剂、抗微管蛋白剂、和其它用于治疗癌症的药剂诸如抗HER-2抗体、抗CD20抗体、表皮生长因子受体(EGFR)拮抗剂(例如酪氨酸激酶抑制剂)、HER1/EGFR抑制剂(例如erlotinib(TarcevaTM)、血小板衍生生长因子抑制剂(例如GleevecTM(Imatinib Mesylate))、COX-2抑制剂(例如塞来考昔(celecoxib))、干扰素、细胞因子、能与ErbB2、ErbB3、ErbB4、PDGFR-β、BlyS、APRIL、BCMA或VEGF受体中的一种或多种靶物结合的拮抗剂(例如中和性抗体)、TRAIL/Apo2、及其它生物活性和有机化学剂等。本发明还包括它们的组合。
术语“细胞毒剂”在用于本文时指抑制或阻止细胞功能和/或引起细胞破坏的物质。该术语意图包括放射性同位素(例如I131、I125、Y90和Re186)、化疗剂、和毒素诸如细菌、真菌、植物或动物起源的酶活毒素或其片段。
“化疗剂”指可用于治疗癌症的化学化合物。化疗剂的例子包括可用于治疗癌症的化学化合物。化疗剂的例子包括烷化剂类(alkylating agents)，诸如塞替派(thiotepa)和环磷酰胺(cyclophosphamide)；磺酸烷基酯类(alkyl sulfonates)，诸如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶类(aziridines)，诸如苯佐替派(benzodepa)、卡波醌(carboquone)、美妥替派(meturedepa)和乌瑞替派(uredepa)；乙撑亚胺类(ethylenimines)和甲基蜜胺类(methylamelamines)，包括六甲蜜胺(altretamine)、三乙撑蜜胺(triethylenemelamine)、三乙撑磷酰胺(triethylenephosphoramide)、三乙撑硫代磷酰胺(triethylenethiophosphoramide)和三羟甲蜜胺(trimethylolomelamine)；番荔枝内酯类(acetogenins)(尤其是布拉他辛(bullatacin)和布拉他辛酮(bullatacinone))；喜树碱(camptothecin)(包括合成类似物托泊替康(topotecan))；苔藓抑素(bryostatin)；callystatin；CC-1065(包括其阿多来新(adozelesin)、卡折来新(carzelesin)和比折来新(bizelesin)合成类似物)；隐藻素类(cryptophycins)(特别是隐藻素1和隐藻素8)；多拉司他汀(dolastatin)；duocarmycin(包括合成类似物，KW-2189和CB1-TM1)；艾榴塞洛素(eleutherobin)；pancratistatin；sarcodictyin；海绵抑素(spongistatin)；氮芥类(nitrogen mustards)，诸如苯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlomaphazine)、胆磷酰胺(cholophosphamide)、雌莫司汀(estramustine)、异环磷酰胺(ifosfamide)、双氯乙基甲胺(mechlorethamine)、盐酸氧氮芥(mechlorethamine oxide hydrochloride)、美法仑(melphalan)、新氮芥(novembichin)、苯芥胆甾醇(phenesterine)、泼尼莫司汀(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥(uracil mustard)；亚硝脲类(nitrosoureas)，诸如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)和雷莫司汀(ranimustine)；抗生素类，诸如烯二炔类抗生素(enediyne)(例如加利车霉素(calicheamicin)，尤其是加利车霉素γ1I和加利车霉素ωI1(参见例如Agnew(1994)Chem.Intl.Ed.Engl.33：183-186)；蒽环类抗生素(dynemicin)，包括dynemicin A；二膦酸盐类(bisphosphonates)，诸如氯膦酸盐(clodronate)；埃斯波霉素(esperamicin)；以及新制癌素(neocarzinostatin)发色团和相关色蛋白烯二炔类抗生素发色团)、阿克拉霉素(aclacinomycin)、放线菌素(actinomycin)、氨茴霉素(anthramycin)、偶氮丝氨酸(azaserine)、博来霉素(bleomycin)、放线菌素C(cactinomycin)、carabicin、洋红霉素(carminomycin)、嗜癌霉素(carzinophilin)、色霉素(chromomycin)、放线菌素D(dactinomycin)、柔红霉素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-二氮-5-氧-L-正亮氨酸、
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多柔比星(doxorubicin)(包括吗啉代多柔比星、氰基吗啉代多柔比星、2-吡咯代多柔比星和脱氧多柔比星)、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、伊达比星(idarubicin)、麻西罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素类(mitomycins)诸如丝裂霉素C、霉酚酸(mycophenolic acid)、诺拉霉素(nogalamycin)、橄榄霉素(olivomycin)、培洛霉素(peplomycin)、potfiromycin、嘌呤霉素(puromycin)、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑菌素(streptonigrin)、链佐星(streptozocin)、杀结核菌素(tubercidin)、乌苯美司(ubenimex)、净司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代谢物类，诸如甲氨蝶呤(methotrexate)和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，诸如二甲叶酸(denopterin)、甲氨蝶呤(methotrexate)、蝶罗呤(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤类似物，诸如氟达拉滨(fludarabine)、6-巯基嘌呤(mercaptopurine)、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鸟嘌呤(thioguanine)；嘧啶类似物，诸如安西他滨(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6-氮尿苷(azauridine)、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、双脱氧尿苷(dideoxyuridine)、去氧氟尿苷(doxifluridine)、依诺他滨(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine)；雄激素类，诸如卡鲁睾酮(calusterone)、丙酸屈他雄酮(dromostanolone propionate)、表硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睾内酯(testolactone)；抗肾上腺类，诸如氨鲁米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；叶酸补充剂，诸如亚叶酸(folinic acid)；醋葡醛内酯(aceglatone)；醛磷酰胺糖苷(aldophosphamide glycoside)；氨基乙酰丙酸(aminolevulinic acid)；恩尿嘧啶(eniluracil)；安吖啶(amsacrine)；bestrabucil；比生群(bisantrene)；依达曲沙(edatraxate)；地磷酰胺(defosfamide)；地美可辛(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；elfomithine；依利醋铵(elliptinium acetate)；埃坡霉素(epothilone)；依托格鲁(etoglucid)；硝酸镓；羟脲(hydroxyurea)；香菇多糖(lentinan)；氯尼达明(lonidamine)；美登木素生物碱类(maytansinoids)，诸如美登素(maytansine)和安丝菌素(ansamitocin)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌达醇(mopidamol)；二胺硝吖啶(nitracrine)；喷司他丁(pentostatin)；蛋氨氮芥(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；洛索蒽醌(losoxantrone)；鬼臼酸(podophyllinic acid)；2-乙基酰肼(ethylhydrazide)；丙卡巴肼(procarbazine)；
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多糖复合物(JHS Natural Products，Eugene，OR)；雷佐生(razoxane)；根霉素(rhizoxin)；西佐喃(sizofiran)；螺旋锗(spirogermanium)；细交链孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亚胺醌(triaziquone)；2，2′，2″-三氯三乙胺；单端孢菌素类(trichothecenes)(尤其是T-2毒素、疣孢菌素(verrucarin)A、杆孢菌素(roridin)A和蛇行菌素(anguidin))；乌拉坦(urethan)；长春地辛(vindesine)；达卡巴嗪(dacarbazine)；甘露莫司汀(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴卫矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；gacytosine；阿糖胞苷(arabinoside)(“Ara-C”)；环磷酰胺(cyclophosphamide)；塞替派(thiotepa)；类紫杉醇类(taxoids)，例如
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帕利他塞(paclitaxel)(Bristol-Myers Squibb Oncology，Princeton，N.J.)、ABRAXANETM不含克列莫佛(Cremophor)、清蛋白改造纳米颗粒剂型帕利他塞(American Pharmaceutical Partners，Schaumberg，Illinois)和
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多西他塞(doxetaxel)(
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Rorer，Antony，France)；苯丁酸氮芥(chlorambucil)；
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吉西他滨(gemcitabine)；6-硫鸟嘌呤(thioguanine)；巯基嘌呤(mercaptopurine)；甲氨蝶呤(methotrexate)；铂类似物，诸如顺铂(cisplatin)和卡铂(carboplatin)；长春碱(vinblastine)；铂(platinum)；依托泊苷(etoposide)(VP-16)；异环磷酰胺(ifosfamide)；米托蒽醌(mitoxantrone)；长春新碱(vincristine)；
Figure A20068004583900275
长春瑞滨(vinorelbine)；能灭瘤(novantrone)；替尼泊苷(teniposide)；依达曲沙(edatrexate)；道诺霉素(daunomycin)；氨基蝶呤(aminopterin)；希罗达(xeloda)；伊本膦酸盐(ibandronate)；伊立替康(irinotecan)(Camptosar，CPT-11)(包括伊立替康及5-FU和亚叶酸的治疗方案)；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；类视黄酸类(retinoids)，诸如视黄酸(retinoic acid)；卡培他滨(capecitabine)；考布他汀(combretastatin)；亚叶酸(leucovorin)(LV)；奥沙利铂(oxaliplatin)，包括奥沙利铂治疗方案(FOLFOX)；PKC-α、Raf、H-Ras、EGFR(例如erlotinib(TarcevaTM))和VEGF-A的、降低细胞增殖的抑制剂；及任何上述物质的药剂学可接受的盐、酸或衍生物。
该定义还包括作用于调节或抑制激素对肿瘤作用的抗激素剂诸如抗雌激素类和选择性雌激素受体调控物类(SERM)，包括例如他莫昔芬(tamoxifen)(包括
Figure A20068004583900276
他莫昔芬)、雷洛昔芬(raloxifene)、屈洛昔芬(droloxifene)、4-羟基他莫昔芬、曲沃昔芬(trioxifene)、那洛昔芬(keoxifene)、LYl 17018、奥那司酮(onapristone)和
Figure A20068004583900277
托瑞米芬(toremifene)；抑制在肾上腺中调节雌激素生成的芳香酶的芳香酶抑制剂，诸如例如4(5)-咪唑、氨鲁米特(aminoglutethimide)、
Figure A20068004583900278
醋酸甲地孕酮(megestrol acetate)、
Figure A20068004583900281
依西美坦(exemestane)、福美坦(formestane)、法倔唑(fadrozole)、
Figure A20068004583900282
伏罗唑(vorozole)、
Figure A20068004583900283
来曲唑(letrozole)和
Figure A20068004583900284
阿那曲唑(anastrozole)；抗雄激素类，诸如氟他米特(flutamide)、尼鲁米特(nilutamide)、比卡米特(bicalutamide)、亮丙瑞林(leuprolide)、和戈舍瑞林(goserelin)；以及曲沙他滨(troxacitabine)(1，3-二氧戊环核苷胞嘧啶类似物)；反义寡核苷酸，特别是抑制牵涉异常(abherant)细胞增殖的信号途经中的基因表达的反义寡核苷酸，诸如例如PKC-α、Raf和H-Ras；核酶，诸如VEGF表达抑制剂(例如
Figure A20068004583900285
核酸)和HER2表达抑制剂；疫苗，诸如基因疗法疫苗，例如
Figure A20068004583900286
疫苗、
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疫苗和
Figure A20068004583900288
疫苗；
Figure A20068004583900289
rIL-2；
Figure A200680045839002810
拓扑异构酶1抑制剂；rmRH；长春瑞滨(Vinorelbine)和埃斯波霉素(Esperamicins)(见美国专利No.4,675,187)；及任何上述物质的药剂学可接受的盐、酸或衍生物。
术语“前体药物”在用于本申请时指与母药(parent drug)相比对肿瘤细胞的细胞毒性较小并能够酶促活化或转变为更具活性母药形式的药用活性物质的前体或衍生物形式。参见例如Wilman(1986)“Prodrugs in CancerChemotherapy”，Biochemical Society Transactions，14，pp.375-382，615thMeeting Belfast和Stella等(1985)“Prodrugs：A Chemical Approach to TargetedDrug Delivery”，Directed Drug Delivery，Borchardt等，编，pp.247-267，HumanaPress。本发明的前体药物包括但不限于含磷酸盐/酯前体药物、含硫代磷酸盐/酯前体药物、含硫酸盐/酯前体药物、含肽前体药物、D-氨基酸修饰前体药物、糖基化前体药物、含β-内酰胺前体药物、含任选取代苯氧基乙酰胺的前体药物或含任选取代苯乙酰胺的前体药物、可转化为更具活性而无细胞毒性的药物的5-氟胞嘧啶和其它5-氟尿苷前体药物。可衍生为本发明使用的前体药物形式的细胞毒性药物的例子包括但不限于上文描述的那些化疗剂。
“分离的”核酸分子指已经鉴定且与抗体核酸的天然来源中通常与之关联的至少一种污染性核酸分子分开的核酸分子。分离的核酸分子不同于在自然界中发现它时的形式或背景。分离的核酸分子因此与存在于天然细胞中时的核酸分子有区别。然而，分离的核酸分子包括通常表达该抗体的细胞中所包含的核酸分子，例如当所述核酸分子在所述细胞中的染色体定位不同于它在天然细胞中的染色体定位时。
表述“控制序列”指在特定宿主生物体中表达可操作连接的编码序列所必需的DNA序列。例如，适于原核生物的控制序列包括启动子、任选的操纵基因序列、和核糖体结合位点。已知真核细胞利用启动子、多腺苷酸化信号、和增强子。
若一段核酸与另一段核酸序列处于功能性相互关系中，则它是“可操作连接的”。例如，若前序列(presequence)或分泌前导(secretory leader)的DNA表达成参与多肽分泌的前蛋白质(preprotein)，则它与该多肽的DNA可操作连接；若启动子或增强子影响编码序列的转录，则它与该序列可操作连接；或者，若核糖体结合位点的位置促进翻译，则它与编码序列可操作连接。一般而言，“可操作连接的”意味着相连的DNA序列是相邻的，而且在分泌前导的情况中意味着相邻且处于阅读状态。然而，增强子不必相邻。连接可以通过在方便的限制性位点处的连接来实现。若没有此类位点，则依照常规实践使用合成的寡核苷酸衔接头或接头。
在用于本文时，表述“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”可互换使用，而且所有此类名称包括后代。如此，词语“转化子”和“(经)转化细胞”包括原代受试细胞及由其衍生的培养物，不管传代的次数。还应理解，所有后代在DNA内容上可能不是精确相同的，这是由于有意或无意的突变。包括与最初对转化细胞所筛选的具有相同功能或生物学活性的突变后代。在意指不同的名称时，上下文会有清楚表述。
本发明的实施方式
抗NRP1抗体的生成
本发明在此提供新的抗NRP1抗体。产生抗体的示例性方法在以下章节中有更详细的描述。
用衍生自哺乳动物物种的NRP1抗原选出新的抗NRP1抗体。抗原优选是人NRP1(hNRP1)。然而，来自其它物种的NRP，诸如鼠NRP1(mNRP1)，也可用作靶抗原。来自各种哺乳动物物种的NRP抗原可分离自天然来源。在其它实施方案中，抗原是重组生产的或者是利用本领域已知的其它合成方法而制备的。
所选的抗体通常将具有足够强的针对NRP1抗原的结合亲和力。例如，抗体结合hNRP1的Kd值可不超过约5nM，优选不超过约2nM，而更优选不超过约500pM。例如，抗体亲和力可由基于表面等离振子共振的测定法(如实施例所述的BIAcore测定法)；酶联免疫吸附测定法(ELISA)；和竞争测定法(如RIA的)来测定。
而且，抗体可进行其它生物学活性测定法，如，用以评估其作为治疗剂的有效性。此类测定法是本领域已知的，而且依赖于靶抗原并意图用于抗体。实例包括HUVEC抑制测定法(如下文实施例所述的)；肿瘤细胞生长抑制测定法(如例如WO89/06692所述的)；抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)和补体介导的细胞毒性(CDC)测定法(美国专利5,500,362)；和激动剂活性或造血作用测定法(参见WO95/27062)。
为了筛选能结合感兴趣的抗原上的特定表位的抗体，可进行常规的交叉阻断测试，如Antibodis，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，Ed Harlow和David Lane(1988)所述的。另外，可进行表位作图，如Champe等(1995)J.Biol.Chem.270：1388-1394所述的，来确定抗体是否结合感兴趣的表位。
从合成的抗体噬菌体文库中产生新的抗NRP1抗体
在一个优选的实施方案中，本发明提供利用独特的噬菌体展示法来产生和挑选新的抗NRP1抗体的方法。该方法包括产生基于单个框架模板的合成抗体噬菌体文库，设计可变域内的足够的多样性，展示具有多样化可变域的多肽，选择对靶NRP1抗原具有高亲和力的候选抗体，和分离所选的抗体。
噬菌体展示方法的详情可在例如2003年12月11日公开的WO03/102157中找到。
在一个方面，本发明中所用的抗体文库可通过在抗体可变域的至少一个CDR中突变溶剂可及的和/或高度多变的位置来产生。一些或全部CDR可用本文提供的方法来突变。在一些实施方案中，优选突变CDRH1、CDRH2和CDRH3中的位置以形成单个文库或突变CDRL3和CDRH3中的位置以形成单个文库或突变CDRL3和CDRH1、CDRH2和CDRH3中的位置以形成单个文库，由此产生多样的抗体文库。
例如，可产生这样的抗体可变域文库，其在CDRH1、CDRH2和CDRH3中溶剂可及的和/或高度多变的位置上有突变。产生的另一种文库在CDRL1、CDRL2和CDRL3中有突变。这些文库也可互相结合使用以产生具有期望亲和力的结合物。例如，在一或多轮选择对靶抗原结合的重链文库后，在其它轮次的选择中可将轻链文库替换入重链结合物群中以提供结合物的亲和力。
文库优选通过用重链序列可变区CDRH3区中的变异氨基酸替代原始氨基酸来产生。所得文库可包含多种抗体序列，其中序列多样性主要位于重链序列的CDRH3区中。
在一个方面，文库在人源化抗体4D5序列、或人源化抗体4D5序列的框架氨基酸序列的背景中产生。文库优选通过用DVK密码子集编码的氨基酸至少替代重链残基95-100a来产生，其中DVK密码子集用于编码这些位置中每个位置的变异氨基酸集。可用于产生这些替代的寡核苷酸集的例子包括序列(DVK)7。在一些实施方案中，文库通过用DVK和NNK两个密码子集编码的氨基酸替代残基95-100a来产生。可用于产生这些替代的寡核苷酸集的例子包括序列(DVK)6(NNK)。在另一个实施方案中，文库通过用DVK和NNK两个密码子集编码的氨基酸替代残基95-100a来产生。可用于产生这些替代的寡核苷酸集的例子包括序列(DVK)5(NNK)。可用于产生这些替代的寡核苷酸集的另一个例子包括序列(NNK)6。根据本文所述标准，本领域技术人员可确定合适寡核苷酸序列的其它例子。
在另一个实施方案中，利用不同的CDRH3设计来分离高亲和力结合物和分离针对各种表位的结合物。该文库中产生的CDRH3的长度范围是11至13个氨基酸，尽管也可产生不同于此的长度。通过用NNK、DVK和NVK密码子集也可拓展H3多样性，以及在N和/或C-末端处的更有限的多样性。
CDRH1和CDRH2中也可产生多样性。CDR-H1和H2多样性的设计遵循目标为模拟所述带有如下修饰的天然抗体全集的策略，所述修饰使多样性较前述设计更紧密地与天然多样性相匹配。
对于CDRH3中的样性，可分开构建多个文库，它们具有不同长度的H3，然后组合起来以选择针对靶抗原的结合物。合并多个文库并用前述和本文下述的固体支持物选择和溶液分选法来选择。可采用多种选择策略。例如，一种变化涉及在结合至固相的靶物上选择，然后分选可能在融合多肽上存在的标签(如抗gD标签)，然后再一次在结合至固相的靶物上分选。或者，文库可首先在结合至固相表面的靶物上选择，然后用靶抗原浓度逐渐减低的溶液相结合来分选所洗脱的结合物。利用不同分选方法的组合来最低限度地只选择高度表达的序列并选择许多不同的高亲和力克隆。
针对NRP1抗原的高亲和力结合物可由文库分离。H1/H2区中的有限多样性可降低简并性约104至105倍并允许为更多高亲和力结合物提供更大的H3多样性。利用在CDRH3中具有不同类型多样性的文库(如利用DVK或NVT)可分离能与靶抗原的不同表位结合的结合物。
对于如上所述合并的文库中分离的结合物，已经发现亲和力可通过提供轻链中的有限多样性来进一步提高。在该实施方案中，轻链多样性如下产生，在CDRL1中：氨基酸第28位由RDT编码；氨基酸第29位由RKT编码；氨基酸第30位由RVW编码；氨基酸第31位由ANW编码；氨基酸第32位由THT编码；任选的，氨基酸第33位由CTG编码；在CDRL2中：氨基酸第50位由KBG编码；氨基酸第53位由AVC编码；任选的，氨基酸第55位由GMA编码；在CDRL3中：氨基酸第91位由TMT或SRT或这两者编码；氨基酸第92位由DMC编码；氨基酸第93位由RVT编码；氨基酸第94位由NHT编码；和氨基酸第96位由TWT或YKG或这两者编码。
在另一个实施方案中，产生在CDRH1、CDRH2和CDRH3区中具有多样性的一个或多个文库。在该实施方案中，用各种长度的H3区并主要用密码子集XYZ和NNK或NNS来产生CDRH3中的多样性。用各寡核苷酸形成文库并合并，或者合并寡核苷酸来形成文库子集。该实施方案的文库可针对结合至固相的靶物进行分选。分离自多次分选的克隆可利用ELISA测定法来筛选特异性和亲和力。对于特异性，克隆可以针对期望靶抗原以及其它非靶抗原进行筛选。然后，在溶液结合竞争ELISA测定法或点竞争测定法中对那些针对靶NRP1抗原的结合物筛选亲和力。可以用如上所述制备的XYZ密码子集由文库分离高亲和力结合物。可方便地在细胞培养中以高产率将这些结合物制备成抗体或抗原结合片段。
在一些实施方案中，可能希望产生在CDRH3区长度方面具有更大多样性的文库。例如，可能希望产生CDRH3区的长度范围为约7至19个氨基酸的文库。
由这些实施方案中的文库分离的高亲和力结合物可方便地在细菌和真核细胞培养中以高产率产生。可设计载体以方便地去除如下序列如gD标签、病毒外壳蛋白成分序列，和/或增加恒定区序列来高产率地产生全长抗体或抗原结合片段。
可以将CDRH3中有突变的文库与包含不同型式的其它CDR(例如CDRL1、CDRL2、CDRL3、CDRH1和/或CDRH2)的文库组合。因此，例如，在一个实施方案中，将CDRH3文库与CDRL3文库组合，所述CDRL3文库用预先确定的密码子集在第28、29、30、31、和/或32位有变异氨基酸的人源化4D5抗体序列的背景中产生。在另一个实施方案中，将CDRH3有突变的文库与包含变异CDRH1和/或CDRH2重链可变域的文库组合。在一个实施方案中，CDRH1文库用第28、30、31、32和33位有变异氨基酸的人源化抗体4D5序列产生。CDRH2文库可用预先确定的密码子集用第50、52、53、54、56和58位有变异氨基酸的人源化抗体4D5序列产生。
抗NRP1抗体突变体
可进一步修饰噬菌体文库产生的新抗NRP1抗体以产生抗体突变体，所述突变体具有比亲本抗体改善了的物理、化学和/或生物学性质。当所用的测定法是生物学活性测定法时，优选抗体突变体在所选测定法中的生物学活性比亲本抗体在该测定法中的生物学活性好至少约10倍，优选好至少约20倍，更优选好至少约50倍，有时好至少约100倍或200倍。例如，优选抗NRP1抗体突变体针对NRP1的结合亲和力比亲本抗NRP1抗体的结合亲和力强至少约10倍，优选强至少约20倍，更优选强至少约50倍，有时强至少约100倍或200倍。
为了产生抗体突变体，将一处或多处氨基酸改变(如替代)导入亲本抗体的一个或多个高变区。或者/另外，可将框架区残基的一处或多处改变(如替代)导入亲本抗体，这些改变导致抗体突变体针对来自第二哺乳动物物种的抗原的结合亲和力有所改善。要修饰的框架区残基的实例包括那些直接非共价结合抗原的(Amit等(1986)Science 233：747-753)；相互作用于/影响CDR构象的(Chothia等(1987)J.Mol.Biol.196：901-917)；和/或参与VL-VH界面的(EP 239 400B1)的残基。在某些实施方案中，一个或多个这类框架区残基的修饰导致抗体针对来自第二哺乳动物物种的抗原的结合亲和力有所增强。例如，在本发明的该实施方案中，可改变约1个至约5个框架残基。有时，这可足以产生适用于临床前试验中的抗体突变体，甚至其中没有高变区残基被改变。可是通常，抗体突变体将包含别的高变区改变。
改变的高变区残基可以是随机改变的，尤其是在其中亲本抗体的起始结合亲和力使得这类随机产生的抗体突变体可方便地被筛选出来。
可用于生成此类抗体突变体的一种方法称作“丙氨酸扫描诱变”(Cunningham and Wells(1989)Science 244：1081-1085)。这里，一个或多个高变区残基用丙氨酸或多丙氨酸残基替代，以影响氨基酸与来自第二哺乳动物物种的抗原的相互作用。然后通过在或对替代位点引入更多或其它突变，推敲那些对替代展现出功能敏感性的高变区残基。如此，虽然引入氨基酸序列变异的位点是预先决定的，但是突变本身的性质不需要预先决定。如本文所述对如此生成的丙氨酸突变体筛选它们的生物学活性。
通常，从保守替代诸如下文显示在标题“优选替代”下的那些开始。如果此类替代导致生物学活性(例如结合亲和力)的改变，那么可以引入下表中称为“例示替代”的更实质性改变，或如下文中关于氨基酸种类的进一步描述，并筛选产物。
优选替代：
  原始残基   例示替代   优选替代
  Ala(A)   val；leu；ile   val
  Arg(R)   lys；gln；asn   lys
  Asn(N)   gln；his；lys；arg   gln
  Asp(D)   glu   glu
  Cys(C)   ser   ser
  Gln(Q)   asn   asn
  Glu(E)   asp   asp
  Gly(G)   pro；ala   ala
  His(H)   asn；gln；lys；arg   arg
  Ile(I)  leu；val；met；ala；phe；正亮氨酸   leu
  Leu(L)  正亮氨酸；ile；val；met；ala；phe   ile
  Lys(K)  arg；gln；asn   arg
  Met(M)  leu；phe；ile   leu
  Phe(F)  leu；val；ile；ala；tyr   leu
  Pro(P)  ala   ala
  Ser(S)  thr   thr
  Thr(T)  ser   ser
  Trp(W)  tyr；phe   tyr
  Tyr(Y)  trp；phe；thr；ser   phe
  Val(V)  ile；leu；met；phe；ala；正亮氨酸   leu
对抗体生物学特性的甚至更实质性修饰通过选择在保持以下方面的效果上显著不同的替代来完成：(a)替代区域的多肽主链的结构，例如作为折叠片或螺旋构象，(b)靶位点处分子的电荷或疏水性，或(c)侧链的体积。
基于共同的侧链特性，将天然存在残基如下分组：
(1)疏水性的：正亮氨酸、met、ala、val、leu、ile；
(2)中性、亲水性的：cys、ser、thr、asn、gln；
(3)酸性的：asp、glu；
(4)碱性的：his、lys、arg；
(5)影响链取向的残基：gly、pro；及
(6)芳香族的：trp、tyr、phe。
非保守替代将需要用这些类别之一的一个成员替换另一个类别的。
在另一个实施方案中，利用噬菌体展示(见上)，对为修饰而选择的位点进行亲和力成熟。
编码氨基酸序列突变体的核酸分子由本领域已知的多种方法制备。这些方法包括但不限于，寡核苷酸介导的(或定点)诱变、PCR诱变、和盒式诱变早先制备的突变或非突变型式的亲本抗体。制备突变体的优选方法是定点诱变(参见例如Kunkel(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：488)。
在某些实施方案中，抗体突变体仅有单个高变区残基被替代。在其它实施方案中，有亲本抗体的两个或更多个高变区残基被替代，如约2个至约10个高变区替代。
通常，生物学特性得到改善的抗体突变体所具有的氨基酸序列与亲本抗体重链或轻链可变域的氨基酸序列有至少75％，更优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，和最优选至少95％的氨基酸序列同一性或相似性。关于此序列的同一性或相似性在本文中定义为在比对序列并在必要时引入缺口以实现最大百分比序列同一性后，候选序列中与亲本抗体残基相同(即相同残基)或相似(即根据共同侧链特性来自同一组的氨基酸残基，见上文)的氨基酸残基的百分比。N-末端、C-末端、或内部的延伸、删除、或插入可变域以外的抗体序列都不应视为影响序列同一性或相似性。
产生抗体突变体后，测定该分子相对于亲本抗体的生物学活性。如上所示，这可包括测定抗体的结合亲和力和/或其它生物学活性。在本发明的一个优选实施方案中，制备一组抗体突变体并筛选针对抗原(诸如NRP1或其片段)的结合亲和力。任选将该初始筛选中选出的一个或多个抗体突变体进行一种或多种其它生物学活性测定法以确证结合亲和力增强的抗体突变体是真正有用的，例如可用于临床前研究。
这样选出的抗体突变体可进一步修饰，修饰时常取决于抗体的预期用途。此类修饰可包括进一步改变氨基酸序列，融合异源多肽和/或共价修饰，诸如下文所详述的那些。对于氨基酸序列改变，示例性的修饰上文有详述。例如，也可替代任何不涉及保持抗体突变体正确构象的半胱氨酸残基，一般替代为丝氨酸，用以改善分子的氧化稳定性并防止异常交联。相反地，可向抗体中加入半胱氨酸键以改善其稳定性(特别是在抗体是抗体片段，诸如Fv片段时)。另一类氨基酸突变体具有改变的糖基化模式。这可通过删除抗体中发现的一个或多个碳水化合物模块和/或增加不存在于抗体中的一个或多个糖基化位点来实现。抗体糖基化通常是N-连接的或O-连接的。N-连接的指碳水化合物模块附着于天冬酰胺残基侧链。三肽序列天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸，其中X是除了脯氨酸之外的任何氨基酸，是碳水化合物模块酶促附着于天冬酰胺侧链的识别序列。因此，多肽中存在这些三肽序列之任一产生潜在的糖基化位点。O-连接的糖基化指糖类N-乙酰半乳糖胺、半乳糖、或木糖之一附着于羟基氨基酸(最常见的是丝氨酸或苏氨酸，尽管也可用5-羟脯氨酸或5-羟赖氨酸)。在抗体上增加糖基化位点可通过改变氨基酸序列使之包含一个或多个上述的三肽序列来方便地实现(用于N-连接的糖基化位点)。也可在原始抗体序列中通过添加、或替代一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基来产生改变(用于O-连接的糖基化位点)。
载体、宿主细胞和重组方法
本发明的抗NRP1抗体可使用易于得到的技术和材料而重组生产。
为了重组生产抗NRP1抗体，分离编码抗体的核酸，并插入可复制载体，用于进一步克隆(DNA扩增)或表达。编码抗体的DNA易于使用常规规程分离或合成(例如通过使用能够与编码抗体重链和轻链的DNA特异性结合的寡核苷酸探针)。可以获得许多载体。载体构件通常包括但不限于下列一种或多种：信号序列、复制起点、一种或多种标志基因、增强子元件、启动子、和转录终止序列。
(i)信号序列构件
本发明的抗体不仅可以直接重组生产，而且可以作为与异源多肽的融合多肽，所述异源多肽优选是成熟蛋白质或多肽的N-末端处的信号序列或具有特异性切割位点的其它多肽。所选择的异源信号序列优选是受到宿主细胞识别并加工(即受到信号肽酶切割)的。对于不识别和加工天然抗体信号序列的原核宿主细胞，所述信号序列用例如选自碱性磷酸酶、青霉素酶、1pp或热稳定肠毒素II前导序列的原核信号序列取代。为了酵母分泌，天然信号序列可以用例如酵母转化酶前导序列、α因子前导序列(包括糖酵母属和克鲁维氏酵母属α因子前导序列)、酸性磷酸酶前导序列、白色假丝酵母葡萄糖淀粉酶前导序列、或WO 90/13646中记载的信号取代。在哺乳动物细胞表达中，可以利用哺乳动物信号序列以及病毒分泌前导序列，例如单纯疱疹gD信号。
将此类前体区(precursor region)的DNA以符合读码框的方式与编码抗体的DNA连接。
(ii)复制起点构件
表达和克隆载体都包含能够使载体在一种或多种所选择的宿主细胞中复制的核酸序列。通常，在克隆载体中，这种序列是能够使载体不依赖于宿主染色体DNA而复制的序列，包括复制起点或自主复制序列。众所周知多种细菌、酵母和病毒的此类序列。来自质粒pBR322的复制起点适合于大多数革兰氏阴性细菌，2μ质粒起点适合于酵母，而各种病毒起点(SV40、多瘤病毒、腺病毒、VSV或BPV)可用于哺乳动物细胞中的克隆载体。通常，哺乳动物表达载体不需要复制起点构件(SV40起点的使用通常可能只是因为它包含早期启动子)。
(iii)选择基因构件
表达和克隆载体可包含选择基因，也称为选择标志。典型的选择基因编码如下蛋白质：(a)赋予对抗生素或其它毒素的抗性，例如氨苄青霉素、新霉素、甲氨蝶呤或四环素；(b)补足营养缺陷型的缺陷；或(c)提供不能由复合培养基获得的必需营养物，例如用于芽孢杆菌的编码D-丙氨酸消旋酶的基因。
选择方案的一个例子利用药物来阻滞宿主细胞的生长。用异源基因成功转化的那些细胞生成赋予药物抗性的蛋白质，因而幸免于选择方案。此类显性选择的例子使用药物新霉素、霉酚酸和潮霉素。
适于哺乳动物细胞的选择标志的另一个例子是那些能够鉴定有能力摄取抗体核酸的细胞的选择标志，诸如DHFR、胸苷激酶、金属硫蛋白-I和-II优选灵长类金属硫蛋白基因、腺苷脱氨酶、鸟氨酸脱羧酶等。
例如，首先通过将所有转化子在含有甲氨蝶呤(Mtx)，DHFR的一种竞争性拮抗剂的培养基中进行培养来鉴定经DHFR选择基因转化的细胞。在采用野生型DHFR时，适宜的宿主细胞是DHFR活性缺陷的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系。
或者，可以通过细胞在含有针对选择标志的选择剂诸如氨基糖苷抗生素例如卡那霉素、新霉素或G418的培养基中的生长来选择经编码抗体、野生型DHFR蛋白质、和另一种选择标志诸如氨基糖苷3′-磷酸转移酶(APH)的DNA序列转化或共转化的宿主细胞(特别是包含内源DHFR的野生型宿主)。参阅美国专利No.4,965,199。
适用于酵母的选择基因是存在于酵母质粒YRp7中的trp1基因(Stinchcomb等(1979)Nature 282：39)。trp1基因为缺乏在色氨酸中生长能力的酵母突变株，例如ATCC No.44076或PEP4-1提供了选择标志。Jones(1977)Genetics 85：12。酵母宿主细胞基因组中存在trp1损伤随之提供了用于通过在缺乏色氨酸时的生长来检测转化的有效环境。类似的，用携带Leu2基因的已知质粒补足Leu2缺陷型酵母菌株(ATCC 20,622或38,626)。
此外，衍生自1.6μm环状质粒pKD1的载体可用于转化克鲁维氏酵母属酵母。或者，报导了用于在乳酸克鲁维氏酵母中大规模生产重组小牛凝乳酶的表达系统。Van den Berg(1990)Bio/Technology 8：135。还披露了用于由克鲁维氏酵母属的工业用菌株分泌成熟重组人血清清蛋白的稳定多拷贝表达载体。Fleer等(1991)Bio/Technology 9：968-975。
(iv)启动子构件
表达和克隆载体通常包含受到宿主生物体识别的启动子，而且它与抗体核酸可操作连接。适用于原核宿主的启动子包括phoA启动子、β-内酰胺酶和乳糖启动子系统、碱性磷酸酶、色氨酸(trp)启动子系统、和杂合启动子诸如tac启动子。然而，其它已知的细菌启动子也是合适的。用于细菌系统的启动子还将包含与编码抗体的DNA可操作连接的Shine-Dalgamo(S.D.)序列。
已知真核细胞的启动子序列。事实上，所有真核基因都具有富含AT区，它位于起始转录的位点上游大约25至30个碱基处。在许多基因的转录起点上游70至80个碱基处找到的另一种序列是CNCAAT区，其中N可以是任何核苷酸。在大多数真核基因的3′端是AATAAA序列，它可能是向编码序列的3′端添加聚腺苷酸尾的信号。所有这些序列合适的插入真核表达载体。
适用于酵母宿主的启动序列的例子包括3-磷酸甘油酸激酶或其它糖酵解酶的启动子，诸如烯醇酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、己糖激酶、丙酮酸脱羧酶、磷酸果糖激酶、葡萄糖-6-磷酸异构酶、3-磷酸甘油酸变位酶、丙酮酸激酶、磷酸丙糖异构酶、磷酸葡萄糖异构酶和葡糖激酶。
作为具有通过生长条件控制转录的额外优点的诱导型启动子的其它酵母启动子是醇脱氢酶2、异细胞色素C、酸性磷酸酶、与氮代谢有关的降解酶、金属硫蛋白、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、及负责麦芽糖和半乳糖利用的酶的启动子区。适用于酵母表达的载体和启动子进一步记载于EP 73,657。酵母增强子也可以有利的与酵母启动子一起使用。
在哺乳动物宿主细胞中由载体转录抗体受到例如从病毒诸如多瘤病毒、禽痘病毒、腺病毒(诸如腺病毒2)、牛乳头瘤病毒、禽类肉瘤病毒、巨细胞病毒、逆转录病毒、乙肝病毒和最优选的猿猴病毒40(SV40)基因组，从异源哺乳动物启动子例如肌动蛋白启动子或免疫球蛋白启动子，及此热休克启动子获得的启动子的控制，倘若此类启动子与宿主细胞系统相容的话。
方便的以SV40限制性片段的形式获得SV40病毒的早期和晚期启动子，该片段还包含SV40病毒复制起点。方便的以HindIIIE限制性片段的形式获得人巨细胞病毒的立即早期启动子。美国专利No.4,419,446中披露了使用牛乳头瘤病毒作为载体在哺乳动物宿主中表达DNA的系统。美国专利No.4,601,978中记载了该系统的一种改良。关于在小鼠细胞中在来自单纯疱疹病毒的胸苷激酶启动子的控制下表达人β-干扰素cDNA还可参阅Reyes等(1982)Nature 297：598-601。或者，可以使用劳氏肉瘤病毒长末端重复序列作为启动子。
(v)增强子元件构件
常常通过将增强子序列插入载体来提高高等真核细胞对编码本发明抗体的DNA的转录。现在知道来自哺乳动物基因(球蛋白、弹性蛋白酶、清蛋白、甲胎蛋白和胰岛素)的许多增强子序列。然而，通常使用来自真核细胞病毒的增强子。例子包括SV40复制起点晚期一侧的增强子(bp 100-270)、巨细胞病毒早期启动子增强子、多瘤病毒复制起点晚期一侧的增强子、和腺病毒增强子。关于激活真核启动子的增强元件还可参阅Yaniv(1982)Nature297：17-18。可以将增强子剪接到载体中，位于抗体编码序列的5′或3′位置，但是优选位于启动子的5′位点。
(vi)转录终止构件
用于真核宿主细胞(酵母、真菌、昆虫、植物、动物、人或来自其它多细胞生物体的有核细胞)的表达载体还将包含终止转录和稳定mRNA所必需的序列。此类序列通常可以从真核或病毒DNA或cDNA非翻译区的5′端和偶尔的3′端获得。这些区域包含在编码抗体的mRNA的非翻译部分中转录成聚腺苷酸化片段的核苷酸区段。一种有用的转录终止构件是牛生长激素聚腺苷酸化区。参阅WO 94/11026及其中披露的表达载体。
(vii)宿主细胞的选择和转化
适于克隆或表达本文载体中的DNA的宿主细胞是上文描述的原核生物、酵母或高等真核细胞。适于此目的的原核生物包括真细菌，诸如革兰氏阴性生物体或革兰氏阳性生物体，例如肠杆菌科，诸如埃希氏菌属(Escherichia)例如大肠埃希氏菌(E.coli)、肠杆菌属(Enterobacter)、欧文氏菌属(Erwinia)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、变形菌属(Proteus)、沙门氏菌属(Salmonella)例如鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、沙雷氏菌属(Serratia)例如粘质沙雷氏菌(Serratia marcescans)、志贺氏菌属(Shigella)、以及芽孢杆菌属(Bacilli)诸如枯草芽孢杆菌(B.subtilis)和地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)(例如1989年4月12日公开的DD 266,710中披露的地衣芽孢杆菌41P)、假单胞菌属Pseudomonas)诸如铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)、和链霉菌属(Streptomyces)。一种优选的大肠杆菌克隆宿主是大肠杆菌294(ATCC 31,446)，尽管其它菌株诸如大肠杆菌B、大肠杆菌X1776(ATCC 31,537)和大肠杆菌W3110(ATCC27,325)也是合适的。这些例子是例示性的，而不是限制性的。
在原核生物以外，真核微生物诸如丝状真菌或酵母也是编码抗体的载体的合适克隆或表达宿主。酿酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)或常用的面包酵母是最常用的低等真核宿主微生物。然而，通常可获得许多其它属、种和菌株且可用于本发明，诸如粟酒裂殖糖酵母(Schizosaccharomyces pombe)；克鲁维酵母属(Kluyveromyces)宿主，诸如例如乳酸克鲁维酵母(K.lactis)、脆壁克鲁维酵母(K.fragilis)(ATCC 12,424)、保加利亚克鲁维酵母(K.bulgaricus)(ATCC 16,045)、威克克鲁维酵母(K.wickeramii)(ATCC 24,178)、K.waltii(ATCC 56,500)、果蝇克鲁维酵母(K.drosophilarum)(ATCC 36,906)、耐热克鲁维酵母(K.thermotolerans)和马克思克鲁维酵母(K.marxianus)；亚罗酵母属(Yarrowia)(EP 402,226)；巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)(EP 183,070)；假丝酵母属(Candida)；瑞氏木霉(Trichoderma reesia)(EP 244,234)；粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)；许旺酵母属(Schwanniomyces)，诸如许旺酵母(Schwanniomyces occidentalis)；和丝状真菌，诸如例如脉孢菌属(Neurospora)、青霉属(Penicillium)、弯颈霉属(Tolypocladium)、和曲霉属(Aspergillus)宿主诸如构巢曲霉(A.nidulans)和黑曲霉(A.niger)。
适于表达糖基化抗体的宿主细胞衍生自多细胞生物体。无脊椎动物细胞的例子包括植物和昆虫细胞。已经鉴定了许多杆状病毒株和变体及相应的允许昆虫宿主细胞，它们来自诸如草地夜蛾Spodoptera frugiperda(毛虫)、埃及伊蚊Aedes aegypti(蚊子)、白纹伊edes albopictus(蚊子)、黑腹果蝇Drosophila melanogaster(果蝇)和家蚕Bombyx mori等宿主。公众可获得多种病毒株用于转染，例如苜蓿尺蠖Autographa califomica NPV的L-1变体和家蚕Bombyd mori NPV的Bm-5株，而且此类病毒可依照本发明用作本文中的病毒，特别是用于转染草地夜蛾细胞。还可利用棉、玉米、马铃薯、大豆、矮牵牛、番茄和烟草的植物细胞培养物作为宿主。
然而，脊椎动物细胞得到最多关注，而且培养(组织培养)中脊椎动物细胞的繁殖已经成为常规流程。有用哺乳动物宿主细胞系的例子是用SV40转化的猴肾CV1系(COS-7，ATCC CRL 1651)；人胚肾系(293或为了在悬浮培养中生长而亚克隆的293细胞，Graham等(1977)J.Gen Virol.36：59)；幼仓鼠肾细胞(BHK，ATCC CCL 10)；中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR(CHO，Urlaub等(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4216))；小鼠塞托利(sertoli)细胞(TM4，Mather(1980)Biol.Reprod.23：243-251)；猴肾细胞(CV1，ATCC CCL 70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)；人宫颈癌细胞(HELA，ATCCCCL 2)；犬肾细胞(MDCK，ATCC CCL 34)；牛鼠(bufflo rat)肝细胞(BRL 3A，ATCC CRL 1442)；人肺细胞(W138，ATCC CCL 75)；人肝细胞(Hep G2，HB8065)；小鼠乳瘤(MMT 060562，ATCC CCL 51)；TRI细胞(Mather等(1982)Annals N.Y.Acad.Sci.383：44-68；MRC5细胞；FS4细胞；和人肝瘤系(Hep G2)。
用上文所述用于生产抗体的表达或克隆载体转化宿主细胞，并在为了诱导启动子、选择转化子或扩增编码期望序列的基因而适当更改的常规营养培养基中进行培养。
(viii)培养宿主细胞
可以在多种培养基中培养用于生产本发明抗体的宿主细胞。商品化培养基诸如Ham氏F10(Sigma)、极限必需培养基(MEM，Sigma)、RPMI-1640(Sigma)、和Dulbecco氏改良的Eagle氏培养基(DMEM，Sigma)适于培养宿主细胞。另外，可以使用下列文献中记载的任何培养基作为宿主细胞的培养基：Ham等(1979)，Meth.Enz.58：44；Barnes等(1980)，Anal.Biochem.102：255；美国专利No.4,767,704；4,657,866；4,927,762；4,560,655；或5,122,469；WO90/03430；WO 87/00195；或美国专利复审30,985。任何这些培养基可以根据需要补充激素和/或其它生长因子(诸如胰岛素、运铁蛋白或表皮生长因子)、盐(诸如氯化钠、钙、镁和磷酸盐)、缓冲剂(诸如HEPES)、核苷酸(诸如腺苷和胸苷)、抗生素(诸如GENTAMYCINTM药物)、痕量元素(定义为通常以微摩尔范围的终浓度存在的无机化合物)、和葡萄糖或等效能源。还可以以本领域技术人员知道的适宜浓度包含任何其它必需补充物。培养条件，诸如温度、pH等，就是先前为表达而选择用于宿主细胞的，这对于普通技术人员而言是显而易见的。
(ix)抗体纯化
在使用重组技术时，可以在细胞内、在周质空间中生成抗体，或者直接分泌到培养基中。如果在细胞内生成抗体，那么作为第一步，通过例如离心或超滤除去宿主细胞或裂解片段的微粒碎片。Carter等(1992)Bio/Technology10：163-167记载了用于分离分泌到大肠杆菌周质空间的抗体的流程。简单的说，在存在乙酸钠(pH 3.5)、EDTA和苯甲基磺酰氟(PMSF)时使细胞糊融化约30分钟。可通过离心除去细胞碎片。如果将抗体分泌到培养基中，那么通常首先使用商品化蛋白质浓缩滤器，例如Amicon或Millipore Pellicon超滤单元浓缩来自此类表达系统的上清液。在任何上述步骤中，可以包括蛋白酶抑制剂诸如PMSF来抑制蛋白水解，而且可以包括抗生素来防止外来污染物的生长。
可以使用例如羟磷灰石层析、凝胶电泳、透析和亲和层析来纯化由细胞制备的抗体组合物，优选的纯化技术是亲和层析。蛋白A作为亲和配体的适宜性取决于抗体中存在的任何免疫球蛋白Fc区的种类和同种型。蛋白A可用于纯化基于人γ1、γ2或γ4重链的抗体(Lindmark等(1983)J.Immunol.Meth.62：1-13)。蛋白G推荐用于所有小鼠同种型和人γ3(Guss等(1986)EMBO J.5：1567-1575)。亲和配体所附着的基质最常用的是琼脂糖，但是可以使用其它基质。物理稳定的基质诸如可控孔径玻璃或聚(苯乙烯二乙烯)苯容许获得比琼脂糖所能获得的更快的流速和更短的加工时间。若抗体包含CH3结构域，则可使用Bakerbond ABXTM树脂(J.T.Baker，Phillipsburg，NJ)进行纯化。根据待回收的抗体，也可使用其它蛋白质纯化技术，诸如离子交换柱上的分级、乙醇沉淀、反相HPLC、硅土上的层析、肝素SEPHAROSETM上的层析、阴离子或阳离子交换树脂(诸如聚天冬氨酸柱)上的层析、层析聚焦、SDS-PAGE、和硫酸铵沉淀。
在任何预备性纯化步骤后，包含目的抗体和污染物的混合物可进行低pH疏水相互作用层析，使用pH大约2.5-4.5之间的洗脱缓冲液，优选在低盐浓度进行(例如大约0-0.25M盐)。
药用配制剂
抗体的治疗用配制剂可通过将具有期望纯度的抗体与任选的生理学可接受的载体、赋形剂或稳定剂伍(Remington′s Pharmaceutical Sciences，16thedition，Osol，A.Ed.，1980)混合，以冻干剂型或水溶液的形式制备供贮存。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在所采用的剂量和浓度对接受者是无毒的，包括缓冲剂，诸如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(诸如氯化十八烷基二甲基苄基铵；氯化己烷双胺；苯扎氯铵、苯索氯铵；酚、丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烷基酯，诸如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，诸如血清清蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，诸如EDTA；糖类，诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐反荷离子，诸如钠；金属复合物(例如Zn-蛋白质复合物)；和/或非离子表面活性剂，诸如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。
本文中的配制剂还可含有所治疗具体适应症所必需的超过一种活性化合物，优选那些活性互补且彼此没有不利影响的。例如，可能希望进一步提供免疫抑制剂。合适的是，此类分子以对于预定目的有效的量组合存在。
活性成分还可包载于例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊中(例如分别是羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)、在胶状药物投递系统中(例如脂质体、清蛋白微球体、微乳剂、纳米颗粒和纳米胶囊)、或在粗滴乳状液中。此类技术披露于例如Remington′sPharmaceutical Sciences，16th edition，Osol，A.Ed.，1980。
用于体内施用的配制剂必须是无菌的。这可容易的通过使用无菌滤膜过滤来实现。
可制备持续释放制剂。持续释放制剂的合适例子包括含有抗体的固体疏水性聚合物半透性基质，该基质是定型产品的形式，例如薄膜或微胶囊。持续释放基质的例子包括聚酯、水凝胶(例如聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚交酯(美国专利No.3,773,919)、L-谷氨酸与L-谷氨酸γ乙酯的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物诸如LUPRONDEPOTTM(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林构成的可注射微球体)及聚-D-(-)-3-羟基丁酸。虽然诸如乙烯-乙酸乙烯和乳酸-乙醇酸等聚合物能够释放分子达100天以上，但是某些水凝胶释放蛋白质的时间较短。当胶囊化抗体在体内长时间维持时，它们可能由于暴露于37℃的潮湿环境而变性或聚集，导致生物学活性损失和免疫原性可能改变。可以根据相关机制来设计合理的稳定化策略。例如，如果发现聚集机制是经由硫-二硫化物互换的分子间S-S键形成，那么可通过修饰巯基残基、由酸性溶液冻干、控制湿度、采用适宜添加剂和开发特定聚合物基质组合物来实现稳定。
治疗用途
设想了本发明的抗体可用于治疗哺乳动物。例如，在一个实施方案中，给非人哺乳动物施用抗体用以获得临床前数据。示例性的要治疗的非人哺乳动物包括非人灵长类动物、犬、猫、啮齿类动物和其它临床前研究所用的哺乳动物。这类哺乳动物可以是用抗体治疗的疾病的已确立的动物模型，或者可用于研究目的抗体的毒性。在这些实施方案的每一个中，可以在哺乳动物中进行剂量放大研究。例如，当抗体是抗NRP1抗体时，将它施用给实体瘤模型的宿主啮齿类动物。
另外/或者，抗体用于治疗人，例如患有能由施用抗体而受益的疾病或病症的患者。
本发明涵盖抗血管发生癌症疗法，一种新的癌症治疗策略，其目标在于抑制提供营养以支持肿瘤生长所需的肿瘤血管发育。因为血管发生涉及原发性肿瘤生长和转移，所以本发明提供的抗血管发生治疗能够在原发性位置处抑制肿瘤的瘤生长，以及在继发性位置处防止肿瘤转移，因而容许其它治疗剂攻击肿瘤。本文中要治疗的癌症的实例包括但不限于癌、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤、和白血病。此类癌症的更具体例子包括鳞状细胞癌、肺癌(包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺的腺癌、和肺的鳞癌)、腹膜癌、肝细胞癌、胃癌(gastric or stomach cancer)(包括胃肠癌)、胰腺癌、成胶质细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌(liver cancer or hepatic carcinoma)、膀胱癌、肝瘤(hepatoma)、乳腺癌、结肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾癌(kidney or renal cancer)、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、及各种类型的头和颈癌，以及B细胞淋巴瘤(包括低级/滤泡性非何杰金氏淋巴瘤(NHL)、小淋巴细胞性(SL)NHL、中级/滤泡性NHL、中级弥漫性NHL、高级成免疫细胞性NHL、高级成淋巴细胞性NHL、高级小无核裂细胞性NHL、贮积病(bulky disease)NHL、套细胞淋巴瘤、AIDS相关淋巴瘤、和瓦尔登斯特伦氏(Waldenstrom)巨球蛋白血症)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、毛细胞性白血病、慢性成髓细胞性白血病、和移植后淋巴增殖性病症(PTLD)、以及与瘢痣病(phakomatoses)、水肿(诸如与脑瘤有关的)和梅格斯氏(Meigs)综合征有关的异常血管增殖。更具体的，本发明抗体能治疗的癌症包括乳腺癌、结肠直肠癌、直肠癌、非小细胞肺癌、非何杰金氏淋巴瘤(NHL)、肾细胞癌、前列腺癌、肝癌、胰腺癌、软组织肉瘤、卡波西氏肉瘤、类癌癌(carcinoid carcinoma)、头和颈癌、黑素瘤、卵巢癌、间皮瘤、和多发性骨髓瘤。更优选的是，本发明的方法用于治疗人患者的结肠直肠癌。
设想了在用于治疗各种疾病诸如肿瘤时，本发明的抗体可以与其它适用于相同或相似疾病的治疗剂组合在一起。在用于治疗癌症时，本发明的抗体可以与常规癌症疗法(诸如手术、放疗、化疗或其组合)组合使用。
在某些方面，可用于与本发明抗体一起构成组合癌症疗法的其它治疗剂包括其他抗血管发生剂。许多抗血管发生剂已得到鉴定并且是本领域已知的，包括Carmeliet和Jain(2000)所列的那些。
在一个方面，本发明的抗体与VEGF拮抗剂或VEGF受体拮抗剂(诸如抗VEGF抗体、VEGF变体、可溶性VEGF受体片段、能阻断VEGF或VEGFR的适体、中和性抗VEGFR抗体、VEGFR酪氨酸激酶的抑制剂及其任何组合)组合使用。或者/另外，两种或更多种抗NRP1抗体可共施用给患者。在一个更优选的实施方案中，本发明的抗NRP1A或抗NRPB抗体与抗VEGF抗体组合使用以产生叠加或协同效应。优选的抗VEGF抗体包括那些与抗hVEGF抗体A4.6.1结合相同表位的抗体。更优选的是，抗VEGF抗体是bevacizumab(贝伐单抗)或ranibizumab(兰尼单抗)。
在一些其它方面，可用于与本发明抗体一起构成组合肿瘤疗法的其它治疗剂包括涉及肿瘤生长的其它因子(诸如EGFR、ErbB2(也称为Her2)、ErbB3、ErbB4、或TNF)的拮抗剂。优选的是，本发明的抗NRP1抗体可以与靶向一种或多种酪氨酸激酶受体(诸如VEGF受体、FGF受体、EGF受体和PDGF受体)的小分子受体酪氨酸激酶抑制剂(RTKI)组合使用。许多治疗性小分子RTKI是本领域已知的，包括但不限于vatalanib(PTK787)、erlotinib
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OSI-7904、ZD6474
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semaxanib(SU5416)、AMG706、AG013736、ImatinibMLN-518、CEP-701、PKC-412、Lapatinib(GSK572016)、
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AZD2171、sorafenib
Figure A20068004583900466
XL880、和CHIR-265。
本发明的抗NRP1抗体，单独的或与第二治疗剂(诸如抗VEGF抗体)组合的，都可进一步与一种或多种化疗剂组合使用。多种化疗剂可用于与本发明一起构成组合治疗方法。所设想的示例性的和非限制性的化疗剂列表在本文“定义”小节中有提供。
当抗NRP1抗体与第二治疗剂共施用时，可首先施用第二治疗剂，然后施用抗NRP1抗体。然而，也设想了同时施用或首先施用抗NRP1抗体。第二治疗剂的合适剂量就是当前所用的那些，而且可以由于该药剂与抗NRP1抗体的组合(协同)作用而降低。
为了预防或治疗疾病，抗体的合适剂量将取决于要治疗的疾病的类型、疾病的严重性和进程、是为了预防还是为了治疗目的而施用抗体的、以前的疗法、患者的临床史和对抗体的应答、和主治医师的判断。合适的是，抗体在一次或在一系列治疗中施用于患者。
根据疾病类型和严重性，例如，约1μg/kg至50mg/kg(例如0.1-20mg/kg)抗体是向患者施用的初始候选剂量，无论是一次或多次分开给药，或者通过连续输注。根据上述因素，典型的每日剂量的范围可以是约1μg/kg至约100mg/kg或更多。对于持续数天或更长时间的重复给药，根据状况，治疗持续到发生所希望的疾病症状消退。然而，可以用其它剂量方案。在一个优选的方面，本发明的抗体每两至三周施用一次，剂量范围为约5mg/kg至约15mg/kg。更优选的是，这类剂量给药方案与化疗方案组合使用，作为治疗转移性结肠直肠癌的一线疗法。在一些方面，化疗方案包括传统的高剂量间歇性给药。在一些其它方面，用更小且更频繁的剂量施用化疗剂而无预定的中断(“节奏性化疗”)。本发明疗法过程可容易地用常规技术和测定法来监测。
抗体组合物将以与优良医学实践一致的方式配成剂型、定剂量(dosed)、和施用。本文考虑的因素包括所治疗的特定疾病、所治疗的特定哺乳动物、患者个体的临床状况、病症成因、药剂投递位置、施用方法、施用计划、和医学从业人员已知的其它因素。要施用的抗体的“治疗有效量”将根据这类考量而决定，而且是预防、改善、或治疗疾病或病症所必需的最小量。抗体不必是但任选与一种或多种当前用于预防或治疗所讨论病症的药剂配制成剂型。这类其它药剂的有效量取决于存在于配方中的抗体量、病症或治疗法的类型、和以上讨论的其它因素。这些通常是以与上文所用相同剂量和施用路径使用，或是迄今所用剂量的大约1-99％。一般而言，疾病或病症的改善或治疗包括减轻一种或多种症状或与疾病或病症相关的医学问题。对于癌症，药物的治疗有效量可实现以下一项或组合：减少癌细胞数；缩小肿瘤尺寸；抑制(即降低到某种程度和/或停止)癌细胞浸润入周围组织；抑制肿瘤转移；以某种程度抑制肿瘤生长；和/或以某种程度减轻一种或多种与癌症相关的症状。到药物可防止已有癌细胞生长和/或杀死已有癌细胞的程度，它可以是细胞抑制性的和/或细胞毒性的。在一些实施方案中，本发明的组合物可用于防止受试者或哺乳动物中疾病或病症的发作或复发。
非治疗用途
本发明的抗体可用作亲和纯化试剂。在这种方法中，使用本领域众所周知的方法将抗体固定在固相上，诸如Sephadex树脂或滤纸。使固定化抗体接触含有待纯化抗原的样品，然后用合适的溶剂清洗支持物，这将基本上除去样品中固定化抗体所结合的待纯化抗原以外的所有物质。最后，用另一种合适的将从抗体上释放抗原的溶剂清洗支持物，诸如甘氨酸缓冲液pH 5.0。
本发明的抗体还可用于诊断性测定法，例如用于检测目的抗原在特定细胞、组织或血清中的表达。
就诊断性应用而言，通常用可检测模块标记抗体。可利用许多标记物，一般可分成以下几类：
(a)放射性同位素，诸如35S、14C、125I、3H和131I。例如，可使用CurrentProtocols in Immunology，Volumes 1and 2，Coligen等，Ed.，Wiley-Interscience，New York，New York，Pubs.1991中描述的技术用放射性同位素标记抗体，并可使用闪烁计数来测量放射性。
(b)荧光标记物，诸如可利用稀士螯合物(铕螯合物)或荧光素及其衍生物、若丹明及其衍生物、丹酰、丽丝胺、藻红蛋白和德克萨斯红。例如，可使用Current Protocols in Immunology，见上文中披露的技术使荧光标记物与抗体偶联。可使用荧光计对荧光进行定量。
(c)可利用各种酶-底物标记物且美国专利No.4,275,149中提供了有关它们中的一些的综述。酶一般催化可使用多种技术测量的显色底物的化学改变。例如，酶可以催化可通过分光光度法测量的底物的颜色改变。或者，酶可以改变底物的荧光或化学发光。上文描述了用于对荧光改变进行定量的技术。化学发光底物通过化学反应变成电子激发态，然后可发射可测量(例如使用化学发光计)或给荧光受体提供能量的光。酶标记物的例子包括萤光素酶(例如萤火虫萤光素酶和细菌萤光素酶；美国专利No.4,737,456)、萤光素、2，3-二氢酞嗪二酮类、苹果酸脱氢酶、尿素酶、过氧化物酶诸如辣根过氧化物酶(HRPO)、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、溶菌酶、糖氧化酶(例如葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶)、杂环氧化酶(诸如尿酸酶和黄嘌呤氧化酶)、乳过氧化物酶、微过氧化物酶等。用于使酶与抗体偶联的技术描述于O′Sullivan等(1981)Methods for the Preparationof Enzyme-Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay，Methods inEnzym.，J.Langone&H.Van Vunakis Ed.，Academic Press，New York，73：147-166。
酶-底物组合的例子包括例如：
(i)辣根过氧化物酶(HRPO)，其以过氧化氢为底物，其中过氧化氢氧化染料前体(例如邻苯二胺(OPD)或3，3′，5，5′-四甲基联苯胺盐酸盐(TMB))；
(ii)碱性磷酸酶(AP)与作为显色底物的对硝基苯基磷酸酯；和
(iii)β-D-半乳糖苷酶(β-D-Gal)与显色底物(例如对硝基苯基-β-D-半乳糖苷)或荧光底物4-甲基伞形基-β-D-半乳糖苷。
本领域技术人员可利用许多其它酶-底物组合。有关它们的一般性综述参见美国专利No.4,275,149和4,318,980。
有时，将标记物与抗体间接偶联。熟练技术人员了解实现这一目的的多种技术。例如，可将抗体与生物素偶联，而且可以将上述三大类标记物中的任一种与亲合素偶联，或反之亦然。生物素选择性结合亲合素，由此标记物可与抗体以这种间接方式偶联。或者，为了实现标记物与抗体的间接偶联，将抗体与小型半抗原(例如地高辛)偶联，并将上述不同类型的标记物之一与抗半抗原抗体(例如抗地高辛抗体)偶联。由此，可实现标记物与抗体的间接偶联。
在本发明的另一个实施方案中，抗体无需标记，而且可使用结合该抗体的经标记抗体检测其存在。
本发明的抗体可用于任何已知测定方法，诸如竞争性结合测定法、直接和间接夹心式测定法、及免疫沉淀测定法。Zola，Monoclonal Antibodies：AManual ofTechniques，pp.147-158，CRC Press，Inc.，1987。
竞争性结合测定法依赖于经标记标准品与测试样品分析物竞争结合有限量的抗体的能力。测试样品中的抗原量与结合至抗体的标准品量成反比。为了便于测定得到结合的标准品的量，一般在竞争之前或之后使抗体不溶解，从而可以方便的将结合至抗体的标准品和分析物与仍然未结合的标准品和分析物分离。
三明治/夹心式测定法牵涉使用两种抗体，它们都能够结合待检测蛋白质的不同免疫原性部分或表位。在三明治/夹心式测定法中，测试样品分析物得到固定在固体支持物上的第一抗体的结合，此后第二抗体结合至分析物，如此形成不溶性三元复合物。参见例如美国专利No.4,376,110。第二抗体自身可以是用可检测模块标记的(直接夹心测定法)，或者可以使用经可检测模块标记的抗免疫球蛋白抗体来测量(间接夹心测定法)。例如，一种类型的夹心测定法是ELISA测定法，其中的可检测模块是酶。
对于免疫组织化学，例如，肿瘤样品可以是新鲜的或冷冻的，或者可以包埋在石蜡中并用防腐剂诸如福尔马林固定。
抗体还可用于体内诊断性测定法。一般而言，用放射性核素(诸如111In、99Tc、14C、131I、125I、3H、32P或35S)或染料标记抗体，从而可使用免疫闪烁描记法(immunoscintiography)来定位肿瘤。
在一个实施方案中，检测生物学样品(例如组织、血液、血清、脊髓液)或所制备生物学样品中的NRP1的方法可包括使本发明抗体接触该样品并观察结合至样品中NRP1的抗NRP1抗体或测定结合至样品中NRP1的抗NRP1抗体的量的步骤。在另一个实施方案中，检测受试者(例如人、小鼠、兔、大鼠等)中的NRP1的方法包括对受试者施用本发明的抗体并观察结合至受试者中NRP1的抗NRP1抗体或测定结合至受试者中NRP1的抗NRP1抗体的量的步骤。
诊断试剂盒
为方便起见，可以在试剂盒中提供本发明的抗体，即以预定量包装的试剂组合及实施诊断测定法的说明书。若抗体是用酶标记的，则试剂盒将包括酶所需要的底物和辅因子(例如提供可检测生色团或荧光团的底物前体)。另外，可以包括其它添加剂，诸如稳定剂、缓冲剂(例如封闭缓冲液或裂解缓冲液)等等。各种试剂的相对量可以广泛变化，以提供实质性优化测定法灵敏度的、试剂在溶液中的浓度。具体而言，可以以包含赋形剂的干粉形式提供试剂，通常是冻干的，它们在溶解后提供具有适宜浓度的试剂溶液。
制品
在本发明的另一个实施方案中提供了包含可用于治疗上文所述病症的物质的制品。所述制品包括容器和标签。合适的容器包括例如药瓶、药管、注射器和试管。所述容器可以用多种材料制成，诸如玻璃或塑料。所述容器装有有效治疗所述疾患的组合物，可以具有无菌存取口(例如所述容器可以是带有皮下注射针可刺穿的塞子的静脉内溶液袋或药瓶)。所述组合物中的活性药剂是抗体。容器上或与容器有关的标签指明该组合物用于治疗所选疾患。所述制品可进一步包括第二容器，其中装有药剂学可接受的缓冲液，诸如磷酸盐缓冲盐水、林格氏(Ringer)溶液和右旋糖溶液。它可进一步包括从商业和用户立场出发需要的其它物质，包括其它缓冲液、稀释剂、滤器、针头、注射器和带有使用说明书的包装插页。
以下实施例仅仅意图例示本发明的实施，而非作为限制提供的。本文中所引用的所有专利和科学文献的公开内容完整收录作为参考。
实施例
实施例1：抗NRP1抗体的产生
A.抗体噬菌体文库的产生
产生展示于噬菌体上或用其他技术展示的抗体文库的许多方法是本领域已知的。这些文库相对于常规杂交瘤技术的优点之一是，它们非常适于产生跨物种的功能性抗体，因为它们容许在体外选择和筛选而不会导入免疫耐受。Smith(1985)Science 228：1315-1317；Bradbury和Marks(2004)J ImmunolMethods 290：29-49。
一般来说，已开发两类组合抗体文库，区别在于全集的来源。当前大多数文库是“天然”抗体文库，其使用天然全集作为其多样性的来源，其中作为来自未免疫或经免疫的动物或人的免疫细胞的信使RNA的基因被扩增并克隆入用于噬菌体展示或其他展示技术(诸如核糖体或酵母展示)的载体中。天然抗体通常具有多种框架，其与可变的CDR序列及轻链与重链的组合一起，构成了文库多样性。文库容量决定了文库性能，因为一般来说，全集比文库容量更大。另一方面，合成文库是文库的新分支，其中设计了多样性并构建入含合成DNA的文库。已使用单种或多种框架。对于单框架文库，多样性来源仅依赖于设计用于产生多样CDR环的合成DNA的简并性。文库的多样性设计和容量对文库性能来说都是关键的，其可通过文库中找到的抗体的亲和力来测量。Knappik等(2000)J Mol Biol 296：57-86；Sheets等(1998)ProcNatl Acad Sci USA 95：6157-6162；de Haard等(1999)J Biol Chem274：18218-18230。
通过在可变重链互补决定区(CDR)内暴露于溶剂的位置上导入合成多样性，Lee等开发了构建于单个人框架(VLκI，VH子集III)上的噬菌体展示合成抗体文库。Sidhu等(2004)J Mol Biol 338：299-310；Lee等(2004)J Mol Biol340：1073-1093；Carter等(1992)Proc Natl Acad Sci USA 89：4285-4289。该“VH文库”被展示为二价抗原结合片段(Fab’2)并用定制密码子来模拟人免疫球蛋白中观察到的天然多样性。Lee等(2004)J Immunol Methods 284：119-132。虽然根据衍生抗体的亲和力和功能的测量，VH文库性能良好，但是可以要求进一步修改文库设计以产生感兴趣的某些抗原靶物的功能性抗体。近期可用的用于寡核苷酸合成的三核苷酸能够增加氨基酸多样性而不增加DNA多样性。因此如本文所述产生了新的“VH/VL文库”，其中CDR-L3中的高度可变位置被进一步多样化，因为CDR-H3和CDR-L3形成抗原结合位点的内球。Mian等(1991)J Mol Biol 217：133-151。
材料和方法
在CDR-H3上有终止密码子的噬菌粒pV0350-4上用寡核苷酸指导的诱变并在M13噬菌体颗粒的表面上二价展示来产生具有共有CDR-L1、-L2、-L3、-H1和-H2的VH/VL未免疫文库模板。Lee等(2004)J Mol Biol 340：1073-1093。用(Kunkel等(1991)Methods Enzymol 204：125-139)所述的Kunkel诱变方法构建噬菌体展示文库，其中设计诱变寡核苷酸混合物在CDR-L3、H1、H2和H3的设计位点上导入突变并修复CDR-H3终止密码子。如(Sidhu等(2004))所述，将诱变反应物(～10μg DNA)电穿孔入大肠杆菌SS320细胞(～1011个细胞)。
结果
此处所述的VH/VL文库利用
Figure A20068004583900521
衍生的VLκI和VH子集III框架用于VH文库，其显示出在噬菌体上展示良好，在大肠杆菌中表达良好，而且能迅速转换成在哺乳动物细胞中表达良好的全长IgG。Lee等(2004)J Mol Biol340：1073-1093；Carter等(1992)Proc Natl Acad Sci USA 89：4285-4289。通过与噬菌体外壳蛋白P3融合，文库在噬菌体表面上展示为二价Fab(Fab’2)。该二价展示意图提高对固定化抗原的表观结合亲和力并帮助改善稀有或低亲和力噬菌体抗体克隆的回收率。
为了避免VH文库轻链中保持的
Figure A20068004583900522
衍生CDR序列带来的潜在偏好，将共有κI CDR序列导入VH/VL文库的模板。通过选择天然人抗体中存在的最优势的氨基酸来确定共有CDR残基。以前用于VH文库重链中以确保所有3个CDR中有诱变的终止密码子，被CDR-H1和CDR-H2的共有子集III序列进行相似的替换。共有CDR序列代表在每个位置上最优势的氨基酸。CDR-H3在抗原识别中起支配性作用，因此在H3中放置数个终止密码予以确保文库的功能性抗体克隆相互不同。Xu等(2000)Immunity 13：37-45。预计人共有CDR序列的存在容许部分突变的变体(并非所有靶CDR被改变)被展示并保持潜在结合功能。用这种方式，VH/VL设计具有增加文库中功能性噬菌体抗体克隆比率的优点。如表I所示，所用的CDR序列是CDR-L1的SISSYL(第28-33位)，CDR-L2的GASSRA(第50-55位)，CDR-L3的YYSSPL(第91-96位)，CDR-H1的FTFSSYAMS(第27-35位)，CDR-H2的RISPSGGSTY(第50-58位)，和CDR-H3的WXXXRPXXMDY(第95-102位，X是终止密码子)。人抗体中每个位置的优势程度也如表I所示。
根据天然抗体序列中它们的高溶剂暴露性和/或特别高的可变性，将VH/VL文库中的多样性导入CDR位置子集。为诱变选择的位置和要导入的多样性如表II所示。例如，在CDR-H1中，选择第27、28、30、31、32、33和34位来多样化。对于VH/VL文库设计，用简并寡密码子或三核苷酸来指导每个位置中的多样性，使之能代表最优势的氨基酸。例如，在CDR-H1(第30位)中，丝氨酸代表约50％的天然多样性，由此使用有约52％丝氨酸和2.5％除了半胱氨酸之外的氨基酸的三核苷酸的混合物(X1)。
CDR-H3和CDR-L3形成抗原结合位点的中心，因此在结构已知的抗体-抗原复合物中显示出最高频率的抗原接触。Chothia等(1989)Nature342：877-883。将CDR-L3中5个具有最高可变性的残基(表II)进行随机化。总的CDR-H3在长度、序列、和结构上是最多样性的，而且是天然抗体多样性的关键成分。Xu和Davis(2000)Immunity 13：37-45；Wu等(1993)Proteins16：1-7。因此，构建具有不同CDR-H3长度的12个子文库，其长度范围为9至20个氨基酸。组合后，这些子文库覆盖了天然抗体中约90％的CDR-H3长度变化。用三核苷酸密码子合成编码CDR-H3的寡核苷酸。这能使我们容易地删除半胱氨酸(CDR-H3中很少见)，并提升甘氨酸、酪氨酸和丝氨酸(CDR-H3中最丰富的残基)的水平。Mian等(1991)J Mol Biol 217：133-151。CDR-H3中每个位置用密码子X7(三核苷酸混合物，其中有丝氨酸、酪氨酸和甘氨酸各约15.6％和除了半胱氨酸之外的其余氨基酸各3.1％)(对所有三核苷酸混合物的理论计算结果)。在CDR-H1、H2、H3、和L3的所选位置中也使用三核苷酸的不同组合。如表II和补充表I所示，密码子X1至X6有高百分比的丝氨酸、酪氨酸、或甘氨酸。X1有52.5％的丝氨酸，X2有52.5％的酪氨酸，X3有10％的酪氨酸、甘氨酸或丝氨酸，X4有28.8％的甘氨酸，X5有19.2％的酪氨酸、甘氨酸或丝氨酸，而X6有20％的酪氨酸或丝氨酸。估计VH/VL抗体噬菌体文库有约1010种变体被展示。
表I：VH/VL文库模板中CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1和CDR-H2的共有序列。通过选择天然人抗体中存在的最优势氨基酸来确定共有CDR残基。显示了人抗体中给定位置上的每种残基的优势程度(％)，其由Kabat数据库(Kabat等(1977)J Biol Chem 252：6609-6616)中约1600种人轻链序列和3500种人重链序列比对而计算得到。
Figure A20068004583900541
表II：VH/VL文库CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的设计多样性。CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3中选出进行随机化的CDR位置与文库模板中的共有残基一起列出。设计多样性或是由定制的简并密码子(斜体)编码的一组残基或是由三核苷酸密码子混合物(粗体)编码的除了半胱氨酸之外的19种氨基酸，使得每个位置上所编码的氨基酸类型的百分比接近或高于数据库中找到的氨基酸类型的50％。对于特定位置，用对Tyr(Y)、Gly(G)和Ser(S)具有不同偏好的三核苷酸密码子混合物导入除了半胱氨酸之外的所有19种氨基酸。
Figure A20068004583900551
B.噬菌体衍生的单克隆抗NRP1抗体的产生
材料和方法
文库分选和筛选以鉴定抗NRP1抗体-将人和鼠NRP1构建体(1-641aa)克隆入哺乳动物表达载体并在CHO细胞中表达。截短形式的NRP-1(a1a2和b1b2结构域)在杆状病毒中表达。NUNC 96孔Maxisorp免疫板在4℃用靶抗原(10ug/ml)包被过夜并在室温用噬菌体封闭缓冲液PBST(PBS和1％BSA和0.05％Tween20)封闭1小时。向抗原平板加入抗体噬菌体文库并于室温温育过夜。第二天用PBT(含0.05％T-20的PBS)清洗经抗原包被的平板10次，并用50mM HCl和500mM NaCl洗脱所结合的噬菌体30分钟并用等体积的1M Tris碱pH7.5中和。回收的噬菌体在大肠杆菌XL-1Blue细胞中扩增。在后续选择轮次中，抗体噬菌体与抗原包被板的温育缩短至2-3小时，而且平板清洗的严谨度逐渐升高。
抗NRP1抗体结合亲和力、特异性和流式细胞计量术分析-用所述竞争性噬菌体结合ELISA测定噬菌体抗体IC50值。Lee等(2004)J Mol Biol340：1073-1093。竞争曲线用4参数非线性回归曲线拟合程序(Kaleidagraph，Synergy Software)拟合，来确定IC50值，其作为溶液结合阶段中抑制50％噬菌体展示抗体与固定化抗原结合的抗原浓度来计算。
然后，感兴趣的克隆通过将各克隆的VL和VH区分别克隆入LG3和LPG4载体来重定格式为IgG(Carter等(1992)Proc Natl Acad Sci USA89：4285-4289)，在哺乳动物细胞中瞬时表达，和用蛋白A柱纯化。为了进行抗NRP1IgG的结合亲和力测定，用BIAcoreTM-3000设备进行表面等离振子共振(SPR)测量。将抗NRP1 IgG偶联至已活化的CM5生物感应芯片，以获得约500响应单位(RU)，然后用1M乙醇胺封闭未反应的基团。为了进行动力学测量，在25℃以30μl/分钟的流速在PBST缓冲液中注入连续2倍稀释的神经纤毛蛋白(0.7-500nM)。用简单一对一朗格缪尔(Langmuir)结合模型(BIAcore评估软件3.2版)计算结合速率(kon)和解离速率(koff)。平衡解离常数(Kd)作为比率koff/kon来计算。
为了进行结合特异性测试，含10μg/ml IgG的PBST缓冲液与2μg/ml抗原包被的96孔Maxisorp板一起温育至少1小时，并用PBT缓冲液清洗平板。用抗人抗体-HRP偶联物检测所结合的抗体，用TMB底物显色约5分钟，用1MH3PO4淬灭，并用分光光度计于450nm处读数。
为了进行流式细胞计量术分析，用细胞解离缓冲液将HUVEC细胞从组织培养瓶上分离。所解离的细胞在PBS中清洗并重悬于含2％胎牛血清的PBS(FACS缓冲液)。细胞与含10ug/ml抗NRP1抗体或对照抗体(抗IgE)的FACS缓冲液在冰上温育30分钟。然后将细胞在PBS中清洗2次，并用含PE-Fab’2山羊抗人IgG，Fc特异性抗体的FACS缓冲液在冰上染色30分钟。用PBS清洗2次后，将细胞重悬于200μl FACS缓冲液并用Cell-Quest软件通过流式细胞计量术(FACS caliber，Benton Dickenson，Mountain View，CA)分析。
结果
第一轮选择，12个VH/VL子文库分别对固定化CHO细胞表达的hNRP1(a1a2b1b2)-Fc蛋白质进行淘选。扩增从每个子文库洗脱的噬菌体，然后合并用于第二轮选择。因为将hNRP1-Fc用作抗原，所以第一轮淘选后预先用过量的无关Fc融合蛋白吸收所合并的噬菌体，用以最小化抗Fc噬菌体抗体的回收。第四轮筛选后，对95个随机挑选的噬菌体克隆评估特异性结合NRP1的能力。90％的克隆是hNRP1结合阳性的，而且40％的阳性克隆结合人和鼠NRP1二者。
测序这些噬菌体克隆，并选择10个独特的克隆进行进一步表征。它们在噬菌体ELISA中都以低于70nM的IC50结合人和鼠NRP1。克隆YW64.3分别以0.5和3.4nM的IC50结合人和鼠NRP1(表III)。10个克隆的序列反映出VH/VL文库设计，其中有可变的CDR-H3长度并且遍及CDR-H1、H2和L3分布有各式变化，但仍旧保留了一些文库模板的共有CDR序列。克隆64.3和64.29在所有4个CDR中都有改变，而且也有对人和鼠NRP1二者的最佳结合亲和力(表III)。
表III：抗NRP1抗体的部分CDR序列和结合亲和力(噬菌体IC50)。只显示了最初鉴定自VH/VL文库的11个不同噬菌体克隆在随机化位置上的CDR氨基酸序列。用竞争性噬菌体ELISA测量IC50值形式的对hNRP1和mNRP1的亲和力。
  克隆  部分CDR-L3(91-96)   SEQIDNO：   部分CDR-H1(27-34)   SEQIDNO：   部分CDR-H2(50-58)   SEQIDNO：  部分CDR-H3(95-102)   SEQIDNO：
  YW64.3  YMSVPI   7   FSFSSEPI   18   SITGKNGYY   29  WGKKVYG----MDV   40
  YW 64.4  YYSSPL   8   FTFSSYAM   19   SIAGSGGYY   30  WGGSNGSG---FDY   41
  YW 64.14  YYSSPL   9   YSFSSHMM   20   SIYPPGGYY   31  WGSRSPG----MDV   42
  YW 64.23  YYSSPL   10   FTFSSYAM   21   TIIPHGGYY   32  WAKRSYG----MDV   43
  YW 64.28  YYSSPL   11   FTFSSYAM   22   WISPLNGYY   33  WGRRYIG----MDV   44
  YW 64.29  RYSVPI   12   FTFSSYQL   23   SIF-SGGYY   34  YGNHV------MDV   45
  YW64.30  YYSSPL   13   FTFSSYAM   24   SISRGDGYY   35  WAGGSA-----MDV   46
  YW 64.47  YYSSPL   14   FTFSQYSI   25   TIYPFGGYY   36  FGQSYYGGSYAMDV   47
  YW 64.53  YYSSPL   15   FTFTSRTM   26   SIS-SGGYY   37  WESYYG-----MDV   48
  YW 64.55  YYSSPL   16   FTFSSYAM   27   SIYSTGGYY   38  WGYPG------MDV   49
  YW 107.4  YYSSPL   17   FTFSSYAM   28   QISPAGGYN   39  ELPYYRMSKV-MDV   50
Figure A20068004583900581
用hNRP1的结构域截短变体来鉴定这些克隆的结合表位，所有的都定位于hNRP1的a1a2结构域上。为了选出结合NRP1的b1b2结构域并潜在阻断VEGF结合的噬菌体抗体，我们用杆状病毒表达的hNRP1(b1b2)-His作为固定化抗原启动新的淘选过程。4轮选择后，仅鉴定出一个独特的克隆YW107.4能结合人和鼠NRP1二者。YW107.4在噬菌体ELISA中以6和38nM的IC50结合人和鼠NRP1(表III)。
所选抗NRP1 IgG的表征-表III中选出的抗NRP1克隆重定格式为全长人IgG1，在CHO细胞中表达并纯化以进一步表征。抗NRP1噬菌体抗体YW64.3和YW107.4特异性结合人和鼠NRP1，而且不结合人或鼠NRP-2、ErbB2-ECD或BSA。图1A。其它8种噬菌体抗体中的每一种显示出相似的特异性。通过表面等离振子共振，固定化YW64.3和YW107.4IgG不与浓度高至500nM的这些抗原相互作用。可是，YW64.3和YW107.4分别以0.9和5nM的Kd结合人NRP1，而且分别以7.8和11nM的Kd结合鼠NRP1。尽管这些抗体是用平板固定化抗原选出的，但是FACS分析证明了所有纯化的IgG也结合内源表达hNRP1的HUVEC细胞(例如YW64.3和YW107.4，如图1B所示)。
C.抗NRP1抗体的亲和力成熟
YW107.4分别以6和38nM的噬菌体IC50结合人和鼠NRP1二者的b1b2结构域(表III)。为了改善体内效力，用人NRP1-His使该克隆亲和力成熟。
材料和方法
为了产生用于克隆YW107.4亲和力成熟的文库模板，首先用Kunkel诱变去除亲本噬菌粒的GCN4亮氨酸拉链，用以提供单价展示Fab格式。将一个终止密码子掺入CDR-L3。用软随机化策略进行亲和力成熟，其通过使用偏好野生型核苷酸的70-10-10-10碱基混合物的诱变DNA合成在选定位置上导入约50％的突变率。Gallop等(1994)J Med Chem 37：1233-1251。通过软随机化CDR-L1第28-32位、CDR-L2第50和53-55位、CDR-L3第91、92、93、94和96位、CDR-H1第28-35位、CDR-H2第50-58位、和CDR-H3第95-100位上的所选残基，产生了具有CDR环组合(L1/L2/L3、L3/H1/H2和L3/H3随机化)的3个不同文库。
为了选出亲和力成熟的克隆，第一轮将噬菌体文库进行平板分选，然后4轮进行所述的溶液相分选。Lee等(2004)J Mol Biol 340：1073-1093。在第一轮平板分选中，将3个文库于37℃分开加入hNRP1包被的平板中1小时。然后，进行4轮溶液相分选以增强基于亲和力的选择的效率，其逐渐升高的严谨性如下：第2轮(5nM生物素化的hNRP1)，第3轮(1nM生物素化的hNRP1)，第4轮(0.5nM生物素化的hNRP1和250nM非生物素化的hNRP1竞争物，于37℃进行1小时)，和第5轮(0.5nM生物素化的hNRP1和500nM非生物素化的hNRP1竞争物，于37℃进行3小时)。在选择过程中，包括了不带有生物素化hNRP1的反应并用作背景噬菌体结合来计算每轮淘选的富集度。
5轮筛选后，如所述的，用高通量单点竞争性噬菌体ELISA来迅速筛选高亲和力克隆。Sidhu等(2004)J Mol Biol 338：299-310。选择在存在5nMhNRP1的情况下与不存在hNRP1的情况下450nm处吸光度比率低的克隆，进行进一步表征。
结果
3种不同CDR组合(L1/L2/L3、L3/H1/H2和L3/H3)的目标是利用维持野生型序列偏好的“软随机化”策略进行随机化，使得所选的位置当时仅突变50％。Gallop等(1994)J Med Chem 37：1233-1251。为了进行亲和力成熟，在噬菌体上展示单价Fab而非二价Fab，用以在选择中降低潜在亲合力。在每个子文库中的CDR-L3上导入终止密码子。用解离速率选择策略(参见方法)来改善YW107.4的亲和力，因为它已经拥有相对高的结合速率常数(2.2×105)，但解离速率常数(1.1×10-3)相对较快(表V)。
在第一轮选择中，对所有3个CDR软随机化文库针对固定化hNRP1进行淘选，接着的后续轮次用溶液相分选策略来限制靶物浓度并增强基于亲和力的选择。生物素化hNRP1的浓度逐步从5降至0.5nM并加入500倍过量的非生物素化hNRP1来竞争有快速解离速率的结合物。混合物也于37℃温育多至2小时。
第5轮后，L1/L2/L3文库显示有显著的富集。随机挑选96个克隆，测序并进行亲和力评级。选出23个独特的噬菌体克隆并纯化，用于进一步表征。根据噬菌体竞争ELISA的测定，大多数克隆改善了对NRP1的亲和力。令人惊讶的是，尽管选择过程中省略mNRP1，但也改善了对mNRP1的亲和力，这说明克隆结合的是保守表位。所选择的克隆在3个轻链CDR中有4至7处改变；CDR-L1中的第28和30位倾向于分别用酪氨酸和组氨酸替代，而CDR-L3中的第92、93、和96位有更大多样性(表IV)。
对人和鼠NRP1二者有最高亲和力的克隆(YW107.4.18、YW107.4.38、YW107.4.52、YW107.4.63、YW107.4.76a和YW107.4.87)重定格式并表达成全长抗体。所有6种IgG都改善了对hNRP1的亲和力并保持了对VEGF-A结合的完全阻断。对人和鼠NRP1的亲和力的范围为0.4至1.8nM(表V)。改善了YW107.4.87的解离速率常数，导致全面改善对人和鼠NRP1的亲和力约10倍；没有观察到对人或鼠NRP2的结合(图2A)。YW107.4.87也显示出改善了的对细胞表面NRP1的结合(图2B)。
表IV：亲和力改善了的YW107.4克隆的CDR序列和结合亲和力(噬菌体IC50)。显示了亲和力成熟的YW107.4克隆在随机化轻链CDR位置上的推导氨基酸序列。使用来自竞争噬菌体ELISA的各克隆对hNRP1和mNRP1的Fab-噬菌体IC50值来比较相对于YW107.4的亲和力改善。
Figure A20068004583900621
表V：抗NRP1 IgG于25℃的结合动力学分析。在BIAcore-3000仪器上用IgG-固定化生物感应芯片并用稀释的hNRP1或mNRP1于25℃流过来测量抗NRP1IgG的结合亲和力(参见材料和方法)。每个Kd测量值的误差约±25％。
Figure A20068004583900622
实施例2：抗NRP1抗体的生物学活性
YW64.3和YW107.4.87的抗体序列如图3所示。为了本申请的目的，在抗NRP1抗体活性的以下描述中，“YW64.3”与“抗NRPA”可互换使用；而“YW107.4.87”与“抗NRPB”可互换使用。
材料和方法
细胞培养
HUVEC、HUAEC、和HMVEC购自Cambrex并在EGM-2培养基(Cambrex)中培养。细胞和组织培养物于37℃保存于5％CO2、95％湿度的温箱中。
DRG和海马塌陷测定法
如He和Tessier-Lavigne(1997)Cell 90：739-751所述，在来自小鼠E12.5DRG的轴突上进行塌陷测定法。简而言之，DRG外植体置于层粘连蛋白包被的8室载玻片(Nunc)上并在含50ng/ml NGF的N3-F12培养基中于37℃在5％CO2、95％湿度的温箱中培养过夜。将人信号素-3A(Met-1至Val-771)克隆入带有C-末端六组氨酸融合标签的真核表达载体pRK5。该蛋白质在CHO细胞中瞬时表达并通过NiNTA亲和层析纯化。用N-末端测序来确证在考马斯染色的SDS-PAGE凝胶上作为90kDa条带可见的蛋白质。在存在或不存在抑制剂的情况下加入～8ng/ml纯化的Sema3A，而且于37℃温育外植体30分钟以诱导塌陷。为了可视化，生长锥体在4％PFA和15％蔗糖中固定，用以1∶40稀释于PBS的若丹明-鬼笔毒环肽(Molecular Probes)染色30分钟，然后清洗并用Fluoromount G(Fisher)制片。为了进行海马塌陷测定法，在冷的PBS中解剖E17小鼠大脑，并用组织切片机(Mcllwain)水平切成250μm厚的切片。用细小钨针从所选的海马切片上进一步细解剖齿状回(dentate gyrus)。外植体置于层粘连蛋白包被的8室载玻片(Nunc)上并在补充有B27(Gibco Life Technologies)的神经基础培养基中于37℃培养过夜。为了诱导塌陷，外植体与对照或抗NRP1抗体(10μg/ml)在存在模拟转染的或Sema3F转染的COS细胞条件化培养基中于37℃温育30分钟。
细胞迁移测定法
用8μm孔径Falcon 24-多孔插入系统(BD Biosciences)的改良Boyden室测定法进行细胞迁移测定法。在上和下室中，平板用8μg/ml层粘连蛋白(Invitrogen)预先于37℃包被16小时。用胰蛋白酶收获HUVEC(80-90％汇合)，计数，离心并以5×105细胞/ml的浓度重悬于含0.1％BSA的EBM-2。将100μl细胞加入转孔系统的上室中。将抑制剂加入含细胞的上室中，然后立即向下室中加入刺激剂(大多数情况下为10ng/ml VEGF)，其含500μl EBM-2并含0.1％BSA。然后将平板于37℃放置过夜。为了终止测定法，用海绵签去除膜上表面上的细胞并用甲醇固定下表面上的细胞，并用Cytox绿(MolecularProbes)染色。用AxiPhot荧光显微镜计数膜下表面上迁移细胞数并用ImageJ程序(NIH，http://rsb.info.nih.gov/ij/)分析结果。
珠向外生长测定法
葡聚糖包被的Cytodex 3微载体珠(Amersham Pharmacia)与亚汇合的HUVEC以每珠400细胞的浓度在1ml EGM-2培养基中于37℃在5％CO2温箱中温育4小时，期间每20分钟轻轻摇动。然后将珠转移到25cm2组织培养瓶(BDBiosciences)并于37℃在5ml EGM-2中温育12-16小时。然后用1ml EGM-2清洗HUVEC包被的珠3次并重悬于含2.5μg/ml纤维蛋白原(Sigma)的PBS中，其密度为200珠/ml。0.5ml纤维蛋白原/珠溶液转移入24孔组织培养板的一个孔中，其含0.625单位凝血酶(Sigma)来诱导凝结。纤维蛋白原/珠溶液于室温温育5分钟，然后在5％CO2温箱中于37℃温育20分钟。凝结完成后，向每个孔加入1ml EGM-2并于37℃使凝块平衡30分钟。去除培养基，并将1ml皮肤成纤维细胞(Detroit 551)以2000/ml的浓度在EGM-2培养基中置于凝块顶部。然后，向每个孔加入不同抗体并对测定法监测8天，每2-3天监测培养基变化。用倒置显微镜拍下珠的10x解析度图像，以100、200、和300μm间隔的同心圆数字化地标注在每张图像中的珠的周围。计数穿过每条线的血管数并对每种距离和条件取平均。
FACS分析
汇合的HUVEC与对照或抗NRP1抗体以10μg/ml于37℃在5％CO2温箱中温育5分钟、2小时或20小时。用无酶的细胞解离缓冲液(Gibco)收获细胞，用等体积FACS缓冲液(1x PBS，2％FBS，2mM EDTA，0.1％叠氮钠)中和并以每孔500,000细胞转移入Pro-bind U形底96孔测定板(Falcon)。以2000rpm离心收集细胞沉淀物，并重悬于25μl以1∶100含合适生物素化抗体的染色缓冲液(FACS缓冲液，其中含5％正常小鼠血清，2％正常大鼠血清和10％10μg/ml人IgG)，然后于4℃温育2小时。用FluoReporter微型生物素-xx蛋白质标记试剂盒(Molecular Probes)将抗体生物素化。然后用FACS缓冲液清洗细胞2次并于4℃在25μl含1∶1000链霉亲合素-PE(BD Biosciences)的FACS缓冲液中温育20分钟。最后，清洗细胞并重悬于FACS缓冲液，并用FacsCalibur系统(BDBiosciences)分析。
细胞粘附测定法
亚汇合的HUVEC与对照或抗NRP1抗体于37℃在100μl培养基199中温育30分钟，然后置于用1μg/ml纤连蛋白(Roche)包被的NUNC maxisorp平底96孔板(eBioscience)上，每孔10,000细胞。平板以140g离心1分钟使细胞与底物同步接触(contract)，并于37℃温育30分钟。然后用PBS洗板3次，于-80℃冷冻2小时。用CyQuant试剂盒(Molecular Probes)测定细胞密度。
小鼠新生视网膜血管测定法
不同抗体以10mg/kg的浓度向新生CD1小鼠(同一窝)腹膜内(i.p.)给药。在出生后第1和3天进行注射用以在第5天(P5)研究，并在第1、3和5天进行用以在P8研究。收集眼睛并用含4％PFA的PBS于4℃固定16小时，然后用PBS清洗。解剖出的视网膜用含10％小鼠血清的PBSt(PBS，1％Triton X-100)封闭3小时，然后在含生物素化异凝集素B4(Bandeiraea simplicifolia；Sigma)25μg/ml的PBLEC(1％Triton X-100，0.1mM CaCl2，0.1mM MgCl2，0.1mMMnCl2，溶于PBS pH 6.8)中于4℃温育过夜。然后用PBSt洗视网膜4次并与Alexa 488链霉亲合素(1∶200；Molecular Probes)于4℃温育过夜。染色完成后，用PBSt洗视网膜4次，然后用含4％PFA的PBS固定，然后再用PBS洗4次。用共聚焦荧光显微镜拍下平铺的视网膜的图像。
小鼠皮肤血管通透性测定法
用150μl 0.5％Evan氏蓝溶液静脉内(i.v.)注射5-7周大的C57BL6J雌性小鼠。给动物的背部和侧部区域刮毛，以除去颈部以下、臀部以上的毛，剃净的区域分成4个注射区。Evan氏蓝注射1小时后，在4个区域之任一随机皮内(i.d.)注射20μl含BSA(7.5μg/ml)或hVEGF(7.5μg/ml)并含或不含抗体(0.5mg/ml)的PBS，每个区域注射一次。皮内(i.d.)注射1小时后，处死动物并切下含4个区域的皮肤。拍下皮肤的数字图像。用8mm皮肤活组织检查穿孔器切出注射位置上相同面积的皮肤样品，并将皮肤样品在甲酰胺溶液中于55℃温育48小时以从组织中提取Evan氏蓝染料。然后用分光光度计于605nm处测量溶液的吸光度。
细胞增殖测定法
用细胞增殖ELISA试剂盒(Roche)分析细胞增殖。简而言之，收获90％汇合的HUVEC并重悬于测定培养基(DMEM∶F12 50∶50，1.5％FBS)，并以每孔3,000细胞置入用1％明胶预先包被的黑色96孔组织培养板(ViewPlate-96，Perkin Elmer)。细胞于37℃温育16小时，更换新鲜的测定培养基并再温育8小时。向培养物加入VEGF(20ng/ml)和不同抗体并将细胞温育20小时。以10mM的终浓度加入BrdU标记液并于37℃再温育细胞24小时。用化学发光免疫测定法来测定BrdU掺入度。
VEGFR2磷酸化测定法
用DuoSet IC ELISA试剂盒(R&D)测定总的VEGFR2和磷酸-VEGFR2。简而言之，亚汇合的HUVEC用PBS冲洗并在所提供的裂解缓冲液中裂解。细胞裂解物于4℃以14,000g离心5分钟，并将上清液移入干净的管。然后如所指导的，进行ELISA测定法。
免疫印迹
汇合的HUVEC在含0.2％FBS和0.1％BSA的EBM-2中饥饿(starve)16小时，然后换入含0.1％BSA的EMB-2，然后于37℃温育90分钟。加入50μg/ml对照和抗NRP1抗体，并于37℃温育细胞30分钟。用VEGF(20ng/ml)于37℃刺激细胞10分钟，用冰冷的PBS洗2次并在含20mM Tris 7.5、150mM NaCl、1％Triton X-100、磷酸酶抑制剂混合物I和II(Sigma)和完全蛋白酶抑制剂片(Roche)的裂解缓冲液中裂解。裂解物的等分试样在4-20％Novex Tris-甘氨酸SDS凝胶(Invitrogen)中进行电泳，然后电转移到Invitrolon PVDF膜(Invitrogen)。本研究中所用的第一抗体是抗Erk、抗磷酸-Erk、抗Akt、抗磷酸-Akt、抗p38、抗磷酸-p38、抗Src和抗磷酸-Src(Tyr416)，均购自CellSignalling Technology。
结果
A.抗NRP1A和抗NRP1B分别对Sema34功能和VEGF结合的选择性作用
测试抗NRP1抗体阻断VEGF165与NRP1结合的能力。抗NRP1B有力地阻断了VEGF与NRP1的结合，而抗NRP1A没有(图4)。这些结果表明NRP1的CUB结构域(a1-a2)对VEGF结合而言不是必需的。Gu等(2002)J Biol Chem277：18069-18076。
接着，测试抗NRP1抗体对Sema3A功能的效应。以前有提示，Sema3A和VEGF165在b1结构域的N-末端区共享重叠的结合结构域，因此可竞争与NRP1的结合。Gu等(2002)J Biol Chem 277：18069-18076；Miao等(1999)JCell Biol 146：233-242。因此，似乎可能单个抗NRP1mAb能阻断Sema3A和VEGF结合二者。测试本发明的抗NRP1mAb阻断Sema3A诱导的轴突生长锥塌陷的能力。从小鼠E12.5胚胎上解剖出背根神经结(DRG)并培养以形成感觉神经元生长锥，其应答Sema3A/NRP1依赖性塌陷。He和Tessier-Lavigne(1997)Cell 90：739-751。向这些培养物添加Sema3A引起生长锥收回富含肌动蛋白的结构。然而，如果向孔中与Sema3A同时加入抗NRP1A，则可完全阻断塌陷。相反，抗NRP1B对Sema3A诱导的塌陷没有影响(图5A)。
因此，这两种抗体有功能上截然不同的作用：抗NRP1A阻断Sema3A功能但不干扰VEGF与NRP1结合；而抗NRP1B阻断VEGF与NRP1结合但对Sema3A功能没有影响。进一步的研究显示这两种抗体都不阻断E17海马生长锥的Sema3F/NRP2依赖性塌陷(图5B)，这与这两种抗体都不结合NRP2的观察结果一致。因此，这些抗体提供了选择性工具来剖析NRP1在血管生物学中的作用及用于选择性阻断NRP1活性的手段。
B.抗NRP1A和抗NRP1B都降低VEGF165依赖性内皮细胞迁移和珠向外生长
在VEGF驱动的内皮细胞(EC)迁移中测试抗NRP1 mAb。利用转孔系统，将人脐带静脉内皮细胞(HUVEC)导入顶部室中，而将VEGF加入底部室中以促进EC迁移。然后将迁移入底部室中的EC固定、染色、和定量(图6A)。在这个和后续实验中，将抗VEGF抗体用作阳性对照来阻断VEGF驱动的EC迁移(除非另外说明，跨物种反应性抗VEGF抗体B20.4.1用于所有实验；Liang等(2006)J Biol Chem 281：951-961。
向顶部室中的细胞加入抗NRP1mAb，然后立即加入VEGF。有趣的是，抗NRP1A和抗NRP1B都显著地降低了内皮细胞迁移，其中抗NRP1B更强地阻断了迁移(图6A)。用其它两类EC细胞系(HUAEC和HAEC)得到了相似的结果。
为了进一步剖析NRP1和抗NRP1mAb在更复杂的EC功能中的作用，使用血管发生性萌发(sprouting)的体外系统。Nakatsu等(2003)Microvasc Res66：102-112。在该测定法中，包被在珠上的EC在7天时间中萌发，这导致多个清楚限定的血管结构从每个珠上伸出。向这些培养物加入任一种抗NRP1mAb造成血管长度缩短，而且在抗NRP1B的情况下还观察到萌发数目的减少。该观察结果被定量确证了(图6B)。在该测定法中，将抗VEGF用作阳性对照并完全阻断萌发。在该体外测定法中，结果确证了每种抗NRP1mAb在降低EC迁移和血管向外生长方面的强效果。
C.NRP1对于小鼠视网膜的血管重塑而言是必需的
Nrp1敲除小鼠中观察到的表型与血管重塑缺陷一致。Gu等(2003)DevCell 5：45-57；Kawasaki等(1999)Development 126：895-4902；Takashima等(2002)Proc Natl Acad Sci USA 99：3657-3662。接着，通过分析抗NRP1mAb全身处理对发育中小鼠视网膜的效果来测试NRP1在血管重塑中的作用，其为研究血管萌发、重塑、和成熟的典型事件(stereotyped event)的理想模型。Dorrell和Friedlander(2006)Prog Retin Eye Res 25：277-95。出生时，星形胶质细胞网络就位以指导EC从位于视神经乳头(ONH)附近的中央视网膜动脉中萌发。出产后生活一天(P1)后，视网膜血管系统在神经纤维层(NFL)中发育出形态发生性沟回(morphogenic furrow)，位于神经节细胞层表面，其开始向视网膜边缘以同心模式延伸，到P5到达中途(图7A)。在接着的3天，沟回继续向视网膜边缘延伸，而最接近ONH的血管丛进行典型的重塑，包括NFL中血管丛变薄成精细化的毛细管网络(图7B)，并萌发血管进入视网膜更深层(图7C)。
抗体在P1开始注射入新生小鼠，然后隔天注射直至到P5和P8时收集视网膜。为了显现血管系统，用异凝集素B4染色视网膜并比较。尽管IgG对照组的精细化毛细管网络在P5和P8之间得到很好地建立，该血管重塑完全被这两种抗NRP1mAb抑制了。通过比较拍摄ONH邻近区域中NFL血管网络的代表性图像中的血管密度，来定量该差异(图7D)。因为用任一抗NRP1mAb处理导致对血管重塑的强抑制，因此血管密度在抗NRP1A和抗NRP1B处理的视网膜中都比对照显著更高。有趣的是，发育的沟回在这两种抗NRP1mAb处理的视网膜中都继续延伸，其中在抗NRP1B处理的动物中仅有轻微延伸抑制(图7E)。这表明用任一抗NRP1mAb处理时一般不会抑制视网膜发育，但代之以特异性阻断血管重塑。
与抗NRP1mAb相反，抗VEGF处理导致视网膜血管密度相对于对照减小了(图7D)。在定性水平，抗VEGF处理的视网膜中的血管在P8降低了复杂度，在P5就已经存在该趋势但不明显。这些数据表明，抗VEGF处理导致阻断最初的萌发和/或血管消退。有趣的是，抗VEGF的全身递送并不显著减少血管沟回的延伸(图7E)。这可能是抗体扩散到延伸中顶部细胞不良的结果，其原因是在该外部区域缺少血管内腔。Gerhardt等(2003)J Cell Biol161：1163-1177。
评估P8视网膜也容许进一步研究抗体处理对血管发生性萌发的效应。在P5和P8之间，血管开始从NFL血管网络萌发，进入更深的血管层，这导致外网层(OPL)血管网络的形成，所述外网层(OPL)血管网络在外核层的表面而且是视网膜中最深的血管床(图7C)。发育后期，从侧支萌发产生OPL，形成中闻血管珠，其被称为内网层(IPL)。P8时从OPL拍摄的图像显示这两种抗NRP1mAb和抗VEGF处理都能完全抑制萌发。
用抗NRP1A或抗NRP1B全身性处理的动物中获得的视网膜中观察到的相对于抗VEGF的不同表型，表明NRP1可能通过除了增强VEGFR2信号传导之外的机制来调节EC功能。
D.阻断NRP1功能对VEGFR2倍争传导不大有作用
在观察到内皮细胞应答VEGF的迁移需要NRP1后，我们研究了NRP1在EC增殖和血管通透性(两种由VEGF诱导的限定性细胞活性)中的需求情况。令人惊奇的是，用抗NRP1A或抗NRP1B处理对VEGF诱导的通透性没有影响，而抗VEGF提供强阻断(图8A)。当测试VEGF诱导的EC增殖时，观察到相似的趋势，其中抗NRP1A显示出不阻断增殖，而抗NRP1B仅有轻微剂量应答性降低(图8B)。这些结果支持了以前公开的数据，其显示在EC中用siRNA敲低NRP1不影响VEGF诱导的增殖(Murga等(2005)Blood 105：1992-1999)，并表明NRP1在VEGF驱动的EC行为中的主要作用是介导细胞迁移。
研究了抗NRP1抗体对VEGFR2信号传导的效应。VEGF结合VEGFR2的第二和第三胞外IgG结构域，并通过触发胞内结构域中数个酪氨酸残基的自磷酸化而活化受体。与抗VEGF(其在HUVEC中完全阻断VEGF诱导的VEGFR2磷酸化)相反，抗NRP1A并不显著改变VEGFR2磷酸化水平，而抗NRP1B仅造成适度降低(图8C)。
与其说直接调节VEGFR2磷酸化水平，不如说NRP1的作用可能是调节特异性VEGFR2途径。为了鉴定该可能性，检查了抗NRP1处理对VEGFR2介导的下游信号传导事件的影响。已显示VEGFR2通过活化促分裂原激活的蛋白激酶Erk1/2来诱导EC增殖(Rousseau等(1997)Oncogene 15：2169-2177；Takahashi等Shibuya(1999)Oncogene 18：2221-2230)，而且通过PI3-激酶/Akt途径来调控EC存活和血管通透性。Chen等(2005)Nat Med 11：1188-1196；Gerber等(1998)J Biol Chem 273：13313-13316；Six等(2002)FEBS Lett532：67-69。与抗NRP1mAb处理不显著改变VEGF诱导的EC增殖或血管通透性的观察结果一致，抗NRP1A和抗NRP1B温育不影响VEGF诱导的Erk1/2或Akt磷酸化。在另一方面，用抗NRP1抗体抑制NRP1功能强力降低EC迁移。可能是NRP1特异性调节细胞运动所需的VEGFR2途径，诸如p38MAP激酶途径，其已显示是EC中VEGF驱动的肌动蛋白重组织和细胞迁移所需的。Rousseau等(1997)Oncogene 15：2169-2177。抗NRP1A和抗NRP1B处理都在HUVEC中造成p38磷酸化水平的轻微下降(图8D)，这支持了该假说。然而，p38磷酸化单独的缓和下降不可能解释我们在前面章节所述的迁移和萌发测定法中观察到的猛烈下降(图6)，或解释在视网膜血管重塑实验中抗NRP1mAb和抗VEGF mAb之间所观察到的性质不同的表型(图7)。
实施例3：抗NRP1抗体的肿瘤抑制活性
材料和方法
人细胞系H1299和SK-MES-1非小细胞肺癌得自ATCC(Rockville，MD)。对于SK-MES-1，每只HRLN雌性裸鼠侧部接受1mm3肿瘤碎片皮下(s.c.)植入物。对于H1299，1×107个肿瘤细胞皮下(s.c.)注射入HRLN雌性裸鼠侧部。每周两次用测径仪测量肿瘤生长。当肿瘤平均大小达到80-120mm3时，将小鼠分组，每组有几乎相同的平均肿瘤大小，并开始处理。这天被认为是每次研究的第1天。所有的处理都根据体重调节至0.2ml/20g。肿瘤体积(mm3)＝宽度2×长度/2。肿瘤生长抑制百分比(％TGI)＝(对照组的肿瘤体积中值-治疗组的肿瘤体积中值)/对照组的肿瘤体积中值×100。只在所有动物维持其研究时(对于SK-MES-1＝第22天；对于H1299＝第15天)才测量％TGI。至终点的时间(TTE)＝log10(终点体积，mm3)-b/m；其中b和m分别是通过线性回归对数转化的肿瘤生长数据而得到的直线的截距和斜率。肿瘤生长延迟百分比(％TGD)＝(治疗组的TTE中值-对照组的TTE中值)/对照组的TTE中值×100。
用阿佛丁(Avertin)(1.3％三溴乙醇和0.8％戊醇；Sigma-Aldrich)麻醉小鼠。全身输注前3分钟静脉内(i.v.)注射FITC标记的番茄(Lycopersicon esculentum)凝集素(150μg，溶于150μl 0.9％NaCl；Vector Laboratories)。经心脏向血管系统灌输含4％低聚甲醛(PFA)的PBS 2至3分钟。取出肿瘤，通过浸在相同固定剂中16小时来进行后固定，然后为了冷冻防护在30％蔗糖中温育过夜，然后在OCT中包埋并冷冻。切下切片(30μm)并安装在玻璃载片上，再水化并在含5％正常山羊血清的PBSt(PBS，0.5％Triton X-100)中于室温封闭2小时。切片于4℃与抗NRP1B(1∶500)或大鼠抗小鼠PDGFRβ(1∶1000；克隆APB5，eBioscience)一起温育过夜。然后在PBSt中清洗切片4次，并与第二抗体Alexa488山羊抗人IgG和Alexa 568山羊抗大鼠IgG(1∶200；Molecular Probes)于室温温育4小时。染色完成后，在PBSt中清洗切片4次，之后用含4％PFA的PBS进行后固定，然后再在PBS中清洗4次。去除最后的清洗液并加入1-2滴Fluoromount-G(SouthemBiotech)。将玻璃盖片置于样品上，并用ZeissAxiophot荧光显微镜拍摄图像。
结果
阻断VEGF途径已证明在小鼠肿瘤模型和人癌症中减少新血管形成。Ferrara和Kerbel(2005)Nature 438：967-974。然而，据信一些肿瘤较不依赖于VEGF来使血管形成，或对抗VEGF疗法变得不敏感。Jain等(2006)Nat ClinPract Oncol 3：24-40；Kerbel等(2001)Cancer Metagusis Rev 20：79-86。为了确定NRP1阻断是否能增强阻断VEGF所带来的肿瘤生长抑制，我们选择了数种已知展现出对抗VEGF疗法不同敏感性的异种移植物模型。因为除了肿瘤衍生的VEGF外，小鼠基质VEGF也显示出影响肿瘤生长，所以我们使用抗VEGF mAb，其能识别鼠和人VEGF二者。Liang等(2006)J Biol Chem281：951-961。
设计这些实验来测试单独阻断NRP1和与抗VEGF联合的效果。还包括单一药剂抗VEGF和同种型对照抗体。SK-MES-1是NSCLC异种移植物模型，其主要在血管和基质组织中表达NRP1，其中在肿瘤细胞中以中等水平表达。在该模型中，抗VEGF带来了52％的肿瘤生长抑制(TGI)，单一药剂抗NRP1B造成了37％的TGI，而抗NRP1A对TGI没有显著效果(图9A)。
令人惊奇的是，当任一抗NRP1抗体与抗VEGF联合使用时，观察到叠加效应。如图10A所示，抗NRP1A与抗VEGF联合使用将TGI从约52％增加至约70％；而抗NRP1B与抗VEGF联合使用将TGI增加至约77％(图9A)。在H1299NSCLC异种移植物模型中获得了相似的结果，其也在血管和基质组织中高水平地表达NRP1，但在肿瘤细胞中程度较低。单一药剂抗NRP1B显示出39％的TGI，抗VEGF显示出28％的TGI，而其组合显示出51％的TGI(图9C)。
向SK-MES-1模型中的动物给药至第35天并跟踪至第60天以检查肿瘤生长延迟情况(当肿瘤大小超过1500mm3时将动物去除；没有因为中毒而去除动物)。Kaplan-Meier图显示，相对于单一药剂组，两个抗NRP1mAb组合组对延迟肿瘤生长有显著效果(图9B)。肿瘤生长延迟(TGD)的测量结果显示，对于抗NRP1A，单一药剂没有延迟；对于抗NRP1B，有24％的TGD；对于抗VEGF，有60％的TGD；对于抗NRP1A+抗VEGF组合组，有93％的TGD；和对于抗NRP1B+抗VEGF组合组，有96％的TGD。
在乳腺癌鼠模型(称为创始者5(Fo5)，其中解剖出MMTV-Her2转基因表达而产生的肿瘤并植入裸鼠)中也观察到与NSCLC模型中所见的那些相似的结果。Finkle等(2004)Clin Cancer Res 10：2499-2511。在该模型中，NRP1主要在血管和邻近基质上表达，而抗VEGF也仅部分有效地降低肿瘤生长(图9C)。生长抑制与NSCLC模型中所见的相似，然而，为了关注抗NRP1和抗VEGF处理背景中的组织学变化，在实验早期的相同日子收获动物(虚线；图9C)。
利用Fo5模型进行血管组织学研究，我们观察到对照肿瘤显示出非常大的无组织血管，如PDGFR-β免疫组化所确定的，其一般缺少周细胞覆盖。单独用抗VEGF处理导致减小血管直径并整体降低血管密度。而且，如果不是抗VEGF处理的肿瘤中保留的所有血管都显示出周细胞的紧密结合，也是大多数。用其它周细胞标志物观察到了相似的结果。
单独用任一抗NRP1 mAb处理的肿瘤的血管在形态上与新生小鼠视网膜中抗NRP1处理的血管相似，其中血管呈现出平且无组织，保持着丛样外观。在另一方面，与对照处理的肿瘤血管相似，用任一抗NRP1mAb处理的肿瘤也缺乏明显的周细胞覆盖。更有趣的是，抗VEGF及抗NRP1A或抗NRP1B处理的肿瘤显示出组合表型，其中血管减少与抗VEGF处理的肿瘤相似，但剩下的血管呈现出较不精细且缺少紧密的周细胞结合。
这些形态观察结果与血管密度的定量变化相关。如图10所示，用这两种抗NRP1抗体和抗VEGF处理减小血管密度(图10A)。在另一方面，相对于对照，仅用抗VEGF处理似乎在所测试的肿瘤样品中增加周细胞染色。总体上，测量周细胞覆盖的周细胞/血管比率显示，抗VEGF处理的肿瘤有最高的比率，其因抗NRP1A和抗NRP1B处理而降低。
抗NRP1(抗NRP1A和抗NRP1B)和抗VEGF可通过阻断不同EC功能和/或信号传导途径而起作用的发现增加了以下可能性，即在肿瘤模型中组合使用这些抗体将对减少肿瘤生长起叠加或协同效应。事实上，当抗NRP1与抗VEGF组合时观察到了深深的叠加效应(图9)。尤其在抗NRP1A的情况下，结果表明有协同效应，而不是叠加效应，因为在多肿瘤模型中，单一药剂抗NRP1A处理后的平均肿瘤体积不同于对照，但在与抗VEGF组合时，相对于单独用抗VEGF处理，抗体显著增强肿瘤应答。
在抗NRP1B的情况下，单一药剂处理显著降低肿瘤生长。有趣的是，这些效果仅轻微弱于单独使用抗VEGF的。然而，抗NRP1B组合组中的肿瘤生长降低与抗NRP1A组合组相似。抗NRP1B的单一药剂效应可归因于其相对于抗NRP1A相对更强的减少萌发和体内血管发生的抑制活性。在另一方面，这两种抗体等强地在小鼠视网膜发育测定法中阻断血管重塑并在Fo5肿瘤模型中抑制周细胞与血管的结合。
曾有提示，视网膜中的血管重塑发生在缺少紧密周细胞结合的情况下，表明周细胞用于稳定不成熟的血管，结束血管重塑的弹性期。Benjamin等(1998)Development 125：1591-1598。本发明的发现表明NRP1是该复杂的血管重塑过程所需的，其包括血管丛变成毛细管，然后进一步成熟的形态发生。
周细胞稳定肿瘤血管并由此因血管丧失其VEGF依赖性而产生抗VEGF疗法抗性的观点被提出并用实验检验了。Bergers等(2003)J Clin Invest111：1287-1295；Erber等(2004)Faseb J 18：338-340。在这些研究中，观察到阻断VEGF(EC配体)和PDGF(周细胞配体)二者功能导致进一步破坏肿瘤血管系统。随后，在图像研究中显示单独阻断肿瘤中的VEGF功能导致显著量的血管消退，但剩余血管变“正常”了，有紧密的周细胞结合，这可能是因为不成熟血管进行了血管重塑并成熟了。Inai等(2004)Am J Pathol 165：35-52。
根据发育中的视网膜中所得的观察结果，可假设阻断肿瘤中的NRP1功能也会降低肿瘤血管的血管重塑，接着抑制血管成熟，因此使血管保持在VEGF依赖性的状态。单独用这可能不能对降低肿瘤生长起显著的效果，因为大多数肿瘤血管早就内在的无组织化了。Baluk等(2005)Curr Opin GenetDev 15：102-111。该预测与如下观察结果一致，即尽管抗NRP1A强力抑制血管重塑，但我们没有见到该抗体在降低肿瘤生长方面的单一药剂效果。然而，推测阻断血管重塑及后续成熟，在联合抗VEGF疗法时可以使剩余肿瘤血管更易于消退。本发明的实验显示用任一抗NRP1 mAb与抗VEGF联合处理的肿瘤中剩余的血管确实缺少周细胞结合。这些结果表明，我们在阻断NRP1和VEGF二者功能中观察到的叠加效应可能是由于抗VEGF处理的肿瘤中的剩余血管变得更易于消退的结果。
根据发育中的视网膜和异种移植物肿瘤模型中得到的结果，假设在新形成的血管中阻断NRP1功能会抑制血管进行重塑及后续成熟，因此使这些血管的存活更依赖于VEGF(参见图11A中的模型)。与该模型一致的是，在以单一药剂单独使用的一半剂量用抗NRP1B和抗VEGF二者处理的新生小鼠中，我们观察到了发育中的视网膜的血管密度显著降低(每种抗体的单一剂量＝10mg/kg，组合剂量＝5mg/kg)。参见图11B，与图7D作比较。
另外，可能不但内皮功能需要NRP1，而且周细胞功能也需要NRP1。近来报道，bFGF在平滑肌细胞上诱导NRP1上调，造成VEGF诱导平滑肌细胞迁移的能力。Liu等(2005)Cytokine 32：206-212。在本实验中，在人平滑肌细胞上以及在各种鼠和人肿瘤中的周细胞上见到了NRP1的表达(例如在Fo5模型中，NRP1的表达扩大至凝集素阳性染色邻近的区域)。
总之，本文所述实验证明了在肿瘤模型中阻断NRP1和VEGF功能导致降低肿瘤生长的叠加效应。还提供了证据表明NRP1也可通过除了VEGFR2信号传导之外的机制来起作用。

Claims (30)

1.一种抗神经纤毛蛋白-1(NRP1)抗体，其能够抑制至少一种神经纤毛蛋白(NRP)介导的生物学活性。
2.权利要求1的抗体，其能够抑制NRP1与信号素的相互作用。
3.权利要求1的抗体，其能够抑制NRP1与血管内皮细胞生长因子(VEGF)的相互作用。
4.权利要求1的抗体，其在NRP1的a1a2结构域内与NRP1结合，并阻断NRP1与信号素的结合，但不阻断NRP1与VEGF的结合。
5.权利要求4的抗体，其能够抑制NRP1介导的血管发生。
6.权利要求4的抗体，其包含轻链可变域，该轻链可变域包含以下互补决定区(CDR)氨基酸序列：CDRL1(RASQSISSYLA；SEQ ID NO：123)、CDRL2(GASSRAS；SEQ ID NO：124)和CDRL3(QQYMSVPIT；SEQ IDNO：125)。
7.权利要求6的抗体，其包含SEQ ID NO：3的轻链可变域序列。
8.权利要求4的抗体，其包含重链可变域，该重链可变域包含以下CDR氨基酸序列：CDRH1(GFSFSSEPIS；SEQ ID NO：126)、CDRH2(SSITGKNGYTYYADSVKG；SEQ ID NO：127)和CDRH3(WGKKVYGMDV；SEQ ID NO：128)。
9.权利要求8的抗体，其包含SEQ ID NO：4的重链可变域序列。
10.权利要求4的抗体，其是包含SEQ ID NO：3的轻链可变域序列和SEQ IDNO：4的重链可变域序列的YW64.3抗体。
11.权利要求1的抗体，其在NRP1的b1b2结构域内结合NRP1，并阻断NRP1与VEGF的结合，但不阻断NRP1与信号素的结合。
12.权利要求11的抗体，其包含轻链可变域，该轻链可变域包含以下CDR氨基酸序列：CDRL1(RASQYFSSYLA；SEQ ID NO：129)、CDRL2(GASSRAS；SEQ ID NO：130)和CDRL3(QQYLGSPPT；SEQ IDNO：131)。
13.权利要求12的抗体，其包含SEQ ID NO：5的轻链可变域序列。
14.权利要求11的抗体，其包含重链可变域，该重链可变域包含以下CDR氨基酸序列：CDRH1(GFTFSSYAMS；SEQ ID NO：132)、CDRH2(SQISPAGGYTNYADSVKG；SEQ ID NO：133)和CDRH3(ELPYYRMSKVMDV；SEQ ID NO：134)。
15.权利要求14的抗体，其包含SEQ ID NO：6的重链可变域序列。
16.权利要求11的抗体，其是包含SEQ ID NO：5的轻链可变域序列和SEQ IDNO：6的重链可变域序列的YW107.4.87抗体。
17.依照权利要求1的抗体，其中所述抗体既能够与鼠NRP1结合又能够与人NRP1结合。
18.依照权利要求1的抗体，其中所述抗体是单克隆抗体。
19.依照权利要求1的抗体，其中所述抗体是双特异性抗体。
20.依照权利要求1的抗体，其中所述抗体是合成抗体。
21.权利要求1的抗NRP1抗体在制备用于在哺乳动物中治疗或预防与病理性血管发生有关的病症的药物中的用途。
22.权利要求21的用途，其中所述病症是癌症。
23.权利要求22的用途，其中所述癌症选自乳腺癌、结肠直肠癌、非小细胞肺癌、非何杰金氏淋巴瘤(NHL)、肾癌、前列腺癌、肝癌、头颈癌、黑素瘤、卵巢癌、间皮瘤、和多发性骨髓瘤。
24.权利要求23的用途，其中所述治疗进一步包含第二治疗剂。
25.权利要求24的用途，其中所述第二治疗剂是选自下组的药剂：抗血管发生剂、抗肿瘤组合物、化疗剂和细胞毒剂。
26.权利要求25的方法，其中所述抗血管发生剂是VEGF拮抗剂。
27.权利要求26的方法，其中所述VEGF拮抗剂是抗hVEGF抗体。
28.权利要求27的方法，其中所述抗hVEGF抗体能够与抗体A4.6.1结合相同的VEGF表位。
29.权利要求28的方法，其中所述抗hVEGF抗体是bevacizumab或ranibizumab。
30.权利要求24的方法，其中所述第二治疗剂是选自下组的受体酪氨酸激酶抑制剂：vatalanib(PTK787)、erlotinib
Figure A2006800458390003C1
OSI-7904、ZD6474
Figure A2006800458390003C2
ZD6126(ANG453)、ZD1839、sunitinib
Figure A2006800458390003C3
semaxanib(SU5416)、AMG706、AG013736、Imatinib
Figure A2006800458390003C4
MLN-518、CEP-701、PKC-412、Lapatinib(GSK572016)、
Figure A2006800458390003C5
AZD2171、sorafenib
Figure A2006800458390003C6
XL880和CHIR-265。
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