KR102293753B1 - Vegf 와 nrp1 의 결합을 저해하는 항체 - Google Patents

Abstract

본 발명은, 혈관 내피 증식 인자 (VEGF) 와 뉴로필린-1 (NRP1) 의 결합을 저해하는 VEGF 에 대한 항체의 제공을 목적으로 한다. 본 발명은, VEGF 와 NRP1 의 결합을 저해하는, VEGF 에 대한 항체를 제공한다.

Description

VEGF 와 NRP1 의 결합을 저해하는 항체

본 발명은 혈관 내피 증식 인자 (VEGF) 와 뉴로필린-1 (NRP1) 의 결합을 저해하는 항체 및 그 항체를 포함하는 의약 조성물에 관한 것이다.

새로운 혈관이 형성되는 것 (혈관 신생) 은, 생명을 유지하는 데 있어서 필요 불가결한 프로세스이다. 그 한편으로, 병적인 혈관 신생은, 많은 질병에 관여하는 것이 알려져 있다.

혈관 신생에 관련된 인자로는, 혈관 내피 증식 인자 (VEGF) 가 알려져 있다 (비특허문헌 1：Ferrara N, et al, Endocr Rev., 1997,18 (1)：4-25). VEGF 는 그 수용체와 결합함으로써, 세포 내에 시그널을 전달시키고, 세포 분열이나 유주 (遊走), 분화 유도, 혈관 투과성의 항진, 단구나 매크로파지의 활성화 등에 관여하고 있는 것이 알려져 있다.

VEGF 의 수용체로는, 혈관 내피 증식 인자 수용체-1 (VEGFR1 (별명 Flt-1)), 혈관 내피 증식 인자 수용체-2 (VEGFR2 (별명 KDR)), 뉴로필린-1 (NRP1) 의 3 종류가 보고되어 있다.

NRP1 은, 대략 130 kDa 의 I 형 막관통형 당단백질이며, 당초에는 축색 가이던스의 메디에이터로서 보고되었지만, 맥관 발생에 있어서도 중요한 역할을 하는 것이 보고되어 있다 (비특허문헌 2：Nature, 436：193-200, 2005). 또, 녹아웃 마우스를 사용한 연구에서는, NRP1 의 기능이 상실됨으로써, 혈관 리모델링 및 분지에 결함이 초래되는 것이 보고되어 있다 (비특허문헌 3：Development, 135, 2479-88, 2008). 또한, 상피 세포에 있어서는, NRP1 은 VEGF 와 VEGFR2 가 결합함으로써 발생하는 시그널을 증강시키는 기능을 가지고 있어, 세포의 이동이나 혈관 형성이 항진되는 것이 보고되어 있다 (비특허문헌 4：Cell, 92, 735-745, 1998).

VEGF 는, VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, VEGF-E, PIGF-1, PIGF-2 로 이루어지는 VEGF 패밀리를 형성하고 있다. 인간 VEGF-A 에는, VEGF₁₂₁, VEGF₁₄₅, VEGF₁₆₅, VEGF₁₈₃, VEGF₁₈₉, VEGF₂₀₆ 등의 아형 (亞型) 이 알려져 있지만, VEGF₁₆₅ 가 가장 많이 존재한다. 또, VEGF₁₆₅ 는, VEGFR1, VEGFR2 및 NRP1 모두에 결합하는 것이 알려져 있다.

한편, VEGF₁₆₅ 의 아형으로서, VEGF₁₆₅ 의 C 말단의 6 잔기가 엑손 8a 가 아니라 엑손 8b 로부터 번역된 VEGF_165b 가 보고되어 있다. VEGF1_65b 는, VEGF₁₆₅ 와는 달리, 혈관 신생을 억제하고, 신장암의 증식을 억제한다는, VEGF 와는 반대의 기능을 갖는 것이 보고되어 있다. VEGF_165b 에서는 VEGF₁₆₅ 의 160 번째의 시스테인 (Cys) 이 세린 (Ser) 으로 치환되어 있기 때문에, NRP1 에 결합하는 입체 구조가 형성되지 않고, 혈관 신생의 작용이 일어나지 않는 것으로 생각되고 있다 (비특허문헌 5：Nature Reviews Cancer, 8, 880-887, 2008).

또, VEGF 는, 정상적인 혈관 신생 뿐만 아니라, 병적인 혈관 신생이나 혈관 투과성 항진도 유도하는 것이 알려져 있다. 병적인 혈관 신생이 관여하는 질환으로는, 종양의 악성화, 전이나 삼출형 가령 황반 변성 등이 알려져 있다. 비정상인 혈관 투과성 항진이 관여하는 질환으로는, 망막 정맥 폐색증이나 당뇨병 황반 부종 등이 알려져 있다. 이들 질환의 치료에는, VEGF 의 활성을 중화하는 항체가 사용되고 있다.

항VEGF 중화 항체는, 누드 마우스에 있어서 각종 인간 종양 세포주의 성장을 억제하고, 또, 허혈성 망막 장애의 모델에 있어서, 안내 (眼內) 의 신맥관 형성을 저해한다 (특허문헌 1：일본 공표특허공보 2011-525359호, 특허문헌 2：일본 공표특허공보 2007-526756호). 항VEGF 항체로는, 베바시주맙 (bevacizumab, 아바스틴 (등록상표)) 이 알려져 있으며, 전이성 직장 결장암 (CRC) 및 비소세포 폐암 (NSCLC) 을 처치하기 위해서 화학 요법 레지멘과의 병용이 FDA 에 의해 승인되어 있다.

또, 베바시주맙의 Fab (antigen-binding fragment) 항체로서, 라니비주맙 (Ranibizumab 루센티스 (등록상표)) 가 개발되어 있다. 라니비주맙은, 2006년에 FDA 에 의해 가령 황반 변성 치료약으로서 승인되어 있다.

베바시주맙 및 그 Fab 항체는, VEGF 와 결합함으로써, VEGF 와 VEGFR1 및 VEGFR2 의 결합을 저해함으로써, 혈관 신생을 저해하고, 증식 속도가 빠른 암 세포에 대한 영양 공급을 저하시키는 기구에서 약효를 발휘하는 것으로 생각되고 있다. 그러나, 베바시주맙은 VEGF 와 NRP1 의 결합을 저해하지 않는 것이 알려져 있다.

한편, NRP1 에 대한 항체 중에는, VEGF 와 NRP1 의 결합을 저해하는 모노클로날 항체가 보고되어 있다 (특허문헌 3：일본 공표특허공보 2010-530359호). 이들 항체는, NRP1 에 결합함으로써, VEGF 가 NRP1 에 결합하는 것을 저해하고, VEGF 의 기능을 억제한다.

VEGF 는 혈관 신생 및 혈관 투과성에 관련된 작용을 갖는 한편, 암 줄기세포에도 영향을 미치고 있는 것이 보고되어 있다. 피부의 편평 상피암에 있어서는, VEGF 가 NRP1 과 결합함으로써, 암 줄기세포의 줄기세포성의 제어에 관여하고 있는 것으로 보고되어 있다 (비특허문헌 5：Nature, 478, 399-403, 2011).

상기와 같이, 베바시주맙은 VEGF 와 VEGFR1 및 VEGFR2 의 결합을 저해하는 항체이며, VEGF 와 NRP1 의 결합을 억제할 수는 없다. 또, VEGF 에 대한 항체 중에서, VEGF 와 NRP1 의 결합을 억제하는 항체는 보고되어 있지 않았다.

일본 공표특허공보 2011-525359호 일본 공표특허공보 2007-526756호 일본 공표특허공보 2010-530359호

Endocrine Reviews, 18, 4-25, 1997 Nature, 436：193-200, 2005 Development, 135, 2479-88, 2008 Cell, 92, 735-745, 1998 Nature Reviews Cancer, 8, 880-887, 2008 Nature, 478, 399-403, 2011

본 발명은 이와 같은 상황을 감안하여 이루어진 것이며, 그 해결하고자 하는 과제는, 혈관 내피 증식 인자 (VEGF) 와 뉴로필린-1 (NRP1) 의 결합을 저해하는, VEGF 에 대한 신규 항체를 제공하는 것에 있다.

본 발명자들은, 상기 과제를 해결하기 위해서 연구를 거듭한 결과, VEGF 와 NRP1 의 결합을 저해하는 항체를 제조하고, 당해 항체가 VEGF 의 생리 작용을 저해하는 것을 알아내어, 본 발명을 완성시켰다.

즉, 본 발명은 이하와 같다.

(1) 혈관 내피 증식 인자 (VEGF) 와 뉴로필린-1 (NRP1) 의 결합을 저해하는, VEGF 에 대한 항체.

(2) 혈관 내피 증식 인자 (VEGF) 와 뉴로필린-1 (NRP1) 및 혈관 내피 증식 인자 수용체-2 (VEGFR2) 의 결합을 저해하는, VEGF 에 대한 항체.

(3) 혈관 내피 증식 인자 (VEGF) 와 뉴로필린-1 (NRP1) 및 혈관 내피 증식 인자 수용체-1 (VEGFR1) 의 결합을 저해하는, VEGF 에 대한 항체.

(4) 혈관 내피 증식 인자 (VEGF) 와, 뉴로필린-1 (NRP1), 혈관 내피 증식 인자 수용체-2 (VEGFR2) 및 혈관 내피 증식 인자 수용체-1 (VEGFR1) 의 결합을 저해하는, VEGF 에 대한 항체.

(5) 항체가 모노클로날 항체인 상기 (1) ∼ (4) 중 어느 하나에 기재된 항체.

(6) 상기 (1) ∼ (5) 중 어느 하나에 기재된 항체가 결합하는 부위에 결합하는 항체.

(7) 항체가 키메라 항체 또는 인간형화 항체인, 상기 (5) 또는 (6) 에 기재된 항체.

(8) 서열 번호 14 의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열 번호 16 의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및 서열 번호 18 의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3 을 포함하는, 상기 (1) ∼ (7) 중 어느 하나에 기재된 항체.

(9) 서열 번호 20 의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 아미노산 서열 Glu-Gly-Asn 을 포함하는 CDR-L2 및 서열 번호 22 의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3 을 포함하는, 상기 (1) ∼ (7) 중 어느 하나에 기재된 항체.

(10) 서열 번호 14 의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열 번호 16 의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및 서열 번호 18 의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3 을 포함하고, 또한, 서열 번호 20 의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 아미노산 서열 Glu-Gly-Asn 을 포함하는 CDR-L2 및 서열 번호 22 의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3 을 포함하는, 상기 (1) ∼ (7) 중 어느 하나에 기재된 항체.

(11) 추가로 인간 IgG1 중쇄 정상 영역에서 유래하는 아미노산 서열 및 인간 IgG1 경쇄 정상 영역에서 유래하는 아미노산 서열을 포함하는, 상기 (10) 에 기재된 항체.

(12) 인간 IgG1 중쇄 정상 영역에서 유래하는 아미노산 서열이 서열 번호 36 의 아미노산 서열을 포함하는 것이고, 또한, 인간 IgG1 경쇄 정상 영역에서 유래하는 아미노산 서열이 서열 번호 38 의 아미노산 서열을 포함하는 것인, 상기 (11) 에 기재된 항체.

(13) 서열 번호 24 의 아미노산 서열 및 서열 번호 36 의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 그리고 서열 번호 26 의 아미노산 서열 및 서열 번호 38 의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는, 상기 (12) 에 기재된 항체.

(14) 추가로 개 IgGB 중쇄 정상 영역에서 유래하는 아미노산 서열 및 개 Ig 경쇄 (κ 사슬) 정상 영역에서 유래하는 아미노산 서열을 포함하는 상기 (10) 에 기재된 항체.

(15) 개 IgGB 중쇄 정상 영역에서 유래하는 아미노산 서열이 서열 번호 40 의 아미노산 서열을 포함하는 것이고, 또한, 개 Ig 경쇄 (κ 사슬) 정상 영역에서 유래하는 아미노산 서열이 서열 번호 42 의 아미노산 서열을 포함하는 것인, 상기 (14) 에 기재된 항체.

(16) 서열 번호 24 의 아미노산 서열 및 서열 번호 40 의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 그리고 서열 번호 26 의 아미노산 서열 및 서열 번호 42 의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄

를 포함하는, 상기 (15) 에 기재된 항체.

(17) 상기 (1) ∼ (16) 중 어느 하나에 기재된 항체의 단편.

(18) 단편이 항원 결합 단편인 상기 (17) 에 기재된 단편.

(19) 항원 결합 단편이 단쇄 항체 또는 2 본쇄 항체인, 상기 (18) 에 기재된 단편.

(20) 상기 (5) 에 기재된 모노클로날 항체를 산생하는 하이브리도마.

(21) 상기 (1) ∼ (19) 중 어느 하나에 기재된 항체 또는 그 단편을 포함하는 의약 조성물.

(22) 암 또는 VEGF 매개성 안질환의 치료 또는 예방에 사용하기 위한, 상기 (21) 에 기재된 의약 조성물.

(23) 암 또는 VEGF 매개성 안질환의 치료 또는 예방이, 혈관 내피 증식 인자 (VEGF) 와 뉴로필린-1 (NRP1) 의 결합의 저해에 의한 것인, 상기 (22) 에 기재된 의약 조성물.

(24) 암 또는 VEGF 매개성 안질환의 치료 또는 예방이 혈관 신생 또는 혈관 투과성 항진의 저해에 의한 것인, 상기 (22) 에 기재된 의약 조성물.

(25) 혈관 신생이 병적인 혈관 신생인, 상기 (24) 에 기재된 의약 조성물.

(26) 암이 고형암 또는 혈액 종양인, 상기 (22) 에 기재된 의약 조성물.

(27) 암이, 뇌종양, 경암 (頸癌), 식도암, 설암, 폐암, 유방암, 췌암, 위암, 소장의 암, 십이지장암, 대장암, 방광암, 신암, 간암, 전립선암, 자궁암, 자궁경암, 난소암, 갑상선암, 담낭암, 인두암, 육종, 멜라노마, 백혈병, 림프종 및 다발성 골수종으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종인, 상기 (22) 에 기재된 의약 조성물.

(28) VEGF 매개성 안질환이, 가령 황반 변성, 당뇨병 망막증, 당뇨병 황반 부종, 혈관 신생 녹내장, 망막 정맥 폐색증, 미숙아 망막증, 병적 근시에 수반하는 맥락막 혈관 신생, 익상편 (翼狀片), 루베오시스, 판누스, 점막피부안 증후군 및 눈에 있어서의 이식 조직의 면역 거절로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종인, 상기 (22) 에 기재된 의약 조성물.

(29) 상기 (1) ∼ (19) 중 어느 하나에 기재된 항체 또는 그 단편을 포함하는, 혈관 신생 저해제.

(30) 상기 (1) ∼ (19) 중 어느 하나에 기재된 항체 또는 그 단편을 포함하는, 시약.

(31) 상기 (1) ∼ (19) 중 어느 하나에 기재된 항체 또는 그 단편을 포함하는, 키트.

(32) 치료상 유효량의 상기 (1) ∼ (19) 중 어느 하나에 기재된 항체 또는 그 단편을 피험자에게 투여하는 공정을 포함하는, 암 또는 VEGF 매개성 안과 질환의 치료 또는 예방 방법.

(33) 암 또는 VEGF 매개성 안질환의 치료 또는 예방 방법에 있어서 사용하기 위한, 상기 (1) ∼ (19) 중 어느 하나에 기재된 항체 또는 그 단편.

(34) 암 또는 VEGF 매개성 안질환을 치료 또는 예방하기 위한 의약의 제조에 있어서 사용하기 위한, 상기 (1) ∼ (19) 중 어느 하나에 기재된 항체 또는 그 단편.

본 발명에 의해, 혈관 내피 증식 인자 (VEGF) 와 뉴로필린-1 (NRP1) 의 결합을 저해하는, VEGF 에 대한 신규 항체를 제공할 수 있다.

도 1 은, VEGF₁₆₅ 와 VEGF₁₂₁ 에 대해서 수용체 결합 도메인을 나타낸 도면이다.
도 2 는, 본 발명의 항체에 대해서, VEGF 와 NRP1 의 결합 저해능을 해석한 결과를 나타내는 도면이다.
도 3 은, 본 발명의 항체에 대해서, VEGF 와 VEGFR2 의 결합 저해능을 해석한 결과를 나타내는 도면이다.
도 4 는, 본 발명의 항체에 대해서, VEGF 와 VEGFR1 의 결합 저해능을 해석한 결과를 나타내는 도면이다.
도 5 는, 본 발명의 항체인 KLHc161 의 세포 증식 저해 효과를 검토한 결과를 나타내는 도면이다.
도 6 은, 본 발명의 항체인 KLHc161 의 세포 증식 저해 효과를 검토한 결과를 나타내는 도면이다.
도 7 은, 본 발명의 항체인 KLHc161 의 in vivo 에 있어서의 종양 증식 저해 효과를 검토한 결과를 나타내는 도면이다.
도 8 은, 마우스·레이저 유발 맥락막 혈관 신생 (CNV) 모델을 이용한 시험의 스케줄을 나타내는 도면이다.
도 9 는, 본 발명의 항체인 KLHc161 의 CNV 모델에 대한 혈관 신생 저해 효과를 검토한 결과를 나타내는 도면이다.
도 10 은, 본 발명의 인간형 키메라 항체인 KLHc161HC 의 in vivo 에 있어서의 종양 증식 저해 효과를 검토한 결과를 나타내는 도면이다.
도 11 은, 본 발명의 개형 키메라 항체인 KLHc161CC 의 인간 및 개 VEGF 에 대한 교차성을 검토한 결과를 나타내는 도면이다.
도 12 는, 본 발명의 개형 키메라 항체인 KLHc161CC 의 in vivo 에 있어서의 인간 세포주에 대한 종양 증식 저해 효과를 검토한 결과를 나타내는 도면이다.
도 13 은, 본 발명의 개형 키메라 항체인 KLHc161CC 의 in vivo 에 있어서의 개 세포주에 대한 종양 증식 저해 효과를 검토한 결과를 나타내는 도면이다.
도 14 는, 본 발명의 인간형 키메라 항체인 KLHc161HC 의, VEGF165, VEGF121 및 VEGF165b 에 대한 결합능을 검토한 결과를 나타내는 도면이다.

이하, 본 발명을 상세하게 설명한다. 이하의 실시형태는, 본 발명을 설명하기 위한 예시이며, 본 발명을 이 실시형태에만 한정되는 취지는 아니다. 본 발명은, 그 요지를 일탈하지 않는 한, 다양한 형태로 실시를 할 수 있다. 또, 본 명세서는, 본원 우선권 주장의 기초가 되는 2016년 1월 6일에 출원된 일본국 특허출원 (일본 특허출원 2016-001275호) 의 명세서 및 도면에 기재된 내용을 포함한다.

1. 개요

본 발명은, 혈관 내피 증식 인자 (VEGF) 와 뉴로필린-1 (NRP1) 의 결합을 저해하는, VEGF 에 대한 항체에 관한 것이다.

항VEGF 중화 항체로서 알려진 베바시주맙은, VEGF 와 VEGFR1 및 VEGFR2 의 결합을 저해하는 항체이며, VEGF 와 NRP1 의 결합은 저해하지 않는다. 또, VEGF 와 NRP1 의 결합을 저해하는 항체에는, NRP1 에 대한 항체는 알려져 있지만, VEGF 에 대한 항체는 알려져 있지 않다.

이에 대해, 본 발명자는 VEGF 와 NRP1 의 결합을 저해하는 VEGF 에 대한 항체를 개발하였다. 또, 본 발명자는, 이 항체가 VEGF 와 NRP1 의 결합을 저해하는 것에 더하여, VEGF 와 혈관 내피 증식 인자 수용체-2 (VEGFR2) 의 결합 및 VEGF 와 혈관 내피 증식 인자 수용체-1 (VEGFR1) 의 결합을 저해하는 것을 알아내었다. 또한, 본 발명자는, NRP1 이 VEGF 에 의한 혈관 신생이나 암 줄기세포의 제어에 중요한 역할을 하고 있는 것에 주목하고, VEGF 와 NRP1 의 결합을 저해하는 VEGF 에 대한 항체가, 암, VEGF 매개성 안질환, 그 외 병적인 혈관 신생 또는 혈관 투과성 항진에서 기인하는 질환의 치료 또는 예방에 유효한 것을 알아내었다. 본 발명은 이와 같은 지견에 기초하여 완성된 것이다.

2. 혈관 내피 증식 인자 (VEGF)

VEGF 는, 혈관 신생에 있어서 중요한 역할을 하고 있는 단백질이다. VEGF 는, 그 수용체와 결합함으로써, 세포 내에 시그널을 전달하고, 세포 분열이나 유주, 분화 유도, 혈관 투과성의 항진, 단구나 매크로파지의 활성화 등에 관여하고 있다.

본 발명에 있어서, VEGF 로는, 예를 들어, VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, VEGF-E, PIGF-1, PIGF-2 등을 들 수 있는데, 바람직하게는 VEGF-A 이다.

본 발명에 있어서의 VEGF 는, 임의의 포유 동물에서 유래하는 것이어도 되고, 그러한 포유 동물로는, 예를 들어, 마우스, 래트, 토끼, 염소, 개, 원숭이, 인간을 들 수 있으며, 바람직하게는 마우스, 래트, 개, 인간이다.

또, 인간 VEGF-A 로는, 예를 들어, 165 아미노산 잔기로 이루어지는 VEGF (VEGF₁₆₅), 그 아형인 121 아미노산 잔기로 이루어지는 VEGF (VEGF₁₂₁), 145 아미노산 잔기로 이루어지는 VEGF (VEGF₁₄₅), 183 아미노산 잔기로 이루어지는 VEGF (VEGF₁₈₃), 189 아미노산 잔기로 이루어지는 VEGF (VEGF₁₈₉), 206 아미노산 잔기로 이루어지는 VEGF (VEGF₂₀₆), 상기 VEGF₁₆₅ 와는 C 말단 영역의 아미노산 서열이 상이한 VEGF (VEGF_165b), 그리고 그들의 천연으로 발생하는 대립 유전자형 및 프로세싱형을 들 수 있다. 본 발명에 있어서, 인간 VEGF-A 로는, VEGF₁₂₁, VEGF₁₆₅ 가 바람직하다. VEGF 는 염색체 6p12 에 코드되고, mRNA 는 16,272 bp 의 길이이다. VEGF 는, 엑손 1 ∼ 5 와, 6a, 6b, 7a, 7b, 8a 및 8b 로 이루어진다. VEGF₁₆₅ 는, NRP1, VEGFR1 및 VEGFR2 모두에 결합한다.

또한, 개 VEGF 로는, 예를 들어, 164 아미노산 잔기로 이루어지는 VEGF (VEGF₁₆₄), 120 아미노산 잔기로 이루어지는 VEGF (VEGF₁₂₀), 144 아미노산 잔기로 이루어지는 VEGF (VEGF₁₄₄), 147 아미노산 잔기로 이루어지는 VEGF (VEGF₁₄₇), 162 아미노산 잔기로 이루어지는 VEGF (VEGF₁₆₂), 182 아미노산 잔기로 이루어지는 VEGF (VEGF₁₈₂), 188 아미노산 잔기로 이루어지는 VEGF (VEGF₁₈₈), 205 아미노산 잔기로 이루어지는 VEGF (VEGF₂₀₅), 상기 VEGF₁₆₄ 와는 C 말단 영역의 아미노산 서열이 상이한 VEGF (VEGF_164b), 그리고 그들의 천연으로 발생하는 대립 유전자형 및 프로세싱형을 들 수 있지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 마우스, 래트, 개 및 인간의 VEGF, 그리고 VEGF₁₂₁ 및 VEGF₁₆₅ 의 아미노산 서열은, 각각, 서열 번호 2, 4, 6, 8, 10 및 12 로 나타낸다. 또, 마우스, 래트, 개 및 인간의 VEGF, 그리고 VEGF₁₂₁ 및 VEGF₁₆₅ 를 코드하는 DNA 의 염기 (뉴클레오티드) 서열은, 각각, 서열 번호 1, 3, 5, 7, 9 및 11 로 나타낸다. 각 아미노산 서열 및 염기 서열은, 각각 GenBank 데이터베이스에 있어서, 소정의 액세션 번호 (Accession No.) 에 의해 등록되어 있다.

마우스 VEGF 의 아미노산 서열：NP_001020421.2 (서열 번호 2)

래트 VEGF 의 아미노산 서열：NP_114024.2 (서열 번호 4)

개 VEGF 의 아미노산 서열：NP_001003175 (서열 번호 6)

인간 VEGF-A 의 아미노산 서열：NP_001020537.2 (서열 번호 8)

VEGF₁₂₁ 의 아미노산 서열：ABO26344.1 (서열 번호 10)

VEGF₁₆₅ 의 아미노산 서열：AAM03108.1 (서열 번호 12)

마우스 VEGF 를 코드하는 DNA 의 염기 서열：NM_001025250.3 (서열 번호 1)

래트 VEGF 를 코드하는 DNA 의 염기 서열：NM_031836.2 (서열 번호 3)

개 VEGF 를 코드하는 DNA 의 염기 서열：NM_001003175.2 (서열 번호 5)

인간 VEGF-A 를 코드하는 DNA 의 염기 서열：NM_001025366.2 (서열 번호 7)

VEGF₁₂₁ 을 코드하는 DNA 의 염기 서열：EF424789.1 (서열 번호 9)

VEGF₁₆₅ 를 코드하는 DNA 의 염기 서열：AF486837.1 (서열 번호 11)

본 발명에서 사용되는 VEGF 에는, 이하의 (a) ∼ (c) 의 단백질이 포함된다.

(a) 서열 번호 2, 4, 6, 8, 10 혹은 12 로 나타내는 아미노산 서열을 포함하는 단백질,

(b) 서열 번호 2, 4, 6, 8, 10 혹은 12 로 나타내는 아미노산 서열에 있어서, 1 혹은 몇 개의 아미노산이, 결실 (缺失), 치환 혹은 부가된 아미노산 서열을 포함하고, 또한 VEGF 수용체와 결합하는 활성을 갖는 단백질,

(c) 서열 번호 2, 4, 6, 8, 10 혹은 12 로 나타내는 아미노산 서열에 대해서 80 ％ 이상의 상동성 (동일성) 을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 VEGF 수용체와 결합하는 활성을 갖는 단백질.

본 발명에 있어서, 「서열 번호 2, 4, 6, 8, 10 혹은 12 로 나타내는 아미노산 서열을 포함하는 단백질」 에는, 서열 번호 2, 4, 6, 8, 10 혹은 12 로 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질이 포함된다.

또, 「서열 번호 2, 4, 6, 8, 10 혹은 12 로 나타내는 아미노산 서열에 있어서, 1 혹은 몇 개의 아미노산이, 결실, 치환 혹은 부가된 아미노산 서열」 로는, 예를 들어,

(i) 서열 번호 2, 4, 6, 8, 10 혹은 12 로 나타내는 아미노산 서열 중의 1 ∼ 10 개 (예를 들어, 1 ∼ 5 개, 바람직하게는 1 ∼ 3 개, 보다 바람직하게는 1 ∼ 2 개, 더욱 바람직하게는 1 개) 의 아미노산이 결실된 아미노산 서열,

(ii) 서열 번호 2, 4, 6, 8, 10 혹은 12 로 나타내는 아미노산 서열 중의 1 ∼ 10 개 (예를 들어, 1 ∼ 5 개, 바람직하게는 1 ∼ 3 개, 보다 바람직하게는 1 ∼ 2 개, 더욱 바람직하게는 1 개) 의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 아미노산 서열,

(iii) 서열 번호 2, 4, 6, 8, 10 혹은 12 로 나타내는 아미노산 서열에 1 ∼ 10 개 (예를 들어, 1 ∼ 5 개, 바람직하게는 1 ∼ 3 개, 보다 바람직하게는 1 ∼ 2 개, 더욱 바람직하게는 1 개) 의 아미노산이 부가된 아미노산 서열,

(iv) 상기 (i) ∼ (iii) 의 조합에 의해 변이된 아미노산 서열

등을 들 수 있다.

본 발명에 있어서 「VEGF 수용체」 란, 뉴로필린-1 (NRP1), 혈관 내피 증식 인자 수용체-1 (VEGFR1 (별명 Flt-1)) 또는 혈관 내피 증식 인자 수용체-2 (VEGFR2 (별명 KDR)) 이다. 또, 「VEGF 수용체와 결합하는 활성」 이란, VEGF 수용체와 특이적으로 결합하는 활성을 의미한다. 당해 결합 활성의 유무에 대해서는, 공지된 방법, 예를 들어 면역 침강법, 웨스턴 블로팅, EIA (enzyme immunoassay), ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) 등의 면역학적 수법이나 풀다운 어세이 등의 방법을 이용함으로써 측정할 수 있다. 또, 「VEGF 수용체와 결합하는 활성」 이란, 서열 번호 2, 4, 6, 8, 10 또는 12 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질의 활성을 100 으로 했을 때와 비교하여, 적어도 10 ％ 이상, 20 ％ 이상, 30 ％ 이상, 40 ％ 이상, 50 ％ 이상, 60 ％ 이상, 70 ％ 이상, 80 ％ 이상, 바람직하게는 90 ％ 이상의 활성을 갖는 것을 의미한다.

또, 본 발명에 있어서의 VEGF 에는, 서열 번호 2, 4, 6, 8, 10 또는 12 로 나타내는 아미노산 서열 외에, 서열 번호 2, 4, 6, 8, 10 또는 12 로 나타내는 아미노산 서열과 80 ％ 이상의 상동성 (동일성) 을 갖는 아미노산 서열을 갖고, 또한 VEGF 수용체와 결합하는 활성을 갖는 단백질을 들 수 있다. 이와 같은 단백질로는, 서열 번호 2, 4, 6, 8, 10 또는 12 로 나타내는 아미노산 서열에 대해서, 약 80 ％ 이상, 85 ％ 이상, 90 ％ 이상, 95 ％ 이상, 96 ％ 이상, 97 ％ 이상, 98 ％ 이상 또는 99 ％ 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 갖고, 또한 VEGF 수용체와 결합하는 활성을 갖는 것 (서열 번호 2, 4, 6, 8, 10 또는 12 로 나타내는 아미노산 서열과 실질적으로 동등한 아미노산 서열) 도 포함된다. 상동성은, 인터넷을 이용한 호몰로지 검색 사이트, 예를 들어, 일본 DNA 데이터 뱅크 (DDBJ) 에 있어서, FASTA, BLAST, PSI-BLAST 등의 상동성 검색을 이용할 수 있다. 또, National Center for Biotechnology Information (NCBI) 에 있어서, BLAST 를 이용한 검색을 실시할 수도 있다.

상기의 변이를 갖는 단백질을 조제하기 위해서, 그 단백질을 코드하는 DNA 에 변이를 도입하려면, Kunkel 법이나 Gapped duplex 법 등의 부위 특이적 돌연변이 유발법을 이용한 변이 도입용 키트, 예를 들어 QuikChange^TM Site-Directed Mutagenesis Kit (스트라테이진사 제조), GeneTailor^TM Site-Directed Mutagenesis System (인비트로젠사 제조), TaKaRa Site-Directed Mutagenesis System (Mutan-K, Mutan-Super Express Km 등：타카라 바이오사 제조) 등을 사용하여 실시할 수 있다. 또, 「Molecular Cloning, A Laboratory Manual (4th edition)」 (Cold Spring Harbor Laboratory Press (2012)) 등에 기재된 부위 특이적 변이 유발법 등의 방법을 이용할 수 있다.

3. VEGF 에 대한 항체

본 발명에 있어서, VEGF 에 대한 항체 (이하 「항VEGF 항체」 라고도 칭한다.) 란, 상기 VEGF 와 특이적으로 결합하는 항체를 의미한다. 본 발명의 항VEGF 항체는, VEGF 와 NRP1 의 결합을 저해한다. 또, 본 발명의 항VEGF 항체는, VEGF 와 NRP1 및 VEGFR2 의 결합, VEGF 와 NRP1 및 VEGFR1 의 결합을 저해한다. 또한, 본 발명의 항VEGF 항체는, VEGF 와 NRP1, VEGFR2 및 VEGFR1 의 결합을 저해한다.

또한, 항VEGF 항체로서 널리 알려져 있는 베바시주맙 (아바스틴 (등록상표)) 은, VEGF 와 VEGFR1 및 VEGFR2 의 결합을 저해하지만, VEGF 와 NRP1 의 결합은 저해하지 않는다.

본 발명에 있어서, 「VEGF 와 NRP1 및 VEGFR2 의 결합을 저해한다」 란, 본 발명의 항체가, VEGF 에 결합함으로써, VEGF 와 NRP1 의 결합 및 VEGF 와 VEGFR2 의 결합을 저해하는 것을 의미한다. 「VEGF 와 NRP1 및 VEGFR1 의 결합을 저해한다」 및 「VEGF 와 NRP1, VEGFR2 및 VEGFR1 의 결합을 저해한다」 에 대해서도 동일하다.

본 발명에 있어서 「결합을 저해한다」 란, 반드시 VEGF 와 VEGF 수용체 (NRP1, VEGFR2 또는 VEGFR1) 의 결합을 100 ％ 저해하는 것을 의미하는 것은 아니다. 본 발명의 항체는, VEGF 와 VEGF 수용체의 결합을, 예를 들어 50 ％ 이상, 바람직하게는 60 ％ 이상, 70 ％ 이상, 80 ％ 이상, 90 ％ 이상, 95 ％ 이상, 96 ％ 이상, 97 ％ 이상, 98 ％ 이상, 99 ％ 이상 저해한다.

결합 저해 효과는, 결합 저해 시험에 관한 공지된 방법, 예를 들어 본 명세서의 실시예 2 에서 사용한 방법을 이용하여 평가할 수 있다.

본 발명의 항체는 폴리클로날 항체여도 되고 모노클로날 항체여도 되지만, 바람직하게는 모노클로날 항체이다.

본 발명의 항체는, VEGF 에 특이적으로 결합하고, VEGF 의 활성을 중화하는 중화 항체이다. 본 발명에 있어서, 「특이적으로 결합한다」 란, 표적 분자에는 결합 (반응) 하지만, 표적 분자 이외에는 실질적으로 결합하지 않는 (반응하지 않는) 것을 의미한다. 또, 본 발명에 있어서, 「중화한다」 란, 적어도, VEGF 의 NRP1, VEGFR2 및/또는 VEGFR1 에 결합하는 활성을 저해 (억제) 하는 것을 의미한다. 결합이 특이적인지 아닌지의 확인은, 면역학적 수법, 예를 들어 ELISA 법, 웨스턴 블롯법 또는 면역 조직학적 염색 등에 의해 확인할 수 있다.

이하, 항VEGF 항체의 조제 방법에 대해서 설명한다.

(1) 항원의 조제

VEGF 는, 본 발명의 항체를 제조하기 위한 면역원으로서 사용된다.

면역원으로서 VEGF 를 사용하는 경우, VEGF 의 전체 길이 서열 중 일부의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드를 사용할 수도 있다. 항원 또는 면역원으로서 사용되는 VEGF 및 변이의 도입 방법 등의 설명에 대해서는, 상기 「2. VEGF」 에 기재한 바와 같다.

VEGF 는, 마우스, 래트, 개, 인간 등의 조직이나 세포로부터 정제된 천연형의 VEGF 여도 되고, 유전자 공학적으로 생산된 VEGF 여도 된다. 예를 들어, VEGF 가 확인되는 생체 시료를 각종 계면 활성제, 예를 들어 트리톤-X (Triton-X), 사르코실 (Sarkosyl) 등을 사용하여, 가용성 획분과 불용성 획분으로 분획한다. 또한 불용성 획분을 우레아나 구아니딘염산 등에 용해하고, 각종 칼럼, 예를 들어 헤파린 칼럼 혹은 결합 수지에 결합시킴으로써 VEGF 를 얻을 수 있다. 또, 항원으로서 사용하는 VEGF 는, 그 아미노산 서열을 지정함으로써, 고상법 등의 공지된 단백질 합성법 또는 시판되는 단백질 합성 장치를 사용하여 합성할 수도 있다. 합성한 펩티드는, 키홀 림펫 헤모사이아닌 (Keyhole Limpet Hemocyanin, KLH) 또는 티로글로불린 (Thyroglobulin) 등의 담체 단백질과 결합시켜, 면역원으로서 사용할 수 있다.

(2) 폴리클로날 항체의 제조

상기와 같이 하여 제조한 VEGF 또는 부분 펩티드를 그 자체로, 혹은 담체, 희석제와 함께 비인간 포유 동물, 예를 들어 토끼, 개, 모르모트, 마우스, 래트, 염소 등에 투여함으로써 면역한다. 항원의 동물 1 마리당 투여량은, 애쥬번트를 사용할 때에는 0.1 ∼ 10 ㎎ 이다. 애쥬번트로는, 프로인트 완전 애쥬번트 (FCA), 프로인트 불완전 애쥬번트 (FIA), 수산화알루미늄 애쥬번트 등을 들 수 있다. 면역은, 주로 정맥내, 피하 또는 복강내 등에 주입함으로써 실시된다. 또, 면역의 간격은 특별히 한정되지 않고, 수 일 내지 수 주일 간격, 바람직하게는 1 ∼ 2 주간 간격으로, 2 ∼ 10 회, 바람직하게는 3 ∼ 5 회 면역을 실시한다. 면역의 간격은, 당업자이면 얻어지는 항체가를 감안하여 설정할 수 있다. 3 ∼ 4 회 피하 면역을 실시한 시점에서 시채혈을 실시하고, 항체가를 측정하는 것이 바람직하다. 혈청 중의 항체가의 측정은, ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay), EIA (enzyme immunoassay), 방사성 면역 측정법 (RIA ; radioimmuno assay) 등에 의해 실시할 수 있다. 항체가가 충분히 상승한 것을 확인한 후, 전(全) 채혈하고, 통상적으로 실시되는 방법에 의해 항체를 분리 정제할 수 있다. 분리 정제는, 황안염석법, 이온 교환 크로마토그래피, 겔 여과 크로마토그래피, 어피니티 크로마토그래피 등의 공지된 방법을 적절히 선택하여, 또는 이들을 조합함으로써, 정제할 수 있다. 구체적으로는, 목적으로 하는 항체를 함유하는 혈청을, VEGF 이외의 단백질을 결합한 칼럼에 통과시키고, 그냥 통과하는 획분을 채취함으로써, VEGF 에 대한 특이성을 향상시킨 폴리클로날 항체를 얻을 수 있다.

(3) 모노클로날 항체의 제조

(i) 항체 산생 세포의 채취

폴리클로날 항체의 제조와 마찬가지로, VEGF 또는 부분 펩티드를 그 자체로, 혹은 담체 및 희석제와 함께 비인간 포유 동물에 투여함으로써 면역한다. 동물 1 마리당 항원의 투여량, 사용되는 애쥬번트의 종류, 면역 방법, 면역의 간격은 폴리클로날 항체의 제조와 동일하다. 최종 면역일부터 1 ∼ 30 일 후, 바람직하게는 2 ∼ 5 일 후에, 항체가가 확인된 개체를 선택하여 항체 산생 세포를 채집한다. 항체 산생 세포로는, 비장 세포, 림프절 세포, 말초혈 세포 등을 들 수 있는데, 비장 세포 또는 림프절 세포가 바람직하다.

(ii) 세포 융합

하이브리도마를 얻기 위해서, 항체 산생 세포와 미엘로마 세포의 세포 융합을 실시한다. 융합 조작은 이미 알려진 방법, 예를 들어 Kohler 등의 방법에 따라서 실시할 수 있다. 항체 산생 세포와 융합시키는 미엘로마 세포로서, 마우스 등의 동물의 일반적으로 입수 가능한 주화 세포를 사용할 수 있다. 사용하는 세포주로는, 약제 선택성을 갖고, 미융합 상태에서는 HAT 선택 배지 (히포잔틴, 아미노프테린, 티미딘을 포함한다) 에서 생존하지 못하고, 항체 산생 세포와 융합한 상태에서만 생존할 수 있는 성질을 갖는 것이 바람직하다. 미엘로마 세포로는, 예를 들어 P3-x63-Ag8U.1, SP2/O-Ag14, PAI, P3U1, NSI/1-Ag4-1, NSO/1 등의 마우스 미엘로마 세포주, YB2/0 등의 래트 미엘로마 세포주 등을 들 수 있다.

상기 미엘로마 세포와 항체 산생 세포의 세포 융합은, 혈청을 포함하지 않는 DMEM, RPMI-1640 배지 등의 동물 세포 배양용 배지 중에서, 1 × 10⁸ ∼ 5 × 10⁸ 개의 항체 산생 세포와 2 × 10⁷ ∼ 10 × 10⁷ 개의 미엘로마 세포를 혼합하고 (항체 산생 세포와 미엘로마 세포의 세포비 10：1 ∼ 1：1), 세포 융합 촉진제 존재 아래에서 융합 반응을 실시한다. 세포 융합 촉진제로서, 평균 분자량 1000 ∼ 6000 달톤의 폴리에틸렌글리콜 또는 센다이 바이러스 등을 사용할 수 있다. 또, 전기 자극 (예를 들어 일렉트로포레이션) 을 이용한 시판되는 세포 융합 장치를 사용하여 항체 산생 세포와 미엘로마 세포를 융합시킬 수도 있다.

(iii) 하이브리도마의 선별 및 클로닝

세포 융합 처리 후의 세포로부터 목적으로 하는 하이브리도마를 선별한다. 그 방법으로서, 세포 현탁액을, 예를 들어 10 ∼ 20 ％ 의 소 태아 혈청 함유 RPMI-1640 배지 등으로 적당하게 희석 후, 마이크로타이터 플레이트 상에 한계 희석법으로 계산상 0.3 개/웰 정도 뿌리고, 각 웰에 HAT 배지 등의 선택 배지를 첨가하고, 이후 적당하게 선택 배지를 교환하여 배양을 실시한다. 그 결과, 선택 배지에서 배양 개시 후, 10 일 전후부터 생육해 오는 세포를 하이브리도마로서 얻을 수 있다.

다음으로, 생육해 온 하이브리도마를 추가로 스크리닝 한다. 하이브리도마의 스크리닝은, 통상적인 방법에 따르면 되고, 특별히 한정되는 것은 아니다. 예를 들어, 하이브리도마를 배양한 웰에 포함되는 배양 상청의 일부를 채집하고, 효소 면역 측정법, 방사성 면역 측정법 등에 의해, 스크리닝 할 수 있다. 구체적으로는, 96 웰 플레이트에 항원을 흡착시킨 후, 송아지 혈청으로 블로킹 한다. 하이브리도마 세포의 배양 상청을 고상화한 항원에 37 ℃ 에서 1 시간 반응시킨 후, 퍼옥시다아제 표지한 항마우스 IgG 를 37 ℃ 에서 1 시간 반응시키고, 오르토페닐렌디아민을 기질로서 사용하여 발색시킨다. 산으로 반응을 정지시킨 후, 490 ㎚ 파장에 있어서의 흡광도를 측정함으로써, 스크리닝 할 수 있다. 상기 측정법에 의해 양성을 나타낸 모노클로날 항체를 산생하는 하이브리도마를, 한계 희석법 등에 의해 클로닝 한다. 그리고, 최종적으로, VEGF 에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체를 산생하는 세포인 하이브리도마를 수립한다.

(iv) 모노클로날 항체의 채취

수립한 하이브리도마로부터 모노클로날 항체를 채취하는 방법으로서, 통상적인 세포 배양법 또는 복수 형성법 등을 채용할 수 있다. 세포 배양법에 있어서는, 하이브리도마를 10 ％ 소 태아 혈청 함유 RPMI-1640 배지, MEM 배지 또는 무혈청 배지 등의 동물 세포 배양 배지 중에서, 통상적인 배양 조건 (예를 들어 37 ℃, 5 ％ CO₂ 농도) 으로 7 ∼ 14 일간 배양하고, 그 배양 상청으로부터 항체를 취득한다. 복수 형성법의 경우에는, 미엘로마 세포 유래의 포유 동물과 동종계 동물, 예를 들어 마우스 (BALB/c) 의 복강 내에 하이브리도마를 약 5 × 10⁶ ∼ 2 × 10⁷ 개 투여하고, 하이브리도마를 대량으로 증식시킨다. 그리고, 1 ∼ 2 주일 후에 복수를 채취한다. 상기 항체의 채취 방법에 있어서 항체의 정제가 필요해지는 경우에는, 황안염석법, 이온 교환 크로마토그래피, 겔 여과, 어피니티 크로마토그래피 등의 공지된 방법을 적절히 선택하여, 또는 이들을 조합함으로써 정제할 수 있다.

본 발명의 항체로는, 예를 들어, 중쇄 가변 영역 (VH) 이, 서열 번호 14 로 나타내는 아미노산 서열을 포함하거나 혹은 그 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 상보성 결정 영역 (CDR)1(CDR-H1), 서열 번호 16 으로 나타내는 아미노산 서열을 포함하거나 혹은 그 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 CDR2(CDR-H2) 및/또는 서열 번호 18 로 나타내는 아미노산 서열을 포함하거나 혹은 그 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 CDR3(CDR-H3) 을 포함하고, 또한/또는 경쇄 가변 영역 (VL) 이, 서열 번호 20 으로 나타내는 아미노산 서열을 포함하거나 혹은 그 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 CDR1(CDR-L1), 글루타민산 (E)-글리신 (G)-아스파라긴 (N) 으로 이루어지는 아미노산 서열 (「아미노산 서열 EGN」 또는 「아미노산 서열 Glu-Gly-Asn」 이라고도 칭한다) 을 포함하거나 혹은 그 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 CDR2(CDR-L2) 및/또는 서열 번호 22 로 나타내는 아미노산 서열을 포함하거나 혹은 그 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 CDR3(CDR-L3) 을 포함하는 항체를 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다. 또 다른 양태에 있어서, 본 발명의 항체로는, 예를 들어, 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열이, 서열 번호 24 로 나타내는 아미노산 서열을 포함하거나 혹은 그 아미노산 서열로 이루어지고, 또한/또는 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열이, 서열 번호 26 으로 나타내는 아미노산 서열을 포함하거나 혹은 그 아미노산 서열로 이루어지는 항체를 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다.

(4) 유전자 재조합 항체의 제조

본 발명의 항체의 바람직한 양태의 하나로서, 유전자 재조합 항체를 들 수 있다. 유전자 재조합 항체로는, 한정되지는 않지만, 예를 들어, 키메라 항체, 인간형화 항체, 개형화 항체 등을 들 수 있다.

키메라 항체는, 이종 (異種) 동물의 면역 글로블린 유전자 단편을 연결하여 제조된 항체를 말한다. 본 발명에 있어서, 키메라 항체로는, 예를 들어, 인간형 키메라 항체, 개형 키메라 항체 등을 들 수 있지만, 키메라 항체의 가변 영역 및 정상 영역이 유래하는 동물의 종류는 한정되는 것은 아니다. 인간형 키메라 항체는, 예를 들어, 마우스 유래 항체의 가변 영역을 인간 유래의 정상 영역에 연결 (접합) 한 항체이며 (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81, 6851-6855, (1984) 등을 참조), 개형 키메라 항체는, 예를 들어, 마우스 유래 항체의 가변 영역을 개 유래의 정상 영역에 연결한 항체이다. 키메라를 제조하는 경우에는, 그와 같이 연결한 항체가 얻어지도록, 유전자 재조합 기술에 의해 용이하게 구축할 수 있다.

여기서, 마우스 유래 항체의 가변 영역으로는, 중쇄 가변 영역이, 예를 들어 서열 번호 24 로 나타내는 아미노산 서열을 포함하거나 혹은 그 아미노산 서열로 이루어지는 것을 들 수 있으며, 경쇄 가변 영역이, 예를 들어 서열 번호 26 으로 나타내는 아미노산 서열을 포함하거나 혹은 그 아미노산 서열로 이루어지는 것을 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다.

인간형화 항체를 제조하는 경우에는, 이른바 CDR 그래프팅 (CDR 이식) 이라고 불리는 수법을 채용할 수 있다. CDR 그래프팅이란, 마우스 항체의 가변 영역으로부터 상보성 결정 영역 (CDR) 을 인간 가변 영역에 이식하여, 프레임 워크 영역 (FR) 은 인간 유래의 것으로 CDR 은 마우스 유래의 것으로 이루어지는, 재구성한 가변 영역을 제조하는 방법이다. 다음으로, 이들의 인간형화 된 재구성 인간 가변 영역을 인간 정상 영역에 연결한다. 이와 같은 인간형화 항체의 제조법은, 당분야에 있어서 주지이다 (Nature, 321, 522-525 (1986)；J. Mol. Biol., 196, 901-917 (1987)；Queen C et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86：10029-10033 (1989)；일본 특허공보 제2828340호 등을 참조). 여기서, 본 발명의 인간형화 항체에 사용할 수 있는 마우스 유래의 CDR 의 아미노산 서열로는, 예를 들어, 중쇄 가변 영역의 CDR1 ∼ 3 (CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3) 으로서, 각각 서열 번호 14, 16 및 18 로 나타내는 아미노산 서열을 포함하거나 혹은 그 아미노산 서열로 이루어지는 것을 들 수 있으며, 경쇄 가변 영역의 CDR1 ∼ 3 (CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3) 으로서, 각각 서열 번호 20 으로 나타내는 아미노산 서열을 포함하거나 혹은 그 아미노산 서열로 이루어지는 것, 글루타민산 (E)-글리신 (G)-아스파라긴 (N) 으로 이루어지는 아미노산 서열 (아미노산 서열 Glu-Gly-Asn) 을 포함하거나 혹은 그 아미노산 서열로 이루어지는 것 및 서열 번호 22 로 나타내는 아미노산 서열을 포함하거나 혹은 그 아미노산 서열로 이루어지는 것을 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다.

개형화 항체에 대해서도, 상기의 인간형화 항체의 제조 방법과 동일한 수법에 의해 제조할 수 있다.

본 발명에 있어서, 키메라 항체 및 인간형화 항체에 사용할 수 있는 인간 중쇄 정상 영역으로는, 인간 IgG1 중쇄 정상 영역에서 유래하는 아미노산 서열을 포함하는 것, 예를 들어, 서열 번호 36 으로 나타내는 아미노산 서열을 포함하거나 혹은 그 아미노산 서열로 이루어지는 인간 중쇄 정상 영역을 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다. 또, 키메라 항체 및 인간형화 항체에 사용할 수 있는 인간 경쇄 정상 영역으로는, 인간 IgG1 경쇄 정상 영역에서 유래하는 아미노산 서열을 포함하는 것, 예를 들어, 서열 번호 38 로 나타내는 아미노산 서열을 포함하거나 혹은 그 아미노산 서열로 이루어지는 인간 경쇄 정상 영역을 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다. 또, 인간 중쇄 정상 영역을 코드하는 DNA 로는, 예를 들어, 서열 번호 35 로 나타내는 염기 서열을 포함하거나 혹은 그 염기 서열로 이루어지는 DNA 를 들 수 있으며, 인간 경쇄 정상 영역을 코드하는 DNA 로는, 예를 들어, 서열 번호 37 로 나타내는 염기 서열을 포함하거나 혹은 그 염기 서열로 이루어지는 DNA 를 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다.

또, 본 발명에 있어서, 키메라 항체 및 개형화 항체에 사용할 수 있는 개 중쇄 정상 영역으로는, 개 IgGB 중쇄 정상 영역에서 유래하는 아미노산 서열을 포함하는 것, 예를 들어, 서열 번호 40 으로 나타내는 아미노산 서열을 포함하거나 혹은 그 아미노산 서열로 이루어지는 개 중쇄 정상 영역을 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다. 또, 키메라 항체 및 개형화 항체에 사용할 수 있는 개 경쇄 정상 영역으로는, 개 Ig 경쇄 (κ 사슬) 정상 영역에서 유래하는 아미노산 서열을 포함하는 것, 예를 들어, 서열 번호 42 로 나타내는 아미노산 서열을 포함하거나 혹은 그 아미노산 서열로 이루어지는 개 경쇄 정상 영역을 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다. 또, 개 중쇄 정상 영역을 코드하는 DNA 로는, 예를 들어, 서열 번호 39 로 나타내는 염기 서열을 포함하거나 혹은 그 염기 서열로 이루어지는 DNA 를 들 수 있으며, 개 경쇄 정상 영역을 코드하는 DNA 로는, 예를 들어, 서열 번호 41 로 나타내는 염기 서열을 포함하거나 혹은 그 염기 서열로 이루어지는 DNA 를 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다.

본 발명에 있어서는, 하이브리도마 또는 당해 하이브리도마로부터 추출한 DNA 혹은 RNA 등을 원료로 하여, 상기 서술한 주지의 방법에 준하여 키메라 항체, 인간형화 항체, 개형화 항체를 제조할 수 있다.

또한, 본 발명의 항체가 융합한 단백질은, 항체의 가변 영역과 그 밖의 단백질을 공지된 유전자 재조합 방법을 이용함으로써 제조할 수 있다. 또, 당해 융합 단백질은, 모노클로날 항체와 다른 단백질을 크로스 링커를 사용하여 가교함으로써 제조할 수 있다.

(5) 항체 단편의 제조

본 발명에서 사용되는 VEGF 에 대한 항체의 단편은, VEGF 에 특이적으로 결합한다.

항체의 단편은, 본 발명의 항체의 일부분의 영역을 포함하는 폴리펩티드를 의미한다. 항체의 단편으로는, 항원 결합 단편이 바람직하다. 항원 결합 단편으로는, 예를 들어, 단쇄 항체 (scFv (single chain Fv), sc(Fv)₂), 2 본쇄 항체 (Fab, Fab', 다이아보디 (diabody (dibodies), dsFv), F(ab')₂) 등을 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다. 상기 항체 단편은, 본 발명의 항체를 목적에 따라 각종 단백질 분해 효소로 절단함으로써 얻을 수 있다.

예를 들어, Fab 는, 항체 분자를 파파인으로 처리함으로써, F(ab')₂ 는, 항체 분자를 펩신으로 처리함으로써 각각 얻을 수 있다. 또, Fab' 는, 상기 F(ab')₂ 의 힌지 영역의 디술파이드 결합을 절단함으로써 얻을 수 있다.

scFv 의 경우에는, 항체의 H 사슬 V 영역 및 L 사슬 V 영역을 코드하는 cDNA 를 취득하고, scFv 를 코드하는 DNA 를 구축한다. 이 DNA 를 발현 벡터에 삽입하고, 당해 발현 벡터를 숙주 생물에 도입하여 발현시킴으로써, scFv 를 제조할 수 있다.

diabody 의 경우에는, 항체의 H 사슬 V 영역 및 L 사슬 V 영역을 코드하는 cDNA 를 취득하고, 펩티드 링커의 아미노산 서열의 길이가 8 잔기 이하가 되도록 scFv 를 코드하는 DNA 를 구축한다. 이 DNA 를 발현 벡터에 삽입하고, 당해 발현 벡터를 숙주 생물에 도입하여 발현시킴으로써, diabody 를 제조할 수 있다.

dsFv 의 경우에는, 항체의 H 사슬 V 영역 및 L 사슬 V 영역을 코드하는 cDNA 를 취득하고, dsFv 를 코드하는 DNA 를 구축한다. 이 DNA 를 발현 벡터에 삽입하고, 당해 발현 벡터를 숙주 생물에 도입하여 발현시킴으로써, dsFv 를 제조할 수 있다.

본 발명에 있어서, 중쇄 가변 영역을 코드하는 DNA 의 염기 서열로는, 예를 들어 서열 번호 23 으로 나타내는 염기 서열을 포함하거나 혹은 또는 그 염기 서열로 이루어지는 것을 들 수 있으며, 경쇄 가변 영역을 코드하는 DNA 의 염기 서열로는, 예를 들어 서열 번호 25 로 나타내는 염기 서열을 포함하거나 혹은 또는 그 염기 서열로 이루어지는 것을 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다.

또, 본 발명의 항체 단편의 구체예로는, 예를 들어, 중쇄 가변 영역 (VH) 이, 서열 번호 14 로 나타내는 아미노산 서열을 포함하거나 혹은 그 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 CDR1(CDR-H1), 서열 번호 16 으로 나타내는 아미노산 서열을 포함하거나 혹은 그 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 CDR2(CDR-H2) 및/또는 서열 번호 18 로 나타내는 아미노산 서열을 포함하거나 혹은 그 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 CDR3(CDR-H3) 을 포함하고, 또한/또는 경쇄 가변 영역 (VL) 이, 서열 번호 20 으로 나타내는 아미노산 서열을 포함하거나 혹은 그 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 CDR1(CDR-L1), 글루타민산 (E)-글리신 (G)-아스파라긴 (N) 으로 이루어지는 아미노산 서열 (아미노산 서열 Glu-Gly-Asn) 을 포함하거나 혹은 그 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 CDR2(CDR-L2) 및/또는 서열 번호 22 로 나타내는 아미노산 서열을 포함하거나 혹은 그 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 CDR3(CDR-L3) 을 포함하는 항체 단편을 들 수 있다. 또한, VH 가 서열 번호 24 로 나타내는 아미노산 서열을 포함하거나 혹은 그 아미노산 서열로 이루어지고, 또한/또는 VL 이 서열 번호 26 으로 나타내는 아미노산 서열을 포함하거나 혹은 그 아미노산 서열로 이루어지는 항체 단편을 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다.

CDR 을 포함하는 항체 단편 (펩티드) 은, VH 또는 VL 의 CDR (CDR1 ∼ 3) 의 적어도 1 영역 이상을 포함하여 구성된다. 복수의 CDR 을 포함하는 항체 단편은, 직접 또는 적당한 펩티드 링커를 개재하여 결합시킬 수 있다. CDR 을 포함하는 항체 단편은, 항체의 VH 및 VL 의 CDR 을 코드하는 DNA 를 구축하고, 그 DNA 를 원핵 생물용 발현 벡터 또는 진핵 생물용 발현 벡터에 삽입하여, 그 발현 벡터를 원핵 생물 또는 진핵 생물에 도입함으로써 발현시켜, 제조할 수 있다. 또, CDR 을 포함하는 펩티드는, Fmoc 법 (플루오레닐메틸옥시카르보닐법) 및 tBoc 법 (t-부틸옥시카르보닐법) 등의 화학 합성법에 의해 제조할 수도 있다.

VH 의 CDR1 ∼ 3 을 코드하는 DNA 로는, 예를 들어, 각각 서열 번호 13, 15 및 17 로 나타내는 염기 서열을 포함하거나 혹은 그 염기 서열로 이루어지는 DNA 를 들 수 있으며, VL 의 CDR1 ∼ 3 을 코드하는 DNA 로는, 예를 들어, 각각 서열 번호 19 로 나타내는 염기 서열을 포함하거나 혹은 그 염기 서열로 이루어지는 DNA, 구아닌 (G)-아데닌 (A)-아데닌 (A)-구아닌 (G)-구아닌 (G)-시토신 (C)-아데닌 (A)-아데닌 (A)-티민 (T) 으로 이루어지는 염기 서열 (「염기 서열 GAAGGCAAT」 라고도 칭한다) 을 포함하거나 혹은 그 염기 서열로 이루어지는 DNA 및 서열 번호 21 로 나타내는 염기 서열을 포함하거나 혹은 그 염기 서열로 이루어지는 DNA 를 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다.

(6) 결합 친화성

결합 친화성은, 결합 정수 (定數) (KA) 및 해리 정수 (KD) 에 의해 결정할 수 있다. 친화성 평형 정수 (K) 는 KA/KD 의 비로 나타낸다. 그 결합 친화성은, 이하와 같이 하여 검출할 수 있다.

결합 정수 (KA) 및 해리 정수 (KD) 는, 표면 플라즈몬 공명 (SPR) 을 이용하여 측정할 수 있고, 결합률을 리얼타임으로 검출하고, 또한 모니터링 하는 공지된 기기 및 방법을 채용할 수 있다 (예를 들어 Biacore (등록상표)-3000 (GE Healthcare 사), ProteON XPR36 (Bio-Rad 사) 등).

본 발명은, 본 발명의 VEGF 에 대한 항체가 결합하는 부위에 결합하는 항체를 제공한다. 구체적으로는, 본 발명의 VEGF 에 대한 항체에는, (i) VEGF 와 NRP1 의 결합을 저해하는 VEGF 에 대한 항체, (ii) VEGF 와 NRP1 및 VEGFR2 의 결합을 저해하는 VEGF 에 대한 항체, 그리고 (iii) VEGF 와, NRP1, VEGFR2 및 VEGFR1 의 결합을 저해하는 VEGF 에 대한 항체, 중 어느 것의 항체가 결합하는 부위에 결합하는 항체가 포함된다.

본 발명의 항VEGF 항체가 결합하는 부위는, 항원인 VEGF 의 적어도 일부의 영역이면 되고, 한정되지 않는다. 본 발명의 항VEGF 항체가 결합하는 부위로는, 엑손 1, 2, 3, 4, 5, 6a, 6b, 7a, 7b, 8a 로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 개의 영역을 들 수 있지만, 엑손 1 ∼ 5 의 영역이 바람직하다. 당업자이면, Genbank 등의 공지된 정보에 기초하여 각종 VEGF 의 엑손 1 ∼ 5 의 영역을 특정할 수 있다. 예를 들어, 마우스, 래트, 개, 인간의 VEGF 의 엑손 1 ∼ 5 의 아미노산 서열은, 각각, 서열 번호 43, 44, 45 및 46 으로 나타낸다.

본 발명의 항VEGF 항체가 결합하는 부위 (영역, 에피토프 등) 또는 이것을 포함하는 폴리펩티드는, 당업자이면, 본 명세서의 기재 및 에피토프 매핑이나 X 선 구조 해석 등의 공지된 수법에 기초하여 특정할 수 있다.

또, 상기 (i) ∼ (iii) 중 어느 것의 항체가 결합하는 부위에 결합하는 항체는, 폴리클로날 항체여도 되고 모노클로날 항체여도 되며, 모노클로날 항체인 경우에는, 유전자 재조합 항체, 예를 들어, 키메라 항체, 인간형화 항체, 개형화 항체여도 된다.

본 발명의 VEGF 에 대한 항체가 결합하는 부위에 결합하는 항체는, VEGF 와의 결합에 대해서 본 발명의 VEGF 에 대한 항체와 경합하는 항체이다. 당업자이면, VEGF 와의 결합에 대해서 본 발명의 VEGF 에 대한 항체와 경합하는 항체는, 본 발명의 항체 (즉 상기 (i) ∼ (iii) 의 항체) 와 동등한 특이성 및/또는 활성을 갖는 것으로 이해할 수 있다.

항체를 사용한 경합 시험은, 1 세트의 항체가 동일한 (또는 중복된) 부위에 결합하는지 여부를 조사하기 위한 수법으로서 항체의 기술 분야에 있어서 확립된 수법이다 (Ju-Won Kwak et al., Journal of Immunological Methods 191 (1996) 49-54 등을 참조). 그리고, 경합 시험에 있어서, 본 발명의 VEGF 에 대한 항체가, 시험 대상의 항VEGF 항체에 의해 결합이 경합 저해되는 경우에는, 당해 시험 대상의 항VEGF 항체는, 본 발명의 VEGF 에 대한 항체가 결합하는 부위에 결합하는 항체라고 동정 (同定) 할 수 있다. 또, 이 시험 방법에 있어서는, 1 세트의 항체가 동일한 (또는 중복된) 부위에 결합하는지 여부를 조사하는 데 있어서, 그 부위가 어떠한 구조인가 하는 정보를 필요로 하지 않는다.

즉, 본 발명의 VEGF 에 대한 항체가 결합하는 부위에 결합하는 항체는, 당업자이면, 본 발명의 VEGF 에 대한 항체를 사용하여 경합 시험을 실시함으로써, 과도한 실험을 수반하는 일 없이 얻을 수 있다.

4. 의약 조성물

본 발명의 의약 조성물은, 상기 「3. VEGF 에 대한 항체」 에 기재한 항체 또는 그 단편을 유효 성분으로서 함유하고, 대상 질환에 대한 의약 조성물이다. 본 발명의 의약 조성물은, 대상 질환의 예방 또는 치료에 사용되고, 당해 예방 또는 치료에 유효하다.

본 발명의 의약 조성물의 대상이 되는 질환은, VEGF 가 관여하는 질환 (증상을 포함한다) 이면 한정되는 것은 아니고, 이와 같은 질환으로는, 고형 종양, 특히 문제가 되는 전이성 종양을 포함하는 암, VEGF 매개성 안질환을 들 수 있으며, 그 외 면역성의 질환도 대상이 된다.

종양의 혈관 구조는, 혈액을 공급하는 것이 알려져 있지만, 암 줄기세포를 지탱하는 혈관 니치 환경으로서도 기능하고, 예를 들어, NRP1 의 유전자인 Nrp1 을 결실시키면, VEGF 의 종양 형성 촉진능이 저해되는 것이 나타나 있다 (Nature, 478, p. 399-403, 2011). 혈관 니치 환경이란, 혈액이나 혈관의 근원이 되는 조혈 줄기세포의 유지나 증식, 분화에 관련된 환경을 나타내고 있으며, 암 줄기세포의 증식에 있어서도 중요한 환경인 것으로 생각되고 있다.

암 세포는, 정상 세포에 비해, 높은 증식력이나 세포 분열의 횟수에 제한이 없고, 주변 조직으로의 침윤이나 전이를 일으킨다고 하는 특징을 가지고 있다. 최근, 암조직 중의 암 세포 전부가 이와 같은 성질을 갖는 것이 아니라, 일부의 한정된 세포가 이와 같은 성질을 가지는 것으로 생각되게 되었다. 즉, 이들 일부의 암 세포는, 자신과 완전히 동일한 세포를 만들어 내는 자기 복제능과, 다종류의 세포로 분화할 수 있는 다분화능이라고 하는, 배성 줄기세포나 체성 줄기세포 등의 줄기세포에 공통되게 보이는 특징을 갖는 세포이며, 암 조직 중에서 자기 복제에 의해 자신과 동일한 세포를 유지하면서, 분화에 의해 주변의 대다수의 암 세포를 만들어내는 근원이 되어 있는 암 줄기세포인 것으로 생각되고 있다.

암 줄기세포는, 암의 재발이나 전이의 주요한 원인이라고 생각되고 있으며, 암 치료에 있어서 암 줄기세포를 표적으로 하는 것의 중요성이 지적되고 있다. 종양 조직 내에 있어서의 암 줄기세포의 증식을 우위로 저해하는 것이 가능해지면, 효과적으로 암 세포 전체를 살상할 수 있는 새로운 치료법의 개발이 가능해지는 것으로 생각된다. VEGF 와 NRP1 의 결합이, 피부의 편평 상피암에 있어서의 암 줄기세포의 줄기세포성을 제어하고 있을 가능성이 나타나 있기 때문에, VEGF 와 결합하는 항체 중에서 NRP1 의 결합을 저해하는 항체는, 베바시주맙으로 대표되는 종래의 항VEGF 항체를 견뎌내는 치료 효과를 발휘할 가능성이 있다.

본 발명에 있어서 「암 줄기세포성」 이란, 암 줄기세포의 성질을 나타내는 세포의 집단의 성질을 의미한다. 즉, 암 줄기세포성이란, 줄기세포에 특유의 자기 복제와 다분화능을 갖고, 암의 근원이 되는 세포의 성질을 갖는 성질을 의미한다.

본 발명에 있어서, 암으로는, 뇌종양, 경암, 식도암, 설암, 폐암, 유방암, 췌암, 위암, 소장의 암, 십이지장암, 대장암, 방광암, 신암, 간암, 전립선암, 자궁암, 자궁경암, 난소암, 갑상선암, 담낭암, 인두암, 육종, 멜라노마, 백혈병, 림프종, 다발성 골수종 등을 들 수 있다.

본 발명에 있어서, VEGF 매개성 안질환이란, 눈에 있어서의 병적인 혈관 신생 혹은 혈관 투과성 항진에서 기인하는 질환이며, VEGF 가 관여하는 질환이다. 즉, VEGF 매개성 안질환은, 항VEGF 항체를 사용하여 VEGF 와 VEGF 수용체의 결합을 저해함으로써, 치료 또는 예방이 가능하다. 이와 같은 질환으로는, 예를 들어, 가령 황반 변성 (폴립상 맥락막 혈관증, 망막 혈관종상 증식 등의 특수형을 포함한다), 당뇨병 망막증, 당뇨병 황반 부종, 혈관 신생 녹내장, 망막 정맥 폐색증, 미숙아 망막증, 병적 근시에 수반하는 맥락막 혈관 신생, 익상편, 루베오시스, 판누스, 점막피부안 증후군, 눈에 있어서의 이식 조직 (예를 들어 각막 조직 등) 의 면역 거절 등을 들 수 있다.

본 발명에 있어서, 「병적인 혈관 신생」 이란, 병적 상태 또는 병적 상태를 일으키는 상태에 있어서, 정상적인 생리적 혈관 신생 (혈관 형성) 과 비교하여, 새로운 혈관이 과잉되게, 불충분하게 또는 부적절하게 (예를 들어, 혈관 형성의 의학적 견지에서 보아 바람직하지 않은 위치, 시기 또는 발생에 있어서) 성장할 때에 발생하는 혈관 신생을 말한다.

본 발명에 있어서, 「치료」 란, 질환의 발증 후에 본 발명의 항체 혹은 그 단편 또는 그것을 포함하는 의약 조성물 (이하 「본 발명의 의약 조성물 등」 이라고도 칭한다) 을 피험자에게 접촉시킴 (예를 들어, 투여함) 으로써, 접촉시키지 않는 경우에 비해, 당해 질환의 증상을 경감하는 것을 의미하며, 반드시 질환의 증상을 완전히 억제하는 것을 의미하는 것은 아니다. 질환의 발증이란, 질환의 증상이 신체에 나타나는 것을 의미한다.

본 발명에 있어서, 「예방」 이란, 질환의 발증 전에 본 발명의 의약 조성물 등을 피험자에게 접촉시킴 (예를 들어, 투여함) 으로써, 접촉시키지 않는 경우에 비해, 질환의 발증 후의 증상을 경감하는 것을 의미하며, 반드시 발증을 완전히 억제하는 것을 의미하는 것은 아니다.

본 발명의 의약 조성물은, 본 발명의 VEGF 에 대한 항체 외에, 약학적으로 허용할 수 있는 담체를 포함할 수 있다. 「약학적으로 허용할 수 있는 담체」 란, 면역 질환에 대한 의약 조성물에 적합한 임의의 담체 (리포좀, 지질 소포체, 미셀 등), 희석제, 부형제, 습윤제, 완충제, 현탁제, 윤활제, 애쥬번트, 유화제, 붕괴제, 흡수제, 보존료, 계면 활성제, 착색료, 착향료 또는 감미료를 가리킨다.

본 발명의 의약 조성물 등은, 주사제, 동결 건조품, 정제, 경캡슐제, 연캡슐제, 과립제, 산제, 환제, 시럽제, 좌제, 파프제, 연고제, 크림제, 점안제 등의 제형을 취할 수 있다. 주사제 등의 액체 제제는, 사용 전에 생리 식염수 등으로 용해하는 용시 조제용 분말 (예를 들어 동결 건조 분말) 의 형태여도 된다.

본 발명의 의약 조성물 등은, 당업자에게 이미 알려진 임의의 수단에 의해 국소적 또는 전신에 투여할 수 있다. 본 발명의 의약 조성물의 투여 경로로는, 경구투여 및 비경구투여 모두 가능하고, 비경구투여의 경우에는, 조직내 투여 (피하 투여, 복강내 투여, 근육내 투여, 정맥내 투여 등), 피내 투여, 국소 투여 (경피 투여 등) 또는 경직장적으로 투여할 수 있다. 본 발명의 의약 조성물은, 이들 투여 경로에 적합한 투여 형태로 투여할 수 있다.

본 발명의 의약 조성물 등의 투여량은, 피험자의 연령, 체중, 건강 상태, 성별, 증상, 동물종, 투여 경로, 투여 횟수, 제형 등의 요인에 따라 변화하고, 구체적인 투여 순서는 당업자에 의해 설정할 수 있다. 암의 치료를 위한 본 발명의 항체의 투여량으로는, 피험자의 체중 1 ㎏ 당, 예를 들어 0.1 ㎎ ∼ 100 ㎎/일, 바람직하게는 1 ㎎ ∼ 15 ㎎/일, 보다 바람직하게는 2 - 12 ㎎/일이지만, 이것에 한정되지 않는다. 투여 횟수로는, 하루에 1 ∼ 5 회 투여할 수 있다. VEGF 매개성 안질환의 치료를 위한 본 발명의 항체의 투여량으로는, 예를 들어 0.01 ㎎ ∼ 100 ㎎/눈이며, 보다 바람직하게는 0.1 ㎎ ∼ 10 ㎎/눈이다. 투여 횟수로는, 1 일 ∼ 2 개월에 1 회 투여할 수 있지만, 이것에 한정되지 않는다.

투여 시기는, 증상에 따라 적절히 정할 수 있으며, 복수회분을 동시에 또는 시간을 두고 따로 따로 투여할 수 있다. 또, 본 발명의 의약 조성물은, 질환의 발증 전에 피험자에게 투여해도 되고, 질환의 발증 후에 투여해도 된다.

본 발명의 의약 조성물은, 포유 동물을 피험자로서 투여할 수 있다. 포유 동물로는, 예를 들어, 마우스, 래트, 햄스터, 모르모트, 토끼, 고양이, 개, 염소, 돼지, 양, 소, 말, 원숭이, 인간 등을 들 수 있다.

5. 암 또는 VEGF 매개성 안질환의 치료 또는 예방 방법

본 발명에 있어서는, VEGF 에 대한 항체 혹은 그 단편 또는 이것을 포함하는 의약 조성물을 피험자에게 투여함으로써, 암 또는 VEGF 매개성 안질환을 치료 또는 예방할 수 있다. 즉, 본 발명은, 치료상 유효량의 본 발명의 항체 혹은 그 단편 또는 그것을 포함하는 의약 조성물을 피험자에게 투여하는 공정을 포함하는, 암 또는 VEGF 매개성 안질환의 치료 또는 예방 방법을 제공한다. 본 발명의 항체 혹은 그 단편 또는 그것을 포함하는 의약 조성물의 치료상의 유효량은, 피험자의 연령, 체중, 건강 상태, 성별, 증상, 투여 경로, 투여 횟수, 제형 등의 요인에 따라 변화한다. 당업자이면, 암 또는 VEGF 매개성 안질환을 치료, 또는 예방에 필요한 치료상의 유효량을 용이하게 결정할 수 있다. 본 발명에 있어서, 「피험자」 에게는, 암 또는 VEGF 매개성 안질환의 치료 또는 예방을 필요로 하는 피험자가 포함된다. 또, 「피험자」 로서 치료 또는 예방의 대상이 되는 포유 동물은, 상기한 바와 같다.

본 발명의 암 또는 VEGF 매개성 안질환의 치료 또는 예방 방법에 있어서, 「암」, 「VEGF 매개성 안질환」, 「치료」 및 「예방」 에 대한 설명은 상기한 바와 같다. 또, 본 발명의 항체 혹은 그 단편 또는 그것을 포함하는 의약 조성물의 제형, 투여 경로, 투여량, 투여 시기 등의 설명에 대해서도 상기한 바와 같다.

6. 혈관 신생 저해제

본 발명의 항체는, VEGF 와 VEGF 수용체의 결합을 저해하기 때문에, 당해 결합에 의해 발생하는 혈관 신생을 저해할 수 있다. 즉, 본 발명은, 상기 「3. VEGF 에 대한 항체」 에 기재된 항체 또는 그 단편을 유효 성분으로서 포함하는 혈관 신생 저해제를 제공한다.

본 발명의 혈관 신생 저해제는, 시약으로서, 혹은 포유 동물의 치료에 사용할 수 있으며, 그 투여 형태, 첨가물, 투여 경로, 투여 대상, 투여량 등은, 상기 「4. 의약 조성물」 의 기재에 준하여 적절히 선택할 수 있다. 단, 본 발명의 혈관 신생 저해제는, 본 발명의 항체 또는 그 단편만을 함유하는 것이어도 된다.

7. 항체의 사용

본 발명의 항체 또는 그 단편은, 암 또는 VEGF 매개성 안질환의 치료 또는 예방 방법에 있어서, 혹은 암 또는 VEGF 매개성 안질환을 치료 또는 예방하기 위한 의약의 제조에 있어서, 사용할 수 있다. 즉, 본 발명은, 암 또는 VEGF 매개성 안질환의 치료 또는 예방 방법에 있어서 사용하기 위한, 본 발명의 항VEGF 항체 또는 그 단편을 제공한다. 또, 본 발명은, 암 또는 VEGF 매개성 안질환을 치료 또는 예방하기 위한 의약의 제조에 있어서 사용하기 위한, 본 발명의 항VEGF 항체 또는 그 단편을 제공한다. 또한, 본 발명은, 혈관 신생 저해제의 제조에 있어서 사용하기 위한, 항VEGF 항체 또는 그 단편을 제공한다.

이들 양태에 있어서의, 「암」, 「VEGF 매개성 안질환」, 「치료」 및 「예방」 에 대한 설명은 상기한 바와 같다.

8. 병용 요법

본 발명의 의약 조성물은, 다른 항암제의 적어도 1 종과 병용 투여하기 위해서 사용할 수 있다. 본 발명에 사용되는 항암제로는, 예를 들어, 소라페니브 (넥사바 (등록상표)), 수니티니브 (스텐트 (등록상표)), 베바시주맙 (아바스틴 (등록상표)), 시스플라틴 (cDDP), 카보플라틴 (파라플라틴 (등록상표)), 파클리탁셀 (택솔 (등록상표)), 도세탁셀 (탁소테르 (등록상표)), 염산겜시타빈 (젬자르 (등록상표)), 게피티니브 (이레사 (등록상표)), 엘로티니브 (타세바 (등록상표)), 염산이리노테칸 (CPT-11), 5-플루오로우라실 (5-FU) 등을 들 수 있다.

본 발명의 의약 조성물과 항암제의 적어도 1 종을 병용 투여함으로써, 각각 단독으로 사용하는 것보다 더욱 우수한 효과가 기대된다. 우수한 효과에는, 치료 효과를 유지하면서 종래보다 부작용을 경감시킨다는 효과가 포함된다.

본 발명에 있어서 「병용」 이란, 본 발명의 의약 조성물과 상기 항암제의 적어도 1 종을, 동시 또는 따로 따로 투여하는 것을 의미한다. 「동시」 란, 하나의 투여 스케줄에 있어서 동일한 타이밍으로 투여되는 것을 의미하며, 투여 시분 (時分) 이 완전히 동일할 필요는 없다. 「따로 따로」 란, 하나의 투여 스케줄에 있어서 상이한 타이밍으로 투여되는 것을 의미한다.

본 발명의 병용 요법에 사용하는 의약 조성물 등 및 항암제의 투여 형태, 투여 경로, 투여 대상은 특별히 한정되지 않고, 상기 「4. 의약 조성물」 의 기재에 준하여 적절히 선택할 수 있다. 또, 병용하는 약제의 투여 형태 또는 투여량이 서로 상이해도 되고, 그 병용하는 조합에 의해, 적절히 조정할 수 있다.

본 발명의 의약 조성물을 다른 항암제와 병용하는 경우에는, 투여량을 적절히 줄이는 것도 가능하다. 따라서, 본 발명의 의약 조성물과 다른 항암제의 조합에 있어서는,

(i) 본 발명의 의약 조성물의 유효량과, 다른 항암제의 유효량,

(ii) 본 발명의 의약 조성물의 유효량과, 다른 항암제의 비유효량,

(iii) 본 발명의 의약 조성물의 비유효량과, 다른 항암제의 유효량, 및

(iv) 본 발명의 의약 조성물의 비유효량과, 다른 항암제의 비유효량

의 조합을 채용할 수 있다.

의약 조성물 및 항암제의 일방 또는 양자가 비유효량의 사용 양태이더라도, 병용에 의해 약리 효과를 발휘할 수 있는 경우에는, 그러한 양태에 의해 병용 투여할 수 있다.

9. 시약, 키트

본 발명의 항체 또는 그 단편은, VEGF 의 검출 시약 또는 키트에 포함시킬 수 있다. 즉, 본 발명은, 본 발명의 항체 또는 그 단편을 포함하는 시약 및 키트를 제공한다. 본 발명의 시약 및 키트는, 예를 들어, VEGF 의 검출용 시약 또는 키트로서 사용할 수 있다.

본 발명의 시약 및 키트에 있어서, 본 발명의 항체 또는 그 단편은, 예를 들어 동결 등의 방법에 의해 취급하기 쉽게 한 후, 그대로 혹은 부형제, 증량제, 결합제, 활택제 등 공지된 약학적으로 허용되는 담체, 공지된 첨가제 (완충제, 등장화제, 킬레이트제, 착색제, 보존제, 향료, 풍미제, 감미제 등이 포함된다) 등과 혼합해도 된다.

본 발명의 키트에는, 본 발명의 항체 또는 그 단편 외에, 완충액, 효소액, 2 차 항체, 희석용 용액, 사용 설명서 등을 포함시킬 수도 있다.

이하, 실시예에 의해 본 발명을 상세하게 설명하는데, 본 발명은 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1

모노클로날 항체의 제조

(1) 항원의 조제

CHO 세포에서 발현시킨 인간 재조합체 VEGF₁₆₅ (이하 「VEGF」, 「rhVEGF₁₆₅」 또는 「rhVEGF」 라고도 칭한다) (PROSPEC 사) 를 항원으로서 사용하였다. VEGF 에 의한 마우스에 대한 영향을 억제하는 목적으로, KLH (Keyhole Limpet Hemocyanin) 에 결합시킨 항원을 준비하였다. 이 경우, VEGF 와 KLH 가, 몰비로 4：1 이 되도록 PBS(-) (0.01M 인산-나트륨 버퍼 (sodium-phosphate buffer), 0.138M NaCl, 0.0027M KCl, pH 7.4) 에 혼합한 후, 1 ％ 의 글루타르알데히드를 첨가하고, 1 시간, 실온에서 반응시킴으로써, KLH 와 rhVEGF₁₆₅ 를 가교하였다. 이와 같이 조제한 단백질을, 이하 「KLH-VEGF」 라고도 칭한다.

(2) 면역

rhVEGF 또는 KLH-VEGF 를 프로인트 완전 애쥬번트와 등량 혼합하고, BALB/c 마우스의 복강 내에 100 ㎕ (약 40 ㎍/마우스) 투여하였다. 약 3 주일 후, 동일하게 rhVEGF 를 프로인트 불완전 애쥬번트와 등량 혼합하고, 복강 내에 투여하였다. 이 작업을 7 회 ∼ 12 회 반복한 후, 항체가의 상승을 확인하였다. 역가 (力價) 가 상승한 마우스에 대해서는, 최종 면역으로서 rhVEGF 혹은 KLH-VEGF 를 약 40 ㎍ 정맥 내에 투여하고, 그 3 일 후에 비장을 적출하였다.

(3) 세포 융합

단리한 비세포와 마우스 골수종 세포주인 P3-x63-Ag8U.1 (DS 파머 바이오 메디컬사) 을 5：1 의 세포수로 혼합하고, 50 ％ 폴리에틸렌글리콜 3350 (Sigma 사) 을 사용하여 세포 융합을 실시하였다. 세포는 HAT 배지 (1/2 × HT (MP 사), 1/2 × HAT (MP 사), 10 ％ FBS, 50 ng/ℓ 마우스I L-6, 500 ㎎/㎖ D-글루코오스를 첨가한 RPMI1640 배지) 에 현탁하고, 96 구멍의 마이크로 컬처 플레이트에 분주하여 배양하였다.

(4) ELISA

하이브리도마가 증식해 온 웰의 배양 상청을 회수하고, rhVEGF₁₆₅ 에 반응하는 모노클로날 항체를 산생하고 있는 하이브리도마를 선택하였다. rhVEGF₁₆₅ 를 PBS(-) 로 희석하고, 96 웰의 ELISA 플레이트 (Nunc 사) 에 1 웰당 1 ㎍ 가 되도록 분주하여, 4 ℃ 에서 하룻밤 방치함으로써 플레이트 표면에 결합시켰다. 다음으로, 0.05 ％ 트윈 20 을 포함하는 PBS(-) (이하, 「PBS-T」 라고 기재한다) 350 ㎕ 로 3 회 세정한 후, 1 ％ 스킴 밀크를 포함하는 PBS-T 를 300 ㎕ 씩 각 웰에 분주하고, 1 시간, 실온에서 블로킹 하였다. PBS-T 로 세정 후, 하이브리도마의 배양 상청을 rhVEGF₁₆₅ 를 고상화한 ELISA 플레이트에 분주하고, 1 시간, 실온에서 반응시켰다. PBS-T 로 세정 후, 퍼옥시다아제 (이하, 「POD」 라고 기재한다) 표지 항마우스 면역 글로블린 항체 (BETHYL 사 제조) 를 10000 배 희석한 것을 각 웰 100 ㎕ 분주하고, 1 시간, 실온에서 반응시켰다. 동일한 세정을 실시한 후, 1 ㎎/㎖ POD 가 되도록 조제한 POD 기질을 첨가하고, 실온, 5 분간 발색시켰다. 1.5N 의 황산으로 반응을 정지시킨 후, 490 ㎚ 의 흡수를 플레이트 리더 (몰레큘러 디바이스사) 를 사용하여 측정하였다.

(5) 항VEGF 모노클로날 항체의 수립

rhVEGF₁₆₅ 를 고상화하지 않은 플레이트에 있어서의 흡광도를 기준으로 하여, 흡광도가 3 배 이상인 웰을 양성으로 하여, 한계 희석법으로 클로닝 하였다. 단일 콜로니를 포함하는 웰의 세포 상청의 항체 활성을 상기 (4) 의 방법으로 조사하고, 선택한 후에, 배양하고, rhVEGF₁₆₅ 에 반응하는 모노클로날 항체를 산생하는 하이브리도마주를 수립하였다.

실시예 2

모노클로날 항체의 평가

(1) rhVEGF₁₂₁ 과 반응하는 모노클로날 항체의 선별

인간 293 세포로 발현시킨 rhVEGF (이하 「rhVEGF₁₂₁」 이라고도 칭한다) (HUMANZYME 사) 를 사용하여, 실시예 1 의 (4) 기재의 방법으로, 얻어진 하이브리도마 세포가 산생하는 모노클로날 항체의 평가를 실시하였다. VEGF165 와 NRP1 의 결합 도메인은, 엑손 7 에 상당하는 Heparin 결합 도메인과 엑손 8a 에 상당하는 C 말단 영역인 것이 알려져 있다. VEGF121 은, NRP1 결합 도메인의 하나인, Heparin 결합 도메인이 결여되어 있다. 1 차 서열을 바탕으로 제조한 모식도를 도 1 에 나타내었다. VEGF121 은, VEGFR1, VEGFR2 결합 도메인을 가지면서, NRP1 결합 도메인의 하나인 Heparin 결합 도메인을 가지지 않기 때문에, VEGF121 에 결합하는 항체는, VEGF165 의 엑손 1, 2, 3, 4, 5 혹은 8a 에 결합한다. NRP1 결합 도메인이 아닌 영역에 결합함에도 불구하고, NRP1 과 VEGF 의 결합을 저해하는 항체를 취득할 목적으로, 얻어진 하이브리도마 세포가 산생하는 모노클로날 항체 중에서, rhVEGF121 에 강하게 반응하는 클론을 선별하였다.

(2) 모노클로날 항체의 정제

상기에서 선별 하이브리도마 세포가 산생하는 모노클로날 항체에 관해서, VEGF 와 VEGFR1, VEGFR2 및 NRP1 의 결합을 저해하는지 해석하기 위해서, 당해 하이브리도마 세포가 산생하는 모노클로날 항체의 정제를 실시하였다. 하이브리도마 세포를, 10 ㎝ 디시 (dish) 1 매에 90 ％ 콘플루언트가 되도록 배양하고, HT 배지 (Invitrogen 사 제조) 와 EX CELL Sp2/0 (니치레이 바이오사이언스사 제조) 을 1：1 로 혼합한 배지에서 추가로 10 일간 배양을 실시하였다. 배양 상청을 회수하고, 프로테인 G (Protein G) 칼럼을 사용하여 정제하였다. 배양 상청 20 ㎖ 에 대해서, 0.1 ㎖ 의 Protein G 칼럼 (GE 헬스케어사) 을 사용하였다. PBS 로 평형화한 Protein G 칼럼에 대해서, 배양액을 1 ∼ 3 ㎖/분의 유속으로 통과시킨 후, 2 ㎖ 의 세정 버퍼 (25 mM Tris-HCl (pH 7.4), 140 mM NaCl, 10 mM KCl) 로 세정하였다. 다음으로 0.5 ㎖ 의 용출 버퍼 (0.1M Glycine (pH 2.5)) 로 항체 단백질을 용출시키고, 3M Tris-HCl (pH 7.4) 을 사용하여 pH 7.0 ∼ 7.4 의 사이가 되도록 중화하였다. Amicon Ultra 30 (Millipore 사) 을 사용하여 항체를 농축함과 함께 버퍼를 PBS 로 치환하였다.

(3) 항마우스 폴리클로날 항체의 HRP 표지

상기 실시예 1 의 (2) 에서 면역한 마우스로부터 항혈청을 회수하고, 항VEGF 폴리클로날 항체를 포함하는 분획의 조제를 실시하였다. 디에틸에테르를 사용하여 면역 마우스에 마취를 실시하고, 심장으로부터 혈액을 회수하였다. 회수된 혈액을 12000 rpm, 10 분간, 4 ℃ 에서 원심 분리를 실시하고, 혈구를 포함하지 않는 상청을 항혈청으로서 회수하였다. 이 항혈청으로부터, 상기 (2) 와 동일한 방법으로 마우스 IgG 항체를 정제하고, HRP Labeling Kit (DOJINDO 사) 를 사용하여 HRP 표지를 실시하였다 (이하, HRP 표지된 폴리클로날 항체를, 「항VEGF 폴리클로날 항체-HRP 표지」 라고도 칭한다).

(4) VEGF 와 NRP1 의 결합 저해 시험

실시예 1 에서 얻어진 하이브리도마 세포가 산생하는 모노클로날 항체에 관해서, VEGF 와 NRP1 의 결합을 저해하는지 해석을 실시하였다. 재조합 인간 뉴로필린 (recombinant Human Neuropilin-1) (R & D Systems 사) (이하 「NRP1」 이라고도 칭한다) 을, PBS(-) 로 희석한 후, 96 웰의 ELISA 플레이트에 1 웰당 0.5 ㎍ 씩 첨가하고, 실온에서 2 시간 정치 (靜置) 함으로써, 플레이트 표면 상에 고상화 시켰다. 다음으로, 0.1 ％ 트윈 20 을 포함하는 TBS (50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 500 mM NaCl) (이하 「TBS-T」 라고도 칭한다) 를 사용하여 세정한 후, 2 ％ Bovine Serum Albumin (이하 「BSA」 라고도 칭한다) 함유 TBS-T 를 1 웰당 300 ㎕ 씩 첨가하고, 실온에서 1 시간 정치함으로써, 블로킹 하였다. 이것과는 별도로, 10 ㎍/㎖ 가 되도록 PBS(-) 에 희석한 재조합 인간 혈관내피성장인자 (Recombinant Human Vascular Endothelial Growth Factor, CHO) (Prospec 사) (이하 「rhVEGF」 라고도 칭한다) 및 34.1 ㎍/㎖ 가 되도록 PBS(-) 에 희석한 모노클로날 항체 (실시예 1 에서 얻어진 하이브리도마 세포가 산생하는 모노클로날 항체) 를, 각각 100 ㎕ 씩 혼합하고, 37 ℃ 에서 1 시간 반응시켰다. 이 용액을 NRP1-Fc 가 고상화 된 플레이트에 첨가하고, 실온에서 1 시간 반응시킨 후, TBS-T 로 세정하였다. 다른 모노클로날 항체 (클론 번호 KLHa1527) 를, 1 ％ BSA 함유 TBS-T 를 사용하여, 5 ㎍/㎖ 의 농도로 희석하고, 1 웰당 100 ㎕ 씩 첨가하고, 실온에서 1 시간 반응시켰다. TBS-T 로 세정 후, 1 ％ BSA 함유 TBS-T 를 사용하여 5000 배로 희석한 퍼옥시다아제 표지 항마우스 IgG 항체 (Bethyl 사) 를, 1 웰당 100 ㎕ 씩 첨가하고, 실온에서 30 분간 반응시켰다. TBS-T 로 세정 후, TMB ELISA Substrates (Invitrogen 사) 를 사용하여 시그널을 검출하였다. 마우스 IgG 아이소 타입 컨트롤 (BD 사) 을 사용한 흡광도를 100 ％ 로 하여, 모노클로날 항체의 첨가에 의한 저해 효과를 평가하였다. 또한, 상기 클론 번호 KLHa1527 은, VEGF 와 수용체의 결합을 저해하지 않는 것으로 생각되기 때문에, 수용체에 결합한 VEGF 를 정량하기 위해서 사용하였다.

그 결과, VEGF 와 NRP1 의 결합을 저해하는 복수의 항VEGF 항체를 얻을 수 있었다 (도 2). 그 중에서도 특히 클론 번호 KLHc161 의 모노클로날 항체는, VEGF 와 NRP1 의 결합을 현저하게 저해하였다.

즉, 본 실시예에 있어서, VEGF 와 NRP1 의 결합을 저해하는 항VEGF 항체를 얻을 수 있었다.

또, VEGF 와 NRP1 의 결합은 암 줄기세포의 줄기세포성을 제어하고 있는 것으로 생각되고 있고 (Nature, 478, 399-403, 2011), 또 NRP1 은 암 세포의 증식에도 관여하고 있는 것으로 생각되고 있기 때문에, VEGF 와 NRP1 의 결합을 저해하는 본 발명의 항체는 암의 치료 또는 예방에 유용하다.

(5) VEGF 와 VEGFR2 의 결합 저해 시험

실시예 1 에서 얻어진 하이브리도마 세포가 산생하는 모노클로날 항체에 관해서, VEGF 와 VEGFR2 의 결합을 저해하는지 해석을 실시하였다.

재조합 인간 VEGF R2/KDR/Flk-1 Fc 키메라 (R & D Systems 사) (이하 「VEGFR2-Fc」 라고도 칭한다) 를, PBS(-) 로 희석한 후, 96 웰의 ELISA 플레이트에, 1 웰당 0.5 ㎍ 씩 첨가하고, 실온에서 2 시간 정치함으로써, 플레이트 표면 상에 고상화 시켰다. 다음으로, 0.1 ％ 트윈 20 을 포함하는 TBS (50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 500 mM NaCl) (이하 「TBS-T」 라고도 칭한다) 를 사용하여 세정한 후, 1 ％ Bovine Serum Albumin (이하 「BSA」 라고도 칭한다) 함유 TBS-T 를 1 웰당 300 ㎕ 씩 첨가하고, 실온에서 1 시간 정치함으로써, 블로킹 하였다. 이것과는 별도로, 5 ㎍/㎖ 가 되도록 PBS(-) 에 희석한 재조합 인간 혈관내피성장인자 (Recombinant Human Vascular Endothelial Growth Factor, CHO) (Prospec 사) (이하 「rhVEGF」 라고도 칭한다), 및 80 ㎍/㎖ 가 되도록 PBS(-) 에 희석한 모노클로날 항체 (실시예 1 에서 얻어진 하이브리도마 세포가 산생하는 모노클로날 항체) 를, 각각 100 ㎕ 씩 혼합하고, 37 ℃ 에서 1 시간 반응시켰다. 이 용액을 VEGFR2-Fc 가 고상화 된 플레이트에 첨가하고, 실온에서 1 시간 반응시킨 후, TBS-T 로 세정하였다. 항VEGF 항체 (HRP) (abcam 사) 를, 1 ％ BSA 함유 TBS-T 를 사용하여 200 배로 희석하고, 1 웰당 100 ㎕ 씩 첨가하고, 실온에서 1 시간 반응시켰다. TBS-T 로 세정 후, TMB ELISA 기질 (Substrates) (Invitrogen 사) 를 사용하여 시그널을 검출하였다. 마우스 IgG 아이소 타입 컨트롤 (BD 사) 을 사용한 흡광도를 100 ％ 로 하여, 모노클로날 항체의 첨가에 의한 저해 효과를 평가하였다.

그 결과, VEGF 와 VEGFR2 의 결합을 저해하는 복수의 항VEGF 항체를 얻을 수 있었다 (도 3). 또, 이들 항VEGF 항체에는 VEGF 와 NRP1 의 결합을 저해하는 항체 (예를 들어 클론 번호 KLHc161) 도 포함되기 때문에, 이 결과는, VEGF 와 NRP1 의 결합을 저해하고, 또한 VEGF 와 VEGFR2 의 결합도 저해하는 항체가 얻어진 것을 나타낸다.

즉, 본 실시예에 있어서, VEGF 와 NRP1 및 VEGFR2 의 결합을 저해하는 항VEGF 항체를 얻을 수 있었다.

(6) VEGF 와 VEGFR1 의 결합 저해 시험

실시예 1 에서 얻어진 하이브리도마 세포가 산생하는 모노클로날 항체에 관해서, VEGF 와 VEGFR1 의 결합을 저해하는지 해석을 실시하였다. 재조합 인간 VEGF R1/Flt-1 Fc 키메라 (R & D Systems 사) (이하 「VEGFR1-Fc」 라고도 칭한다) 를, PBS(-) 로 희석한 후, 96 웰의 ELISA 플레이트에, 1 웰당 0.3 ㎍ 씩 첨가하고, 실온에서 3 시간 정치함으로써, 플레이트 표면 상에 고상화 시켰다. 다음으로, 0.1 ％ 트윈 20 을 포함하는 TBS (50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 500 mM NaCl) (이하 「TBS-T」 라고도 칭한다) 를 사용하여 세정한 후, 1 ％ 소혈청알부민 (Bovine Serum Albumin) (이하 「BSA」 라고도 칭한다) 함유 TBS-T 를 1 웰당 300 ㎕ 씩 첨가하고, 실온에서 1 시간 정치함으로써, 블로킹 하였다. 이것과는 별도로, 1 ㎍/㎖ 가 되도록 PBS(-) 에 희석한 재조합 인간 혈관내피성장인자 (Recombinant Human Vascular Endothelial Growth Factor, CHO) (Prospec 사) (이하 「rhVEGF」 라고도 칭한다) 및 5 ㎍/㎖ 가 되도록 PBS(-) 에 희석한 모노클로날 항체 (실시예 1 에서 얻어진 하이브리도마 세포가 산생하는 모노클로날 항체) 를, 각각 100 ㎕ 씩 혼합하고, 37 ℃ 에서 1 시간 반응시켰다. 이 용액을 VEGFR1-Fc 가 고상화 된 플레이트에 첨가하고, 실온에서 1 시간 반응시킨 후, TBS-T 로 세정하였다. 항VEGF 항체 (HRP) (abcam 사) 를, 1 ％ BSA 함유 TBS-T 를 사용하여 200 배로 희석하고, 1 웰당 100 ㎕ 씩 첨가하고, 실온에서 1 시간 반응시켰다. TBS-T 로 세정 후, TMB ELISA 기질 (Invitrogen 사) 를 사용하여 시그널을 검출하였다. 마우스 IgG 아이소 타입 컨트롤 (BD 사) 을 사용한 흡광도를 100 ％ 로 하여, 모노클로날 항체의 첨가에 의한 저해 효과를 평가하였다.

그 결과, VEGF 와 VEGFR1 의 결합을 저해하는 복수의 항VEGF 항체를 얻을 수 있었다 (도 4). 또, 이들 항VEGF 항체에는, VEGF 와 NRP1 및 VEGFR2 의 결합을 저해하는 항체 (예를 들어 클론 번호 KLHc161) 도 포함되기 때문에, 이 결과는, VEGF 와 NRP1 의 결합, VEGF 와 VEGFR2 의 결합 및 VEGF 와 VEGFR1 의 결합을 저해하는 항체가 얻어진 것을 나타낸다.

즉, 본 실시예에 있어서, VEGF 와 NRP1 및 VEGFR1 의 결합을 저해하는 항VEGF 항체, 그리고 VEGF 와 NRP1, VEGFR2 및 VEGFR1 의 결합을 저해하는 항VEGF 항체를 얻을 수 있었다.

실시예 3

모노클로날 항체의 세포 증식 저해 효과

취득한 항VEGF 항체로부터 클론 번호 KLHc161 의 모노클로날 항체를 선택하고, 이 항체가, 정상 인간 제대 정맥 유래 내피 세포 (이하 「HUVEC」 라고도 칭한다) 에 대한 VEGF 의 작용을 저해하는지 해석을 실시하였다. HUVEC (BD 사) 를 부속의 증식 배지를 사용하여 해동, 배양함으로서, 대수 (對數) 증식기의 HUVEC 를 준비하였다. 시험에 사용한 HUVEC 는, 계대 횟수가 8 회를 초과하지 않는 범위에서 사용하였다. 1 ％ 소혈청 (Fetal Bovine Serum) 및 1 ％ 페니실린-스트렙토마이신 (Invitrogen 사) 을 포함하는 Medium 200 (Invitrogen 사) 을 사용하여, 12 웰 플레이트에 5000 개씩 세포를 파종하고, 재조합 인간 혈관내피성장인자 (Recombinant Human Vascular Endothelial Growth Factor, CHO) (Prospec 사) (이하 「rhVEGF」 라고도 칭한다) 를, 50 ng/㎖ 의 농도로 첨가하고, 배양을 계속하였다. 평가시에는, 배양 개시와 동시에, rhVEGF 를 50 ng/㎖ 의 농도로 첨가한 세포군, 또는, 50 ng/㎖ 의 농도로 rhVEGF 를 포함함과 동시에 2500 ng/㎖ 의 농도로 그 항체를 첨가한 세포군에 있어서, rhVEGF 를 첨가 후, 2, 4, 6, 8 일째의 세포수를, 혈구 계산반을 사용하여 측정하였다.

결과를 도 5 에 나타낸다. 그 항체를 2500 ng/㎖ 의 농도로 첨가한 세포군에서는, rhVEGF 및 마우스 IgG 아이소 타입 컨트롤 (BD 사) 을 첨가한 양성 대조와 비교하여, 세포수가 적은 것으로부터, 그 항체에 의한 세포 증식 저해 (억제) 효과가 확인되었다.

또한, 상기와 동일한 방법으로 대수 증식기의 HUVEC 를 준비하고, 1 ％ Fetal Bovine Serum 및 1 ％ 페니실린-스트렙토마이신 (Invitrogen 사) 을 포함하는 Medium 200 (Invitrogen 사) 을 사용하여, 96 웰 플레이트에 10000 개씩 세포를 파종하였다. 재조합 인간 혈관내피성장인자 (Recombinant Human Vascular Endothelial Growth Factor, CHO) (Prospec 사) (이하 「rhVEGF」 라고도 칭한다) 를, 50 ng/㎖ 의 농도로 첨가하고, 배양을 계속하였다. rhVEGF 첨가 24 시간 후의 세포수를, 혈구 계산반을 사용하여 측정하였다.

결과를 도 6 에 나타낸다. 본 발명의 항체를 2500 ng/㎖ 의 농도로 첨가한 세포군에서는, rhVEGF 및 마우스 IgG 아이소 타입 컨트롤 (BD 사) 을 첨가한 양성 대조와 비교하여, 세포수가 적은 것으로부터, 그 항체에 의한 세포 증식 저해 효과가 확인되었다.

이들 결과로부터, 본 발명의 항체는, 세포 증식 저해 효과를 갖는 것이 나타났다.

실시예 4

in vivo 에 있어서의 모노클로날 항체의 종양 증식 저해 효과

인간 대장암 세포주 LS174T 세포를, 20 마리의 면역 부전 마우스에, 마우스당 2 X 10⁶ 세포의 비율로, 우측 복부에 피하 주사하였다. 주사 다음날에, 0.9 ％ NaCl (대조군 A) 또는 항VEGF 항체 (클론 번호 KLHc161；대조군 B) 중 어느 하나를 복강 내에 투여하였다. 대조군 B 의 마우스에는, 항VEGF 항체를, 0.5 ㎎/Kg, 2.5 ㎎/Kg, 혹은 5 ㎎/Kg 으로, 주 2 회 투여하였다. 또, 항체와 마찬가지로, 대조군 A 의 마우스에는, 0.9 ％ NaCl 을 주에 2 회 투여하였다. 세포 접종 후, 1, 5, 9, 16 및 20 일째에, 종양을 측정하고, 종양 양 (Tumor Volume) 을, 식：V (㎣) = d²X D/2 를 사용하여 산출하였다.

결과를 도 7 에 나타낸다. 도 7 에 있어서는, A 군 (0.9 ％ NaCl 대조) 을 (◇) 로 나타내고, B 군 (항VEGF 항체를 접종한 마우스) 을, (□：0.5 ㎎/Kg), (△：2.5 ㎎/Kg), (○：5.0 ㎎/Kg) 중 어느 것으로 나타내었다. 도 7 에 나타내는 바와 같이, 종양 양의 감소가, 항VEGF 항체를 접종한 마우스에서 관찰되었다.

이들 결과로부터, 본 발명의 항VEGF 항체는, in vivo 에 있어서도 종양의 증식을 저해 (억제) 하는 것이 나타났다. 또, 이로부터, 본 발명의 항체를 포함하는 의약 조성물은 암의 치료 또는 예방에 매우 유효한 것이 나타났다.

실시예 5

마우스·레이저 유발 맥락막 혈관 신생 모델에 대한 효과의 검토

본 실시예에서는, 본 발명의 항체의 VEGF 매개성 안질환에 대한 효과를 in vivo 에서 검토하기 때문에, 삼출형 가령 황반 변성 (wAMD) 모델인 마우스·레이저 유발 맥락막 혈관 신생 (CNV) 모델을 이용하여 시험을 실시하였다. 마우스·레이저 유발 맥락막 혈관 신생 (CNV) 모델은, 맥락막에 레이저광 응고를 실시함으로써 염증을 야기하고, 맥락막으로부터 혈관 신생을 유도함으로써 제조할 수 있다.

1. 재료 및 방법

(1) 항체

본 실시예에서는, 실시예 1 에 있어서 제조된 항VEGF 항체를 사용하였다. 구체적으로는, VEGF 와 NRP1 및 VEGFR2 의 결합을 저해하는 항체로서 KLHc161 을 사용하였다.

(2) 삼출형 가령 황반 변성 (wAMD) 모델의 제조

삼출형 가령 황반 변성 (wAMD) 모델인 마우스·레이저 유발 맥락막 혈관 신생 (CNV) 모델은, 8 주령 수컷 C57BL/6J 마우스의 안저 후극부에 있어서, 산재성으로 굵은 망막 혈관을 피하여, 4 스폿 (스폿 사이즈 50 ㎛, 출력 60 mW, 응고 시간 0.1 초) 의 광 응고를 실시함으로써 제조하였다.

(3) 군 구성

군 구성을 하기의 표에 나타낸다. 하기 표에 있어서 PBS 는 음성 대조이다.

(4) 약물 투여 (유리체 내 투여)

유리체 내 투여에 있어서의 항체를 포함하는 조성물의 투여량은 5 ㎕/눈 (eye) 이며, 투여 횟수는 1 회이다.

(5) 시험 스케줄

시험 스케줄을 도 8 에 나타낸다.

(6) 평가 방법

광 응고 14 일 후에 양안 (兩眼) 의 형광 안저 조영을 실시하고, 광 응고 부위의 형광 색소 누출 면적을 측정함으로써, 맥락막 신생 혈관 (CNV) 면적을 구하였다.

2. 결과

상기 CNV 모델에 KLHc161 을 투여한 결과, 0.3 ㎍/눈 투여군에 있어서, CNV 면적이 유의하게 억제되었다 (도 9). 도 9 에 있어서, #：PBS 투여군에 대해서 p < 0.05 (두네티의 다중비교 검증 (Dunnett's multiple comparison test)).

이 결과로부터, 본 발명의 항체는, in vivo 에 있어서도, 혈관 신생 저해제로서 유효하고, 또, 가령 황반 변성 등의 VEGF 매개성 안질환에도 유효한 것이 나타났다.

실시예 6

모노클로날 항체의 가변 영역에 관한 검토

본 발명의 항체의 가변 영역의 아미노산 서열 및 이것을 코드하는 뉴클레오티드 서열에 대해서 해석을 실시하였다.

구체적으로는, 항VEGF 항체 (클론 번호 KLHc161) 를 산생하는 하이브리도마의 중쇄의 가변 영역의 게놈 서열을, 이하의 프라이머를 각각 사용하여 서열 결정에 의해 해석하였다.

5'-CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3' (센스 프라이머) (서열 번호 27)

5'-CCAGGGGCCAGTGGATAGACCGATGGGGCTGTTG-3' (안티센스 프라이머) (서열 번호 28)

및

5'-CTAATACGACTCACTATAGGGC-3' (센스 프라이머) (서열 번호 29)

5'-CCAGGGGCCAGTGGATAGACCGATGGGGCTGTTG-3' (안티센스 프라이머) (서열 번호 30)

또, 그 항체를 산생하는 하이브리도마의 경쇄의 가변 영역의 게놈 서열을, 이하의 프라이머를 각각 사용하여 서열 결정에 의해 해석하였다.

5'-CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3' (센스 프라이머) (서열 번호 31)

5'-GCACCTCCAGATGTTAACTGCTCACT-3' (안티센스 프라이머) (서열 번호 32)

및

5'-CTAATACGACTCACTATAGGGC-3' (센스 프라이머) (서열 번호 33)

5'-GCACCTCCAGATGTTAACTGCTCACT-3' (안티센스 프라이머) (서열 번호 34)

또한, 그 항체의 가변 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3 의 아미노산 서열을, IMGT/V-QUEST 소프트웨어, 버젼 3.3.0 을 사용하여, 「the international ImMunoGeneTics information system (등록상표)」 (IMGT/GENE-DB) 의 면역 글로블린 데이터베이스 상에서 결정하였다.

그 결과를 하기의 표에 나타낸다.

실시예 7

인간-IgG1 키메라 KLHc161 항체 (KLHc161HC) 의 제조

KLHc161 항체를 산생하는 하이브리도마로부터, KLHc161 항체의 중쇄 가변 영역 유전자 (염기 서열：서열 번호 23, 아미노산 서열：서열 번호 24) 및 경쇄 가변 영역 유전자 (염기 서열：서열 번호 25, 아미노산 서열：서열 번호 26) 를 클로닝 하였다. 다음으로, 이들 유전자를 각각 인간 IgG1 의 중쇄 정상 영역 유전자, 혹은 경쇄 (κ 사슬) 정상 영역 유전자의 염기 서열에 인프레임으로 연결하였다. 중쇄 가변 영역의 5' 말단 염기 서열과 제한 효소 MluI 서열을 갖는 프라이머 및 3' 말단 염기 서열의 상보 서열과 제한 효소 NheI 서열을 갖는 안티센스 프라이머를 사용하여 PCR 을 실시하였다. 다음으로, 경쇄 가변 영역 유전자의 5' 말단 염기 서열과 코작 서열과 제한 효소 BamHI 서열을 갖는 프라이머 및 3' 말단 염기 서열의 상보 서열과 제한 효소 BsiWI 서열을 갖는 안티센스 프라이머를 사용하여 PCR 을 실시하였다. 얻어진 증폭 산물을 제한 효소 MluI 및 NheI 또는 BamHI 및 BsiWI 로 처리하고, 인간 IgG1 중쇄 정상 영역 발현 플라스미드 (pEF6/G1) 의 MluI-NheI 사이트, 혹은 인간 IgG1 경쇄 정상 영역 발현 플라스미드 (pEF1/G1k) 의 BamHI-BsiWI 사이트에 짜넣었다. pEF6/G1 은, 플라스미드 pEF6/myc-His (인비트로젠사) 에 인간 IgG1 의 중쇄 정상 영역 유전자 (염기 서열：서열 번호 35, 아미노산 서열：서열 번호 36) 가, 또 pEF1/G1-k 에는, 플라스미드 pEF1/myc-His (인비트로젠사) 에 인간 IgG1 의 경쇄 정상 영역 유전자 (염기 서열：서열 번호 37, 아미노산 서열：서열 번호 38) 가 클로닝 되어 있다. 제한 효소 NheI 에 의해 마우스 중쇄 가변 영역과 인간 중쇄 정상 영역이 연결되고, 제한 효소 BsiWI 서열에 의해 마우스 경쇄 가변 영역과 인간 경쇄 정상 영역이 연결되었다.

FreeStyle^TM 293 Expression System (써모피셔 사이언티픽사) 을 이용하여, 플라스미드 pEF6/G1-KLHc161 및 pEF1/G1-K-KLHc161 을 293F 세포에 도입하고, 일과성으로 인간 IgG1 키메라 KLHc161 항체 (이하 「KLHc161HC 항체」 라고도 칭한다) 를 발현시켰다. 다음으로, 이 키메라 유전자를 도입한 293F 세포의 배양 상청으로부터 Protein G Sepharose 4 Fast Flow (GE 헬스케어·재팬사) 를 사용하여 KLHc161HC 항체를 정제하였다. 아미콘 울트라-15 원심식 필터 유닛 (머크 밀리포아사) 을 사용하여 용매를 D-PBS(-) 로 치환하였다. 정제한 KLHc161HC 항체의 농도는 Nano drop 1000 (써모피셔 사이언티픽사) 을 사용하여 정량하였다. KLHc161HC 항체의 VEGF 에 대한 결합을, 상기 「모노클로날 항체의 정제 (4) ELISA」 기재의 방법에 의해 평가한 결과, KLHc161HC 항체가 VEGF 에 특이적으로 결합하는 것이 확인되었다.

즉, 본 실시예에 있어서, 본 발명의 항VEGF 항체의 키메라 항체를 얻을 수 있었다.

실시예 8

in vivo 에 있어서의 인간 IgG1 키메라 KLHc161 항체 (KLHc161HC 항체) 의 종양 증식 저해 효과

인간 대장암 세포주 LS174T 세포를, 20 마리의 면역 부전 마우스에, 마우스당 2 x 10⁶ 세포의 비율로, 우측 복부에 피하 주사하였다. 주사 다음날에, 0.9 ％ NaCl (대조군 A) 또는 KLHc161HC 항체 (대조군 B) 중 어느 하나를 복강 내에 투여하였다. 대조군 B 의 마우스에는, KLHc161HC 항체를, 0.5 ㎎/Kg, 2.5 ㎎/Kg, 혹은 5 ㎎/Kg 으로, 주 2 회 투여하였다. 또, 항체와 마찬가지로, 대조군 A 의 마우스에는, 0.9 ％ NaCl 을 주에 2 회 투여하였다. 세포 접종 후, 1, 5, 8, 12, 15, 19 및 22 일째에, 종양 지름을 측정하고, 종양 양 (Tumor Volume) 을, 식：V (㎣) = (d：단경)² x (D：장경)/2 를 이용하여 산출하였다. 결과를 도 10 에 나타낸다. 도 10 에 있어서는, A 군 (0.9 ％ NaCl 대조) 을 (◇) 로 나타내고, B 군 (KLHc161HC 항체를 접종한 마우스) 을, (□：0.5 ㎎/Kg), (△：2.5 ㎎/Kg), (○：5.0 ㎎/Kg) 중 어느 것으로 나타내었다. 도 10 에 나타내는 바와 같이, 종양 양의 현저한 감소가, KLHc161HC 항체를 접종한 마우스에서 관찰되었다.

이들 결과로부터, 본 발명의 키메라 항체인 KLHc161HC 항체는, in vivo 에 있어서도 종양의 증식을 저해 (억제) 하는 것이 나타났다.

이로부터, 본 발명의 인간 IgG1 키메라 항VEGF 항체를 포함하는 의약 조성물은 암의 치료 또는 예방에 매우 유효한 것이 나타났다.

실시예 9

개-IgGB 키메라 KLHc161 항체 (KLHc161CC 항체) 의 제조

KLHc161 항체를 산생하는 하이브리도마로부터, KLHc161 항체의 중쇄 가변 영역 유전자 (염기 서열：서열 번호 23, 아미노산 서열：서열 번호 24) 및 경쇄 가변 영역 유전자 (염기 서열：서열 번호 25, 아미노산 서열：서열 번호 26) 를 클로닝 하였다. 다음으로, 이들 유전자를 각각 개 IgGB 의 중쇄 정상 영역 유전자, 혹은 경쇄 (κ 사슬) 정상 영역 유전자의 염기 서열에 인프레임으로 연결하였다. 중쇄 가변 영역의 5' 말단 염기 서열과 코작 서열과 제한 효소 EcoRV 서열을 갖는 프라이머, 및 3' 말단 염기 서열의 상보 서열과 제한 효소 NheI 서열을 갖는 안티센스 프라이머를 사용하여 PCR 을 실시하였다. 다음으로, 경쇄 가변 영역 유전자의 5' 말단 염기 서열과 제한 효소 EcoRI 서열을 갖는 프라이머, 및 3' 말단 염기 서열의 상보 서열과 제한 효소 XhoI 서열을 갖는 안티센스 프라이머를 사용하여 PCR 을 실시하였다. 얻어진 증폭 산물을 제한 효소 EcoV 및 NheI, 또는 EcoRI 및 XhoI 로 처리하고, 개 IgGB 중쇄 정상 영역 발현 플라스미드 (pFUSE2ss-CHIg-dGB) 의 EcoRV-NheI 사이트, 혹은 개 Ig 경쇄 정상 영역 발현 플라스미드 (pFUSE2ss-CHIg-dK) 의 EcoRI-XhoI 사이트에 짜넣었다. pFUSE2ss-CHIg-dGB 는, 플라스미드 pFUSE2ss-CLIg-hl2 (인비보젠사) 에 개 IgGB 의 중쇄 정상 영역 유전자 (염기 서열：서열 번호 39, 아미노산 서열：서열 번호 40) 가, 또 pFUSE2ss-CHIg-dK 에는, 플라스미드 pFUSE2ss-CLIg-hl2 에 개 Ig 의 경쇄 (κ 사슬) 정상 영역 유전자 (염기 서열：서열 번호 41, 아미노산 서열：서열 번호 42) 가 클로닝 되어 있다. 제한 효소 NheI 에 의해 마우스 중쇄 가변 영역과 개 중쇄 정상 영역이 연결되고, 제한 효소 XhoI 서열에 의해 마우스 경쇄 가변 영역과 개 경쇄 정상 영역이 연결되었다.

실시예 10

개-IgGB 키메라 KLHc161 항체 (KLHc161CC 항체) 와 인간 VEGF165 및 개 VEGFA 에 대한 교차성

제조한 개-IgGB 키메라 항체가, 인간 VEGF165 및 개 VEGFA (VEGF164) 에 대한 결합능을 가지고 있는지, ELISA 로 확인하였다. 인간 VEGF165 혹은 개 VEGFA 를 TBS 로 희석하고, 96 웰의 ELISA 플레이트 (Nunc 사) 에 1 웰당 20 ng 이 되도록 분주하여, 37 ℃ 에서 1 시간 인큐베이트함으로써 플레이트 표면에 결합시켰다. 다음으로, 0.02 ％ 트윈 20 을 포함하는 PBS(-) (이하, 「PBS-T」 라고 기재한다) 300 ㎕ 로 3 회 세정한 후, 3 ％ 스킴 밀크를 포함하는 PBS(-) 를 300 ㎕ 씩 각 웰에 분주하고, 37 ℃ 에서 1 시간, 블로킹 하였다. PBS-T 로 세정 후, 1 ㎍/㎖ 의 농도로부터 단계 희석한 개-IgGB 키메라 KLHc161 항체 (KLHc161CC 항체) 를 VEGF 가 고상화 된 ELISA 플레이트에 분주하고, 37 ℃ 에서 1 시간 반응시켰다. PBS-T 로 세정 후, 100 ng/㎖ 로 조제한 퍼옥시다아제 표지 항개 면역 글로블린 항체 (BETHYL 사 제조) 를 각 웰 100 ㎕ 분주하고, 37 ℃ 에서 1 시간 반응시켰다. 동일한 세정을 실시한 후, TMB 단일 용액 (TMB Single Solution) 을 첨가하고, 실온에서 발색시켰다. 1N 의 황산으로 반응을 정지시킨 후, 450 ㎚ 의 흡수를 플레이트 리더 (몰레큘러 디바이스사) 를 사용하여 측정하였다. 결과를 도 11 에 나타낸다. KLHc161CC 항체는, 개 VEGFA 에 대해서 인간 VEGF165 와 동일한 정도의 친화성으로 결합하는 것이 나타났다.

이로부터, 본 발명의 개 IgGB 키메라 항VEGF 항체를 포함하는 의약 조성물은, 개에 있어서의 질환의 치료 또는 예방에 사용할 수 있는 것이 나타났다.

실시예 11

in vivo 에 있어서의 개 IgGB 키메라 KLHc161 항체 (KLHc161CC 항체) 의 인간 암 세포주에 대한 종양 증식 저해 효과

인간 대장암 세포주 LS174T 세포를, 20 마리의 면역 부전 마우스에, 마우스당 2 x 10⁶ 세포의 비율로, 우측 복부에 피하 주사하였다. 주사 다음날에, 0.9 ％ NaCl (대조군 A) 또는 KLHc161CC 항체 (대조군 B) 중 어느 하나를 복강 내에 투여하였다. 대조군 B 의 마우스에는, KLHc161CC 항체를, 0.5 ㎎/Kg, 2.5 ㎎/Kg, 혹은 5 ㎎/Kg 으로, 주 2 회 투여하였다. 또, 항체와 마찬가지로, 대조군 A 의 마우스에는, 0.9 ％ NaCl 을 주에 2 회 투여하였다. 세포 접종 후, 5, 8, 12, 15, 19 및 22 일째에, 종양 지름을 측정하고, 종양 양 (Tumor Volume) 을, 식：V (㎣) = (d：단경)² x (D：장경)/2 를 이용하여 산출하였다. 결과를 도 12 에 나타낸다. 도 12 에 있어서는, A 군 (0.9 ％ NaCl 대조) 을 (■) 로 나타내고, B 군 (항VEGF 항체를 접종한 마우스) 을, (●：0.5 ㎎/Kg), (▲：2.5 ㎎/Kg), (△：5.0 ㎎/Kg) 중 어느 것으로 나타내었다. 도 12 에 나타내는 바와 같이, 종양 양의 현저한 감소가, KLHc161CC 항체를 접종한 마우스에서 관찰되었다.

이들 결과로부터, 본 발명의 KLHc161CC 항체는, in vivo 에 있어서도 인간의 종양의 증식을 저해 (억제) 하는 것이 나타났다. 또, 이로부터, 본 발명의 개 IgGB 키메라 항VEGF 항체를 포함하는 의약 조성물은, 암의 치료 또는 예방에 매우 유효한 것이 나타났다.

실시예 12

in vivo 에 있어서의 개 IgGB 키메라 KLHc161 항체 (KLHc161CC 항체) 의 개 암 세포주에 대한 종양 증식 저해 효과

개 골육종 세포주 D-17 세포를, 20 마리의 면역 부전 마우스에, 마우스당 1 x 10⁷ 세포의 비율로, 우측 복부에 피하 주사하였다. 평균 종양 양이 150 ㎣ 에 이르고 나서, 0.9 ％ NaCl (대조군 A) 또는 KLHc161CC 항체 (대조군 B) 중 어느 하나를 복강 내에 투여하였다. 대조군 B 의 마우스에는, KLHc161CC 항체를, 0.5 ㎎/Kg, 2.5 ㎎/Kg, 혹은 5 ㎎/Kg 으로, 주 2 회 투여하였다. 또, 항체와 마찬가지로, 대조군 A 의 마우스에는, 0.9 ％ NaCl 을 주에 2 회 투여하였다. 세포 접종 후, 50, 54, 57, 61, 64, 67, 70, 74, 77 및 81 일째에, 종양 지름을 측정하고, 종양 양 (Tumor Volume) 을, 식：V (㎣) = (d：단경)² x (D：장경)/2 를 이용하여 산출하였다. 결과를 도 13 에 나타낸다. 도 13 에 있어서는, A 군 (0.9 ％ NaCl 대조) 을 (■) 로 나타내고, B 군 (항VEGF 항체를 접종한 마우스) 을, (●：0.5 ㎎/Kg), (▲：2.5 ㎎/Kg), (△：5.0 ㎎/Kg) 중 어느 것으로 나타내었다. 도 13 에 나타내는 바와 같이, 종양 양의 현저한 감소가, KLHc161CC 항체를 접종한 마우스에서 관찰되었다. 이들 결과로부터, 본 발명의 KLHc161CC 항체는, in vivo 에 있어서도 개의 종양의 증식을 저해 (억제) 하는 것이 나타났다. 또, 이로부터, 본 발명의 개 IgGB 키메라 항VEGF 항체를 포함하는 의약 조성물은, 개의 암의 치료 또는 예방에 매우 유효한 것이 나타났다.

실시예 13

본 발명의 항체의 항원 결합 부위에 관한 검토

VEGF 에 있어서의 본 발명의 항체와의 결합 부위를 조사하기 위해서, 하기하는 바와 같이, ELISA 법에 기초하는 결합 실험을 실시하였다.

본 실시예에 있어서, 항VEGF 항체로는, 실시예 7 에서 얻어진 인간-IgG1 키메라 항체 중, VEGF 와 NRP1 의 결합을 저해하는 항VEGF 항체인 KLHc161HC 를 포함하는 3 개의 항VEGF 항체를 선택하여 사용하였다.

또, VEGF 로는, (i) NRP1 과의 2 개의 결합 영역 중 하나 (VEGF 의 C 말단 영역인 엑손 8a) 를 포함하는 VEGF165, (ii) NRP1 과의 2 개의 결합 영역 중 하나 (헤파린 결합 영역) 가 결여된 VEGF121, (iii) VEGF165 에 있어서의 NRP1 과의 결합 영역과는 상이한 아미노산 서열 (엑손 8b) 을 갖는 VEGF165b, 의 3 타입의 VEGF 를 사용하였다.

결합 실험은, 구체적으로는 하기와 같이 실시하였다.

인간 VEGF165 (엑손 1, 2, 3, 4, 5, 7 과 8a 로 이루어진다) 인간 VEGF165b (엑손 1, 2, 3, 4, 5, 7 과 8b 로 이루어진다) 혹은 인간 VEGF121 (엑손 1, 2, 3, 4, 5 로 8a 로 이루어진다) 을 TBS 로 희석하고, 96 웰의 ELISA 플레이트 (Nunc 사) 에 1 웰당 20 ng 이 되도록 분주하여, 37 ℃ 에서 1 시간 인큐베이트함으로써 플레이트 표면에 결합시켰다. 다음으로, 0.02 ％ 트윈 20 을 포함하는 PBS(-) (이하, 「PBS-T」 라고 기재한다) 300 ㎕ 로 3 회 세정한 후, 3 ％ 스킴 밀크를 포함하는 PBS(-) 를 300 ㎕ 씩 각 웰에 분주하고, 37 ℃ 에서 1 시간, 블로킹 하였다. PBS-T 로 세정 후, 1 ug/㎖ 의 농도로부터 단계 희석한 KLHc161HC 항체를 VEGF 가 고상화 된 ELISA 플레이트에 분주하고, 37 ℃ 에서 1 시간 반응시켰다. PBS-T 로 세정 후, 100 ng/㎖ 로 조제한 퍼옥시다아제 표지 항인간 면역 글로블린 항체 (BETHYL 사 제조) 를 각 웰 100 ㎕ 분주하고, 37 ℃ 에서 1 시간 반응시켰다. 동일한 세정을 실시한 후, TMB Single Solution 을 첨가하고, 실온에서 발색시켰다. 1N 의 황산으로 반응을 정지시킨 후, 450 ㎚ 의 흡수를 플레이트 리더 (몰레큘러 디바이스사) 를 사용하여 측정하였다.

그 결과, 본 발명의 VEGF 와 NRP1 의 결합을 저해하는 항VEGF 항체인 KLHc161HC 를 포함하는 3 개의 항VEGF 항체 모두가, 상기 VEGF165, VEGF121 및 VEGF165b 전부에 결합하였다 (도 14).

이 결과는, 본 발명의 항체가, NRP1 과의 결합 영역으로서 알려져 있는 VEGF 의 C 말단측의 2 개의 영역과는 완전히 상이한, VEGF 의 N 말단측인 엑손 1 ∼ 5 의 영역에 결합하는 것을 나타낸다.

또, 이 결과는, 놀랍게도, 본 발명의 항체가, VEGF 의 NRP1 의 결합 영역으로서 알려져 있지 않은 엑손 1 ∼ 5 의 영역에 결합함에도 불구하고, VEGF 와 NRP1 의 결합을 저해하는 것을 나타낸다.

산업상 이용가능성

본 발명에 의해, VEGF 와 NRP1 의 결합을 저해하는 항VEGF 항체가 제공된다. 본 발명의 항체는, VEGF 에 의한 비정상인 혈관 신생, 혈관 투과성 항진이나 세포 증식을 억제함으로써, 암, VEGF 매개성 안질환, 그 외 비정상인 혈관 신생 혹은 혈관 투과성 항진이 관여하는 질환 등의 치료 또는 예방에 이용할 수 있다.

서열표 프리 텍스트

서열 번호 13：합성 DNA

서열 번호 14：합성 펩티드

서열 번호 15：합성 DNA

서열 번호 16：합성 펩티드

서열 번호 17：합성 DNA

서열 번호 18：합성 펩티드

서열 번호 19：합성 DNA

서열 번호 20：합성 펩티드

서열 번호 21：합성 DNA

서열 번호 22：합성 펩티드

서열 번호 23：합성 DNA

서열 번호 24：합성 펩티드

서열 번호 25：합성 DNA

서열 번호 26：합성 펩티드

서열 번호 27 ∼ 34：합성 DNA

서열 번호 35：합성 DNA

서열 번호 36：합성 펩티드

서열 번호 37：합성 DNA

서열 번호 38：합성 펩티드

서열 번호 39：합성 DNA

서열 번호 40：합성 펩티드

서열 번호 41：합성 DNA

서열 번호 42：합성 펩티드

서열 번호 43 ∼ 46：합성 펩티드

SEQUENCE LISTING <110> Order-made Medical Research Inc. Santen Pharmaceutical Co., Ltd <120> Antibody inhibiting the binding between VEGF and NRP1 <130> G1262WO <150> JP2016-001275 <151> 2016-01-06 <160> 46 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 3487 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 1 cggcggcagc ggagctctgt cgcgagacgc agcgacaagg cagactattc agcggactca 60 ccagcccggg agtctgtgct ctgggatttg atattcaaac ctcttaattt ttttttctta 120 aactgtattg ttttacgctt taatttattt ttgcttccta ttcccctctt aaatcgtgcc 180 aacggtttga ggaggttggt tcttcactcc ctcaaatcac ttcggattgt ggaaatcagc 240 agacgaaaga ggtatcaaga gctccagaga gaagtcaagg aagagagaga gagaccggtc 300 agagagagcg cgctggcgag cgaacagaga gagggacagg ggcaaagtga ctgacctgct 360 tttgggggtg accgccagag cgcggcgtga gccctccccc ttgggatctt gcatcggacc 420 agtcgcgctg acggacagac agacagacac cgcccccagc cccagcgccc acctcctcgc 480 cggcgggctg ccgacggtgg acgcggcggc gagccgcgag gaaccgaagc ccgcgcccgg 540 aggcggggtg gagggggtcg gggctcgcgg gattgcacgg aaacttttcg tccaacttct 600 gggctcttct cgctccgtag tagccgtggt ctgcgccgca ggagacaaac cgatcggagc 660 tgggagaagt gctagctcgg gcctggagaa gccggggccc gagaagagag gggaggaaga 720 gaaggaagag gagagggggc cgcagtgggc gctcggctct caggagccga gctcatggac 780 gggtgaggcg gccgtgtgcg cagacagtgc tccagccgcg cgcgcgcccc aggccccggc 840 ccgggcctcg gttccagaag ggagaggagc ccgccaaggc gcgcaagaga gcgggctgcc 900 tcgcagtccg agccggagag ggagcgcgag ccgcgccggc cccggacggg cctccgaaac 960 catgaacttt ctgctctctt gggtgcactg gaccctggct ttactgctgt acctccacca 1020 tgccaagtgg tcccaggctg cacccacgac agaaggagag cagaagtccc atgaagtgat 1080 caagttcatg gatgtctacc agcgaagcta ctgccgtccg attgagaccc tggtggacat 1140 cttccaggag taccccgacg agatagagta catcttcaag ccgtcctgtg tgccgctgat 1200 gcgctgtgca ggctgctgta acgatgaagc cctggagtgc gtgcccacgt cagagagcaa 1260 catcaccatg cagatcatgc ggatcaaacc tcaccaaagc cagcacatag gagagatgag 1320 cttcctacag cacagcagat gtgaatgcag accaaagaaa gacagaacaa agccagaaaa 1380 aaaatcagtt cgaggaaagg gaaagggtca aaaacgaaag cgcaagaaat cccggtttaa 1440 atcctggagc gttcactgtg agccttgttc agagcggaga aagcatttgt ttgtccaaga 1500 tccgcagacg tgtaaatgtt cctgcaaaaa cacagactcg cgttgcaagg cgaggcagct 1560 tgagttaaac gaacgtactt gcagatgtga caagccaagg cggtgagcca ggctgcagga 1620 aggagcctcc ctcagggttt cgggaaccag acctctcacc ggaaagaccg attaaccatg 1680 tcaccaccac gccatcatcg tcaccgttga cagaacagtc cttaatccag aaagcctgac 1740 atgaaggaag aggagactct tcgaggagca ctttgggtcc ggagggcgag actccggcag 1800 acgcattccc gggcaggtga ccaagcacgg tccctcgtgg gactggattc gccattttct 1860 tatatctgct gctaaatcgc caagcccgga agattagggt tgtttctggg attcctgtag 1920 acacacccac ccacatacac acatatatat atattatata tataaataaa tatatatgtt 1980 ttatatataa aatatatata tattcttttt tttaaattaa ctctgctaat gttattggtg 2040 tcttcactgg atatgtttga ctgctgtgga cttgtgttgg gaggaggatg tcctcactcg 2100 gatgccgaca cgggagacaa tgggatgaaa ggcttcagtg tggtctgaga gaggccgaag 2160 tccttttgcc tgccggggag caagcaaggc cagggcacgg gggcacattg gctcacttcc 2220 agaaacacga caaacccatt cctggccctg agtcaagagg acagagagac agatgatgac 2280 agagaaagag ataaagatgc cggttccaac cagaagtttg gggagcctca ggacatggca 2340 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ttgctattct gttttttata tgtaaaaaca aaacaagaaa aatagagaat tctacatact 3240 aaatctctct ccttttttaa ttttaatatt tgttatcatt tatttattgg tgctactgtt 3300 tatccgtaat aattgtgggg gaaaaagata ttaacatcac gtctttgtct ctagagcagt 3360 tttccgagat attccgtagt acatatttat ttttaaacag caacaaagaa atacagatat 3420 atcttaaaaa aaaaagcatt ttgtattaaa gaattgaatt ctgatctcaa aaaaaaaaaa 3480 aaaaaaa 3487 <210> 2 <211> 392 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 2 Met Thr Asp Arg Gln Thr Asp Thr Ala Pro Ser Pro Ser Ala His Leu 1 5 10 15 Leu Ala Gly Gly Leu Pro Thr Val Asp Ala Ala Ala Ser Arg Glu Glu 20 25 30 Pro Lys Pro Ala Pro Gly Gly Gly Val Glu Gly Val Gly Ala Arg Gly 35 40 45 Ile Ala Arg Lys Leu Phe Val Gln Leu Leu Gly Ser Ser Arg Ser Val 50 55 60 Val Ala Val Val Cys Ala Ala Gly Asp Lys Pro Ile Gly Ala Gly Arg 65 70 75 80 Ser Ala Ser Ser Gly Leu Glu Lys Pro Gly Pro Glu Lys Arg Gly Glu 85 90 95 Glu Glu Lys Glu Glu Glu Arg Gly Pro Gln Trp Ala Leu Gly Ser Gln 100 105 110 Glu Pro Ser Ser Trp Thr Gly Glu Ala Ala Val Cys Ala Asp Ser 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atttaatttt gctaacactc agctctgccc tccccgatcc cctggctccc 3240 cagcacacat tcctttgaaa taaggtttca atatacatct acatactata tatatatttg 3300 gcaacttgta tttgtgtgta tatatatata tatatgttta tgtatatatg tgattctgat 3360 aaaatagaca ttgctattct gttttttata tgtaaaaaca aaacaagaaa aaatagagaa 3420 ttctacatac taaatctctc tcctttttta attttaatat ttgttatcat ttatttattg 3480 gtgctactgt ttatccgtaa taattgtggg gaaaagatat taacatcacg tctttgtctc 3540 tagtgcagtt tttcgagata ttccgtagta catatttatt tttaaacaac gacaaagaaa 3600 tacagatata tcttaaaaaa aaaaaagcat tttgtattaa agaatttaat tctgatctca 3660 aaaaaaaaaa aaaaaaa 3677 <210> 8 <211> 412 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Met Thr Asp Arg Gln Thr Asp Thr Ala Pro Ser Pro Ser Tyr His Leu 1 5 10 15 Leu Pro Gly Arg Arg Arg Thr Val Asp Ala Ala Ala Ser Arg Gly Gln 20 25 30 Gly Pro Glu Pro Ala Pro Gly Gly Gly Val Glu Gly Val Gly Ala Arg 35 40 45 Gly Val Ala Leu Lys Leu Phe Val Gln Leu Leu Gly Cys Ser Arg Phe 50 55 60 Gly Gly Ala Val Val Arg Ala Gly Glu Ala Glu Pro Ser Gly Ala Ala 65 70 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tgtctttcct gcagcacaac 300 aaatgtgaat gtcgcccgaa gaaagaccgt gcacgccagg aaaagtgtga caagccgcgt 360 cgttaa 366 <210> 10 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic peptide <400> 10 Ala Pro Met Ala Glu Gly Gly Gly Gln Asn His His Glu Val Val Lys 1 5 10 15 Phe Met Asp Val Tyr Gln Arg Ser Tyr Cys His Pro Ile Glu Thr Leu 20 25 30 Val Asp Ile Phe Gln Glu Tyr Pro Asp Glu Ile Glu Tyr Ile Phe Lys 35 40 45 Pro Ser Cys Val Pro Leu Met Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Asp Glu 50 55 60 Gly Leu Glu Cys Val Pro Thr Glu Glu Ser Asn Ile Thr Met Gln Ile 65 70 75 80 Met Arg Ile Lys Pro His Gln Gly Gln His Ile Gly Glu Met Ser Phe 85 90 95 Leu Gln His Asn Lys Cys Glu Cys Arg Pro Lys Lys Asp Arg Ala Arg 100 105 110 Gln Glu Lys Cys Asp Lys Pro Arg 115 120 <210> 11 <211> 576 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic DNA <400> 11 atgaactttc tgctgtcttg ggtgcattgg agccttgcct tgctgctcta cctccaccat 60 gccaagtggt cccaggctgc acccatggca gaaggaggag ggcagaatca tcacgaagtg 120 gtgaagttca tggatgtcta tcagcgcagc tactgccatc caatcgagac cctggtggac 180 atcttccagg agtaccctga tgagatcgag tacatcttca agccatcctg tgtgcccctg 240 atgcgatgcg ggggctgctg caatgacgag ggcctggagt gtgtgcccac tgaggagtcc 300 aacatcacca tgcagattat gcggatcaaa cctcaccaag gccagcacat aggagagatg 360 agcttcctac agcacaacaa atgtgaatgc agaccaaaga aagatagagc aagacaagaa 420 aatccctgtg ggccttgctc agagcggaga aagcatttgt ttgtacaaga tccgcagacg 480 tgtaaatgtt cctgcaaaaa cacagactcg cgttgcaagg cgaggcagct tgagttaaac 540 gaacgtactt gcagatgtga caagccgagg cggtga 576 <210> 12 <211> 191 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic peptide <400> 12 Met Asn Phe Leu Leu Ser Trp Val His Trp Ser Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 Tyr Leu His His Ala Lys Trp Ser Gln Ala Ala Pro Met Ala Glu Gly 20 25 30 Gly Gly Gln Asn His His Glu Val Val Lys Phe Met Asp Val Tyr Gln 35 40 45 Arg Ser Tyr Cys His Pro Ile Glu Thr Leu Val Asp Ile Phe Gln Glu 50 55 60 Tyr Pro Asp Glu Ile Glu Tyr Ile Phe Lys Pro Ser Cys Val Pro Leu 65 70 75 80 Met Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn 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agc gtc ctc acc gtc ctg 576 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 cac cag gac tgg ctg aat ggc aag gag tac aag tgc aag gtc tcc aac 624 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205 aaa gcc ctc cca gcc ccc atc gag aaa acc atc tcc aaa gcc aaa ggg 672 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220 cag ccc cga gaa cca cag gtg tac acc ctg ccc cca tcc cgg gag gag 720 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu 225 230 235 240 atg acc aag aac cag gtc agc ctg acc tgc ctg gtc aaa ggc ttc tat 768 Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 ccc agc gac atc gcc gtg gag tgg gag agc aat ggg cag ccg gag aac 816 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 260 265 270 aac tac aag acc acg cct ccc gtg ctg gac tcc gac ggc tcc ttc ttc 864 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285 ctc tac agc aag ctc acc gtg gac aag agc agg tgg cag cag ggg aac 912 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 290 295 300 gtc ttc tca tgc tcc gtg atg cat gag gct ctg cac aac cac tac acg 960 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320 cag aag agc ctc tcc ctg tct ccg ggt aaa tgagtcctag ctgg 1004 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330 <210> 36 <211> 330 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Construct <400> 36 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu 225 230 235 240 Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 260 265 270 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 290 295 300 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330 <210> 37 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic DNA <220> <221> CDS <222> (1)..(318) <400> 37 acg gtg gct gca cca tct gtc ttc atc ttc ccg cca tct gat gag cag 48 Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln 1 5 10 15 ttg aaa tct gga act gcc tct gtt gtg tgc ctg ctg aat aac ttc tat 96 Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr 20 25 30 ccc aga gag gcc aaa gta cag tgg aag gtg gat aac gcc ctc caa tcg 144 Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser 35 40 45 ggt aac tcc cag gag agt gtc aca gag cag gac agc aag gac agc acc 192 Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr 50 55 60 tac agc ctc agc agc acc ctg acg ctg agc aaa gca gac tac gag aaa 240 Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys 65 70 75 80 cac aaa gtc tac gcc tgc gaa gtc acc cat cag ggc ctg agc tcg ccc 288 His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro 85 90 95 gtc aca aag agc ttc aac agg gga gag tgt tag 321 Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105 <210> 38 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Construct <400> 38 Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln 1 5 10 15 Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr 20 25 30 Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser 35 40 45 Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr 50 55 60 Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys 65 70 75 80 His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro 85 90 95 Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105 <210> 39 <211> 1008 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic DNA <220> <221> CDS <222> (1)..(1008) <400> 39 gcc tcc acc acg gcc ccc tcg gtt ttc cca ctg gcc ccc agc tgc ggg 48 Ala Ser Thr Thr Ala Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Cys Gly 1 5 10 15 tcc act tcc ggc tcc acg gtg gcc ctg gcc tgc ctg gtg tca ggc tac 96 Ser Thr Ser Gly Ser Thr Val Ala Leu Ala Cys Leu Val Ser Gly Tyr 20 25 30 ttc ccc gag cct gta act gtg tcc tgg aat tcc ggc tcc ttg acc agc 144 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ser Leu Thr Ser 35 40 45 ggt gtg cac acc ttc ccg tcc gtc ctg cag tcc tca ggg ctc tac tcc 192 Gly Val His Thr Phe Pro Ser Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 ctc agc agc atg gtg aca gtg ccc tcc agc agg tgg ccc agc gag acc 240 Leu Ser Ser Met Val Thr Val Pro Ser Ser Arg Trp Pro Ser Glu Thr 65 70 75 80 ttc acc tgc aac gtg gcc cac ccg gcc agc aaa act aaa gta gac aag 288 Phe Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Lys Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 cca gtg ccc aaa aga gaa aat gga aga gtt cct cgc cca cct gat tgt 336 Pro Val Pro Lys Arg Glu Asn Gly Arg Val Pro Arg Pro Pro Asp Cys 100 105 110 ccc aaa tgc cca gcc cct gaa atg ctg gga ggg cct tcg gtc ttc atc 384 Pro Lys Cys Pro Ala Pro Glu Met Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile 115 120 125 ttt ccc ccg aaa ccc aag gac acc ctc ttg att gcc cga aca cct gag 432 Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Leu Ile Ala Arg Thr Pro Glu 130 135 140 gtc aca tgt gtg gtg gtg gat ctg gac cca gaa gac cct gag gtg cag 480 Val Thr Cys Val Val Val Asp Leu Asp Pro Glu Asp Pro Glu Val Gln 145 150 155 160 atc agc tgg ttc gtg gac ggt aag cag atg caa aca gcc aag act cag 528 Ile Ser Trp Phe Val Asp Gly Lys Gln Met Gln Thr Ala Lys Thr Gln 165 170 175 cct cgt gag gag cag ttc aat ggc acc tac cgt gtg gtc agt gtc ctc 576 Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Gly Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu 180 185 190 ccc att ggg cac cag gac tgg ctc aag ggg aag cag ttc acg tgc aaa 624 Pro Ile Gly His Gln Asp Trp Leu Lys Gly Lys Gln Phe Thr Cys Lys 195 200 205 gtc aac aac aaa gcc ctc cca tcc ccg atc gag agg acc atc tcc aag 672 Val Asn Asn Lys Ala Leu Pro Ser Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys 210 215 220 gcc aga ggg caa gcc cat cag ccc agt gtg tat gtc ctg ccg cca tcc 720 Ala Arg Gly Gln Ala His Gln Pro Ser Val Tyr Val Leu Pro Pro Ser 225 230 235 240 cgg gag gag ttg agc aag aac aca gtc agc ttg aca tgc ctg atc aaa 768 Arg Glu Glu Leu Ser Lys Asn Thr Val Ser Leu Thr Cys Leu Ile Lys 245 250 255 gac ttc ttc cca cct gac att gat gtg gag tgg cag agc aat gga cag 816 Asp Phe Phe Pro Pro Asp Ile Asp Val Glu Trp Gln Ser Asn Gly Gln 260 265 270 cag gag cct gag agc aag tac cgc acg acc ccg ccc cag ctg gac gag 864 Gln Glu Pro Glu Ser Lys Tyr Arg Thr Thr Pro Pro Gln Leu Asp Glu 275 280 285 gac ggg tcc tac ttc ctg tac agc aag ctc tct gtg gac aag agc cgc 912 Asp Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Ser Val Asp Lys Ser Arg 290 295 300 tgg cag cgg gga gac acc ttc ata tgt gcg gtg atg cat gaa gct cta 960 Trp Gln Arg Gly Asp Thr Phe Ile Cys Ala Val Met His Glu Ala Leu 305 310 315 320 cac aac cac tac aca cag gaa tcc ctc tcc cat tct ccg ggt aaa tga 1008 His Asn His Tyr Thr Gln Glu Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys 325 330 335 <210> 40 <211> 335 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Construct <400> 40 Ala Ser Thr Thr Ala Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Cys Gly 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Ser Thr Val Ala Leu Ala Cys Leu Val Ser Gly Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ser Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ser Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Met Val Thr Val Pro Ser Ser Arg Trp Pro Ser Glu Thr 65 70 75 80 Phe Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Lys Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Pro Val Pro Lys Arg Glu Asn Gly Arg Val Pro Arg Pro Pro Asp Cys 100 105 110 Pro Lys Cys Pro Ala Pro Glu Met Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile 115 120 125 Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Leu Ile Ala Arg Thr Pro Glu 130 135 140 Val Thr Cys Val Val Val Asp Leu Asp Pro Glu Asp Pro Glu Val Gln 145 150 155 160 Ile Ser Trp Phe Val Asp Gly Lys Gln Met Gln Thr Ala Lys Thr Gln 165 170 175 Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Gly Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu 180 185 190 Pro Ile Gly His Gln Asp Trp Leu Lys Gly Lys Gln Phe Thr Cys Lys 195 200 205 Val Asn Asn Lys Ala Leu Pro Ser Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys 210 215 220 Ala Arg Gly Gln Ala His Gln Pro Ser Val Tyr Val Leu Pro Pro Ser 225 230 235 240 Arg Glu Glu Leu Ser Lys Asn Thr Val Ser Leu Thr Cys Leu Ile Lys 245 250 255 Asp Phe Phe Pro Pro Asp Ile Asp Val Glu Trp Gln Ser Asn Gly Gln 260 265 270 Gln Glu Pro Glu Ser Lys Tyr Arg Thr Thr Pro Pro Gln Leu Asp Glu 275 280 285 Asp Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Ser Val Asp Lys Ser Arg 290 295 300 Trp Gln Arg Gly Asp Thr Phe Ile Cys Ala Val Met His Glu Ala Leu 305 310 315 320 His Asn His Tyr Thr Gln Glu Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys 325 330 335 <210> 41 <211> 342 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic DNA <220> <221> CDS <222> (1)..(342) <400> 41 ctc gag ata aaa aat gat gcc cag cca gcc gtc tat ttg ttc caa cca 48 Leu Glu Ile Lys Asn Asp Ala Gln Pro Ala Val Tyr Leu Phe Gln Pro 1 5 10 15 tct cca gac cag tta cac aca gga agt gcc tct gtt gtg tgt ttg ctg 96 Ser Pro Asp Gln Leu His Thr Gly Ser Ala Ser Val Val Cys Leu Leu 20 25 30 aat agc ttc tac ccc aaa gac atc aat gtc aag tgg aaa gtg gat ggt 144 Asn Ser Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Val Asp Gly 35 40 45 gtc atc caa gac aca ggc atc cag gaa agt gtc aca gag cag gac aag 192 Val Ile Gln Asp Thr Gly Ile Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Lys 50 55 60 gac agt acc tac agc ctc agc agc acc ctg acg atg tcc agt act gag 240 Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Met Ser Ser Thr Glu 65 70 75 80 tac cta agt cat gag ttg tac tcc tgt gag atc act cac aag agc ctg 288 Tyr Leu Ser His Glu Leu Tyr Ser Cys Glu Ile Thr His Lys Ser Leu 85 90 95 ccc tcc acc ctc atc aag agc ttc caa agg agc gag tgt cag aga gtg 336 Pro Ser Thr Leu Ile Lys Ser Phe Gln Arg Ser Glu Cys Gln Arg Val 100 105 110 gac tag 342 Asp <210> 42 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Construct <400> 42 Leu Glu Ile Lys Asn Asp Ala Gln Pro Ala Val Tyr Leu Phe Gln Pro 1 5 10 15 Ser Pro Asp Gln Leu His Thr Gly Ser Ala Ser Val Val Cys Leu Leu 20 25 30 Asn Ser Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Val Asp Gly 35 40 45 Val Ile Gln Asp Thr Gly Ile Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Lys 50 55 60 Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Met Ser Ser Thr Glu 65 70 75 80 Tyr Leu Ser His Glu Leu Tyr Ser Cys Glu Ile Thr His Lys Ser Leu 85 90 95 Pro Ser Thr Leu Ile Lys Ser Phe Gln Arg Ser Glu Cys Gln Arg Val 100 105 110 Asp <210> 43 <211> 114 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic peptide <400> 43 Ala Pro Thr Thr Glu Gly Glu Gln Lys Ser His Glu Val Ile Lys Phe 1 5 10 15 Met Asp Val Tyr Gln Arg Ser Tyr Cys Arg Pro Ile Glu Thr Leu Val 20 25 30 Asp Ile Phe Gln Glu Tyr Pro Asp Glu Ile Glu Tyr Ile Phe Lys Pro 35 40 45 Ser Cys Val Pro Leu Met Arg Cys Ala Gly Cys Cys Asn Asp Glu Ala 50 55 60 Leu Glu Cys Val Pro Thr Ser Glu Ser Asn Ile Thr Met Gln Ile Met 65 70 75 80 Arg Ile Lys Pro His Gln Ser Gln His Ile Gly Glu Met Ser Phe Leu 85 90 95 Gln His Ser Arg Cys Glu Cys Arg Pro Lys Lys Asp Arg Thr Lys Pro 100 105 110 Glu Asn <210> 44 <211> 114 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic peptide <400> 44 Ala Pro Thr Thr Glu Gly Glu Gln Lys Ala His Glu Val Val Lys Phe 1 5 10 15 Met Asp Val Tyr Gln Arg Ser Tyr Cys Arg Pro Ile Glu Thr Leu Val 20 25 30 Asp Ile Phe Gln Glu Tyr Pro Asp Glu Ile Glu Tyr Ile Phe Lys Pro 35 40 45 Ser Cys Val Pro Leu Met Arg Cys Ala Gly Cys Cys Asn Asp Glu Ala 50 55 60 Leu Glu Cys Val Pro Thr Ser Glu Ser Asn Val Thr Met Gln Ile Met 65 70 75 80 Arg Ile Lys Pro His Gln Ser Gln His Ile Gly Glu Met Ser Phe Leu 85 90 95 Gln His Ser Arg Cys Glu Cys Arg Pro Lys Lys Asp Arg Thr Lys Pro 100 105 110 Glu Asn <210> 45 <211> 114 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic peptide <400> 45 Ala Pro Met Ala Gly Gly Glu His Lys Pro His Glu Val Val Lys Phe 1 5 10 15 Met Asp Val Tyr Gln Arg Ser Tyr Cys Arg Pro Ile Glu Thr Leu Val 20 25 30 Asp Ile Phe Gln Glu Tyr Pro Asp Glu Ile Glu Tyr Ile Phe Lys Pro 35 40 45 Ser Cys Val Pro Leu Met Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Asp Glu Gly 50 55 60 Leu Glu Cys Val Pro Thr Glu Glu Phe Asn Ile Thr Met Gln Ile Met 65 70 75 80 Arg Ile Lys Pro His Gln Gly Gln His Ile Gly Glu Met Ser Phe Leu 85 90 95 Gln His Ser Lys Cys Glu Cys Arg Pro Lys Lys Asp Arg Ala Arg Gln 100 105 110 Glu Asn <210> 46 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic peptide <400> 46 Ala Pro Met Ala Glu Gly Gly Gly Gln Asn His His Glu Val Val Lys 1 5 10 15 Phe Met Asp Val Tyr Gln Arg Ser Tyr Cys His Pro Ile Glu Thr Leu 20 25 30 Val Asp Ile Phe Gln Glu Tyr Pro Asp Glu Ile Glu Tyr Ile Phe Lys 35 40 45 Pro Ser Cys Val Pro Leu Met Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Asp Glu 50 55 60 Gly Leu Glu Cys Val Pro Thr Glu Glu Ser Asn Ile Thr Met Gln Ile 65 70 75 80 Met Arg Ile Lys Pro His Gln Gly Gln His Ile Gly Glu Met Ser Phe 85 90 95 Leu Gln His Asn Lys Cys Glu Cys Arg Pro Lys Lys Asp Arg Ala Arg 100 105 110 Gln Glu Asn 115

Claims (34)

1. 혈관 내피 증식 인자 (VEGF) 와 뉴로필린-1 (NRP1) 의 결합을 저해하는, VEGF 에 대한 모노클로날 항체로서,
   서열 번호 14 의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR-H1, 서열 번호 16 의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR-H2 및 서열 번호 18 의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR-H3 을 포함하고, 또한,
   서열 번호 20 의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR-L1, 아미노산 서열 Glu-Gly-Asn 으로 이루어지는 CDR-L2 및 서열 번호 22 의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR-L3 을 포함하는, 항체.
2. 제 1 항에 있어서,
   혈관 내피 증식 인자 (VEGF) 와 뉴로필린-1 (NRP1) 및 혈관 내피 증식 인자 수용체-2 (VEGFR2) 의 결합을 저해하는, 항체.
3. 제 1 항에 있어서,
   혈관 내피 증식 인자 (VEGF) 와 뉴로필린-1 (NRP1) 및 혈관 내피 증식 인자 수용체-1 (VEGFR1) 의 결합을 저해하는, 항체.
4. 제 1 항에 있어서,
   혈관 내피 증식 인자 (VEGF) 와, 뉴로필린-1 (NRP1), 혈관 내피 증식 인자 수용체-2 (VEGFR2) 및 혈관 내피 증식 인자 수용체-1 (VEGFR1) 의 결합을 저해하는, 항체.
5. 제 1 항에 있어서,
   서열 번호 24 의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 번호 26 의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는, 항체.
6. 제 1 항에 있어서,
   항체가 키메라 항체, 인간형화 항체 또는 개형화 항체인, 항체.
7. 제 1 항에 있어서,
   추가로 인간 IgG1 중쇄 정상 영역에서 유래하는 아미노산 서열 및 인간 IgG1 경쇄 정상 영역에서 유래하는 아미노산 서열을 포함하는, 항체.
8. 제 7 항에 있어서,
   인간 IgG1 중쇄 정상 영역에서 유래하는 아미노산 서열이 서열 번호 36 의 아미노산 서열을 포함하는 것이고, 또한, 인간 IgG1 경쇄 정상 영역에서 유래하는 아미노산 서열이 서열 번호 38 의 아미노산 서열을 포함하는 것인, 항체.
9. 제 8 항에 있어서,
   서열 번호 24 의 아미노산 서열 및 서열 번호 36 의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 그리고
   서열 번호 26 의 아미노산 서열 및 서열 번호 38 의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄
   를 포함하는, 항체.
10. 제 1 항에 있어서,
    추가로 개 IgGB 중쇄 정상 영역에서 유래하는 아미노산 서열 및 개 Ig 경쇄 (κ 사슬) 정상 영역에서 유래하는 아미노산 서열을 포함하는, 항체.
11. 제 10 항에 있어서,
    개 IgGB 중쇄 정상 영역에서 유래하는 아미노산 서열이 서열 번호 40 의 아미노산 서열을 포함하는 것이고, 또한, 개 Ig 경쇄 (κ 사슬) 정상 영역에서 유래하는 아미노산 서열이 서열 번호 42 의 아미노산 서열을 포함하는 것인, 항체.
12. 제 11 항에 있어서,
    서열 번호 24 의 아미노산 서열 및 서열 번호 40 의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 그리고
    서열 번호 26 의 아미노산 서열 및 서열 번호 42 의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄
    를 포함하는, 항체.
13. 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 기재된 항체의 항원 결합 단편.
14. 제 13 항에 있어서,
    항원 결합 단편이 단쇄 항체 또는 2 본쇄 항체인, 항원 결합 단편.
15. 제 1 항에 기재된 모노클로날 항체를 산생하는, 하이브리도마.
16. 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 기재된 항체의 항원 결합 단편을 포함하는, 암 또는 VEGF 매개성 안질환의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 의약 조성물로서, 상기 VEGF 매개성 안질환이, 눈에 있어서의, VEGF 에 의한 병적인 혈관 신생 혹은 혈관 투과성 항진에서 기인하는 질환인, 의약 조성물.
17. 제 16 항에 있어서,
    암 또는 VEGF 매개성 안질환의 치료 또는 예방이, 혈관 내피 증식 인자 (VEGF) 와 뉴로필린-1 (NRP1) 의 결합의 저해에 의한 것인, 의약 조성물.
18. 제 16 항에 있어서,
    암 또는 VEGF 매개성 안질환의 치료 또는 예방이 혈관 신생 또는 혈관 투과성 항진의 저해에 의한 것인, 의약 조성물.
19. 제 18 항에 있어서,
    혈관 신생이 병적인 혈관 신생인, 의약 조성물.
20. 제 16 항에 있어서,
    암이 고형암 또는 혈액 종양인, 의약 조성물.
21. 제 16 항에 있어서,
    암이, 뇌종양, 경암 (頸癌), 식도암, 설암, 폐암, 유방암, 췌암, 위암, 소장의 암, 십이지장암, 대장암, 방광암, 신암, 간암, 전립선암, 자궁암, 자궁경암, 난소암, 갑상선암, 담낭암, 인두암, 육종, 멜라노마, 백혈병, 림프종 및 다발성 골수종으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종인, 의약 조성물.
22. 제 16 항에 있어서,
    VEGF 매개성 안질환이, 가령 황반 변성, 당뇨병 망막증, 당뇨병 황반 부종, 혈관 신생 녹내장, 망막 정맥 폐색증, 미숙아 망막증, 병적 근시에 수반하는 맥락막 혈관 신생, 익상편 (翼狀片), 루베오시스, 판누스, 점막피부안 증후군 및 눈에 있어서의 이식 조직의 면역 거절로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종인, 의약 조성물.
23. 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 기재된 항체의 항원 결합 단편을 포함하는, 혈관 신생 저해 시험용 시약.
24. 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 기재된 항체의 항원 결합 단편을 포함하는, 시험용 시약.
25. 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 기재된 항체의 항원 결합 단편을 포함하는, VEGF 의 검출용 시약.
26. 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 기재된 항체 항원 결합 단편을 포함하는, 시험용 키트.
27. 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 기재된 항체 항원 결합 단편을 포함하는, VEGF 의 검출용 키트.
28. 암 또는 VEGF 매개성 안질환의 치료 또는 예방 방법에 있어서 사용하기 위한, 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 기재된 항체의 항원 결합 단편으로서, 상기 VEGF 매개성 안질환이, 눈에 있어서의, VEGF 에 의한 병적인 혈관 신생 혹은 혈관 투과성 항진에의 기인하는 질환인, 상기 항체 또는 항원 결합 단편.
29. 암 또는 VEGF 매개성 안질환을 치료 또는 예방하기 위한 의약의 제조에 있어서 사용하기 위한, 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 기재된 항체의 항원 결합 단편으로서, 상기 VEGF 매개성 안질환이, 눈에 있어서의, VEGF 에 의한 병적인 혈관 신생 혹은 혈관 투과성 항진에서 기인하는 질환인, 상기 항체 또는 항원 결합 단편.
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