JPWO2017119434A1 - Vegfとnrp1との結合を阻害する抗体 - Google Patents
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Abstract
本発明は、VEGFとNRP1との結合を阻害する、VEGFに対する抗体を提供する。
Description
NRP1は、およそ130kDaのI型膜貫通型糖タンパク質であり、当初は軸索ガイダンスのメディエータとして報告されたが、脈管発生においても重要な役割を果たすことが報告されている(非特許文献2:Nature,436:193-200, 2005)。また、ノックアウトマウスを用いた研究では、NRP1の機能が喪失することにより、血管リモデリング及び分枝に欠陥がもたらされることが報告されている(非特許文献3:Development, 135, 2479-88, 2008)。さらに、上皮細胞においては、NRP1はVEGFとVEGFR2とが結合することによって生じるシグナルを増強する働きを持っており、細胞の移動や血管形成を亢進されることが報告されている(非特許文献4:Cell, 92, 735-745, 1998)。
すなわち、本発明は以下の通りである。
(2)血管内皮増殖因子(VEGF)とニューロピリン−1(NRP1)及び血管内皮増殖因子受容体−2(VEGFR2)との結合を阻害する、VEGFに対する抗体。
(3)血管内皮増殖因子(VEGF)とニューロピリン−1(NRP1)及び血管内皮増殖因子受容体−1(VEGFR1)との結合を阻害する、VEGFに対する抗体。
(4)血管内皮増殖因子(VEGF)と、ニューロピリン−1(NRP1)、血管内皮増殖因子受容体−2(VEGFR2)及び血管内皮増殖因子受容体−1(VEGFR1)との結合を阻害する、VEGFに対する抗体。
(5)抗体がモノクローナル抗体である上記(1)〜(4)のいずれかに記載の抗体。
(6)上記(1)〜(5)のいずれかに記載の抗体が結合する部位に結合する抗体。
(7)抗体がキメラ抗体又はヒト型化抗体である、上記(5)又は(6)に記載の抗体。
(8)配列番号14のアミノ酸配列を含むCDR-H1、配列番号16のアミノ酸配列を含むCDR-H2及び配列番号18のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含む、上記(1)〜(7)のいずれかに記載の抗体。
(9)配列番号20のアミノ酸配列を含むCDR-L1、アミノ酸配列Glu−Gly−Asnを含むCDR-L2及び配列番号22のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含む、上記(1)〜(7)のいずれかに記載の抗体。
(10)配列番号14のアミノ酸配列を含むCDR-H1、配列番号16のアミノ酸配列を含むCDR-H2及び配列番号18のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含み、かつ、配列番号20のアミノ酸配列を含むCDR-L1、アミノ酸配列Glu−Gly−Asnを含むCDR-L2及び配列番号22のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含む、上記(1)〜(7)のいずれかに記載の抗体。
(11)さらにヒトIgG1重鎖定常領域に由来するアミノ酸配列及びヒトIgG1軽鎖定常領域に由来するアミノ酸配列を含む、上記(10)に記載の抗体。
(12)ヒトIgG1重鎖定常領域に由来するアミノ酸配列が配列番号36のアミノ酸配列を含むものであり、かつ、ヒトIgG1軽鎖定常領域に由来するアミノ酸配列が配列番号38のアミノ酸配列を含むものである、上記(11)に記載の抗体。
(13)配列番号24のアミノ酸配列及び配列番号36のアミノ酸配列を含む重鎖並びに配列番号26のアミノ酸配列及び配列番号38のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、上記(12)に記載の抗体。
(14)さらにイヌIgGB重鎖定常領域に由来するアミノ酸配列及びイヌIg軽鎖(κ鎖)定常領域に由来するアミノ酸配列を含む上記(10)に記載の抗体。
(15)イヌIgGB重鎖定常領域に由来するアミノ酸配列が配列番号40のアミノ酸配列を含むものであり、かつ、イヌIg軽鎖(κ鎖)定常領域に由来するアミノ酸配列が配列番号42のアミノ酸配列を含むものである、上記(14)に記載の抗体。
(16)配列番号24のアミノ酸配列及び配列番号40のアミノ酸配列を含む重鎖並びに配列番号26のアミノ酸配列及び配列番号42のアミノ酸配列を含む軽鎖
を含む、上記(15)に記載の抗体。
(17)上記(1)〜(16)のいずれかに記載の抗体の断片。
(18)断片が抗原結合断片である上記(17)に記載の断片。
(19)抗原結合断片が単鎖抗体又は二本鎖抗体である、上記(18)に記載の断片。
(20)上記(5)に記載のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ。
(21)上記(1)〜(19)のいずれかに記載の抗体又はその断片を含む医薬組成物。
(22)癌又はVEGF媒介性眼疾患の治療又は予防に使用するための、上記(21)に記載の医薬組成物。
(23)癌又はVEGF媒介性眼疾患の治療又は予防が、血管内皮増殖因子(VEGF)とニューロピリン−1(NRP1)との結合の阻害によるものである、上記(22)に記載の医薬組成物。
(24)癌又はVEGF媒介性眼疾患の治療又は予防が血管新生又は血管透過性亢進の阻害によるものである、上記(22)に記載の医薬組成物。
(25)血管新生が病的な血管新生である、上記(24)に記載の医薬組成物。
(26)癌が固形癌又は血液腫瘍である、上記(22)に記載の医薬組成物。
(27)癌が、脳腫瘍、頚癌、食道癌、舌癌、肺癌、乳癌、膵癌、胃癌、小腸の癌、十二指腸癌、大腸癌、膀胱癌、腎癌、肝癌、前立腺癌、子宮癌、子宮頸癌、卵巣癌、甲状腺癌、胆嚢癌、咽頭癌、肉腫、メラノーマ、白血病、リンパ腫及び多発性骨髄腫からなる群から選ばれる少なくとも1種である、上記(22)に記載の医薬組成物。
(28)VEGF媒介性眼疾患が、加齢黄斑変性、糖尿病網膜症、糖尿病黄斑浮腫、血管新生緑内障、網膜静脈閉塞症、未熟児網膜症、病的近視に伴う脈絡膜血管新生、翼状片、ルベオーシス、パンヌス、粘膜皮膚眼症候群及び眼における移植組織の免疫拒絶からなる群から選ばれる少なくとも1種である、上記(22)に記載の医薬組成物。
(29)上記(1)〜(19)のいずれかに記載の抗体又はその断片を含む、血管新生阻害剤。
(30)上記(1)〜(19)のいずれかに記載の抗体又はその断片を含む、試薬。
(31)上記(1)〜(19)のいずれかに記載の抗体又はその断片を含む、キット。
(32)治療上有効量の上記(1)〜(19)のいずれかに記載の抗体又はその断片を被験者に投与する工程を含む、癌又はVEGF媒介性眼科疾患の治療又は予防方法。
(33)癌又はVEGF媒介性眼疾患の治療又は予防方法において使用するための、上記(1)〜(19)のいずれかに記載の抗体又はその断片。
(34)癌又はVEGF媒介性眼疾患を治療又は予防するための医薬の製造において使用するための、上記(1)〜(19)のいずれかに記載の抗体又はその断片。
本発明は、血管内皮増殖因子(VEGF)とニューロピリン−1(NRP1)との結合を阻害する、VEGFに対する抗体に関する。
抗VEGF中和抗体として知られるベバシズマブは、VEGFとVEGFR1及びVEGFR2との結合を阻害する抗体であり、VEGFとNRP1との結合は阻害しない。また、VEGFとNRP1との結合を阻害する抗体には、NRP1に対する抗体は知られているが、VEGFに対する抗体は知られていない。
これに対し、本発明者はVEGFとNRP1との結合を阻害するVEGFに対する抗体を開発した。また、本発明者は、この抗体がVEGFとNRP1との結合を阻害することに加えて、VEGFと血管内皮増殖因子受容体−2(VEGFR2)との結合及びVEGFと血管内皮増殖因子受容体−1(VEGFR1)との結合を阻害することを見出した。さらに、本発明者は、NRP1がVEGFによる血管新生や癌幹細胞の制御に重要な役割を果たしていることに着目し、VEGFとNRP1との結合を阻害するVEGFに対する抗体が、癌、VEGF媒介性眼疾患、その他病的な血管新生又は血管透過性亢進に起因する疾患の治療又は予防に有効であることを見出した。本発明はこのような知見に基づき完成されたものである。
VEGFは、血管新生において重要な役割を果たしているタンパク質である。VEGFは、その受容体と結合することで、細胞内にシグナルを伝達し、細胞分裂や遊走、分化誘導、血管透過性の亢進、単球やマクロファージの活性化等に関与している。
さらに、イヌVEGFとしては、例えば、164アミノ酸残基からなるVEGF(VEGF164)、120アミノ酸残基からなるVEGF(VEGF120)、144アミノ酸残基からなるVEGF(VEGF144)、147アミノ酸残基からなるVEGF(VEGF147)、162アミノ酸残基からなるVEGF(VEGF162)、182アミノ酸残基からなるVEGF(VEGF182)、188アミノ酸残基からなるVEGF(VEGF188)、205アミノ酸残基からなるVEGF(VEGF205)、前記VEGF164とはC末端領域のアミノ酸配列が異なるVEGF(VEGF164b)、並びにそれらの天然に生じる対立遺伝子型及びプロセシング型が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
ラットVEGFのアミノ酸配列:NP_114024.2(配列番号4)
イヌVEGFのアミノ酸配列:NP_001003175 (配列番号6)
ヒトVEGF-Aのアミノ酸配列:NP_001020537.2(配列番号8)
VEGF121のアミノ酸配列:ABO26344.1(配列番号10)
VEGF165のアミノ酸配列:AAM03108.1(配列番号12)
マウスVEGFをコードするDNAの塩基配列:NM_001025250.3(配列番号1)
ラットVEGFをコードするDNAの塩基配列:NM_031836.2(配列番号3)
イヌVEGFをコードするDNAの塩基配列:NM_001003175.2 (配列番号5)
ヒトVEGF-AをコードするDNAの塩基配列:NM_001025366.2(配列番号7)
VEGF121をコードするDNAの塩基配列:EF424789.1(配列番号9)
VEGF165をコードするDNAの塩基配列:AF486837.1(配列番号11)
(a) 配列番号2、4、6、8、10若しくは12で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質、
(b) 配列番号2、4、6、8、10若しくは12で表されるアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつVEGF受容体と結合する活性を有するタンパク質、
(c) 配列番号2、4、6、8、10若しくは12で表されるアミノ酸配列に対して80%以上の相同性(同一性)を有するアミノ酸配列を含み、かつVEGF受容体と結合する活性を有するタンパク質。
また、「配列番号2、4、6、8、10若しくは12で表されるアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列」としては、例えば、
(i) 配列番号2、4、6、8、10若しくは12で表されるアミノ酸配列中の1〜10個(例えば、1〜5個、好ましくは1〜3個、より好ましくは1〜2個、さらに好ましくは1個)のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、
(ii) 配列番号2、4、6、8、10若しくは12で表されるアミノ酸配列中の1〜10個(例えば、1〜5個、好ましくは1〜3個、より好ましくは1〜2個、さらに好ましくは1個)のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、
(iii) 配列番号2、4、6、8、10若しくは12で表されるアミノ酸配列に1〜10個(例えば、1〜5個、好ましくは1〜3個、より好ましくは1〜2個、さらに好ましくは1個)のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、
(iv) 上記(i)〜 (iii)の組合せにより変異されたアミノ酸配列
などが挙げられる。
本発明において、VEGFに対する抗体(以下「抗VEGF抗体」とも称する。)とは、上記VEGFと特異的に結合する抗体を意味する。本発明の抗VEGF抗体は、VEGFとNRP1との結合を阻害する。また、本発明の抗VEGF抗体は、VEGFとNRP1及びVEGFR2との結合、VEGFとNRP1及びVEGFR1との結合を阻害する。さらに、本発明の抗VEGF抗体は、VEGFとNRP1、VEGFR2及びVEGFR1との結合を阻害する。
なお、抗VEGF抗体として広く知られているベバシズマブ(アバスチン(登録商標))は、VEGFとVEGFR1及びVEGFR2との結合を阻害するが、VEGFとNRP1との結合は阻害しない。
本発明において「結合を阻害する」とは、必ずしもVEGFとVEGF受容体(NRP1、VEGFR2又はVEGFR1)との結合を100%阻害することを意味するものではない。本発明の抗体は、VEGFとVEGF受容体との結合を、例えば50%以上、好ましくは60%以上、70%以上、80%以上、90%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上阻害する。
結合阻害効果は、結合阻害試験に関する公知の方法、例えば本明細書の実施例2で用いた方法を用いて評価することができる。
(1)抗原の調製
VEGFは、本発明の抗体を作製するための免疫原として使用される。
免疫原としてVEGFを用いる場合、VEGFの全長配列のうち一部のアミノ酸配列を含むペプチドを使用することもできる。抗原又は免疫原として用いられるVEGF及び変異の導入方法等の説明については、上記「2.VEGF」に記載した通りである。
前記のようにして作製したVEGF又は部分ペプチドをそれ自体で、あるいは担体、希釈剤と共に非ヒト哺乳動物、例えばウサギ、イヌ、モルモット、マウス、ラット、ヤギ等に投与することにより免疫する。抗原の動物1匹当たりの投与量は、アジュバントを用いるときは0.1〜10 mgである。アジュバントとしては、フロイント完全アジュバント(FCA)、フロイント不完全アジュバント(FIA)、水酸化アルミニウムアジュバント等が挙げられる。免疫は、主として静脈内、皮下又は腹腔内等に注入することにより行われる。また、免疫の間隔は特に限定されず、数日から数週間間隔、好ましくは1〜2週間間隔で、2〜10回、好ましくは3〜5回免疫を行う。免疫の間隔は、当業者であれば得られる抗体価を勘案して設定することができる。3〜4回皮下免疫を行った時点で試採血を行い、抗体価を測定することが好ましい。血清中の抗体価の測定は、ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)、EIA(enzyme immunoassay)、放射性免疫測定法(RIA; radioimmuno assay)等によって行うことができる。抗体価が十分上昇したことを確認した後、全採血し、通常行われる方法により抗体を分離精製することができる。分離精製は、硫安塩析法、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等の公知の方法を適宜選択して、又はこれらを組み合わせることにより、精製することができる。具体的には、目的の抗体を含有する血清を、VEGF以外のタンパク質を結合したカラムに通し、素通り画分を採取することにより、VEGFに対する特異性を向上させたポリクローナル抗体を得ることができる。
(i) 抗体産生細胞の採取
ポリクローナル抗体の作製と同様に、VEGF又は部分ペプチドをそれ自体で、あるいは担体及び希釈剤と共に非ヒト哺乳動物に投与することにより免疫する。動物1匹当たりの抗原の投与量、用いられるアジュバントの種類、免疫方法、免疫の間隔はポリクローナル抗体の作製と同様である。最終の免疫日から1〜30日後、好ましくは2〜5日後に、抗体価の認められた個体を選択し抗体産生細胞を採集する。抗体産生細胞としては、脾臓細胞、リンパ節細胞、末梢血細胞等が挙げられるが、脾臓細胞又はリンパ節細胞が好ましい。
ハイブリドーマを得るため、抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞融合を行う。融合操作は既知の方法、例えばKohlerらの方法に従い実施できる。抗体産生細胞と融合させるミエローマ細胞として、マウスなどの動物の一般に入手可能な株化細胞を使用することができる。使用する細胞株としては、薬剤選択性を有し、未融合の状態ではHAT選択培地(ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジンを含む)で生存できず、抗体産生細胞と融合した状態でのみ生存できる性質を有するものが好ましい。ミエローマ細胞としては、例えばP3-x63-Ag8U.1、SP2/O-Ag14、PAI、P3U1、NSI/1-Ag4-1、NSO/1などのマウスミエローマ細胞株、YB2/0などのラットミエローマ細胞株などが挙げられる。
細胞融合処理後の細胞から目的とするハイブリドーマを選別する。その方法として、細胞懸濁液を、例えば10〜20%のウシ胎児血清含有RPMI-1640培地などで適当に希釈後、マイクロタイタープレート上に限界希釈法で計算上0.3 個/well程度まき、各ウェルにHAT培地などの選択培地を加え、以後適当に選択培地を交換して培養を行う。その結果、選択培地で培養開始後、10日前後から生育してくる細胞をハイブリドーマとして得ることができる。
樹立したハイブリドーマからモノクローナル抗体を採取する方法として、通常の細胞培養法又は腹水形成法等を採用することができる。細胞培養法においては、ハイブリドーマを10%ウシ胎児血清含有RPMI-1640培地、MEM培地又は無血清培地等の動物細胞培養培地中で、通常の培養条件(例えば37℃、5% CO2濃度)で7〜14日間培養し、その培養上清から抗体を取得する。腹水形成法の場合は、ミエローマ細胞由来の哺乳動物と同種系動物、例えばマウス(BALB/c)の腹腔内にハイブリドーマを約5×106 〜2×107個投与し、ハイブリドーマを大量に増殖させる。そして、1〜2週間後に腹水を採取する。上記抗体の採取方法において抗体の精製が必要とされる場合は、硫安塩析法、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過、アフィニティークロマトグラフィーなどの公知の方法を適宜選択して、又はこれらを組み合わせることにより精製することができる。
本発明の抗体の好ましい態様の一つとして、遺伝子組換え抗体が挙げられる。遺伝子組換え抗体としては、限定はされないが、例えば、キメラ抗体、ヒト型化抗体、イヌ型化抗体等が挙げられる。
ここで、マウス由来抗体の可変領域としては、重鎖可変領域が、例えば配列番号24で示されるアミノ酸配列を含むか若しくは該アミノ酸配列からなるものが挙げられ、軽鎖可変領域が、例えば配列番号26で示されるアミノ酸配列を含むか若しくは該アミノ酸配列からなるものが挙げられるが、これらに限定されない。
イヌ型化抗体についても、上記のヒト型化抗体の作製方法と同様の手法により作製することができる。
また、本発明において、キメラ抗体及びイヌ型化抗体に用いることができるイヌ重鎖定常領域としては、イヌIgGB重鎖定常領域に由来するアミノ酸配列を含むもの、例えば、配列番号40で示されるアミノ酸配列を含むか若しくは該アミノ酸配列からなるイヌ重鎖定常領域が挙げられるが、これらに限定されない。また、キメラ抗体及びイヌ型化抗体に用いることができるイヌ軽鎖定常領域としては、イヌIg軽鎖(κ鎖)定常領域に由来するアミノ酸配列を含むもの、例えば、配列番号42で示されるアミノ酸配列を含むか若しくは該アミノ酸配列からなるイヌ軽鎖定常領域が挙げられるが、これらに限定されない。また、イヌ重鎖定常領域をコードするDNAとしては、例えば、配列番号39で示される塩基配列を含むか若しくは該塩基配列からなるDNAが挙げられ、イヌ軽鎖定常領域をコードするDNAとしては、例えば、配列番号41で示される塩基配列を含むか若しくは該塩基配列からなるDNAが挙げられるが、これらに限定されない。
本発明においては、ハイブリドーマ又は当該ハイブリドーマから抽出したDNA若しくはRNAなどを原料として、上述した周知の方法に準じてキメラ抗体、ヒト型化抗体、イヌ型化抗体を作製することができる。
さらに、本発明の抗体が融合したタンパク質は、抗体の可変領域とその他のタンパク質を公知の遺伝子組換え方法を用いることにより作製することができる。また、当該融合タンパク質は、モノクローナル抗体と他のタンパク質とをクロスリンカーを用いて架橋することにより作製することができる。
本発明で使用されるVEGFに対する抗体の断片は、VEGFに特異的に結合する。
抗体の断片は、本発明の抗体の一部分の領域を含むポリペプチドを意味する。抗体の断片としては、抗原結合断片が好ましい。抗原結合断片としては、例えば、単鎖抗体(scFv(single chain Fv)、sc(Fv)2)、二本鎖抗体(Fab、Fab'、ダイアボディ(diabody(dibodies)、dsFv)、F(ab')2などが挙げられるが、これらに限定されない。上記抗体断片は、本発明の抗体を目的に応じて各種タンパク質分解酵素で切断することにより得ることができる。
例えば、Fabは、抗体分子をパパインで処理することにより、F(ab')2は、抗体分子をペプシンで処理することによりそれぞれ得ることができる。また、Fab'は、上記F(ab')2のヒンジ領域のジスルフィド結合を切断することで得ることができる。
scFvの場合は、抗体のH鎖V領域及びL鎖V領域をコードするcDNAを取得し、scFvをコードするDNAを構築する。このDNAを発現ベクターに挿入し、当該発現ベクターを宿主生物に導入して発現させることにより、scFvを製造することができる。
diabodyの場合は、抗体のH鎖V領域及びL鎖V領域をコードするcDNAを取得し、ペプチドリンカーのアミノ酸配列の長さが8残基以下となるようにscFvをコードするDNAを構築する。このDNAを発現ベクターに挿入し、当該発現ベクターを宿主生物に導入して発現させることにより、diabodyを製造することができる。
dsFvの場合は、抗体のH鎖V領域及びL鎖V領域をコードするcDNAを取得し、dsFvをコードするDNAを構築する。このDNAを発現ベクターに挿入し、当該発現ベクターを宿主生物に導入して発現させることにより、dsFvを製造することができる。
また、本発明の抗体断片の具体例としては、例えば、重鎖可変領域(VH)が、配列番号14で示されるアミノ酸配列を含むか若しくは該アミノ酸配列からなる重鎖CDR1(CDR-H1)、配列番号16で示されるアミノ酸配列を含むか若しくは該アミノ酸配列からなる重鎖CDR2(CDR-H2)及び/又は配列番号18で示されるアミノ酸配列を含むか若しくは該アミノ酸配列からなる重鎖CDR3(CDR-H3)を含み、かつ/又は軽鎖可変領域(VL)が、配列番号20で示されるアミノ酸配列を含むか若しくは該アミノ酸配列からなる軽鎖CDR1(CDR-L1)、グルタミン酸(E)-グリシン(G)-アスパラギン(N)からなるアミノ酸配列(アミノ酸配列Glu−Gly−Asn)を含むか若しくは該アミノ酸配列からなる軽鎖CDR2(CDR-L2)及び/又は配列番号22で示されるアミノ酸配列を含むか若しくは該アミノ酸配列からなる軽鎖CDR3(CDR-L3)を含む抗体断片が挙げられる。さらに、VHが配列番号24で示されるアミノ酸配列を含むか該アミノ酸配列からなり、かつ/又はVLが配列番号26で示されるアミノ酸配列を含むか該アミノ酸配列からなる抗体断片が挙げられるが、これらに限定されない。
VHのCDR1〜3をコードするDNAとしては、例えば、それぞれ配列番号13、15及び17で示される塩基配列を含むか該塩基配列からなるDNAが挙げられ、VLのCDR1〜3をコードするDNAとしては、例えば、それぞれ配列番号19で示される塩基配列を含むか該塩基配列からなるDNA、グアニン(G)-アデニン(A)-アデニン(A)-グアニン(G)-グアニン(G)-シトシン(C)-アデニン(A)-アデニン(A)-チミン(T)からなる塩基配列(「塩基配列GAAGGCAAT」とも称する)を含むか該塩基配列からなるDNA及び配列番号21で示される塩基配列を含むか該塩基配列からなるDNAが挙げられるが、これらに限定されない。
結合親和性は、結合定数(KA)及び解離定数(KD)により決定することができる。親和性平衡定数(K)はKA/KDの比で表される。その結合親和性は、以下のようにして検出することができる。
結合定数(KA)及び解離定数(KD)は、表面プラスモン共鳴(SPR)を用いて測定することができ、結合率をリアルタイムで検出し、さらにモニタリングする公知の機器及び方法を採用することができる(例えばBiacore(登録商標)-3000 (GE Healthcare社)、ProteON XPR36 (Bio-Rad社)など)。
本発明の抗VEGF抗体が結合する部位は、抗原であるVEGFの少なくとも一部の領域であればよく、限定されない。本発明の抗VEGF抗体が結合する部位としては、エクソン1、2、3、4、5、6a、6b、7a、7b、8aからなる群から選択される少なくとも1つの領域が挙げられるが、エクソン1〜5の領域が好ましい。当業者であれば、Genbank等の公知の情報に基づいて各種VEGFのエクソン1〜5の領域を特定することができる。例えば、マウス、ラット、イヌ、ヒトのVEGFのエクソン1〜5のアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号43、44、45及び46で示される。
本発明の抗VEGF抗体が結合する部位(領域、エピトープ等)又はこれを含むポリペプチドは、当業者であれば、本明細書の記載及びエピトープマッピングやX線構造解析などの公知の手法に基づいて特定することができる。
また、上記(i)〜(iii)のいずれかの抗体が結合する部位に結合する抗体は、ポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよく、モノクローナル抗体である場合は、遺伝子組換え抗体、例えば、キメラ抗体、ヒト型化抗体、イヌ型化抗体であってもよい。
抗体を用いた競合試験は、一組の抗体が同じ(又は重複する)部位に結合するかどうかを調べるための手法として抗体の技術分野において確立された手法である(Ju-Won Kwak et al., Journal of Immunological Methods 191 (1996) 49-54等を参照)。そして、競合試験において、本発明のVEGFに対する抗体が、試験対象の抗VEGF抗体により結合が競合阻害される場合には、当該試験対象の抗VEGF抗体は、本発明のVEGFに対する抗体が結合する部位に結合する抗体であると同定することができる。また、この試験方法においては、一組の抗体が同じ(又は重複する)部位に結合するかどうかを調べる上で、その部位がどのような構造であるかという情報を必要としない。
すなわち、本発明のVEGFに対する抗体が結合する部位に結合する抗体は、当業者であれば、本発明のVEGFに対する抗体を用いて競合試験を行うことにより、過度の実験を伴うことなく得ることができる。
本発明の医薬組成物は、上記「3.VEGFに対する抗体」に記載した抗体又はその断片を有効成分として含有し、対象疾患に対する医薬組成物である。本発明の医薬組成物は、対象疾患の予防又は治療に使用され、当該予防又は治療に有効である。
本発明の医薬組成物の対象となる疾患は、VEGFが関与する疾患(症状を含む)であれば限定されるものではなく、このような疾患としては、固形腫瘍、特に問題となる転移性腫瘍を含む癌、VEGF媒介性眼疾患が挙げられ、その他免疫性の疾患も対象となる。
本発明において、「予防」とは、疾患の発症前に本発明の医薬組成物等を被験者に接触させる(例えば、投与する)ことにより、接触させない場合に比べて、疾患の発症後の症状を軽減することを意味し、必ずしも発症を完全に抑制することを意味するものではない。
本発明においては、VEGFに対する抗体若しくはその断片又はこれを含む医薬組成物を被験者に投与することにより、癌又はVEGF媒介性眼疾患を治療又は予防することができる。すなわち、本発明は、治療上有効量の本発明の抗体若しくはその断片又はそれを含む医薬組成物を被験者に投与する工程を含む、癌又はVEGF媒介性眼疾患の治療又は予防方法を提供する。本発明の抗体若しくはその断片又はそれを含む医薬組成物の治療上の有効量は、被験者の年齢、体重、健康状態、性別、症状、投与経路、投与回数、剤型などの要因に応じて変化する。当業者であれば、癌又はVEGF媒介性眼疾患を治療、又は予防に必要な治療上の有効量を容易に決定することができる。本発明において、「被験者」には、癌又はVEGF媒介性眼疾患の治療又は予防を必要とする被験者が含まれる。また、「被験者」として治療又は予防の対象となる哺乳動物は、上記の通りである。
本発明の癌又はVEGF媒介性眼疾患の治療又は予防方法において、「癌」、「VEGF媒介性眼疾患」、「治療」及び「予防」についての説明は上記の通りである。また、本発明の抗体若しくはその断片又はそれを含む医薬組成物の剤形、投与経路、投与量、投与時期などの説明についても上記の通りである。
本発明の抗体は、VEGFとVEGF受容体との結合を阻害するため、当該結合によって生じる血管新生を阻害することができる。すなわち、本発明は、上記「3.VEGFに対する抗体」に記載された抗体又はその断片を有効成分として含む血管新生阻害剤を提供する。
本発明の血管新生阻害剤は、試薬として、あるいは哺乳動物の治療に用いることができ、その投与形態、添加物、投与経路、投与対象、投与量などは、上記「4.医薬組成物」の記載に準じて適宜選択することができる。ただし、本発明の血管新生阻害剤は、本発明の抗体又はその断片のみを含有するものであってもよい。
本発明の抗体又はその断片は、癌又はVEGF媒介性眼疾患の治療又は予防方法において、あるいは癌又はVEGF媒介性眼疾患を治療又は予防するための医薬の製造において、使用することができる。すなわち、本発明は、癌又はVEGF媒介性眼疾患の治療又は予防方法において使用するための、本発明の抗VEGF抗体又はその断片を提供する。また、本発明は、癌又はVEGF媒介性眼疾患を治療又は予防するための医薬の製造において使用するための、本発明の抗VEGF抗体又はその断片を提供する。さらに、本発明は、血管新生阻害剤の製造において使用するための、抗VEGF抗体又はその断片を提供する。
これらの態様における、「癌」、「VEGF媒介性眼疾患」、「治療」及び「予防」についての説明は上記の通りである。
本発明の医薬組成物は、他の抗癌剤の少なくとも1種と併用投与するために用いることができる。本発明に使用される抗癌剤としては、例えば、ソラフェニブ(ネクサバール(登録商標))、スニチニブ(スーテント(登録商標))、ベバシズマブ(アバスチン(登録商標))、シスプラチン(cDDP)、カルボプラチン(パラプラチン(登録商標))、パクリタキセル(タキソール(登録商標))、ドセタキセル(タキソテール(登録商標))、塩酸ゲムシタビン(ジェムザール(登録商標))、ゲフィチニブ(イレッサ(登録商標))、エルロチニブ(タルセバ(登録商標))、塩酸イリノテカン(CPT-11)、5-フルオロウラシル(5-FU)などが挙げられる。
本発明において「併用」とは、本発明の医薬組成物と前記抗癌剤の少なくとも1種とを、同時又は別々に投与することを意味する。「同時」とは、一つの投与スケジュールにおいて同一のタイミングで投与されることを意味し、投与の時分が完全に同一である必要はない。「別々」とは、一つの投与スケジュールにおいて異なるタイミングで投与されることを意味する。
本発明の併用療法に用いる医薬組成物等及び抗癌剤の投与形態、投与経路、投与対象は特に限定されず、上記「4.医薬組成物」の記載に準じて適宜選択することができる。また、併用する薬剤の投与形態又は投与量が互いに異なっていてもよく、その併用する組み合わせにより、適宜調整することができる。
本発明の医薬組成物を他の抗癌剤と併用する場合は、投与量を適宜減らすことも可能である。従って、本発明の医薬組成物と他の抗癌剤との組合せにおいては、
(i) 本発明の医薬組成物の有効量と、他の抗癌剤の有効量、
(ii) 本発明の医薬組成物の有効量と、他の抗癌剤の非有効量、
(iii) 本発明の医薬組成物の非有効量と、他の抗癌剤の有効量、及び
(iv) 本発明の医薬組成物の非有効量と、他の抗癌剤の非有効量
の組合せを採用することができる。
医薬組成物及び抗癌剤の一方又は両者が非有効量の使用態様であっても、併用により薬理効果を発揮することができる場合は、そのような態様により併用投与することができる。
本発明の抗体又はその断片は、VEGFの検出試薬又はキットに含めることができる。すなわち、本発明は、本発明の抗体又はその断片を含む試薬及びキットを提供する。本発明の試薬及びキットは、例えば、VEGFの検出用試薬又はキットとして使用することができる。
本発明の試薬及びキットにおいて、本発明の抗体又はその断片は、例えば凍結などの方法により扱いやすくした後、そのまま若しくは賦形剤、増量剤、結合剤、滑沢剤等公知の薬学的に許容される担体、公知の添加剤(緩衝剤、等張化剤、キレート剤、着色剤、保存剤、香料、風味剤、甘味剤等が含まれる)などと混合してもよい。
本発明のキットには、本発明の抗体又はその断片のほか、緩衝液、酵素液、二次抗体、希釈用溶液、使用説明書などを含めることもできる。
(1)抗原の調製
CHO細胞で発現させたヒト組換え体VEGF165(以下「VEGF」、「rhVEGF165」又は「rhVEGF」とも称する)(PROSPEC社)を抗原として用いた。VEGFによるマウスへの影響を抑制する目的で、KLH(Keyhole Limpet Hemocyanin)に結合させた抗原を準備した。この場合、VEGFとKLHとが、モル比で4:1となるようPBS(-)(0.01M sodium-phosphate buffer、0.138M NaCl、0.0027M KCl、pH 7.4)に混合した後、1%のグルタルアルデヒドを添加し、1時間、室温で反応させることにより、KLHとrhVEGF165とを架橋した。このように調製したタンパク質を、以下「KLH-VEGF」とも称する。
rhVEGF又はKLH-VEGFをフロイント完全アジュバントと等量混合し、BALB/cマウスの腹腔内に100μl(約40μg/マウス)投与した。約3週間後、同じくrhVEGFをフロイント不完全アジュバントと等量混合し、腹腔内に投与した。この作業を7回〜12回繰り返した後、抗体価の上昇を確認した。力価の上昇したマウスに対しては、最終免疫としてrhVEGFあるいはKLH-VEGFを約40μg静脈内に投与し、その3日後に脾臓を摘出した。
単離した脾細胞とマウス骨髄腫細胞株であるP3-x63-Ag8U.1(DSファーマバイオメディカル社)とを5:1の細胞数で混合し、50%ポリエチレングリコール3350(Sigma社)を用いて細胞融合を行った。細胞はHAT培地(1/2×HT(MP社)、1/2×HAT(MP社)、10%FBS、50ng/L mouseI L-6、500mg/mL D-Glucoseを添加したRPMI1640培地)に懸濁し、96穴のマイクロカルチャープレートに分注して培養した。
ハイブリドーマが増殖してきたウェルの培養上清を回収し、rhVEGF165に反応するモノクローナル抗体を産生しているハイブリドーマを選択した。rhVEGF165をPBS(-)で希釈し、96ウェルのELISAプレート(Nunc社)に1ウェル当たり1μgとなるよう分注して、4℃で一晩放置することでプレート表面に結合させた。次に、0.05%Tween 20を含むPBS(-)(以下、「PBS-T」と記載する)350μLで3回洗浄した後、1%スキムミルクを含むPBS-Tを300μLずつ各ウェルに分注し、1時間、室温でブロッキングした。PBS-Tで洗浄後、ハイブリドーマの培養上清をrhVEGF165を固相化したELISAプレートに分注し、1時間、室温で反応させた。PBS-Tで洗浄後、ペルオキシダーゼ(以下、「POD」と記載する)標識抗マウス免疫グロブリン抗体(BETHYL社製)を10000倍希釈したものを各ウェル100μL分注し、1時間、室温で反応させた。同様の洗浄を行った後、1 mg/mL PODとなるよう調製したPOD基質を加え、室温、5分間発色させた。1.5Nの硫酸で反応を停止した後、490nmの吸収をプレートリーダー(モレキュラーデバイス社)を用いて測定した。
rhVEGF165を固相化していないプレートにおける吸光度を基準として、吸光度が3倍以上であったウェルを陽性として、限界希釈法にてクローニングした。単一コロニーを含むウェルの細胞上清の抗体活性を上記(4)の方法で調べ、選択した後に、培養し、rhVEGF165に反応するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ株を樹立した。
(1)rhVEGF121と反応するモノクローナル抗体の選別
ヒト293細胞で発現させたrhVEGF(以下「rhVEGF121」とも称する)(HUMANZYME社)を用いて、実施例1の(4)記載の方法で、得られたハイブリドーマ細胞が産生するモノクローナル抗体の評価を行った。VEGF165とNRP1の結合ドメインは、エクソン7に相当するHeparin結合ドメインとエクソン8aに相当するC末端領域であることが知られている。VEGF121は、NRP1結合ドメインの1つである、Heparin結合ドメインを欠いている。一次配列を元に作製した模式図を図1に示した。VEGF121は、VEGFR1、VEGFR2結合ドメインを持ちつつ、NRP1結合ドメインの1つであるHeparin結合ドメインを持たないため、VEGF121に結合する抗体は、VEGF165のエクソン1、2、3、4、5もしくは8aに結合する。NRP1結合ドメインではない領域に結合するにもかかわらず、NRP1とVEGFとの結合を阻害する抗体を取得する目的で、得られたハイブリドーマ細胞が産生するモノクローナル抗体の中で、rhVEGF121に強く反応するクローンを選別した。
上記で選別されたハイブリドーマ細胞が産生するモノクローナル抗体に関して、VEGFとVEGFR1、VEGFR2及びNRP1との結合を阻害するか解析するために、当該ハイブリドーマ細胞が産生するモノクローナル抗体の精製を行った。ハイブリドーマ細胞を、10cm dish 1枚に90%コンフルエントとなるよう培養し、HT培地(Invitrogen社製)とEX CELL Sp2/0(ニチレイバイオサイエンス社製)とを1:1で混合した培地でさらに10日間培養を行った。培養上清を回収し、ProteinGカラムを用いて精製した。培養上清20mLに対し、0.1 mLのProtein Gカラム(GEヘルスケア社)を用いた。PBSで平衡化したProtein Gカラムに対し、培養液を1〜3 ml/minの流速で通過させた後、2 mLの洗浄バッファー(25mM Tris-HCl(pH7.4)、140 mM NaCl、10 mM KCl)で洗浄した。次に0.5 mLの溶出バッファー(0.1M Glycine (pH2.5))で抗体タンパク質を溶出させ、3M Tris-HCl(pH7.4)を用いてpH7.0〜7.4の間になるよう中和した。Amicon Ultra 30(Millipore社)を用いて抗体を濃縮するとともにバッファーをPBSに置換した。
上記実施例1の(2)で免疫したマウスから抗血清を回収し、抗VEGFポリクローナル抗体を含む分画の調製を行った。ジエチルエーテルを用いて免疫マウスに麻酔を行い、心臓から血液を回収した。回収された血液を12000 rpm、10分間、4℃で遠心分離を行い、血球を含まない上清を抗血清として回収した。この抗血清から、上記(2)と同様の方法でマウスIgG抗体を精製し、HRP Labeling Kit(DOJINDO社)を用いてHRP標識を行った(以下、HRP標識されたポリクローナル抗体を、「抗VEGFポリクローナル抗体−HRP標識」とも称する)。
実施例1で得られたハイブリドーマ細胞が産生するモノクローナル抗体に関して、VEGFとNRP1との結合を阻害するか解析を実施した。Recombinant Human Neuropilin-1(R&D Systems社)(以下「NRP1」とも称する)を、PBS(-)で希釈したのち、96ウェルのELISAプレートに1ウェルあたり0.5μgずつ添加し、室温で2時間静置することで、プレート表面上に固相化させた。次に、0.1% Tween 20を含むTBS(50 mM Tris-HCl, pH7.4, 500 mM NaCl)(以下「TBS-T」とも称する)を用いて洗浄した後、2% Bovine Serum Albumin(以下「BSA」とも称する)含有TBS-Tを1ウェルあたり300 μLずつ添加し、室温で1時間静置することにより、ブロッキングした。これとは別に、10 μg/mLとなるようPBS(-)に希釈したRecombinant Human Vascular Endothelial Growth Factor, CHO(Prospec社)(以下「rhVEGF」とも称する)及び34.1 μg/mLとなるようPBS(-)に希釈したモノクローナル抗体(実施例1で得られたハイブリドーマ細胞が産生するモノクローナル抗体)を、各々100 μLずつ混合し、37℃で1時間反応させた。この溶液をNRP1-Fcが固相化されたプレートに添加し、室温で1時間反応させた後、TBS-Tで洗浄した。別のモノクローナル抗体(クローン番号KLHa1527)を、1%BSA含有TBS-Tを用いて、5 μg/mLの濃度に希釈し、1ウェルあたり100 μLずつ添加し、室温で1時間反応させた。TBS-Tで洗浄後、1%BSA含有TBS-Tを用いて5000倍に希釈したペルオキシダーゼ標識抗マウスIgG抗体(Bethyl社)を、1ウェルあたり100μLずつ添加し、室温で30分間反応させた。TBS-Tで洗浄後、TMB ELISA Substrates(Invitrogen社)を用いてシグナルを検出した。マウスIgGアイソタイプコントロール(BD社)を用いた吸光度を100%として、モノクローナル抗体の添加による阻害効果を評価した。なお、上記クローン番号KLHa1527は、VEGFと受容体との結合を阻害しないと考えられるため、受容体に結合したVEGFを定量するために用いた。
その結果、VEGFとNRP1との結合を阻害する複数の抗VEGF抗体を得ることができた(図2)。その中でも特にクローン番号KLHc161のモノクローナル抗体は、VEGFとNRP1との結合を著しく阻害した。
すなわち、本実施例において、VEGFとNRP1との結合を阻害する抗VEGF抗体を得ることができた。
また、VEGFとNRP1との結合は癌幹細胞の幹細胞性を制御していると考えられており(Nature, 478, 399-403, 2011)、またNRP1は癌細胞の増殖にも関与していると考えられていることから、VEGFとNRP1との結合を阻害する本発明の抗体は癌の治療又は予防に有用である。
実施例1で得られたハイブリドーマ細胞が産生するモノクローナル抗体に関して、VEGFとVEGFR2との結合を阻害するか解析を実施した。Recombinant Human VEGF R2/KDR/Flk-1 Fc Chimera (R&D Systems社)(以下「VEGFR2-Fc」とも称する)を、PBS(-)で希釈したのち、96ウェルのELISAプレートに、1ウェルあたり0.5μgずつ添加し、室温で2時間静置することで、プレート表面上に固相化させた。次に、0.1% Tween 20を含むTBS(50 mM Tris-HCl, pH7.4, 500 mM NaCl)(以下「TBS-T」とも称する)を用いて洗浄した後、1%Bovine Serum Albumin(以下「BSA」とも称する)含有TBS-Tを1ウェルあたり300μLずつ添加し、室温で1時間静置することにより、ブロッキングした。これとは別に、5μg/mLとなるようPBS(-)に希釈したRecombinant Human Vascular Endothelial Growth Factor, CHO(Prospec社)(以下「rhVEGF」とも称する)、及び80 μg/mLとなるようPBS(-)に希釈したモノクローナル抗体(実施例1で得られたハイブリドーマ細胞が産生するモノクローナル抗体)を、各々100 μLずつ混合し、37℃で1時間反応させた。この溶液をVEGFR2-Fcが固相化されたプレートに添加し、室温で1時間反応させた後、TBS-Tで洗浄した。Anti-VEGF antibody(HRP)(abcam社)を、1%BSA含有TBS-Tを用いて200倍に希釈し、1ウェルあたり100 μLずつ添加し、室温で1時間反応させた。TBS-Tで洗浄後、TMB ELISA Substrates(Invitrogen社)を用いてシグナルを検出した。マウスIgGアイソタイプコントロール(BD社)を用いた吸光度を100%として、モノクローナル抗体の添加による阻害効果を評価した。
その結果、VEGFとVEGFR2との結合を阻害する複数の抗VEGF抗体を得ることができた(図3)。また、これらの抗VEGF抗体にはVEGFとNRP1との結合を阻害する抗体(例えばクローン番号KLHc161)も含まれることから、この結果は、VEGFとNRP1との結合を阻害し、かつVEGFとVEGFR2との結合も阻害する抗体が得られたことを示す。
すなわち、本実施例において、VEGFとNRP1及びVEGFR2との結合を阻害する抗VEGF抗体を得ることができた。
実施例1で得られたハイブリドーマ細胞が産生するモノクローナル抗体に関して、VEGFとVEGFR1との結合を阻害するか解析を実施した。Recombinant Human VEGF R1/Flt-1 Fc Chimera (R&D Systems社)(以下「VEGFR1-Fc」とも称する)を、PBS(-)で希釈したのち、96ウェルのELISAプレートに、1ウェルあたり0.3 μgずつ添加し、室温で3時間静置することで、プレート表面上に固相化させた。次に、0.1%Tween 20を含むTBS(50 mM Tris-HCl, pH7.4, 500 mM NaCl)(以下「TBS-T」とも称する)を用いて洗浄した後、1%Bovine SerumAlbumin(以下「BSA」とも称する)含有TBS-Tを1ウェルあたり300 μLずつ添加し、室温で1時間静置することにより、ブロッキングした。これとは別に、1 μg/mLとなるようPBS(-)に希釈したRecombinant Human Vascular Endothelial Growth Factor, CHO(Prospec社)(以下「rhVEGF」とも称する)及び5 μg/mLとなるようPBS(-)に希釈したモノクローナル抗体(実施例1で得られたハイブリドーマ細胞が産生するモノクローナル抗体)を、各々100 μLずつ混合し、37℃で1時間反応させた。この溶液をVEGFR1-Fcが固相化されたプレートに添加し、室温で1時間反応させた後、TBS-Tで洗浄した。Anti-VEGF antibody(HRP)(abcam社)を、1%BSA含有TBS-Tを用いて200倍に希釈し、1ウェルあたり100 μLずつ添加し、室温で1時間反応させた。TBS-Tで洗浄後、TMB ELISA Substrates(Invitrogen社)を用いてシグナルを検出した。マウスIgGアイソタイプコントロール(BD社)を用いた吸光度を100%として、モノクローナル抗体の添加による阻害効果を評価した。
その結果、VEGFとVEGFR1との結合を阻害する複数の抗VEGF抗体を得ることができた(図4)。また、これらの抗VEGF抗体には、VEGFとNRP1及びVEGFR2との結合を阻害する抗体(例えばクローン番号KLHc161)も含まれることから、この結果は、VEGFとNRP1との結合、VEGFとVEGFR2との結合及びVEGFとVEGFR1との結合を阻害する抗体が得られたことを示す。
すなわち、本実施例において、VEGFとNRP1及びVEGFR1との結合を阻害する抗VEGF抗体、並びにVEGFとNRP1、VEGFR2及びVEGFR1との結合を阻害する抗VEGF抗体を得ることができた。
取得した抗VEGF抗体からクローン番号KLHc161のモノクローナル抗体を選択し、この抗体が、正常ヒト臍帯静脈由来内皮細胞(以下「HUVEC」とも称する)に対するVEGFの作用を阻害するか解析を行った。HUVEC(BD社)を付属の増殖培地を用いて解凍、培養することで、対数増殖期のHUVECを準備した。試験に用いたHUVECは、継代回数が8回を超えない範囲で使用した。1%Fetal Bovine Serum及び1%ペニシリン-ストレプトマイシン(Invitrogen社)を含むMedium 200(Invitrogen社)を用いて、12ウェルプレートに5000個ずつ細胞を播種し、Recombinant Human Vascular Endothelial Growth Factor, CHO(Prospec社)(以下「rhVEGF」とも称する)を、50 ng/mLの濃度で添加し、培養を継続した。評価に際しては、培養開始と同時に、rhVEGFを50 ng/mLの濃度で添加した細胞群、又は、50 ng/mLの濃度でrhVEGFを含むと同時に2500 ng/mLの濃度で該抗体を添加した細胞群において、rhVEGFを添加後、2、4、6、8日目の細胞数を、血球計算盤を用いて測定した。
結果を図5に示す。該抗体を2500 ng/mLの濃度で添加した細胞群では、rhVEGF及びマウスIgGアイソタイプコントロール(BD社)を添加した陽性対照と比較して、細胞数が少ないことから、該抗体による細胞増殖阻害(抑制)効果が認められた。
結果を図6に示す。本発明の抗体を2500 ng/mLの濃度で添加した細胞群では、rhVEGF及びマウスIgGアイソタイプコントロール(BD社)を添加した陽性対照と比較して、細胞数が少ないことから、該抗体による細胞増殖阻害効果が認められた。
これらの結果から、本発明の抗体は、細胞増殖阻害効果を有することが示された。
ヒト大腸癌細胞株LS174T細胞を、20匹の免疫不全マウスに、マウスあたり2X106細胞の割合で、右側腹部に皮下注射した。注射翌日に、0.9%NaCl(対照群A)又は抗VEGF抗体(クローン番号KLHc161;対照群B)のいずれかを腹腔内に投与した。対照群Bのマウスには、抗VEGF抗体を、0.5 mg/Kg、2.5 mg/Kg、あるいは5 mg/Kgにて、週2回投与した。また、抗体と同様に、対照群Aのマウスには、0.9%NaClを週に2回投与した。細胞接種後、1、5、9、16及び20日目に、腫瘍を測定し、腫瘍量(Tumor Volume)を、式:V(mm3) = d2X D/2を用いて算出した。
結果を図7に示す。図7においては、A群(0.9%NaCl対照)を(◇)で示し、B群(抗VEGF抗体を接種したマウス)を、(□:0.5 mg/Kg)、(△:2.5 mg/Kg)、(○:5.0 mg/Kg)のいずれかで示した。図7に示されるように、腫瘍量の減少が、抗VEGF抗体を接種したマウスで観察された。
これらの結果から、本発明の抗VEGF抗体は、in vivoにおいても腫瘍の増殖を阻害(抑制)することが示された。また、このことから、本発明の抗体を含む医薬組成物は癌の治療又は予防に非常に有効であることが示された。
本実施例では、本発明の抗体のVEGF媒介性眼疾患に対する効果をin vivoで検討するため、滲出型加齢黄斑変性(wAMD)モデルであるマウス・レーザー誘発脈絡膜血管新生(CNV)モデルを用いて試験を行った。マウス・レーザー誘発脈絡膜血管新生(CNV)モデルは、脈絡膜にレーザー光凝固を行うことにより炎症を惹起し、脈絡膜から血管新生を誘導することにより作製することができる。
(1)抗体
本実施例では、実施例1において作製された抗VEGF抗体を用いた。具体的には、VEGFとNRP1及びVEGFR2との結合を阻害する抗体としてKLHc161を用いた。
(2)滲出型加齢黄斑変性(wAMD)モデルの作製
滲出型加齢黄斑変性(wAMD)モデルであるマウス・レーザー誘発脈絡膜血管新生(CNV)モデルは、8週齢雄C57BL/6Jマウスの眼底後極部において、散在性に太い網膜血管を避けて、4スポット(スポットサイズ50 μm、出力60 mW、凝固時間0.l秒)の光凝固を行うことにより作製した。
(3)群構成
群構成を下記の表に示す。下記表においてPBSは陰性対照である。
(4)薬物投与(硝子体内投与)
硝子体内投与における抗体を含む組成物の投与量は5μl/eyeであり、投与回数は1回である。
(5)試験スケジュール
試験スケジュールを図8に示す。
(6)評価方法
光凝固14日後に両眼の蛍光眼底造影を行い、光凝固部位の蛍光色素漏出面積を測定することにより、脈絡膜新生血管(CNV)面積を求めた。
上記CNVモデルにKLHc161を投与した結果、0.3μg/eye投与群において、CNV面積が有意に抑制された(図9)。図9において、#: PBS投与群に対しp<0.05 (Dunnett's multiple comparison test)。
この結果から、本発明の抗体は、in vivoにおいても、血管新生阻害剤として有効であり、また、加齢黄斑変性等のVEGF媒介性眼疾患にも有効であることが示された。
本発明の抗体の可変領域のアミノ酸配列及びこれをコードするヌクレオチド配列について解析を行った。
具体的には、抗VEGF抗体(クローン番号KLHc161)を産生するハイブリドーマの重鎖の可変領域のゲノム配列を、以下のプライマーをそれぞれ用いて配列決定により解析した。
5’-CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3’(センスプライマー) (配列番号27)
5’-CCAGGGGCCAGTGGATAGACCGATGGGGCTGTTG-3’(アンチセンスプライマー) (配列番号28)
及び
5’-CTAATACGACTCACTATAGGGC-3’(センスプライマー) (配列番号29)
5’-CCAGGGGCCAGTGGATAGACCGATGGGGCTGTTG-3’(アンチセンスプライマー) (配列番号30)
また、該抗体を産生するハイブリドーマの軽鎖の可変領域のゲノム配列を、以下のプライマーをそれぞれ用いて配列決定により解析した。
5’-CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3’(センスプライマー) (配列番号31)
5’-GCACCTCCAGATGTTAACTGCTCACT-3’(アンチセンスプライマー) (配列番号32)
及び
5’-CTAATACGACTCACTATAGGGC-3’(センスプライマー) (配列番号33)
5’-GCACCTCCAGATGTTAACTGCTCACT-3’(アンチセンスプライマー) (配列番号34)
その結果を下記の表に示す。
KLHc161抗体を産生するハイブリドーマから、KLHc161抗体の重鎖可変領域遺伝子(塩基配列: 配列番号23、アミノ酸配列: 配列番号24) 及び軽鎖可変領域遺伝子(塩基配列: 配列番号25、アミノ酸配列: 配列番号26)をクローニングした。次に、これらの遺伝子をそれぞれヒトIgG1の重鎖定常領域遺伝子、あるいは軽鎖(κ鎖)定常領域遺伝子の塩基配列にインフレームで連結した。重鎖可変領域の5’末端塩基配列と制限酵素MluI配列を有するプライマー及び3’末端塩基配列の相補配列と制限酵素NheI配列を有するアンチセンスプライマーを用いてPCRを実施した。次に、軽鎖可変領域遺伝子の5’末端塩基配列とコザック配列と制限酵素BamHI配列とを有するプライマー及び3’末端塩基配列の相補配列と制限酵素BsiWI配列とを有するアンチセンスプライマーを用いてPCRを実施した。得られた増幅産物を制限酵素MluI及びNheI又はBamHI及びBsiWIで処理し、ヒトIgG1重鎖定常領域発現プラスミド(pEF6/G1)のMluI-NheIサイト、あるいはヒトIgG1軽鎖定常領域発現プラスミド(pEF1/G1k)のBamHI-BsiWIサイトに組み込んだ。pEF6/G1は、プラスミドpEF6/myc-His(インビトロジェン社)にヒトIgG1の重鎖定常領域遺伝子(塩基配列: 配列番号35、アミノ酸配列: 配列番号36)が、またpEF1/G1-kには、プラスミドpEF1/myc-His(インビトロジェン社)にヒトIgG1の軽鎖定常領域遺伝子(塩基配列: 配列番号37、アミノ酸配列: 配列番号38)がクローニングされている。制限酵素NheIによりマウス重鎖可変領域とヒト重鎖定常領域が連結され、制限酵素BsiWI配列によりマウス軽鎖可変領域とヒト軽鎖定常領域が連結された。
すなわち、本実施例において、本発明の抗VEGF抗体のキメラ抗体を得ることができた。
ヒト大腸癌細胞株LS174T細胞を、20匹の免疫不全マウスに、マウスあたり2x106細胞の割合で、右側腹部に皮下注射した。注射翌日に、0.9%NaCl(対照群A)又はKLHc161HC抗体(対照群B)のいずれかを腹腔内に投与した。対照群Bのマウスには、KLHc161HC抗体を、0.5 mg/Kg、2.5 mg/Kg、あるいは5 mg/Kgにて、週2回投与した。また、抗体と同様に、対照群Aのマウスには、0.9%NaClを週に2回投与した。細胞接種後、1、5、8、12、15、19及び22日目に、腫瘍径を測定し、腫瘍量(Tumor Volume)を、式:V(mm3) = (d: 短径)2 x (D: 長径)/2を用いて算出した。結果を図10に示す。図10においては、A群(0.9%NaCl対照)を(◇)で示し、B群KLHc161HC抗体を接種したマウス)を、(□:0.5 mg/Kg)、(△:2.5 mg/Kg)、(○:5.0 mg/Kg)のいずれかで示した。図10に示されるように、腫瘍量の著しい減少が、KLHc161HC抗体を接種したマウスで観察された。これらの結果から、本発明のキメラ抗体であるKLHc161HC抗体は、in vivoにおいても腫瘍の増殖を阻害(抑制)することが示された。
このことから、本発明のヒトIgG1キメラ抗VEGF抗体を含む医薬組成物は癌の治療又は予防に非常に有効であることが示された。
KLHc161抗体を産生するハイブリドーマから、KLHc161抗体の重鎖可変領域遺伝子(塩基配列: 配列番号23、アミノ酸配列: 配列番号24)及び軽鎖可変領域遺伝子(塩基配列: 配列番号25、アミノ酸配列: 配列番号26)をクローニングした。次に、これらの遺伝子をそれぞれイヌIgGBの重鎖定常領域遺伝子、あるいは軽鎖(κ鎖)定常領域遺伝子の塩基配列にインフレームで連結した。重鎖可変領域の5’末端塩基配列とコザック配列と制限酵素EcoRV配列を有するプライマー、及び3’末端塩基配列の相補配列と制限酵素NheI配列を有するアンチセンスプライマーを用いてPCRを実施した。次に、軽鎖可変領域遺伝子の5’末端塩基配列と制限酵素EcoRI配列を有するプライマー、及び3’末端塩基配列の相補配列と制限酵素XhoI配列を有するアンチセンスプライマーを用いてPCRを実施した。得られた増幅産物を制限酵素EcoVびNheI、又はEcoRI及びXhoIで処理し、イヌIgGB重鎖定常領域発現プラスミド(pFUSE2ss-CHIg-dGB)のEcoRV-NheIサイト、あるいはイヌIg軽鎖定常領域発現プラスミド(pFUSE2ss-CHIg-dK)のEcoRI-XhoIサイトに組み込んだ。pFUSE2ss-CHIg-dGBは、プラスミドpFUSE2ss-CLIg-hl2(インビボジェン社)にイヌIgGBの重鎖定常領域遺伝子(塩基配列: 配列番号39、アミノ酸配列: 配列番号40)が、またpFUSE2ss-CHIg-dKには、プラスミドpFUSE2ss-CLIg-hl2にイヌIgの軽鎖(κ鎖)定常領域遺伝子(塩基配列: 配列番号41、アミノ酸配列: 配列番号42)がクローニングされている。制限酵素NheIによりマウス重鎖可変領域とイヌ重鎖定常領域が連結され、制限酵素XhoI配列によりマウス軽鎖可変領域とイヌ軽鎖定常領域が連結された。
作製したイヌ-IgGBキメラ抗体が、ヒトVEGF165及びイヌVEGFA(VEGF164)への結合能を有しているか、ELISAで確認した。ヒトVEGF165もしくはイヌVEGFAをTBSで希釈し、96ウェルのELISAプレート(Nunc社)に1ウェル当たり20 ngとなるよう分注して、37℃で1時間インキュベートすることでプレート表面に結合させた。次に、0.02%Tween 20を含むPBS(-)(以下、「PBS-T」と記載する)300μLで3回洗浄した後、3%スキムミルクを含むPBS(-)を300μLずつ各ウェルに分注し、37℃で1時間、ブロッキングした。PBS-Tで洗浄後、1μg/mlの濃度から段階希釈したイヌ-IgGBキメラKLHc161抗体(KLHc161CC抗体)をVEGFが固相化されたELISAプレートに分注し、37℃で1時間反応させた。PBS-Tで洗浄後、100 ng/mlに調製したペルオキシダーゼ標識抗イヌ免疫グロブリン抗体(BETHYL社製)を各ウェル100μL分注し、37℃で1時間反応させた。同様の洗浄を行った後、TMB Single Solutionを加え、室温で発色させた。1Nの硫酸で反応を停止した後、450nmの吸収をプレートリーダー(モレキュラーデバイス社)を用いて測定した。結果を図11に示す。KLHc161CC抗体は、イヌVEGFAに対してヒトVEGF165と同程度の親和性で結合することが示された。
このことから、本発明のイヌIgGBキメラ抗VEGF抗体を含む医薬組成物は、イヌにおける疾患の治療又は予防に用いることができることが示された。
ヒト大腸癌細胞株LS174T細胞を、20匹の免疫不全マウスに、マウスあたり2 x 106細胞の割合で、右側腹部に皮下注射した。注射翌日に、0.9% NaCl(対照群A)又はKLHc161CC抗体(対照群B)のいずれかを腹腔内に投与した。対照群Bのマウスには、KLHc161CC抗体を、0.5 mg/Kg、2.5 mg/Kg、あるいは5 mg/Kgにて、週2回投与した。また、抗体と同様に、対照群Aのマウスには、0.9%NaClを週に2回投与した。細胞接種後、5、8、12、15、19及び22日目に、腫瘍径を測定し、腫瘍量(Tumor Volume)を、式:V(mm3) = (d: 短径)2 x (D: 長径)/2を用いて算出した。結果を図12に示す。図12においては、A群(0.9%NaCl対照)を(■)で示し、B群(抗VEGF抗体を接種したマウス)を、(●:0.5 mg/Kg)、(▲:2.5 mg/Kg)、(△:5.0 mg/Kg)のいずれかで示した。図12に示されるように、腫瘍量の著しい減少が、KLHc161CC抗体を接種したマウスで観察された。
これらの結果から、本発明のKLHc161CC抗体は、in vivoにおいてもヒトの腫瘍の増殖を阻害(抑制)することが示された。また、このことから、本発明のイヌIgGBキメラ抗VEGF抗体を含む医薬組成物は、癌の治療又は予防に非常に有効であることが示された。
イヌ骨肉腫細胞株D-17細胞を、20匹の免疫不全マウスに、マウスあたり1 x 107細胞の割合で、右側腹部に皮下注射した。平均腫瘍量が150 mm3に達してから、0.9%NaCl(対照群A)又はKLHc161CC抗体(対照群B)のいずれかを腹腔内に投与した。対照群Bのマウスには、KLHc161CC抗体を、0.5 mg/Kg、2.5 mg/Kg、あるいは5 mg/Kgにて、週2回投与した。また、抗体と同様に、対照群Aのマウスには、0.9% NaClを週に2回投与した。細胞接種後、50、54、57、61、64、67、70、74、77及び81日目に、腫瘍径を測定し、腫瘍量(Tumor Volume)を、式:V(mm3) = (d: 短径)2 x (D: 長径)/2を用いて算出した。結果を図13に示す。図13においては、A群(0.9% NaCl対照)を(■)で示し、B群(抗VEGF抗体を接種したマウス)を、(●:0.5 mg/Kg)、(▲:2.5 mg/Kg)、(△:5.0 mg/Kg)のいずれかで示した。図13に示されるように、腫瘍量の著しい減少が、KLHc161CC抗体を接種したマウスで観察された。これらの結果から、本発明のKLHc161CC抗体は、in vivoにおいてもイヌの腫瘍の増殖を阻害(抑制)することが示された。また、このことから、本発明のイヌIgGBキメラ抗VEGF抗体を含む医薬組成物は、イヌの癌の治療又は予防に非常に有効であることが示された。
VEGFにおける本発明の抗体との結合部位を調べるため、下記の通り、ELISA法に基づく結合実験を行った。
本実施例において、抗VEGF抗体としては、実施例7で得られたヒト-IgG1キメラ抗体のうち、VEGFとNRP1との結合を阻害する抗VEGF抗体であるKLHc161HCを含む3つの抗VEGF抗体を選択して用いた。
また、VEGFとしては、(i) NRP1との2つの結合領域のうちの一つ(VEGFのC末端領域であるエクソン8a)を含むVEGF165、(ii) NRP1との2つの結合領域のうちの一つ(ヘパリン結合領域)を欠いたVEGF121、(iii) VEGF165におけるNRP1との結合領域とは異なるアミノ酸配列(エクソン8b)を有するVEGF165b、の3つタイプのVEGFを用いた。
結合実験は、具体的には下記のように実施した。
ヒトVEGF165 (エクソン1、2、3、4、5、7と8aからなる)ヒトVEGF165b (エクソン1、2、3、4、5、7と8bからなる)もしくはヒトVEGF121(エクソン1、2、3、4、5と8aからなる)をTBSで希釈し、96ウェルのELISAプレート(Nunc社)に1ウェル当たり20 ngとなるよう分注して、37℃で1時間インキュベートすることでプレート表面に結合させた。次に、0.02%Tween 20を含むPBS(-)(以下、「PBS-T」と記載する)300μLで3回洗浄した後、3%スキムミルクを含むPBS(-)を300μLずつ各ウェルに分注し、37℃で1時間、ブロッキングした。PBS-Tで洗浄後、1 ug/mlの濃度から段階希釈したKLHc161HC抗体をVEGFが固相化されたELISAプレートに分注し、37℃で1時間反応させた。PBS-Tで洗浄後、100 ng/mlに調製したペルオキシダーゼ標識抗ヒト免疫グロブリン抗体(BETHYL社製)を各ウェル100μL分注し、37℃で1時間反応させた。同様の洗浄を行った後、TMB Single Solutionを加え、室温で発色させた。1Nの硫酸で反応を停止した後、450nmの吸収をプレートリーダー(モレキュラーデバイス社)を用いて測定した。
その結果、本発明のVEGFとNRP1との結合を阻害する抗VEGF抗体であるKLHc161HCを含む3つの抗VEGF抗体のいずれもが、上記VEGF165、VEGF121及びVEGF165bの全てに結合した(図14)。
この結果は、本発明の抗体が、NRP1との結合領域として知られているVEGFのC末端側の2つの領域とは全く異なる、VEGFのN末端側であるエクソン1〜5の領域に結合することを示す。
また、この結果は、驚くべきことに、本発明の抗体が、VEGFのNRP1の結合領域として知られていないエクソン1〜5の領域に結合するにもかかわらず、VEGFとNRP1との結合を阻害することを示す。
配列番号14:合成ペプチド
配列番号15:合成DNA
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配列番号40:合成ペプチド
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配列番号42:合成ペプチド
配列番号43〜46:合成ペプチド
Claims (34)
- 血管内皮増殖因子(VEGF)とニューロピリン−1(NRP1)との結合を阻害する、VEGFに対する抗体。
- 血管内皮増殖因子(VEGF)とニューロピリン−1(NRP1)及び血管内皮増殖因子受容体−2(VEGFR2)との結合を阻害する、VEGFに対する抗体。
- 血管内皮増殖因子(VEGF)とニューロピリン−1(NRP1)及び血管内皮増殖因子受容体−1(VEGFR1)との結合を阻害する、VEGFに対する抗体。
- 血管内皮増殖因子(VEGF)と、ニューロピリン−1(NRP1)、血管内皮増殖因子受容体−2(VEGFR2)及び血管内皮増殖因子受容体−1(VEGFR1)との結合を阻害する、VEGFに対する抗体。
- 抗体がモノクローナル抗体である請求項1〜4のいずれか1項に記載の抗体。
- 請求項1〜5のいずれか1項に記載の抗体が結合する部位に結合する抗体。
- 抗体がキメラ抗体、ヒト型化抗体又はイヌ型化抗体である、請求項5又は6に記載の抗体。
- 配列番号14のアミノ酸配列を含むCDR-H1、配列番号16のアミノ酸配列を含むCDR-H2及び配列番号18のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含む、請求項1〜7のいずれか1項に記載の抗体。
- 配列番号20のアミノ酸配列を含むCDR-L1、アミノ酸配列Glu−Gly−Asnを含むCDR-L2及び配列番号22のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含む、請求項1〜7のいずれか1項に記載の抗体。
- 配列番号14のアミノ酸配列を含むCDR-H1、配列番号16のアミノ酸配列を含むCDR-H2及び配列番号18のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含み、かつ、
配列番号20のアミノ酸配列を含むCDR-L1、アミノ酸配列Glu−Gly−Asnを含むCDR-L2及び配列番号22のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含む、請求項1〜7のいずれか1項に記載の抗体。 - さらにヒトIgG1重鎖定常領域に由来するアミノ酸配列及びヒトIgG1軽鎖定常領域に由来するアミノ酸配列を含む、請求項10に記載の抗体。
- ヒトIgG1重鎖定常領域に由来するアミノ酸配列が配列番号36のアミノ酸配列を含むものであり、かつ、ヒトIgG1軽鎖定常領域に由来するアミノ酸配列が配列番号38のアミノ酸配列を含むものである、請求項11に記載の抗体。
- 配列番号24のアミノ酸配列及び配列番号36のアミノ酸配列を含む重鎖並びに
配列番号26のアミノ酸配列及び配列番号38のアミノ酸配列を含む軽鎖
を含む、請求項12に記載の抗体。 - さらにイヌIgGB重鎖定常領域に由来するアミノ酸配列及びイヌIg軽鎖(κ鎖)定常領域に由来するアミノ酸配列を含む請求項10に記載の抗体。
- イヌIgGB重鎖定常領域に由来するアミノ酸配列が配列番号40のアミノ酸配列を含むものであり、かつ、イヌIg軽鎖(κ鎖)定常領域に由来するアミノ酸配列が配列番号42のアミノ酸配列を含むものである、請求項14に記載の抗体。
- 配列番号24のアミノ酸配列及び配列番号40のアミノ酸配列を含む重鎖並びに
配列番号26のアミノ酸配列及び配列番号42のアミノ酸配列を含む軽鎖
を含む、請求項15に記載の抗体。 - 請求項1〜16のいずれか1項に記載の抗体の断片。
- 断片が抗原結合断片である請求項17に記載の断片。
- 抗原結合断片が単鎖抗体又は二本鎖抗体である、請求項18に記載の断片。
- 請求項5に記載のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ。
- 請求項1〜19のいずれか1項に記載の抗体又はその断片を含む医薬組成物。
- 癌又はVEGF媒介性眼疾患の治療又は予防に使用するための、請求項21に記載の医薬組成物。
- 癌又はVEGF媒介性眼疾患の治療又は予防が、血管内皮増殖因子(VEGF)とニューロピリン−1(NRP1)との結合の阻害によるものである、請求項22に記載の医薬組成物。
- 癌又はVEGF媒介性眼疾患の治療又は予防が血管新生又は血管透過性亢進の阻害によるものである、請求項22に記載の医薬組成物。
- 血管新生が病的な血管新生である、請求項24に記載の医薬組成物。
- 癌が固形癌又は血液腫瘍である、請求項22に記載の医薬組成物。
- 癌が、脳腫瘍、頚癌、食道癌、舌癌、肺癌、乳癌、膵癌、胃癌、小腸の癌、十二指腸癌、大腸癌、膀胱癌、腎癌、肝癌、前立腺癌、子宮癌、子宮頸癌、卵巣癌、甲状腺癌、胆嚢癌、咽頭癌、肉腫、メラノーマ、白血病、リンパ腫及び多発性骨髄腫からなる群から選ばれる少なくとも1種である、請求項22に記載の医薬組成物。
- VEGF媒介性眼疾患が、加齢黄斑変性、糖尿病網膜症、糖尿病黄斑浮腫、血管新生緑内障、網膜静脈閉塞症、未熟児網膜症、病的近視に伴う脈絡膜血管新生、翼状片、ルベオーシス、パンヌス、粘膜皮膚眼症候群及び眼における移植組織の免疫拒絶からなる群から選ばれる少なくとも1種である、請求項22に記載の医薬組成物。
- 請求項1〜19のいずれか1項に記載の抗体又はその断片を含む、血管新生阻害剤。
- 請求項1〜19のいずれか1項に記載の抗体又はその断片を含む、試薬。
- 請求項1〜19のいずれか1項に記載の抗体又はその断片を含む、キット。
- 治療上有効量の請求項1〜19のいずれか1項に記載の抗体又はその断片を被験者に投与する工程を含む、癌又はVEGF媒介性眼科疾患の治療又は予防方法。
- 癌又はVEGF媒介性眼疾患の治療又は予防方法において使用するための、請求項1〜19のいずれか1項に記載の抗体又はその断片。
- 癌又はVEGF媒介性眼疾患を治療又は予防するための医薬の製造において使用するための、請求項1〜19のいずれか1項に記載の抗体又はその断片。
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