KR20080068105A - 뉴로필린 길항제 - Google Patents

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Abstract

본원에는 독특한 구조적 및 기능적 특징을 지닌 신규한 항-NRP1 항체 및 그의 변이체가 기재되어 있다. 또한, 조사, 진단 및 치료적 적용에 있어서의 상기 항체의 용도가 제공된다.
뉴로필린 (NRP) 길항제, 항-NRP1 항체, 혈관형성 관련 장애, 암, 항-VEGF 항체와의 병용 요법

Description

뉴로필린 길항제 {Neuropilin Antagonists}
본 출원은 2005년 11월 8일자로 출원된 미국 가특허원 제60/734,798호 및 2006년 7월 27일자로 출원된 미국 가특허원 제60/820,561호에 대해 35 USC 119(e) 하에 우선권을 청구하고 있고, 그 전문이 본원에 참고로 도입된 비-가출원이다.
본 발명은 일반적으로, 뉴로필린 (NRP) 활성과 연관된 조성물 및 방법에 관한 것이다. 보다 특히, 본 발명은 뉴로필린-1 (NRP1) 수용체에 의해 매개된 혈관 형성과 유지를 조정하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 본 발명은 추가로, 혈관형성 (angiogenesis)과 연관된 질환 및 질병을 예방 또는 치료하는데 치료적으로 유용한 물질을 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.
수 많은 생리적 과정과 병리적 과정을 위해 기본적으로 요구되는 것은 혈관계의 발생이다. 활동적으로 성장하는 조직, 예를 들어 배아 및 종양에는 적절한 혈액이 공급되어야 한다. 이들 조직은 일반적으로 혈관형성으로서 지칭되는 과정을 통하여 새로운 혈관 형성과 유지를 증진시켜 주는 프로-혈관형성 인자를 생성시킴으로써 이러한 요구를 충족시키고 있다. 혈관 형성은 복잡하지만, 다음 단계들을 전부 또는 많이 포함하는 규칙적인 생물학적 사건이다: a) 내피 세포 (EC)가 기 존의 EC로부터 증식되거나 기원 세포로부터 분화되는 단계; b) EC가 이동하고 유착하여 코드 (cord)-유사 구조를 형성시키는 단계; c)이어서, 혈관 코드가 세관형성을 진행하여 중앙에 내강이 있는 혈관을 형성시키는 단계; d) 기존의 코드나 혈관에 싹이 나기 시작하여 이차 혈관을 형성시키는 단계; e) 원시 혈관총이 추가의 재형성과 재생을 진행하는 단계; 및 f) 내피 주변 세포를 동원하여 내피 관에 넣어, 혈관에 대한 유지 및 조정 기능을 제공하는 단계 (이러한 세포에는, 작은 모세혈관의 경우에는 혈관주위세포, 큰 혈관의 경우에는 평활근 세포, 및 심장 내의 심근 세포가 포함된다) [참고: Hanahan, D. Science 277:48-50 (1997); Hogan, B. L. & Kolodziej, P. A. Nature Reviews Genetics. 3:513-23 (2002); Lubarsky, B. & Krasnow, M. A. Cell. 112:19-28 (2003)].
혈관형성이 각종 장애의 발병 기전에 밀접한 영향을 끼치는 것으로 현재 널리 정립되었다. 이러한 장애로는 고형 종양 및 전이, 아테롬성 경화증, 후수정체 섬유증식증, 혈관종, 만성 염증, 안내 신생혈관 질환, 예를 들어 증식성 망막병증, 예를 들어 당뇨병성 망막병증, 연령 관련 황반 변성 (AMD), 신생혈관 녹내장, 이식된 각막 조직 및 기타 조직의 면역 거부, 류마티스성 관절염, 및 건선이 있다 [참고: Folkman et al., J. Biol. Chem., 267:10931-10934 (1992); Klagsbran et al., Annu. Rev. Physiol. 53:217-239 (1991); and Garner A., "Vascular diseases", In: Pathobiology of Ocular Disease. A Dynamic Approach, Garner A., Klintworth GK, eds., 2nd Edition (Marcel Dekker, NY, 1994), pp 1625-1710].
종양 성장의 경우, 혈관형성은 과형성에서 종양으로 전이되는데 있어 결정적 이고, 종양의 성장과 전이에 대한 영양을 제공하는데 있어서도 결정적인 것으로 여겨진다 [참고: Folkman et al., Nature 339:58 (1989)]. 신생혈관증식으로 인해 종양 세포는 정상 세포와 비교해서 성장 이점과 증식 자율성을 획득할 수 있게 된다. 종양은 통상적으로, 이용 가능한 모세혈관상으로부터의 거리 때문에 수 입방 밀리미터 크기로만 증식할 수 있는 단일 비정상 세포로서 시작하고, 추가의 성장과 전염없이 장 기간 동안 '잠복' 상태로 정체될 수 있다. 이어서, 몇몇 종양 세포는 혈관형성성 표현형으로 전환되어 내피 세포를 활성화시켜, 새로운 모세혈관으로 증식 및 성숙된다. 이와 같이 새로이 형성된 혈관은 원발성 종양을 지속적으로 성장시킬 수 있게 해줄 뿐만 아니라 전이성 종양 세포를 전염시키고 재집락 형성시킬 수 있다. 따라서, 종양 박편 중의 미소혈관 밀도와, 유방암 뿐만 아니라 기타 몇 가지 종양 환자 생존률 간에는 상관 관계가 있는 것으로 관찰되었다 [참고: Weidner et al., N. Engl. J. Med 324:1-6 (1991); Horak et al., Lancet 340:1120-1124 (1992); Macchiarini et al., Lancet 340:145-146 (1992)]. 혈관형성성 전환을 제어하는 정확한 기전은 충분히 밝혀지지 않았지만, 종양 덩어리의 신생혈관증식은 다수의 혈관형성 자극인자와 억제인자의 전체적인 밸런스로부터 비롯되는 것으로 여겨진다 [참고: Folkman, 1995, Nat Med 1(1):27-31].
혈관 발생 과정은 치밀하게 조절되고 있다. 현재, 상당 수의 분자, 대개는 주변 세포에 의해 생성되고 분비된 인자가 코드-유사 구조로의 EC 분화, 증식, 이동 및 유착을 조절하는 것으로 밝혀졌다. 예를 들어, 혈관 내피 성장 인자 (VEGF)가 혈관형성을 자극하고 혈관 침투성을 유도시키는데 관여하는 중요한 인자로서 확 인되었다 [참고: Ferrara et al., Endocr. Rev. 18:4-25 (1997)]. 심지어 단일 VEGF 대립 유전자의 상실로 인해서도 배아 치사성이 발생한다는 발견은 혈관계 발생과 분화에 있어 상기 인자에 의해 수행된 바꿀 수 없는 역할을 지적하고 있다. 더우기, VEGF는 종양 및 안내 장애와 연관된 신생혈관증식의 중요한 매개인자인 것으로 밝혀졌다 [참고: Ferrara et al., Endocr. Rev. 상기 참고]. VEGF mRNA는 조사된 대다수의 인간 종양에 의해 과발현된다 [참고: Berkman et al., J. Clin. Invest. 91:153-159 (1993); Brown et al., Human Pathol. 26:86-91 (1995); Brown et al., Cancer Res. 53:4727-4735 (1993); Mattern et al., Brit. J. Cancer 73:931-934 (1996); Dvorak et al., Am. J. Pathol. 146:1029-1039 (1995)].
또한, 안구 액체 중의 VEGF의 농도 수준은 당뇨병 환자와 기타 허혈증 관련 망막병증 환자에게서 혈관의 적극적 증식 존재와 고도로 상관이 있다 [참고: Aiello et al., N. Engl. J. Med. 331:1480-1487 (1994)]. 더우기, 연구 결과, AMD에 걸린 환자의 맥락막성 신생혈관 막에 VEGF가 국재하는 것으로 입증되었다 [참고: Lopez et al., Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 37:855-868 (1996)].
항-VEGF 중화 항체는 누드 마우스에서 각종 인간 종양 세포주의 성장을 저해하고 [참고: Kim et al., Nature 362:841-844 (1993); Warren et al., J. Clin. Invest. 95:1789-1797 (1995); Borgstrom et al., Cancer Res. 56:4032-4039 (1996); Melnyk et al., Cancer Res. 56:921-924 (1996)], 또한 허혈성 망막 장애 모델에서 안내 혈관형성을 억제시킨다 [참고: Adamis et al., Arch. Ophthalmol. 114:66-71 (1996)]. 따라서, 항-VEGF 모노클로날 항체 또는 VEGF 작용의 기타 억 제제가 종양 및 각종 안내 신생혈관 장애를 치료하기 위한 장래성 있는 후보이다. 이러한 항체는, 예를 들어 EP 817,648 (1998년 1월 14일자로 공개됨); 및 WO 98/45331 및 WO 98/45332 (둘 다 1998년 10월 15일자로 공개됨)에 기재되어 있다. 항-VEGF 항체 중의 하나인 베바시주마브 (bevacizumab)는 전이성 결장직장암 (CRD)과 비소세포 폐암 (NSCLC)을 치료하기 위해 화학요법 섭생과 병용해서 사용하도록 FDA에 의해 승인되었다. 그리고, 베바시주마브는 현재 각종 암 적응증을 치료하기 위해 진행되고 있는 많은 임상 시험으로 연구 중에 있다.
신경계 발생 동안, 신경세포에서 케이블-유사 액손 (cable-like axon)이 나오기 시작하고 이는 그들의 표적에 도달하기 위해 장 거리에 걸쳐 이동한다 [참고: Carmeliet and Tessier-Lavigne (2005) Nature 436:193-200]. 성장하고 있는 액손의 선두 끝은 성장 원뿔로 불리우는 고도로 운동성인 감각 구조이다. 필로포디아성 (filopodial) 신장물의 신장과 수축의 동적 주기를 통하여, 성장 원뿔은 지속적으로 그의 공간적 환경에서 무수한 안내 신호로부터 느끼고 평가하며, 그의 최종 표적을 향한 신장을 위해 정확한 트랙을 정밀하게 선택한다.
지난 십 여년 동안, 액손 안내 기전을 이해하는데 있어서 상당한 수준의 진보가 이루어졌다 [참고: Dickson (2002) Science 298:1959-64]. 안내 신호는 4가지 다양체, 즉 유인물질과 기피제에 오는데, 이들은 짧은 범위 (즉, 세포- 또는 매트릭스-연합됨) 또는 보다 긴 범위 (즉, 확산성)에서 작용할 수 있다. 지금까지, 4가지 주요 계열의 액손 안내 분자가 확인되었다: 네트린 (netrin), 세마포린 (semaphorin), 에프린 (ephrin) 및 슬리트 (slit) [참고: Huber et al (2003) Annu Rev Neurosci 26:509-63].
콜랩신 (collapsin)으로 지칭되기도 하는 세마포린 (세마)은 큰 계열의 계통발생적으로 보존되고 분비된 막 관련 단백질에 속한다. 세마포린 계열의 구성원은 신경 세포 발생 동안 반발성 및 유인성 액손 안내 사건 둘 다를 매개할 수 있다 [참고: Raper (2000) Curr Opin Neurobiol 10:88-94]. 지금까지 확인된 30개 이상의 세마포린은 모두 약 500개 아미노산의 보존된 N-말단 세마 도메인을 공유하고 있다. 세마포린 구성원은 그들의 구조적 유사성과 기원 종에 따라서 8개의 아계열로 분류된다. 세마포린에 대한 통일된 명칭에 관한 보다 상세한 설명은 다음 문헌을 참고할 수 있다 [참고: Semaphorin Nomenclature Committee (1999) Cell 97:551-552].
뉴로필린 (NRP) 계열은 2개의 상동성 단백질, 즉 뉴로필린-1 (NRP1) 및 뉴로필린-2 (NRP2)로 구성된다. NRP1은 성장하는 액손의 성장 원뿔에서 발현된 유형 I 130-kDa 막관통 당단백질로서 처음 확인되었다. NRP2는 발현 클로닝에 의해 후속 확인되었다 [참고: Fujisawa and Kitsukawa (1998) Curr Opin Neurobiol 8:587-592]. NRP는 세마포린의 일부인 부류 3 세마포린에 대한 수용체인 것으로 밝혀졌다. NRP는 또 다른 세마포린 수용체 계열인 플렉신 (plexin)과 함께 비-신호전달 공동-수용체로서 기능하는 것으로 제안되었다.
NRP가 초기에는 액손 안내의 매개인자로서 보고되긴 하였지만, 혈관 발생에 있어서 결정적인 역할을 하는 것으로 또한 밝혀졌다 [참고: Carmeliet and Tessier-Lavigne (2005)]. 이는 종양 및 내피 세포 상에서 발현된 이소형-특이적 VEGF 수용체로서 확인되어, 혈관 및 종양 생물학에 있어서의 NRP의 역할을 밝히는데 상당한 노력을 기울이게 하였다 [참고: Soker et al (1998) Cell 92:735-745; Klagsbrun et al (2002) Adv Exp Med Biol 515:33-48]. 유전적 연구 결과는 Nrp1이 혈관 형태발생에 요구된다는 강력한 증거를 제공하였다. Nrp1 기능이 상실되면 혈관 재형성과 분지형성 결함이 생겨, Nrp2 기능 상실에 의해 추가로 증강될 수 있는 표현형이 된다 [참고: Kawasaki et al. (1999) Development 126:4895-4902; Takashima et al. (2002) Proc Natl Acad Sci USA 99:3657-3662]. 이들 결과는 Nrp1과 Nrp2 발생 초기에는 중복 기능을 가질 수도 있다고 제안한다. 그러나, 각 Nrp의 발현이 발생 후기에 분할되는데, Nrp1은 주로 동맥에서 발현되고 Nrp2는 정맥과 림프관에서 발현된다 [참고: Yuan et al (2002) Development 129:4797-4806; Herzog et al. (2001) Mech Dev 109: 115-119]. 특히, Nrp2 기능 상실 만이 림프관 발생에 특이적으로 손상을 입힌다.
Nrp1은 발생 동안 기타 많은 세포 유형에서 발현되기 때문에, 혈관성 Nrp1 의 역할은 EC-특이적 녹아웃 (knock-out)의 생성을 통하여 다루어졌고, 그 결과로 기능없는 (null) 대립 유전자에서 관찰된 것과 유사한 혈관성 결함이 생겨났다 [참고: Gu et al. (2003) Dev Cell 5:45-57]. 흥미롭게도, 이러한 연구 결과 또한, NRP1에 대한 세마3A 결합성이 혈관 발생에는 요구되지 않는 것으로 밝혀졌다. 또 다른 연구에서는 Nrp1 KO 배아에서 발생하는 후뇌 (hindbrain)의 내피 끝 세포 안내에서 결함이 관찰되었다 [참고: Gerhardt et al. (2004) Dev Dyn 231:503-509].
혈관 발생에 있어서의 NRP1의 역할에 관한 광범위한 연구에도 불구하고, NRP1이 VEGF 수용체 2 (VEGFR2)에 대한 VEGF 결합을 위한 증강인자로서 그리고 이로 인해 VEGFR2 신호 전달을 위한 증강인자로서 VEGF-VEGFR2 경로를 통하여, 또는 VEGFR2와 독립적인 신호 전달 경로를 통해서, 또는 이 둘 다의 조합을 통하여 그의 혈관 기능을 발휘하는지에 관해서는 아직 명확하지 않다.
재조합 DNA 기술을 이용하여 모노클로날 항체를 제작할 수 있다. 모노클로날 항체, 특히 설치류로부터 유래된 모노클로날 항체에 관한 광범위한 이용이 이루어질 수 있지만, 비-인간 항체는 종종 인간에게서 항원성이다. 당해 분야에서는 비-인간 항원 결합성 도메인을 인간 불변 도메인과 커플링시킨 "키메라" 항체를 구축함으로써 이러한 문제점을 극복하고자 하였다 [참고: Cabilly et al., U.S. Patent No. 4,816,567]. 인간 불변 도메인의 이소형은 키메라 항체가 항체 의존성 세포성 세포독성 (ADCC) 및 보체 의존성 세포독성에 참여할 수 있도록 선택할 수 있다. 항체의 항원 결합 기능을 해결하고 인간 항체에서 이종 서열의 사용을 최소화하기 위한 추가의 노력으로, 무손상 인간 가변 도메인을 실질적으로 일부를 해당 영역에서 비-인간 종으로부터의 상응하는 서열에 의해 치환시킨 인간화 항체를 각종 항원에 대해 생성시켰다. 예를 들어, 인간 항체의 상응하는 절편을 설치류 잔기로 대체시켰다. 실제적으로, 인간화 항체는 전형적으로, 몇몇 상보성 결정 영역 (CDR) 잔기 및 가능하게는 몇몇 골격 영역 (FR) 잔기를 설치류 항체 중의 유사한 부위로부터의 잔기로 대체시킨 인간 항체이다 [참고: Jones et al. (1986) Nature 321:522-525; Riechmann et al. (1988) Nature 332:323-327; Verhoeyen et al. (1988) Science 239:1534-1536].
치료적 항체를 인간에게 투여하기에 앞서, 비-인간 포유류에서의 임상전 연구는 일반적으로 상기 항체의 효능 및/또는 독성을 평가하려고 한다. 이상적으로는, 이들 연구에 참여한 항체는 숙주 동물 (예를 들어, 마우스 또는 비-인간 영장류)에 대해 내인성인 표적 항원과 높은 효력으로 인식 및 반응할 수 있다.
파아지 디스플레이 (phage display) 기술은 특정 리간드 (예: 항원)와 결합하는 신규 단백질을 생성 및 선별하기 위한 강력한 도구를 제공하였다. 파아지 디스플레이 기술을 사용하여, 단백질 변이체의 큰 라이브러리를 생성시키고, 표적 항원과 고 친화성으로 결합하는 서열을 신속하게 분류할 수 있다. 변이체 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 바이러스성 외피 단백질, 예를 들어 유전자 III 단백질 또는 유전자 VIII 단백질을 암호화하는 핵산 서열과 융합시킨다. 단백질 또는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열을 유전자 III 단백질의 일부를 암호화하는 핵산 서열과 융합시킨 1가 파아지 디스플레이 시스템을 개발하였다 [참고: Bass, S. (1990) Proteins 8:309; Lowman and Wells (1991) Methods: A Companion to Methods in Enzymology 3:205]. 1가 파아지 디스플레이 시스템에서는, 유전자 융합물이 저 수준으로 발현되고 야생형 유전자 III 단백질이 또한 발현되어 입자 감염성이 유지된다. 펩티드 라이브러리를 생성시키는 방법과 이들 라이브러리를 스크리닝하는 방법이 수 많은 특허에 기재되었다 [참고: 예를 들어, 미국 특허 제5,723,286호, 미국 특허 제5,432,018호, 미국 특허 제5,580,717호, 미국 특허 제5,427,908호 및 미국 특허 제5,498,530호].
섬유상 파아지 표면 상에서의 펩티드의 발현과, 이. 콜라이 (E. coli)의 주 변세포질에서의 기능성 항체 단편의 발현을 입증하는 것이 항체 파아지 디스플레이 라이브러리를 개발하는 데에 있어 중요하였다 [참고: Smith et al. (1985) Science 228:1315; Skerra and Pluckthun (1988) Science 240:1038]. 항체 또는 항원 결합성 폴리펩티드의 라이브러리는 수 많은 방식, 예를 들어 무작위 DNA 서열을 삽입함으로써 단일 유전자를 변경시키는 방법 또는 관련 유전자 계열을 클로닝하는 방법으로 제조하였다. 파아지 디스플레이를 이용하여 항체 또는 항원 결합성 단편을 디스플레이하는 방법이 미국 특허 제5,750,373호, 제5,733,743호, 제5,837,242호, 제5,969,108호, 제6,172,197호, 제5,580,717호, 및 제5,658,727호에 기재되었다. 이어서, 라이브러리를 대상으로 하여, 목적하는 특징을 수반한 항체 또는 항원 결합성 단백질의 발현에 관하여 스크리닝하였다.
파아지 디스플레이 기술은 목적하는 특징을 지닌 항체를 제조하기 위한 통상적인 하이브리도마 및 재조합 방법에 비해 몇 가지 이점을 지니고 있다. 이러한 기술은 동물을 사용하지 않고서도 짧은 시간에 다양한 서열을 지닌 큰 항체 라이브러리를 생성시킬 수 있게 해준다. 하이브리도마의 제조나 인간화 항체의 제조는 수 개월의 제조 기간을 필요로 할 수 있다. 또한, 면역이 전혀 요구되지 않기 때문에, 파아지 항체 라이브러리는 독성이거나 항원성이 낮은 항원에 대해서도 생성시킬 수 있다 [참고: Hogenboom (1988) Immunotechniques 4:1-20]. 파아지 항체 라이브러리를 또한 사용하여 신규한 치료적 항체를 생성 및 확인할 수 있다.
파아지 디스플레이 라이브러리를 사용하여 면역시킨, 비-면역시킨 인간, 생식세포계 서열, 또는 본래 그대로의 B 세포 Ig 레퍼토리 (repertory)로부터 인간 항체를 생성시켰다 [참고: Barbas & Burton(1996) Trends Biotech 14:230; Griffiths et al. (1994) EMBO J. 13:3245; Vaughan et al. (1996) Nat Biotech. 14:309; Winter EP 0368 684 B1]. 각종 림프계 조직을 사용하여, 본래 그대로의, 또는 비면역 항원 결합성 라이브러리를 생성시켰다. 이들 라이브러리 중의 몇몇이 시판되고 있다 (개발업체: Cambridge Antibody Technology and Morphosys) [참고: Vaughan et al.(1996) Nature Biotech 14:309; Knappik et al. (1999) J. Mol. Biol. 296:57]. 그러나, 이들 라이브러리 중의 많은 것이 제한된 다양성을 지닌다.
파아지 디스플레이 라이브러리로부터 고 친화성 항체를 확인 및 분리할 수 있는 능력은 치료용의 신규 항체를 분리하는 데에 있어 중요하다. 라이브러리로부터 고 친화성 항체를 분리하는 것은 라이브러리의 크기, 세균성 세포 중에서의 생산 효율 및 라이브러리의 다양성에 좌우된다 [참고: 예를 들어, Knappik et al. (1999) J. Mol. Biol. 296:57]. 라이브러리의 크기는 항체 또는 항원 결합성 단백질의 부적절한 폴딩과 정지 코돈의 존재로 인한 비효율적 생산에 의해 감소된다. 세균성 세포에서의 발현은 항체 또는 항원 결합성 도메인이 적절하게 폴딩되지 않는 경우에는 억제될 수 있다. 발현은 가변/불변 계면의 표면이나 선별된 CDR 잔기에서의 잔기를 교대로 돌연변이시킴으로써 개선시킬 수 있다 [참고: Deng et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:9533, Ulrich et al. (1995) PNAS, 92:11907-11911; Forsberg et al. (1997) J. Biol. Chem. 272:12430]. 골격 영역의 서열은 항체 파아지 라이브러리를 세균성 세포에서 생성시키는 경우에 적절한 폴딩을 제공하는 데 있어서의 한 인자이다.
항체 또는 항원 결합성 단백질의 다양한 라이브러리를 생성시키는 것이 또한, 고 친화성 항체를 분리하는데 중요하다. 제한된 CDR에서 다양화를 나타내는 라이브러리는 각종 접근 방식을 이용하여 생성시켰다 [참고: 예를 들어, Tomlinson (2000) Nature Biotech. 18:989-994]. CDR3 영역은 이들이 종종 항원 결합에 참여하는 것으로 밝혀졌기 때문에 부분적으로 관심이 있다. 중쇄 상의 CDR3 영역은 크기, 서열 및 구조적 입체 형태 면에서 상당히 다양하다.
또한, 각 위치에서 20개 아미노산 모두를 사용하여 가변 중쇄 및 경쇄의 CDR 영역을 무작위화함으로써 다양성을 발생시켰다. 20개의 모든 아미노산을 사용하면 다양성이 큰 변이체 항체 서열이 생성되고 신규한 항체를 확인할 기회가 증가하는 것으로 여겨졌다 [참고: Barbas (1994) PNAS 91:3809; Yelton, DE (1995) J. Immunology 155:1994; Jackson, J.R. (1995) J. Immunology 154:3310 and Hawkins, RE (1992) J. Mol. Biology 226:889].
발명의 요약
본 발명은 한 가지 이상의 뉴로필린 매개된 생물학적 활성을 조정할 수 있는 신규한 항-NRP1 항체를 제공한다. 바람직하게, 항-NRP1 항체는 한 가지 이상의 뉴로필린 매개된 생물학적 활성을 억제할 수 있는 길항제 항체이다. 보다 구체적으로 언급하면, 본 발명은 지정된 인간 합성 항체 파아지 라이브러리로부터 항-NRP1 항체를 생성시키는 방법, 및 이로써 생성된 신규한 기능 차단 항-NRP1 항체를 제공한다. 본 발명의 항-NRP1 항체는 그들이 결합하는 NRP1 상의 위치에 따라서 두 가 지 부류에 속한다: 항-NRP1A 항체 (YW64.3 및 그의 변이체 포함)는 NRP1의 CUB 도메인 (a1a2)과 결합하는 것이고; 항-NRP1B 항체 (YW107.4 및 그의 변이체 포함)는 NRP1의 응고 인자 V/VIII 도메인 (b1b2)과 결합하는 것이다.
한 국면에서, 본 발명의 항-NRP1A 항체는 확인된 부분 CDR 서열을 갖고 뮤린 및 인간 NRP1에 대한 결합 친화성을 지닌, 표 III에 제시된 바와 같은 "YW64" 항체 클론 중에서 선택될 수 있다. 본 발명의 항-NRP1A 항체는 바람직하게, 다음 CDR 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함한다: CDRL1 (RASQSISSYLA; 서열 123), CDRL2 (GASSRAS; 서열 124) 및 CDRL3 (QQYMSVPIT; 서열 125). 예를 들어, 항-NRP1A 항체는 서열 3의 경쇄 가변 도메인 서열을 포함한다. 본 발명의 항-NRP1A 항체는 바람직하게, 다음 CDR 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함한다: CDRH1 (GFSFSSEPIS; 서열 126), CDRH2 (SSITGKNGYTYYADSVKG; 서열 127) 및 CDRH3 (WGKKVYGMDV; 서열 128). 예를 들어, 항-NRP1A 항체는 서열 4의 중쇄 가변 도메인 서열을 포함한다. 보다 바람직하게, 본 발명의 항-NRP1A 항체는 서열 3의 경쇄 가변 도메인 서열과 서열 4의 중쇄 가변 도메인 서열을 포함하는 YW64.3 항체이다.
또 다른 국면에서, 본 발명의 항-NRP1B 항체는 확인된 부분 CDR 서열을 갖고 뮤린 및 인간 NRP1에 대한 결합 친화성을 지닌, 표 IV에 제시된 바와 같은 "YW107.4" 항체 클론 중에서 선택될 수 있다. 본 발명의 항-NRP1B 항체는 바람직하게, 다음 CDR 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함한다: CDRL1 (RASQYFSSYLA; 서열 129), CDRL2 (GASSRAS; 서열 130) 및 CDRL3 (QQYLGSPPT; 서열 131). 예를 들어, 항-NRP1B 항체는 서열 5의 경쇄 가변 도메인 서열을 포함한다. 본 발명의 항-NRP1B 항체는 바람직하게, 다음 CDR 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함한다: CDRH1 (GFTFSSYAMS; 서열 132), CDRH2 (SQISPAGGYTNYADSVKG; 서열 133) 및 CDRH3 (ELPYYRMSKVMDV; 서열 134). 예를 들어, 항-NRP1B 항체는 서열 6의 중쇄 가변 도메인 서열을 포함한다. 보다 바람직하게, 본 발명의 항-NRP1B 항체는 서열 5의 경쇄 가변 도메인 서열과 서열 6의 중쇄 가변 도메인 서열을 포함하는 YW107.4.87 항체이다.
또한, 본 발명은 혈관형성 관련 장애, 예를 들어 암을 치료하기 위한 항-NRP1 항체의 용도를 제공한다. 한 가지 바람직한 양태에서, 본 발명의 항-NRP1 항체는 항-VEGF 항체와 병용해서 사용한다. 바람직하게, 항-VEGF 항체는 항체 A4.6.1과 동일한 VEGF 에피토프와 결합할 수 있다. 보다 바람직하게, 항-VEGF 항체는 베바시주마브 또는 라니비주마브 (ranibizumab)이다.
도 1은 항-NRP1 항체의 결합 특이성을 예시한 것이다. (1A) 항-NRP1 항체는 인간 및 뮤린 NRP1과 특이적으로 결합한다. 항-NRP1 항체 YW64.3 및 YW107.4 IgG (lO ㎍/ml)의 결합 특이성은 hNRP1-, mNRP1-, hNRP2-, mNRP2-, ErbB2-ECD-, 또는 BSA-피복된 웰에 대한 결합성을 시험함으로써 평가하고, 결합된 IgG는 항-인간 IgG HRP 접합체에 의해 탐지하였다. (1B) 항-NRP1 항체 YW64.3 및 YW107.4 IgG의 FACS 분석은 세포 표면 NRP1 단백질 (HUVEC)에 대한 항체 결합 능력을 나타낸다.
도 2는 항-NRP1 항체 YW107.4 및 그의 친화성 성숙된 변이체 YW107.4.87 (항-NRP1B)의 결합 특성을 예시한 것이다. (2A) 친화성 성숙된 YW107.4.87 변이체의 BIAcore 역학 분석. (2B) YW107.4 및 YW107.4.87 IgG의 FACS 분석은 친화성 성숙된 변이체 YW107.4.87에 의한 세포 표면 NRP1 단백질 (HUVEC)에 대한 개선된 결합성을 나타낸다.
도 3은 YW64.3 (항-NRP1A) 및 YW107.4.87 (항-NRP1B)의 가변 영역 서열을 도시한 것인데, h4D5의 서열이 기준물로서 열거되었다. 넘버링은 카바트 (Kabat) 데이터베이스에 기초하였다. CDR 서열은 박스 영역 내에 있다. (3A) h4D5에 대한 경쇄 가변 영역 서열 (서열 1), YW64.3에 대한 경쇄 가변 영역 서열 (서열 3) 및 YW107.4.87에 대한 경쇄 가변 영역 서열 (서열 5). (3B) h4D5에 대한 중쇄 가변 영역 서열 (서열 2), YW 64.3에 대한 중쇄 가변 영역 서열 (서열 4) 및 YW107.4.87에 대한 중쇄 가변 영역 서열 (서열 6).
도 4는 항-NRP1 항체에 의한, NRP1에 대한 VEGF165 결합성의 차단을 도시한 것이다.
도 5는 세마3A-유도된 DRG 콜랩스 (collapse) (5A) 및 세마3F-유도된 해마 콜랩스 검정 (5B)의 정량화를 도시한 것이다. 항-NRP1A는 DRG 신경 세포의 세마3A-유도된 성장 원뿔 콜랩스(growth cone collapse)를 특이적으로 차단시키지만, 해마 신경 세포의 세파3F-유도된 성장 원뿔 콜랩스는 그렇게 하지 못하는 것으로 밝혀졌다.
도 6은 항-NRP1 항체가 시험관 내에서 VEGF-유도된 HUVEC 이동과 발아를 억제할 수 있다는 것을 예시한 것이다. (6A) 이동 검정의 정량화, (각 조건에 대해 n = 6). *p = 0.00003; **p=9.9x10-11; 스튜던츠 (Student's) t 시험. (6B) 비드 발아 검정의 정량화, 조건당 n = 12-14 비드.
도 7은 발생 중인 마우스 망막에서 혈관 재형성에 대한 항-NRP1 항체의 생체내 억제 효과를 예시한 것이다. (7A)는 생후 5일 (P5)에서 P8 까지의 혈관 발생을 예시한 것이다. 혈관은 동심 패턴으로 망막 가장자리로 신장된다. 시신경 헤드 (ONH)는 망막 중앙에 위치한다. (7B) ONH 근처의 혈관 재형성은 P5와 P8 사이에 일어난다. (7C)는 망막 심부 층 내로의 혈관 발아를 예시한 것이다. 혈관은 외부 얼기층 (OPL)으로 발아 신장되고 얼기 (plexus)를 형성한다. 나중 분류 (spout)는 NFL 층과 OPL 층 사이에 생겨나, 궁극적으로는 내부 얼기층 (IPL)을 생성시킨다. (7D) 혈관 밀도의 정량화; 각 조건으로 처리시킨 4개 망막으로부터의 12개 대표적 영상으로부터의 총 픽셀 계수치. *p = 0.006; **p < 0.0001; 스튜던츠 t 시험. (7E) ONH에서부터 망막 컵의 가장자리까지의 길이에 걸쳐, ONH에서부터 혈관계의 가장자리까지의 거리 비로써 측정된 혈관 신장의 정량화. 처리시킨 4개 망막으로 부터 12개 대표적 측정치를 취하였다.
도 8은 VEGF-유도된 혈관 투과성, HUVEC 증식, VEGFR2 인산화 및 VEGFR2 하단 신호 전달에 대한 항-NRP1 항체의 효과를 도시한 것이다. (8A) 마우스 피부 혈관 투과성 검정의 정량화. 제시된 값은 6개 독립적인 실험의 평균치이다 (항-NRP1A의 경우 p=0.69이고, 항-NRP1B의 경우 p=0.989이다). (8B) VEGF의 존재 또는 부재 하에 HUVEC 증식의 정량화 (각 조건에 대해 n=5). (8C) 총 또는 티로신-인산화 VEGFR2를 인식한 항체를 사용하여 ELISA 검정에 의해 탐지된 HUVEC 내에서의 VEGFR2 인산화 수준. 항-NRP1A 처리시킨 세포에서의 VEGFR2 인산화 수준은 대조군과 상당히 상이하지 않았다 (p=0.133). *p=0.00017; 스튜던츠 t 시험. (8D) HUVEC 용해물의 면역블롯 분석. 세포를 표시된 항체로 처리한 다음, VEGF와 함께 항온 배양하였다.
도 9는 각종 이종이식편 종양 모델에서 항-NRP1 항체에 의한 종양 성장 억제 효과 (단독 또는 항-VEGF와 병용한 효과)를 예시한 것이다. (9A-C) SK-MES-1, H1299 및 Fo5 종양 모델 각각의 평균 종양 용적 그래프. (9D) SK-MES-1 종양 모델에 대한 카플란-마이어 (Kaplan-Meier) 플롯.
도 10은 Fo5 종양 모델에서 항-NRP1 항체에 의한 혈관 효과 (단독 또는 항-VEGF와 병용한 효과)를 도시한 것이다. (10A) 평균 혈관 밀도 (렉틴 관류로써 측정됨); 각 조건으로 처리시킨 3 내지 4개 종양으로부터의 총 픽셀 계수치. (10B) 평균 혈관주위세포 밀도 (PDGFRβ 염색에 의해 측정됨). (10C) 상대적 혈관주위세 포 적용 범위를 측정하는 혈관주위세포/혈관 비.
도 11은 혈관 재형성에 대한 NRP1 및 VEGF 억제의 상가적 효과를 예시한 것이다. 11A는 새로이 형성된 혈관에서 NRP1 기능을 차단시키는 것이 진행되고 있는 재형성과 후속 성숙로부터 혈관을 억제시켜, 생존에 위해 VEGF에 의존적인 혈관이 되도록 하는 모델을 제시한다. 11B는 항-NRP1B, 항-VEGF, 또는 그의 조합물의 존재 하에 신생 마우스 망막 상의 평균 혈관 밀도 변화를 도시한 것이다.
본 발명은 NRP 매개된 생물학적 활성을 조정하기 위한 신규한 조성물 및 방법에 관한 것이다.
정의
"뉴로필린" 또는 NRP는 집합적으로 뉴로필린-1 (NRP1), 뉴로필린-2 (NRP2) 및 그들의 이소형 및 변이체를 지칭한다 [참고: Rossignol et al. (2000) Genomics 70:211-222]. 뉴로필린은 120 내지 130 kDa 비-티로신 키나제 수용체이다. 다수의 NRP-1 및 NRP-2 스플라이스 변이체 및 가용성 이소형이 있다. 뉴로필린의 기본 구조는 5개 도메인을 포함한다: 3개의 세포외 도메인 (a1a2, b1b2 및 c), 막관통 도메인 및 세포질성 도메인. a1a2 도메인은 2개의 디설파이드 브릿지를 형성하는 4개의 시스테인 잔기를 일반적으로 함유하는 보체 성분 Clr 및 Cls (CUB)와 상동성이다. b1b2 도메인은 응고 인자 V 및 VIII와 상동성이다. c 도메인의 중앙부는 메프린 (meprin), A5 및 수용체 티로신 포스파타제 μ 단백질과의 상동성 때문에 MAM으로서 명명된다. a1a2 및 b1b2 도메인은 리간드 결합에 책임이 있는 반면, c 도메인은 동종-이량체화 또는 이종-이량체화에 있어 결정적이다 [참고: Gu et al. (2002) J. Biol. Chem. 277:18069-76; He and Tessier-Lavigne (1997) Cell 90:739-51].
"뉴로필린 매개된 생물학적 활성"은 일반적으로, 뉴로필린-1 및/또는 뉴로필린-2가 실질적 역할을 하는 생리적 또는 병리학적 사건을 지칭한다. 이러한 활성의 비제한적 예는 배아 신경계 발생 또는 신경 세포 재생 동안의 액손 안내, 혈관형성 (혈관 재형성 포함), 종양 생성 및 종양 전이이다.
용어 "항체"는 가장 광범위한 의미로 사용되고, 구체적으로는 모노클로날 항체 (완전한 길이의 모노클로날 항체 포함), 폴리클로날 항체, 다중-특이적 항체 (예: 이중-특이적 항체), 및 목적하는 생물학적 활성을 나타내는 항체 단편이 포함된다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "모노클로날 항체"는 실질적으로 동질적 항체 집단으로부터 수득한 항체, 즉 집단을 차지하고 있는 개개의 항체가 미량으로 존재할 수 있는 가능한 천연 발생적 돌연변이를 제외하고는 동일한 것을 지칭한다. 모노클로날 항체는 고도로 특이적이어서, 단일 항원 부위에 대항하여 유도된다. 더우기, 상이한 결정기 (에피토프)에 대항하여 유도된 상이한 항체를 전형적으로 포함하는 통상적인 (폴리클로날) 항체 제제와는 달리, 각각의 모노클로날 항체는 항원 상의 단일 결정기에 대항하여 유도된다. 수식어 "모노클로날"은 실질적으로 동질적 항체 집단으로부터 수득되는 바와 같은 항체의 형질을 표시하고, 특별한 방법에 의한 항체의 생성을 요구하는 것으로 추론되지 않는다. 예를 들어, 본 발명에 따라서 사용될 모노클로날 항체는 문헌 [참고: Kohler et al., Nature, 256: 495 (1975)]에 최초로 기재된 하이브리도마 방법에 의해 만들 수 있거나 또는 재조합 DNA 방법 [미국 특허 제4,816,567호 참고]에 의해 만들 수 있다. "모노클로날 항체"는 또한, 예를 들어 문헌 [참고: Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991) and Marks et al., J. Mol.Biol., 222: 581-597 (1991)]에 기재된 기술을 사용하여 파아지 항체 라이브러리로부터 분리할 수 있다.
본원에서의 모노클로날 항체에는 구체적으로, 중쇄 및/또는 경쇄 일부가 특별한 종으로부터 유래되거나 특별한 항체 부류 또는 아부류에 속하는 항체 내의 상응하는 서열과 동일하거나 이와 상동성인 반면, 나머지 쇄(들)는 또 다른 종으로부터 유래되거나 또 다른 항체 부류 또는 아부류에 속하는 항체 내의 상응하는 서열과 동일하거나 이와 상동성인 "키메라" 항체 (면역글로불린) 뿐만 아니라 목적하는 생물학적 활성을 나타내는 상기 항체의 단편이 포함된다 [참고: 미국 특허 제4,816,567호; Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6851-6855 (1984)].
"인간화" 형태의 비-인간 (예: 뮤린) 항체는 비-인간 면역글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 함유하는 키메라 항체이다. 대부분의 경우, 인간화 항체는, 수용자의 초가변 영역으로부터의 잔기를 목적하는 특이성, 친화성 및 능력을 보유하고 있는 비-인간 종 (공여자 항체), 예를 들어 마우스, 랫트, 토끼 또는 비-인간 영장류의 초가변 영역로부터의 잔기로 대체시킨 인간 면역글로불린 (수용자 항체)이다. 몇몇 경우에는, 인간 면역글로불린의 Fv 골격 영역 (FR) 잔기를 상응하는 비-인간 잔기로 대체시킨다. 더우기, 인간화 항체는 수용자 항체 또는 공여자 항체에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이들 변형은 항체 성능을 추가로 정련시키기 위해 만들어진다. 일반적으로, 인간화 항체는 1개 이상, 전형적으로 2개의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함할 것이며, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 초가변 루프는 비-인간 면역글로불린에 상응하고, 모든 또는 실질적으로 모든 FR 영역은 인간 면역글로불린 서열의 것이다. 인간화 항체는 임의로, 면역글로불린 불변 영역 (Fc), 전형적으로는 인간 면역글로불린의 불변 영역의 적어도 일부를 포함할 것이다. 추가의 상세 내역에 대해서는 다음 문헌을 참고할 수 있다 [참고: Jones et al. (1986) Nature 321: 522-525; Reichmann et al. (1988) Nature 332: 323-329; and Presta (1992) Curr. Op. Struct. Biol. 2: 593-596].
"종-의존성 항체"는 제2 포유류 종으로부터의 항원의 상동체에 대한 것 보다, 제1 포유류 종으로부터의 항원에 대한 결합 친화성이 더 강력한 항체이다. 정상적으로, 종-의존성 항체는 인간 항체와 "특이적으로 결합"하지만 [즉, 결합 친화도 (Kd) 값이 약 1 x 10-7 M 이하, 바람직하게 약 1 x 10-8 M 이하, 가장 바람직하게 약 1 x 10-9 M 이하이다], 제2 비-인간 포유류 종으로부터의 항원의 상동체에 대한 결합 친화도는 인간 항원에 대한 그의 결합 친화도 보다 약 50배 이상, 또는 약 500배 이상, 또는 약 1000배 이상 더 약하다. 종-의존성 항체는 상기 정의된 바와 같은 각종 유형의 항체일 수 있지만, 바람직하게 인간화 또는 인간 항체이다.
본원에 사용된 바와 같은 "항체 돌연변이체" 또는 "항체 변이체"는 종-의존성 항체의 하나 이상의 아미노산 잔기를 변형시킨 종-의존성 항체의 아미노산 서열 변이체를 지칭한다. 이러한 돌연변이체는 필수적으로, 종-의존성 항체와의 서열 동일률 또는 유사율이 100% 미만이다. 바람직한 양태에서, 항체 돌연변이체는 종-의존성 항체의 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인의 아미노산 서열과의 아미노산 서열 동일률 또는 유사율이 75% 이상, 보다 바람직하게 80% 이상, 보다 바람직하게 85% 이상, 보다 바람직하게 90% 이상, 가장 바람직하게 95% 이상인 아미노산 서열을 가질 것이다. 이러한 서열에 대한 동일률 또는 유사율은 서열들을 정렬시키고, 필요한 경우 갭을 도입하여 최대 서열 동일률을 달성한 후, 종-의존성 항체 잔기와 동일하거나 (즉, 동일한 잔기) 유사한 (즉, 공통의 측쇄 특성을 기준으로 하여 동일한 군으로부터의 아미노산 잔기, 하기 참고), 후보 서열 중의 아미노산 잔기의 비율로서 본원에 정의된다. 어떠한 N-말단, C-말단 또는 내부 연장물, 결실물, 또는 가변 도메인 외부에 있는 항체 서열 내로의 삽입물도 서열 동일률 또는 유사율에 영향을 미치는 것으로 간주되지 말아야 한다.
"분리된" 항체는 그의 천연 환경의 특정 구성분으로 확인되어, 이러한 환경으로부터 격리 및/또는 회수시킨 것이다. 그의 천연 환경의 오염 성분은 상기 항체에 대한 진단적 또는 치료적 용도를 방해할 수도 있는 물질인데, 이에는 효소, 호르몬, 및 기타 단백질성 또는 비-단백질성 용질이 포함될 수 있다. 바람직한 양태에서, 항체는 (1) 로리 (Lowry) 방법에 의해 결정된 바와 같이 항체의 95 중량% 초과, 가장 바람직하게는 99 중량% 초과로 정제시키거나, (2) 스피닝 컵 시퀘네이터 (spinning cup sequenator)의 사용에 의해 N-말단 또는 내부 아미노산 서열의 15개 이상 잔기를 수득하기에 충분한 정도로 정제시키거나, 또는 (3) 쿠마시 블루, 또는 바람직하게는 은 염색 (silver stain)을 이용하여 환원성 또는 비환원성 조건 하에 SDS-PAGE에 의해 균질하도록 정제할 것이다. 분리된 항체에는 재조합 세포 내의 계내 항체가 포함되는데, 이는 항체의 천연 환경의 적어도 하나의 성분이 존재하지 않을 것이기 때문이다. 그러나, 통상적으로 분리된 항체는 한 가지 이상의 정제 단계에 의해 제조될 것이다.
본원에 사용된 바와 같은 "항체 가변 도메인"은 상보성 결정 영역 (CDR; 즉, CDR1, CDR2, 및 CDR3), 및 골격 영역 (FR)의 아미노산 서열을 포함하는 항체 분자의 경쇄 및 중쇄 부분을 지칭한다. VH는 중쇄의 가변 도메인을 지칭한다. VL은 경쇄의 가변 도메인을 지칭한다. 본 발명에 사용된 방법에 따르면, CDR 및 FR에 할당된 아미노산 위치는 카바트에 따라서 규정될 수 있다 [참고: Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1987 and 1991)]. 항체 또는 항원 결합성 단편의 아미노산 넘버링도 카바트에 따른다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "상보성 결정 영역 (CDR; 즉, CDR1, CDR2, 및 CDR3)은 항원 결합을 위해 필요한 존재인, 항체 가변 도메인의 아미노산 잔기를 지칭한다. 각 가변 도메인은 전형적으로, CDR1, CDR2 및 CDR3으로서 확인된 3개의 CDR 영역을 갖는다. 각 상보성 결정 영역은 카바트에 의해 정의된 바와 같은 "상보성 결정 영역"으로부터의 아미노산 잔기 [즉, 경쇄 가변 도메인 내의 잔기 약 24-34 (L1), 50-56 (L2) 및 89-97 (L3); 및 중쇄 가변 도메인 내의 잔기 31-35 (H1), 50-65 (H2) 및 95-102 (H3) (참고: Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991))] 및/또는 "초가변 루프"로부터의 잔기 [즉, 경쇄 가변 도메인 내의 잔기 약 26-32 (L1), 50-52 (L2) 및 91-96 (L3); 및 중쇄 가변 도메인 내의 잔기 26-32 (H1), 53-55 (H2) 및 96-101 (H3) (참고: Chothia and Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196:901-917)]를 포함할 수 있다. 몇몇 경우에는, 상보성 결정 영역이 카바트에 따라서 정의된 CDR 영역과 초가변 루프 둘 다로부터의 아미노산을 포함할 수 있다. 예를 들어, 항체 4D5의 중쇄의 CDRH1에는 아미노산 26 내지 35가 포함된다.
"골격 영역" (FR로 후술됨)은 CDR 잔기 이외의 가변 도메인 잔기이다. 각 가변 도메인은 전형적으로, FR1, FR2, FR3 및 FR4로서 확인된 4개의 FR을 갖는다. CDR이 카바트에 따라서 정의되는 경우, 경쇄 FR 잔기는 잔기 약 1-23 (LCFR1), 35-49 (LCFR2), 57-88 (LCFR3), 및 98-107 (LCFR4)에 위치하고, 중쇄 FR 잔기는 중쇄 잔기 내의 잔기 약 1-30 (HCFR1), 36-49 (HCFR2), 66-94 (HCFR3), 및 103-113 (HCFR4)에 위치한다. CDR이 초가변 루프로부터의 아미노산 잔기를 포함하는 경우, 경쇄 FR 잔기는 경쇄 내의 잔기 약 1-25 (LCFR1), 33-49 (LCFR2), 53-90 (LCFR3), 및 97-107 (LCFR4)에 위치하고, 중쇄 FR 잔기는 중쇄 잔기 내의 잔기 약 1-25 (HCFR1), 33-52 (HCFR2), 56-95 (HCFR3), 및 102-113 (HCFR4)에 위치한다. 몇몇 경우에, CDR이 카바트에 의해 정의된 바와 같은 CDR과 초가변 루프 둘 다로부터의 아미노산을 포함하는 경우, FR 잔기는 이에 따라서 조정될 것이다. 예를 들어, CDRH1이 아미노산 H26-H35를 포함하는 경우, 중쇄 FR1 잔기는 위치 1-25에 존재하고, FR2 잔기는 위치 36-49에 존재한다.
본원에 사용된 바와 같은 "코돈 세트"는 목적하는 변이체 아미노산을 암호화하기 위해 사용되는 상이한 뉴클레오티드 삼중자 서열 세트를 지칭한다. 올리고뉴클레오티드 세트는 코돈 세트에 의해 제공된 뉴클레오티드 삼중자의 가능한 모든 조합을 나타내고 목적하는 아미노산 군을 암호화할 서열을 포함하여, 예를 들어 고체 상 합성에 의해 합성할 수 있다. 표준 형태의 코돈 명칭은 당해 분야에 공지되어 있고 본원에 기재된 IUB 코드에 따른다. 코돈 세트는 전형적으로, 3개의 대문자를 이탤리체로써 나타낸 것인데, 예를 들면 NNK, NNS, XYZ, DVK 등이다. 따라서, 본원에 사용된 바와 같은 "비-무작위 코돈 세트"는 본원에 기재된 바와 같은 아미노산 선별 기준을 부분적으로, 바람직하게 완전히 충족시키는 선별 아미노산을 암호화하는 코돈 세트를 지칭한다. 특정 위치에서 선별된 뉴클레오티드 "축퇴 (degeneracy)"를 나타내는 올리고뉴클레오티드의 합성은 당해 분야에 널리 공지되어 있고, 예를 들면 TRIM 접근 방식이다 [참고: Knappek et al. (1999) J. Mol. Biol. 296:57-86; Garrard & Henner (1993) Gene 128:103]. 특정한 코돈 세트를 갖는 올리고뉴클레오티드 세트는 시판용 핵산 합성기 [공급처: 예를 들어, Applied Biosystems, Foster City, CA]를 사용하여 합성할 수 있거나, 또는 상업적으로 구입할 수 있다 [공급처; 예를 들어, Life Technologies, Rockville, MD]. 따라서, 특별한 코돈 세트를 갖는 합성된 올리고뉴클레오티드 세트는 전형적으로, 상이한 서열을 수반한 복수 개의 올리고뉴클레오티드를 포함할 것인데, 이러한 상이성은 전반적인 서열 내의 코돈 세트에 의해 확립된다. 본 발명에 따라서 사용된 바와 같은 올리고뉴클레오티드는 가변 도메인 핵산 주형과 혼성화할 수 있는 서열을 갖고, 또한 반드시는 아니지만, 예를 들어 클로닝 목적에 유용한 제한 효소 부위를 포함할 수 있다.
"Fv" 단편은 완전한 항체 인식 및 결합 부위를 함유하는 항체 단편이다. 이러한 영역은 1개의 중쇄 가변 도메인과 1개의 경쇄 가변 도메인이, 예를 들어 scFv로 단단하게 사실상 공유적으로 연합된 이량체로 이루어진다. 이러한 입체 배치에서는, 각 가변 도메인의 3개 CDR이 VH-VL 이량체 표면 상에 항원 결합 부위를 명백히 규정하도록 상호 작용한다. 집합적으로, 6개 CDR 또는 그의 일부가 항체에 항원 결합 특이성을 부여해 준다. 그러나, 통상적으로 전체 결합 부위 보다는 낮은 친화도이긴 하지만, 심지어 단일 가변 도메인 (또는 특정 항원에 대해 특이적인 3개의 CDR 만을 포함하는 Fv의 절반)도 항원을 인식하고 결합할 수 있는 능력을 지니고 있다.
"Fab" 단편은 경쇄의 가변 및 불변 도메인과, 중쇄의 가변 및 제1 불변 도메인 (CH1)을 함유한다. F(ab')2 항체 단편은 일반적으로 그들 사이에 힌지 시스테인에 의해 그들의 카복시 말단 근처에 공유적으로 연결되는 한 쌍의 Fab 단편을 포함한다. 항체 단편의 기타 화학적 커플링물이 또한 공지되어 있다.
"단일 쇄 Fv" 또는 "scFv" 항체 단편은 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함하는데, 이들 도메인은 단일 폴리펩티드 쇄 내에 존재한다. 바람직하게, Fv 폴리펩티드는 scFv가 항원 결합을 위해 목적하는 구조를 형성할 수 있게 해주는, VH 도메인과 VL 도메인 사이에 폴리펩티드 링커를 추가로 포함한다. scFv 고찰에 대해서는 다음 문헌을 참고할 수 있다 [참고: Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)].
용어 "디아보디"는 2개의 항원 결합 부위를 갖는 작은 항체 단편을 지칭하는데, 이들 단편은 동일한 폴리펩티드 쇄 내에 경쇄 가변 도메인 (VL)과 연결된 중쇄 가변 도메인 (VH)을 포함한다 (VH 및 VL). 동일한 쇄 상에서 두 도메인 간에 짝짓기를 허용하기에는 너무 짧은 링커를 사용함으로써, 이들 도메인을 또 다른 쇄의 상보적 도메인와 짝짓기하여, 2개의 항원-결합 부위를 창출시킨다. 디아보디는, 예를 들어 다음 문헌에 보다 상세히 기재되었다 [참고: EP 404,097; WO 1993/11161; and Hollinger et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6444-6448].
"선형 항체"란 표현은 문헌 [참고: Zapata et al. (1995 Protein Eng, 8(10):1057-1062)]에 기재된 항체를 지칭한다. 간단하게 설명하면, 이들 항체는 상보성 경쇄 폴리펩티드와 함께, 한 쌍의 항원 결합성 영역을 형성하는 한 쌍의 직렬식 Fd 절편 (VH-CH1-VH-CH1)을 포함한다. 선형 항체는 이중-특이적 또는 단일-특이적일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 "라이브러리"는 복수 개의 항체 또는 항체 단편 서열 (예를 들어, 본 발명의 폴리펩티드), 또는 이들 서열을 암호화하는 핵산을 지칭하는데, 이 서열은 본 발명의 방법에 따라서 이들 서열 내로 도입되는 변이체 아미노산의 조합에 있어서 상이하다.
"파아지 디스플레이"는 변이체 폴리펩티드를 파아지, 예를 들어 섬유상 파아지 입자의 표면 상에 외피 단백질의 적어도 일부와의 융합 단백질로서 디스플레이하는 기술이다. 파아지 디스플레이의 유용성은 무작위화 단백질 변이체의 큰 라이브러리를 대상으로 하여, 표적 항원과 고 친화도로 결합하는 서열을 신속하고도 효율적으로 분류할 수 있다는 사실에 있다. 펩티드 및 단백질 라이브러리를 파아지 상에 디스플레이하는 것은 특이적 결합 특성을 지닌 폴리펩티드를 알아보기 위해 수 백만개의 폴리펩티드를 스크리닝하는데 사용되어 왔다. 다가 파아지 디스플레이 방법은 섬유상 파아지의 유전자 III 또는 유전자 VIII과의 융합을 통하여 소형 무작위 펩티드 및 소형 단백질을 디스플레이하기 위해 사용되어 왔다 [참고: Wells and Lowman (1992) Curr. Opin. Struct. Biol. 3:355-362, 및 이에 인용된 참고 문헌들]. 1가 파아지 디스플레이에서는, 단백질 또는 펩티드 라이브러리를 유전자 III 또는 그의 일부와 융합시키고, 야생형 유전자 III 단백질의 존재 하에 저 수준으로 발현시켜 파아지 입자가 상기 융합 단백질의 1개 카피를 디스플레이하거나 전혀 디스플레이하지 않도록 한다. 결합 활성도 효과는 다가 파아지에 비해 저하되므로, 분류는 내재된 리간드 친화성을 기준으로 하였고 DNA 조작을 단순화시켜 주는 파아지미드 (phagemid) 벡터를 사용하였다 [참고: Lowman and Wells (1991) Methods: A companion to Methods in Enzymology 3:205-0216].
"파아지미드"는 세균성 복제 기점, 예를 들어 Co1El, 및 박테리오파아지의 유전자간 영역의 카피를 갖는 플라스미드 벡터이다. 파아지미드는 섬유상 박테리오파아지 및 람다 박테리오파아지를 포함한 공지된 모든 박테리오파아지 상에서 사용할 수 있다. 이러한 플라스미드는 또한 일반적으로, 항생제 내성을 위한 선별성 마커를 함유할 것이다. 이들 벡터 내로 클로닝된 DNA 절편은 플라스미드로서 증식될 수 있다. 이들 벡터를 정착시킨 세포에 파아지 입자의 생성에 필요한 모든 유전자가 제공되는 경우에는, 플라스미드의 복제 방식이 롤링 서클 복제 방식으로 변화되어 플라스미드 DNA 및 패키지 파아지 입자의 1개 가닥 카피를 생성시킨다. 파아지미드는 감염성 또는 비-감염성 파아지 입자를 형성할 수 있다. 이 용어에는 융합 단백질로서 이종 폴리펩티드 유전자와 연결된 파아지 외피 단백질 유전자 또는 그의 단편을 함유하므로 상기 이종 폴리펩티드가 파아지 입자의 표면 상에서 디스플레이 되도록 하는 파아지미드가 포함된다.
용어 "파아지 벡터"는 이종 유전자를 함유하고 복제할 수 있는 이중 가닥 복제 형태의 박테리오파아지를 의미한다. 파아지 벡터는 파아지 복제와 파아지 입자 형성을 허용해 주는 파아지 복제 기점을 갖는다. 파아지는 바람직하게, 섬유상 박테리오파아지, 예를 들어 M13, f1, fd, Pf3 파아지 또는 그의 유도체, 또는 람다 파아지, 예를 들어 람다 21, 파이 (phi)80, 파이81, 82, 424, 434 등 또는 그의 유도체이다.
본원에 사용된 바와 같은 "용매 접근 가능한 위치"는 용매 접근 및/또는 분자 (예: 항체-특이적 항원)와의 접촉에 잠재적으로 이용 가능한 바와 같이, 구조에 기초하여 항체 또는 항원 결합성 단편의 구조 및/또는 모델화 구조의 앙상블을 결정하는 원시 항체 또는 항원 결합성 단편의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역 내의 아미노산 잔기 위치를 지칭한다. 이들 위치는 전형적으로, CDR 내에 그리고 단백질의 외부 상에서 발견된다. 본원에 정의된 바와 같은, 항체 또는 항원 결합성 단편의 용매 접근 가능한 위치는 당해 분야에 공지된 수 많은 알고리듬을 사용하여 결정할 수 있다. 바람직하게, 용매 접근 가능한 위치는 항체의 3차원적 모델로부터의 좌표를 사용하여, 바람직하게는 인사이트II 프로그램 (공급처: Accelrys, San Diego, CA)과 같은 컴퓨터 프로그램을 사용하여 결정한다. 용매 접근 가능한 위치는 당해 분야에 공지된 알고리듬을 사용하여 결정할 수도 있다 [참고: 예를 들어, Lee and Richards (1971) J. Mol. Biol. 55, 379 and Connolly (1983) J. Appl. Cryst. 16, 548]. 용매 접근 가능한 위치의 결정은 항체로부터 수득한 3차원적 구조 정보 및 단백질 모델링에 적합한 소프트웨어를 사용하여 수행할 수 있다. 이들 목적에 활용될 수 있는 소프트웨어에는 SYBYL 바이오폴리머 모듈 (Biopolymer Module) 소프트웨어 (공급처: Tripos Associates)가 포함된다. 일반적으로, 그리고 바람직하게, 알고리듬 (프로그램)에 사용자 입력 크기 파라미터가 요구되는 경우, 계산에 사용되는 프로브의 "크기"는 직경이 약 1.4 이하 옹스트롬으로 설정된다. 또한, 개인용 컴퓨터용 소프트웨어를 사용하여 용매 접근 가능한 영역과 구역 공법을 결정하는 것이 다음 문헌에 보고되었다 [참고: Pacios (1994) Comput. Chem. 18(4): 377-386].
"혈관형성성 인자 또는 혈관형성제"는 혈관 발생을 자극하는, 예를 들어 혈관형성, 내피 세포 성장, 혈관 안정성, 및/또는 혈관생성 등을 증진시키는 성장 인자이다. 예를 들어, 혈관형성 인자에는 VEGF 및 VEGF 계열 구성원, PIGF, PDGF 계열, 섬유아세포 성장 인자 계열 (FGF), TIE 리간드 (안지오포이에틴: Angiopoietin), 에프린, Del-1, 섬유아세포 성장 인자: 산성 (aFGF) 및 염기성 (bFGF), 폴리스타틴 (Follistatin), 과립구 집락 자극 인자 (G-CSF), 간세포 성장 인자 (HGF)/스캐터 인자 (SF), 인터루킨-8 (IL-8), 렙틴 (Leptin), 미드카인 (Midkine), 뉴로필린, 태반 성장 인자, 혈소판 유래된 내피 세포 성장 인자 (PD-ECGF), 혈소판 유래된 성장 인자, 특히 PDGF-BB 또는 PDGFR-베타, 플레이오트로핀 (Pleiotrophin) (PTN), 프로그라눌린, 프롤리페린, 전환 성장 인자-알파 (TGF-알파), 전환 성장 인자-베타 (TGF-베타), 종양 괴사 인자-알파 (TNF-알파) 등이 포함되지만, 그에 제한되지 않는다. 이에는 또한, 상처 치유를 촉진시켜 주는 인자, 예를 들어 성장 호르몬, 인슐린 유사 성장 인자-I (IGF-I), VIGF, 표피 성장 인자 (EGF), CTGF 및 그의 계열 구성원, 및 TGF-알파 및 TGF-베타가 포함될 수 있다 [참고: 예를 들어, Klagsbrun and D'Amore (1991) Annu. Rev. Physiol. 53:217-39; Streit and Detmar (2003) Oncogene 22:3172-3179; Ferrara & Alitalo (1999) Nature Medicine 5(12):1359-1364; Tonini et al. (2003) Oncogene 22:6549-6556 (e.g., Table 1 listing known angiogenic factors); and, Sato (2003) Int. J. Clin. Oncol. 8:200-206].
"항혈관형성제" 또는 "혈관형성 억제제"는 혈관형성, 혈관생성 또는 바람직하지 못한 혈관 투과성을 직접 또는 간접적으로 억제시키는 소 분자량 물질, 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드, 분리된 단백질, 재조합 단백질, 항체, 또는 그의 접합체 또는 융합 단백질을 지칭한다. 항혈관형성제에는 혈관형성 인자 또는 그의 수용체와 결합하여 이들의 혈관형성 활성을 차단시키는 작용제가 포함된다는 것을 인지해야 한다. 예를 들어, 항혈관형성제는 상기 정의된 바와 같은 혈관형성제에 대한 항체 또는 기타 길항제, 예를 들어 VEGF-A 또는 VEGF-A 수용체 (예: KDR 수용체 또는 Flt-1 수용체)에 대한 항체, 항-PDGFR 억제제, 예를 들어 글리벡 (Gleevec™) (이마티니브 메실레이트: Imatinib Mesylate)이다. 항혈관형성제에는 또한, 본래의 혈관형성 억제제, 예를 들어 안지오스타틴, 엔도스타틴 등이 포함된다 [참고: 예를 들어, Klagsbrun and D'Amore (1991) Annu. Rev. Physiol. 53:217-39; Streit and Detmar (2003) Oncogene 22:3172-3179 (e.g., Table 3 listing anti-angiogenic therapy in malignant melanoma); Ferrara & Alitalo (1999) Nature Medicine 5(12):1359-1364; Tonini et al. (2003) Oncogene 22:6549-6556 (e.g., Table 2 listing known antiangiogenic factors); and, Sato (2003) Int. J. Clin. Oncol. 8:200-206 (e.g., Table 1 listing anti- angiogenic agents used in clinical trials)].
본원에 사용된 바와 같은 용어 "VEGF" 또는 "VEGF-A"는 문헌 [참고: Leung et al. (1989) Science 246:1306, and Houck et al. (1991) Mol. Endocrin, 5:1806]에 기재된 바와 같은, 165-아미노산 인간 혈관 내피 세포 성장 인자 및 관련된 121-, 189- 및 206-아미노산 인간 혈관 내피 세포 성장 인자, 및 그의 천연 발생적 대립 유전자성 및 프로세싱된 형태를 지칭한다. 용어 "VEGF"는 또한, 비-인간 종, 예를 들어 마우스, 랫트 또는 영장류로부터의 VEGF를 지칭한다. 종종 특이적 종으로부터의 VEGF는 인간 VEGF의 경우에는 hVEGF란 용어로써 표시되고, 뮤린 VEGF의 경우에는 mVEGF란 용어로써 표시된다. 용어 "VEGF"는 또한, 165-아미노산 인간 혈관 내피 세포 성장 인자의 아미노산 8 내지 109 또는 1 내지 109를 포함하는 폴리펩티드의 절단된 형태를 지칭하기 위해 사용된다. 이러한 형태의 VEGF에 대한 참고는 본 출원에서, 예를 들어 "VEGF (8-109)," "VEGF (1-109)" 또는 "VEGF165"로써 확인할 수 있다. "절단된" 본래의 VEGF에 대한 아미노산 위치는 본래의 VEGF 서열에서 표시된 바와 같이 넘버링된다. 절단된 본래의 VEGF 내의 아미노산 위치 17 (메티오닌)은 또한, 본래의 VEGF 내의 위치 17 (메티오닌)이다. 절단된 본래의 VEGF는 본래의 VEGF와 거의 동등한 수준으로 KDR 및 Flt-1 수용체에 대한 결합 친화도를 갖는다.
"항-VEGF 항체"는 VEGF와 충분한 친화성과 특이성으로 결합하는 항체이다. 바람직하게, 본 발명의 항-VEGF 항체는 VEGF 활성과 관련된 질병이나 질환을 표적으로 하여 이를 방해하는데 있어서 치료제로서 사용할 수 있다. 항-VEGF 항체는 통상적으로, 기타 VEGF 상동체, 예를 들어 VEGF-B 또는 VEGF-C와는 결합하지 않을 뿐만 아니라 기타 성장 인자, 예를 들어 PIGF, PDGF 또는 bFGF와도 결합하지 않을 것이다. 바람직한 항-VEGF 항체는 하이브리도마 ATCC HB 10709에 의해 생산된 모노클로날 항-VEGF 항체 A4.6.1과 동일한 에피토프와 결합하는 모노클로날 항체이다. 보다 바람직하게, 항-VEGF 항체는 문헌 [참고: Presta et al. (1997) Cancer Res. 57:4593-4599]에 따라서 생성된 재조합 인간화 항-VEGF 모노클로날 항체인데, 이에는 베바시주마브 (BV; Avastin™)로서 공지된 항체가 포함되지만, 그에 제한되지 않는다.
"rhuMAb VEGF" 또는 "Avastin®"로서 공지되기도 한 항-VEGF 항체 "베바시주마브 (BV)"는 문헌 [참고: Presta et al. (1997) Cancer Res. 57:4593-4599]에 따라서 생성된 재조합 인간화 항-VEGF 모노클로날 항체이다. 이는 인간 VEGF가 그의 수용체와 결합하는 것을 차단시키는 뮤린 항-hVEGF 모노클로날 항체 A.4.6.1로부터의 항원 결합성 상보성 결정 영역과 돌연변이된 인간 IgG1 골격 영역을 포함한다. 대부분의 골격 영역을 포함한, 베바시주마브의 아미노산 서열의 대략 93%가 인간 IgG1로부터 유래되고, 이 서열의 약 7%는 뮤린 항체 A4.6.1로부터 유래된다. 베바시주마브는 분자량이 약 149,000 달톤이고 당화된다.
"VEGF 길항제"는 VEGF 활성 (이에는 하나 이상의 VEGF 수용체와의 결합성이 포함된다)을 중화, 차단, 억제, 폐기, 저하 또는 방해할 수 있는 분자를 지칭한다. VEGF 길항제에는 항-VEGF 항체 및 그의 항원 결합성 단편; VEGF와 특이적으로 결합함으로써 하나 이상의 수용체에 대한 그의 결합을 봉쇄시키는 수용체 분자 및 유도체; 항-VEGF 수용체 항체; 및 VEGF 수용체 길항제, 예를 들어 VEGF 티로신 키나제의 소분자 억제제가 포함된다.
"치료 (처치)"는 치료적 처치와 예방적 조치 둘 다를 지칭한다. 치료가 필요한 대상체에는 이미 장애가 있는 대상체 뿐만 아니라 해당 장애를 예방하기 위한 대상체가 포함된다.
"장애"는, 예를 들어 비정상적인 혈관형성 (과도한, 부적절한, 또는 제어되지 않은 혈관형성) 또는 혈관 투과성으로 인해 고통받고 있거나 이러한 비정상적인 혈관형성 또는 혈관 투과성에 대항한 예방을 필요로 하는 포유류에게서, 항체를 이용한 치료로부터 이득을 얻을 수 있는 모든 질환이다. 이에는 포유류가 문제의 장애에 걸리기 쉬운 병리적 상태를 포함한, 만성 및 급성 장애 또는 질병이 포함된다. 본원에서 치료하고자 하는 장애의 비제한적 예에는 악성 및 양성 종양; 비-백혈병 및 림프계 악성 종양; 신경 세포, 신경교, 성상 세포, 시상 하부 및 기타 과립상, 대식 세포성, 표피성, 간질성 및 포배강 장애; 및 염증성, 혈관형성성 및 면역학적 장애가 포함된다.
비정상적인 혈관형성은 새로운 혈관이 질병 상태에서 과도하게, 불충분하게 또는 부적절하게 (예를 들어, 혈관형성 부위, 시기 또는 발병이 의학적 관점에서 볼 때 바람직하지 못하다) 성장하는 경우, 또는 이로 인해 질병 상태가 유발되는 경우에 일어난다. 과도한, 부적절한 또는 제어되지 않은 혈관형성은 암, 특히 혈관화 고형 종양 및 전이성 종양 [결장, 폐암 (특히 소세포 폐암), 또는 전립선 암 포함], 안구 신생혈관 생성에 의해 유발된 질환, 특히 당뇨병성 실명, 망막병증, 주로 당뇨병성 망막병증 또는 연령 관련 황반 변성 (AMD), 건선, 건선성 관절염, 혈관모세포종, 예를 들어 혈관종; 염증성 신 질환, 예를 들어 사구체신염, 특히 메산지움 증식성 사구체신염, 용혈성 요독 증후군, 당뇨병성 신병증 또는 고혈압성 신경화증; 각종 염증 질환, 예를 들어 관절염, 특히 류마티스성 관절염, 염증성 장 질환, 건선, 사르코이드증, 동맥성 동맥경화증 및 이식 후 발생하는 질환, 자궁내막증 또는 만성 천식 및 기타 70가지 이상 질환에서와 같이 병든 상태를 유발시키거나 병든 상태를 악화시키는데 일조하는 새로운 혈관 성장이 있는 경우에 일어난다. 새로운 혈관은 병든 조직에 영양을 공급하고, 정상 조직을 파괴시키며, 암의 경우에는 새로운 혈관이 종양 세포를 순환계 내로 도피시켜 다른 기관에 머무르게 할 수 있다 (종양 전이). 예를 들어, 관상 동맥 질환, 발작 및 지연된 상처 치유와 같은 질병에서 병든 상태 악화에 일조하는 부적절한 혈관 성장이 있는 경우에 불충분한 혈관혈성이 일어난다. 추가로, 궤양, 발작 및 심장 마비는 자연 치유를 위해 통상적으로 요구되는 혈관형성의 부재로부터 비롯될 수 있다. 본 발명은 상기 언급된 질병이 발생할 위험이 있는 환자를 치료하는 것을 고려한다.
본 발명의 항체 또는 폴리펩티드를 투여하기 위한 후보인 기타 환자는 섬유혈관 조직의 비정상적 증식, 딸기코, 후천성 면역 결핍증, 동맥 폐색, 아토피성 각막염, 세균성 궤양, 베체트병 (Bechets disease), 혈행성 종양, 경동맥 폐색 질환, 맥락막 신생혈관 증식, 만성 염증, 만성 망막 박리, 만성 포도막염, 만성 유리체염, 콘택트 렌즈 과도착용, 각막 이식편 거부, 각막 신생혈관 증식, 각막 이식편 신생혈관 증식, 크론병 (Crohn's disease), 일스병 (Eales disease), 유행성 각결막염, 진균성 궤양, 단순 포진 감염증, 대상 포진 감염증, 과점성 증후군, 카포시 (Kaposi) 육종, 백혈병, 지질 변성, 라임병 (Lyme's disease), 말단 표피 박리, 무렌 (Mooren) 궤양, 나병 이외의 미코박테리아 감염증, 근시, 안구 신생혈관병, 안와, 오슬러-웨버 (Osler-Weber) 증후군 [오슬러-웨버-렌두 (Osler-Weber-Rendu)], 골관절염, 파제트병 (Pagets disease), 주변 포도막염, 유사천포창, 필렉테눌로시스 (phylectenulosis), 다발성 동맥염, 레이저 후 합병증, 원충 감염증, 탄성섬유성 가성황색종, 건성 익상편 각막염, 방사상 각막절개술, 망막 신생혈관 증식, 미숙아 망막병증, 후수정체 섬유증식증, 사르코이드, 공막염, 겸상 적혈구 빈혈, 쇼그렌 (Sogrens) 증후군, 고형 종양, 슈타르가르츠 (Stargarts) 질환, 스티븐 존슨 (Steven's Johnson) 질환, 상부연 각막염, 매독, 전신성 루푸스, 테리엔 (Terrien) 말단 변성, 독성 플라시모시스, 외상, 유윙 (Ewing) 육종의 종양, 신경모세포종의 종양, 골육종의 종양, 망막모세포종의 종양, 횡문근육종의 종양, 궤양성 결장염, 정맥 폐색, 비타민 A 결핍증 및 베게너 (Wegener) 사르코이드증, 당뇨병과 연관된 바람직하지 못한 혈관형성, 기생충 질병, 비정상적 상처 치유, 수술 후 비대증, 손상 또는 외상, 모발 성장 억제, 배란 및 황체 형성의 억제, 착상 억제 및 자궁 내에서의 배아 발생 억제가 있거나 이러한 질병에 걸릴 위험이 있다.
항혈관형성 요법은 이식편 거부, 폐 염증, 신 증후군, 자간전증, 심낭 삼출, 예를 들어 심막염과 연관된 심낭 삼출, 및 흉막 삼출, 바람직하지 못한 혈관 투과성을 특징으로 하는 질병 및 장애, 예를 들어 뇌 종양과 연관된 부종, 악성 종양과 연관된 복수, 메이그스 (Meigs) 증후군, 폐 염증, 신 증후군, 심낭 삼출, 흉막 삼출, 심혈관계 질환과 연관된 투과성, 예를 들어 심근 경색 및 발작 후의 질환 등의 일반적인 치료에 유용하다.
본 발명에 따르는 기타 혈관형성 의존성 질환에는 혈관섬유종 (출혈을 일으키기 쉬운 비정상적인 혈관), 신생혈관 녹내장 (안구에서의 혈관 성장), 동정맥 기형 (동맥과 정맥 간의 비정상적인 소통), 유착 결여 골절 (치유되지 않을 골절), 아테롬성 경화성 플라크 (동맥의 경화), 화농성 육아종 (혈관으로 구성된 통상의 피부 병변), 피부 경화증 (결합 조직 질병 형태), 혈관종 (혈관으로 구성된 종양), 트라코마 (제3 세계에서 실명의 주요 원인), 혈우병성 관절, 혈관 유착 및 비대성 반흔 (비정상적인 반흔 형성)이 포함된다.
용어 "암" 및 "암성"은 전형적으로 조절되지 않는 세포 성장을 특징으로 하는 포유류에게서의 생리적 질환을 지칭하거나 기재한다. 암의 예에는 암종, 림프종, 모세포종, 육종, 및 백혈병이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 이러한 암의 보다 특정한 예에는 편평 세포 암, 폐암 (소세포 폐암, 비소세포 폐암, 폐의 선암종 및 폐의 편평 암종 포함), 복막암, 간세포암, 위암 (위장암 포함), 췌장암, 교모세포종, 자궁경부암, 난소암, 간암, 방광암, 간세포암, 유방암, 결장암, 결장직장암, 자궁내막 또는 자궁 암종, 타액선 암종, 신장암 또는 신암, 간암, 전립선암, 외음부암, 갑상선암, 간 암종 및 각종 유형의 두경부암 뿐만 아니라; B-세포 림프종 [저 악성도/소포 비호지킨 림프종 (NHL); 소 림프구성 (SL) NHL; 중간 악성도/소포 NHL; 중간 악성도 확산성 NHL; 고 악성도 면역모세포성 NHL; 고 악성도 림프아구성 NHL; 고 악성도 소 비-절단 세포 NHL; 거대 질환 NHL; 외투 세포 림프종; AIDS-관련 림프종 및 발덴스트롬 (Waldenstrom) 마크로글로불린혈증 포함]; 만성 림프구성 백혈병 (CLL); 급성 림프아구성 백혈병 (ALL); 모발 세포 백혈병; 만성 골수아구성 백혈병; 및 이식 후 림프증식성 장애 (PTLD) 뿐만 아니라 모반증, 부종 (예를 들어, 뇌 종양과 연관된 부종) 및 메이그스 증후군과 연관된 비정상적인 혈관 증식이 포함된다.
용어 "항종양 조성물"은 한 가지 이상의 활성 치료제, 예를 들어 "항암제"를 포함하는, 암을 치료하는데 유용한 조성물을 지칭한다. 치료제 (항암제)의 예에는, 예를 들어 화학요법제, 성장 억제제, 세포독성제, 방사선 요법에 사용된 작용제, 항혈관형성제, 세포소멸제, 항투불린제, 및 암을 치료하기 위한 기타 작용제, 예를 들어 항-HER-2 항체, 항-CD20 항체, 표피 성장 인자 수용체 (EGFR) 길항제 (예: 티로신 키나제 억제제), HER1/EGFR 억제제 [예: 에를로티니브 (erlotinib) (Tarceva™)], 혈소판 유래된 성장 인자 억제제 [예: Gleevec™ (이마티니브 메실레이트)], COX-2 억제제 [예: 셀레콕시브 (celecoxib)], 인터페론, 사이토킨, 다음 표적, 즉 ErbB2, ErbB3, ErbB4, PDGFR-베타, BlyS, APRIL, BCMA 또는 VEGF 수용체, TRAIL/Apo2 중의 하나 이상과 결합하는 길항제 (즉, 중화 항체), 및 기타 생체 활성 및 유기 화학제 등이 포함되지만, 그에 제한되지 않는다. 이들 조합물이 또한 본 발명에 포함된다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "세포독성제"는 세포의 기능을 억제 또는 방지하고/하거나 세포의 파괴를 유발시키는 물질을 지칭한다. 이 용어에는 방사성 동위원소 (예: I131, I125, Y90 및 Re186), 화학요법제, 및 독소, 예를 들어 세균, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소적 활성 독소 또는 그의 단편이 포함된다.
"화학요법제"는 암을 치료하는데 유용한 화학적 화합물이다. 화학요법제의 예에는 알킬화제, 예를 들어 티오테파 및 CYTOXAN® 시클로포스파미드; 알킬 설포네이트, 예를 들어 부설판, 임프로설판 및 피포설판; 아지리딘, 예를 들어 벤조도파, 카르보쿠온, 메투레도파, 및 우레도파; 에틸렌이민 및 메틸라멜라민, 예를 들어 알트레타민, 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌포스포르아미드, 트리에틸렌티오포스포르아미드 및 트리메틸롤로멜라민; 아세토게닌 (특히, 불라타신 및 불라타시논); 캄프토테신 (합성적으로 유사한 토포테칸 포함); 브리오스타틴; 칼리스타틴; CC-1065 (그의 아도젤레신, 카르젤레신 및 비젤레신 합성 유사체 포함); 크립토피신 (특히 크립토피신 1 및 크립토피신 8); 돌라스타틴; 두오카르마이신 (합성 유사체 KW-2189 및 CBl-TMl 포함); 엘레우테로빈; 판크라티스타틴; 사르코딕티인; 스폰지스타틴; 질소 머스타드, 예를 들어 클로람부실, 클로르나파진, 콜로포스파미드, 에스트라무스틴, 이포스파미드, 메클로르에타민, 메클로르에타민 옥사이드 히드로클로라이드, 멜팔란, 노벰비킨, 페네스테린, 프레드니무스틴, 트로포스파미드, 우라실 머스타드; 니트로스우레아, 예를 들어 카르무스틴, 클로로조토신, 포테무스틴, 로무스틴, 니무스틴, 및 라님무스틴; 항생제, 예를 들어 엔디인 (enediyne) 항생제 [예를 들어, 칼리케아미신, 특히 칼리케아미신 감마1I 및 칼리케아미신 오메가I1 (참고: Agnew (1994) Chem Intl. Ed. Engl. 33: 183-186); 디네미신 (디네미신 A 포함); 비스포스포네이트, 예를 들어 클로드로네이트, 에스페라미신; 뿐만 아니라 네오카르지노스타틴 발색단 및 관련 색단백질 엔디인 항생제 발색단], 아클라시노마이신, 악티노마이신, 아우트라마이신, 아자세린, 블레오마이신, 칵티노마이신, 카라비신, 카르미노마이신, 카르지노필린, 크로모마이시니스, 닥티노마이신, 다우노루비신, 데토루비신, 6-디아조-5-옥소-L-노르루이신, ADRIAMYCIN® 독소루비신 [모르폴리노-독소루비신, 시아노모르폴리노-독소루비신, 2-피롤리노-독소루비신 및 데옥시독소루비신 포함], 에피루비신, 에소루비신, 이다루비신, 마르셀로마이신, 미토마이신 (예: 미토마이신 C), 미코페놀산, 노갈라마이신, 올리보마이신, 페플로마이신, 포트피로마이신, 푸로마이신, 쿠엘라마이신, 로도루비신, 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 투베르시딘, 우베니멕스, 지노스타틴, 조루비신; 항대사제, 예를 들어 메토트렉세이트 및 5-플루오로우라실 (5-FU); 엽산 유사체, 예를 들어 데노프테린, 메토트렉세이트, 프테로프테린, 트리메트렉세이트; 퓨린 유사체, 예를 들어 플루다라빈, 6-머캅토퓨린, 티아미프린, 티오구아닌; 피리미딘 유사체, 예를 들어 안시타빈, 아자시티딘, 6-아자우리딘, 카르모푸르, 시타라빈, 디데옥시우리딘, 독시플루리딘, 에노시타빈, 플록수리딘; 안드로겐, 예를 들어 칼루스테론, 드로모스타놀론 프로피오네이트, 에피티오스타놀, 메피티오스탄, 테스토락톤; 항부신제, 예를 들어 아미노글루테티미드, 미토탄, 트릴로스탄; 엽산 보충물, 예를 들어 프롤린산; 아세글라톤; 알도포스파미드 글리코시드; 아미노레불린산; 에닐우라실; 암사크린; 베스트라부실; 비산트렌; 에다트락세이트; 데포파민; 데메콜신; 디아지쿠온; 엘포르니틴; 엘리프티늄 아세테이트; 에포틸론; 에토글루시드; 질산갈륨; 히드록시우레아; 렌티난; 로니다이닌; 마이탄시노이드, 예를 들어 마이탄신 및 안사미토신; 미토구아존; 미톡산트론; 모피단몰; 니트라에린; 펜토스타틴; 페나메트; 피라루비신; 로속산트론; 포도필린산; 2-에틸히드라지드; 프로카르바진; PSK® 다당류 복합체 (공급처: JHS Natural Products, Eugene, OR); 라족산; 리족신; 시조피란; 스피로게르마늄; 테누아존산; 트리아지쿠온; 2,2',2"-트리클로로트리에틸아민; 트리코테센 (특히, T-2 독소, 베라쿠린 A, 로리딘 A 및 안구이딘); 우레탄; 빈데신; 다카르바진; 만노무스틴; 미토브로니톨; 미토락톨; 피포브로만; 가시토신; 아라비노시드 ("Ara-C"); 시클로포스파미드; 티오테파; 탁소이드, 예를 들어 TAXOL® 파클리탁셀 (공급처: Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.), ABRAXANE™ 크레모포르-무함유, 파클리탁셀의 알부민-공학 처리시킨 나노입자 제형 (공급처: Americal Pharmaceutical Partners, Schaumberg, Illinois), 및 TAXOTERE® 독세탁셀 (공급처; Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France); 클로란부실; GEMZAR® 젬시타빈; 6-티오구아닌; 머캅토퓨린; 메토트렉세이트; 백금 유사체, 예를 들어 시스플라틴 및 카르보플라틴; 빈블라스틴; 백금; 에토포시드 (VP-16); 이포스파미드; 미톡산트론; 빈크리스틴; NAVELBINE® 비노렐빈; 노반트론; 테니포시드; 에다트렉세이트; 다우노마이신; 아미노프테린; 크셀로다; 이반드로네이트; 이리노테칸 (캄프토사르, CPT-11) (이리노테칸과 5-FU 및 류코보린의 치료 섭생 포함); 토포이소머라제 억제제 RFS 2000; 디플루오로메틸오르니틴 (DMFO); 레티노이드 (예: 레티노산); 카페시타빈; 콤브레타스타틴; 류코보린 (LV); 옥살리플라틴 [옥살리플라틴 치료 섭생 (FOLFOX) 포함]; 세포 증식을 저하시키는 PKC-알파, Raf, H-Ras, EGFR [예: 에를로티니브 (Tarceva™)] 및 VEGF-A의 억제제; 및 상기 언급된 제제의 제약상 허용 가능한 염, 산 또는 유도체가 포함된다.
상기 정의에는 또한, 종양에 대한 호르몬 작용을 조절 또는 억제시키는 작용을 하는 항호르몬제, 예를 들어 항에스트로겐제 및 선택적 에스트로겐 수용제 조정제 (SERM)가 포함되는데, 예를 들어 타목시펜 (NOLVADEX® 타목시펜 포함), 랄록시펜, 드롤록시펜, 4-히드록시타목시펜, 트리옥시펜, 케옥시펜, LY117018, 오나프리스톤 및 FARESTON® 토레미펜; 부신에서의 에스트로겐 생성을 조절하는 효소 아로마타제를 억제하는 아로마타제 억제제, 예를 들어 4(5)-이미다졸, 아미노글루테티미드, MEGASE® 메게스트롤 아세테이트, AROMASIN® 엑세메스탄, 포르메스타니에, 파드로졸, RIVISOR® 보로졸, FEMARA® 레트로졸 및 ARIMIDEX® 아나스트로졸; 및 항안드로겐제, 예를 들어 플루타미드, 닐루타미드, 비칼루타미드, 류프롤리드 및 고세렐린; 뿐만 아니라 트록사시타빈 (1,3-디옥솔란 뉴클레오시드 시토신 유사체); 안티센스 올리고뉴클레오티드, 특히 이상한 세포 증식에 밀접한 영향을 미치는 신호 전달 경로에 있어 유전자, 예를 들어 PKC-알파, Raf 및 H-Ras의 발현을 억제시키는 안티센스 올리고뉴클레오티드; 리보자임, 예를 들어 VEGF 발현 억제제 (예: ANGIOZYME® 리보자임) 및 HER2 발현 억제제; 백신, 예를 들어 유전자 요법 백신, 예를 들면 ALLOVECTIN® 백신, LEUVECTIN® 백신 및 VAXID® 백신; PROLEUKIN® rIL-2; LURTOTECAN® 토포이소머라제 1 억제제; ABARELIX® rmRH; 비노렐빈 및 에스페라미신 [참고: 미국 특허 제4,675,187호]; 및 이들의 제약상 허용 가능한 염, 산 또는 유도체가 포함된다.
본 출원에 사용된 바와 같은 용어 "프로드럭 (prodrug)"은 모 약물과 비교해서 종양 세포에 대해 덜 세포독성이고 효소적으로 활성화되거나 보다 더 활성인 모 형태로 전환될 수 있는, 제약상 활성 물질의 전구체 또는 유도체 형태를 지칭한다 [참고: 예를 들어, Wilman (1986), "Prodrugs in Cancer Chemotherapy" Biochemical Society Transactions, 14, pp. 375-382, 615th Meeting Belfast and Stella et al. (1985), "Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery," Directed Drug Delivery, Borchardt et al., (ed.), pp. 247-267, Humana Press]. 본 발명의 프로드럭에는 보다 활성인 세포독성 자유 약물로 전환될 수 있는, 포스페이트 함유 프로드럭, 티오포스페이트 함유 프로드럭, 설페이트 함유 프로드럭, 펩티드 함유 프로드럭, D-아미노산 변형된 프로드럭, 당화 프로드럭, β-락탐 함유 프로드럭, 임의로 치환된 페녹시아세트아미드 함유 프로드럭 또는 임의로 치환된 페닐아세트아미드 함유 프로드럭, 5-플루오로시토신, 및 기타 5-플루오로우리딘 프로드럭이 포함되지만, 그에 제한되지 않는다. 본 발명에 사용하기 위한 프로드럭 형태로 유도체화할 수 있는 세포독성 약물의 예에는 상기 언급된 화학요법제가 포함되지만, 그에 제한되지 않는다.
"분리된" 핵산 분자는 항체 핵산의 천연 공급원 내에서 통상 연합되는 하나 이상의 오염성 핵산 분자로부터 확인되어 이로부터 격리시킨 핵산 분자이다. 분리된 핵산 분자는 천연에서 발견되는 형태 또는 환경 이외의 것이다. 따라서, 분리된 핵산 분자는 천연 세포에 존재하는 바와 같은 핵산 분자와는 구별된다. 그러나, 분리된 핵산 분자에는, 예를 들어 핵산 분자가 천연 세포와는 상이한 염색체 위치 내에 존재하는 경우에 항체를 통상적으로 발현하는 세포 내에 함유된 핵산 분자가 포함된다.
"제어 서열"이란 표현은 특별한 숙주 유기체에서 작동적으로 연결된 암호화 서열을 발현시키는데 필요한 DNA 서열을 지칭한다. 원핵생물에 적합한 제어 서열에는, 예를 들어 프로모터, 임의의 작동인자 서열, 및 리보솜 결합 부위가 포함된다. 진핵 세포는 프로모터, 폴리아데닐화 신호 및 증강인자를 활용하는 것으로 공지되어 있다.
핵산은 이것이 또 다른 핵산 서열과 기능적 관계에 놓여있을 때 "작동적으로 연결된"다. 예를 들어, 프리-서열 또는 분비성 리더에 대한 DNA는 이것이 해당 폴리펩티드의 분비에 참여하는 프리-단백질로서 발현되는 경우에 이러한 폴리펩티드에 대한 DNA에 작동적으로 연결되어 있거나; 프로모터 또는 증강인자는 이것이 암호화 서열의 전사에 영향을 미치는 경우에 이러한 서열과 작동적으로 연결되어 있거나; 또는 리보솜-결합 부위는 이것이 해독을 촉진시키도록 위치 설정된 경우에 암호화 서열과 작동적으로 연결되어 있다. 일반적으로, "작동적으로 연결된"이란 연결되는 DNA 서열이 연속된 것이고, 분비성 리더인 경우에는 연속된 판독 기에 있다는 것을 의미한다. 그러나, 증강인자는 연속적이지 않다. 편리한 제한 부위에서 연결시킴으로써 연결을 수행한다. 이러한 부위가 존재하지 않는 경우에는, 합성 올리고뉴클레오티드 적응인자 또는 링커를 통상적인 실시에 따라서 사용할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 표현 "세포", "세포주" 및 "세포 배양물"은 상호 교환적으로 사용되고, 이러한 명칭 모두는 자손을 포함한다. 따라서, 단어 "형질전환체" 및 "형질전환된 세포"에는 1차 대상 세포와, 전이 횟수에 상관없이 이로부터 유래된 배양물이 포함된다. 의도하였거나 의도하지 않은 돌연변이로 인해, 모든 자손이 DNA 함량에 있어 정확하게 동일할 수는 없다는 것을 인지해야 한다. 최초로 형질전환된 세포에 대해 스크리닝한 바와 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 지닌 돌연변이체 자손이 포함된다. 별개의 명칭을 고려하는 경우에도, 이는 본문 내용으로부터 명백할 것이다.
본 발명의 수행 방식
항-NRP1 항체의 생성
본 발명은 신규한 항-NRP1 항체를 제공한다. 항체를 생성시키기 위한 예시 방법이 다음 섹션에 보다 상세히 기재되어 있다.
신규한 항-NRP1 항체는 포유류 종으로부터 유래된 NRP1 항원을 사용하여 선별한다. 바람직하게, 상기 항원은 인간 NRP1 (hNRP1)이다. 그러나, 기타 종으로부터의 NRP1, 예를 들어 뮤린 NRP1 (mNRP1)을 표적 항원으로서 사용할 수 있다. 각종 포유류 종으로부터의 NRP 항원은 천연 공급원으로부터 분리할 수 있다. 기타 양태에서, 항원은 재조합적으로 생성시키거나, 또는 당해 분야에 공지된 기타 합성 방법을 사용하여 만든다.
선별된 항체는 통상적으로, NRP1 항원에 대한 충분히 강력한 결합 친화도를 가질 것이다. 예를 들어, 항체는 hNRP1과 약 5 nM 이하, 바람직하게 약 2 nM 이하, 보다 바람직하게 약 50O pM 이하의 Kd 값으로 결합할 수 있다. 항체 친화도는, 예를 들어 표면 플라스몬 공명에 의거한 검정 (예: 본 실시예에 기재된 바와 같은 BIAcore 검정); 효소 결합 면역 흡착 검정 (ELISA); 및 경쟁 검정 (예: RIA)에 의해 결정할 수 있다.
또한, 항체를 대상으로 하여 그의 치료제로서의 유효성을 평가하기 위해 기타 생물학적 활성 검정을 수행할 수 있다. 이러한 검정은 당해 분야에 공지되어 있고 표적 항원과 의도한 항체 용도에 좌우된다. 이의 예에는 HUVEC 억제 검정 (다음 실시예에 기재된 바와 같음); 종양 세포 성장 억제 검정 (예를 들어, WO 89/06692에 기재된 바와 같음); 항체 의존성 세포성 세포독성 (ADCC) 및 보체-매개된 세포독성 (CDC) 검정 [참고: 미국 특허 제5,500,362호]; 및 작동 활성 또는 조혈 검정 [참고: WO 95/27062]이 포함된다.
관심있는 항원 상의 특별한 에피토프와 결합하는 항체를 스크리닝하기 위해, 예를 들어 문헌 [참고: Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane (1988)]에 기재된 바와 같은 통상적인 교차-차단성 검정을 수행할 수 있다. 또 다른 한편, 예를 들어 문헌 [참고: Champe et al. (1995) J. Biol. Chem. 270:1388-1394]에 기재된 바와 같은 에피토프 지도화를 수행하여 항체가 관심있는 에피토프와 결합하는지를 결정할 수 있다.
합성 항체 파아지 라이브러리로부터 신규한 항-NRP1 항체의 생성
바람직한 양태에서, 본 발명은 독특한 파아지 디스플레이 접근 방식을 사용하여 신규한 항-NRP1 항체를 생성 및 선별시키는 방법을 제공한다. 이러한 접근 방식은 단일 골격 주형에 기초하여 합성 항체 파아지 라이브러리를 생성시키고, 가변 도메인 내에 충분한 다양성을 설계하며, 다양화된 가변 도메인을 갖는 폴리펩티드를 디스플레이하고, 표적 NRP1 항원에 대한 고 친화성을 지닌 후보 항체를 선별하며, 이와 같이 선별된 항체를 분리하는 것을 포함한다.
파아지 디스플레이 방법에 관한 상세 내역은, 예를 들어 WO 03/102157 (2003년 12월 11일자로 공개됨)를 참고할 수 있다.
한 국면에서, 본 발명에 사용된 항체 라이브러리는 항체 가변 도메인의 하나 이상의 CDR 내의 용매 접근 가능한 위치 및/또는 고도로 다양한 위치를 돌연변이시킴으로써 생성시킬 수 있다. 몇몇 CDR 또는 모든 CDR은 본원에 제공된 방법을 사용하여 돌연변이시킬 수 있다. 몇몇 양태에서, CDRH1, CDRH2 및 CDRH3 내의 위치를 돌연변이시켜 단일 라이브러리를 형성시키거나, CDRL3 및 CDRH3 내의 위치를 돌연변이시켜 단일 라이브러리를 형성시키거나, 또는 CDRL3 및 CDRH1, CDRH2 및 CDRH3 내의 위치를 돌연변이시켜 단일 라이브러리를 형성시킴으로써 다양한 항체 라이브러리를 생성시키는 것이 바람직할 수 있다.
예를 들어, CDRH1, CDRH2 및 CDRH3의 용매 접근 가능한 위치 및/또는 고도로 다양한 위치에서 돌연변이가 이루어진 항체 가변 도메인의 라이브러리를 생성시킬 수 있다. CDRL1, CDRL2 및 CDRL3 내에서 돌연변이가 이루어진 또 다른 라이브러리를 생성시킬 수 있다. 이들 라이브러리는 서로 연계해서 사용하여 목적하는 친화성의 결합제를 생성시킬 수도 있다. 예를 들어, 표적 항원과 결합하는 것을 알아보기 위해 중쇄 라이브러리를 1회전 이상 선별한 후, 결합제의 친화성을 증가시키기 위한 추가 선별 회전 동안 경쇄 라이브러리를 중쇄 집단으로 대체시킬 수 있다.
바람직하게, 라이브러리는 본래 아미노산을 중쇄 서열의 가변 영역의 CDRH3 영역 내의 변이체 아미노산으로 치환시킴으로써 창출된다. 이로써 생성되는 라이브러리는 복수 개의 항체 서열을 함유할 수 있는데, 서열 다양성은 주로 중쇄 서열의 CDRH3 영역 내에 있다.
한 국면에서, 라이브러리는 인간화 항체 4D5 서열, 또는 인간화 항체 4D5 서열의 골격 아미노산 서열 맥락에서 창출된다. 바람직하게, 라이브러리는 적어도 중쇄 잔기 95-10Oa를 DVK 코돈 세트에 의해 암호화된 아미노산으로 치환시킴으로써 창출되는데, DVK 코돈 세트는 이들 위치 1개마다 변이체 아미노산 세트를 암호화하기 위해 사용된다. 이들 치환을 창출시키는데 유용한 올리고뉴클레오티드 세트의 한 예는 서열 (DVK)7을 포함한다. 몇몇 양태에서, 특정 라이브러리는 잔기 95-10Oa를 DVK 코돈 세트와 NNK 코든 세트 둘 다에 의해 암호화된 아미노산으로 치환시킴으로써 창출시킨다. 이들 치환을 창출시키는데 유용한 올리고뉴클레오티드 세트의 한 예는 서열 (DVK)6(NNK)을 포함한다. 또 다른 양태에서, 특정 라이브러리는 적어도 잔기 95-10Oa를 DVK 코돈 세트와 NNK 코든 세트 둘 다에 의해 암호화된 아미노산으로 치환시킴으로써 창출시킨다. 이들 치환을 창출시키는데 유용한 올리고뉴클레오티드 세트의 한 예는 서열 (DVK)5(NNK)을 포함한다. 이들 치환을 창출시키는데 유용한 올리고뉴클레오티드 세트의 또 다른 예는 서열 (NNK)6을 포함한다. 적합한 올리고뉴클레오티드 서열의 기타 예는 본원에 기재된 기준에 따라서 당업자에 의해 결정할 수 있다.
또 다른 양태에서, 상이한 CDRH3 설계를 활용하여 고 친화성 결합제를 분리하고 각종 에피토프에 대한 결합제를 분리한다. 이러한 라이브러리에서 생성된 CDRH3의 길이 범위는 11 내지 13개 아미노산이지만, 이와 상이한 길이가 생성될 수도 있다. NNK, DVK 및 NVK 코든 세트를 사용함으로써 H3 다양성을 확장시킬 수 있을 뿐만 아니라 N 및/또는 C 말단에서 보다 제한된 다양성을 만들 수 있다.
다양성은 CDRH1 및 CDRH2에서도 생성될 수 있다. CDR-H1 및 H2 다양성의 설계는 기존의 설계 보다는 천연 다양성에 보다 근접하게 부합된 다양성에 초점을 맞춘 변형을 수반하여 기재된 바와 같은 모의 천연 항체 레퍼토리를 표적으로 하는 전략에 따른다.
CDRH3에서의 다양성을 위해, 다중 라이브러리를 상이한 길이의 H3과 별개로 구축한 다음, 합하여 표적 항원에 대한 결합제에 대해 선별할 수 있다. 다중 라이브러리를 모은 다음, 앞서 기재되고 다음에 기재되는 바와 같은 고체 지지체 선별 및 용액 분류 방법을 사용하여 분류할 수 있다. 다중 분류 전략을 이용할 수 있다. 예를 들어, 한 가지 전략은 고체와 결합된 표적 상에서 분류한 다음, 융합 폴리펩티드 상에 존재할 수 있는 태그 (예: 항-gD 태그)에 관하여 분류하고, 이어서 고체와 결합된 표적 상에서 또 다르게 분류하는 것을 포함한다. 또 다른 한편, 라이브러리를 먼저, 고체 표면과 결합된 표적 상에서 분류한 다음, 표적 항원의 농도를 감소시키면서 용액 상 결합을 이용하여, 상기 용출된 결합제를 분류한다. 상이한 분류 방법을 조합하여 활용하는 것은 단지 고도로 발현된 서열 선별을 최소화시켜 주고 수 많은 상이한 고 친화성 클론을 선별시켜 준다.
표적 NRP1 항원에 대한 고 친화성 결합제를 상기 라이브러리로부터 분리할 수 있다. H1/H2 영역에서의 다양성을 제한하면 축퇴가 약 104 내지 약 105배 저하되고, 보다 많은 H3 다양성을 허용하면 보다 고 친화성 결합제가 제공된다. CDRH3에서 상이한 유형의 다양성을 지닌 라이브러리를 활용하면 (예를 들어, DVK 또는 NVT를 활용함) 표적 항원의 상이한 에피토프와 결합할 수 있는 결합제를 분리할 수 있다.
상기 언급된 바와 같이 풀링된 라이브러리로부터 분리된 결합제 중에서, 경쇄에서의 다양성을 제한함으로써 친화성을 추가로 개선시킬 수 있다는 사실이 밝혀졌다. 이러한 양태에서는 경쇄 다양성이 다음과 같이 생성될 수 있다: CDRL1에서: 아미노산 위치 28은 RDT에 의해 암호화되고; 아미노산 위치 29는 RKT에 의해 암호화되며; 아미노산 위치 30은 RVW에 의해 암호화되고; 아미노산 위치 31은 ANW에 의해 암호화되며; 아미노산 위치 32는 THT에 의해 암호화되고; 임의로, 아미노산 위치 33은 CTG에 의해 암호화되며; CDRL2에서: 아미노산 위치 50은 KBG에 의해 암호화되고; 아미노산 위치 53은 AVC에 의해 암호화되며; 임의로, 아미노산 위치 55는 GMA에 의해 암호화되고; CDRL3에서: 아미노산 위치 91은 TMT 또는 SRT, 또는 둘 다에 의해 암호화되며; 아미노산 위치 92는 DMC에 의해 암호화되고; 아미노산 위치 93은 RVT에 의해 암호화되며; 아미노산 위치 94는 NHT에 의해 암호화되고; 아미노산 위치 96은 TWT 또는 YKG, 또는 둘 다에 의해 암호화된다.
또 다른 양태에서, CDRH1, CDRH2 및 CDRH3 영역에서의 다양성을 지닌 라이브러리(들)이 생성된다. 이러한 양태에서, CDRH3에서의 다양성은 각종 길이의 H3 영역을 사용하고 주로 코돈 세트 XYZ 및 NNK 또는 NNS를 사용하여 생성시킨다. 라이브러리는 개개의 올리고뉴클레오티드를 사용하여 형성시킨 다음 모으거나, 또는 올리고뉴클레오티드를 모아 라이브러리의 일부를 형성시킬 수 있다. 이러한 양태의 라이브러리를 고체와 결합된 표적에 대항하여 분류할 수 있다. 다중 분류로부터 분리한 클론을 대상으로 하여, ELISA 검정을 사용하여 특이성과 친화성에 관하여 스크리닝할 수 있다. 특이성의 경우, 목적하는 표적 항원 뿐만 아니라 기타 비표적 항원에 대항하는 클론을 스크리닝할 수 있다. 이어서, 표적 NRP1 항원에 대한 결합제를 대상으로 하여 용액 결합 경쟁 ELISA 검정 또는 스폿 경쟁 검정에서 친화성에 관하여 스크리닝할 수 있다. 상기 언급된 바와 같이 제조된 XYZ 코든 세트를 활용하는 라이브러리로부터 고 친화성 결합제를 분리할 수 있다. 이들 결합제는 세포 배양액 중에서 항체 또는 항원 결합성 단편으로서 고 수율로 용이하게 생성될 수 있다.
몇몇 양태에서, CDRH3 영역의 길이 측면에서 다양성이 보다 큰 라이브러리를 생성시키는 것이 요망될 수 있다. 예를 들어, 약 7 내지 19개 아미노산 범위의 CDRH3 영역을 지닌 라이브러리를 생성시키는 것이 요망될 수 있다.
이들 양태의 라이브러리로부터 분리된 고 친화성 결합제는 세균성 및 진핵성 세포 배양물 중에서 고 수율로 용이하게 생성된다. gD 태그, 바이러스성 외피 단백질 성분 등의 서열을 용이하게 제거시키고/시키거나 불변 영역 서열에 부가하여 완전한 길이의 항체 또는 항원 결합성 단편을 고 수율로 생성시켜 주는 벡터를 설계할 수 있다.
CDRH3에서의 돌연변이를 수반한 라이브러리를, 기타 CDR의 변이체 버젼, 예를 들어 CDRL1, CDRL2, CDRL3, CDRH1 및/또는 CDRH2를 함유하는 라이브러리와 합할 수 있다. 따라서, 예를 들어 한 양태에서, CDRH3라이브러리를 예정된 코돈 세트를 사용하여 위치 28, 29, 30, 31 및/또는 32에서의 변이체 아미노산을 수반한 인간화 4D5 항체 서열 맥락에서 창출된 CDRL3 라이브러리와 합한다. 또 다른 양태에서는, CDRH3에 대한 돌연변이를 수반한 라이브러리를, 변이체 CDRH1 및/또는 CDRH2 중쇄 가변 도메인을 포함하는 라이브러리와 합할 수 있다. 한 양태에서, CDRH1 라이브러리는 위치 28, 30, 31, 32 및 32에서의 변이체 아미노산을 수반한 인간화 4D5 항체 서열을 이용하여 창출시킨다. CDRH2 라이브러리는 예정된 코돈 세트를 사용하여 50, 52, 53, 54, 56 및 58에서의 변이체 아미노산을 수반한 인간화 항체 4D5 서열을 이용하여 창출시킨다.
항-NRP1 항체 돌연변이체
파아지 디스플레이로부터 생성된 신규한 항-NRP1 항체를 추가로 변형시켜 모 항체에 비해 개선된 물리적, 화학적 및/또는 생물학적 특성을 지닌 항체 돌연변이체를 생성시킬 수 있다. 사용된 검정이 생물학적 활성 검정인 경우, 항체 돌연변이체는 선택 검정에서의 생물학적 활성이, 이러한 검정에서의 모 항체의 생물학적 활성 보다 약 10배 이상, 바람직하게 약 20배 이상, 보다 바람직하게 약 50배 이상, 종종 약 100배 이상 또는 200배 이상 더 우수하다. 예를 들어, 항-NRP1 항체 돌연변이체는 바람직하게, NRP1에 대한 결합 친화도가 모 항-NRP1 항체의 결합 친화도 보다 약 10배 이상, 바람직하게 약 20배 이상, 보다 바람직하게 약 50배 이상, 종종 약 100배 이상 또는 200배 이상 더 강력하다.
이러한 항체 돌연변이체를 생성시키기 위해, 하나 이상의 아미노산 변경 (예: 치환)을 모 항체의 하나 이상의 초가변 영역에 도입한다. 또 다른 한편, 또는 또한, 골격 영역 잔기의 하나 이상의 변경 (예: 치환)을 모 항체에 도입할 수 있는데, 이로써 제2 포유류 종으로부터의 항원에 대한 항체 돌연변이체의 결합 친화도가 개선된다. 변형시키기 위한 골격 영역 잔기의 예에는 항체와 직접 비공유적으로 결합하고/하거나 [참고: Amit et al. (1986) Science 233:747-753]; CDR의 입체 형태 효과와 상호 작용하고/하거나 [참고: Chothia et al. (1987) J. Mol. Biol. 196:901-917] VL - VH 계면에 참여하는 잔기가 포함된다 [참고: EP 239 400B1]. 특정 양태에서, 이러한 골격 영역 잔기 하나 이상의 변형으로 인해, 제2 포유류 종으로부터의 항원에 대한 항체의 결합 친화도가 증강된다. 예를 들어, 이러한 본 발명의 양태에서는 약 1개 내지 약 5개 골격 잔기를 변경시킬 수 있다. 종종 초가변 영역 잔기 중의 어느 것도 변경시키지 않은 경우일지라도, 전임상 시험에 사용하기 적합한 항체 돌연변이체를 산출시키기에는 상기와 같은 변경이면 충분할 수 있다. 그러나, 통상적으로 항체 돌연변이체는 부가의 초가변 영역 변경(들)을 포함할 것이다.
변경되는 초가변 영역 잔기는, 특히 모 항체의 출발 결합 친화도가 무작위로 생성된 항체 돌연변이체를 용이하게 스크리닝할 수 있도록 하는 수준인 경우에 무작위로 변화시킬 수 있다.
이러한 항체 돌연변이체를 생성시키기 위한 한 가지 유용한 과정은 "알라닌 스캐닝 돌연변이 유발"로 지칭된다 [참고: Cunningham and Wells (1989) Science 244:1081-1085]. 여기서는, 초가변 영역 잔기(들) 중의 하나 이상을 알라닌 또는 폴리알라닌 잔기로 대체시켜 아미노산과 제2 포유류 종으로부터의 항원과의 상호 작용에 영향을 미친다. 이때, 치환에 대한 기능적 민감성을 나타내는 초가변 영역 잔기는 치환 부위에 추가의 또는 기타 변형을 도입함으로써 정련시킨다. 따라서, 아미노산 서열 변이를 도입하기 위한 부위가 예정되긴 하였지만, 돌연변이 자체의 특성이 예정될 필요는 없다. 이러한 방식으로 생성된 ala-돌연변이체를 대상으로 하여 본원에 기재된 바와 같은 그들의 생물학적 활성에 관하여 스크리닝한다.
통상적으로, 보존적 치환이 "바람직한 치환물"이란 표제 하에 다음에 나타나 있다. 이러한 치환으로 인해 생물학적 활성 (예: 결합 친화도) 상의 변화가 이루어진다면, 다음 표에서 "예시 치환물"로 명명되거나 아미노산 부류와 관련하여 다음에 추가로 기재되는 바와 같은 보다 실재적인 변화를 도입하고 생성물을 스크리닝한다.
바람직한 치환물:
Figure 112008040384719-PCT00001
Figure 112008040384719-PCT00002
항체의 생물학적 특성 면에 있어서 보다 더 실질적인 변형은 (a) 치환 부위에서 폴리펩티드 주쇄의 구조를, 예를 들어 시트 또는 나선 입체 형태로서 유지시키는 데에 대한 그의 효과, (b) 표적 부위에서 분자의 전하 또는 소수성을 유지시키는 데에 대한 그의 효과, 또는 (c) 측쇄의 벌크를 유지시키는 데에 대한 그의 효과 측면에서 상당히 상이한 치환을 선택함으로써 달성한다. 천연 발생적 잔기는 공통의 측쇄 특성을 기초로 하여 다음 군으로 나눌 수 있다:
(1) 소수성: 노르루이신, met, ala, val, leu, ile;
(2) 중성 친수성: cys, ser, thr, asn, gln;
(3) 산성: asp, glu;
(4) 염기성: his, lys, arg;
(5) 쇄 배향에 영향을 미치는 잔기: gly, pro; 및
(6) 방향족: trp, tyr, phe.
비-보존적 치환은 이들 부류 중의 하나의 구성원을 또 다른 부류의 구성원으로 교환시키는 것을 수반할 것이다.
또 다른 양태에서, 변형을 위해 선택된 부위는 파아지 디스플레이 (상기 참고)를 이용하여 친화성 성숙시킨다.
아미노산 서열 변이체를 암호화하는 핵산 분자는 당해 분야에 공지된 각종 방법에 의해 제조한다. 이들 방법에는 앞서 제조된 돌연변이체 또는 모 항체의 비-돌연변이체 버젼을 올리고뉴클레오티드-매개된 (또는 부위-지시된) 돌연변이 유발, PCR 돌연변이 유발 및 카세트 돌연변이 유발시키는 방법이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 돌연변이체를 제조하는 바람직한 방법은 부위 지시된 돌연변이 유발이다 [참고: 예를 들어, Kunkel (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488].
특정 양태에서, 항체 돌연변이체는 치환된 단일 초가변 영역 잔기 만을 가질 것이다. 기타 양태에서, 모 항체의 초가변 영역 잔기의 2개 이상, 예를 들어 약 2개 내지 약 10개 초가변 영역이 치환될 것이다.
통상적으로, 개선된 생물학적 특성을 지닌 항체 돌연변이체는 모 항체의 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인의 아미노산 서열과의 아미노산 서열 동일률 또는 유사율이 75% 이상, 보다 바람직하게 80% 이상, 보다 바람직하게 85% 이상, 보다 바람직하게 90% 이상, 가장 바람직하게 95% 이상인 아미노산 서열을 가질 것이다. 이러한 서열과 관련한 동일률 또는 유사율은 서열들을 정렬시키고, 필요한 경우 갭을 도입하여 최대 서열 동일률을 달성한 후, 모 항체 잔기와 동일하거나 (즉, 동일한 잔기) 유사한 (즉, 공통의 측쇄 특성을 기준으로 하여 동일한 군으로부터의 아미노산 잔기, 상기 참고), 후보 서열 중의 아미노산 잔기의 비율로서 본원에 정의된다. 어떠한 N-말단, C-말단 또는 내부 연장물, 결실물, 또는 가변 도메인 외부에 있는 항체 서열 내로의 삽입물도 서열 동일률 또는 유사율에 영향을 미치는 것으로 간주되지 말아야 한다.
항체 돌연변이체를 생성시킨 후, 모 항체와 비교하여 해당 분자의 생물학적 활성을 결정한다. 상기 언급된 바와 같이, 이는 항체의 결합 친화도 및/또는 기타 생물학적 활성을 결정하는 것을 포함할 수 있다. 본 발명의 바람직한 양태에서, 항체 돌연변이체 패널을 준비하고, 이를 대상으로 하여 NRP1과 같은 항원 또는 그의 단편에 대한 결합 친화도에 관하여 스크리닝한다. 이러한 초기 스크린으로부터 선별된 하나 이상의 항체 돌연변이체를 대상으로 하여, 임의로 한 가지 이상의 추가 생물학적 활성 검정을 수행하여 결합 친화도가 증강된 항체 돌연변이체가 실제로, 예를 들어 전임상 연구에 유용한지를 확인한다.
이와 같이 선별된 항체 돌연변이체를 대상으로 하여, 종종 의도한 항체 용도에 따라서 추가의 변형을 수행할 수 있다. 이러한 변형에는 아미노산 서열의 추가 변경, 이종 폴리펩티드와의 융합 및/또는 다음에 상세히 설명되는 바와 같은 공유 변형이 포함될 수 있다. 아미노산 서열 변경과 관련하여, 예시 변형이 다음에 상세히 설명된다. 예를 들어, 항체 돌연변이체의 적당한 입체 형태를 유지시키는 데에 관여하지 않은 어떠한 시스테인 잔기도, 일반적으로 세린으로 치환시켜 분자의 산화적 안정성을 개선시키고 이상한 가교 결합을 방지할 수 있다. 역으로 말하면, 시스테인 결합을 항체에 가하여 그의 안정성을 개선시킬 수 있다 (특히, 항체가 Fv 단편과 같은 항체 단편인 경우). 또 다른 유형의 항체 돌연변이체는 변경된 당화 패턴을 갖고 있다. 이는 항체에서 발견된 하나 이상의 탄수화물 부분을 결실시키고/시키거나 항체에는 존재하지 않는 하나 이상의 당화 부위를 부가함으로써 달성할 수 있다. 항체의 당화는 전형적으로, N-연결 또는 O-연결된다. N-연결된이란 탄수화물 부분을 아스파라긴 잔기의 측쇄에 부착시킨 것을 지칭한다. 트리펩티드 서열 아스파라긴-X-세린 및 아스파라긴-X-트레오닌 (여기서, X는 프롤린을 제외한 모든 아미노산이다)은 탄수화물 부분을 아스파라긴 측쇄에 효소적 부착시키기 위한 인식 서열이다. 따라서, 이들 트리펩티드 서열 중의 어느 하나가 폴리펩티드에 존재하는 것은 잠재적 당화 부위를 창출시켜 준다. O-연결된 당화는 당 N-아세틸갈락토사민, 갈락토스 또는 크실로스 중의 하나를 히드록시아미노산, 가장 통상적으로는 세린 또는 트레오닌에 부착시키는 것을 지칭하지만, 5-히드록시프롤린 또는 5-히드록시리신을 사용할 수도 있다. 당화 부위를 항체에 부가하는 것은 (N-연결된 당화 부위의 경우에는) 상기 언급된 트리펩티드 서열 중의 하나 이상를 함유하도록 아미노산 서열을 변경시킴으로써 편리하게 수행된다. 이러한 변경은 하나 이상의 세린 또는 트레오닌 잔기를 본래의 항체 서열에 부가하거나, 또는 이들 잔기에 의해 치환시킴으로써 만들 수도 있다 (O-연결된 당화 부위의 경우).
벡터, 숙주 세포 및 재조합 방법
본 발명의 항-NRP1 항체는 용이하게 수득 가능한 물질 및 기술을 사용하여 재조합적으로 생성시킬 수 있다.
항-NRP1 항체를 재조합 생성하기 위해, 이를 암호화하는 핵산을 분리하고, 이를 복제 가능한 벡터 내로 삽입하여 추가로 클로닝하거나 (DNA의 증폭) 또는 추가로 발현시킨다. 상기 항체를 암호화하는 DNA는 통상적인 과정을 사용하여 (예를 들어, 항체의 중쇄와 경쇄를 암호화하는 DNA와 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용함으로써) 용이하게 분리 또는 합성한다. 많은 벡터가 입수 가능하다. 벡터 성분에는 일반적으로, 다음 중의 하나 이상이 포함되지만, 그에 제한되지 않는다: 신호 서열, 복제 기점, 하나 이상의 마커 유전자, 증강인자 요소, 프로모터, 및 전사 종결 서열.
(i) 신호 서열 성분
본 발명의 항체는 직접적으로 뿐만 아니라 이종 폴리펩티드, 바람직하게는 신호 서열, 또는 성숙한 단백질 또는 폴리펩티드의 N-말단에 특이적 절단 부위를 갖는 기타 폴리펩티드와의 융합 폴리펩티드로서 재조합적으로 생성될 수 있다. 선별된 이종 신호 서열은 바람직하게는, 숙주 세포에 의해 인식되고 프로세싱되는 (즉, 신호 펩티다제에 의해 절단되는) 것이다. 본래의 항체 신호 서열을 인식 및 프로세싱하지 못하는 원핵성 숙주 세포의 경우에는, 신호 서열을, 예를 들어 알칼리성 포스파타제, 페니실리나제, lpp 또는 열-안정한 엔테로톡신 II 리더로 이루어진 군 중에서 선택된 원핵성 신호 서열로 대체시킨다. 효모 분비의 경우에는, 본래의 신호 서열을, 예를 들어 효모 전화효소 리더, α-인자 리더 [삭카로마이세스 (Saccharomyces) 및 클루이베로마이세스 (Kluyveromyces) α-인자 리더 포함], 산-포스파타제 리더, 씨. 알비칸스 (C. albicans) 글루코아밀라제 리더, 또는 문헌 [참고: WO 90/13646]에 기재된 신호로 대체시킬 수 있다. 포유류 세포 발현에서는, 포유류 신호 서열 뿐만 아니라 바이러스성 분비 리더, 예를 들어 단순 포진 gD 신호를 이용할 수 있다.
이러한 전구체 영역에 대한 DNA가 동일 판독 프레임 내에서, 상기 항체를 암호화하는 DNA에 연결된다.
(ii) 복제 기점 성분
발현 벡터와 클로닝 벡터 둘 다는 이러한 벡터가 하나 이상의 선별된 숙주 세포에서 복제될 수 있게 해주는 핵산 서열을 함유한다. 일반적으로, 클로닝 벡터에서는 상기 서열이 벡터가 숙주 염색체성 DNA와는 독립적으로 복제할 수 있게 해주는 것이고, 이에는 복제 기점 또는 자기 복제 서열이 포함된다. 이러한 서열은 각종 세균, 효모 및 바이러스에 대해 널리 공지되어 있다. 플라스미드 pBR322로부터의 복제 기점은 대부분의 그람-음성 세균에 적합하고, 2 μ 플라스미드 기점은 효모에 적합하며, 각종 바이러스성 기점 (SV40, 폴리오마, 아데노바이러스, VSV 또는 BPV)는 포유류 세포에서의 클로닝 벡터에 유용하다. 일반적으로, 복제 기점 성분은 포유류 발현 벡터에 필요치 않다 (SV40 기점이 전형적으로 사용될 수 있는데, 이는 단지 이것이 초기 프로모터를 함유하기 때문이다).
(iii) 선별 유전자 성분
발현 및 클로닝 벡터는 선별성 마커로 명명되기도 하는 선별 유전자를 함유할 수 있다. 전형적인 선별 유전자는 (a) 항생제 또는 기타 독소, 예를 들어 앰피실린, 네오마이신, 메토트렉세이트 또는 테트라사이클린에 대한 내성을 부여해주는 단백질; (b) 영양요구성 결핍증을 보충해주는 단백질; 또는 (c) 복합 배지로부터 입수 가능하지 않은 중요한 영양분, 예를 들어 바실루스 (Bacillus)에 대한 D-알라닌 라세마제를 암호화하는 유전자를 공급해 주는 단백질을 암호화한다.
선별 도식의 한 가지 예는 숙주 세포의 성장을 중지시키기 위한 약물을 활용한다. 이종 유전자를 이용하여 성공적으로 형질전환시킨 세포는 약물 내성을 부여해 주는 단백질을 생산하므로, 선별 섭생에서 살아 남는다. 이러한 우성 선별의 예들은 약물 네오마이신, 미코페놀산 및 히그로마이신을 이용한다.
포유류 세포에 적합한 선별성 마커의 또 다른 예는 항체 핵산을 흡수하기에 적격한 세포를 확인시켜 줄 수 있는 것인데, 예를 들면 DHFR, 티미딘 키나제, 메탈로티오네인-I 및 -II, 바람직하게는 영장류 메탈로티오네인 유전자, 아데노신 데아미나제, 오르니틴 데카복실라제 등이 있다.
예를 들어, DHFR 선별 유전자로 형질전환시킨 세포는 먼저, 형질전환체 모두를 DHFR의 경쟁적 길항제인 메토트렉세이트 (Mtx)를 함유하는 배양 배지에서 배양함으로써 확인한다. 야생형 DHFR이 이용되는 경우에 적당한 숙주 세포는, DHFR 활성이 결핍된 중국산 햄스터 난소 (CHO) 세포주이다.
또 다른 한편, 항체, 야생형 DHFR 단백질 및 또 다른 선별성 마커, 예를 들어 아미노글리코시드 3'-포스포트랜스퍼라제 (APH)를 암호화하는 DNA 서열로 형질전환시켰거나 공동-형질전환시킨 숙주 세포 (특히, 내인성 DHFR을 함유하는 야생형 숙주)는, 선별성 마커, 예를 들어 아미노글리코시드성 항생제 (예: 카나마이신, 네오마이신 또는 G418)에 대한 선별제를 함유하는 배지에서 세포 성장시킴으로써 선별할 수 있다 [참고: 미국 특허 제4,965,199호].
효모에 사용하기 적합한 선별 유전자는 효모 플라스미드 YRp7에 존재하는 trp1 유전자이다 [참고: Stinchcomb et al. (1979) Nature, 282:39]. 이러한 trp1 유전자는 트립토판에서 성장할 수 있는 능력이 결여된 효모의 돌연변이체 균주, 예를 들어 ATCC No. 44076 또는 PEP4-1에 대한 선별 마커를 제공한다 [참고: Jones (1977) Genetics, 85:12]. 이때, 효모 숙주 세포 게놈 내에 trp1 병변이 존재한다는 것은 트립토판 부재 하의 성장에 의한 형질전환을 탐지하는데 유효한 환경을 제공해준다. 유사하게, Leu2-결핍성 효모 균주 (ATCC 20,622 또는 38,626)가 Leu2 유전자를 보유하고 있는 공지된 플라스미드로써 고려된다.
또한, 1.6 ㎛ 환상 플라스미드 pKD1로부터 유래된 벡터를 클루이베로마이세스 효모의 형질전환을 위해 사용할 수 있다. 또 다른 한편, 재조합 송아지 카이모신 (chymosin)을 대규모로 생성하기 위한 발현 시스템이 케이. 락티스 (K. lactis)에 대해 보고되었다 [참고: Van den Berg (1990) Bio/Technology 8:135]. 클루이베로마이세스의 산업용 균주에 의해 성숙한 재조합 인간 혈청 알부민을 분비시키는데 적합한 다중-복사 발현 벡터가 또한 보고되었다 [참고: Fleer et al. (1991) Bio/Technology 9: 968-975].
(iv) 프로모터 성분
발현 및 클로닝 벡터는 통상적으로, 숙주 유기체에 의해 인식되고 항체 핵산에 작동적으로 연결되는 프로모터를 함유한다. 원핵성 숙주를 이용한 경우에 사용하기 적합한 프로모터에는 phoA 프로모터, β-락타마제 및 락토스 프로모터 시스템, 알칼리성 포스파타제, 트립토판 (trp) 프로모터 시스템, 및 하이브리드 프로모터, 예를 들어 tac 프로모터가 포함된다. 그러나, 기타 공지된 세균성 프로모터도 적합하다. 세균성 시스템에 사용하기 위한 프로모터는 또한, 항체를 암호화하는 DNA에 작동적으로 연결된 샤인-달가르노 (S.D.) 서열을 함유할 것이다.
진핵생물에 대한 프로모터 서열이 공지되어 있다. 사실상 모든 진핵성 유전자가, 전사가 개시되는 부위로부터의 대략 25 내지 30개 염기 상단에 위치한 AT-풍부 영역을 갖는다. 많은 유전자의 전사 개시 부위로부터 70 내지 80개 염기 상단에서 발견된 또 다른 서열은 CNCAAT 영역인데, 여기서 N은 모든 뉴클레오티드일 수 있다. 대부분의 진핵성 유전자의 3' 말단에는 AATAAA 서열이 존재하는데, 이는 폴리 A 미부를 암호화 서열의 3' 말단에 부가하기 위한 신호일 수 있다. 이들 서열 모두는 진핵성 발현 벡터 내로 적합하게 삽입된다.
효모 숙주를 이용한 경우에 사용하기 적합한 프로모터 서열의 예에는 3-포스포글리세레이트 키나제 또는 기타 당분해 효소, 예를 들어 에놀라제, 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제, 헥소키나제, 피루베이트 데카복실라제, 포스포프럭토키나제, 글루코스-6-포스페이트 이소머라제, 3-포스포글리세레이트 무타제, 피루베이트 키나제, 트리오스포스페이트 이소머라제, 포스포글루코스 이소머라제, 및 글루코키나제에 대한 프로모터가 포함된다.
성장 조건에 의해 제어된 전사의 부가 이점을 지니고 있는 유도성 프로모터인 기타 효모 프로모토는 알코올 데히드로게나제 2, 이소시토크롬 C, 산 포스파타제, 질소 대사와 연관된 분해성 효소, 메탈로티오네인, 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제, 및 말토스 및 갈락토스 활용에 책임이 있는 효소에 대한 프로모터 영역이다. 효모 발현에 있어 사용하기 적합한 벡터 및 프로모터가 EP 73,657에 추가로 기재되어 있다. 효모 증강인자가 또한 효모 프로모터와 함께 유리하게 사용된다.
포유류 숙주 세포에서 벡터로부터의 항체 전사는, 예를 들어 폴리오마 바이러스, 조류폭스 (fowlpox) 바이러스, 아데노바이러스 (예: 아데노바이러스 2), 소 유두종 바이러스, 조류 육종 바이러스, 시토메갈로바이러스, 레트로바이러스, B형 간염 바이러스 및 가장 바람직하게는 원숭이 바이러스 40 (SV40) 등의 바이러스 게놈으로부터 수득한 프로모터, 이종 포유류 프로모터, 예를 들어 악틴 프로모터 또는 면역글로불린 프로모터, 및 열-쇽 프로모터에 의해 제어되는데, 단 이들 프로모터는 숙주 세포 시스템과 화합성이어야 한다.
SV40 바이러스의 초기 및 후기 프로모터는 SV40 바이러스성 복제 기점을 함유하기도 하는 SV40 제한 단편으로서 편리하게 수득된다. 인간 시토메갈로바이러스의 즉발형 프로모터는 HindIII E 제한 단편으로서 편리하게 수득된다. 벡터로서 소 유두종 바이러스를 사용하여 포유류 숙주에서 DNA를 발현하기 위한 시스템이 미국 특허 제4,419,446호에 기재되어 있다. 이러한 시스템의 변형이 미국 특허 제4,601,978에 기재되어 있다. 단순 포진 바이러스로부터의 티미딘 키나제 프로모터의 제어 하에 마우스 세포에서 인간 β-인터페론 cDNA를 발현하는 것에 관해서는 다음 문헌을 참고할 수 있다 [참고: Reyes et al. (1982) Nature 297:598-601]. 또 다른 한편, 라우스 (rous) 육종 바이러스 장-말단 반복 서열을 프로모터로서 사용할 수 있다.
(v) 증강인자 요소 성분
고등 진핵생물에 의해 본 발명의 항체를 암호화하는 DNA를 전사하는 것은 종종, 증강인자 서열을 벡터 내로 삽입함으로써 증가된다. 많은 증강인자 서열이 현재 포유류 유전자로부터 공지되어 있다 (글로빈, 엘라스타제, 알부민, α-태아단백질 및 인슐린). 그러나, 전형적으로는, 진핵성 세포 바이러스로부터의 증강인자가 사용될 것이다. 이의 예에는 복제 기점의 후기 측면 (bp 100-270) 상의 SV40 증강인자, 시토메갈로바이러스 초기-프로모터 증강인자, 복제 기점의 후기 측면 상의 폴리오마 증강인자, 및 아데노바이러스 증강인자가 포함된다. 진핵성 프로모터 활성화를 위한 증강 요소에 관해서는 다음 문헌을 참고할 수 있다 [참고: Yaniv (1982) Nature 297:17-18]. 증강인자는 항체 암호화 서열에 대한 5' 또는 3' 위치에서 벡터 내로 분할될 수 있지만, 바람직하게는 프로모터로부터의 5' 부위에 위치한다.
(vi) 전사 종결 요소
진핵성 숙주 세포 (예를 들어, 효모, 진균, 곤충, 식물, 동물, 인간, 또는 기타 다세포 유기체로부터의 핵형성 세포)에 사용된 발현 벡터는 또한, 전사를 종결시키고 mRNA를 안정화시키는데 필요한 서열을 함유할 것이다. 이러한 서열은 진핵성 또는 바이러스성 DNA 또는 cDNA의 비해독 영역의 5' 말단, 종종 3' 말단으로부터 통상 이용 가능하다. 이들 영역은 항체를 암호화하는 mRNA의 비해독 부분에서 폴리아데닐화 단편으로서 전사된 뉴클레오티드 절편을 함유한다. 한 가지 유용한 전사 종결 요소는 소의 성장 호르몬 폴리아데닐화 영역이다 [참고: WO 1994/11026; 및 이에 기재된 발현 벡터].
(vii) 숙주 세포의 선별 및 형질전환
본원 내의 벡터에서 DNA를 클로닝 또는 발현하는데 적합한 숙주 세포는 상기 언급된 원핵생물, 효모 또는 고등 진핵생물 세포이다. 이러한 목적에 적합한 원핵생물에는 유박테리아 (eubacteria), 예를 들어, 그람-음성 또는 그람-양성 유기체, 예를 들면, 엔테로박테리아세애 (Enterobacteriaceae), 예를 들어 에스케리챠 (Escherichia), 예를 들면, 이. 콜라이 (E. coli), 엔테로박터 (Enterobacter), 에르위니아 (Erwinia), 클렙시엘라 (Klebsiella), 프로테우스 (Proteus), 살모넬라 (Salmonella), 예를 들면, 살모넬라 티피무륨 (Salmonella typhimurium), 세라티아 (Serratia), 예를 들면, 세라티아 마르세스칸스 (Serratia marcescans), 및 쉬겔라 (Shigella) 뿐만 아니라 바실루스 (Bacillus), 예를 들어 비. 서브틸리스 (B. subtilis) 및 비. 리케니포르미스 (B. licheniformis) (예: 1989년 4월 12일자로 공개된 DD 266,710에 기재된 비. 리케니포르미스 41P), 슈도모나스 (Pseudomonas), 예를 들면, 피. 애루기노사 (P. aeruginosa), 및 스트렙토마이세스 (Streptomyces)가 포함된다. 한 가지 바람직한 이. 콜라이 클로닝 숙주는 이. 콜라이 294 (ATCC 31,446)이지만, 기타 균주, 예를 들어 이. 콜라이 B, 이. 콜라이 X1776 (ATCC 31,537), 및 이. 콜라이 W3110 (ATCC 27,325)도 적합하다. 이들 예는 제한적이기 보다는 예시적이다.
원핵생물 이외에도, 진핵성 미생물, 예를 들면, 섬유상 진균 또는 효모가 항체-암호화 벡터에 적합한 클로닝 또는 발현 숙주이다. 삭카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae), 또는 통상의 빵 효모가 하등 진핵성 숙주 미생물 중에 가장 흔히 사용되는 것이다. 그러나, 수 많은 기타 속, 종 및 균주가 통상적으로 입수 가능하고 본원에 유용한데, 예를 들면 시조삭카로마이세스 폼베 (Schizosaccharomyces pombe); 클루이베로마이세스 (Kluyveromyces) 숙주, 예를 들어 케이. 락티스 (K. lactis), 케이. 프라질리스 (K. fragilis) (ATCC 12,424), 케이. 불가리쿠스 (K. bulgaricus) (ATCC 16,045), 케이. 위케라미이 (K. wickeramii) (ATCC 24,178), 케이. 왈티이 (K. waltii) (ATCC 56,500), 케이. 드로소필라룸 (K. drosophilarum) (ATCC 36,906), 케이. 더모톨레란스 (K. thermotolerans), 및 케이. 마륵시아누스 (K. marxianus); 야로위아 (yarrowia) (EP 402,226); 피치아 파스토리스 (Pichia pastoris) (EP 183,070); 칸디다 (Candida); 트리코데르마 레에시아 (Trichoderma reesia) (EP 244,234); 뉴로스포라 크라사 (Neurospora crassa); 쉬와니오마이세스 (Schwanniomyces), 예를 들어 쉬와니오마이세스 옥시덴탈리스 (Schwanniomyces occidentalis); 및 섬유상 진균, 예를 들어 뉴로스포라 (Neurospora), 페니실륨 (Penicillium), 톨리포클라듐 (Tolypocladium), 및 아스페르길루스 (Aspergillus) 숙주, 예를 들어 에이. 니둘란스 (A. nidulans) 및 에이. 니거 (A. niger)가 있다.
당화 항체를 발현하기에 적합한 숙주 세포는 다세포 유기체로부터 유래된다. 무척추 동물 세포의 예에는 식물 및 곤충 세포가 포함된다. 수 많은 바쿨로바이러스성 균주 및 변이체, 및 숙주, 예를 들어 스포도프테라 프루기페르다 (Spodoptera frugiperda) (모충: caterpillar), 애데스 애깁티 (Aedes aegypti) (모기: mosquito), 애데스 알보픽투스 (Aedes albopictus) (모기), 드로소필라 멜라노가스테르 (Drosophila melanogaster) (초파리: fruitfly), 및 봄빅스 모리 (Bombyx mori)로부터의 상응하는 증식 허용 곤충 숙주 세포가 확인되었다. 형질감염시키기 위한 각종 바이러스성 균주, 예를 들어, 아우토그라파 칼리포르니카 (Autographa californica) NPV의 L-1 변이체 및 봄빅스 모리 NPV의 Bm-5 균주가 공개적으로 입수 가능하고, 이러한 바이러스는 특히 스포도프테라 프루기페르다 세포의 형질감염을 위해 본 발명에 따르는 바이러스로서 사용할 수 있다. 면, 옥수수, 감자, 대두, 페튜니아 (petunia), 토마토 및 담배의 식물 세포 배양물을 숙주로서 활용할 수도 있다.
그러나, 척추동물 세포에 대한 관심이 가장 크며, 척추동물 세포를 배양하여 증식시키는 것이 (조직 배양) 통상적인 과정이 되었다. 유용한 포유류 숙주 세포주의 예는 SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 주 (COS-7, ATCC CRL 1651); 현탁 배양 하에 성장하도록 아클로닝된 인간 배아 신장주 293 세포 [참고: Graham et al. (1977) J. Gen Virol. 36:59]; 유아 햄스터 신장 세포 (BHK, ATCC CCL 10); 중국산 햄스터 난소 세포/-DHFR [CHO (참고: Urlaub et al. (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 77:4216)]; 마우스 세르톨리 (sertoli) 세포 [TM4; 참고: Mather (1980) Biol. Reprod.,23:243-251]; 원숭이 신장 세포 (CV1 ATCC CCL 70); 아프리카산 그린 원숭이 신장 세포 (VERO-76, ATCC CRL-1587); 인간 자궁경부 암종 세포 (HELA, ATCC CCL 2); 개의 신장 세포 (MDCK, ATCC CCL 34); 버팔로 랫트 간 세포 (BRL 3A, ATCC CRL 1442); 인간 폐 세포 (W138, ATCC CCL 75); 인간 간 세포 (Hep G2, HB 8065); 마우스 유방 종양 (MMT 060562, ATCC CCL51); TRI 세포 [참고: Mather et al. (1982) Annals N. Y. Acad. Sci. 383:44-68]; MRC 5 세포; FS4 세포; 및 인간 간세포암 주 (Hep G2)이다.
숙주 세포를 항체 생성을 위해 상기 언급된 발현 또는 클로닝 벡터로 형질전환시키고; 프로모터를 유도하거나, 형질전환체를 선별하거나 또는 목적하는 서열을 암호화하는 유전자를 증폭시키기에 적당한 바 대로 변형시킨 통상적인 영양 배지에서 배양한다.
(viii) 숙주 세포 배양
본 발명의 항체를 생성시키기 위해 사용된 숙주 세포는 각종 배지에서 배양할 수 있다. 시판용 배지, 예를 들면 햄스 (Ham's) F10 (공급처: Sigma), 최소 필수 배지 [(MEM); 공급처: Sigma], RPMI-1640 (공급처: Sigma), 및 둘벡코 변형 이글 배지 [(DMEM); 공급처: Sigma]가 상기 숙주 세포를 배양하는데 적합하다. 또한, 다음 문헌에 기재된 배지 중의 어떠한 것도 숙주 세포에 대한 배양 배지로서 사용할 수 있다 [참고: Ham et al. (1979) Meth. Enz. 58:44; Barnes et al. (1980) Anal. Biochem. 102:255; 미국 특허 제4,767,704호; 제4,657,866호; 제4,927,762호; 제4,560,655호; 또는 제5,122,469호; WO 90/03430; WO 87/00195; 또는 미국 특허 제(재)30,985호]. 이들 배지 모두는 필요에 따라, 호르몬 및/또는 기타 성장 인자 (예: 인슐린, 트랜스페린, 또는 표피 성장 인자), 염 (예: 염화나트륨, 칼슘, 마그네슘 및 인산염), 완충제 (예: HEPES), 뉴클레오티드 (예: 아데노신 및 티미딘), 항생제 (예: GENTAMYCIN™ 약물), 미량 원소 (마이크로몰 범위의 최종 농도로 통상 존재하는 무기 화합물로서 정의됨), 및 글루코스 또는 등가 에너지원으로 보충시킬 수 있다. 당업자에게 공지되어 있는 기타 모든 필수 보충물이 적당한 농도로 포함될 수도 있다. 배양 조건, 예를 들어 온도, pH 등이 발현을 위해 선별된 숙주 세포와 함께 이미 사용되고 있고, 이는 당업자에게 명백할 것이다.
(ix) 항체 정제
재조합 기술을 사용하는 경우, 항체를 주변세포질 공간에서 세포내적으로 생성시킬 수 있거나, 또는 배지 내로 직접 분비할 수 있다. 항체가 세포내적으로 생성되는 경우에는, 제1 단계로서 숙주 세포 또는 용해된 단편의 미세 부스러기를, 예를 들어 원심분리 또는 한외여과에 의해 제거한다. 문헌 [참고: Carter et al. (1992) Bio/Technology 10:163-167]에는 이. 콜라이의 주변세포질 공간 내로 분비되는 항체를 분리하는 과정이 기재되어 있다. 간략하게 언급하면, 세포 페이스트를 약 30분에 걸쳐 나트륨 아세테이트 (pH 3.5), EDTA, 및 페닐메틸설포닐플루오라이드 (PMSF)의 존재 하에 해동시킨다. 세포 부스러기를 원심분리에 의해 제거할 수 있다. 항체가 배지 내로 분비되는 경우에는, 이러한 발현 시스템으로부터의 상등액을 먼저 일반적으로, 시판용 단백질 농축 필터, 예를 들어 아미콘 (Amicon) 또는 밀리포어 펠리콘 (Millipore Pellicon) 한외여과 장치를 사용하여 농축시킨다. 프로테아제 억제제, 예를 들어 PMSF를 전술된 단계들 중의 어느 단계에 포함시켜 단백질 분해를 억제시킬 수 있고, 항생제를 포함시켜 우발적 오염물의 성장을 방지시킬 수 있다.
세포로부터 제조된 항체 조성물은, 예를 들어 히드록실아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석, 및 친화 크로마토그래피를 이용하여 정제할 수 있는데, 친화 크로마토그래피가 바람직한 정제 기술이다. 단백질 A가 친화성 리간드로서 적합한지의 여부는 항체에 존재하는 모든 면역글로불린 Fc 도메인의 종 및 이소형에 좌우된다. 단백질 A를 사용하여 인간 γ1, γ2, 또는 γ4 중쇄에 의거하여 항체를 정제할 수 있다 [참고: Lindmark et al. (1983) J. Immunol. Meth. 62: 1-13]. 단백질 G는 모든 마우스 이소형과 인간 γ3에 권장된다 [참고: Guss et al. (1986) EMBO J. 5: 15671575]. 친화성 리간드가 부착되는 매트릭스는 가장 흔히는 아가로스지만, 기타 매트릭스도 이용 가능하다. 기계적으로 안정적인 매트릭스, 예를 들어 제어 공극 유리 또는 폴리(스티렌디비닐)벤젠은 아가로스를 이용하여 달성된 것 보다 더 신속한 유속 및 보다 짧은 처리 시간을 허용해 준다. 항체가 CH3 도메인을 포함하는 경우, 베이커본드 (Bakerbond) ABX™ 수지 (공급처: J. T. Baker, Phillipsburg, NJ)가 정제에 유용하다. 단백질을 정제하기 위한 기타 기술, 예를 들어 이온 교환 칼럼 상에서의 분획화, 에탄올 침전, 역상 HPLC, 실리카 상에서의 크로마토그래피, 헤파린 SEPHAROSE™ 상에서의 크로마토그래피, 음이온 또는 양이온 교환 수지 (예: 폴리아스파르트산 칼럼) 상에서의 크로마토그래피, 크로마토분획 (chromatofocusing), SDS-PAGE, 및 황산암모늄 침전을, 회수하고자 하는 항체에 따라서 이용하기도 한다.
예비 정제 단계(들) 후, 관심있는 항체와 오염물을 포함하는 혼합물을 대상으로 하여 pH 약 2.5 내지 4.5, 바람직하게는 저염 농도 (예: 약 0 내지 0.25 M 염)에서 용출 완충제를 사용하여 저 pH 소수성 상호 작용 크로마토그래피할 수 있다.
제약 제형 (제제)
본 발명의 항체의 치료적 제형은, 목적하는 순도를 지닌 항체를 임의의 생리적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 안정화제 [참고: Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)]와 혼합하여, 동결건조된 제형 또는 수성 용제 형태로 저장하기 위해 제조한다. 허용 가능한 담체, 부형제 또는 안정화제는 이용된 투여량 및 농도에서 수용자에게 비독성이고, 이에는 완충제, 예를 들어 인산염, 시트레이트 및 기타 유기 산; 항산화제, 예를 들어 아스코르브산 및 메티오닌; 방부제 (예: 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드; 벤즈에토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올; 알킬 파라벤, 예를 들어 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레소르시놀; 시클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레솔); 저분자량 (약 10개 미만 잔기) 폴리펩티드; 단백질, 예를 들어 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예를 들어 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예를 들어 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 리신; 단당류, 이당류 및 기타 탄수화물, 예를 들어 글루코스, 만노스, 또는 덱스트린; 킬레이트제, 예를 들어 EDTA; 당, 예를 들어 슈크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 솔비톨; 염 형성 반대-이온, 예를 들어 나트륨; 금속 착물 (예: Zn-단백질 착물); 및/또는 비이온성 계면활성제, 예를 들어 TWEEN™, PLURONICS™ 또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)이 포함된다.
본원의 제형은 치료하고자 하는 특별한 적응증에 대해 필요한 만큼의 한 가지 이상의 활성 화합물, 바람직하게는 서로에게 불리한 영향을 미치지 않는 상보적 활성을 지닌 한 가지 이상의 활성 화합물을 함유할 수도 있다. 예를 들어, 면역억제제를 추가로 제공하는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 분자는 의도한 목적에 유효한 양으로 병용해서 존재하는 것이 적합하다.
활성 성분을, 예를 들어 액적형성 (coacervation) 기술 또는 계면 중합에 의해 제조된 미소캡슐, 예를 들면, 히드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴 미소캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 미소캡슐; 콜로이드상 약물 전달 시스템 (예를 들면, 리포솜, 알부민 미소구, 마이크로에멀션, 나노-입자 및 나노-캡슐); 또는 매크로에멀션 내에 포착시킬 수도 있다. 이러한 기술은 문헌 [참고: Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)]에 기재되어 있다.
생체내 투여에 사용하고자 하는 제형은 멸균성이어야만 한다. 이는 멸균성 여과 막을 통하여 여과시킴으로써 용이하게 달성된다.
지속 방출 제제를 제조할 수 있다. 지속 방출 제제의 적합한 예에는 본 발명의 항체를 함유하는 고형 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스가 포함되는데, 이러한 매트릭스는 성형품, 예를 들어 필름 또는 미소캡슐 형태이다. 지속 방출 매트릭스의 예에는 폴리에스테르, 히드로겔 [예를 들면, 폴리(2-히드록시에틸-메타크릴레이트) 또는 폴리(비닐알코올)], 폴리락티드 [참고: 미국 특허 제3,773,919호], L-글루탐산과 γ에틸-L-글루타메이트의 공중합체, 비분해성 에틸렌-비닐 아세테이트, 분해성 락트산-글리콜산 공중합체, 예를 들어 LUPRON DEPOT™ (락트산-글리콜산 공중합체 및 류프롤리드 아세테이트로 구성된 주사용 미소구), 및 폴리-D-(-)-3-히드록시부티르산이 포함된다. 에틸렌-비닐 아세테이트 및 락트산-글리콜산 등의 중합체가 분자를 100일에 걸쳐 방출시킬 수 있긴 하지만, 특정 히드로겔은 보다 짧은 기간 동안 단백질을 방출시킨다. 피막화 항체가 체내에 장기간 동안 잔존하는 경우, 이들은 37℃하 수분에 대한 노출에 따른 결과로서 변성되거나 응집되어 생물학적 활성을 상실하고 면역원성이 변할 수 있다. 관련된 기전에 따라서 안정화시키기 위한 합리적 전략을 고안할 수 있다. 예를 들어, 응집 기전이 티오-디설피드 교환을 통한 분자간 S-S 결합 형성인 것으로 밝혀진 경우에는, 설프히드릴 잔기를 변형시키고, 산성 용액으로부터 동결건조시키며, 적당한 부가제를 사용하여 수분 함량을 제어하며 특이적 중합체 매트릭스 조성물을 개발함으로써 안정화를 달성시킬 수 있다.
치료적 용도
본 발명의 항체를 사용하여 포유류를 치료할 수 있는 것으로 고려된다. 한 양태에서는, 항체를, 예를 들어 전임상 데이터를 수득하기 위해 비-인간 포유류에게 투여한다. 처치하고자 하는 비-인간 포유류의 예에는 비-인간 영장류, 개, 고양이, 설치류 및 전임상 연구가 수행되는 기타 포유류가 포함된다. 이러한 포유류는 본 발명의 항체를 사용하여 치료하고자 하는 질병에 대한 확립된 동물 모델일 수 있거나, 또는 상기 포유류를 사용하여 관심있는 항체의 독성을 연구할 수 있다. 이들 양태 각각에서는, 용량의 단계적 상승 연구를 포유류에서 수행할 수 있다. 항체가 항-NRP1 항체인 경우, 이는 예를 들어 고형 종양 모델에서 숙주 설치류에게 투여할 수 있다.
또한, 또는 또 다른 한편, 항체를 사용하여 인간, 예를 들어 이러한 항체 투여로부터 이득을 얻을 수 있는 특정 질병이나 장애로 인해 고통받고 있는 환자를 치료한다.
본 발명은 종양 성장을 뒷받침해주는 영양분 공급을 요구하는 종양 혈관 발생을 억제시키고자 하는 새로운 암 치료 전략인 혈관형성성 암 요법을 포괄한다. 혈관형성은 원발성 종양 성장과 전이 둘 다에 관여하기 때문에, 본 발명에 의해 제공된 혈관형성성 치료법은 일차 부위에서의 종양의 신생 성장을 억제시킬 수 있을 뿐만 아니라 이차 부위에서의 종양 전이를 예방할 수 있으므로, 기타 치료제가 종양을 공격할 수 있게 해준다. 본원에서 치료하고자 하는 암의 예에는 암종, 림프종, 모세포종, 육종 및 백혈병이 포함되지만, 그에 제한되지 않는다. 이러한 암의 보다 특정한 예에는 편평 세포 암, 폐암 (소세포 폐암, 비소세포 폐암, 폐의 선암종 및 폐의 편평 암종 포함), 복막암, 간세포암, 위암 (위장암 포함), 췌장암, 교모세포종, 자궁경부암, 난소암, 간암, 방광암, 간세포암, 유방암, 결장암, 결장직장암, 자궁내막 또는 자궁 암종, 타액선 암종, 신장암 또는 신암, 간암, 전립선암, 외음부암, 갑상선암, 간 암종 및 각종 유형의 두경부암 뿐만 아니라 B-세포 림프종 [저 악성도/소포 비호지킨 림프종 (NHL); 소 림프구성 (SL) NHL; 중간 악성도/소포 NHL; 중간 악성도 확산성 NHL; 고 악성도 면역모세포성 NHL; 고 악성도 림프아구성 NHL; 고 악성도 소 비-절단 세포 NHL; 거대 질환 NHL; 외투 세포 림프종; AIDS-관련 림프종 및 발덴스트롬 마크로글로불린혈증 포함]; 만성 림프구성 백혈병 (CLL); 급성 림프아구성 백혈병 (ALL); 모발 세포 백혈병; 만성 골수아구성 백혈병; 및 이식 후 림프 증식성 장애 (PTLD) 뿐만 아니라 모반증, 부종 (예를 들어, 뇌 종양과 연관된 부종) 및 메이그스 증후군과 연관된 비정상적인 혈관 증식이 포함된다. 보다 특히, 본 발명의 항체에 의해 치료되기 쉬운 암에는 유방암, 결장직장암, 직장암, 비소세포 폐암, 비호지킨 림프종 (NHL), 신세포암, 전립선암, 간암, 췌장암, 연질 조직 육종, 카포시 육종, 경동맥 암종, 두경부암, 흑색종, 난소암, 중피종 및 다발성 골수종이 포함된다. 보다 특히, 본 발명의 방법을 사용하여 인간 환자에게서 결장직장암을 치료한다.
종양과 같은 각종 질환을 치료하기 위해 사용하는 경우, 본 발명의 항체를 동일하거나 유사한 질환에 적합한 기타 치료제와 병용할 수 있는 것으로 고려된다. 암을 치료하기 위해 사용하는 경우, 본 발명의 항체를 통상적인 암 요법, 예를 들어 수술, 방사선요법, 화학요법 또는 이의 조합과 병용해서 사용할 수 있다.
특정 국면에서, 본 발명의 항체와의 병용 암 요법에 유용한 기타 치료제에는 기타 항혈관형성제가 포함된다. 많은 항혈관형성제가 당해 분야에서 확인되었고 공지되어 있으며, 예를 들어 문헌 [참고: Carmeliet and Jain (2000)]에 열거되어 있다.
한 국면에서, 본 발명의 항체를 VEGF 길항제 또는 VEGF 수용체 길항제, 예를 들어 항-VEGF 항체, VEGF 변이체, 가용성 VEGF 수용체 단편, VEGF 또는 VEGFR을 차단시킬 수 있는 압타머 (aptamer), 중화 항-VEGFR 항체, VEGFR 티로신 키나제의 억제제 및 그의 모든 조합과 병용해서 사용한다. 또 다른 한편, 또는 또한, 2가지 이상의 항-NRP1 항체를 환자에게 공동 투여할 수 있다. 보다 바람직한 양태에서, 본 발명의 항-NRP1A 또는 항-NRP1B 항체를 항-VEGF 항체와 병용해서 사용하여 부가 또는 상승적 효과를 발생시킨다. 바람직한 항-VEGF 항체에는 항-hVEGF 항체 A4.6.1과 동일한 에피토프와 결합하는 항체가 포함된다. 보다 바람직하게, 항-VEGF 항체는 베바시주마브 또는 라니비주마브이다.
몇몇 기타 국면에서, 본 발명의 항체와의 병용 종양 요법에 유용한 기타 치료제에는 종양 성장에 관여하는 기타 인자, 예를 들어 EGFR, ErbB2 (Her2로서 공지되기도 함), ErbB3, ErbB4, 또는 TNF의 길항제가 포함된다. 바람직하게, 본 발명의 항-NRP1 항체를 하나 이상의 티로신 키나제 수용체, 예를 들어 VEGF 수용체, FGF 수용체, EGF 수용체 및 PDGF 수용체를 표적으로 하는 소분자 수용체 티로신 키나제 억제제 (RTKI)와 병용해서 사용할 수 있다. 많은 치료적 소분자 RTKI가 당해 분야에 공지되어 있는데, 이에는 바탈라니브 (vatalanib) (PTK787), 에를로티니브 (erlotinib) (TARCEVA®), OSI-7904, ZD6474 (ZACTIMA®), ZD6126 (ANG453), ZD1839, 수니티니브 (sunitinib) (SUTENT®), 세막사니브 (semaxanib) (SU5416), AMG706, AG013736, 이마티니브 (GLEEVEC®), MLN-518, CEP-701, PKC-412, 라파티니브 (Lapatinib) (GSK572016), VELCADE®, AZD2171, 소라페니브 (sorafenib) (NEXAVAR®), XL880, 및 CHIR-265가 포함되지만, 그에 제한되지 않는다.
본 발명의 항-NRP1 항체를 단독으로 또는 제2의 치료제 (예: 항-VEGF 항체)와 병용해서, 한 가지 이상의 화학요법제와 병용해서 추가로 사용할 수 있다. 각종 화학요법제를 본 발명의 병용 치료 방법에 사용할 수 있다. 고려된 화학요법제의 비제한적 예시 목록이 본원에 "정의" 항목에 제공되어 있다.
항-NRP1 항체를 제2의 치료제와 함께 공동 투여하는 경우, 이러한 제2 치료제를 먼저 투여한 다음, 항-NRP1 항체를 투여할 수 있다. 그러나, 동시 투여하거나 항-NRP1 항체를 먼저 투여하는 것이 또한 고려된다. 제2 치료제에 대한 적합한 투여량은 현재 사용되고 있는 양이고, 이러한 작용제와 항-NRP1 항체의 조합 작용 (상승 작용)으로 인해 낮출 수도 있다.
질병을 예방 또는 치료하는데 적당한 항체 투여량은 치료하고자 하는 질병의 유형, 질병의 중증도 및 과정, 항체가 예방적 용도로 투여되는지 아니면 치료적 용도로 투여되는지의 여부, 기존의 요법, 환자의 임상 병력 및 항체에 대한 반응, 및 담당 의사의 판단에 좌우될 것이다. 항체는 환자에게 1회 투여하거나 일련의 치료 기간 내내 투여하는 것이 적합하다.
질병의 유형과 중증도에 따라서, 1회 이상의 별도 투여이든지 아니면 연속적인 주입이든지 간에, 항체 약 1 ㎍/kg 내지 약 50 mg/kg (예: 0.1 mg/kg 내지 10 mg/kg)이 환자에게 투여하기 위한 초기 후보 투여량이다. 전형적인 1일 투여량은 상기 언급된 요인들에 따라서 약 1 ㎍/kg 내지 100 mg/kg 이상의 범위일 수 있다. 수 일에 걸쳐 반복 투여하는 경우에는, 질환에 따라서 목적하는 질병 증상 억제가 나타날 때까지 치료를 지속한다. 그러나, 기타 투여량 섭생도 유용할 수 있다. 바람직한 국면에서, 본 발명의 항체를 2주 내지 3주 마다 약 5 mg/kg 내지 약 15 mg/kg의 범위 용량으로 투여한다. 보다 바람직하게, 이러한 투여 섭생을 전이성 결장직장암을 치료하기 위한 1차 치료로서 화학요법 섭생과 병용해서 사용한다. 몇몇 국면에서는, 화학요법 섭생이 전통적인 고 용량 간헐적 투여를 포함한다. 몇몇 기타 국면에서는, 예정된 중단 없이 화학요법제를 보다 적은 용량으로 보다 자주 투여한다 ["메트로노믹 (metronomic) 화학요법"]. 본 발명의 요법의 진행 과정은 통상적인 기술 및 검정에 의해 용이하게 모니터링할 수 있다.
항체 조성물은 우수한 의료 행위에 일관되는 방식으로 제형화, 투약 및 투여될 것이다. 이러한 맥락에서 고려해야 하는 요인에는 치료하고자 하는 특정 장애, 치료하고자 하는 특정 포유류, 개개 환자의 임상 상태, 장애의 원인, 작용제 전달 부위, 투여 방법, 투여 스케쥴, 및 의사에게 공지된 기타 요인들이 포함된다. 투여하고자 하는 항체의 "치료적 유효량"은 이러한 고려 사항에 의해 좌우될 것이며, 이는 특정 질병이나 장애를 예방, 완화 또는 치료하는데 필요한 최소량이다. 본 발명의 항체를, 문제의 장애를 예방 또는 치료하기 위해 현재 사용되고 있는 한 가지 이상의 작용제와 함께 반드시 제형화할 필요는 없지만, 임의로 제형화한다. 이러한 기타 작용제의 유효량은 제형 내에 존재하는 항체의 양, 장애 또는 치료 유형, 및 상기 논의된 기타 요인들에 의해 좌우된다. 이들은 일반적으로, 지금까지 사용된 바와 동일한 투여량과 투여 경로로 사용되거나, 또는 지금까지 이용된 투여량의 약 1 내지 99%이다. 일반적으로, 특징 질병이나 장애의 완화 또는 치료는 이러한 질병이나 장애와 연관된 한 가지 이상 증상 또는 의학적 문제를 경감시키는 것을 포함한다. 암의 경우, 약물의 치료적 유효량은 다음 중의 한 가지 또는 조합을 달성할 수 있다: 암 세포 수를 감소시키고/시키거나; 종양 크기를 감소시키고/시키거나; 암 세포가 말초 기관 내로 침윤되는 것을 억제 (즉, 어느 정도 저하시키고/시키거나 중지시킨다)시키고/시키거나; 종양 전이를 억제시키고/시키거나; 종양 성장을 어느 정도 억제시키고/시키거나; 암과 연관된 한 가지 이상의 증상을 어느 정도 경감시킨다. 약물이 기존의 암 세포의 성장을 방지시키고/시키거나 암 세포를 사멸시킬 수 있는 정도까지는 이러한 약물이 세포증식 억제성 및/또는 세포독성일 수 있다. 몇몇 양태에서, 본 발명의 조성물을 사용하여 특정 대상체 또는 포유류에게서 해당 질병이나 장애의 발병 또는 재발을 예방할 수 있다.
비-치료적 용도
본 발명의 항체를 친화성 정제 작용제로서 사용할 수 있다. 이러한 공정에서는, 당해 분야에 널리 공지된 방법을 사용하여, 항체를 고체 상, 예를 들어 세파덱스 수지 또는 여과지 상에 고정화시킨다. 이와 같이 고정화시킨 항체를, 정제시키고자 하는 항원을 함유하는 샘플과 접촉시킨 후, 고정화 항체와 결합되는, 정제시키고자 하는 항원을 제외하고는 샘플 내의 실질적으로 모든 물질을 제거시키는데 적합한 용매를 이용하여 지지체를 세척한다. 최종적으로, 항체로부터 상기 항원을 방출시키는데 적합한 또 다른 용매, 예를 들어 글리신 완충액 (pH 5.0)으로 지지체를 세척한다.
본 발명의 항체는, 예를 들어 관심있는 항원이 특이적 세포, 조직 또는 혈청 내에서 발현되는지를 탐지하기 위한 진단 검정에 유용할 수도 있다.
진단 적용하는 경우에는, 항체를 전형적으로, 탐지 가능한 부분으로 표지시킬 것이다. 일반적으로 다음 범주로 나눌 수 있는 수 많은 표지가 이용 가능하다:
(a) 방사성 동위원소, 예를 들어 35S, 14C, 125I, 3H, 및 131I. 항체를, 예를 들어 문헌 [참고: Current Protocols in Immunology, Volumes 1 and 2, Coligen et al. (1991) Ed. Wiley-Interscience, New York, New York, Pubs.]에 기재된 기술을 사용하여 방사성 동위원소로 표지시킬 수 있고, 신틸레이션 계수를 이용하여 방사능을 측정할 수 있다.
(b) 형광성 표지, 예를 들어 희토류 킬레이트 (에우로퓸 킬레이트) 또는 플루오레세인 및 그의 유도체, 로다민 및 그의 유도체, 단실, 리사민 (Lissamine), 피코에리트린 및 텍사스 레드 (Texas Red)가 이용 가능하다. 형광성 표지는 예를 들어 문헌 [Current Protocols in Immunology, 상기 참고]에 기재된 기술을 사용하여 항체에 접합시킬 수 있다. 형광계를 사용하여 형광을 정량화할 수 있다.
(c) 각종 효소-기질 표지가 이용 가능하고, 미국 특허 제4,275,149호에는 이들 중의 몇 가지에 관한 고찰이 제공된다. 효소는 일반적으로, 각종 기술을 사용하여 측정할 수 있는 발색 기질의 화학적 변경을 촉매한다. 예를 들어, 효소는 기질에서의 색상 변화를 촉매할 수 있는데, 이는 분광광도계를 이용하여 측정할 수 있다. 또 다른 한편, 효소는 기질의 형광 또는 화학발광을 변경시킬 수 있다. 형광 상의 변화를 정량화하는 기술이 상기 언급되어 있다. 화학발광성 기질은 화학적 반응에 의해 전자적으로 여기된 다음, 예를 들어 화학발광계를 사용하여 측정할 수 있는 빛을 방출하거나 에너지를 형광 수용체에 기증할 수 있다. 효소적 표지의 예에는 루시퍼라제 (예를 들어, 개똥벌레 루시퍼라제 및 세균성 루시퍼라제; 미국 특허 제4,737,456호), 루시페린, 2,3-디히드로프탈라진디온, 말레이트 데히드로게나제, 우레아제, 퍼옥시다제, 예를 들어 서양고추냉이 퍼옥시다제 (HRPO), 알킬리성 포스파타제, β-갈락토시다제, 글루코아밀라제, 리소자임, 당류 옥시다제 (예: 글루코스 옥시다제, 갈락토스 옥시다제, 및 글루코스-6-포스페이트 데히드로게나제), 헤테로사이클릭 옥시다제 (예: 우리카제 및 크산틴 옥시다제), 락토퍼옥시다제, 마이크로퍼옥시다제 등이 포함된다. 효소를 항체에 접합시키는 기술은 다음 문헌에 기재되어 있다 [참고: O'Sullivan et al. (1981) Methods for the Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay, in Methods in Enzym. (Ed., J. Langone & H. Van Vunakis), Academic Press, New York, 73:147-166].
효소-기질 조합물의 예에는, 예를 들어 다음이 포함된다:
(i) 서양고추냉이 퍼옥시다제 (HRPO)와 기질로서의 수소 퍼옥시다제의 조합물 [여기서는, 수소 퍼옥시다제가 염료 전구체 (예: 오르토페닐렌 디아민 (OPD) 또는 3,3',5,5'-테트라메틸 벤지딘 히드로클로라이드 (TMB))를 산화시킨다];
(ii) 알칼리성 포스파타제 (AP)와 발색 기질로서의 파라-니트로페닐 포스페이트의 조합물; 및
(iii) β-D-갈락토시다제 (β-D-Gal)와 발색 기질 (예: p-니트로페닐-β-D-갈락토시다제) 또는 형광발생 기질 4-메틸움벨리페릴-β-D-갈락토시다제의 조합물.
당업자는 수 많은 기타 효소-기질 조합물을 입수할 수 있다. 이들에 관한 일반적인 고찰을 위해, 미국 특허 제4,275,149호 및 제4,318,980호를 참고할 수 있다.
종종, 표지를 항체와 간접적으로 접합시킨다. 당업자는 이를 달성하기 위한 각종 기술을 알고 있을 것이다. 예를 들어, 항체를 바이오틴과 접합시키고, 상기 언급된 3 가지 광범위한 범주의 표지 중의 어느 하나를 아비딘과 접합시킬 수 있는데, 그 반대의 경우도 가능하다. 바이오틴은 아비딘과 선택적으로 결합하므로, 표지를 이러한 간접 방식으로 항체와 접합시킬 수 있다. 또 다른 한편, 표지를 항체와 간접적으로 접합시키기 위해, 항체를 작은 합텐 [예: 디곡신 (digoxin)]과 접합시키고, 상기 언급된 상이한 유형의 표지 중의 하나를 항-합텐 항체 (예: 항-디곡신 항체)와 접합시킨다. 이로써, 표지와 항체와의 간접적 접합이 달성될 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에서는, 항체를 표지시킬 필요가 없는데, 그의 존재는 항체와 결합하는 표지된 항체를 사용하여 탐지할 수 있다.
본 발명의 항체는 공지된 모든 검정 방법, 예를 들어 경쟁적 결합 검정, 직접 및 간접 샌드위치 검정, 및 면역침전 검정에 이용할 수 있다 [참고: Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, pp.147-158 (CRC Press, Inc. 1987)].
경쟁적 결합 검정은 제한된 양의 항체와의 결합을 놓고 시험 샘플 분석물과 경쟁할 수 있는 표지된 표준물의 능력에 좌우된다. 시험 샘플 중의 항원의 양은 항체와 결합되는 표준물의 양에 반비례한다. 결합되는 표준물의 양을 결정하는 것을 촉진시키기 위해, 항체를 일반적으로 경쟁 전 또는 후에 가용화시키므로, 항체와 결합되는 표준물 및 분석물은 결합되지 않은 채로 남아 있는 표준물 및 분석물로부터 편리하게 격리시킬 수 있다.
샌드위치 검정은 각각 탐지하고자 하는 단백질의 상이한 면역원성 부분 또는 에피토프와 결합할 수 있는 2개의 항체를 사용하는 것을 포함한다. 샌드위치 검정에서는, 시험 샘플 분석물이 고체 지지체 상에서 고정화되는 제1 항체에 의해 결합된 후, 제2 항체가 분석물과 결합하므로, 불용성 3-부분 복합체가 형성된다 [참고: 예를 들어, 미국 특허 제4,376,110호]. 제2 항체 자체를 탐지 가능한 부분으로 표지시킬 수 있거나 (직접 샌드위치 검정) 또는 탐지 가능한 부분으로 표지시킨 항-면역글로불린 항체를 사용하여 측정할 수 있다 (간접 샌드위치 검정). 예를 들어, 샌드위치 검정의 한 가지 유형이 ELISA 검정이고, 여기서는 탐지 가능한 부분이 효소이다.
면역조직화학의 경우에는, 종양 샘플이 신선하거나 동결될 수 있거나, 또는 파라핀에 포매시키고 포르말린 등의 방부제로 고정시킬 수 있다.
본 발명의 항체를 생체내 진단 검정에 사용할 수도 있다. 일반적으로, 항체를 방사성 핵종 (예: 111In, 99Tc, 14C, 131I, 125I, 3H, 32P 또는 35S) 또는 염료로 표지시켜 면역섬광조영술을 이용하여 종양을 국재시킬 수 있다.
한 양태에서, 특정 생물학적 샘플 (예: 조직, 혈액, 혈청, 척수액) 또는 준비된 생물학적 샘플 중에서 NRP1을 탐지하는 방법은 본 발명의 항체를 상기 샘플과 접촉시키는 단계; 및 이러한 샘플 중에서 NRP1과 결합된 항-NRP1 항체를 관찰하거나 또는 상기 샘플 중에서 NRP1과 결합된 항-NRP1 항체의 양을 결정하는 단계를 포함할 수 있다. 또 다른 양태에서, 특정 대상체에게서 NRP1을 탐지하는 방법은 본 발명의 항체를 상기 대상체에게 투여하는 단계; 및 이러한 대상체에게서 NRP1과 결합된 항-NRP1 항체를 관찰하거나 또는 상기 대상체 (예: 인간, 마우스, 토끼, 랫트 등)에게서 NRP1과 결합된 항-NRP1 항체의 양을 결정하는 단계를 포함한다.
진단용 키트
편의상, 본 발명의 항체를 키트 내에 제공할 수 있는데, 즉 진단 검정을 수행하기 위한 지시사항과 함께 예정량으로 패키지된 시약 조합물로 제공될 수 있다. 항체를 효소로 표지시킨 경우에는, 키트가 이러한 효소에 의해 요구되는 기질 및 조인자 (예를 들어, 탐지 가능한 발색단 또는 형광단을 제공하는 기질 전구체)를 포함할 것이다. 또한, 기타 부가제, 예를 들어 안정화제, 완충제 (예: 차단 완충제 또는 용해 완충제) 등을 포함할 수 있다. 각종 시약의 상대량은 해당 검정의 민감도를 실질적으로 최적화시키는 시약 용액 중의 농도를 제공하기 위해 광범위하게 다양할 수 있다. 특히, 시약은 통상적으로 동결건조된 무수 분말로서 제공될 수 있는데, 이에는 용해시 적당한 농도를 지닌 시약 용액을 제공해주는 부형제가 포함된다.
제조품
본 발명의 또 다른 양태에서는, 상기 언급된 장애를 치료하는데 유용한 물질을 함유하는 제조품이 제공된다. 본 발명의 제조품은 용기, 및 표지를 포함한다. 적합한 용기에는, 예를 들어 병, 바이알, 주사기 및 시험용 튜브가 포함된다. 용기는 각종 재료, 예를 들어 유리 또는 플라스틱으로부터 형성할 수 있다. 용기는 상기 질환을 치료하는데 유효한 조성물을 보유하고 있고 멸균성 유입 포트를 가질 수 있다 (예를 들어, 상기 용기는 피하 주사 바늘에 의해 뚫을 수 있는 마개를 갖는 정맥내 용제 봉지 또는 바이알일 수 있다). 조성물 내의 활성제는 상기 항체이다. 용기 상에 있거나 이와 연합된 표지는 해당 조성물이 선택 장애를 치료하는데 사용된다는 것을 표시한다. 본 발명의 제조품은 제약상 허용 가능한 완충제, 예를 들어 인산염 완충 식염수, 링거액 및 덱스트로스 용액을 포함하는 제2 용기를 추가로 포함할 수 있다. 상업적 및 사용자 측면에서 바람직한 기타 재료, 예를 들어 기타 완충제, 희석제, 충진제, 바늘, 주사기 및 사용에 관한 지시사항을 수반한 패키지된 삽입물을 추가로 포함할 수 있다.
다음 실시예는 본 발명의 실시를 단지 예시하기 위한 것이며, 이로써 본 발명의 범위가 제한되지 않는다. 본원에 인용된 모든 특허 및 과학지의 기재 내용은 그의 전문이 본원에 참고로 도입된다.
실시예 1. 항-NRP1 항체의 생성
A. 항체 파아지 라이브러리의 생성
파아지 상에 디스플레이되거나 기타 기술을 사용하여 디스플레이된 항체 라이브러리를 생성시키기 위한 각종 방법이 당해 분야에 공지되어 있다. 통상적인 하이브리도마 기술과 비교해서 이들 라이브러리의 이점 중의 한 가지는 이들이 교차-종 기능적 항체를 생성시키는데 매우 적합하다는 것인데, 이는 면역 관용을 도입하지 않고서도 시험관내 선별과 스크리닝을 할 수 있기 때문이다 [참고: Smith (1985) Science 228:1315-1317; Bradbury and Marks (2004) J Immunol Methods 290:29-49].
일반적으로, 두 가지 유형의 조합 항체 라이브러리가 개발되었는데, 이는 레퍼토리 공급원으로써 구별된다. 현재까지 공지된 대부분의 라이브러리는 그의 다양성에 대한 공급원으로서 천연 레퍼토리를 이용하는 "천연" 항체 라이브러리인데, 여기서는 본래 그대로의 또는 면역시킨 동물 또는 인간으로부터의 면역 세포의 메 시지 RNA로서의 유전자를 증폭시키고 파아지 디스플레이 또는 기타 디스플레이 기술, 예를 들어 리보솜 또는 효모 디스플레이를 위해 벡터 내로 클로닝한다. 천연 항체는 통상적으로 다중 골격을 갖고 있는데, 이는 가변 CDR 서열과 경쇄 및 중쇄의 재조합과 함께, 항체 다양성을 구성한다. 라이브러리의 크기가 라이브러리의 성능을 결정하는데, 이는 레퍼토리가 일반적으로 라이브러리 크기 보다 더 크기 때문이다. 한편, 합성 라이브러리는 다양성을 설계하고 합성 DNA를 수반한 라이브러리에 내장시킨 새로운 분기의 라이브러리이다. 단일 또는 다중 골격을 사용하였다. 단일 골격 라이브러리의 경우에는, 다양성 공급원이 다양한 CDR 루프를 창출하도록 설계된 합성 DNA의 축퇴에만 좌우된다. 다양성 설계와 라이브러리 크기 둘 다가 라이브러리 성능에 있어 중요한데, 이는 라이브러리로부터 발견된 항체의 친화도에 의해 측정할 수 있다. [참고: Knappik et al. (2000) J Mol Biol 296:57-86; Sheets et al. (1998) Proc Natl Acad Sci USA 95:6157-6162; de Haard et al. (1999) J Biol Chem 274:18218-18230].
가변 중쇄 상보성 결정 영역 (CDR) 내의 용매-노출된 위치에 합성 다양성을 도입함으로써, 리 (Lee) 등은 단일 인간 골격 상에 집적된 파아지-디스플레이된 합성 항체 라이브러리를 개발하였다 (VL카파 I, VH아군 III) [참고: Sidhu et al. (2004) J Mol Biol 338:299-310; Lee et al. (2004) J Mol Biol 340:1073-1093; Carter et al. (1992) Proc Natl Acad Sci USA 89:4285-4289]. 이러한 "VH 라이브러리"를 2가 항원 결합성 단편 (Fab'2)으로서 디스플레이하고, 인간 면역글로불린에서 관찰 된 천연 다양성을 모방하기 위해 적응시킨 코돈을 사용하였다 [참고: Lee et al. (2004) J Immunol Methods 284:119-132]. 유래된 항체의 친화도와 기능에 의해 측정된 바와 같이 VH 라이브러리를 잘 수행하긴 하였지만, 관심있는 특정의 항원 표적의 기능적 항체를 생성시키는 데에는 라이브러리 설계에 있어서의 추가의 변형이 요망될 수 있다. 최근에, 올리고뉴클레오티드 합성을 위해 트리뉴클레오티드를 이용할 수 있음으로 인해, DNA 다양성을 증가시키지 않고서도 아미노산 다양성을 증가시킬 수 있는 능력이 생겨났다. 이로써, 새로운 VH/VL 라이브러리가 본원에 기재된 바와 같이 생성되었는데, 여기서는 CDR-L3 내의 고도의 가변 위치가 추가로 다양화되었는데, 이는 CDR-H3과 CDR-L3이 항원 결합 부위의 내부 구를 형성하기 때문이다 [참고: Mian et al. (1991) J Mol Biol 217:133-151].
재료 및 방법
CDR-H3 상에 정지 코돈을 수반한 파아지미드 pV0350-4 상에서 올리고뉴클레오티드-지시된 돌연변이 유발을 사용하고 M13 박테리오파아지 입자의 표면 상에 2가적으로 디스플레이하여, 컨센서스 CDR-L1, -L2, -L3, -H1 및 -H2를 수반한 VH/VL 본래 그대로의 라이브러리 주형을 생성시켰다 [참고: Lee et al. (2004) J Mol Biol 340:1073-1093]. CDR-L3, H1, H2 및 H3 내의 설계된 부위에 돌연변이를 도입하고 CDR-H3 정지 코돈을 수복하기 위해 설계된 돌연변이원성 올리고뉴클레오티드의 혼합물을 사용하여, 문헌 [참고: Kunkel et al. (1991) Methods Enzymol 204:125-139]에 기재된 바와 같이 쿤켈 (Kunkel) 돌연변이 유발 방법을 사용하여 파아지-디스플레이된 라이브러리를 구축하였다. 문헌 [참고: Sidhu et al. (2004)]에 기재된 바와 같이, 돌연변이 유발 반응물 (약 10 ㎍ DNA)을 이. 콜라이 SS320 세포 (약 1011개 세포) 내로 전기천공시켰다.
결과
본원에 기재된 VH/VL 라이브러리는 박테리오파아지 상에서 잘 디스플레이하고 이. 콜라이에서 잘 발현하는 것으로 밝혀졌고 포유류 세포에서 잘 발현하는 완전한 길이의 IgG로 신속하게 전환될 수 있는, VH 라이브러리에 사용된 바와 같은 헤르셉틴 (Herceptin®) 유래된 VL카파 I 및 VH아군 III 골격을 활용하였다 [참고: Lee et al. (2004) J Mol Biol 340:1073-1093; Carter et al. (1992) Proc Natl Acad Sci USA 89:4285-4289]. 이러한 라이브러리는 파아지 외피 단백질 P3과 융합됨으로써 2가 Fab (Fab'2)로서 파아지 표면 상에 디스플레이하였다. 이러한 2가 디스플레이는 고정화 항원에 대한 겉보기 결합 친화도를 증가시키고, 친화성이 거의 없거나 낮은 파아지 항체 클론 회수를 개선시키는 데에 도움을 주기 위한 것이다.
VH 라이브러리의 경쇄 내에 유지된 헤르셉틴®-유래된 CDR 서열로부터 내재된 잠재적 편재를 피하기 위해, 컨센서스 카파 I CDR 서열을 VH/VL 라이브러리에 대한 주형 내로 도입하였다. 천연 인간 항체에 존재하는 가장 우세한 아미노산을 선별함으로써 컨센서스 CDR 잔기를 결정하였다. 기존에 3개 모든 CDR에서의 돌연변이 유발을 보장하기 위해 VH 라이브러리의 중쇄에 이용된 정지 코돈을 CDR-H1 및 CDR-H2에 대한 컨센서스 아군 III 서열로 유사하게 대체시켰다. 컨센서스 CDR 서 열은 각 위치에서 가장 우세한 아미노산을 나타낸다. CDR-H3은 항원 인식에 있어 우성적 역할을 하므로, 몇 가지 정지 코돈을 H3에 위치시켜 라이브러리로부터의 기능적 항체 클론이 서로 상이하였다는 것을 보장하였다 [참고: Xu et al. (2000) Immunity 13:37-45]. 인간 컨센서스 CDR 서열의 존재로 인해, 부분적으로 돌연변이된 변이체 (모든 표적화 CDR이 변하는 것은 아니다)가 디스플레이될 수 있고 결합에 있어 잠재적 기능성을 유지할 수 있는 것으로 예상되었다. 이러한 방식으로, VH/VL 설계는 라이브러리 내의 기능성 파아지 항체 클론의 비를 증가시키는 이점을 지니고 있다. 사용된 CDR 서열은 표 1에 제시된 바와 같이, CDR-L1의 경우에는 SISSYL (위치 28-33)이고, CDR-L2의 경우에는 GASSRA (위치 50-55)이며, CDR-L3의 경우에는 YYSSPL (위치 91-96)이고, CDR-H1의 경우에는 FTFSSYAMS (위치 27-35)이며, CDR-H2의 경우에는 RISPSGGSTY(위치 50-58)이고, CDR-H3의 경우에는 WXXXRPXXMDY (위치 95-102, X는 정지 코돈이다)이다. 인간 항체에서의 각 위치의 우세가 또한 표 I에 제시되어 있다.
그들의 고 용매 노출 및/또는 특히 천연 항체 서열 중에서의 고 가변성을 기준으로 하여, VH/VL 라이브러리 내의 다양성을 CDR 위치의 일부에 도입하였다. 돌연변이 유발을 위해 선택된 위치와, 도입된 다양성이 표 II에 제시되었다. 예를 들어, CDR-H1에서는 위치 27, 28, 30, 31, 32, 33 및 34가 다양화되도록 선택되었다. VH/VL 라이브러리 설계의 경우에는, 퇴화 올리고 코돈 또는 트리뉴클레오티드를 사용하여 다양성을 각 위치에 안내하여 가장 우세한 아미노산이 나타낼 수 있도록 하였다. 예를 들어, CDR-H1 (위치 30)에서는 세린이 천연 다양성의 약 50%를 나타내기 때문에, 세린 약 52%와 시스테인을 제외한 기타 아미노산 2.5%을 갖는 트리뉴클레오티드의 혼합물 (X1)을 사용하였다.
CDR-H3과 CDR-L3은 항원 결합 부위의 중앙을 형성하므로, 구조적으로 공지된 항체-항원 복합체에서 가장 높은 항원 접촉 빈도를 나타낸다 [참고: Chothia et al. (1989) Nature 342:877-883]. 가장 높은 가변성을 나타내는 CDR-L3 내의 5개 잔기 (표 II)를 무작위화하였다. 전체 CDR-H3은 길이, 서열 및 구조 측면에서 가장 다양하고 천연 항체 내의 다양성의 주요 성분이다 [참고; Xu and Davis (2000) Immunity 13:37-45; Wu et al. (1993) Proteins 16:1-7]. 따라서, 9 내지 20개 아미노산으로 길이가 다양한 상이한 CDR-H3을 수반한 12개 서브-라이브러리를 구축하였다. 합한 이들 서브-라이브러리는 천연 항체 내의 CDR-H3 길이 변동의 대략 90%를 포괄한다. 트리뉴클레오티드 코돈을 사용하여, CDR-H3을 암호화하는 올리고뉴클레오티드를 합성하였다. 이로써, 본 발명자들은 (CDR-H3 내에 드문) 시스테인을 용이하게 결실시킬 수 있게 되고, CDR-H3 내에 가장 풍부한 잔기인 글리신, 티로신 및 세린의 수준을 증대시킬 수 있게 된다 [참고: Mian et al. (1991) J Mol Biol 217:133-151]. 세린, 티로신 및 글리신이 각각 약 15.6%이고 시스테인을 제외한 나머지 아미노산 각각이 3.1%인 트리뉴클레오티드 혼합물인 코돈 X7을 CDR-H3 내의 각 위치에 사용하였다 (모든 트리뉴클레오티드 혼합물에 대한 이론적 계산치). 트리뉴클레오티드의 상이한 조합을 CDR-H1, H2, H3, 및 L3의 선별된 위치에 또한 사용하였다. 표 II 및 보충적 표 I에 제시된 바와 같이, 코돈 X1 내지 X6은 세린, 티로신 또는 글리신을 높은 비율로 갖고 있다. X1은 52.5%의 세린을 갖고 있고, X2는 52.5% 티로신을 갖고 있으며, X3은 10% 티로신, 글리신 또는 세린을 갖고 있고, X4는 28.8% 글리신을 갖고 있으며, X5는 19.2% 티로신, 글리신 또는 세린을 갖고 있고, X6은 20% 티로신 또는 세린을 갖고 있다. VH/VL 항체 파아지 라이브러리는 대략 1010개 변이체가 디스플레이된 것으로 추정되었다.
Figure 112008040384719-PCT00003
VH / VL 라이브러리의 주형 내의 CDR - L1 , CDR - L2 , CDR - L3 , CDR - H1 및 CDR - H2 의 컨센서스 서열. 천연 인간 항체에 존재하는 가장 우세한 아미노산을 선별함으로써 컨센서스 CDR 잔기를 결정하였다. 소정의 위치에서 인간 항체 내의 각 잔기의 우세율 (%)이 제시되었는데, 이는 카바트 데이터베이스에서 대략 1600개 인간 경쇄 서열과 3500개 인간 중쇄 서열의 정렬로부터 계산하였다 [참고: Kabat et al. (1977) J Biol Chem 252:6609-6616].
Figure 112008040384719-PCT00004
VH / VL 라이브러리에 대한 CDR - L3 , CDR - H1 , CDR - H2 및 CDR - H3 의 계획된 다양성. CDR-L3, CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3 내에서의 무작위화를 위해 선택된 CDR 위치가 라이브러리 주형 내의 컨센서스 잔기와 함께 열거되어 있다. 계획된 다양성은 맞게 적응시킨 퇴화 코돈 (이탤리체)에 의해 암호화된 잔기 군이거나 또는 트리뉴클레오티드 코돈 (진하게 표시함)의 혼합물에 의해 암호화된 시스테인을 제외한 19개 아미노산이므로, 각 위치에서 암호화된 아미노산 유형의 비율 (%)은 데이터베이스에서 발견된 아미노산 유형의 50%에 근접하거나 이 보다 더 높았다. 특별한 위치에서는, Tyr (Y), Gly (G) 및 Ser (S)을 향한 상이한 편재를 나타내는 트리뉴클레오티드 코돈 혼합물을 사용하여, 시스테인을 제외한 19개 아미노산 모두를 도입하였다.
B. 파아지 유래된 모노클로날 항-NRP1 항체의 생성
재료 및 방법
항-NRP1 항체를 확인하기 위한 라이브러리 분류 및 스크리닝 - 인간 및 뮤린 NRP1 구조물 (l-641aa)을 포유류 발현 벡터 내로 클로닝하고, CHO 세포에서 발현시켰다. 절단된 형태의 NRP-1, a1a2 및 b1b2 도메인을 바쿨로바이러스에서 발현시켰다. NUNC 96 웰 맥시소르프 (Maxisorp) 면역판을 4℃ 하에 밤새 표적 항원 (10 ㎍/ml)으로 피복시키고, 실온 하에 1시간 동안 파아지 차단용 완충액 PBST [PBS 및 1% BSA 및 0.05% 트윈 (Tween) 20]으로 차단시켰다. 항체 파아지 라이브러리를 항원 판에 가하고 실온 하에 밤새 항온 배양하였다. 그 다음날 항원 피복시킨 판을 PBT (0.05% T-20을 수반한 PBS)로 10회 세척하고, 결합된 파아지를 5O mM HCl 및 50O mM NaCl로 30분 동안 용출시키고, 등 용적의 1 M 트리스 (Tris) 염기 pH 7.5로 중화시켰다. 회수된 파아지를 이. 콜라이 XL-1 블루 세포에서 증폭시켰다. 후속 선별 회전 동안, 항체 파아지와 항원 피복시킨 판과의 항온 배양을 2 내지 3시간으로 단축시키고, 판 세척의 엄격도를 점차적으로 증가시켰다.
항-NRP1 항체 결합 친화도, 특이성 및 유동 세포계수법 분석 - 문헌 [참고: Lee et al. (2004) J Mol Biol 340:1073-1093]에 기재된 바와 같이 경쟁적 파아지-결합성 ELISA를 사용하여 파아지 항체 IC50 값을 결정하였다. 4개-파라미터 비선형 회귀 곡선-피팅 프로그램 (공급처: Kaleidagraph, Synergy Software)을 사용하여 경쟁 곡선을 피팅하여, 파아지-디스플레이된 항체의 50%가 고정화 항원과 결합하지 못하게 억제시키는 용액 결합 단계 중의 항원 농도로서 계산되는 IC50 값을 결정하였다.
개개 클론의 VL 및 VH 영역을 LPG3 및 LPG4 벡터 [참고: Carter et al. (1992) Proc Natl Acad Sci USA 89:4285-4289] 내로 각각 클로닝함으로써 관심있는 클론을 IgG 내로 재포맷하고, 포유류 세포에서 일시적으로 발현시킨 다음, 단백질 A 칼럼으로 정제하였다. 항-NRP1 IgG의 결합 친화도를 결정하기 위해, BIAcore™-3000 기기를 이용한 표면 플라스몬 공명 (SPR) 측정을 사용하였다. 항-NRP1 IgG를 활성화 CM5 바이오센서 칩과 커플링시켜 대략 500 반응 단위 (RU)를 달성한 다음, 반응되지 않은 군을 1 M 에탄올아민으로 차단시켰다. 역학 측정을 위해, 뉴로필린의 2배 일련의 희석물 (0.7 내지 500 nM)을 25℃ 하에 30 ㎕/min의 유속으로 PBST 완충액에 주사하였다. 간단한 일-대-일 랑뮈르 결합 모델 (BIAcore Evaluation Software version 3.2)을 사용하여 연합 속도 (kon) 및 해리 속도 (koff)를 계산하였다. 평형 해리 상수 (Kd)를 koff/kon 비로서 계산하였다.
결합 특이성 시험의 경우에는, PBST 완충액 중의 10 ㎍/ml의 IgG를 1시간 이상 동안 2 ㎍/ml 항원-피복시킨 96-웰 맥시소르프 판과 함께 항온 배양하고, 판을 PBT 완충액으로 세척하였다. 결합된 항체를 항-인간 항체 HRP 접합체로 탐지하고, 대략 5분 동안 TMB 기질을 이용하여 전개하며, 1 M H3PO4로 급냉시킨 다음, 450 nm 하에 분광광도계로 판독하였다.
유동 세포계수 분석의 경우에는, 세포 해리 완충액을 이용하여 HUVEC 세포를 조직 배양 플라스크로부터 분리시켰다. 해리된 세포를 PBS에서 세척시키고, 2% 태아 소 혈청을 함유하는 PBS (FACS 완충액)에서 재현탁시켰다. 세포를 얼음 상에서 30분 동안 FACS 완충액 중의 10 ㎍/ml 항-NRP1 항체 또는 대조군 항체 (항-IgE)와 함께 항온 배양하였다. 이어서, 세포를 PBS에서 2회 세척하고, 얼음 상에서 30분 동안 FACS 완충액 중에서 PE-Fab'2 염소 항-인간 IgG, Fc 특이적 항체로 염색하였다. 2회 PBS 세척 후, 세포를 200 ㎕ FACS 완충액에 재현탁시키고, 셀-퀘스트 (Cell-Quest) 소프트웨어를 사용하여 유동 세포계수법 (FACS caliber, Benton Dickenson, Mountain View, CA)에 의해 분석하였다.
결과
12개 VH/VL 서브-라이브러리를 선별 제1 회전 동안 고정화 CHO 세포 발현된 hNRP1 (a1a2b1b2)-Fc 단백질에 대항하여 개별적으로 패닝하였다. 각 서브-라이브러리로부터 용출된 파아지를 증폭시킨 다음, 선별 제2 회전 동안 합하였다. hNRP1-Fc가 항원으로서 사용되었기 때문에, 풀링된 파아지를 패닝 제1 회전 후에 과량의 무관한 융합 Fc 단백질로 예비-흡수시켜 항-Fc 파아지 항체의 회수를 최소화하였다. 패닝 제4 회전 후, 무작위로 골라낸 95개 파아지 클론을 대상으로 하여 NRP1과 특이적으로 결합할 수 있는 능력에 관하여 평가하였다. 클론의 90%가 hNRP1 결합에 대해 양성이었고, 양성 클론의 40%가 인간 및 뮤린 NRP1 둘 다와 결합하였다.
이들 파아지 클론을 서열 분석하고, 추가의 성상 확인을 위해 10개의 독특한 클론을 선택하였다. 모든 클론은 파아지 ELISA에서 70 nM 이하의 IC50으로 인간 및 뮤린 NRP1 둘 다와 결합하였다. 클론 YW64.3은 각각 0.5 및 3.4 nM의 IC50으로 인간 및 뮤린 NRP1과 결합하였다 (표 III). 10개 클론으로부터의 서열은 가변 CDR-H3 길이를 갖고 CDR-H1, H2 및 L3 전반에 걸쳐 변화가 다양하게 분포되었지만, 라이브러리 주형으로부터의 몇몇 컨센서스 CDR 서열은 유지되는 VH/VL 라이브러리 설계를 반영하고 있다. 클론 64.3 및 64.29는 4개 모든 CDR에서 변화를 나타내고 인간 및 뮤린 NRP1 둘 다에 대한 가장 우수한 친화도를 또한 지니고 있다 (표 III).
Figure 112008040384719-PCT00005
항- NRP1 항체에 대한 부분 CDR 서열 및 결합 친화도 ( 파아지 IC50 ). VH/VL 라이브러리로부터 초기에 확인된 11개 상이한 파아지 클론의 무작위화 위치에서의 CDR 아미노산 서열 만이 제시되었다. 경쟁적 파아지 ELISA를 이용하여 hNRP1 및 mNRP1에 대한 IC50 값으로서의 친화도를 측정하였다.
hNRP1의 도메인-절단된 변이체를 사용하여 이들 클론에 대한 결합성 에피토프를 확인하였고, 모두를 대상으로 하여 hNRP1의 a1a2 도메인에 대해 지도화하였다. NRP1의 b1b2 도메인과 결합한 파아지 항체를 선별하고 VEGF의 결합성을 잠재적으로 차단하기 위해, 본 발명자들은 고정화 항원으로서 바쿨로바이러스 발현된 hNRP1 (b1b2)-His를 사용하여 새로운 패닝 공정을 개시하였다. 선별 4회전 후, 인간 및 뮤린 NRP1 둘 다와 결합한 1개의 독특한 클론 YW107.4 만을 확인하였다. YW107.4는 파아지 ELISA에서 6 및 38 nM의 IC50으로 인간 및 뮤린 NRP1과 결합하였다 (표 III).
선별된 항-NRP1 IgG의 성상 확인 - 표 III으로부터의 선별된 항-NRP1 클론을 완전한 길이의 인간 IgG1로 재포맷하고, CHO 세포에서 발현시킨 다음, 추가로 성상 확인하기 위해 정제하였다. 항-NRP1 파아지 항체 YW64.3 및 YW107.4는 인간 및 뮤린 NRP1와 특이적으로 결합하였지만, 인간 또는 뮤린 NRP-2, ErbB2-ECD 또는 BSA와는 결합하지 않았다. 도 1A. 기타 8개 파아지 항체 각각은 유사한 특이성을 나타내었다. 표면 플라스몬 공명에 의해, 고정화 YW64.3 및 YW107.4 IgG는 500 nM 이하 농도에서는 이들 항원과 상호 작용하지 않았다. 그러나, YW64.3과 YW107.4 둘 다는 0.9 및 5 nM의 Kd로 인간 NRP1과 결합하였을 뿐만 아니라 7.8 및 11 nM의 Kd로 뮤린 NRP1과 각각 결합하였다. 판 고정화 항원을 사용하여 이들 항체를 선별하였지만, FACS 분석 결과 정제된 모든 IgG가 또한, hNRP1을 내적으로 발현하는 HUVEC 세포와 결합한 것으로 입증되었다 (예를 들어, 도 1B에 도시된 YW64.3 및 YW107.4).
C. 항-NRP1 항체의 친화성 성숙
YW107.4는 각각 6 및 38 nM의 파아지 IC50으로 인간 및 뮤린 NRP1 둘 다의 b1b2 도메인과 결합하였다 (표 III). 생체내 효력을 개선시키기 위해, 인간-NRP1-His를 사용하여 상기 클론을 친화성 성숙시켰다.
재료 및 방법
클론 YW107.4의 친화성 성숙을 위한 라이브러리 주형을 생성시키기 위해, 쿤켈 돌연변이 유발을 시용하여 먼저 모 파아지미드의 GCN4 루이신 지퍼를 제거하여 1가 디스플레이 Fab 포맷을 제공하였다. 정지 코돈을 CDR-L3에 혼입시켰다. 야생형 뉴클레오티드를 선호하는 염기의 70-10-10-10 혼합물을 이용하여 돌연변이원성 DNA 합성함으로써 선별된 위치에서 대략 50% 돌연변이 비율을 도입시키는 연질 무작위화 전략을 친화성 성숙에 사용하였다 [참고: Gallop et al. (1994) J Med Chem 37:1233-1251]. CDR-L1의 위치 28-32, CDR-L2의 위치 50 및 53-55, CDR-L3의 위치 91, 92, 93, 94 및 96, CDR-H1의 위치 28-35, CDR-H2의 위치 50-58, 및 CDR-H3의 위치 95-100에서 선별된 잔기를 연질 무작위화함으로써, CDR 루프의 조합, L1/L2/L3, L3/H1/H2 및 L3/H3 무작위화를 나타내는 3가지 상이한 라이브러리를 생성시켰다.
친화성 성숙된 클론을 선별하기 위해, 문헌 [참고: Lee et al. (2004) J Mol Biol 340:1073-1093]에 기재된 바와 같이 파아지 라이브러리를 대상으로 하여 제1 회전 동안 판 분류한 다음, 용액 상 분류 4회전을 수행하였다. 판 분류 제1 회전에서는, 3개 라이브러리를 37℃ 하에 1시간 동안 hNRP1-피복된 판에 개별적으로 가하였다. 이 후, 용액 상 분류 4회전을 수행하여 다음과 같이 엄격도를 증가시키면서 친화성에 의거한 선별의 효율을 증강시켰다: 2회전 (5 nM 바이오티닐화 hNRP1), 3회전 (1 nM 바이오티닐화 hNRP1), 4회전 (37℃ 하에 1시간 동안 0.5 nM 바이오티닐화 hNRP1 및 250 nM 비-바이오티닐화 hNRP1 경쟁인자) 및 5회전 (37℃ 하에 3시간 동안 0.5 nM 바이오티닐화 hNRP1 및 500 nM 비-바이오티닐화 hNRP1 경쟁인자). 선별 공정 동안, 바이오티닐화 hNRP1을 이용하지 않은 반응이 포함되었고, 이는 각 패닝 회전의 증강을 계산하기 위한 배경 파아지 결합성으로서 제공되었다.
패닝 5회전 후, 고-처리량 단일 점 경쟁적 파아지 ELISA를 사용하여 고 친화성 클론에 대해 신속하게 스크리닝하였다 [참고: Sidhu et al. (2004) J Mol Biol 338:299-310]. 5 nM hNRP1의 존재 하에 450 nm 하에서의 흡광도 대 hNRP1의 부재 하에 450 nm 하에서의 흡광도 비가 낮은 클론을 추가로 성상 확인하기 위해 선택하였다.
결과
선별된 위치가 단지 50%만 돌연변이되도록 하는 야생형 서열 편재를 유지하는 '연질 무작위화' 전략을 사용하여 무작위화하기 위해, 3가지 상이한 CDR 조합물, L1/L2/L3, L3/H1/H2 및 L3/H3을 표적으로 하였다 [참고: Gallop et al. (1994) J Med Chem 37:1233-1251]. 친화성 성숙을 위해서는, 2가 Fab 보다는 오히려 1가 Fab를 파아지 상에서 디스플레이하여 선별 동안의 잠재적 결합 활성도를 저하시켰다. 정지 코돈을 각 서브-라이브러리 내의 CDR-L3에 도입하였다. 이탈 속도 선별 전략 (방법 참고)을 이용하여 YW107.4의 친화도를 개선시켰는데, 이는 이것이 이미 비교적 높은 연합 속도 상수 (2.2xlO5)를 보유하고 있지만, 해리 속도 상수 (1.1x1O3)는 비교적 신속하였기 때문이다 (표 V).
선별 제1 회전에서는, 3개 모든 CDR 연질-무작위화 라이브러리를 고정화 hNRP1에 대항하여 패닝시킨 다음, 용액 상 분류 전략을 이용하는 후속 회전을 수행하여 표적 농도를 제한하고 친화도에 의거한 선별을 증강시켰다. 바이오티닐화-hNRP1의 농도를 점차적으로 5 nM에서 0.5 nM으로 감소시키고, 500배 과량의 비-바이오티닐화 hNRP1을 가하여 신속한 이탈 속도 결합제와 경쟁하였다. 혼합물을 또한, 37℃ 하에 2시간 이하 동안 항온 배양하였다.
L1/L2/L3 라이브러리는 5회전 이후에 상당한 증강을 나타내었다. 96개 클론을 무작위로 골라내고, 서열 분석한 다음, 친화도 순위를 매겼다. 23개의 독특한 파아지 클론을 선별하고 추가로 성상 확인하기 위해 정제하였다. 대부분의 클론은 파아지 경쟁 ELISA에 의해 결정된 바와 같이 hNRP1에 대한 개선된 친화도를 갖고 있었다. 놀랍게도, mNRP1에 대한 친화도도 선별 공정으로부터 생략되었음에도 불구하고 개선되었는데, 이는 상기 클론이 보존된 에피토프와 결합하였다는 것을 제안하고 있다. 선별된 클론은 3개 경쇄 CDR 내에 4 내지 7개 변화를 나타내었는데; CDR-L1 내의 위치 28 및 30은 각각 티로신 및 히스티딘으로 치환되는 경향이 있는 반면, CDR-L3 내의 위치 92, 93 및 96은 보다 다양하였다 (표 IV).
인간 및 뮤린 NRP1 둘 다에 대한 가장 높은 친화도를 나타내는 클론 (YW107.4.18, YW107.4.38, YW107.4.52, YW107.4.63, YW107.4.76a 및 YW107.4.87)을 재포맷하고 완전한 길이의 항체로서 발현시켰다. 6개 모든 IgG는 hNRP1에 대한 개선된 친화도를 나타내고 VEGF-A 결합의 완전한 차단을 유지하였다. 인간 및 뮤린 NRP1에 대한 친화도 범위는 0.4 내지 1.8 nM이었다 (표 V). YW107.4.87의 해리 속도 상수는 개선되어 인간 및 뮤린 NRP1 둘 다에 대한 친화도를 약 10배 개선시켰는데; 인간 또는 뮤린 NRP2에 대한 결합은 전혀 관찰되지 않았다 (도 2A). YW107.4.87은 또한, 세포 표면 NRP1에 대한 개선된 결합성을 보여주었다 (도 2B).
Figure 112008040384719-PCT00006
친화도 개선된 YW107 .4 클론에 대한 결합 친화도 ( 파아지 IC50 ) 및 CDR 서열. 무작위화 경쇄 CDR 위치에서 친화성 성숙된 YW107.4 클론의 추론 아미노산 서열이 제시되었다. 경쟁 파아지 ELISA로부터의 hNRP1 및 mNRP1에 대항한 개개 클론의 Fab-파아지 IC50 값을 사용하여 YW107.4를 이용한 경우의 친화도 개선과 비교하였다.
Figure 112008040384719-PCT00007
25℃ 하에 항- NRP1 IgG 의 결합성 역학 분석. 25℃ 하에 hNRP1 또는 mNRP1 관류 희석물을 이용하여 IgG-고정화 바이오센서 칩을 사용하여, 항-NRP1 IgG의 결합 친화도를 BIAcore-3000 기기 상에서 측정하였다 (재료 및 방법 참고). 각 측정치는 Kd 오차 대략 ±25%를 갖는다.
실시예 2. 항-NRP1 항체의 생물학적 활성
YW64.3 및 YW107.4.87의 항체 서열이 도 3에 도시되었다. 본원 목적상 그리고 항-NRP1 항체 활성에 관한 다음의 설명에서, "YW64.3"와 "항-NRPA"는 상호 교환적으로 사용되었고; "YW107.4.87"과 "항-NRPB"는 상호 교환적으로 사용되었다.
재료 및 방법
세포 배양물
HUVEC, HUAEC, 및 HMVEC을 구입처 (Cambrex)로부터 구입하고 EGM-2 배지 (공급처: Cambrex)에서 배양하였다. 세포 및 조직 배양물을 37℃ 하에 5% CO2, 95% 습도 항온 배양기에서 유지시켰다.
DRG 및 해마 콜랩스 검정
마우스 E12.5 DRG로부터의 액손 상에서의 콜랩스 검정을 문헌 [참고: He and Tessier-Lavigne (1997) Cell 90:739-751]에 기재된 바와 같이 수행하였다. 간략하게 언급하면, DRG 외식편을 라미닌 피복된 8-챔버 슬라이드 (Nunc) 상에 도말하고, 37℃ 하에 5% CO2, 95% 습도 항온 배양기에서 밤새 N3-F12 배지 내에서 50 ng/ml NGF와 함께 배양하였다. 인간 세마포린-3A (Met-1 내지 Val-771)를 C-말단 헥사히스티딘 융합 태그를 수반한 진핵성 발현 벡터 pRK5 내로 클로닝하였다. 단백질을 CHO 세포에서 일시적으로 발현시키고 NiNTA 친화 크로마토그래피에 의해 정제하였다. N-말단 서열 분석을 사용하여 쿠마시 염색된 SDS-PAGE 겔 상에서 90 kDa 밴드로서 가시적인 단백질을 확증하였다. 정제된 세마3A를 억제제의 존재 또는 부재 하에 약 8 ng/ml으로 가하고, 외식편을 37℃ 하에 30분 동안 항온 배양하여 콜랩스를 유도시켰다. 가시화를 위해, 성장 원뿔을 4% PFA 및 15% 슈크로스에 고정시키고, 로다민-팔로이딘 (공급처: Molecular Probes)으로 PBS에서 30분 동안 1:40으로 염색한 다음, 세척하고 플루오로마운트 (Fluoromount) G (공급처: Fisher) 상에 올려 놓았다. 해마 콜랩스 검정을 수행하기 위해, E17 마우스 뇌를 냉각 PBS에서 해부하고, 조직 초퍼 (Mcllwain)를 사용하여 250 ㎛ 두께 슬라이스로 수평으로 절단하였다. 미세한 텅스턴 바늘을 사용하여, 치상회 (dentate gyrus)를 선별된 해마 박편으로부터 추가로 미세해부하였다. 외식편을 라미닌 피복된 8-챔버 슬라이드 (Nunc) 상에 도말하고, 37℃ 하에 밤새 B27 (공급처: Gibco Life Technologies)을 보충시킨 뉴로바살 (Neubasal) 배지 중에서 배양하였다. 콜랩스를 유도하기 위해, 외식편을 모의 형질감염되거나 세마3F 형질감염된 COS 세포 적응시킨 배지의 존재 하에 37℃에서 30분 동안 대조군 또는 항-NRP1 항체 (10 ㎍/ml)와 함께 항온 배양하였다.
세포 이동 검정
8 ㎛ 공극 크기 팔콘 (Falcon) 24-다중웰 삽입 시스템 (공급처: BD Biosciences)를 이용하는 변형된 보이덴 (Boyden) 챔버 검정을 사용하여 세포 이동 검정을 수행하였다. 판을 상부 챔버와 하부 챔버 둘 다에서 37℃ 하에 16시간 동안 8 ㎍/ml 라미닌 (공급처: Invitrogen)으로 예비피복시켰다. HUVEC (80-90% 융합성)를 트립신으로 수거하고, 계수하며, 원심분리한 다음, 5 x 105개 세포/ml의 농도로 0.1% BSA를 수반한 EBM-2에 재현탁시켰다. 100 ㎕ 세포를 트랜스웰 시스템의 상부 챔버에 가하였다. 0.1% BSA를 수반한 500 ㎕ EBM-2를 함유한 하부 챔버에 자극을 가하기 직전 세포를 수반한 상부 챔버에 억제제를 가하였다 (대부분의 경우 lO ng/ml의 VEGF). 이어서, 판을 37℃ 하에 밤새 놓아 두었다. 본 검정을 중지시키기 위해서는, 스폰지 면봉을 사용하여 막의 상부 면 상의 세포를 제거하고, 하부 면 상의 세포를 메탄올로 고정시킨 다음 시톡스 그린 (Cytox green) (공급처: Molecular Probes)으로 염색하였다. 막의 하부 면 상의 이동된 세포 수는 악시포트 (AxiPhot) 형광 현미경을 사용하여 계수하고, 그 결과를 이미지제이 (ImageJ) 프로그램 (NIH, http://rsb.info.nih.gov/ij/)으로 분석하였다.
비드 증식 검정
덱스트란-피복된 시토덱스 (Cytodex) 3 마이크로캐리어 비드 (공급처: Amersham Pharmacia)를, 20분 마다 온화하게 진탕시키면서 37℃ 5% CO2 항온 배양기에서 4시간 동안, 1 ml의 EGM-2 배지 중에서 비드당 400개 세포 농도로 아융합성 HUVEC와 함께 항온 배양하였다. 이어서, 비드를 25-㎠ 조직 배양 플라스크 (공급처: BD Biosciences)에 옮기고, 37℃ 하에 12 내지 16시간 동안 5 ml의 EGM-2와 함께 항온 배양하였다. 이어서, HUVEC-피복된 비드를 1 ml EGM-2로 3회 세척하고, 200 비드/ml의 밀도로 PBS 중의 2.5 ㎍/ml의 피브리노겐 (공급처: Sigma)에 재현탁시켰다. 0.5 ml의 피브리노겐/비드 용액을, 0.625 단위 트롬빈 (공급처: Sigma)을 함유하는 24-웰 조직 배양 판의 1개 웰에 옮겨 응고를 유도시켰다. 피브리노겐/비드 용액을 실온에서 5분 동안 항온 배양한 다음, 37℃ 하 5% CO2 항온 배양기에서 20분 동안 항온 배양하였다. 응고를 완료한 후, 1 ml의 EGM-2를 각 웰에 가하고 37℃ 하에 30분 동안 응고액을 평형시켰다. 배지를 꺼내고, EGM-2 배지 중의 2000/ml 농도의 1 ml의 피부 섬유아세포 (Detroit 551)를 응고액 상부 상에 도말하였다. 이어서, 상이한 항체를 각 웰에 가하고, 배지를 2 내지 3일 마다 변화시키면서 검정을 8일 동안 모니터링하였다. 비드의 10x 해상 영상을 도립 현미경으로 포착하고, 100, 200, 및 300 ㎛으로 이격된 동심원을 각 영상에서 비드 주변에 디지털로 뽑아내었다. 각 라인을 교차하는 혈관 수를 계수하고, 각 거리와 조건에서 평균을 취하였다.
FACS 분석
융합성 HUVEC를 37℃ 하 5% CO2 항온 배양기에서 5분, 2시간 또는 20시간 동안 10 ㎍/ml의 항-NRP1 항체 또는 대조군과 함께 항온 배양하였다. 세포를 효소 무함유 세포 해리 완충액 (공급처: Gibco)으로 수거하고, 등 용적의 FACS 완충액 (1 x PBS, 2% FBS, 2 mM EDTA, 0.1% 나트륨 아지드)으로 중화시킨 다음, 웰당 500,000개 세포로 프로-바인드 U-바닥 96-웰 검정 판 (Falcon) 내로 옮겼다. 세포 펠릿을 2k rpm으로 원심분리함으로써 수집하고, 적당한 바이오티닐화 항체를 1:100으로 함유하는 25 ㎕ 염색 완충액 (5% 정상 마우스 혈청, 2% 정상 랫트 혈청 및 10% 10 ㎍/ml 인간 IgG를 수반한 FACS 완충액)에 재현탁시킨 다음, 4℃ 하에 2시간 동안 항온 배양하였다. 플루오리포터 (FluoReporter) 미니-바이오틴-xx 단백질 표지화 키트 (공급처: Molecular Probes)를 사용하여 항체를 바이오티닐화하였다. 이어서, 세포를 FACS 완충액으로 2회 세척하고, 4℃ 하에 20분 동안 1:1000 스트렙타비딘-PE (공급처: BD Biosciences)를 함유하는 25 ㎕ FACS 완충액에서 항온 배양하였다. 최종적으로, 세포를 세척하고 FACS 완충액에 재현탁시킨 다음, FacsCalibur 시스템 (공급처: BD Biosciences)을 이용하여 분석하였다.
세포 부착 검정
아융합성 HUVEC를 37℃ 하에 30분 동안 대조군 또는 항-NRP1 항체와 함께 100 ㎕ 배지 199에서 예비 항온 배양한 다음, 웰당 10,000개 세포로 1 ㎍/ml 피브로넥틴 (공급처: Roche)으로 피복시킨 NUNC 맥시소르프 평저 96-웰 판 (공급처: eBioscience) 상에 도말하였다. 판을 140 g으로 1분 동안 원심분리시켜 세포와 기질의 접촉을 동시에 일어나게한 다음, 37℃ 하에 30분 동안 항온 배양하였다. 이어서, 판을 PBS로 3회 세척하고, -80℃에서 2시간 동안 동결시켰다. CyQuant 키트 (공급처: Molecular Probes)를 사용하여 세포 밀도를 결정하였다.
마우스 신생아 망막 혈관 검정
신생아 CD1 마우스 (한배 새끼)에게 상이한 항체를 10 mg/kg의 농도로 복강내 투여하였다. 생후 5일 (P5) 연구의 경우에는 생후 1일 및 3일째에 주사를 수행하고, P8 연구의 경우에는 1일, 3일 및 5일 째에 주사를 수행하였다. 안구를 수집하고, 4℃ 하에 16시간 동안 PBS 중의 4% PFA로 고정시킨 다음, PBS 세척하였다. 해부된 망막을 PBSt (PBS, 1% 트리톤 X-100) 중의 10% 마우스 혈청으로 3시간 동안 차단시킨 다음, PBLEC (PBS pH 6.8 중의 1% 트리톤 X-100, O.1 mM CaCl2, 0.1 mM MgCl2, 0.1 mM MnCl2) 중의 바이오티닐화 이소렉틴 B4 (Bandeiraea simplicifolia; Sigma) 25 ㎍/ml과 함께 4℃ 하에 밤새 항온 배양하였다. 이어서, 망막을 PBSt에서 4회 세척하고, 알렉사 (Alexa) 488 스트렙타비딘 (1:200; 공급처: Molecular Probes)과 함께 4℃ 하에 밤새 항온 배양하였다. 염색을 완료한 후, 망막을 PBSt에서 4회 세척하고, PBS 중의 4% PFA로 후 고정시킨 다음, PBSt에서 4회 더 세척하였다. 편평하게 올려 놓은 망막의 영상을 공초점 형광 현미경으로 포착하였다.
마우스 피부 혈관 투과성 검정
5 내지 7주생 C57BL6J 암컷 마우스에게 150 ㎕의 0.5% 에반스 블루 (Evan's blue) 용액을 정맥내 주사하였다. 동물의 등과 옆구리 부위를 면도하여 목 아래 엉덩이 윗 부분의 털을 제거하고, 면도한 부위를 4개 주사 영역으로 나누었다. 에반스 블루 주사한지 1시간 후에, 항체 (0.5 mg/ml)을 수반하거나 수반하지 않으면서 BSA (7.5 ㎍/ml) 또는 hVEGF (7.5 ㎍/ml)를 함유하는 PBS 20 ㎕를 상기 4개 영역 중의 어느 한 영역에 무작위로 피내 주사하였는데, 각 영역에 대해 1회 주사하였다. 피내 주사한지 1시간 후에, 동물을 희생시키고 4개 영역을 함유하는 피부를 해부하였다. 피부의 디지털 영상을 찍었다. 8 mm 피부 생검 펀치를 사용하여 주사 부위 상의 동일한 부위의 피부 샘플을 절단시키고, 피부 샘플을 55℃ 하에 48시간 동안 포름아미드 용액 중에서 항온 배양하여 조직으로부터 에반스 블루 염료를 추출하였다. 이어서, 605 nm에서 분광계를 이용하여 용액의 흡광도를 측정하였다.
세포 증식 검정
세포 증식 ELISA 키트 (공급처: Roche)를 사용하여 세포 증식을 분석하였다. 간략하게 설명하면, 90% 융합성 HUVEC를 수거하고 검정용 배지 (DMEM:F12 50:50, 1.5% FBS)에 재현탁시키며, 1% 젤라틴으로 예비 피복시킨 블랙 96-웰 조직 배양 판 (ViewPlate-96, Perkin Elmer)으로 웰당 3,000개 세포로 도말하였다. 세포를 37℃ 하에 16시간 동안 항온 배양하고, 신선한 검정용 배지로 변화시킨 다음, 8시간 더 항온 배양하였다. VEGF (20 ng/ml) 및 상이한 항체를 배양물에 가하고, 세포를 20시간 동안 항온 배양하였다. BrdU 표지화 용액을 10 mM의 최종 농도에 가하고 세포를 37℃ 하에 24시간 더 항온 배양하였다. 화학발광 면역검정에 의해 BrdU 혼입량을 결정하였다.
VEGFR2 인산화 검정
듀오세트 (DuoSet) IC ELISA 키트 (공급처: R&D)를 사용하여 총 VEGFR2 및 포스포-VEGFR2를 결정하였다. 간략하게 설명하면, 아융합성 HUVEC를 PBS로 세정하고 공급된 용해 완충액에서 용해시켰다. 세포 용해물을 4℃ 하에 14 kg으로 5분 동안 원심분리시키고, 상등액을 청정한 튜브에 옮겼다. 이어서, ELISA 검정을 지시된 바와 같이 수행하였다.
면역블롯팅
융합성 HUVEC를 0.2% FBS 및 0.1% BSA를 수반한 EBM-2에서 16시간 동안 고갈시킨 다음, 0.1% BSA를 수반한 EMB-2으로 변화시킨 후, 37℃ 하에 90분 동안 항온 배양하였다. 대조군 및 항-NRP1 항체를 50 ㎍/ml으로 가하고, 세포를 37℃ 하에 30분 동안 항온 배양하였다. 세포를 37℃ 하에 10분 동안 VEGF (20 ng/ml)로 자극하고, 빙냉 PBS로 2회 세척한 다음, 20 mM 트리스 7.5, 150 mM NaCl, 1% 트리톤 X-100, 포스파타제 억제제 칵테일 I 및 II (공급처: Sigma) 및 완전한 프로테아제 억제제 정제 (공급처: Roche)를 함유하는 용해 완충액에서 용해시켰다. 용해물 분취액을 대상으로 하여 4 내지 20% 노벡스 (Novex) 트리스-글리신 SDS 겔 (공급처: Invitrogen)에서 전기영동한 다음, 인비트롤론 (Invitrolon) PVDF 막 (공급처: Invitrogen)에 전기전이시켰다. 본 연구에 사용된 일차 항체는 항-Erk, 항-포스포-Erk, 항-Akt, 항-포스포-Akt, 항-p38, 항-포스포-p38, 항-Src 및 항-포스포-Src (Tyr416) [구입처: Cell Signaling Technology]였다.
결과
A. 세마3A 기능 및 VEGF 결합성에 대한 항-NRP1 A 및 항-NRP1 B 각각의 선택적 작용
항-NRP1 항체를 대상으로 하여 NRP1에 대한 VEGF165의 결합을 차단할 수 있는 그들의 능력에 관하여 시험하였다. 항-NRP1B는 NRP1에 대한 VEGF 결합을 강력하게 차단시킨 반면, 항-NRP1A는 그렇치 못하였다 (도 4). 이들 결과는 NRP1의 CUB 도메인 (a1-a2)이 VEGF 결합에 필요치 않다는 것을 제안하고 있다 [참고: Gu et al. (2002) J Biol Chem 277:18069-18076].
이어서, 항-NRP1 항체를 대상으로 하여 세마3A 기능에 대한 그들의 효과에 관하여 시험하였다. 세마3A와 VEGF165가 b1 도메인의 N-말단 영역에 중복 결합성 도메인을 공유할 수 있으므로, NRP1와의 결합을 놓고 경쟁할 수 있는 것으로 기존에 제안된 바 있다 [참고: Gu et al. (2002) J Biol Chem 277:18069-18076; Miao et al. (1999) J Cell Biol 146:233-242]. 따라서, 단일 항-NRP1 mAb가 세마3A 및 VEGF 결합성을 차단할 수 있는 것으로 여겨졌다. 본 발명의 항-NRP1 mAb를 대상으로 하여 세마3A-유도된 액손 성장 원뿔 콜랩스를 차단시킬 수 있는 그들의 능력에 관하여 시험하였다. 후근절 (DRG)을 마우스 E12.5 배아로부터 해부하고 배양하여 세마3A/NRP1-의존성 콜랩스에 대해 반응성인 감각 신경세포 성장 원뿔을 확립시켰다 [참고: He and Tessier-Lavigne (1997) Cell 90:739-751]. 이들 배양물에 세마3A를 부가하면 성장 원뿔은 그들의 악틴 풍부 구조가 수축되었다. 그러나, 항-NRP1을 세마3A와 동시에 웰에 가하면, 콜랩스가 완전히 차단되었다. 이와는 달리, 항-NRP1B는 세마3A-유도된 콜랩스에 대해 어떠한 효과도 나타내지 않았다 (도 5A).
따라서, 이들 두 항체는 기능적으로 별개의 작용을 한다: 항-NRP1A는 세마3A 기능을 차단시키지만 NRP1에 대한 VEGF 결합을 방해하지 않는 반면; 항-NRP1B는 NRP1에 대한 VEGF 결합은 차단시키지만 세마3A 기능에 대해서는 어떠한 효과도 나타내지 않았다. 추가 연구 결과, 어떠한 항체도 E17 해마 성장 원뿔의 세마3F/NRP2-의존성 콜랩스를 차단하지 못한 것으로 밝혀졌는데 (도 5B), 이는 어떠한 항체도 NRP2와 결합하지 않았다는 관찰 결과와 일치한다. 따라서, 상기 항체는 혈관 생물학에 있어서의 NRP1의 역할을 해부하기 위한 선택적 도구를 제공하고, NRP1 활성을 선택적으로 차단시키기 위한 수단을 제공한다.
B. 항-NRP1 A 와 항-NRP1 B 둘 다는 VEGF-의존성 내피 세포 이동 및 비드 증식을 저하시킨다
본 발명의 항-NRP1 mAb를 VEGF-구동된 내피 세포 (EC) 이동으로 시험하였다. 트랜스웰 시스템을 사용하여, 인간 제대 정맥 내피 세포 (HUVEC)를 상부 챔버 내로 도입하였지만, VEGF는 하부 챔버에 가하여 EC 이동을 증진시켰다. 이어서, 하부 챔버로 이동한 EC를 고정시키고, 염색한 다음 정량화하였다 (도 6A). 본 실험 및 후속 실험에서 VEGF-구동된 EC 이동을 차단시키기 위한 양성 대조군으로서 항-VEGF 항체를 사용하였다 (달리 언급되지 않는 한, 모든 실험에서 교차 종 반응성 항-VEGF 항체 B20.4.1을 사용하였다) [참고: Liang et al. (2006) J Biol Chem 281:951-961].
VEGF를 부가하기 직전에 항-NRP1 mAb를 상부 챔버 내의 세포에 가하였다. 흥미롭게도, 항-NRP1A와 항-NRP1B 둘 다는 내피 세포 이동을 상당히 저하시켰는데, 항-NRP1B가 더 강력한 이동 차단을 제공하였다 (도 6A). 2가지 기타 유형의 EC 주, 즉 HUAEC 및 HAEC를 사용하여 유사한 결과를 수득하였다.
보다 복잡한 EC 기능에 있어서의 NRP1 및 항-NRP1 mAb의 역할을 추가로 해부하기 위해, 혈관형성 발아의 시험관내 시스템을 이용하였다 [참고: Nakatsu et al. (2003) Microvasc Res 66:102-112]. 이러한 검정에서는, EC를 수 일 동안 비드 아체 상에 피복시키면 각 비드로부터 돌출되는 널리 규정된 다중 혈관 구조가 생성되었다. 어느 하나의 항-NRP1 mAb를 이들 배양물에 부가하면 혈관 길이가 감소되었고, 항-NRP1 B의 경우에는 아체 수 감소가 또한 관찰되었다. 이러한 관찰 결과는 정량화에 의해 확증되었다 (도 6B). 항-VEGF가 양성 대조군으로서 사용되어 본 검정에서 발아를 완전히 차단시켰다. 이러한 결과는 상기 시험관내 검정에서관의 EC 이동과 증식을 저하시키는데 있어서의 각 항-NRP1 mAb에 대한 강력한 효과를 확증시켜 주었다.
C. NRP1은 마우스 망막에서 혈관 재형성을 위해 필요하다
Nrpl 녹아웃 마우스에서 관찰된 표현형은 혈관 재형성 상의 결함과 일치하였다 [참고: Gu et al. (2003) Dev Cell 5:45-57; Kawasaki et al. (1999) Development 126:895-4902; Takashima et al. (2002) Proc Natl Acad Sci USA 99:3657-3662]. 이어서, 혈관 재형성에 있어서의 NRP1의 역할은 혈관 발아, 재형성 및 성숙의 혈청형화 시건을 연구 조사하기 위한 이상적 모델인 발생 중인 마우스 망막에 대한, 항-NRP1 mAb를 이용한 전신 치료 효과를 분석함으로써 시험하였다 [참고: Dorrell and Friedlander (2006) Prog Retin Eye Res 25:277-95]. 출생시에는 성상 세포성 네트워크가 시신경 헤드 (ONH) 근처에 위치한 중앙 망막 동맥으로부터 발아되는 EC를 대신 안내하였다. 생후 1일 (P1)이 지난 후, 망막 혈관계는 신경 섬유층 (NFL)에서 형태발생적 주름 (morphogenic furrow)을 발생시켰는데, 이는 신경절 세포 층에 대한 표재에 놓여있고 망막 가장자리를 향해 동심 패턴으로 신장하기 시작하여 P5 째에 절반에 도달한다 (도 7A). 그 다음 3일에 걸쳐, 주름이 망막 가장자리로 지속적으로 신장하지만, ONH에 가장 근접한 혈관 얼기는 혈청형화 재형성을 진행하는데, 이는 혈관 얼기가 NFL 내의 정련된 모세혈관 네트워크 내로 얇아지고 (도 7B), 혈관이 망막의 보다 심부 층 내로 발아되는 것으로 이루어진다 (도 7C).
항체를 P1에서 시작하여 신생 마우스에게 주사한 다음, 망막을 P5 및 P8에 수집할 때까지 격일로 주사하였다. 혈관계를 가시화하기 위해, 망막을 이소렉틴 B4로 염색하고 비교하였다. IgG 대조군의 정련된 모세혈관 네트워크가 P5와 P8 간에 잘 수립되긴 하였지만, 이러한 혈관 재형성은 양 항-NRP1 mAb에 의해 완전히 억제되었다. 이러한 차이는 ONH에 인접한 영역 내의 NFL 혈관 네트워크를 찍은 대표적 영상으로부터 혈관 밀도를 비교함으로써 정량화하였다 (도 7D). 어느 한 항-NRP1 mAb를 이용한 처치가 혈관 재형성을 강력하게 억제시켜 주었기 때문에, 혈관 밀도가 대조군과 비교해서 항-NRP1A 및 항-NRP1B 처치된 망막 둘 다에서 상당히 더 높았다. 흥미롭게도, 발생 중인 주름은 양 항-NRP1 mAb 처치한 망막에서 지속적으로 신장하였는데, 항-NRP1B 처치된 동물에서는 단지 약간의 신장 억제가 나타났다 (도 7E). 이는 망막 발생이 일반적으로 억제되지 않지만, 대신 어느 하나의 항-NRP1 mAb로 처치하는 경우에는 혈관 재형성이 특이적으로 차단된다는 것을 제안하고 있다.
항-NRP1 mAb과는 달리, 항-VEGF 처치는 대조군과 비교해서 망막 혈관 밀도를 저하시켜 주었다 (도 7D). 정성적 수준에서는, 항-VEGF 처치한 망막 내의 혈관이 P8에서 감소된 복잡성을 나타내었는데, 이러한 경향은 P5에 존재하긴 하지만 덜 명백하다. 이들 데이터는 항-VEGF 처치로 인해 초기 발아 및/또는 혈관 퇴행이 차단된다는 것을 제안하고 있다. 흥미롭게도, 항-VEGF를 전신 전달하는 것이 혈관 주름의 신장을 상당히 저하시키지 못하였다 (도 7E). 이는 이러한 외부 영역에서의 혈관 관강의 결여로 인해 신장성 말단 세포에 대한 항체 확산이 불량하기 때문인 것으로 예상된다 [참고: Gerhardt et al. (2003) J Cell Biol 161:1163-1177].
P8 망막을 평가함으로써, 혈관형성성 발아에 대한 항체 처치 효과에 관하여 추가로 조사할 수 있었다. P5와 P8 사이에서는, 혈관이 NFL 혈관 네트워크로부터 보다 심부 혈관 층 내로 발아되기 시작하여, 외부 얼기층 (OPL) 혈관 네트워크가 형성되는데, 이는 외부 핵 층에 대해서는 표재성이고 망막 내의 가장 깊은 혈관 상이다 (도 7C). OPL을 유발시키는 측부로부터 발아하는 나중 발생으로 인해, 내부 얼기층 (IPL)으로 명명되는 중간체 혈관 비드가 생성된다. P8에서 OPL로부터 찍은 영상은 양 항-NRP1 mAb, 및 항-VEGF 처치로 인해 발아가 완전히 억제되었다는 것을 보여준다.
항-VEGF와 비교해서 항-NRP1A 또는 항-NRP1B로 전신 처치한 동물로부터 취한 망막에서 관찰된 상이한 표현형은 NRP1이 VEGFR2 신호 전달을 증강시키는 것 이외의 기전에 의해 EC 기능을 조절할 수 있다는 것을 제안하고 있다.
D. NRP1 기능을 차단시키는 것은 VEGFR2 신호 전달에 거의 영향을 미치지 않는다
NRP1이 VEGF에 반응하여 내피 세포 이동에 요구되는 것으로 관찰되긴 하였지만, 본 발명자들은 VEGF에 의해 유도된 세포성 활성을 규정하는 2가지 특성인 EC 증식과 혈관 투과성에 있어서의 NRP1의 요구 사항에 관하여 연구하였다. 특히, 항-NRP1A 또는 항-NRP1B를 이용한 처치는 VEGF-유도된 투과성에 전혀 영향을 미치지 못한 반면, 항-VEGF는 강력한 차단을 제공하였다 (도 8A). VEGF-유도된 EC 증식에 관하여 시험하는 경우에 유사한 경향이 관찰되었는데, 항-NRP1A는 증식을 전혀 차단시키지 않았고, 항-NRP1B는 약간의 용량-반응성 저하 만을 나타내었다 (도 8B). 이들 결과는 EC에서 NRP1의 siRNA 녹다운이 VEGF에 의해 유도된 증식에 영향을 미치지 않는다는 것을 보여주는 기존에 공개된 데이터를 뒷받침하고 있고 [참고: Murga et al. (2005) Blood 105:1992-1999], VEGF-구동된 EC 행위에 있어서의 NRP1의 일차 역할이 세포 이동을 매개하는 것이란 사실을 제안하고 있다.
VEGFR2 신호 전달에 대한 항-NRP1 항체의 효과를 연구하였다. VEGF는 VEGFR2의 제2 및 제3 세포외 IgG 도메인과 결합하고, 세포내 도메인에서 몇 가지 티로신 잔기의 자가인산화를 촉발시킴으로써 상기 수용체를 활성화시킨다. HUVEC에서 VEGF에 의해 유도된 VEGFR2 인산화를 완전히 차단시키는 항-VEGF와는 달리, 항-NRP1A는 VEGFR2 인산화 수준을 상당히 변화시키지 못한 반면, 항-NRP1B는 단지 중간 수준의 저하를 가져다 주었다 (도 8C).
NRP1은 VEGFR2 인산화 수준을 직접 조절하는 것이 아니라, 특이적 VEGFR2 경로를 조정하는 역할을 할 수 있다. 이러한 가능성에 역점을 두기 위해, VEGFR2에 의해 매개된 하단 신호 전달 사건에 대한 항-NRP1 처치 효과를 조사하였다. VEGFR2는 분열촉진물질 활성화 단백질 키나제 Erk1/2의 활성화를 통하여 EC 증식을 유도시키고 [참고: Rousseau et al. (1997) Oncogene 15:2169-2177; Takahashi et al. Shibuya (1999) Oncogene 18:2221-2230], PI3-키나제/Akt 경로를 통하여 EC 생존과 혈관 투과성을 조절하는 것으로 밝혀졌다 [참고: Chen et al. (2005) Nat Med 11:1188-1196; Gerber et al. (1998) J Biol Chem 273:13313-13316; Six et al. (2002) FEBS Lett 532:67-69]. 항-NRP1 mAb 처치가 VEGF-유도된 EC 증식 또는 혈관 투과성을 상당히 변화시키지 못하였다는 관찰 결과에 일치하게, 항-NRP1A 및 항-NRP1B 항온 배양은 Erk1/2 또는 Akt의 VEGF-유도된 인산화에 전혀 영향을 미치지 못하였다. 한편, 항-NRP1 항체를 이용하여 NRP1 기능을 억제시키는 것이 EC 이동을 강력하게 저하시켰다. NRP1이 VEGF-구동된 악틴 재구성 및 EC에서의 세포 이동에 요구되는 것으로 밝혀진, 세포 이동을 위해 요구되는 VEGFR2 경로, 예를 들어 p38 MAP 키나제 경로를 특이적으로 조절하는 것이 가능하다 [참고: Rousseau et al. (1997) Oncogene 15:2169-2177]. 항-NRP1A 및 항-NRP1B 처치 둘 다는 HUVEC에서 p38 인산화 수준을 약간 저하시켰는데 (도 8D), 이는 상기 가설을 뒷받침해준다. 그러나, p38 인산화 단독의 약한 수준 저하는 본 발명자들이 앞서 섹션에 기재된 바와 같은 이동 및 발아 검정에서 관찰한 강력한 저하를 예기하는 것으로 예상되지 않거나, 또는 망막 혈관 재형성 실험에서 항-NRP1 mAb 처치와 항-VEGF mAb 처치 간에 관찰된 상이한 표현형을 정성적으로 설명하는 것으로 예상되지 않는다 (도 7).
실시예 3. 항-NRP1 항체의 종양 억제 활성
재료 및 방법
인간 세포주 H1299 및 SK-MES-1 비소세포 폐암종은 공급처 [ATCC (Rockville, MD)]로부터 수득하였다. SK-MES-1의 경우에는, 각 HRLN 암컷 누드 마우스에게 1 ㎣ 종양 단편 이식제를 옆구리에 피하 주사하였다. H1299의 경우에는, 1x1O7개 종양 세포를 HRLN 암컷 누드 마우스의 옆구리에 피하 주사하였다. 종양 성장은 칼리퍼 측정함으로써 매주 2회씩 모니터링하였다. 종양 크기가 평균 80 내지 120 ㎣에 도달하면, 마우스를 평균 종양 크기가 거의 동일한 군으로 분류하고 처치를 시작하였다. 이를 각 연구의 1일로 간주하였다. 모든 처치는 0.2 ml/20 g으로 체중 조정되었다. 종양 용적 (㎣) = 폭2 x 길이/2. 종양 성장 억제율 (%) (% TGI) = (대조군의 평균 종양 용적 - 처치군의 평균 종양 용적/대조군의 평균 종양 용적) x 100. % TGI는 모든 동물을 연구 중인 기간 동안에만 측정한다 (SK-MES-1의 경우에는, 22일이고; H1299의 경우에는 15일이다). 종말점까지의 시간 (TTE) = log10 (종말점 용적, ㎣) - b / m (여기서, b는 절편이고, m은 log-변환된 종양 성장 데이터의 선형 회귀에 의해 수득된 선의 기울기이다). 종양 성장 지연율 (%) (% TGD) = (처치군에 대한 평균 TTE - 대조군에 대한 평균 TTE/대조군에 대한 평균 TTE) x 100.
아베르틴 (Avertin) (1.3% 트리브로모에탄올 및 0.8% 아밀 알코올; 공급처: Sigma-Aldrich)을 사용하여 마우스를 마취시켰다. FITC-표지된 라이코페르시콘 에스쿨렌툼 (Lycopersicon esculentum) 렉틴 (150 ㎕의 0.9% NaCl 중의 150 ㎍; 공급처: Vector Laboratories)을 전신 관류하기 3분 전에 정맥내 주사하였다. 혈관계에 PBS 중의 4% 파라포름알데히드 (PFA)를 2 내지 3분 동안 경심장 관류하였다. 종양을 제거하고 16시간 동안 동일한 고정액에 함침시킴으로써 후-고정시킨 다음, 한랭보호를 위해 30% 슈크로스에서 밤새 항온 배양한 후, OCT에 포매시키고 동결시켰다. 박편 (30 ㎛)을 절단하고, 유리 슬라이드 위에 올려 놓은 다음, 실온 하에 2시간 동안 5% 정상 염소 혈청을 수반한 PBSt (PBS, 0.5% 트리톤 X-100)에서 재수화 및 차단시켰다. 이 박편을 4℃ 하에 밤새 항-NRP1B (1:500) 또는 랫트 항-마우스 PDGFRβ (1:1000; 클론 APB5, eBioscience)과 함께 항온 배양하였다. 이어서, 박편을 PBSt에서 4회 세척하고, 실온 하에 4시간 동안 이차 항체, 알렉사 488 염소 항-인간 IgG 및 알렉사 568 염소 항-랫트 IgG (1:200; 공급처: Molecular Probes)와 함께 항온 배양하였다. 염색을 완료한 후, 박편을 PBSt에서 4회 세척하고, PBS 중의 4% PFA로 후-고정시킨 다음, PBS에서 4회 더 세척하였다. 최종 세척 용액을 꺼내고, 플루오로마운트-G (공급처: SouthernBiotech) 1 내지 2 방울을 가하였다. 유리 커버슬립을 샘플 위에 놓아 두고, 짜이스 악시오포트 (Zeiss Axiophot) 형광 현미경을 이용하여 영상을 포착하였다.
결과
VEGF 경로를 차단시키는 것이 마우스 종양 모델 및 인간 암에서의 신생혈관 증식을 저하시키는 것으로 입증되었다 [참고: Ferrara and Kerbel (2005) Nature 438:967-974]. 그러나, 몇몇 종양은 혈관 형성을 위해 VEGF에 덜 의존적이거나 또는 항-VEGF 요법에 덜 민감해질 수 있는 것으로 여겨진다 [참고: Jain et al. (2006) Nat Clin Prat Oncol 3:24-40; Kerbel et al. (2001) Cancer Metastasis Rev 20:79-86]. NRP1 차단이 VEGF 차단에 의해 제공된 종양 성장 억제를 증강시킬 수 있었는지를 결정하기 위해, 본 발명자들은 항-VEGF 요법에 대한 다양한 민감성을 나타내는 것으로 공지된 몇 가지 이종이식편 모델을 선별하였다. 종양 유래된 VEGF 이외에도, 마우스 간질성 VEGF는 종양 성장에 대해 강한 영향력을 행사하는 것으로 밝혀졌기 때문에, 본 발명자들은 뮤린 및 인간 VEGF 둘 다를 인식하는 항-VEGF mAb를 사용하였다 [참고: Liang et al. (2006) J Biol Chem 281:951-961].
이들 실험은 NRP1 차단 효과 단독과 항-VEGF과 병용한 NRP1 차단 효과를 시험하기 위해 설계하였다. 또한, 단일 작용제 항-VEGF 및 이소형 대조군 항체가 포함되었다. SK-MES-1은 주로 혈관 및 간질성 조직에서 NRP1을 발현시키는 (종양 세포에서의 발현 수준의 중간 정도이다) NSCLC 이종이식편 모델이다. 이 모델에서는, 항-VEGF가 52% 종양 성장 억제 (TGI)를 제공하였고, 단일 작용제 항-NRP1B은 37% TGI를 유발시켰으며, 항-NRP1A는 TGI에 대한 상당한 효과를 전혀 나타내지 않았다 (도 9A).
특히, 어느 하나의 항-NRP1 항체를 항-VEGF와 병용해서 사용하는 경우에 상가적 효과가 관찰되었다. 도 1OA에 도시된 바와 같이, 항-NRP1A를 항-VEGF와 병용해서 사용하면 TGI가 약 52%에서 약 70%로 증가하였고; 항-NRP1B를 항-VEGF와 병용해서 사용하면 TGI가 약 77%로 증가하였다 (도 9A). 혈관 및 간질성 조직에서는 NRP1을 고 수준으로 발현하지만 종양 세포에서는 보다 덜한 정도로 발현하기도 하는 H1299 NSCLC 이종이식편 모델에서 유사한 결과를 수득하였다. 단일 작용제 항-NRP1B는 39% TGI를 나타내었고, 항-VEGF는 28% TGI를 나타내었으며, 병용 처치는 51% TGI를 나타내었다 (도 9C).
SK-MES-1 모델 동물에게 35일 동안 투여한 다음 60일 동안 투여하여 종양 성장 지연을 조사하였다 (종양 크기가 1500 ㎣을 초과하는 경우에는 동물을 본 연구로부터 제외시켰는데, 독성 결과로서 제외된 동물은 없었다). 카플란-마이어 플롯은 단일 작용제 군과 비교해서 양 항-NRP1 mAb 병용군(combination arms)이 종양 성장을 지연시키는데 있어서 상당한 효과가 있다는 것을 나타낸다 (도 9B). 종양 성장 지연 (TGD) 측정치는 항-NRP1A의 경우에는 단일 작용제 지연이 전혀 없었고; 항-NRP1B의 경우에는 24% TGD를 나타내었으며; 항-NRP1의 경우에는 60% TGD를 나타내었고; 항-NRP1A + 항-NRP1B 병용군의 경우에는 93% TGD를 나타내었으며; 항-NRP1B + 항-NRP1 병용군의 경우에는 96% TGD를 나타내었다.
NSCLC 모델에서 관찰된 바와 유사한 결과가 또한, 기원 5 (Fo5)로 명명된 유방암의 뮤린 모델에서 관찰되었는데, 여기서는 MMTV-Her2 트랜스제닉 (transgenic) 발현에 의해 발생된 종양을 해부하고 누드 마우스에 이식하였다 [참고: Finkle et al. (2004) Clin Cancer Res 10:2499-2511]. 이 모델에서는, NRP1이 주로 혈관 및 인접한 간질 상에서 발현되고, 항-VEGF는 종양 성장을 저하시키는데 있어서 단지 부분적으로만 유효하였다 (도 9C). 종양 억제는 NSCLC 모델에서 관찰된 바와 유사하였지만, 항-NRP1 및 항-VEGF 처치 맥락에서 조직학적 변화에 초점을 맞추기 위해서는, 동물을 실험 초기에 동일자로 수거하였다 (대시 라인; 도 9C).
혈관 조직학 연구를 위해 Fo5 모델을 사용하여, 본 발명자들은 대조군 종양이, PDGFRβ 면역조직학에 의해 결정된 바와 같이 일반적으로 혈관주위세포 적용 범위가 결여된 매우 큰 미조직 (unorganized) 혈관을 나타내었다는 것을 관찰하였다. 항-VEGF 단독으로 처치하면 혈관 직경이 감소하였고, 일반적으로 혈관 밀도가 감소되었다. 또한, 전부는 아니지만, 항-VEGF 처치된 종양에서 유지된 대부분의 혈관은 혈관주위세포의 밀접한 연합을 나타내었다. 기타 혈관주위세포 마커를 이용한 경우에 유사한 결과가 관찰되었다.
어느 한 항-NRP1 mAb 단독으로 처치한 종양으로부터의 혈관은 신생 마우스 망막 내의 항-NRP1 처치한 혈관과 형태 면에서 유사한 것으로 여겨지는데, 혈관은 얼기-유사 외관을 유지하면서 편평하고 미조직된 것으로 여겨진다. 한편, 대조군 처치된 종양 혈관과 유사하게, 어느 한 항-NRP1 mAb로 처치한 종양은 또한, 상당한 혈관주위세포 적용 범위가 결여되었다. 가장 흥미롭게도, 항-VEGF과 항-NRP1A 또는 항-NRP1B로 처치한 종양은 복합 표현형을 나타내었는데, 혈관은 항-VEGF 처치된 종양과 유사한 감소를 나타내지만 나머지 혈관은 덜 정련되고 밀접한 혈관주위세포 연합이 결여된 것으로 보인다.
이들 형태학적 관찰 결과는 혈관 밀도 상의 정량화된 변화와 상관이 있었다. 도 10에 도시된 바와 같이, 항-NRP1 항체와 항-VEGF 둘 다를 이용한 처치는 혈관 밀도를 감소시켰다 (도 10A). 한편, 항-VEGF 만은 대조군과 비교해서 시험된 종양 샘플 중의 혈관주위세포 염색을 증가시키는 것으로 여겨진다. 전반적으로, 상대적 혈관주위세포 적용 범위를 측정하는 혈관주위세포/혈관 비는 항-VEGF 처치된 종양이 가장 높은 비를 갖고 있다는 것을 보여주는데, 이는 항-NRP1A 및 항-NRP1B 처치에 의해 감소된다.
항-NRP1 (항-NRP1A 및 항-NRP1B) 및 항-VEGF가 상이한 EC 기능 및/또는 신호 전달 경로를 차단함으로써 작용할 수 있다는 발견은, 이들 항체를 종양 모델에서 병용하는 것이 종양 성장을 저하시키는데 있어서 상가적 또는 상승적 효과를 나타낼 수 있다는 가능성을 야기시켰다. 실제로, 항-NRP1을 항-VEGF와 병용하는 경우에 현저한 상가적 효과가 관찰되었다 (도 9). 특히 항-NRP1A의 경우에는, 상기 결과가 상가적 효과라기 보다는 오히려 상승적 효과를 제안하는데, 이는 다중 종양 모델에서는 단일 작용제 항-NRP1A 처치 후의 평균 종양 용적이 대조군과 상이하지 않았지만, 항-VEGF와 병용한 경우에는 항-VEGF 처치 단독과 비교해서 상기 항체가 종양 반응을 상당히 증강시켰기 때문이다.
항-NRP1B의 경우에는, 단일 작용제 처치가 종양 성장을 상당히 저하시켰다. 흥미롭게도, 이들 효과는 항-VEGF 단독의 경우보다 약간 덜 강력하였다. 그러나, 항-NRP1B에 대한 병용군으로부터의 종양 성장 저하는 항-NRP1A 병용군과 유사하였다. 항-NRP1B의 단일 작용제 효과는 항-NRP1A와 비교해서, 발아 및 생체내 혈관형성을 저하시키는데 있어서 그의 비교적 더 강력한 억제 활성에 기인할 수 있다. 한편, 양 항체는 마우스 망막 발생 검정에서 혈관 재형성을 차단시키고 Fo5 종양 모델에서 혈관주위세포와 혈관과의 연합을 억제하는데 있어서 동등한 수준으로 강력하였다.
망막에서의 혈관 재형성은 밀접한 혈관주위세포 연합 부재 하에서도 일어난다고 제안되었는데, 이는 혈관주위세포가 혈관 재형성의 가요성 주기를 종결시키는 미성숙 혈관을 안정화시키는 작용을 한다고 제안하고 있다 [참고: Benjamin et al. (1998) Development 125: 1591-1598]. 본 발명의 발견은 혈관 얼기를 형태발생시켜 미세한 모세혈관으로 만든 다음, 추가로 성숙시키는 것으로 이루어진 복잡한 혈관 재형성 공정에 NRP1이 요구된다고 제안하고 있다.
혈관주위세포가 종양 혈관을 안정화시킴으로써, 혈관이 VEGF-의존성을 상실한 결과로서 항-VEGF 요법 내성을 유발시킨다는 개념이 제안되었고 실험적으로 시험되었다 [참고: Bergers et al. (2003) J Clin Invest 111:1287-1295; Erber et al. (2004) Faseb J 18:338-340]. 이들 연구에서는, VEGF (EC 리간드)와 PDGF (혈관주위세포 리간드)의 기능 둘 다를 차단시키면 종양 혈관계가 추가로 붕괴되는 것으로 관찰되었다. 연속해서, 영상화 연구에서는 종양에서 VEGF 기능 만을 차단시키면 상당한 양의 혈관 퇴행이 일어나지만, 잔류 혈관은 밀접한 혈관주위세포 연합을 수반하여 "정상화"되는데, 이는 미성숙 혈관이 혈관 재형성과 성숙을 진행한 결과인 것으로 예상된다 [참고: Inai et al. (2004) Am J Pathol 165:35-52].
발생 중인 망막에서 획득한 관찰 결과를 근거로 하여, 종양에서 NRP1 기능을 차단시키는 것이 종양 혈관의 혈관 재형성을 저하시킬 수도 있고, 연속해서 혈관 성숙을 억제시키므로, 혈관을 VEGF-의존성 상태로 유지시킬 수 있는 것으로 가정할 수 있다. 이것만으로는 종양 성장 저하에 대한 상당한 효과를 발휘할 수 없는데, 이는 대부분의 종양 혈관이 이미 고유적으로 조직 파괴되었기 때문이다 [참고: Baluk et al. (2005) Curr Opin Genet Dev 15:102-111]. 이러한 예측은 항-NRP1A이 혈관 재형성을 강력하게 억제하긴 하지만, 본 발명자들은 종양 성장을 저하시키는데 있어서 상기 항체를 이용한 단일 작용제 효과를 관찰하지 못하였다는 관찰 결과와 일치한다. 그러나, 항-VEGF 요법과 병용해서 혈관 재형성을 차단시키고, 연속해서 성숙을 차단시키는 것이 잔류 종양 혈관을 보다 잘 퇴행할 수 있게 만들 수 있다고 추측되었다. 본 발명의 실험 결과, 항-VEGF과 병용해서 어느 한 항-NRP1 mAb로 처치한 종양에서 잔류 혈관은 실제로 혈관주위세포 연합이 결여된 것으로 밝혀졌다. 이들 결과는 NRP1 기능과 VEGF 기능 둘 다를 차단시키는데 있어서 본 발명자들이 관찰한 상가적 효과가, 항-VEGF 처치된 종양에서 잔류 혈관이 보다 잘 퇴행될 수 있도록 만든 결과로서 유발될 수 있음을 제안하고 있다.
발생 중인 망막 및 이종이식편 종양 모델에서 획득한 결과를 근거로 하여, 새로이 형성된 혈관에서 NRP1 기능을 차단시키는 것은 혈관이 재형성과 후속 성숙을 진행하지 못하게 억제하므로, 이들 혈관이 생존을 위해 VEGF에 보다 더 의존적이 되도록 한다고 가정하였다 (도 11A 내의 모델 참고). 이러한 모델과 일관되게, 본 발명자들은 단일 작용제 단독 용량의 절반 용량 (단일 용량 = 항체 10 mg/kg, 병용 용량 = 각 항체 5 mg/kg)에서 항-NRP1B 및 항-VEGF 둘 다로 처치한 신생 마우스에서 발생 중인 망막의 혈관 밀도가 상당한 저하되었다는 것을 관찰하였다 (도 7D와 비교한 도 11B 참고).
더우기, NRP1이 내피에 대해서 뿐만 아니라 혈관주위세포 기능에 대해서도 요구될 가능성이 있다. bFGF가 평활근 세포 상에서 NRP1의 상향 조절을 유도하여, 평활근 세포 이동을 유도시킬 수 있는 VEGF의 능력이 생겨나는 것으로 최근에 보고되었다 [참고: Liu et al. (2005) Cytokine 32:206-212]. 본 실험에서는, NRP1의 발현이 인간 평활근 세포 상에서 관찰되었을 뿐만 아니라 각종 뮤린 및 인간 종양 중의 혈관주위세포 상에서도 관찰되었다 (예를 들어, NRP1의 발현은 Fo5 모델에서 렉틴 양성 염색에 인접한 부위까지 연장된다).
결론적으로 언급하면, 본원에 기재된 실험은 종양 모델에서 NRP1와 VEGF 기능을 차단시키면 종양 성장을 저하시키는 데 상가적 효과가 발생한다는 것을 입증해주었다. 또한, NRP1이 VEGFR2 신호 전달 이외의 기전을 통하여 작용할 수도 있다는 명백한 증거가 제안되었다.
<110> GENENTECH, INC. <120> NEUROPILIN ANTAGONISTS <130> P2291R1 PCT <140> PCT/US2006/043516 <141> 2006-08-11 <150> US 60/734,798 <151> 2005-11-08 <150> US 60/820,561 <151> 2006-07-27 <160> 134 <210> 1 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <400> 1 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val 1 5 10 15 Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser 20 25 30 Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys 35 40 45 Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile 65 70 75 Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln 80 85 90 Ser Tyr Thr Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu 95 100 105 Ile Lys Arg <210> 2 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <400> 2 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly 1 5 10 15 Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser 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<400> 117 Tyr Ser Ser Pro Leu 5 <210> 118 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <400> 118 Tyr Gly Ser Pro His 5 <210> 119 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <400> 119 Tyr Ser Ser Pro Ile 5 <210> 120 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <400> 120 Tyr Ser Ser Pro Val 5 <210> 121 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <400> 121 Phe Ile Ser Pro His 5 <210> 122 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <400> 122 Tyr Gly Thr Pro Ile 5 <210> 123 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <400> 123 Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Ala 5 10 <210> 124 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <400> 124 Gly Ala Ser Ser Arg Ala Ser 5 <210> 125 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <400> 125 Gln Gln Tyr Met Ser Val Pro Ile Thr 5 <210> 126 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <400> 126 Gly Phe Ser Phe Ser Ser Glu Pro Ile Ser 5 10 <210> 127 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <400> 127 Ser Ser Ile Thr Gly Lys Asn Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser 1 5 10 15 Val Lys Gly <210> 128 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <400> 128 Trp Gly Lys Lys Val Tyr Gly Met Asp Val 5 10 <210> 129 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <400> 129 Arg Ala Ser Gln Tyr Phe Ser Ser Tyr Leu Ala 5 10 <210> 130 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <400> 130 Gly Ala Ser Ser Arg Ala Ser 5 <210> 131 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <400> 131 Gln Gln Tyr Leu Gly Ser Pro Pro Thr 5 <210> 132 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <400> 132 Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met Ser 5 10 <210> 133 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <400> 133 Ser Gln Ile Ser Pro Ala Gly Gly Tyr Thr Asn Tyr Ala Asp Ser 1 5 10 15 Val Lys Gly <210> 134 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <400> 134 Glu Leu Pro Tyr Tyr Arg Met Ser Lys Val Met Asp Val 5 10

Claims (30)

  1. 한 가지 이상의 뉴로필린 (NRP) 매개된 생물학적 활성을 억제할 수 있는 항-뉴로필린-1 (NRP1) 항체.
  2. 제1항에 있어서, NRP1과 세마포린 (semaphorin)의 상호 작용을 억제할 수 있는 항체.
  3. 제1항에 있어서, NRP1과 혈관 내피 세포 성장 인자 (VEGF)의 상호 작용을 억제할 수 있는 항체.
  4. 제1항에 있어서, a1a2 도메인 내의 NRP1과 결합하고, VEGF에 대한 NRP1의 결합을 차단시키지 않으면서 세마포린에 대한 NRP1의 결합을 차단시키는 항체.
  5. 제4항에 있어서, NRP1 매개된 혈관형성 (angiogenesis)을 억제할 수 있는 항체.
  6. 제4항에 있어서, 다음 상보성 결정 영역 (CDR) 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함하는 항체: CDRL1 (RASQSISSYLA; 서열 123), CDRL2 (GASSRAS; 서열 124) 및 CDRL3 (QQYMSVPIT; 서열 125).
  7. 제6항에 있어서, 서열 3의 경쇄 가변 도메인 서열을 포함하는 항체.
  8. 제4항에 있어서, 다음 CDR 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함하는 항체: CDRH1 (GFSFSSEPIS; 서열 126), CDRH2 (SSITGKNGYTYYADSVKG; 서열 127) 및 CDRH3 (WGKKVYGMDV; 서열 128).
  9. 제8항에 있어서, 서열 4의 중쇄 가변 도메인 서열을 포함하는 항체.
  10. 제4항에 있어서, 서열 3의 경쇄 가변 도메인 서열과 서열 4의 중쇄 가변 도메인 서열을 포함하는 YW64.3 항체인 항체.
  11. 제1항에 있어서, b1b2 도메인 내의 NRP1과 결합하고, 세마포린에 대한 NRP1의 결합을 차단시키지 않으면서 VEGF에 대한 NRP1의 결합을 차단시키는 항체.
  12. 제11항에 있어서, 다음 CDR 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함하는 항체: CDRL1 (RASQYFSSYLA; 서열 129), CDRL2 (GASSRAS; 서열 130) 및 CDRL3 (QQYLGSPPT; 서열 131).
  13. 제12항에 있어서, 서열 5의 경쇄 가변 도메인 서열을 포함하는 항체.
  14. 제11항에 있어서, 다음 CDR 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함하는 항체: CDRH1 (GFTFSSYAMS; 서열 132), CDRH2 (SQISPAGGYTNYADSVKG; 서열 133) 및 CDRH3 (ELPYYRMSKVMDV; 서열 134).
  15. 제14항에 있어서, 서열 6의 중쇄 가변 도메인 서열을 포함하는 항체.
  16. 제11항에 있어서, 서열 5의 경쇄 가변 도메인 서열과 서열 6의 중쇄 가변 도메인 서열을 포함하는 YW107.4.87 항체인 항체.
  17. 제1항에 있어서, 뮤린 NRP1과 인간 NRP1 둘 다와 결합할 수 있는 항체.
  18. 제1항에 있어서, 모노클로날 항체인 항체.
  19. 제1항에 있어서, 이중-특이적 항체인 항체.
  20. 제1항에 있어서, 합성 항체인 항체.
  21. 포유류에서 병리학적 혈관형성과 연관된 장애를 치료 또는 예방하기 위한 약물을 제조하는데 있어서의, 제1항의 항-NRP1 항체의 용도.
  22. 제21항에 있어서, 장애가 암인 용도.
  23. 제22항에 있어서, 암이 유방암, 결장직장암, 비소세포 폐암, 비호지킨 림프종 (NHL), 신암, 전립선암, 간암, 두경부암, 흑색종, 난소암, 중피종 및 다발성 골수종으로 이루어진 군 중에서 선택되는 용도.
  24. 제23항에 있어서, 치료가 제2 치료제를 추가로 포함하는 용도.
  25. 제24항에 있어서, 제2 치료제가 항혈관형성제, 항종양 조성물, 화학요법제 및 세포독성제로 이루어진 군 중에서 선택된 작용제인 용도.
  26. 제25항에 있어서, 항혈관형성제가 VEGF 길항제인 방법.
  27. 제26항에 있어서, VEGF 길항제가 항-hVEGF 항체인 방법.
  28. 제27항에 있어서, 항-hVEGF 항체가 항체 A4.6.1과 동일한 VEGF 에피토프와 결합할 수 있는 방법.
  29. 제28항에 있어서, 항-hVEGF 항체가 베바시주마브 (bevacizumab) 또는 라니비 주마브 (ranibizumab)인 방법.
  30. 제24항에 있어서, 제2 치료제가 바탈라니브 (vatalanib) (PTK787), 에를로티니브 (erlotinib) (TARCEVA®), OSI-7904, ZD6474 (ZACTIMA®), ZD6126 (ANG453), ZD1839, 수니티니브 (sunitinib) (SUTENT®), 세막사니브 (semaxanib) (SU5416), AMG706, AG013736, 이마티니브 (Imatinib) (GLEEVEC®), MLN-518, CEP-701, PKC-412, 라파티니브 (Lapatinib) (GSK572016), VELCADE®, AZD2171, 소라페니브 (sorafenib) (NEXAVAR®), XL880, 및 CHIR-265로 이루어진 군 중에서 선택된 수용체 티로신 키나제 억제제인 방법.
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